▶ ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-19
(54)【発明の名称】制御性Ｔ細胞を増殖させる方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/0783 20100101AFI20240209BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240209BHJP
A61P 37/06 20060101ALI20240209BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240209BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240209BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240209BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240209BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240209BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240209BHJP
【ＦＩ】
C12N5/0783 ZNA
C12N5/10
A61P37/06
A61P29/00
A61K35/17
C07K16/28
C12N15/09 100
C12N15/12
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550647
(86)(22)【出願日】2022-02-23
(85)【翻訳文提出日】2023-08-22
(86)【国際出願番号】 US2022017526
(87)【国際公開番号】W WO2022182763
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】63/152,787
(32)【優先日】2021-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】520352311
【氏名又は名称】ケーエスキュー セラピューティクス， インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】チョ， ジョン
(72)【発明者】
【氏名】トゥンセル， ケレム ジョナタン
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA94X
4B065AB01
4B065BA01
4B065BB19
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB37
4C087DA32
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB08
4C087ZB11
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045DA76
4H045EA28
(57)【要約】
本明細書で提供されているのは、操作されたＴｒｅｇを含む制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、それらの安定性及び活性を維持しながら増殖させるための生体外の方法である。Ｔｒｅｇの成長及び増殖を改善することに加えて、制御性Ｔ細胞の不連続刺激（ＤＳＯＲＴ（商標））の使用を含むことができる該方法は安定性及び活性が向上したＴｒｅｇを生成する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させる方法であって、前記方法が、（ａ）第１の刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養して、第１の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第１の刺激工程と；
（ｂ）刺激剤の非存在下で前記第１の刺激したＴｒｅｇ集団を培養し続けて第１の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することを含む第１の休止工程とを含む、前記方法。
【請求項2】
（ｃ）第２の刺激剤の存在下で前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を培養して第２の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第２の刺激工程を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
さらに、（ｄ）刺激剤の非存在下で前記第２の刺激したＴｒｅｇ集団を培養し続けて第２の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することを含む第２の休止工程を含み、任意でさらに
（ｅ）第３の刺激剤の存在下で前記第２の休止させたＴｒｅｇ集団を培養して第３の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第３の刺激工程を含み；任意でさらに
（ｆ）刺激剤の非存在下で前記第３の刺激したＴｒｅｇ集団を培養し続けて第３の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することを含む第３の休止工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
さらに刺激したＴｒｅｇ集団を生成するための１以上の追加の刺激工程（複数可）、及び／またはさらに休止させたＴｒｅｇ集団を生成するための１以上の追加の休止工程（複数可）をさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
請求項１に記載の方法がさらに、前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含み、請求項２に記載の方法がさらに、前記第２の刺激したＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含み；請求項３に記載の方法がさらに、前記第２の休止させたＴｒｅｇ集団、前記第３の刺激したＴｒｅｇ集団、または前記第３の休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含み；または、請求項４に記載の方法が、前記さらに刺激したＴｒｅｇ集団または前記さらに休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することをさらに含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項6】
請求項１に記載の方法がさらに、前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を回収することを含み；請求項２に記載の方法がさらに、前記第２の刺激したＴｒｅｇ集団を回収することを含み；請求項３に記載の方法がさらに、前記第２の休止させたＴｒｅｇ集団、前記第３の刺激したＴｒｅｇ集団、または前記第３の休止させたＴｒｅｇ集団を回収することを含み；請求項４に記載の方法が、前記さらに刺激したＴｒｅｇ集団または前記さらに休止させたＴｒｅｇ集団を回収することをさらに含み；または請求項５に記載の方法がさらに、前記遺伝子操作したＴｒｅｇ集団を回収することを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させる方法であって、前記方法が、（ａ）刺激剤を含む培地にてＴｒｅｇ集団を培養して、第１の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第１の刺激工程と；
（ｂ）前記刺激したＴｒｅｇ集団を洗浄して前記刺激剤を含む前記培地を除去し、洗浄したＴｒｅｇ集団を生成することと；
（ｃ）前記洗浄したＴｒｅｇ集団を新鮮な培地で培養して第１の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することとを含む、前記方法。
【請求項8】
前記新鮮な培地がどんな刺激剤も含まない、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
さらに、前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作すること及び／または刺激剤を含む培地にて前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を培養して第２の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む、請求項７または８に記載の方法。
【請求項10】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させる方法であって、前記方法が、（ａ）刺激剤の非存在下で以前刺激したＴｒｅｇ集団を培養して第１の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程と；
（ｂ）前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団に刺激剤を加えて刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程とを含む、前記方法。
【請求項11】
さらに、前記Ｔｒｅｇを遺伝子操作することを含み、任意で、前記第１の休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含む、請求項７～１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項12】
前記方法がさらに、前記遺伝子操作したＴｒｅｇ集団を培養することを含む、請求項５または１１に記載の方法。
【請求項13】
前記操作したＴｒｅｇ集団の培養が刺激剤の存在下で行われ、任意で、前記方法がさらに、前記刺激剤の非存在下で前記操作したＴｒｅｇ集団を培養し続けることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記操作したＴｒｅｇ集団の培養が前記刺激剤の非存在下で行われ、任意で、前記方法がさらに、刺激剤の存在下で前記操作したＴｒｅｇ集団を培養し続けることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させる方法であって、前記方法が、（ａ）Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作して操作したＴｒｅｇ集団を生成することと；
（ｂ）刺激剤の存在下で前記操作したＴｒｅｇ集団を培養して刺激した操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程と；
（ｃ）刺激剤の非存在下で前記刺激した操作したＴｒｅｇ集団を培養し続けて休止させた操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程とを含む、前記方法。
【請求項16】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させる方法であって、前記方法が、（ａ）Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作して操作したＴｒｅｇ集団を生成することと；
（ｂ）刺激剤の非存在下で前記操作したＴｒｅｇ集団を培養して休止させた操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程と；
（ｃ）刺激剤の存在下で前記休止させた操作したＴｒｅｇ集団を培養して刺激した操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程とを含む、前記方法。
【請求項17】
遺伝子操作する前に、前記Ｔｒｅｇ集団が刺激剤の存在下で前記集団を培養することを含む刺激工程に供される；または、遺伝子操作する前に、前記Ｔｒｅｇ集団が刺激剤の存在下で前記集団を培養することを含む刺激工程に供され、次いで、刺激剤の非存在下で前記集団を培養することを含む休止工程に供される；または、遺伝子操作する前に、前記Ｔｒｅｇ集団が刺激剤の存在下で前記集団を培養することを含む刺激工程、次いで、刺激剤の非存在下で前記集団を培養することを含む休止工程、次いで刺激剤の存在下で前記集団を培養することを含む別の刺激工程に供される、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項18】
前記遺伝子操作が刺激剤の非存在下で行われる、請求項１１～１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項19】
前記方法がさらに、前記Ｔｒｅｇ集団を回収することを含む、請求項７～１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
さらに、対象から前記Ｔｒｅｇ集団を得ることを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項21】
さらに、対象の胸腺、末梢血、臍帯血、もしくは組織試料から前記Ｔｒｅｇ集団を得ることを含む；またはさらに、工程（ａ）の前記培養の前に、対象の末梢血から前記Ｔｒｅｇ集団を得ることを含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記Ｔｒｅｇ集団が対象の胸腺、末梢血、臍帯血、もしくは組織試料から得られ；または前記Ｔｒｅｇ集団が前記対象の末梢血から得られた、請求項１～２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
前記対象がヒトである、請求項２０～２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
四量体抗体複合体が、前記操作した集団の前記刺激工程及び／または前記培養のうちの少なくとも１つにおける前記刺激剤であり；任意で、前記四量体抗体複合体が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、及び／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片が、前記操作した集団の前記刺激工程及び／または前記培養のうちの少なくとも１つにおける前記刺激剤である、請求項１～２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
ＣＤ３結合及び／またはＣＤ２８結合の超磁性ビーズが前記操作した集団の前記刺激工程及び／または前記培養のうちの少なくとも１つにおける前記刺激剤である、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項27】
前記方法が超磁性ビーズを使用しない、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
前記方法全体を通して同じ刺激剤が使用される、または少なくとも２つの異なる刺激剤が前記方法にて使用される；及び／または前記刺激剤は前記方法の前記刺激工程のすべてを通して同じ濃度で存在する、または少なくとも２つの異なる濃度の刺激剤が前記方法で使用される、請求項１～２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
前記ＴｒｅｇがＩＬ－２の存在下で培養され、任意で、前記方法の間にＩＬ－２濃度を低下させる、または任意で、ＩＬ－２が約７日間は約８００単位／ｍＬの濃度で存在し、その後は約３００単位／ｍＬで存在する、請求項１～２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で約１～約５日間培養し、次いで、刺激剤の非存在下で約１から約５日間培養し、次に、刺激剤の存在下で約１～約５日間培養し、その後遺伝子操作する；及び／または前記Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で約３～約４日間培養し、次に、刺激剤の非存在下で約３～約４日間培養し、次に、刺激剤の存在下で約１～約４日間培養し、その後遺伝子操作する、請求項１～２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項31】
前記Ｔｒｅｇ集団を表Ａに従って刺激剤の存在下及び／または非存在下で培養する、請求項１～３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項32】
前記Ｔｒｅｇを、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインの存在下で培養し、任意で、前記Ｎ－アセチル－Ｌ－システインが培養にて約５ｍＭの濃度で存在する、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項33】
前記Ｔｒｅｇ集団が約２５０倍に増殖したときに前記Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作する、請求項１～３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項34】
対象からＴｒｅｇを取得してから約６日から約１０日後に前記Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作する、任意で、対象からＴｒｅｇを取得してから約７日後に前記Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作する、請求項１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記遺伝子操作が前記Ｔｒｅｇ集団に核酸を導入することを含み；任意で、前記核酸がウイルス核酸である、または前記核酸がウイルス核酸ではない；及び／または
任意で、前記核酸がタンパク質をコードし、任意で前記タンパク質は異種タンパク質であり、さらに任意で前記異種タンパク質はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である、請求項５、６及び１１～３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項36】
前記遺伝子操作が前記Ｔｒｅｇ集団に遺伝子調節システムを導入することを含む、請求項５、６及び１１～３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項37】
前記遺伝子調節システムが（ｉ）核酸分子；（ｉｉ）酵素タンパク質；もしくは（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含み；または前記遺伝子調節システムがｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲ、もしくはアンチセンスＲＮＡから選択される核酸分子を含む；または
前記遺伝子調節システムが酵素タンパク質を含み、前記酵素タンパク質は前記Ｔｒｅｇにおける１以上の遺伝子の標的配列に特異的に結合するように操作されており、任意で、前記酵素タンパク質は転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、もしくはメガヌクレアーゼである；または
前記遺伝子調節システムが核酸分子及び酵素タンパク質を含み、前記核酸分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、前記酵素タンパク質はＣａｓタンパク質もしくはＣａｓオルソログであり、任意で前記Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である、請求項３６に記載の方法。
【請求項38】
前記導入が、エレクトロポレーションまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が介在する方法を使用する、請求項３５～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記方法が人工抗原提示細胞を使用しない、請求項１～３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記方法がラパマイシンを使用しない、または前記方法がラパマイシンを使用することを含む、請求項１～３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項41】
前記方法が前記Ｔｒｅｇの数を１１日間で少なくとも１０００倍増やす、請求項１～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記方法が刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇよりも表面積が小さいＴｒｅｇを生じる；及び／または前記方法が刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べてＨｅｌｉｏｓ＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの割合の増加を生じる；及び／または前記方法が刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べてエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を抑制する能力が高いＴｒｅｇを生じる；及び／または前記方法が前記Ｔｒｅｇ集団の過剰刺激を防止する；及び／または前記方法が刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べて活性化誘導性の細胞死を減らす、請求項１～４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項43】
Ｔｅｆｆの増殖を抑制する前記高い能力は少なくとも８倍高い能力である、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記ＴｒｅｇにおけるＨｅｌｉｏｓ発現の少なくとも７５％が維持される、請求項１～４３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項45】
前記ＴｒｅｇがＨｅｌｉｏｓ＋である、請求項１～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記Ｔｒｅｇが完全に脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有する、請求項１～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
さらに、前記Ｔｒｅｇ集団を凍結保存することを含む、請求項１～４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法によって生成されるＴｒｅｇ集団。
【請求項49】
請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法によって生成される凍結保存されたＴｒｅｇ集団。
【請求項50】
さらに、対象に前記Ｔｒｅｇ集団を投与することを含む、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
対象にて自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法であって、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法を使用して得られたＴｒｅｇ集団または請求項４８に記載のＴｒｅｇの有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項52】
対象にて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療するまたは予防する方法であって、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法を使用して得られたＴｒｅｇ集団または請求項４８に記載のＴｒｅｇの有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項53】
対象にて免疫応答を減らす方法であって、請求項１～４７のいずれか１項に記載の方法を使用して得られたＴｒｅｇ集団または請求項４８に記載のＴｒｅｇの有効量を前記対象に投与することを含む、前記方法。
【請求項54】
前記Ｔｒｅｇ集団が前記対象に対して同種異系である、または、前記Ｔｒｅｇ集団が前記対象に対して自家である、請求項５０～５３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２３日に出願された米国仮出願第６３／１５２，７８７号の優先権利益を主張する。
本出願は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、２０２１年２月２３日に出願された米国仮出願第６３／１５２，７８７号の優先権利益を主張する。
【0002】
電子出願された配列表への参照
２０２２年２月２２日に作成され、サイズが１１，３６６バイトの「４１９５＿０２２ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルとして２０２２年２月２３日に提出された配列表は参照によって本明細書に組み込まれる。
２０２２年２月２２日に作成され、サイズが１１，３６６バイトの「４１９５＿０２２ＰＣ０１＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」という名称のテキストファイルとして２０２２年２月２３日に提出された配列表は参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【0003】
分野
本明細書で提供されているのは、操作したＴｒｅｇを含む制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、それらの安定性及び活性を維持しながら増殖させるための生体外の方法である。
本明細書で提供されているのは、操作したＴｒｅｇを含む制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を、それらの安定性及び活性を維持しながら増殖させるための生体外の方法である。
【0004】
背景
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は自己免疫の防止に重要である。Ｔｒｅｇは、炎症とエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の活性を抑制して恒常性を維持するＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔｒｅｇの数及び／または機能の欠陥は自己免疫疾患の患者で頻繁に観察される。Ｔｒｅｇの治療用途の可能性が認識されており、Ｔｒｅｇは種々の自己免疫状態及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療に関する臨床試験で評価されている。
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は自己免疫の防止に重要である。Ｔｒｅｇは、炎症とエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の活性を抑制して恒常性を維持するＣＤ４＋Ｔ細胞である。Ｔｒｅｇの数及び／または機能の欠陥は自己免疫疾患の患者で頻繁に観察される。Ｔｒｅｇの治療用途の可能性が認識されており、Ｔｒｅｇは種々の自己免疫状態及び移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）の治療に関する臨床試験で評価されている。
【0005】
新たに単離されたＴｒｅｇを使用した臨床研究は過去にも実施されているが、Ｔｒｅｇ養子細胞療法（ＡＣＴ）の広範な使用には、十分な数の細胞を生成するために生体外でのＴｒｅｇの増殖が必要である。生体外での増殖は、Ｔｒｅｇの純度、安定性、及び固有の抑制機能が損なわれないように行う必要がある。
【0006】
Ｔｒｅｇの安定した且つ活性がある集団を効果的に増殖させることができないことは重大な難題を生じている。Ｔｒｅｇの臨床な操作は通常、ＣＤ２５発現細胞の単離用のＣｌｉｎｉＭＡＣＳのような密閉型ＧＭＰ認定磁気濃縮システムが使用されるが、それは活性化されたエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の大量の混入を生じる。そのような細胞の増殖は、ｍＴＯＲプロテインキナーゼ阻害剤であるラパマイシンを培養物に添加することによって、少なくとも部分的に防ぐことができる。ＴｒｅｇはｍＴＯＲ阻害に対して比較的耐性がある一方で、研究によって、ラパマイシンが３５日間にわたるＴｒｅｇの増殖を約３５％減らすことが見いだされている。さらに、ラパマイシンは、例えば、ＣＣＲ４及びＣＸＣＲ３のような組織ホーミング受容体の発現、と同様にそれらの機能（例えば、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＰ）及び系列（Ｈｅｌｉｏｓ及びＦｏｘｐ３）を変化させることによってＴｒｅｇの表現型に影響を与え、それは遺伝子編集の効果を不明瞭にしてもよく、または変化させてもよい。
【0007】
ラパマイシンは、試験管内でのＴｒｅｇの純度を向上させ、または増殖を誘導するために使用されている唯一の化合物ではない。ＴＧＦ－βは、ビタミンＡ誘導体であるオールトランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ）と共に前臨床試験にて、Ｔｒｅｇの生体外での増殖をサポートすることが示されているが、ＣＣＲ９及びインテグリン－α４β７のような腸管ホーミング受容体やＣＤ１６１の上方調節のようにＴｒｅｇの表現型に大きな影響を与える。
【0008】
ラパマイシンとＡＴＲＡを使用する別のアプローチは、胸腺、末梢血、または臍帯血から採取した、ナイーブＣＤ４５ＲＡ＋ナイーブＴｒｅｇのさらに均質な集団から開始することである。そのような単離された産物は、エフェクターＴ細胞をほとんど含有しないので、ラパマイシンの非存在下での長期のＴｒｅｇの増殖にさら好適である。生体外で増殖させたナイーブＴｒｅｇは、ナイーブ表現型を維持し、前臨床モデルにおける自己免疫疾患の予防に必要であることが示されているＣＤ６２ＬやＣＣＲ７のようなリンパ節（ＬＮ）ホーミングマーカーを発現することが示されている。しかしながら、Ｔｒｅｇの純度と安定性に関しては、時間は最も重要な因子の１つである。Ｔｒｅｇは、試験管内で活性化されると抑制性となり、培養中の最初の１～２週間ずっと高レベルの抑制能力を維持し、その間、Ｔｒｅｇは混入したエフェクターＴ細胞の増殖を効果的に防ぐ。しかしながら、時間の経過とともに、他のＴ細胞の増殖を制御するＴｒｅｇの能力が低下し、非Ｔｒｅｇが急速に蓄積し、純粋なＴｒｅｇ集団が失われる。
【0009】
したがって、Ｔｒｅｇの生体外の増殖に現在利用可能なプロトコールは不十分な増殖及び／または安定性をもたらす。したがって、純粋で安定した高機能のＴｒｅｇ集団を生成するためにＴｒｅｇを増殖させる効率的な方法に対するニーズが存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0010】
培養の最初の１～２週間でＴｒｅｇの増殖を最大化し、活性化後の早期にＴｒｅｇの増強された抑制活性を利用する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を増殖させる方法が本明細書で提供されている。本明細書で実証されているように、制御性Ｔ細胞の不連続刺激（ＤＳＯＲＴ（商標））は、刺激と休止の期間を交互に行うことによって急速なＴｒｅｇの増殖を達成することができる。例示的なＤＳＯＲＴ（商標）プロセスを図８に示す。１０００倍を超える増殖率にもかかわらず、そのような方法は純粋で安定した高機能Ｔｒｅｇ産物を作り出すことができる。有利なことに、これらの方法は、培養の最初の１～２週間の間、細胞の増殖を遅らせるためにラパマイシンを使用する必要がない。
【0011】
本明細書で提供されているのは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させるための方法であり、該方法は：（ａ）第１の刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養して第１の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第１の刺激工程と；（ｂ）刺激剤の非存在下で第１の刺激したＴｒｅｇ集団を培養し続けて、第１の休止させたＴｒｅｇ集団を生成することを含む第１の休止工程とを含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、（ｃ）第１の休止させたＴｒｅｇ集団を第２の刺激剤の存在下で培養して第２の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む第２の刺激工程を含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、（ｄ）第２の刺激Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養し続けて第２の休止Ｔｒｅｇ集団を生成することを含む第２の休止工程を含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、（ｅ）第２の休止Ｔｒｅｇ集団を第３の刺激剤の存在下で培養して第３の刺激Ｔｒｅｇ集団を生成することを含む第３の刺激工程を含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、（ｆ）第３の刺激Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養し続けて第３の休止Ｔｒｅｇ集団を生成することを含む第３の休止工程を含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、さらに刺激したＴｒｅｇ集団を生成するための１以上の追加の刺激工程（複数可）、及び／またはさらに休止させたＴｒｅｇ集団を生成するための１以上の追加の休止工程（複数可）を含む。
【0012】
いくつかの態様では、該方法はさらに、第１の休止させたＴｒｅｇ集団、第２の刺激したＴｒｅｇ集団、第２の休止させたＴｒｅｇ集団、第３の刺激したＴｒｅｇ集団、第３の休止させたＴｒｅｇ集団、さらに刺激したＴｒｅｇ集団、またはさらに休止させたＴｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含む。
【0013】
いくつかの態様では、該方法はさらに、第１の休止させたＴｒｅｇ集団、第２の刺激したＴｒｅｇ集団、第２の休止させたＴｒｅｇ集団、第３の刺激したＴｒｅｇ集団、第３の休止させたＴｒｅｇ集団、さらに刺激したＴｒｅｇ集団、さらに休止させたＴｒｅｇ集団、または遺伝子操作したＴｒｅｇ集団を回収することを含む。
【0014】
本明細書で提供されているのは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させるための方法であり、該方法は：（ａ）刺激剤を含む培地でＴｒｅｇ集団を培養して第１の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程と；（ｂ）刺激したＴｒｅｇ集団を洗浄して刺激剤を含む培地を取り除いて洗浄Ｔｒｅｇ集団を生成することと；（ｃ）洗浄Ｔｒｅｇ集団を新鮮な培地で培養して第１の休止Ｔｒｅｇ集団を生成することとを含む。いくつかの態様では、新鮮な培地はいかなる刺激因子も含まない。いくつかの態様では、該方法はさらに、第１の休止Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、刺激剤を含む培地で第１の休止Ｔｒｅｇ集団を培養して第２の刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む。
【0015】
本明細書で提供されているのは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させるための方法であり、該方法は：（ａ）以前刺激したＴｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下培養して第１の休止Ｔｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程と；（ｂ）第１の休止Ｔｒｅｇ集団に刺激剤を加えて刺激したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程とを含む。
【0016】
いくつかの態様では、該方法はさらに、Ｔｒｅｇを遺伝子操作することを含む。いくつかの態様では、該方法はさらに、第１の休止Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作することを含む。
【0017】
いくつかの態様では、該方法はさらに、遺伝子操作したＴｒｅｇ集団を培養することを含む。
【0018】
いくつかの態様では、遺伝子操作したＴｒｅｇ集団の培養は刺激剤の存在下で行われる。いくつかの態様では、該方法はさらに、操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養し続けることを含む。
【0019】
いくつかの態様では、遺伝子操作したＴｒｅｇ集団の培養は刺激剤の非存在下で行われる。いくつかの態様では、該方法はさらに、遺伝子操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で培養し続けることを含む。
【0020】
本明細書で提供されているのは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させるための方法であり、該方法は：（ａ）Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作して操作したＴｒｅｇ集団を生成することと；（ｂ）操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で培養して刺激した操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程と；（ｃ）刺激した操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養し続けて休止させた操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程とを含む。
【0021】
本明細書で提供されているのは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）集団を増殖させるための方法であり、該方法は：（ａ）Ｔｒｅｇ集団を遺伝子操作して操作したＴｒｅｇ集団を生成することと；（ｂ）操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養して休止させた操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む休止工程と；（ｃ）休止させた操作したＴｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で培養して刺激した操作したＴｒｅｇ集団を生成することを含む刺激工程とを含む。
【0022】
いくつかの態様では、遺伝子操作する前に、Ｔｒｅｇ集団は、刺激剤の存在下で集団を培養することを含む刺激工程に供される。
【0023】
いくつかの態様では、遺伝子操作する前に、Ｔｒｅｇ集団は、刺激剤の存在下で集団を培養することを含む刺激工程と、次いで刺激剤の非存在下で集団を培養することを含む休止工程とに供される。
【0024】
いくつかの態様では、遺伝子操作する前に、Ｔｒｅｇ集団は、刺激剤の存在下で集団を培養することを含む刺激工程と、次いで刺激剤の非存在下で集団を培養することを含む休止工程と、次いで刺激剤の存在下で集団を培養することを含む別の刺激工程とに供される。
【0025】
いくつかの態様では、遺伝子操作は刺激剤の非存在下で行われる。
【0026】
いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔｒｅｇ集団を回収することを含む。
【0027】
いくつかの態様では、方法はさらに、対象からＴｒｅｇ集団を得ることを含む。
【0028】
いくつかの態様では、方法はさらに、対象の胸腺、末梢血、臍帯血または組織試料からＴｒｅｇ集団を得ることを含む。
【0029】
いくつかの態様では、方法はさらに、工程（ａ）の培養の前に対象の末梢血からＴｒｅｇ集団を得ることを含む。
【0030】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は対象の胸腺、末梢血、臍帯血または組織試料から得られた。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は対象の末梢血からを得られた。
【0031】
いくつかの態様では、対象はヒトである。
【0032】
いくつかの態様では、四量体抗体複合体は、操作された集団の刺激工程及び／または培養の少なくとも１つにおける刺激剤である。いくつかの態様では、四量体抗体複合体は、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ２、またはそれらの組み合わせに特異的に結合する。
【0033】
いくつかの態様では、抗ＣＤ３抗体もしくはその抗原結合断片、及び／または抗ＣＤ２８抗体もしくはその抗原結合断片は、操作された集団の刺激工程及び／または培養の少なくとも１つにおける刺激剤である。
【0034】
いくつかの態様では、ＣＤ３結合及び／またはＣＤ２８結合の超磁性ビーズは操作された集団の刺激工程及び／または培養の少なくとも１つにおける刺激剤である。
【0035】
いくつかの態様では、方法は超磁性ビーズを使用しない。
【0036】
いくつかの態様では、方法全体を通して同じ刺激剤が使用される。いくつかの態様では、少なくとも２つの異なる刺激剤が方法にて使用される。
【0037】
いくつかの態様では、刺激剤は方法の刺激工程すべての全体を通して同じ濃度で存在する。いくつかの態様では、少なくとも２つの異なる濃度の刺激剤が方法にて使用される。
【0038】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＩＬ－２の存在下で培養される。いくつかの態様では、方法の間にＩＬ－２濃度を減らす。いくつかの態様では、ＩＬ－２は約７日間約８００単位／ｍＬの濃度で存在し、その後、約３００単位／ｍＬで存在する。
【0039】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団を、刺激剤の存在下で約１～約５日間培養し、次いで、刺激剤の非存在下で約１～約５日間培養し、その後、刺激剤の存在下で約１～約５日間培養し、その後遺伝子操作する。
【0040】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団を、刺激剤の存在下で約３～約４日間培養し、次いで、刺激剤の非存在下で約３～約４日間培養し、その後、刺激剤の存在下で約１～約４日間培養し、その後遺伝子操作する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は表Ａに従って刺激剤の存在下及び／または非存在下で培養される。
【0041】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＮ－アセチル－システインの存在下で培養される。いくつかの態様では、Ｎ－アセチル－Ｌ－システインは培養物中に約５ｍＭの濃度で存在する。
【0042】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団が約２５０倍に増殖したときにＴｒｅｇ集団は遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は、Ｔｒｅｇが対象から得られてから約６日～約１０日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団はＴｒｅｇが対象から得られてから約７日後に遺伝子操作される。
【0043】
いくつかの態様では、遺伝子操作はＴｒｅｇ集団に核酸を導入することを含む。いくつかの態様では、核酸はウイルス核酸である。いくつかの態様では、核酸はウイルス核酸ではない。いくつかの態様では、核酸はタンパク質をコードする。いくつかの態様では、タンパク質は異種タンパク質である。いくつかの態様では、異種タンパク質はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【0044】
いくつかの態様では、遺伝子操作はＴｒｅｇ集団に遺伝子調節システムを導入することを含む。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、（ｉ）核酸分子；（ｉｉ）酵素タンパク質；または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含む。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲ、またはアンチセンスＲＮＡから選択される核酸分子を含む。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは酵素タンパク質を含み、酵素タンパク質はＴｒｅｇ内の１以上の遺伝子の標的配列に特異的に結合するように操作されている。いくつかの態様では、酵素タンパク質は、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼである。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、核酸分子及び酵素タンパク質を含み、その際、核酸分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、酵素タンパク質はＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質である。
【0045】
いくつかの態様では、導入はエレクトロポレーションまたはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）が介在する方法を使用する。
【0046】
いくつかの態様では、方法は人工抗原提示細胞を使用しない。
【0047】
いくつかの態様では、方法はラパマイシンを使用しない。いくつかの態様では、方法はラパマイシンを使用することを含む。
【0048】
いくつかの態様では、方法は１１日間でＴｒｅｇの数を少なくとも１０００倍増やす。
【0049】
いくつかの態様では、方法は、刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇよりも表面積が小さいＴｒｅｇを生じる。いくつかの態様では、方法は刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べてＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ集団を増やす。いくつかの態様では、方法は刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べてエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）の増殖を抑制する能力が高いＴｒｅｇを生じる。いくつかの態様では、Ｔｅｆｆの増殖を抑制する高い能力は少なくとも８倍高い能力である。
【0050】
いくつかの態様では、方法はＴｒｅｇ集団の過剰刺激を防止する。
【0051】
いくつかの態様では、方法は刺激剤の存在下で６日間培養したＴｒｅｇと比べて活性化が誘導する細胞死を減らす。
【0052】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇにおけるＨｅｌｉｏｓ発現の少なくとも７５％が維持される。
【0053】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＨｅｌｉｏｓ＋である。
【0054】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは完全に脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有する。
【0055】
いくつかの態様では、方法はさらに、Ｔｒｅｇ集団を凍結保存することを含む。
【0056】
本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されているいずれかによって作り出されるＴｒｅｇ集団である。いくつかの態様では、本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されている任意の方法によって作り出されるＴｒｅｇの凍結保存集団である。
【0057】
いくつかの態様では、方法はさらに、対象にＴｒｅｇ集団を投与することを含む。
【0058】
本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されている任意の方法または本明細書で提供されている任意のＴｒｅｇを使用して得られたＴｒｅｇ集団の有効量を対象に投与することを含む、対象にて自己免疫疾患または炎症性疾患を治療する方法である。
【0059】
本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されている任意の方法または本明細書で提供されている任意のＴｒｅｇを使用して得られたＴｒｅｇ集団の有効量を対象に投与することを含む、対象にて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療するまたは予防する方法である。
【0060】
本明細書で提供されているのは、本明細書で提供されている任意の方法または本明細書で提供されている任意のＴｒｅｇを使用して得られたＴｒｅｇ集団の有効量を対象に投与することを含む、対象にて免疫応答を低下させる方法である。
【0061】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は対象にとって同種異系である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団は対象にとって自家である。
【図面の簡単な説明】
【0062】
【図1】ＣＤ３／２８／２四量体モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＤｙｎａｂｅａｄｓによる連続的なまたは不連続的な刺激を受けた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を示す。（実施例２を参照のこと）
【図2】連続的（「基準」）または不連続的な（「ＤＳＯＲＴ（商標）」）刺激を受けたＴｒｅｇの活性化の尺度としての相対的なサイズを示す。（実施例３を参照のこと）
【図3】連続刺激または長い非刺激期を伴う不連続刺激を受けたＴｒｅｇの増殖を示す。刺激はＣＤ３／２８／２四量体モノクローナル抗体（ｍＡｂ）またはＤｙｎａｂｅａｄｓのいずれかによって実施した。（実施例４を参照のこと）
【図4】連続的（「Ｃｏｎｔ」）刺激または不連続的（ＤＳＯＲＴ（商標））刺激を受けたＣＲＩＳＰＲ操作したＴｒｅｇの増殖を示す。白抜き四角はｎ＝３の平均値を表す。（実施例５を参照のこと）
【図5】ＤＳＯＲＴ（商標）を使用して得られたＴｒｅｇの細胞数（左ｙ軸）及び増殖倍数（右ｙ軸）を示すグラフ（上）及び交互増殖プロトコールに加えてＤＳＯＲＴ（商標）（「ＫＳＱ Ｔｘ」）を使用して得られた増殖倍数を示す表（下）を提供する。「Ｔｈｉｅｌ」試験とは、ＴＨＥＩＬ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，”Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｔｏ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｈｒｏｎｉｃ ｇｒａｆｔ－ｖｅｒｓｕｓ－ｈｏｓｔ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，１７（４）：Ｐ４７３－４８６（Ａｐｒｉｌ，２０１５）を指す。「Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ」試験とは、ＢＬＵＥＳＴＯＮＥ，Ｊ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｔｙｐｅ １ ｄｉａｂｅｔｅｓ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｕｓｉｎｇ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ，”Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．ｍｅｄ．７（３１５）：３１５ｒａ１８９（Ｎｏｖｅｍｂｅｒ，２０１５）を指す。「Ｃａｎａｖａｎ」試験とは、ＣＡＮＡＶＡＮ，Ｊ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．”Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｅｘｐａｎｄｅｄ ＣＤ４５ＲＡ＋ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａｎ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ Ｃｒｏｈｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｇｕｔ，６５（４）：５８４－５９４（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎｌｉｎｅ Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１５）を指す。「Ｓａｆｉｎａ」試験とは、ＳＡＦＩＮＩＡ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，”Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ，７（７）：７５６３－７５７７（Ｆｅｂｒｕａｒｙ，２０１６）を指す。「Ｔｒｚｏｎｋｏｗｓｋａ」試験とは、ＭＡＲＥＫ－ＴＲＺＯＮＫＯＷＳＫＡ，Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｍｉｌｄ ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ ｐｒｏｖｉｄｅｓ Ｔｒｅｇ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，７：１１９１５（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ，２０１７）を指す。「Ｌｏｍｂａｒｄｉ」試験とは、ＦＲＡＳＥＲ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｒａｐａｍｙｃｉｎ－Ｂａｓｅｄ ＧＭＰ－Ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ－Ｍｅｔｈｏｄｓ ＆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８：１９８－２０９（Ｊａｎｕａｒｙ，２０１８）を指す。「Ｌｅｖｅｎｔｈａｌ」試験とは、ＭＡＴＨＥＷ，Ｊ．Ｍ．，ｅｔ ａｌ．，”Ａ Ｐｈａｓｅ Ｉ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｒｉａｌ ｗｉｔｈ Ｅｘ Ｖｉｖｏ Ｅｘｐａｎｄｅｄ Ｒｅｃｉｐｉｅｎｔ Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ Ｌｉｖｉｎｇ Ｄｏｎｏｒ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ，”Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，８：７４２８（Ｍａｙ，２０１８）を指す。「Ｔｈｏｎｈｏｆｆ」試験とは、ＴＨＯＮＨＯＦＦ，Ｊ．Ｒ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｅｘｐａｎｄｅｄ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ｉｎｆｕｓｉｏｎｓ ｉｎ ＡＬＳ，”Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ＆ Ｎｅｕｒｏｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，５（４）：１－７（Ｊｕｌｙ，２０１８）を指す。「ＭａｃＤｏｎａｌｄ」試験とは、ＭＡＣＤＯＮＡＬＤ，Ｋ．Ｎ．，ｅｔ ａｌ．，”Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｔｉｍｉｎｇ ｉｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｐｒｏｃｅｓｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｉｎ ａ ｔｈｙｍｉｃ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒｏｔｏｃｏｌ，”Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２１（１２）：１２１６－１２３３（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ，２０１９）を指す。（実施例６を参照のこと）
【図6】（Ａ）Ｈｅｌｉｏｓ及びＦｏｘｐ３の発現がある細胞及び発現がない細胞におけるＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）のメチル化状態を示す。（Ｂ）Ｈｅｌｉｏｓを発現する細胞の割合が異なる細胞集団のエフェクターＴ細胞の増殖を抑制する能力を示す。（Ｃ）Ｈｅｌｉｏｓの発現は不連続（「ＤＳＯＲＴ（商標）」）刺激または連続（「基準」）刺激を使用して増殖した細胞である。（実施例７を参照のこと）
【図7】連続刺激（基準増殖）または不連続刺激（ＤＳＯＲＴ（商標））を受けたＴｒｅｇがＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖を抑制する能力を示す。（実施例８を参照のこと）
【図8】Ｔｒｅｇを交互の刺激サイクルと休止サイクルに供し、遺伝子操作する例示的なＤＳＯＲＴ（商標）プロセスの概略図である。「フラスコ」はＴｒｅｇをプレートからフラスコに移すことを示す。
【発明を実施するための形態】
【0063】
定義
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門的及び科学的用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、定義を含めて本出願が優先される。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載されている全ての刊行物、特許、及び他の参考文献は、個々の刊行物、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示され、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。
特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての専門的及び科学的用語は、本開示が関連する当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。矛盾が生じる場合は、定義を含めて本出願が優先される。別段文脈によって要求されない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。本明細書に記載されている全ての刊行物、特許、及び他の参考文献は、個々の刊行物、または特許出願が参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示され、あらゆる目的のためにその全体が参照によって本明細書に援用される。
【0064】
本明細書で記載したものと類似または同等の方法及び材料を、本開示の実施または試験で使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。材料、方法及び実施例は例示にすぎず、限定を意図するものではない。本開示のその他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【0065】
本開示をさらに定義するために、以下の用語及び定義を提供する。
【0066】
本明細書にて態様が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用して記載される場合は常に、「から成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」及び／または「から本質的に成る（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語で記載される類似の態様も提供されることが理解される。
【0067】
本明細書で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、別途指示されない限り、複数の対象を含む。
【0068】
本明細書における用語「または」の使用は代替物を相互に排除することを意味するものではない。本出願では、「または」の使用は、明示的に述べられていない、または当業者によって理解されていない限り「及び／または」を意味する。複数の従属請求項の文脈では、「または」の使用は、１を超える先行する独立請求項または従属請求項にさかのぼって言及する。本明細書で使用されるときの用語「及び／または」は、その他のものの有無にかかわらず、２つの明示した特徴または成分のそれぞれの個別の開示として解釈されるべきである。したがって、本明細書における「Ａ及び／またはＢ」のような語句で使用される用語「及び／または」は、「Ａ及びＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）、ならびに「Ｂ」（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」のような語句で使用される「及び／または」という用語は、次の態様：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【0069】
単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）が承認した形式で示される。数値範囲はその範囲を定義する数を含むものとする。本明細書で提供されている見出しは、本開示のさまざまな態様を限定するものではなく、全体として本明細書を参照することによって得られ得る。したがって、すぐ下で定義されている用語は、本明細書を全体として参照することによってさらに完全に定義される。
【0070】
本明細書で使用されるとき、「約」という用語は記載されている数の±１０％を含む。したがって、「約１０」は９～１１を意味する。当業者によって理解されているように、本明細書における「約」値またはパラメーターに対する言及は、その値またはパラメーター自体を対象とする具体例を含む（且つ説明する）。例えば、「約Ｘ」について言及する記述は「Ｘ」の記述を包含する。
【0071】
本明細書で使用されるとき「制御性Ｔ細胞」または「Ｔｒｅｇ」という用語は、免疫系を調節し、自己抗原に対する寛容を維持し、ならびに自己免疫疾患及び炎症疾患を抑止するフォークヘッドボックスＰ３（Ｆｏｘｐ３）転写因子を構成的に発現するＴ細胞の部分集団を指す。これらの細胞は一般に、エフェクターＴ細胞の誘導と増殖を抑制し、または下方調節し、且つ抗原提示細胞の機能を調節する。Ｔｒｅｇは、細胞間接触によって、または免疫抑制性サイトカインの放出を介して抑制活性（すなわち、従来のＴ細胞の増殖の阻害）が可能である細胞である。
【0072】
本明細書で使用されるとき、「集団」という用語は細胞の集団を指し、その際、その大部分、すなわち、細胞の総数の少なくとも５０％（任意で、少なくとも６０％、少なくとも７０％、または少なくとも約８０％）が目的の細胞の特定の特性（例えば、目的の機能的特性及び／またはマーカー）を有する。したがって、「Ｔｒｅｇ集団」とは、細胞の大部分がＴｒｅｇであるが、一部の細胞はＴｒｅｇではない細胞であり得る（例えば、一部の細胞はＴｅｆｆであり得る）細胞の集団を指す。
【0073】
本明細書で使用されるとき、「培養」とは、定義されたまたは制御された条件下で試験管内にて１以上の細胞を増殖させることを指す。定義できる培養条件の例には、温度、混合ガス、時間、培地配合が含まれる。
【0074】
本明細書で使用されるとき、「培養培地」及び「細胞培養培地」及び「フィード培地」及び「発酵培地」という用語は、細胞、特に哺乳類細胞の増殖及び／または維持に使用される栄養溶液を指す。限定しないで、これらの溶液は通常、以下のカテゴリー：（１） エネルギー源、ふつうはグルコースのような炭水化物の形態；（２）すべての必須アミノ酸、ふつうは２０のアミノ酸の基本セット；（３）低濃度で必要とされるビタミン及び／または他の有機化合物；（４）遊離脂肪酸または遊離脂質、例えばリノール酸；及び（５）微量元素の１以上に由来する少なくとも１つの成分を提供し、その際、微量元素は、通常はマイクロモル範囲の非常に低い濃度で必要とされる無機化合物または天然に存在する元素として定義される。栄養溶液には、以下のカテゴリー：（１）ホルモン及び他の成長因子、例えば、血清、インスリン、トランスフェリン、及び上皮増殖因子；（２）塩類、例えば、マグネシウム、カルシウム、及びリン酸塩；（３）ＨＥＰＥＳのような緩衝液；（４）アデノシン、チミジン、及びヒポキサンチンのようなヌクレオシド及び塩基；（５）タンパク質及び組織加水分解物、例えば、精製ゼラチン、植物材料、または動物副産物から得ることができるペプトンまたはペプトン混合物；（６）ゲンタマイシンのような抗生物質；（７）細胞保護剤、例えばプルロニック（登録商標）ポリオール；ならびに（８）ガラクトースのいずれかに由来する１以上の成分を選択的に補充することができる。Ｈａｍ’ｓ Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）のような市販されている培地は宿主細胞の培養に好適である。さらに、Ｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９），Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）に記載されている培地のいずれかを宿主細胞の培養培地として使用することができる。任意の他の必要な補充物も適切な濃度で含まれ得る。
【0075】
本明細書で使用されるとき、「刺激剤」または「刺激剤」は、Ｔｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／またはＣＤ２８もしくはＧＩＴＲのような共刺激分子を（直接的または間接的に）活性化する、及び／または分裂促進活性を有する薬剤を指す。刺激剤はＴｒｅｇの増殖を高めることができる。刺激剤として作用する薬剤の能力はＣＤ３ゼータサブユニット上のＩＴＡＭモチーフのリン酸化を増加させる能力によって立証することができる。
【0076】
本明細書で使用されるとき、「刺激剤の存在下」または「刺激剤の存在下」での培養は、Ｔｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／またはＣＤ２８やＧＩＴＲのような共刺激分子を活性化するのに十分な量の刺激剤の存在下でＴｒｅｇを培養することを指す。
【0077】
本明細書で使用されるとき、「刺激剤の非存在下」または「刺激剤の非存在下」での培養は、Ｔｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／またはＣＤ２８やＧＩＴＲのような共刺激分子を活性化するのに十分な量の刺激剤の非存在下で培養することを指す。「刺激剤の非存在下」での培養には、いかなる刺激剤も使用せずに培養することが含まれる。
【0078】
本明細書で使用されるとき「播種」という用語は培養を開始するために培養培地に細胞を添加することを指す。
【0079】
本明細書で使用されるとき「遺伝子操作」という用語は、バイオテクノロジーを使用して細胞内の核酸を直接操作することによって、細胞の遺伝子構成（すなわち、少なくとも１つの核酸の）を変更（付加、抑制、または置換）するプロセスを指す。遺伝子操作には、例えば、細胞または細胞集団に異種核酸を導入することが含まれる。核酸は、例えば、形質導入または形質移入によって細胞または細胞集団に導入することができる。
【0080】
「形質導入」または「形質導入すること」という用語は、ウイルスによる遺伝物質の導入及びレシピエント細胞におけるその発現を指す。
【0081】
本明細書で使用されるとき「形質移入」または「形質移入すること」という用語は、ＤＮＡ（例えば、製剤化されたＤＮＡ発現ベクター）を細胞に導入し、それによって細胞の形質転換を可能にするプロセスを指す。
【0082】
本明細書で使用されるとき「ベクター」という用語は、宿主細胞内で複製する及び／または組み込むベクターの能力を破壊することなく外来核酸の挿入を可能にする核酸分子を指す。
【0083】
本明細書で使用されるとき「組換えベクター」という用語は、ベクターに挿入された別のポリヌクレオチドを転移または輸送することができるポリヌクレオチド分子を指す。挿入されるポリヌクレオチドは発現カセットであってもよい。いくつかの態様では、組換えベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクター（例えば、プラスミド）であってもよい。
【0084】
「発現カセット」または「発現構築物」はプロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡポリヌクレオチド配列を指す。「操作可能に連結される」は、そのように説明される構成要素が、その意図される様式でそれらが機能することを可能する関係にある並置を指す。例えば、プロモーターは、そのプロモーターがポリヌクレオチド配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、ポリヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。
【0085】
本明細書で使用されるとき、「発現」及び「発現する」という用語は細胞内で起こる転写及び翻訳を指すために使用される。宿主細胞における生成物遺伝子の発現レベルは、細胞に存在する対応するｍＲＮＡの量、またはその細胞によって産生される生成物遺伝子によってコードされるタンパク質の量のいずれか、または双方に基づいて決定されてもよい。
【0086】
「試料」という用語は、生物学的組成物（例えば、細胞または組織の一部）を指す。いくつかの態様では、試料は、対象から直接得られるという点で「一次試料」であり；いくつかの態様では、「試料」は、例えば特定の成分を除去するための、及び／または特定の対象成分を単離または精製するための一次試料の処理の成果である。いくつかの態様では、試料は血液試料である。
【0087】
「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すのに相互交換可能に使用され、最小長には限定されない。アミノ酸残基のそのようなポリマーは、天然または非天然のアミノ酸残基を含む場合があり、また、アミノ酸残基のペプチド、オリゴペプチド、二量体、三量体、及び多量体を含むが、これらに限定されない。完全長タンパク質及びその断片の双方は、定義に包含される。この用語にはまた、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化などが含まれる。さらに、本開示の目的に関して、「ポリペプチド」とは、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ネイティブ配列に対する欠失、付加及び置換のような（概して本質的に保存的な）修飾を有するタンパク質を指す。これらの修飾は、部位特異的突然変異誘発などによる意図的なものであってもよく、またはタンパク質を産生する宿主の突然変異もしくはＰＣＲ増幅に起因するエラーなどによる偶発的なものであってもよい。
【0088】
「抗体」という用語は、標的、例えば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、またはこれらの組み合わせを、当該免疫グロブリン分子の可変領域内の少なくとも１つの抗原認識部位を介して認識しこれに結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で使用されるとき、「抗体」という用語は、インタクトなポリクローナル抗体、インタクトなモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体を含む融合タンパク質、及び当該抗体が所望の生物活性を示す限り任意の他の修飾された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれ、アルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、及びミューと呼ばれる重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンのクラス： ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）のいずれかのものであることができる。異なるクラスの免疫グロブリンは、異なる周知のサブユニット構造及び三次元構造を有する。抗体は裸であることができ、または毒素や放射性同位体等のような他の分子とコンジュゲートすることができる。
【0089】
「抗体断片」という用語はインタクトな抗体の一部を指す。「抗原結合断片」、「抗原結合ドメイン」または「抗原結合領域」は抗原に結合するインタクトな抗体の一部を指す。抗原結合性断片はインタクトな抗体の抗原決定可変領域（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））を含有することができる。抗体の抗原結合断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片、線状抗体、及び単鎖抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体の抗原結合断片は、げっ歯類（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）及びヒトのような任意の動物種に由来することができ、または人工的に生成することができる。
【0090】
本明細書で使用されるとき、「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は相互交換可能に使用され、当該技術分野では一般的である。可変領域は通常、抗体の一部、一般に軽鎖または重鎖の一部を指し、通常、成熟重鎖のアミノ末端ほぼ１１０～１２０アミノ酸または１１０～１２５アミノ酸及び成熟軽鎖のほぼ９０～１１５アミノ酸を指し、それらは抗体間で配列が大きく異なり、特定の抗原に対する特定の抗体の結合と特異性に使用される。配列の可変性は相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる領域に集中している一方で、可変ドメイン内のさらに保存された領域はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。どんな特定のメカニズムまたは理論にも束縛されることを望まないで、軽鎖及び重鎖のＣＤＲは主に、抗体と抗原との相互作用及び特異性に関与すると考えられている。いくつかの態様では、可変領域はヒト可変領域である。いくつかの態様では、可変領域は齧歯類またはマウスのＣＤＲ及びヒトのフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。いくつかの態様では、可変領域は霊長類（例えば、非ヒト霊長類）の可変領域である。いくつかの態様では、可変領域は齧歯類またはマウスのＣＤＲ及び霊長類（例えば、非ヒト霊長類）のフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。
【0091】
「ＶＬ」及び「ＶＬドメイン」という用語は抗体の軽鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。「ＶＨ」及び「ＶＨドメイン」という用語は抗体の重鎖可変領域を指すのに相互交換可能に使用される。
【0092】
いくつかの態様では、抗体の抗原結合断片はｓｃＦｖである。本明細書で使用されるとき、「単鎖可変断片」または「ｓｃＦｖ」という用語は、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）は直接連結される、またはＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と接続する、またはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と接続するペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、または２５アミノ酸）によって連結される。リンカーは、柔軟性のためにグリシンを豊富に含むことができ、同様に、溶解性のためにセリンまたはスレオニンを豊富に含むことができる。定常領域の除去とリンカーの導入にもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は元の免疫グロブリンの特異性を保持する。単鎖Ｆｖポリペプチド抗体は、ＶＨコード配列及びＶＬコード配列を含む核酸から発現させることができる。
【0093】
本明細書にて相互交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、任意の長さのヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重鎖のＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド、またはプリン塩基及びピリミジン塩基を含むポリマー、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている態様に適用できるように、一本鎖ポリヌクレオチド（例えば、センスまたはアンチセンス）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【0094】
「操作された抗原受容体」という用語は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または組換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のような、天然に存在しない抗原特異的受容体を指す。「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という用語は、当該技術分野における一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された、例えば、抗体（例えばｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含有する人工的に構築されたハイブリッドポリペプチドを指す。抗原結合ドメイン及びＴ細胞シグナル伝達ドメインはヒンジを介して連結することができる。「ＴＣＲ」は、当該技術分野における一般的な意味を有し、特定の標的を認識し、ＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含むタンパク質複合体を指す。
【0095】
「ヒンジ」または「ヒンジ領域」という用語は、隣接するポリペプチド領域に構造的柔軟性及び間隔を与える、柔軟な接続子領域、例えば、天然のまたは合成のポリペプチドを指す。
【0096】
「修飾された」という用語は、対応する未修飾の物質または化合物と比べて改変または変更されている物質または化合物（例えば、細胞、ポリヌクレオチド配列、及び／またはポリペプチド配列）を指す。
【0097】
核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される場合、本明細書で使用されるとき「天然に存在する」という用語は、自然界に見いだされる核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。例えば、自然界の供給源から単離することができ、且つ研究室にてヒトによって意図的に修飾されていない生物（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列は天然に存在する。
【0098】
「単離されている」ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は、自然界には見られない形態であるポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物である。単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物には、もはやそれらが自然界に見られる形態ではない程度まで精製されたものが含まれる。いくつかの態様では、単離されている抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、または組成物は実質的に純粋である。本明細書で使用されるとき、「実質的に純粋」とは、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）である物質を指す。したがって、「実質的に純粋」には、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である物質も含まれる。
【0099】
「生体内」という用語は、哺乳類対象の体内で起こる事象を指し、細胞培養物（哺乳類細胞培養物を含む）で起こる事象を指すものではない。
【0100】
「生体外」という用語は、哺乳類対象の体の外側、人工環境で起こる事象を指す。
【0101】
「試験管内」という用語は、試験システム内で起こる事象を指す。試験管内アッセイには、生細胞または死細胞が採用されてもよい細胞ベースのアッセイが含まれ、またインタクトの細胞が採用されない無細胞アッセイも含まれてもよい。
【0102】
本明細書で使用されるとき、「治療」とは有益なまたは所望の臨床成果を得るためのアプローチである。本明細書で使用されるとき、「治療」とはヒトを含む哺乳類における疾患に対する治療剤の投与または適用を対象とする。本開示の目的に関して、有益なまたは所望の臨床結果としては、１以上の症状の緩和、疾患の程度の減少、疾患の広がり（例えば、転移）の予防もしくは遅延、疾患の再発の予防もしくは遅延、疾患進行の遅延もしくは緩徐化、疾患状態の改善、疾患もしくは疾患の進行の阻害、疾患もしくはその進行の阻害もしくは緩徐化、その発症の阻止、及び寛解（部分的または全体的かどうかにかかわらず）、のうち１以上が挙げられるが、これらに限定されない。増殖性疾患の病理学的結果の低下も、「治療」に包含される。本明細書に記載されている方法は、治療のこれらの態様のうち任意の１以上を企図したものである。上記に沿って、治療という用語は障害の全ての態様を１００パーセント除去する必要はない。
【0103】
本明細書で使用されるとき、「遅延させること」は、疾患の発症または進行の延期、妨害、緩徐化、遅延、安定化、抑制及び／または先延ばしを意味する。この遅延は、治療されている病歴及び／または個体に応じて異なる期間であることができる。
【0104】
「治療上有効な量」の物質は、個体の疾患状態、年齢、性別、及び体重のような因子、ならびに個体における所望の反応を引き出す物質の能力によって変更される場合がある。治療上有効な量はまた、治療上有益な効果が、物質のいずれかの毒性または有害な影響にまさる量でもある。治療上有効な量は、１回以上の投与で送達され得る。治療有効量は、所望の治療効果を達成するのに必要な投与量及び期間での有効な量を指す。
【0105】
「予防有効量」は、所望の予防成果（例えば、感染または疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量及び期間での有効な量を指す。
【0106】
「低下する」または「減少する」とは、基準値と比べて特定の値の少なくとも５％、例えば５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％の低下での低下または減少を指す。
【0107】
「増加する」とは、基準値と比べて特定の値の少なくとも５％、例えば、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％以上の増加での特定の値における増加を指す。
【0108】
「投与する」、「投与すること」、「投与」などという用語は、生物作用の所望の部位への治療剤の送達を可能にするために使用することができる方法を指す。本明細書に記載されている薬剤及び方法と共に採用することができる投与技法は、例えば、Ｇｏｏｄｍａｎ ａｎｄ Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄ．；Ｐｅｒｇａｍｏｎ；ａｎｄ Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（ｃｕｒｒｅｎｔ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａに見いだすことができる。２以上の治療剤の投与には同時（同時発生）投与、及び任意の順序での連続的投与が含まれる。
【0109】
「個体」または「対象」という用語は、動物、例えば、ヒトのような哺乳類を指すのに本明細書では相互交換可能に使用される。場合によっては、ヒト、げっ歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳類実験用動物、哺乳類家畜動物、哺乳類スポーツ用動物、及び哺乳類のペットを含むが、これらに限定されない哺乳類を治療する方法が提供される。いくつかの例では、「個体」または「対象」とは、疾患または障害に対する治療を必要とする個体または対象を指す。場合によっては、治療を受ける対象は、対象が治療に関連する障害を有する、または障害に罹患する特定のリスクがあると特定されたことがあるという事実を示している患者であることができる。
【0110】
本開示の目的のために、治療に使用される制御性Ｔ細胞は、後に投与される対象（「自家細胞」）または別の個体（「同種異系細胞」）から単離することができる。本明細書で使用されるとき、「同種異系細胞」とは、ある対象（ドナー）から単離され、別の対象（レシピエントまたは宿主）に注入される細胞を指す。本明細書で使用されるとき、「自家細胞」とは、単離され、同じ対象（レシピエントまたは宿主）に注入して戻される細胞を指す。
【0111】
「医薬製剤」及び「医薬組成物」という用語は、有効成分（複数可）の生物活性が有効になるような形態であり、且つ製剤が投与されることになる対象にとって許容できない毒性である追加成分をまったく含有していない調製物を指す。そのような製剤は滅菌されてもよい。
【0112】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」という用語とは、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒト及び動物の組織と接触させて使用するのに適した、安全な医学的判断の範囲内にあり、妥当な利益／リスク比に見合う、化合物、材料、組成物及び／または製剤を指す。
【0113】
「薬学的に許容される担体」とは、患者への投与向けの「医薬組成物」を一緒に含む治療剤と共に用いるための、非毒性の固形物、半固形物もしくは液体充填材、希釈剤、カプセル化材料、製剤補助剤、または当該技術分野の従来の担体を指す。薬学的に許容される担体は、用いられる投薬量及び濃度でレシピエントに対して非毒性であり、製剤の他の成分と相溶性がある。薬学的に許容される担体は、用いられる製剤に適切なものである。
【0114】
「滅菌」製剤は、無菌である、または生きている微生物及びそれらの胞子を実質的に含まない。
【0115】
分子生化学及び細胞生化学の一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９６）；Ｎｏｎｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｖｉｒａｌ Ｖｅｃｔｏｒｓ （Ｋａｐｌｉｆｔ ＆ Ｌｏｅｗｙ ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９５）；Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ，（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，１９９７）；ａｎｄ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ ＆ Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９８）のような標準的な教科書に見いだすことができる。
【0116】
Ｔｒｅｇ及びＴｒｅｇ集団
転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）を発現するＴｒｅｇは免疫系にて天然に存在する。したがって、本明細書で提供されているいくつかの態様では、ＴｒｅｇはＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。転写因子Ｈｅｌｉｏｓも、免疫系にて天然に存在する多くのＴｒｅｇで発現される。したがって、本明細書で提供されているいくつかの態様では、ＴｒｅｇはＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋またはＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。
転写因子フォークヘッドボックスＰ３（ＦｏｘＰ３）を発現するＴｒｅｇは免疫系にて天然に存在する。したがって、本明細書で提供されているいくつかの態様では、ＴｒｅｇはＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。転写因子Ｈｅｌｉｏｓも、免疫系にて天然に存在する多くのＴｒｅｇで発現される。したがって、本明細書で提供されているいくつかの態様では、ＴｒｅｇはＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋またはＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。
【0117】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは完全に脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ）を有する。
【0118】
ＦｏｘＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、及びＴＳＤＲの脱メチル化は細胞内のＴｒｅｇマーカーである。しかしながら、ＣＤ２５ｈｉ（高分子密度）及びＣＤ１２７ｌｏ（低分子密度）を含む細胞表面マーカーもＴｒｅｇのマーカーとして機能し、例えば、フローサイトメトリーを使用してＴｒｅｇを特定するのに使用することができる。したがって、いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋Ｔ細胞である。いくつかの態では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＴ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【0119】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【0120】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞である。
【0121】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５＋ＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。
【0122】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔ細胞である。
【0123】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、ＳＯＣＳ、ＰＤ－１、ＣＬＴＡ４、ニューロピリン、ＴＲＡＩＬ、及び／またはＧＩＴＲを発現する。
【0124】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＩＬ－１０及び／またはＴＧＦβを発現する。
【0125】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはヒトＴｒｅｇである。
【0126】
活性化された細胞は、前方散乱（ＦＳＣ）プロファイルに基づいて特徴付けることができる。細胞の相対的なサイズに比例するＦＳＣ値が高いほど、活性化が大きいことを示す。本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇの細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）は、従来の方法に従って生成されるＴｒｅｇ、例えば６日間（約１４４時間）連続で刺激したＴｒｅｇよりも小さい可能性がある。（例えば、実施例３を参照のこと）。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇの０．７５倍未満である相対的な細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇの０．８倍未満の相対的な細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇの０．７５倍未満の相対的な細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。
【0127】
Ｔｒｅｇ集団も本明細書で提供されている。いくつかの態様では、集団は少なくとも１×１０３個の細胞、少なくとも１×１０４個の細胞、少なくとも１×１０５個の細胞、少なくとも１×１０６個の細胞、少なくとも１×１０７個の細胞、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、または少なくとも１×１０１０個の細胞を含む。いくつかの態様では、集団は少なくとも１×１０３個のＴｒｅｇ、少なくとも１×１０４個のＴｒｅｇ、少なくとも １×１０５個のＴｒｅｇ、少なくとも１×１０６個のＴｒｅｇ、少なくとも１×１０７個のＴｒｅｇ、少なくとも１×１０８個のＴｒｅｇ、少なくとも１×１０９個のＴｒｅｇ、または少なくとも１×１０１０個のＴｒｅｇを含む。
【0128】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも６０％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７０％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７５％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８０％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８５％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９０％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９５％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９６％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９７％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９８％がＴｒｅｇである。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９９％がＴｒｅｇである。
【0129】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の１％未満がエフェクターＴ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の２％未満がエフェクターＴ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の３％未満がエフェクターＴ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の４％未満がエフェクターＴ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の５％未満がエフェクターＴ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の１０％未満がエフェクターＴ細胞である。
【0130】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の１％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の２％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の３％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の４％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の５％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇ集団における細胞の１０％未満がＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。集団内のＣＤ２５－ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である細胞の割合はフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【0131】
いくつかの態様では、提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の０．７５倍未満である平均相対細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の０．８倍未満である平均相対的な細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の０．７５倍未満である相対的な細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）を有する。
【0132】
本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団におけるＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの比率は、従来の方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団、例えば、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団よりも少なくてもよい。（例えば、実施例７を参照のこと）。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも１．５倍の割合のＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも２倍の割合のＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の１．５～３倍の割合のＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の１．５～２．５倍の割合のＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を有することができる。Ｔｒｅｇ集団におけるＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇの割合はフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【0133】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも５０％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも６０％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７０％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７５％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８０％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８５％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９０％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９５％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９６％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９７％はＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９８％はＨｅｌｉｏｓを発現する。Ｈｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇ集団における細胞の割合はフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【0134】
いくつかの態様では、Ｈｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇの割合は、本明細書で提供されている方法に従ってＴｒｅｇを増殖させる場合（及び任意で遺伝子操作される場合）、５０％を超えて減少しない。いくつかの態様では、Ｈｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇの割合は、本明細書で提供されている方法に従ってＴｒｅｇを増殖させる場合（及び任意で遺伝子操作される場合）、４０％を超えて減少しない。いくつかの態様では、Ｈｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇの割合は、本明細書で提供されている方法に従ってＴｒｅｇを増殖させる場合（及び任意で遺伝子操作される場合）、３０％を超えて減少しない。いくつかの態様では、Ｈｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇの割合は、本明細書で提供されている方法に従ってＴｒｅｇを増殖させる場合（及び任意で遺伝子操作される場合）、２５％を超えて減少しない。
【0135】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも６０％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７０％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７５％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８０％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８５％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９０％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９５％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９６％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９７％はＦｏｘＰ３を発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９８％はＦｏｘＰ３を発現する。ＦＯＸＰ３を発現するＴｒｅｇ集団における細胞の割合はフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【0136】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも５０％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも６０％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７０％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも７５％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８０％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも８５％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９０％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９５％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９６％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９７％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法によって生成されるＴｒｅｇ集団における細胞の少なくとも９８％はＦｏｘＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現する。ＦＯＸＰ３及びＨｅｌｉｏｓを発現するＴｒｅｇ集団における細胞の割合はフローサイトメトリーを使用して決定することができる。
【0137】
本明細書で実証されているように、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、従来の方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団、例えば、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団と比べてエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を抑制する高い能力を有することができる。（例えば、実施例８を参照のこと）
【0138】
Ｔｒｅｇ集団がＴｅｆｆの増殖を抑制する能力は、例えば、本明細書の実施例１に提供されているような試験管内抑制アッセイを使用して決定することができる。Ｔｒｅｇ集団がＴｅｆｆの増殖を抑制する能力は試験管内で検出することができる。
【0139】
本明細書で提供されている一態様では、Ｔｅｆｆの増殖を抑制するＴｒｅｇ集団の能力は、以下のアッセイ（ｉ）一晩静置したＴｒｅｇを１０μｌ／ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／２８／２四量体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｔ＃１０９７０））及びＩＬ－２（３００単位／ｍＬ）を含有するＴｒｅｇ培地中で刺激することと、（ｉｉ）Ｔｒｅｇ を洗浄して四量体及びＩＬ－２を取り除くことと、（ｉｉｉ）Ｔｒｅｇ培地にＴｒｅｇを再浮遊させることと、（ｉｖ）Ｔｒｅｇを細胞トレースバイオレット（ＣＴＶ）で標識したＰＢＭＣと混合すること（例えば、１：１～１：１６の比率で）と、（ｖ）０．１ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔＣＤ３／２８／２四量体（３μｌ／ｍＬ）を４日間（約９６時間）添加することと、（ｖｉ）ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８について細胞を染色することとを使用して決定される。Ｔｒｅｇの非存在下と比べてＴｒｅｇの存在下でＣＤ４＋またはＣＤ８＋エフェクターＴ細胞からのＣＴＶシグナルが低いことは、ＴｒｅｇがＴｅｆｆの増殖を抑制することを示している。
【0140】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも２倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも３倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも４倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも５倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも６倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも７倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の少なくとも８倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。
【0141】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の約２～約１０倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の約４～約１０倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇ集団は、６日間（約１４４時間）連続して刺激したＴｒｅｇ集団の約６～約１０倍のＴｅｆｆの増殖を抑制する能力を有することができる。
【0142】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている方法の工程（例えば、すべての刺激工程、すべての休止工程、及び存在する場合にはすべての編集工程）は、３０日未満、または２９日未満、または２８日未満、または２７日未満、または２６日未満、または２５日未満、または２４日未満、または２３日未満、または２２日未満、または２１日未満、または２０日未満、または１９日未満、または１８日未満、または１７日未満、または１６日未満、または１４日未満で、または１４日未満で、または１４日～３０日の間、または１４日～２５日の間、または１５日～２８日、または１５日～２５日の間で完了する。
【0143】
Ｔｒｅｇの刺激
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇ集団を増殖させる方法は、Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で培養する刺激工程を含むことができる。刺激工程は刺激したＴｒｅｇ集団を生成することができる。
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇ集団を増殖させる方法は、Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の存在下で培養する刺激工程を含むことができる。刺激工程は刺激したＴｒｅｇ集団を生成することができる。
【0144】
本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも４０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも５０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも６０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも７０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも８０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９０％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９５％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９６％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９７％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９８％が活性化される。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）の少なくとも９９％が活性化される。
【0145】
個々の刺激工程の間中、Ｔｒｅｇは刺激剤の存在下で途切れることなく培養される。いくつかの態様では、個々の刺激工程は（刺激工程の開始時に）Ｔｒｅｇ培養物への刺激剤の単回添加を含むので、刺激剤の濃度は刺激工程全体を通して変化（例えば、減少）することができる。いくつかの態様では、個々の刺激工程は所望の濃度の刺激剤を維持するために、Ｔｒｅｇ培養物に刺激剤を繰り返し添加することを含む。
【0146】
本明細書で提供されているいくつかの方法は刺激工程から始まる。刺激工程はまた、休止工程の後に行うこともでき、及び／または休止工程の前に行うこともできる。いくつかの態様では、刺激工程は２回の休止工程の間に存在する。
【0147】
刺激剤は、抗原非特異的刺激因子（例えば、抗ＣＤ３抗体）または抗原特異的刺激因子、例えば、ＭＨＣペプチド多量体であることができる。いくつかの態様では、刺激剤は、例えば、ＴＣＲに結合することによってＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体を活性化する。いくつかの態様では、刺激剤は、例えば、ＣＤ２８に結合することによってＴｒｅｇ上のＣＤ２８を活性化する。いくつかの態様では、刺激剤は、例えば、ＴＣＲ及びＣＤ２８に結合することによってＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及びＣＤ２８を活性化する。いくつかの態様では、刺激剤はＰＨＡまたはＣｏｎＡのような分裂促進因子である。
【0148】
いくつかの態様では、刺激剤は抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、刺激剤は抗体複合体である。いくつかの態様では、刺激剤は四量体抗体複合体である。いくつかの態様では、四量体抗体複合体はＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ２に特異的に結合する。いくつかの態様では、四量体抗体複合体はＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する。ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する例示的な四量体抗体複合体は、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／２８／２四量体としてＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９７０から入手可能である。
【0149】
いくつかの態様では、四量体抗体複合体は少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【0150】
いくつかの態様では、刺激剤は抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片である。いくつかの態様では、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片はＯＫＴ３である。そのような刺激剤は少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
【0151】
「抗ＣＤ３抗体」という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体におけるＣＤ３受容体に対するヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、及びマウス抗体を含む、抗体、例えばモノクローナル抗体を指す。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ－３が含まれる。抗ＣＤ３抗体には、Ｔ３及びＣＤ３ｃとしても知られるＵＨＣＴ１クローンも含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリズマブ、テプリズマブ、及びビシリズマブが挙げられる。
【0152】
「ＯＫＴ－３」抗体（本明細書では「ＯＫＴ３」とも呼ぶ）は、例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡからＯＫＴ－３ ３０ｎｇ／ｍＬ、ＭＡＣＳ ＧＭＰ ＣＤ３ ｐｕｒｅとして市販されている。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１及び配列番号２に示す。
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＧＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＡＤＴＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号２）
ＱＶＱＬＱＱＳＧＡＥＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＲＹＴＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＹＩＮＰＳＲＧＹＴＮＹＮＱＫＦＫＤＫＡＴＬＴＴＤＫＳＳＳＴＡＹＭＱＬＳＳＬＴＳＥＤＳＡＶＹＹＣＡＲＹＹＤＤＨＹＣＬＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＡＫＴＴＡＰＳＶＹＰＬＡＰＶＣＧＧＴＴＧＳＳＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＦＰＥＰＶＴＬＴＷＮＳＧＳＬＳＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＤＬＹＴＬＳＳＳＶＴＶＴＳＳＴＷＰＳＱＳＩＴＣＮＶＡＨＰＡＳＳＴＫＶＤＫＫＩＥＰＲＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１）
ＱＩＶＬＴＱＳＰＡＩＭＳＡＳＰＧＥＫＶＴＭＴＣＳＡＳＳＳＶＳＹＭＮＷＹＱＱＫＳＧＴＳＰＫＲＷＩＹＤＴＳＫＬＡＳＧＶＰＡＨＦＲＧＳＧＳＧＴＳＹＳＬＴＩＳＧＭＥＡＥＤＡＡＴＹＹＣＱＱＷＳＳＮＰＦＴＦＧＳＧＴＫＬＥＩＮＲＡＤＴＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ（配列番号２）
【0153】
いくつかの態様では、刺激剤は抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片である。そのような刺激剤は少なくとも０．５ｎｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
【0154】
刺激剤は細胞またはビーズのような基材上に存在することができる。ビーズは、プラスチック、ガラス、またはその他の好適な材料であることができ、通常、１～２０ミクロンの範囲である。いくつかの態様では、ビーズは常磁性ビーズである。いくつかの態様では、ビーズは超磁性ビーズである。したがって、例えば、刺激剤は抗ＣＤ３コーティングされた超磁性ビーズ及び／または抗ＣＤ２８コーティングされた超磁性ビーズであることができる。そのような刺激剤は、例えば、約５μｇ／ｍｌまたは約１０μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。そのような刺激剤は、例えば、約２．５μｇ／ｍｌ～約１５μｇ／ｍｌの濃度で存在することができる。
【0155】
基質としての使用に好適な細胞には、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）が挙げられる。
【0156】
いくつかの態様では、刺激剤は抗原提示細胞（ＡＰＣ）または人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）である。ａＡＰＣは照射されたａＡＰＣであることができる。
【0157】
いくつかの態様では、刺激剤はビーズ上にない。
【0158】
いくつかの態様では、刺激剤は、ＣＤ３、ＣＤ２８、及び／またはＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体、抗ＣＤ３抗体またはその抗原結合断片、抗ＣＤ２８抗体またはその抗原結合断片、及び／または抗原提示細胞または人工抗原提示細胞である。
【0159】
いくつかの態様では、刺激剤は、Ｔｒｅｇ増殖を、例えば、７２時間以内に少なくとも１．５倍増やすのに十分な濃度で存在する。いくつかの態様では、刺激剤は、Ｔｒｅｇ増殖を、例えば、７２時間以内に少なくとも２倍増やすのに十分な濃度で存在する。いくつかの態様では、刺激剤は、Ｔｒｅｇ増殖を、例えば、７２時間以内に少なくとも３倍増やすのに十分な濃度で存在する。Ｔｒｅｇ の増殖は、ＡＴＰの定量に基づいて培養物にて代謝活性がある生細胞の数を決定するＣｅｌｌ Ｔｉｔｅｒ Ｇｌｏ（登録商標）のような発光細胞生存率アッセイを使用して測定することができる。
【0160】
いくつかの態様では、刺激剤は、試験管内で培養されたＴ細胞の活性化状態の一般的に使用される指標である、細胞の前方散乱（ＦＳＣ）プロファイルを増加させるのに十分な濃度で存在する。
【0161】
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇ集団を増殖させる方法は複数の刺激工程を含むことができる。そのような態様では、刺激工程は同じ刺激剤を使用することができ、または刺激工程は異なる刺激剤を使用することができる。複数の刺激工程が同じ刺激剤を使用する場合、刺激剤は同じ濃度の刺激剤を使用することができ、または異なる濃度の刺激剤を使用することができる。刺激剤は、単一の刺激工程が２つの刺激剤の使用を（同時に及び／または連続的に）含むことができるように、組み合わせて使用することができる。したがって、いくつかの態様では、刺激剤はＣＤ３及びＣＤ２８でコーティングされた超磁性ビーズである。
【0162】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は２つの刺激工程（休止工程によって分離される）を含む。本明細書で提供されている方法は少なくとも２つの刺激工程（休止工程によってそれぞれ分離される）を含む。本明細書で提供されている方法は少なくとも３つの刺激工程（休止工程によって分離される）を含む。
【0163】
いくつかの態様では、刺激工程は少なくとも１日（約２４時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は少なくとも２日（約４８時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は少なくとも３日（約７２時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は少なくとも４日（約９６時間）である。
【0164】
いくつかの態様では、刺激工程は約１日（約２４時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約２日（約４８時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約３日（約７２時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約４日（約９６時間）である。
【0165】
いくつかの態様では、刺激工程は約１日（約２４時間）～約５日（約１２０時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約１日（約２４時間）～約４日（約９６時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約１日（約２４時間）～約３日（約７２時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約２日（約４８時間）～約４日（約９６時間）である。いくつかの態様では、刺激工程は約３日（約７２時間）～約４日（約９６時間）である。
【0166】
日によっては、刺激工程は６日（約１４４時間）を超えない、または５日（約１２０時間）を超えない。
【0167】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は少なくとも２つ（例えば、２つ）の刺激工程（休止工程によってそれぞれ分離される）を含み、その際、第１の刺激工程は第２の刺激工程よりも長い。いくつかの態様では、第１の刺激工程は、第２の刺激工程より、少なくとも約１２時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３６時間、少なくとも約４８時間、少なくとも約６０時間、または少なくとも約７２時間長い。第１の刺激工程は、例えば、約１日（約２４時間）～約４日（約９６時間）であることができ、第２の刺激工程は、例えば、約１日（約２４時間）～約３日（約７２時間）であることができる。いくつかの態様では、第１の刺激工程は約３日（約７２時間）であり、第２の刺激工程は約２日（約４８時間）である。
【0168】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法はＴｒｅｇを遺伝子操作する前に、少なくとも１回の刺激工程を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、Ｔｒｅｇを遺伝子操作する前に、少なくとも２回の刺激工程（それぞれ休止工程によって分離される）を含む。
【0169】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、Ｔｒｅｇを遺伝子操作した後に、少なくとも１回の刺激工程を含む。
【0170】
Ｔｒｅｇを休止させること
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇ集団を増殖させる方法は、Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養する休止工程を含むことができる。休止工程は休止させたＴｒｅｇ集団を生成することができる。本明細書で使用されるとき、休止とは刺激剤が存在しないことを指す（且つ、例えば、細胞の成長、分裂、増殖、またはＴｒｅｇの他の活性が存在しないことを指すものではない）。
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇ集団を増殖させる方法は、Ｔｒｅｇ集団を刺激剤の非存在下で培養する休止工程を含むことができる。休止工程は休止させたＴｒｅｇ集団を生成することができる。本明細書で使用されるとき、休止とは刺激剤が存在しないことを指す（且つ、例えば、細胞の成長、分裂、増殖、またはＴｒｅｇの他の活性が存在しないことを指すものではない）。
【0171】
本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の非存在下で培養されたＴｒｅｇ集団におけるＴｒｅｇの有意な部分は活性があるＴ細胞受容体、及び／またはＣＤ２８またはＧＩＴＲのような共刺激分子を含まない。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）のわずか２０％しか活性化されない。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）のわずか１５％しか活性化されない。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）のわずか１０％しか活性化されない。本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇ集団を培養すると、集団におけるＴｒｅｇ上のＴ細胞受容体及び／または共刺激分子（例えば、ＣＤ２８またはＧＩＴＲ）のわずか５％しか活性化されない。
【0172】
当業者は、Ｔｒｅｇ集団が刺激剤の非存在下で培養されているかどうかを決定するための方法を知っているであろう。例えば、刺激剤の除去／非存在は、当業者に既知の方法を使用して、例えば、細胞サイズ及び／または粒度の変化を決定することによって、Ｔｒｅｇ活性化マーカーの下方調節を決定することによって、及び／または免疫抑制性サイトカイン産生の下方調節によって定量されてもよい。
【0173】
いくつかの態様では、刺激剤の非存在は細胞サイズ及び／または粒度の変化を決定することによって決定される。いくつかの態様では、細胞サイズ及び／または粒度の変化はフローサイトメーター（すなわち、ＦＳＣ／ＳＳＣ測定）を使用して測定される。本明細書で言及されているように、活性化された細胞はその前方散乱（ＦＳＣ）プロファイルに基づいて特徴付けることができる。いくつかの態様では、刺激剤を除去する前のＴｒｅｇ集団の細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）と比べて、刺激剤の非存在下では、Ｔｒｅｇ集団の細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）は、約４０％未満、または約５０％未満、または約６０％未満、または約７０％未満、または約７５％未満、または約８０％未満、または約９０％未満、またはそれ以下である。いくつかの態様では、刺激剤の非存在下でのＴｒｅｇ集団の細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）は、刺激剤の除去後約１２時間、または約１８時間、または約２４時間、または約３６時間、または約４８時間、または約７２時間で決定される。いくつかの態様では、刺激剤の除去前のＴｒｅｇ集団の細胞サイズ（ＦＳＣ－Ａ）は、刺激剤の除去前の約２時間、約１時間、約３０分、約１５分、またはそれ未満の時点で決定される。
【0174】
刺激剤の非存在を決定するための他の非限定的な例には、Ｔｒｅｇ活性化マーカー（例えば、ＦｏｘＰ３、Ｈｅｌｉｏｓ、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ－ＤＲ）の下方調節を決定すること、及び／または免疫抑制性サイトカイン産生（例えば、ＩＬ－１０、ＴＧＦｂ）の下方調節を決定することが挙げられる。いくつかの態様では、刺激剤を除去する前のＴｒｅｇ集団のＴｒｅｇ活性化マーカーの発現及び／または免疫抑制性サイトカインの産生と比べて、刺激剤の非存在下では、Ｔｒｅｇ活性化マーカーの発現及び／または免疫抑制性サイトカインの産生は、約４０％未満、または約５０％未満、または約６０％未満、または約７０％未満、または約７５％未満、または約８０％未満、または約９０％未満、またはそれ以下である。いくつかの態様では、刺激剤の非存在下でのＴｒｅｇ集団のＴｒｅｇ活性化マーカーの発現及び／または免疫抑制性サイトカインの産生は、刺激剤の除去後約１２時間、または約１８時間、または約２４時間、または約３６時間、または約４８時間、または約７２時間で決定される。いくつかの態様では、刺激剤の除去前のＴｒｅｇ集団のＴｒｅｇ活性化マーカーの発現及び／または免疫抑制性サイトカインの産生は、刺激剤の除去前の約２時間、約１時間、約３０分、約１５分、またはそれ未満の時点で決定される。
【0175】
休止工程はＴｒｅｇ培養物から刺激剤を除去することによって開始することができる。刺激剤は、例えば、洗浄工程及び／または遠心分離工程によって除去することができる。本明細書で実証されているように、例えば、２日（約４８時間）、または３日（約７２時間）、または４日（約９６時間）、またはそれ以上の刺激後、休止工程のための刺激を除去すると、Ｔｒｅｇの増殖に改善がもたらされ得る。
【0176】
いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも２５％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも５０％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも６０％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも７０％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも８０％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９０％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９１％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９２％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９３％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９４％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９５％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９６％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９７％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９８％減らす。いくつかの態様では、刺激剤の濃度は、刺激工程に存在する刺激剤の濃度と比べて休止工程にて少なくとも９９％減らす。いくつかの態様では、休止工程では刺激剤は存在しない、すなわち、Ｔｒｅｇはどんな刺激剤も含まずに培養される。本明細書で提供されているいくつかの方法は休止工程から始まる。休止工程 は刺激工程の後に行うこともでき、及び／または刺激工程の前に行うことができる。いくつかの態様では、休止工程は２回の刺激工程の間に存在する。
【0177】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は少なくとも１回の休止工程を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は少なくとも２回の休止工程を含む。
【0178】
いくつかの態様では、休止工程は少なくとも１日（約２４時間）である。
【0179】
いくつかの態様では、休止工程は少なくとも２日（約４８時間）である。
【0180】
いくつかの態様では、休止工程は約３日（約７２時間）である。
【0181】
いくつかの態様では、休止工程は約４日（約９６時間）である。
【0182】
いくつかの態様では、休止工程は約５日（約１２０時間）である。
【0183】
いくつかの態様では、休止工程は約１日（約２４時間）～約５日（約１２０時間）である。いくつかの態様では、休止工程は約１日（約２４時間）～約４日（約９６時間）である。いくつかの態様では、休止工程は約１日（約２４時間）～約３日（約７２時間）である。いくつかの態様では、休止工程は約２日（約４８時間）～約４日（約９６時間）である。いくつかの態様では、休止工程は約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）である。いくつかの態様では、休止工程は約３日（約７２時間）～約４日（約９６時間）である。
【0184】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、Ｔｒｅｇを遺伝子操作する前に、少なくとも１回の休止工程を含む。本明細書で使用されるとき、遺伝子操作「前」の休止工程は、遺伝子操作の直前に休止工程が行われることを必要としない。したがって、刺激工程、次に休止工程、その後刺激工程、次いで遺伝子操作を含む方法は、遺伝子操作の前に休止工程を含む方法である。
【0185】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法はＴｒｅｇを遺伝子操作した後に、少なくとも１回の休止工程を含む。
【0186】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法はＴｒｅｇを遺伝子操作した後に休止工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇを遺伝子操作し、その後、遺伝子操作と休止工程との間に刺激工程を含まずに休止させる。
【0187】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、（ｉ）Ｔｒｅｇが遺伝子操作される前の少なくとも１回の休止工程、及び（ｉｉ）Ｔｒｅｇが遺伝子操作された後、例えば、Ｔｒｅｇが再び刺激される前に少なくとも１回の休止工程を含む。
【0188】
Ｔｒｅｇの増殖
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇを増殖させる方法は、Ｔｒｅｇを刺激することとＴｒｅｇを休止させることとの交互の期間、または「不連続刺激」を含むことができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は少なくとも１回の刺激工程と少なくとも１回の休止工程とを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は休止工程によって分離される少なくとも２回の刺激工程を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法はそれぞれ休止工程によって分離される少なくとも３回の刺激工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、例えば、休止工程の間に遺伝子操作することができる（本明細書の他の場所で考察されているように）（すなわち、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇを遺伝子操作することができる）。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は遺伝子操作を含まない。
本明細書で提供されているように、Ｔｒｅｇを増殖させる方法は、Ｔｒｅｇを刺激することとＴｒｅｇを休止させることとの交互の期間、または「不連続刺激」を含むことができる。したがって、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は少なくとも１回の刺激工程と少なくとも１回の休止工程とを含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は休止工程によって分離される少なくとも２回の刺激工程を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法はそれぞれ休止工程によって分離される少なくとも３回の刺激工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、例えば、休止工程の間に遺伝子操作することができる（本明細書の他の場所で考察されているように）（すなわち、刺激剤の非存在下でＴｒｅｇを遺伝子操作することができる）。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は遺伝子操作を含まない。
【0189】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、第１の刺激工程、続いて第１の休止工程、その後に第２の刺激工程、その後に第２の休止工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは第２の休止工程の後に回収される。
【0190】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、第１の刺激工程、続いて第１の休止工程、その後に第２の刺激工程、その後に第２の休止工程、その後に第３の刺激工程、その後に第３の休止工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは第３の休止工程の後に回収される。
【0191】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、第１の刺激工程、続いて第１の休止工程、その後に第２の刺激工程、その後、その間にＴｒｅｇが遺伝子操作される第２の休止工程、その後に第３の刺激工程、その後に第３の休止工程を含む。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは第３の休止工程の後に回収される。
【0192】
刺激工程及び休止工程の時間の非限定的な例が本明細書に記載されている。非限定的な態様では、第１の刺激工程は約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）（例えば、約３日（約７２時間））であることができ；第１の休止工程は約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）（例えば、約３日（約７２時間））であることができ；第２の刺激工程は、約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）（例えば、約２日（約４８時間））であることができ；第２の休止工程は、約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）（例えば、約３日（約７２時間））であることができ；第３の刺激工程は、約２日（約４８時間）～約５日（約７２時間）（例えば、約２日（約４８時間））であることができ；且つ第３の休止工程は約２日（約４８時間）～約５日（約１２０時間）（例えば、約２日（約４８時間））であることができる。休止工程と刺激工程の時間の非限定的な例を表Ａに提供する。
【表1】
【0193】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは凍結保存される。
【0194】
本明細書で提供されているように、ＴｒｅｇはＴｒｅｇに好適な培地にて培養することができる。例示的なＴ細胞培地は、例えば、（ｉ）１０％ヒト非働化血清を補充したＸ－ＶＩＶＯ１５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ，Ｃａｔ＃０４－４１８Ｑ）、（ｉｉ）５ｍＭのＨＥＰＥＳ、２ｍＭのＬ－グルアミン、５０ｍｇ／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、５ｍＭ非必須アミノ酸、５ｍＭピルビン酸ナトリウム、及び１０％ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０培地、または（ｉｉｉ）１０％熱非働化ウシ胎児血清（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、非必須アミノ酸、０．５ｍＭのピルビン酸ナトリウム、５ｍＭのＨｅｐｅｓ、１ｍＭのｇｌｕｔａＭａｘＩ、及び５５μＭのβ－メルカプトエタノールを含むＤＭＥＭベースを含むことができる。
【0195】
Ｔｒｅｇ培養培地はさらに、例えば、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）、及び／またはインターロイキン－７（ＩＬ－７）のようなインターロイキンのようなサイトカインを含むことができる。
【0196】
「ＩＬ－２」（または「ＩＬ２」）という用語は、インターロイキン－２として知られるサイトカイン及びＴ細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳類の形態、保存的アミノ酸置換がある形態、それらのグリコフォーム、バイオ後続品、及び変異体を含むＩＬ－２のすべての形態が含まれる。ＩＬ－２は、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００４，１７２，３９８３－８８及びＭａｌｅｋ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００８，２６，４５３－７９に記載されており、その開示全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＩＬ－２ という用語は、アルデスロイキン（ＰＲＯＬＥＵＫＩＮ、使い捨てバイアルあたり２，２００万ＩＵで複数の供給業者から市販されている）のようなＩＬ－２のヒト組換え型、と同様にＣｅｌｌＧｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｐｏｒｔｓｍｏｕｔｈ，Ｎ．Ｈ．，ＵＳＡ（ＣＥＬＬＧＲＯ ＧＭＰ）またはＰｒｏＳｐｅｃ－Ｔａｎｙ ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ Ｌｔｄ．，Ｅａｓｔ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，Ｎ．Ｊ．，ＵＳＡ（Ｃａｔ．Ｎｏ．ＣＹＴ－２０９－ｂ）によって商業的に供給されている組換え型ＩＬ－２、及び他の供給業者の他の市販同等品を包含する。アルデスロイキン（デスアラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は分子量約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ－２である。ＩＬ－２という用語はまた、Ｎｅｋｔａｒ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｓｏｕｔｈ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡから入手可能なＰＥＧ化ＩＬ－２プロドラッグＮＫＴＲ－２１４を含む、ＩＬ－２のＰＥＧ化形態も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ－２１４及びペグ化ＩＬ－２は、米国特許出願公開第ＵＳ２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際特許出願公開第ＷＯ２０１２／０６５０８６Ａ１号に記載されており、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適な結合型ＩＬ－２の別の形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号、及び同第４，９０２，５０２号に記載されており、これらの開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。本発明での使用に好適なＩＬ－２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ヒトＩＬ２遺伝子はＮＣＢＩ Ｇｅｎｅ ＩＤ ３５５８によって特定されている。ヒトＩＬ２遺伝子の例示的なヌクレオチド配列はＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１６７７９．１である。
【0197】
本明細書での使用に好適な組換えヒトＩＬ－２のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＭＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３）。
ＭＡＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＣＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号３）。
【0198】
アルデスロイキン（デスアラニル－１、セリン－１２５ヒトＩＬ－２）は分子量約１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ－２である。本明細書で提供されている方法での使用に好適なアルデスロイキンのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４）。
ＰＴＳＳＳＴＫＫＴＱＬＱＬＥＨＬＬＬＤＬＱＭＩＬＮＧＩＮＮＹＫＮＰＫＬＴＲＭＬＴＦＫＦＹＭＰＫＫＡＴＥＬＫＨＬＱＣＬＥＥＥＬＫＰＬＥＥＶＬＮＬＡＱＳＫＮＦＨＬＲＰＲＤＬＩＳＮＩＮＶＩＶＬＥＬＫＧＳＥＴＴＦＭＣＥＹＡＤＥＴＡＴＩＶＥＦＬＮＲＷＩＴＦＳＱＳＩＩＳＴＬＴ（配列番号４）。
【0199】
インターロイキン２（ＩＬ－２）は免疫系におけるサイトカインシグナル伝達分子の一種であり、免疫を担当する白血球（白血球、多くの場合はリンパ球）の活性を調節する１５．５～１６ｋＤａのタンパク質であることが報告されている。ＩＬ－２は、微生物感染に対する生体の自然な反応の一部であり、リンパ球によって発現されるＩＬ－２受容体に結合することによってその効果に介在すると理解されている。ＩＬ－２の主な供給源は活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞と活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【0200】
ＩＬ－２は、主にＴ細胞に対する直接的な影響を介して、免疫系、寛容、及び免疫の重要な機能にて本質的な役割を担っていると考えられている。Ｔ細胞が成熟する胸腺では、特定の未熟Ｔ細胞の、体内の正常な健康な細胞を攻撃する準備ができている他のＴ細胞を抑制する制御性Ｔ細胞への分化を促進することによってＩＬ－２は自己免疫疾患を防止する。ＩＬ－２は活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を増強する。また、ＩＬ－２は、最初のＴ細胞が抗原によって刺激された場合、Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞に分化するのを促進するので、生体が感染症を撃退するのを助ける。ＩＬ－２は他の極性サイトカインと一緒に、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のＴｈ１リンパ球及びＴｈ２リンパ球への分化を刺激する一方で、Ｔｈ１７リンパ球及び濾胞性Ｔｈリンパ球への分化を妨げる。その発現及び分泌は厳密に調節されており、免疫応答の増強及び抑制における一時的な正及び負のフィードバックループ双方の一部として機能する。抗原によって選択されたＴ細胞クローンの数と機能の拡大に依存するＴ細胞免疫記憶の発達における役割を通して、ＩＬ－２は細胞性免疫の持続にて役割を担う。
【0201】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇはインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の存在下で培養される。インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）は、組換えインターロイキン（例えば、ＩＬ－２）であることができる。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は少なくとも４００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は少なくとも５００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は少なくとも５５０単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は少なくとも６００単位／ｍＬである。
【0202】
いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は１，０００単位／ｍＬ以下である。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は９００単位／ｍＬ以下である。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は８００単位／ｍＬ以下である。
【0203】
いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約２００単位／ｍＬ～約２，５００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５００単位／ｍＬ～約１，０００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５００単位／ｍＬ～約９００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５００単位／ｍＬ～約８００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５５０単位／ｍＬ～約１，０００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５５０単位／ｍＬ～約９００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約５５０単位／ｍＬ～約８００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約６００単位／ｍＬ～約１，０００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約６００単位／ｍＬ～約９００単位／ｍＬである。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度は約６００単位／ｍＬ～約８００単位／ｍＬである。
【0204】
インターロイキン（ＩＬ－２など）の濃度は、ここで提供される方法中に変更することができる。例えば、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）の濃度を低下させることができる。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）は約８００単位／ｍＬの濃度で存在し、次いで約３００単位／ｍＬの濃度に低下させる。いくつかの態様では、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２）は約８００単位／ｍＬの濃度で約７日間（約１６８時間）存在し、次いで約３００単位／ｍＬで存在する。
【0205】
「ＩＬ－７」（本明細書では「ＩＬ７」とも呼ばれる）という用語は、骨髄及び胸腺の間質細胞によって分泌されるサイトカインである。また、それは角化細胞、樹状細胞、肝細胞、ニューロン、及び上皮細胞によっても産生されるが、通常のリンパ球によっては産生されない。ＩＬ－７は多分化能（多分化能）造血幹細胞のリンパ前駆細胞への分化を刺激する（ＩＬ－３によって分化が刺激される骨髄前駆細胞とは対照的に）。ＩＬ－７はリンパ系列（Ｂ細胞、Ｔ細胞、ＮＫ細胞）のすべての細胞の増殖を刺激することが報告されている。それは、Ｂ細胞の成熟、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の生存、発生、及び恒常性の特定の段階での増殖に重要であると考えられている。ヒトＩＬ７遺伝子のヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩ参照配列：ＡＨ００６９０６．２である。本明細書で提供されている方法での使用に好適な組換えヒトＩＬ－７のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＭＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ（配列番号５）。
ＭＤＣＤＩＥＧＫＤＧＫＱＹＥＳＶＬＭＶＳＩＤＱＬＬＤＳＭＫＥＩＧＳＮＣＬＮＮＥＦＮＦＦＫＲＨＩＣＤＡＮＫＥＧＭＦＬＦＲＡＡＲＫＬＲＱＦＬＫＭＮＳＴＧＤＦＤＬＨＬＬＫＶＳＥＧＴＴＩＬＬＮＣＴＧＱＶＫＧＲＫＰＡＡＬＧＥＡＱＰＴＫＳＬＥＥＮＫＳＬＫＥＱＫＫＬＮＤＬＣＦＬＫＲＬＬＱＥＩＫＴＣＷＮＫＩＬＭＧＴＫＥＨ（配列番号５）。
【0206】
本明細書で提供されている方法で利用される場合、ＩＬ－７の濃度は約１０Ｕ／ｍｌ～約７，０００Ｕ／ｍｌであることができる。いくつかの態様では、ＩＬ－７の濃度は約５ｎｇ／ｍｌ～約３，５００ｎｇ／ｍｌであることができる。
【0207】
「ＩＬ－１５」（「ＩＬ１５」とも呼ばれる）という用語は、インターロイキン－１５として知られるサイトカイン及びＴ細胞増殖因子を指し、本発明で利用されるとき、ヒト及び他の哺乳類の形態、保存的アミノ酸置換がある形態、それらのグリコフォーム、バイオ後続品、及び変異体を含むＩＬ－１５のすべての形態が含まれる。ＩＬ－１５は、例えば、Ｓｔｅｅｌ ＪＣ，Ｗａｌｄｍａｎｎ ＴＡ，Ｍｏｒｒｉｓ ＪＣ （Ｊａｎｕａｒｙ ２０１２），”Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｉｔｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ，”Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，３３（１）：３５－４１及びＷａｌｄｍａｎｎ ＴＡ，Ｔａｇａｙａ Ｙ（１９９９），”Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ－１５ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｉｎ ＮＫ ｃｅｌｌ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ａｎｄ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ，”Ａｎｎｕａｌ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７：１９－４９に記載されており、それらの開示はその全体が参照によって本明細書に組み込まれる。ＩＬ－１５という用語はＩＬ－１５の組換え型も包含する。本明細書で使用されるとき、ＩＬ－１５という用語はＩＬ－１５のペグ化形態も包含する。ヒトＩＬ１５遺伝子はＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ３６００によって特定されている。ヒトＩＬ１５遺伝子のヌクレオチド配列の例は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２９６０５．２である。本明細書で提供されている方法での使用に好適な組換えヒトＩＬ－１５のアミノ酸配列は以下のとおりである。
ＭＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号６）
ＭＮＷＶＮＶＩＳＤＬＫＫＩＥＤＬＩＱＳＭＨＩＤＡＴＬＹＴＥＳＤＶＨＰＳＣＫＶＴＡＭＫＣＦＬＬＥＬＱＶＩＳＬＥＳＧＤＡＳＩＨＤＴＶＥＮＬＩＩＬＡＮＮＳＬＳＳＮＧＮＶＴＥＳＧＣＫＥＣＥＥＬＥＥＫＮＩＫＥＦＬＱＳＦＶＨＩＶＱＭＦＩＮＴＳ（配列番号６）
【0208】
ＩＬ－１５は０．５ｎｇ／ｍｌを超える濃度で本明細書に提供されている方法にて利用され得る。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１０ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は５０ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は７５ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１００ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１５０ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２００ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１０，０００ｎｇ／ｍｌ未満、任意で９０００、８０００、７０００、６０００、５０００、４０００、３０００、２０００、または１０００ｎｇ／ｍｌ未満である。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は約３００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は約１０００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は１０００ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は１００ｎｇ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約１００ｎｇ／ｍｌ～約１０００ｎｇ／ｍｌである。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約３００ｎｇ／ｍｌである。
【0209】
ＩＬ－１５は１Ｕ／ｍｌを超える濃度で本明細書に提供されている方法にて利用され得る。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は４Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２０Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２００Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２０，０００Ｕ／ｍｌ未満、任意で１８，０００、１６，０００、１４，０００、１２，０００、１０，０００、８０００、６０００、４０００、または２０００ｎｇ／ｍｌ未満である。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は約６００Ｕ／ｍｌである。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は約２０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの態様では、利用されるＩＬ－１５の濃度は２０００Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は２００Ｕ／ｍｌを超える。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約２００Ｕ／ｍｌ～約２０００Ｕ／ｍｌである。いくつかの態様では、ＩＬ－１５の濃度は約６００Ｕ／ｍｌである。
【0210】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＮ－アセチル－Ｌ－システイン（ＮＡＣ）の存在下で培養される。いくつかの態様では、ＮＡＣは培養物にて約５ｍＭの濃度で存在する。いくつかの態様では、ＮＡＣは培養物にて約８．２ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【0211】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0212】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約５，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約５，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約５，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0213】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約３，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約３，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約３，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0214】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0215】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約２，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0216】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，５００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0217】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約１２５，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約２５０，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり約５００，０００個の細胞～１ｍｌあたり約１，０００，０００個の細胞の濃度で培養される。
【0218】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり５，０００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり３，０００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり２，５００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり２，０００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり１，５００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは１ｍｌあたり１，０００，０００個の細胞を超えない濃度で培養される。
【0219】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、Ｔ細胞の増殖に好適な温度、例えば少なくとも摂氏２５度、少なくとも摂氏３０度、または摂氏約３７度で培養される。
【0220】
いくつかの態様では、方法は、エフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆ）の増殖を制限することができるラパマイシンの使用を含む。ラパマイシンは、例えば、培養の最初の週に使用することができる。いくつかの態様では、ラパマイシンは培養の最初の２週間に使用することができる。いくつかの態様では、方法はラパマイシンの使用を含まない。いくつかの態様では、方法は遺伝子操作の前にラパマイシンの使用を含まない。いくつかの態様では、方法は培養の最初の２週間にラパマイシンの使用を含まない。いくつかの態様では、方法はラパマイシンの使用を含まない。培養の最初の週。
【0221】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は超磁性ビーズの使用を含む。いくつかの態様では、方法は超磁性ビーズの使用を含まない。いくつかの態様では、方法はビーズの使用を含まない。
【0222】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は人工抗原提示細胞の使用を含む。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は人工抗原提示細胞の使用を含まない。
【0223】
いくつかの態様では、本明細書で提供されているＴｒｅｇを増殖させる方法は：（ａ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約３日間（約７２時間）（例えば、０日目から３日目）培養することと；（ｂ）任意で洗浄によって刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；任意で１ｍｌ当たり５０万個の細胞で細胞を再播種すること；刺激剤の非存在下で細胞を約３日間（約７２時間）（例えば、３日目から６日目）培養することとを含み、その際、該方法は、Ｔｒｅｇの少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、または約８０倍の増殖をもたらす。
【0224】
いくつかの態様では、本明細書で提供されているＴｒｅｇを増殖させる方法は、
（ａ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約３日間（約７２時間）（例えば、０日目から３日目）培養することと；
（ｂ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；任意で１ｍｌ当たり５０万細胞で細胞を再播種すること；刺激剤の非存在下で細胞を約３日間（約７２時間）（例えば、３日目から６日目）培養することと；
（ｃ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約２日間（約４８時間）（例えば、６日目から８日目）培養すること；１ｍｌあたり５０万個の細胞の濃度に調整することと；
（ｄ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；Ｔｒｅｇを遺伝子操作すること；刺激剤の非存在下で約３日間（約７２時間）（例えば、８日目から１１日目）細胞を培養することと；
（ｅ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約２日間（約４８時間）（例えば、１１日目から１３日目）培養することと；
（ｆ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；任意で１ｍｌ当たり５０万個の細胞で細胞を再播種すること；刺激剤の非存在下で細胞を約２日間（約４８時間）（例えば、１３日目から１５日目）培養することと；
（ｇ）細胞を回収することとを含む。
（ａ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約３日間（約７２時間）（例えば、０日目から３日目）培養することと；
（ｂ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；任意で１ｍｌ当たり５０万細胞で細胞を再播種すること；刺激剤の非存在下で細胞を約３日間（約７２時間）（例えば、３日目から６日目）培養することと；
（ｃ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約２日間（約４８時間）（例えば、６日目から８日目）培養すること；１ｍｌあたり５０万個の細胞の濃度に調整することと；
（ｄ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；Ｔｒｅｇを遺伝子操作すること；刺激剤の非存在下で約３日間（約７２時間）（例えば、８日目から１１日目）細胞を培養することと；
（ｅ）刺激剤（例えば、任意で１０μｌ／ｍｌの濃度でのＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）の存在下でＴｒｅｇを約２日間（約４８時間）（例えば、１１日目から１３日目）培養することと；
（ｆ）任意で洗浄することによって、刺激剤（例えば、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２に特異的に結合する四量体抗体複合体）を除去すること；任意で１ｍｌ当たり５０万個の細胞で細胞を再播種すること；刺激剤の非存在下で細胞を約２日間（約４８時間）（例えば、１３日目から１５日目）培養することと；
（ｇ）細胞を回収することとを含む。
【0225】
工程（ａ）～（ｇ）を含むそのような方法は、ＩＬ－２（任意で４００ＩＵ／ｍｌの濃度）及び／またはＮＡＣ（任意で８．２ｍｇ／ｍｌの濃度）の存在下でＴｒｅｇを培養することを含むことができる。いくつかの態様では、ＩＬ－２の濃度は、２～９日目、１１日目、１３日目、及び１４日目に４００ＩＵ／ｍｌに調整される。
【0226】
工程（ａ）～（ｇ）を含むそのような方法は、細胞を複数回、例えば４日目、５日目、７日目、１１日目、１３日目、及び１４日目に分割することを含むことができる。
【0227】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、工程（ｂ）の終わりまでに、例えば６日目までに少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、工程（ｂ）の終わりまでに、例えば６日目までに８０倍に増殖している。
【0228】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは工程（ｂ）の終わりまでに、例えば６日目までに約８０倍に増殖している。
【0229】
いくつかの態様では、工程（ｃ）はさらに、ＴｒｅｇをＴ２５フラスコに移す工程を含む。
【0230】
本明細書で提供されている増殖方法を使用して、Ｔｒｅｇ集団におけるＴｒｅｇの数を、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍、少なくとも１５００倍、少なくとも２０００倍、少なくとも２５００倍、少なくとも３０００倍、少なくとも３５００倍、または少なくとも４０００倍増やすことができる。
【0231】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１０日以内に少なくとも５００倍増加する。
【0232】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は２０日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１９日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１８日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１７日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１６日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１５日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１４日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１３日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１２日以内に少なくとも１０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は１１日以内に少なくとも１０００倍増加する。
【0233】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は２０日以内に少なくとも２５００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は２０日以内に少なくとも３０００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は２０日以内に少なくとも３５００倍増加する。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇの数は２０日以内に少なくとも４０００倍増加する。
【0234】
本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、本明細書で提供されている方法がＴｒｅｇ集団の過剰刺激を防止し、及び／または活性化誘導細胞死を防止するので、改善された特性を有する。例えば、いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇと比べて、さらに小さい表面積を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇ表面積の０．９倍未満、０．８５倍未満、０．８倍未満または０．７５倍未満である表面積を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇと比べて高い比率のＨｅｌｉｏｓ＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇを有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇと比べて高い倍率の増殖を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇの増殖倍率の少なくとも１．５倍または少なくとも２倍である増殖倍率を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇと比べてエフェクターＴ細胞（Ｔｅｆｆｓ）の増殖を抑制する高い能力を有する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、例えば、刺激剤の存在下で６日間（約１４４時間）培養されたＴｒｅｇと比べてＴｅｆｆの増殖を抑制する少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い能力を有する。
【0235】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って増殖させたＴｒｅｇは、増殖前のＴｒｅｇ集団と比べて、Ｈｅｌｉｏｓ発現の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を維持する。
【0236】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、遺伝子操作後も増殖し続ける。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、遺伝子操作後（例えば、遺伝子操作後３日（約７２時間）以内または４日（約９６時間）以内）に少なくとも１．５倍に増殖する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、遺伝子操作後（例えば、遺伝子操作後３日（約７２時間）以内または４日（約９６時間）以内）に少なくとも２倍に増殖する。いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法に従って生成されるＴｒｅｇは、遺伝子操作後（例えば、遺伝子操作後３日（約７２時間）以内または４日（約９６時間）以内）に少なくとも３倍に増殖する。
【0237】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、増殖した（及び任意で遺伝子操作された）Ｔｒｅｇ集団を回収することを含む。いくつかの態様では、回収は刺激工程の直後に行われる。いくつかの態様では、回収は休止工程の直後に行われる。
【0238】
いくつかの態様では、刺激工程は遺伝子操作後、且つ回収前に行われる。いくつかの態様では、休止工程は遺伝子操作後、且つ回収前に行われる。いくつかの態様では、刺激工程及び休止工程の双方は遺伝子操作後、且つ回収前に行われる。
【0239】
いくつかの態様では、本明細書で提供されている方法は、増殖した（及び任意で遺伝子操作された）Ｔｒｅｇ集団を凍結保存することを含む。いくつかの態様では、凍結保存は刺激工程の直後に行われる。いくつかの態様では、凍結保存は休止工程の直後に行われる。
【0240】
Ｔｒｅｇの遺伝子操作
本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、Ｔｒｅｇは遺伝子操作される。遺伝子操作は、例えば、核酸または遺伝子調節システムをＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ集団に導入することを含むことができる。核酸または遺伝子調節システムは、例えば、エレクトロポレーション及び／またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）介在法によることを含む、当該技術分野で知られている方法を使用して導入することができる。
本明細書で提供されている方法のいくつかの態様では、Ｔｒｅｇは遺伝子操作される。遺伝子操作は、例えば、核酸または遺伝子調節システムをＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ集団に導入することを含むことができる。核酸または遺伝子調節システムは、例えば、エレクトロポレーション及び／またはリボ核タンパク質（ＲＮＰ）介在法によることを含む、当該技術分野で知られている方法を使用して導入することができる。
【0241】
遺伝子操作を介してＴｒｅｇに導入できる核酸は、ウイルス核酸または非ウイルス核酸であることができる。
【0242】
ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇ集団に導入される核酸はタンパク質をコードする核酸であることができる。タンパク質はＴｒｅｇ（複数可）に対して異種であるタンパク質であることができる。例えば、タンパク質はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または操作されたＴＣＲのような操作された抗原受容体であることができる。
【0243】
いくつかの態様では、操作された抗原受容体は、シグナル伝達ドメインを含む細胞質ドメインにヒンジ及び膜貫通ドメインを介して融合された細胞外抗原結合ドメインを含むＣＡＲである。いくつかの態様では、ＣＡＲの細胞外ドメインは抗体に由来する抗原結合断片を含む。本開示にて有用な抗原結合ドメインには、例えば、ｓｃＦｖが含まれる。いくつかの態様では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲ複合体ゼータ鎖（例えば、ＣＤ３ξシグナル伝達ドメイン）、ＦｃγＲＩＩＩ、ＦｃεＲＩ、またはＴリンパ球活性化ドメインに由来することができる。いくつかの態様では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、共刺激ドメイン、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ７０ドメインを含む。いくつかの態様では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインはさらに、例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＭｙＤ８８、またはＣＤ７０ドメインのうちのいずれか２つのような２つの共刺激ドメインを含む。例示的なＣＡＲ構造及び細胞内シグナル伝達ドメインは当該技術分野で知られている（例えば、参照によって本明細書に組み込まれるＷＯ２００９／０９１８２６、ＵＳ２０１３０２８７７４８、ＷＯ２０１５／１４２６７５、ＷＯ２０１４／０５５６５７、及びＷＯ２０１５／０９０２２９を参照のこと）。
【0244】
自己免疫疾患（例えば、ＧＶＨＤ、大腸炎、及び多発性硬化症）に関連する抗原に特異的なＣＡＲは、例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，９：１－８（２０１８）；Ｉｎｔ’ｌ Ｐｕｂｌ．Ｎｏ．ＷＯ２０１７２１８８５０Ａ１；及びＭａｃＤｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．，ＪＣＩ，２０１６；１２６（４）：１４１３－１４２４で考察されており、そのそれぞれが全体として参照によって本明細書に組み込まれる。
【0245】
いくつかの態様では、操作された抗原受容体は操作されたＴＣＲである。操作されたＴＣＲは、特定の標的抗原を認識するＴ細胞集団から単離されている及びクローニングされているＴＣＲα鎖及び／またはＴＣＲβ鎖を含む。操作されたＴＣＲは、内在性対応物と同じメカニズムを介して抗原を認識する（例えば、標的細胞の表面に発現される主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質の文脈にて提示される同族抗原の認識による）。この抗原の結合は内在性シグナル伝達経路を刺激し、ＴＣＲを操作した細胞の活性化と増殖をもたらす。
【0246】
本明細書では、「遺伝子調節システム」という用語は、細胞に導入されたときに内在性標的ＤＮＡ配列を修飾することができ、それによって、コードされた遺伝子産物の発現または機能を調節することができるタンパク質、核酸、またはそれらの組み合わせを指す。本開示の方法での使用に好適な多数の遺伝子編集システムが当該技術分野で知られており、それらには、ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ジンクフィンガーヌクレアーゼシステム、ＴＡＬＥＮシステム、及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書の方法にて有用な遺伝子調節システムは、例えば、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる国際公開第２０２０／１６０４８９号に提供されている。
【0247】
本明細書で使用されるとき「調節する」という用語は、内在性標的遺伝子に対する遺伝子調節システムの効果に関して使用される場合、内在性標的遺伝子の配列の任意の変化、内在性標的遺伝子のエピジェネティックな状態の任意の変化、及び／または内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現または機能の任意の変化を包含する。
【0248】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、例えば、内在性標的配列に１以上の突然変異を導入することによって、例えば、内在性標的配列に１以上の核酸を挿入するまたは欠失させることによって内在性標的遺伝子の配列の変化に介在することができる。内在性標的配列の変化に介在することができる例示的なメカニズムには、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）（例えば、古典的なまたは代替の）、マイクロホモロジー介在性末端結合（ＭＭＥＪ）、相同組換え修復（例えば、内在性ドナーテンプレートの介在）、ＳＤＳＡ（合成依存性鎖アニーリング）、一本鎖アニーリングまたは一本鎖侵入が挙げられるが、これらに限定されない。
【0249】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、内在性標的配列のエピジェネティックな状態の変化に介在することができる。例えば、いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、内在性標的遺伝子ＤＮＡの共有結合修飾（例えば、シトシンのメチル化及びヒドロキシメチル化）または関連するヒストンタンパク質の共有結合修飾（例えば、リジンのアセチル化、リジン及びアルギニンのメチル化、セリン及びスレオニンのリン酸化、リジンのユビキチン化及びＳＵＭＯ化）に介在することができる。
【0250】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、内在性標的遺伝子によってコードされるタンパク質の発現の変化に介在することができる。そのような態様では、遺伝子調節システムは、内在性標的ＤＮＡ配列の修飾によって、またはＤＮＡ配列によりコードされるｍＲＮＡ産物に作用することによって、コードされたタンパク質の発現を調節することができる。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、修飾された内在性タンパク質の発現をもたらすことができる。そのような態様では、遺伝子調節システムが介在する内在性ＤＮＡ配列に対する修飾は、遺伝子操作されていないＴｒｅｇにおける対応する内在性タンパク質と比べて機能の低下を示す内在性タンパク質の発現をもたらす。そのような態様では、修飾された内在性タンパク質の発現レベルは増加することも、低下することもでき、遺伝子操作されていないＴｒｅｇにおける対応する内在性タンパク質の発現レベルと同じである、または実質的に類似することができる。
【0251】
遺伝子操作を介してＴｒｅｇに導入することができる遺伝子調節システムは、（ｉ）核酸分子；（ｉｉ）酵素タンパク質；または（ｉｉｉ）核酸分子及び酵素タンパク質を含むことができる。そのような遺伝子調節システムは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲ）、アンタゴｍｉＲ、またはアンチセンスＲＮＡから選択される核酸分子を含むことができる。そのような遺伝子調節システムは、Ｔｒｅｇにおける１以上の遺伝子の標的配列に特異的に結合するように操作されている酵素タンパク質を含むことができる。酵素タンパク質は、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、またはメガヌクレアーゼであることができる。そのような遺伝子調節システムは、核酸分子及び酵素タンパク質を含むことができ、その際、核酸分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）分子であり、酵素タンパク質はＣａｓタンパク質またはＣａｓオルソログである。Ｃａｓタンパク質はＣａｓ９タンパク質であることができる。
【0252】
核酸に基づく遺伝子調節システム
本明細書で使用されるとき、核酸に基づく遺伝子調節システムは、外来性タンパク質を必要とせずに内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは、標的核酸配列に相補性であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
本明細書で使用されるとき、核酸に基づく遺伝子調節システムは、外来性タンパク質を必要とせずに内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１以上の核酸分子を含むシステムである。いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは、標的核酸配列に相補性であるＲＮＡ干渉分子またはアンチセンスＲＮＡ分子を含む。
【0253】
「アンチセンスＲＮＡ分子」とは、長さに関わらず、ｍＲＮＡ転写物に相補性であるＲＮＡ分子を指す。アンチセンスＲＮＡ分子とは、細胞、組織、または対象に導入することができ、内在性の遺伝子サイレンシング経路に頼らず、むしろ標的ｍＲＮＡ転写物のＲＮＡ分解酵素Ｈが介在する分解に頼るメカニズムを介して、内在性の標的遺伝子産物の発現低下をもたらす一本鎖ＲＮＡ分子を指す。いくつかの態様では、アンチセンス核酸は、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、または当該技術分野で知られている他のものを含む、または非天然ヌクレオシド間結合を含んでもよい。いくつかの態様では、アンチセンス核酸はロックド核酸（ＬＮＡ）を含むことができる。
【0254】
本明細書で使用されるとき「ＲＮＡ干渉分子」は、内在性遺伝子サイレンシング経路（例えば、ダイサー及びＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ））を介した標的ｍＲＮＡの分解によって内在性の標的遺伝子産物の発現低下に介在するＲＮＡポリヌクレオチドを指す。例示的なＲＮＡ干渉因子には、マイクロＲＮＡ（本明細書では「ｍｉＲＮＡ」とも呼ばれる）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＲＮＡアプタマー、及びモルホリノが挙げられる。
【0255】
いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは、１以上のｍｉＲＮＡを含む。ｍｉＲＮＡは、長さ約２１～２５ヌクレオチドの天然に存在する小さな非コードＲＮＡ分子を指す。ｍｉＲＮＡは１以上の標的ｍＲＮＡ分子に対して少なくとも部分的に相補性である。ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制、ｍＲＮＡの切断、及び／または脱アデニル化を介して内在性の標的遺伝子産物の発現を下方調節する（例えば、減少させる）ことができる。
【0256】
いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは１以上のｓｈＲＮＡを含む。ｓｈＲＮＡは、ステムループ構造を形成し、相補性のｍＲＮＡ配列の分解を引き起こす、長さ約５０～７０ヌクレオチドの一本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｈＲＮＡは、プラスミドまたは非複製組換えウイルスベクターにクローニングして細胞内に導入することができ、ｓｈＲＮＡがコードする配列のゲノムへの統合をもたらす。そのため、ｓｈＲＮＡは内在性の標的遺伝子の翻訳と発現を安定かつ一貫して抑制することができる。
【0257】
いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは１以上のｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡは通常、長さが約２１～２３ヌクレオチドの二本鎖ＲＮＡ分子を指す。ｓｉＲＮＡ は、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と呼ばれる複数タンパク質の複合体と会合し、その間に「パッセンジャー」センス鎖が酵素的に切断される。活性化されたＲＩＳＣに含有されるアンチセンス「ガイド」鎖は、配列の相同性のためＲＩＳＣを対応するｍＲＮＡに誘導し、同じヌクレアーゼが標的ｍＲＮＡを切断し、結果的に特異的な遺伝子サイレンシングを生じる。最適には、ｓｉＲＮＡは、長さが１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドであり、その３’末端に２塩基のオーバーハングを有する。ｓｉＲＮＡは個々の細胞及び／または培養系に導入することができ、その結果、標的ｍＲＮＡ配列が分解される。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、Ｆｉｒｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３９１：１９，１９９８ 及び米国特許第７，７３２，４１７号；同第８，２０２，８４６号；及び同第８，３８３，５９９号にさらに記載されている。
【0258】
いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは１以上のモルホリノを含む。本明細書で使用されるとき「モルホリノ」は、標準的な核酸塩基がモルホリン環に結合され、ホスホロジアミデート結合を介して連結されている修飾核酸オリゴマーを指す。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡと同様に、モルホリノは相補性のｍＲＮＡ配列に結合する。しかしながら、モルホリノは相補性な ｍＲＮＡ配列を標的にして分解するのではなく、ｍＲＮＡ翻訳の立体阻害やｍＲＮＡスプライシングの変化を介して機能する。
【0259】
いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは、表１に列挙されるものから選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含む。いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含む。いくつかの態様では、核酸に基づく遺伝子調節システムは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡと１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ＲＮＡアプタマー、またはモルホリノ）を含む。
【表2】
【0260】
いくつかの態様では、核酸ベースの遺伝子調節システムは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒなどのような供給業者から入手可能なｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡ構築物のような、当該技術分野で知られているものから選択されるｓｉＲＮＡ分子またはｓｈＲＮＡ分子を含む。
【0261】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、２以上の核酸分子（例えば、２以上のｓｉＲＮＡ、２以上のｓｈＲＮＡ、２以上のＲＮＡアプタマー、または２以上のモルホリノ）を含み、その際、核酸分子の少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、２以上の核酸分子（例えば、２以上のｓｉＲＮＡ、２以上のｓｈＲＮＡ、２以上のＲＮＡアプタマー、または２以上のモルホリノ）を含み、その際、核酸分子の少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、２以上の核酸分子（例えば、２以上のｓｉＲＮＡ、２以上のｓｈＲＮＡ、２以上のＲＮＡアプタマー、またはつ以上のモルホリノ）を含み、その際、核酸分子の少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子のＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡ配列と１００％同一である標的ＲＮＡ配列に結合する。
【0262】
タンパク質に基づく遺伝子調節システム
いくつか態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、配列特異的な方法で内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、１以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。そのような態様は本明細書では「ＴＡＬＥＮ」と呼ばれる。
いくつか態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、核酸ガイド分子を必要とせずに、配列特異的な方法で内在性標的遺伝子の発現を調節することができる１以上のタンパク質を含むシステムである。いくつかの態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、１以上のジンクフィンガー結合ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。いくつかの態様では、タンパク質に基づく遺伝子調節システムは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）ドメイン及び酵素ドメインを含むタンパク質を含む。そのような態様は本明細書では「ＴＡＬＥＮ」と呼ばれる。
【0263】
１．ジンクフィンガーシステム
ジンクフィンガーに基づくシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインの２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、１以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡを結合する、タンパク質、またはさらに大きなタンパク質内のドメインであり、それは、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、酵素ドメインの活性をその配列の近傍に向け、それにより、標的配列の近傍の内在性標的遺伝子の修飾を誘導する。ジンクフィンガードメインは、事実上あらゆる所望の配列に結合するように操作することができる。したがって、切断または組換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含有する標的遺伝子座（例えば、表１で参照される標的遺伝子における標的遺伝子座）を特定した後、１以上のジンクフィンガー結合ドメインは標的遺伝子座内の１以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメインと酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現は、標的遺伝子座の修飾に影響を与える。
ジンクフィンガーに基づくシステムは、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインの２つのタンパク質ドメインを含む融合タンパク質を含む。「ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン」、「ジンクフィンガータンパク質」、または「ＺＦＰ」は、１以上のジンクフィンガーを介して配列特異的にＤＮＡを結合する、タンパク質、またはさらに大きなタンパク質内のドメインであり、それは、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である。ジンクフィンガードメインは、標的ＤＮＡ配列に結合することによって、酵素ドメインの活性をその配列の近傍に向け、それにより、標的配列の近傍の内在性標的遺伝子の修飾を誘導する。ジンクフィンガードメインは、事実上あらゆる所望の配列に結合するように操作することができる。したがって、切断または組換えが所望される標的ＤＮＡ配列を含有する標的遺伝子座（例えば、表１で参照される標的遺伝子における標的遺伝子座）を特定した後、１以上のジンクフィンガー結合ドメインは標的遺伝子座内の１以上の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。細胞におけるジンクフィンガー結合ドメインと酵素ドメインを含む融合タンパク質の発現は、標的遺伝子座の修飾に影響を与える。
【0264】
いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインは１以上のジンクフィンガーを含む。Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８５），ＥＭＢＯ Ｊ．４：１６０９－１６１４；Ｒｈｏｄｅｓ（１９９３），Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｅｂｕａｒｙ：５６－６５；米国特許第６，４５３，２４２号 。通常、単一のジンクフィンガードメインの長さは約３０アミノ酸である。個々のジンクフィンガーは、３ヌクレオチド（すなわち、トリプレット）配列（または、隣接するジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチドだけ重複し得る４ヌクレオチド配列）に結合する。したがって、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作されている配列（例えば、標的配列）の長さによって、操作されたジンクフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガーの数が決定されるであろう。例えば、フィンガーモチーフが重複する亜部位に結合しないＺＦＰについては、６ヌクレオチドの標的配列は ２つのフィンガー結合ドメインによって結合され；９ヌクレオチドの標的配列は３つのフィンガー結合ドメインによって結合される、等である。標的部位内の個々のジンクフィンガーの結合部位（すなわち、亜部位）は連続している必要はないが、複数のフィンガー結合ドメインにおけるジンクフィンガー間のアミノ酸配列（すなわち、フィンガー間リンカー）の長さと性質に応じて１つまたはいくつかのヌクレオチドによって分離することができる。いくつかの態様では、個々のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、３～６の間の個々のジンクフィンガーリピートを含み、それぞれ９～１８の間の塩基対を認識することができる。
【0265】
ジンクフィンガー結合ドメインは選択した配列に結合するように操作することができる。例えば、Ｂｅｅｒｌｉ ｅｔ ａｌ．（２００２），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：１３５－１４１；Ｐａｂｏ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：３１３－３４０；Ｉｓａｌａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：６５６－６６０；Ｓｅｇａｌ ｅｔ ａｌ．（２００１），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：６３２－６３７；Ｃｈｏｏ ｅｔ ａｌ．（２０００），Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１０：４１１－４１６を参照のこと。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比べて、新規の結合特異性を有することができる。操作方法には、合理的な設計や種々の種類の選択が含まれるが、これらに限定されない。
【0266】
ジンクフィンガードメインによる結合のための標的ＤＮＡ配列の選択は、例えば、米国特許第６，４５３，２４２号に開示されている方法に従って達成することができる。ヌクレオチド配列の簡単な目視検査も標的ＤＮＡ配列の選択に使用できることは当業者には明らかであろう。したがって、標的ＤＮＡ配列選択のための任意の手段を、本明細書に記載されている方法にて使用することができる。標的部位は一般に少なくとも９ヌクレオチドの長さを有するので、少なくとも３つのジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ドメインによって結合される。しかしながら、例えば、４フィンガーの結合ドメインの１２ヌクレオチドの標的部位への結合、５フィンガーの結合ドメインの１５ヌクレオチドの標的部位への結合、または６フィンガーの結合ドメインの１８ヌクレオチドの標的部位への結合も可能である。明らかなように、さらに大きな結合ドメイン（例えば、７フィンガー、８フィンガー、９フィンガーなど）のさらに長い標的部位への結合も可能である。
【0267】
いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ジンクフィンガー結合ドメインは表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ジンクフィンガーシステムは、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈのような供給業者から入手可能なもののような当該技術分野で既知のものから選択される。
【0268】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれジンクフィンガー結合ドメインを含む２以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、その際、ジンクフィンガー結合ドメインの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれジンクフィンガー結合ドメインを含む２以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、その際、ジンクフィンガー結合ドメインの少なくとも１つは表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムはそれぞれジンクフィンガー結合ドメインを含む２以上のＺＦＰ融合タンパク質を含み、その際、ジンクフィンガー結合ドメインの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0269】
ジンクフィンガー融合タンパク質の酵素ドメイン部分は、任意のエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得られ得る。酵素ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼには、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、２００２－２００３ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ，Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．；及びＢｅｌｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７），Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３７９－３３８８を参照のこと。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が知られている（例えば、５１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮＡ分解酵素Ｉ；ミクロコッカスヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ；Ｌｉｎｎ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｎｕｃｌｅａｓｅｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９３も参照のこと）。これらの酵素（またはそれらの機能的断片）のうちの１以上を切断ドメインの供給源として使用することができる。
【0270】
本明細書に記載されているＺＦＰの酵素ドメインとして使用するのに好適な例示的な制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種に存在し、ＤＮＡに配列特異的に結合し（認識部位で）、且つ結合部位でまたはその近傍でＤＮＡを切断することができる。特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去された部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメイン及び切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド及び他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドにてＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号、同第５，４３６，１５０号、及び同第５，４８７，９９４号、ならびにＬｉ ｅｔ ａｌ．（１９９２），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２７５－４２７９；Ｌｉ ｅｔ ａｌ．（１９９３），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２７６４－２７６８；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ａ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：８８３－８８７；Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４ｂ），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３１，９７８－３１，９８２を参照のこと。したがって、いくつかの態様では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素由来の酵素ドメイン、及び１以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【0271】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋＩである。この特定の酵素は二量体として活性がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ ｅｔ ａｌ．（１９９８），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５：１０，５７０－１０，５７５．したがって、ジンクフィンガー－ＦｏｋＩ融合を使用した標的とされる二本鎖ＤＮＡの切断については、それぞれＦｏｋＩ酵素ドメインを含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性がある切断ドメインを再構成することができるあるいは、ジンクフィンガー結合ドメイン及び２つのＦｏｋＩ酵素ドメインを含有する単一のポリペプチド分子も使用することができるＦｏｋＩ酵素ドメインを含む例示的なＺＦＰは米国特許第９，７８２，４３７号に記載されている。
【0272】
２．ＴＡＬＥＮシステム
ＴＡＬＥＮに基づくシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインを含むタンパク質を含む。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作成される。上述のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子調節システムでの使用に好適な例示的な酵素ドメインである。
ＴＡＬＥＮに基づくシステムは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインと酵素ドメインを含むタンパク質を含む。それらは、ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインをＤＮＡ切断ドメイン（ＤＮＡ鎖を切断するヌクレアーゼ）に融合することによって作成される。上述のＦｏｋＩ制限酵素は、ＴＡＬＥＮに基づく遺伝子調節システムでの使用に好適な例示的な酵素ドメインである。
【0273】
ＴＡＬエフェクターは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属細菌が植物に感染したときに、ＩＩＩ型分泌系を介して細菌によって分泌されるタンパク質である。ＤＮＡ結合ドメインは、１２番目と１３番目のアミノ酸が異なる、高度に保存された繰り返しの３３～３４アミノ酸配列を含有する。これら２つの位置は、反復可変性二残基（ＲＶＤ）と呼ばれ、非常に可変的であり、特定のヌクレオチド認識と強く相関する。したがって、ＴＡＬエフェクタードメインは、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特定の標的ＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＲＶＤの組み合わせについての核酸特異性は次のとおりである：ＨＤはシトシンを標的とし、ＮＩはアデネニンを標的とし、ＮＧはチミンを標的とし、及びＮＮはグアニンを標的とする（しかし、いくつかの態様では、ＮＮはさらに低い特異性でアデネニンに結合することもできる）。
【0274】
いくつかの態様では、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ＴＡＬエフェクタードメインは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ＴＡＬエフェクタードメインは表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0275】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、その際、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、その際、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムはそれぞれＴＡＬエフェクタードメインを含む２以上のＴＡＬエフェクター融合タンパク質を含み、その際、ＴＡＬエフェクタードメインの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0276】
ＴＡＬエフェクター反復を組み立てるための方法及び組成物は当該技術分野で知られている。例えば、Ｃｅｒｍａｋ ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３９：１２，２０１１，ｅ８２を参照のこと。ＴＡＬエフェクター反復の構築用のプラスミドはＡｄｄｇｅｎｅから市販されている。
【0277】
組み合わせ核酸／タンパク質に基づく遺伝子調節システム
組み合わせ遺伝子調節システムは部位特異的修飾ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的修飾ポリペプチド」は、核酸ガイド分子に結合し、それが結合される核酸ガイド分子によって標的核酸配列（例えば、内在性の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）に差し向けられ、標的核酸配列を修飾する（例えば、標的核酸配列の切断、突然変異、またはメチル化）ポリペプチドを指す。
組み合わせ遺伝子調節システムは部位特異的修飾ポリペプチド及び核酸ガイド分子を含む。本明細書では、「部位特異的修飾ポリペプチド」は、核酸ガイド分子に結合し、それが結合される核酸ガイド分子によって標的核酸配列（例えば、内在性の標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列）に差し向けられ、標的核酸配列を修飾する（例えば、標的核酸配列の切断、突然変異、またはメチル化）ポリペプチドを指す。
【0278】
部位特異的修飾ポリペプチドは核酸ガイドに結合する部分と活性部分の２つの部分を含む。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドは、部位特異的酵素活性（例えば、ＤＮＡメチル化、ＤＮＡまたはＲＮＡの切断、ヒストンのアセチル化、ヒストンのメチル化など）を示す活性部分を含み、その際、酵素活性の部位はガイド核酸によって決定される。場合によっては、部位特異的修飾ポリペプチドは、内在性標的核酸配列を修飾する酵素活性（例えば、ヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性またはグリコシラーゼ活性）を有する活性部分を含む。他の場合では、部位特異的修飾ポリペプチドは、内在性標的核酸配列に関連するポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性または脱ミリストイル化活性）を有する活性部分を含む。） いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＤＮＡ配列の転写を調節する（例えば、転写を増加または減少させるための）活性部分を含む。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドは、標的ＲＮＡ配列の発現または翻訳を調節する（例えば、転写を増加または減少させるための）活性部分を含む。
【0279】
核酸ガイドは２つの部分：内在性標的核酸配列に相補性であり、且つそれと結合することができる第１の部分（本明細書では「核酸結合セグメント」と呼ぶ）、及び部位特異的修飾ポリペプチドと相互作用することができる第２の部分（本明細書では「タンパク質結合セグメント」と呼ぶ）を含む。いくつかの態様では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントは単一のポリヌクレオチド分子内に含まれる。いくつかの態様では、核酸ガイドの核酸結合セグメント及びタンパク質結合セグメントはそれぞれ、別個のポリヌクレオチド分子内に含まれるので、核酸ガイドは、互いに会合して機能性ガイドを形成する２つのポリヌクレオチド分子を含む。
【0280】
核酸ガイドは、標的核酸配列と特異的にハイブリッド形成することによって、組み合わせたタンパク質／核酸遺伝子調節システムの標的特異性に介在する。いくつかの態様では、標的核酸配列は、標的遺伝子のｍＲＮＡ転写物内に含まれるＲＮＡ配列のようなＲＮＡ配列である。いくつかの態様では、標的核酸配列は、標的遺伝子のＤＮＡ配列内に含まれるＤＮＡ配列である。本明細書における標的遺伝子への言及は、複数の標的遺伝子座（すなわち、特定の標的遺伝子配列の一部（例えば、エクソンまたはイントロン））を含むその特定の遺伝子の完全長ＤＮＡ配列を包含する。各標的遺伝子座内にあるのは、本明細書に記載されている遺伝子調節システムによって修飾され得る本明細書にて「標的ＤＮＡ配列」と呼ばれるＤＮＡ配列のさらに短い区間である。さらに、各標的遺伝子座は、遺伝子調節システムによって誘発される修飾の正確な位置（例えば、挿入、欠失、または突然変異の位置、ＤＮＡ破断の位置、またはエピジェネティックな修飾の位置）を指す「標的修飾部位」を含む。
【0281】
本明細書に記載されている遺伝子調節システムは、単一の核酸ガイドを含んでもよく、または複数の核酸ガイド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の核酸ガイド）を含んでもよい。
【0282】
いくつかの態様では、組み合わせタンパク質／核酸遺伝子調節システムは、アルゴノート（Ａｇｏ）タンパク質（例えば、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓのＡｇｏまたはＴｔＡｇｏ）由来の部位特異的修飾ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＴ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓのＡｇｏ ＤＮＡエンドヌクレアーゼであり、核酸ガイドはガイドＤＮＡ（ｇＤＮＡ）である（Ｓｗａｒｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５０７（２０１４），２５８－２６１を参照のこと）。いくつかの態様では、本開示はｇＤＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、ｇＤＮＡをコードする核酸は発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。いくつかの態様では、本開示は、ＴｔＡｇｏ部位特異的修飾ポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、ＴｔＡｇｏ部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。
【0283】
いくつかの態様では、本明細書に記載されている遺伝子編集システムは、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化され、規則的に間隔が空いた短い回文構造の繰り返し）／Ｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）ヌクレアーゼシステムである。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムはクラス２システムである。クラス２ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、ＩＩ型、Ｖ型、及びＶＩ型システムの３つの型に分類される。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓシステムはＣａｓ９タンパク質を利用するクラス２のＩＩ型である。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＣａｓ９ ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（またはその変異体）であり、核酸ガイド分子はガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）である。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１としても知られる）、Ｃａｓ１２ｃ（Ｃ２ｃ３としても知られる）、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹとしても知られる）、及びＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸとしても知られる））を利用するクラス２のＶ型システムである。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＣａｓ１２ＤＮＡエンドヌクレアーゼ（またはその変異体）であり、核酸ガイドはｇＲＮＡである。いくつかの態様では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ１３タンパク質（例えば、Ｃａｓ１３ａ（Ｃ２ｃ２としても知られる）、Ｃａｓ１３ｂ、及びＣａｓ１３ｃ）を利用するクラス２及びＶＩ型システムである（Ｐｙｚｏｃｈａ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ，１３（２），３４７－３５６を参照のこと）。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＣａｓ１３ ＲＮＡエンドヌクレアーゼであり、核酸ガイド分子はｇＲＮＡである。
【0284】
Ｃａｓポリペプチドは、ｇＲＮＡ分子と相互作用し、ｇＲＮＡ分子と協働して、標的ＤＮＡ配列または標的ＲＮＡ配列にホーミングまたは局在することができるポリペプチドを指す。Ｃａｓポリペプチドには、天然に存在するＣａｓタンパク質、及び天然に存在するＣａｓ配列とは１以上のアミノ酸残基が異なる操作された、改変された、またはその他の修飾されたＣａｓタンパク質が含まれる。
【0285】
ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は２つのセグメント：ＤＮＡ結合セグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。いくつかの態様では、ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは１つのＲＮＡ分子に含まれ、ＤＮＡ結合セグメントはもう１つの別のＲＮＡ分子に含まれる。そのような態様は、本明細書では「二重分子ｇＲＮＡ」または「二分子ｇＲＮＡ」または「二重ｇＲＮＡ」と呼ばれる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは単一のＲＮＡ分子であり、本明細書では「単一ガイドＲＮＡ」または「ｓｇＲＮＡ」と呼ばれる。「ガイドＲＮＡ」または「ｇＲＮＡ」という用語は包括的であり、２分子ガイドＲＮＡとｓｇＲＮＡの双方を指す。
【0286】
ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、部分的には、互いにハイブリッド形成して二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成する２つの相補性のヌクレオチドの区間で構成され、Ｃａｓタンパク質への結合を促進する。ｇＲＮＡの核酸結合セグメント（または「核酸結合配列」）は、特定の標的核酸配列に相補性であり、それに結合することができるヌクレオチド配列を含む。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントはＣａｓポリペプチドと相互作用し、ｇＲＮＡ分子と部位特異的修飾ポリペプチドの相互作用によってＣａｓが内在性核酸配列に結合し、標的核酸配列内またはその周囲に１以上の修飾を作り出す。標的修飾部位の正確な位置は、（ｉ）ｇＲＮＡと標的核酸配列の間の塩基対形成の相補性；及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ配列内のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる（標的ＲＮＡ配列ではプロトスペーサーフランキング配列（ＰＦＳ）と呼ばれる）短いモチーフの位置の双方によって決定される。ＰＡＭ／ＰＦＳ配列はＣａｓが標的核酸配列に結合するのに必要とされる。種々のＰＡＭ／ＰＦＳ配列が当該技術分野で知られており、特定のＣａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ）との使用に好適である（例えば、Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，Ｎｏｖ；１０（１１）：１１１６－１１２１及びＳｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：５４０５を参照のこと）。いくつかの態様では、ＰＡＭ配列は標的ＤＮＡ配列における標的修飾部位の５０塩基対以内に位置する。いくつかの態様では、ＰＡＭ配列は標的ＤＮＡ配列における標的修飾部位の１０塩基対以内に位置する。この方法によって標的とすることができるＤＮＡ配列は、標的修飾部位までのＰＡＭ配列の相対距離と、配列特異的なｇＲＮＡが介在するＣａｓ 結合に介在する固有の２０塩基対配列の存在とによってのみ制限される。いくつかの態様では、ＰＦＳ配列は標的ＲＮＡ配列の３’末端に位置する。いくつかの態様では、標的修飾部位は標的遺伝子座の５’末端に位置する。いくつかの態様では、標的修飾部位は標的遺伝子座の３’末端に位置する。いくつかの態様では、標的修飾部位は標的遺伝子座のイントロンまたはエキソンの範囲内に位置する。
【0287】
いくつかの態様では、本開示はｇＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡをコードする核酸は発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。いくつかの態様では、本開示は部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、発現ベクター、例えば、組換え発現ベクターに含まれる。
【0288】
１．Ｃａｓタンパク質
いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＣａｓタンパク質である。本明細書で提供されているものを含む任意のＣａｓタンパク質を使用することができる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．、またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子を含む種々の種のＣａｓ分子は本明細書に記載されている方法及び組成物にて使用することができる。
いくつかの態様では、部位特異的修飾ポリペプチドはＣａｓタンパク質である。本明細書で提供されているものを含む任意のＣａｓタンパク質を使用することができる。Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｐｌｅｕｒｏｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｉｓ、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．、Ｃｙｃｌｉｐｈｉｌｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ、Ａｍｉｎｏｍｏｎａｓ ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｅｒｅｕｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｍｉｔｈｉｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ、Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ ｓｐ．、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ、Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍ ｓｐ．、Ｂｒｅｖｉｂａｃｉｌｌｕｓ ｌａｔｅｒｏｓｐｏｘｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｏｌｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｌａｒｉ、Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｐｕｎｉｃｅｉｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｃｅｌｌｕｌｏｌｙｔｉｃｕｍ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｃｏｌｅｎｓ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍａｔｒｕｃｈｏｔｉｉ、Ｄｉｎｏｒｏｓｅｏｂａｃｔｅｒ ｓｈｉｂａｅ、Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｏｌｉｃｈｕｍ、Ｇａｍｍａｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｌｕｃｏｎａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ ｄｉａｚｏｔｒｏｐｈｉｃｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐｕｔｏｍｍ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃａｎａｄｅｎｓｉｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｃｉｎａｅｄｉ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｍｕｓｔｅｌａｅ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ ｐｏｌｙｔｒｏｐｕｓ、Ｋｉｎｇｅｌｌａ ｋｉｎｇａｅ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｃｒｉｓｐａｔｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｃｙｓｔｉｓ ｓｐ．、Ｍｅｔｈｙｌｏｓｉｎｕｓ ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｍｏｂｉｌｕｎｃｕｓ ｍｕｌｉｅｒｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｂａｃｉｌｌｉｆｏｒｍｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｃｉｎｅｒｅａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｌａｃｔａｍｉｃａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｓｐ．、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｗａｄｓｗｏｒｔｈｉｉ、Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｐａｒｖｉｂａｃｕｌｕｍ ｌａｖａｍｅｎｔｉｖｏｒａｎｓ、Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｍｕｌｔｏｃｉｄａ、Ｐｈａｓｃｏｌａｒｃｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｕｃｃｉｎａｔｕｔｅｎｓ、Ｒａｌｓｔｏｎｉａ ｓｙｚｙｇｉｉ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐａｌｕｓｔｒｉｓ、Ｒｈｏｄｏｖｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ ｍｕｅｌｌｅｒｉ、Ｓｐｈｉｎｇｏｍｏｎａｓ ｓｐ．、Ｓｐｏｒｏｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｖｉｎｅａｅ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．、Ｓｕｂｄｏｌｉｇｒａｎｕｌｕｍ ｓｐ．、Ｔｉｓｔｒｅｌｌａ ｍｏｂｉｌｉｓ、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．、またはＶｅｒｍｉｎｅｐｈｒｏｂａｃｔｅｒ ｅｉｓｅｎｉａｅに由来するＣａｓ分子を含む種々の種のＣａｓ分子は本明細書に記載されている方法及び組成物にて使用することができる。
【0289】
いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質は天然に存在するＣａｓタンパク質である。いくつかの態様では、Ｃａｓエンドヌクレアーゼは、Ｃ２Ｃ１、Ｃ２Ｃ３、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａとも呼ばれる）、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃａｓｌ、ＣａｓｌＢ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎｌ及びＣｓｘ１２としても知られる）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃｌ、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒｌ、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂｌ、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘｌ７、Ｃｓｘｌ４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘｌ、Ｃｓｘｌ５、Ｃｓｆｌ、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４から成る群から選択される。
【0290】
いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＣａｓ１３タンパク質のようなエンドリボヌクレアーゼである。いくつかの態様では、Ｃａｓ１３タンパク質は、Ｃａｓ１３ａ（Ａｂｕｄａｙｙｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，５５０（２０１７），２８０－２８４）、Ｃａｓ１３ｂ（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、Ｃａｓ１３ｃ（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，（２０１７）３５８：６３３６，１０１９－１０２７）、またはＣａｓ１３ｄ（Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７５（２０１８），２１２－２２３）タンパク質である。
【0291】
いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書で具体的に提供されているＣａｓ９タンパク質のいずれかを含む、任意のＣａｓ９タンパク質である。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質は野生型のまたは天然に存在するＣａｓタンパク質またはＣａｓ９オルソログである。野生型Ｃａｓ９は、ＨＮＨヌクレアーゼドメインを使用してＤＮＡの標的鎖を切断し、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して非標的鎖を切断するマルチドメイン酵素である。ｇＲＮＡの特異性に基づいてＷＴ Ｃａｓ９がＤＮＡに結合すると、二本鎖ＤＮＡの切断が生じ、これは非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。例示的な天然に存在するＣａｓ９分子は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３１０：５，７２７－７３７に記載されており、追加のＣａｓ９オルソログは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号に記載されている。そのようなＣａｓ９分子には、クラスター１細菌ファミリー、クラスター２細菌ファミリー、クラスター３細菌ファミリー、クラスター４細菌ファミリー、クラスター５細菌ファミリー、クラスター６細菌ファミリー、クラスター７細菌ファミリー、クラスター８細菌ファミリー、クラスター９細菌ファミリー、クラスター１０細菌ファミリー、クラスター１１細菌ファミリー、クラスター１２細菌ファミリー、クラスター１３細菌ファミリー、クラスター１４細菌ファミリー、クラスター１５細菌ファミリー、クラスター１６細菌ファミリー、クラスター１７細菌ファミリー、クラスター１８細菌ファミリー、クラスター１９細菌ファミリー、クラスター２０細菌ファミリー、クラスター２１細菌ファミリー、クラスター２２細菌ファミリー、クラスター２３細菌ファミリー、クラスター２４細菌ファミリー、クラスター２５細菌ファミリー、クラスター２６細菌ファミリー、クラスター２７細菌ファミリー、クラスター２８細菌ファミリー、クラスター２９細菌ファミリー、クラスター３０細菌ファミリー、クラスター３１細菌ファミリー、クラスター３２細菌ファミリー、クラスター３３細菌ファミリー、クラスター３４細菌ファミリー、クラスター３５細菌ファミリー、クラスター３６細菌ファミリー、クラスター３７細菌ファミリー、クラスター３８細菌ファミリー、クラスター３９細菌ファミリー、クラスター４０細菌ファミリー、クラスター４１細菌ファミリー、クラスター４２細菌ファミリー、クラスター４３細菌ファミリー、クラスター４４細菌ファミリー、クラスター４５細菌ファミリー、クラスター４６細菌ファミリー、クラスター４７細菌ファミリー、クラスター４８細菌ファミリー、クラスター４９細菌ファミリー、クラスター５０細菌ファミリー、クラスター５１細菌ファミリー、クラスター５２細菌ファミリー、クラスター５３細菌ファミリー、クラスター５４細菌ファミリー、クラスター５５細菌ファミリー、クラスター５６細菌ファミリー、クラスター５７細菌ファミリー、クラスター５８細菌ファミリー、クラスター５９細菌ファミリー、クラスター６０細菌ファミリー、クラスター６１細菌ファミリー、クラスター６２細菌ファミリー、クラスター６３細菌ファミリー、クラスター６４細菌ファミリー、クラスター６５細菌ファミリー、クラスター６６細菌ファミリー、クラスター６７細菌ファミリー、クラスター６８細菌ファミリー、クラスター６９細菌ファミリー、クラスター７０細菌ファミリー、クラスター７１細菌ファミリー、クラスター７２細菌ファミリー、クラスター７３細菌ファミリー、クラスター７４細菌ファミリー、クラスター７５細菌ファミリー、クラスター７６細菌ファミリー、クラスター７７細菌ファミリー、またはクラスター７８細菌ファミリーのＣａｓ９分子が挙げられる。
【0292】
いくつかの態様では、天然に存在するＣａｓ９ポリペプチドは、ＳｐＣａｓ９、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ１、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ２、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ３、ＳｐＣａｓ９－ＨＦ４、ＳａＣａｓ９、ＦｎＣｐｆ、ＦｎＣａｓ９、ｅＳｐＣａｓ９、及びＮｍｅＣａｓ９から成る群から選択される。いくつかの態様では、Ｃａｓ９タンパク質は、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０：５，７２７－７３７；Ｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｅａｒｌｙ Ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１３，１－６）に記載されているＣａｓ９アミノ酸配列に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【0293】
いくつかの態様では、Ｃａｓポリペプチドは、以下の活性：
ａ． ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力；
ｂ． 二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、一態様では、２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖核酸の双方の鎖を切断し、二本鎖破壊を作り出す能力；
ｃ． エンドヌクレアーゼ活性；
ｄ． エキソヌクレアーゼ活性；及び／または
ｅ． ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力のうちの１以上を含む。
ａ． ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を切断する能力；
ｂ． 二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、一態様では、２つのニッカーゼ活性の存在である、二本鎖核酸の双方の鎖を切断し、二本鎖破壊を作り出す能力；
ｃ． エンドヌクレアーゼ活性；
ｄ． エキソヌクレアーゼ活性；及び／または
ｅ． ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のらせん構造をほどく能力のうちの１以上を含む。
【0294】
いくつかの態様では、Ｃａｓポリペプチドは、ＤＮＡ損傷シグナル伝達タンパク質、エキソヌクレアーゼ、またはホスファターゼを動員する異種タンパク質に融合されて、何らかの修復メカニズムによる標的配列の修復の可能性または修復速度をさらに高める。いくつかの態様では、ＷＴ Ｃａｓポリペプチドは、相同組換え修復による外来性核酸配列の組み込みを促進するために、核酸修復鋳型と共に共発現される。
【0295】
いくつかの態様では、さまざまなＣａｓタンパク質（すなわち、種々の種に由来するＣａｓ９タンパク質）は、さまざまなＣａｓタンパク質の種々の酵素特性を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列の優先性のために；酵素活性の増加または低下のために；細胞毒性レベルの増加または減少のために；ＮＨＥＪ、相同組換え修復、一本鎖切断、二本鎖切断の間のバランスを変更するために）提供されている種々の方法で使用するのに有利であってもよい。
【0296】
いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧ、ＮＡＧ、ＮＧＡを認識する（Ｍａｌｉ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１３；３３９（６１２１）：８２３－８２６）。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧＮＧ及び／またはＮＮＡＧＡＡＷ（Ｗ＝ＡまたはＴ）を認識する（例えば、Ｈｏｒｖａｔｈ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２０１０；３２７（５９６２）：１６７－１７０，及びＤｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照のこと）。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ｍｕｔａｎｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＧＧ及び／またはＮＡＡＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する（例えば、Ｄｅｖｅａｕ ｅｔ ａｌ，Ｊ．ＢＡＣＴＥＲＩＯＬ．２００８；１９０（４）：１３９０－１４００を参照のこと）。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮＮＧＲＲ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＲＲＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＳ．ａｕｒｅｕｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＲＲＶ（Ｒ＝ＡまたはＧ）を認識する。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ由来のＣａｓ９タンパク質であり、ＰＡＭ配列モチーフＮ ＧＡＴＴまたはＮ ＧＣＴＴ（Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｖ＝Ａ、ＧまたはＣ）を認識する（例えば、Ｈｏｕ ｅｔ ａｈ，ＰＮＡＳ，２０１３，１－６を参照のこと）。前述の態様では、Ｎは、任意のヌクレオチド残基、例えば、Ａ、Ｇ、ＣまたはＴのいずれかであり得る。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質はＬｅｐｔｏｔｒｉｃｈｉａ ｓｈａｈｉｉに由来するＣａｓ１３ａタンパク質であり、単一の３’Ａ、Ｕ、またはＣのＰＦＳ配列モチーフを認識する。
【0297】
いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９０％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／０７１４７４号またはＣｈｙｌｉｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，１０：５，７２７－７３７に記載されているＣａｓタンパク質と１００％同一であるＣａｓタンパク質をコードする。
【0298】
２．Ｃａｓ突然変異型
いくつかの態様では、ＣａｓポリペプチドはＣａｓポリペプチドの１以上の特性を変更するように操作される。例えば、いくつかの態様では、Ｃａｓポリペプチドは、変化した酵素特性、例えば、変化したヌクレアーゼ活性（天然に存在するまたは他の参照のＣａｓ分子と比べて）または変化したヘリカーゼ活性を含む。いくつかの態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変える改変、例えば、Ｃａｓポリペプチドの別の特性に大きな影響を与えることなくそのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの態様では、操作されたＣａｓポリペプチドはＰＡＭ認識に影響を与える変化を含む。例えば、操作されたＣａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように変化させることができる。
いくつかの態様では、ＣａｓポリペプチドはＣａｓポリペプチドの１以上の特性を変更するように操作される。例えば、いくつかの態様では、Ｃａｓポリペプチドは、変化した酵素特性、例えば、変化したヌクレアーゼ活性（天然に存在するまたは他の参照のＣａｓ分子と比べて）または変化したヘリカーゼ活性を含む。いくつかの態様では、操作されたＣａｓポリペプチドは、そのサイズを変える改変、例えば、Ｃａｓポリペプチドの別の特性に大きな影響を与えることなくそのサイズを減少させるアミノ酸配列の欠失を有することができる。いくつかの態様では、操作されたＣａｓポリペプチドはＰＡＭ認識に影響を与える変化を含む。例えば、操作されたＣａｓポリペプチドは、対応する野生型Ｃａｓタンパク質によって認識されるＰＡＭ配列以外のＰＡＭ配列を認識するように変化させることができる。
【0299】
所望の特性を持つＣａｓポリペプチドは、所望の特性を有する突然変異型または改変されたＣａｓポリペプチドを提供するための、天然に存在するＣａｓポリペプチドまたは親Ｃａｓポリペプチドの改変を含む多くの方法で作製することができる。例えば、１以上の突然変異を親Ｃａｓポリペプチド（例えば、天然に存在するまたは操作されたＣａｓポリペプチド）の配列に導入することができる。そのような突然変異及び差異は、置換（例えば、保存的置換または非必須アミノ酸の置換）；挿入；または欠失を含んでもよい。いくつかの態様では、突然変異型Ｃａｓポリペプチドは、親Ｃａｓポリペプチドと比べて１以上の突然変異（例えば、少なくとも１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０または５０の突然変異）を含む。
【0300】
いくつかの態様では、突然変異型Ｃａｓポリペプチドは天然に存在するＣａｓポリペプチドとは異なる切断特性を含む。いくつかの態様では、Ｃａｓは不活性化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）突然変異型である。いくつかの態様では、Ｃａｓポリペプチドはどんな固有の酵素活性を含まず、標的核酸の切断に介在することができない。いくつかの態様では、ｄＣａｓは、非切断に基づく様式で標的核酸を修飾することができる異種タンパク質と融合されてもよい。例えば、いくつかの態様では、ｄＣａｓタンパク質は、転写活性化因子ドメインまたは転写抑制因子ドメイン（例えば、クルッペル関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）；Ｍａｄ ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤまたはＳＩＤ４Ｘ）；ＥＲＦ抑制因子ドメイン（ＥＲＤ））、ＭＡＸ相互作用タンパク質１（ＭＸＩ１）、メチル－ＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）など）に融合される。そのような場合には、ｄＣａｓ融合タンパク質はｇＲＮＡによって標的核酸内の特定の位置（すなわち、配列）に差し向けられ、例えば、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼの結合を阻止する（転写活性化因子の機能を選択的に阻害する）こと、及び／または局所クロマチン状態を改変すること（例えば、標的ＤＮＡを修飾する、または標的ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する融合配列が使用される場合）のような遺伝子座特異的な調節を発揮する。場合によっては、変化は一過性である（例えば、転写の抑制または活性化）。場合によっては、その変化は遺伝性である（例えば、標的ＤＮＡまたは標的ＤＮＡに関連するタンパク質、例えばヌクレオソームヒストンに対してエピジェネティック修飾が行われる場合）。
【0301】
いくつかの態様では、ｄＣａｓはｄＣａｓ１３突然変異型である（Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７３（２０１８），６６５－６７６）。次いで、これらのｄＣａｓ１３突然変異型を、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡＲ１及びＡＤＡＲ２）を含むＲＮＡを修飾する酵素に融合させることができる。アデノシンデアミナーゼはアデニンをイノシンに変換し、翻訳機構はこれをグアニンと同様に扱い、それによってＲＮＡ配列に機能的なＡ→Ｇ変化を作り出す。いくつかの態様では、ｄＣａｓはｄＣａｓ９突然変異型である。
【0302】
いくつかの態様では、突然変異型Ｃａｓ９はＣａｓ９ニッカーゼ突然変異型である。Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異型は触媒活性があるドメイン（ＨＮＨドメインまたはＲｕｖＣドメインのいずれか）を１つだけ含む。Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異型はｇＲＮＡの特異性に基づいてＤＮＡ結合を保持するが、ＤＮＡの１本の鎖のみを切断することができ、その結果、一本鎖の切断（例えば「ニック」）を生じる。いくつかの態様では、２つの相補性のＣａｓ９ニッカーゼ突然変異型（例えば、不活化されたＲｕｖＣドメインを持つ１つのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異型、及び不活化されたＨＮＨドメインを持つ１つのＣａｓ９ニッカーゼ突然変異型）が、２つのそれぞれの標的配列に対応する２つのｇＲＮＡと共に同じ細胞内で発現され；１つの標的配列はセンスＤＮＡ鎖上にあり、もう１つはアンチセンスＤＮＡ鎖上にある。この二重ニッカーゼシステムは、二本鎖切断を生成するのに十分な近さに２つの的外れニックが生成される可能性は低いので、千鳥状の二本鎖切断をもたらし、標的の特異性を高めることができる。いくつかの態様では、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異型は、相同組換え修復による外来性核酸配列の組み込みを促進するために、核酸修復鋳型と共に共発現される。
【0303】
いくつかの態様では、本明細書に記載されているＣａｓポリペプチドは、ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を改変するように操作することができる。いくつかの態様では、突然変異型Ｃａｓポリペプチドは、親ＣａｓポリペプチドのＰＡＭ／ＰＦＳ特異性とは異なるＰＡＭ／ＰＦＳ特異性を有する。例えば、天然に存在するＣａｓタンパク質を修飾して、突然変異型Ｃａｓポリペプチドが認識するＰＡＭ／ＰＦＳ配列を変更して、的外れ部位を減らし、特異性を改善し、またはＰＡＭ／ＰＦＳ認識要件を排除することができる。いくつかの態様では、Ｃａｓタンパク質を修飾してＰＡＭ／ＰＦＳ認識配列の長さを増やすことができる。いくつかの態様では、ＰＡＭ認識配列の長さは少なくとも４、５、６、７、８、９、１０または１５アミノ酸長である。異なるＰＡＭ／ＰＦＳ配列を認識する、及び／または的外れ活性が低下したＣａｓポリペプチドは指向性進化を使用して生成することができる。Ｃａｓポリペプチドの指向性進化に使用できる例示的な方法及びシステムは、例えば、Ｅｓｖｅｌｔ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７２（７３４４）：４９９－５０３に記載されている。
【0304】
例示的なＣａｓ突然変異型は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる、国際ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１５／１６１２７６号及びＫｏｎｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１７３（２０１８），６６５－６７６に記載されている。
【0305】
３．ｇＲＮＡ
本開示は、部位特異的修飾ポリペプチドを特定の標的核酸配列に導くガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸を標的とするセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、標的核酸配列における配列に相補性であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントはハイブリッド形成（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な方法で標的核酸と相互作用し、核酸を標的とするセグメントのヌクレオチド配列はｇＲＮＡが結合するであろう標的核酸内の位置を決定する。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、標的核酸配列内の任意の所望の配列とハイブリッド形成するように修飾することができる（例えば、遺伝子操作によって）。
本開示は、部位特異的修飾ポリペプチドを特定の標的核酸配列に導くガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を提供する。ｇＲＮＡは、核酸を標的とするセグメント及びタンパク質結合セグメントを含む。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、標的核酸配列における配列に相補性であるヌクレオチド配列を含む。したがって、ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントはハイブリッド形成（すなわち、塩基対形成）を介して配列特異的な方法で標的核酸と相互作用し、核酸を標的とするセグメントのヌクレオチド配列はｇＲＮＡが結合するであろう標的核酸内の位置を決定する。ｇＲＮＡの核酸を標的とするセグメントは、標的核酸配列内の任意の所望の配列とハイブリッド形成するように修飾することができる（例えば、遺伝子操作によって）。
【0306】
ガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは部位特異的修飾ポリペプチド（例えば、Ｃａｓタンパク質）と相互作用して複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、結合したポリペプチドを、上述の核酸を標的とするセグメントを介して標的核酸内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。ｇＲＮＡのタンパク質結合セグメントは互いに相補性であり、二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つの区間を含む。
【0307】
いくつかの態様では、ｇＲＮＡは２つの別個のＲＮＡ分子を含む。いくつかの態様では、２つのＲＮＡ分子のそれぞれは、２つのＲＮＡ分子の相補性ヌクレオチドがハイブリッド形成してタンパク質結合セグメントの二本鎖ＲＮＡ二重鎖を形成するように、互いに相補性であるヌクレオチドの区間を含む。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは単一ＲＮＡ分子（ｓｇＲＮＡ）を含む。
【0308】
標的遺伝子座に対するｇＲＮＡの特異性には、標的遺伝子座内の標的核酸配列に対して相補性である約２０ヌクレオチドを含む核酸結合セグメントの配列が介在する。いくつかの態様では、対応する標的核酸配列は長さが約２０ヌクレオチドである。いくつかの態様では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的核酸配列に対して少なくとも９０％相補性である。いくつかの態様では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的核酸配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相補性である。いくつかの態様では、本開示のｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、標的遺伝子座内の標的核酸配列に対して１００％相補性である。
【0309】
いくつかの態様では、標的核酸配列はＲＮＡ標的配列である。いくつかの態様では、標的核酸配列はＤＮＡ標的配列である。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは表１に列挙されたものから選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0310】
いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれＤＮＡ結合セグメントを含む２以上のｇＲＮＡ分子を含み、その際、核酸結合セグメントの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９０％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムは、それぞれ核酸結合セグメントを含む２以上のｇＲＮＡ分子を含み、その際、核酸結合セグメントの少なくとも１つは表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。いくつかの態様では、遺伝子調節システムはそれぞれ核酸結合セグメントを含む２以上のｇＲＮＡ分子を含み、その際、核酸結合セグメントの少なくとも１つは、表１から選択される標的遺伝子の標的ＤＮＡ配列と１００％同一である標的ＤＮＡ配列に結合する。
【0311】
いくつかの態様では、本明細書に記載されているｇＲＮＡ配列の核酸結合セグメントは、特定の標的遺伝子座または標的遺伝子に特有の標的配列を特定するために、当該技術分野で知られているアルゴリズム（例えば、Ｃａｓ－ＯＦＦファインダー）を使用して的外れ結合を最小限に抑えるように設計される。
【0312】
いくつかの態様では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、ヌクレアーゼに対する安定性を導入する１以上の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含むことができる。いくつかの態様では、これらの修飾されたｇＲＮＡは非修飾ｇＲＮＡと比べて、低下した自然免疫応答を誘発してもよい。「自然免疫応答」という用語には、サイトカインの発現及び放出、特にインターフェロンの発現及び放出、及び細胞死の誘導が関与する、一般にウイルス起源または細菌起源の一本鎖核酸を含む外来性核酸に対する細胞性応答が含まれる。
【0313】
いくつかの態様では、本明細書に記載されているｇＲＮＡは、５’末端またはその近傍（例えば、それらの５’末端の１～１０、１～５、または１～２ヌクレオチド以内）で修飾される。いくつかの態様では、ｇＲＮＡの５’末端は、真核生物のｍＲＮＡキャップ構造またはキャップ類似体（例えば、Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇキャップ類似体、または３’－０－Ｍｅ－ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇアンチリバースキャップ類似体（ＡＲＣＡ））を含めることによって修飾される。いくつかの態様では、試験管内で転写されたｇＲＮＡは、ホスファターゼ（例えば、仔ウシ腸アルカリホスファターゼ）による処理によって修飾され、５’三リン酸基が取り除かれる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡは、その３’末端にまたはその近傍（例えば、その３’末端の１～１０、１～５、または１～２ヌクレオチド以内）に修飾を含む例えば、いくつかの態様では、ｇＲＮＡの３’末端は、１以上（例えば、２５～２００）のアデニン（Ａ）残基の付加によって修飾される。
【0314】
いくつかの態様では、修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドはｇＲＮＡに存在することができるが、他の遺伝子調節システム、例えば、ｍＲＮＡ、ＲＮＡｉ、またはｓｉＲＮＡに基づくシステムにも存在してもよい。いくつかの態様では、修飾されたヌクレオシド及びヌクレオチドは：
ａ． ホスホジエステル主鎖結合における非結合リン酸酸素の一方または双方、及び／または結合リン酸酸素の１以上の変更、例えば置換；
ｂ． リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、例えば置換；
ｃ． 「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大規模置換；
ｄ． 天然に存在する核酸塩基の修飾または置換；
ｅ． リボース－リン酸主鎖の置換または修飾；
ｆ． オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば末端リン酸基の除去、修飾または置換、または部分の結合；及び
ｇ． 糖の修飾のうちの１以上を含むことができる。
ａ． ホスホジエステル主鎖結合における非結合リン酸酸素の一方または双方、及び／または結合リン酸酸素の１以上の変更、例えば置換；
ｂ． リボース糖の構成要素、例えばリボース糖上の２’ヒドロキシルの変更、例えば置換；
ｃ． 「デホスホ」リンカーによるリン酸部分の大規模置換；
ｄ． 天然に存在する核酸塩基の修飾または置換；
ｅ． リボース－リン酸主鎖の置換または修飾；
ｆ． オリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端の修飾、例えば末端リン酸基の除去、修飾または置換、または部分の結合；及び
ｇ． 糖の修飾のうちの１以上を含むことができる。
【0315】
いくつかの態様では、上に挙げた修飾を組み合わせて、２、３、４、またはそれ以上の修飾を有することができる修飾ヌクレオシド及び修飾ヌクレオチドを提供することができる。例えば、いくつかの態様では、修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドは修飾された糖及び修飾された核酸塩基を有することができる。いくつかの態様では、ｇＲＮＡのあらゆる塩基が修飾される。いくつかの態様では、ｇＲＮＡ分子のリン酸基のそれぞれがホスホロチオエート基で置換される。
【0316】
いくつかの態様では、ソフトウェアツールを使用して、ユーザーの標的配列内のｇＲＮＡの選択を最適化することができ、例えば、ゲノム全体にわたる全体の的外れ活性を最小限に抑えることができる。的外れ活性は切断以外であってもよい。例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓのＣａｓ９を使用した考えられるｇＲＮＡの選択ごとに、ソフトウェアツールはミスマッチ塩基対の特定の数（例：１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）までを含有するゲノム全体にわたるすべての潜在的な的外れ配列（ＮＡＧまたはＮＧＧＰＡＭに先行する）を特定することができる。各的外れ配列における切断効率は、例えば、実験に由来する重み付けスキームを使用して予測することができる。次に、考えられる各ｇＲＮＡを、予測される的外れ切断の合計に従ってランク付けすることができ；上位にランク付けされたｇＲＮＡは、狙い通りの切断が最も大きく、的外れ切断が最も少ない可能性が高いものを表す。他の機能、例えば、ｇＲＮＡベクター構築のための自動試薬設計、的確なＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイのためのプライマー設計、及び次世代配列決定を介した的外れ切断のハイスループット検出及び定量のためのプライマー設計も、そのツールに含めることができる。
【0317】
本明細書で提供されているいくつかの方法は遺伝子操作から始まる。そのような遺伝子操作の後には、例えば、１以上の休止工程及び／または１以上の刺激工程が続くことができる。例えば、Ｔｒｅｇを遺伝子操作し、休止させ、次いで刺激することができる。あるいは、Ｔｒｅｇを遺伝子操作し、刺激し、次いで休止させることができる。
【0318】
本明細書で提供されている方法の他の態様では、１以上の休止工程及び／または１以上の刺激工程の後にＴｒｅｇを遺伝子操作することができる。例えば、Ｔｒｅｇは、第１の刺激工程、休止工程、及び第２の刺激工程の後に遺伝子操作することができる。
【0319】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは遺伝子操作の直前に刺激因子の存在下で培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは刺激剤の非存在下で遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは遺伝子操作の直後に刺激剤の非存在下で（休止して）培養される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは休止工程の間に（例えば、刺激剤の非存在下で）遺伝子操作される。
【0320】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは遺伝子操作の直前に刺激剤の非存在下で培養される。
【0321】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日～約１２日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日～約１１日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日～約１０日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日～約９日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日～約８日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日～約１２日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日～約１１日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日～約１０日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日～約９日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日～約８日後に遺伝子操作される。
【0322】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて少なくとも６日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて少なくとも７日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて少なくとも８日後に遺伝子操作される。
【0323】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約６日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約７日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約８日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約９日後に遺伝子操作される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは培養にて約１０日後に遺伝子操作される。
【0324】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計１０日を超えない後に遺伝子操作され、その際、合計１０日には５日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計９日を超えない後に遺伝子操作され、その際、合計９日には５日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計８日を超えない後に遺伝子操作され、その際、合計８日には５日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計７日以内の後に遺伝子操作され、その際、合計７日には連続５日を超える日は含まれない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計６日を超えない後に遺伝子操作され、その際、合計６日には５日を超える連続した日を含まない。
【0325】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計少なくとも４日の後に遺伝子操作され、その際、合計４日には３日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計少なくとも５日の後に遺伝子操作され、その際、合計５日には３日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計少なくとも６日の後に遺伝子操作され、その際、合計４日には６日を超える連続した日を含まない。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、刺激剤への曝露の合計少なくとも７日の後に遺伝子操作され、その際、合計７日には５日を超える連続した日を含まない。
【0326】
遺伝子操作前の培養日数は、例えば、第１の刺激工程、休止工程、及び第２の刺激工程を含むことができる。
【0327】
いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＴｒｅｇ集団が約１００倍～約５００倍に増殖した時点で遺伝子操作される。いくつかの態様では、ＴｒｅｇはＴｒｅｇ集団が約２５０倍に増殖した時点で遺伝子操作される。
【0328】
Ｔｒｅｇの単離
増殖の前に、Ｔｒｅｇは、例えば、対象から、または対象から得られた試料から単離することができる。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象の末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、臍帯血、または組織試料から得られる。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象の末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、臍帯血、または組織試料から得られる試料から得られる。対象は、例えば、ヒト対象のような哺乳類対象であることができる。
増殖の前に、Ｔｒｅｇは、例えば、対象から、または対象から得られた試料から単離することができる。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象の末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、臍帯血、または組織試料から得られる。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象の末梢血、胸腺、リンパ節、脾臓、骨髄、臍帯血、または組織試料から得られる試料から得られる。対象は、例えば、ヒト対象のような哺乳類対象であることができる。
【0329】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは末梢血から得られる。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇヒト末梢血から得られる。
【0330】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇはヒト末梢血由来のＰＢＭＣから得られ、その際、ＣＤ４＋Ｔ細胞は陰性免疫磁気選択（例えば、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キットを使用）を介して単離され、ＣＤ４＋Ｔ細胞はＣＤ２５、ＣＤ４、ＣＤ１２７、及びｈＣＤ４５ＲＡに対する抗体で標識され、且つＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋Ｔｒｅｇが選択される。
【0331】
ＰＢＭＣは密度勾配沈降によって血液から単離することができ、ＣＤ４＋Ｔ細胞は磁気細胞選別によるＰＢＭＣからの陽性選択によって濃縮することができる。ＣＤ４＋Ｔ細胞を次いで、ＣＤ４、ＣＤ２５、ＣＤ１２７のような制御性Ｔ細胞マーカーに特異的な蛍光標識抗体で染色し、その後、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分離してＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇを濃縮し、例えばＣＤ４＋ＣＤ２５－ＣＤ１２７＋の従来のＴ細胞から分離することができる。
【0332】
Ｔｒｅｇを含有する試料が分離されると、Ｔｒｅｇを濃縮することができる。Ｔｒｅｇは、例えば、免疫抑制性Ｔｒｅｇに特異的な細胞表面マーカーの選択を標的とし、ＦＡＣＳ、固相磁気ビーズ等のような自動細胞選別を使用して分離することによって濃縮することができる。Ｔｒｅｇを濃縮する方法は、例えば、米国特許第７，７２２，８６２号にて提供されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。濃縮には陽性選択及び／または陰性選択が含まれ得る。例えば、陰性選択を使用して、例えば、ＣＤ８、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＣＤ１９、ＣＤ３６、及び／またはＣＤ５６のような非Ｔｒｅｇ細胞型に特異的な表面マーカーを持つ細胞を取り除くことができる。
【0333】
いくつかの態様では、例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞のＦＡＣＳを使用する、ＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋細胞についての細胞選別を使用してＴｒｅｇは単離される。いくつかの態様では、合計ＣＤ４５ＲＡｈｉＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４＋細胞についての細胞選別を使用してＴｒｅｇは単離される。
【0334】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、磁気ビーズを使用してＣＤ２５＋Ｔ細胞を濃縮することによって単離される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用してＣＤ２５＋Ｔ細胞を濃縮することによって単離される。
【0335】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、ＣＤ４及びＣＤ２５の存在、ならびにＩＬ－７Ｒ（ＣＤ１２７）のα鎖の欠如に基づいて単離される。
【0336】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは磁気ビーズを使用しないで単離される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは人工抗原提示細胞を使用しないで単離される。いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは磁気ビーズまたは人工抗原提示細胞を使用しないで単離される。
【0337】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは、リンパ球密度勾配遠心分離を使用して対象から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、磁気ビーズを使用してＣＤ８＋細胞を枯渇させ、次いでＣＤ２５＋Ｔ細胞を濃縮することによって得られる。
【0338】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇはビーズ分離によって（例えば、対象から）単離される。
【0339】
増殖したＴｒｅｇの用途
本明細書で提供されているのはまた、本明細書で提供されている方法に従って増殖させているＴｒｅｇを使用する方法である。例えば、増殖したＴｒｅｇを対象に投与することができる。投与は、例えば、対象にて自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するため、対象にて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防するため、及び／または対象にて免疫応答を低下させるためであることができる。対象は、哺乳類対象、例えば、ヒト対象であることができる。
本明細書で提供されているのはまた、本明細書で提供されている方法に従って増殖させているＴｒｅｇを使用する方法である。例えば、増殖したＴｒｅｇを対象に投与することができる。投与は、例えば、対象にて自己免疫疾患または炎症性疾患を治療するため、対象にて移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を治療または予防するため、及び／または対象にて免疫応答を低下させるためであることができる。対象は、哺乳類対象、例えば、ヒト対象であることができる。
【0340】
いくつかの態様では、自己免疫性または炎症性の疾患または障害は、乾癬、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、Ｉ型糖尿病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、潰瘍性大腸炎、クローン病、ＨＣＶに関連する血管炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、シェーグレン症候群、自己免疫性肝炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、大腸炎、血管炎、側頭動脈炎、狼瘡、セリアック病、リウマチ性多発筋痛、及び関節炎から成る群から選択される。
【0341】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象から得られ、本明細書で提供されている任意の方法に従って増殖させ、次いで同じ対象に投与される。したがって、本明細書で提供されている増殖したＴｒｅｇの使用は自家性であることができる。
【0342】
いくつかの態様では、Ｔｒｅｇは対象から得られ、本明細書で提供されている任意の方法に従って増殖させ、次いで異なる対象に投与される。したがって、本明細書で提供されている増殖したＴｒｅｇの使用は同種異系間であることができる。
【0343】
症状の治療または予防に有効であろうＴｒｅｇの量は疾患の性質に左右されるであろう。採用されるべき正確な用量は、投与経路及び状態の重篤度にも依存するであろう。通常、Ｔ細胞療法の施行は体重１キログラムあたりの細胞数によって定義される。しかしながら、Ｔ細胞は投与後に複製し、増殖する。細胞は当該技術分野で知られている注入技術によって投与することができる。
【実施例】
【0344】
本明細書に記載されている実験は、自己免疫疾患の治療のための免疫療法としての臨床使用のためにヒト制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の増殖を最大化するための周期的な試験管内アプローチを使用する。
【0345】
実施例１：材料及び方法
材料
ｇＲＮＡ：示されている場合、すべての実験では単一分子のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が使用されている。二重ｇＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼを含まない二重鎖緩衝液（ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０３－０１）にて２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）を２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）によって９５℃で５分間二重鎖化し、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖１００μＭを形成することによって形成されたが、その際、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは１：１の比率で存在する。
材料
ｇＲＮＡ：示されている場合、すべての実験では単一分子のｇＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が使用されている。二重ｇＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼを含まない二重鎖緩衝液（ＩＤＴカタログ番号１１－０１－０３－０１）にて２００μＭのｔｒａｃｒＲＮＡ（ＩＤＴカタログ番号１０７２５３４）を２００μＭの標的特異的ｃｒＲＮＡ（ＩＤＴ）によって９５℃で５分間二重鎖化し、ｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二本鎖１００μＭを形成することによって形成されたが、その際、ｔｒａｃｒＲＮＡとｃｒＲＮＡは１：１の比率で存在する。
【0346】
Ｃａｓ９：Ｃａｓ９はＳ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴ Ｃａｔ＃１０７４１８２）の導入によって標的細胞にて発現された。
【0347】
ＲＮＰ：ｇＲＮＡ－Ｃａｓ９リボ核タンパク質（ＲＮＰ）は、１．２μＬの１００μＭｔｒａｃｒＲＮＡ：ｃｒＲＮＡ二重鎖を、１μＬの２０μＭＣａｓ９タンパク質及び０．８μＬのＰＢＳと混合することによって形成された。混合物を室温で２０分間インキュベートしてＲＮＰ複合体を形成した。
【0348】
方法
ヒトＴｒｅｇ細胞の単離：末梢血Ｔｒｅｇ細胞を新鮮な白血球パックまたは健康なボランティア献血者由来の全血から段階的に単離した。まず、ＥａｓｙＳｅｐ直接ヒトＰＢＭＣ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９６５４）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５２）を使用して、陰性免疫磁気選択を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｈＣＤ２５（ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ｈＣＤ４（ＡＰＣ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｈＣＤ１２７（ＢＶ４２１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びｈＣＤ４５ＲＡ（ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する抗体で標識し、次いで以下のパラメーター：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋に基づいて選別した。
ヒトＴｒｅｇ細胞の単離：末梢血Ｔｒｅｇ細胞を新鮮な白血球パックまたは健康なボランティア献血者由来の全血から段階的に単離した。まず、ＥａｓｙＳｅｐ直接ヒトＰＢＭＣ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１９６５４）を使用して末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。次に、ＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１７９５２）を使用して、陰性免疫磁気選択を介してＣＤ４＋Ｔ細胞を単離した。単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞を、ｈＣＤ２５（ＰＥ、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、ｈＣＤ４（ＡＰＣ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、ｈＣＤ１２７（ＢＶ４２１、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びｈＣＤ４５ＲＡ（ＡＰＣ－Ｃｙ７、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に対する抗体で標識し、次いで以下のパラメーター：ＣＤ４＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏＣＤ４５ＲＡ＋に基づいて選別した。
【0349】
生体外でのヒトＴｒｅｇ細胞の増殖：単離したＴｒｅｇを、１０％ヒト熱非働化血清、ヒトＩＬ－２（８００単位／ｍＬ）、Ｎ－アセチル－Ｌ－システイン（５ｍＭ）、及び１０μｌ／ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／２８／２四量体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９７０））を補充したＸ－ＶＩＶＯ １５Ｔ細胞増殖培地（Ｌｏｎｚａ、カタログ番号０４－４１８Ｑ）（以下、Ｔｒｅｇ培地と呼ぶ）にて１．２５×１０５細胞／ｍＬ（ウェルあたり０．２ｍＬ）で９６ウェルＵ底プレート（Ｆａｌｃｏｎ、ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）に播種した。培養３日目に細胞を洗浄し、ＩＬ－２を含有するＴｒｅｇ培地に元の濃度で再播種し、３日間増殖させた。この増殖期の間に、細胞を毎日分割して１．２５×１０５細胞／ｍＬの濃度を維持した。培養６日目に、細胞をＣＤ３／２８／２四量体（１０μｌ／ｍＬ）で再刺激し、濃度を５×１０５細胞／ｍＬに調整した（この細胞密度は培養期間の残りの間維持された）。ＩＬ－２の濃度は、培養の最初の７日間は８００単位／ｍＬに維持し、その後３００単位／ｍＬに減らした。四量体は各刺激サイクルの初日にのみ培養物に添加され、毎日補充されることはなかった。残りの培養期間を通して、刺激と増殖のサイクルを３～４日ごとに繰り返した。培養Ｔｒｅｇ細胞の純度は、以下に概説するようなフローサイトメトリーによって定期的にチェックした。
【0350】
Ｔｒｅｇ細胞のＲＮＰ形質移入：示されている場合、Ｃａｓ９－ＲＮＰを使用してＴｒｅｇを以下のように編集した：培養８日目にＴｒｅｇ細胞を洗浄し、５×１０７細胞／ｍＬでＰＢＳに再浮遊させた。Ｔｒｅｇ細胞に無関係な遺伝子であるＯＲ１Ａ１（配列番号７：ＧＣＴＧＡＣＣＡＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧ）を標的とする単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を試験管内にて９５℃で５分間、トランス活性化ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と複合体形成させた。新しく生成された二重鎖分子を材料（前出）に記載されているようなＣａｓ９タンパク質と混合し、室温で２０分間インキュベートして、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を形成した。エレクトロポレーションの直前に、細胞をヌクレオフェクション緩衝液（１８％のサプリメント１、Ａｍａｘａ Ｐ３初代細胞４Ｄ－ＮｕｃｌｅｆｅｃｔｏｒＸキット Ｓ（カタログ番号Ｖ４ＸＰ－３０３２）からの８２％ Ｐ３緩衝液）に８×１０７細胞／ｍＬの濃度で再浮遊させた。この細胞浮遊液を、上記の工程で得たＲＮＰ溶液及び不活性一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド（Ａｌｔ－Ｒ Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー）と２０：５：１の比率で混合した。「Ｔ細胞、ヒト、刺激」プログラム（ＥＯ－１１５）に従って細胞をエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの後、８０μＬの温めたＸ－ＶＩＶＯ１５培地を各ウェルに添加し、ＩＬ－２（３００単位／ｍＬ）を含有するＸ－ＶＩＶＯ１５培地中にて２×１０６細胞／ｍＬの密度で細胞を培養フラスコにプールした。
【0351】
編集効率の評価この方法では、Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号：１３３２３）を使用して業者推奨のプロトコールに従って編集したＴ細胞からゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離し、定量した。ｇＤＮＡの単離に続いて、Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｎｅｘｔ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ配列決定アダプターの添加に必要なオーバーハングを含有する遺伝子座特異的なＰＣＲプライマーを使用して、編集されたゲノムＤＮＡの領域を増幅するためにＰＣＲを実行した。得られたＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動し、ゲノム遺伝子座の特異的かつ適切な増幅が確実に行われるようにした後、Ｍｏｎａｒｃｈ ＰＣＲ ＆ ＤＮＡ Ｃｌｅａｎｕｐ Ｋｉｔ（カタログ番号：Ｔ１０３０Ｓ）を使用して業者推奨のプロトコールに従ってＰＣＲクリーンアップを実施した。次に、精製されたＰＣＲ産物を定量し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定アダプターと多重化に必要な試料固有のインデックス配列をアニーリングするために２回目のＰＣＲを実行した。この後、ＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズ（社内で製造）を使用して精製する前に、ＰＣＲ産物を１％アガロースゲル上で泳動してサイズを評価した。次に、精製されたＰＣＲ産物を、Ｋａｐａ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（カタログ番号：ＫＫ４９２３）及びＫａｐａ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ＤＮＡ Ｓｔａｎｄａｒｄｓ（カタログ番号：ＫＫ４９０３）を使用したｑＰＣＲによって定量した。次に、定量した生成物を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０中出力試薬カートリッジｖ２（カタログ番号：ＦＣ－４０４－２００３）を使用してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００システムに負荷した。作成した配列決定データの分析を実行して、編集したＴ細胞プールのＤＮＡの予想される切断部位での挿入と欠失（インデル）を評価した。
【0352】
ＯＲ１Ａ１編集Ｔｒｅｇ細胞の免疫表現型検査及びＴＳＤＲ分析：培養Ｔｒｅｇ細胞の純度を、ＣＤ４の表面染色（クローンＳＫ３、室温で１０分間）、その後の生存率染色（ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ ＦｉｘａｂｌｅＮｅａｒ－ＩＲ染色、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｌ３４９７５、室温で５分）、固定／透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＦｏｘＰ３／転写因子染色緩衝液セット、カタログ番号：００－５５２３－００、室温で４５分）、そして最後に、Ｈｅｌｉｏｓ（クローン２２Ｆ６）及びＦｏｘＰ３（クローン２５９Ｄ／Ｃ７）の室温での３０分間の細胞内染色によって増殖の間、定期的に調べた。データ収集には ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ＦｌｏｗＪｏ ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を使用して分析を実行した。ＴＳＤＲ分析では、ＯＲ１Ａ１についてＴｒｅｇ細胞を編集してから１２日後に、細胞を上記のように抗ｈＣＤ４及び生存色素で染色し、続いて０．５％パラホルムアルデヒド（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、カタログ番号４２０８０１）で室温にて１０分間固定した。固定した細胞を１％ＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗浄し、細胞膜を透過化するために氷冷メタノール（１００％）にて氷上で３０分間インキュベートし、その後上記のようにＨｅｌｉｏｓ及びＦｏｘＰ３について細胞内染色した。染色後、細胞を洗浄し、１％ＢＳＡを伴うＰＢＳに再浮遊させ、ＢＤ ＦＡＣＳＡｒｉａ ＩＩ細胞選別機にてＦｏｘＰ３－、ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓ－、ＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓｌｏ、及びＦｏｘＰ３＋Ｈｅｌｉｏｓｈｉ（１×１０６細胞／サブセット）として選別した。Ｑｉａｇｅｎ Ｂｌｏｏｄ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ＤＮＡ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（カタログ番号：１３３２３）を使用して業者推奨のプロトコールに従って、上述のような選別された集団のそれぞれからゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を単離した。ゲノムＤＮＡの重亜硫酸塩変換とパイロシーケンスをＥｐｉｇｅｎＤｘ（アッセイＩＤ ＡＤＳ７８３－ＦＳ２）によって実行し、ＦｏｘＰ３遺伝子領域のメチル化状態を定量した。
【0353】
Ｔｒｅｇによる同種異系または自家のＴエフェクター細胞の試験管内抑制：新鮮なまたは凍結したＴｒｅｇの抑制機能は、Ｃａｎａｖａｎ ｅｔ ａｌ．（”Ａ ｒａｐｉｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｈｕｍａｎ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｔｏ ｅｎａｂｌｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ”Ｂｌｏｏｄ．２０１２，Ｆｅｂ，２３；１１９（８））によって開発されたＦａｓｔＩｍｍｕｎｅ法の改変版、と同様に社内で開発された従来の試験管内抑制アッセイを使用して決定した。凍結したＴｒｅｇの場合、アッセイ開始の４日前に細胞を解凍し、ＩＬ－２（３００単位／ｍＬ）を含有するＴｒｅｇ培地中で一晩静置した。一晩静置したＴｒｅｇを、１０μｌ／ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／２８／２四量体（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１０９７０）及びＩＬ－２（３００単位／ｍＬ）を含有するＴｒｅｇ培地にて再刺激した。アッセイ開始の１日前、凍結した同種異系または自家のＰＢＭＣを解凍し、以下のように細胞追跡バイオレット（ＣＴＶ）で標識した；０．１％ＢＳＡを含有するＰＢＳでＰＢＭＣを２回洗浄した後、細胞を２．５×１０７細胞／ｍＬで同じ緩衝液に再浮遊させた。等量のＣＴＶ（１２．５μＭ）を細胞浮遊液にゆっくりと加え、続いて暗所、室温にて８分間インキュベートした。標識した細胞を１０容量のＴｒｅｇ培地で３回洗浄し、ＩＬ－２（１００単位／ｍＬ）を含有する同じ培地に１×１０６細胞／ｍＬで再浮遊させた。翌日、標識したＰＢＭＣを１回洗浄して残留ＩＬ－２を除去し、Ｔｒｅｇ培地に５×１０５細胞／ｍＬで再浮遊させた。次いで、ウェル当たりこの細胞浮遊液５０マイクロリットルを２枚の９６ウェルＵ底プレート（各アッセイに１枚）に加えた。予め活性化したＴｒｅｇ細胞を２回洗浄してＩＬ－２及び四量体を除去し、Ｔｒｅｇ培地中に５×１０５細胞／ｍＬで再浮遊させた。Ｔｒｅｇ 細胞の５段階の２倍連続希釈を別のプレート上にて２つ組で調製し、そこから５０μｌを２つのアッセイプレートのそれぞれに移し、Ｔｒｅｇ：ＰＢＭＣ比が１／１～１／１６になるようにし、最後の行はＰＢＭＣのみを含有した。Ｄｙｎａｂｅａｄｓ Ｈｕｍａｎ Ｔｒｅｇ Ｅｘｐａｎｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１１１２９Ｄ、７’５００ビーズ／ウェル）及びＡＰＣ結合抗ヒトＣＤ４０ＬｍＡｂ（クローン２４－３１、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄカタログ番号３１０８０５、１：５０希釈）をウェルあたり０．２ｍＬの最終容量でＦａｓｔＩｍｍｕｎｅ Ａｓｓａｙの各ウェルに添加した。試験管内抑制アッセイプレートにウェルあたり０．１ｍＬのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ ＣＤ３／２８／２四量体（３μｌ／ｍＬ）を加えた。３７℃で７～１２時間インキュベートした後、ＦａｓｔＩｍｍｕｎｅアッセイを停止し、細胞をＣＤ３（クローンＨＩＴ３ａ）、ＣＤ４（クローンＳＫ３）、ＣＤ８（クローンＳＫ１）及びＣＤ６９（クローンＦＮ５０）に対するｍＡｂで染色した（ｍＡｂはすべてＢｉｏＬｅｇｅｎｄから購入した）。Ｔｒｅｇ抑制のレベルは、Ｔｒｅｇの非存在下及び存在下で培養したＴエフェクター細胞上のＣＤ４０Ｌ及びＣＤ６９の発現（平均蛍光強度）を比較するフローサイトメトリーによって決定した。従来の抑制アッセイは４日間のインキュベート後に終了し、細胞をＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８について染色した （クローン及び業者については上記を参照のこと）。ＣＤ４及びＣＤ８Ｔエフェクター細胞についてのＣＴＶ希釈をフローサイトメトリーで捕捉し、ＦｌｏｗＪｏ（ＴｒｅｅＳｔａｒ Ｉｎｃ）のＤｉｖｉｓｉｏｎ Ｉｎｄｅｘを使用して、元の集団内の細胞が受けた細胞分裂の平均回数を計算した。
【0354】
実施例２：Ｔｒｅｇの増殖に対する連続刺激と不連続刺激の効果
刺激期間（すなわち、刺激が存在する場合）の後に非刺激条件の期間（すなわち、刺激が存在しない場合）が続く不連続な刺激投与計画を実施することによってＴｒｅｇの増殖が加速できるかどうかを調べるためにアッセイを実施した。ヒトＴｒｅｇを末梢血から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏとしてＦＡＣＳ選別し、次いでＩＬ－２及びＮＡＣの存在下でＣＤ３／２８／２四量体抗体（白抜き記号）またはＣＤ３／２８でコーティングした磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激した。３日間の培養後、細胞を洗浄し、計数し、次いで四量体抗体（Ａｂ）／Ｄｙｎａｂｅａｄｓの有無にかかわらず培地とＩＬ－２を含有する２つの別々のウェルに分割した。培養６日目に細胞を再度計数したところ、その時点で不連続刺激を受けたＴｒｅｇは約４０倍に増殖していたのに対して、連続刺激したＴｒｅｇは約２０倍にすぎなかった。（図１を参照）。細胞が四量体ＡｂまたはＤｙｎａｂｅａｄｓのどちらで刺激されたかに関係なく、２つの条件間の増殖の差異が観察された。（同上を参照のこと）。
実施例３：Ｔｒｅｇの活性化に対する連続刺激と不連続刺激の効果
刺激期間（すなわち、刺激が存在する場合）の後に非刺激条件の期間（すなわち、刺激が存在しない場合）が続く不連続な刺激投与計画を実施することによってＴｒｅｇの増殖が加速できるかどうかを調べるためにアッセイを実施した。ヒトＴｒｅｇを末梢血から単離したＣＤ４＋Ｔ細胞からＣＤ４５ＲＡ＋ＣＤ２５ｈｉＣＤ１２７ｌｏとしてＦＡＣＳ選別し、次いでＩＬ－２及びＮＡＣの存在下でＣＤ３／２８／２四量体抗体（白抜き記号）またはＣＤ３／２８でコーティングした磁性Ｄｙｎａｂｅａｄｓで刺激した。３日間の培養後、細胞を洗浄し、計数し、次いで四量体抗体（Ａｂ）／Ｄｙｎａｂｅａｄｓの有無にかかわらず培地とＩＬ－２を含有する２つの別々のウェルに分割した。培養６日目に細胞を再度計数したところ、その時点で不連続刺激を受けたＴｒｅｇは約４０倍に増殖していたのに対して、連続刺激したＴｒｅｇは約２０倍にすぎなかった。（図１を参照）。細胞が四量体ＡｂまたはＤｙｎａｂｅａｄｓのどちらで刺激されたかに関係なく、２つの条件間の増殖の差異が観察された。（同上を参照のこと）。
実施例３：Ｔｒｅｇの活性化に対する連続刺激と不連続刺激の効果
【0355】
３日間の非刺激条件がＴｒｅｇの活性化状態にどのような影響を与えるかを評価するためにアッセイを実行した。細胞の前方散乱（ＦＳＣ）プロファイルに比例する相対的な細胞サイズは、試験管内で培養されたＴ細胞の活性化状態の指標として一般的に使用される：ナイーブ細胞は表面積が小さいため、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ライゲーションを受けた活性化細胞に比べてＦＳＣ値は低くなる。この実験の結果は、３日間刺激され、その後３日間非刺激条件が続いたＴｒｅｇは、６日間連続で刺激したＴｒｅｇよりも表面積が大幅に小さいことを示している。（図２を参照のこと）。
【0356】
実施例４：Ｔｒｅｇの増殖に対する長期非刺激の影響
長期間の非刺激条件がＴｒｅｇの増殖にどのような影響を与えるかを実証するためのアッセイを実施した。図１に示すように、刺激の後に３日間の非刺激条件が続くと、Ｔｒｅｇの増殖が加速される。非刺激条件の期間が７日間に延長されると、１０日目にＴｒｅｇが再刺激された場合でも、０日目と１１日目の間の増殖倍数として決定される増殖は基準条件（連続刺激）と比べて減少する。（図３を参照のこと）。
長期間の非刺激条件がＴｒｅｇの増殖にどのような影響を与えるかを実証するためのアッセイを実施した。図１に示すように、刺激の後に３日間の非刺激条件が続くと、Ｔｒｅｇの増殖が加速される。非刺激条件の期間が７日間に延長されると、１０日目にＴｒｅｇが再刺激された場合でも、０日目と１１日目の間の増殖倍数として決定される増殖は基準条件（連続刺激）と比べて減少する。（図３を参照のこと）。
【0357】
実施例５：操作したＴｒｅｇの増殖に対する連続刺激と不連続刺激の効果
不連続刺激（ＤＳＯＲＴ（商標））または連続刺激（基準）に供されたＴｒｅｇのＣＲＩＳＰＲ操作後の細胞回復を比較するためにアッセイを実施した。細胞が約２５０倍に増殖したときに操作を実行した。ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇは８日目に約２５０倍に増殖し；基準のＴｒｅｇは１１日目に約２５０倍に増殖した。Ｃａｓ９タンパク質と一緒に細胞に形質移入（エレクトロポレーション）したＴｒｅｇ非関連遺伝子Ｏｒ１ａ１に対する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して操作を実行した。
不連続刺激（ＤＳＯＲＴ（商標））または連続刺激（基準）に供されたＴｒｅｇのＣＲＩＳＰＲ操作後の細胞回復を比較するためにアッセイを実施した。細胞が約２５０倍に増殖したときに操作を実行した。ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇは８日目に約２５０倍に増殖し；基準のＴｒｅｇは１１日目に約２５０倍に増殖した。Ｃａｓ９タンパク質と一緒に細胞に形質移入（エレクトロポレーション）したＴｒｅｇ非関連遺伝子Ｏｒ１ａ１に対する単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を使用して操作を実行した。
【0358】
形質移入当日、形質移入１日後、その後の試験の残りの期間は１～２日ごとに生存Ｔｒｅｇの数を測定した。ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇ（白抜き四角）は遺伝子操作後さらに３倍に増殖し続けた一方で、基準Ｔｒｅｇ（黒丸）は形質移入後に遺伝子操作前のレベルに回復できなかった。（図４を参照のこと）
【0359】
実施例６：ＤＳＯＲＴ（商標）増殖プロトコールと他の増殖プロトコールの比較
ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの増殖速度を、生体外増殖用の公的に入手可能なプロトコールを使用して生成されるＴｒｅｇの増殖速度と比較した。結果を図５に示す。上のグラフは３人の異なるドナーから単離され、増殖の８日目に対照遺伝子（Ｏｒ１ａ１）について操作したＴｒｅｇの１１日間にわたる生体外ＤＳＯＲＴ（商標）増殖における細胞数（左ｙ軸）と増殖倍率（右ｙ軸）を示す。下の表は２０１５年から２０１９年の間に公開された種々の試験に由来するＴｒｅｇの対応する増殖倍率を示す。これらの公開された試験におけるＴｒｅｇは１１日を超えて培養されており、遺伝子操作されていなかった。上のグラフからのＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの平均増殖倍率は参考のために表（「ＫＳＱ Ｔｘ ２０２０」とラベル付け）に含まれている。この表の結果は、操作されたＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの増殖倍率が、他の増殖プロトコールに従った操作されていないＴｒｅｇで観察された最高増殖倍率であってもそのほぼ２倍であったことを示している。
ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの増殖速度を、生体外増殖用の公的に入手可能なプロトコールを使用して生成されるＴｒｅｇの増殖速度と比較した。結果を図５に示す。上のグラフは３人の異なるドナーから単離され、増殖の８日目に対照遺伝子（Ｏｒ１ａ１）について操作したＴｒｅｇの１１日間にわたる生体外ＤＳＯＲＴ（商標）増殖における細胞数（左ｙ軸）と増殖倍率（右ｙ軸）を示す。下の表は２０１５年から２０１９年の間に公開された種々の試験に由来するＴｒｅｇの対応する増殖倍率を示す。これらの公開された試験におけるＴｒｅｇは１１日を超えて培養されており、遺伝子操作されていなかった。上のグラフからのＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの平均増殖倍率は参考のために表（「ＫＳＱ Ｔｘ ２０２０」とラベル付け）に含まれている。この表の結果は、操作されたＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇの増殖倍率が、他の増殖プロトコールに従った操作されていないＴｒｅｇで観察された最高増殖倍率であってもそのほぼ２倍であったことを示している。
【0360】
実施例７：Ｔｒｅｇの安定性に対する連続刺激と不連続刺激の効果
不連続な刺激を受けた場合に、Ｔｒｅｇが試験管内で系列安定性をどのように維持するかを検討するためのアッセイを実行した。
不連続な刺激を受けた場合に、Ｔｒｅｇが試験管内で系列安定性をどのように維持するかを検討するためのアッセイを実行した。
【0361】
ＨｅｌｉｏｓはＴｒｅｇにてＦｏｘＰ３の発現を強化する転写因子である。ある細胞世代から次の世代まで安定性を維持するＴｒｅｇは、完全に脱メチル化されたＴｒｅｇ特異的脱メチル化領域（ＴＳＤＲ、ＦｏｘＰ３遺伝子内の遺伝子座）を有するのに対して、試験管内でエフェクターＴ細胞から変換された（いわゆる誘導型Ｔｒｅｇ）、または炎症条件下で不安定化しやすいＴｒｅｇのＴＳＤＲは部分的にメチル化されている。この実験のＴｒｅｇはＦｏｘＰ３とＨｅｌｉｏｓの発現に基づいて４つのサブセットに選別された。次に、選別された細胞をＤＮＡメチル化アッセイ（パイロシークエンシング）を使用して分析し、ＴＳＤＲ遺伝子座のメチル化レベルを決定した。図６Ａに示す結果は、Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇのみが完全に脱メチル化されたＴＳＤＲを有したことを示している。
【0362】
種々の割合のＨｅｌｉｏｓ＋細胞を含むＴｒｅｇを、エフェクターＴ細胞の増殖を抑制するＴｒｅｇの能力を測定する従来の試験管内抑制アッセイに供した。図６Ｂでは、抑制のレベル（ｘ軸、倍率変化、ＦＣとして示される）をＨｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇの割合（ｙ軸）に対してプロットした。Ｈｅｌｉｏｓ＋細胞の割合が高いＴｒｅｇはエフェクターＴ細胞の増殖の抑制において、Ｈｅｌｉｏｓ＋細胞の割合が低いＴｒｅｇよりも優れていた。このデータはＴｒｅｇ機能のマーカーとしてのＨｅｌｉｏｓの重要性を裏付けている。
【0363】
ＤＳＯＲＴ（商標）プロトコールを使用して生成されたＨｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇの割合を、培養１２日目の基準（途切れることなく刺激された）Ｔｒｅｇを使用して生成されたＨｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇの割合と比較した。図６Ｃに示す結果は、ＤＳＯＲＴ（商標）プロトコールを使用して生成されるＴｒｅｇの大部分がＨｅｌｉｏｓ＋であったことを示している。
【0364】
実施例８：Ｔｒｅｇの抑制活性に対する連続刺激と不連続刺激の効果
ＤＳＯＲＴ（商標）（黒四角）と基準（途切れることなく刺激された）Ｔｒｅｇ（白抜き四角）の抑制機能を比較するためにアッセイを実行した（図７）。図７に提示されたグラフは、ＴｒｅｇのＰＢＭＣに対する種々の比率（ｘ軸）でのＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖を示す（ｙ軸にて最大増殖の％として示す）。グラフにおける水平破線はＩＣ５０（５０％抑制時のＴｒｅｇ：ＰＢＭＣの比）を示す。図７に提示する表は、複数のドナーからのＤＳＯＲＴ（商標）及び基準のＴｒｅｇのＩＣ５０値を示す。これらのデータに基づくと、ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇは基準Ｔｒｅｇよりも少なくとも８倍抑制性である。
＊ ＊ ＊
ＤＳＯＲＴ（商標）（黒四角）と基準（途切れることなく刺激された）Ｔｒｅｇ（白抜き四角）の抑制機能を比較するためにアッセイを実行した（図７）。図７に提示されたグラフは、ＴｒｅｇのＰＢＭＣに対する種々の比率（ｘ軸）でのＣＤ４＋エフェクターＴ細胞の増殖を示す（ｙ軸にて最大増殖の％として示す）。グラフにおける水平破線はＩＣ５０（５０％抑制時のＴｒｅｇ：ＰＢＭＣの比）を示す。図７に提示する表は、複数のドナーからのＤＳＯＲＴ（商標）及び基準のＴｒｅｇのＩＣ５０値を示す。これらのデータに基づくと、ＤＳＯＲＴ（商標）Ｔｒｅｇは基準Ｔｒｅｇよりも少なくとも８倍抑制性である。
＊ ＊ ＊
【0365】
本明細書に引用されている特許及び刊行物はすべて、その全体的が参照によって本明細書に完全に組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】