特表 2024-507282 プロセス

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-16

(54)【発明の名称】プロセス

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/53 20060101AFI20240208BHJP

   C12P 15/00 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 9/02 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240208BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240208BHJP

【ＦＩ】

C12N15/53

C12P15/00 ZNA

C12N9/02

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023572045

(86)(22)【出願日】2022-02-09

(85)【翻訳文提出日】2023-08-14

(86)【国際出願番号】 AU2022050077

(87)【国際公開番号】W WO2022170385

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】2101796.7

(32)【優先日】2021-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523302496

【氏名又は名称】サン・ファーマシューティカル・インダストリーズ・オーストラリア・プロプライエタリ・リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114188

【弁理士】

【氏名又は名称】小野 誠

(74)【代理人】

【識別番号】100119253

【弁理士】

【氏名又は名称】金山 賢教

(74)【代理人】

【識別番号】100124855

【弁理士】

【氏名又は名称】坪倉 道明

(74)【代理人】

【識別番号】100129713

【弁理士】

【氏名又は名称】重森 一輝

(74)【代理人】

【識別番号】100137213

【弁理士】

【氏名又は名称】安藤 健司

(74)【代理人】

【識別番号】100143823

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 英彦

(74)【代理人】

【識別番号】100183519

【弁理士】

【氏名又は名称】櫻田 芳恵

(74)【代理人】

【識別番号】100196483

【弁理士】

【氏名又は名称】川嵜 洋祐

(74)【代理人】

【識別番号】100160749

【弁理士】

【氏名又は名称】飯野 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100160255

【弁理士】

【氏名又は名称】市川 祐輔

(74)【代理人】

【識別番号】100146318

【弁理士】

【氏名又は名称】岩瀬 吉和

(74)【代理人】

【識別番号】100127812

【弁理士】

【氏名又は名称】城山 康文

(72)【発明者】

【氏名】リ，シー

(72)【発明者】

【氏名】グラス，サリー・ルイーズ

(72)【発明者】

【氏名】スペンサー，ギャリック・ウェストリー・カイル

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B064AE41

4B064CA19

4B064CA21

4B064CB01

4B064CC24

4B064CD04

4B065AA26X

4B065AA88Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065BC01

4B065BD34

4B065CA18

4B065CA28

(57)【要約】

本開示は、粗製ケシ抽出物、又はオピエート若しくはオピオイドアルカロイドの精製又は半精製源を使用して、１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドを産生するための生体内変換、酵素をコードする核酸分子を含むベクター、該酵素をコードする核酸を発現し、増強された活性を有する修飾酵素を含む微生物細胞に関する。
【選択図】図７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

１つ以上のオピエートアルカロイド又は合成オピオイドアルカロイド又はそれらの誘導体の生体内変換のための方法であって、
１つ以上のオピエートアルカロイド又は合成オピオイドアルカロイド又はそれらの誘導体の、１つ以上の異なるオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイド又はそれらの誘導体への変換において、少なくとも１つの反応を触媒することができる、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子で形質転換された宿主細胞を含む調製物を形成するステップと、
前記反応をインキュベートして、１つ以上のオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイド又はそれらの誘導体の変換を可能にするステップと、任意選択で、
前記１つ以上の変換された異なるオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイド又はそれらの誘導体を、前記調製物から抽出するステップと、を含む、方法。

【請求項2】

前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、前記配列が、（ｉ）で定義された前記ヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に記載の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号３に記載されるか、又は配列番号３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８に記載されるか、又は配列番号８と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項5】

前記ポリペプチドが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記ポリペプチドが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記核酸分子が、
ｉ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、前記配列が、（ｉ）で定義された前記ヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６３に記載されるか、又は配列番号６３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５９に記載されるか、又は配列番号５９と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６８に記載されるか、又は配列番号６８と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６７に記載されるか、又は配列番号６７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号６６に記載されるか、又は配列番号６６と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記ポリペプチドが、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記ポリペプチドが、配列番号５９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記ポリペプチドが、配列番号６８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記ポリペプチドが、配列番号６７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記ポリペプチドが、配列番号６６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１６に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、前記配列が、（ｉ）で定義された前記ヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１６の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、テバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、テバイン６－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１８に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、前記配列が、（ｉ）で定義された前記ヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１８の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、コデイノンレダクターゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイノンレダクターゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項20】

前記核酸分子が、
ｉ）配列番号１７に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、前記配列が、（ｉ）で定義された前記ヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１７の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、前記核酸分子が、ネオピノンイソメラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、前記アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、ネオピノンイソメラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記細胞が、真核細胞である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記細胞が、原核細胞である、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記オピエートアルカロイドが、粗製ケシ抽出物から取得され、Ｐａｐａｖｅｒ植物から取得される、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記Ｐａｐａｖｅｒ植物が、修飾され、前記植物が、配列番号１若しくは３７に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１若しくは３７に記載のヌクレオチド配列と９５～９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる１、２、又は３個の連結されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失又は変異される、請求項２３に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｐａｐａｖｅｒ植物が、各コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失され、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性が、検出不能である、請求項２３又は２４に記載の方法。

【請求項26】

前記Ｐａｐａｖｅｒ植物が、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１６に記載のヌクレオチド配列と９５～９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる１、２、３、４、又は５個の連結されたテバイン６－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失又は変異される、請求項２４又は２５に記載の方法。

【請求項27】

前記Ｐａｐａｖｅｒ植物が、各テバイン６－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失され、テバイン６－Ｏ－デメチラーゼ活性が、検出不能である、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記Ｐａｐａｖｅｒ植物が、修飾され、
コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする１、２、又は３個の遺伝子に対するゲノム修飾、
テバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする１、２、３、４、又は５個の遺伝子に対するゲノム修飾を含み、
コデイン３－Ｏ－デメチラーゼの発現又はコデイン３－Ｏ－デメチラーゼの活性が、低減されるか、又は検出不能であり、更に、前記テバイン６－Ｏ－デメチラーゼの発現又はテバイン６－Ｏ－デメチラーゼの活性が、低減されるか、又は検出不能であり、前記修飾植物が、野生型Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物と比較した場合にテバインのレベルが上昇しており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする機能遺伝子及びテバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする機能遺伝子を含む、請求項２４～２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドであって、前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドの活性が、非修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼと比較した場合に改変される、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項30】

前記修飾が、配列番号１９に記載のアミノ酸配列に対するものであり、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾され、前記コデイン３－Ｏ－デメチラーゼが、改変された活性を有する、請求項２９に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項31】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、アミノ酸２５９位及び／若しくはアミノ酸２６０位で修飾されているか、又は配列番号１９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２５９及び／若しくはアミノ酸残基２６０に対する修飾を含む、アミノ酸配列を含む、請求項２９又は３０に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項32】

前記修飾が、配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対するものであり、前記ポリペプチドが、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾され、前記コデイン３－Ｏ－デメチラーゼが、改変された活性を有する、請求項２９に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項33】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、３、４、５、７、２５９、３５７、及び／若しくは３６０、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸位置で修飾されるか、あるいは配列番号５３と少なくとも９０％同一であり、３、４、５、７、２５９、３５７、及び／若しくは３６０、又はそれらの組み合わせから選択される１つ以上のアミノ酸残基位置のコドンに対する修飾を含む、アミノ酸配列を含む、請求項２９又は３２に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項34】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１から選択される、請求項２９又は３０に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項35】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８から選択される、請求項２９又は３２に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項36】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号１９又は５３に記載のアミノ酸配列で表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、増強された活性を有する、請求項２９～３５のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項37】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号２１に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項38】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号２６に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項39】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号６３に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項40】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号５９に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項41】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号６８に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項42】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号６７に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項43】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、配列番号６６に記載のアミノ酸配列で表される、請求項２９～３６のいずれか一項に記載のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド。

【請求項44】

請求項２９～４３のいずれか一項に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子。

【請求項45】

前記核酸分子が、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５と少なくとも９０％同一であり、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離核酸分子。

【請求項46】

修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号８に記載されるか、又は配列番号８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２５９及び任意選択でアミノ酸残基２６０のコドンに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む、請求項４５に記載の単離核酸分子。

【請求項47】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４６に記載の単離核酸分子。

【請求項48】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４６又は４７に記載の単離核酸分子。

【請求項49】

前記核酸分子が、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２と少なくとも９０％同一であり、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列を含む、請求項４４に記載の単離核酸分子。

【請求項50】

修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号４３に記載されるか、又は配列番号４３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基５並びに任意選択でアミノ酸残基３６０、２５９、３、７、３５７、及び／若しくは４のコドンに対する１つ以上の修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。

【請求項51】

修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする前記ヌクレオチド配列が、配列番号５１に記載されるか、又は配列番号５１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基４、３６０、２５９並びに任意選択でアミノ酸残基３、７、３５７、及び／若しくは５のコドンに対する１つ以上の修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む、請求項４９に記載の単離核酸分子。

【請求項52】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４９又は５０に記載の単離核酸分子。

【請求項53】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４９又は５０に記載の単離核酸分子。

【請求項54】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４９又は５０に記載の単離核酸分子。

【請求項55】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４９又は５１に記載の単離核酸分子。

【請求項56】

前記ヌクレオチド配列が、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする、請求項４９又は５１に記載の単離核酸分子。

【請求項57】

前記核酸分子が、ヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、前記遺伝コードのために縮重し、請求項２９～４３のいずれか一項に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする、請求項４４～５６のいずれか一項に記載の単離核酸分子。

【請求項58】

請求項４４～５７のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。

【請求項59】

請求項４４～５８のいずれか一項に記載の核酸分子又はベクターで形質転換された、細胞。

【請求項60】

第１のオピエート又はオピオイドアルカロイドの第２のオピエート又はオピオイドアルカロイドへの生体内変換のためのプロセスであって、
請求項２９～４３のいずれか一項に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、及び粗製ケシ抽出物、あるいは選択されたオピエート若しくはオピオイドアルカロイドの精製又は半精製源を含む、調製物を形成することと、
前記調製物をインキュベートして、１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドの変換を可能にすることと、任意選択で、
前記調製物から前記１つ以上の変換されたオピエート又はオピオイドアルカロイドを抽出することと、を含む、プロセス。

【請求項61】

前記修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが、請求項５９に記載の細胞によって発現される、請求項６０に記載のプロセス。

【請求項62】

前記第１のオピエートアルカロイドが、テバインであり、前記第２のオピエートアルカロイドが、オリパビンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項63】

前記第１のオピエートアルカロイドが、コデインであり、前記第２のオピエートアルカロイドが、モルヒネである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項64】

前記第１のオピエートアルカロイドが、コデイノンであり、前記第２のオピエートアルカロイドが、モルヒノンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項65】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、オキシコドンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、オキシモルホンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項66】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ヒドロコドンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、ヒドロモルホンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項67】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ジヒドロコデインであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、ジヒドロモルヒネである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項68】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシコデインであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシモルヒネである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項69】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ノルオキシコドンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、ノルオキシモルホンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項70】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ノルオキシコデイノンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、ノルオキシモルヒノンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項71】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシノルコデイノンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシノルモルヒノンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項72】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシコデイノンであり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、１４－ヒドロキシモルヒノンである、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項73】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ブプレノルフィン中間体（Ｎ－シクロプロピルメチル－７α－（２－ヒドロキシ－３，３－ジメチル－２－ブチル）－６，１４－エンドエタノ－６，７，８，１４－テトラヒドロノルテバイン）であり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、ブプレノルフィン（（２Ｓ）－２－［１７－（シクロプロピルメチル）－４，５α－エポキシ－３－ヒドロキシ－６－メトキシ－６α，１４－エタノ－１４α－モルフィナン－７α－γｌ］－３，３－ジメチルブタン－２－オール）である、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【請求項74】

前記第１の半合成オピオイドアルカロイドが、ブプレノルフィン中間体（７－アセチル－６，１４－エンドエテノ－６，７，８，１４－テトラヒドロテバイン）であり、前記第２の半合成オピオイドアルカロイドが、エトルフィン中間体である、請求項６０又は６１に記載のプロセス。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドを産生するためのプロセスであって、該プロセスが、半合成オピオイドアルカロイドを含むオピエートアルカロイドの変換において、少なくとも１つの反応を触媒する酵素をコードする１つ以上の核酸分子で形質転換された宿主細胞を含む反応混合物を形成することと、混合物を反応させて、該オピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイドを更なるオピエート又はオピオイドアルカロイドへ変換することと、任意選択で、反応混合物の生成物を抽出することと、を含む、プロセスと、該核酸分子を含むベクターと、ポリペプチド及び改変された又は増強された活性を有する修飾ポリペプチドをコードする核酸を発現する宿主細胞と、に関する。

【背景技術】

【0002】

コデイン及びモルヒネなどのオピエートは強力な鎮痛剤であり、中程度から強い痛みを治療するために頻繁に使用される。オキシコドン、オキシモルホン、ナルブフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、又はエトルフィンなどの半合成オピオイドは、コデイン及びモルヒネと比較して低い副作用プロファイルを有することが多いため、貴重な疼痛管理代替をもたらす。

【0003】

モルフィナンアルカロイドの生合成経路は十分に確立されており、ドーパミン及び４－ヒドロキシフェニルアセトアルデヒドから始まり、その後テバインに変換されるＲ－レチクリンの合成に至る一連の酵素的ステップが含まれる。次いで、テバインは、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ（ＣＯＤＭ）によってオリパビンに変換されるか、又はテバイン－６－Ｏ－デメチラーゼ（Ｔ６ＯＤＭ）の活性を伴ういくつかのステップでコデインに変換される。続いて、コデインは、ＣＯＤＭによる脱メチル化によってモルヒネに変換される。

【0004】

テバインは、一部の半合成オピオイド合成の出発物質である。オピエートアルカロイドは、ラテックスから抽出する、アヘンケシの緑色の種子のさやから、又は乾燥した成熟植物であるケシガラから収穫することができるが、オピエートアルカロイドの需要は一般に利用可能な天然供給量を超えており、高価な化学合成が必要となる。コデイン、モルヒネ、及び半合成オピオイドの化学前駆体であるテバインは、植物内で容易に変換されるため、野生型ケシ植物におけるテバインのレベルは低い。

【0005】

ＷＯ２０１７／１２２０１１は、参照によりその全体が組み込まれ、Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍにおけるＣＯＤＭ遺伝子をコードするゲノム遺伝子座の特徴付けを開示する。遺伝子座は、ゲノム配列レベルで約９９％同一である、３個の密接に関連したＣＯＤＭ遺伝子を含む。酵素活性に影響を及ぼすＣＯＤＭ遺伝子における変異は、コデインの上昇と関連し、ＣＯＤＭ遺伝子の各々が欠失している植物では、植物は非常に高いレベルのコデインを有する。ＥＰ３３９８４３０は、参照によりその全体が組み込まれ、Ｔ６ＯＤＭ遺伝子をコードするゲノム遺伝子座の特徴付けを開示する。座位は、５個のＴ６ＯＤＭ遺伝子を含む。Ｔ６ＯＤＭ遺伝子の変異と組み合わせたＣＯＤＭの３個の遺伝子クラスターの両方で変異を保有するＰ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物では、結果として生じる二重変異は、高いレベルのテバインを示す。ＣＯＤＭ及びＴ６ＯＤＭの発現又は活性が検出不能である場合、結果として生じる植物は非常に高いレベルのテバインを有する。

【0006】

例えば、オピエート生体内変換に関与する酵素、又は半合成オピオイドの合成に関与する酵素、例えば、オキシコドン、オキシモルホン、ナルブフィン、ナロキソン、ナルトレキソン、ブプレノルフィン、又はエトルフィンをコードする１つ以上の核酸で形質転換された細菌、真菌、又は植物細胞などの宿主細胞を含む調製物を形成することを含む、１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドの１つ以上のオピエート又はオピオイド中間体への変換のためのプロセスを開示する。

【0007】

また、ケシ、例えばＰ．ｓｏｍｉｎｆｅｒｕｍから得られる粗製ケシ抽出物の使用、生体内変換を得るために調製物をインキュベートすること、及び任意選択で、形質転換調製物から１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドを抽出することを開示する。本開示は、Ｐａｐａｖｅｒ種からのオピエートアルカロイドのインプランタ抽出の代替として、オピエートアルカロイドのスケール変換を提供する。また、改変又は増強されたＣＯＤＭ活性をもたらすアミノ酸修飾を担持するＣＯＤＭポリペプチドも開示する。

【発明を実施するための形態】

【0008】

本発明の一態様によれば、１つ以上のオピエートアルカロイド又は合成オピオイドアルカロイドの生体内変換のための方法であって、
１つ以上のオピエートアルカロイド又は合成オピオイドアルカロイドの、１つ以上の異なるオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイドへの変換において、少なくとも１つの反応を触媒する、１つ以上のポリペプチドをコードする１つ以上の核酸分子で形質転換された宿主細胞を含む調製物を形成するステップと、
反応をインキュベートして、１つ以上のオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイドの変換を可能にするステップと、任意選択で、
該１つ以上の変換された異なるオピエートアルカロイド又は半合成オピオイドアルカロイドを、該調製物から抽出するステップと、を含む、方法が提供される。

【0009】

本発明の好ましい方法では、該調製物は、天然起源のオピエートアルカロイドを含む。

【0010】

本発明の別の好ましい方法では、該調製物は、半合成オピオイドアルカロイドを含む。

【0011】

本発明の好ましい方法では、該調製物は、天然オピエートアルカロイド、例えば、コデイン、テバイン、コデイノン、及びモルヒノンを含む、粗製ケシ抽出物を含む。

【0012】

好ましい方法では、該調製物は、テバイン、オリパビン、コデイン、モルヒノン、ネオモルヒノン、ネオピノン、及びコデイノンからなる群から選択されるオピエートアルカロイド、好ましくはテバイン及びコデインを含む。

【0013】

好ましい方法では、該調製物は、コデイン又はテバインを含む。

【0014】

好ましい方法では、該１つ以上の変換されたオピエートアルカロイドは、オリパビン、コデイン、モルヒノン、ネオモルヒノン、ネオピノン、及びコデイノンからなる群から選択され、好ましくはテバイン及びコデインである。

【0015】

好ましい方法では、該１つ以上の変換された異なるオピエートアルカロイドは、オリパビン及びモルヒネである。

【0016】

本発明の別の方法では、該オピオイドアルカロイドは、オキシコドン、オキシモルホン、ヒドロコドン、ヒドロモルホン、ジヒドロコデイン、ジヒドロモルヒネ：１４－ヒドロキシコデイン、１４－ヒドロキシモルヒネ、ノルオキシコドン、ノルオキシモルホン、ノルオキシコデイノン、ノルオキシモルヒノン、１４－ヒドロキシノルコデイノン、１４－ヒドロキシノルモルヒノン、１４－ヒドロキシコデイノン、１４－ヒドロキシモルヒノン、ブプレノルフィン中間体、例えば、Ｎ－シクロプロピルメチル－７α－（２－ヒドロキシ－３，３－ジメチル－２－ブチル）－６，１４－エンドエタノ－６，７，８，１４－テトラヒドロノルテバイン又は７－アセチル－６，１４－エンドエテノ－６，７，８，１４－テトラヒドロテバイン、ブプレノルフィン（（２Ｓ）－２－［１７－（シクロプロピルメチル）－４，５α－エポキシ－３－ヒドロキシ－６－メトキシ－６α，１４－エタノ－１４α－モルフィナン－７α－γｌ］－３，３－ジメチルブタン－２－オール）、及びエトルフィン中間体からなる群から選択される半合成オピオイドアルカロイドである。

【0017】

半合成オピオイドアルカロイドの更なる例は、ＵＳ２０１９／０１４４９００に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。

【0018】

本発明の好ましい方法では、該核酸分子は、
ｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、該配列が、（ｉ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、又は１５の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子が、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0019】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号３に記載されるか、又は配列番号３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0020】

配列相同性は、本明細書に開示される完全長ヌクレオチド配列又はアミノ酸配列との９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、若しくは９９％の同一性又は類似性である。

【0021】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号８に記載されるか、又は配列番号８と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0022】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号１、２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５からなる群から選択されるか、又は配列番号１、２、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、及び１５と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0023】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号１９に記載されるアミノ酸配列、又は配列番号１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0024】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0025】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0026】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２２と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｈを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0027】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｑを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0028】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ａを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0029】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｓを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0030】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇを含む、アミノ酸配列を含むコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドを含む。

【0031】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｒ２６０Ｔを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0032】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＲ２６０Ｔを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0033】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号２９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｒ２６０Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0034】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄ及びＲ２６０Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0035】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号３１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＲ２６０Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0036】

本発明の好ましい方法では、該核酸分子は、
ｉ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、該配列が、（ｉ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、又は５２の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子が、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0037】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択されるか、又は配列番号３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0038】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号４７に記載されるか、又は配列番号４７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0039】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号４３に記載されるか、又は配列番号４３と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0040】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号５２に記載されるか、又は配列番号５２と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0041】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号５１に記載されるか、又は配列番号５１と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0042】

本発明の好ましい実施形態では、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号５０に記載されるか、又は配列番号５０と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。

【0043】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５３に記載されるアミノ酸配列、又は配列番号５３と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0044】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、及びＩ７Ｍを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0045】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｙ３５７Ｓ及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0046】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｉ７Ｍ、Ｙ３５７Ｓ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0047】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0048】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0049】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列、又は配列番号５９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0050】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ７Ｍを含む、アミノ酸配列を含むコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドを含む。

【0051】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｙ３５７Ｓを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0052】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６２と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｍ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0053】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６３に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0054】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６４に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＥ２５９Ｇを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0055】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0056】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0057】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６７に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0058】

本発明の好ましい実施形態では、該コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列、又は配列番号６８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含む、アミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。

【0059】

本発明の好ましい方法では、該核酸分子は、
ｉ）配列番号１６に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、該配列が、ｉ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１６の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子が、テバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３２で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、テバイン６－Ｏ－デメチラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0060】

本発明の好ましい方法では、該核酸分子は、
ｉ）配列番号１８に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、該配列が、ｉ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１８の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子が、コデイノンレダクターゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３４で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、コデイノンレダクターゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0061】

本発明の本発明の好ましい方法では、該核酸分子は、
ｉ）配列番号１７に記載のヌクレオチド配列、
ｉｉ）ヌクレオチド配列であって、該配列が、ｉ）で定義されたヌクレオチド配列に対する遺伝子コードの結果として縮退する、ヌクレオチド配列、
ｉｉｉ）配列番号１７の配列と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする相補鎖のヌクレオチド配列を含む核酸分子であって、該核酸分子が、ネオピノンイソメラーゼをコードする、核酸分子、
ｉｖ）配列番号３３で表されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ｖ）アミノ酸配列を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であって、該アミノ酸配列が、上記ｉｖ）に表される少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾されており、ネオピノンイソメラーゼ活性を有する、ヌクレオチド配列からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。

【0062】

核酸分子のハイブリダイゼーションは、２つの相補的な核酸分子が互いにある程度の水素結合を受けるときに生じる。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、核酸の周囲の環境条件、ハイブリダイゼーション方法の性質、及び使用される核酸分子の組成及び長さに応じて変化し得る。特定の程度のストリンジェンシーを達成するために必要なハイブリダイゼーション条件に関する計算については、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２００１）、及びＴｉｊｓｓｅｎ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９３）に記載される。Ｔ_ｍは、核酸分子の所与の鎖の５０％がその相補鎖とハイブリダイズする温度である。以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定するものではない。
非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を共有する配列のハイブリダイズが可能）
ハイブリダイゼーション：５ｘＳＳＣ、６５℃、１６時間
２回洗浄：２ｘＳＳＣ、室温（ＲＴ）、各１５分間
２回洗浄：０．５ｘＳＳＣ、６５℃、各２０分間
高いストリンジェンシー（少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、又は８９％の同一性を共有する配列のハイブリダイズが可能）
ハイブリダイゼーション：５ｘ～６ｘＳＳＣ、６５℃～７０℃、１６～２０時間
２回洗浄：２ｘＳＳＣ、室温、各５～２０分間
２回洗浄：１ｘＳＳＣ、５５℃～７０℃、各３０分間
低いストリンジェンシー（少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、又は７９％の同一性を共有する配列のハイブリダイズが可能）
ハイブリダイゼーション：６ｘＳＳＣ、室温～５５℃、１６～２０時間
少なくとも２回洗浄：２ｘ～３ｘＳＳＣ、室温～５５℃、各２０～３０分間。

【0063】

本発明の好ましい方法では、該宿主細胞は、真核細胞である。

【0064】

本発明の好ましい方法では、該真核細胞は、植物細胞、例えば、Ｐａｐａｖｅｒ種植物細胞、例えば、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ細胞である。

【0065】

本発明の好ましい方法では、該真核細胞は、微生物細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞である。

【0066】

本発明の別の好ましい方法では、該宿主細胞は、原核細胞である。

【0067】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該原核細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。

【0068】

本発明によるプロセスにおいて微生物が生物として使用される場合、それらは、宿主生物に応じて、当業者が精通している方法で増殖又は培養される。微生物は、通常は糖の形態の炭素源、通常は酵母抽出物などの有機窒素源の形態の窒素源、又は硫酸アンモニウムなどの塩、鉄、マンガン、及びマグネシウムの塩などの微量元素を含む液体培地中で、必要に応じて、ビタミンを、０℃～１００℃、好ましくは１０℃～６０℃の温度で、酸素中でガス補給しながら増殖する。

【0069】

液体媒体のｐＨは、培養期間中に一定に維持されてもよく、調節されてもよく、又はそうでなくてもよい。培養物は、バッチ式、半バッチ式、又は連続的に増殖させることができる。栄養素は、発酵の開始時に提供されてもよく、又は半連続的に若しくは連続的に供給されてもよい。これらの生成物は、当業者に公知のプロセス、例えば、酸又は塩基を用いたｐＨ調整による生成物の可溶性の操作による、水相から不混和性有機溶媒中への、及び不混和性有機溶媒からの外への選択的抽出によって、上述のように生物から単離することができる。溶液の温度、極性、溶液のｐＨ、標的化合物の塩の形成を使用して、標的化合物の溶解性を変化させることによる、吸着剤及び又は結晶の形成を使用した精製により、所望の生成物の単離を可能にする。この目的のために、生物体は有利に事前に破壊され得る。このプロセスにおいて、ｐＨ値は、有利には４～１２、好ましくはｐＨ６～９、特に好ましくはｐＨ７～８に維持される。

【0070】

既知の栽培方法の概要は、Ｃｈｍｉｅｌによる教科書（ＢｉｏｐｒｏｚｅBｔｅｃｈｎｉｋ １．Ｅｉｎｆuｈｒｕｎｇ ｉｎ ｄｉｅ Ｂｉｏｖｅｒｆａｈｒｅｎｓｔｅｃｈｎｉｋ ［Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ］（Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ，１９９１））又はＳｔｏｒｈａｓによる教科書（Ｂｉｏｒｅａｋｔｏｒｅｎ ｕｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒｅ Ｅｉｎｒｉｃｈｔｕｎｇｅｎ［Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ］（Ｖｉｅｗｅｇ Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ／Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ，１９９４））に見出すことができる。

【0071】

使用する培地は、問題の菌株の要件を満たす必要がある。様々な微生物の培養培地の説明は、米国細菌学会の教科書「Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）に記載されている。

【0072】

上述したように、本発明に従って使用できるこれらの培地は、通常、１つ以上の炭素源、窒素源、無機塩、ビタミン及び／又は微量元素を含む。

【0073】

好ましい炭素源は、単糖類、二糖類、又は多糖類などの糖類である。炭素源の例は、グルコース、フルクトース、マンノース、ガラクトース、リボース、ソルボース、リブロース、ラクトース、マルトース、スクロース、ラフィノース、デンプン、又はセルロースである。糖は、糖蜜又は精製糖からの他の副産物などの複雑な混合物を介して培地に添加され得る。様々な炭素源の混合物の添加も有利であり得る。他の可能性のある炭素源は、油脂、例えば、大豆油、ヒマワリ油、ピーナッツ油、及び／若しくはココナッツ脂肪、脂肪酸、例えば、パルミチン酸、ステアリン酸、及び／若しくはリノール酸、アルコール及び／又は多価アルコール、例えば、グリセロール、メタノール、及び／若しくはエタノール、並びに／又は有機酸、例えば、酢酸及び／若しくは乳酸である。

【0074】

窒素源は通常、有機若しくは無機の窒素化合物、又はこれらの化合物を含む材料である。窒素源の例は、液体若しくは気体形態のアンモニア、又はアンモニウム塩、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、若しくは硝酸アンモニウム、ナイトレート、尿素、アミノ酸、又は複合窒素源、例えば、コーンスティープリカー、大豆ミール、大豆タンパク質、酵母抽出物、肉エキスなどを含む。窒素源は、個別に又は混合物として使用することができる。

【0075】

培地中に存在し得る無機塩化合物には、カルシウム、マグネシウム、ナトリウム、コバルト、モリブデン、カリウム、マンガン、亜鉛、銅、及び鉄の塩化物、リン、並びに硫酸塩が含まれる。

【0076】

無機硫黄含有化合物、例えば、サルフェート、サルファイト、ジチオナイト、テトラチオネート、チオスルファト、スルフィドなど、又は有機硫黄化合物、例えば、メルカプタン及びチオールは、硫黄含有ファインケミカル、特にメチオニンの産生のための硫黄源として使用され得る。

【0077】

リン酸、リン酸二水素カリウム、若しくはリン酸水素二カリウム、又は対応するナトリウム含有塩をリン源として使用することができる。

【0078】

金属イオンを溶液中に維持するために、キレート剤を培地に添加してもよい。特に好適なキレート剤は、カテコール又はプロトカテコールなどのジヒドロキシフェノール、及びクエン酸などの有機酸を含む。

【0079】

微生物を培養するために本発明に従って使用される発酵培地は、通常、例えば、ビオチン、リボフラビン、チアミン、葉酸、ニコチン酸、パントテナート、及びピリドキシンを含む、ビタミン又は成長促進剤などの他の成長因子も含む。成長因子及び塩は、酵母抽出物、糖蜜、コーンスティープリカーなどの複合培地成分に由来することが多い。更に、好適な前駆体を培養培地に添加することが可能である。培地化合物の正確な組成は、特定の実験に大きく依存し、それぞれの特定の事例について個別に決定される。メディアの最適化に関する情報は、教科書「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｅｄｉｔｏｒｓ Ｐ．Ｍ．Ｒｈｏｄｅｓ，Ｐ．Ｆ． Ｓｔａｎｂｕｒｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９７）ｐｐ．５３－７３，ＩＳＢＮ ０ １９ ９６３５７７ ３）に見出すことができる。成長培地はまた、例えば、標準１（Ｍｅｒｃｋ）又はＢＨＩ（脳心臓注入、ＤＩＦＣＯ）など商業供給業者から取得することができる。

【0080】

全ての培地成分は、熱（１．５バール及び１２１℃で２０分）又はフィルター滅菌のいずれかによって滅菌される。成分は、一緒に又は必要に応じて、別々に滅菌されてもよい。全ての培地成分は、培養の開始時に存在してもよく、又は必要に応じて、連続的に若しくはバッチ式で添加されてもよい。

【0081】

培養温度は通常、１５℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃であり、一定に維持されてもよく、又は実験中に変更されてもよい。媒体のｐＨは、５．０～８．５、好ましくは７．０の範囲内である必要がある。培養のためのｐＨは、培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、及び水性アンモニアなどの塩基性化合物、又はリン酸、酢酸、若しくは硫酸などの酸性化合物を添加することにより制御することができる。発泡は、例えば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いることによって制御することができる。プラスミドの安定性を維持するために、選択的効果を有する好適な物質、例えば、抗生物質を培地に添加することが可能である。好気的条件は、酸素又は酸素含有ガス混合物、例えば、周囲空気を培養物に導入することによって維持される。培養温度は、通常２０℃～４５℃、好ましくは２５℃～４０℃である。培養は、所望の生成物の形成が最大になるまで継続される。この目標は、通常１０～１６０時間以内に達成される。

【0082】

このようにして得られる多価不飽和脂肪酸を含む発酵ブロスは、通常、７．５重量％～２５重量％の乾燥質量を含む。

【0083】

その後、発酵ブロスを更に処理することができる。バイオマスは、必要に応じて、例えば、遠心分離、濾過、デカント、又はこれらの方法の組み合わせなどの分離方法によって、発酵ブロスから完全に又は部分的に除去されてもよく、又は該ブロスに完全に残されてもよい。その分離後にバイオマスを処理することが有利である。

【0084】

しかしながら、発酵ブロスは、例えば、回転式蒸発器、薄膜蒸発器、流下膜式蒸発器、逆浸透又はナノ濾過などの公知の方法を使用して、細胞を分離することなく濃厚又は濃縮することができる。最後に、この濃縮発酵ブロスを処理して、その中に存在するオピエートアルカロイドを得ることができる。

【0085】

本発明の好ましい方法では、該粗製ケシ抽出物は、Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ又はＰａｐａｖｅｒ ｂｒａｃｔｅａｔｕｍ植物から取得される。

【0086】

抽出方法の最適化に関する情報は、教科書「Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｍ Ｒｏｓｔａｇｎｏ ａｎｄ Ｊ Ｐｒａｄｏ編集，ＲＳＣ出版（２０１３），ＩＳＢＮ ９７８ １ ８４９７３ ６０６ ０）に見出すことができる。

【0087】

好ましくは、該Ｐａｐａｖｅｒ種は、１つ以上のオピエートアルカロイドを高いレベルで、天然で含む。

【0088】

本発明の別の好ましい方法では、該Ｐａｐａｖｅｒ種は、修飾され、該修飾は、ゲノム修飾であり、該ゲノム修飾は、オピエートアルカロイド含量の上昇と関連する。

【0089】

本発明の好ましい方法では、該Ｐａｐａｖｅｒ種は、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍであり、該修飾は、１つ以上のコデイン３－Ｏ－デメチラーゼにおける変異である。

【0090】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、修飾され、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１に記載のヌクレオチド配列と９５～９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる１、２、又は３個の連結されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失又は変異される。

【0091】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、修飾され、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号３７に記載のヌクレオチド配列と９５～９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる１、２、又は３個の連結されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失又は変異される。

【0092】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、配列番号３５に記載のヌクレオチド配列を含む、若しくはそれからなる核酸分子の全部又は一部を欠失させることによって修飾され、１、２、又は３個の連結されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子が、欠失又は変異される。

【0093】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、各コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失され、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性が、検出不能である。

【0094】

「遺伝子」という用語は、オープンリーディングフレームに限定されず、プロモーター領域及び他の制御配列にも拡張され得る。例えば、酵素の活性は、欠失又は変異された制御領域に起因して検出不能とすることができ、それにより、遺伝子発現、及びその後の酵素活性の欠如がもたらされる。

【0095】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、修飾を含み、該修飾は、１つ以上のテバイン６－Ｏ－デメチラーゼにおける欠失又は変異である。

【0096】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、修飾され、配列番号１６に記載のヌクレオチド配列を含む核酸分子、又は配列番号１６に記載のヌクレオチド配列と９５～９９％同一であるヌクレオチド配列を含む核酸分子によってコードされる１、２、３、４、又は５個の連結されたテバイン６－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失又は変異される。

【0097】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、配列番号３６に記載のヌクレオチド配列を含む、若しくはそれからなる核酸分子の全部又は一部を欠失させることによって修飾され、１、２、３、４、又は５個の連結されたテバイン６－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子が、欠失又は変異される。

【0098】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、各テバイン６－Ｏ－デメチラーゼ遺伝子について欠失され、６－Ｏ－デメチラーゼ活性が、検出不能である。

【0099】

本発明の好ましい方法では、該Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物は、修飾され、
コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする１、２、又は３個の遺伝子に対するゲノム修飾、
テバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする１、２、３、４、又は５個の遺伝子に対するゲノム修飾を含み、
コデイン３－Ｏ－デメチラーゼの発現又はコデイン３－Ｏ－デメチラーゼの活性は、低減されるか、又は検出不能であり、更に、該テバイン６－Ｏ－デメチラーゼの発現又はテバイン６－Ｏ－デメチラーゼの活性は、低減されるか、又は検出不能であり、修飾植物は、野生型Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ植物と比較した場合にテバインのレベルが上昇しており、コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする機能遺伝子及びテバイン６－Ｏ－デメチラーゼをコードする機能遺伝子を含む。

【0100】

本発明の更なる態様によれば、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドが提供され、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドの活性は改変される。

【0101】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列に対するものであり、該ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾される。

【0102】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸２５９位で修飾される。

【0103】

本発明の別の実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸２６０位で修飾される。

【0104】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸２５９位及び２６０位で修飾される。

【0105】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、又は３１からなる群から選択される。

【0106】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列に対するものであり、該ポリペプチドは、少なくとも１つのアミノ酸残基の付加、欠失、又は置換によって修飾される。

【0107】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸３位で修飾される。

【0108】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸４位で修飾される。

【0109】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸５位で修飾される。

【0110】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸７位で修飾される。

【0111】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸２５９位で修飾される。

【0112】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸３５７位で修飾される。

【0113】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸３６０位で修飾される。

【0114】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸３位、４位、５位、７位、２５９位、３５７位、及び／若しくは３６０位、又はそれらの組み合わせで修飾され、任意選択で、ｉ）３５７及び３６０、ｉｉ）５及び３６０、ｉｉｉ）５及び２５９、ｉｖ）２５９及び３６０、ｖ）５、２５９、及び３６０、ｖｉ）４、２５９、及び３６０、ｖｉｉ）４、５、２５９、及び３６０、ｖｉｉｉ）３、４、５、及び７、並びにｉｘ）３、４、５、７、３５７、及び３６０からなる群から選択される位置で修飾される。

【0115】

好ましくは、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、アミノ酸３位、４位、５位、７位、２５９位、２６０位、３５７位、及び／若しくは３６０位、又はそれらの組み合わせで修飾される。

【0116】

本発明の別の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、又は６８からなる群から選択される。

【0117】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、増強された活性を有する。

【0118】

本発明の好ましい実施形態では、該増強されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼと比較した場合に、少なくとも１０％高い。

【0119】

本発明の好ましい実施形態では、該増強されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性は、配列番号１９に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％高い。

【0120】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0121】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0122】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号２２、２３、２４、２５、２７、２８、２９、３０、及び３１に記載の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列によって表される。

【0123】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、増強された活性を有する。

【0124】

本発明の好ましい実施形態では、該増強されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼと比較した場合に、少なくとも１０％高い。

【0125】

本発明の好ましい実施形態では、該増強されたコデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性は、配列番号５３に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は１００％高い。

【0126】

コデイン及びテバインは、コデイン ３－Ｏ－デメチラーゼ ポリペプチドの基質である。コデイン及びテバインに対するコデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドの基質特異性が、特定の変異に応じて変化し得ることを開示する。これは、野生型酵素を使用した場合に得られる収量と比較した場合、及びモルヒネ収量と比較した場合のオリパビン収量の低減によって測定可能である。例えば、図５を参照されたい。４時間後、Ｉ７Ｍ株のオリパビンに対するテバインの収率の平均はわずか６％であったのに対し、ＷＴ ＣＯＤＭ発現株では４７％であった。一方、コデインからモルヒネへの収率の平均は、Ｉ７Ｍ及びＷＴ ＣＯＤＭ発現株でそれぞれ３２％及び４７％であった。

【0127】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５３又は１９に記載のアミノ酸配列によって表される野生型コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドと比較した場合に、改変された基質特異性を有する。

【0128】

本発明の好ましい実施形態では、該改変された基質特異性は、野生型の収率と比較した場合のオリパビンの収率の増加又は減少によって表される。

【0129】

本発明の好ましい実施形態では、該改変された基質特異性は、野生型の収率と比較した場合のモルヒネの収率の増加又は減少によって表される。

【0130】

本発明の好ましい実施形態では、配列番号５４、５５、５６、６０、及び６１は、コデインと比較した場合、及び野生型と比較した場合に、テバインに対してより高い基質特異性を示す。

【0131】

本発明の好ましい実施形態では、配列番号５７、５８、５９、６２、６３、６４、６５、６６、６７、及び６８は、テバインと比較した場合、及び野生型と比較した場合に、コデインに対してより高い基質特異性を示す。

【0132】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６７、及び６８からなる群から選択されるアミノ酸配列によって表される。

【0133】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号４９に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0134】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0135】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５６に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0136】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５７に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0137】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５８に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0138】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号５９に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0139】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６０に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0140】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６１に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0141】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６２に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0142】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６５に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0143】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６４に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0144】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６８に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0145】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６７に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0146】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６６に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0147】

本発明の好ましい実施形態では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、配列番号６３に記載のアミノ酸配列によって表される。

【0148】

本発明の更なる態様によれば、本発明による修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子が提供される。

【0149】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、若しくは１５と少なくとも９０％同一であり、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする配列を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0150】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２に記載のヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、若しくは５２と少なくとも９０％同一であり、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼ活性を有するポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列を含む。

【0151】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号１に記載のヌクレオチド配列を含み、該配列は、修飾され、該修飾は、アミノ酸残基２５９及び／又は２６０のコドンに対するものである。

【0152】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号３７に記載のヌクレオチド配列を含み、該配列は、修飾され、該修飾は、アミノ酸残基３、４、５、７、２５９、３５７、及び／又は３６０のコドンに対するものである。

【0153】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号３に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２５９、及び任意選択で更に、２６０のコドンに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0154】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号８に記載の修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードするか、又は配列番号８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２５９、及び任意選択で更に、２６０のコドンに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0155】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号２、４、５、６、７、１０、１２、１３、１４、及び１５からなる群から選択される修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号２、４、５、６、７、１０、１２、１３、１４、及び１５からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２５９、及び任意選択で更に、２６０のコドンに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0156】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、配列番号９及び１１からなる群から選択される修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードするヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号９及び１１からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸残基２６０、及び任意選択で更に、２５９のコドンに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0157】

本発明の好ましい実施形態では、修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼをコードする該ヌクレオチド配列は、配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択されるか、又は配列番号３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、及び５２からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一であり、３、４、５、７、２５９、３５７、及び３６０からなる群から選択されるアミノ酸残基のコドン、並びに任意選択で、ｉ）３５７及び３６０、ｉｉ）５及び３６０、ｉｉｉ）５及び２５９、ｉｖ）２５９及び３６０、ｖ）５、２５９、及び３６０、ｖｉ）４、２５９、及び３６０、ｖｉｉ）４、５、２５９、及び３６０、ｖｉｉｉ）３、４、５、及び７、並びにｉｘ）３、４、５、７、３５７、及び３６０からなる群から選択されるそれらの組み合わせに対する修飾を含む、ヌクレオチド配列を含む。

【0158】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0159】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0160】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２２と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｈを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0161】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｑを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0162】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ａを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0163】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｓを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0164】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0165】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｒ２６０Ｔを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0166】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＲ２６０Ｔを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0167】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号２９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｒ２６０Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0168】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号３０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｄ及びＲ２６０Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0169】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号３１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＲ２６０Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0170】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、及びＩ７Ｍを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0171】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｙ３５７Ｓ及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0172】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｉ７Ｍ、Ｙ３５７Ｓ、及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0173】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｔ３Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0174】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0175】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号５９に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号５９と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0176】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６０に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６０と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ７Ｍを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0177】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６１に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６１と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｙ３５７Ｓを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0178】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６２に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６２と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｍ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0179】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６３に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６３と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0180】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６４に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６４と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ及びＥ２５９Ｇを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0181】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６５に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６５と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｅ２５９Ｇ及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0182】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６６に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６６と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0183】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６７に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６７と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0184】

本発明の好ましい実施形態では、該ヌクレオチド配列は、配列番号６８に記載のアミノ酸配列を含む修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、又は配列番号６８と少なくとも９０％同一であり、アミノ酸置換Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉを含むアミノ酸配列を含む、ポリペプチドをコードする。

【0185】

本発明の好ましい実施形態では、該核酸分子は、ヌクレオチド配列を含み、該ヌクレオチド配列は、遺伝コードのために縮重し、本発明による修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドをコードする。

【0186】

本発明の更なる態様によれば、本発明による核酸分子を含む発現ベクターが提供される。

【0187】

本発明の好ましい実施形態では、該発現ベクターは、該核酸分子と作動可能に連結されたプロモーターを含む。

【0188】

本発明の好ましい実施形態では、該プロモーターは、構成的プロモーターである。

【0189】

本発明の代替的な好ましい実施形態では、該プロモーターは、制御可能である。

【0190】

好ましくは、該プロモーターは、作動可能に連結された核酸の誘導発現を提供するように誘導可能である。

【0191】

好ましくは、該発現ベクターは、微生物宿主細胞における発現に適合される。

【0192】

本発明の態様によれば、本発明による核酸分子又はベクターで形質転換された細胞が提供される。

【0193】

本発明の好ましい実施形態では、該宿主細胞は、真核細胞である。

【0194】

本発明の好ましい実施形態では、該真核細胞は、植物細胞、例えば、Ｐａｐａｖｅｒ種植物細胞、例えば、Ｐ．ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍである。

【0195】

本発明の好ましい実施形態では、該真核細胞は、微生物細胞、例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ細胞又はＰｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞である。

【0196】

本発明の別の好ましい実施形態では、該宿主細胞は、原核細胞である。

【0197】

本発明の更に別の好ましい実施形態では、該原核細胞は、細菌細胞、例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ細胞である。

【0198】

本発明の更なる態様によれば、本発明による細胞を含む細胞培養物が提供される。

【0199】

本発明の更なる態様によれば、本発明による細胞培養を含む発酵槽が提供される。

【0200】

本発明の更なる態様によれば、第１のオピエート又はオピオイドアルカロイドの第２のオピエート又はオピオイドアルカロイドへの生体内変換のためのプロセスであって、
本発明による修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチド、及び粗製ケシ抽出物、あるいは選択されたオピエート若しくはオピオイドアルカロイドの精製又は半精製源を含む、調製物を形成することと、
調製物をインキュベートして、１つ以上のオピエート又はオピオイドアルカロイドの変換を可能にすることと、任意選択で、
該調製物から該１つ以上の変換されたオピエート又はオピオイドアルカロイドを抽出することと、を含む、プロセスが提供される。

【0201】

本発明の好ましい方法では、該修飾コデイン３－Ｏ－デメチラーゼポリペプチドは、本発明による細胞によって発現される。

【0202】

本発明の好ましい方法では、該第１のオピエートアルカロイドは、天然のオピエートアルカロイドである。

【0203】

本発明の別の方法では、該第１のオピエートアルカロイドは、半合成オピオイドアルカロイドである。

【0204】

本発明の好ましい方法では、該第１のオピエートアルカロイドは、テバインであり、該第２のオピエートアルカロイドは、オリパビンである。

【0205】

本発明の別の好ましい方法では、該第１のオピエートアルカロイドは、コデインであり、該第２のオピエートアルカロイドは、モルヒネである。

【0206】

本発明の更に別の方法では、該第１のオピエートアルカロイドは、コデイノンであり、該第２のオピエートアルカロイドは、モルヒノンである。

【0207】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、オキシコドンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、オキシモルホンである。

【0208】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ヒドロコドンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、ヒドロモルホンである。

【0209】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ジヒドロコデインであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、ジヒドロモルヒネである。

【0210】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシコデインであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシモルヒネである。

【0211】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ノルオキシコドンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、ノルオキシモルホンである。

【0212】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ノルオキシコデイノンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、ノルオキシモルヒノンである。

【0213】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシノルコデイノンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシノルモルヒノンである。

【0214】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシコデイノンであり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、１４－ヒドロキシモルヒノンである。

【0215】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ブプレノルフィン中間体（Ｎ－シクロプロピルメチル－７α－（２－ヒドロキシ－３，３－ジメチル－２－ブチル）－６，１４－エンドエタノ－６，７，８，１４－テトラヒドロノルテバイン）であり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、ブプレノルフィン（（２Ｓ）－２－［１７－（シクロプロピルメチル）－４，５α－エポキシ－３－ヒドロキシ－６－メトキシ－６α，１４－エタノ－１４α－モルフィナン－７α－γｌ］－３，３－ジメチルブタン－２－オール）である。

【0216】

本発明の更に別の方法では、該第１の半合成オピオイドアルカロイドは、ブプレノルフィン中間体（７－アセチル－６，１４－エンドエテノ－６，７，８，１４－テトラヒドロテバイン）であり、該第２の半合成オピオイドアルカロイドは、エトルフィン中間体である。

【0217】

半合成オピエートアルカロイドの更なる例は、ＵＳ２０１９／０１４４９００に開示されており、その全体が参照により組み込まれる。

【0218】

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通じて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」並びにこれらの語の変化形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含むがこれらに限定されない」ことを意味し、他の部分、添加物、構成要素、整数、又はステップを除外するようには意図されていない（かつ除外しない）。「本質的になる」とは、必須整数を有するが、必須整数の関数に重大な影響を与えない整数を含むことを意味する。

【0219】

本明細書の説明及び特許請求の範囲全体を通じて、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単数形は複数形を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、文脈上別段の解釈を必要としない限り、明細書は、複数の単数性を企図するものとして理解されるべきである。

【0220】

本発明の特定の態様、実施形態、又は実施例と併せて記載される特徴、整数、特徴、化合物、化学的部分、又は基は、矛盾しない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態、又は実施例に適用されると理解されるべきである。

【0221】

ここで、本発明の実施形態は、以下の図及び表を参照しながら、例示のみで説明される：

【図面の簡単な説明】

【0222】

【図1】Ｐａｐａｖｅｒ ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍにおけるテバインからモルヒネへの変換経路；

【図2】Ａ）野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭで得られた収率と比較してＣＯＤＭ変異発現によって産生されたオリパビン及びモルヒネの収率。２５９位での異なるアミノ酸を有するＣＯＤＭ変異体、又はＷＴ ＣＯＤＭを発現する株を使用して、オリパビンの場合は４時間、モルヒネの場合は３０分間、生体内変換を実施した。データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。Ｂ）ＷＴ ＣＯＤＭ及びＣＯＤＭ変異発現の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。値は、デンシオメトリック分析によって決定されたＷＴ ＣＯＤＭに対する相対的な発現を示し、データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である；

【図3】Ａ）野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭで得られた収率と比較してＣＯＤＭ変異発現によって産生されたオリパビン及びモルヒネの収率。２５９位、２６０位、若しくは２５９位及び２６０位の両方での異なるアミノ酸を有するＣＯＤＭ変異体、又はＷＴ ＣＯＤＭを発現する株を使用して、オリパビンの場合は４時間、モルヒネの場合は３０分間、生体内変換を実施した。データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。Ｂ）ＷＴ ＣＯＤＭ及びＣＯＤＭ変異発現の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。値は、デンシオメトリック分析によって決定されたＷＴ ＣＯＤＭに対する相対的な発現を示し、データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である；

【図4】生体内変換の関数としてのオリパビンの産生は、基質として純粋なテバイン又はテバイン粗抽出物、及び野生型ＣＯＤＭを発現する細胞を使用して進行する。データは、２つの独立した複製の平均±標準偏差である。

【図5】Ａ）野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭで得られた収率と比較してＣＯＤＭ変異発現によって産生されたオリパビン及びモルヒネの収率。単一アミノ酸残基変化（Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｉ７Ｍ、Ｙ３５７Ｓ、又はＭ３６０Ｉ）、又は複数部位での変異；１）Ｔ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｍ、２）Ｙ３５７Ｓ＋Ｍ３６０Ｉ、及び３）Ｔ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｍ＋Ｙ３５７Ｓ＋Ｍ３６０Ｉを有するＣＯＤＭ変異体、又はＷＴ ＣＯＤＭを発現する株を使用して、生体内変換を実施した。オリパビンの収率を４時間後、モルヒネを３０分後にアッセイした。データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。Ｂ）ＷＴ ＣＯＤＭ及びＣＯＤＭ変異タンパク質発現の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。値は、デンシオメトリック分析によって決定されたＷＴ ＣＯＤＭに対する相対的な発現を示し、データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。

【図6】Ａ）野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭで得られた収率と比較してＣＯＤＭ変異発現によって産生されたオリパビン及びモルヒネの収率。Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０Ｉ変異の組み合わせ、若しくはＩ５Ｋ単一変異を有するＣＯＤＭ変異体、又はＷＴ ＣＯＤＭを発現する株を使用して、生体内変換を実施した。オリパビンの収率を４時間後、モルヒネを３０分後にアッセイした。データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。Ｂ）ＷＴ ＣＯＤＭ及びＣＯＤＭ変異タンパク質発現の代表的なＳＤＳ－ＰＡＧＥ画像。値は、デンシオメトリック分析によって決定されたＷＴ ＣＯＤＭに対する相対的な発現を示し、データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。

【図7】Ａ）単一Ｉ５Ｋ変異、単一Ｍ３６０Ｉ変異、二重Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉ変異、又は野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭのいずれかでＣＯＤＭを発現する細胞による生体変換中に時間の関数として産生されるオリパビンの収率。オリパビンを、９時間の間は１時間毎にアッセイし、その後は２４時間が経過するまで３時間毎にアッセイした。Ｂ）単一Ｉ５Ｋ変異、単一Ｍ３６０Ｉ変異、二重Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉ変異、又は野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭのいずれかでＣＯＤＭを発現する細胞による生体変換中に時間の関数として産生されるモルヒネの収率。モルヒネを、２時間が経過するまで１５分毎にアッセイした。データは、３つの独立した複製の平均±標準偏差である。

【0223】

材料及び方法
化学物質及び試薬
抗生物質、分析グレードグリセロール、イソプロピル β－Ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、塩化ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム、グルコース、硫酸鉄七水和物、ＨＰＬＣグレードアセトニトリル、メタノール、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン（ＤＣＭ）、及び酢酸を、Ｍｅｒｃｋ（ＵＳＡ）から購入した。制限酵素、Ｐｈｕｓｉｏｎ Ｈｉｇｈ Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙ、Ｅ．ｃｏｌｉ ５－アルファコンピテントセル、及びＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ 株誘導体）を、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ Ｉｎｃ．、ＵＳＡから購入した。培地調製用の酵母抽出物及びトリプトンを、Ｏｘｉｏｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＫから購入した。全ての実験で使用する水を、比抵抗が１８．２ＭΩ．ｃｍ以上になるまで精製した。テバイン、オリパビン、コデイン、及びモルヒネを、Ｓｕｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ．から得た。

【0224】

プラスミド及び染色
本研究で使用したプラスミドを、表１に列挙し、プライマー及び合成配列を、表２及び３に列挙した。合成ｇＢｌｏｃｋ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株での発現用にコドンが最適化され、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、ＵＳＡ）に注文した。ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ ＨｉＦｉ ＤＮＡ Ａｓｓｅｍｂｌｙによるアセンブリのための十分なベクター相同性（約２０ｂｐ）をｇＢｌｏｃｋに設計し、構築物の作製を高速化した。Ｔ７ポリメラーゼ発現ベクターｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰ（Ｍｅｒｃｋ、ＵＳＡ）を使用して、目的の遺伝子の発現を制御した。各オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を、Ｎ末端で、６つのヒスチジンタグ（６Ｈ）及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）に融合した。加えて、ＯＲＦは、Ｔ７プロモーター及びＴ７ターミネーターの転写制御下であった。Ｅ．ｃｏｌｉ ５－アルファコンピテントセルをプラスミドのクローニング及び維持に使用し、Ｅ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを生体内変換及びタンパク質発現に使用した。構築した構築物を、プライマーＵＭ１３／ＵＭ０３（表２を参照）を使用して配列決定（Ａｕｓｔｒａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）により検証した。

【0225】

Ｅ．ｃｏｌｉコドン使用法を採用したＣＯＤＭ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ：Ｄ４Ｎ５０２）（比較しやすいように、ここではＷＴ ＣＯＤＭと呼ぶ）発現プラスミドｐＧＷＫＳ１００は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを使用して１．１ｋｂ ＣＯＤＭ ｇＢｌｏｃｋ（ＵＭｇ４）をＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩで線形化したｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰ骨格に組み込むことによって作製した。

【0226】

いくつかの発現ベクター（ｐＧＷＫＳ１０１、１１９～１２６、表１を参照）を、同じ手順を使用して作製し、野生型残基を、ＰＣＲ増幅によって適切な残基で置換し（表２を参照）、次いでＮＥＢｕｉｌｄｅｒを使用して線形化ｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰ発現ベクターにクローニングした。例えば、内因性ＣＯＤＭ Ｅ２５９Ｋバリアント（ＮＣＢＩ参照配列：ＸＰ＿０２６４１６２３４．１）の発現ベクターｐＧＷＫＳ１０１を構築するために、ＣＯＤＭ ＷＴアイソフォーム内に存在するグルタミン酸（Ｅ）残基を、ＰＣＲ増幅（ＵＭ１５／ＵＭ０５及びＵＭ０６／ＵＭ１８）によりリジン（Ｋ）残基で置換し、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒを介して２つの断片を線形化ｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰに組み込んだ。

【0227】

残りの発現ベクター（ｐＧＷＳＫ１２７～１２９、１３１～１４６）（表１を参照）は、それぞれの１．１ ｋｂ ＯＲＦ ｇＢｌｏｃｋ（ＵＭｇ８－２６）（表３を参照）をＮＥＢｕｉｌｄｅｒを使用して線形化されたｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰ骨格に組み込むことによって作製した。

【0228】

細胞培養及びタンパク質発現
細胞を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を補充した溶原培養培地（０．５％酵母抽出物、１％トリプトン、及び１％ＮａＣｌ）中で３７℃で一晩培養した。１ｍＬの一晩細胞培養物を、カナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）及び１ｍＬのグリセロールを補充した５０ｍＬの２－ＹＴ培地（１％酵母抽出物、１．６％トリプトン、及び０．５％ＮａＣｌ）を含む三角フラスコに接種した。タンパク質発現は、ＯＤ６００（６００ｎｍで測定される光学密度）が０．４～０．８に達し、１８℃で２２時間継続したときにＩＰＴＧ添加（０．１ ｍＭ）によって誘導された。タンパク質発現後、３，０００ｇで１５分間遠心分離することにより細胞ペレットを収集し、生体内変換のためにＯＤ６００が１００になるまで１５％グリセロールに再懸濁した。

【0229】

全細胞生体内変換
生体変換を、２０ｍＬ体積で行い、示されたアルカロイド（１ｍＭのテバイン、１ｍＭのコデイン、又はテバインの粗製ケシ抽出物）、１００ｍＭのリン酸緩衝液（ｐＨ６．０）、０．５％ｗ／ｗのグルコース、１０μＭの硫酸鉄（ＩＩ）（ＦｅＳＯ_４）、及び１０ｍＭのアスコルビン酸ナトリウム、並びに１０のＯＤ６００のＥ．ｃｏｌｉ細胞からなる。反応を２４℃で２２０ｒｐｍで振盪しながら行った。試料を、異なる時間間隔で定期的に採取した。採取した試料を、１６，０００ｇで７分間遠心分離し、上清を、アルカロイド定量化のために液体クロマトグラフィー－質量分析計により分析した。ＣＯＤＭ変異生体内変換については３回、テバイン粗抽出物生体内変換については２回の独立した複製を実施した。

【0230】

タンパク質発現分析
タンパク質発現によって産生される可溶性タンパク質を、製造元によって提供されるＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）プロトコルを使用したＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって決定した。簡潔に述べると、可溶性タンパク質画分を、ベンゾナーゼを含有するＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬（２５単位／ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬）（Ｍｅｒｃｋ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に再懸濁することによって、ＯＤ６００が１である、凍結細胞ペレットから遊離した。次いで、不溶性細胞片及び可溶性タンパク質含有上清を、１６，０００ｇで２０分間及び４℃で遠心分離することによって分離した。可溶性タンパク質画分を、プレキャストＢｏｌｔ ８％ Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ Ｐｌｕｓ Ｇｅｌｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＵＳＡ）上でＭＯＰＳランニング緩衝液中で、１２０Ｖで６０分間実行した。タンパク質のサイズを、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓ ｐｒｏｔｅｉｎ（商標）Ｋａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ（商標）Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｎｄａｒｄ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して推定した。Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェア（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＵＳＡ）を使用して、バンド強度（バックグラウンド強度が低く、７５ｋＤａの分子量バンドに対して正規化された）を計算した。可溶性タンパク質発現を、ＣＯＤＭ変異アッセイの独立した各複製について決定した。

【0231】

粗製ケシ抽出物の調製
抽出方法の最適化は、教科書「Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（Ｍ Ｒｏｓｔａｇｎｏ ａｎｄ Ｊ Ｐｒａｄｏ編集，ＲＳＣ出版（２０１３），ＩＳＢＮ ９７８ １ ８４９７３ ６０６ ０）に見出すことができる。抽出物は、天然産物抽出の技術分野で精通している者によって調製され、抽出物は、０℃～１００℃の温度で、適切な酸性又はアルカリ性試薬を使用してｐＨ（ｐＨ２～ｐＨ１４）に調整された、水性及び／又は炭化水素系液体系を含み得る。

【0232】

アルカロイドのＬＣ－ＭＳ分析
アルカロイドの定量は、Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬＣＭＳ－２０２０液体クロマトグラフ質量分析計を使用して実施した。分析を、０～２０％緩衝液Ｂの直線勾配で、流速を２８℃で１０分間かけて１ｍＬ／分から２．５ ｍＬ／分に増加させて、Ｏｎｙｘ Ｍｏｎｏｌｉｔｈｉｃ Ｃ１８ カラム（１００×４．６ｍｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ａｕｓｔｒａｌｉａ Ｐｔｙ Ｌｔｄ）上で実施した［緩衝液Ａ：水中０．１％ＴＦＡ、緩衝液Ｂ：アセトニトリル中０．１％のＴＦＡ］。検出器の波長を２８５ｎｍに設定し、参照波長を３６０ｎｍに設定した。生体内変換試料中のアルカロイド化合物は、保持時間［モルヒネ４．３分、コデイン６．９分、オリパビン７．５分、及びテバイン１０．１分］及び質量電荷比（ｍ／ｚ）［モルヒネ２８６、コデイン３００、オリパビン２９８、及びテバイン３１２］の両方を参照して、アルカロイド標準と比較することによって同定した。Ｓｈｉｍａｄｚｕ ＬａｂＳｏｌｕｔｉｏｎｓソフトウェアを使用して、２５μｇ／ｍＬ～５００μｇ／ｍＬの範囲の濃度のアルカロイド標準系列のピーク面積を参照して、各化合物のピーク面積を積分して、各試料のアルカロイドの濃度を定量した。分析のために、試料を５μＬの注入量でＬＣ－ＭＳに注入した。

【0233】

実施例１
純粋なテバインと比較した、生体内変換基質としてのテバイン粗製ケシ抽出物の適合性を、２４時間にわたって評価した。０．２ｇ／Ｌテバイン及び０．５ｇ／Ｌテバインに相当する２つの濃度のテバイン粗抽出物をアッセイした。粗抽出物を、純粋なテバインの代わりに反応混合物に加え、他の全ての成分を一定に維持した。図４に見られるように、テバイン粗製抽出物は、反応の進行の変化を最小限に抑えながら純粋なテバインを置き換えることができる。更に、いくつかの濃度のテバイン粗抽出物を生体内変換基質として使用して、より高濃度のオリパビンを産生することができる。

【0234】

実施例２
ＣＯＤＭの２５９番目のアミノ酸残基（Ｅ２５９Ｋ、－Ｄ、－Ｈ、－Ｑ、－Ａ、－Ｓ、及び－Ｇ）に変異を含む７個の株を生成し、ＣＯＤＭの２６０番目の残基（Ｒ２６０Ｔ及び－Ｋ）に変異を含む２個の株を生成した。ＣＯＤＭの２５９番目及び２６０番目の残基（Ｅ２５９Ｇ＋Ｒ２６０Ｔ、Ｅ２５９Ｄ＋Ｒ２６０Ｋ、及びＥ２５９Ｇ＋Ｒ２６０Ｋ）の両方に変異を含む３個の二重変異株を作製した。ＣＯＤＭ変異株の性能は、図２～３に示すように、生体内変換を介して評価し、モルヒネ収率は３０分後にアッセイし、オリパビン収率は４時間後にアッセイした。図２～３に示すように、これらの条件下での可溶性タンパク質の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によってアッセイした。

【0235】

調査した７個の２５９残基変異株のうち、Ｅ２５９Ｄ及びＥ２５９Ｇ変異体のみが、生成物収率の改善を示し、野生型（ＷＴ）ＣＯＤＭと比較して、モルヒネ収率が、それぞれ約３０％及び約２４％、並びにオリパビン収率がそれぞれ約３８％及び約２７％改善された。更に、これらの変異は、ＷＴ ＣＯＤＭと比較して、約２．１倍以上の可溶性Ｅ２５９Ｄ、及び約１．５倍以上の可溶性Ｅ２５９Ｇが産生されることを伴って、可溶性タンパク質の発現量を改善するようであった。比較すると、Ｅ２５９Ｋ、－Ｈ、－Ｑ、－Ａ、及び－Ｓ ＣＯＤＭ変異体による生体内変換は、図２～３に示すように、可溶性タンパク質発現の発現の低減と一致して、ＷＴ ＣＯＤＭと比較して少なくとも２０％の産物収率の低減をもたらす。

【0236】

Ｒ２６０Ｔ発現株は、ＷＴ ＣＯＤＭよりもモルヒネが約２８％少なく、オリパビンが約２９％少なく、可溶性タンパク質が約６３％少なくなり、図３を参照されたい。比較すると、Ｒ２６０Ｋ発現株は、ＷＴ ＣＯＤＭ株と同様のレベルの両方の産物を産生し、ＷＴ ＣＯＤＭ株と同様の量の可溶性タンパク質を産生し、図３を参照されたい。

【0237】

Ｅ２５９Ｇ変異の組み込みにより、Ｅ２５９Ｇ＋Ｒ２６０Ｔ二重変異株におけるＲ２６０Ｔ変異の性能が回復し、ＷＴ ＣＯＤＭ株への同様のレベルの変換が生成された（図３）。比較すると、Ｅ２５９Ｄ＋Ｒ２６０Ｋ、及びＥ２５９Ｇ＋Ｒ２６０Ｋ二重変異株の性能は、ＷＴ ＣＯＤＭ染色と比較して改善され、Ｅ２５９Ｄ及びＥ２５９Ｇ単一変異株と同等の性能及びタンパク質発現レベルを有した（図３）。

【0238】

実施例３
ＷＴ ＣＯＤＭの３番目、４番目、５番目、７番目、３５７番目、又は３６０番目の残基のいずれかに単一のアミノ酸変異：Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｉ７Ｍ、Ｙ３５７Ｓ、又はＭ３６０Ｉを含む６個の株を作製した。以下の変異の組み合わせを用いて、３個の追加の株を生成した：１）Ｔ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｍ、２）Ｙ３５７Ｓ＋Ｍ３６０Ｉ、及び３）Ｔ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｍ＋Ｙ３５７Ｓ＋Ｍ３６０Ｉ。ＣＯＤＭ変異株の性能は、図５Ａに示すように、生体内変換を介して評価し、モルヒネ収率は３０分後にアッセイし、オリパビン収率は４時間後にアッセイした。図５Ｂに示すように、これらの条件下での可溶性タンパク質の発現をＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によってアッセイした。

【0239】

調査した６個の単一変異株のうち、Ｉ５Ｋ株及びＭ３６０Ｉ株の両方が、生成物収率の改善を示し、ＷＴ ＣＯＤＭ株と比較して、モルヒネ収率はそれぞれ約５８％及び約２９％、オリパビン収率はそれぞれ約７９％及び約３３％改善された（図５Ａ）。Ｉ５Ｋ変異は、ＷＴ ＣＯＤＭよりも約２．９倍多く可溶性タンパク質の発現量を改善するようであったが、Ｍ３６０Ｉ株では、ＷＴ ＣＯＤＭと比較して、タンパク質発現のわずかな変化のみが観察された（図５Ｂ）。

【0240】

４個の他の単一変異株（Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｉ７Ｍ、又はＹ３５７Ｓ）は、ＷＴ ＣＯＤＭ株と比較して、産物収率（例えば、Ｔ３Ｋ又はＰ４Ａ）のわずかな改善、又は産物収率の少なくとも約２２％（例えば、Ｉ７Ｍ又はＹ３５７Ｓ）の低減のいずれかをもたらした。これは、タンパク質発現のレベルにおけるわずかな変化（例えば、Ｔ３Ｋ、Ｐ４Ａ、Ｙ３５７Ｓ、又はＩ７Ｍ）と一致した（図５Ｂ）。

【0241】

組み合わせた変異体を含む３個の株は全て、ＷＴ ＣＯＤＭ株と比較して、２個の所望の産物のうちの少なくとも１個について生体内変換収率が低かった。これは、３個の株全てのタンパク質発現レベルの増加と一致し、これは、Ｔ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｋ株（約３．２倍）及びＴ３Ｋ＋Ｐ４Ａ＋Ｉ５Ｋ＋Ｉ７Ｍ＋Ｙ３５７Ｓ＋Ｍ３６０Ｉ株（約４倍）で最も顕著であった。

【0242】

実施例４
Ｐ４Ａ、Ｉ５Ｋ、Ｅ２５９Ｇ、及びＭ３６０変異の様々な組み合わせを含む６個の追加の株を生成し、これらの有益な変異が、修飾ＣＯＤＭ酵素の可溶性タンパク質発現の収率及びレベルに与える影響を評価した。本事例では、図６Ａに示すように、モルヒネ産生は１５分後（実施例３では３０分と比較）に測定し、オリパビンは２時間後（実施例３では４時間と比較）に測定した。これは、これらの変異体に対する反応速度の加速によるものであった。

【0243】

６個の株全てが、生体内変換によるモルヒネ及びオリパビンの両方の産生、並びにＷＴ ＣＯＤＭと比較して検出された可溶性タンパク質発現のレベルに対する収率の改善を示した（図６Ａ及びＢ）。Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉ変異の両方を含む株は、全ての変異株で最も高い収率を産生し、ＷＴ ＣＯＤＭ株と比較して、モルヒネ収率が２．３倍、オリパビン収量が２．７６倍増加し（図６Ａ）、ＷＴ ＣＯＤＭと比較して、可溶性タンパク質が約５．５倍増加した（図６Ｂ）。

【0244】

実施例５
単一変異Ｉ５Ｋ又はＭ３６０Ｉ、又は二重変異Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉを含む株の性能を、テバイン又はコデインの脱メチル化反応全体の時間経過にわたってＷＴ ＣＯＤＭと比較した。オリパビンを、最初の９時間の間は１時間毎にアッセイし、その後は２４時間が経過するまで３時間毎にアッセイした。より速いコデイン脱メチル化反応を、２時間にわたって１５分毎にモルヒネを測定することによって評価した。

【0245】

Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉ二重変異を含む株は、基質としてテバインを用いて最も速い生体内変換を実施し、約５時間後にオリパビンに対するテバインの収率が約９５％に達した（図７Ａ）。単一変異を有する株も、ＷＴ ＣＯＤＭを有する株よりも速く実施された。生物変換反応は、ＷＴ ＣＯＤＭ株の少なくとも１２時間前に、３個の変異株全てについて、完全な変換に近づいた。

【0246】

２個の株は、コデインを基質として同様の速い生体内変換速度を示し、単一変異Ｉ５Ｋ又は二重変異Ｉ５Ｋ＋Ｍ３６０Ｉを含み、１時間後に約９４％のモルヒネの収率を達成し、ＷＴ ＣＯＤＭ対照よりもより速かった（図７Ｂ）。単一変異体Ｍ３６０Ｉは、ＷＴ ＣＯＤＭ対照よりも速かったが、他の２個の変異株ほど速くはなかった。全ての３個の変異体は、２時間でほぼ完全な変換を達成した。

【0247】

全ての株をｐＥＴ２４ｂ－６Ｈ－ＭＢＰで作製した

【表1】

【0248】

ｐＧＷＫＳ１３４は、ｐＧＷＫＳ１００プラスミド内のＷＴ ＣＯＤＭ酵素と同一のタンパク質をコードするが、２番目（ＧＡＧ→ＧＡＡ）、６番目（ＴＴＧ→ＣＴＧ）、及び１１８番目（ＣＧＣ→ＣＧＴ）のコドンで使用されるコドンのみが異なる。ｐＧＷＫＳ１２７－１２９及びｐＧＷＫＳ１３５－１４５は、ｐＧＷＫＳ１３４と同等のコドン使用を含み、ｐＧＷＫＳ１３４株をこれらのアッセイにおける対照ＷＴ ＣＯＤＭとして使用した。この対照を、対照ＷＴ ＣＯＤＭとしてｐＧＷＫＳ１００株を使用した、実施例１～３ではなく、実施例４～６に記載の実験に使用した。

【表2】

【0249】

「Δ」プライマーは汎用であるため、全ての断片１及び２の増幅に対してそれぞれ上部プライマー（ＵＭ１５）及び下部プライマー（ＵＭ１８）を使用した。

【0250】

Ｒ２６０Ｋ、Ｅ２５９Ｄ＋Ｒ２６０Ｋ、及びＥ２５９Ｇ＋Ｒ２６０Ｋ発現プラスミドは、ＰＣＲ変異誘導を介してではなく合成配列を使用して作製した。材料及び方法のセクションを参照されたい。

【0251】

クローニングに使用した合成配列はＵＭｇＸで示され、ＩＤＴに注文し、Ｅ．ｃｏｌｉ Ｂ株での発現のためにコドン最適化されている。
相同性領域
ＣＣＴＧＡＡＡＧＡＣＧＣＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＴＣＣ及びＣＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＴＧＣＴＡ

【0252】

及び他の同様の配列は、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ組み立てを促進するために各合成配列の上流及び下流にそれぞれ含まれており、本発明によるタンパク質をコードする核酸分子に関しては任意である。

【表3】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【配列表】

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【国際調査報告】