特表 2024-507363 転移性がん治療のための併用遺伝子治療

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-19

(54)【発明の名称】転移性がん治療のための併用遺伝子治療

(51)【国際特許分類】

   A61K 48/00 20060101AFI20240209BHJP

   A61K 38/20 20060101ALI20240209BHJP

   A61K 45/00 20060101ALI20240209BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240209BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240209BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240209BHJP

   A61K 47/44 20170101ALI20240209BHJP

   A61K 47/26 20060101ALI20240209BHJP

   A61K 47/36 20060101ALI20240209BHJP

   A61K 47/34 20170101ALI20240209BHJP

   A61K 47/10 20170101ALI20240209BHJP

   A61K 9/32 20060101ALI20240209BHJP

   A61K 9/42 20060101ALI20240209BHJP

【ＦＩ】

A61K48/00

A61K38/20

A61K45/00

A61P35/00

A61P35/04

A61P43/00 121

A61K47/44

A61K47/26

A61K47/36

A61K47/34

A61K47/10

A61K9/32

A61K9/42

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550050

(86)(22)【出願日】2022-02-18

(85)【翻訳文提出日】2023-10-02

(86)【国際出願番号】 US2022017099

(87)【国際公開番号】W WO2022178325

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/150,846

(32)【優先日】2021-02-18

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510082868

【氏名又は名称】エンジーン，インコーポレイティド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100196977

【弁理士】

【氏名又は名称】上原 路子

(72)【発明者】

【氏名】マリー－リーヌ グーレ

(72)【発明者】

【氏名】ジョゼ ローラ

(72)【発明者】

【氏名】ショーナ ドーフィニー

【テーマコード（参考）】

4C076

4C084

【Ｆターム（参考）】

4C076AA42

4C076AA95

4C076BB01

4C076BB05

4C076BB07

4C076BB11

4C076BB21

4C076BB25

4C076CC27

4C076DD38

4C076DD66

4C076DD67

4C076EE01A

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4C076EE25

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4C076EE37

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4C076FF21

4C076FF63

4C076FF68

4C084AA02

4C084AA13

4C084AA19

4C084BA01

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4C084MA02

4C084MA52

4C084MA55

4C084MA56

4C084MA59

4C084MA60

4C084MA66

4C084NA05

4C084NA13

4C084ZB261

4C084ZB262

4C084ZC751

4C084ZC752

(57)【要約】

本開示は、がん抗原に対するメモリーＴ細胞応答を活性化するための、好ましくはＲＩＧ－Ｉアゴニストと組み合わせたＩＬ－１２を限局性発現するための方法及び組成物に関する。実施形態では、方法は転移性疾患を治療するのに有効である。
【選択図】図４Ｃ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

原発性がんに対するメモリーＴ細胞応答の活性化をそれを必要とする患者にて行う方法であって、前記方法が：
カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む治療有効量の組成物に前記患者の原発性がんを接触させることを含み、ＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉをコードする前記治療用核酸構築物は同一のまたは異なる核酸構築物である、前記方法。

【請求項2】

前記方法が、前記患者における粘膜腫瘍以外の原発性がんを治療する、または抑制するのに有効である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記方法が、前記原発性がんとは異なる部位にて前記患者の転移性疾患を治療する、または抑制するのに有効である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記原発性がんが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、肉腫、膀胱癌、膣癌、子宮頸癌、胃癌、消化管癌、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、食道癌、鼻腔癌、喉頭癌、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、及び精巣癌から選択される、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項5】

前記原発性がんとは異なる部位が、肝臓、肺、骨、脳、リンパ節、腹膜、皮膚、前立腺、乳房、結腸、直腸及び子宮頸部のうちの１以上である、請求項３または４に記載の方法。

【請求項6】

前記転移性疾患が、前記原発性がんとは異なる２以上の部位にある、請求項３～５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項7】

前記ＲＩＧ－Ｉアゴニストが、ｅＲＮＡ１１ａ、ＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ＭＫ４６２１、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４及びＳＬＲ２０から成る群から選択され、さらに好ましくは、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ｅＲＮＡ１１ａから成る群から選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＡＭＡＭ、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、キトサン、及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項9】

前記カチオン性ポリマーが、誘導体化キトサン、好ましくはアミノ官能化キトサンを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記アミノ官能化キトサンがアルギニンを含み、且つさらに親水性ポリオールを含む、または親水性ポリオールで官能化される、請求項９に記載の方法。

【請求項11】

前記親水性ポリオールがグルコン酸及びグルコースから選択される、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記核酸ポリプレックスがさらに、少なくとも１つのポリアニオン性アンカー領域と少なくとも１つの親水性テール領域とを有する１以上のポリアニオン含有ブロックコポリマーを含む可逆性コーティングを含み、好ましくは、前記ポリアニオン含有ブロックコポリマーが線状の二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項13】

ＩＬ－１２をコードする前記治療用核酸構築物が配列番号８を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

原発性がんの部位とは異なる部位における転移腫瘍の治療または抑制をそれを必要とする患者にて行う方法であって、前記方法が：
カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む治療有効量の組成物に前記患者の前記原発性がん及び／または転移腫瘍を接触させることを含み、ＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉをコードする前記治療用核酸構築物は同一のまたは異なる核酸構築物である、前記方法。

【請求項15】

前記がんが、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌（ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ）、肺癌（ｐｕｌｍｏｎａｒｙ ｃａｎｃｅｒ）、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、肉腫、膀胱癌、膣癌、子宮頸癌、胃癌、消化管癌、腎臓癌、甲状腺癌、食道癌、喉頭癌、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、及び精巣癌から選択される、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記原発性がんが、消化管癌、鼻腔癌または肺癌、及び泌尿生殖器癌から成る群から選択される、請求項１５記載の方法。

【請求項17】

前記原発性がんが、口腔癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、及び直腸癌から成る群から選択される消化管癌である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記原発性がんが、副鼻腔癌、中咽頭癌、気管癌、及び肺癌から成る群から選択される鼻腔癌または肺癌である、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

前記原発性がんが、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、精巣癌、腎臓癌、前立腺癌、陰茎癌、副腎癌、子宮癌、子宮頸癌、及び卵巣癌から成る群から選択される泌尿生殖器癌である、請求項１６に記載の方法。

【請求項20】

前記泌尿生殖器癌が膀胱癌である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記腫瘍の転移部位が、肝臓、肺、骨、脳、リンパ節、腹膜、皮膚、前立腺、乳房、結腸、直腸及び子宮頸部のうちの１以上にある、請求項１４～２０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項22】

前記転移腫瘍が２以上の異なる部位である、請求項１４～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

前記ＲＩＧ－Ｉアゴニストが、ｅＲＮＡ１１ａ、ＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ＭＫ４６２１、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４及びＳＬＲ２０から成る群から選択され、さらに好ましくは、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ｅＲＮＡ１１ａから成る群から選択される、請求項１４～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記カチオン性ポリマーが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＡＭＡＭ、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、キトサン、及びそれらの誘導体から成る群から選択される、請求項１４～２３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項25】

前記カチオン性ポリマーが、誘導体化キトサン、好ましくはアミノ官能化キトサンを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記アミノ官能化キトサンがアルギニンを含み、且つさらに親水性ポリオールを含む、または親水性ポリオールで官能化される、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記親水性ポリオールがグルコン酸及びグルコースから選択される、請求項２６に記載の方法。

【請求項28】

前記核酸ポリプレックスがさらに、少なくとも１つのポリアニオン性アンカー領域と少なくとも１つの親水性テール領域とを有する１以上のポリアニオン含有ブロックコポリマーを含む可逆性コーティングを含み、好ましくは、前記ポリアニオン含有ブロックコポリマーが線状の二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーである、請求項１４～２７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項29】

ＩＬ－１２をコードする前記治療用核酸構築物が配列番号８を含む、請求項１４～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項30】

前記接触させることが膀胱内注入を含む、請求項１４記載の方法。

【請求項31】

前記接触させることが、消化管（ＧＩＴ）への経口投与または直腸内／結腸内投与である、請求項１４に記載の方法。

【請求項32】

前記接触させることが腫瘍内注射によるものである、請求項１４に記載の方法。

【請求項33】

前記接触させることが、肺への鼻腔内投与または気管内投与である、請求項１４に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１８日出願の米国仮特許出願第６３／１５０，８４６号の優先権の利益を主張し、その内容は、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【0002】

技術分野
本開示は、ＩＬ－１２の限局性の送達及び発現によって、好ましくはＩ型ＩＦＮ（ＩＦＮ－１）活性化因子／誘導因子と組み合わせて、遠隔部位での転移腫瘍を治療するための方法及び組成物に関する。

【背景技術】

【0003】

がん性疾患及び腫瘍はヒトの死亡や重篤な病気の主な原因の１つである。特に転移腫瘍は、主に転移が形成され始めると現在の治療法が無効になるため、がん患者の死亡に大きく寄与する。

【0004】

転移性がんの治療は特に、体内の複数の異なる部位に広がっている場合、とてつもない難題である。通常、転移性がん患者は、体のあらゆる場所のがん細胞を殺すことを目的とした全身療法のみで治療される。しかし、残念ながら、このアプローチの有効性は理想とは程遠い。したがって、「治癒」と「転移性がん」という用語が一緒に使用されることは稀である。転移性腫瘍がある人は、既存の治療法に反応しないことが多く、これらの患者で長期寛解を達成することは、限局性がんがある患者の場合よりもはるかに可能性が低い。むしろ、転移性疾患の治療目標は通常、がんの増殖を遅らせること、またはがんによって引き起こされる症状を緩和することである。

【0005】

転移性がんの治療が難しい理由は正確には理解されてないが、転移性腫瘍細胞がすぐに適応して治療に耐性を示し得ることは明らかである。場合によっては、それぞれの転移性腫瘍がさまざまな臓器で増殖する場合がある。このため治療が困難になるが、これは各腫瘍が独自の腫瘍微小環境を有する場合があり、治療に対する反応が異なる場合があるためである。したがって、転移性がんのある人の予後は一般に不良であり、がんによる死亡のほとんどは転移性がんが占めている。

【0006】

したがって、癌腫を有する個体にて、原発性がんとは異なる第２の腫瘍部位における腫瘍細胞増殖を阻害する方法、及び原発性がんとは異なる部位における転移腫瘍を治療または抑制する方法に対するニーズが当該技術分野に残っている。幸いなことに、本開示はこれらのニーズ及びその他のニーズに応えるものである。

【発明の概要】

【0007】

本開示は、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ－１）活性化因子／誘導因子、例えば、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト及び／またはＴＬＲ７／９アゴニストと共にＩＬ－１２を原発性腫瘍部位にて限局性に送達し、且つ発現させることによって、遠隔部位における転移腫瘍を阻害する当該技術分野にて未だ満たされていないニーズを解決する。本明細書で初めて実証されたように、主題の治療法は、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋メモリーＴ細胞を含む原発性がんに対する頑健な免疫応答を刺激し、特に後者の細胞集団は遠隔転移に対する主題の治療法の全身効果を支援する。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍部位は粘膜組織である。いくつかの実施形態では、原発性腫瘍部位は粘膜組織以外である。好ましい実施形態では、主題の方法及び組成物はＩＬ－１２と少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストとの同時発現を含む。

【0008】

一態様では、本開示は、がん抗原に対するメモリーＴ細胞応答を活性化する方法を提供する。該方法は、原発性がんを、カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む治療有効量の組成物に接触させることを含み、ＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉをコードする治療用核酸構築物は同一のまたは異なる核酸構築物である。

【0009】

いくつかの実施形態では、該方法は原発性がんを治療する、または抑制するのに有効である。実施形態では、原発性がんは、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、肉腫、膀胱癌、膣癌、子宮頸癌、胃癌、消化管のがん、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、食道癌、鼻腔癌、喉頭癌、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、及び精巣癌から選択される。実施形態では、原発性がんは粘膜癌以外である。

【0010】

いくつかの実施形態では、該方法は、原発性がんとは異なる部位における転移性疾患を治療する、または抑制するのに有効である。実施形態では、原発性がんは、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、肉腫、膀胱癌、膣癌、子宮頸癌、胃癌、消化管のがん、腎臓癌、肝臓癌、甲状腺癌、食道癌、鼻腔癌、喉頭癌、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、及び精巣癌から選択される。いくつかの実施形態では、原発性がんとは異なる部位は、肝臓、肺、骨、脳、リンパ節、腹膜、皮膚、前立腺、乳房、結腸、直腸、及び子宮頸部のうちの１以上である。いくつかの実施形態では、転移性疾患は原発性がんとは異なる２以上の部位にある。

【0011】

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－ＩアゴニストはｅＲＮＡ１１ａ、ＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ＭＫ４６２１、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４、及びＳＬＲ２０から成る群から選択され、さらに好ましくは、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ｅＲＮＡ１１ａから成る群から選択される。

【0012】

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＡＭＡＭ、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、キトサン、及びそれらの誘導体から成る群から選択される。いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは誘導体化キトサン、好ましくはアミノ官能化キトサンを含む。いくつかの実施形態では、アミノ官能化キトサンはアルギニンを含み、且つさらに親水性ポリオールを含む、または親水性ポリオールで官能化される。いくつかの実施形態では、親水性ポリオールはグルコン酸及びグルコースから選択される。

【0013】

いくつかの実施形態では、核酸ポリプレックスはさらに、少なくとも１つのポリアニオン性アンカー領域及び少なくとも１つの親水性テール領域を有する１以上のポリアニオン含有ブロックコポリマーを含む可逆性コーティングを含み、好ましくは、ポリアニオン含有ブロックコポリマーは線状の二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーである。

【0014】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２をコードする治療用核酸構築物は配列番号８を含む。

【0015】

別の態様では、本開示は、例えば、膀胱癌のような原発性がんを有する個体における原発性がんとは異なる部位での転移腫瘍を治療する、または抑制する方法を提供し、該方法は、原発性がんを、カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む治療有効量の組成物に接触させることを含み、ＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉをコードする治療用核酸構築物は同一のまたは異なる核酸構築物である。

【0016】

実施形態では、原発性がんは、乳癌、結腸癌、前立腺癌、膵臓癌、黒色腫、肺癌、卵巣癌、腎臓癌、脳腫瘍、肉腫、膀胱癌、膣癌、子宮頸癌、胃癌、消化管のがん、腎臓癌、甲状腺癌、食道癌、鼻腔癌、喉頭癌、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜癌、及び精巣癌から選択されるがんである。一実施形態では、原発性がんは、消化管癌、鼻腔癌または肺癌、及び泌尿生殖器癌から成る群から選択される粘膜癌である。いくつかの実施形態では、原発性粘膜癌は、口腔癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、及び直腸癌から成る群から選択される消化管癌である。いくつかの実施形態では、原発粘膜癌は、副鼻腔癌、中咽頭癌、気管癌、及び肺癌から成る群から選択される鼻腔癌または肺癌である。いくつかの実施形態では、原発性粘膜癌は、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、精巣癌、腎臓癌、前立腺癌、陰茎癌、副腎癌、子宮癌、子宮頸癌、及び卵巣癌から成る群から選択される泌尿生殖器癌である。いくつかの実施形態では、泌尿生殖器癌は膀胱癌である。

【0017】

いくつかの実施形態では、腫瘍の転移部位は、肝臓、肺、骨、脳、リンパ節、腹膜、皮膚、前立腺、乳房、結腸、直腸、及び子宮頸部のうちの１以上にある。いくつかの実施形態では、転移腫瘍は２以上の異なる部位にある。

【0018】

いくつかの実施形態では、ＲＩＧ－Ｉアゴニストは、ｅＲＮＡ１１ａ、ＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ＭＫ４６２１、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４、及びＳＬＲ２０から成る群から選択され、さらに好ましくは、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ｅＲＮＡ１１ａから成る群から選択される。

【0019】

他の実施形態では、カチオン性ポリマーは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ＰＡＭＡＭ、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン、キトサン、及びそれらの誘導体から成る群から選択される。別の実施形態では、カチオン性ポリマーは誘導体化キトサン、好ましくはアミノ官能化キトサンを含む。

【0020】

いくつかの実施形態では、カチオン性ポリマーは、アルギニンを含み、且つさらに親水性ポリオールを含む、または親水性ポリオールで官能化されているアミノ官能化キトサンである。いくつかの実施形態では、親水性ポリオールはグルコン酸及びグルコースから選択される。

【0021】

いくつかの実施形態では、核酸ポリプレックスはさらに、少なくとも１つのポリアニオン性アンカー領域及び少なくとも１つの親水性テール領域を有する１以上のポリアニオン含有ブロックコポリマーを含む可逆性コーティングを含み、好ましくは、ポリアニオン含有ブロックコポリマーは線状の二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーである。

【0022】

いくつかの実施形態では、ＩＬ－１２をコードする治療用核酸構築物は配列番号８を含む。

【0023】

いくつかの実施形態では、接触させることは膀胱内注入を含む。別の実施形態では、投与は、経口投与または直腸内／結腸内から消化管（ＧＩＴ）への投与である。いくつかの実施形態では、投与は消化管（ＧＩＴ）への直腸内／結腸内投与である。さらに他の実施形態では、接触させることは腫瘍内注射による。さらに他の実施形態では、接触させることは肺への鼻腔内または気管内の投与である。

【0024】

他の特徴、目的、及び利点は後に続く本開示から明らかになるであろう。

【0025】

本開示は添付の図面を参照して開示されている。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1A】膀胱癌の同所性モデルにおけるｍＥＧ－７０構築物による雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの実験的処理のタイムラインを示す。１日目に、ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１×１０^５細胞）をマウスの膀胱に注入した。移植は注入後９日目にてルシフェラーゼシグナルの生体内画像処理によって確認した。生物発光レベルに基づいてマウスを処理群（ｎ＝２２）に均等に分配し、マウスは１０日目（Ｔｘ１）及び１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ；８０μｇのＤＮＡに相当）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。担腫瘍動物のコホートは未処理であった。生存を８５日間モニタリングした。

【図1B】ｍＥＧ－７０処理動物はそのうちおよそ７０％が疾患で死亡した対照マウスと比べて長期生存を示した。ｍＥＧ－７０の生存曲線は偽処理（１％マンニトール）または未処理マウスの生存率とは有意に異なる（それぞれ＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。

【図1C】完全な疾患退縮を示し、７６日間の観察期間中に再発しなかった（「ｍＥＧ－７０治癒」と呼ばれる）ｍＥＧ－７０で処理したマウスにＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞を再負荷して、再発性疾患からの防御を評価した。１７匹中１５匹のマウスで頑健な腫瘍移植を示した週齢を一致させた無処置対照とは対照的に、ｍＥＧ－７０で治癒したマウスはすべて、再負荷後３週間まで腫瘍再発に対して耐性を示した（ｎ＝１７）。

【図2A】膀胱癌の同所性モデルにおけるｍＥＧ－７０構築物による雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの実験的処理のタイムラインを示す。１日目にＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１×１０５細胞）をマウスの膀胱に注入した。注入後９日目にルシフェラーゼシグナルの生体内画像処理によって移植を確認し、生物発光のレベルに基づいて処理群（ｎ＝２２）に均等に分配した。マウスは１０日目（Ｔｘ１）と１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ；８０μｇのＤＮＡに相当）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。担腫瘍動物のコホートは未処理だった。すべてのマウスが膀胱癌で死亡する、または腫瘍がない（生物発光シグナルが陰性で臨床症状なし）とみなされるまで生存をモニタリングした。８５日目に、生存している腫瘍のないｍＥＧ－７０処理マウス及び週齢を一致させた対照にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞）をＩＶＩによって再負荷した。ｍＥＧ－７０処理マウスはすべて腫瘍が存在しないままであり、１５３日目に、ＭＢ４９－Ｌｕｃ（１×１０^５細胞）またはＢ１６－Ｆ１０細胞（１×１０^５細胞）のいずれかを脇腹皮下に再負荷した。

【図2B】ｍＥＧ－７０処理動物はＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞による遠隔腫瘍の再負荷から保護された。９匹の動物のうち１匹だけが腫瘍増殖を示し、それは著しくゆっくり進行した。対照的に、無処置対照コホートでは、腫瘍が増殖したマウスは９匹のうち８匹だった。

【図2C】応答の特異性を評価するためにＢ１６－Ｆ１０細胞をマウスに再負荷した。再負荷群及び無処置対照群のマウスはすべて、頑健なＢ１６－Ｆ１０腫瘍移植を示した（ｎ＝８／群）。

【図3A】膀胱癌の同所性モデルにおけるｍＥＧ－７０構築物による雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの実験的処理のタイムラインを示す。ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１×１０^５細胞）を雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの膀胱（１２～１６週）に注入し、注入後９日目のルシフェラーゼシグナルの生体内画像処理によって移植を確認した（Ｌｕｍｉｎａ ＬＴ ＩＶＩＳ画像処理システムを使用）。マウスは生物発光のレベルに基づいて処理群（ｎ＝２０）に均等に分配され（ルシフェラーゼ陰性マウスは試験から除外された）、１０日目（Ｔｘ１）と１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ、８０μｇのＤＮＡに相当）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。すべてのマウスが膀胱癌で死亡するまで、または腫瘍がないとみなされるまで（生物発光シグナルが陰性で臨床症状なし；データを示さず）、生存をモニタリングした。１６７日目に、生存している腫瘍のないｍＥＧ－７０処理マウスと、週齢を一致させた無処置対照に、枯渇を確立するために連続４日間、その後維持するために週に２回アイソタイプ対照（非枯渇）、抗ＣＤ４抗体、または抗ＣＤ８抗体のいずれかのうち１つを腹腔内注射した。３回目の枯渇抗体注射後、マウスの脇腹皮下にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞）を再負荷した（１７０日目；ｎ＝６）。ノギスで測定することによって腫瘍をモニタリングし；腫瘍体積は式（長さ×幅^２／２）を使用して算出した。

【図3B】アイソタイプ対照抗体（非枯渇）を投与された無処置マウスは増殖する皮下腫瘍を有している一方で、ｍＥＧ－７０処理動物はすべてＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞による遠隔腫瘍再負荷から保護された。

【図3C】抗ＣＤ４抗体を投与されたマウス（ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇）は、無処置であろうと、またはｍＥＧ－７０処理によって以前治療されていようと、増殖するＭＢ４９－Ｌｕｃ皮下腫瘍を有する。

【図3D】抗ＣＤ８抗体（ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇）を投与された無処置マウスはすべて増殖する皮下腫瘍を有するが、ｍＥＧ－７０処理動物では６匹のうち１匹だけが活発に増殖する腫瘍を有した。

【図4A】ｍＥＧ－７０構築物による雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの実験的処理のタイムラインを示す。ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１００μＬ中に２．５×１０^５細胞）を、麻酔下でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１２～１６週）の右脇腹に皮下移植して疾患を誘導した。腫瘍が約５０～２００ｍｍ^３に達したとき、マウスを無作為に処理群に割り当てた（ｎ＝１０）。１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目及び１８日目にｍＥＧ－７０（５０μＬ中０．５ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ、２５μｇのＤＮＡに相当）をマウスに直接腫瘍内（ＩＴ）投与し、対照動物には１％マンニトール（偽処理）を投与した。担腫瘍動物のコホートは未処理だった。ノギスで測定することによって週に３回、腫瘍サイズをモニタリングした（腫瘍体積は式（長さ×幅^２／２）を使用して算出した）。腫瘍のないｍＥＧ－７０で治癒した個体（ｍＥＧ－７０「治癒」；ｎ＝９）にて腫瘍が再発していないことを確認するために、７０日目にＬｕｍｉｎａ ＬＴ ＩＶＩＳ画像処理システムを使用してルシフェラーゼシグナルの生物発光画像処理を実施した。７３日目に、ｍＥＧ－７０で治癒し、週齢を一致させた対照の左脇腹にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１００μＬ中２．５×１０^５細胞）を皮下移植した。ノギスで測定することによって週３回、腫瘍をモニタリングし；腫瘍体積は式（長さ×幅^２／２）を使用して算出した。

【図4B】ｍＥＧ－７０の腫瘍内（ＩＴ）投与は偽処理マウスと比べて腫瘍増殖を阻害した。

【図4C】ｍＥＧ－７０「治癒」マウスは反対側脇腹の腫瘍細胞の再負荷から保護された。

【発明を実施するための形態】

【0027】

本開示は、遠隔部位における転移性疾患の治療のために、原発性腫瘍部位におけるＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉアゴニストの限局性発現を企図する。例えば、膀胱への膀胱内投与、肺へのエアロゾル化投与、腫瘍内注射、及び／または消化管（ＧＩＴ）への経口剤形のような粘膜組織での限局性遺伝子治療は、望ましくない全身性の副作用を最小限に抑えながら免疫調節性タンパク質の限局性発現を促進する魅力的なアプローチを提示する。さらに、本明細書で初めて実証されるように、驚くべきことに、本明細書に開示されている非ウイルスベクタープラットフォームを使用するＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉアゴニストを含む治療用核酸の送達は、原発性腫瘍から離れた部位での転移腫瘍の治療する及び防止するのに使用できる、細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＣＤ４＋メモリーＴ細胞の双方を含む強力で全身性の抗腫瘍活性を引き起こすことが見いだされている。

【0028】

理論に束縛されるものではないが、主題の開示による原発性がん部位におけるＩＬ－１２経路の活性化は、エフェクターＣＤ４＋及びＣＤ８＋細胞に作用し、メモリーＴ細胞の誘導を含む強力な抗腫瘍機能及び抗血管新生機能をもたらすのに対して、ＲＩＧ－Ｉ経路の同時または逐次の刺激はＩ型インターフェロン及びＩＦＮ刺激遺伝子の誘導をもたらし、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞に対する腫瘍抗原の交差提示の改善につながる。本明細書に記載され、例示されている好ましい実施形態では、これらの協調した生物学的メカニズムを組み合わせて、頑強で長持ちする抗腫瘍免疫応答を駆動する驚くべき且つ顕著に強力な炎症反応を生成し、ＲＩＧ－Ｉアゴニストによる自然免疫系の刺激を適応免疫応答のＩＬ－１２が介在する刺激につなぎ合わせる。

【0029】

定義
別途定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語、表記法、及び他の科学用語は、本開示が関係する分野の当業者らによって一般に理解される意味を有するように意図される。場合によっては、一般に理解される意味を有する用語は、明確にするために及び／またはすぐに参照できるように本明細書中で定義され、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当該技術分野において一般に理解されているものを超える差を表すように解釈されるべきではない。本明細書に記載または参照される手法及び手順は、一般によく理解され、当業者らによって、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹに記載の広く利用される分子クローニング方法論を使用して一般に用いられる。必要に応じて、市販のキット及び試薬の使用を含む手順は、別途記載のない限り、一般に、製造者が定義したプロトコール及び／またはパラメーターに従って実施される。

【0030】

本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈が別途明示しない限り、複数の指示対象を含む。

【0031】

「約」という用語は、示された値及びその値の上下範囲を示し、包含する。特定の実施形態では、「約」という用語は、指定された値±１０％、±５％、または±１％を示す。特定の実施形態では、示されている場合、「約」という用語は、指定された値±その値の１標準偏差を示す。

【0032】

「それらの組み合わせ」という用語は、その用語が参照する要素のすべての可能な組み合わせを含む。

【0033】

本明細書で使用されるとき「メモリーＴ細胞応答」または「メモリーＴ細胞の誘導」という用語は、Ｔ細胞上の分子、抗原提示細胞（ＡＰＣ）、及び炎症性サイトカインメディエーター間の協調的相互作用を介したナイーブＴ細胞の「活性化」を指し、これにより、刺激されたＴ細胞が、免疫学的侵襲、例えば、がん抗原に対処するのに適したエフェクターへと分化する。メモリーＴ細胞応答は当該技術分野で知られている。例えば、Ｐｅｎｎｏｃｋ ｅｔ ａｌ，（２０１３），Ａｄｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｅｄｕｃ．３７（４）：２７３－２８３；Ｓｐｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．（２０１１），Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４７８－８４；ＭａｃＬｅｏｄ ｅｔ ａｌ．（２０１０），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１３０（１）：１０－１５を参照のこと。

【0034】

したがって、「メモリーＴ細胞応答を活性化すること」とは、免疫防御に介在することができるＴ細胞を作り出すための無処置／休止状態からのＴ細胞の活性化及びプログラミングを指す。

【0035】

本明細書で使用されるとき「がん抗原」または「腫瘍抗原」という用語は、腫瘍抗原として作用することができる腫瘍細胞内で産生されるタンパク質を指す。「がん抗原」または「腫瘍抗原」は当該技術分野で知られている。例えば、がんエピトープデータベース及び分析リソース（ＣＥＤＡＲ）は、文献から厳選されたがんエピトープの包括的な収集ならびにがんエピトープの予測及び分析ツールを提供する。例えば、Ｋｏｓａｌｏｇｌｕ－Ｙａｌｑｎ１ ｅｔ ａｌ．（２０２１），Ｆｒｏｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１－１４を参照のこと。例示的ながん抗原は、例えば、ｃａｐｅｄ．ｉｃｐ．ｕｃｌ．ａｃ．ｂｅ／Ｐｅｐｔｉｄｅ／ｌｉｓｔでのワールドワイドウェブにて利用可能ながん抗原性ペプチドデータベースにも開示されている。

【0036】

本明細書で使用されるとき「原発性腫瘍」または「原発性がん」という用語は、腫瘍の進行が始まり、がん性塊を生じるように進行する解剖学的部位に存在する腫瘍を指す。例示的な原発性がんには、膀胱、結腸、肺、膣、卵巣、子宮頸部、腎臓、胃、消化管、前立腺、脳、乳房、膵臓、肺、甲状腺、子宮内膜、食道、喉頭、鼻腔癌、口腔癌、黒色腫、咽頭癌、網膜芽細胞腫、精巣癌などの原発性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。

【0037】

本明細書に開示されている方法は、抗原、例えばがん抗原に対する強力なメモリーＴ細胞応答を活性化するのに有用であるので、がん性病変または腫瘍が抑制または治癒され得る。さらに、がん抗原に対する強力なメモリーＴ細胞応答を活性化する本明細書に開示されている方法は、この方法が原発性がんとは異なる部位にて転移性疾患を治療するまたは抑制するのに有効であるように長持ちする全身性免疫をもたらす。

【0038】

本明細書で使用されるとき「転移性」という用語は、原発性腫瘍の部位から離れた部位で発生する腫瘍を指す。

【0039】

本明細書で使用されるとき「転移性疾患」という用語は、腫瘍を別の臓器または組織（またはその一部）に、隣接しない別の臓器または組織（またはその一部）に広げる可能性がある状態または症状を指す。一実施形態では、転移性疾患はがん転移性疾患、例えば、転移の確立を指す。一部のがん細胞は、リンパ管及び／または血管の壁を貫通する能力を獲得する場合があり、その後、血流（循環腫瘍細胞）を介して体内の他の部位及び組織に循環することができる。このプロセスは通常、（それぞれ）リンパ性または血行性の伝播として知られている。腫瘍細胞は別の部位で静止した後、血管または壁を再貫通して増殖し続け、最終的には臨床的に検出可能な別の腫瘍が形成される。この新しい腫瘍は転移性（または二次または三次）腫瘍として知られている。腫瘍細胞が転移する場合、その新しい腫瘍は二次腫瘍または転移性腫瘍、「転移」または「転移性疾患」と呼ばれ、その細胞は元の原発性腫瘍の細胞と似ている。これは、例えば、膀胱がんが子宮に転移した場合、二次腫瘍は異常な子宮細胞ではなく、異常な膀胱細胞で構成されることを意味する。この場合、子宮内の腫瘍は子宮がんではなく転移性膀胱がんと呼ばれる。

【0040】

「転移性疾患」には、がん性腫瘍、例えば、粘膜癌に由来するがんの転移性伝播が含まれるが、これに限定されない。「転移性疾患」には、良性腫瘍からの転移性の伝播も含まれる。したがって、例示的な実施形態では、転移性疾患には、乳房、結腸、前立腺、膵臓、皮膚、肺、卵巣、腎臓、脳、膀胱、膣、子宮頸部、胃、消化管、肝臓、甲状腺、食道、鼻腔癌、喉頭、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜、及び精巣などのがん性及び良性の腫瘍からの転移性伝播が挙げられる。いくつかの実施形態では、転移性疾患は転移性膀胱癌である。

【0041】

本明細書に開示されている方法は、癌腫を有する個体にて原発性がんとは異なる部位での転移腫瘍を治療する、または抑制することによって転移性疾患を防止する、または治療するのに有用である。したがって、本明細書で使用されるとき、「転移性疾患の防止または治療」という表現は、カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む組成物の、転移性疾患の発生を限定するまたは減らす、がんの転移能を限定する、及び／または対照と比べた場合の転移の数及び播種を限定する、あるいは病気を治癒させる能力を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されている方法は、転移性疾患に関連する症状の予防、または転移性疾患に関連する症状の重症度を制限するのに有用である。

【0042】

本明細書に記載されている方法はまた、転移性疾患の進行を制限するのにも有用であり得る。本明細書で使用されるとき、「転移性疾患の進行を制限する」という表現は、カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む組成物の、転移の出現を遅らせるもしくは抑制する、転移の数を制限する、転移のサイズを制限する、及び／または転移を含有する臓器もしくは組織の数を制限する能力を指す。一実施形態では、本明細書に記載されている方法は、転移性疾患の進行に関連する症状を予防すること、または転移性疾患の進行に関連する症状の重症度を制限することにも有用であり得る。

【0043】

したがって、任意の疾患または障害の「治療すること」または「治療」は、特定の実施形態では、対象に存在する疾患または障害を改善することを指す。「治療すること」または「治療」は、対象によって識別できなくてもよい少なくとも１つの身体的パラメーターを改善することを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、身体的に（例えば、識別可能な症状の安定化）または生理学的に（例えば、身体的パラメーターの安定化）あるいはその双方のいずれかで、疾患または障害を調整することを含む。さらに別の実施形態では、「治療すること」または「治療」は、疾患または障害の発症を遅らせるまたは予防することを含む。例えば、例示的な実施形態では、「がんを治療する」という語句は、がん細胞の増殖の阻害、がんの伝播（転移）の阻害、腫瘍増殖の阻害、がん細胞数または腫瘍増殖の減少、がんの悪性度（例えば、分化の増加）の低下、あるいはがん関連症状の改善を指す。さらに、本明細書で使用されるとき「治療」には、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または減速、疾患状態の改善、疾患の（部分的または全体的）寛解の提供、疾患を治療するのに必要な１以上の他の薬物の投与量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上または改善、体重増加の上昇、及び／または生存期間の延長が含まれる。「治療」によって包含されるのはまた、がんの病理学的帰結の軽減である。

【0044】

本明細書で使用されるとき、「治療有効量」または「有効量」という用語は、対象に投与される場合に、疾患または障害を治療するのに有効である主題の組成物の量を指す。例えば、例示的な実施形態では、「有効量」という語句は、「治療有効量」または「治療有効用量」などと相互交換可能に使用され、がんを治療するのに有効な治療剤の量を意味する。本明細書で提供されている組成物の有効量は、動物の疾患状態、週齢、性別、体重のような因子に応じて変化してもよい。

【0045】

本明細書で使用されるとき、「対象」または「個体」という用語は哺乳類対象を意味する。例示的な対象には、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ラクダ、トリ、ヤギ、及びヒツジが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、本明細書で提供されている抗体で治療することができるがん、自己免疫の疾患もしくは状態、及び／または感染症を有する。いくつかの実施形態では、対象は、がん、自己免疫の疾患もしくは状態、及び／または感染症を有することが疑われるヒトである。

【0046】

「キトサン」は、Ｎ－アセチルグルコサミンのポリマーである、キチンの部分的または完全に脱アセチル化された形態である。脱アセチル化度が５０％を超えるキトサンが本開示では使用される。

【0047】

キトサンは、脱アセチル化部位の遊離アミノ基を官能化することによって誘導体化されてもよい。本明細書に記載されている誘導体化キトサンは、負に荷電した核酸に効果的に結合及び複合体化すること、制御可能なサイズのナノ粒子に形成され得ること、細胞によって取り込まれ得ること、ならびに細胞内に適切な時間で核酸を放出することができることを含む、核酸送達ビヒクルに有利である多数の特性を有する。１％～５０％の間で任意の官能化度を持つキトサン。（官能化前のまたは官能化がないキトサンポリマー上の遊離アミノ部分の数に対して、官能化パーセントを決定する。）脱アセチル化度及び官能化度は、官能化キトサン誘導体に特定の電荷密度を付与する。

【0048】

本開示に係るポリオールは、３、４、５、６、または７の炭素骨格を有してもよく、少なくとも２つのヒドロキシル基を有してもよい。そのようなポリオール、またはそれらの組み合わせは、カチオン部分（例えば、リシン、オルニチンのようなアミノ基を含む分子、グアニジニウム基、アルギニンを含む分子、またはそれらの組み合わせ）で官能化されているキトサンのようなキトサン骨格へのコンジュゲートに有用であり得る。

【0049】

本明細書で使用される「Ｃ_２－Ｃ_６アルキレン」という用語は、任意に１以上の炭素－炭素多重結合を含有する線状または分枝状の二価炭化水素ラジカルを指す。誤解を避けるために、本明細書で使用される「Ｃ_２－Ｃ_６アルキレン」という用語は、アルカン、アルケン、及びアルキンの二価ラジカルを包含する。

【0050】

本明細書で使用されるとき、別途指示のない限り、「ペプチド」及び「ポリペプチド」という用語は、相互交換可能に使用される。

【0051】

「ポリペプチド」という用語は、従来のポリペプチド（すなわち、ＬまたはＤ－アミノ酸を含有する短いポリペプチド）、ならびに所望の機能的活性を保持するペプチド同等物、ペプチド類似体、及びペプチド模倣体を指すように最も広い意味で使用される。ペプチド同等物は、１以上のアミノ酸を関連有機酸、アミノ酸などで置き換えること、または側鎖もしくは官能基を置換または修飾することによって、従来のペプチドとは異なり得る。

【0052】

ペプチド模倣体は、当該技術分野で知られているように、代替の結合によって置き換えられた１以上のペプチド結合を有してもよい。当該技術分野で知られているように、ペプチド骨格の一部または全部は、機能的アミノ酸側鎖の可動性を制限するために、立体配座的に拘束された環状アルキルまたはアリール置換基で置き換えることもできる。

【0053】

本開示のポリペプチドは、当該技術分野で周知である組み換え及び合成方法のような認識された方法によって生成されてもよい。ペプチド合成の手法は周知であり、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９－２４５６（１９６３），Ａｔｈｅｒｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９８９），及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１－３４７（１９８６）に記載されたものが挙げられる。

【0054】

本明細書で使用されるとき、「線状ポリペプチド」は、構成アミノ酸側鎖に共有結合している分岐基を欠くポリペプチドを指す。本明細書で使用されるとき、「分岐ポリペプチド」は、構成アミノ酸側鎖に共有結合している分岐基を含むポリペプチドを指す。

【0055】

本明細書で使用されるとき、カチオンまたはポリオールの「最終官能化度」は、それぞれ、カチオン（例えば、アミノ）またはポリオールで官能化されたキトサン骨格上のカチオン（例えば、アミノ）基の割合を指す。したがって、「α：β比」、「最終官能化度比」（例えば、アルギニンの最終官能化度：ポリオールの最終官能化度の比）などは、「モル比」または「数比」という用語と相互交換可能に使用されてもよい。

【0056】

分散系は、連続媒体全体に分布した分散相として知られる粒子物質から成る。キトサン核酸ポリプレックスの「分散系」は、水和キトサン核酸ポリプレックスを含む組成物であり、ポリプレックスは媒体全体に分布している。

【0057】

本明細書で使用されるとき、「予備濃縮された」分散系は、濃縮された分散系を形成するための濃縮プロセスを受けていないものである。

【0058】

本明細書で使用されるとき、ポリプレックス沈殿物を「実質的に含まない」は、組成物が、目視検査で観察することができる粒子を本質的に含まないことを意味する。

【0059】

本明細書で使用されるとき、生理学的ｐＨは、６～８の間のｐＨを指す。

【0060】

「キトサン核酸ポリプレックス」またはその文法上の同等物は、複数のキトサン分子及び複数の核酸分子を含む複合体を意味する。好ましい実施形態では、（例えば、二重）誘導体化キトサンは、該核酸と複合体化される。

【0061】

本明細書で使用されるとき「ポリエチレングリコール」（「ＰＥＧ」）という用語は、－（ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ）－の繰り返し単位及びＨＯ－（ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ）ｎ－Ｈの一般式を有するエチレンオキシドのポリマーを意味することが意図される。

【0062】

本明細書で使用されるとき「モノメトキシポリエチレングリコール」（「ｍＰＥＧ」）という用語は、－（ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ）－の繰り返し単位及びＣＨ_３Ｏ－（ＣＨ_２ＣＨ_２－Ｏ）ｎ－Ｈの一般式を有するエチレンオキシドのポリマー、例えば、一端がメトキシ基でキャップされたＰＥＧを意味することが意図される。

【0063】

Ｉ．転移性疾患
がんの転移とは、がん細胞が体の一部から近くの組織、器官、さらには体の離れた部分に広がることを指す。通常、がんが原発臓器から離れた臓器に広がる場合、全身性疾患とみなされ、制御するのは困難である。転移性疾患を発症した対象のための治療選択肢は限られており、予後は通常、不良である。

【0064】

転移性疾患が存在する場合、局所療法は無駄であると見なされていた。しかしながら、現在、一部の悪性腫瘍（例えば、腎臓、乳房、及び前立腺）では、転移拡散が確立されているにもかかわらず、原発性腫瘍の治療によって死亡率が低下し得ることが理解されている（例えば、Ｍｏｒｇａｎ ＳＣ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２０１１，Ｊｕｎ，７；８（８）：５０４－６；Ｓａｍｉ－Ｒａｍｚｉ Ｌｅｙｈ－Ｂａｎｎｕｒａｈ ｅｔ ａｌ．（２０１７）Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｕｒｏｌｏｇｙ，７２：１１８－１２４を参照のこと）。それでも、原発性腫瘍に対する治療は既存の転移の進行を遅らせ得る一方で、通常、治癒をもたらすことはない。

【0065】

幸いなことに、以下に詳細に説明するように、驚くべきことに、原発性腫瘍の部位に限局性に送達された、本明細書に開示されている組成物が、長持ちする全身性の特異的な抗腫瘍免疫を提供することが見いだされている。

【0066】

ＩＩ．組成物
本明細書で提供されているのは、ポリアニオン含有ブロックコポリマー、例えば、二元ブロック及び／または三元ブロックコポリマーのコーティングと複合体化されたキトサン誘導体核酸ナノ粒子（ポリプレックス）を含むキトサン組成物であり、この場合、個々のポリマー分子は、負に荷電したアンカー領域及び１以上の非荷電親水性テール領域を含む。本開示の方法及び組成物にて有用な例示的なポリマー分子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分及びポリアニオン（ＰＡ）部分を含む「ＰＥＧ－ＰＡ」ポリマー分子である。

【0067】

Ａ．キトサン
キトサン誘導体核酸ナノ粒子のキトサン構成成分は、カチオン官能基及び／または親水性部分で官能化することができる。２つの異なる官能基で官能化されたキトサンは二重誘導体化キトサン（ＤＤ－キトサン）と呼ばれる。例示的なＤＤ－キトサンは、親水性部分（例えば、ポリオール）及びカチオン官能基（例えば、アミノ基）の双方で官能化される。例示的なキトサン誘導体は、例えば、ＵＳ２００７／０２８１９０４、及びＵＳ２０１６／０２３５８６３にも記載されており、それぞれ、参照によって本明細書に組み込まれる。

【0068】

一実施形態では、本明細書に記載されている二重誘導体化キトサンは、脱アセチル化度が少なくとも５０％であるキトサンを含む。一実施形態では、脱アセチル化度は、少なくとも６０％、さらに好ましくは、少なくとも７０％、さらに好ましくは、少なくとも８０％、さらに好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％である。好ましい実施形態では、本明細書に記載されている二重誘導体化キトサンは、脱アセチル化度が少なくとも９８％であるキトサンを含む。

【0069】

本明細書に記載されているキトサン誘導体は、中性及び生理学的ｐＨで可溶性である幅広い平均分子量を有し、本開示の目的のために、３～１１０ｋＤａの範囲の分子量を含む。本明細書に記載されている実施形態は、誘導体化キトサンのさらに低い平均分子量（２５ｋＤａ未満、例えば、約５ｋＤａ～約２５ｋＤａ）を特徴とし、これは、望ましい送達及び形質移入の特性を有することができ、サイズが小さく、良好な溶解性を有する。低平均分子量の誘導体化キトサンは一般に、高い分子量のものよりも溶解性が高いので、前者は、核酸をさらに容易に放出し、細胞の形質移入を増加させる核酸／キトサン複合体を生成する。多くの文献で、キトサンに基づく送達システムのためのこれらパラメーターのすべての最適化について記載されている。

【0070】

当業者は、キトサンが、式Ｉの構造（式中、ｎは、任意の整数であり、各Ｒ１は独立して、アセチルまたは水素から選択され、水素から選択されるＲ１の程度は、５０％～１００％である）を有する複数の分子を指すことを理解するであろう。また、例えば、３ｋＤ～１１０ｋＤの平均分子量を有するものと呼ばれるキトサンは一般に、例えば、それぞれ、３ｋＤ～１１０ｋＤの重量平均分子量を有する複数のキトサン分子を指し、キトサン分子のそれぞれは異なる鎖長（ｎ＋２）を有してもよい。「ｎ－量体キトサン」と呼ばれるキトサンは、必ずしも式Ｉのキトサン分子（式中、各キトサン分子はｎ＋２の鎖長を有する）を含むとは限らないこともよく認識される。むしろ、本明細書で使用されるような「ｎ－量体キトサン」は、複数のキトサン分子を指し、これらのそれぞれは、異なる鎖長を有してもよく、多くは、鎖長がｎであるキトサン分子と実質的に同等または等しい平均分子量を有する。例えば、２４－量体のキトサンは、複数のキトサン分子を含んでもよく、それぞれは、例えば、７～５０の範囲に及ぶ異なる鎖長を有するが、これは、鎖長が２４のキトサン分子と実質的に同等または等しい重量平均分子量を有する。

【0071】

本開示の二重誘導体化キトサンはまた、ポリオール、またはポリオールのような親水性官能基で官能化されてもよい。理論に束縛されることを望むものではないが、キトサン（アルギニン－キトサンを含む）の親水性を高めるのに役立つ場合があるポリオールなどの親水性基で官能化すること、及び／またはヒドロキシル基を供与することが仮説として考えられる。いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子の親水性官能基はグルコン酸である、またはそれを含む。例えば、ＷＯ２０１３／１３８９３０を参照のこと。いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子の親水性官能基は、グルコースである、またはそれを含む。追加的または代替的に、親水性官能基は、ポリオールを含むことができる。例えば、ＵＳ２０１６／０２３５８６３を参照のこと。キトサンの官能化のための例示的なポリオールはさらに、以下に記載される。

【0072】

本明細書に記載されている官能化キトサン誘導体は、二重誘導体化キトサン化合物、例えば、カチオン－キトサン－ポリオール化合物を含む。一般に、カチオン－キトサン－ポリオール化合物は、アミノ含有部分、例えば、アルギニン、リシン、オルニチン、もしくはグアニジニウムを含む分子、またはそれらの組み合わせで官能化される。特定の実施形態では、カチオン－キトサン－ポリオール化合物は、以下の式Ｉの構造を有する：

【化1】

式中、ｎは１～６５０の整数であり、
αは、カチオン部分（例えば、リシン、オルニチン、グアニジニウム基を含む分子、アルギニン、またはそれらの組み合わせのようなアミノ基を含む分子）の最終官能化度であり、
βは、ポリオールの最終官能化度であり；
各Ｒ^１は独立して、水素、アセチル、カチオン（例えば、アルギニン）、及びポリオールから選択される。

【0073】

好ましくは、本開示の二重誘導体化キトサンは、カチオンアミノ酸であるアルギニンで官能化されてもよい。

【0074】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、１％、２％、４％、７％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の最終官能化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、１％、２％、４％、７％、８％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、またはそれ以上の最終官能化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１％～約２５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約４０％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。

【0075】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２０％～約３５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％～約３５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％～約３０％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。

【0076】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約４０％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３０％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約２８％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。

【0077】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３０％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約２８％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能化度でカチオン部分（例えば、アルギニン）と結合したキトサンを含む。

【0078】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能化度でグルコン酸と結合したキトサンを含む。

【0079】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能化度で親水性ポリオールと結合したキトサンを含む。

【0080】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３０％、約５％～約３０％、約７．５％～約３０％、約５％～約２５％、約５％～約２２％、約５％～約２０％、約５％～約１５％、または約５％～約１０％の最終官能化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約２５％、約７．５％～約２０％、約７．５％～約１５％、または約７．５％～約１２％の最終官能化度でグルコースと結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％の最終官能化度でグルコースと結合したキトサンを含む。

【0081】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約４０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約５％～約４０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約４０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約４０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。

【0082】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２％～約３５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約５％～約３５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約７．５％～約３５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。

【0083】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１０％～約３０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約２％～約３０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１２％～約３０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％～約３０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％～約３０％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％、または約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。

【0084】

一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約７．５％～約１５％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。一実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約５％～約２０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。

【0085】

好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１２％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１４％の最終官能化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１０％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約１５％の最終官能化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１２％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。

【0086】

好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能化度でカチオン（例えば、アルギニン）と結合したキトサン及び約１０％の最終官能度で親水性ポリオール（例えば、グルコースまたはグルコン酸）と結合したキトサンを含む。別の好ましい実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、約２８％の最終官能化度でアルギニンと結合したキトサン及び約１０％の最終官能度でグルコースと結合したキトサンを含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、必要に応じて、ＤＤ－キトサンは、ＤＤ－キトサン誘導体、例えば、追加の官能化を組み込んだＤＤキトサン、例えば、結合したリガンドを有するＤＤ－キトサンを含む。「誘導体」は、共有結合的に修飾されたＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン及び／またはＤ－グルコサミンユニットを含むキトサン系ポリマー、ならびに他のユニットを組み込むかまたは他の部分に結合したキトサン系ポリマーの幅広い分類を含むと理解されるであろう。誘導体は、アルギニン官能化キトサンで行われるように、グルコサミンのヒドロキシル基またはアミン基の修飾に基づくことが多い。キトサン誘導体の例には、トリメチル化キトサン、チオール化キトサン、ガラクトシル化キトサン、アルキル化キトサン、ＰＥＩ組み込みキトサン、ウロン酸修飾キトサン、グリコールキトサンなどが挙げられるが、これらに限定されない。キトサン誘導体に関するさらなる教示について、例えば、ｐｐ．６３－７４ ｏｆ “Ｎｏｎ－ｖｉｒａｌ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ”，Ｋ．Ｔａｉｒａ，Ｋ．Ｋａｔａｏｋａ，Ｔ．Ｎｉｉｄｏｍｅ（ｅｄｉｔｏｒｓ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ Ｔｏｋｙｏ，２００５，ＩＳＢＮ ４－４３１－２５１２２－７；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ，Ｄｅｃｅｍｂｅｒ ２００７，ｖｏｌ．５２（２３），ｐｐ．３２０７－３２１５；及びＶａｒｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ５５（２００４）７７－９３を参照のこと。

【0088】

Ａ．１．キトサン核酸ポリプレックス
キトサン誘導体ナノ粒子組成物は一般に、少なくとも１つの核酸分子、好ましくは、複数のそのような核酸分子を含有する。典型的な核酸分子は、例えば、複数のホスホジエステルまたはその誘導体（例えば、ホスホロチオエート）の形態で、核酸骨格の構成成分としてリンを含む。カチオン官能化キトサン誘導体の核酸に対する比率は、カチオン（＋）のリン（Ｐ）に対するモル比を特徴とすることができ、この場合、（＋）はカチオン官能化キトサン誘導体のカチオンを指し、（Ｐ）は核酸骨格のリンを指す。通常、（＋）：（Ｐ）のモル比は、キトサン－誘導体－核酸複合体がポリアニオン含有ブロックコポリマー可逆性コーティングの非存在下で正電荷を有するように選択される。したがって、（＋）：（Ｐ）のモル比は一般に１より大きい。好ましい実施形態では、（＋）：（Ｐ）のモル比は、１．５を超え、少なくとも２、または２を超える。特定の好ましい実施形態では、（＋）：（Ｐ）のモル比は２より大きい。

【0089】

場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、３：１である、または約３：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、４：１である、または約４：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、５：１である、または約５：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、６：１である、または約６：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、７：１である、または約７：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、８：１である、または約８：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、９：１である、または約９：１である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、１０：１である、または約１０：１である。

【0090】

場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、１超～約２０：１以下、約２～約２０：１以下、または約２～約１０：１以下である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、約２超～約２０：１以下、または約２超～約１０：１以下である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、約３～約２０：１以下、約３～約１０：１以下、約３～約８：１以下、または約３～約７：１以下である。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、約３～２０：１以下、約３～１０：１以下、約３～８：１以下、または約３～７：１以下である。

【0091】

特定の実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１００：１、好ましくは、１００：１未満である。例えば、特定の実施形態では、（＋）：（Ｐ）モル比は、１超～１００：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～１００：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～５０：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、２超～２５：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、３以上～２５：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、５以上～２５：１以下であることができる。場合によっては、（＋）：（Ｐ）モル比は、７以上～２５：１以下であることができる。

【0092】

いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子のカチオン官能基は、アミノ基である、またはそれを含む。そのようなアミノ官能化キトサン誘導体ナノ粒子の例としては、グアニジニウムもしくはグアニジニウム基を含む分子、リシン、オルニチン、アルギニン、またはそれらの組み合わせで官能化されるキトサンを含有するものが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態では、カチオン官能基は、アルギニンである。アミノ官能化キトサン誘導体の核酸に対する比率はアミノ（Ｎ）のリン（Ｐ）に対するモル比を特徴とすることができ、この場合、（Ｎ）はアミノ官能化キトサン誘導体のアミノ基の窒素原子を指し、（Ｐ）は、核酸骨格のリンを指す。通常、Ｎ：Ｐのモル比は、キトサン誘導体核酸複合体がＰＥＧ－ＰＡポリマー分子の非存在下で、生理学的に適切なｐＨにて正電荷を有するように選択される。したがって、Ｎ：Ｐのモル比は一般に１より大きい。好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐのモル比は１．５より大きい、少なくとも２である、または２より大きい。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐのモル比は２より大きい。

【0093】

場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、３：１である、または約３：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、４：１である、または約４：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、５：１である、または約５：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、６：１である、または約６：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、７：１である、または約７：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、８：１である、または約８：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、９：１である、または約９：１である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、１０：１である、または約１０：１である。

【0094】

場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、１超～約２０：１以下、約２～約２０：１以下、または約２～約１０：１以下である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、約２超～約２０：１以下、または約２超～約１０：１以下である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、約３～約２０：１以下、約３～約１０：１以下、約３～約８：１以下、または約３～約７：１以下である。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、約３～２０：１以下、約３～１０：１以下、約３～８：１以下、または約３～７：１以下である。

【0095】

特定の実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、１００：１、好ましくは、１００：１未満である。例えば、特定の実施形態では、Ｎ：Ｐモル比は、１超～１００：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、２超～１００：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～１００：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、２超～５０：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～５０：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、２超～２５：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、３以上～２５：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、５以上～２５：１以下であることができる。場合によっては、Ｎ：Ｐモル比は、７以上～２５：１以下であることができる。

【0096】

好ましい実施形態では、主題のポリプレックスは、２～１００、例えば、２～５０、例えば、２～４０、例えば、２～３０、例えば、２～２０、例えば、２～５のアミン対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）の比を有する。好ましくは、Ｎ／Ｐ比は、キトサンの分子量に反比例し、すなわち、さらに小さい分子量の（例えば、二重）誘導体化キトサンはさらに高いＮ／Ｐ比を必要とし、逆もまた同様である。

【0097】

本開示の核酸は一般に、ホスホジエステル結合を含有することになるが、場合によっては、種々の目的、例えば、安定性及び保護のいずれかのために組み込まれる代替の骨格または他の修飾もしくは部分を有してもよい核酸類似体が含まれる。企図される他の類似体核酸は非リボース骨格を持つものを含む。加えて、天然に存在する核酸、類似体、及びその双方の混合物を作成することができる。核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または二本鎖もしくは一本鎖の配列の双方の部分を含有してもよい。核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、及びハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されず、核酸は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドの任意の組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンタニン、ヒポキサンタニン、イソシトシン、イソグアニンなどを含む塩基の任意の組み合わせを含有する。核酸は、任意の形態のＤＮＡ、三重鎖、二本鎖、または一本鎖、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ、リボザイム、デオキシリボザイム、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、キメラ、マイクロＲＮＡ、及びそれらの誘導体を含む任意の形態のＲＮＡを含む。核酸は、限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミダートモルホリノオリゴ（ＰＭＯ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含む人工核酸を含む。リンを含まない人工核酸の場合、（＋）：ＰまたはＮ：Ｐ比の同等の測定値は、ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）塩基の数によって近似することができることが理解されるであろう。

【0098】

好ましい実施形態では、組成物のポリプレックスは、官能化前の１１０ｋＤａ未満、さらに好ましくは、６５ｋＤａ未満、さらに好ましくは、５０ｋＤａ未満、さらに好ましくは、４０ｋＤａ未満、最も好ましくは、３０ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサン分子を含む。いくつかの実施形態では、組成物のポリプレックスは、官能化前の１５ｋＤａ未満、１０ｋＤａ未満、７ｋＤａ未満、または５ｋＤａ未満の平均分子量を有するキトサンを含む。

【0099】

好ましい実施形態では、ポリプレックスは、平均して、６８０グルコサミンモノマー単位未満、さらに好ましくは、４００グルコサミンモノマー単位未満、さらに好ましくは、３１０グルコサミンモノマー単位未満、さらに好ましくは、２５０グルコサミンモノマー単位未満、最も好ましくは、１９０グルコサミンモノマー単位未満を有するキトサン分子を含む。いくつかの実施形態では、ポリプレックスは、平均して、９５グルコサミンモノマー単位未満、６５グルコサミンモノマー単位未満、４５グルコサミンモノマー単位未満、または３５グルコサミンモノマー単位未満を有するキトサン分子を含む。

【0100】

本明細書に記載されているものを含むが、これらに限定されないキトサン、及び（例えば、二重）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスは当該技術分野で既知の任意の方法で調製されてもよい。

【0101】

Ａ．２．核酸
上記のように、キトサンポリプレックスは複数の核酸を含有することができる。一実施形態では、核酸構成成分は治療用核酸を含む。主題の（例えば、二重）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスは、例えば、ホルモン、酵素、サイトカイン、ケモカイン、抗体、分裂促進因子、成長因子、分化因子、細胞アポトーシスに影響を及ぼす因子、炎症に影響を及ぼす因子、免疫応答に影響を及ぼす因子（例えば、免疫刺激因子）などのような治療用タンパク質をコードする核酸を含む、当該技術分野で既知の任意の治療用核酸の使用に適している。

【0102】

治療用核酸を使用して、欠損遺伝子の置き換えもしくは増強として役立てることによって遺伝子治療を達成してもよく、または、治療用産物をコードすることによって特定の遺伝子産物の欠如を補ってもよい。治療用核酸はまた、内在性遺伝子の発現を阻害してもよい。治療用核酸は、翻訳産物のすべてまたは一部をコードしてもよく、細胞にすでに存在するＤＮＡと再結合し、それによって、遺伝子の欠陥部分を置換することによって機能してもよい。それは、また、タンパク質の一部をコードしてもよく、遺伝子産物の共抑制によってその効果を発揮してもよい。

【0103】

いくつかの実施形態では、核酸構成成分は治療用核酸構築物を含む。治療用核酸構築物は、治療効果を発揮することができる核酸構築物である。治療用核酸構築物は、治療用タンパク質をコードする核酸、及び治療用ＲＮＡである転写物を産生する核酸を含んでもよい。

【0104】

本明細書に記載され、例示されている好ましい実施形態では、治療用核酸構築物は、単独で、または追加の免疫刺激分子（複数可）と組み合わせて、ＩＬ－１２をコードする核酸を含む。ＩＬ－１２は、４つのα－ヘリックスバンドル構造を持つヘテロ二量体の１型サイトカインである。ＩＬ－１２ｐ７０としても知られる活性があるヘテロ二量体は、ＩＬ－１２Ａ（ｐ３５をコードする）及びＩＬ－１２Ｂ（ｐ４０をコードする）という２つの別個の遺伝子によってコードされる２つのサブユニットで構成される。ＩＬ－１２Ａには少なくとも６つのスプライス変異体転写物がある（ＥＮＳＴ０００００３０５５７９．６、ＥＮＳＴ０００００４６６５１２．１、ＥＮＳＴ０００００４８０７８７．５、ＥＮＳＴ０００００４６８８６２．５、ＥＮＳＴ０００００４９６３０８．１、及びＥＮＳＴ０００００４８００８８．１）。ヒトＩＬ－１２Ａアイソフォーム１前駆体の核酸配列及びペプチド配列は、例えば、それぞれＮＭ＿０００８８２．４、ＮＭ＿００１３５４５８２．２、ＮＭ＿００１３５４５８３．２、及びＮＰ＿０００８７３．２、ＮＰ＿００１３４１５１１．１、及びＮＰ＿００１３４１５１２．１である。マウスＩＬ１２ａの核酸配列及びペプチド配列は、例えば、それぞれＮＭ＿００１１５９４２４．２及びＮＰ＿００１１５２８９６．１である。ヒトＩＬ－１２Ｂゲノム配列、転写物、及びペプチド配列は、例えば、それぞれＮＧ＿００９６１８．１、ＮＭ＿００２１８７．３、及びＮＰ＿００２１７８．２である。マウスＩＬ－１２Ｂの核酸配列及びペプチド配列は、例えば、ＮＭ＿００１３０３２４４及びＮＰ＿００１２９０１７３．１である。

【0105】

いくつかの実施形態では、単鎖ＩＬ－１２タンパク質は、短いアミノ酸リンカー配列を介してｐ４０サブユニットをｐ３５サブユニットに融合することによって生成することができる。２つのサブユニットはｐ４０－リンカー－ｐ３５またはｐ３５－リンカー－ｐ４０のいずれかの方向で連結することができる。タンパク質はリンカーの５’でのサブユニットからのシグナルペプチドの包含の結果として分泌される一方で、シグナルペプチドはリンカー配列の下流のサブユニットから除去される。好ましい実施形態では、リンカー配列は、ウシのエラスチンに由来し、バリン（Ｖ）、プロリン（Ｐ）及びグリシン（Ｇ）の残基で構成される１０アミノ酸配列（ＶＰＧＶＧＶＰＧＶＧ）を含む。いくつかの実施形態では、リンカー配列は、（ＧＧＧＧＳ）ｎのようなＧ残基及び／またはセリン（Ｓ）残基を含有してもよい。他の実施形態では、リンカー配列はＧ、Ｓ、及びＰ、アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）、スレオニン（Ｔ）及びグルタミン酸（Ｅ）を含むが、これらに限定されない追加のアミノ酸を含有してもよい。例示的な実施形態では、リンカーはＧＳＧＳＳＲＧＧＳＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＫ（配列番号１）、ＧＳＴＳＧ（Ａ／Ｓ）ＧＫＳＳＥＧＫＧ（配列番号２）、ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ（配列番号３）、ＧＧＧＧＧＧＳ（配列番号４）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５）から成る群から選択される。

【0106】

例示的な実施形態では、ｈＩＬ－１２ｐ４０ｐ３５をコードする核酸配列は、以下を含む：
ａｔｇｔｇｃｃａｔｃａｇｃａａｃｔｔｇｔｃａｔｃｔｃｃｔｇｇｔｔｃｔｃｃｃｔｃｇｔｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｃｃｃｃｔｃｔｔｇｔｃｇｃｇａｔｔｔｇｇｇａｇｃｔｇａａｇａａａｇａｔｇｔｇｔａｃｇｔｃｇｔｇｇａａｃｔｃｇａｃｔｇｇｔａｃｃｃｇｇａｃｇｃｃｃｃｃｇｇｇｇａａａｔｇｇｔｇｇｔｇｃｔｃａｃｔｔｇｔｇａｔａｃｔｃｃｃｇａａｇａｇｇａｔｇｇａａｔｔａｃｃｔｇｇａｃｃｃｔｃｇａｔｃａｇｔｃｃｔｃｃｇａｇｇｔｃｔｔｇｇｇａｔｃｃｇｇｃａａａａｃｔｃｔｇａｃｃａｔｃｃａａｇｔｃａａｇｇａａｔｔｃｇｇｃｇａｃｇｃｇｇｇｇｃａｇｔａｃａｃｃｔｇｔｃａｃａａｇｇｇｃｇｇａｇａａｇｔｇｃｔｇｔｃｇｃａｃｔｃａｃｔｃｃｔｇｃｔｃｃｔｔｃａｃａａａａａｇｇａｇｇａｃｇｇｃａｔｃｔｇｇｔｃｇａｃｃｇａｃａｔｃｃｔｇａａｇｇａｃｃａｇａａｇｇａａｃｃｃａａｇａａｃａａｇａｃｃｔｔｔｃｔｇｃｇｃｔｇｃｇａｇｇｃｃａａｇａａｃｔａｔｔｃｇｇｇａａｇｇｔｔｃａｃｃｔｇｔｔｇｇｔｇｇｃｔｇａｃｔａｃｃａｔｃｔｃｃａｃｃｇａｃｃｔｇａｃｔｔｔｃｔｃｃｇｔｇａａｇｔｃｃｔｃｔｃｇｇｇｇｔｔｃｇａｇｃｇａｃｃｃｇｃａｇｇｇｔｇｔｔａｃｇｔｇｃｇｇｔｇｃｔｇｃａａｃｃｃｔｇｔｃｃｇｃｇｇａｇａｇａｇｔｇｃｇｇｇｇｇｇａｃａａｃａａｇｇａａｔａｃｇａｇｔａｃｔｃａｇｔｇｇａａｔｇｃｃａｇｇａａｇａｔａｇｃｇｃｃｔｇｃｃｃｔｇｃｃｇｃｃｇａａｇａｇｔｃｃｃｔｇｃｃｇａｔｔｇａａｇｔｃａｔｇｇｔｇｇａｃｇｃａｇｔｇｃａｔａａｇｔｔｇａａａｔａｔｇａｇａａｃｔａｃａｃｃｔｃｇｔｃｇｔｔｃｔｔｃａｔｃｃｇｇｇａｃａｔｃａｔｃａａｇｃｃｔｇａｃｃｃｃｃｃｔａａｇａａｔｃｔｇｃａｇｃｔｃａａｇｃｃｃｃｔｃａａｇａａｃｔｃｃａｇａｃａｇｇｔｃｇａａｇｔｇｔｃｃｔｇｇｇａｇｔａｃｃｃａｇａｔａｃｇｔｇｇａｇｃａｃａｃｃｇｃａｃｔｃｇｔａｃｔｔｃｔｃｃｔｔｇａｃｃｔｔｃｔｇｃｇｔｃｃａａｇｔｇｃａｇｇｇａａａｇｔｃｃａａａｃｇｇｇａｇａａｇａａｇｇａｃｃｇｃｇｔｇｔｔｃａｃｔｇａｔａａｇａｃｔｔｃｃｇｃｔａｃｔｇｔｇａｔｃｔｇｃｃｇｃａａａａａｃｇｃｃａｇｃａｔｃａｇｃｇｔｇｃｇｃｇｃｇｃａａｇａｔａｇａｔａｃｔａｃｔｃａａｇｃｔｃｔｔｇｇｔｃｃｇａａｔｇｇｇｃｇｔｃｃｇｔｇｃｃａｔｇｃｔｃｇｇｔｇｃｃｃｇｇｃｇｔｇｇｇｃｇｔｇｃｃｔｇｇａｇｔｇｇｇａｇｃｃｃｇｇａａｃｔｔｇｃｃｇｇｔｇｇｃｃａｃｃｃｃｔｇａｃｃｃｃｇｇａａｔｇｔｔｃｃｃｔｔｇｃｃｔｇｃａｃｃａｃｔｃｃｃａａａａｃｃｔｔｃｔｇａｇｇｇｃｔｇｔｇｔｃｃａａｃａｔｇｃｔｇｃａｇａａｇｇｃｔｃｇｇｃａｇａｃｃｃｔｇｇａａｔｔｃｔａｃｃｃｃｔｇｃａｃｃｔｃｃｇａｇｇａｇａｔｃｇａｃｃａｃｇａａｇａｔａｔｔａｃｃａａｇｇａｃａａｇａｃｃｔｃａａｃｃｇｔｇｇａａｇｃｃｔｇｃｃｔｇｃｃｃｃｔｇｇａａｃｔｇａｃｃａａｇａａｃｇａａｔｃｇｔｇｃｃｔｇａａｔａｇｃｃｇｇｇａａａｃｃｔｃｃｔｔｃａｔｃａｃｃａａｃｇｇｃｔｃｃｔｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃａｃｇａａａｇａｃｃａｇｃｔｔｔａｔｇａｔｇｇｃｃｃｔｇｔｇｃｃｔｇａｇｃｔｃｇａｔｃｔａｃｇａｇｇａｃｃｔｇａａｇａｔｇｔａｃｃａｇｇｔｃｇａｇｔｔｃａａｇａｃｔａｔｇａａｃｇｃｃａａｇｃｔｇｃｔｇａｔｇｇａｔｃｃｇａａｇｃｇｇｃａｇａｔｃｔｔｃｔｔｇｇａｃｃａｇａａｔａｔｇｃｔｇｇｃａｇｔｇａｔｃｇａｃｇａｇｃｔｇａｔｇｃａｇｇｃｃｃｔｃａａｃｔｔｃａａｃｔｃｃｇａｇａｃｔｇｔｇｃｃｇｃａａａａｇｔｃｇａｇｃｃｔｇｇａｇｇａａｃｃｇｇａｃｔｔｃｔａｃａａｇａｃｃａａｇａｔｃａａｇｔｔａｔｇｔａｔｔｃｔｃｃｔｇｃａｃｇｃｇｔｔｔａｇｇａｔｔｃｇｃｇｃｃｇｔｇａｃｃａｔｔｇａｔａｇａｇｔｇａｔｇｔｃｃｔａｃｃｔｇａａｃｇｃｃａｇｃｔｇａ（配列番号６）

【0107】

例示的な実施形態では、ｈＩＬ－１２ｐ４０ｐ３５アミノ酸配列は以下を含む：
Ｍ Ｃ Ｈ Ｑ Ｑ Ｌ Ｖ Ｉ Ｓ Ｗ Ｆ Ｓ Ｌ Ｖ Ｆ Ｌ Ａ Ｓ Ｐ Ｌ Ｖ Ａ Ｉ Ｗ Ｅ Ｌ Ｋ Ｋ Ｄ Ｖ Ｙ Ｖ Ｖ Ｅ Ｌ Ｄ Ｗ Ｙ Ｐ Ｄ Ａ Ｐ Ｇ Ｅ Ｍ Ｖ Ｖ Ｌ Ｔ Ｃ Ｄ Ｔ Ｐ Ｅ Ｅ Ｄ Ｇ Ｉ Ｔ Ｗ Ｔ Ｌ Ｄ Ｑ Ｓ Ｓ Ｅ Ｖ Ｌ Ｇ Ｓ Ｇ Ｋ Ｔ Ｌ Ｔ Ｉ Ｑ Ｖ Ｋ Ｅ Ｆ Ｇ Ｄ Ａ Ｇ Ｑ Ｙ Ｔ Ｃ Ｈ Ｋ Ｇ Ｇ Ｅ Ｖ Ｌ Ｓ Ｈ Ｓ Ｌ Ｌ Ｌ Ｌ Ｈ Ｋ Ｋ Ｅ Ｄ Ｇ Ｉ Ｗ Ｓ Ｔ Ｄ Ｉ Ｌ Ｋ Ｄ Ｑ Ｋ Ｅ Ｐ Ｋ Ｎ Ｋ Ｔ Ｆ Ｌ Ｒ Ｃ Ｅ Ａ Ｋ Ｎ Ｙ Ｓ Ｇ Ｒ Ｆ Ｔ Ｃ Ｗ Ｗ Ｌ Ｔ Ｔ Ｉ Ｓ Ｔ Ｄ Ｌ Ｔ Ｆ Ｓ Ｖ Ｋ Ｓ Ｓ Ｒ Ｇ Ｓ Ｓ Ｄ Ｐ Ｑ Ｇ Ｖ Ｔ Ｃ Ｇ Ａ Ａ Ｔ Ｌ Ｓ Ａ Ｅ Ｒ Ｖ Ｒ Ｇ Ｄ Ｎ Ｋ Ｅ Ｙ Ｅ Ｙ Ｓ Ｖ Ｅ Ｃ Ｑ Ｅ Ｄ Ｓ Ａ Ｃ Ｐ Ａ Ａ Ｅ Ｅ Ｓ Ｌ Ｐ Ｉ Ｅ Ｖ Ｍ Ｖ Ｄ Ａ Ｖ Ｈ Ｋ Ｌ Ｋ Ｙ Ｅ Ｎ Ｙ Ｔ Ｓ Ｓ Ｆ Ｆ Ｉ Ｒ Ｄ Ｉ Ｉ Ｋ Ｐ Ｄ Ｐ Ｐ Ｋ Ｎ Ｌ Ｑ Ｌ Ｋ Ｐ Ｌ Ｋ Ｎ Ｓ Ｒ Ｑ Ｖ Ｅ Ｖ Ｓ Ｗ Ｅ Ｙ Ｐ Ｄ Ｔ Ｗ Ｓ Ｔ Ｐ Ｈ Ｓ Ｙ Ｆ Ｓ Ｌ Ｔ Ｆ Ｃ Ｖ Ｑ Ｖ Ｑ Ｇ Ｋ Ｓ Ｋ Ｒ Ｅ Ｋ Ｋ Ｄ Ｒ Ｖ Ｆ Ｔ Ｄ Ｋ Ｔ Ｓ Ａ Ｔ Ｖ Ｉ Ｃ Ｒ Ｋ Ｎ Ａ Ｓ Ｉ Ｓ Ｖ Ｒ Ａ Ｑ Ｄ Ｒ Ｙ Ｙ Ｓ Ｓ Ｓ Ｗ Ｓ Ｅ Ｗ Ａ Ｓ Ｖ Ｐ Ｃ Ｓ Ｖ Ｐ Ｇ Ｖ Ｇ Ｖ Ｐ Ｇ Ｖ Ｇ Ａ Ｒ Ｎ Ｌ Ｐ Ｖ Ａ Ｔ Ｐ Ｄ Ｐ Ｇ Ｍ Ｆ Ｐ Ｃ Ｌ Ｈ Ｈ Ｓ Ｑ Ｎ Ｌ Ｌ Ｒ Ａ Ｖ Ｓ Ｎ Ｍ Ｌ Ｑ Ｋ Ａ Ｒ Ｑ Ｔ Ｌ Ｅ Ｆ Ｙ Ｐ Ｃ Ｔ Ｓ Ｅ Ｅ Ｉ Ｄ Ｈ Ｅ Ｄ Ｉ Ｔ Ｋ Ｄ Ｋ Ｔ Ｓ Ｔ Ｖ Ｅ Ａ Ｃ Ｌ Ｐ Ｌ Ｅ Ｌ Ｔ Ｋ Ｎ Ｅ Ｓ Ｃ Ｌ Ｎ Ｓ Ｒ Ｅ Ｔ Ｓ Ｆ Ｉ Ｔ Ｎ Ｇ Ｓ Ｃ Ｌ Ａ Ｓ Ｒ Ｋ Ｔ Ｓ Ｆ Ｍ Ｍ Ａ Ｌ Ｃ Ｌ Ｓ Ｓ Ｉ Ｙ Ｅ Ｄ Ｌ Ｋ Ｍ Ｙ Ｑ Ｖ Ｅ Ｆ Ｋ Ｔ Ｍ Ｎ Ａ Ｋ Ｌ Ｌ Ｍ Ｄ Ｐ Ｋ Ｒ Ｑ Ｉ Ｆ Ｌ Ｄ Ｑ Ｎ Ｍ Ｌ Ａ Ｖ Ｉ Ｄ Ｅ Ｌ Ｍ Ｑ Ａ Ｌ Ｎ Ｆ Ｎ Ｓ Ｅ Ｔ Ｖ Ｐ Ｑ Ｋ Ｓ Ｓ Ｌ Ｅ Ｅ Ｐ Ｄ Ｆ Ｙ Ｋ Ｔ Ｋ Ｉ Ｋ Ｌ Ｃ Ｉ Ｌ Ｌ Ｈ Ａ Ｆ Ｒ Ｉ Ｒ Ａ Ｖ Ｔ Ｉ Ｄ Ｒ Ｖ Ｍ Ｓ Ｙ Ｌ Ｎ Ａ Ｓ Ｓｔｏｐ（配列番号７）

【0108】

別の例示的な実施形態では、治療用核酸は、配列番号７の配列を有するポリペプチドをコードするｏｐｔ－ｈＩＬ－１２と呼ばれるコドン最適化ヒトインターロイキン－１２遺伝子で構成される４１５６ｂｐのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）（配列番号８）を含み、これは、スクロースに基づく抗生物質不使用選択マーカー（ＲＮＡ－ＯＵＴ）を持つＮＴＣ９３８５Ｒ骨格上の構成的に活性があるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに連結されている。表１に４１５６ｂｐのプラスミド（配列番号８）を示す。

【表1-1】

【表1-2】

【0109】

Ｒ６Ｋの複製起点は、プラスミドの複製をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の株に限定する。ｏｐｔ－ｈＩＬ１２遺伝子はサイトカインタンパク質ＩＬ－１２の２つのサブユニット（ｐ４０及びｐ３５）をコードする。サブユニットの１：１化学量論量を確保するために、ＥＧ－７０プラスミドは、短い反復エラスチンリンカー配列を加えることによってｐ４０～ｐ３５を単量体化するために単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するように設計された。また、プラスミドは、ｅＲＮＡ１１ａ（免疫刺激性二本鎖リボ核酸［ｄｓＲＮＡ］）及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ１の遺伝子で構成される。これらの遺伝子の２つのＲＮＡ産物はＲＩＧ－Ｉ経路を刺激し、それはさらに多くの免疫細胞を局所組織に動員する。さらなる実施形態では、この治療用核酸は、アルギニン及びグルコースで官能化され、且つ取り外し可能なＰＥＧ－ｂ－ＰＬＥ賦形剤でコーティングされる二重誘導体化キトサンポリマーに包装され、医薬組成物ＥＧ－７０が形成される。該組成物を、１ｗ／ｗ％マンニトール溶液におけるナノ粒子水性分散系として製剤化し、濾過して滅菌し、乾燥粉末に凍結乾燥し、４℃で保存する。ナノ粒子分散系の平均粒度は７５～１７５ナノメートルの範囲内にある。

【0110】

治療用核酸には、環状の二本鎖ＤＮＡプラスミド、ミニ環状ＤＮＡ（Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｒｅｐｏｒｔ ６：２３１５， ２０１６）または閉端型直鎖状の二本鎖ＤＮＡの形態での治療用ＤＮＡも含まれる（Ｌｉ ｅｔ ａｌ，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，８（８）：ｅ６９８７９，２０１３）。

【0111】

治療用核酸にはまた、治療用ＲＮＡも含まれ、それは哺乳類細胞にて治療効果を発揮することができるＲＮＡ分子である。治療用ＲＮＡには、メッセンジャーＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び酵素ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。治療用核酸は、三重分子を形成するように意図される核酸、タンパク質結合核酸、リボザイム、デオキシリボザイム、及び小さいヌクレオチド分子を含むが、これらに限定されない。多くの種類の治療用ＲＮＡが当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａ ｎｅｗ ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｃｌａｓｓ ｏｆ ｇｅｎｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ ＲＮＡ－ｂａｓｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．，５，２３８１－２３９２，２０１７；Ｇｒｉｍｍ ｅｔ ａｌ．，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ ｉｓ ｍＲＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｆｉｎａｌｌｙ ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｐｒｉｍｅ ｔｉｍｅ ？ Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１１７：３６３３－３６４１，２００７；Ａａｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡｉ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５９：７５－８６，２００７；Ｄｏｒｓｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，ｓｉＲＮＡｓ：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．，３：３１８－３２９，２００４を参照のこと。これらは二本鎖低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。

【0112】

Ａ．３．発現制御領域
好ましい実施形態では、本開示のポリプレックスは、コード領域に操作可能に連結された発現制御領域を含む治療構築物である治療用核酸を含む。治療構築物は治療用核酸を生成し、これは、それ自体で治療的であってもよく、または治療用タンパク質をコードしてもよい。

【0113】

いくつかの実施形態では、治療構築物の発現制御領域は、構成的活性を有する。多くの好ましい実施形態では、治療構築物の発現制御領域は、構成的活性を有さない。これは、治療用核酸の動的発現を提供する。「動的」発現とは、経時的に変化する発現を意味する。動的発現は、検出可能な発現の期間で隔てられた発現が低いまたは存在しない、いくつかのそのような期間を含んでもよい。多くの好ましい実施形態では、治療用核酸は調節可能なプロモーターに操作可能に連結される。これは、治療用核酸の調節可能な発現を提供する。

【0114】

発現制御領域は、プロモーター及びエンハンサーのような調節ポリヌクレオチド（場合によって、本明細書ではエレメントと呼ばれる）を含み、これらは、操作可能に連結された治療用核酸の発現に影響を及ぼす。

【0115】

本明細書に含まれる発現制御エレメントは、細菌、酵母、植物、または動物（哺乳類もしくは非哺乳類）由来であることができる。発現制御領域は、全長プロモーター配列、例えば、ネイティブプロモーター及びエンハンサーエレメント、ならびに完全なまたは非変異体機能の全部または一部を保持する（例えば、ある程度の栄養調節または細胞／組織特異的発現を保持する）部分配列またはポリヌクレオチド変異体を含む。本明細書で使用されるとき、「機能的」という用語及びその文法的変形は、核酸配列、部分配列、またはフラグメントに関して使用される場合、その配列が、天然の核酸配列の１以上の機能（例えば、非変異体または非修飾配列）を有することを意味する。本明細書で使用されるとき、「変異体」という用語は、配列の置換、欠失、もしくは付加、または他の修飾（例えば、ヌクレアーゼに耐性のある修飾形態のような化学誘導体）を意味する。

【0116】

本明細書で使用されるとき、「作動可能な連結」という用語は、それらが意図された方法で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的並置を指す。核酸と操作可能に連結された発現制御エレメントの例では、関係は、制御エレメントが核酸の発現を調節するようなものである。通常、転写を調節する発現制御領域は、転写された核酸の５’末端付近（すなわち、「上流」）に並置される。発現制御領域は、また、転写された配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（例えば、イントロン内）に位置することができる。発現制御エレメントは、転写された配列から離れた距離に位置することができる（例えば、核酸から１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００以上のヌクレオチド）。発現制御エレメントの具体例は、プロモーターであり、これは、通常、転写された配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例は、転写された配列の５’もしくは３’、または転写された配列内に位置することができるエンハンサーである。

【0117】

いくつかの発現制御領域は、操作可能に連結された治療用核酸に調節可能な発現を付与する。シグナル（場合によって、刺激と呼ばれる）は、そのような発現制御領域に操作可能に連結された治療用核酸の発現を増加または減少させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるそのような発現制御領域は誘導性と呼ばれることが多い。シグナルに応答して発現を減少させるそのような発現制御領域は抑制性と呼ばれることが多い。通常、そのようなエレメントによって与えられる増加または減少の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多い程、発現の増加または減少が大きくなる。

【0118】

多数の調節可能なプロモーターが、当該技術分野で既知である。好ましい誘導性発現制御領域には、小分子化学化合物で刺激される誘導性プロモーターを含むものを含む。一実施形態では、発現制御領域は、経口的に送達可能であるが、通常は、食品には見られない化学物質に応答する。特定の例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号；同第５，９３５，９３４号；同第６，０１５，７０９号；及び同第６，００４，９４１号に見いだすことができる。

【0119】

特に興味深いプロモーター／エンハンサー配列には以下が含まれる：

【表2】

【0120】

本開示のいくつかの実施形態では、治療構築物は、起点、マルチクローニング部位及び選択可能なマーカーを含むプラスミド内に含まれる。いくつかの実施形態では、１０ｋｂ未満のプラスミドが望ましい。いくつかの実施形態では、使用されるプラスミドは、ヒト患者における遺伝子治療に好適であり、及び／または哺乳類の組織における高レベルの一過性遺伝子発現のために操作される。好ましい実施形態では、プラスミドは、Ｎａｎｏｐｌａｓｍｉｄ（商標）（例えば、ＮＴＣ９３８５プラスミド、ＮＴＣ９３８５Ｒ、ＮＴＣ９３８５Ｒ－ＲＩＧ－Ｉ、ＮＴＣ９３８５Ｒ（３ＣｐＧ）、ＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈ－ＣｐＧ、ＮＴＣ８６８５プラスミド（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ｇＷＩＺプラスミド（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、またはｐＶＡＸ１プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）から成る群から選択される。例えば、米国特許第ＵＳ６，０２７，７２２号、同第ＵＳ６，２８７，８６３号、同第ＵＳ６，４１０，２２０号、同第ＵＳ６，５７３，０９１号、同第ＵＳ９，０１２，２２６号、同第ＵＳ９，０１７，９６６号、同第ＵＳ９，０１８，０１２号、同第ＵＳ９，１０９，０１２号、同第ＵＳ９，４８７，７８８号、同第ＵＳ９，４８７，７８９号、同第ＵＳ９，５０６，０８２号、同第ＵＳ９，５５０，９９８号、同第ＵＳ９，７２５，７２５号、同第ＵＳ９，７３７，６２０号、同第ＵＳ９，９５０，０８１号、同第ＵＳ１０，０４７，３６５号、同第ＵＳ１０，１４４，９３５、及び同第ＵＳ１０，１６７，４７８号を参照のこと。いくつかの実施形態では、プラスミドは、抗生物質選択剤を除去するため及び／または発現レベルを高めるために「改造されている」。

【0121】

さらなる教示については、その全体が参照によって本明細書に明示的に組み込まれるＷＯ２００８／０２０３１８を参照のこと。一実施形態では、（例えば、二重）誘導体化キトサン核酸ポリプレックスの核酸は人工核酸である。

【0122】

一実施形態では、ＤＤ－キトサン核酸ポリプレックスの核酸は、治療用核酸である。一実施形態では、治療用核酸は、治療用ＲＮＡである。好ましい治療用ＲＮＡとしては、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、短いヘアピンＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、及び酵素ＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。

【0123】

一実施形態では、治療用核酸はＤＮＡである。

【0124】

一実施形態では、治療用核酸は治療用タンパク質をコードする核酸配列を含む。一実施形態では、治療用タンパク質はＩＬ－１２である。

【0125】

Ｂ．ポリオール
キトサン誘導体ナノ粒子はポリオールで官能化することができる。一般に、本開示で有用なポリオールは通常、親水性である。場合によっては、キトサン誘導体ナノ粒子はアミノ基のようなカチオン構成成分及びポリオールで官能化される。アミノ基のようなカチオン部分及びポリオールで官能化されたそのようなキトサン誘導体ナノ粒子は「二重誘導体化キトサンナノ粒子」と呼ばれる。

【0126】

いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は式ＩＩのポリオールを含み：

【化2】

式中、
Ｒ^２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｒ^３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｘは、１以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキレンから選択される。

【0127】

いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は、式ＩＩのポリオールで官能化され、式中、Ｒ^２はＨ及びヒドロキシルから選択され；Ｒ^３はＨ及びヒドロキシルから選択され；Ｘは１以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキレンから選択される。

【0128】

いくつかの実施形態では、キトサン誘導体ナノ粒子は式ＩＩＩのポリオールを含み：

【化3】

式中、
－－－－－Ｙは、＝Ｏまたは－Ｈ_２であり、
Ｒ^２は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｒ^３は、Ｈ及びヒドロキシルから選択され、
Ｘは、１以上のヒドロキシル置換基で任意に置換されたＣ_２－Ｃ_６アルキレンから選択され、

【0129】

【化4】

は、ポリオールと誘導体化キトサンの間の結合を表す。

【0130】

一実施形態では、３～７の炭素を有する本開示に係るポリオールは１以上の炭素－炭素多重結合を有してもよい。好ましい実施形態では、本開示に係るポリオールはカルボキシル基を含む。さらに好ましい実施形態では、本開示に係るポリオールはアルデヒド基を含む。本開示に係るポリオールがアルデヒド基を含む場合、そのようなポリオールは開鎖構造（アルデヒド）及び環状構造（ヘミアセタール）の双方を包含することを当業者は認識するであろう。

【0131】

ポリオールの非限定例には、グルコン酸、トレオン酸、グルコース、及びトレオースが挙げられる。カルボキシル基及び／またはアルデヒド基を有し得るか、または糖類もしくはその酸形態であることができる他のそのようなポリオールの例は、米国特許第１０，０４６，０６６号でさらに詳細に記載されており、その開示は、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。ポリオールが特定の立体化学に限定されないことを、当業者は認識するであろう。

【0132】

好ましい実施形態では、ポリオールは、２，３－ジヒドロキシルプロパン酸、２，３，４，５，６，７－ヘキサヒドロキシルヘプタナール；２，３，４，５，６－ペンタヒドロキシルヘキサナール；２，３，４，５－テトラヒドロキシルヘキサナール；及び２，３－ジヒドロキシルプロパナールから成る群から選択されてもよい。

【0133】

好ましい実施形態では、ポリオールは、Ｄ－グリセリン酸、Ｌ－グリセリン酸、Ｌ－グリセロ－Ｄ－マンノヘプトース、Ｄ－グリセロ－Ｌ－マンノヘプトース、Ｄ－グルコース、Ｌ－グルコース、Ｄ－フコース、Ｌ－フコース、Ｄ－グリセルアルデヒド、及びＬ－グリセルアルデヒドから成る群から選択され得る。

【0134】

いくつかの実施形態では、ポリオールは式ＩＶまたは式Ｖの化合物であってもよい。

【化5】

【0135】

好ましい実施形態では、ポリオールは、式ＩＶの化合物である。場合によっては、式ＩＶのポリオールは、還元的アミノ化によってキトサンに結合されている。

【0136】

カルボキシル基を有する親水性ポリオールは、キトサンまたはアミン官能化キトサンのようなカチオン官能化キトサン（例えば、Ａｒｇ結合キトサン（Ａｒｇ－キトサン））に結合されてもよい。いくつかの実施形態では、ポリオールは、６．０±０．３の反応ｐＨで結合される。このｐＨでは、求核置換反応メカニズムに従って、親水性ポリオールのカルボン酸基がキトサン骨格上の非結合アミンによって攻撃されてもよい。

【0137】

当業者は、そのような親水性ポリオールをＡｒｇ－キトサンに結合させる場合、求核置換反応は主にキトサン骨格のアミン基で発生する可能性が高いけれども、少量の親水性ポリオールが同じメカニズムを介してＡｒｇのアミン基と共有結合を形成してもよいことも可能であることを認識するであろう。

【0138】

天然糖である親水性ポリオールは、還元的アミノ化とそれに続くＮａＣＢＨ_３またはＮａＢＨによる還元を使用して、キトサン、カチオン官能化キトサン、例えば、アミン官能化キトサン（例えば、Ａｒｇ結合キトサン（Ａｒｇ－キトサン））に結合されてもよい。

【0139】

Ｃ．ポリマー：ポリプレックス組成物
キトサンポリプレックスは、複数のポリマーと混合することができ、該ポリマーは親水性非荷電部分、及び負に荷電した（アニオン）部分を含む。上記のように、キトサンポリプレックスは、アニオン部分含有ポリマーとの複合体化がない、または複合体化前に正電荷を有するように製剤化される。したがって、好適な条件下で、ポリマー構成成分は、キトサン誘導体核酸ポリプレックスと可逆的な電荷：電荷複合体を形成することになる。いくつかの実施形態では、ポリマー構成成分のポリマーは、非分岐状である。いくつかの実施形態では、ポリマーは、分岐状である。場合によっては、ポリマー構成成分は、分岐ポリマー及び非分岐ポリマーの混合物を含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、ポリマー構成成分は、投与後、細胞に入った後、及び／またはエンドサイトーシス後に、キトサンポリプレックスから放出される。理論に拘束されることを望むものではないが、ポリプレックス及びアニオン部分含有ポリマーを複合体化することによって、このように形成されたポリプレックス：ポリマー組成物は、形質移入効率を実質的に妨げることなく、試験管内、溶液中、及び／または生体内の安定性の改善を提供し得ると仮定される。いくつかの実施形態では、このように形成されたポリプレックス：ポリマー組成物は、例えば、別途、ポリマー構成成分のない同一のポリプレックスと比べて、粘膜接着特性の低減を提供し得る。

【0141】

好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、生理学的ｐＨで、低い正味の正の、中性の、または正味の負のゼータ電位を有する（約＋１０ｍＶ～約－２０ｍＶ）。そのような組成物は、生理学的条件での凝集の減少、及び生体内での遍在するアニオン構成成分への非特異的結合の低減を示し得る。該特性は、細胞と接触して核酸の細胞内放出の増強をもたらすように、そのような組成物の移動を増強（例えば、粘液で拡散の増強）させ得る。

【0142】

好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、１０００ｎｍ未満、さらに好ましくは、５００ｎｍ未満、最も好ましくは、２００ｎｍ未満の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、５０ｎｍ～１０００ｎｍ以下、好ましくは、５０ｎｍ～５００ｎｍ以下、最も好ましくは、５０ｎｍ～２００ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、５０ｎｍ～１７５ｎｍ以下、好ましくは、５０ｎｍ～１５０ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、７５ｎｍ～１０００ｎｍ以下、好ましくは、７５ｎｍ～５００ｎｍ以下、最も好ましくは、７５ｎｍ～２００ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、７５ｎｍ～１７５ｎｍ以下、好ましくは、７５ｎｍ～１５０ｎｍ以下の平均流体力学的直径を有する。特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、１００ｎｍ超且つ１７５ｎｍ未満の平均流体力学的直径を有する。

【0143】

一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、８０％、少なくとも８０％、または好ましくは９０％、さらに好ましくは少なくとも９０％の％スーパーコイルＤＮＡ含量を有する。

【0144】

一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物は、生理学的ｐＨで＋１０ｍＶ～－１０ｍＶ、最も好ましくは、生理学的ｐＨで＋５ｍＶ～－５ｍＶの平均ゼータ電位を有する。

【0145】

ポリプレックス：ポリマー組成物は、好ましくは、粒径に関して均質である。したがって、好ましい実施形態では、組成物は、低い平均多分散度指数（「ＰＤＩ」）を有する。特に好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、０．５未満、さらに好ましくは、０．４未満、さらに好ましくは、０．３未満、さらにより好ましくは、０．２５未満、最も好ましくは、０．２未満のＰＤＩを有する。

【0146】

場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１回以上の凍結融解サイクル後に、上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、溶液中４℃で少なくとも４８時間保存した後に、上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、溶液中４℃で少なくとも１または２週間以上保存した後に、上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。

【0147】

場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、凍結乾燥及び再水和の後に上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、噴霧乾燥及び再水和後に上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、少なくとも２５０μｇ／ｍＬの核酸濃度に（例えば、タンジェンシャルフロー濾過のような限外濾過で）濃縮された場合に、上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１２５μｇ／ｍＬ～約１，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１２５μｇ／ｍＬ～約２５，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１２５μｇ／ｍＬ～約２，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１２５μｇ／ｍＬ～約５，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。場合によっては、ポリプレックス：ポリマー組成物の分散系は、１２５μｇ／ｍＬ～約１０，０００μｇ／ｍＬの核酸濃度に濃縮された場合の上述のＰＤＩ、平均ゼータ電位、％スーパーコイルＤＮＡ、または平均粒度（ｎｍ）もしくはサイズ範囲のうちの１以上を示す。

【0148】

一般に、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物は、賦形剤、例えば、凍結保護剤、抗凍結剤、界面活性剤、再水和または湿潤剤などがない状態でも、好ましい溶液挙動（例えば、安定性及び／または非凝集）（ＰＤＩまたは平均粒度で測定）を示す。場合によっては、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物は、生理学的流体または模擬生理学的流体にて、好ましい溶液挙動（例えば、安定性及び／または非凝集）（ＰＤＩまたは平均粒度で測定）を示す。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物は、疑似腸液にて、哺乳類尿にて、及び／または哺乳類膀胱で（例えば、尿と接触して）保存された場合、安定である。

【0149】

上記のように、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物は好ましくは、組成物にて実質的にサイズ安定性である。好ましい実施形態では、本開示の組成物は、６時間、さらに好ましくは１２時間、さらに好ましくは２４時間、最も好ましくは４８時間室温にて、１００％未満、さらに好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満平均直径が増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。特に好ましい実施形態では、本開示の組成物は、少なくとも２４時間または少なくとも４８時間室温で、２５％未満平均直径が増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。

【0150】

主題の組成物のポリプレックス：ポリマー粒子は好ましくは、冷却条件下にて実質的にサイズ安定性である。好ましい実施形態では、本開示の組成物は、６時間、さらに好ましくは１２時間、さらに好ましくは２４時間、最も好ましくは４８時間、２～８℃にて、１００％未満、さらに好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満平均直径が増加するポリプレックス：ポリマー粒子を含む。

【0151】

主題の組成物のポリプレックス：ポリマー粒子は好ましくは、凍結融解条件下で実質的にサイズ安定性である。好ましい実施形態では、本開示の組成物は、－２０～－８０℃での凍結からの解凍後６時間、さらに好ましくは１２時間、さらに好ましくは２４時間、最も好ましくは４８時間室温にて、１００％未満、さらに好ましくは５０％未満、最も好ましくは２５％未満平均直径が増加するポリプレックスを含む。

【0152】

好ましい実施形態では、組成物は０．５ｍｇ／ｍｌを超える核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。さらに好ましくは、組成物は、少なくとも０．６ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも０．７５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも１．０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも１．２ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、少なくとも１．５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。別の好ましい実施形態では、組成物は、２ｍｇ／ｍｌを超える核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。さらに好ましくは、組成物は、少なくとも２．５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも５ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも１０ｍｇ／ｍｌ、さらに好ましくは、少なくとも１５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは、約２５ｍｇ／ｍｌの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、０．５ｍｇ／ｍＬ～約２５ｍｇ／ｍＬの核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。いくつかの実施形態では、組成物は、約２５ｍｇ／ｍＬ以下の核酸濃度を有し、沈殿ポリプレックスを実質的に含まない。組成物を水和させることができる。好ましい実施形態では、組成物は、複合体を形成していない核酸を実質的に含まない。

【0153】

好ましい実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子の組成物は、等張である。ポリプレックスの安定性を維持しながら等張性を達成することは、医薬組成物を製剤化するのに非常に望ましく、これらの好ましい組成物は、医薬製剤及び治療用途に十分に適する。

【0154】

特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物はｐＨを下げることによってコーティングされずに、例えば、ＰＥＧのようなポリマーコートの全部または一部を放出することができる。特定の実施形態では、ポリマーのポリアニオン性アンカー領域のｐＫａを下回るｐＨ条件下で粒子をインキュベートすることによってポリマーコートが放出される。例えば、ポリマーコートがポリグルタマートである場合、ポリマーコートは、粒子をポリグルタマートのｐＫａより低いｐＨ、例えば、約４．２５未満のｐＨでインキュベートすることによって放出することができる。特定の実施形態では、ポリマーコートは、ポリマーコートのポリアニオン性アンカー領域のｐＫａより低い、少なくとも０．２５ｐＨ単位または少なくとも０．５ｐＨ単位下であるｐＨ条件下で粒子をインキュベートすることによって放出することができる。

【0155】

特定の実施形態では、ポリプレックス：ポリマー粒子組成物は、粒子を高いイオン強度にさらすことによってコーティングされずに、例えば、ＰＥＧのようなポリマーコートの全部または一部を放出することができる。

【0156】

理論に束縛されることを望むものでないが、特定の生理学的条件が、本明細書に記載されている可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（例えば、９０％超）、または完全な（１００％）脱コーティングを促進することができると仮定される。例えば、特定の細胞内区画（例えば、エンドソーム、初期エンドソーム、後期エンドソーム、またはリソソーム）における低ｐＨ条件は、ポリマーコートの放出を促進することができる。別の例として、特定の細胞外条件は、本明細書に記載されている可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（９０％超）、または完全な（１００％）脱コーティングを促進することができる。場合によっては、消化管の特定の位置で通常生じる高いイオン強度及び／または酸性ｐＨ条件は、本明細書に記載されている可逆的にＰＥＧ化されているキトサンＤＮＡポリプレックスの部分的な（例えば、５％超）、実質的な（５０％超）、広範囲の（９０％超）、または完全な（１００％）脱コーティングを促進することができる。

【0157】

特定の実施形態では、本明細書に記載されているＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達のために製剤化されるので、ポリプレックスがＰＥＧ化されているままであり、それによって、標的細胞の形質移入を容易にする。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されているＰＥＧ化ポリプレックスは、細胞内環境への侵入後または侵入中に、部分的に（例えば、５％超）、実質的に（５０％超）、広範囲に（例えば、９０％超）、または完全に（１００％）ポリマーコートを放出する。特定の実施形態では、本明細書に記載されているＰＥＧ化ポリプレックスが、細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達時にポリマーコートを部分的に（例えば、５％超）、実質的に（５０％超）、広範囲に（例えば、９０％超）、または完全に（１００％）放出するように、本明細書に記載されているＰＥＧ化ポリプレックスは細胞、組織、または身体区画（例えば、腸、小腸、大腸、結腸、肺、または膀胱）への送達のために製剤化される。

【0158】

ポリマーのアニオン性アンカー領域のアニオン電荷密度及び／またはｐＫａは、意図された条件下で放出を促進する、または阻害するように調整できることが理解されるであろう。同様に、ｐＨ、体積、及びイオン強度、ならびに製剤の他の条件を調整して、意図された条件下での放出を促進するまたは抑制することができることが理解されるであろう。例えば、低ｐＨの胃環境を介して腸に送達することについては、胃環境のｐＨを高めるために、ＰＥＧ化ポリプレックス製剤を緩衝剤中で腸溶コーティング及び／または送達することができる。最適化された可逆的にＰＥＧ化されている粒子組成物は、本明細書に記載されているアッセイを使用して安定性及び形質移入効率をアッセイすることによって特定することができる。

【0159】

アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、「（＋）：（－）モル比」と呼ばれる、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのカチオン官能基（＋）のポリマーのアニオン部分（－）に対する比を特徴とすることができる。この（＋）：（－）モル比は約１：１００を超えて約１０：１未満まで変化することができる。

【0160】

特定の実施形態では、（＋）：（－）モル比は約１：７５を超えて約８：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は１：１０を超えて１０：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は、１：１０または約１：１０から１：１０または約１：１０までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は、１：８または約１：８から８：１または約８：１までであることができる。特定の実施形態では、（＋）：（－）モル比は、１：５０を超えて約１０：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は、１：２５を超えて約１０：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は１：１０を超えて約７：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は、１：８を超えて約７：１未満までであることができる。場合によっては、（＋）：（－）モル比は１：８を超えて約６：１未満までであることができる。

【0161】

特定の実施形態では、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのカチオン官能基がアミノ部分である場合、アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのアミノ基（Ｎ）のポリマーのアニオン（Ａ）部分に対する比（「Ｎ：Ａモル比」と呼ばれる）を特徴とすることができる。このＮ：Ａモル比は約１：１００を超えて約１０：１未満まで変化することができる。

【0162】

特定の実施形態では、Ｎ：Ａモル比は約１：７５を超えて約８：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は、１：１０を超えて１０：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は、１：１０または約１：１０から１０：１または約１０：１までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は１：８または約１：８から８：１または約８：１までであることができる。特定の実施形態では、Ｎ：Ａモル比は１：５０を超えて約１０：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は１：２５を超えて約１０：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は１：１０を超えて約７：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は１：８を超えて約７：１未満までであることができる。場合によっては、Ｎ：Ａモル比は１：８を超えて約６：１未満までであることができる。

【0163】

さらに、または代わりに、アニオン部分含有ポリマーと複合体化されたキトサンポリプレックスを含む組成物は、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのカチオン官能基（＋）の核酸のリン原子（Ｐ）とポリマーのアニオン部分（－）とに対する３構成成分比（「（＋）：Ｐ：（－）モル比」と呼ばれる）を特徴とすることができる。

【0164】

特定の実施形態では、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：４０～約４０：１で変化することができる。特定の実施形態では、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は少なくとも１：４０～約１：１０で変化することができる。いくつかの実施形態では、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約２５：１で変化することができる。いくつかの実施形態では、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約１：１０で変化することができる。場合によっては、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約２０：１で変化することができる。場合によっては、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約１：１０で変化することができる。場合によっては、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：１０～約１０：１で変化することができる。場合によっては、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２５～約２：１で変化することができる。場合によっては、（＋）：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、（＋）：（－）のモル比は、少なくとも１：２０～約１：１で変化することができる。

【0165】

特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、３：１：３．５～３：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、５：１：３．５～５：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、７：１：３．５～７：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約３：１：３．５、３：１：７、３：１：１０、３：１：１５、３：１：１７．５、または３：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約５：１：３．５、５：１：７、５：１：１０、５：１：１５、５：１：１７．５、または５：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約７：１：３．５、７：１：７、７：１：１０、７：１：１５、７：１：１７．５、または７：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、（＋）：Ｐ：（－）は、約１０：１：１０、１０：１：１５、１０：１：２０、１０：１：２５、１０：１：３０、または１０：１：４０である。

【0166】

アニオン部分含有ポリマーと複合体化したアミノ官能化キトサンポリプレックス粒子は、（例えば、二重）誘導体化キトサンポリプレックスのアミノ官能基（Ｎ）の核酸のリン原子（Ｐ）とポリマーのアニオン部分（Ａ）に対する３構成成分比（「Ｎ：Ｐ：Ａモル比」と呼ばれる）を特徴とすることができることを、当業者は理解するであろう。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は少なくとも１：４０～約４０：１で変化することができる。

【0167】

特定の実施形態では、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：４０～約１：１０で変化することができる。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約２５：１で変化することができる。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約１：１０で変化することができる。場合によっては、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約２０：１で変化することができる。場合によっては、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約１：１０で変化することができる。場合によっては、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：１０～約１０：１で変化することができる。場合によっては、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２５～約２：１で変化することができる。場合によっては、Ｎ：Ｐが少なくとも２：１～２０：１以下である場合、Ｐ：Ａのモル比は、少なくとも１：２０～約１：１で変化することができる。

【0168】

特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、３：１：３．５～３：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、５：１：３．５～５：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、７：１：３．５～７：１：１７．５である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、１０：１：１０～１０：１：４０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約３：１：３．５、３：１：７、３：１：１０、３：１：１５、３：１：１７．５、または３：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約５：１：３．５、５：１：７、５：１：１０、５：１：１５、５：１：１７．５、または５：１：２０である。特定の好ましい実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約７：１：３．５、７：１：７、７：１：１０、７：１：１５、７：１：１７．５、または７：１：２０である。特定の実施形態では、Ｎ：Ｐ：Ａは、約１０：１：１０、１０：１：１５、１０：１：２０、１０：１：２５、１０：１：３０、または１０：１：４０である。

【0169】

Ｃ．１．親水性非荷電部分
ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリアルキレンポリオールまたはポリアルキレンオキシポリオール部分、またはそれらの組み合わせであることができる、またはそれらを含むことができる。ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリアルキレングリコールまたはポリアルキレンオキシグリコール部分であることができるか、またはそれらを含み得る。特定の実施形態では、ポリアルキレングリコール部分は、ポリエチレングリコール部分及び／またはモノメトキシポリエチレングリコール部分である、またはそれらを含む。特定の好ましい実施形態では、ポリマーの非荷電部分は、ポリエチレングリコールである、またはそれを含む。ポリマーの親水性非荷電部分は、ポリ乳酸のような他の生物学的に適合性のあるポリマー（複数可）であることができるか、またはそれを含み得る。

【0170】

ＰＥＧに加えて、いくつかの親水性の非荷電実体が当該技術分野で既知である。例えば、Ｌｏｗｅ ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｂｉｏｆｏｕｌｉｎｇ ｐｏｌｙｍｅｒ ｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ：ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ，Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，６，１９８－２１２，２０１５、及びＫｎｏｐ ｅｔ．ａｌ．，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）ｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｒｏｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓ ａｓ Ｗｅｌｌ ａｓ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｓ．Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｄｉｔｉｏｎ，４９（３６），６２８８－６３０８，２０１０を参照のこと。ポリマーの親水性非荷電部分の例は、ポリ（グリセロール）、ポリ（２－メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン）、ポリ（スルホベタインメタクリラート）、及びポリ（カルボキシベタインメタクリラート）、ポリ（２－メチル－２－オキサゾリン）、ポリ（２－エチル－２－オキサゾリン）、及びポリ（ビニルピロリドン）であるが、これらに限定されない。

【0171】

親水性部分は約５００Ｄａ～約５０，０００Ｄａの重量平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態では、親水性部分は、約１，０００Ｄａ～約１０，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、親水性部分は、約１，５００Ｄａ～約７，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、親水性部分は、約３，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。場合によっては、親水性部分は５，０００Ｄａまたは約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。

【0172】

Ｃ．２．アニオン性ポリマー部分
ポリマーのアニオン性ポリマー部分は、生理学的ｐＨで負に電荷している複数の官能基を含むことができる。多種多様なアニオン性ポリマーは、本明細書に記載されている方法及び組成物での使用に好適であるが、但し、そのようなアニオン性ポリマーは、親水性非荷電ポリマー部分を有するポリマーの構成成分として提供することができ、正に荷電する（例えば、二重）誘導体化キトサン－核酸ナノ粒子との（例えば、可逆的な）電荷：電荷複合体を形成することができるという条件がある。

【0173】

例示的なアニオン性ポリマーとしては、生理学的ｐＨで正味の負電荷を有するポリペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。場合によっては、ポリペプチドまたはその一部は、生理学的ｐＨで負荷電側鎖を有するアミノ酸から成る。例えば、ポリマーのアニオン性ポリマー部分は、ポリグルタマートポリペプチド、ポリアスパルテートポリペプチド、またはそれらの混合物であることができる。追加のアミノ酸またはその模倣体は、ポリアニオンポリペプチドに組み込むことができる。例えば、グリシン及び／またはセリンアミノ酸は、柔軟性を増加させるか、または２次構造を低減させるために組み込むことができる。

【0174】

場合によっては、アニオン性ポリマーは、アニオン炭水化物ポリマーである、またはそれを含み得る。例示的なアニオン炭水化物ポリマーとしては、生理学的ｐＨで負電荷を有するグリコサミノグリカンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なアニオングリコサミノグリカンとしては、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ヒアルロン酸、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、ポリマーのアニオン性ポリマー部分は、ヒアルロン酸である、またはそれを含む。

【0175】

追加または代替のアニオン炭水化物ポリマーは、デキストラン硫酸を含むポリマーを含み得る。

【0176】

場合によっては、ポリアニオン部分は、ポリメタクリル酸及びその塩、ポリアクリル酸及びその塩、メタクリル酸とその塩のコポリマー、ならびにアクリル酸及び／またはメタクリル酸及びその塩のコポリマー、例えば、ポリアルキレンオキシド、ポリアクリル酸コポリマーから成る群から選択されるポリアニオンである、またはそれを含む。

【0177】

場合によっては、ポリアニオン部分は、アルギネート、カラギーナン、ファーセレラン、ペクチン、キサンタン、ヒアルロン酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、セルロース、酸化セルロース、カルボキシメチルセルロース、クロスカルメロース、ペンダントカルボキシル基、リン酸基または硫酸基を含有する合成ポリマー及びコポリマー、主に負電荷のポリアミノ酸、ならびに生体適合性ポリフェノール材料から成る群から選択されるポリアニオンである、またはそれらを含む。

【0178】

ポリマーのアニオン部分は約５００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有することができる。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約３，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約２，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約２，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約５００Ｄａ～約１，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約５，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。いくつかの実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約３，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は、約１，０００Ｄａ～約２，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。特定の実施形態では、アニオン部分は約１，０００Ｄａ～約２，０００Ｄａの重量平均分子量を有する。場合によっては、アニオン部分は１，５００Ｄａまたは約１，５００Ｄａの重量平均分子量を有する。

【0179】

本明細書で使用されるとき、「ブロックコポリマー（ｂｌｏｃｋ ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）」、「ブロックコポリマー（ｂｌｏｃｋ ｃｏ－ｐｏｌｙｍｅｒ）」などは別個のホモポリマー領域を含有するコポリマーを指す。二元ブロックコポリマーは２つの異なるホモポリマー領域を含有する。三元ブロックコポリマーは３つの異なるホモポリマー領域を含有する。３つの異なる領域が、それぞれ異なることができ（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＣＣＣＣ）、または２つの領域が、同じ（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＡＡＡＡ）、類似（例えば、ＡＡＡＡ－ＢＢＢＢ－ＡＡＡ）であることができ、この場合、「Ａ」、「Ｂ」、及び「Ｃ」はコポリマーを形成する異なるモノマーサブユニットが含まれることを表す。例えば、「Ａ」は、ポリエチレングリコールのホモポリマーのエチレングリコールモノマーサブユニットを表し、Ｂは、ポリグルタミン酸ホモポリマーのグルタミン酸サブユニットを表すことができる。ブロックコポリマーは、線状（例えば、二元または三元）ブロックコポリマーであることができる。本開示で使用される線状二元ブロック及び三元ブロックコポリマーの例示的な実施形態には、以下の包括的ではないリストに列挙されているものが挙げられる：

【表3-1】

【表3-2】

【0180】

一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ポリグルタミン酸ポリマーである、またはそれを含む：

【化6】

【0181】

一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ポリアスパラギン酸ポリマーである、またはそれを含む：

【化7】

【0182】

一実施形態では、ブロックコポリマーは、以下の構造を有するＰＥＧ－ヒアルロン酸ポリマーである、またはそれを含む：

【化8】

【0183】

Ｄ．代替的なカチオン性ポリマー及び脂質
本開示の核酸ポリプレックスは、酵素分解からヌクレオチドを濃縮する及び保護するように機能する。キトサン及びその誘導体に加えて、この目的のために有利に使用することもできる代わりの材料には、他の正に電荷する（すなわち、カチオン性の）ポリマー及び／または脂質が挙げられる。

【0184】

本開示の治療用核酸構築物とポリプレックスを形成するのに使用できるカチオン性ポリマーの例には、ポリアミン；ポリ有機アミン（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレンイミンセルロース及びその誘導体）；ポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ及びその誘導体）；ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン（ＰＬＬ）、ポリアルギニン及びその誘導体）；多糖類（例えば、セルロース、デキストラン、ＤＥＡＥデキストラン、デンプン）；スペルミン、スペルミジン、ポリ（ビニルベンジルトリアルキルアンモニウム）、ポリ（４（－ビニル－Ｎ－アルキル－ピリジウミウム）、ポリ（アクリロイル－トリアルキルアンモニウム）、及びＴａｔタンパク質が挙げられる。例えば、Ｓａｍａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｔｉｏｎｉｃ ｐｏｌｙｍｅｒｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｒｅｖ．４１：７１４７－９４（２０１２）を参照のこと。

【0185】

正に帯電した脂質の例には、ホスファチジン酸のアミノアルコールとのエステル、例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸またはジステアロイルホスファチジン酸のヒドロキシエチレンジアミンとのエステルが挙げられる。正に電荷した脂質のさらに具体的な例には、３β－［Ｎ－－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノエチル）カルバモイル）コレステロール（ＤＣ－ｃｈｏｌ）；臭化Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ジオクタシルアンモニウム（ＤＤＡＢ）；塩化Ｎ，Ｎ’－ジメチル－Ｎ，Ｎ’－ジオクタシルアンモニウム（ＤＤＡＣ）；塩化１，２－ジオレオイルオキシプロピル－３－ジメチルヒドロキシエチルアンモニウム（ＤＯＲＩ）；１，２－ジオレオイルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］プロパン（ＤＯＴＡＰ）；塩化Ｎ－（１－（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）；ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）；１，２－ジオクタデシルオキシ－３－［トリメチルアンモニオ］－プロパン（ＤＳＴＡＰ）；及び例えば、Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｅｓｉｇｎ，２００５，１１，３７５－３９４に記載されているカチオン性脂質が挙げられる。

【0186】

任意の濃度及び任意の比率での脂質とポリマーとのブレンドを使用することもできる。様々な等級を使用して異なるポリマー種を異なる比率で混合することは、寄与するポリマーのそれぞれから取り入れる特性をもたらすことができる。種々の末端基化学も採用することができる。

【0187】

ＩＩＩ．作成方法
上記のように、当業者は、本開示のポリプレックス：ポリマー粒子が種々の方法で生成されてもよいことを理解するであろう。例えば、ポリプレックス粒子を生成し、その後、ポリマーと接触させることができる。例示的な非限定的な実施形態では、ポリプレックス粒子は、官能化キトサン及びヌクレオチド原料を提供及び組み合わせることによって調製される。原料濃度は、様々なアミノ対リン酸塩（Ｎ／Ｐ）比、混合比、及び標的ヌクレオチド濃度に適応するように調整されてもよい。いくつかの実施形態、特に小さなバッチ、例えば、２ｍＬ未満のバッチでは、官能化キトサン、及びヌクレオチド原料は、容器をボルテックスしながら、官能化キトサン原料にヌクレオチド原料を徐々に滴下することによって混合されてもよい。他の実施形態では、官能化キトサン及びヌクレオチド原料は、２つの流体流をインライン混合することによって混合されてもよい。他の実施形態では、得られるポリプレックス分散系は、限外濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））または溶媒蒸発（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）のような当該技術分野で既知の手段によって濃縮されてもよい。ポリプレックス形成のための好ましい方法は、ＷＯ２００９／０３９６５７に開示されており、その全体が参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。

【0188】

同様に、ポリプレックス粒子原料（例えば、ポリプレックス組成物を含む水溶液）を提供し（例えば、上記の反応混合物から単離し）、ポリマー原料（例えば、ポリマーを含む水溶液）と組み合わせることができる。原料濃度を調節して、種々のアミノ－対－アニオンの比（Ｎ／Ａ）、アミノ－対－リン（Ｎ：Ｐ）の比、Ｎ：Ｐ：Ａの比、混合比、及び標的ヌクレオチド濃度を調整してもよい。いくつかの実施形態、特に小さなバッチ、例えば、２ｍＬ未満のバッチでは、原料は、容器をボルテックスしながら、第１の原料（例えば、ポリプレックス）を第２の原料（例えば、ポリマー）にゆっくりと滴下することによって、混合されてもよい。他の実施形態では、原料は２つの流体流をインライン混合することによって混合されてもよい。他の実施形態では、得られるポリプレックス：ポリマー複合体分散系は、限外濾過（例えば、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ））または溶媒蒸発（例えば、凍結乾燥または噴霧乾燥）のような当該技術分野で既知の手段によって濃縮されてもよい。

【0189】

１．粉末製剤
本開示のポリプレックス：ポリマー組成物は粉末を含む。好ましい実施形態では、本開示は乾燥粉末のポリプレックス：ポリマー組成物を提供する。好ましい実施形態では、乾燥粉末のポリプレックス：ポリマー組成物は本開示のキトサン－核酸ポリプレックス分散系の脱水（例えば、噴霧乾燥または凍結乾燥）を介して生成される。

【0190】

２．医薬製剤
本開示はまた、本開示のポリプレックス：ポリマー組成物を含む「薬学的に許容される」または「生理学的に許容される」製剤も提供する。そのような製剤は、開示されている治療方法を実施するために対象に生体内で投与することができる。

【0191】

本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」及び「生理学的に許容される」という用語は、好ましくは、過度の有害な副作用（例えば、悪心、腹痛、頭痛など）を生じさせることなく、対象に投与することができる担体、希釈剤、賦形剤などを指す。投与のためのそのような調製物は、滅菌水溶液または非水溶液、懸濁液、及びエマルションを含む。液体製剤は、懸濁剤、溶剤、シロップ剤、及びエリキシル剤を含む。液体製剤は、固体の再構成によって調製されてもよい。

【0192】

医薬製剤は、対象への投与と適合性のある担体、希釈剤、賦形剤、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤などから作製することができる。そのような製剤は、錠剤（コーティングされたまたはコーティングされていない）、カプセル剤（ハードまたはソフト）、マイクロビーズ、エマルション剤、散剤、顆粒剤、結晶剤、懸濁剤、シロップ剤、またはエリキシル剤に含有することができる。他の添加剤のうち、補助的な活性化合物及び防腐剤、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスなどもまた存在し得る。

【0193】

賦形剤には、塩、等張剤、血清タンパク質、緩衝剤もしくは他のｐＨ調整剤、酸化防止剤、増粘剤、非荷電ポリマー、防腐剤、または抗凍結剤を挙げることができる。本開示の組成物に使用される賦形剤はさらに、等張剤及び緩衝液または他のｐＨ調整剤を含んでもよい。これらの賦形剤は、好ましい範囲のｐＨ（約６．０～８．０）及び浸透圧（約５０～４００ｍｍｏｌ／Ｌ）を得るために添加されてもよい。好適な緩衝液の例は、酢酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、リン酸塩、及びスルホン化有機分子緩衝液である。そのような緩衝液は、０．０１～１．０％（ｗ／ｖ）の濃度で組成物中に存在し得る。等張剤は、当該技術分野で既知のもの、例えば、マンニトール、デキストロース、グルコース、及び塩化ナトリウム、または他の電解質のいずれかから選択されてもよい。好ましくは、等張剤は、グルコースまたは塩化ナトリウムである。等張剤は、それが導入される生物学的環境の浸透圧と同一のまたは同様の浸透圧を組成物に与える量で使用されてもよい。組成物における等張剤の濃度は、使用される特定の等張剤の性質に依存し、約０．１～１０％の範囲であってもよい。グルコースが使用される場合、それは好ましくは、１～５％ｗ／ｖ、さらに具体的には、５％ｗ／ｖの濃度で使用される。等張剤が塩化ナトリウムである場合、それは好ましくは、最大１％ｗ／ｖ、特に０．９％ｗ／ｖの量で用いられる。本開示の組成物はさらに、防腐剤を含有してもよい。防腐剤の例は、ポリヘキサメチレン－ビグアニジン、塩化ベンザルコニウム、安定したオキシクロロ錯体（Ｐｕｒｉｔｅ（登録商標）として知られているもの）、酢酸フェニル水銀、クロロブタノール、ソルビン酸、クロルヘキシジン、ベンジルアルコール、パラベン、及びチメロサールである。通常、そのような防腐剤は約０．００１～１．０％の濃度で存在する。さらに、本開示の組成物は凍結保存剤も含有してもよい。好ましい凍結保存剤は、グルコース、スクロース、マンニトール、ラクトース、トレハロース、ソルビトール、コロイド状二酸化ケイ素、１００，０００ｇ／モル未満の好ましい分子量のデキストラン、グリセロール、及び１００，０００ｇ／モル未満の分子量のポリエチレングリコール、またはそれらの混合物である。最も好ましいのは、グルコース、トレハロース、及びポリエチレングリコールである。通常は、そのような凍結保存剤は、約０．０１～１０％の濃度で存在する。

【0194】

医薬製剤は、意図された投与経路と適合性があるように製剤化することができる。例えば、経口投与のために、組成物は賦形剤と共に組み込まれ、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、例えば、ゼラチンカプセル剤、またはコーティング、例えば、腸溶性コーティング（Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）またはＳｕｒｅｔｅｒｉｃ（登録商標））の形態で使用され得る。薬学的に適合性である結合剤、及び／または補助物質は経口製剤に含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分のいずれか、もしくは同様の性質の化合物を含有し得る：結合剤、例えば、微結晶性セルロース、トラガカントガム、もしくはゼラチン；賦形剤、例えば、デンプンもしくはラクトース；崩壊剤、例えば、アルギン酸、プリモゲル、もしくはコーンスターチ；潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウムもしくは他のステアリン酸塩；滑剤、例えば、コロイド状二酸化ケイ素；甘味料、例えば、スクロースもしくはサッカリン；または、着香剤、例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、もしくは香味料。

【0195】

製剤は、インプラント及びマイクロカプセル化送達システムを含む制御放出製剤など、身体からの急速な分解または排除から組成物を保護するための担体も含み得る。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を単独で、またはワックスと組み合わせて用いられてもよい。

【0196】

坐剤及び他の直腸投与可能な製剤（例えば、浣腸によって投与可能なもの）もまた企図される。さらに、直腸送達に関して、例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｍｕｃｏｓａｌ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ：ｍｅｍｂｒａｎｅｓ，ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ，ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，２１：１９５－２５６，２００４；Ｗｅａｒｌｅｙ，Ｒｅｃｅｎｔ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ａｎｄ ｐｅｐｔｉｄｅ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｂｙ ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ ｒｏｕｔｅｓ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．，８：３３１－３９４，１９９１を参照のこと。

【0197】

投与のための適切な追加の医薬製剤は当該技術分野で既知であり、本開示の方法及び組成物に適用可能である（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）１８ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．；Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｉｎｄｅｘ（１９９６）１２ｔｈ ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ，Ｎ．Ｊ．；及びＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｓｏｌｉｄ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｎｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，Ｐａ．，（１９９３）を参照のこと）。

【0198】

ＩＶ．投与
一実施形態では、ポリプレックス：ポリマー組成物の使用は生理学的ｐＨでのポリプレックスの長期安定性を提供する。これは、有効な投与を提供する。

【0199】

細胞または組織に接触させる多数の投与経路のうちのいずれかが可能であり、特定の経路の選択は部分的には、標的の細胞または組織に依存するであろう。注射器、内視鏡、カニューレ、挿管チューブ、カテーテル、ネブライザー、吸入具及び他の物品が投与に使用されてもよい。

【0200】

いくつかの実施形態では、がんは膀胱癌である。化学療法剤の膀胱内投与は一部の膀胱癌に対する標準的な治療である。簡潔には、膀胱内療法は、尿道カテーテルの挿入によって治療剤を膀胱に直接注入することを含む。いくつかの実施形態では、主題の組成物は尿中での増強された安定性を提供し、それによって限局性発現が改善される。

【0201】

障害もしくは状態、または症状の進行もしくは悪化を防止することまたは抑制することは良好な転帰であるけれども、対象を治療するための用量または「有効量」は好ましくは、測定可能または検出可能な程度に状態の症状のうちの１つ、いくつか、またはすべてを改善するのに十分である。したがって、標的組織にて治療用核酸を発現させることによって治療可能な状態または障害の場合、本開示の方法によって治療可能な状態を改善するために製造される治療用ＲＮＡまたは治療用タンパク質の量は状態及び所望の結果に依存し、当業者が容易に確認することができる。適切量は、治療される状態、所望の治療効果、及び個々の対象（例えば、対象内の生物学的利用能、性別、齢など）に依存することになる。有効量は関連する生理学的効果を測定することによって確認することができる。

【0202】

獣医の応用もまた、本開示によって企図される。したがって、一実施形態では、本開示は、治療を必要とする非ヒト哺乳類に本開示のポリプレックス：ポリマー組成物を投与することを含む、非ヒト哺乳類を治療する方法を提供する。本開示の組成物はまた、粘膜に投与されてもよい。例えば、組成物は、小腸及び／または大腸及びの粘膜細胞または粘膜組織を含むが、これらに限定されない消化管の粘膜細胞または粘膜組織に投与することができる。他の標的の粘膜細胞または粘膜組織には、眼、気道上皮、肺、膣、及び膀胱の細胞または組織が挙げられるが、これらに限定されない。他の標的の細胞または組織には、乳房、結腸、前立腺、膵臓、皮膚、肺、卵巣、腎臓、脳、膀胱、膣、子宮頸部、胃、消化管、腎臓、肝臓、甲状腺、食道、鼻腔癌、喉頭、口腔癌、咽頭癌、網膜芽細胞腫、子宮内膜、及び精巣などの細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

【0203】

この目的のための典型的な製剤には、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、溶剤、クリーム剤、泡状剤、フィルム剤、インプラント、スポンジ、繊維剤、散剤、及びマイクロエマルション剤が挙げられる。

【0204】

本開示の化合物は、通常、ドライパウダー吸入器から乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、もしくは混合構成成分粒子として）、または好適な噴射剤の使用の有無にかかわらず、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾル噴霧として鼻腔内にまたは吸入によって粘膜に投与することができる。

【0205】

吸入器または吸入具で使用されるカプセル剤、ブリスター及びカートリッジは、本開示の化合物、ラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤、及びＩ－ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムのような性能調整剤の粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。

【0206】

吸入／鼻腔内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。

【0207】

本開示の化合物は、例えば、坐剤、ペッサリー、または浣腸の形態で、直腸または膣に投与されてもよい。ココアバターは、従来の坐薬基剤であるが、種々の代替品が必要に応じて使用されてもよい。

【0208】

直腸／膣内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。

【0209】

本開示の化合物はまた、通常、液滴の形態で眼または耳に直接投与されてもよい。眼投与及び耳投与に好適な他の製剤には、軟膏剤、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）及び非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウエハー、レンズ、及び粒子系が挙げられる。製剤は、また、イオントフォレーシスで送達されてもよい。

【0210】

眼／耳投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、またはプログラム放出を含む。

【0211】

１．粘膜投与
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は粘膜に投与される。例えば、組成物は膀胱の粘膜細胞または粘膜組織、ならびに小腸及び／または大腸及び／または結腸の粘膜細胞または粘膜組織を含むが、これらに限定されない消化管の粘膜細胞または粘膜組織に投与することができる。他の標的の粘膜細胞または粘膜組織には、眼、気道上皮、肺、膣、及び膀胱の細胞または組織が挙げられるが、これらに限定されない。

【0212】

この目的のための典型的な製剤には、液剤、ゲル剤、ヒドロゲル剤、溶剤、クリーム剤、泡状剤、フィルム剤、インプラント、スポンジ、繊維剤、散剤、及びマイクロエマルション剤が挙げられる。

【0213】

膀胱粘膜に関する例示的な実施形態では、本明細書に記載されている化合物は膀胱内療法を使用して投与することができる。膀胱内療法は、尿道カテーテルの挿入によって治療剤を膀胱に直接注入することを含む。薬剤は０．５時間～６時間の間、膀胱に置かれる。それは膀胱がん化学療法の標準投与経路である。それは、膀胱における疾患部位に直接薬剤を送達するために利用可能な外部の解剖学的アクセスを利用し、それによって、体内の他の場所にて健康な組織に、注入された薬剤が不必要に曝露されるのを回避する。

【0214】

膀胱投与のための製剤は、即時放出及び／または調節放出されるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、またはプログラム放出を含む。

【0215】

本開示の化合物は、鼻腔内にまたは吸入によって、通常、ドライパウダー吸入器から乾燥粉末の形態で（単独で、混合物として、例えば、ラクトースとの乾燥ブレンドで、もしくは混合構成成分粒子として）、または好適な噴射剤の使用の有無にかかわらず、加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾル噴霧として、粘膜に投与することもできる。

【0216】

吸入器または吸入具で使用されるカプセル剤、ブリスター及びカートリッジは、本開示の化合物、ラクトースまたはデンプンのような好適な粉末基剤、及びＩ－ロイシン、マンニトール、またはステアリン酸マグネシウムのような性能調整剤の粉末混合物を含有するように製剤化されてもよい。

【0217】

吸入／鼻腔内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。

【0218】

本開示の化合物は、例えば、坐剤、ペッサリー、または浣腸の形態で、直腸または膣に投与されてもよい。ココアバターは、従来の坐薬基剤であるが、種々の代替品が必要に応じて使用されてもよい。

【0219】

直腸／膣内投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、及びプログラム放出を含む。

【0220】

本開示の化合物はまた、通常、液滴の形態で眼または耳に直接投与されてもよい。眼投与及び耳投与に好適な他の製剤には、軟膏剤、生分解性（例えば、吸収性ゲルスポンジ、コラーゲン）及び非生分解性（例えば、シリコーン）インプラント、ウエハー、レンズ、及び粒子系が挙げられる。製剤は、また、イオントフォレーシスで送達されてもよい。

【0221】

眼／耳投与用の製剤は、即時放出及び／または調節放出になるように製剤化されてもよい。調節放出製剤は、遅延放出、徐放性放出、パルス放出、制御放出、標的放出、またはプログラム放出を含む。

【0222】

２．腫瘍内投与
いくつかの実施形態では、本開示の組成物は腫瘍（がん）に直接投与される。例えば、カチオン性ポリマー及び／または脂質を含む核酸ポリプレックスと、インターロイキン－１２（ＩＬ－１２）をコードする治療用核酸構築物と、少なくとも１つのＲＩＧ－Ｉアゴニストをコードする核酸を含む治療用核酸構築物とを含む組成物をがんに直接接触させ、局所に投与することによって、乳房、前立腺、皮膚、肺、脳、膀胱、胃、腎臓などのような組織にて組成物をがんに投与することができ、この場合、ＩＬ－１２及びＲＩＧ－Ｉをコードする治療用核酸構築物は同一のまたは異なる核酸構築物である。

【0223】

腫瘍内注射は、当該技術分野において知られている（例えば、Ｍｅｌｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，（２０２１），Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１８：５５８－５７６を参照のこと）。

【0224】

Ｖ．治療応用
本明細書に開示されている方法は、がん抗原に対する強いメモリーＴ細胞応答を活性化する。したがって、本開示での使用が企図される治療用タンパク質は、多種多様な活性を有し、多種多様な障害の治療で使用される。したがって、治療用タンパク質活性の以下の記載、及び本開示の治療用核酸及びタンパク質で治療可能な適応症の記載は、例示的であり、網羅的であることを意図するものではない。「対象」という用語は動物を指し、哺乳類が好ましく、ヒトが特に好ましい。治療上の実施形態の具体的な非限定例が以下に記載されている。

【0225】

いくつかの治療上の実施形態では、治療用ポリプレックス：ポリマー組成物は、例えば、腫瘍内注射によって腫瘍に直接適用される。治療効果が転移性疾患に適用される場合、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物が接触する細胞または組織は腫瘍性であるが、治療効果は原発性腫瘍または原発標的組織に対して遠位である。

【0226】

場合によっては、治療上の実施形態は粘膜組織に適用されるが、非粘膜標的の組織、細胞、または臓器に作用することが意図される。そのような実施形態では、治療効果が非粘膜性である場合、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物が接触する細胞または組織は粘膜性であることが理解される。いくつかの実施形態では、治療作用は粘膜標的に対して近位である。例えば、粘膜細胞は、ＩＬ－１２及び／または別の免疫刺激分子を産生し、且つ分泌するように形質移入することができる。しかしながら、治療効果が転移性疾患であるような非粘膜性である他の実施形態では、本明細書に記載されているポリプレックス：ポリマー組成物が接触する細胞または組織は粘膜性であるが、治療効果は原発性腫瘍または原発粘膜性標的組織に対して遠位である。

【0227】

一実施形態では、本開示のポリプレックス：ポリマー組成物は治療的処置または予防的処置に使用されてもよい。そのような組成物は、本明細書では治療用組成物と呼ばれることがある。上記のように、主題の組成物及び方法は主に、ＩＬ－１２をコードする治療用核酸を、単独で、または追加の自然及び／または適応型の免疫刺激分子、例えば、ＲＩＧ－Ｉアゴニストと併せて使用する。いくつかの実施形態では、治療用核酸はさらに、例えば、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、ＴＬＲ７／９アゴニスト、及び／または他のパターン認識受容体アゴニストのようなＩＦＮ－１活性化因子／誘導因子をコードする。例えば、Ｖａｓｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓｅｓ，９：１８６（２０１７）を参照のこと。いくつかの実施形態では、治療用核酸はさらに、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＬＡＧ－３、ＫＩＲ及びそれらのリガンドから成る群から選択される免疫チェックポイント分子のモジュレーターをコードする。

【0228】

好適なＩＦＮ－１活性化因子／誘導因子には、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト（例えば、ｅＲＮＡ１１ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ、ＭＫ４６２１（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４及びＳＬＲ２０）、ＳＴＩＮＧ（すなわち、インターフェロン遺伝子の刺激剤）アゴニスト（例えば、ＣＤＮ、すなわち、サイクリックジヌクレオチド）、ＰＲＲａｇｏ（例えば、ＣｐＧ、ＩｍｉｑｕｉｍｏｄまたはポリＩ：Ｃ）、ならびにＴＲＬ７及びＴＬＲ９を含むＴＬＲアゴニスト（例えば、ＣＰＧ－１８２６、ＧＳ－９６２０、ＡＥＤ－１４１９、ＣＹＴ－００３－ＱｂＧ１０、ＡＶＥ－０６７５またはＰＦ－７９０９）、ならびにＲＬＲ刺激剤（例えば、ＲＩＧ－Ｉ、Ｍｄａ５、またはＬＧＰ２刺激剤）が挙げられる。いくつかの実施形態では、ＩＦＮ－１活性化因子／誘導因子は樹状細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／またはＴ濾胞ヘルパー細胞を誘導する。

【0229】

好ましい実施形態では、ＩＦＮ－１活性化因子／誘導因子はＲＩＧ－Ｉアゴニストである。ＲＩＧ－Ｉ（レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ、Ｄｄｘ５８によってコードされる）はＲＮＡセンサーとして作用する細胞質性抗ウイルス性ヘリカーゼであり、これは細胞質におけるウイルスＲＮＡを検出し、その認識の際に活性化される。パターン認識受容体、ＲＩＧ－ＩはＲＮＡヘリカーゼドメインと２つのＮ末端カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）とを含有し、それはシグナルを下流のシグナル伝達アダプターＭＡＶＳ（ミトコンドリア抗ウイルス－シグナル伝達タンパク質）に中継する。ＭＡＶＳを介したＲＩＧ－１シグナル伝達は、ＴＢＫ１及びＩＲＦ７／８を介した、ＩＦＮα及びＩＦＮβを含むＩ型ＩＦＮ応答の誘導ならびにカスパーゼ８依存性アポトーシスの活性化を含む種々の応答をもたらす。それらは、がん細胞を含むほとんどの組織に見いだされる（Ｋａｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．２４３（１）：９１－９８（２０１１））。

【0230】

ＲＩＧ－Ｉ誘導の応答は細胞間で異なる。メラニン細胞及び線維芽細胞のような正常な健常細胞は、ＲＩＧ－Ｉ誘導のアポトーシスに対して非常に耐性がある一方で、腫瘍細胞はＲＩＧ－Ｉ誘導の細胞死に非常に感受性が高い（Ｂｅｓｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００９；Ｋｕｂｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１０）。ＲＩＧ－Ｉの天然リガンドは、５’三リン酸または５’二リン酸（５’ｐｐｐまたは５’ｐｐ）を含有する二本鎖ＲＮＡのウイルス性の短い平滑末端である。ＲＩＧ－Ｉ特異的リガンドは現在、がんの免疫療法のために開発されている（Ｄｕｅｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，２０１４，２０１５；Ｅｌｌｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１３；Ｓｃｈｎｕｒｒ ＆ Ｄｕｅｗｅｌｌ，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２（５）：ｅ２４１７０（２０１３）及び２０１４）。ＲＩＧ－Ｉリガンドの強力な抗腫瘍活性の一部は、ＣＤ８^＋Ｔ細胞への抗原の交差提示を促進し、且つ細胞毒性活性を誘導するための下流能力である（Ｈｏｃｈｈｅｉｓｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０１６）。ＲＩＧ－Ｉリガンドはまた、インフルエンザのようなウイルス感染モデルにて強い治療活性も示す（Ｗｅｂｅｒ－Ｇｅｒｌａｃｈ ＆ Ｗｅｂｅｒ，２０１６）。

【0231】

ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターからＲＩＧ－Ｉリガンドを発現するプラスミドベクター骨格は、強力な合成ＲＩＧ－Ｉリガンドを特定するのに使用されている（Ｌｕｋｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８５（３）：１３７０－１３８３）。三リン酸で修飾されたステムループＲＮＡは本開示では特にアゴニストとして使用される。これらには、（ｉ）収束転写によって発現される免疫刺激性ｄｓＲＮＡであるｅＲＮＡ１１ａを（ｉｉ）アデノウイルスＶＡ ＲＮＡＩ、ＳＬＲ２０と組み合わせるｅＲＮＡ４１Ｈ、５’三リン酸配列で修飾された二本鎖三リン酸化２０塩基対ステムループＲＮＡ（Ｅｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７８（２１）：６１８３－６１９５（２０１８））、ならびに一方の末端に安定なテトラループを持つ代替的なポリリン酸化ＲＮＡであるＳＬＲ１０及びＳＬＲ１４（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２１６：２８５４－６８（２０１９））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0232】

本明細書に記載されている組成物及び方法にて有利に使用される追加のＲＩＧ－Ｉアゴニストには、ＲＩＧ－Ｉ及びヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン２経路の活性化を介して作用する広範なスペクトルの抗ウイルス性の自然のセンサーアゴニストであるＳＢ－９２００（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．８９：１６２０－１６２８（２０１７）、ＭＫ ４６２１（ＲＧＴ１００，Ｍｅｒｃｋ）、ＣＢＳ－１３－ＢＰＳ、インフルエンザウイルスパンハンドルプロモーターの構造を模倣する合成ＲＩＧ－Ｉ特異的アゴニスト（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．４６：１０５５３（２０１８）；ＩＶＴ－Ｂ２ ＲＮＡ（Ｌｉｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，２４：１３５－４５（２０１６）、ＳｅＶ ＤＶＧ（Ｘｕ ｅｔ ａｌ．，ｍＢｉｏ，６５：ｅ０１２６５－１５（２０１５））、９９ヌクレオチドのヘアピン（Ｍ８）を持つウリシンに富んだ配列を有する５’ｐｐｐＲＮＡ（Ｃｈｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８９：８０１１－２５（２０１５）、及び３ｐＲＮＡが挙げられる。

【0233】

前述の実施形態によれば、対象の組成物及び方法にてＩＬ－１２と同時発現するのに好適なＲＩＧ－Ｉアゴニストには、ＲＩＧ－Ｉ ＤＮＡワクチン、プラスミドがコードするＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ発現ＲＮＡベースのＲＩＧ－Ｉアゴニスト、例えば、ｅＲＮＡ１１ａ、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡ１、ｅＲＮＡ４１Ｈ（Ｎａｔｕｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐ）、ＧＦＰ２、Ｌａｍｉｎ Ａ／Ｃ及びＬａｍｉｎ ＶＳＶ、トリ－ＧＦＰｓ、ＳＡＤ ΔＰＬｐ、トリ－Ｇ－ＡＣ－Ｕ、Ｆｌｕ ｖＲＮＡ、ＲＮａｓｅＬフラグメント、ｐｐｐＲＶＬ、ｐｐｐＶＳＶＬ、ｐｐｐ－ｓｈＲＮＡ－ｌｕｃ３ＶＡ１、５’ｐｐｐ－ｄｓＲＮＡ、３ｐ－ｈｐＲＮＡ、ＭＫ４６２１（Ｍｅｒｃｋ）、ＳＬＲ１０、ＳＬＲ１４、ＳＬＲ２０、ＣＢＳ－１３－ＢＰＳ、ＩＶＴ－Ｂ２ ＲＮＡ、ＳｅＶ ＣＶＧ、ＳＢ－９２００、及びＥｌｌｅｒｍｅｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，（２０１３），７３（６）に開示されているようなｓｉＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、ＩＬ－１２との同時発現に好適なＳＴＩＮＧアゴニストには、ＤＤＸ４１を含むＤＥｘＤ／Ｈヘリカーゼが挙げられるが、これらに限定されず、ＴＬＲアゴニストには、例えば、ＣｐＧ－１８２６（ＯＤＮ１８２６、Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）のようなＣｐＧジヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。

【0234】

前述の実施形態によれば、主題の組成物及び方法にてＩＬ－１２と同時発現するのに好適な免疫チェックポイント分子のモジュレーターには、例えば、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＬＡＧ－３、及びＫＩＲ（例えば、ＫＮ０３５（Ａｂｌｙｎｘ／Ｓａｎｏｆｉ）；Ｉｎｈｉｂｒｉｘ １０５）のうちの１以上に向けた単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）（Ｗａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｏｎｃｏｌ．Ｒｅｐ．（２０１８）；Ｈｏｓｓｅｉｎｚａｄｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ ＆ Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，（２０１７）；Ｄｏｕｇａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎ．Ｉｍｍ．Ｒｅｓ．（２０１６）；Ｉｎｇｒａｍ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，（２０１８）、及びＷＯ２０１７１９８２１２も参照のこと）；ドミナントネガティブＰＤ－１分子（例えば、Ａｔａｒａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＰＤ－Ｌ１に対して高い親和性を有するＰＤ－１変異体（例えば、競合的アンタゴニスト）（Ｍａｕｔｅ、ＰＮＡＳ（２０１５））；及びＣＤ２８に対する結合が上昇したＣＤ８０変異体（複数可）（例えば、ＷＯ２０１７／１８１１５２）が挙げられる。

【0235】

場合によっては、当該ＩＦＮ－１アゴニスト及び／または当該免疫チェックポイント阻害剤は以下によってコードされる。
－当該誘導体化キトサン核酸ポリプレックス中の当該治療用核酸構築物；
－当該誘導体化キトサン核酸ポリプレックス中の異なる治療用核酸構築物；
－異なる誘導体化キトサン核酸ポリプレックス内の治療用核酸構築物（例えば、ＩＬ－１２をコードする構築物を含まない）；
－治療用核酸構築物（例えば、ＰＥＩまたはカチオン性脂質製剤のような代替核酸送達製剤に製剤化される）。

【0236】

ＩＬ－１２をコードする治療用核酸構築物及び当該ＩＦＮ－１アゴニスト及び／または当該免疫チェックポイント阻害剤をコードする治療用核酸構築物は同時にまたは順次、投与することができる。場合によっては、当該ＩＦＮ－１アゴニスト及び／または当該免疫チェックポイント阻害剤をコードする治療用核酸構築物は、単一の製剤で、または単一の、例えば、混合された２つの異なる製剤の組み合わせで同時投与される。場合によっては、ＩＬ－１２をコードする治療用核酸構築物及び当該ＩＦＮ－１アゴニスト及び／または当該免疫チェックポイント阻害剤をコードする治療用核酸構築物は順次、投与される。

【0237】

本開示の免疫刺激分子は、腫瘍細胞または他の過剰増殖性細胞の増殖または維持に関与するタンパク質（複数可）を阻害するように設計されたｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）分子をコードしてもよい。プラスミドＤＮＡは治療用タンパク質及び１以上のｓｈＲＮＡを同時にコードしてもよい。さらに、当該組成物の核酸は、プラスミドＤＮＡと、センスＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡまたはリボザイムを含む合成ＲＮＡとの混合物であってもよい。

【0238】

ＶＩ．治療の方法
過剰増殖性障害
主題の組成物及び方法は過剰増殖性障害の治療において有利に使用される。例示的な過剰増殖性障害には、乳房、結腸、前立腺、膵臓、皮膚、肺、卵巣、腎臓、脳、膀胱、膣、子宮頸部、胃、消化管、腎臓、肝臓、甲状腺、食道、鼻腔、喉頭、口腔、咽喉、網膜、子宮内膜、精巣などの過剰増殖性障害が挙げられる。特に重要であるのは、原発性がん／腫瘍から原発性がんとは異なる部位に転移している過剰増殖性障害を治療するための組成物及び方法である。

【0239】

いくつかの実施形態では、過剰増殖性障害は、粘膜組織またはその近傍の組織における過剰増殖性障害である。本開示の方法及び組成物は、口腔癌、食道癌、胃癌、膵臓癌、肝臓癌、大腸癌、及び直腸癌を含むが、これらに限定されない消化管癌の治療に使用されてもよい。本開示の方法及び組成物によって治療され得る鼻腔癌及び肺癌には、副鼻腔癌、中咽頭癌、気管癌、及び肺癌が挙げられるが、これらに限定されない。本開示の方法及び組成物によって治療され得る泌尿生殖器癌には、膀胱癌、尿路上皮癌、尿道癌、精巣癌、腎臓癌、前立腺癌、陰茎癌、副腎癌、子宮癌、子宮頸癌及び卵巣癌が挙げられるが、これらに限定されない。

【0240】

上記で提供された方法のいずれか１つに係るいくつかの実施形態では、該方法はさらに、非核酸に基づく免疫刺激分子を（腫瘍の部位に全身性にまたは限局性に）投与することを含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、免疫刺激分子は、ＣＴＬＡ－４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＴＩＭ３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＬＡＧ－３、ＫＩＲ及びそれらのリガンドから成る群から選択される免疫チェックポイント分子のモジュレーターである。いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ１の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＰＤ－１の阻害剤は抗ＰＤ－１抗体、例えば、ペムブロリズマブまたはニボルマブである。いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＣＴＬＡ－４の阻害剤である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ－４の阻害剤は抗ＣＴＬＡ－４抗体、例えば、イピリムマブまたはトレメリムマブである。いくつかの実施形態では、ＰＤ－Ｌ１の阻害剤は抗ＰＤ－Ｌ１抗体、例えば、アテゾリズマブである。

【0242】

いくつかの実施形態では、免疫調節剤はＩＦＮ－１アゴニスト、例えば、ＲＩＧ－Ｉアゴニスト、ＳＴＩＮＧアゴニスト、またはＴＬＲ７／９アゴニストである。同時投与するのに好適なＲＩＧ－Ｉアゴニストには、短いポリＩ：Ｃ及びポリＡＵ組成物（例えば、ポリ（Ｉ：Ｃ）／ＬｙｏＶｅｃ錯体（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））、ＲＧＴ１００（ＭＫ４６２１、Ｍｅｒｃｋ）ＳＬＲ２０（Ｅｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．；ＳＬＲ１０＆ＳＬＲ１４（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．）、及びＵＳ８８７１７９９、ＵＳ８８９５６０８、ＵＳ８９２７５６１、ＵＳ９，０７３，９４６、ＵＳ９４５８４９２、ＵＳ９５５５１０６、ＵＳ９８８４８７６、ＵＳ９９５６２８５、ＵＳ９７７５８９４、ＵＳ９８６１５７４、ＵＳ９９３７２４７、ＵＳ１０１６７４７６、ＵＳ１０３５０１５８、ＵＳ１０４３４０６４、ＵＳ１０２７３４８４、ＵＳ９３８１２０８Ｂ２、ＵＳ９７３８６８０Ｂ２、ＵＳ９７９０５０９、ＵＳ１００５９９４３、ＵＳ９１０９０１２Ｂ２、ＵＳ９９３７２４７Ｂ２、ＵＳ９８１６０９１Ｂ２、ＵＳ９１３３４５６Ｂ２、ＵＳ９４０９９４１Ｂ２、ＵＳ９３４０７８９Ｂ２、ＵＳ９０４０２３４Ｂ２、ＵＳ２０２０００７１３１６、ＵＳ２０２０００６３１４１Ａ１、ＵＳ２０２０００６１０９７Ａ１、ＵＳ２０２０００５５８７１Ａ１、ＵＳ２０２０００１６２５３Ａ１、ＵＳ２０１９００７６４６３Ａ１、ＵＳ２０１８０１９５０６３Ａ１、ＵＳ２０１６０２８７６２３Ａ１に開示されたようなアゴニストが挙げられるが、これらに限定されない。

【0243】

ＩＬ－１２と共に同時投与するのに好適なＳＴＩＮＧアゴニストには、ｃ－Ｄｉ－ＡＭＰナトリウム塩、ｃ－Ｄｉ－ＧＭＰナトリウム塩、２’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩、３’，３’－ｃＧＡＭＰナトリウム塩、１０－カルボキシメチル－９－アクリダノン（ＣＭＡ）、ＤＭＸＡＡ（Ｔｏｃｒｉｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，Ｎｉｍｂｕｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、Ｇ１０、α－マンゴスチン、ＣＲＤ１００（Ｃｕｒａｄｅｖ）、ｃＡＩＭＰ、２’２’－ｃ－ＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭ（ＰＳ）２（Ｒｐ／Ｓｐ）、２’３’－ｃ－ジ－ＡＭＰ、ｃ－ジ－ＩＭＰ、ｃ－ジ－ＵＭＰ、５，６－ジメチルキサンテノン－４－酢酸（ＤＭＸＡＡ）、ＭＫ－１４５４（Ｍｅｒｃｋ）ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＧ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ＣＤＡ（ＡＤＵ－Ｓ１００）、ＳＢ１１２８５（Ｓｐｒｉｎｇｂａｎｋ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＭＡＶＵ（ＡｂｂＶｉｅ）、ＤｉＡＢＺＩ、ジナトリウムジチオ－（Ｒｐ１Ｒｐ）－［サイクリック［Ａ（２’５’）ｐＡ（３’５’）ｐ］］［Ｒｐ，Ｒｐ］－サイクリック９アデノシン－（２’５’）－モノホスホロチオエート－アデノシン－（３’５）－モノホスホロチオエート）、ジナトリウム（ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＡ、ＡＤＵ－Ｓ１００、ＭＩＷ８１５）（Ｃｏｒｒａｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０１６）、ならびにＵ．Ｓ．１０，１７６，２９２、Ｕ．Ｓ．９，７２４，４０８、Ｕ．Ｓ．１０，０１１，６３０、Ｕ．Ｓ．１０，４３５，４６９、Ｕ．Ｓ．１０，４１４，７４７、Ｕ．Ｓ．１０，４１３，６１２、Ｕ．Ｓ．１０，１３１，６８６、Ｕ．Ｓ．１０，１０６，５７４、Ｕ．Ｓ．１０，０４７，１１５、Ｕ．Ｓ．１０，０４５，９６１、Ｕ．Ｓ．１０，０１１，６３０、Ｕ．Ｓ．９，９９４，６０７、Ｕ．Ｓ．９，９３７，２４７、Ｕ．Ｓ．９，８４０，５３３、Ｕ．Ｓ．９，７７０，４６７、Ｕ．Ｓ．９，７２４，４０８、Ｕ．Ｓ．９，７１８，８４８、及びＵ．Ｓ．９，６４２，８３０に開示された組成物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0244】

ＩＬ－１２と共に同時投与するのに好適なＴＬＲ７アゴニスト及びＴＬＲ９アゴニストには、レシキモド及びイミキモド（Ａｌｄａｒａ）を含むイミダゾキノリン及びその類似体、ヒドロキシクロロキン、クロロキン（ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｒｅ）、ブロピリミン、ロキソリビン、イサトリビン、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、安定化免疫調節性ＲＮＡ（ＳＩＭＲＡ）ＡＳＴ－００８（Ｅｘｉｃｕｒｅ）、ＭＥＤＩ９１９７、ならびにＵ．Ｓ．４３４，０６４、Ｕ．Ｓ．１０，４１３，６１２、Ｕ．Ｓ．１０，４０７，４３１、Ｕ．Ｓ．１０，３７０，３４２、Ｕ．Ｓ．１０，３６４，２６６、Ｕ．Ｓ．１０，２０８，０３７、Ｕ．Ｓ．１０，２０２，３８６、Ｕ．Ｓ．９，９４４，６４９、Ｕ．Ｓ．９，９０２，７３０、Ｕ．Ｓ．９，８６８，９５５、Ｕ．Ｓ．９，３５９，３６０、Ｕ．Ｓ．９，２９５，７３２、Ｕ．Ｓ．９，２４３，０５０、Ｕ．Ｓ．９，２２８，１８４、Ｕ．Ｓ．９，２１６，１９２、Ｕ．Ｓ．９，２２０６，４３０、Ｕ．Ｓ．８，７３５，４２１、Ｕ．Ｓ．８，７２８，４８６、Ｕ．Ｓ．８，３９９，４２３及びＵ．Ｓ．８，２４２，１０６に開示された組成物が挙げられるが、これらに限定されない。

【0245】

いくつかの実施形態では、非核酸に基づく免疫調節剤及び主題の組成物は同じ組成物中のように、同時に投与される。いくつかの実施形態では、非核酸に基づく免疫調節剤及び主題の組成物は順次投与される。

【0246】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供されているがんを治療するための方法はさらに、対象に少なくとも１つの追加の治療剤を投与することを含む。さらなる実施形態では、追加の治療剤は化学療法薬または放射線治療薬である。いくつかの実施形態では、化学療法薬には、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、５－フルオロウラシル１、ブレオマイシン、メソトレキセート、イフォサミド、オキサリプラチン、シクロホスファミド、ダカルバジン、テモゾロミド、ゲムシタビン、カペシタビン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、フロクスウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、ペメトレキセド、ペントスタチン、チオグアナジン（ｔｈｉｏｇｕａｎａｄｉｎｅ）、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、トポテカン、イリノテカン、エトポシド、エニポシド、コルヒチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、及びビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。例示的ながん特異的な薬剤及び抗体には、アファチニブ、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アキシチニブ、ベリムマブ、ベバシズマブ、ボルテゾミブ、ボスチニブ、ブレンツキシマブ、ベドチン、カボザンチニブ、カナキヌマブ、カルフィルゾミブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダブラフェニブ、ダサチニブ、デノスマブ、エルロチニブ、エベロリムス、ゲフィチニブ、イブリツモマブチウキセタン、ルブルチニブ、イマチニブ、イピリムマブ、ラパチニブ、ニロチニブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペルツズマブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、リツキシマブ、ロミデプシン、ルキソリチニブ、シプロイセル－Ｔ、ソラフェニブ、テムシロリムス、トシリズマブ、トファシチニブ、トシツモマブ、トラメチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ベムラフェニブ、ビスモデギブ、ボリノスタット、Ｚｉｖ－アフリベルセプト、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は免疫複合体の投与前に、投与と同時に、または投与後に対象に投与される。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は全身性に投与される。例えば、いくつかの実施形態では、追加の治療剤は静脈内注射によって投与される。

【0247】

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されている方法を使用して治療されるがんは膀胱癌である。米国で現在承認されている従来の膀胱がん治療は尿道内バチルス・カルメット・ゲランワクチンである。この抗原ワクチンは、膀胱細胞を刺激してインターフェロンを発現させ、次に、患者の生来の免疫系を動員してがん細胞表面抗原をさらに良好に認識し、がん細胞を攻撃すると考えられている。しかしながら、症例の３分の１以上ではこのワクチンは無効である。同様に、外来性に製造されたインターフェロンポリペプチドの膀胱内注入も調べられているが、効果は示されていない。主題の組成物及び方法を、これら従来のアプローチと併せて有利に採用して免疫応答を増強し、且つ改善することもできる。

【0248】

本明細書に示されている実施例は、本開示のいくつかの実施形態を例示するが、いかなる形でも本開示の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

【実施例】

【0249】

実施例１：膀胱癌の同所性モデルにおける長持ちする抗腫瘍免疫の評価
ｍＥＧ－７０ナノ粒子の長持ちする抗腫瘍免疫を評価するために、マウス膀胱癌の同所性モデルを使用した。簡潔には、コドンが最適化されたマウスＩＬ－１２（オプト－マウスＩＬ－１２ｐ４０ｐ３５）遺伝子は、サイトカインタンパク質ＩＬ－１２の２つのサブユニット（ｐ４０及びｐ３５）をコードする。サブユニットの１：１化学量論量を確保するために、ｍＥＧ－７０プラスミドは、短い反復エラスチンリンカー配列を加えることによってｐ４０～ｐ３５を単量体化する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するように設計された。コドンが最適化された配列を、ＮＴＣ９３８５ＲまたはＮＴＣ９３８５Ｒ－ｅＲＮＡ４１Ｈベクター骨格にクローニングし、参照によってその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０２０／１８３２３９に開示されているように発現を確認した。プラスミドは、ｅＲＮＡ１１ａ（免疫刺激性二本鎖リボ核酸［ｄｓＲＮＡ］）及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ１の遺伝子を含む。これらの遺伝子の２つのＲＮＡ産物はＲＩＧ－Ｉ経路を刺激し、これによって局所組織にさらに多くの免疫細胞を動員する。

【0250】

この治療用核酸は、アルギニン及びグルコースで官能化され、且つ取り外し可能なＰＥＧ－ｂ－ＰＬＥ賦形剤でコーティングされる二重誘導体化キトサンポリマーにパッケージングされ、ＷＯ２０２０／１８３２３９に開示されているような医薬組成物ｍＥＧ－７０を形成する。

【0251】

マウスの膀胱をポリ－Ｌ－リシンで前処理し、尿路上皮表層の剥離を促進し、がん細胞の移植を容易にすることによって疾患を確立した。ルシフェラーゼ遺伝子（ＭＢ４９－Ｌｕｃ）を安定に過剰発現する尿路上皮癌細胞を、その後、マウス膀胱（マウス当たり１００，０００細胞）に注入し、注入後９日目に生体内画像処理システム（ＩＶＩＳ）を使用してルシフェラーゼ発現を確認した。生物発光シグナルの強度を使用して、生物発光のレベルに基づいて動物を処理群（ｎ＝２２）に割り当てた。陽性生物発光シグナルのない動物を試験から除外した。

【0252】

イソフルランによる麻酔下でマウスは１０日目（Ｔｘ１）と１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ；８０μｇのＤＮＡに相当）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。この投与計画は、ＷＯ２０２０／１８３２３９に開示されているように決定されたタンパク質発現動態の評価に基づいて選択した。担腫瘍動物のコホートは未処理であった。

【0253】

ＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞の注入後、生存を８５日間モニタリングした。統計的有意性を、ログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定によって分析した（それぞれ偽処理及び未処理と比べたｍＥＧ－７０についての＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。（Ｃ）生存している腫瘍のないｍＥＧ－７０処理マウス（生物発光シグナルが陰性で臨床症状なし）及び週齢の一致した対照に、８５日目にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞）のＩＶＩで再負荷した。再負荷の７日後、１４日後、及び２１日後（それぞれ、試験の９２日目、９９日目、及び１０６日目）に生物発光の生体内画像処理によって腫瘍移植をモニタリングした。

【0254】

図１Ｂに示すように、ｍＥＧ－７０処理動物は、そのうちおよそ７０％が疾患で死亡した対照マウスと比べて長期生存を示した。ｍＥＧ－７０の生存曲線は偽処理（１％マンニトール）または未処理マウスの生存率とは有意に異なる（それぞれ＊ｐ＜０．０５及び＊＊ｐ＜０．０１）。

【0255】

完全な疾患退縮を示し、７６日間の観察期間中に再発しなかった（「ｍＥＧ－７０治癒」と呼ばれる）処理したマウスにＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞を再負荷して、再発性疾患からの防御を評価した。１７匹のマウスのうち１５匹にて頑健な腫瘍移植を示した齢の一致した無処置対照とは対照的に、ｍＥＧ－７０で治癒したマウスはすべて、再負荷後から３週間まで腫瘍再発に対して耐性を示した（ｎ＝１７）。図１Ｃを参照のこと。

【0256】

まとめると、これらのデータは、長持ちする全身性の抗腫瘍免疫がｍＥＧ－７０処理に応答して確立されていることを示唆している。

【0257】

実施例２：遠隔腫瘍の再負荷
実施例１に記載されているように、ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１×１０^５細胞）を雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの膀胱（１２～１６週）に注入し、注入後９日目のルシフェラーゼシグナルの生体内画像処理によって移植を確認した（Ｌｕｍｉｎａ ＬＴ ＩＶＩＳ画像処理システムを使用）。マウスは生物発光のレベルに基づいて処理群（ｎ＝２２）に均等に分配され（ルシフェラーゼ陰性マウスは試験から除外された）、１０日目（Ｔｘ１）と１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０ナノ粒子（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ、８０μｇのＤＮＡに相当、実施例１を参照のこと）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。担腫瘍動物のコホートは未処理であった。

【0258】

すべてのマウスが膀胱癌で死亡する、または腫瘍がないとみなされるまで（生物発光シグナルが陰性で臨床症状なし）、生存をモニタリングした。８５日目に、生存している腫瘍のないｍＥＧ－７０処理マウス及び週齢を一致させた対照にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞）をＩＶＩによって再負荷した。ｍＥＧ－７０処理マウスはすべて腫瘍が存在しないままであり、１５３日目に、ＭＢ４９－Ｌｕｃ（１×１０^５細胞；図２Ｂ）またはＢ１６－Ｆ１０細胞（１×１０^５細胞；図２Ｃ）のいずれかを脇腹皮下に再負荷した。週齢の一致した動物のコホートも、皮下細胞移植のための対照のために含めた。ノギスで測定することによって腫瘍をモニタリングし；腫瘍体積は式（長さ×幅^２／２）を使用して算出した。

【0259】

図２Ｂに示すように、ｍＥＧ－７０処理動物はＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞による遠隔腫瘍の再負荷から保護された。９匹の動物のうち１匹だけが腫瘍増殖を示し、それは著しくゆっくり進行した。対照的に、無処置対照コホートでは、腫瘍が増殖したマウスは９匹のうち８匹だった。

【0260】

反応の特異性を評価するためにＢ１６－Ｆ１０細胞をマウスに再負荷した。再負荷群及び無処置対照群のマウスはすべて、頑健なＢ１６－Ｆ１０腫瘍移植を示した（ｎ＝８／群）。図２Ｃを参照のこと。

【0261】

まとめると、これらのデータは、長持ちする全身性の及び特異的な抗腫瘍免疫がｍＥＧ－７０処理に応答して確立されていることを示唆している。

【0262】

実施例３：遠位腫瘍の再負荷中のＴ細胞の枯渇
以下の実施例は、主題の治療法で達成された、長持ちする全身性の抗腫瘍免疫がＴ細胞依存性であることを説明する。

【0263】

実施例１に記載されているように、ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１×１０^５細胞）を雌Ｃ５７ＢＬ／６Ｊの膀胱（１２～１６週）に注入し、注入後９日目のルシフェラーゼシグナルの生体内画像処理によって移植を確認した（Ｌｕｍｉｎａ ＬＴ ＩＶＩＳ画像処理システムを使用）。マウスを、生物発光のレベルに基づいて処理群（ｎ＝２０）に等しく分配した（ルシフェラーゼ陰性マウスを試験から除外した）。図３Ａは実験のタイムラインの概略図を提供している。

【0264】

マウスは１０日目（Ｔｘ１）と１７日目（Ｔｘ２）にｍＥＧ－７０ナノ粒子（１ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ；８０μｇのＤＮＡに相当、実施例１を参照のこと）の膀胱内注入（ＩＶＩ）を受け、対照動物は１％マンニトール（偽処理）の注入を受けた。すべてのマウスが膀胱癌で死亡するまで、または腫瘍がないとみなされるまで（生物発光シグナルが陰性で臨床症状なし）、生存をモニタリングした。

【0265】

１６７日目に、生存している腫瘍のないｍＥＧ－７０処理マウスと、週齢を一致させた無処置対照に、枯渇を確立するために連続４日間、その後維持するために週に２回アイソタイプ対照（非枯渇）、抗ＣＤ４抗体、または抗ＣＤ８抗体を腹腔内注射した。３回目の枯渇抗体注射後、マウスの脇腹皮下にＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１×１０^５細胞）を再負荷した（１７０日目；ｎ＝６）。ノギスによる測定によって腫瘍をモニタリングした。腫瘍体積は式［長さ×幅^２／２］を使用して算出した。結果を以下に要約し、図３（Ｂ～Ｄ）に示す。

【0266】

アイソタイプ対照抗体（非枯渇）を受けた無処置マウスはすべて、増大する皮下腫瘍を有していた。対照的に、ｍＥＧ－７０で処理したマウスはすべて、ＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞による遠隔腫瘍の再負荷から保護された（図３Ｂ）。

【0267】

抗ＣＤ４抗体を投与されたマウス（ＣＤ４＋Ｔ細胞枯渇）はすべて、無処置であろうと、またはｍＥＧ－７０処理によって以前治療されていようと、増大するＭＢ４９－Ｌｕｃ皮下腫瘍を有していた（図３Ｃ）。

【0268】

抗ＣＤ８抗体（ＣＤ８＋Ｔ細胞枯渇）を投与された無処置のマウスはすべて、増大する皮下腫瘍を有していた。対照的に、ｍＥＧ－７０で処理された６匹の動物のうち１匹のみが活発に増大する腫瘍を有していた（図３Ｄ）。注目すべきことに、ＣＤ８＋Ｔ細胞が枯渇した、ｍＥＧ－７０処理したマウス６匹のうち２匹が、静止状態であり、増大が遅延した小さな腫瘍塊を有していた。

【0269】

したがって、ｍＥＧ－７０で処理したマウスにおける再負荷からの保護は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の非存在下では損なわれる。したがって、ｍＥＧ－７０処理はＣＤ４＋Ｔ細胞が主として介在する長持ちする且つ全身性の抗腫瘍免疫を提供する。

【0270】

実施例４：反対側脇腹での再負荷
以下の実施例は、皮下腫瘍における腫瘍内直接注射によって投与されたｍＥＧ－７０が、長持ちする及び全身性の双方である抗腫瘍応答をもたらすことを説明する。

【0271】

ＭＢ４９－ルシフェラーゼ細胞（ＭＢ４９－Ｌｕｃ；１００μＬ中に２．５×１０^５細胞）を麻酔下でＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１２～１６週）の右脇腹に皮下移植した。腫瘍が約５０～２００ｍｍ^３に達したら、マウスを無作為に処理群（ｎ＝１０）に割り当てた。

【0272】

１日目、４日目、８日目、１１日目、１５日目及び１８日目にｍＥＧ－７０ナノ粒子（５０μＬ中０．５ｍｇのＤＮＡ／ｍＬ、２５μｇのＤＮＡに相当）をマウスに直接腫瘍内（ＩＴ）投与し、対照動物には１％マンニトール（偽処理）を投与した。担腫瘍動物のコホートは未処理だった。ノギスで測定することによって週３回、腫瘍サイズをモニタリングし、腫瘍体積は式［長さ×幅^２／２］を使用して算出した（図４Ａ）。

【0273】

腫瘍が再発していないことを確認するために、腫瘍がないｍＥＧ－７０で処理したマウス（ｍＥＧ－７０「治癒」；ｎ＝９）にて７０日目にＬｕｍｉｎａ ＬＴ ＩＶＩＳ画像処理システムを使用してルシフェラーゼシグナルの生物発光画像処理を実施した。７３日目に、ｍＥＧ－７０で治癒した且つ週齢が一致した対照は、左脇腹でＭＢ４９－Ｌｕｃ細胞（１００μＬにて２．５×１０^５細胞）の皮下移植を受けた。ノギスで測定することによって週３回、腫瘍をモニタリングし；腫瘍体積は式［長さ×幅^２／２］を使用して算出した。

【0274】

図４Ｂに示すように、ｍＥＧ－７０の腫瘍内（ＩＴ）投与は偽処理マウスと比べて腫瘍増殖を阻害した。さらに、ｍＥＧ－７０「治癒」マウスは反対側脇腹での腫瘍細胞の再負荷から保護された（図４Ｃ）。

【0275】

したがって、皮下腫瘍における腫瘍内直接注射によって投与したｍＥＧ－７０は、長持ちする且つ全身性の抗腫瘍応答をもたらした。

【0276】

実施例５：転移性膀胱癌におけるヒト臨床試験
膀胱癌は、米国（ＵＳ）の男女にてそれぞれ４番目及び１０番目に多い一般的な悪性腫瘍である（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｓｏｃｉｅｔｙ ２０１９）。筋層非浸潤性膀胱癌（ＮＩＭＢＣ）は一般的に、外科的切除（ＴＵＲＢＴ）によって管理され、その後、再発率を３５％低下させるために、２４時間以内に膀胱内化学療法（ゲムシタビンまたはマイトマイシン）の単回投与が行われることが多い（Ｓｙｌｖｅｓｔｅｒ ｅｔ ａｌ，２０１６）。

【0277】

病理から膀胱癌の存在を確認した後、医師は、ＢＣＧ療法を伴うことが多い継続的な治療計画を立てる。著しい有害作用、及び３０％～４０％の失敗率にもかかわらず、ＢＣＧによる膀胱内免疫療法は、高度（Ｔａ以上）のＮＭＩＢＣ患者における再発及び／または進行を防止するために使用される主な治療である。ＢＣＧに反応しないＮＭＩＢＣ患者はＢＣＧによる更なる治療の恩恵を受ける可能性が極めて低く、したがって新たな治療の研究のための独自の集団を表しているにもかかわらず、ＢＣＧは疾患の無い状態を達成するために第２の維持過程で投与されることが多い（Ｊａｒｏｗ ｅｔ ａｌ，２０１５）。

【0278】

薬理学的介入または膀胱切除がない場合、ＢＣＧ不応答性ＮＭＩＢＣは、切除疾患の有無にかかわらず、持続し、進行することになる。ＴＵＲＢＴ後に投与されることが多いゲムシタビン及びマイトマイシンは、有効なサルベージ剤ではないので、現在のところ、ＢＣＧに失敗した患者に利用できる有効な治療法は存在しない。したがって、ＢＧＣ不応性疾患に対する治療は、（ＢＣＧ難治性または再発に関わらず）すべての腫瘍を外科的に除去して無病生存を保証する根治的膀胱切除術である。ＮＭＩＢＣに利用可能な治療選択肢が少なく、患者が早期の疾患のために根治的な臓器切除を続けているという事実により、真に大きな満たされていない医学的ニーズが説明される。難治性患者で有効であるさらに効果的な治療がＮＭＩＢＣでは切迫して必要である。

【0279】

例示的な実施形態では、治療用核酸は、配列番号８で示されるような、スクロースに基づく抗生物質不使用選択マーカー（ＲＮＡ－ＯＵＴ）を持つＮＴＣ９３８５Ｒ骨格上の構成的に活性があるサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターに連結されているｏｐｔ－ｈＩＬ－１２と呼ばれるコドン最適化ヒトインターロイキン－１２遺伝子で構成される４１５６ｂｐのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を含む。

【0280】

Ｒ６Ｋの複製起点は、プラスミドの複製をＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の特定の株に限定する。ｏｐｔ－ｈＩＬ１２遺伝子はサイトカインタンパク質ＩＬ－１２の２つのサブユニット（ｐ４０及びｐ３５）をコードする。サブユニットの１：１化学量論量を確保するために、ＥＧ－７０プラスミドは、短い反復エラスチンリンカー配列を加えることによってｐ４０～ｐ３５を単量体化する単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含有するように設計された。また、プラスミドは、ｅＲＮＡ１１ａ（免疫刺激性二本鎖リボ核酸［ｄｓＲＮＡ］）及びアデノウイルスＶＡ ＲＮＡ１の遺伝子で構成される。これらの遺伝子の２つのＲＮＡ産物はＲＩＧ－Ｉ経路を刺激し、これによって局所組織にさらに多くの免疫細胞を動員する。さらなる実施形態では、この治療用核酸は、アルギニン及びグルコースで官能化され、且つ、取り外し可能なＰＥＧ－ｂ－ＰＬＥ賦形剤でコーティングされた二重誘導体化キトサンポリマーにパッケージングされ、医薬組成物ＥＧ－７０を形成する。該組成物を、１ｗ／ｗ％マンニトール溶液におけるナノ粒子水性分散系として製剤化し、濾過して滅菌し、乾燥粉末に凍結乾燥し、４℃で保存する。ナノ粒子分散系の平均粒度は７５～１７５ナノメートルの範囲内にある。

【0281】

本試験は、ＢＣＧ療法に失敗し、根治的膀胱切除術を待っている患者の遠位部位でのＥＧ－７０の膀胱内投与の安全性及び膀胱腫瘍に対するその効果を評価する。この試験は、各コホートで３人の患者を治療する古典的な用量漸増試験になる。ＥＧ－７０の初期用量は、非臨床的毒性学のデータ及び非臨床的有効性データに基づくものとし、ＧＬＰ－毒性学試験で見られる最小毒性用量の少なくとも１／５である。投影されるフェーズＩの用量漸増は、用量制限毒性（ＤＬＴ）なしで治療される連続するコホートについて、最大１／２－ｌｏｇ増分で行われる。

【0282】

二次腫瘍の増殖を防止／根絶するために免疫系を刺激するのに膀胱へのナノ粒子の送達が十分かどうかを評価するために患者をモニタリングする。
＊ ＊ ＊ ＊

【0283】

均等物
本明細書に記載されているすべての刊行物、特許、及び特許出願は、全体が、あらゆる目的のために、それぞれ個々の刊行物、特許、または特許出願が参照によって組み込まれように具体的且つ個々に指示されるのと同程度に、参照によって本明細書に組み込まれる。上記の開示は、独立した有用性を持つ複数の別個の開示を包含してもよい。これらの開示のそれぞれが好ましい形態（複数可）で開示されているが、本明細書に開示され及び例示されたその特定の実施形態は、多数の変形が可能であるので、限定的な意味で考慮されるべきではない。本開示の主題は、本明細書に開示されている種々の要素、特徴、機能、及び／または特性のすべての新規且つ非自明な組み合わせ及び副組み合わせを含む。以下の特許請求の範囲は特に、新規且つ非自明であるとみなされる特定の組み合わせ及び副組み合わせを指摘する。特徴、機能、要素、及び／または特性の他の組み合わせ及び副組み合わせで実行される開示は、本出願で、本出願の優先権を主張する出願で、または関連出願で特許請求されてもよい。このような特許請求の範囲は、異なる開示に向けられたものであれ、同じ開示に向けられたものであれ、また、元の特許請求の範囲と比べて、さらに広い範囲であれ、狭い範囲であれ、等しい範囲であれ、または異なる範囲であれ、本開示の主題の範囲内に含まれるものとみなされる。

【図1A】

【図1B】

【図1C】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図4A】

【図4B】

【図4C】

【配列表】

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【国際調査報告】