特表 2024-507426 カタツムリ粘液（ＡＣＨＡＴＩＮＡ ＦＵＬＩＣＡ）由来のヘパリン様物質の単離、精製、および特徴付けの新規な方法ならびにその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-20

(54)【発明の名称】カタツムリ粘液（ＡＣＨＡＴＩＮＡ ＦＵＬＩＣＡ）由来のヘパリン様物質の単離、精製、および特徴付けの新規な方法ならびにその使用

(51)【国際特許分類】

   C12P 19/04 20060101AFI20240213BHJP

   A61K 35/618 20150101ALI20240213BHJP

   A61P 31/14 20060101ALI20240213BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240213BHJP

   A61P 37/04 20060101ALI20240213BHJP

   A61K 31/737 20060101ALI20240213BHJP

【ＦＩ】

C12P19/04 Z

A61K35/618

A61P31/14

A61P35/00

A61P37/04

A61K31/737

【審査請求】有

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023533218

(86)(22)【出願日】2021-01-08

(85)【翻訳文提出日】2023-07-10

(86)【国際出願番号】 TH2021000001

(87)【国際公開番号】W WO2022150018

(87)【国際公開日】2022-07-14

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523200424

【氏名又は名称】アデン インターナショナル カンパニー リミテッド

【氏名又は名称原語表記】ＡＤＥＮ ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ ＣＯ．，ＬＴＤ．

【住所又は居所原語表記】５９９／３３０ Ｒａｃｈａｄａｐｉｓｅｋ Ｒｏａｄ， Ｊａｔｕｊａｋ， Ｂａｎｇｋｏｋ， １０９００ （ＴＨ）

(74)【代理人】

【識別番号】110003487

【氏名又は名称】弁理士法人東海特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】コンタウェラート，プラチャ

【テーマコード（参考）】

4B064

4C086

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B064AF17

4B064CA21

4B064CE02

4B064CE03

4B064CE08

4B064CE10

4B064CE11

4B064CE17

4B064DA01

4B064DA05

4C086AA01

4C086AA02

4C086EA26

4C086MA01

4C086MA04

4C086NA14

4C086ZB09

4C086ZB26

4C086ZB33

4C087AA01

4C087AA02

4C087AA04

4C087AA05

4C087BB13

4C087CA03

4C087CA14

4C087NA14

4C087ZB09

4C087ZB26

4C087ZB33

(57)【要約】

ヘパリン様物質（ＨＬＳ）は、高度に硫酸化したグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）であるヘパリンと類似する構造を有している。マスト細胞の産物である多糖は、動物組織（ブタ腸粘膜、ウシの肺）から単離され、また、抗凝血活性を有しており、アンチトロンビンおよびプロテアーゼ阻害剤を活性化する。本明細書において、カタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）からのＨＬＳの単離、精製および特徴付けの方法、ならびにその使用が開示されている。このＨＬＳは、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＣＯＶＩＤ－１９）および乳がん細胞に対する抗ＰＤ－Ｌ１の生物学的活性のための単純で敏感かつ特異的な試験法を開発するために使用され得る。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

カタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）からヘパリン様物質（ＨＬＳ）を単離、精製、および特徴付けする新規な方法
（１）カタツムリ粘液からの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の調製：１Ｌの粘液を、生きているカタツムリの足およびマントルから集め、次いで凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥した。この乾燥粘液粉末を、３倍量のアセトンで、終夜振盪しながら脱脂した。凍結乾燥後、粘液粉末（１５～２０ｇ）を、５ｍＭ ＥＤＴＡと５ｍＭシステインを含有する、５倍量の酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で懸濁した。５０ｍｇ（それぞれ３回）のパパイン酵素（３．２ｕｎｉｔ／ｍｇ固体）を加えた。次いで、反応混合物を、５５℃で、振盪しながら４８時間インキュベートした。この消化混合物を、１００℃で５分間加熱することによって停止させ、次いで、この懸濁液を、室温で、５０００ｇで３０分間遠心し、上清（これは、ＧＡＧを含有する）を集めた。
（２）消化したカタツムリ粘液からの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の単離および精製：パパイン消化したサンプルを、ＤＥＡＥ架橋アガロースビーズカラム（ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、アニオン交換クロマトグラフィーによって単離および精製した。溶出は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中、０．１Ｍ～１．０Ｍ ＮａＣｌの濃度範囲で、ステップワイズで行った。溶出は２１０ｎｍでモニタリングし、流速は０．５ｍＬ／分に設定した。３つの溶出フラクション、（１）非相互作用フラクション（Ｆ１、収率１．２％（ｗ／ｗ））、（２）低硫酸化ＧＡＧ含有率（Ｆ２、収率６．９％（ｗ／ｗ））、および（３）高硫酸化ＧＡＧ含有率（Ｆ３、収率１４％（ｗ／ｗ））を集めた。単離したフラクションは、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、クロマトグラフィーによって徹底的に脱塩し、凍結乾燥して、淡黄色粉末を得た。
（３）二糖の繰り返しの特徴が発見された：カタツムリ粘液から単離されたＧＡＧの特定の二糖組成は、酵素消化およびＨＰＬＣを使用して研究することができる。活性な硫酸化ＧＡＧフラクション（Ｆ３）を行った。高硫酸化ＧＡＧ含有率のＦ３オリゴ糖は、０．３ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）および１０ｍＭ ＣａＣｌ_２中で、１ｍＩＵのヘパリンリアーゼＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎｔｉｎａｓｅ ＩＩ）およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎｔｉｎａｓｅ Ｉ）を使用して、３７℃で、振盪しながら２４時間脱重合させた。その後、反応混合物を沸騰水中で５分間加熱し、５０００ｇで１０分間遠心し、凍結乾燥した。このヘパリンリアーゼ消化産物を、反応をモニタリングするために、分析ＳＡＸ－ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｒｒｅｌｌｓ ＣＡ）にインジェクションした。０．１～１．０Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジエントを、４０分間にわたり、流速１．０ｍＬ／分で行い、ウロン酸の不飽和二糖をモニタリングするために、検出を２３２ｎｍに設定した。組成の７３％を超える、ピーク４（１７．８９分）に観察される活性硫酸化ＧＡＧフラクション（Ｆ３）二糖の主要ピークは、アカラン硫酸、ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃの二糖繰り返し単位に相当する。さらに、ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）（ピーク７）およびΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＳＯ３（６Ｓ）（ピーク８）もまた、それぞれ１５％および１２％の成分として観察された。全て、以下「カタツムリヘパリン様物質（カタツムリＨＬＳ）」と呼ぶ。

【請求項2】

抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のために使用されるカタツムリＨＬＳが報告された。抗ウイルス活性は、競合イムノアッセイによって、スパイクＡＣＥ２結合の阻害に基づいて評価した。平均５０％抑制濃度（ＩＣ_５０）の阻害活性を算出した。このデータは、カタツムリＨＬＳが、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ領域に対して、強力な阻害活性を示したことを示していた。

【請求項3】

乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）に対する抗ＰＤ－Ｌｌ活性のために使用されるカタツムリＨＬＳが報告された。モノクローナル抗体によるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）とプログラム細胞死１（ＰＤ－１）免疫チェックポイントの阻害が、がんにおいて成功したことが示された。ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１の結合（binding of PD-L1 to PD-L1）によってＴ細胞エフェクター機能が阻害され、その結果、免疫抑制状態がもたらされる。がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、がん免疫回避およびがんの進行において重要な役割を果たす。ＰＤ－Ｌ１発現をダウンレギュレーションする化合物の開発が研究された。カタツムリＨＬＳは、乳がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１において、遺伝子発現とタンパク質レベルの両方において、ＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションを示し得ることが見出された。

【請求項4】

乳がん細胞の抗遊走活性のために使用されるカタツムリＨＬＳが報告された、本発明者らは、カタツムリＨＬＳの特性を研究するために、スクラップアッセイ（scrap-assay）を使用してがん細胞の遊走の阻害を研究し、遊走アッセイを使用して、Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ由来のカタツムリＨＬＳが、乳がん細胞の遊走を阻害することができることを見出した。

【請求項5】

ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞に対する、Ｔ細胞の細胞毒性効果の能力を増大させるために使用されるカタツムリＨＬＳが報告された。がん細胞に対するＴ細胞の細胞毒性のアッセイ、健常ドナースクリーニングに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｍａｈａｒａｊ Ｎａｋｏｒｎ Ｃｈｉａｎｇ Ｍａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌから集められるであろう。そして、ＰＢＭＣは、分画密度勾配遠心法（フィコール）によって単離された。ＰＢＭＣを刺激するために、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの抗体で４時間、プレートをプレインキュベーションすることによって、６ウェルプレートを抗ＣＤ３でコーティングした。さらに、培養実験の開始において、可溶性の抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）を追加した。カタツムリＨＬＳ（０～２００μｇ／ｍｌ）あり、またはなしで、ＭＤＡ－ＭＢ２３１で４８時間前処理した後、培地を交換し、がん細胞をＴ細胞と共培養して活性化させた（腫瘍細胞とリンパ球の比は１：１０）。活性化したＴ細胞のウェルをＰＢＳで２回洗浄してＴ細胞を除去し、次いで、生きているがん細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、２０％酢酸で溶出して５９０ｎｍで吸光度を測定した。カタツムリＨＬＳによるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞上のＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションが、免疫介在性細胞毒性を変化させるか否かを判定するために、健常ボランティアの末梢血単核球から単離したＴ細胞を、カタツムリＨＬＳで前処理したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞と、４８時間インキュベーションした。その後、２４時間共培養し、生き残ったがん細胞を、クリスタルバイオレット溶液でマーキングした。Ｔ細胞は、対照（Ｔ細胞なし）と比較して、カタツムリＨＬＳ非存在下で、がん細胞の生存率をわずかに低下させたものの、カタツムリＨＬＳ（２００μｇ／ｍｌ）の処理は、対照群（Ｔ細胞あり）と比較して、Ｔ細胞と共培養したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞におけるがん細胞の生存率を、およそ３３．７８％低下させた。得られたこの知見は、カタツムリＨＬＳによってＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションが誘導されたがん細胞によってＴ細胞が活性化され、がん細胞を殺す作用が増大したことを示唆していた。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

医薬
生物学

【背景技術】

【0002】

ヘパリン様物質（ＨＬＳ）は、ウロン酸（ＩｄｏＡまたはβ－Ｄ－グルクロン酸（ＧｌｃＡ）が、グルコサミン（α－Ｄ－Ｎ－スルホグルコサミン（ＧｌｃＮＳ）またはα－Ｄ－Ｎ－スルホグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）に、交互に（１→４）グリコシド結合した二糖繰り返し単位からなるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と密接に関連している（Ｌｉｎｈａｒｄｔ、２００３）。ＨＬＳは、種々の臨床的状況において説明されており、それらは、一般に循環性グリコサミノグリカン、主にヘパリン（ＨＰ）およびデルマタン硫酸（ＤＳ）に起因する。この高度に硫酸化したグリコサミノグリカン（すなわちヘパリン）は、１０２年の歴史を持つ抗血栓薬として使用されており、今日でも依然として最も幅広く処方される医薬品の一つである。医薬品としては、抗凝血剤（抗血栓薬）として使用される。具体的には、心臓発作および不安定狭心症の治療においても使用され、静脈または皮下への注射によって投与される。その他の用途としては、試験管および腎臓透析装置における使用があげられる。

【0003】

ヘパリン（未分画ヘパリン（ＵＦＨ）としても知られる）は、全ての哺乳動物において、好塩基球およびマスト細胞によって産生される。市販の調製物は、現在最も一般的には、ブタ（ｐｏｒｃｉｎｅ）の腸の粘液内膜に由来し、生産サイクルが長いが、一方で、アルゼンチン、ブラジルおよびインドを含むいくつかの国では、宗教上の理由により、ウシ由来ヘパリンが依然として認められている。過去には、カタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）由来のヘパリン様物質の単離、精製および特徴付けの新規な方法、ならびにその使用（これらは本発明と同一である）についての研究は、依然としてなされていない。根拠は、記録には、それらの技術の記載が乏しいことである。

【0004】

本発明は、操作が単純で、生産サイクルが短く、宗教上、健康上のいかなる問題もなく、将来のヘパリンとＨＬＳの不足についてのリスクを回避する、新たな代替供給源としてのカタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）からのＨＬＳの単離、精製、および特徴付けの新規な方法の一種を提供する。この原料の代替的な資源は、家庭において、有機的環境で飼育することができる。この資源は、さらなる使用に向けられ、かつ出発原料から活性なフラクションを単離および精製することが容易であるように、産業的および農業的な収穫として管理され得る。本発明は、抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、および乳がん細胞の抗遊走活性を含む乳がん細胞に対する抗ＰＤ－Ｌｌ活性のための、ＨＬＳの使用の相対的な試験レポートを提供する。

【0005】

ＪＹ ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒ（２０１７）．Ｆｒｏｍ Ｆａｒｍ ｔｏ Ｐｈａｒｍａ： Ａｎ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｈｅｐａｒｉｎ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ，この文献は、多くの化学物質が、ブタ／ウシ／ヒツジヘパリン製造プロセスにおいて添加され、それが健康上の問題と密接に関連することを示している。

【0006】

Ｈａｉｙｉｎｇ Ｌｉｕら（２００９）．Ｌｅｓｓｏｎｓ ｌｅａｒｎｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｒｉｎ，この文献は、潜在的なヘパリン汚染物質としてのヘパリン類似物質のヘパリン汚染危機を強調している。

【0007】

Ｓｚａｊｅｋ Ａ．Ｙ．ら（２０１６）Ｔｈｅ ＵＳ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ａｎｄ ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ ｔｈｅ ｇｌｏｂａｌ ｈｅｐａｒｉｎ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｃｒｉｓｉｓ，この文献は、ブタヘパリン製造プロセスが、導入されてから、実質的に変わっていないことを報告している。

【0008】

特許文献ＣＮ１０５，００１，３５３Ａは、より長く、より複雑なプロセスであるいかなる未精製ヘパリン単離方法も用いない、未精製ヘパリンナトリウムのための精製最適化技術を開示している。

【0009】

特許文献ＥＰ０１１３０４０Ａ２は、いかなる記載もないヘパリンの精製および分画のための２つの膜による限外濾過プロセスを開示しており、本プロセスは先行技術よりも優れている。

【0010】

特許文献ＫＲ０１７００６４Ｂ１は、アカラン硫酸を含有するカタツムリ抽出物を開示しており、本発明は、カタツムリ組織供給源と、異なる抽出方法を使用する。トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）、酢酸カリウム、塩化セチルピリジニウムによるＧＡＧ沈殿は、このプロセスにおける危険な残留物として見出され得る。

【0011】

特許文献ＩＮ２５０２ＤＥＬ１９９６Ａは、異なる単離方法と血リンパ供給源を使用する、内臓リーシュマニア症の診断に役立つＡｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａカタツムリからの、新たな高特異性の９－Ｏ－アセチル化シアロ糖複合体結合レクチン（9-O-acetilated sialoglycoconjugate binding lectin）（Ａｃｈａｔｉｎｉｎ－Ｈ）の単離のためのプロセスを開示する。

【0012】

Ｕ Ｌｉｎｄａｈｌ（２０２０）．Ｈｅｐａｒｉｎ－Ａｎ ｏｌｄ ｄｒｕｇ ｗｉｔｈ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐｒｏｔｅｎｔｉａｌ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ Ｃｏｖｉｄ－１９ ｔｈｅｒａｐｙ，このレポートは、低分子量ヘパリン（ＬＭＷＨ）による治療が、重篤な患者における死亡率を低下させることを示す。

【0013】

Ａｎｄｒａｄｅら（２０１３）．Ａ ｈｅｐａｒｉｎ－ｌｉｋｅ ｃｏｍｐｏｕｎｄ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ａ ｍａｒｉｎｅ ｃｒａｂ ｒｉｃｈ ｉｎ ｇｌｙｃｕｒｏｎｉｃ ａｃｉｄ ２－Ｏ－ｓｕｌｆａｔｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｌｏｗ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｃｔｉｖｉｔｙ．

【0014】

Ｌｉ Ｆｕら（２０１６）．Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｈｅｐａｒｉｎｓ ａｎｄ ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅｓは、内在的な不純物、供給源組織の制約、製造プロセスの不十分な制御を解決するための、化学酵素合成および代謝工学における組換え技術の使用を開示する。

【0015】

Ｇｒｉｆｆｉｎら（１９９５）．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｅｐａｒａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ｆｒｏｍ ｃｒｕｄｅ ｐｏｒｃｉｎｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｍｕｃｏｓａｌ ｐｅｐｔｉｄｏｇｌｙｃａｎ ｈｅｐａｒｉｎは、より長く、より複雑なプロセスを開示している。

【0016】

Ｌｉｎｈａｒｄｔら（１９９５）．Ｄｅｒｍａｔａｎ ｓｕｌｆａｔｅ ａｓ ａ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔ ｏｆ ａｎｔｉｃｏａｇｕｌａｎｔ ａｎｄ ａｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ．

【発明の開示】

【0017】

本発明は、カタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）由来のヘパリン様物質（ＨＬＳ）の代替供給源、ならびに抗ＰＤ－Ｌｌおよび抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２（ＣＯＶＩＤ－１９）感染としての、その新しい生物学的活性を発見するための革新的な戦略的研究であり、本発明は、生産サイクルが短く、生産収率が高く、品質が信頼でき、宗教上、健康上のいかなる問題もなく、将来のヘパリンとＨＬＳの不足についてのリスクを回避する、出発原料から活性なフラクションを単純かつ容易に単離、精製、および特徴付けする方法の一種を提供し、また、本発明の最も重要な利点は、原料の供給源が、際限のない量の医薬を生産するために使用できることである。

【0018】

上記の目的を達成するために、本発明の技術的スキームは以下の通りである。
（１）本発明者らは、以下の図１および２に示すように、カタツムリ粘液（Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ）からヘパリン様物質（ＨＬＳ）を単離、精製、および特徴付けする新規な方法を開発した。

【0019】

１．１ カタツムリ粘液からの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の調製
１Ｌの粘液を、生きているカタツムリの足およびマントルから集め、次いで凍結乾燥プロセスによって凍結乾燥した。この乾燥粘液粉末を、３倍量のアセトンで、終夜振盪しながら脱脂した。凍結乾燥後、粘液粉末（１５～２０ｇ）を、５ｍＭ ＥＤＴＡと５ｍＭシステインを含有する、５倍量の酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）で懸濁した。５０ｍｇ（それぞれ３回）のパパイン酵素（３．２ｕｎｉｔ／ｍｇ固体）を加えた。次いで、反応混合物を、５５℃で、振盪しながら４８時間インキュベートした。この消化混合物を、１００℃で５分間加熱することによって停止させ、次いで、この懸濁液を、室温で、５０００ｇで３０分間遠心し、上清（これは、ＧＡＧを含有する）を集めた。

【0020】

１．２ 消化したカタツムリ粘液からの硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の単離および精製
パパイン消化したサンプルを、ＤＥＡＥ架橋アガロースビーズカラム（ＨｉＴｒａｐ ＤＥＡＥ ＦＦ、ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、アニオン交換クロマトグラフィーによって単離および精製した。溶出は、５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．５）中、０．１Ｍ～１．０Ｍ ＮａＣｌの濃度範囲で、ステップワイズで行った。溶出は２１０ｎｍでモニタリングし、流速は０．５ｍＬ／分に設定した。３つの溶出フラクション、（１）非相互作用フラクション（Ｆ１、収率１．２％（ｗ／ｗ））、（２）低硫酸化ＧＡＧ含有率（Ｆ２、収率６．９％（ｗ／ｗ））、および（３）高硫酸化ＧＡＧ含有率（Ｆ３、収率１４％（ｗ／ｗ））を集めた。単離したフラクションは、ＨｉＴｒａｐ脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で、クロマトグラフィーによって徹底的に脱塩し、凍結乾燥して、淡黄色粉末を得た。

【0021】

１．３ 二糖の繰り返しの特徴が発見された。
カタツムリ粘液から単離されたＧＡＧの特定の二糖組成は、酵素消化およびＨＰＬＣを使用して研究することができる。活性な硫酸化ＧＡＧフラクション（Ｆ３）を、図３に示すように、以下の手順のように行った。高硫酸化ＧＡＧ含有率のＦ３オリゴ糖は、０．３ｍＬの５０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．２）および１０ｍＭ ＣａＣｌ_２中で、１ｍＩＵのヘパリンリアーゼＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎｔｉｎａｓｅ ＩＩ）およびヘパリンリアーゼＩＩＩ（ｈｅｐａｒｉｎｔｉｎａｓｅ Ｉ）を使用して、３７℃で、振盪しながら２４時間脱重合させた。その後、反応混合物を沸騰水中で５分間加熱し、５０００ｇで１０分間遠心し、凍結乾燥した。このヘパリンリアーゼ消化産物を、反応をモニタリングするために、分析ＳＡＸ－ＨＰＬＣカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、０．４６×２５ｃｍ、Ｔｏｒｒｅｌｌｓ ＣＡ）にインジェクションした。０．１～１．０Ｍ ＮａＣｌのリニアグラジエントを、４０分間にわたり、流速１．０ｍＬ／分で行い、ウロン酸の不飽和二糖をモニタリングするために、検出を２３２ｎｍに設定した。図４において、組成の７３％を超える、ピーク４（１７．８９分）に観察される活性硫酸化ＧＡＧフラクション（Ｆ３）二糖の主要ピークは、アカラン硫酸、ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃの二糖繰り返し単位に相当する。さらに、ΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）（ピーク７）およびΔＨｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＳＯ３（６Ｓ）（ピーク８）もまた、それぞれ１５％および１２％の成分として観察された。全て、以下「カタツムリヘパリン様物質（カタツムリＨＬＳ）」と呼ぶ。

【0022】

（２）抗ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のｉｎ ｖｉｔｒｏ研究が報告された。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のライフサイクルが報告されており、ウイルス感染および複製の各ステップが、医薬発見の標的にされている。特に、ウイルス粒子としての第１のステップは、図５に示すように、ＡＣＥＩＩ（アンジオテンシン変換酵素ＩＩ）である受容体に対するスパイクタンパク質の結合を利用しており、抗ウイルス活性は、競合イムノアッセイによって、スパイクＡＣＥ２結合の阻害に基づいて評価した。平均５０％抑制濃度（ＩＣ_５０）の阻害活性を算出した（図６）。このデータは、カタツムリＨＬＳが、ＳＡＲ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤ領域に対して、強力な阻害活性を示したことを示す。

【0023】

（３）乳がん細胞株（ＭＤＡ－ＭＢ２３１）に対する抗ＰＤ－Ｌ１活性が報告された。
モノクローナル抗体によるプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）とプログラム細胞死１（ＰＤ－１）免疫チェックポイントの阻害が、がんにおいて成功したことが示された。ＰＤ－Ｌ１に対するＰＤ－Ｌ１の結合（binding of PD-L1 to PD-L1）によってＴ細胞エフェクター機能が阻害され、その結果、免疫抑制状態がもたらされる。がん細胞におけるＰＤ－Ｌ１の発現は、がん免疫回避およびがんの進行において重要な役割を果たす。ＰＤ－Ｌ１発現をダウンレギュレーションする化合物の開発が研究された。カタツムリＨＬＳは、図７に示すように、乳がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１において、遺伝子発現とタンパク質レベルの両方において、ＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションを示し得ることが見出された。

【0024】

（４）乳がん細胞の抗遊走活性が報告された
転移は、がんの最も特徴的なステージであり、全身にわたって、組織および他の臓器の機能不全を引き起こす。本発明者らは、カタツムリＨＬＳの特性を研究するために、図８に示すように、スクラップアッセイ（scrap-assay）を使用してがん細胞の遊走の阻害を研究し、遊走アッセイを使用して、Ａｃｈａｔｉｎａ ｆｕｌｉｃａ由来のカタツムリＨＬＳが、乳がん細胞の遊走を阻害することができることを見出した。

【0025】

（５）カタツムリＨＬＳが、ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞に対する、Ｔ細胞の細胞毒性効果の能力を増大させることが報告された。がん細胞に対するＴ細胞の細胞毒性のアッセイ。健常ドナースクリーニングに由来する末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｍａｈａｒａｊ Ｎａｋｏｒｎ Ｃｈｉａｎｇ Ｍａｉ Ｈｏｓｐｉｔａｌから集められるであろう。そして、ＰＢＭＣは、分画密度勾配遠心法（フィコール）によって単離された。ＰＢＭＣを刺激するために、ＰＢＳ中、１μｇ／ｍｌの抗体で４時間、プレートをプレインキュベーションすることによって、６ウェルプレートを抗ＣＤ３でコーティングした。さらに、培養実験の開始において、可溶性の抗ＣＤ２８抗体（１μｇ／ｍｌ）およびＩＬ－２（１０ｎｇ／ｍｌ）を追加した。カタツムリＨＬＳ（０～２００μｇ／ｍｌ）あり、またはなしで、ＭＤＡ－ＭＢ２３１で４８時間前処理した後、培地を交換し、がん細胞をＴ細胞と共培養して活性化させた（腫瘍細胞とリンパ球の比は１：１０）。活性化したＴ細胞のウェルをＰＢＳで２回洗浄してＴ細胞を除去し、次いで、生きているがん細胞を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、２０％酢酸で溶出して５９０ｎｍで吸光度を測定した。カタツムリＨＬＳによるＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞上のＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションが、免疫介在性細胞毒性を変化させるか否かを判定するために、健常ボランティアの末梢血単核球から単離したＴ細胞を、カタツムリＨＬＳで前処理したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞と、４８時間インキュベーションした。その後、２４時間共培養し、生き残ったがん細胞を、クリスタルバイオレット溶液でマーキングした。Ｔ細胞は、対照（Ｔ細胞なし）と比較して、カタツムリＨＬＳ非存在下で、がん細胞の生存率をわずかに低下させたものの、カタツムリＨＬＳ（２００μｇ／ｍｌ）の処理は、図９に示すように、対照群（Ｔ細胞あり）と比較して、Ｔ細胞と共培養したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞におけるがん細胞の生存率を、およそ３３．７８％低下させた。得られたこの知見は、カタツムリＨＬＳによってＰＤ－Ｌ１のダウンレギュレーションが誘導されたがん細胞によってＴ細胞が活性化され、がん細胞を殺す作用が増大したことを示唆していた。

【図面の簡単な説明】

【0026】

【図1】カタツムリ粘液から硫酸化グリコサミノグリカンを調製するための方法を示す概略図。

【図2】イオン交換クロマトグラフィーによる、消化されたカタツムリ粘液から硫酸化グリコサミノグリカンを単離および精製するための方法。

【図3】ＨＰＬＣ－ＵＶ検出による、活性な硫酸化オリゴ糖の二糖組成物分析のための方法。

【図4】カタツムリＨＬＳと呼ばれる活性な硫酸化ＧＡＧフラクションに含まれる二糖の繰り返しのＨＰＬＣクロマトグラム。標準的な二糖（黒い破線）の構造は数字のラベルで示されており、１：ΔＨｅｘＡ－ＧｌｃＮＡｃ、２：ΔｈｅｘＡ－ＧｌｃＮＳＯ３、３：ΔｈｅｘＡ－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、４：ΔｈｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ、５：ΔｈｅｘＡ－ＧｌｃＮＳＯ３（６Ｓ）、６：ΔｈｅｘＡ（２Ｓ）－ＧＩｃＮＳＯ３、７：ΔｈｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＡｃ（６Ｓ）、８：ΔｈｅｘＡ（２Ｓ）－ＧｌｃＮＳＯ３（６Ｓ）である。略語：ＧｌｃＮＡｃ、Ｎ－アセチルグルコサミン；ＧｌｃＮＳＯ３、Ｎ－硫酸化グルコサミン；２Ｓと６Ｓは、それぞれ、２－Ｏ－サルフェート基と６－Ｏ－サルフェート基である；ΔｈｅｘＡ、除去的なリアーゼ切断によって二糖およびオリゴ糖の非還元末端に形成される不飽和ヘキサウロン酸残基。

【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のライフサイクル、および増殖ステップ。

【図6】スパイクタンパク質の結合に対する、カタツムリＨＬＳの阻害曲線。データは、シグモイドモデルにフィッティングし、ＩＣ_５０の値を示した。

【図7】リアルタイムＰＣＲ（Ａ）およびウェスタンブロッティング（Ｂ）を使用した、乳がん細胞ＭＤＡ－ＭＢ２３１におけるＰＤ－Ｌ１の発現に対するカタツムリＨＬＳの効果（ｐ＜０．０１）。

【図8】ＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞の遊走に対する、カタツムリＨＬＳの効果（ｐ＜０．０１）。

【図9】カタツムリＨＬＳ（２００μｇ／ｍｌ）の処理は、対照群（Ｔ細胞あり）と比較して、Ｔ細胞と共培養したＭＤＡ－ＭＢ２３１細胞におけるがん細胞の生存率を、およそ３３．７８％低下させた。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】