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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-19
(54)【発明の名称】疾患の処置に関連する組成物および方法
(51)【国際特許分類】
A61K 38/21 20060101AFI20240209BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240209BHJP
C07K 14/52 20060101ALI20240209BHJP
C12N 15/21 20060101ALN20240209BHJP
【ＦＩ】
A61K38/21 ZNA
A61P31/12
C07K14/52
C12N15/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023513245
(86)(22)【出願日】2022-02-16
(85)【翻訳文提出日】2023-04-24
(86)【国際出願番号】 GB2022050406
(87)【国際公開番号】W WO2022175651
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102261.1
(32)【優先日】2021-02-17
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520440065
【氏名又は名称】アイエルシー セラピューティクス リミテッド
【氏名又は名称原語表記】ＩＬＣ ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ ＬＩＭＩＴＥＤ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100175477
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 林太郎
(72)【発明者】
【氏名】ウィリアム スティムソン
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA22
4C084BA23
4C084DA22
4C084NA14
4C084ZB331
4C084ZB332
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA40
4H045DA16
4H045EA29
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、ウイルス感染の予防または処置に使用するための、ＩＦＮ－α１０およびＩＦＮ－α１４のハイブリッドであるインターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）サブタイプを含む組成物、ならびに、前記ＩＦＮ－α１４ハイブリッドを用いたウイルス感染の処置および／または予防方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ウイルス感染の処置および／または予防のための方法であって、前記方法は、
（ｉ）それを必要とする対象に、治療有効量のハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアントを投与するステップ
を含む、方法。
【請求項2】
前記ウイルスは、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ウイルス感染は、直接注入により、または適切な場合には、例えば呼吸器系の問題を引き起こすウイルスの場合には肺への直接エアロゾルにより、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのフラグメントもしくはバリアントを提供することによって処置される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記ウイルス感染は、コロナウイルス感染、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）からの感染から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項5】
前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項6】
治療上有用な量の追加の抗ウイルス処置を投与するステップを含む、先行する請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項7】
前記抗ウイルス処置が、リバビリン、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ、デキサメタゾン、アビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）または別のインターフェロンサブタイプである、請求項６に記載の方法。
【請求項8】
ウイルスまたはウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント。
【請求項9】
ウイルスまたはウイルス感染の処置および／または予防のための薬剤の調製におけるＨＹＢＩＲＤ２またはそのフラグメントもしくはバリアントの使用。
【請求項10】
前記ウイルスまたはウイルス感染は、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
から選択される、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【請求項11】
前記ウイルス感染は、直接注入により、または適切な場合には、例えば呼吸器系の問題を引き起こすウイルスの場合には肺への直接エアロゾルにより、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのフラグメントもしくはバリアントを提供することによって処置される、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【請求項12】
前記ウイルス感染は、コロナウイルス感染、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）からの感染から選択される、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【請求項13】
前記ウイルスまたはウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から選択される、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【請求項14】
治療上有用な量の追加の抗ウイルス処置をさらに含む、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【請求項15】
治療上有用な量の追加の抗ウイルス処置をさらに含み、前記抗ウイルス処置が、リバビリン、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ、デキサメタゾン、アビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）または別のインターフェロンサブタイプである、請求項８に記載のウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプ、ハイブリッド２またはそのフラグメントもしくはバリアント、または請求項９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ウイルス感染を予防または処置するための組成物および方法に関する。本発明は、ＮＫ細胞およびＴ細胞の応答性を誘導することにより、ウイルス感染による感染を予防または処置するための組成物に及ぶ。本発明は、さらに、ヒトおよび獣医学的治療のためのウイルス感染の処置および／または予防のための組成物および本発明の組成物の使用にも及ぶ。
【背景技術】
【0002】
インターフェロン－アルファ（ＩＦＮ－アルファ）は、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、慢性Ｂ型肝炎、慢性Ｃ型肝炎、およびＨＩＶなどのさまざまなウイルスの処置に成功し、臨床的および商業的に使用されている（例えば、ロフェロンＡ（登録商標）、イントロンＡ（登録商標）、ペガシス（登録商標）、ペグイントロン（登録商標）など）。ＩＦＮ－アルファは、自然免疫応答の一部として抗原提示細胞から放出される最も初期のサイトカインの１つである。それは、ＮＫ細胞とＴ細胞の応答性に直接関与している。
【0003】
さまざまな病原体がｉｎ ｖｉｔｒｏでさまざまなインターフェロンアルファ（ＩＦＮ－α）サブタイプを誘導し、ＩＦＮ－αサブタイプはさまざまな抗ウイルス活性、抗増殖活性、および免疫調節活性を有することが知られている。ＩＦＮ－α、特に個々のＩＦＮ－αサブタイプの作用機序は、まだ部分的にしか理解されていない。さまざまな経路による感染は、異なるサブタイププロファイルを誘導することが示されている。ＩＦＮ－αサブタイプは同じ受容体に結合し、共通のシグナル伝達経路を活性化し、同様の免疫機能を持つと予想されていた。すべてのＩＦＮ－αサブタイプは、定義上、抗ウイルス活性を有するが、この文脈での絶対的な効力はかなり異なる可能性がある。さらに、免疫調節および抗増殖作用を含む他の多くの生物学的特性が報告されているが、その効力はまちまちである。このような多面的な作用は、受容体鎖との異なる相互作用と、一連のエフェクター分子への異なる細胞内経路を介したシグナル伝達によるものと思われる。Ｉ型ＩＦＮ受容体は、ＩＦＮＲ１とＩＦＮＲ２の２つの鎖からなる。１２種類のＩＦＮ－αサブタイプのそれぞれについて、異なる受容体鎖との結合親和性に幅がある。ＩＦＮα－１４は、２つのインターフェロン受容体の両方に対して最も高い親和性を有するため、他の１１種類のサブタイプと比較して活性が高い。
【0004】
現在、ＩＦＮアルファ２サブタイプのみからなる組換えインターフェロンが、抗ウイルス適応症の市場を席巻している。主な組み換えアルファＩＦＮ製品には、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ社のイントロンＡ（商標）（ＩＦＮ－アルファ２ｂ）とＲｏｃｈｅ社のロフェロン（商標）（ＩＦＮ－アルファ２ａ）の２つがある。これらの単一サブタイプ製品とは対照的に、異なるサブタイプの混合物からなるいくつかのアルファＩＦＮ製剤がある。これらのマルチサブタイプＩＦＮアルファ製品は、ウイルスからの刺激に応答してヒト白血球によって産生される（Ｖｉｒａｇｅｎ社またはその子会社のマルチフェロン（商標）、Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｉｘ社のアルフェロン－Ｎ（商標）など）か、またはバーキットリンパ腫患者から培養されたヒトリンパ芽球様細胞によって産生される（住友社のスミフェロン（商標）など）。
【発明の概要】
【0005】
本発明は、特に呼吸器ウイルス疾患、胃腸ウイルス疾患、発疹性ウイルス疾患、肝臓ウイルス疾患、皮膚ウイルス疾患、出血性ウイルス疾患、神経ウイルス疾患などのウイルス状態、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を予防または処置するための組成物および方法に関する。本発明はさらに、治療上有用な量の本発明のインターフェロンを、治療上有用な量の適切な抗ウイルス化合物とともに、処置を必要とする対象に投与することに及ぶ。
【0006】
特定のウイルス、特に新興ウイルスを標的とするワクチンがない場合、効果的な抗ウイルス薬が、好適にはＳＡＲｓ、インフルエンザ（特にＨ５Ｎ１）、ジカウイルス、ＷＮＶおよびＥＢＯＶの発生に関連して、特に有利となる。
【0007】
したがって、本発明の第一の態様は、ウイルス感染の処置および／または予防のための方法であって、前記方法は、（ｉ）それを必要とする対象に、治療有効量のハイブリッド２を投与するステップを含む、方法を提供する。
【0008】
広範な実験の後、本発明の発明者は、驚くべきことに、本明細書に記載のインターフェロンアルファ１４のバリアントであるハイブリッド２（配列番号３）またはそのバリアントもしくはフラグメントを投与すると、ウイルス感染の影響が抑制または阻害されることを発見した。本発明者は予想外に、ハイブリッド２がウイルス感染に起因する細胞変性効果を直接阻害できることを決定した。細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔまたはｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。本発明者は、ハイブリッド２がウイルス感染に関連するプラーク形成も阻害することを実証した。
【0009】
本発明者は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１およびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染の結果として引き起こされる細胞変性効果およびプラーク形成に基づくモデル系を使用して、合成アルファ－インターフェロンハイブリッド２がウイルス感染を阻害する能力を調べた。本発明者はまた、抗ウイルス化合物であるリバビリンおよびマルチサブタイプのインターフェロンであるマルチフェロン（商標）と比較して、細胞変性効果の阻害を調べた。
【0010】
さらに、本発明者は、ＨＩＶおよびＲＳＶモデルを利用して、ハイブリッド２の抗ウイルス効果を実証した。本発明者は、ＨＩＶおよびＨＲＳＶに対するハイブリッド２の抗ウイルス活性を実証するために、異なる接着細胞系を利用した。各抗ウイルスアッセイについて、抗ウイルスアッセイで試験したのと同じ濃度の阻害剤を使用して、生存率試験を並行してセットアップした。生存率アッセイを使用して、ウイルスの非存在下における化合物による細胞毒性効果を決定した。世界中で３，７００万人以上がＨＩＶに感染している。ＲＳＶ感染は乳児の入院の最も重要な原因であり、乳児死亡率の主要な原因の１つである。呼吸器ウイルスの１つとして、インフルエンザ、リオウイルスおよびコロナウイルスとともに、それ自体が興味深いものであると同時に、指標となるモデルを提供する。本発明者は、初代ヒトケラチノサイトをハイブリッド２で処置すると、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）感染が減少することも実証した。適切には、前記ウイルス感染は、直接注入により、または適切な場合には、例えば呼吸器系の問題を引き起こすウイルスの場合には肺への直接エアロゾルにより、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのフラグメントもしくはバリアントを提供することによって処置され得る。適切には、１回の投与につき１０４～１０７ＩＵの範囲の用量が使用され得る。適切には、ハイブリッド２（配列番号３）は、舌下処置として提供され得る。舌下処置としてハイブリッド２またはそのバリアントもしくはフラグメントを投与すると、以前の抗ウイルス薬と比較して、ウイルス活性が大幅に低下または阻害される可能性がある。さらに、本発明者らは、非常に低用量のハイブリッド２、例えば１日当たり１０４～５×１０６ＩＵまでが使用され得ることを確認した。
【0011】
これにより、発明者は、ウイルス感染の処置および／または予防に有用な改善された治療用組成物を特定するに至った。
【0012】
適切には、前記ウイルス感染は、Ｃ型肝炎ウイルス、黄熱ウイルスを含むフラビウイルス科のメンバー（例えば、フラビウイルス、ペスチウイルス、およびヘパシウイルス属のメンバー）；Ｇａｄｇｅｔｓ Ｇｕｌｌｙウイルス、Ｋａｄａｍウイルス、キャヌサル森林病ウイルス、ランガットウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ポワッサンウイルス、Ｒｏｙａｌ Ｆａｒｎ１ウイルス、Ｋａｒｓｈｉウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、Ｎｅｕｄｏｅｒｆｌウイルス、Ｓｏｆｊｉｎウイルス、跳躍病ウイルおよびネギシウイルスなどのダニ媒介ウイルス；Ｍｅａｂａｎウイルス、Ｓａｕｍａｒｅｚ Ｒｅｅｆウイルス、およびＴｙｕｌｅｎｉｙウイルスなどの海鳥ダニ媒介ウイルス；Ａｒｎａウイルス、デングウイルス、Ｋｅｄｏｕｇｏｕウイルス、Ｃａｃｉｐａｃｏｒｅウイルス、Ｋｏｕｔａｎｇｏウイルス、日本脳炎ウイルス、マリーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ウスツウイルス、ウエストナイルウイルス、Ｙａｍｍｄｅウイルス、ココベラウイルス、バガザウイルス、イルヘウスウイルス、イスラエル七面鳥髄膜脳炎ウイルス、ウンタヤウイルス、Ｔｅｍｂｕｓｕウイルス、ジカウイルス、Ｂａｒｉｚｉウイルス、Ｂｏｕｂｏｕｉ ｖｉｍｓ、エッジヒルウイルス、Ｊｕｇｒａウイルス、Ｓａｂｏｙａウイルス、Ｓｅｐｉｋウイルス、ウガンダＳウイルス、ヴェセルスブロンウイルス、黄熱ウイルスなどの蚊媒介ウイルス；Ｅｎｔｅｂｂｅコウモリウイルス、ヨコセウイルス、アポイウイルス、カウボーンリッジウイルス、Ｊｕｔｉａｐａウイルス、モドックウイルス、Ｓａｌ Ｖｉｅｊａウイルス、Ｓａｎ Ｐｅｒｌｉｔａウイルス、ブカラサコウモリウイルス、カレー島ウイルス、ダカールコウモリウイルス、モンタナ筋炎白質脳炎ウイルス、プノンペンコウモリウイルス、リオブラボーウイルス、Ｔａｍａｎａコウモリウイルス、および細胞融合ウイルス（Ｃｅｌｌ ｆｕｓｉｎｇ ａｇｅｎｔ ｖｉｒｕｓ）から選択されるウイルスから選択され得る。
【0013】
別の実施形態において、前記ウイルスは、Ｉｐｐｙウイルス、ラッサウイルス（Ｊｏｓｉａｈ、ＬＰ、またはＧＡ３９１株など）、リンパ性脈絡膜髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、Ｍｏｂａｌａウイルス、Ｍｏｐｅｉａウイルス、アマパリウイルス、Ｆｌｅｘａｌウイルス、グアナリトウイルス、フニンウイルス、ラチノウイルス、マチュポウイルス、Ｏｌｉｖｅｒｏｓウイルス、パラナウイルス、ピチンデウイルス、Ｐｉｒｉｔａｌウイルス、サビアウイルス、タカリベウイルス、タミアニウイルス、Ｗｈｉｔｅｗａｔｅｒ Ａｒｒｏｙｏウイルス、Ｃｈａｐａｒｅウイルス、およびルジョウイルスを含むアレナウイルス科のメンバー；から選択され得る。
【0014】
さらに他の実施形態において、前記ウイルスは、ハンタンウイルス、シンノンブルウイルス、ジュグベウイルス、ブニヤムウェラウイルス、Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ出血熱ウイルス、ラクロスウイルス、Ｐｕｎｔａ Ｔｏｒｏウイルス（ＰＴＶ）、カリフォルニア脳炎ウイルス、およびクリミア・コンゴ出血熱（ＣＣＨＦ）ウイルスを含むブニヤウイルス科のメンバー（例えば、ハンタウイルス、ナイロウイルス、オルソブニヤウイルス、およびフレボウイルス属のメンバー）、エボラウイルス（例えば、ザイール、スーダン、コートジボワール、レストン、およびウガンダ株）およびマールブルグウイルス（例えば、アンゴラ、Ｃｉ６７、ムソケ、ポップ、レイヴン、およびレイクビクトリア株）を含むフィロウイルス科のウイルス；から選択され得る。
【0015】
実施形態において、前記ウイルスは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＶＥＥ）、東部ウマ脳炎ウイルス（ＥＥＥ）、西部ウマ脳炎ウイルス（ＷＥＥ）、シンドビスウイルス、風疹ウイルス、セムリキ森林ウイルス、ロスリバーウイルス、バーマフォレストウイルス、オニョンニョンウイルス、およびチクングニアウイルスを含むトガウイルス科のメンバー（例えば、アルファウイルス属のメンバー）；天然痘ウイルス、牛痘、鉤痘ウイルス、およびワクシニアウイルスを含むポックスウイルス科のメンバー（例えば、オルソポックスウイルス属のメンバー）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ；１、２、および６型）、ヒトヘルペスウイルス（例えば、７型および８型）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス、およびカポジ肉腫関連－ヘルペスウイルス（ＫＳＨＶ）を含むヘルペスウイルス科のメンバー；から選択され得る。
【0016】
別の実施形態において、前記ウイルスは、Ｈ５Ｎ１トリインフルエンザウイルスまたはＨ１Ｎ１ブタインフルエンザなどのインフルエンザウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣ）を含むオルトミクソウイルス科のメンバー；重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）ウイルスを含むコロナウイルス科のメンバー；狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）を含むラブドウイルス科のメンバー；ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ニューカッスル病ウイルス、ヘンドラウイルス、ニパウイルス、麻疹ウイルス、牛疫ウイルス、犬ジステンパーウイルス、センダイウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス（例：１、２、３、および４）、ライノウイルス、およびおたふく風邪ウイルスを含むパラミクソウイルス科のメンバー；から選択され得る。
【0017】
実施形態において、前記ウイルスは、ポリオウイルス、ヒトエンテロウイルス（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）、Ａ型肝炎ウイルス、およびコクサッキーウイルスを含むピコルナウイルス科のメンバー；Ｂ型肝炎ウイルスを含むヘパドナウイルス科のメンバー；から選択され得る。
【0018】
実施形態において、前記ウイルスは、ヒトパピローマウイルスを含むパピローマウイルス科のメンバー；アデノ随伴ウイルスを含むパルボウイルス科のメンバー；アストロウイルスを含むアストロウイルス科のメンバー；ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、およびＳＶ４０ウイルスを含むポリオーマウイルス科のメンバー；から選択され得る。
【0019】
実施形態において、前記ウイルスは、ノーウォークウイルスを含むカリシウイルス科のメンバーから選択され得る。
【0020】
実施形態において、前記ウイルスは、ロタウイルスを含むレオウイルス科のメンバーから選択され得る。
【0021】
実施形態において、前記ウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ；例えば、１型および２型）、ならびにヒトＴリンパ好性ウイルス１型およびＩＩ型（それぞれ、ＨＴＬＶ－１およびＨＴＬＶ－２）を含むレトロウイルス科のメンバーから選択され得る。
【0022】
実施形態において、前記ウイルスは、アテリウイルス、パポバウイルス、およびエコーウイルスから選択され得る。
適切には、前記ウイルスは、１型ＩＦＮ応答に拮抗することが知られているタンパク質をコードするウイルスから選択され得る：
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
適切には、前記ウイルスは、１型ＩＦＮ応答に拮抗することが知られているタンパク質をコードするウイルスから選択され得る：
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
【0023】
適切には、前記ウイルスは、エンベロープウイルスによって引き起こされるウイルス疾患から選択され得、好ましくはヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－ｌ）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ－２）、ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ－１）、ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ－２）、インフルエンザウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ジカウイルス（ＺＫＶ）、デングウイルス、ウエストナイルウイルス、ラッサウイルス、エボラウイルス、Ｌｌｏｖｉｕウイルス、ブンディブギョウイルス、レストンウイルス、スーダンウイルス、タイフォレストウイルス、マールブルグウイルス、Ｒａｖｎウイルス（ＲＡＷ）、ニューモウイルス、フニンウイルス、Ｒｉｆｔ Ｖａｌｌｅｙ出血熱ウイルス、ラクロスウイルス、ブタ繁殖・呼吸器障害症候群ウイルス、ポックスウイルス、ウシウイルス性下痢症ノロウイルス、ＳＡＲＳコロナウイルス、チクングニアウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、シュマレンベルクウイルス、アフリカブタコレラウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、牛痘ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ニパウイルス、オムスク出血熱ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、ロシア春夏脳炎（ＲＳＳＥ）ウイルス、黄熱ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、ウイルス（ＢＶＤＶ）、パラインフルエンザウイルス５型（ＰＩＶ５）、ヒツジのボーダー病ウイルス（ＢＤＶ）、ブタコレラウイルス（ＣＳＦＶ）、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）およびＨＳＶ－２アシクロビル耐性（ＨＳＶ－２ Ａｃｙ Ｒ）からなる群から選択され得、より好ましくは前記エンベロープウイルスは、ＨＩＶ－ｌ、ＨＳＶ－ｌ、ＨＳＶ－２、ＨＣＭＶ、ＲＳＶ、ＶＳＶ、Ｈ１Ｎ１、ＤＥＮＶ－２およびＺＫＶからなる群から選択され得る。
【0024】
実施形態において、前記ウイルス感染は、コロナウイルス感染、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）からの感染から選択され得る。
【0025】
実施形態において、前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から選択され得る。
【0026】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性なフラグメントもしくはバリアントを含むか、またはそれらからなる。
【0027】
実施形態において、前記投与方法は経口投与である。実施形態において、前記投与方法は注入である。実施形態において、前記投与方法は肺へのエアロゾル送達によるものである。
【0028】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２の治療有効量は低用量である。実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２の治療有効量は、１０４～５×１０６ＩＵ単位／ｍｌである。実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身処置よりも低い。
【0029】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１×１０２ＩＵ／ｍｌ、１×１０３ＩＵ／ｍｌ、１×１０４ＩＵ／ｍｌ、１×１０５ＩＵ／ｍｌ、１×１０６ＩＵ／ｍｌまたは１×１０７ＩＵ／ｍｌの用量で投与される。
【0030】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、０．１ｍｇ～１ｍｇの間、適切には１ｎｇ～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒトへの適用では、５×１０４ＩＵ／ｍｌ単位以下が使用され得る。
【0031】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、舌下投与によって投与される。実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回投与され得る。適切には、舌下投与では、毎日、単回用量が提供され得る。
【0032】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、ウイルスの活動を妨害し、例えば、細胞変性効果またはウイルスのプラーク形成を阻害する。
【0033】
典型的には、前記対象は哺乳動物、特にヒトである。実施形態において、前記対象は鳥であり得る。実施形態において、前記対象は動物であり得る。
【0034】
特定の実施形態において、前記方法は、治療上有用な量の適切な抗ウイルス化合物を投与するステップを含む。実施形態において、前記抗ウイルス化合物はリバビリンである。前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２と組み合わせた実施形態において、さらなる処置は、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ（ａｐｉｌｉｍｏｄ － 選択的ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼ阻害剤）、デキサメタゾン、およびアビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）または別のインターフェロンサブタイプから選択され得る。
【0035】
本発明の第二の態様によれば、ウイルス感染の処置および／または予防に使用するためのインターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２が提供される。
【0036】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性なフラグメントもしくはバリアントを含むか、またはそれらからなる。
【0037】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、呼吸器ウイルス疾患、胃腸ウイルス疾患、発疹性ウイルス疾患、肝臓ウイルス疾患、皮膚ウイルス疾患、出血性ウイルス疾患、神経ウイルス疾患の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0038】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0039】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の処置および／または予防に使用するためのものである。
【0040】
実施形態において、前記ハイブリッド２の治療有効量は低用量である。実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２の治療有効量は、１０４～５×１０６ＩＵ単位／ｍｌである。実施形態において、前記ハイブリッド２の治療有効量は、コロナウイルス感染に対する現在の全身処置よりも低い。
【0041】
実施形態において、ハイブリッド２は、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１×１０２ＩＵ／ｍｌ、１×１０３ＩＵ／ｍｌ、１×１０４ＩＵ／ｍｌ、１×１０５ＩＵ／ｍｌ、１×１０６ＩＵ／ｍｌまたは１×１０７ＩＵ／ｍｌの用量で投与される。
【0042】
実施形態において、ハイブリッド２は、０．１ｍｇ～１ｍｇの間、適切には１ｎｇ～５０マイクログラムの用量で投与される。例えば、ヒトへの適用では、５×１０４ＩＵ／ｍｌ単位以下が使用され得る。動物、例えばイヌでは、舌下使用は、例えば１ｍｌのＰＢＳで１０４ＩＵ／Ｋｇとすることができる。
【0043】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回投与され得る。適切には、舌下投与では、単回用量が毎日提供され得る。
【0044】
ハイブリッド２と組み合わせた実施形態において、さらなる処置は、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ（ａｐｉｌｉｍｏｄ － 選択的ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼ阻害剤）、デキサメタゾン、およびアビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）から選択され得る。
【0045】
本発明の第三の態様によれば、ウイルス感染の処置および／または予防のための薬剤の調製におけるハイブリッド２またはその組み合わせの使用が提供される。
【0046】
本発明のさらなる態様によれば、コロナウイルス感染の処置および／または予防に使用するための、ハイブリッド２を含む組成物が提供される。
【0047】
本発明のさらなる態様によれば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）の処置および／または予防に使用するための、ハイブリッド２を含む組成物が提供される。
【0048】
本発明のさらなる態様によれば、ウイルス感染の処置および／または予防に使用するための、ハイブリッド２を含む医薬組成物が提供される。
【0049】
実施形態において、前記ウイルス感染は、コロナウイルス感染、特に重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１、中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）および重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）からの感染から選択され得る。
【0050】
実施形態において、前記ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）から選択され得る。
【0051】
実施形態において、前記医薬組成物はさらなる処置と組み合わせたハイブリッド２を提供することができ、前記さらなる処置が、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ（ａｐｉｌｉｍｏｄ － 選択的ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼ阻害剤）、デキサメタゾン、およびアビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）から選択され得る。
【0052】
本発明のさらなる態様によれば、免疫応答の調節に使用するためのハイブリッド２が提供される。
【0053】
実施形態において、前記インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２と、レムデシビル、ＬＡＭ－００２Ａ（ａｐｉｌｉｍｏｄ － 選択的ＰＩＫｆｙｖｅキナーゼ阻害剤）、デキサメタゾンおよびアビガン（ｆａｖｉｌａｖｉｒ）から選択されるさらなる処置との組み合わせは、免疫応答を調節するために使用され得る。
【0054】
本発明のさらなる態様によれば、ウイルス、特に重症急性呼吸器系（ＳＡＲＳ）コロナウイルス－１（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）もしくは重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＣｏｖｉｄ１９）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）による感染の処置または予防のための、ハイブリッド２またはその組み合わせと抗ウイルス化合物の使用が提供される。
適切には、ウイルスは、
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
から選択され得る。
適切には、ウイルスは、
チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）
コクサッキーウイルス
デングウイルス（ＤＥＮＶ）
エボラウイルス（ＥＢＯＶ）
エプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）
Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）
ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）
ヒトライノウイルス（ＨＲＶ）
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）
Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＢＶ）
ラッサウイルス（ＬＡＳＶ）
麻疹ウイルス（ＭｅＶ）
中東呼吸器症候群コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）
おたふく風邪ウイルス（ＭｕＶ）
ニパウイルス（ＮｉＶ）
ポリオウイルス（ＰＶ）
狂犬病ウイルス（ＲＡＢＶ）
ロタウイルス（ＲＶ）ＮＳＰ１ Ｅｎｈａｎｃｅｓ
重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）
ワクシニアウイルス（ＶＡＣＶ）
ウエストナイルウイルス（ＷＮＶ）
黄熱ウイルス（ＹＦＶ）
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）
から選択され得る。
【0055】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、配列番号３のアミノ酸配列またはその機能的に活性なフラグメントもしくはバリアントを含むか、またはそれらからなる。
【0056】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプハイブリッド２は、配列番号３のアミノ酸配列、または配列番号３と少なくとも９０％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９５％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９６％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９７％相同、最も好ましくは配列番号３と少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を含むか、またはそれらからなる。
【0057】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、組成物または医薬組成物は舌下投与される。これは、獣医学的処置にとって特に有利であり得る。実施形態では、投与方法は経口投与である。実施形態では、投与方法は注入である。
【0058】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、ハイブリッド２は、５ＩＵ／ｍｌ、１０ＩＵ／ｍｌ、５０ＩＵ／ｍｌ、１×１０２ＩＵ／ｍｌ、１×１０３ＩＵ／ｍｌ、１×１０４ＩＵ／ｍｌ、１×１０５ＩＵ／ｍｌ、１×１０６ＩＵ／ｍｌまたは１×１０７ＩＵ／ｍｌの用量で投与される。
【0059】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、ハイブリッド２は、０．１ｍｇ～１ｍｇの間、適切には１ｎｇ～５０マイクログラムの間の用量で投与される。例えば、ヒトへの適用では、５×１０４ＩＵ／ｍｌ単位またはそれ以下が使用され得る。
【0060】
上記で概説した本発明の態様の実施形態では、インターフェロンアルファサブタイプは、１日１回、１日２回、１日３回、または１日４回投与される。適切には、舌下投与では、単回用量が毎日提供され得る。
【0061】
上記で概説した本発明の態様の特定の実施形態では、ＩＦＮ－αサブタイプは、配列番号３のアミノ酸配列（ハイブリッド２）またはそのバリアントもしくはフラグメントを含むか、またはそれらからなる。本発明のさらなる態様では、配列番号３またはそのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれらからなる組換えポリペプチドが提供される。本発明は、配列番号３のアミノ酸配列に由来する核酸配列に及ぶ。実施形態では、ハイブリッド２はグリコシル化され得る。
【0062】
[発明の詳細な説明]
当技術分野におけるＩＦＮアルファの組換え型と、マルチサブタイプ型との間には多くの違いがある。最も明らかな違いは、それぞれが有するＩＦＮアルファサブタイプの数である。組換え型はアルファ２サブタイプのみを含み、イントロンＡ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ社）はアルファ２ｂ型、Ｒｏｆｅｒｏｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）はアルファ２ａ型である。ＩＦＮアルファのマルチサブタイプ型は、ＩＦＮアルファの多くのサブタイプを含む。ＩＦＮアルファのマルチサブタイプ型は広域薬物であり、ＩＦＮアルファサブタイプのいずれかが抗ウイルス活性をより多く、またはより少なく有するということはない。マルチサブタイプ型と組換え型の別の違いは、マルチサブタイプ型の製造プロセスでヒト細胞によって産生されたＩＦＮアルファ２がグリコシル化されているのに対し、組換え型は細菌発酵により産生されるという点でグリコシル化されていないことである。グリコシル化は、半減期、生物活性、免疫原性など、タンパク質産物の多くの機能において主要な役割を果たす。したがって、産物のグリコシル化は、投与後の体内での持続時間、治療的に適切な用量の活性、および産物自体に対する忍容性に影響を与える可能性があるため、治療的または予防的処置を開発する際に重要な考慮事項となる。
当技術分野におけるＩＦＮアルファの組換え型と、マルチサブタイプ型との間には多くの違いがある。最も明らかな違いは、それぞれが有するＩＦＮアルファサブタイプの数である。組換え型はアルファ２サブタイプのみを含み、イントロンＡ（商標）（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｐｌｏｕｇｈ社）はアルファ２ｂ型、Ｒｏｆｅｒｏｎ（商標）（Ｒｏｃｈｅ社）はアルファ２ａ型である。ＩＦＮアルファのマルチサブタイプ型は、ＩＦＮアルファの多くのサブタイプを含む。ＩＦＮアルファのマルチサブタイプ型は広域薬物であり、ＩＦＮアルファサブタイプのいずれかが抗ウイルス活性をより多く、またはより少なく有するということはない。マルチサブタイプ型と組換え型の別の違いは、マルチサブタイプ型の製造プロセスでヒト細胞によって産生されたＩＦＮアルファ２がグリコシル化されているのに対し、組換え型は細菌発酵により産生されるという点でグリコシル化されていないことである。グリコシル化は、半減期、生物活性、免疫原性など、タンパク質産物の多くの機能において主要な役割を果たす。したがって、産物のグリコシル化は、投与後の体内での持続時間、治療的に適切な用量の活性、および産物自体に対する忍容性に影響を与える可能性があるため、治療的または予防的処置を開発する際に重要な考慮事項となる。
【0063】
配列番号３（本発明のハイブリッド２）は、以下のアミノ酸配列を有する：
【化1】
【0064】
特に、本発明者は、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのバリアントもしくはフラグメントが、細胞変性効果およびプラーク形成を阻害し、抗ウイルス活性を示すことを発見した。細胞変性効果（ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃ ｅｆｆｅｃｔまたはｃｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ ｅｆｆｅｃｔ）とは、ウイルスの侵入によって引き起こされる宿主細胞の構造変化を指す。
【0065】
本発明者はまた、組換えＩＦＮハイブリッド分子ハイブリッド２（配列番号３）がインターフェロン受容体に対して高い結合親和性を有することを確立した。
【0066】
理論に拘束されることを望まないが、本発明者は、ＩＦＮ－α１０のアミノ酸配列を含むタンパク質はインターフェロン受容体２（ＩＦＮＲ２）に対してより大きな親和性を有し、ＩＦＮ－α１４のアミノ酸配列を含むタンパク質はインターフェロン受容体１（ＩＦＮＲ１）に対してより大きな親和性を有すると考えている。したがって、ＩＦＮ－α１０のアミノ酸配列を含むタンパク質を、インターフェロン受容体１に結合可能なＩＦＮ－α１４のアミノ酸で置換する、あるいはＩＦＮ－α１４のアミノ酸配列を含むタンパク質を、インターフェロン受容体２に結合可能なＩＦＮ－α１０のアミノ酸で置換すると、ＩＦＮ－α１０またはＩＦＮ－α１４単独よりもインターフェロン受容体１および２の双方に対してより強い結合親和性を有するはずのＩＦＮ－α１０ ＩＦＮ－α１４ハイブリッドタンパク質が提供されると考えられる。ＩＦＮ－α１０およびＩＦＮ－α１４の一次インターフェロン受容体結合部位を含むとは、ハイブリッドが、ＩＦＮ－α１４サブタイプのインターフェロン受容体２への結合能力を向上させるために、ＩＦＮ－α１０から選択されＩＦＮ－α１４アミノ酸配列中に置換されたアミノ酸を含むこと、および／または、ハイブリッドが、ＩＦＮ－α１０サブタイプのインターフェロン受容体１への結合能力を向上させるために、ＩＦＮ－α１４から選択されＩＦＮ－α１０アミノ酸配列中に置換されたアミノ酸を含むことを意味する。ハイブリッドＤ２は、ウイルスの処置において特に有利であると考えられる。
【0067】
実施形態では、ＩＦＮ－α１０－ＩＦＮ－α１４ハイブリッドは、実質的にＩＦＮ－α１０のアミノ酸配列を有することができるが、（ＩＦＮ－α１０配列のナンバーリングを用いて）アミノ酸残基８０から１５０の間の領域、または適切にはアミノ酸残基８４から１４４の間の領域、または適切にはアミノ酸残基９２から１１５、または適切にはアミノ酸残基９０から１１０の間の領域で改変されて、ＩＦＮ－α１４配列によってもたらされるアミノ酸を提供することができる。これらの領域またはこれらの領域の一部のアミノ酸残基が、インターフェロン受容体１へのＩＦＮ－α１４の結合をもたらすと考えられている。特に、ハイブリッド配列は、ＩＦＮ－α１４配列の対応する残基またはその保存変異を提供するために、ＩＦＮ－α１０配列の少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個または少なくとも１１個の改変を含み得る。実施形態では、太字で示されたアミノ酸によって示されるように、１１個の改変が提供される。
【化2】
【0068】
機能的に活性とは、ＩＦＮ－α１０およびＩＦＮ－α１４の一次インターフェロン結合部位を含むＩＦＮ－α１０－ＩＦＮ－α１４ハイブリッドポリペプチドであって、対象へのペプチドの投与または対象におけるペプチドの発現がウイルス感染に対する免疫応答の抑制を促進する、ハイブリッドポリペプチドを意味する。さらに、機能的活性は、ウイルス感染に対する免疫応答を抑制するハイブリッドペプチドの能力によって示され得る。
【0069】
フラグメントは、配列番号３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個、より好ましくは１５０個以上の連続するアミノ酸を含むことができ、機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えばｃＤＮＡのＣ末端連続欠失を使用して決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失変異体の活性を、本明細書に記載の生物学的活性について試験することができる。
【0070】
バリアントとは、配列番号３と少なくとも９０％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９５％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９６％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９７％相同、最も好ましくは配列番号３と少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を意味する。バリアントは、アミノ酸の置換、特にタンパク質の生物学的活性または立体配置、またはフォールディングの有意な改変をもたらさない可能性が高いことが知られている置換（複数可）を含む、配列番号３のポリペプチド配列を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られ、当技術分野で知られている。例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。適切には、実施形態において、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は互いに置換され得る。適切には、配列をアラインメントしたときに他のアルファサブタイプの類似または同一の位置に存在するアミノ酸へのアミノ酸置換をもたらすように、任意の置換をインターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列アラインメントの分析に基づいて選択することができる。ハイブリッド、ならびにそのバリアントおよびフラグメントは、当技術分野で知られている適切な分子生物学的方法を使用して生成することができる。適切には、相同性は配列同一性によって記述され得る。配列同一性は、当技術分野で知られている方法、例えばＢＬＡＳＴによって決定することができる。
【0071】
本発明者は、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのバリアントもしくはフラグメントの投与により、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのバリアントもしくはフラグメントが投与されていないコントロールと比較して、細胞変性効果もしくはプラーク形成などのウイルス活性または抗ウイルスアッセイにおいて、１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％超の低下がもたらされることを発見した。
【0072】
本発明者は、ハイブリッド２（配列番号３）またはそのバリアントもしくはフラグメントの投与により、これまでの抗ウイルス薬と比較して、細胞変性効果もしくはプラーク形成などのウイルス活性または抗ウイルスアッセイにおいて、１０％、好ましくは２０％、好ましくは３０％、好ましくは４０％、好ましくは５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％と、好ましくは８０％、より好ましくは９０％超の低下がもたらされることを発見した。
【0073】
ハイブリッド２の投与は、細胞変性効果またはプラーク形成を、５０％、好ましくは６０％、好ましくは７０％、好ましくは８０％、好ましくは９０％、好ましくは９１％、好ましくは９２％、好ましくは９３％、好ましくは９４％、好ましくは９５％、好ましくは９６％、好ましくは９７％、より好ましくは９８％低下させることができる。
【0074】
定義
【0075】
フラグメント
フラグメントは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個、より好ましくは１５０個以上の連続するアミノ酸を含むことができ、機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えばｃＤＮＡのＣ末端連続欠失を使用して決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失変異体の活性を、本明細書に記載の生物学的活性について試験することができる。フラグメントは、当技術分野で知られている適切な分子生物学的方法を用いて生成することができる。
フラグメントは、配列番号１、配列番号２または配列番号３からの少なくとも５０個、好ましくは１００個、より好ましくは１５０個以上の連続するアミノ酸を含むことができ、機能的に活性である。適切には、フラグメントは、例えばｃＤＮＡのＣ末端連続欠失を使用して決定され得る。次いで、前記欠失構築物を適切なプラスミドにクローニングすることができる。次いで、これらの欠失変異体の活性を、本明細書に記載の生物学的活性について試験することができる。フラグメントは、当技術分野で知られている適切な分子生物学的方法を用いて生成することができる。
【0076】
バリアント
バリアントとは、配列番号３と少なくとも９０％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９５％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９６％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９７％相同、最も好ましくは配列番号３と少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を意味する。バリアントは、アミノ酸の置換、特にタンパク質の生物学的活性または立体配置、またはフォールディングの有意な改変をもたらさない可能性が高いことが知られている置換（複数可）を含む、配列番号３のポリペプチド配列を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られ、当技術分野で知られている。例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。適切には、実施形態において、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は互いに置換され得る。適切には、配列をアラインメントしたときに他のアルファサブタイプの類似または同一の位置に存在するアミノ酸へのアミノ酸置換をもたらすように、任意の置換をインターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列アラインメントの分析に基づいて選択することができる。バリアントは、当技術分野で知られている適切な分子生物学的方法を使用して生成することができる。
バリアントとは、配列番号３と少なくとも９０％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９５％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９６％相同、さらにより好ましくは配列番号３と少なくとも９７％相同、最も好ましくは配列番号３と少なくとも９８％相同なアミノ酸配列を意味する。バリアントは、アミノ酸の置換、特にタンパク質の生物学的活性または立体配置、またはフォールディングの有意な改変をもたらさない可能性が高いことが知られている置換（複数可）を含む、配列番号３のポリペプチド配列を包含する。これらの置換は、典型的には保存置換として知られ、当技術分野で知られている。例えば、アルギニン、リジン、およびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。例えば、アルギニン、リジンおよびヒスチジンのグループは、交換可能な塩基性アミノ酸として知られている。適切には、実施形態において、同じ電荷、サイズまたは疎水性のアミノ酸は互いに置換され得る。適切には、配列をアラインメントしたときに他のアルファサブタイプの類似または同一の位置に存在するアミノ酸へのアミノ酸置換をもたらすように、任意の置換をインターフェロンアルファサブタイプのアミノ酸配列アラインメントの分析に基づいて選択することができる。バリアントは、当技術分野で知られている適切な分子生物学的方法を使用して生成することができる。
【0077】
対象
本明細書で定義するように、「対象」は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）などの哺乳動物；マウス、ウサギ、ラット、モルモットなどの実験動物；イヌ、ネコなどの伴侶動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌｓ）を含み、包含する。
本明細書で定義するように、「対象」は、ヒト、霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）などの哺乳動物；マウス、ウサギ、ラット、モルモットなどの実験動物；イヌ、ネコなどの伴侶動物（ｃｏｍｐａｎｉｏｎ ａｎｉｍａｌｓ）を含み、包含する。
【0078】
処置／治療
「処置」という用語は、本明細書では、ヒトまたはヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意のレジメンを指すために使用される。処置はウイルス感染に関するものであり得、処置は予防的（予防的処置）であり得る。処置には、治癒効果または緩和効果が含まれる場合がある。本明細書における「治療的」および「予防的」処置への言及は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」とは、対象が最終的に疾患状態に陥らないことを必ずしも意味しない。したがって、治療的および／または予防的処置には、ウイルス感染の症状の改善、またはウイルス感染を発症するリスクの予防もしくは低減が含まれる。「予防的」という用語は、特定の状態の重症度または発症を軽減するものと見なすことができる。「治療」は、既存の状態の重症度を軽減することもある。
「処置」という用語は、本明細書では、ヒトまたはヒト以外の動物に利益をもたらすことができる任意のレジメンを指すために使用される。処置はウイルス感染に関するものであり得、処置は予防的（予防的処置）であり得る。処置には、治癒効果または緩和効果が含まれる場合がある。本明細書における「治療的」および「予防的」処置への言及は、その最も広い文脈で考慮されるべきである。「治療的」という用語は、対象が完全に回復するまで処置されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防的」とは、対象が最終的に疾患状態に陥らないことを必ずしも意味しない。したがって、治療的および／または予防的処置には、ウイルス感染の症状の改善、またはウイルス感染を発症するリスクの予防もしくは低減が含まれる。「予防的」という用語は、特定の状態の重症度または発症を軽減するものと見なすことができる。「治療」は、既存の状態の重症度を軽減することもある。
【0079】
投与
本明細書に記載のハイブリッド２（配列番号３）は、同じ対象に別々に、任意に順次投与され得るか、または医薬組成物もしくは免疫原性組成物として同時に共投与され得る。
本明細書に記載のハイブリッド２（配列番号３）は、同じ対象に別々に、任意に順次投与され得るか、または医薬組成物もしくは免疫原性組成物として同時に共投与され得る。
【0080】
活性成分は、任意の適切な経路を介して処置を必要とする患者に投与され得る。正確な用量は、以下でより詳細に説明するように、多くの要因に依存する。
【0081】
いくつかの適切な投与経路には、（限定されるものではないが）経口、直腸、経鼻、局所（頬および舌下を含む）、膣もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を含む）投与、または経口もしくは鼻吸入による投与が含まれる。
【0082】
組成物は、注入可能な組成物として送達可能であり、経口投与され、経口または鼻吸入によりエアロゾルとして肺に投与される。
【0083】
１つの適切な投与経路は舌下であり、例えば、対象の舌下に適用される。
【0084】
経口または鼻吸入経路による投与の場合、好ましくは、活性成分は適切な医薬製剤であり、吸入器またはネブライザー装置を含むがこれらに限定されない機械的形態を使用して送達され得る。
【0085】
さらに、経口または鼻吸入経路が使用される場合、ＳＰＡＧ（小粒子エアロゾルジェネレーター）による投与が使用され得る。
【0086】
静脈内注入の場合、活性成分は、パイロジェンフリーで、適切なｐＨ、等張性および安定性を有する、非経口的に許容される水溶液の形態である。当業者であれば、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸リンゲル注射液などの等張ビヒクルを用いて適切な溶液を調製することは十分に可能である。必要に応じて、保存剤、安定剤、緩衝液、酸化防止剤、および／またはその他の添加剤を含めることができる。
【0087】
経口投与用の医薬組成物は、錠剤、カプセル、粉末または液体の形態であり得る。錠剤は、ゼラチンまたはアジュバントなどの固体担体を含んでもよい。液体医薬組成物は、一般に、水、石油、動物油または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールが含まれてもよい。
【0088】
組成物は、血液を含む特定の組織に配置されるミクロスフェア、リポソーム、その他の微粒子送達システムまたは徐放性製剤を介して投与することもできる。徐放性担体の適切な例には、共有物、例えば座薬またはマイクロカプセルの形態の半透性ポリマーマトリックスが含まれる。埋め込み型またはマイクロカプセル型の徐放性マトリックスには、Ｌ－グルタミン酸とガンマエチル－Ｌ－グルタメートのポリラクチドコポリマー、ポリ（２－ヒドロキシエチル－メタクリレート）またはエチレンビニルアセテートが含まれる。
【0089】
上記の技法およびプロトコル、ならびに本発明に従って使用され得る他の技法およびプロトコルの例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（第１６版、Ｏｓｌｏ， Ａ．（編）、１９８０年）に記載されている。
【0090】
医薬組成物
上述のように、本発明は、コロナウイルス感染の処置のための医薬組成物に及ぶ。
上述のように、本発明は、コロナウイルス感染の処置のための医薬組成物に及ぶ。
【0091】
本発明による、および本発明に従って使用するための医薬組成物は、活性成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝安定剤、または当業者によく知られている他の材料を含み得る。そのような材料は、非毒性であるべきであり、活性成分の効力を妨げないものでなければならない。担体または他の材料の正確な性質は、例えば、経口、静脈内、鼻腔内、または経口もしくは鼻吸入による投与経路に依存する。製剤は、ｐＨ６．８～７．６の非リン酸緩衝液を含む生理食塩水などの液体であってもよいし、凍結乾燥粉末またはフリーズドライ粉末であってもよい。
【0092】
用量
組成物は、好ましくは「治療有効量」または「所望の量」で個体に投与され、これは個体に利益を示すのに十分である。本明細書で定義されるように、「有効量」という用語は、所望の反応を少なくとも部分的に得るのに必要な量、または処置される特定の状態の発症を遅らせるか、進行を阻害するか、または発症もしくは進行を完全に止めるのに必要な量を意味する。その量は、処置される対象の健康状態および身体的状態、処置される対象の分類群、望まれる保護の程度、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連要因に応じて変化する。その量は比較的広い範囲に収まることが予想され、日常的な試行により決定される可能性がある。処置の処方、例えば投与量の決定などは、最終的には一般開業医、医師またはその他の医師の責任および裁量によるものであり、通常、処置すべき疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に既知のその他の要因を考慮する。最適な用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置される状態の重症度、投与される活性成分および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて、医師が決定することができる。幅広い用量を適用できる可能性がある。ヒト患者への経口投与を考慮すると、例えば、約１０μｇ～約１０００μｇの薬剤が、ヒト１回当たり、任意で３～４回分投与され得る。投与計画は、最適な治療反応を提供し、副作用を軽減するために調整され得る。例えば、いくつかの分割用量を、毎日、毎週、毎月、または他の適切な時間間隔で投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減らすことができる。
組成物は、好ましくは「治療有効量」または「所望の量」で個体に投与され、これは個体に利益を示すのに十分である。本明細書で定義されるように、「有効量」という用語は、所望の反応を少なくとも部分的に得るのに必要な量、または処置される特定の状態の発症を遅らせるか、進行を阻害するか、または発症もしくは進行を完全に止めるのに必要な量を意味する。その量は、処置される対象の健康状態および身体的状態、処置される対象の分類群、望まれる保護の程度、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連要因に応じて変化する。その量は比較的広い範囲に収まることが予想され、日常的な試行により決定される可能性がある。処置の処方、例えば投与量の決定などは、最終的には一般開業医、医師またはその他の医師の責任および裁量によるものであり、通常、処置すべき疾患、個々の患者の状態、送達部位、投与方法および開業医に既知のその他の要因を考慮する。最適な用量は、例えば、年齢、性別、体重、処置される状態の重症度、投与される活性成分および投与経路を含む多くのパラメータに基づいて、医師が決定することができる。幅広い用量を適用できる可能性がある。ヒト患者への経口投与を考慮すると、例えば、約１０μｇ～約１０００μｇの薬剤が、ヒト１回当たり、任意で３～４回分投与され得る。投与計画は、最適な治療反応を提供し、副作用を軽減するために調整され得る。例えば、いくつかの分割用量を、毎日、毎週、毎月、または他の適切な時間間隔で投与することができ、または状況の緊急性によって示されるように用量を比例的に減らすことができる。
【0093】
別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解される意味を有する。
【図面の簡単な説明】
【0094】
【図10】図１０Ａは、インターフェロン－アルファ２ａ（サンプルＡ）およびハイブリッド２（サンプルＢ）およびコントロール阻害剤によるＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性を示す（ＲＬＵ）。図１０Ｂは、ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイを示す（パーセンテージ値）。
【図20】図２０は、試験品インターフェロン－アルファ１４（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）ならびにコントロール阻害剤によるＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性を示す（ＲＬＵ）。
【図21】図２１は、試験品インターフェロン－アルファ１４（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）についてのＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイを示す（パーセンテージ値）。
【図23】図２３は、試験品インターフェロン－アルファ１４（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）についてのＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞による生存率アッセイを示す（パーセンテージ値）。
【0095】
実験データ
【0096】
実験１：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス感染後の細胞変性効果に対するＩＦＮα－１４およびハイブリッドの効果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染後の細胞変性効果を阻害するハイブリッドの有効性を、細胞変性エンドポイントアッセイで試験した。すべてのエンドポイントアッセイは、マルチサブタイプのマルチフェロンおよびＩＦＮ－α１４、ならびに比較のための抗ウイルスリバビリンを使用して実施された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染後の細胞変性効果を阻害するハイブリッドの有効性を、細胞変性エンドポイントアッセイで試験した。すべてのエンドポイントアッセイは、マルチサブタイプのマルチフェロンおよびＩＦＮ－α１４、ならびに比較のための抗ウイルスリバビリンを使用して実施された。
【0097】
抗ウイルス処置の調製
他のウイルス－宿主の組み合わせに一般的に使用される阻害用量を含む広範囲の濃度（１０倍希釈によって得られた）が試験された。化合物をハンクス緩衝生理食塩水に溶解した。
他のウイルス－宿主の組み合わせに一般的に使用される阻害用量を含む広範囲の濃度（１０倍希釈によって得られた）が試験された。化合物をハンクス緩衝生理食塩水に溶解した。
【0098】
プラークアッセイでは、以下に示すように増殖培地を使用して５倍の薬物希釈液を調製した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１産生および感染アフリカミドリザル（Ｖｅｒｏ Ｅ６）細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、マナサス、バージニア州、米国）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、イスラエル）を添加した１９９培地（Ｓｉｇｍａ、セントルイス、米国）からなる増殖培地を含む７５ｃｍ細胞培養フラスコで増殖させた。ＳＡＲＳ－ＨＣｏＶ２００３ＶＡ２７７４（シンガポールのＳＡＲＳ患者からの分離株）は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で増殖された。簡単に説明すると、２ｍｌのストックウイルスをＶｅｒｏ Ｅ６細胞のコンフルエントな単層に添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次いで、５％ＦＣＳを添加した１３ｍｌの１９９培地を加えた。培養物を５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、倒立顕微鏡で各ウェルを観察することにより、細胞変性効果の阻害を測定した。４８時間後に７５％以上の阻害が観察された場合、上清を回収した。上清を２５００ｒｐｍで清澄化し、凍結バイアルに分注し、使用するまで－８０℃で保存した。
【0099】
ウイルスのハンドリングおよび滴定
凍結培養上清中のウイルス力価は、二重に実施されたプラークアッセイを用いて決定された。簡単に説明すると、１０倍連続希釈の１００マイクロリットルのウイルスを、２４ウェルプレートのＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層に加えた。５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベーションした後、５％ＦＣＳを添加したウイルス１９９培地を加えた。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定し、２％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで染色した。プラークを目視で計数し、１ｍｌあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）でウイルス力価を算出した。
凍結培養上清中のウイルス力価は、二重に実施されたプラークアッセイを用いて決定された。簡単に説明すると、１０倍連続希釈の１００マイクロリットルのウイルスを、２４ウェルプレートのＶｅｒｏ Ｅ６細胞の単層に加えた。５％ＣＯ２中、３７℃で１時間インキュベーションした後、５％ＦＣＳを添加したウイルス１９９培地を加えた。細胞を１０％（ｖ／ｖ）ホルマリンで固定し、２％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレットで染色した。プラークを目視で計数し、１ｍｌあたりのプラーク形成単位（ｐｆｕ／ｍｌ）でウイルス力価を算出した。
【0100】
細胞変性エンドポイントアッセイ
各抗ウイルス処置の効果は、４連で試験された。簡単に説明すると、各処置の連続１０倍希釈液１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのＶｅｒｏ Ｅ６細胞とインキュベートして、９６ウェルプレートのウェルあたり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。インキュベーションは、インターフェロン製剤については５％ＣＯ２中３７℃で一晩、０．５の感染率（ＭＯＩ）（細胞あたりのウイルス粒子）については１時間であった。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートし、細胞変性効果についてプレートを毎日観察した。エンドポイントは、４つのセットアップすべてで細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった。
各抗ウイルス処置の効果は、４連で試験された。簡単に説明すると、各処置の連続１０倍希釈液１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのＶｅｒｏ Ｅ６細胞とインキュベートして、９６ウェルプレートのウェルあたり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。インキュベーションは、インターフェロン製剤については５％ＣＯ２中３７℃で一晩、０．５の感染率（ＭＯＩ）（細胞あたりのウイルス粒子）については１時間であった。プレートを５％ＣＯ２中、３７℃で３日間インキュベートし、細胞変性効果についてプレートを毎日観察した。エンドポイントは、４つのセットアップすべてで細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった。
【0101】
細胞毒性を測定するために、各処置の連続１０倍希釈液１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのＶｅｒｏＥ６細胞とインキュベートし、ウイルスチャレンジなしで、９６ウェルプレートのウェルあたり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。次いで、プレートを５％ＣＯ２中３７℃で３日間インキュベートし、倒立顕微鏡を使用して毒性効果を観察した。
【0102】
次いで、１０，０００ｐｆｕ／ウェルの濃度のウイルス１０マイクロリットルを各試験ウェルに添加した。これは、感染多重度（ＭＯＩ）（細胞あたりのウイルス粒子）０．５に相当する。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートし、細胞変性効果についてプレートを毎日観察した。エンドポイントは、４つのセットアップすべてで細胞変性効果を阻害する希釈濃度であった（ＣＩＡ１００）。
【0103】
細胞毒性を測定するために、各処置の連続１０倍希釈液１００マイクロリットルを１００マイクロリットルのＶｅｒｏＥ６細胞とインキュベートし、ウイルスチャレンジなしで、９６ウェルプレートのウェルあたり２０，０００細胞の最終細胞数を得た。次いで、プレートを５％ＣＯ２中３７℃で３日間インキュベートし、倒立顕微鏡を使用して毒性効果を観察した。完全な阻害を示したインターフェロンは、より低いウイルス力価である１０３および１０２ｐｆｕ／ウェルでさらに試験された。
【0104】
実験２：ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１コロナウイルス感染後のプラーク形成に対するハイブリッドの効果
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染後のプラーク形成を抑制するハイブリッドの有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１感染後のプラーク形成を抑制するハイブリッドの有効性を、プラーク減少アッセイで試験した。
【0105】
プラークアッセイはウイルスストックの１０倍希釈液を使用して行い、０．１ｍｌのアリコートを感受性細胞単層に接種した。ウイルスが細胞に付着するのを可能にするインキュベーション期間の後、単層を、ゲルの形成を引き起こす物質、通常は寒天、を含む栄養培地で覆った。プレートのインキュベーション後、元の感染細胞はウイルスの子孫を放出した。新しいウイルスの拡散は、ゲルによって隣接する細胞に制限される。その結果、各感染性粒子は、プラークと呼ばれる感染細胞の円形ゾーンを生成した。最終的に、プラークは肉眼で見えるほど大きくなった。生細胞とプラークの間のコントラストを高めるために、生細胞を染色する色素が使用された。細胞に目に見える損傷を引き起こしたウイルス、つまりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１のみがこの方法で分析された。
【0106】
これらの結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－１の感染の結果として引き起こされる細胞変性効果とプラーク形成を阻害するハイブリッド２の能力を明確に示している。結果は、抗ウイルス化合物リバビリンおよびマルチサブタイプインターフェロンでであるマルチフェロン（商標）と比較して、細胞変性効果の阻害を示している。
【0107】
実験３：ＩＬ－１７、グランザイムＢ、インターフェロンガンマ、インターフェロンアルファ、ＮＫ細胞に関するアッセイ
主要な免疫モジュレーターに関するインターフェロンアルファ１４およびハイブリッド２を利用したアッセイは、当技術分野で理解されるように行われた。
主要な免疫モジュレーターに関するインターフェロンアルファ１４およびハイブリッド２を利用したアッセイは、当技術分野で理解されるように行われた。
【0108】
免疫細胞殺傷に対するハイブリッド２の効果
ハイブリッド組換えインターフェロンの効果は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭプラットフォームでの免疫細胞殺傷の生細胞イメージングアッセイで試験された。
ハイブリッド組換えインターフェロンの効果は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭプラットフォームでの免疫細胞殺傷の生細胞イメージングアッセイで試験された。
【0109】
この研究では、核を赤色で標識したＳＫ－ＯＶ－３卵巣癌細胞（ＳＫ－ＯＶ－３ ＮｕｃＬｉｇｈｔレッド）を標的細胞として使用した。免疫細胞殺傷のために、細胞をナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と共培養し、陽性コントロールはＩＬ－２およびＩＬ－１２で処置した細胞で構成した。アポトーシスは、カスパーゼ３／７陽性オブジェクトを染色することによって検出され、細胞数は赤色の核の計数によって決定された。共培養モデルの結果を、ＳＫ－ＯＶ－３ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ細胞のみからなる単一培養モデルの結果と比較した。
【0110】
標的細胞とエフェクター細胞の４つの比率をテスト試験する最初の最適化実験を実施した。これらの結果から、９６ウェルプレートのウェルあたり５，０００個のナチュラルキラー細胞と２，０００個のＳＫ－ＯＶ－３ ＮｕｃＬｉｇｈｔレッド細胞が、免疫細胞殺傷を検出するための適切なアッセイウィンドウを提供することが決定された。
【0111】
１０ＩＵ／ｍｌ～３×１０６ＩＵ／ｍｌの範囲のハイブリッド組換えインターフェロンの８つの用量が、免疫細胞殺傷に対する効果について試験された。結果を無処置コントロール、ビヒクル処置コントロールおよびＩＬ－２／ＩＬ－１２処置細胞と比較した。すべての条件は、共培養（ＳＫ－ＯＶ－３ ＮｕｃＬｉｇｈｔおよびＮＫ細胞）および単一培養（ＳＫ－ＯＶ－３ ＮｕｃＬｉｇｈｔ Ｒｅｄ）の細胞を用いて試験された。
【0112】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ ＺＯＯＭを使用して細胞を４日間モニタリングし、ＩｎｃｕＣｙｔｅソフトウェアを使用して緑色（アポトーシス）および赤色（細胞数）のオブジェクト数を経時的に測定した。曲線下面積（ＡＵＣ）分析を使用して、経時的なアポトーシスおよび細胞数を定量化した。
【0113】
ＩＬ－１７、Ｉｌ－６、ＣＣＬ－５、および免疫応答は、Ｃｏｖｉｄ－１９感染後に調節されることが決定されており、特にＣｏｖｉｄ－１９による急性呼吸窮迫症候群ではＩＬ－１７炎症が重要であることが指摘されている。
【0114】
ハイブリッド組換えインターフェロンは共培養モデルでアポトーシスを強力に誘導し、ビヒクルコントロールの２００からハイブリッド組換えインターフェロンの最高用量では１１７４までＡＵＣが増加した。アポトーシス誘導のＥＣ５０は１．５×１０６ＩＵ／ｍｌであった。対照的に、単一培養の細胞は、ハイブリッドｒＩＦＮに対してごくわずかな応答しか示さなかった。
【0115】
ハイブリッド組換えインターフェロンはまた細胞数の減少を引き起こした。細胞数のＡＵＣ値は、ビヒクルコントロールの３９９２１からハイブリッドｒＩＦＮの最高用量では１９５０１に低下した。細胞数の減少について、１．３×１０６ＩＵ／ｍｌのＩＣ５０値が測定された。
【0116】
ハイブリッドｒＩＦＮによるナチュラルキラー細胞の非常に強力な直接活性化の証拠があり、ＮＫ細胞単一培養モデルにおいてハイブリッド組換えインターフェロン処置に応答してＮＫ細胞の細胞クラスタリングが観察された。
【0117】
ハイブリッド２は、Ｉｌ－１７（１７ＡおよびＦの両方を非常に強力に阻害する）、Ｉｌ－６、ＣＣＬ－５、およびＣＣｌ－２を調節し、抗ウイルスＮＫ応答をもたらすことが実証されている。
【0118】
実験４：ＨＩＶおよびＨＲＳＶに対するインターフェロン－アルファ２ａ（サンプルＡ）およびハイブリッド２（サンプルＢ）の抗ウイルス活性の評価
試験品インターフェロン－アルファ２ａ（サンプルＡ）およびハイブリッド２（サンプルＢ）について、総用量（ｆｕｌｌ－ｄｏｓｅ）抗ウイルス試験を実施した。これらの試験品は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）ＬＡＩ株およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）Ｌｏｎｇ株で試験された。すべての試験品は固体で提供され、そこから０．２５ｍｇ／ｍＬ（サンプルＡ）および０．１０ｍｇ／ｍＬ（サンプルＢ）がｄｄＨ２Ｏで調製され、分注され、凍結融解サイクルの繰り返しを防ぐために－８０℃で保存された。
試験品インターフェロン－アルファ２ａ（サンプルＡ）およびハイブリッド２（サンプルＢ）について、総用量（ｆｕｌｌ－ｄｏｓｅ）抗ウイルス試験を実施した。これらの試験品は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）ＬＡＩ株およびヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）Ｌｏｎｇ株で試験された。すべての試験品は固体で提供され、そこから０．２５ｍｇ／ｍＬ（サンプルＡ）および０．１０ｍｇ／ｍＬ（サンプルＢ）がｄｄＨ２Ｏで調製され、分注され、凍結融解サイクルの繰り返しを防ぐために－８０℃で保存された。
【0119】
このプロジェクトでは、さまざまな接着細胞株を利用して、さまざまなウイルスに対する試験品の抗ウイルス活性を評価した。ＲＶＸで実行される標準的なアッセイが、各ウイルスに使用された。簡単に説明すると、試験品は、標的細胞とプレインキュベートするか（ＨＩＶアッセイ）、または、ＨＲＳＶアッセイでは、ウイルスと阻害剤の混合物を細胞に添加する前に、推定阻害剤をウイルスと３０分間プレインキュベートした。阻害剤は、感染期間中、細胞培養培地に存在していた（下記参照）。各抗ウイルスアッセイについて、抗ウイルスアッセイで試験したのと同じ濃度の阻害剤を使用して、生存率試験を並行してセットアップした。生存率アッセイを使用して、ウイルスの非存在下における化合物による細胞毒性効果を決定した。細胞生存率は、ＸＴＴ法によって決定された。生存率アッセイは、対応する抗ウイルスアッセイで評価したのと同じ期間実施された。試験品の９つの濃度（ＨＩＶ－１）および８つの濃度（ＨＲＳＶ）が、二重で評価された。１０μｇ／ｍＬから始まる１０倍連続希釈を評価した。可能であれば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、各アッセイについて阻害剤のＩＣ５０値およびＣＣ５０値を決定した。
【0120】
ＨＩＶ－１アッセイ
ＨＩＶに対する抗ウイルス活性は、ベータ－ガラクトシダーゼ活性を明らかにするキットにより生成された相対発光を用いて評価された。ＨＩＶに対する活性を測定するために、ＨＩＶ感染によりベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導されるＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータｇａｌ細胞を使用した。感染の２日後に感染の程度をモニターした。
ＨＩＶに対する抗ウイルス活性は、ベータ－ガラクトシダーゼ活性を明らかにするキットにより生成された相対発光を用いて評価された。ＨＩＶに対する活性を測定するために、ＨＩＶ感染によりベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導されるＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータｇａｌ細胞を使用した。感染の２日後に感染の程度をモニターした。
【0121】
ＨＲＳＶアッセイ
Ｈｅｐ－２細胞を用いたＨＲＳＶに対する抗ウイルス活性は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス抗原の発現をモニターするイムノアッセイで評価された。異なる濃度のコントロールまたは試験阻害剤の存在下で、細胞をウイルスでチャレンジした。ウイルス抗原のレベルを比色読み出しで定量化することにより、感染の３日後に感染の程度をモニターした。
Ｈｅｐ－２細胞を用いたＨＲＳＶに対する抗ウイルス活性は、ウイルスに感染した細胞におけるウイルス抗原の発現をモニターするイムノアッセイで評価された。異なる濃度のコントロールまたは試験阻害剤の存在下で、細胞をウイルスでチャレンジした。ウイルス抗原のレベルを比色読み出しで定量化することにより、感染の３日後に感染の程度をモニターした。
【0122】
試験品Ａ（インターフェロンアルファ２ａ）および試験品Ｂ（ハイブリッド２）の抗ウイルス活性
全体として、試験品ＡおよびＢは、ＨＩＶ－ＬＡＩおよびＨＲＳＶ－Ｌｏｎｇに対して抗ウイルス活性を示した。ＨＩＶに対するＩＣ５０値は、ＡおよびＢでそれぞれ０．３ｎｇ／ｍＬおよび０．００９ｎｇ／ｍＬであり、ＨＲＳＶに対するＩＣ５０値は、それぞれ０．２ｎｇ／ｍＬおよび０．０３ｎｇ／ｍＬであった（表１）。
全体として、試験品ＡおよびＢは、ＨＩＶ－ＬＡＩおよびＨＲＳＶ－Ｌｏｎｇに対して抗ウイルス活性を示した。ＨＩＶに対するＩＣ５０値は、ＡおよびＢでそれぞれ０．３ｎｇ／ｍＬおよび０．００９ｎｇ／ｍＬであり、ＨＲＳＶに対するＩＣ５０値は、それぞれ０．２ｎｇ／ｍＬおよび０．０３ｎｇ／ｍＬであった（表１）。
【0123】
両方の試験品で処置したＨｅＬａ－ＣＤ４－ｂｅｔａ－ｇａｌ細胞で、細胞生存率の低下が観察された。最も高い細胞生存率阻害（１０μｇ／ｍＬで観察）は、細胞培養物の３０～３３％超には影響をせず（図６、１５頁）、抗ＨＩＶ活性の選択指数はいずれも極めて高い値を示した。注目すべきは、どの阻害剤もＨＩＶ感染を完全に阻止するものではなかったことである。培養物の一部（約２５％と推定）が阻害剤の活性に感応しなかった可能性がある。しかし、並行して評価されたコントロール阻害剤は、ＨＩＶ感染を完全にブロックしている。同様のプロファイル（完全阻害の欠如）は、抗ＨＲＳＶアッセイでも観察されたが、今回は阻害剤が約９４％をブロックした。また、完全阻害の欠如のため、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍで生成されたＩＣ５０値は、阻害効果の５０％が観察される濃度と異なる場合があることに留意することが重要である。
【0124】
ＨＥｐ－２細胞でも化合物による細胞毒性が観察されたが、試験した最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）でも細胞生存率の低下は培養物の５０％に達することはなかった（図１２、２３頁）。ＨＲＳＶでも優れた選択性指数が観察された。
【0125】
以下に示すように、複数の抗ウイルス阻害剤をコントロールとして使用し、試験品ＡおよびＢと並行して実施した。研究に含まれる阻害剤コントロールは、ＨＩＶのヌクレオチド逆転写酵素阻害剤であるＴＡＦ（テノホビルアラフェナミド）、ＨＩＶの侵入をブロックする融合阻害剤ペプチドであるＴ２０（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））、およびＨＲＳＶに対するものを含む幅広い抗ウイルス活性を有するグアノシン類似体であるリバビリンであった。すべての阻害剤が予想通りにそれぞれの標的ウイルスをブロックし、本研究で使用したアッセイの感度を検証した。
【0126】
阻害剤とクオリティコントロール
感染性アッセイのクオリティコントロールをすべてのプレートで実施し、ｉ）シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）値、ｉｉ）既知の阻害剤による阻害、およびｉｉｉ）すべてのレプリケート試験品データポイントの変動係数（Ｃ．Ｖ．）によって測定されるアッセイの変動を決定した。すべてのコントロールは、各アッセイで予想どおりに機能した。既知のＨＩＶ用抗ウイルス剤（ＴＡＦおよびＴ２０）は、試験したいくつかの濃度で９９％超の感染をブロックし、総用量反応曲線で評価すると、文献で報告されているようにウイルスの複製をブロックした。ＨＲＳＶアッセイで使用した抗ウイルスコントロールである広域抗ウイルス薬剤リバビリンは、５０μＭで９９％超の感染をブロックした。ＸＴＴ細胞毒性アッセイで使用した生存率コントロール（エメチン）は、試験したすべての細胞タイプで８５％超の阻害を示した。感染アッセイの全体的な変動は４．４％（ＨＩＶ）および４．９％（ＨＲＳＶ）であり、生存率アッセイの全体的な変動は３．７％（ＨＩＶ）および４．６％（ＨＲＳＶ）であった。感染アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、ＨＩＶアッセイでは３６６倍、ＨＲＳＶアッセイでは３．４倍であった。生存率アッセイのシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、両方のアッセイで１０倍であった。
感染性アッセイのクオリティコントロールをすべてのプレートで実施し、ｉ）シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）値、ｉｉ）既知の阻害剤による阻害、およびｉｉｉ）すべてのレプリケート試験品データポイントの変動係数（Ｃ．Ｖ．）によって測定されるアッセイの変動を決定した。すべてのコントロールは、各アッセイで予想どおりに機能した。既知のＨＩＶ用抗ウイルス剤（ＴＡＦおよびＴ２０）は、試験したいくつかの濃度で９９％超の感染をブロックし、総用量反応曲線で評価すると、文献で報告されているようにウイルスの複製をブロックした。ＨＲＳＶアッセイで使用した抗ウイルスコントロールである広域抗ウイルス薬剤リバビリンは、５０μＭで９９％超の感染をブロックした。ＸＴＴ細胞毒性アッセイで使用した生存率コントロール（エメチン）は、試験したすべての細胞タイプで８５％超の阻害を示した。感染アッセイの全体的な変動は４．４％（ＨＩＶ）および４．９％（ＨＲＳＶ）であり、生存率アッセイの全体的な変動は３．７％（ＨＩＶ）および４．６％（ＨＲＳＶ）であった。感染アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、ＨＩＶアッセイでは３６６倍、ＨＲＳＶアッセイでは３．４倍であった。生存率アッセイのシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、両方のアッセイで１０倍であった。
【0127】
【表1】
【0128】
１．シグナル対バックグラウンドレベルは、感染性アッセイにおいて、ビヒクルのみの存在下で感染した細胞のシグナルを、非感染細胞（「モック感染」）のシグナルで割ることによって算出した。細胞毒性アッセイのシグナル対バックグラウンドレベルは、ビヒクルのみ（培地のみ）の存在下における細胞のシグナルを、細胞を含まないウェル（「細胞なし」）のシグナルで割ることによって算出した。
２．アッセイのＣ．Ｖ．は、すべてのレプリケート試験品データポイントについて決定されたＣ．Ｖ．値の平均として算出する。
３．選択性指数（Ｓ．Ｉ．）は、ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割ることによって算出する。
２．アッセイのＣ．Ｖ．は、すべてのレプリケート試験品データポイントについて決定されたＣ．Ｖ．値の平均として算出する。
３．選択性指数（Ｓ．Ｉ．）は、ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割ることによって算出する。
【0129】
表１．結果のまとめ。ＩＣ５０（感染性）、ＣＣ５０（細胞生存率）、および選択性指数（Ｓ．Ｉ．）の値が、各ウイルスと各試験品について示されている。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）やすべてのレプリケート試験品データポイントの平均変動係数（Ｃ．Ｖ．）など、各アッセイのクオリティコントロールも示されている。試験した最高濃度で阻害の程度が５０％に達しなかったアッセイの生存率（ＣＣ５０）および感染性（ＩＣ５０）の値は、＞１０μｇ／ｍＬ（生存率または感染性）として示されている。場合によっては、既知の抗ウイルスコントロールを総用量反応曲線と並行して評価し、得られたＩＣ５０値およびＣＣ５０値を示している。
【0130】
実験手順－β－ガラクトシダーゼ読み出しによる抗ウイルスアッセイ
ＨＩＶ－１感染性アッセイ
感染性アッセイは、試験品の存在下または非存在下で、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞をＨＩＶ－１ ＬＡＩでチャレンジすることによって実施した。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞は、ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターの制御下でベータ－ガラクトシダーゼを発現する。ＨＩＶに感染し、ウイルスのＴａｔタンパク質を発現すると、ベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導される。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、白色のＴＣ処理９６ウェル平底プレートにウェルあたり１２，０００細胞で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ１０と称する）で維持した。試験品は、ＤＭＥＭ１０を使用してＵ底プレートで１０倍に希釈した。試験物質の希釈液は、最終濃度の１．２５倍で調製した。細胞を１．２５倍希釈した試験物質とともに３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした（１ウェルあたり８０μＬ）。試験物質のプレインキュベーションに続いて、ＤＭＥＭ１０で調製したＨＩＶ－ＬＡＩウイルスを細胞に添加し（ウェルあたり２０μＬ）、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルには１００μＬの最終容量が含まれていた。アッセイで使用するウイルスの量は、既知のＨＩＶ－１阻害剤であるＴＡＦおよびＴ２０によって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。感染は重複反応で行った。感染の２日後、Ｇａｌａｃｔｏｎ－Ｓｔａｒ（登録商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して細胞をベータ－ガラクトシダーゼ活性についてモニターした。Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ試験は、哺乳動物細胞ライセート中のベータ－ガラクトシダーゼを検出する感度の高い化学発光アッセイである。発光は、１秒の読み出しで測定された。０．０００１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲で、試験品の連続１０倍希釈液の複製からの９つのデータポイントが評価された。コントロールには、ウイルスなしでインキュベートした細胞（「モック感染」）、ビヒクルのみ（ＤＭＥＭ１０）で感染およびインキュベートした細胞、またはＴＡＦとＴ２０（ＨＩＶ感染の既知の阻害剤）の存在下で、２０μＭから始まる総用量反応（単一データポイント）または０．５μＭで感染させた細胞が含まれていた。
ＨＩＶ－１感染性アッセイ
感染性アッセイは、試験品の存在下または非存在下で、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞をＨＩＶ－１ ＬＡＩでチャレンジすることによって実施した。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞は、ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターの制御下でベータ－ガラクトシダーゼを発現する。ＨＩＶに感染し、ウイルスのＴａｔタンパク質を発現すると、ベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導される。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、白色のＴＣ処理９６ウェル平底プレートにウェルあたり１２，０００細胞で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ１０と称する）で維持した。試験品は、ＤＭＥＭ１０を使用してＵ底プレートで１０倍に希釈した。試験物質の希釈液は、最終濃度の１．２５倍で調製した。細胞を１．２５倍希釈した試験物質とともに３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした（１ウェルあたり８０μＬ）。試験物質のプレインキュベーションに続いて、ＤＭＥＭ１０で調製したＨＩＶ－ＬＡＩウイルスを細胞に添加し（ウェルあたり２０μＬ）、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルには１００μＬの最終容量が含まれていた。アッセイで使用するウイルスの量は、既知のＨＩＶ－１阻害剤であるＴＡＦおよびＴ２０によって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。感染は重複反応で行った。感染の２日後、Ｇａｌａｃｔｏｎ－Ｓｔａｒ（登録商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して細胞をベータ－ガラクトシダーゼ活性についてモニターした。Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ試験は、哺乳動物細胞ライセート中のベータ－ガラクトシダーゼを検出する感度の高い化学発光アッセイである。発光は、１秒の読み出しで測定された。０．０００１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲で、試験品の連続１０倍希釈液の複製からの９つのデータポイントが評価された。コントロールには、ウイルスなしでインキュベートした細胞（「モック感染」）、ビヒクルのみ（ＤＭＥＭ１０）で感染およびインキュベートした細胞、またはＴＡＦとＴ２０（ＨＩＶ感染の既知の阻害剤）の存在下で、２０μＭから始まる総用量反応（単一データポイント）または０．５μＭで感染させた細胞が含まれていた。
【0131】
ＨＩＶ－１感染性アッセイのクオリティコントロール（ＱＣ）
アッセイにおける平均Ｓ／Ｂは３６６（バックグラウンドは「モック感染」細胞を用いて決定したバックグラウンド）であったが、すべてのデータポイントの平均変動は４．４％（Ｃ．Ｖ．値）および３．６％（５０％を超える感染を示すすべてのウェルのＣ．Ｖ．値）であった。ウイルスの非存在下におけるモック感染細胞で観察されたバックグラウンドレベルは、すべてのサンプルから差し引かれた。このアッセイで使用したコントロール抗ウイルス剤（ＴＡＦ ０．５μＭおよびＴ－２０ ０．５μＭ）は、感染をほぼ１００％ブロックした。
アッセイにおける平均Ｓ／Ｂは３６６（バックグラウンドは「モック感染」細胞を用いて決定したバックグラウンド）であったが、すべてのデータポイントの平均変動は４．４％（Ｃ．Ｖ．値）および３．６％（５０％を超える感染を示すすべてのウェルのＣ．Ｖ．値）であった。ウイルスの非存在下におけるモック感染細胞で観察されたバックグラウンドレベルは、すべてのサンプルから差し引かれた。このアッセイで使用したコントロール抗ウイルス剤（ＴＡＦ ０．５μＭおよびＴ－２０ ０．５μＭ）は、感染をほぼ１００％ブロックした。
【0132】
実験手順 － 抗ウイルスアッセイ（免疫染色手順）
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）に対する抗ウイルス活性を決定するために、免疫染色アッセイを用いて感染の程度をモニターした。このタイプのアッセイでは、感染細胞を固定した後、抗ＲＳＶ抗体のカクテルを用いて、比色読み出しでウイルス抗原の量を定量化する。
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）に対する抗ウイルス活性を決定するために、免疫染色アッセイを用いて感染の程度をモニターした。このタイプのアッセイでは、感染細胞を固定した後、抗ＲＳＶ抗体のカクテルを用いて、比色読み出しでウイルス抗原の量を定量化する。
【0133】
ＨＲＳＶ感染性アッセイ
ＨＲＳＶ感染性アッセイでは、ＨＲＳＶのＬｏｎｇ株を用いて、ＨＥｐ－２細胞（ヒト子宮頸部上皮腺癌）に感染させた。細胞は、播種手順のために１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ中で維持した。感染の前日、細胞を１２，０００細胞／ウェルで９６ウェル透明平底プレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。感染当日、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ（以下、ＭＥＭ２と称する。）を用いて、試験品をＵ底プレートで連続希釈（１０倍）した。希釈液は、最終濃度の２倍で調製した。ＭＥＭ２で希釈した等量（３０μＬ）のＬｏｎｇウイルスを、３０μＬの２倍濃縮の試験品と共に室温で３０分間インキュベートした。アッセイで使用するウイルスの量は、ウイルスＲＮＡ合成とウイルスｍＲＮＡキャッピングをブロックするヌクレオシド類似体に代謝されるプロドラッグであるリバビリンによって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。３０分間のプレインキュベーション後、細胞をＭＥＭ２で洗浄し、５０μＬのウイルス／サンプル混合物を細胞に加え、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートした。ウイルスの侵入を可能にした後、ＭＥＭ２中の対応する試験品またはコントロール阻害剤の追加量を各ウェルに加えた。インキュベーションは、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で３日間行った。
ＨＲＳＶ感染性アッセイでは、ＨＲＳＶのＬｏｎｇ株を用いて、ＨＥｐ－２細胞（ヒト子宮頸部上皮腺癌）に感染させた。細胞は、播種手順のために１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ中で維持した。感染の前日、細胞を１２，０００細胞／ウェルで９６ウェル透明平底プレートに播種し、３７℃で２４時間インキュベートした。感染当日、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＭＥＭ（以下、ＭＥＭ２と称する。）を用いて、試験品をＵ底プレートで連続希釈（１０倍）した。希釈液は、最終濃度の２倍で調製した。ＭＥＭ２で希釈した等量（３０μＬ）のＬｏｎｇウイルスを、３０μＬの２倍濃縮の試験品と共に室温で３０分間インキュベートした。アッセイで使用するウイルスの量は、ウイルスＲＮＡ合成とウイルスｍＲＮＡキャッピングをブロックするヌクレオシド類似体に代謝されるプロドラッグであるリバビリンによって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。３０分間のプレインキュベーション後、細胞をＭＥＭ２で洗浄し、５０μＬのウイルス／サンプル混合物を細胞に加え、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で１時間インキュベートした。ウイルスの侵入を可能にした後、ＭＥＭ２中の対応する試験品またはコントロール阻害剤の追加量を各ウェルに加えた。インキュベーションは、５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で３日間行った。
【0134】
ＭＥＭ２による連続１０倍希釈を用いて、試験品を二重に評価した。コントロールには、ウイルスなしでインキュベートした細胞（「モック感染」）、ビヒクルのみで感染およびインキュベートした細胞（ＭＥＭ２）、および５０μＭのリバビリン（広域スペクトル抗ウイルス剤）の存在下で感染した細胞が含まれていた。感染の３日後、感染レベルを定量化するために、さまざまな抗ＨＲＳＶ抗体のカクテルを使用した免疫染色プロトコルで細胞を染色した。次に、細胞を洗浄して固定し、ウイルス抗原の量を、いくつかのウイルス抗原に対するマウスモノクローナル抗体のカクテルを利用したＨＲＳＶ特異的免疫染色アッセイで推定した。アッセイのバックグラウンドレベルを決定するために、ビヒクルのみの存在下でウイルスとインキュベートした細胞、コントロール阻害剤であるリバビリンの存在下でウイルスとインキュベートした細胞、またはウイルスの非存在下でインキュベートした細胞（「モック感染」コントロール）を含む、一連のコントロールを各９６ウェルプレートで実行した。ビヒクルのみと比較した活性パーセントを算出する前に、すべてのデータポイントからバックグラウンドを差し引いた。
【0135】
ＨＲＳＶ感染性アッセイのクオリティコントロール（ＱＣ）
感染性は、４９０ｎｍの吸光度をモニターすることによって決定した。アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は３．４であり、ＭＥＭ２のみで処置した感染細胞のパーセンテージと、「モック感染」細胞のパーセンテージを比較したものとして決定された。すべての反復試験品データポイントの平均変動は４．９％（すべてのＣ．Ｖ．値の平均）、および６．３％（５０％を超える感染を示すすべての試験品ウェルのＣ．Ｖ．値）であった。
感染性は、４９０ｎｍの吸光度をモニターすることによって決定した。アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）は３．４であり、ＭＥＭ２のみで処置した感染細胞のパーセンテージと、「モック感染」細胞のパーセンテージを比較したものとして決定された。すべての反復試験品データポイントの平均変動は４．９％（すべてのＣ．Ｖ．値の平均）、および６．３％（５０％を超える感染を示すすべての試験品ウェルのＣ．Ｖ．値）であった。
【0136】
実験手順－細胞毒性アッセイ
化合物による細胞毒性を評価するための生存率アッセイ（ＸＴＴ）
非感染細胞を、感染性アッセイで使用した濃度よりも1用量高い試験品濃度を使用して、試験品またはコントロールの生存率阻害剤希釈液とインキュベートした。インキュベーション温度とインキュベーション期間は、対応する感染性アッセイの条件を反映させた。細胞生存率はＸＴＴ法で評価した。テトラゾリウム塩（ＸＴＴ）は、活性なミトコンドリアを有する生存細胞でのみ発生する反応を通じて、オレンジ色のホルマザン色素に切断される。ホルマザン色素は、走査マルチウェル分光光度計を使用して直接定量化される。細胞なしのウェルから得られたバックグラウンドレベルは、すべてのデータポイントから差し引かれた。４９０ｎｍで吸光度を測定することにより、生存率をモニターした。
化合物による細胞毒性を評価するための生存率アッセイ（ＸＴＴ）
非感染細胞を、感染性アッセイで使用した濃度よりも1用量高い試験品濃度を使用して、試験品またはコントロールの生存率阻害剤希釈液とインキュベートした。インキュベーション温度とインキュベーション期間は、対応する感染性アッセイの条件を反映させた。細胞生存率はＸＴＴ法で評価した。テトラゾリウム塩（ＸＴＴ）は、活性なミトコンドリアを有する生存細胞でのみ発生する反応を通じて、オレンジ色のホルマザン色素に切断される。ホルマザン色素は、走査マルチウェル分光光度計を使用して直接定量化される。細胞なしのウェルから得られたバックグラウンドレベルは、すべてのデータポイントから差し引かれた。４９０ｎｍで吸光度を測定することにより、生存率をモニターした。
【0137】
細胞毒性データのクオリティコントロール（ＱＣ）および分析
細胞を含まないウェルで得られた平均シグナルをすべてのサンプルから差し引いた。読み出し値は、ビヒクルのみ（培地のみ）で処置した非感染細胞で観察された平均シグナルのパーセンテージとして与えられた。得られたシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、１０．２（４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞）、１０．４（３日間インキュベートしたＨＥｐ－２細胞）であった。エメチンは、生存率アッセイにおいて細胞毒性化合物コントロールとして使用され、１μＭで９０％超の細胞生存率を阻害した。
細胞を含まないウェルで得られた平均シグナルをすべてのサンプルから差し引いた。読み出し値は、ビヒクルのみ（培地のみ）で処置した非感染細胞で観察された平均シグナルのパーセンテージとして与えられた。得られたシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は、１０．２（４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞）、１０．４（３日間インキュベートしたＨＥｐ－２細胞）であった。エメチンは、生存率アッセイにおいて細胞毒性化合物コントロールとして使用され、１μＭで９０％超の細胞生存率を阻害した。
【0138】
結果－ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）抗ウイルス活性
【0139】
【表2】
【0140】
表２．ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイ（ＲＬＵ）。個々のβ－ガラクトシダーゼ発光ＲＬＵ値が、評価された各データポイントについて示されている。「モック」と示されたものを除いて、すべてのサンプルが感染した。ＴＡＦおよびＴ２０で処置したサンプルも示されている。さまざまな濃度のＴＡＦおよびＴ２０も評価した。試験品の濃度はナノグラム／ミリリットルで示され、コントロール抗ウイルス剤はμＭで示されている。
【0141】
図１０Ａは、サンプルＡ（インターフェロン－アルファ２ａ）およびサンプルＢ（ハイブリッド２）ならびにコントロール阻害剤（ＲＬＵ）によるＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性を示す。データは、ビヒクル単独またはさまざまな濃度の試験品の存在下で感染させたＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を含むウェルにおける相対発光単位（ＲＬＵ）値として示されている（重複の平均と標準偏差）。非感染細胞は「モック」として表示される。ＴＡＦおよびＴ２０は、抗ウイルスコントロールとして含まれている（総用量反応における単一データポイント、または０．５μＭにおける重複データポイントの平均）。
【0142】
【表3】
【0143】
表３．ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイ（ビヒクルに対するパーセンテージ）。データは、ビヒクルのみ（ＤＭＥＭ１０）で処置したウェルから得られた値のパーセンテージとして、（ベータ－ガラクトシダーゼ発光によって測定される）ＨＩＶ感染のパーセンテージを表す。各プレートの非感染細胞から得られた平均値が、ビヒクルのみに正規化する前に、すべての生の値（ｒａｗ ｖａｌｕｅｓ）から差し引かれた。試験品とビヒクルについて、それぞれ２重レプリケートまたは６重レプリケートの平均とその標準偏差が示されている。ＴＡＦおよびＴ２０の用量反応曲線については単一データポイントを、０．５μＭ濃度については重複データポイントを示している。
【0144】
図１０Ｂは、ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイを示す（パーセンテージ値）。結果は、４８時間でのベータ－ガラクトシダーゼアッセイ（発光読み出し）によって決定されたＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染の程度を示す。データは、試験品の非存在下（ビヒクルのみ）における細胞で観察された活性に対して正規化されている。試験品の結果は、二重データポイントの平均および標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。また、ＴＡＦおよびＴ２０で観察された用量反応（単一データポイント）も含まれている。
【0145】
図１１Ａおよび図１１Ｂは、サンプルＡ（図１１Ａ）およびサンプルＢ（図１１Ｂ）のＨＩＶ－１感染性についてのＩＣ５０値の決定を示す。値は、ビヒクルのみでインキュベートしたサンプルと比較したＨＩＶ感染性のパーセンテージを示す。結果は、重複データポイントの平均と標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。データはシグモイド関数に調整され、ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。ＩＣ５０値を表１にまとめる。
【0146】
図１２Ａおよび図１２Ｂは、コントロール抗ウイルス剤のＨＩＶ－１感染性についてのＩＣ５０値の決定を示す。値は、ビヒクルのみでインキュベートしたサンプルと比較したＨＩＶ－１感染性のパーセンテージを示す。結果は、コントロール抗ウイルス剤の単一データポイントを示す。データはシグモイド関数に調整され、ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。ＩＣ５０値を表１にまとめる。
【0147】
結果－ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）に対する細胞毒性アッセイ
【0148】
【表4】
【0149】
表４．ＸＴＴアッセイによって決定された、試験品の存在下におけるＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞の生存率（Ａ４９０）。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、さまざまな濃度の試験品の存在下で、またはビヒクルのみ（培地のみ）とともにインキュベートした。各データポイントについて、個々の生データを表示する（４９０ｎｍの吸光度値）。下の表は、コントロールサンプルの生データ値を示す。
【0150】
【表5】
【0151】
表５．ＸＴＴアッセイにおけるＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞の生存率（パーセント値）。データは、４８時間後にビヒクル（培地のみ）で処置した非感染ＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞から得られた値のパーセンテージとして生存率を表す。バックグラウンドウェルから得られた平均値は、ビヒクルに正規化する前にすべての生の値（ｒａｗ ｖａｌｕｅｓ）から差し引かれた。データは、該当する場合、重複の平均および標準偏差を表す。
【0152】
図１３は、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を用いた生存率アッセイを示す（パーセント値）。結果は、４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞における化合物による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。データは、試験品の非存在下でビヒクルのみ（培地のみ）における細胞で観察された値に正規化されている。結果は、試験品についての重複データポイントの平均および標準偏差（ｓ．ｄ）を示す。ＴＡＦおよびＴ２０で観察された用量反応も含まれている（単一データポイント）。
【0153】
図１４Ａおよび図１４Ｂは、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞におけるサンプルＡ（図１４Ａ）およびサンプルＢ（図１４Ｂ）についてのＣＣ５０値の決定を示す（パーセント値）。結果は、４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞における試験品による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。値は、ビヒクルのみ（培地のみ）でインキュベートしたサンプルで観察された生存率に対するパーセンテージとして推定される％生存率を示す。結果は、重複データポイントの平均を示す。データはシグモイド関数に調整され、ＣＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。生存率が５０％に達しなかった場合、報告されたＣＣ５０値は１０μｇ／ｍＬ超であった。ＣＣ５０値を表１に示す。
【0154】
図１５Ａおよび図１５Ｂは、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を用いたコントロール抗ウイルス剤についてのＣＣ５０値の決定を示す（パーセント値）。結果は、４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞における試験品による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。値は、ビヒクルのみ（培地のみ）でインキュベートしたサンプルで観察された生存率に対するパーセンテージとして推定される％生存率を示す。結果は単一データポイントを示す。データはシグモイド関数に調整され、ＣＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。生存率が５０％に達しなかった場合、報告されたＣＣ５０値は２０μＭ超であった。ＣＣ５０値を表１に示す。
【0155】
結果－ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）抗ウイルス活性
【0156】
【表6】
【0157】
表６．ＨＲＳＶ感染性アッセイ（Ａ４９０）。個々の生存率の値（４９０ｎｍで測定された吸光度によって定量化）が、各テスト条件について示されている。感染細胞は、吸光度レベルの上昇を示す。各試験品濃度について、Ａ４９０の値が重複して示されている。「モック」と示されたものを除いて、すべてのサンプルが感染した。リバビリン（Ｒｉｂ）５０μＭで処置したサンプルも示されている。試験品の濃度はナノグラム／ミリリットルで示され、ＲｉｂはμＭで示されている
【0158】
図１６は、試験品によるＨＲＳＶ阻害を示す（Ａ４９０）。データは、ビヒクルのみまたはさまざまな濃度の試験品の存在下で感染したＨＥｐ－２細胞を含むウェルのＡ４９０値として示される（重複の平均と標準偏差）。非感染細胞は「モック」として表示される。バックグラウンドレベルは、細胞を含まないウェル（「細胞なし」）で示されている。Ｒｉｂ ５０μＭは、コントロール抗ウイルス剤として示されている。
【0159】
【表7】
【0160】
表７．ＨＲＳＶ感染性アッセイ（パーセント値）。データは、ビヒクルのみ（培地のみ）で処置した感染ウェルから得られた値のパーセンテージとして感染性を表す。「モック」と示されたものを除いて、以下に示すすべてのサンプルが感染した。一部のサンプルは、コントロール抗ウイルス剤であるリバビリン（Ｒｉｂ ５０μＭ）で処置されている。試験品の濃度はナノグラム／ミリリットルで示され、抗ウイルス剤の濃度はμＭで示される。試験品について表示されたデータは、重複の平均および標準偏差を表す。非感染細胞（「モック」）と「ビヒクル」については、平均および標準偏差はそれぞれ４回の複製から得られた。
【0161】
図１７は、ＨＲＳＶ感染性アッセイを示す（パーセンテージ値）。結果は、７２時間後の感染性について４９０ｎｍでの免疫染色の読み出しによって、ＨＲＳＶ感染の程度を示している。データは、試験品の非存在下（ビヒクルのみ）における細胞で観察された活性に対して正規化されている。試験品の結果は、重複データポイントの平均と標準偏差を示す。
【0162】
図１８Ａおよび図１８Ｂは、ＨＲＳＶ感染性におけるサンプルＡ（図１８Ａ）およびサンプルＢ（図１８Ｂ）についてのＩＣ５０値の決定を示す（パーセント値）。結果は、ビヒクルのみ（培地のみ）でインキュベートしたサンプルと比較した、７２時間でのＨＲＳＶ感染の程度を示す。結果は、重複データポイントの平均を示す。可能な場合、データはシグモイド関数に調整され、ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。ＩＣ５０値を表１にまとめる。
【0163】
結果－ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＨＲＳＶ）に対する細胞毒性アッセイ
【0164】
【表8】
【0165】
表８．ＸＴＴアッセイによって決定される、試験品の存在下におけるＨＥｐ－２細胞の生存率（Ａ４９０）。ＨＥｐ－２細胞は、さまざまな濃度の試験品の存在下で、またはビヒクルのみ（培地のみ）とともにインキュベートされた。各試験品について重複データポイントが表示されている。個々の生データが表示されている（４９０ｎｍの吸光度値）。下の表は、コントロールサンプルの生データ値を示す。
【0166】
【表9】
【0167】
表９．ＸＴＴアッセイにおけるＨＥｐ－２の生存率（パーセント値）。データは、７２時間後にビヒクル（培地のみ）で処置した非感染ＨＥｐ－２細胞から得られた値のパーセンテージとして生存率を表す。バックグラウンドウェルから得られた平均値は、ビヒクルに正規化する前にすべての生の値（ｒａｗ ｖａｌｕｅｓ）から差し引かれた。試験品について、重複の平均とその標準偏差を示す。ビヒクル（培地のみ）の場合、平均および標準偏差は６回の複製から導出された。
【0168】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、ＨＥｐ－２細胞を用いたサンプルＡ（図１９Ａ）およびサンプルＢ（図１９Ｂ）についてのＣＣ５０値の決定（パーセント値）を示す。結果は、７２時間インキュベートしたＨＥｐ－２細胞における試験品による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。値は、ビヒクルのみ（培地のみ）でインキュベートしたサンプルで観察された生存率に対するパーセンテージとして推定される％生存率を示す。データは、各試験品の重複データポイントを表す。データはシグモイド関数に調整され、ＣＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。細胞生存率の低下が５０％に達しなかった場合、報告されたＣＣ５０値は１０μＭ超として示された。ＣＣ５０値も表１に示す。
【0169】
実験５：ＨＩＶに対するインターフェロン－アルファ１４（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）の抗ウイルス活性の評価
試験品であるインターフェロン－アルファ１（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）、およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）について、総用量（Ｆｕｌｌ－ｄｏｓｅ）抗ウイルス試験を実施した。これらの試験品は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）ＬＡＩ株で試験された。すべての試験品は固体で提供され、そこから０．２５ｍｇ／ｍＬ（サンプルＡ）、１．０ｍｇ／ｍＬ（サンプルＢ）、および０．０２ｍｇ／ｍＬ（サンプルＣ）をｄｄＨ２Ｏで調製し、分注し、そして凍結融解サイクルの繰り返しを防ぐために－８０℃で保存した。
試験品であるインターフェロン－アルファ１（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）、およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）について、総用量（Ｆｕｌｌ－ｄｏｓｅ）抗ウイルス試験を実施した。これらの試験品は、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）ＬＡＩ株で試験された。すべての試験品は固体で提供され、そこから０．２５ｍｇ／ｍＬ（サンプルＡ）、１．０ｍｇ／ｍＬ（サンプルＢ）、および０．０２ｍｇ／ｍＬ（サンプルＣ）をｄｄＨ２Ｏで調製し、分注し、そして凍結融解サイクルの繰り返しを防ぐために－８０℃で保存した。
【0170】
ＨＩＶ抗ウイルスアッセイは、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を利用してＨＩＶ－１感染の阻害を評価する。ＨＩＶに感染すると、ベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導される。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、異なる濃度の試験品の存在下でＨＩＶ ＬＡＩに感染させた。ＨＩＶ ＬＡＩウイルスストックは、プロウイルスＤＮＡを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトすることによって生成され、４８時間後に収集され、感染まで凍結された。このプロジェクトでは、ＨＩＶ ＬＡＩウイルスを細胞に添加する前に、試験品を標的細胞と３７℃で３０分間プレインキュベートした。阻害剤は、感染期間中、細胞培養培地中に存在していた。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞の感染の程度は、ベータ－ガラクトシダーゼ活性を評価し、値をビヒクルのみ（組織培養培地）で処置した細胞と比較することにより、４８時間後にモニターした。
【0171】
生存率試験は、抗ウイルスアッセイで評価したものと同じ濃度の試験品を用いて並行して設定された。生存率アッセイを使用して、ウイルスの非存在下における試験品による細胞毒性効果を決定した。細胞生存率は、ＸＴＴ法によって決定した。生存率アッセイは、抗ウイルスアッセイで評価した期間と同じ期間で実施した。
【0172】
試験品の９つの濃度が、重複して評価された。１０μｇ／ｍＬから始まる１０倍連続希釈を評価した。可能であれば、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、各アッセイについて阻害剤のＩＣ５０値およびＣＣ５０値を決定した。
【0173】
試験品Ａ（インターフェロン－アルファ１４）、試験品Ｂ（ハイブリッド２）および試験品Ｃ（インターフェロン－ベータ１ａ）の抗ウイルス活性
すべての試験品Ａ、ＢおよびＣは、ＨＩＶ－ＬＡＩに対する抗ウイルス活性を示した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで生成されたＩＣ５０値は、Ａ、ＢおよびＣについて、それぞれ、０．０４ｎｇ／ｍＬ、０．０３ｎｇ／ｍＬおよび１１３．１ｎｇ／ｍＬであった（表１）。試験品ＡおよびＢはＨＩＶ感染性を完全にブロックするわけではなく、試験した最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）でも感染シグナルの約２５％が観察された。この理由は不明であるが、培養物の一部が試験品ＡおよびＢの活性に感応しない可能性がある。並行して評価したコントロール阻害剤Ｔ－２０（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））は、細胞生存率の低下を最小限に抑えつつＨＩＶ感染を完全にブロックした。Ｔ－２０は、ＨＩＶの侵入をブロックする融合阻害ペプチドである。
すべての試験品Ａ、ＢおよびＣは、ＨＩＶ－ＬＡＩに対する抗ウイルス活性を示した。ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェアで生成されたＩＣ５０値は、Ａ、ＢおよびＣについて、それぞれ、０．０４ｎｇ／ｍＬ、０．０３ｎｇ／ｍＬおよび１１３．１ｎｇ／ｍＬであった（表１）。試験品ＡおよびＢはＨＩＶ感染性を完全にブロックするわけではなく、試験した最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）でも感染シグナルの約２５％が観察された。この理由は不明であるが、培養物の一部が試験品ＡおよびＢの活性に感応しない可能性がある。並行して評価したコントロール阻害剤Ｔ－２０（エンフビルチド（ｅｎｆｕｖｉｒｔｉｄｅ））は、細胞生存率の低下を最小限に抑えつつＨＩＶ感染を完全にブロックした。Ｔ－２０は、ＨＩＶの侵入をブロックする融合阻害ペプチドである。
【0174】
試験品ＡおよびＢについて観察された阻害プロファイルは、ＨＩＶ感染性の５０％阻害をもたらす濃度とは異なるＩＣ５０値につながる可能性があることに注意することが重要である。ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍによって生成された値は、５０％阻害を達成する濃度よりも低かった。
【0175】
試験品ＣでＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞を処置すると、試験した最高濃度（１０μｇ／ｍＬ）で細胞生存率がわずかに低下した（～２５％）（図６、１１頁）。細胞毒性の用量依存的な傾向は、試験品Ａでも観察された。抗ＨＩＶ活性の選択性指数は、試験品Ｃと比較して、試験品ＡおよびＢで有意に高かった。
【0176】
コントロール阻害剤とクオリティコントロール
感染性アッセイのクオリティコントロールをすべてのプレートで実施し、ｉ）シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）値、ｉｉ）既知の阻害剤による阻害、およびｉｉｉ）すべてのレプリケート試験品データポイントの変動係数（Ｃ．Ｖ．）によって測定されるアッセイの変動を決定した。すべてのコントロールは、各アッセイで予想どおりに機能した。既知のＨＩＶ用抗ウイルス剤（Ｔ２０）は、０．５μＭで９９％超の感染をブロックし、ＸＴＴ細胞毒性アッセイで使用した生存率コントロール（エメチンおよび１０％ＤＭＳＯ）は９５％超の細胞生存率を阻害した。感染アッセイの全体的な変動は５．７％であり、生存率アッセイの全体的な変動は６．２％であった。感染アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は２５５倍、生存率アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は７．８倍であった。
感染性アッセイのクオリティコントロールをすべてのプレートで実施し、ｉ）シグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）値、ｉｉ）既知の阻害剤による阻害、およびｉｉｉ）すべてのレプリケート試験品データポイントの変動係数（Ｃ．Ｖ．）によって測定されるアッセイの変動を決定した。すべてのコントロールは、各アッセイで予想どおりに機能した。既知のＨＩＶ用抗ウイルス剤（Ｔ２０）は、０．５μＭで９９％超の感染をブロックし、ＸＴＴ細胞毒性アッセイで使用した生存率コントロール（エメチンおよび１０％ＤＭＳＯ）は９５％超の細胞生存率を阻害した。感染アッセイの全体的な変動は５．７％であり、生存率アッセイの全体的な変動は６．２％であった。感染アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は２５５倍、生存率アッセイにおけるシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は７．８倍であった。
【0177】
【表10】
【0178】
１．シグナル対バックグラウンドレベルは、感染性アッセイにおいて、ビヒクルのみの存在下で感染した細胞のシグナルを、非感染細胞（「モック感染」）のシグナルで割ることによって算出した。細胞毒性アッセイのシグナル対バックグラウンドレベルは、ビヒクルのみ（培地のみ）の存在下における細胞のシグナルを、細胞を含まないウェル（「細胞なし」）のシグナルで割ることによって算出した。
２．アッセイのＣ．Ｖ．は、すべてのレプリケート試験品データポイントについて決定されたＣ．Ｖ．値の平均として算出する。
３．選択性指数（Ｓ．Ｉ．）は、ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割ることによって算出する。
２．アッセイのＣ．Ｖ．は、すべてのレプリケート試験品データポイントについて決定されたＣ．Ｖ．値の平均として算出する。
３．選択性指数（Ｓ．Ｉ．）は、ＣＣ５０値をＩＣ５０値で割ることによって算出する。
【0179】
表９．結果のまとめ。ＩＣ５０（感染性）、ＣＣ５０（生存率）、および選択性指数（Ｓ．Ｉ．）の値が、各試験品について示されている。シグナル対バックグラウンド比（Ｓ／Ｂ）やすべてのレプリケート試験品データポイントの平均変動係数（Ｃ．Ｖ．）など、各アッセイのクオリティコントロールも示されている。試験した最高濃度で阻害の程度が５０％に達しなかったアッセイの生存率（ＣＣ５０）の値は、＞１０μｇ／ｍＬとして示されている。
【0180】
実験手順－β－ガラクトシダーゼ読み出しによる抗ウイルスアッセイ
ＨＩＶ－１感染性アッセイ
感染性アッセイは、試験品の存在下または非存在下で、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞をＨＩＶ－１ ＬＡＩでチャレンジすることによって実施した。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞は、ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターの制御下でベータ－ガラクトシダーゼを発現する。ＨＩＶに感染し、ウイルスのＴａｔタンパク質を発現すると、ベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導される。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、白色のＴＣ処理９６ウェル平底プレートにウェルあたり１２，０００細胞で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ１０と称する）で維持した。試験品は、ＤＭＥＭ１０を使用してＵ底プレートで１０倍に希釈した。試験物質の希釈液は、最終濃度の１．２５倍で調製した。細胞を１．２５倍希釈した試験物質とともに３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした（１ウェルあたり８０μＬ）。試験物質のプレインキュベーションに続いて、ＤＭＥＭ１０で調製したＨＩＶ－ＬＡＩウイルスを細胞に添加し（ウェルあたり２０μＬ）、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルには１００μＬの最終容量が含まれていた。アッセイで使用するウイルスの量は、既知のＨＩＶ－１阻害剤であるＴＡＦ（テノホビルアラフェナミド）およびＴ２０（エンフビルチド）によって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。感染は重複反応で行った。感染の２日後、Ｇａｌａｃｔｏｎ－Ｓｔａｒ（登録商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して細胞をベータ－ガラクトシダーゼ活性についてモニターした。Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ試験は、哺乳動物細胞ライセート中のベータ－ガラクトシダーゼを検出する感度の高い化学発光アッセイである。発光は、１秒の読み出しで測定された。
ＨＩＶ－１感染性アッセイ
感染性アッセイは、試験品の存在下または非存在下で、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞をＨＩＶ－１ ＬＡＩでチャレンジすることによって実施した。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞は、ＨＩＶ－１ ＬＴＲプロモーターの制御下でベータ－ガラクトシダーゼを発現する。ＨＩＶに感染し、ウイルスのＴａｔタンパク質を発現すると、ベータ－ガラクトシダーゼの発現が誘導される。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を、白色のＴＣ処理９６ウェル平底プレートにウェルあたり１２，０００細胞で播種し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を添加したＤＭＥＭ（以下、ＤＭＥＭ１０と称する）で維持した。試験品は、ＤＭＥＭ１０を使用してＵ底プレートで１０倍に希釈した。試験物質の希釈液は、最終濃度の１．２５倍で調製した。細胞を１．２５倍希釈した試験物質とともに３７℃、５％ＣＯ２で３０分間インキュベートした（１ウェルあたり８０μＬ）。試験物質のプレインキュベーションに続いて、ＤＭＥＭ１０で調製したＨＩＶ－ＬＡＩウイルスを細胞に添加し（ウェルあたり２０μＬ）、プレートを５％ＣＯ２の加湿インキュベーターにて３７℃で４８時間インキュベートした。各ウェルには１００μＬの最終容量が含まれていた。アッセイで使用するウイルスの量は、既知のＨＩＶ－１阻害剤であるＴＡＦ（テノホビルアラフェナミド）およびＴ２０（エンフビルチド）によって阻害される線形範囲でシグナルを生成するように予め決定されていた。感染は重複反応で行った。感染の２日後、Ｇａｌａｃｔｏｎ－Ｓｔａｒ（登録商標）キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社）を使用して細胞をベータ－ガラクトシダーゼ活性についてモニターした。Ｇａｌａｃｔｏ－Ｓｔａｒ試験は、哺乳動物細胞ライセート中のベータ－ガラクトシダーゼを検出する感度の高い化学発光アッセイである。発光は、１秒の読み出しで測定された。
【0181】
０．０００１ｎｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの範囲で、試験品の連続１０倍希釈液の複製からの９つのデータポイントが評価された。コントロールには、ウイルスなしでインキュベートした細胞（「モック感染」）、ビヒクルのみ（ＤＭＥＭ１０）で感染およびインキュベートした細胞、または０．５μＭのＴ２０（ＨＩＶ感染の既知の阻害剤）の存在下で感染した細胞が含まれていた。
【0182】
ＨＩＶ感染性アッセイのクオリティコントロール（ＱＣ）
アッセイの平均Ｓ／Ｂは２５５（「モック感染」細胞で決定されたバックグラウンド）であったが、すべてのデータポイントの平均変動は５．７％（Ｃ．Ｖ．値）および５．８％（５０％超の感染を示すすべてのウェルについてのＣ．Ｖ．値）であった。ウイルスの非存在下におけるモック感染細胞で観察されたバックグラウンドレベルが、すべてのサンプルから差し引かれた。このアッセイで使用したコントロール抗ウイルス剤（０．５μＭのＴ－２０）は、感染をほぼ１００％ブロックした。
アッセイの平均Ｓ／Ｂは２５５（「モック感染」細胞で決定されたバックグラウンド）であったが、すべてのデータポイントの平均変動は５．７％（Ｃ．Ｖ．値）および５．８％（５０％超の感染を示すすべてのウェルについてのＣ．Ｖ．値）であった。ウイルスの非存在下におけるモック感染細胞で観察されたバックグラウンドレベルが、すべてのサンプルから差し引かれた。このアッセイで使用したコントロール抗ウイルス剤（０．５μＭのＴ－２０）は、感染をほぼ１００％ブロックした。
【0183】
実験手順－細胞毒性アッセイ
試験品による細胞毒性を評価するための生存率アッセイ（ＸＴＴ）
非感染細胞を、感染性アッセイで使用したものと同じ試験品濃度を使用して、試験品またはコントロール生存率阻害剤の希釈液とともにインキュベートした。インキュベーション温度とインキュベーション期間は、対応する感染性アッセイの条件を反映させた。細胞生存率はＸＴＴ法で評価した。テトラゾリウム塩（ＸＴＴ）は、活性なミトコンドリアを有する生存細胞でのみ発生する反応を通じて、オレンジ色のホルマザン色素に切断される。ホルマザン色素は、走査マルチウェル分光光度計を使用して直接定量化される。細胞なしのウェルから得られたバックグラウンドレベルは、すべてのデータポイントから差し引かれた。４９０ｎｍで吸光度を測定することにより、生存率をモニターした。
試験品による細胞毒性を評価するための生存率アッセイ（ＸＴＴ）
非感染細胞を、感染性アッセイで使用したものと同じ試験品濃度を使用して、試験品またはコントロール生存率阻害剤の希釈液とともにインキュベートした。インキュベーション温度とインキュベーション期間は、対応する感染性アッセイの条件を反映させた。細胞生存率はＸＴＴ法で評価した。テトラゾリウム塩（ＸＴＴ）は、活性なミトコンドリアを有する生存細胞でのみ発生する反応を通じて、オレンジ色のホルマザン色素に切断される。ホルマザン色素は、走査マルチウェル分光光度計を使用して直接定量化される。細胞なしのウェルから得られたバックグラウンドレベルは、すべてのデータポイントから差し引かれた。４９０ｎｍで吸光度を測定することにより、生存率をモニターした。
【0184】
細胞毒性データのクオリティコントロールおよび分析
細胞なしのウェルで得られた平均シグナルをすべてのサンプルから差し引いた。読み出し値は、ビヒクルのみ（培地のみ）で処置した非感染細胞で観察された平均シグナルのパーセンテージとして与えられた。得られたシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は７．８であった。エメチン（１０μＭ）および１０％ＤＭＳＯが生存率アッセイの細胞毒性コントロールとして使用され、９５％超の細胞生存率を阻害した。
細胞なしのウェルで得られた平均シグナルをすべてのサンプルから差し引いた。読み出し値は、ビヒクルのみ（培地のみ）で処置した非感染細胞で観察された平均シグナルのパーセンテージとして与えられた。得られたシグナル対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）は７．８であった。エメチン（１０μＭ）および１０％ＤＭＳＯが生存率アッセイの細胞毒性コントロールとして使用され、９５％超の細胞生存率を阻害した。
【0185】
結果－ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）抗ウイルス活性
【0186】
【表11】
【0187】
表１０．ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイ（ＲＬＵ）。個々のβ－ガラクトシダーゼ発光ＲＬＵ値が、評価された各データポイントについて示されている。「モック」と示されたものを除いて、すべてのサンプルが感染した。Ｔ２０（０．５μＭ）で処置されたサンプルも示されている。試験品の濃度はナノグラム／ミリリットルで示され、コントロール抗ウイルス剤はμＭで示されている。
【0188】
図２０は、試験品のインターフェロン－アルファ１（サンプルＡ）、ハイブリッド２（サンプルＢ）およびインターフェロン－ベータ１ａ（サンプルＣ）ならびにコントロール阻害剤（ＲＬＵ）によるＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性を示す。データは、ビヒクルのみまたはさまざまな濃度の試験品の存在下で感染させたＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を含むウェルにおける相対発光単位（ＲＬＵ）値として示されている（重複の平均と標準偏差）。非感染細胞は「モック」として表示される。Ｔ２０は、抗ウイルスコントロールとして含まれている（０．５μＭでの重複データポイントの平均）。
【0189】
【表12】
【0190】
表１１．ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイ（ビヒクルに対するパーセンテージ）。データは、ビヒクルのみ（ＤＭＥＭ１０）で処置したウェルから得られた値のパーセンテージとして、（ベータ－ガラクトシダーゼ発光によって測定される）ＨＩＶ感染のパーセンテージを表す。各プレートの非感染細胞から得られた平均値が、ビヒクルのみに正規化する前に、すべての生の値（ｒａｗ ｖａｌｕｅｓ）から差し引かれた。試験品とビヒクルについて、それぞれ２重レプリケートまたは８重レプリケートの平均とその標準偏差が示されている。Ｔ２０コントロール（０．５μＭ）は重複データポイントとして表示されている。
【0191】
図２１は、ＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染性アッセイを示す（パーセンテージ値）。結果は、４８時間でのベータ－ガラクトシダーゼアッセイ（発光読み出し）によって決定されたＨＩＶ－１ ＬＡＩ感染の程度を示す。データは、試験品の非存在下（ビヒクルのみ）における細胞で観察された活性に対して正規化されている。試験品およびコントロール抗ウイルス剤の結果は、二重データポイントの平均および標準偏差（ｓ．ｄ．）を示し、ビヒクルは８つのレプリケートの平均およびｓ．ｄ．を示す。
【0192】
図２２Ａ（インターフェロン－アルファ１４）、図２２Ｂ（ハイブリッド２）および図２２Ｃ（インターフェロン－ベータ１ａ）は、ＨＩＶ－１感染性のＩＣ５０値の決定を示す。値は、ビヒクルのみでインキュベートしたサンプルと比較したＨＩＶ感染性のパーセンテージを示す。結果は、二重データポイントの平均および標準偏差（ｓ．ｄ．）を示す。データはシグモイド関数に調整され、ＩＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。ＩＣ５０値を表１０にまとめる。
【0193】
結果－ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）アッセイの細胞毒性
【0194】
【表13】
【0195】
表１２．ＸＴＴアッセイによって決定される、試験品の存在下におけるＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞の生存率（Ａ４９０）。ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞は、さまざまな濃度の試験品の存在下で、またはビヒクルのみ（培地のみ）とともにインキュベートされた。各データポイントについて、個々の生データが表示されている（４９０ｎｍの吸光度値）。下の表は、コントロールサンプルの生データ値を示す。
【0196】
【表14】
【0197】
表１３．ＸＴＴアッセイにおけるＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞の生存率（パーセント値）。データは、４８時間後にビヒクル（培地のみ）で処置した非感染ＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞から得られた値のパーセンテージとして生存率を表す。バックグラウンドウェルから得られた平均値が、ビヒクルに正規化する前にすべての生の値（ｒａｗ ｖａｌｕｅｓ）から差し引かれた。データは、該当する場合、重複の平均および標準偏差を表す。
【0198】
図２３は、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞を用いた生存率アッセイを示す（パーセント値）。結果は、４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞における化合物による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。データは、試験品の非存在下でビヒクルのみ（培地のみ）における細胞で観察された値に正規化されている。結果は、試験品ならびにコントロールのＴ２０（０．５μＭ）、エメチン１０μＭおよび１０％ＤＭＳＯについての重複データポイントの平均および標準偏差（ｓ．ｄ）を示す。
【0199】
図２４は、ＨｅＬａ－ＣＤ４－βｇａｌ細胞における、サンプルＡ（図２４Ａ）、サンプルＢ（図２４Ｂ）およびサンプルＣ（図２４Ｃ）についてのＣＣ５０値の決定を示す（パーセント値）。結果は、４８時間インキュベートしたＨｅＬａ－ＣＤ４－ベータ－ｇａｌ細胞における試験品による細胞毒性の程度を示しており、生存率のＸＴＴ読み出し（吸光度４９０ｎｍ読み出し）によって決定される。値は、ビヒクルのみ（培地のみ）でインキュベートしたサンプルで観察された生存率に対するパーセンテージとして推定される％生存率を示す。結果は重複データポイントの平均を示す。データはシグモイド関数に調整され、ＣＣ５０値はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて、傾きが可変の用量反応曲線（４パラメーター）にフィッティングさせて算出した。生存率が５０％に達しなかった場合、報告されたＣＣ５０値は、試験した最高濃度である１０μｇ／ｍＬよりも高かった。ＣＣ５０値を表１０に示す。
【0200】
実験６：単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ１）に対するインターフェロンアルファハイブリッドの効果
ハイブリッドインターフェロンによる初代ヒトケラチノサイトの処置がＨＳＶ１感染を低下させるかどうかを決定するために実験を行った。使用したインターフェロンは、ハイブリッド１、ハイブリッド２、インターフェロンアルファ－１４、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンベータ－１ａでした。
ハイブリッドインターフェロンによる初代ヒトケラチノサイトの処置がＨＳＶ１感染を低下させるかどうかを決定するために実験を行った。使用したインターフェロンは、ハイブリッド１、ハイブリッド２、インターフェロンアルファ－１４、インターフェロンアルファ－２ａ、およびインターフェロンベータ－１ａでした。
【0201】
図２５は、ハイブリッド１、ハイブリッド２、インターフェロンアルファ－１４、インターフェロンアルファ－２ａおよびインターフェロンベータ－１ａで処置したときのベロ細胞における単純ヘルペスウイルス１型の組織培養感染用量（ＴＣＩＤ）を示す。
【0202】
図２６は、プラーク形成単位（ＰＦＵ）に変換されたＴＣＩＤの中央値を示す。
【0203】
材料および方法
１．凍結ストックからのベロ細胞の増殖（１）
２．凍結ストックからの初代成人ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ細胞）の増殖
３．ＨＳＶ１によるＨＥＫａ細胞の感染
４．インターフェロンの投与
５．細胞上清のプラークアッセイ（２）
６．ＦＡＣＳ、ＩＣＣ、ＲＴ－ｑＰＣＲのための感染したＨＥＫａ細胞の処理
７．ベロ細胞の凍結
８．ケラチノサイトの凍結
１．凍結ストックからのベロ細胞の増殖（１）
２．凍結ストックからの初代成人ヒト表皮ケラチノサイト（ＨＥＫａ細胞）の増殖
３．ＨＳＶ１によるＨＥＫａ細胞の感染
４．インターフェロンの投与
５．細胞上清のプラークアッセイ（２）
６．ＦＡＣＳ、ＩＣＣ、ＲＴ－ｑＰＣＲのための感染したＨＥＫａ細胞の処理
７．ベロ細胞の凍結
８．ケラチノサイトの凍結
【0204】
凍結ストックからのベロ細胞の増殖
材料：
アフリカミドリザル腎臓ベロ細胞（Ｍｅｒｃｋ ８４１１３００１－１ＶＬ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）、細胞培養インキュベーター（３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２）、１×ＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムなし）（Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７）、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｔ４０４９）、細胞培養培地（高グルコース、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、２５ｃｍ２および７５ｃｍ２ベント式細胞培養フラスコ、ウォーターバス（３７℃）、遠心分離機、および１５ｍｌ遠心チューブ
材料：
アフリカミドリザル腎臓ベロ細胞（Ｍｅｒｃｋ ８４１１３００１－１ＶＬ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ－８１）、細胞培養インキュベーター（３７℃、９５％空気、５％ＣＯ２）、１×ＰＢＳ（カルシウムまたはマグネシウムなし）（Ｓｉｇｍａ Ｄ８５３７）、トリプシン－ＥＤＴＡ（０．２５％トリプシン、０．０２％ＥＤＴＡ）（Ｓｉｇｍａ Ｔ４０４９）、細胞培養培地（高グルコース、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）、２５ｃｍ２および７５ｃｍ２ベント式細胞培養フラスコ、ウォーターバス（３７℃）、遠心分離機、および１５ｍｌ遠心チューブ
【0205】
方法：
凍結ストックからの細胞の播種
液体窒素または超低温フリーザーからクライオバイアルを取り出し、３７℃のウォーターバスですばやく解凍する。解凍したら、１０ｍｌの予熱した細胞培養培地を含む１５ｍｌ遠心チューブにすぐに移す。２００ｇを室温（ＲＴ）で５分間遠心分離する。上清を捨てる。５ｍｌの細胞培養培地で再懸濁し、２５ｃｍ２のベント付き細胞培養フラスコに入れる。細胞が９０％超コンフルエントになるまで、３～４日ごとに培地を交換する。ベロ細胞は凍結後にゆっくりと回復し、コンフルエントになるまでに１週間超かかる場合がある。細胞が通常の増殖速度に達するまでに、２～３回継代する必要がある場合がある。
凍結ストックからの細胞の播種
液体窒素または超低温フリーザーからクライオバイアルを取り出し、３７℃のウォーターバスですばやく解凍する。解凍したら、１０ｍｌの予熱した細胞培養培地を含む１５ｍｌ遠心チューブにすぐに移す。２００ｇを室温（ＲＴ）で５分間遠心分離する。上清を捨てる。５ｍｌの細胞培養培地で再懸濁し、２５ｃｍ２のベント付き細胞培養フラスコに入れる。細胞が９０％超コンフルエントになるまで、３～４日ごとに培地を交換する。ベロ細胞は凍結後にゆっくりと回復し、コンフルエントになるまでに１週間超かかる場合がある。細胞が通常の増殖速度に達するまでに、２～３回継代する必要がある場合がある。
【0206】
細胞の継代（２５ｃｍ２フラスコについての容量、７５ｃｍ２フラスコの場合は×２）
培地を除去する。５ｍｌの１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。２．５ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡを加え、３７℃で２～３分間、または細胞が剥離してストリークが出始めるまでインキュベートする。フラスコを軽くタップ／シェイクして、剥離しやすくしする。必要に応じて、使用するトリプシンを減らし、より長くインキュベートできる。２．５ｍｌの培地を加えて、ピペットで細胞を洗浄し、塊をほぐす。１５ｍｌ遠心チューブに移し、室温（ＲＴ）にて２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、１０ｍｌの培地に再懸濁する。維持のために１：５～１：１０の間で分割できる。プラークアッセイ用に１２ウェルプレートにウェルあたり２×１０＾５細胞を播種する。
培地を除去する。５ｍｌの１×ＰＢＳで細胞を洗浄する。２．５ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡを加え、３７℃で２～３分間、または細胞が剥離してストリークが出始めるまでインキュベートする。フラスコを軽くタップ／シェイクして、剥離しやすくしする。必要に応じて、使用するトリプシンを減らし、より長くインキュベートできる。２．５ｍｌの培地を加えて、ピペットで細胞を洗浄し、塊をほぐす。１５ｍｌ遠心チューブに移し、室温（ＲＴ）にて２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、１０ｍｌの培地に再懸濁する。維持のために１：５～１：１０の間で分割できる。プラークアッセイ用に１２ウェルプレートにウェルあたり２×１０＾５細胞を播種する。
【0207】
細胞上清のプラークアッセイ
材料：
ベロ細胞、ベロ細胞培地、上清、１×ＰＢＳ中の１．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｍ６３８５－１００Ｇ）、１：１比率のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ中の１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃ０７７５－２５Ｇ）
材料：
ベロ細胞、ベロ細胞培地、上清、１×ＰＢＳ中の１．５％メチルセルロース（Ｓｉｇｍａ Ｍ６３８５－１００Ｇ）、１：１比率のＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ中の１％クリスタルバイオレット（Ｓｉｇｍａ Ｃ０７７５－２５Ｇ）
【0208】
方法：
－２日目：１．５％メチルセルロースの調製
１．５ｇのメチルセルロースを１００ｍｌの１×ＰＢＳに加える。液体サイクルで４５分間オートクレーブする。冷ます。ベロ細胞培地３５０ｍｌを加える。４℃で一晩撹拌する。
－１日目：ベロ細胞の播種
条件ごとに１枚の１２ウェルプレートにラベルを付ける。前述のように細胞を分割する。１２ウェルプレートのウェルあたり２×１０＾５のベロ細胞を播種する。インキュベーターに戻す前に、１５～３０分間静置する。
０日目：ベロ細胞の感染
ベロ細胞がコンフルエントであることを確認する。細胞培養培地で上清の段階希釈液を調製する。希釈は１０＾－２～１０＾－７の間の範囲で行う必要がある。各ウェルあたり２００μｌの希釈液が必要で、二重に実施する。ベロ細胞培地を除去する。各ウェルに適切な希釈液２００μｌを加える。インキュベーターに入れる。１５分ごとにプレートを１時間振とうする。ウイルスを吸引し、１．５ｍｌのメチルセルロースでオーバーレイする。３～５日間、またはプラークが見えるまでインキュベートする。オーバーレイを除去し、２ｍｌのクリスタルバイオレットを加える。室温（ＲＴ）で１０～２０分間インキュベートする。ステインを吸引し、水道水で軽くすすぐ。乾燥させる。（プラーク数）／（接種量（ｍｌ））＊（希釈）＝ｐｆｕ／ｍｌ。
－２日目：１．５％メチルセルロースの調製
１．５ｇのメチルセルロースを１００ｍｌの１×ＰＢＳに加える。液体サイクルで４５分間オートクレーブする。冷ます。ベロ細胞培地３５０ｍｌを加える。４℃で一晩撹拌する。
－１日目：ベロ細胞の播種
条件ごとに１枚の１２ウェルプレートにラベルを付ける。前述のように細胞を分割する。１２ウェルプレートのウェルあたり２×１０＾５のベロ細胞を播種する。インキュベーターに戻す前に、１５～３０分間静置する。
０日目：ベロ細胞の感染
ベロ細胞がコンフルエントであることを確認する。細胞培養培地で上清の段階希釈液を調製する。希釈は１０＾－２～１０＾－７の間の範囲で行う必要がある。各ウェルあたり２００μｌの希釈液が必要で、二重に実施する。ベロ細胞培地を除去する。各ウェルに適切な希釈液２００μｌを加える。インキュベーターに入れる。１５分ごとにプレートを１時間振とうする。ウイルスを吸引し、１．５ｍｌのメチルセルロースでオーバーレイする。３～５日間、またはプラークが見えるまでインキュベートする。オーバーレイを除去し、２ｍｌのクリスタルバイオレットを加える。室温（ＲＴ）で１０～２０分間インキュベートする。ステインを吸引し、水道水で軽くすすぐ。乾燥させる。（プラーク数）／（接種量（ｍｌ））＊（希釈）＝ｐｆｕ／ｍｌ。
【0209】
ベロ細胞の凍結
材料：
１ ７５ｃｍ２フラスココンフルエントベロ細胞、凍結培地（高グルコースＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＰＢＳ（カルシウム・マグネシウムなし）、トリプシン－ＥＤＴＡ、クライオバイアル、１５ｍｌ遠心チューブ、クライオセル凍結容器、イソプロパノール
材料：
１ ７５ｃｍ２フラスココンフルエントベロ細胞、凍結培地（高グルコースＤＭＥＭ、２０％ＦＢＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ＤＰＢＳ（カルシウム・マグネシウムなし）、トリプシン－ＥＤＴＡ、クライオバイアル、１５ｍｌ遠心チューブ、クライオセル凍結容器、イソプロパノール
【0210】
方法：
１ｍｌのＤＭＳＯを９ｍｌの凍結培地に加え、取っておく。１０個のクライオバイアルに、日付、細胞の種類、および継代数のラベルを付ける。フラスコから培地を除去する。１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄する。５ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡを加え、３７℃で２～３分間インキュベートする。５ｍｌの凍結培地を加え、細胞を洗浄し、塊をほぐす。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移す。２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、ＤＭＳＯ－凍結培地１０ｍｌに再懸濁する。各クライオバイアルに１ｍｌの細胞を加え、すぐにイソプロパノールを含む凍結チャンバーに移す。－８０℃で一晩保存する。長期保存のために液体窒素に移す。
１ｍｌのＤＭＳＯを９ｍｌの凍結培地に加え、取っておく。１０個のクライオバイアルに、日付、細胞の種類、および継代数のラベルを付ける。フラスコから培地を除去する。１０ｍｌのＤＰＢＳで洗浄する。５ｍｌのトリプシン－ＥＤＴＡを加え、３７℃で２～３分間インキュベートする。５ｍｌの凍結培地を加え、細胞を洗浄し、塊をほぐす。細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移す。２００ｇで５分間遠心分離する。上清を捨て、ＤＭＳＯ－凍結培地１０ｍｌに再懸濁する。各クライオバイアルに１ｍｌの細胞を加え、すぐにイソプロパノールを含む凍結チャンバーに移す。－８０℃で一晩保存する。長期保存のために液体窒素に移す。
【0211】
本発明の範囲から逸脱することなく、本発明の記載された実施形態に対する様々な修正および変形が当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されたが、特許請求される本発明は、そのような特定の実施形態に不当に限定されるべきではないことを理解されたい。実際、当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された態様の様々な変更は、本発明によってカバーされることが意図されている。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22-1】
【図22-2】
【図23】
【図24-1】
【図24-2】
【図25】
【図26】
【配列表】
【国際調査報告】