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特表2024-507287ＲＮＡウイルス感染の処置のためのＤＨＯＤＨ阻害性ＮＥＵＲＯＬＡＥＮＡ葉に基づく治療組成物
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-16
(54)【発明の名称】ＲＮＡウイルス感染の処置のためのＤＨＯＤＨ阻害性ＮＥＵＲＯＬＡＥＮＡ葉に基づく治療組成物
(51)【国際特許分類】
A61K 36/28 20060101AFI20240208BHJP
A61P 31/14 20060101ALI20240208BHJP
【ＦＩ】
A61K36/28
A61P31/14
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023572055
(86)(22)【出願日】2022-02-09
(85)【翻訳文提出日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 EP2022053144
(87)【国際公開番号】W WO2022171682
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】2101262
(32)【優先日】2021-02-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(31)【優先権主張番号】2200066
(32)【優先日】2022-01-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523303404
【氏名又は名称】フィトボカズ
【氏名又は名称原語表記】ＰＨＹＴＯＢＯＫＡＺ
(74)【代理人】
【識別番号】100080447
【弁理士】
【氏名又は名称】太田 恵一
(72)【発明者】
【氏名】ジョゼフ，アンリ
【テーマコード（参考）】
4C088
【Ｆターム（参考）】
4C088AB26
4C088AC05
4C088BA10
4C088CA08
4C088CA11
4C088MA17
4C088MA23
4C088MA35
4C088MA52
4C088NA14
4C088ZB33
(57)【要約】
ヒトジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）を阻害する薬物としての使用のための「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属及び「ｌｏｂａｔａ」種の植物の葉抽出物のマザーチンキを含む治療組成物が開示される。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＲＮＡゲノムウイルスのウイルス感染の処置においてヒトジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）を阻害する薬物として使用するための、「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属及び「ｌｏｂａｔａ」種の植物の葉抽出物のマザーチンキを含む治療組成物であって、前記ＲＮＡゲノムウイルスが、以下のリスト：－コロナウイルス科のウイルス、
－Ｃ型肝炎の原因であるウイルス、黄熱病の原因であるウイルス又はフラビウイルス科のジカウイルス、
－トガウイルス科のチクングニアの原因であるウイルス
のウイルスから選択されることを特徴とする、治療組成物。
【請求項2】
前記ＲＮＡゲノムウイルスが、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスであることを特徴とする、請求項１に記載の治療組成物。
【請求項3】
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキの乾燥抽出物を調製するための方法であって、ｉ）５０°のサトウキビアルコール中のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の混合物を調製する工程であり、前記混合物が１５～２０ｇ／Ｌの質量濃度を有する工程、
ｉｉ）前記混合物を撹拌下で約２１日間浸軟させる工程、
ｉｉｉ）浸軟後、混合物を多孔度５０～７５μｍの「カートリッジ」上で濾過し、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉のマザーチンキに相当する液体濾液及び固体残余分を得る工程、
ｉｖ）水溶液を添加することによって前記液体マザーチンキを１／４に希釈し、このようにして水性アルコール溶液を得る工程、
ｖ）水溶液が得られるまで、この溶液に含まれるアルコールをロータリーエバポレーターによって蒸発させる工程、
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を固化し、次いで凍結乾燥して、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキの乾燥抽出物を得る工程
を含むことを特徴とする、方法。
【請求項4】
工程ｉ）で調製された混合物が、５０°のサトウキビアルコール１リットル（Ｌ）当たり１６～１７ｇ、好ましくは１６ｇ／Ｌに等しいＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉に含まれる質量濃度を有することを特徴とする、先行する請求項に記載のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキから乾燥抽出物を調製する方法。
【請求項5】
工程ｉｖ）の間に、０．７５Ｌに等しい体積の濾液と２．２５Ｌに等しい体積の水を混合することによって前記マザーチンキを希釈することを特徴とする、請求項３又は請求項４に記載のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキから乾燥抽出物を調製する方法。
【請求項6】
請求項３～５のいずれか一項に記載の方法によって得られたＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の凍結乾燥希釈マザーチンキの乾燥抽出物から液体溶液を調製する方法であって、前記液体溶液が、前記乾燥抽出物を水又は薬学的に許容される水性溶媒に希釈することによって得られ、前記液体溶液が、水性溶媒１ｍＬ当たり６，５００～２０，０００ｎｇ、好ましくは６，６６７～２０，０００ｎｇ／ｍＬの乾燥抽出物の濃度を有することを特徴とする、方法。
【請求項7】
Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス感染の処置におけるその使用のためのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキ抽出物、特にマザーチンキの１／４に希釈され、凍結乾燥されたマザーチンキ抽出物であって、溶液中にあり、６，５００～２０，０００ｎｇ／ｍＬの最終濃度（希釈されたマザーチンキの凍結乾燥された乾燥抽出物の質量／水溶液の体積）を有する、希釈されたマザーチンキ抽出物。
【請求項8】
Ｃｏｖｉｄ １９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる重篤な形態のウイルス感染の処置において、サイトカイン、特にＩＬ－６及びＩＰ－１０の産生を減少させる医薬として使用するための、先行する請求項に記載のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ葉のマザーチンキ抽出物。【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【0001】
ＲＮＡゲノムウイルスは、例えば、インフルエンザ、デング熱、Ｃ型肝炎、はしか、乳児気管支炎、又はより最近ではＣｏｖｉｄ－１９コロナウイルスなどの多数のヒト病態の原因である。
【0002】
ＲＮＡゲノムウイルスに対する従来の治療手段は、ウイルスサイクルにおける必須ウイルスタンパク質の活性を標的とすることからなる。このような必須タンパク質は、特に、ＲＮＡポリメラーゼ、インテグラーゼ、ヘリカーゼ又はプロテアーゼからなり得る。しかし、これらのウイルスタンパク質は、いくつかのＲＮＡゲノムウイルスにおいて保存され得るが、異なるウイルスに対して活性な広域スペクトル治療分子の開発は、比較的限られたままである。
【0003】
更に、ウイルスゲノムの可塑性、並びにＲＮＡゲノムウイルスの適応及び変化する能力は、エスケープ変異体の迅速な出現を促進する。これらの変異体は、ウイルスのサイクルに必須のウイルスタンパク質を標的とする広域スペクトル治療分子による処置を無効にする。
【0004】
治療標的変異のこれらの問題を克服するために、ウイルス自体ではなく宿主細胞を標的とする新規の治療アプローチが近年開発されている。この新規のアプローチの原理は、ＲＮＡゲノムウイルスに感染した細胞における自然免疫応答を刺激することによってウイルス増殖を防止するために、ウイルス複製に必須の細胞機構を遮断することである。
【0005】
ウイルス複製に必須の既知の細胞機構の１つは、ピリミジン生合成サイクルである。実際、ピリミジンは、特にヒト細胞が病原体の宿主細胞、特にＲＮＡゲノムウイルスの宿主細胞である場合に、ヒト細胞の生存にとって重要である。
【0006】
より詳細には、哺乳動物及びヒト細胞において、ピリミジンの合成は、２つの生合成経路：「デノボピリミジン経路」、及び特定の生理学的条件下で行われる別の「サルベージ経路」によって行われる。ほとんどのヒト寄生虫は、ピリミジンを合成するための「サルベージ経路」を有していない。しかしながら、ピリミジンはピリミジンヌクレオチドの製造に必要である。これらのピリミジンヌクレオチドは、細胞生存及び細胞増殖に必須である。したがって、「デノボピリミジン経路」の遮断は、ヒト宿主及びその正常な細胞機能に影響を及ぼすことなく、ヒト寄生虫を選択的に標的化するのに有効な治療手段であると考えられる。
【0007】
言い換えれば、ＲＮＡゲノムウイルスを含む全てのヒト病原体は、ピリミジン生合成のための「サルベージ経路」が欠損している。したがって、宿主細胞の「デノボピリミジン経路」は、これらの病原体を排除するための、特に宿主細胞におけるＲＮＡウイルスの複製を防止するための治療における標的経路である。
【0008】
デノボピリミジン生合成経路は、いくつかの連続工程で行われる合成経路である。この経路及びその様々な工程は、添付図面の図１に示されている。
【0009】
より詳細には、デノボピリミジン生合成経路の第４の工程は、オロト酸「ＯＲＯ」の形成をもたらす「ＤＨＯ」と呼ばれるジヒドロオロト酸の脱水素からなる。
【0010】
ジヒドロオロト酸の脱水素反応を触媒する酸化還元酵素型の酵素は、「ＤＨＯＤＨ」としても知られるジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼである。
【0011】
ＤＨＯのＯＲＯへの脱水素中、２つの補因子の間に電子移動が存在し、その一方は電子供与体であり、他方は電子受容体である。例えば、ジヒドロオロト酸のこの脱水素反応中の電子移動は、フラビンモノヌクレオチド酸化還元対ＦＭＮ／ＦＭＮＨ２とユビキノン対ＱＨ２／Ｑ又はニコチンアミドアデニン対ＮＡＤ＋／ＮＡＤＨによって行われる。ＤＨＯＤＨは、ユビキノンと共にそのＦＭＮ補因子に結合して、ジヒドロオロト酸のオロト酸への酸化を触媒する。
【0012】
ピリミジンのデノボ生合成経路は、ＵＭＰとも呼ばれるウリジン５－一リン酸の合成を確実にする。ＵＭＰは、他のピリミジンヌクレオチドの前駆体として働く。これらのヌクレオチドは、細胞分裂及びＲＮＡゲノムウイルスに感染した宿主細胞の代謝活性に必要かつ必須である。したがって、宿主細胞のＤＨＯＤＨを阻害すると、感染細胞中のピリミジンの量が減少し、それにより抗ウイルス自然免疫応答が増幅されることが実証されている。
【0013】
既知の方法で、ＤＨＯＤＨ酵素は、クラス１のＤＨＯＤＨ及びクラス２のＤＨＯＤＨの２つの群に分けられる。これらの２つのクラスのＤＨＯＤＨは、それらの配列類似性、それらの結合部位、それらの細胞位置及びそれらの好ましい基質に応じて確立される。
【0014】
ＤＨＯＤＨクラス１は、原生動物型の病原体に存在する細胞質酵素である。
【0015】
ＤＨＯＤＨクラス２は、真核生物ミトコンドリアの内膜に結合する単量体タンパク質型酵素である。
【0016】
言い換えれば、ヒトでは、ＤＨＯＤＨはクラス２に属し、ミトコンドリア内膜の外表面に位置するミトコンドリアタンパク質である。ヒトＤＨＯＤＨは、活性部位を含有するアルファ／ベータバレルドメイン及びアルファヘリックスドメインからなる２つのドメインを有する。後者は、活性部位につながるトンネルの開口部を形成する。
【0017】
現在までに、ブレキナール、テリフルノミド又はレフルノミドなどのヒトＤＨＯＤＨのいくつかの公知の阻害剤が存在する。
【0018】
例えば、レフルノミドは、関節リウマチ又は多発性硬化症を処置するために使用される。レフルノミドの免疫抑制効果は、Ｔ細胞に対するピリミジンの付加の枯渇、又はより複雑なインターフェロン若しくはインターロイキン媒介経路に起因していた。レフルノミドによるヒトＤＨＯＤＨの阻害は、ＤＨＯＤＨの活性部位につながるトンネルの開口部を形成するアルファヘリックスドメインへのレフルノミドの結合によるものである。レフルノミドは、医薬中の活性成分として市販されているが、患者の１％～１０％において副作用、特に下痢、悪心、嘔吐、アフタ、腹痛、結腸の炎症、頭痛、腱の炎症、自然脱毛の増強、湿疹、乾燥肌、トランスアミナーゼの増加、又は白血球数の低下をもたらす。
【0019】
ブレキナールによるヒトＤＨＯＤＨの阻害は、活性部位に至るトンネルの開口部を考慮して、レフルノミドと同じ機構によって行われる。ブレキナールは、１９８０年代後半に抗癌処置として使用された。それにもかかわらず、複数の望ましくない副作用の原因であるため、医薬として受け入れられていない。更に、ブレキナールは、ヒト細胞に対して非常に毒性であると認識されている。その結果、ウイルス感染に対抗するための治療においてブレキナールを使用するという発想は、医学界によって非常に早く放棄された。
【0020】
したがって、ＲＮＡゲノムウイルスによるウイルス感染に関連する病態の発症の場合、ＤＨＯＤＨの公知の阻害剤は、特にそれらの副作用及び細胞に対する細胞毒性効果のために、細胞の種類を区別することなく、患者のウイルス症状を処置するのに不適切であると思われる。
【0021】
これが、ウイルス感染、特にＲＮＡウイルスによる感染の場合に、ＤＨＯＤＨの公知の阻害剤、例えばブレキナール、テリフルノミド又はレフルノミドに対する代替的な解決策を見出すことが望ましい理由である。この代替的な解決策は、ＤＨＯＤＨの酵素活性の阻害によってデノボピリミジン経路を防止することに加えて、全てのヒト細胞に対して非細胞毒性であり、医薬として服用された場合に最小限の副作用を有することが望ましい。
【0022】
更に、現在の状況では、ほとんどの患者は、医薬の起源及び設計様式に注意を払っている。一般に、患者は、医薬中の合成成分の割合を最小限にすることを望む。これらの合成成分は、活性成分と同様に副作用の原因となり得る。結果として、ヒトＤＨＯＤＨを阻害することに加えて、本発明の目的はまた、ＲＮＡウイルス感染及び関連する症状を処置しながら副作用を制限するために、可能な限り天然起源であり、簡素な設計であり、カーボンフットプリントが少ないＤＨＯＤＨ阻害剤を見出すことからなる。
【発明の概要】
【0023】
本発明の目的は、ヒトジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）を阻害する薬物として使用するための「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属、この場合「ｌｏｂａｔａ」に属する植物の葉抽出物のマザーチンキを含む治療組成物を提案することにより、先行技術の欠点を克服することである。
【0024】
この治療組成物は、ＤＨＯＤＨの活性を阻害する活性成分として、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの当該マザーチンキを有するという利点を有する。このマザーチンキは、有利には、工業規模で安価に容易かつ迅速に調製することができる。更に、本発明の治療組成物の当該マザーチンキは、有利には天然起源、すなわち非合成であるが、文献ではｉｎ ｖｉｖｏで非細胞毒性であると認識されている。
【0025】
結果として、当該治療組成物は、天然及び非細胞毒性起源のその活性成分に関連する副作用をほとんど又は全く有さない。患者による摂取後、本発明の当該治療組成物は、細胞毒性効果を有することなくＤＨＯＤＨの活性を阻害する。当該マザーチンキを含む当該治療組成物の設定は、免疫系が病原体又は任意の他の疾患によって弱まっている患者における自然免疫応答の増加をもたらす。
【0026】
更に、本発明の他の特徴によれば、当該治療組成物は、ＲＮＡゲノムウイルスのウイルス感染に関連する症状の処置における医薬として使用するためのものである。
【0027】
ＤＨＯＤＨの活性を阻害し、デノボピリミジン合成経路を妨げる特性を有するＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａのマザーチンキを含む当該治療組成物は、ＲＮＡウイルス、特に陽性ＲＮＡによるウイルス感染の場合に適している。
【0028】
実際に、ＲＮＡウイルスは「ピリミジンサルベージ経路」を欠損している。ＲＮＡウイルスは、その感染機構のために、細胞複製機構に必要な、言い換えればウイルス増殖に必要なピリミジンを合成するために宿主の「デノボ経路」を使用しなければならない。したがって、宿主細胞のデノボ経路の阻害は、細胞複製、すなわちＲＮＡウイルスのウイルス複製を防止する。これが、ＲＮＡゲノムウイルスのウイルス感染に関連する症状を処置するための医薬としての本発明の当該治療組成物の使用が適切である理由である。
【0029】
好ましい実施形態によれば、本発明の治療組成物は、以下のリスト：コロナウイルス科、フラビウイルス科、オルトミクソウイルス科、又はトガウイルス科のウイルス科から選択されるＲＮＡゲノムウイルスのウイルス感染に関連する症状の処置における薬物として使用される。
【0030】
最も優先的には、本発明はまた、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキの乾燥抽出物を調製する方法であって、
ｉ）５０°のサトウキビアルコール中のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の混合物を調製する工程であり、当該混合物が１５～２０ｇ／Ｌの質量濃度を有する工程、
ｉｉ）当該混合物を撹拌下で約２１日間浸軟させる工程、
ｉｉｉ）浸軟後、混合物を多孔度５０～７５μｍの「カートリッジ」上で濾過し、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉のマザーチンキに相当する液体濾液及び固体残余分を得る工程、
ｉｖ）水溶液を添加することによって当該液体マザーチンキを１／４に希釈し、このようにして水性アルコール溶液を得る工程、
ｖ）水溶液が得られるまで、この溶液に含まれるアルコールをロータリーエバポレーターによって蒸発させる工程、
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を固化し、次いで凍結乾燥して、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキの乾燥抽出物を得る工程を含むことを特徴とする方法に関する。
ｉ）５０°のサトウキビアルコール中のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の混合物を調製する工程であり、当該混合物が１５～２０ｇ／Ｌの質量濃度を有する工程、
ｉｉ）当該混合物を撹拌下で約２１日間浸軟させる工程、
ｉｉｉ）浸軟後、混合物を多孔度５０～７５μｍの「カートリッジ」上で濾過し、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉のマザーチンキに相当する液体濾液及び固体残余分を得る工程、
ｉｖ）水溶液を添加することによって当該液体マザーチンキを１／４に希釈し、このようにして水性アルコール溶液を得る工程、
ｖ）水溶液が得られるまで、この溶液に含まれるアルコールをロータリーエバポレーターによって蒸発させる工程、
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を固化し、次いで凍結乾燥して、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキの乾燥抽出物を得る工程を含むことを特徴とする方法に関する。
【0031】
有利には、工程ｉ）で調製された混合物は、５０°のサトウキビアルコール１リットル（Ｌ）当たり１６～１７ｇ、好ましくは１６ｇ／Ｌに等しいＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の質量濃度を有する。
【0032】
最も優先的には、工程ｉｖ）の間に、当該マザーチンキは、０．７５Ｌに等しい体積の濾液と２．２５Ｌに等しい体積の水を混合することによって希釈される。
【0033】
本発明はまた、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の凍結乾燥希釈マザーチンキの乾燥抽出物から液体溶液を調製する方法であって、当該乾燥抽出物が上記の方法に従って得られ、当該液体溶液が、当該乾燥抽出物を水又は薬学的に許容される水性溶媒に希釈することによって得られ、当該液体溶液が水性溶媒１ｍＬ当たり乾燥抽出物６，５００～２０，０００ｎｇ、好ましくは６，６６７～２０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度を有する方法に関する。
【0034】
本出願において、薬学的に許容される溶媒は、医薬組成物の調製において使用することができ、非毒性であり、獣医学的使用並びにヒトの薬学的使用のために生物学的に許容されるという特徴を有する溶媒を意味すると理解される。
【0035】
本出願はまた、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス感染の処置におけるその使用のためのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の希釈されたマザーチンキ抽出物、特にマザーチンキの１／４に希釈され、凍結乾燥されたマザーチンキ抽出物であって、溶液中にあり、６，５００～２０，０００ｎｇ／ｍＬ（希釈されたマザーチンキの凍結乾燥された乾燥抽出物の質量／水溶液の体積）の最終濃度を有する希釈されたマザーチンキ抽出物に関する。
【0036】
上記のように希釈されたＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの当該乾燥葉マザーチンキ抽出物は、上記の方法に従って得ることができる。
【0037】
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ葉のマザーチンキ抽出物は、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる重篤な形態のウイルス感染の処置において、サイトカイン、特にＩＬ－６及びＩＰ－１０の産生の減少における薬物としての使用に特に適応される。
【図面の簡単な説明】
【0038】
本発明の他の特徴及び利点は、添付の図面を参照して、本発明の非限定的な実施形態の以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図1】図１は、ヒト細胞におけるデノボピリミジンの合成経路の工程を概略的に示し、その第４の工程は、脱水素反応、すなわち、ジヒドロオロト酸「ＤＨＯ」をオロト酸ＯＲＯに変換するジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ酵素「ＤＨＯＤＨ」の作用からなる。
【発明を実施するための形態】
【0039】
本発明は、ヒトジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ（ＤＨＯＤＨ）を阻害する薬物としての使用のための、「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属、この場合「ｌｏｂａｔａ」に属する植物の葉抽出物のマザーチンキを含む治療組成物に関する。
【0040】
図１は、いくつかの工程を含むピリミジンを合成するためのデノボ経路を概略的に示し、工程４は、ヒトジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ「ＤＨＯＤＨ」の作用を含む。
【0041】
ピリミジンを合成するためのデノボ経路において、ピリミジン核の前駆体は、グルタミン、アスパラギン酸及びＣＯ２である。図１に見ることができるように、第１の工程では、カルバミルリン酸がカルバミルリン酸合成酵素によって形成される。第２の工程では、アスパラギン酸トランスカルバモイラーゼがカルバミルアスパラギン酸の形成を触媒する。後者は、第３の工程で、ジヒドロオロターゼによってジヒドロオロト酸「ＤＨＯ」に変換される。次いで、第４の工程では、ジヒドロオロト酸デヒドロゲナーゼ「ＤＨＯＤＨ」が「ＤＨＯ」のオロト酸「ＯＲＯ」への変換を触媒し、これがウリジン一リン酸「ＵＭＰ」を得るための反応前駆体として使用される。ＵＭＰは、細胞増殖に必要なＲＮＡとの重合機構において有用である。
【0042】
本発明によれば、「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属、この場合「ｌｏｂａｔａ」に属する植物の葉抽出物のマザーチンキは、有利には天然起源のものである。実際、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａは、アンティル諸島及び中央アメリカ、特にグアドループに見出されるキク科に属する植物である。これらの土地では、農業生態学的条件及び土壌気候条件が好ましいため、この植物は容易に栽培及び収穫される。
【0043】
したがって、その天然起源により、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの抽出物の使用は、有利には疾患を処置するための治療組成物内でのその使用中の副作用のリスクを低減することを可能にする。
【0044】
加えて、この発想を強化するために、いくつかの科学的研究及び刊行物が、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの抽出物がｉｎ ｖｉｖｏでいかなる毒性も有さないことを実証している（Ｇｒａｃｉｏｓｏ Ｊ．Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１９９８，５０：１４２５－１４２９；Ｇｒａｃｉｏｓｏ Ｊ．Ｓ．ら、Ｐｈｙｔｏｍｅｄｅｃｉｎｅ、２０００年、第７巻（４）、２８３～２８９頁）。特に、マウスにおいて、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの苗条のヒドロ－アルコール抽出物５０００ｍｇ／ｋｇの用量を経口経路によって摂取した後、数日後に生理的毒性は観察されなかった。
【0045】
結果として、その天然起源に加えて、ＤＨＯＤＨの活性を阻害することを目的とする治療組成物の活性成分としてのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの抽出物の選択は、有利には選択された濃度で、全てのヒト細胞、特に免疫応答に関与する細胞に対して非細胞毒性であるという本発明の目的に合致する。
【0046】
本発明によれば、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉抽出物の当該マザーチンキは、ヒドロアルコール溶液からなる。
【0047】
好ましい実施形態によれば、マザーチンキは、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉のみの抽出物から生成される。
【0048】
本発明によれば、当該治療組成物は、経口摂取用の剤形である。例えば、当該治療組成物は、液体形態、例えばシロップの形態、又は固体形態、例えば錠剤の形態である。
【0049】
本発明によれば、当該治療組成物は、活性成分として、ＤＨＯＤＨの活性に対して阻害効果を有するＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの当該マザーチンキ、及びその投与製剤化を可能にする他の賦形剤を含む。これらの賦形剤と当該マザーチンキとの間に存在し得る相互作用は、ＤＨＯＤＨの阻害効果に影響を及ぼさず、影響を与えない。
【0050】
好ましくは、本発明の当該治療組成物は、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの当該マザーチンキを含む製剤中にある場合、ほとんど又は全く副作用を生じない天然起源の賦形剤のみを含む。
【0051】
好ましい実施形態によれば、当該治療組成物は、ウイルス感染に関連する症状の処置における薬物として使用される。
【0052】
より具体的には、本発明の当該治療組成物は、以下のリスト：コロナウイルス科、フラビウイルス科、又はトガウイルス科のウイルス科から選択されるＲＮＡゲノムウイルスによる感染に関連する症状の処置における薬物として使用される。
－コロナウイルス科のうち、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が言及され、
－フラビウイルス科のうち、その唯一の代表がＣ型肝炎の原因であるウイルスであるヘパシウイルス属、及びフラビウイルス属において、黄熱病の原因であるウイルス又はジカウイルスが言及され、
－トガウイルス科のうち、チクングニアの原因であるウイルスが言及される。
－コロナウイルス科のうち、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が言及され、
－フラビウイルス科のうち、その唯一の代表がＣ型肝炎の原因であるウイルスであるヘパシウイルス属、及びフラビウイルス属において、黄熱病の原因であるウイルス又はジカウイルスが言及され、
－トガウイルス科のうち、チクングニアの原因であるウイルスが言及される。
【0053】
実際、宿主内でのそれらのウイルス複製のために、ＲＮＡウイルスは、宿主細胞のピリミジンを合成するためのデノボ経路が機能的であることを必要とする。これらのウイルスはピリミジン合成経路を欠いている。しかし、この細胞経路がＤＨＯＤＨの活性を阻害する本発明の治療組成物の使用によって遮断される場合、宿主細胞はデノボ経路とピリミジン合成サルベージ経路の両方を欠くため、宿主細胞内でのＲＮＡウイルスのウイルス複製はもはや不可能である。
【0054】
図２は、ＲＮＡゲノムウイルスに感染したヒト細胞におけるＤＨＯＤＨの阻害に対する本発明の組成物の作用機構を示す。本発明の組成物のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉抽出物のマザーチンキのために、ミトコンドリアにおいてＤＨＯＤＨによって行われる脱水素反応は起こらない。ピリミジンの合成のためのデノボ経路は遮断され、それを欠くウイルスはサルベージ経路を使用することができない。ヌクレオチドのＵＭＰ及びピリミジン塩基は、ウイルス複製を開始するためにＲＮＡウイルスによって使用することができない。
【0055】
その結果、ウイルスＲＮＡゲノムを当該宿主細胞内に導入した後であっても、宿主細胞によってビリオンを製造することができない。ＤＨＯＤＨの阻害は、ＲＮＡゲノムウイルスのウイルス増殖を防止し、宿主の細胞膜の外側でのビリオンの産生及び排出を防止する。したがって、ＤＨＯＤＨの活性を阻害する作用を有する本発明の組成物の使用は、ウイルス増殖及び生物内の病原体の存在に関連する症状の発症を防止する。したがって、本発明の組成物は、特にＲＮＡゲノムによるウイルス感染を処置するのに有効な治療手段を構成する。
【0056】
結果として、ＲＮＡゲノムウイルスによる感染に関連する症状の処置における薬物としての本発明の治療組成物の使用は、感染に対抗し、ウイルス増殖を制限するための解決策からなる。
【0057】
本発明の治療組成物は、ＤＨＯＤＨの阻害を標的とするウイルス疾患を処置するための既存の解決策に対する良好な代替物である。この特定の使用は、デノボピリミジン合成経路を阻害することによって宿主細胞内のウイルス複製を防止することを可能にし、一方で防御細胞による免疫応答を増加させ、細胞毒性効果を伴わない。
【0058】
したがって、本発明の治療組成物は、病原体に対する免疫応答に関与する細胞に侵襲的及び破壊的であることなくＤＨＯＤＨを阻害すること、すなわちＲＮＡウイルスの複製に必要なピリミジンのデノボ合成経路を遮断することを可能にする代替的な解決策からなる。
【0059】
本発明の治療組成物はまた、製造が容易である一方で、それを使用する消費者及び患者から見て可能な限り自然であるという利点を有する。
【0060】
以下の実験の結果は、本発明の治療組成物によるＤＨＯＤＨを阻害する効果を示すことを意図する。
【0061】
以下に詳述するｉｎ ｖｉｔｒｏで得られた実験の他の結果は、特に、特にＣｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによるウイルス感染によって引き起こされる重篤な形態に対する本発明の治療組成物の作用を示す。
【0062】
実際、これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスによる感染後に細胞によって放出される特定のサイトカインの量の減少に対する、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉抽出物のマザーチンキを含む本発明の治療組成物の特に興味深い作用を実証する。
【0063】
サイトカインは、病原体による感染後の免疫応答を媒介するために免疫細胞によって天然に合成されるタンパク質である。それらは、感染した生物が病原体に対して防御することを可能にする天然の炎症反応を促進する。
【0064】
しかし、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の特定の場合において、特に肺細胞におけるサイトカインの放出は非常に重要であるため、「サイトカインストーム」を誘発する。この免疫系の暴走は、組織を破壊するか、生理学的悪化を引き起こす可能性がある急性呼吸窮迫症候群を引き起こすか、あるいはこの反応が誘発された人にとって致死的になる傾向がある過剰炎症反応を引き起こす。
【0065】
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキを含む本発明による治療組成物に対してｉｎ ｖｉｔｒｏで行われた以下に示す試験の結果は、サイトカイン産生が当該組成物の作用によって実質的に減少され得ることを実証する。
【0066】
ここでＤＨＯＤＨの作用の阻害に関する試験の結果に戻ると、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキを含む本発明の治療組成物に対して試験を行った。
【0067】
このマザーチンキは、試験される試料を構成する。基質に対するＤＨＯＤＨの作用の阻害の測定は、透明な壁を有する従来のマルチウェルプレートで行われる。ウェルは、試験される試料、ＤＨＯＤＨ及びその基質を含む。
【0068】
試料によるＤＨＯＤＨの阻害を評価するために、「ＯＤ」と呼ばれる光学密度のパラメータが使用される。実際、各ウェルにおいて、「ＯＤ」は６００ｎｍの波長で、いくつかの時間間隔で５分間の持続時間にわたって測定される。
【0069】
より具体的には、各ウェルは、希釈又は非希釈試料、ＤＨＯＤＨの酵素、及び試験緩衝液中に希釈されたその比色基質を含む。当該比色基質は、ＤＨＯＤＨの作用によってＯＲＯに変換され得るＤＨＯを含む。
【0070】
経時的に、酵素ＤＨＯＤＨによる比色基質ＤＨＯの消費は、ＯＤの低減をもたらす。この減少は、ＤＨＯＤＨの活性による着色ＤＨＯの無着色ＯＲＯへの変換を示す。言い換えれば、ＤＨＯが消費され、ＤＨＯＤＨの活性によってＯＲＯに還元され、これが測定されるＯＤの変化を引き起こす。
【0071】
試料によってＤＨＯＤＨの活性が阻害されると、ＯＤは経時的に安定なままである。実際、阻害された場合、比色ＤＨＯ基質はＤＨＯＤＨによってＯＲＯに変換されず、したがってＯＤは最初のＤＨＯのＯＤのままである。
【0072】
実験を行うために、以下のものを使用した：
－「ヒト組換えＤＨＯＤＨ」を表す「ｒｈ ＤＨＯＤＨ」と呼ばれるクラス１酵素の溶液
－５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＫＣｌ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００からなるｐＨ８の試験緩衝液
－試験緩衝液中に「ＤＨＯ」と呼ばれる２ｍＭのＬ－ジヒドロオロト酸、「Ｑ」と呼ばれる０．２ｍＭのデシルユビキノン、及び「ＤＰＩＰ」と呼ばれる０．１２ｍＭの２，６－ジクロロインドフェノールナトリウム塩水和物を含むＤＨＯＤＨの基質混合物
－「ＤＭＳＯ」と呼ばれるジメチルスルホキシドからなる希釈緩衝液で希釈された、又は希釈されていないＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキ試料。
－「ヒト組換えＤＨＯＤＨ」を表す「ｒｈ ＤＨＯＤＨ」と呼ばれるクラス１酵素の溶液
－５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ ＫＣｌ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００からなるｐＨ８の試験緩衝液
－試験緩衝液中に「ＤＨＯ」と呼ばれる２ｍＭのＬ－ジヒドロオロト酸、「Ｑ」と呼ばれる０．２ｍＭのデシルユビキノン、及び「ＤＰＩＰ」と呼ばれる０．１２ｍＭの２，６－ジクロロインドフェノールナトリウム塩水和物を含むＤＨＯＤＨの基質混合物
－「ＤＭＳＯ」と呼ばれるジメチルスルホキシドからなる希釈緩衝液で希釈された、又は希釈されていないＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキ試料。
【0073】
ＤＨＯＤＨの基質の混合物において、「ＤＨＯ」と呼ばれるＬ－ジヒドロオロト酸は、脱水素反応中にＤＨＯＤＨによって使用される比色基質を構成することに留意すべきである。
【0074】
基質混合物において、「Ｑ」と呼ばれるデシルユビキノン及び「ＤＰＩＰ」と呼ばれるジクロロインドフェノールナトリウム塩水和物は、電子受容体及び供与体である。これらの電子の移動は、酸化還元酵素ＤＨＯＤＨによる脱水素反応を行うことを可能にする。
【0075】
試料Ｈ１を構成するＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキの調製：
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のＨ１マザーチンキは、以下の方法工程を実行することによって得られる：
・Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉を収穫する、
・当該葉を乾燥させる、
・当該乾燥葉を粉末が得られるまで粉砕する、
・粉末をサトウキビアルコール溶液中で２１日間、浸軟物が得られるまで浸軟し、量の割合は、サトウキビアルコール溶液６２．５ｍＬ毎に粉末１ｇである、
・Ｈ１と呼ばれる濾液が得られるまで当該浸軟物を濾過する。
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のＨ１マザーチンキは、以下の方法工程を実行することによって得られる：
・Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉を収穫する、
・当該葉を乾燥させる、
・当該乾燥葉を粉末が得られるまで粉砕する、
・粉末をサトウキビアルコール溶液中で２１日間、浸軟物が得られるまで浸軟し、量の割合は、サトウキビアルコール溶液６２．５ｍＬ毎に粉末１ｇである、
・Ｈ１と呼ばれる濾液が得られるまで当該浸軟物を濾過する。
【0076】
上述の方法において、好ましい実施形態によれば、葉は、６～９、好ましくは６．５～９％程度の残留含水量を有するまで、好ましくは４０℃未満の温度でおよそ１２０時間、熱気流中で乾燥させることができる。
【0077】
含水量は、当業者に公知の任意の適切な方法によって決定される。例えば、含水量は、４０℃未満の温度を有し、８５％未満の相対湿度比を有する部屋に設置されたデシケータを使用して、太陽光線、気流又は振動に直接曝露することなく決定することができる。
【0078】
例えば、高分解能で１ｍｇの標準精度、及び１℃刻みで３０℃～２３０℃の範囲の温度範囲を有するフランスのＰＲＥＣＩＳＡ ＭＯＬＥＮによって市販されている製品コードＸＭ６０のデシケータを、葉の残留含水量を測定するために使用することができる。
【0079】
好ましくは、上記プロトコルにおいて、粉末は、サトウキビアルコール溶液中で、２５℃～３０℃、好ましくは３０℃の温度でおよそ２１日間、毎日１２時間ゆっくり撹拌しながら浸軟される。
【0080】
試料Ｈ２を構成するＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉抽出物のマザーチンキの調製
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉抽出物のＨ２マザーチンキは、以下の方法工程を実行することによって得られる：
－Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉を収穫する、
－当該葉を乾燥させる、
－１００ｇの乾燥葉を１Ｌの純粋なエタノール溶液中で７日間、浸軟物が得られるまで浸軟する、
－当該浸軟物を、濾液が得られるまでセライト上で濾過する、
－当該濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。
Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉抽出物のＨ２マザーチンキは、以下の方法工程を実行することによって得られる：
－Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉を収穫する、
－当該葉を乾燥させる、
－１００ｇの乾燥葉を１Ｌの純粋なエタノール溶液中で７日間、浸軟物が得られるまで浸軟する、
－当該浸軟物を、濾液が得られるまでセライト上で濾過する、
－当該濾液をロータリーエバポレーターによって濃縮する。
【0081】
当該濃縮濾液は、試料Ｈ２が得られるまで、特にシュレンクラインを使用して加圧下で乾燥される。
【0082】
本発明の組成物によるＤＨＯＤＨの阻害を分析するためのプロトコル。
本発明の治療組成物によるＤＨＯＤＨの阻害を検証するために、それぞれＨ１及びＨ２と呼ばれる２つのストック溶液を調製した。
本発明の治療組成物によるＤＨＯＤＨの阻害を検証するために、それぞれＨ１及びＨ２と呼ばれる２つのストック溶液を調製した。
【0083】
母液Ｈ１は、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ植物の葉を収穫した後、上述の方法を実施することによって得られる。
【0084】
Ｈ２ストック溶液は、前述の方法を実施することによって得られる。
【0085】
ＤＨＯＤＨの阻害に対する試料の影響を試験し、「用量応答効果」を把握するために、各試料Ｈ１及びＨ２をＤＭＳＯ緩衝液中に希釈した。
【0086】
Ｈ１及びＨ２試料の希釈により、以下の濃度を得ることが可能になった：試料のμｇ／ウェル中の全溶液のｍＬ単位で：以下の表１及び表２に示される０．０１μｇ／ｍＬ；０．１μｇ／ｍＬ；１μｇ／ｍＬ；１０μｇ／ｍＬ；１００μｇ／ｍＬ；１０００μｇ／ｍＬ。
【0087】
プロトコルを開始するために、試料Ｈ１又はＨ２の各希釈物を、ウェル内のｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素及び基質の混合物の存在下に置いた。Ｈ１又はＨ２の試料濃度について測定されたＯＤの平均を得るために、Ｈ１及びＨ２の希釈濃度のそれぞれについて三連測定を行った。
【0088】
より具体的には、以下の結果を得るために、プロトコルの以下の工程を実施した：
－Ｈ１又はＨ２試料の希釈物を含む各ウェルに、同日に調製したｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素を試験緩衝液中で添加する。
－酵素及び試料を互いの存在下で３７℃で６分間放置する、
－次いで、５０μＬの上述の着色基質混合物を添加し、これが時間０からなり、
－ＯＤを６００ｎｍで、５５秒毎の規則的な間隔で２７５秒間直ちに読み取ることにより、各ウェル中で測定する。
－Ｈ１又はＨ２試料の希釈物を含む各ウェルに、同日に調製したｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素を試験緩衝液中で添加する。
－酵素及び試料を互いの存在下で３７℃で６分間放置する、
－次いで、５０μＬの上述の着色基質混合物を添加し、これが時間０からなり、
－ＯＤを６００ｎｍで、５５秒毎の規則的な間隔で２７５秒間直ちに読み取ることにより、各ウェル中で測定する。
【0089】
各ウェルに添加される酵素の量は同じである。プロトコルでは、０．０６μｇのｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素／ウェル中の全溶液のｍＬの濃度を有するように、酵素をウェルに添加する。
【0090】
以下の表１は、試料Ｈ１について得られた結果を示す。
【0091】
【表1】
【0092】
表１において、第１列は、６００ｎｍにおけるＯＤの測定値取得時間間隔を示す。言い換えれば、これは、基質混合物の存在下での試料Ｈ１とｒｈ ＤＨＯＤＨとの接触時間に対応する。
【0093】
表１において、２行目は、ウェル中の試料Ｈ１の濃度を示す。この濃度は、試料Ｈ１のμｇ／ウェル中の全溶液のｍＬで表される。
【0094】
表１の各列は、同じ試料濃度のＨ１について、並びにｒｈ ＤＨＯＤＨ及びその基質との規定の接触時間についての三連測定の６００ｎｍで測定された平均ＯＤ値を示す。
【0095】
例えば、表１に見られるように、０．１μｇ／ｍＬの濃度の試料Ｈ１、ｒｈ ＤＨＯＤＨ、及び着色基質の混合物の間の１１０秒間の接触後、同一容量の３つのウェルで測定されたＯＤの平均値は０．３１５である。
【0096】
表１の記号Δの行は、試料Ｈ１、ｒｈ ＤＨＯＤＨ及びその基質の間の存在０秒で測定されたＯＤの平均値と、存在２７５秒で測定された平均ＯＤ値との間の差を示す。
【0097】
記号Δは、存在０秒と２７５秒との間のＯＤの減少、すなわち、ＤＨＯＤＨの有効活性によってＤＨＯをＯＲＯに変換する能力を表す。
【0098】
表１において、最後の２行は、Ｈ１の各試料濃度について、ｒｈ ＤＨＯＤＨの活性による着色ＤＨＯのＯＲＯへの変換の活性のパーセンテージ、並びに試料Ｈ１によるｒｈ ＤＨＯＤＨの活性の阻害のパーセンテージを示す。
【0099】
活性％は、所与の試料濃度のＨ１（続いてＨ２）について、以下のように計算される：
活性％＝（ΔＨ１×１００）／陰性対照のΔ。
例えば、０．０１μｇ／ｍＬまでの試料Ｈ１の場合：活性％＝（０．０９２×１００）／０．２０８＝４４．２３１。
活性％＝（ΔＨ１×１００）／陰性対照のΔ。
例えば、０．０１μｇ／ｍＬまでの試料Ｈ１の場合：活性％＝（０．０９２×１００）／０．２０８＝４４．２３１。
【0100】
阻害％は、以下の式によって計算される：１００－活性％の値。
【0101】
実験中にそのＤＨＯ基質を形質転換するｒｈ ＤＨＯＤＨの有効活性を検証するために、陰性対照を二連で行った。この陰性対照は、その基質に対するＤＨＯＤＨの活性を検証し、試料の活性％及び阻害％を決定するために必須である。
【0102】
陰性対照の列は、秒単位の様々な測定間隔で６００ｎｍで測定された平均ＯＤ値を示す。
【0103】
陰性対照は、０．０６μｇ／ウェル中の全溶液のｍＬの濃度で表１において「Ｅ」と示されるｒｈ ＤＨＯＤＨと、「Ｓ」と示される着色基質の混合物５０μＬと、試料Ｈ１の代替として「Ｔ」と示されるＤＭＳＯ緩衝液の溶液のみを含有する。
【0104】
結果は、０～２７５秒の間に、６００ｎｍで測定されたＯＤの平均値が減少することを示す。
【0105】
その結果、着色基質ＤＨＯは、酵素ｒｈ ＤＨＯＤＨによる還元活性により、実際にＯＲＯに変換される。酵素ｒｈ ＤＨＯＤＨは、基質混合物に関して実際に機能的である。また、ＤＭＳＯ緩衝液もＤＨＯ基質が希釈された試験緩衝液も、酵素ｒｈ ＤＨＯＤＨによる脱水素活性に影響を及ぼさない。
【0106】
表１に見ることができるように、本発明の試料Ｈ１は、その基質に対するＤＨＯＤＨの活性を阻害する。試験した全てのＨ１濃度について、阻害パーセンテージは５１％～５６％である。また、試験した濃度では、試料Ｈ１の濃度の増加は、ＤＨＯＤＨの活性に対する阻害パーセンテージの値の増加と同義ではないことが見出される。
【0107】
同じプロトコル及び同じＯＤ測定により、試料Ｈ２の阻害パーセンテージを定量することが可能になった。
【0108】
以下の表２は、試料Ｈ２の様々な試験濃度について得られた結果を示す。
【0109】
【表2】
【0110】
表２から見ることができるように、本発明の試料Ｈ２は、ＤＨＯＤＨの活性を阻害する。
【0111】
試験した全てのＨ２濃度について、阻害パーセンテージは４８％～６７％である。
【0112】
試料Ｈ１とは異なり、用量応答効果があるように思われる。実際、１０００μｇ／ｍＬの濃度では、阻害パーセンテージは０．０１μｇ／ｍＬの濃度の場合よりも有意に高いように思われる。
【0113】
言い換えれば、酵素の存在下で試料Ｈ２の濃度が増加すると、阻害パーセンテージが増加する。試験体Ｈ２は、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ葉抽出物調製プロトコルが試料Ｈ１と異なる。したがって、ｒｈ ＤＨＯＤＨの阻害活性の原因である要素は葉に集中しており、葉のマザーチンキの調製の様式に応じて阻害活性は異なるように思われる。
【0114】
図３～５は、所与の濃度のＨ１、Ｈ２又はブレキナールの試料について、経時的に６００ｎｍで測定した光学密度の傾向を示す。
【0115】
図３の曲線は、０．０１μｇ／ウェル中のｍＬの総濃度の試料についての、経時的な６００ｎｍでのＯＤ値の測定を示す。
【0116】
【0117】
いずれの場合も、試料の濃度にかかわらず、ＤＨＯＤＨの既知の阻害剤であるブレキナールについては、６００ｎｍでのＯＤが経時的に実質的に安定なままであることに留意すべきである。したがって、ブレキナールはＤＨＯＤＨの阻害剤である。
【0118】
試料Ｈ１及びＨ２について、６００ｎｍで測定されたＯＤの低減が観察される。この減少はｒｈ ＤＨＯＤＨの活性と同義である。しかし、各試料について、ＯＤの低減は、接触して１１０秒から明らかであることが分かる。
【0119】
０～１１０秒では、６００ｎｍで測定されたＯＤはかなり安定している。この観察は、ＤＨＯＤＨ酵素が直ちに活性ではないことを意味するように思われる。最初の１１０秒において、ＤＨＯＤＨは、試料Ｈ１又はＨ２の存在下にある場合、脱水素反応を行わないか、又はほとんど行わない。したがって、試料Ｈ１及びＨ２は、その基質に関してＤＨＯＤＨ活性の開始を遅らせるように思われる。
【0120】
酵素ｒｈ ＤＨＯＤＨのその基質を還元する活性を有効に検証するために、陽性対照も二連で行った。陽性対照ウェルは、希釈試料Ｈ１又はＨ２の代替として、ＤＨＯＤＨの活性の既知の阻害剤であるブレキナールを含む。
【0121】
試料のＯＤ測定と並行して、ＤＭＳＯ緩衝液で希釈したブレキナールの溶液のＯＤをｒｈ ＤＨＯＤＨ及びその基質の存在下で測定した。
【0122】
試料と同様にして、ｒｈ ＤＨＯＤＨの阻害に対する異なる濃度のブレキナール溶液の作用を測定した。
【0123】
その基質に対するｒｈ ＤＨＯＤＨの活性を検証するために、ブレキナールによるＤＨＯＤＨの阻害を測定するためのプロトコルと並行して陽性対照を三連で行う。陽性対照ウェルは、「Ｅ」と呼ばれるｒｈ ＤＨＯＤＨ、及び「Ｔ」と呼ばれる基質のその混合物、並びにブレキナールの代わりに「Ｔ」と呼ばれるＤＭＳＯ緩衝液を含む。
【0124】
以下の表３は、種々の試験濃度のブレキナール試料について得られた結果を示す。
【0125】
【表3】
【0126】
表３では、その基質を変換するｒｈ ＤＨＯＤＨの活性を陽性対照によって検証する。実際、経時的に、６００ｎｍで測定されるＯＤの低減が効果的に観察される。この減少は、ｒｈ ＤＨＯＤＨの脱水素活性による、ＤＨＯのＯＲＯへの変換をもたらす。ＤＭＳＯ緩衝液も試験緩衝液もｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素の活性に影響を与えない。したがって、ｒｈ ＤＨＯＤＨ酵素は、ブレキナールによるＤＨＯＤＨの阻害を測定するためのこのプロトコルにおいて機能的である。
【0127】
表３は、試験した種々の濃度のブレキナールが、９２％～１００％のｒｈ ＤＨＯＤＨの阻害活性を示すことを示す。
【0128】
試料Ｈ１及びＨ２の阻害活性を強調するために、図６は、ＤＨＯＤＨとその基質を２７５秒接触させた後の、それらの濃度の関数としての互いに対する試料Ｈ１及びＨ２の阻害パーセンテージの曲線を示す。
【0129】
図６では、０．０１～１０００μｇ／ｍＬの範囲の濃度で、Ｈ１は比較的安定したｒｈ ＤＨＯＤＨの阻害パーセンテージを有することが注目される。
【0130】
対照的に、Ｈ２は、１００μｇ／ｍＬを超える濃度で、その阻害パーセンテージが有意に増加する。特に、１０００μｇのＨ２／ウェル中の総溶液のｍＬの濃度では、ｒｈ ＤＨＯＤＨの阻害パーセンテージは有利には６６．３％に達する。
【0131】
同様に、図７は、ＤＨＯＤＨ及びその基質と２７５秒接触した後の、それらの濃度の関数としてのＨ１、Ｈ２及びブレキナール試料の阻害パーセンテージの変化を示す。試料Ｈ１及びＨ２は、ブレキナールと同様に、基質に対するＤＨＯＤＨの活性の阻害剤であることに留意されたい。実際、試料Ｈ１及びＨ２によるＤＨＯＤＨの阻害は１００％ではなく、ブレキナールほど有効ではないが、存在する。
【0132】
したがって、得られた結果に関して、天然起源のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａ Ｈ１及びＨ２のマザーチンキの試料は、実際に、そして有意に、ＤＨＯＤＨ酵素に対する阻害活性を有する。
【0133】
したがって、「Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ」属、この場合は「ｌｏｂａｔａ」に属する植物の葉抽出物のマザーチンキを含む本発明の治療組成物は、ＤＨＯＤＨの活性を阻害する効果を有する。
【0134】
結果として、これらの試料のいずれかを含む治療組成物、すなわちＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉ベースのマザーチンキは、その治療標的がＤＨＯＤＨの不活化である疾患を処置するための有望な非毒性の天然生成物である。
【0135】
特に、本発明の治療組成物は、ウイルス病原体、特にＲＮＡゲノムウイルスによる感染から生じる疾患を処置するための考えられる経路である。
【0136】
また、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験を行って、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａのマザーチンキベースの治療組成物の抗ウイルス及び殺ウイルス効果を実証し、更に特定のサイトカインの放出に対する阻害効果を決定した。
【0137】
試験される試料の調製：
これらの試験を行うために、いくつかの試料を植物Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉から調製した。
これらの試験を行うために、いくつかの試料を植物Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉から調製した。
【0138】
試料を「ＴＯＴＵＭ」と示す。
【0139】
「ＴＯＴＵＭ ３」は、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉から得られるマザーチンキに相当する。以下の方法で調製した：
ｉ）質量３．６ｋｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉を体積２２５Ｌの５０°のサトウキビアルコールと混合し、これはサトウキビアルコール１リットル当たり１６ｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の質量濃度に相当する。より一般的には、５０°のサトウキビアルコール１リットル当たり１５～２０ｇ／Ｌ、好ましくは１６～１７ｇ／Ｌ、より好ましくは１６ｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉に等しい質量濃度を有する混合物を調製する。
優先的には、上述の試料Ｈ１の調製に関して、葉は、それらが６～７％程度の残留含水量を有するまで、好ましくは４０℃未満の温度で、およそ１２０時間熱気流下で乾燥され得る。含水量は、Ｈ１の場合と同様に決定することもできる。
ｉｉ）混合物を、毎日１２時間ゆっくりと撹拌しながら、３０℃程度の温度でおよそ２１日間撹拌しながら放置して浸軟させる。
ｉｉｉ）浸軟後、混合物を、５０～７５μｍの多孔度を有する「カートリッジ」又は濾過ポケットで濾過し、濾液及び残余分を得る。
ｉｖ）体積３Ｌの濾液を収集する
ｖ）その中に含まれるアルコールを、水溶液がおよそ１Ｌに等しい体積を有するまで、ロータリーエバポレーターによって３つの期間で蒸発させる。
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を凍結し、次いで凍結乾燥する。
ｉ）質量３．６ｋｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉を体積２２５Ｌの５０°のサトウキビアルコールと混合し、これはサトウキビアルコール１リットル当たり１６ｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉の質量濃度に相当する。より一般的には、５０°のサトウキビアルコール１リットル当たり１５～２０ｇ／Ｌ、好ましくは１６～１７ｇ／Ｌ、より好ましくは１６ｇのＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉に等しい質量濃度を有する混合物を調製する。
優先的には、上述の試料Ｈ１の調製に関して、葉は、それらが６～７％程度の残留含水量を有するまで、好ましくは４０℃未満の温度で、およそ１２０時間熱気流下で乾燥され得る。含水量は、Ｈ１の場合と同様に決定することもできる。
ｉｉ）混合物を、毎日１２時間ゆっくりと撹拌しながら、３０℃程度の温度でおよそ２１日間撹拌しながら放置して浸軟させる。
ｉｉｉ）浸軟後、混合物を、５０～７５μｍの多孔度を有する「カートリッジ」又は濾過ポケットで濾過し、濾液及び残余分を得る。
ｉｖ）体積３Ｌの濾液を収集する
ｖ）その中に含まれるアルコールを、水溶液がおよそ１Ｌに等しい体積を有するまで、ロータリーエバポレーターによって３つの期間で蒸発させる。
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を凍結し、次いで凍結乾燥する。
【0140】
最終的に、１２．３ｇに等しい質量を有する凍結乾燥物が得られる。
【0141】
「ＴＯＴＵＭ ４」は、マザーチンキから希釈された試料である。
【0142】
より具体的には、この試料を得るために、以下のＴＯＴＵＭ ３を得るためのプロトコルの工程ｉｖ）において、３Ｌの濾液を収集する代わりに０．７５Ｌの濾液を収集し、これを２．２５Ｌの水に等しい体積で希釈する。次いで、３Ｌに等しい総体積を有するヒドロ－アルコール溶液を得る。一般に、上記工程ｉｉｉ）で得られた液体濾液又はマザーチンキは、１／４に希釈される。
【0143】
次に、ＴＯＴＵＭ ４を得るための以下の工程は、ＴＯＴＵＭ ３を得るために使用され、かつ上述されたものと同様であり、すなわち：
ｖ）好ましくは３Ｌに等しい体積を有するヒドロ－アルコール溶液中に含有されるアルコールを、およそ１Ｌに等しい体積を有し得る水溶液が得られるまで、例えば、３つの期間でロータリーエバポレーターによって蒸発させる。
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を凍結し、次いで凍結乾燥する。
ｖ）好ましくは３Ｌに等しい体積を有するヒドロ－アルコール溶液中に含有されるアルコールを、およそ１Ｌに等しい体積を有し得る水溶液が得られるまで、例えば、３つの期間でロータリーエバポレーターによって蒸発させる。
ｖｉ）このようにして得られた水溶液を凍結し、次いで凍結乾燥する。
【0144】
最後に、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉を（４分の１に）希釈したマザーチンキの乾燥抽出物に相当する、５．６ｇに等しい質量を有する凍結乾燥物を得る。
【0145】
陰性対照として、「ＴＯＴＵＭ ２」と呼ばれる試料を乾燥バナナパルプＭｕｓａ ｓａｐｉｅｎｔｕｍから調製した。
【0146】
より具体的には、この試料を得るために、１５０ｇの乾燥バナナパルプを５０°の５Ｌの容量のサトウキビアルコールで希釈した。
【0147】
混合物を１日２～３時間撹拌しながら約５日間浸軟させた後、多孔度１０～２０μｍの紙で濾過して、４Ｌのヒドロ－アルコール濾液を得る。
【0148】
次いで、濾液を、６ｇに等しい質量を有する乾燥抽出物が得られるまでロータリーエバポレーターによって蒸発させる。
【0149】
ＴＯＴＵＭ２、３及び４によるヒト肺上皮細胞（Ｃａｌｕ－３）及び腎細胞（ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２）の処理中のＣｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルスの増殖の阻害の評価。
これらの試験の運転中に使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス株は、Ｓｌｏｖａｋｉａ／ＳＫ－ＢＭＣ５／２０２０と示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対応する欧州株（Ｄ６１４Ｇにおける元のＷｕｈａｎ株の変異）である。
これらの試験の運転中に使用されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ２ウイルス株は、Ｓｌｏｖａｋｉａ／ＳＫ－ＢＭＣ５／２０２０と示されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２株に対応する欧州株（Ｄ６１４Ｇにおける元のＷｕｈａｎ株の変異）である。
【0150】
ウイルス株は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｖｉｒｕｓ Ａｒｃｈｉｖｅ ｇｏｅｓ Ｇｌｏｂａｌ（Ｅｖａｇ）プラットフォーム（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｅｕｒｏｐｅａｎ－ｖｉｒｕｓ－ａｒｃｈｉｖｅ．ｃｏｍ／）によって提供された。
【0151】
ＳＡＲＳ－Ｃｏｖ２のウイルス株を増幅し、Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２細胞系上でＯｎｃｏｄｅｓｉｇｎによって力価測定した。
【0152】
これらの評価試験では２つの細胞系を使用した：これらは以下の系である：
－Ｃａｌｕ－３、ヒト肺腺癌（ＡＴＣＣ－Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから）；
－Ｖｅｒｏ Ｅ６－ＴＭＰＲＳＳ２、非ヒト霊長類腎臓上皮細胞（ＮＩＢＳＣ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、英国から）。
－Ｃａｌｕ－３、ヒト肺腺癌（ＡＴＣＣ－Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから）；
－Ｖｅｒｏ Ｅ６－ＴＭＰＲＳＳ２、非ヒト霊長類腎臓上皮細胞（ＮＩＢＳＣ－Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｓ、英国から）。
【0153】
Ｃａｌｕ－３細胞モデルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶに関する文献に既に十分に記載されている（Ｃ．－Ｔ．Ｋ．Ｔｓｅｎｇ，Ｊ．Ｔｓｅｎｇ，Ｌ．Ｐｅｒｒｏｎｅ，Ｍ．Ｗｏｒｔｈｙ，Ｖ．Ｐｏｐｏｖ，ａｎｄ Ｃ．Ｊ．Ｐｅｔｅｒｓ，「Ａｐｉｃａｌ ｅｎｔｒｙ ａｎｄ ｒｅｌｅａｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒｅ ａｃｕｔｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｄｒｏｍｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｉｎ ｐｏｌａｒｉｚｅｄ Ｃａｌｕ－３ ｌｕｎｇ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，」Ｊ Ｖｉｒｏｌ，ｖｏｌ．７９，ｎｏ．１５，ｐｐ．９４７０－９４７９，Ａｕｇ．２００５，ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．７９．１５．９４７０－９４７９．２００５を参照されたい）。
【0154】
Ｃａｌｕ－３細胞を、対応する細胞培養培地（ＭＥＭ＋１％ピルビン酸塩＋１％グルタミン＋１０％ウシ胎児血清）中、加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中３７℃で単層培養した。
【0155】
Ｖｅｒｏ Ｅ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞を、対応する細胞培養培地（ＤＭＥＭ＋１％ピルビン酸塩＋抗生物質（ペニシリン、ストレプトマイシン及びジェネティシン）の１％カクテル＋２％ウシ胎児血清）中、加湿雰囲気（５％ＣＯ２、９５％空気）中３７℃で単層培養した。
【0156】
これら２つの細胞系の細胞をプラスチックフラスコ上に付着させる。細胞継代手順のために、トリプシン－ベルセンで２０分間（Ｃａｌｕ系の細胞について）及び５分間（Ｖｅｒｏ系の細胞について）処理することによって細胞を培養瓶から取り出し、完全培養培地を添加することによって中和した。研究のために、細胞を９６ウェルプレート上に置いた。
【0157】
細胞を計数し、Ｖｉ－ｃｅｌｌカウンターを使用してそれらの生存率を評価した。
【0158】
「ＣＡＳ１」と示される第１の系列の試験では、２つの前述の細胞系の細胞を、試験される化合物（特にＴＯＴＵＭ ２、３及び４）と２４時間接触させ、その後ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株に曝露する。この第１の系列「ＣＡＳ１」は、抗ウイルス効果を研究することを可能にし、言い換えれば、細胞を化合物によって処理した後に感染させる。
【0159】
「ＣＡＳ２」と示される第２の系列の試験では、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス株を、ＴＯＴＵＭ２、３及び４を含む試験される種々の化合物と室温で３０分間接触させ、その後細胞をウイルスと接触させる。この第２の系列「ＣＡＳ２」は、殺ウイルス効果を研究することを可能にし、言い換えれば、ウイルスを化合物と接触させた後に細胞と接触させる。
【0160】
細胞系Ｃａｌｕ－３及びＶｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２を用いたＣＡＳ１試験のための試験プロトコル
細胞を計数し、細胞分析装置Ｖｉ－ＣＥＬＬを使用してそれらの生存率を評価した。
細胞を計数し、細胞分析装置Ｖｉ－ＣＥＬＬを使用してそれらの生存率を評価した。
【0161】
細胞をコンフルエンスに到達するまで播種した：
－Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２－３０，０００細胞／ウェル；
－Ｃａｌｕ－３－９０，０００細胞／ウェル。
－Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２－３０，０００細胞／ウェル；
－Ｃａｌｕ－３－９０，０００細胞／ウェル。
【0162】
ＴＯＴＵＭ２、３及び４の凍結乾燥物及び乾燥抽出物から、ストック溶液をＤＭＳＯ中１０ｍｇ／ｍＬで調製する。これらのストック溶液から、７つの濃度の試験化合物を完全増殖培地中で調製し、細胞に添加した：１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２３、４１、１４ｎｇ／ｍＬ。
【0163】
第１の生物学的反復（Ｎ＝１）をこれらの濃度で行った。
【0164】
第２の生物学的反復（Ｎ＝２）を異なる濃度で行った。実際、試験した濃度は、第１の生物学的反復の結果を分析した後に調整した。
【0165】
したがって、反復Ｎ＝２については、以下の濃度を使用した：ＴＯＴＵＭ ３について１０００００、３３３３３、１１１１１、３７０４、１２３５、４１２及び１３７ｎｇ／ｍＬ、並びにＴＯＴＵＭ２及び４について２００００、６６６７、２２２２、７４１、２４７、８２及び２７ｎｇ／ｍＬ。
【0166】
参照対照化合物又は陽性対照として、レムデシビルの活性代謝産物を使用した。７つのレムデシビル濃度（２００００、６６６７、２２２２、７４１、２４７、８２、２７ｎＭ）を調製し、細胞に添加した。
【0167】
レムデシビルの活性代謝産物は、ＤＭＳＯ中２０ｍＭの母液の形態で、Ｏｎｃｏｄｅｓｉｇｎによって提供された。
【0168】
プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。
【0169】
次に、ＭＯＩ（感染多重度）＝０．０１に相当する体積１０μＬのウイルス調製物を添加し、３７℃で、ＶｅｒｏＥ６ ＴＭＰＲＳＳ２細胞については４８時間、Ｃａｌｕ－３細胞については７２時間インキュベートした。
【0170】
上清の画分（５０μＬ）を収集し、－２０℃に等しい温度で保存してウイルス量を決定した。
【0171】
上清の画分（３つのアリコートで約２００μＬ：２×５０μＬ＋残りの体積）を収集し、サイトカインアッセイのために－２０℃に等しい温度で保存した。
【0172】
細胞系Ｃａｌｕ－３及びＶｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２を用いたＣＡＳ２試験のための試験プロトコル
細胞を計数し、細胞分析装置Ｖｉ－ＣＥＬＬを使用してそれらの生存率を評価した。
細胞を計数し、細胞分析装置Ｖｉ－ＣＥＬＬを使用してそれらの生存率を評価した。
【0173】
細胞をコンフルエンスに到達するまで播種した：
－Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２－３５，０００細胞／ウェル；
－Ｃａｌｕ－３－８０，０００細胞／ウェル。
－Ｖｅｒｏ Ｅ６ ＴＭＰＲＳＳ２－３５，０００細胞／ウェル；
－Ｃａｌｕ－３－８０，０００細胞／ウェル。
【0174】
ＴＯＴＵＭ２、３及び４の乾燥凍結乾燥物及び抽出物から、７つの濃度の試験化合物を新鮮な増殖培地中で調製した：１００００、３３３３、１１１１、３７０、１２３、４１、１４ｎｇ／ｍＬ。
【0175】
第１の生物学的反復（Ｎ＝１）をこれらの濃度で行った。
【0176】
ＣＡＳ１と同様に、第２の生物学的反復（Ｎ＝２）を異なる濃度で行った。
【0177】
したがって、反復Ｎ＝２については、以下の濃度を使用した：ＴＯＴＵＭ ３について１０００００、３３３３３、１１１１１、３７０４、１２３５、４１２及び１３７ｎｇ／ｍＬ、並びにＴＯＴＵＭ２及び４について２００００、６６６７、２２２２、７４１、２４７、８２及び２７ｎｇ／ｍＬ。
【0178】
同様に、７つの濃度の参照対照又は陽性対照、レムデシビルの活性代謝産物（２００００、６６６７、２２２２、７４１、２４７、８２、２７ｎＭ）を調製した。
【0179】
ＭＯＩ＝０．０１に相当する体積１０μＬのウイルス調製物を試験化合物と混合し、室温で３０分間インキュベートした。
【0180】
次いで、化合物／ウイルス混合物を細胞に添加した。
【0181】
細胞を、Ｖｅｒｏ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞については３７℃で４８時間、Ｃａｌｕ－３細胞については７２時間インキュベートした。
【0182】
上清の画分（５０μＬ）を収集し、ウイルス量を決定するために－２０℃で保存した。
【0183】
上清の画分（３つのアリコートで約２００μＬ：２×５０μＬ＋残りの体積）を収集し、サイトカインアッセイのために－２０℃で保存した。
【0184】
注記：両方の細胞型に対して試験した化合物の細胞毒性を評価するために、ウイルスを含まないプレートを調製した。細胞生存率を、製造業者の推奨（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７０）に従い、全ての条件についてＣｅｌｌＴｉｔｅｒ Ｇｌｏ試験によって評価した。
【0185】
ＣＡＳ１及びＣＡＳ２については、ＯＲＦ１ａｂウイルス遺伝子を標的とするＲＴｑＰＣＲによるウイルス量の定量を実験の最後に行った。
【0186】
ウイルスＲＮＡの抽出をＭａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ Ｖｉｒａｌ ＲＮＡキットによって行い、ＲＴ－ｑＰＣＲを行うまでＲＮＡを－８０℃で凍結した。
【0187】
ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）Ｏｎ－Ｓｔｅｐ ｑＲＴ－ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍキットを使用して、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的とするプライマー及びｑＲＴ－ＰＣＲ条件を使用して完全なＲＴ－ｑＰＣＲを行った。増幅は、Ｂｉｏ－Ｒａｄ ＣＦＸ３８４（商標）装置及び対応するソフトウェアを用いて行った。
【0188】
また、ＣＡＳ１及びＣＡＳ２について、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率試験又は細胞毒性試験を対照プレート（ウイルスなし）と処理及び感染したプレートの両方で行い、試験される試料の細胞毒性を評価した。
【0189】
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ－Ｇｌｏ（登録商標）発光細胞生存率試験は、代謝的に活性な細胞の指標である、存在するＡＴＰの定量に基づいて培養中の生存細胞の数を決定するための均一な方法である。
【0190】
方法をウイルスの非存在下でＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２及びＣａｌｕ－３細胞に使用して、試験した各化合物の細胞毒性を確立した。
【0191】
方法はまた、細胞変性効果（活性ウイルスの存在）の場合、感染の４８時間後にウイルスの存在下でＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞に使用された。Ｖｅｒｏ細胞モデルにおけるウイルスの存在は、細胞機構の使用後に細胞変性効果をもたらすが、Ｃａｌｕモデルではウイルスが連続的に産生される。
【0192】
試験は、供給者のプロトコルに従って行った。
【0193】
ＰＣＲ反応及びサイトカインアッセイのために全上清を除去した後、１００μＬの新鮮な細胞培地を１００μＬの試薬に添加し、発光が記録されるまで、混合後少なくとも１５分インキュベートする。
【0194】
ＣＡＳ１及び２については、ＭＣＰ１及びＩＰ１０のサイトカイン、より具体的にはＩＬ６の量決定を、Ｖｅｒｏ細胞系及びＣａｌｕ－３についてそれぞれ感染後４８時間及び７２時間で収集した細胞培養上清で、市販のキットを使用してＥＬＩＳＡによって行った。
【0195】
結果：ＴＯＴＵＭ（ウイルスなし）の細胞毒性の評価
ウイルスに曝露されていないＣａｌｕ－３細胞に対する「ＴＯＴＵＭ」試験試料及びレムデシビルの活性代謝産物の毒性を、化合物への曝露の９６時間後に細胞生存率を測定することによって評価した。
ウイルスに曝露されていないＣａｌｕ－３細胞に対する「ＴＯＴＵＭ」試験試料及びレムデシビルの活性代謝産物の毒性を、化合物への曝露の９６時間後に細胞生存率を測定することによって評価した。
【0196】
結果を以下の表に示し、細胞生存率は、細胞系Ｃａｌｕ－３の化合物に曝露した後の未処理細胞に対する％として表され、ＳＤは標準偏差に相当する：
【0197】
【表4】
【0198】
【表5】
【0199】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で類似しており、平均細胞生存率は９１％（２７ｎＭ、Ｎ＝１）～１１６％（２４７ｎＭ及び２００００ｎＭ、Ｎ＝１）の範囲である。
【0200】
生物学的反復Ｎ＝１の間、１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ２、３及び４による処理後の生存率は、レムデシビルの活性代謝産物による処理後に得られた生存率と同様であった。
【0201】
生物学的反復Ｎ＝２の間に、１３７ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の試験濃度について、ＴＯＴＵＭ２及び４で同様の結果が得られた（以下の表を参照されたい）。
【0202】
【表6】
【0203】
【表7】
【0204】
【表8】
【0205】
しかし、１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＴＯＴＵＭ ３で細胞生存率の低減が観察されたことに留意すべきである。
【0206】
ウイルスに曝露されていないＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２細胞に対するＴＯＴＵＭ２、３及び４並びにレムデシビルの活性代謝産物の毒性も、化合物への曝露の７２時間後の細胞生存率を測定することによって評価した。
【0207】
結果を以下の表に示し、細胞生存率は、細胞系Ｖｅｒｏ Ｅ６の化合物に曝露した後の未処理細胞に対する％として表され、ＳＤは標準偏差に対応する。
【0208】
【表9】
【0209】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で類似しており、平均生存率は９２％（２７ｎＭ、Ｎ＝１、表の左上）～１０９％（２０，０００ｎＭ、Ｎ＝２、表の右側）の範囲である。
【0210】
Ｎ＝１の間、１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ２、３及び４による処理後の細胞生存率は、レムデシビルの活性代謝産物による処理後に得られた生存率と同様であった。
【0211】
【表10】
【0212】
Ｎ＝２の間に、１３７ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の試験濃度について、ＴＯＴＵＭ２及び４で同様の結果が得られた。
【0213】
【表11】
【0214】
【表12】
【0215】
更に、ＴＯＴＵＭ ３では、３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で細胞毒性が存在する。
【0216】
結果：ＣＡＳ１－化合物の抗ウイルス効果
これらの試験の目的は、分析されなければならない化合物の抗ウイルス効果を評価することであり、言い換えれば、細胞を化合物で処理した後に感染させる。
これらの試験の目的は、分析されなければならない化合物の抗ウイルス効果を評価することであり、言い換えれば、細胞を化合物で処理した後に感染させる。
【0217】
最初に、細胞系Ｃａｌｕ－３において、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的化することによるウイルスＲＮＡの定量によってウイルス量を評価した。感染細胞対照は参照の１００％である。
【0218】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で同様である。ウイルス量は、化合物の濃度が増加すると減少し、以下を伴う：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの８４％から２，２２２ｎＭ、６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ。
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの８４％から２，２２２ｎＭ、６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ。
【0219】
【表13】
【0220】
－Ｎ＝２において、５５ｎＭのレムデシビルの９２％から４，４４４ｎＭ、１３，３３３ｎＭ及び４０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ。
【0221】
【表14】
【0222】
試験した化合物について、Ｎ＝１の間、ウイルス量は６７％（３７０ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ３）～２８０％（１０，０００ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ２）の範囲であった。
【0223】
【表15】
【0224】
Ｎ＝２の間、７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ ２でＮ＝１と同様の結果が観察された。６，６６７ｎｇ／ｍＬ及び２０，０００ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ４では、５９％及び４９％のウイルス量が観察された。
【0225】
【表16】
【0226】
更に、１００，０００ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ３では、検出不能なウイルス量（０％）が観察された。
【0227】
【表17】
【0228】
３種のサイトカイン（ＩＬ６、ＩＰ１０及びＭＣＰ１）の量決定を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を接種したＣａｌｕ３肺細胞系の細胞培養上清で行った（ｎｇ／ｍＬ単位）。細胞を試験生成物で２４時間処理した後、ウイルス株を７２時間接種した。化合物の濃度は、レムデシビルの活性代謝産物についてはｎＭで、試験されたＴＯＴＵＭについてはｎｇ／ｍＬで示される。
【0229】
ＩＬ６は炎症促進性サイトカインであり、３００ｐｇ／ｍＬの基底量で発現される。感染の場合、その量は２，０００ｐｇ／ｍＬ程度で大幅に増加する。ケモカインＩＰ１０は炎症過程に関与しており、基底量では検出できない。感染の場合、その量は４００ｐｇ／ｍＬ程度で大幅に増加する。
【0230】
サイトカインＭＣＰ１は、行われた研究において検出することができなかった。サイトカインは一過性発現を有する。したがって、アッセイが行われる時点で、Ｖｅｒｏ及びＣａｌｕモデルについて感染後４８時間及び７２時間でそれぞれ単一の読み取り点が行われ、動態読み取りが行われないことを考えると、サイトカインは既に発現されているか、又はその後に発現される。
【0231】
ＩＬ６（以下の表の第１の反復Ｎ＝１については左、第２の反復Ｎ＝２については右）に関して、予想通り、レムデシビルの活性代謝産物について用量応答効果が観察され、化合物の濃度が増加するとサイトカインの濃度が減少した。
【0232】
【表18】
【0233】
ケモカインＩＰ１０（以下の表の反復Ｎ＝１については左、反復Ｎ＝２については右）についても、用量応答効果が観察される。
【0234】
【表19】
【0235】
同様の結果、すなわち用量応答効果が、ＩＬ６のアッセイ中にＮ＝１でＴＯＴＵＭ３及び４について観察されたことに留意することは特に興味深い。
【0236】
【表20】
【0237】
同じことがＮ＝２にも当てはまる。
【0238】
【表21】
【0239】
用量応答効果はまた、ＩＰ１０の量決定のためのＮ＝１についてのＴＯＴＵＭ３及び４を用いた試験中に、反復Ｎ１で顕著である。
【0240】
【表22】
【0241】
同じことがＮ＝２にも当てはまる：
【0242】
【表23】
【0243】
ＴＯＴＵＭ ２については、ＩＬ６の量決定の状況であろうとＩＰ１０の量決定の状況であろうと、用量応答効果は観察されない（結果は示さず）。
【0244】
細胞系ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２において、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的化することによるウイルスＲＮＡの定量によってウイルス量を評価した。
【0245】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で同様である。ウイルス量は、化合物の濃度が増加すると減少し、以下を伴う：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの１０１％から６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ、
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの１０１％から６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ、
【0246】
【表24】
【0247】
－Ｎ＝２において、２７ｎＭのレムデシビルの７０％から６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ：
【0248】
【表25】
【0249】
Ｎ＝１の間、１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ２、３及び４で処理した後の感染した未処理細胞に対するウイルス量は、レムデシビルの活性代謝産物の最低用量で処理した後に得られたウイルス量と同様であるか、又はそれより大きかった。抗ウイルス活性は低減しないように思われる。
これらの結果についてはここでは説明しない。
これらの結果についてはここでは説明しない。
【0250】
Ｎ＝２の間、１３７ｎｇ／ｍＬ～１００，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ ２でＮ＝１と同様の結果が観察された（ウイルス量の減少は誘導されず、したがってＴＯＴＵＭ ２の抗ウイルス活性はなかった）。
【0251】
更に：
－３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３による処理後、それぞれ９％及び０％のウイルス量が観察され、言い換えれば検出不能であった：
－３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３による処理後、それぞれ９％及び０％のウイルス量が観察され、言い換えれば検出不能であった：
【0252】
【表26】
【0253】
－６，６６７ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ４による処理後、未処理の感染細胞に対して７８％のウイルス量が観察され、２０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度による処理の場合、４０％のウイルス量の低減が観察された：
【0254】
【表27】
【0255】
ＴＯＴＵＭ ３は、３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度でウイルス量の有意な低減を誘導するか、又はそれを検出不能にさえする。
【0256】
ＴＯＴＵＭ ４は、２０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度でウイルス量の実質的な減少を誘導する。
【0257】
結果：ＣＡＳ２－化合物の殺ウイルス効果
これらの試験の目標は、分析されなければならない化合物の殺ウイルス効果の評価であり、言い換えれば、ウイルスを化合物と共に３０分間インキュベートし、その後細胞を前処理された接種物と共に培養した。
これらの試験の目標は、分析されなければならない化合物の殺ウイルス効果の評価であり、言い換えれば、ウイルスを化合物と共に３０分間インキュベートし、その後細胞を前処理された接種物と共に培養した。
【0258】
最初に、細胞系Ｃａｌｕ－３において、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的化することによるウイルスＲＮＡの定量によってウイルス量を評価した。
【0259】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で同様である。ウイルス量は、化合物の濃度が増加すると減少し、以下を伴う：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの１１３％から６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの１１３％から６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ：
【0260】
【表28】
【0261】
－Ｎ＝２において、２７ｎＭのレムデシビルの１０９％から２２２２ｎＭ、６６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％までの範囲の感染した未処理細胞に対するパーセンテージ：
【0262】
【表29】
【0263】
Ｎ＝１の間、１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ２、３及び４で処理した後の感染した未処理細胞に対するウイルス量は、レムデシビルの活性代謝産物の最低用量で処理した後に得られたウイルス量と同様であるか、又はそれより大きかった（結果は示さず）。
【0264】
Ｎ＝２の間、２７ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ｍＬ及び１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ ２でＮ＝１と同様の結果が観察された。
【0265】
更に：
－１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３で処理した後、０％のウイルス量（検出不能なウイルス量）が観察された；
－２，２２２ｎｇ／ｍＬ及び６，６６７ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ４で処理した後、それぞれ４６％及び４３％のウイルス量が観察された。
－１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３で処理した後、０％のウイルス量（検出不能なウイルス量）が観察された；
－２，２２２ｎｇ／ｍＬ及び６，６６７ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ４で処理した後、それぞれ４６％及び４３％のウイルス量が観察された。
【0266】
【表30】
【0267】
３種のサイトカインの量決定を、細胞培養上清の試料に対してＩＬ６及びＩＰ１０について行った。
【0268】
ＩＬ６については、反復Ｎ＝１（下の表の左）及び反復Ｎ＝２（下の表）について、レムデシビルの活性代謝産物について用量応答効果が観察され、化合物濃度が増加するとサイトカイン濃度が減少した。
【0269】
【表31】
【0270】
ＩＬ６のアッセイの状況では、Ｎ＝１についてＴＯＴＵＭ３及び４で同様の結果が観察された：
【0271】
【表32】
【0272】
同じことが反復Ｎ＝２にも当てはまる。
【0273】
【表33】
【0274】
ＩＰ１０については、反復Ｎ＝１（下の表の左）及び反復Ｎ＝２（下の表の右）で、ウイルスをレムデシビルと共にインキュベートした場合にも用量応答効果が認められる。
【0275】
【表34】
【0276】
同様の結果、すなわち用量応答効果が、ＩＰ１０の量決定中にＮ＝１についてＴＯＴＵＭ３及び４で観察された。
【0277】
【表35】
【0278】
同じことが反復Ｎ＝２にも当てはまる。
【0279】
【表36】
【0280】
ここで、細胞系ＶｅｒｏＥ６－ＴＭＰＲＳＳ２において、ＯＲＦ１ａｂ遺伝子を標的化することによるウイルスＲＮＡの定量によってウイルス量を評価した。
【0281】
レムデシビルの活性代謝産物で処理した後、結果は生物学的反復間で同様である。ウイルス量は、化合物の濃度が増加すると減少し、以下を伴う：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの９７％から、それぞれ６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％及び１％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染していない未処理細胞に対するパーセンテージ：
－Ｎ＝１において、２７ｎＭのレムデシビルの９７％から、それぞれ６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％及び１％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染していない未処理細胞に対するパーセンテージ：
【0282】
【表37】
【0283】
－Ｎ＝２において、２７ｎＭのレムデシビルの１００％から２，２２２ｎＭ、６，６６７ｎＭ及び２０，０００ｎＭの０％（検出不能なウイルス量）までの範囲の感染していない未処理細胞に対するパーセンテージ。
【0284】
【表38】
【0285】
Ｎ＝１の間、１４ｎｇ／ｍＬ～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ２、３及び４で処理した後の感染した未処理細胞に対するウイルス量は、レムデシビルの活性代謝産物の最低用量で処理した後に得られたウイルス量と同様であったか、又はそれより大きかった（結果は示さず、殺ウイルス効果を有さないと仮定した）。
【0286】
Ｎ＝２の間、２７ｎｇ／ｍＬ～２０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の７つの濃度について、ＴＯＴＵＭ ２についてＮ＝１と同様の結果が観察された（結果は示さず、ＴＯＴＵＭ ２の殺ウイルス効果はない）。
【0287】
更に：
－３３３３３ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３での処理後、１６％のウイルス量が観察される；１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度では、検出不能なウイルス量（０％）が観察された。
－３３３３３ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ３での処理後、１６％のウイルス量が観察される；１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度では、検出不能なウイルス量（０％）が観察された。
【0288】
【表39】
【0289】
２０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＯＴＵＭ ４での処理後、４７％のウイルス量が観察された。
【0290】
【表40】
【0291】
結論
得られた結果から、以下のことを実証することができる：
一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する参照活性代謝産物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された化合物レムデシビルは、明らかな細胞毒性なしに、当該ウイルスに対する抗ウイルス及び殺ウイルス活性を明確に示す。ＣＡＳ１及びＣＡＳ２についてレムデシビル濃度が増加すると、ウイルス量は減少する。更に、サイトカインＩＬ６及びＩＰ１０については、レムデシビルの活性代謝産物について用量応答効果が観察され、予想通り、当該代謝産物の濃度が増加するとサイトカインの濃度が減少する。これらの結果は、使用された試験プロトコルを検証することを可能にする。
得られた結果から、以下のことを実証することができる：
一方で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する参照活性代謝産物としてｉｎ ｖｉｔｒｏで試験された化合物レムデシビルは、明らかな細胞毒性なしに、当該ウイルスに対する抗ウイルス及び殺ウイルス活性を明確に示す。ＣＡＳ１及びＣＡＳ２についてレムデシビル濃度が増加すると、ウイルス量は減少する。更に、サイトカインＩＬ６及びＩＰ１０については、レムデシビルの活性代謝産物について用量応答効果が観察され、予想通り、当該代謝産物の濃度が増加するとサイトカインの濃度が減少する。これらの結果は、使用された試験プロトコルを検証することを可能にする。
【0292】
とは言え、レムデシビルは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対してインビトロで興味深い活性を有するが、Ｃｏｖｉｄに罹患している患者にとって有害であることが証明され得る顕著な腎毒性効果も有する。
【0293】
ＴＯＴＵＭ ２と呼ばれる試料は、乾燥バナナパルプから得た。実施した試験の間に得られた結果は、そのような抽出物が抗ウイルス又は殺ウイルス効果を示さないことを実証している。更に、サイトカインの放出に対する用量応答効果は、この試料で観察することができなかった。
【0294】
ここでも、否定的であると予想されるこれらの試験結果は、実施されたプロトコルを強化する。
【0295】
ＴＯＴＵＭ ３と呼ばれる試料に関しては、濃縮されたＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａのマザーチンキから得られるが、ＴＯＴＵＭ ４の名称で言及される試料は、上述のこれらのＴＯＴＵＭ ３及び４を得るためのプロトコルの詳細な説明から明らかなように、当該ＴＯＴＵＭ ３も得ることを可能にしたマザーチンキの希釈物に対応する。
【0296】
ＴＯＴＵＭ ３を用いて得られ、上記で詳述された結果は、一方では、１４～１０，０００ｎｇ／ｍＬの範囲の化合物濃度で、Ｃａｌｕ－３及びＶｅｒｏ Ｅ６細胞に対して毒性が認められないことを実証する。
【0297】
しかし、Ｃａｌｕ－３系の細胞に対して１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で顕著な細胞毒性がある。同じことが、細胞毒性が存在するＶｅｒｏ Ｅ６系の細胞に対する３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度にも当てはまる。
【0298】
並行して、ＴＯＴＵＭ ３では、１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、細胞系Ｃａｌｕ－３について検出不能なウイルス量が観察される。とは言え、この濃度は細胞毒性効果を有すると実証された。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞系では、３３，３３３ｎｇ／ｍＬ及び１００，０００ｎｇ／ｍＬの濃度で検出不能なウイルス量が観察された。したがって、ここでも細胞毒性が存在する。
【0299】
この試料中の活性化合物の濃度は高すぎて、細胞に対する細胞毒性をもたらすように思われる。
【0300】
上述のＴＯＴＵＭ ３に対して４分の１までマザーチンキを希釈したものからなるＴＯＴＵＭ ４を用いて得られた結果は、その点で特に有利である。
【0301】
記録として、試料調製方法において、ＴＯＴＵＭ ３を得るためのプロトコルの工程ｉｖ）におけるマザーチンキの濾過の工程に従い、０．７５Ｌの濾液を２．２５Ｌの水に等しい体積で抜き出す。次いで、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの乾燥葉のマザーチンキの１／４希釈に相当する、３Ｌに等しい総体積を有するヒドロ－アルコール溶液を得る。
【0302】
このＴＯＴＵＭ ４を用いて得られた結果は、一方では、試験した濃度にかかわらず、最も高い濃度であってもモデル細胞系に対して細胞毒性を示さないことを実証する。
【0303】
この細胞毒性の欠如と並行して、濃度６，６６７ｎｇ／ｍＬ及び２０，０００ｎｇ／ｍＬでＴＯＴＵＭ ４の抗ウイルス活性が実証され、これらの濃度で観察されたウイルス量は、細胞系Ｃａｌｕ－３についてそれぞれ５９％及び４９％である。６，６６７まで、１０，０００ｎｇ／ｍＬ及び２０，０００ｎｇ／ｍＬのＴＯＴＵＭ ４で処理した後、Ｖｅｒｏ Ｅ６系でも抗ウイルス活性が検出され、これらの濃度についてそれぞれ７８％、６６％及び４０％のウイルス量が観察された。
【0304】
特に有利な方法では、ＣＡＳ１及びＣＡＳ２について行われたサイトカインＩＬ６及びＩＰ１０のアッセイ中に、ＴＯＴＵＭ ４で用量応答効果が観察され、化合物の濃度が増加するとサイトカインの濃度が減少することにも留意すべきである。
【0305】
上記の結果、特に肺細胞におけるＩＬ６及びＩＰ１０サイトカインのアッセイに関する結果として、６，５００～２０，０００ｎｇ／ｍＬ（凍結乾燥されたマザーチンキ抽出物の質量／水溶液の体積）、好ましくは６，６６７～２０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度を有する液体溶液中のＮｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａの葉の希釈されたマザーチンキ抽出物、特に１／４に希釈され、凍結乾燥されたマザーチンキは、Ｃｏｖｉｄ－１９の原因であるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスに対する抗ウイルス活性及び殺ウイルス活性を有し、この疾患の重症型に対抗する効力を示すと主張することが可能である。
【0306】
実際に、結果は、ＩＬ－６及びＩＰ１０サイトカインの放出に対するＴＯＴＵＭ ４の用量依存的な用量効果を実証するため、Ｎｅｕｒｏｌａｅｎａ ｌｏｂａｔａのそのようなマザーチンキ抽出物は、ウイルスによる感染に応答して、特に重症型のＣｏｖｉｄに罹患している患者の肺で生じる可能性が高いサイトカインストームを回避するために、光学で特に適応される。
【0307】
ここで、「重症型のＣｏｖｉｄ－１９に罹患している患者」とは、Ｃｏｖｉｄ－１９に対抗するために入院し、酸素療法を受けている患者を意味すると理解される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【国際調査報告】