特表2024-507454ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールの製造方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-20
(54)【発明の名称】ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールの製造方法
(51)【国際特許分類】
C12P 7/6458 20220101AFI20240213BHJP
C12P 1/00 20060101ALI20240213BHJP
【ＦＩ】
C12P7/6458
C12P1/00 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547064
(86)(22)【出願日】2022-02-03
(85)【翻訳文提出日】2023-08-15
(86)【国際出願番号】 EP2022052549
(87)【国際公開番号】W WO2022171515
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】21156115.4
(32)【優先日】2021-02-09
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】590002013
【氏名又は名称】ソシエテ・デ・プロデュイ・ネスレ・エス・アー
(74)【代理人】
【識別番号】100088155
【弁理士】
【氏名又は名称】長谷川 芳樹
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100140453
【弁理士】
【氏名又は名称】戸津 洋介
(72)【発明者】
【氏名】パティン， アマウリー
【テーマコード（参考）】
4B064
【Ｆターム（参考）】
4B064AD87
4B064AD88
4B064BJ05
4B064CB03
4B064CE01
4B064DA10
(57)【要約】
本発明は、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料を調製するための酵素によるプロセスに関する。
【選択図】 なし
【選択図】 なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料の調製方法であって、ａ）
ｉ）トリパルミチン、及び／又はトリパルミチンが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下でアルコーリシスステップに供して、２－モノパルミチン及び副生成物としてパルミチン酸エステルを含む生成物混合物を得ること、
ｉｉ）前記アルコーリシスステップａ）ｉ）で得られた２－モノパルミチンを含む生成物混合物を、２－モノパルミチンを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、パルミチン酸エステル及び残留アルコールを含む残留液体画分を、例えば濾過又は遠心分離で除去すること、
ｉｉｉ）前記ステップａ）ｉｉ）に由来する２－モノパルミチンを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
オレイン酸エステル、及び／又は１，３－ジオレオ－２－パルミチン（ＯＰＯ）を形成させるように選択された脂肪酸混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位パルミチン酸を含みｓｎ－２位パルミチン酸含量が総パルミチン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供すること、
ｉｖ）前記ステップａ）ｉｉｉ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰な遊離脂肪酸、残りの脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去すること、を含む、１つのプロセスを実施するステップ、
ｂ）
ｉ）トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得ること、
ｉｉ）前記アルコーリシスステップｂ）ｉ）で得られた２－モノオレインを含む混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、オレイン酸エステル及びアルコールを含む残留液体画分を、例えば濾過又は遠心分離で除去すること、
ｉｉｉ）前記ステップｂ）ｉｉ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又は２－オレイン－１，３－ジパルミチン（ＰＯＰ）を形成させるように選択された脂肪酸混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供すること、
ｉｖ）前記ステップｂ）ｉｉｉ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残りの脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップ、を含む、前記ステップａ）のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離された別のプロセスを実施すること、を含み、
前記ステップａ）ｉ）において生成されたパルミチン酸エステル及び前記ステップｂ）ｉ）において生成されたオレイン酸エステルの全て又は少なくとも一部が、前記残留アルコールの蒸発による除去後にそれぞれのプロセスにおいて再利用される、方法。
【請求項2】
前記アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）が、ｎ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、イソプロパノール又はそれらの混合物の存在下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）が、ｎ－ブタノール及びシリカゲル担体上に吸着させたｓｎ－１，３リパーゼの存在下で実施される、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記アルコーリシスステップａ）ｉ）で生成した副生成物がパルミチン酸ブチルであり、前記アルコーリシスステップｂ）ｉ）で生成した副生成物がオレイン酸ブチルである、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記エステル化ステップａ）ｉｉｉ）が、前記アルコーリシスステップｂ）ｉ）で得られたオレイン酸ブチルの存在下、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記エステル化ステップｂ）ｉｉｉ）が、前記アルコーリシスステップａ）ｉ）で得られたパルミチン酸ブチルの存在下、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
前記アルコーリシスステップａ）ｉ）のための出発物質が、トリパルミチンが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えばパルミチン酸が富化されたパーム油画分である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記アルコーリシスステップｂ）ｉ）のための出発物質が、トリオレインが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えば高オレイン酸ヒマワリ油である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）が、４０～７０℃の範囲の温度、例えば４５～５５℃の範囲の温度で実施される、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記中間体精製ステップａ）ｉｉ）が、前記アルコーリシスステップａ）ｉ）で得られた２－モノパルミテートを含む生成物混合物の温度を０～１５℃の範囲の温度、例えば５～１０℃の範囲の温度又は６～８℃の範囲の温度に低下させて、２－モノパルミチンを選択的に結晶化させて分画すること、並びに前記残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記中間体精製ステップｂ）ｉｉ）が、前記アルコーリシスステップｂ）ｉ）で得られた２－モノオレインを含む生成物混合物の温度を－３０℃～－１０℃の範囲の温度、例えば－２５℃～－１５℃の範囲の温度又は－２３℃～－１７℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に結晶化させて分画すること、並びに前記残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記エステル化ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）が、ブタノール及び／又は水除去条件下、３５℃～６０℃の範囲の温度、例えば４０℃～５０℃の範囲の温度で、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｉｓ）の存在下で実施される、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記ステップａ）ｉｖ）及びｂ）ｉｖ）における精製が、脱臭、蒸留、分画又は短行程蒸留を用いて実施される、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法であって、以下のステップ：ａ）トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップと、
ｂ）前記ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、前記オレイン酸エステルを含む残留液体画分及び残りのアルコールを、例えば濾過又は遠心分離で除去するステップと、
ｃ）前記ステップｂ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又はＰＯＰ（２－オレイン－１，３－ジパルミチン）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップと、
ｄ）前記ステップｃ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残りの脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップと、を含む方法。
【請求項15】
前記ステップａ）のアルコーリシスが、ｎ－ブタノール及びシリカゲル担体上に吸着させたｓｎ－１，３リパーゼの存在下で実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記アルコーリシスステップａ）で生成した副生成物が、オレイン酸ブチルである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記エステル化ステップｃ）が、パルミチン酸ブチルの存在下、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記アルコーリシスステップａ）のための出発物質が、トリオレインが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えば高オレイン酸ヒマワリ油である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記アルコーリシスステップａ）が、４０～７０℃の範囲の温度、例えば４５～５５℃の範囲の温度で実施される、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記中間体精製ステップｂ）が、ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む生成物混合物の温度を－３０℃～－１０℃の範囲の温度、例えば－２５℃～－１５℃の範囲の温度又は－２３℃～－１７℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に結晶化させて分画すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される、請求項１４～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記エステル化ステップｃ）が、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシスの存在下、３５～６０℃の範囲の温度、例えば４０℃～５０℃の範囲の温度で、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記ステップｄ）における精製が、脱臭、蒸留、分画又は短行程蒸留を用いて実施される、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のトリアシルグリセロールが富化された原材料の調製方法における、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の方法の使用。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料を調製するための、酵素によるプロセスに関する。
【背景技術】
【0002】
トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）は、約３９ｇ／Ｌでヒトミルク中に見られる主要な脂質であり、ＴＡＧは脂肪酸について固有の位置特異的分布を示す。ＴＡＧの位置特異的分布は、脂肪酸及びカルシウム吸収などのヒトミルクの栄養上の利益、並びに腸の快活さなどのそれらの関連する利益に寄与する。
【0003】
乳児用フォーミュラ（ＩＦ）原材料の設計は、一般に、構成面及び機能面でヒトミルクの組成及び利点と類似させることを目指している。
【0004】
現在既に、幾つかのＩＦには、ＯＰＯ（１，３－ジオレオ－２－パルミチン）が富化された原材料が組み込まれている。それらの原材料は、酵素反応（例えば、Ｂｅｔａｐｏｌ（登録商標）又はＩｎｆａｔ（登録商標））を使用して生産されるが、これらの原材料中のＯＰＯ含量は総ＴＡＧのわずか２０～２８％ｗ／ｗの範囲であり、残りは他のＴＡＧが占める（例えば、総ＴＡＧの５～８％ｗ／ｗはＰＯＯ（２，３－ジオレオ－１－パルミチン）であり得る）。ヒト母乳の脂肪含量に可能な限り近づけて再現した脂肪分を含むＩＦの調製において、これらの原材料を使用するには、他のＴＡＧが存在することに伴ってこれらの原材料が低ＯＰＯ含量であることにより、限界が示される。
【0005】
酵素反応を使用する実験室規模では他のＯＰＯ合成も知られている。しかしながら、これらの反応は、（所望のＯＰＯ含有量、及び／若しくは他のＴＡＧを上回る選択性を得るために、大量の有機溶媒及び複雑で費用のかかる精製ステップを使用するため）工業レベルにスケールアップすることができないか、又は所望のＯＰＯ含有量、及び／若しくは他のＴＡＧを上回る選択性を有する原材料を提供することができない。
【0006】
文献では、ｓｎ－２パルミチン酸含量が高い構造脂質を生産する代替法として、トリグリセリドの２－モノグリセリド中間体へのアルコーリシス（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ，１９９９）、及びそれに続くＦＦＡ（遊離脂肪酸）によるエステル化を介した、酵素による２ステップアプローチが報告されており、このアプローチでは、より高い反応制御、純度及び収率が提供され得る。しかしながら、かかる文献で報告されているこの２ステッププロセスは、溶媒の使用並びに費用のかかる精製ステップを必要とするものであった。
【0007】
酵素による２ステッププロセスを、経済面で現実的であり、かつ工業に応用可能なものにするためには、高純度及び高選択性での、例えば最終ＯＰＯ純度が最低でも５０％でありかつ総ｓｎ－２位パルミチン酸が最終的に最低でも７０％である、ＯＰＯ原材料の取得を維持したままで、コストと出発材料の組成とを考慮に入れるべきであり、溶媒の使用は低減されるか又は排除される必要があり、並びに精製は簡略化されるべきである。
【0008】
本願の出願人は、同出願人らによる欧州特許出願ＥＰ２０１６８９５９．３（現在未公開）に記載のとおりに、ｓｎ－２位パルミチン酸の総含有量が７０％より大きい、例えば７５％であるＯＰＯ富化原材料を製造するための、単純化された、無溶媒での２ステップの酵素による方法を提供することによって、既に上述の問題に対処し、その解決策を提供している。この単純化された酵素プロセスの概念は、ＯＰＯを富化させた原材料の生産のための、経済面で現実的である経路を提供する。
【0009】
欧州特許出願ＥＰ２０１６８９５９．３に記載されている上述の方法の１つの欠点は、いずれにしても多量の脂肪酸ブチルエステルが副生成物として生成されることであり、この副生成物は、この方法において更に使用されはせず、処分する必要もある。このような副生成物は、例えばパルミチン酸ブチルである。
【0010】
したがって、原材料１００ｇ当たり少なくとも５０ｇのＯＰＯ純度を有し、ｓｎ－２位パルミチン酸の総含有量が全パルミチン酸含有量の７０％以上であるＯＰＯ原材料を調製するための方法であって、経済面で現実的であり、工業に応用可能であり、副生成物を別に使用することができかつ廃棄する必要がない、方法を提供することに対するニーズが未だ存在する。
【発明の概要】
【0011】
本発明の目的は、現在の技術水準を改良し、改良された解決策を提供して上記の不都合の少なくともいくつかを克服することである。本発明の目的は、独立請求項の主題によって達成される。従属請求項は、本発明の着想を更に展開させるものである。
【0012】
したがって、本発明は、第１の態様では、添付の特許請求の範囲に記載されるようにｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料の調製方法を提供する。
【0013】
本発明者らは、驚くべきことに、同じ酵素と、条件を適合させた類似のプロセスステップと、原材料の変更（すなわち、ＴＡＧ及びＦＦＡ）とを用いて、欧州特許出願第２０１６８９５９．３号に記載のとおりに、高品質のＯＰＯを産生するための酵素反応を含む２ステッププロセスを使用することで、ＰＯＰ（２－オレオー１，３－ジパルミチン）を産生することができることを見出した。そして本発明者らは、あるプロセスにおいて産生された例えばＯＰＯ産生プロセスからの副生成物を、他のプロセス例えばＰＯＰ産生プロセスにおける反応材料として有利に使用できること、並びに逆もまた同様であることを見出した。したがって、ＰＯＰ産生プロセスのアルコーリシスステップにおいて生成される副生成物、すなわちオレイン酸エステル、例えばオレイン酸ブチルを、ＯＰＯ産生プロセスのエステル化ステップにおける反応物質として使用することができる。逆もまた同様に、ＯＰＯ産生プロセスのアルコーリシスステップにおいて生成される副生成物、すなわちパルミチン酸エステル、例えばパルミチン酸ブチルを、ＰＯＰ産生プロセスのエステル化ステップにおいて使用することができる。
【0014】
本発明による方法は、ＯＰＯ又はＰＯＰのいずれかを産生するために使用される酵素反応を含む２ステッププロセスにおいて生成される副生成物を回収し、反応物質として再使用することができるという利点を有する。したがって、通常では廃棄物としてみなされる副生成物が回収され、反応物質としてリサイクルされることによって、化学産業における価値連鎖全体の資源効率を最適化し、クローズドループの、廃棄物のない化学反応を可能にする。次に本発明者らは、ＯＰＯ富化原材料を生産し、かつココアバター同等物の調製において有用であり得るＰＯＰ富化原材料を生産する、経済面で現実的で費用効果の高い経路を見出した。
【0015】
本発明による方法は、制御されたＦＦＡ混合物をプロセスに添加することで、ヒトミルク組成物と合致するように（例えば、さまざまな比のＯＰＯ／ＯＰＬ（１－オレオ－２－パルミト－３－リノレイン））、又はココアバター組成物と合致するように（同様にさまざまな比のＰＯＰ、ＳＯＰ（２－オレオ－１，３－ジステアリン）及びＳＯＳ（１－オレオ－１，３－ジステアリン）、最終ＴＡＧ組成物をテーラーメイドすることができるという更なる利点を有する。
【0016】
第２の態様では、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載されるような、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法に関する。この単純化された酵素プロセスの概念は、ｓｎ－２位オレイン酸を富化させたトリアシルグリセロールを含む原材料を提供する、経済面で現実的な経路を提供する。ココアバター及びココアバター同等物のトリアシルグリセロールは、ｓｎ－２位オレイン酸を豊富に含む。
【0017】
さらなる態様では、本発明は、添付の特許請求の範囲に記載されるとおり、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法の、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールが富化された原材料を調製するための別の方法における使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【0018】
本発明の追加の特徴及び利点は、図面を参照して以下に記載の現在好ましい実施形態の説明において記載されており、この説明から明らかになる。
【図1A】本発明の幾つかの実施形態のプロセス全体の概略図を示す。図１Ａは、本発明によるプロセスを示す。図中、アルコーリシスステップにおいて生成された副生成物は、ＯＰＯ又はＰＯＰのいずれかを生産するエステル化ステップにおいて反応物質として再使用される。図１には、以下の頭字語が使用される。ＰＰＰは、例えばトリパルミチン含量の高いパーム油画分からのトリパルミチン原材料を示し、 ＯＰＯは、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸（ｓｎ－２位のパルミチン酸）から構成されるトリグリセリドを示し、ＯＯＯは、例えば高オレイン酸ヒマワリ油（ＨＯＳＦＯ）からのトリオレインを示し、ＰＯＰは、１つのオレイン酸及び２つのパルミチン酸（ｓｎ－２位のオレイン酸）から構成されるトリグリセリドを示し、酵素は、任意のｓｎ－１，３選択的リパーゼ、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＴＬ ＩＭを示し、固定化酵素は、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（真菌）から生産されたものである。
【図1B】本発明の幾つかの実施形態のプロセス全体の概略図を示す。図１Ｂは、ＦＦＡと、アルコーリシスステップにおいて生成された副生成物との存在下でエステル化ステップを実施して、ヒト母乳組成物及びココアバター同等組成物のそれぞれにより良く合致するＴＡＧ組成物を生産する、本発明によるプロセスを示す。図１には、以下の頭字語が使用される。ＰＰＰは、例えばトリパルミチン含量の高いパーム油画分からのトリパルミチン原材料を示し、 ＯＰＯは、２つのオレイン酸及び１つのパルミチン酸（ｓｎ－２位のパルミチン酸）から構成されるトリグリセリドを示し、ＯＯＯは、例えば高オレイン酸ヒマワリ油（ＨＯＳＦＯ）からのトリオレインを示し、ＰＯＰは、１つのオレイン酸及び２つのパルミチン酸（ｓｎ－２位のオレイン酸）から構成されるトリグリセリドを示し、酵素は、任意のｓｎ－１，３選択的リパーゼ、例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ Ｌｉｐｏｚｙｍｅ（登録商標）ＴＬ ＩＭを示し、固定化酵素は、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）（真菌）から生産されたものである。
【図2A】本発明の幾つかの実施形態による方法の概略図を示す。図２Ａは、本発明の一実施形態による、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料を調製するためのプロセスの概略図を示す。
【図3】同出願人により特許出願された、未公開の欧州特許第２０１６８９５９．３号明細書に記載されたプロセスの概略図を示す。
【図4】実施例１の結果を示す。リパーゼ４３５及びリパーゼＴＬＩＭをさまざまなアルコールと共に使用するアルコーリシス反応の反応時間にわたる２－モノパルミチンの収率を報告する。収率は、２－モノパルミチンのモル／初期トリパルミチンのモルとして計算される。
【図5】実施例１に記載のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭによって触媒される、トリパルミチンのイソプロパノーリシスの変換プロファイルを示す。
【図6】実施例２の反応混合物において定量されたそれぞれの分子種を、定量された総パルミチン酸含有化合物のパーセンテージとして示す。
【図7】同じ混合物（実施例４）の分画からの沈殿物と比較したアルコーリシス産物の含有量を示す。
【図8】ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）に基づき、２－モノパルミチン生成物（実施例５）の無溶媒エステルの反応混合物中の分子種の変化を示す。
【図9】ＬＣ－ＭＣ分析によって測定された、実施例５の最終ＴＡＧ混合物中の脂肪酸分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
定義
本発明の文脈において、「ＯＰＯ」という用語は、１，３－ジオレオ－２－パルミチン及び／又は２－（パルミトイルオキシ）プロパン－１，３－ジイルジオレエート及び／又は２－（パルミトイルオキシ）－１，３－プロパンジイル（９Ｚ，９’Ｚ）ビス（－９－オクタデセノエート）（ＣＡＳ番号：１７１６－０７－０）を指す。
本発明の文脈において、「ＯＰＯ」という用語は、１，３－ジオレオ－２－パルミチン及び／又は２－（パルミトイルオキシ）プロパン－１，３－ジイルジオレエート及び／又は２－（パルミトイルオキシ）－１，３－プロパンジイル（９Ｚ，９’Ｚ）ビス（－９－オクタデセノエート）（ＣＡＳ番号：１７１６－０７－０）を指す。
【0020】
本発明の文脈において、用語「ＰＯＰ」は、２－オレオ－１，３－ジパルミチン及び／又は１，３－ジヘキサデカノイル－２－（９ｉ－オクタデセノイル）グリセロール（ＣＡＳ番号：２１９０－２５－２）を指す。
【0021】
本発明の文脈において、「ＯＯＯ」という用語は、トリオレイン及び／又は９－オクタデセン酸（９Ｚ）－，１，１’，１’’－（１，２，３－プロパントリイル）エステル（ＣＡＳ番号：１２２－３２－７）を指す。
【0022】
本発明の文脈において、「ＰＰＰ」という用語は、トリパルミチン及び／又はヘキサデカン酸、１，１’，１’’－（１，２，３－プロパントリイル）エステル（ＣＡＳ番号：５５５－４４－２）を指す。
【0023】
本発明の文脈において、「ＯＰＬ」という用語は、１－オレオ－２－パルミト－３－リノレイン（ＣＡＳ番号：２５３４－９７－６）を指す。
【0024】
本発明の文脈において、「ＳＯＰ」という用語は、ラセミ２－オレオ－３－パルミト－１－ステアリン及び／又は２－オレオ－１－パルミト－３－ステアリン（ＣＡＳ番号：２１９０－２７－４）を指す。
【0025】
本発明の文脈において、「ＳＯＳ」という用語は、２－オレオ－１，３－ジステアリン（ＣＡＳ番号：２８４６－０４－０）を指す。
【0026】
本発明の文脈において、「ＰＯＯ」という用語は、３－（パルミトイルオキシ）－１，２－プロパンジイル（９Ｚ，９’Ｚ）ビス（－９－オクタデセノエート）（ＯＯＰ、ＣＡＳ番号：１４９６０－３５－１）、及び／又は１－（パルミトイルオキシ）－２，３－プロパンジイル（９Ｚ，９’Ｚ）ビス（－９－オクタデセノエート）（ＰＯＯ、ＣＡＳ番号：１４８６３－２６－４）の両方を指す。「ＰＯＯ」の量に言及する場合、これは原材料中に存在するＯＯＰの量も含むことに留意されたい。
【0027】
本発明の文脈において、「ＯＰＯ原材料」又は「ＯＰＯ富化原材料」又は「１，３－ジオレオ－２－パルミチン原材料」という用語は、原材料１００ｇ当たり５０ｇよりも高純度でＯＰＯを含む食用原材料を特定する。本発明の一実施形態では、本方法に従って調製されたＯＰＯ原材料はまた、ｓｎ－２位のパルミチン酸含量が総パルミチン含量の７０％以上である。
【0028】
本発明の文脈において、「ＰＯＰ原材料」又は「ＰＯＰ富化原材料」又は「２－オレオ－１，３－ジパルミチン原材料」という用語は、原材料１００ｇ当たり５０ｇよりも高純度のＰＯＰを含む食用原材料を特定する。本発明の一実施形態では、本方法に従って調製されたＰＯＰ原材料はまた、ｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン含量の７０％以上である。
【0029】
本発明の文脈において、「ＴＡＧ」という用語は、トリアシルグリセロール又はトリグリセリドを意味する。
【0030】
本発明の文脈において、「ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロール」という用語は、７０％を超える割合のパルミチン酸残基がトリアシルグリセロール骨格中のｓｎ－２位にある、トリアシルグリセロール及び／又はトリアシルグリセロール原材料を意味する。一実施形態では、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロールは、７５％より高い割合でトリアシルグリセロール骨格中のｓｎ－２位にパルミチン酸残基を有する。別の実施形態では、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロールは、８０％より高い割合でトリアシルグリセロール骨格中のｓｎ－２位にパルミチン酸残基を有する。幾つかの実施形態では、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロールは、パルミチン酸を含有するトリアシルグリセロールが富化されたパーム油画分、例えば、ＩＶ（ヨウ素価）が１０未満であり、トリパルミチン含量が＞６０％ｗ／ｗであり、トリグリセリド骨格中のｓｎ－２位がパルミチン酸残基によって占められる割合が７０％超、例えば７５％超又は８０％超である、パームステアリンである。
【0031】
本発明の文脈において、「ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロール」という用語は、７０％より高い割合のオレイン酸残基がトリアシルグリセロール骨格中のｓｎ－２位にある、トリアシルグリセロール及び／又はトリアシルグリセロール原材料を意味する。一実施形態では、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールは、７５％より高い割合でトリアシルグリセロール骨格中ｓｎ－２位にオレイン酸残基を有する。別の実施形態では、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールは、８０％より高い割合でトリアシルグリセロール骨格中ｓｎ－２位にオレイン酸残基を有する。
【0032】
本発明の文脈において、「循環プロセス」又は「循環方法」という用語は、それぞれ別個の最終生成物をもたらし、副生成物を生成する、２つのプロセスの組合せを意味し、第１のプロセスで生成された副生成物が第２のプロセスで反応物質として使用され、逆もまた同様である。したがって、通常では廃棄物としてみなされる副生成物が回収され、反応物質としてリサイクルされることによって、化学産業における価値連鎖全体の資源効率を最適化し、クローズドループの、廃棄物のない化学反応を可能にする。
【0033】
本発明の文脈において、「副生成物」という用語は、反応又はプロセスにおいて主生成物の調製中に生成される二次生成物を意味する。
【0034】
本発明の文脈において、「ココアバター同等物」（ＣＢＥ）という用語は、チョコレート用途のためのココアバター代用品を意味する。ココアバター同等物は、通常、分画プロセスによって植物性脂肪から製造され、例えばパーム油、シア脂、サル脂又はイリッペ脂から配合され、かつ主要な３種類のＴＡＧである、ＰＯＰ、ＳＯＰ及びＳＯＳのいずれにおいても見られるＴＡＧ組成における類似性により、物理特性及び化学特性の両方においてココアバターに類似している。
【0035】
本発明の文脈において、「アルコーリシス」という用語は、選択的ｓｎ－１，３リパーゼ酵素の作用による、トリグリセリド中に存在する脂肪酸とアルコール（メタノール、エタノール、ブタノールなど）とのエステル交換反応を意味する。この反応は、モノグリセリドの形成、及びそれぞれのアルコールと脂肪酸との脂肪酸エステルの形成をもたらす。
【0036】
本発明の文脈において、「リパーゼ」又は「ｓｎ－１，３リパーゼ」という用語は、エステル結合に作用する酵素であって（ＥＣ３．１）、カルボン酸エステルヒドロラーゼ（ＥＣ３．１．１）のクラスに属し、より具体的には、トリグリセリド骨格中のＳｎ－１及びＳｎ－３エステル結合を加水分解する高い位置選択性を有する、加水分解酵素を意味する。高い１，３－選択性を有するリパーゼは、例えばカンジダータ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａｔａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ）（リパーゼＢ）、サーモマイセス・ラヌギノサス、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）、Ｒ．オリザ（Ｒ．ｏｒｙｚａ）、リゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）などを供給源とすることができる。
【0037】
固定化させた状態のｓｎ－１，３リパーゼの非限定的な例は、シリカ上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、メタクリレート／ジビニルベンゼンコポリマー上に吸着させたカンジダ・アンタークティカ（Ｃａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ ）由来のリパーゼＢ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、イオン交換を介してスチレン／ＤＶＢポリマーに結合させたリゾムコール・ミエヘイ由来のリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４００８６、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、又は疎水性相互作用を介してマクロ多孔質ポリプロピレンに結合させたリパーゼ（Ａｃｃｕｒｅｌ ＥＰ １００）である。
【0038】
本発明の文脈において、「脱臭」という用語は、高温（典型的には＞２００℃）及び高真空（典型的には＜２０ｍＢａｒ）の条件下で蒸気を油に注入して、遊離脂肪酸（ＦＦＡ）、脂肪酸エステル、モノグリセリド及びジグリセリドのような揮発性成分を除去して、ＴＡＧからなる無臭油を得る、水蒸気蒸留プロセスを意味する。
【0039】
本発明の文脈において、「分画」という用語は、ある量の混合物(固体、液体、懸濁液)が相転移中に画分に分離される分離プロセスを意味する。これらの画分は組成が異なり、したがって通常、画分のうちの１つにおける分子種の富化並びにその後の分離及び／又は精製を可能にする。
【0040】
本発明の文脈において、「選択的沈殿」又は「選択的結晶化」という用語は、沈殿温度を適合させることによって、生じ得る他の沈殿物を含有する溶液から１つ又は幾つかの特定の沈殿物（固体）の生成を起こす、分離及び／又は精製技術を示す。例えば、沈殿プロセスの温度より高い融点を有する分子種は、これらの条件下で沈殿を形成しない。
【0041】
本発明の一実施形態では、選択的沈殿は、所望の生成物の結晶化をもたらす。
【0042】
本発明の文脈において、「固定化した状態」という用語は、リパーゼ酵素が固体担体材料上に共有結合又は非共有結合（例えば、吸着）していることを意味する。適切な担体の非限定的な例は、共有結合の場合は、適切なリンカー分子（例えば、グルタルアルデヒド）と共に、例えばエポキシ基、ブチル基又はアミノ基を有するメタクリレート樹脂から作製された、マクロ多孔質疎水性支持体、非共有結合固定化の場合は、例えば、ポリスチレン系吸着剤、オクタデシルメタクリレート、ポリプロピレン、非圧縮性シリカゲルから作製されたマクロ多孔質担体を介した疎水性相互作用によるマクロ多孔質疎水性支持体、であり、イオン相互作用を介した非共有結合的吸着の場合は、イオン交換樹脂（例えばポリスチレンイオン交換樹脂）又はシリカが使用される。
【0043】
ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料の調製方法
本発明者らは、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料を調製するための循環プロセスを見出し、この循環プロセスは、それぞれ別個の副生成物を生成し、別個の最終生成物をもたらす２つのプロセスを組み合わせるものである。２つのプロセスは、時間的及び／又は空間的に分離される。これは、一方のプロセスが例えば別個の製造ラインにおいて並行して実行されてもよく、又は他方のプロセスが完了した後に同じ製造ライン又は別個のラインのいずれかにおいて実行されてもよいことを意味する。環状プロセスにおいて組み合わされる酵素プロセスの１つは、ヒト母乳において豊富である、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料をもたらす。循環プロセスに組み合わされる第２の酵素プロセスは、ココアバター及びココアバター同等物に豊富である、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料をもたらす。これらの２つの酵素プロセスは、共通のステップ、すなわち、第１のアルコーリシスステップ（ステップａ）ｉ）及びステップｂ）ｉ））、続いて中間体精製ステップ（ステップａ）ｉｉ）及びステップｂ）ｉｉ））、並びに無溶媒エステル化ステップ（ステップｃ）ｉ）及びステップｃ）ｉｉ））を共有する。精製ステップ（ステップａ）ｉｖ）及びステップｂ）ｉｖ））は、エステル化ステップの後に実施することができる。
本発明者らは、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料を調製するための循環プロセスを見出し、この循環プロセスは、それぞれ別個の副生成物を生成し、別個の最終生成物をもたらす２つのプロセスを組み合わせるものである。２つのプロセスは、時間的及び／又は空間的に分離される。これは、一方のプロセスが例えば別個の製造ラインにおいて並行して実行されてもよく、又は他方のプロセスが完了した後に同じ製造ライン又は別個のラインのいずれかにおいて実行されてもよいことを意味する。環状プロセスにおいて組み合わされる酵素プロセスの１つは、ヒト母乳において豊富である、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料をもたらす。循環プロセスに組み合わされる第２の酵素プロセスは、ココアバター及びココアバター同等物に豊富である、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料をもたらす。これらの２つの酵素プロセスは、共通のステップ、すなわち、第１のアルコーリシスステップ（ステップａ）ｉ）及びステップｂ）ｉ））、続いて中間体精製ステップ（ステップａ）ｉｉ）及びステップｂ）ｉｉ））、並びに無溶媒エステル化ステップ（ステップｃ）ｉ）及びステップｃ）ｉｉ））を共有する。精製ステップ（ステップａ）ｉｖ）及びステップｂ）ｉｖ））は、エステル化ステップの後に実施することができる。
【0044】
本発明による方法は、ＯＰＯ又はＰＯＰのいずれかを生成するために使用される酵素反応を含む２ステッププロセスにおいて生成される副生成物を回収し、反応物質として再使用することができるという利点を有する。本発明の幾つかの実施形態では、ステップａ）ｉ）において生成されたパルミチン酸エステル及びステップｂ）ｉ）において生成されたオレイン酸エステルの全て又は少なくとも一部は、残留アルコールの蒸発による除去後にそれぞれのプロセスにおいて再利用される。
【0045】
この循環プロセスは、これら２つのプロセスの間に生成される副生成物を再利用するという利点を有する。したがって、通常では廃棄物としてみなされる副生成物が回収され、反応物質としてリサイクルされることによって、化学産業における価値連鎖全体の資源効率を最適化し、クローズドループの、廃棄物のない化学反応を可能にする。
【0046】
アルコーリシス［ステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）］
本発明の方法は、トリパルミチン、及び／又はトリパルミチンが富化されたトリグリセリドを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下でアルコーリシスステップに供して、２－モノパルミチン及び副生成物としてパルミチン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップを含むプロセスを含む。
本発明の方法は、トリパルミチン、及び／又はトリパルミチンが富化されたトリグリセリドを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下でアルコーリシスステップに供して、２－モノパルミチン及び副生成物としてパルミチン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップを含むプロセスを含む。
【0047】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）のための出発物質は、トリパルミチンである。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）のための出発物質は、トリパルミチンが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えばパルミチン酸が富化されたパーム油画分、例えば１０未満のＩＶ（ヨウ素価）を有するパームステアリンである。
【0048】
トリパルミチン及び／又はトリパルミチンが富化されたトリアシルグリセロールの、２－モノパルミチンへの選択的アルコーリシスでは、トリパルミチンの高い融点（約６５℃）が課題である。化学的アルコーリシスは非特異的であり、したがって、２－モノパルミチンを生成するために使用することができない。対照的に、酵素によるアルコーリシスは、高度に選択的なｓｎ－１，３位でのアルコーリシスをもたらすことができ、２－モノパルミチンの高純度な合成を可能にする。酵素使用の課題は、ほとんどの市販の酵素は熱安定性が比較的低いことであり、反応が５０℃を超えて実施される場合にはリパーゼの不活性化がもたらされる。リパーゼの不活性化を最小限に抑え、より低い温度（＜５０℃）で基質（例えばトリパルミチン）を十分に可溶化させるために、有機溶媒、最も一般的にはアセトン、ｎ－ヘキサン、又はＭＴＢＥが典型的に使用される。しかしながら、工業用溶媒を使用すると、プロセスの複雑さ及び操作（溶媒の除去及び取り扱い、安全性の問題）が増加し、ひいては（溶媒、より大きな反応体積、したがって装置／反応器、により）プロセスコストが押し上げられ、並びに環境への負荷（溶媒の再利用）がもたらされる。
【0049】
本発明の方法はまた、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下でアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップを含む、他のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離されている、別のプロセスを実施することを含む。
【0050】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップｂ）ｉ）のための出発物質は、トリオレインである。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップｂ）ｉ）のための出発物質は、トリオレインが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えば高オレイン酸ヒマワリ油などである。
【0051】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、ｎ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、イソプロパノール又はそれらの混合物の存在下で実施される。
【0052】
幾つかの実施形態では、鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールは、ｎ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、イソプロパノール及びそれらの混合物からなるリストから選択される。
【0053】
本発明の文脈において、一般的に使用されるアルコール、メタノール及びエタノールから、高モル比（６～１５当量）でのｎ－ブタノールの供給に切り替えることで、驚くべきことに、酵素を失活させることなく５０℃で基質を可溶化し、９０％純度の２－モノパルミチンを生成させることを可能にした。
【0054】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、ｎ－ブタノールの存在下で実施される。ｎ－ブタノールは過剰であってもよい。
【0055】
幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、シリカ上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、メタクリレート／ジビニルベンゼンコポリマー上に吸着させたカンジダ・アンタークティカ由来のリパーゼＢ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、イオン交換を介してスチレン／ＤＶＢポリマー上に結合させたリゾムコール・ミエヘイ由来のリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４００８６、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、又は疎水性相互作用を介してマクロ多孔質ポリプロピレン上に結合させたリパーゼ（Ａｃｃｕｒｅｌ ＥＰ １００）、からなる群から選択されるｓｎ－１，３リパーゼの存在下で実施される。
【0056】
他の実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、ｓｎ－１，３リパーゼの存在下、例えば、シリカ上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシス由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）の存在下で実施される。
【0057】
別の実施形態では、トリパルミチン、及び／又はトリパルミチンが富化されたトリアシルグリセロールを、ｓｎ－１，３リパーゼ及びｎ－ブタノールの存在下で実施されるアルコーリシスステップａ）ｉ）に供して、２－モノパルミチン及び副生成物としてパルミチン酸ブチルを含む生成物混合物を得る。
【0058】
幾つかの実施形態では、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、ｓｎ－１，３リパーゼ及びｎ－ブタノールの存在下で実施されるアルコーリシスステップｂ）ｉ）に供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸ブチルを含む生成物混合物を得る。
【0059】
アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）において、固定化酵素調製物は、脂肪及び溶媒などの非水性媒質中にリパーゼを適切に分散させ、並びに回収及び再利用を可能にすることで、当該プロセスをより費用効率の高いものにする。
【0060】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、ｎ－ブタノール及びシリカゲル担体上に吸着させたｓｎ－１，３リパーゼの存在下で実施される。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、ｎ－ブタノールと、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシス由来のリパーゼとの存在下で実施される。
【0061】
アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）においてｎ－ブタノールを使用することによって、反応は、５０～６５℃の範囲の温度で溶媒なしで進行した。ブタノールは、基質及びトリグリセリドの溶解補助剤の両方として働くことで、無溶媒反応、高変換収率（過剰）及びリパーゼ活性を可能にする。
【0062】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）は、４０～７０℃の範囲の温度、例えば４５～５５℃の範囲の温度で実施される。
【0063】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）では、２－モノパルミチン及び副生成物としてパルミチン酸エステルを含む生成物混合物が得られる。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップｂ）ｉ）では、２－モノオレエート及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物が得られる。アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）をｎ－ブタノールの存在下で実施する場合、一方では２－モノパルミチン及びパルミチン酸ブチルを含む生成物混合物が得られ、他方では２－モノオレイン及びオレイン酸ブチルを含む生成物混合物が得られる。したがって、本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）ｉ）において生成される副生成物はパルミチン酸ブチルであり、ステップｂ）ｉ）において生成される副生成物はオレイン酸ブチルである。
【0064】
したがって、本発明に記載されるアルコーリシスステップは、本発明による方法に対して、例えば以下のような幾つかの利点を提供する：
無溶媒反応は、リアクター容積を縮小し(容積による産生率の増大）、プロセスコストを削減し、安全な取り扱い、溶媒の除去及び再利用を省く（溶媒除去は、乳幼児期の栄養を目的とする原材料では特に重要である）、
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）などの市販のリパーゼである固定化リパーゼを、工業規模で入手できる、
アルコーリシスステップで生成した副生成物は、その後のエステル化反応で再使用することができ、それによって…。
無溶媒反応は、リアクター容積を縮小し(容積による産生率の増大）、プロセスコストを削減し、安全な取り扱い、溶媒の除去及び再利用を省く（溶媒除去は、乳幼児期の栄養を目的とする原材料では特に重要である）、
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）などの市販のリパーゼである固定化リパーゼを、工業規模で入手できる、
アルコーリシスステップで生成した副生成物は、その後のエステル化反応で再使用することができ、それによって…。
【0065】
中間体精製［ステップａ）ｉｉ）及びｂ）ｉｉ）］
本発明の２ステップでの、酵素によるエステル交換プロセスは、ＯＰＯ又はＰＯＰを産生する従来方法、例えば１ステップの酸分解よりも複雑であるが、わずかに複雑さが増すことで、最終生成物の品質を著しく向上させることができ、すなわち、より高いｓｎ－２パルミテート含量又はより高いｓｎ－２オレエート含量のそれぞれが可能となり、それぞれを、ＩＦ及びココアバター同等物における使用において更に魅力的なものとする。
本発明の２ステップでの、酵素によるエステル交換プロセスは、ＯＰＯ又はＰＯＰを産生する従来方法、例えば１ステップの酸分解よりも複雑であるが、わずかに複雑さが増すことで、最終生成物の品質を著しく向上させることができ、すなわち、より高いｓｎ－２パルミテート含量又はより高いｓｎ－２オレエート含量のそれぞれが可能となり、それぞれを、ＩＦ及びココアバター同等物における使用において更に魅力的なものとする。
【0066】
２ステッププロセスは中間体の精製を必要とし、品質の向上が、中間体精製［ステップａ）ｉｉ）及びｂ）ｉｉ）］により生じ得るコスト増によって相殺されないことが重要である。
【0067】
中間体精製のための現在の技術としては、分子蒸留、溶媒結晶化、及びクロマトグラフィーが挙げられるが、これらの３つの方法は全て、目的とする用途には費用がかかりすぎるものであり、改善／簡略化が利益につながる。例えば、溶媒分画法は、典型的には、溶媒の使用及び低温（＜－１０℃）を必要とする。
【0068】
本発明の方法によれば、中間体精製ステップａ）ｉｉ）及びｂ）ｉｉ）は、それぞれ２－モノパルミチン又は２－モノオレエートの選択的結晶化によって実施することができる。
【0069】
したがって、本発明の方法は、アルコーリシスステップａ）ｉ）で得られた２－モノパルミチンを含む生成物混合物を、２－モノパルミチンを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、パルミチン酸エステルを含む残留液体画分並びにパルミチン酸エステル及び残留アルコールを含む残留液体画分を、例えば濾過又は遠心分離によって除去するステップを含むプロセスを含む。この精製ステップで除去される副生成物は、アルコール（メタノール、エタノール、ブタノールなど）と１，３位に存在する脂肪酸(主にパルミチン酸)との反応生成物である。得られるエステルは、使用されるアルコールに応じて異なる融点を有する。特にパルミチン酸ブチルは、融点がパルミチン酸メチルエステル及びパルミチン酸エチルエステル(それぞれ３０℃及び２４℃）よりも低く（１７℃）、２－モノパルミチン（６０℃）と除去されるべき副生成物との間の融点の差がより大きくなる。このより大きな差は、分離プロセスにとって有益である。アルコーリシスで使用された過剰のアルコールを含む副生成物は、アルコーリシスステップａ）ｉ）の後に、２－モノパルミチン、ブタノール及びパルミチン酸ブチルを含有する粗混合物を０～１５℃の範囲の温度で分画することによって効率的に除去することができ、これにより２－モノパルミチンは選択的結晶化を受け、かつ副生成物は液体状態のままであり、例えば濾別することができる。
【0070】
したがって、粗混合物の分画温度が０℃未満であること及び溶媒の無添加は、２－モノパルミチンの単純かつ安価な精製ステップを可能にする。
【0071】
無溶媒分画を用いると、目的生成物（２－モノパルミチン）の選択的結晶化をより高い温度で実施することができ、蒸留による溶媒除去のためのステップを実施する必要がない。
【0072】
本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ステップａ）ｉｉ）は、ステップａ）ｉ）で得られた２－モノパルミチンを含む生成物混合物の温度を０℃～１５℃の範囲の温度、例えば５℃～１０℃の範囲の温度又は６℃～８℃の範囲の温度に低下させて、２－モノパルミチンを選択的に結晶化させて分画すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される。
【0073】
本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ステップａ）ｉｉ）は、ステップａ）ｉ）で得られた２－モノパルミテートを含む生成物混合物の温度を０～１５℃の範囲の温度に低下させて、２－モノパルミチンを選択的に沈殿させる分画を実施すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される。
【0074】
本発明の方法はまた、アルコーリシスステップｂ）ｉ）において得られた２－モノオレインを含む生成物混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、オレイン酸エステル及び残りのアルコールを含む残留液体画分を、例えば濾過又は遠心分離によって除去するステップを含む、他のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離されている、別のプロセスを実施するステップを含む。
【0075】
２－モノオレインの分画に関しては、より低い温度、例えば－２０℃が必要である。本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ｂ）ｉｉ）は、ステップｂ）ｉ）で得られた２－モノオレインを含む生成物混合物の温度を－３０℃～－１０℃の範囲の温度、例えば－２５℃～－１５℃の範囲の温度又は－２３℃～－１７℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に結晶化させて分画すること、並びに残留液体画分を例えば濾過によって除去することによって実施される。
【0076】
したがって、粗混合物の分画温度が０℃未満であること及び溶媒の無添加は、２－モノオレインの単純かつ安価な精製ステップを可能にする。
【0077】
本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ステップｂ）ｉｉ）は、アルコーリシスステップｂ）ｉ）で得られた２－モノオレインを含む生成混合物の温度を－２５℃～－１５℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に沈殿させる分画を実施すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される。
【0078】
無溶媒エステル化［ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）］
本発明の方法は、ステップａ）ｉｉ）に由来する２－モノパルミチンを、ブタノール及び／又は水除去条件下、固定化リパーゼ、及び、
オレイン酸エステル、及び／又は１，３－ジオレオ－２－パルミチン（ＯＰＯ）を形成させるように選択された脂肪酸混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位パルミチン酸を含みｓｎ－２位パルミチン酸含量が総パルミチン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップを含む、方法を含む。
本発明の方法は、ステップａ）ｉｉ）に由来する２－モノパルミチンを、ブタノール及び／又は水除去条件下、固定化リパーゼ、及び、
オレイン酸エステル、及び／又は１，３－ジオレオ－２－パルミチン（ＯＰＯ）を形成させるように選択された脂肪酸混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位パルミチン酸を含みｓｎ－２位パルミチン酸含量が総パルミチン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップを含む、方法を含む。
【0079】
エステル化ステップａ）ｉｉｉ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下で、例えば窒素バブリングを使用して、モレキュラーシーブを使用して、又は真空下（＞１０ｍｂａｒ）で実施される。
【0080】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップａ）ｉｉｉ）は、アルコーリシスステップｂ）ｉ）で得られたオレイン酸ブチルの存在下、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される。
【0081】
出発物質である２－モノパルミチンは、エステル化ステップの間にアシル転移を受けて、１－モノパルミチンをもたらし得る。この変換は、結果として最終生成物中のｓｎ－２パルミテートを減少させるため、望ましくない。本発明者らは、オレイン酸ブチルの存在下でエステル化ステップａ）ｉｉｉ）を実施することにより、アシル転移が防止及び／又は低減され、反応を実施するのに必要な温度（２－モノパルミチンを融解させるために＞４５℃）でより安定な２－モノパルミチンが得られることを見出した。
【0082】
ＯＰＯを形成するための２－モノパルミチンの無溶媒酵素エステル化は、過去に文献で報告されている。研究Ｈｉｇｈｌｙ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ １，３－Ｏｌｅｏｙｌ－２－Ｐａｌｍｉｔｏｙｌｇｌｙｃｅｒｏｌ ｂｙ Ｌｉｐａｓｅ Ｃａｔａｌｙｓｉｓ（Ｓｃｈｍｉｄ ｅｔ ａｌ，１９９９）では、ＯＰＯは、異なる担体材料上に固定化されたリゾムコール・ミエヘイ及びリゾプス・デレマー（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒ）由来のｓｎ－１，３特異的リパーゼを使用して合成された。反応は、３当量のオレイン酸及び高度に精製された２－モノパルミチン（－２５℃での溶媒結晶化による）を用いて５０℃で行われた。２－モノパルミチンの重量に基づいて１０～２５％の固定化リパーゼが使用されており、著者らは、１６時間の反応後、マクロ多孔質ポリプロピレン（ＥＰ１００）上に固定化されたリゾプス・デレマーのリパーゼを使用して、９６％ ｓｎ－２パルミチン酸で７８％ＯＰＯが得られたと述べている。しかしながら、同研究では、そのような固定化されたＲ．デレマーのリパーゼの温度安定性は限定されていること（５２℃）が明らかにされており、更に、２－モノパルミチンエステル化の間に高ＯＰＯ濃度に達するためには非常に長い反応時間が必要であることが明らかにされている。
【0083】
予備スクリーニング試験において、純粋な２－モノパルミチンを出発物質として使用し、以下の異なる３種類の固定化リパーゼ、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ ４０１４５ ＮＳを評価した。ＴＡＧの形成に最も効率的なリパーゼは、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ ＮＳ ４０１４５及びＴＬ ＩＭであった。アルコーリシス反応において最も有効であることが証明されていたため、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを選択した。
【0084】
ＯＰＯ又はｓｎ－２パルミテートＴＡＧ混合物を調製するため、オレイン酸を、トリオレインのアルコーリシス（ステップｂ）ｉ））に由来するオレイン酸ブチルによって、又はオレイン酸ブチルと遊離脂肪酸（例えばリノール酸）との混合物によって置き換えた。２－モノパルミチンに対して２５％ｗ／ｗの固定化リパーゼ酵素を投入することで、反応は典型的には３時間後に完了した。
【0085】
更に、アルコーリシスステップ及びエステル化反応ステップの両方において同じリパーゼを使用することは、プロセスの費用効率を高め、かつプロセスステップａ）ｉ）及びａ）ｉｉｉ）の両方での同じ固定化酵素調製物の再使用が可能になる。トリパルミチン富化脂肪からＯＰＯへの全プロセスは、わずか１種類のリパーゼ、すなわちＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭのみを使用して実施することができた。
【0086】
本発明の方法はまた、ステップｂ）ｉｉ）に由来する２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
オレイン酸エステル、及び／又は２－オレイン－１，３－ジパルミチン（ＰＯＰ）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリグリセリドプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップを含む、他のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離されている、別のプロセスを実施することを含む。
固定化リパーゼ、及び、
オレイン酸エステル、及び／又は２－オレイン－１，３－ジパルミチン（ＰＯＰ）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリグリセリドプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップを含む、他のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離されている、別のプロセスを実施することを含む。
【0087】
エステル化ステップｂ）ｉｉｉ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下で、例えば窒素バブリングを使用して、モレキュラーシーブを使用して、又は真空下（＞１０ｍｂａｒ）で実施される。
【0088】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップｂ）ｉｉｉ）は、アルコーリシスステップａ）ｉ）において得られたパルミチン酸ブチルの存在下で、ブタノール及び／又は水除去条件下で実施される。
【0089】
ＰＯＰ又はｓｎ－２オレエートＴＡＧ混合物を調製するために、パルミチン酸を、トリパルミチンのアルコーリシスに由来するパルミチン酸ブチルによって、又はパルミチン酸ブチルと遊離脂肪酸（例えばステアリン酸）との混合物によって置き換えることができる。２－モノオレインに対して２５％ｗ／ｗの固定化リパーゼ酵素を投入することで、反応は典型的には３時間後に完了した。
【0090】
本発明による方法は、ＯＰＯ又はＰＯＰのいずれかを生成するために使用される酵素反応を伴う２ステッププロセスにおいて生成される副生成物を回収し、反応物質として再使用することができるという利点を有する。
【0091】
したがって、本発明の幾つかの実施形態では、ステップａ）ｉ）において生成されたパルミチン酸エステル及びステップｂ）ｉ）において生成されたオレイン酸エステルの全て又は少なくとも一部は、残留アルコールの蒸発による除去後にそれぞれのプロセスにおいて再利用される。再循環とは、パルミチン酸エステル及びオレイン酸エステルがそれぞれの反応において反応物質として再使用されることを意味する。
【0092】
幾つかの他の実施形態では、ステップａ）ｉ）において生成されたパルミチン酸ブチル及びステップｂ）ｉ）において生成されたオレイン酸ブチルの全て又は少なくとも一部は、残留アルコールの蒸発による除去後にそれぞれのプロセスにおいて再利用される。
【0093】
固定化酵素調製物は、アルコーリシスステップａ）ｉ）及びｂ）ｉ）において、脂肪及び溶媒などの非水性媒質中にリパーゼを適切に分散させ、並びにエステル化ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）において回収される酵素の回収及び再利用を可能にすることで、プロセスをより費用効率の高いものにする。
【0094】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下、３５℃～６０℃の範囲の温度、例えば４０℃～５０℃の範囲の温度で実施される。
【0095】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下で、３５℃～６０℃の範囲の温度、例えば４０℃～５０℃の範囲の温度、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシスの存在下で実施される。
【0096】
精製［ステップａ）ｉｖ）及びｂ）ｉｖ）］
本発明の方法は、ステップａ）ｉｉｉ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップを含むプロセスを含む。
本発明の方法は、ステップａ）ｉｉｉ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップを含むプロセスを含む。
【0097】
本発明の方法はまた、ステップｂ）ｉｉｉ）で得られた生成物混合物を精製して過剰の遊離脂肪酸、残留脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップを含む、他のプロセスから時間的及び／又は空間的に分離されている、別のプロセスを実施することを含む。
【0098】
本発明の方法によるエステル化ステップａ）ｉｉｉ）及びｂ）ｉｉｉ）に由来する最終ＴＡＧ生成物混合物の精製は、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するために実施することができる。
【0099】
過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドの除去は、脱臭、蒸留、分画又は短行程蒸留を使用して実施することができる。
【0100】
典型的には、精製の必要がある混合物及び／又は生成物の脱臭は、＞２００℃より高い温度で、２０ｍＢａｒ未満の圧力の真空条件下で行われ得る。
【0101】
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの製造方法
本発明の一態様では、本発明は、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法であって、
ａ）トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、オレイン酸エステルを含む残留液体画分及び残りのアルコールを、例えば濾過又は遠心分離で除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又はＰＯＰ（２－オレイン－１，３－ジパルミチン）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップと、を含む調製方法を提供する。
本発明の一態様では、本発明は、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法であって、
ａ）トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップと、
ｂ）ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、オレイン酸エステルを含む残留液体画分及び残りのアルコールを、例えば濾過又は遠心分離で除去するステップと、
ｃ）ステップｂ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、
固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又はＰＯＰ（２－オレイン－１，３－ジパルミチン）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた生成物混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するステップと、を含む調製方法を提供する。
【0102】
アルコーリシス［ステップａ）］
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップを含む。
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、固定化リパーゼ及び鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸エステルを含む生成物混合物を得るステップを含む。
【0103】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）のための出発物質は、トリオレインである。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップａ）のための出発物質は、トリオレインが富化されたトリアシルグリセロール混合物、例えば高オレイン酸ヒマワリ油などである。
【0104】
幾つかの実施形態では、鎖長Ｃ３～Ｃ５の第一級又は第二級アルコールは、ｎ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、イソプロパノール及びそれらの混合物からなるリストから選択される。
【0105】
本発明の文脈において、一般的に使用されるアルコール、メタノール及びエタノールから、高モル比（６～１５当量）でのｎ－ブタノールの供給に切り替えることで、驚くべきことに、酵素を失活させることなく５０℃で基質を可溶化し、９０％純度の２－モノオレインを生成させることを可能にした。
【0106】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、ｎ－ブタノール、ｎ－ペンタノール、イソプロパノール又はそれらの混合物の存在下で実施される。
【0107】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、ｎ－ブタノールの存在下で実施される。ｎ－ブタノールは過剰であってもよい。
【0108】
アルコーリシスステップａ）にｎ－ブタノールを使用することによって、反応は、５０～６５℃の範囲の温度で溶媒なしで進行した。ブタノールは、基質及びトリアシルグリセロールの溶解補助剤の両方として働くことで、無溶媒反応、高変換収率及びリパーゼ活性を可能にする。
【0109】
幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）において生成される副生成物は、オレイン酸ブチルである。別の実施形態では、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、ｓｎ－１，３リパーゼ及びｎ－ブタノールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸ブチルを含む生成物混合物を得る。
【0110】
幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、シリカ上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノサス由来のリパーゼ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、メタクリレート／ジビニルベンゼンコポリマー上に吸着させたカンジダ・アンタークティカ由来のリパーゼＢ（例えば、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、イオン交換を介してスチレン／ＤＶＢポリマーに結合させたリゾムコール・ミエヘイ由来のリパーゼ（例えば、Ｎｏｖｏｚｙｍ（登録商標）４００８６、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ）、又は疎水性相互作用を介してマクロ多孔質ポリプロピレンに結合させたリパーゼ（Ａｃｃｕｒｅｌ ＥＰ １００）、からなる群から選択されるｓｎ－１，３リパーゼの存在下で実施される。
【0111】
アルコーリシスステップａ）において、固定化酵素調製物は、脂肪及び溶媒などの非水性媒質中にリパーゼを適切に分散させ、並びにエステル化ステップｂ）における回収された酵素の回収及び再利用を可能にすることで、プロセスをより費用効率の高いものにする。
【0112】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、ｎ－ブタノールと、シリカゲル担体上に吸着させたｓｎ－１，３リパーゼ、例えばサーモマイセス・ラヌギノシス由来のｓｎ－１，３リパーゼ（例えば、リポザイムＴＬ ＩＭ、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社製）との存在下で実施される。本発明の他の実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、ｎ－ブタノールと、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシスとの存在下で実施される。
【0113】
別の実施形態では、トリオレイン、及び／又はトリオレインが富化されたトリアシルグリセロールを、ｓｎ－１，３リパーゼ及びｎ－ブタノールの存在下で実施されるアルコーリシスステップに供して、２－モノオレイン及び副生成物としてオレイン酸ブチルを含む生成物混合物を得る。
【0114】
本発明の幾つかの実施形態では、アルコーリシスステップａ）は、４０～７０℃の範囲の温度、例えば４５～５５℃の範囲の温度で実施される。
【0115】
中間体精製［ステップｂ）］
本発明の２ステップでの、酵素によるエステル交換プロセスは、ＰＯＰを産生する従来方法、例えば、１ステップの酸分解又はエステル交換よりも複雑であるが、わずかに複雑さが増すことで、最終生成物の品質を著しく改善することができ、すなわち、それぞれ、より高いｓｎ－２オレエートと、制御されたｓｎ－２オレエートトリアシルグリセロール混合物の利用とが可能になり、ココアバター同等物における使用を更に魅力的なものとにする。
本発明の２ステップでの、酵素によるエステル交換プロセスは、ＰＯＰを産生する従来方法、例えば、１ステップの酸分解又はエステル交換よりも複雑であるが、わずかに複雑さが増すことで、最終生成物の品質を著しく改善することができ、すなわち、それぞれ、より高いｓｎ－２オレエートと、制御されたｓｎ－２オレエートトリアシルグリセロール混合物の利用とが可能になり、ココアバター同等物における使用を更に魅力的なものとにする。
【0116】
２ステッププロセスは中間体の精製を必要とし、品質の向上が、中間体精製［ステップｂ）］により生じ得るコスト増によって相殺されないことが重要である。
【0117】
中間体精製のための現在の技術としては、分子蒸留、溶媒結晶化、及びクロマトグラフィーが挙げられるが、これらの３つの方法は全て、目的とする用途には費用がかかりすぎるものであり、改善／簡略化が利益につながる。例えば、溶媒分画法は、典型的には、溶媒の使用及び低温（＜－１０℃）を必要とする。
【0118】
したがって、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む混合物を、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画プロセスによって精製し、その後、オレイン酸エステル及び残留アルコールを含む残留液体画分を、例えば濾過又は遠心分離によって除去するステップを含む。
【0119】
２－モノオレインの分画に関しては、低温、例えば－２０℃が必要である。本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ｂ）は、ステップａ）で得られた２－モノオレインを含む生成混合物の温度を－３０℃～－１０℃の範囲の温度、例えば－２５℃～－１５℃の範囲の温度又は－２３℃～－１７℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に結晶化させる分画を実施すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される。
【0120】
したがって粗混合物の分画温度が０℃未満であること及び溶媒の無添加は、２－モノオレインの単純かつ安価な精製ステップを可能にする。
【0121】
本発明の幾つかの実施形態では、中間体精製ステップｂ）は、アルコーリシスステップａ）で得られた２－モノオレインを含む生成混合物の温度を－２５℃～－１５℃の範囲の温度に低下させて、２－モノオレインを選択的に沈殿させる分画を実施すること、並びに残留液体画分を例えば濾過又は遠心分離で除去することによって実施される。
【0122】
無溶媒エステル化［ステップｃ）］
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、ステップｂ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又はＰＯＰ（２－オレイン－１，３－ジパルミチン）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供することを更に含む。
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、ステップｂ）から得られた２－モノオレインを、ブタノール及び／又は水除去条件下、固定化リパーゼ、及び、
ブチルエステル、及び／又はＰＯＰ（２－オレイン－１，３－ジパルミチン）を形成させるように選択された脂肪酸の混合物、及び／又は、
ｓｎ－２位オレイン酸を含みｓｎ－２位オレイン酸含量が総オレイン酸含量の７０％以上である、カスタマイズされたトリアシルグリセロールプロファイルを有する混合物、
の存在下で、エステル化ステップに供することを更に含む。
【0123】
エステル化ステップｃ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下で、例えば窒素バブリングを使用して、モレキュラーシーブを使用して、又は真空下（＞１０ｍｂａｒ）で実施される。
【0124】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップｃ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下、４０℃～７０℃の範囲の温度、例えば４５℃～５５℃の範囲の温度で実施される。
【0125】
本発明の幾つかの実施形態では、エステル化ステップｃ）は、ブタノール及び／又は水除去条件下、３５℃～６０℃の範囲の温度、例えば、４０℃～５０℃の範囲の温度、シリカゲル担体上に吸着させたサーモマイセス・ラヌギノシス由来のリパーゼの存在下で、実施される。
【0126】
精製［ステップｄ）］
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、ステップｃ）で得られた生成混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノ及びジグリセリドを除去するステップを更に含む。
ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製方法は、ステップｃ）で得られた生成混合物を精製して、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノ及びジグリセリドを除去するステップを更に含む。
【0127】
本発明の方法によるエステル化ステップｃ）に由来する最終ＴＡＧ生成物混合物の精製は、過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノグリセリド及びジグリセリドを除去するために実施することができる。
【0128】
過剰の遊離脂肪酸、残留している脂肪酸アルキルエステル並びにモノ及びジグリセリドの除去は、脱臭、蒸留、分画又は短行程蒸留により実施することができる
典型的には、精製の必要がある混合物及び／又は生成物の脱臭は、＞２００℃より高い温度で、２０ｍＢａｒ未満の圧力の真空条件下で行われ得る。
典型的には、精製の必要がある混合物及び／又は生成物の脱臭は、＞２００℃より高い温度で、２０ｍＢａｒ未満の圧力の真空条件下で行われ得る。
【0129】
ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料の調製プロセスにおける、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製プロセスの使用
先に述べたように、ＰＯＰの産生プロセスのアルコーリシスステップにおいて生成される副生成物、すなわちオレイン酸エステル、例えばオレイン酸ブチルを、ＯＰＯの産生プロセスのエステル化ステップにおいて反応物質として使用できることで、循環プロセスがもたらされる。したがって、この循環プロセスは、組み合わされたプロセスのすべての利点を提供する。
先に述べたように、ＰＯＰの産生プロセスのアルコーリシスステップにおいて生成される副生成物、すなわちオレイン酸エステル、例えばオレイン酸ブチルを、ＯＰＯの産生プロセスのエステル化ステップにおいて反応物質として使用できることで、循環プロセスがもたらされる。したがって、この循環プロセスは、組み合わされたプロセスのすべての利点を提供する。
【0130】
したがって、本発明の態様は、ｓｎ－２位パルミチン酸又はｓｎ－２位オレイン酸のいずれかが富化されたトリアシルグリセロールを含む原材料の調製プロセスにおける、ｓｎ－２位オレイン酸が富化されたトリアシルグリセロールの調製プロセスの使用を提供する。
【0131】
実験項
実施例１
異なる条件下での無溶媒アルコール分解による２－モノパルミチンの製造
材料及び方法
イソプロパノール、ｎ－ブタノール又はｎ－ペンタノールをアルコールとして使用して、無溶媒条件下で純粋なトリパルミチンに対してアルコーリシスを行った。
実施例１
異なる条件下での無溶媒アルコール分解による２－モノパルミチンの製造
材料及び方法
イソプロパノール、ｎ－ブタノール又はｎ－ペンタノールをアルコールとして使用して、無溶媒条件下で純粋なトリパルミチンに対してアルコーリシスを行った。
【0132】
この試験は、鎖長Ｃ３～Ｃ５のアルコールを用いて、無溶媒でのトリパルミチンのアルコーリシスによる２－モノパルミチン産生の実行可能性を評価するために行った。プロセスステップを実行可能なものにするためには、精製プロセス及び反応収率に影響を与える副生成物（例えば、ジグリセリド）の産生を回避する高変換率が達成されなければならない。
【0133】
装置：
１０×１．５ｍＬ Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣガラスバイアル、セプタム付きのねじ蓋付き
１．５ｍＬ Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣバイアルに適合するように改変した加熱ブロック及び温度制御装置を備えたサーモミキサー
１０×１．５ｍＬ Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣガラスバイアル、セプタム付きのねじ蓋付き
１．５ｍＬ Ａｇｉｌｅｎｔ ＧＣバイアルに適合するように改変した加熱ブロック及び温度制御装置を備えたサーモミキサー
【0134】
化学物質：
トリパルミチン、トリパルミチン酸グリセロール、９８％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＬＯＴ＃１０１８４９３３
２－プロパノール、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ ＬＣ－ＭＳ
１－ブタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％
１－ペンタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％
アルコールは実験前にモレキュラーシーブ（３Å）で脱水した。
トリパルミチン、トリパルミチン酸グリセロール、９８％、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、ＬＯＴ＃１０１８４９３３
２－プロパノール、Ｈｏｎｅｙｗｅｌｌ、Ｃｈｒｏｍａｓｏｌｖ ＬＣ－ＭＳ
１－ブタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％
１－ペンタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％
アルコールは実験前にモレキュラーシーブ（３Å）で脱水した。
【0135】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，カンジダ・アンタークティカリパーゼＢを疎水性担体（アクリル樹脂）に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，カンジダ・アンタークティカリパーゼＢを疎水性担体（アクリル樹脂）に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0136】
手順
サーモミキサーを５０℃に加熱した
１７５ｍｇのトリパルミチンを秤量して、サンプリング用のゴムセプタムを含むタイトスクリューキャップ付きの１．５ｍＬガラスバイアルに入れた
アルコールをバイアルに添加し閉じた
閉じたバイアルをサーモミキサーに入れ、基質が完全に溶解するまで６５０ｒｐｍで振とうした
反応開始前（０分）にサンプル（１０μＬ）を採取した
リパーゼを添加して反応を開始させた
サンプルは０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分及び２４０分後に採取した
以下の表１は、実験で使用したリパーゼ及びアルコール、並びに各反応バイアルにおける質量及び体積を報告する。二連で混合物を調製し、合計１０個のバイアルを調製し、試験した。
サーモミキサーを５０℃に加熱した
１７５ｍｇのトリパルミチンを秤量して、サンプリング用のゴムセプタムを含むタイトスクリューキャップ付きの１．５ｍＬガラスバイアルに入れた
アルコールをバイアルに添加し閉じた
閉じたバイアルをサーモミキサーに入れ、基質が完全に溶解するまで６５０ｒｐｍで振とうした
反応開始前（０分）にサンプル（１０μＬ）を採取した
リパーゼを添加して反応を開始させた
サンプルは０分、３０分、６０分、１２０分、１８０分及び２４０分後に採取した
以下の表１は、実験で使用したリパーゼ及びアルコール、並びに各反応バイアルにおける質量及び体積を報告する。二連で混合物を調製し、合計１０個のバイアルを調製し、試験した。
【0137】
【表1】
【0138】
結果及び考察
結果は、試験したいずれのリパーゼでも、鎖長Ｃ３～Ｃ５のアルコールを用い、無溶媒で、酵素によりモデル基質のアルコーリシスを実施することができたことを示す。サンプリング時点毎に、それぞれの反応におけるトリパルミチンの２－モノパルミチンへの変換収率を計算した（図４に報告する）。試験で達成された最良の変換収率は、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭをｎ－ブタノールと共に使用した９７％であった。
結果は、試験したいずれのリパーゼでも、鎖長Ｃ３～Ｃ５のアルコールを用い、無溶媒で、酵素によりモデル基質のアルコーリシスを実施することができたことを示す。サンプリング時点毎に、それぞれの反応におけるトリパルミチンの２－モノパルミチンへの変換収率を計算した（図４に報告する）。試験で達成された最良の変換収率は、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭをｎ－ブタノールと共に使用した９７％であった。
【0139】
トリパルミチンは、５０℃で完全に可溶化され、試験したアルコールと混和性であった。予備試験として、アルコーリシスを無溶媒のエタノール中で行った。トリパルミチンの融点が高いため、トリパルミチンを可溶化させるためには反応温度を６５℃に上昇させる必要があったが、これらの条件下では、トリパルミチンの２－モノパルミチンへの変換率が非常に低いこと（３３％、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５、Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ社の存在下）が観察された。より多量のエタノールを添加して５０℃でトリパルミチンを溶解させる試行は、脂質及びアルコールが十分に混和せず濁った懸濁液が生じたこと、並びに酵素変換が観察されなかったことから、十分に機能しなかった。
【0140】
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを２種類のアルコール：ｎ－ブタノール及びｎ－ペンタノールと共に使用すると、より高い収率が達成された。ｎ－ブタノール反応の変換率は２時間後に最大に達し、ｎ－ペンタノール反応は３時間後に最大に達した。最も高い変換率は、ｎ－ブタノール中のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭにより達成され、２時間の反応後に＞９５％に達した。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭでは、イソプロパノールを使用する反応の速度は他の２種類のアルコールよりも低く、反応は完了まで進行しなかった。
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを２種類のアルコール：ｎ－ブタノール及びｎ－ペンタノールと共に使用すると、より高い収率が達成された。ｎ－ブタノール反応の変換率は２時間後に最大に達し、ｎ－ペンタノール反応は３時間後に最大に達した。最も高い変換率は、ｎ－ブタノール中のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭにより達成され、２時間の反応後に＞９５％に達した。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭでは、イソプロパノールを使用する反応の速度は他の２種類のアルコールよりも低く、反応は完了まで進行しなかった。
【0141】
図５は、初期グリセリド含量のモル分率として表されるトリパルミチン、１，２－ジパルミチン及び２－モノパルミチンの量を示す。３つの画分の合計も示す。
【0142】
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５の使用では、ｎ－ブタノールを用いた３時間の反応後に５０％未満の最高変換率が達成された。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５は、イソプロパノールではＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭよりも高い反応速度を達成した。イソプロパノールを使用して達成された最高変換率は４０％であり、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５との２時間の反応後に到達した。
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５の使用では、ｎ－ブタノールを用いた３時間の反応後に５０％未満の最高変換率が達成された。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５は、イソプロパノールではＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭよりも高い反応速度を達成した。イソプロパノールを使用して達成された最高変換率は４０％であり、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５との２時間の反応後に到達した。
【0143】
実施例２
トリパルミチン含量の高い脂肪に対するＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭよる無溶媒ブタノリシス
トリパルミチンが富化された脂肪のアルコーリシスを実施して、工業上関連のある出発物質を用いて無溶媒条件下で２－モノパルミチンを産生した。
トリパルミチン含量の高い脂肪に対するＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭよる無溶媒ブタノリシス
トリパルミチンが富化された脂肪のアルコーリシスを実施して、工業上関連のある出発物質を用いて無溶媒条件下で２－モノパルミチンを産生した。
【0144】
実験により、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）（トリパルミチンと同様）は、ｎ－ブタノールとＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭとを使用する反応条件下での酵素による２－モノパルミチン産生の際に、ｓｎ－２パルミテートの現実的な供給源になり得ることが確認された。
【0145】
装置：
スクリューキャップ及びガス散布のための配管を備えた５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
マグネチックスターラ、スターラプレート
ヒーター／温度制御付き水浴
ゴムで裏打ちされたスクリューキャップを有する２×１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
温度制御を備えたＡｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ Ｌａｂ－Ｔｈｅｒｍ Ｌａｂシェーカー
スクリューキャップ及びガス散布のための配管を備えた５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
マグネチックスターラ、スターラプレート
ヒーター／温度制御付き水浴
ゴムで裏打ちされたスクリューキャップを有する２×１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
温度制御を備えたＡｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ Ｌａｂ－Ｔｈｅｒｍ Ｌａｂシェーカー
【0146】
化学物質：
１－ブタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％、モレキュラーシーブ（３Å）で乾燥
ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
１－ブタノール、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、≧９９％、モレキュラーシーブ（３Å）で乾燥
ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
【0147】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0148】
手順：
乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
１００ｇのＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）を５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに秤量した
フラスコを７０℃の水浴に入れ、窒素で６時間スパージした。
乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
１００ｇのＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）を５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに秤量した
フラスコを７０℃の水浴に入れ、窒素で６時間スパージした。
【0149】
反応（二連）
１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに、以下を添加した：
１０ｇの乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ
１７ｍＬの無水ｎ－ブタノール
脂肪がブタノールに十分に溶解するまで、フラスコを７０℃の水浴中に入れた（透明、淡黄色液体）。
１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに、以下を添加した：
１０ｇの乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ
１７ｍＬの無水ｎ－ブタノール
脂肪がブタノールに十分に溶解するまで、フラスコを７０℃の水浴中に入れた（透明、淡黄色液体）。
【0150】
フラスコを５０℃及び１４００ｒｐｍのＬａｂ Ｓｈａｋｅｒ中に１時間置いた。
【0151】
反応を開始する前に０分の試料を採取した（１０μＬ）。
【0152】
１．５ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを添加することによって反応を開始した。
【0153】
３０分、６０分、９０分、１２０分及び１５０分後に試料を採取した。
【0154】
リパーゼの再利用性
酵素安定性及び再利用性が高いことは、酵素プロセスにおけるプロセスの経済性及びコストに関して重要な推進力である。完全な変換に達した後にリパーゼを取り出し（濾過）、新鮮な基質溶液に移し、次いで３サイクルの連続反応について変換収率及び生成物プロファイルを比較することによって、アルコーリシス中のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭの再利用性を試験した。
酵素安定性及び再利用性が高いことは、酵素プロセスにおけるプロセスの経済性及びコストに関して重要な推進力である。完全な変換に達した後にリパーゼを取り出し（濾過）、新鮮な基質溶液に移し、次いで３サイクルの連続反応について変換収率及び生成物プロファイルを比較することによって、アルコーリシス中のＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭの再利用性を試験した。
【0155】
手順：
乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
１００ｇのＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）を５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに秤量した
フラスコを７０℃の水浴に入れ、窒素で６時間スパージした。
乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）
１００ｇのＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）を５００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに秤量した
フラスコを７０℃の水浴に入れ、窒素で６時間スパージした。
【0156】
実施例１に記載のものと同じ方式でアルコーリシス反応を実施した。すなわち、生体触媒として１．５ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを使用して、１０ｇの乾燥ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎを１７ｍＬのｎ－ブタノールと反応させた。反応は停止までに２．５時間行った。
【0157】
次いで、酵素を濾別することによって反応を停止させた。次いで、同じ酵素を同一の反応で３サイクル再使用した。各反応サイクルで同様の生成物プロフィールが得られたことから、固定化リパーゼＴＬの活性を損なわずに３サイクルのアルコーリシス反応に再使用することが可能であることが示された。
【0158】
結果及び考察
ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎを用いたアルコーリシス反応の進行を図６に示し、パルミチン酸を含有する（及びＧＣによって定量可能であった）全ての分子種の枯渇及び形成を示す。この無溶媒アルコーリシス反応におけるＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎからの２－モノパルミチンの収率は、Ｓｎ－２位パルミチン酸含量に基づき９４％に達した。出発物質Ｃｒｉｓｔａｌ Ｇｒｅｅｎは、Ｓｎ－２位に３２％のパルミチン酸を含有し（他のパルミチン酸はＳｎ－１及び／又はＳｎ－３に位置する）、最終２－モノパルミチン生成物では３０％のパルミチン酸が回収され、９４％の収率が得られた。Ｓｎ－２位に存在しない残りの６％のパルミチン酸は、幾つかの副生成物、すなわち、１，２－ジグリセリド及び遊離パルミチン酸の量において見出された。出発物質Ｃｒｉｓｔａｌ ＧｒｅｅｎのＳｎ－１及びＳｎ－３に元々存在するパルミチン酸を、パルミチン酸ブチルエステルに変換した。
ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎを用いたアルコーリシス反応の進行を図６に示し、パルミチン酸を含有する（及びＧＣによって定量可能であった）全ての分子種の枯渇及び形成を示す。この無溶媒アルコーリシス反応におけるＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎからの２－モノパルミチンの収率は、Ｓｎ－２位パルミチン酸含量に基づき９４％に達した。出発物質Ｃｒｉｓｔａｌ Ｇｒｅｅｎは、Ｓｎ－２位に３２％のパルミチン酸を含有し（他のパルミチン酸はＳｎ－１及び／又はＳｎ－３に位置する）、最終２－モノパルミチン生成物では３０％のパルミチン酸が回収され、９４％の収率が得られた。Ｓｎ－２位に存在しない残りの６％のパルミチン酸は、幾つかの副生成物、すなわち、１，２－ジグリセリド及び遊離パルミチン酸の量において見出された。出発物質Ｃｒｉｓｔａｌ ＧｒｅｅｎのＳｎ－１及びＳｎ－３に元々存在するパルミチン酸を、パルミチン酸ブチルエステルに変換した。
【0159】
実施例３
無溶媒分画（選択的沈殿による）による２－モノパルミチンの精製試験
２－モノパルミチンを、実施例２に記載されるように、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを使用してＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）のｎ－ブタノール分解によって生成し、選択的結晶化による無溶媒分画によって精製した。２－モノパルミチンに、２当量の脂肪酸アルキルエステル及び１３当量のアルコールを添加して、試験のためのモデル混合物を作製した（以下の表２に記載）。次いで、水浴中で温度を徐々に下げることによってこれらの混合物を分画した。
無溶媒分画（選択的沈殿による）による２－モノパルミチンの精製試験
２－モノパルミチンを、実施例２に記載されるように、Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを使用してＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）のｎ－ブタノール分解によって生成し、選択的結晶化による無溶媒分画によって精製した。２－モノパルミチンに、２当量の脂肪酸アルキルエステル及び１３当量のアルコールを添加して、試験のためのモデル混合物を作製した（以下の表２に記載）。次いで、水浴中で温度を徐々に下げることによってこれらの混合物を分画した。
【0160】
【表2】
【0161】
パートＩ－パルミチン酸アルキルエステルの調製
脂肪酸アルキルエステルは、パルミチン酸と、アルコールのメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール及びｎ－ペンタノールとから調製した。メタノール及びエタノールの反応は、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル中で行った。他の反応は無溶媒で行った。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５は反応を触媒した。
脂肪酸アルキルエステルは、パルミチン酸と、アルコールのメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ－ブタノール及びｎ－ペンタノールとから調製した。メタノール及びエタノールの反応は、メチル－ｔｅｒｔ－ブチルエーテル中で行った。他の反応は無溶媒で行った。Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ４３５は反応を触媒した。
【0162】
装置：
ゴムで裏打ちされたスクリューキャップを有する５×１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
温度制御を備えたＡｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ Ｌａｂ－Ｔｈｅｒｍ Ｌａｂシェーカー
Ｂｕｃｈｉ ｒｏｔａｖａｐｏｒ － 実験室スケール蒸発器
真空濾過設定
５×５０ｍＬ丸底フラスコ
ゴムで裏打ちされたスクリューキャップを有する５×１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコ
温度制御を備えたＡｄｏｌｆ Ｋｕｅｈｎｅｒ Ｌａｂ－Ｔｈｅｒｍ Ｌａｂシェーカー
Ｂｕｃｈｉ ｒｏｔａｖａｐｏｒ － 実験室スケール蒸発器
真空濾過設定
５×５０ｍＬ丸底フラスコ
【0163】
１０ｍＬのアルコール中の１グラムのＬｉｐｏｚｙｍｅ ４３５を使用して１グラムのパルミチン酸を反応させた。アルコールはイソプロパノール、ブタノール、及びペンタノールとした。メタノール及びエタノールの調製を、１ｍＬのアルコール及び１０ｍＬのＭＴＢＥを用いて行った。水を除去するためにモレキュラーシーブ（３Å）を混合物に加えた。
【0164】
反応は１４００ｒｐｍで振とうしながら５０℃で行った。リパーゼを添加することにより反応を開始し、１２時間行った。リパーゼを濾別することにより反応を停止させた。反応を停止させた後、残留しているアルコール及び溶媒をロータリーエバポレーターで蒸発させた。
【0165】
蒸発からの保持相を透明な２ｍＬガラスバイアルに移し、秤量した。対応する量の２－モノパルミチン及びアルコールを計算し、表２のようにチューブに添加した。
【0166】
パートＩＩ－脂肪酸アルキルエステルと、２－モノパルミチンとさまざまなアルコールとの混合物の結晶化／分画挙動
パートＩで調製した混合物を４０℃の水浴中に入れた。次いで、温度を徐々に低下させ、以下の５つの混合物（表２による）について混合物の相転移及び沈殿挙動を観察した。
パートＩで調製した混合物を４０℃の水浴中に入れた。次いで、温度を徐々に低下させ、以下の５つの混合物（表２による）について混合物の相転移及び沈殿挙動を観察した。
【0167】
パルミチン酸メチル＋２－モノパルミテート＋メタノール
パルミチン酸エチル＋２－モノパルミテート＋エタノール
パルミチン酸イソプロピル＋２－モノパルミテート＋イソプロパノール
パルミチン酸ｎ－ブチル＋２－モノパルミチン＋ｎ－ブタノール
パルミチン酸ｎ－ペンチル＋２－モノパルミチン＋ｎ－ペンタノール
パルミチン酸エチル＋２－モノパルミテート＋エタノール
パルミチン酸イソプロピル＋２－モノパルミテート＋イソプロパノール
パルミチン酸ｎ－ブチル＋２－モノパルミチン＋ｎ－ブタノール
パルミチン酸ｎ－ペンチル＋２－モノパルミチン＋ｎ－ペンタノール
【0168】
融点：
２－モノパルミチン：６５℃
パルミチン酸メチル：３０℃
パルミチン酸エチル：２４℃
パルミチン酸ｎ－プロピル：２０．４℃
パルミチン酸ｎ－ブチル：１６．９℃
２－モノパルミチン：６５℃
パルミチン酸メチル：３０℃
パルミチン酸エチル：２４℃
パルミチン酸ｎ－プロピル：２０．４℃
パルミチン酸ｎ－ブチル：１６．９℃
【0169】
結果及び考察
実験の結果、２－モノパルミチン及び１，２－ジパルミチンは沈殿したが、アルコール及びその対応するパルミチン酸アルキルエステルは溶液中に残っていたため、イソプロピル－、ｎ－ブチル－及びｎ－ペンチルの混合物を分画することができた。メチル－及びエチル－の混合物は分画されなかった。
実験の結果、２－モノパルミチン及び１，２－ジパルミチンは沈殿したが、アルコール及びその対応するパルミチン酸アルキルエステルは溶液中に残っていたため、イソプロピル－、ｎ－ブチル－及びｎ－ペンチルの混合物を分画することができた。メチル－及びエチル－の混合物は分画されなかった。
【0170】
長鎖アルコールから誘導される混合物は、１，２－ジパルミチン及び２－モノパルミチンの白色結晶を形成した。
【0171】
より短い鎖に由来する混合物は分画されず、むしろ混合物全体が固化した。
【0172】
これらの結果から、アルコーリシスステップにおけるより長鎖のアルコールの使用は、分画を助け、無溶媒分画を可能にすると推測することができる。
【0173】
したがって、Ｃ３～Ｃ５アルコールを有することは、所望の生成物（２－モノパルミチン）のための単純化された中間体精製ステップのさらなる予想外の利益を与える。
【0174】
実施例４
中間体精製 ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）の無溶媒ブタノリシスによって得られた生成物混合物を選択的に結晶化させる無溶媒分画
本試験は、選択的沈殿による無溶媒分画によって、実施例１に記載のアルコーリシスステップの生成物から２－モノパルミチンを精製するために実施した。
中間体精製 ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）の無溶媒ブタノリシスによって得られた生成物混合物を選択的に結晶化させる無溶媒分画
本試験は、選択的沈殿による無溶媒分画によって、実施例１に記載のアルコーリシスステップの生成物から２－モノパルミチンを精製するために実施した。
【0175】
装置：
５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ
ガラスフィルターを有する真空濾過装置
５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコ
ガラスフィルターを有する真空濾過装置
【0176】
化学物質：
２．５時間の反応後に、実施例１に記載のアルコーリシスステップから約０．９５当量の２－モノグリセリド、０．０５当量の１，２－ジグリセリド、２当量の脂肪酸ｎ－ブチルエステル、１３当量のｎ－ブタノール、からなる最終反応混合物が得られた
ｎ－ヘプタン
２．５時間の反応後に、実施例１に記載のアルコーリシスステップから約０．９５当量の２－モノグリセリド、０．０５当量の１，２－ジグリセリド、２当量の脂肪酸ｎ－ブチルエステル、１３当量のｎ－ブタノール、からなる最終反応混合物が得られた
ｎ－ヘプタン
【0177】
手順：
リパーゼの濾過によりアルコーリシス反応を停止した
濾液を５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した
フラスコを４℃で一晩置いた
分画混合物の一部をガラスフィルター上に注いだ。溶液を通過させると、白色結晶の濾過ケーキが残る。真空を維持しながら結晶上にヘプタンを滴下することによって、結晶を洗浄した。次いで、真空を停止し、結晶をフィルターから掻き取った。
リパーゼの濾過によりアルコーリシス反応を停止した
濾液を５０ｍＬエルレンマイヤーフラスコに移した
フラスコを４℃で一晩置いた
分画混合物の一部をガラスフィルター上に注いだ。溶液を通過させると、白色結晶の濾過ケーキが残る。真空を維持しながら結晶上にヘプタンを滴下することによって、結晶を洗浄した。次いで、真空を停止し、結晶をフィルターから掻き取った。
【0178】
結晶をデシケーター中で乾燥させ、秤量した。
【0179】
分画及び濾過から１．６２ｇの結晶画分を回収した。
【0180】
実施例２及び４に記載されるように達成された全プロセス収率は４０％であった。
【0181】
結果及び考察
２－モノパルミチンを選択的に結晶化させる分画による中間体精製は、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）のブタノリシスからの最終反応混合物に対して首尾よく行われた。パルミチン酸ブチルの量は９０％減少した。これは本方法では、例えば濾過を介して、液体パルミチン酸ブチル及びブタノールから２－モノパルミチン（結晶）を分離することが可能であることを示す。
２－モノパルミチンを選択的に結晶化させる分画による中間体精製は、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）のブタノリシスからの最終反応混合物に対して首尾よく行われた。パルミチン酸ブチルの量は９０％減少した。これは本方法では、例えば濾過を介して、液体パルミチン酸ブチル及びブタノールから２－モノパルミチン（結晶）を分離することが可能であることを示す。
【0182】
実施例５
ＯＰＯ原材料産生のためのブタノリシスから誘導された２－モノパルミチン生成物の、オレイン酸ブチルによる無溶媒エステル交換
本実験は、（実施例２に記載されているように）ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からのブタノリシスによって生成され（実施例４に記載されているように）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された２－モノパルミチンが、オレイン酸ブチルの使用により首尾よく酵素エステル交換されて、ＯＰＯを生成し得ること、を実証するために実施した。最終原材料は、ヒト母乳のものと合致（７０％以上）するＳｎ－２パルミテート含量を含有する。
ＯＰＯ原材料産生のためのブタノリシスから誘導された２－モノパルミチン生成物の、オレイン酸ブチルによる無溶媒エステル交換
本実験は、（実施例２に記載されているように）ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からのブタノリシスによって生成され（実施例４に記載されているように）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された２－モノパルミチンが、オレイン酸ブチルの使用により首尾よく酵素エステル交換されて、ＯＰＯを生成し得ること、を実証するために実施した。最終原材料は、ヒト母乳のものと合致（７０％以上）するＳｎ－２パルミテート含量を含有する。
【0183】
化学物質：
オレイン酸ブチル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノパルミチン、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からブタノリシスにより製造、選択的結晶化による無溶媒分画により精製
オレイン酸ブチル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノパルミチン、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からブタノリシスにより製造、選択的結晶化による無溶媒分画により精製
【0184】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0185】
実験：
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１．５ｇの２－モノパルミチン
４ｇのオレイン酸ブチル（約２．６当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
３７５ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去して反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチルは短行程蒸留又は脱臭によって除去される
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１．５ｇの２－モノパルミチン
４ｇのオレイン酸ブチル（約２．６当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
３７５ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去して反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチルは短行程蒸留又は脱臭によって除去される
【0186】
ＧＣ分析法はＯＰＯとＰＯＯとを区別することができないので、ＬＣ－ＭＳを使用するさらなる分析を最終混合物に対して行ったところ、ＯＰＯが主要なＴＡＧ（５４％）であり、かつｓｎ－２パルミテートが７１％であることが示された。最終ＴＡＧ混合物中のＴＡＧ分布を以下の表３に示す。
【0187】
【表3】
【0188】
結果及び考察
エステル化が成功したことで、酵素がオレイン酸ブチルを効率的に基質として使用して、２－モノパルミチン上でオレイン酸をエステル化することができることが実証された。
エステル化が成功したことで、酵素がオレイン酸ブチルを効率的に基質として使用して、２－モノパルミチン上でオレイン酸をエステル化することができることが実証された。
【0189】
アシル転移
出発物質である２－モノパルミチンは、エステル化ステップの間にアシル転移を受けて、１－モノパルミチンをもたらし得る。この変換は、結果として最終生成物中のｓｎ－２パルミテートを減少させるため、望ましくない。本発明者らは、２－モノパルミチンを３当量のオレイン酸又はオレイン酸ブチル（酵素を含まない）に曝露して、１時間ごとに温度を上昇させる（４５℃で１時間、続いて５０℃で１時間、続いて５５℃で１時間）、安定性試験を実施し、アシル転移を評価した。ＧＣ分析の結果を表４に示す。
出発物質である２－モノパルミチンは、エステル化ステップの間にアシル転移を受けて、１－モノパルミチンをもたらし得る。この変換は、結果として最終生成物中のｓｎ－２パルミテートを減少させるため、望ましくない。本発明者らは、２－モノパルミチンを３当量のオレイン酸又はオレイン酸ブチル（酵素を含まない）に曝露して、１時間ごとに温度を上昇させる（４５℃で１時間、続いて５０℃で１時間、続いて５５℃で１時間）、安定性試験を実施し、アシル転移を評価した。ＧＣ分析の結果を表４に示す。
【0190】
【表4】
【0191】
これらの結果は、この反応においてアシル転移を防止するためには、温度は考慮すべき重要な要素であること、並びにオレイン酸ブチルは遊離オレイン酸を上回るオレイン酸源であること、を示している。オレイン酸ブチルは４５℃でのアシル転移を防止するが、オレイン酸の場合は防止しない。
【0192】
実施例６
ＯＰＯ／ＯＰＬ／ＬＰＬ原材料産生のための、ブタノリシスから誘導される２－モノパルミチン生成物の、オレイン酸ブチル及びリノール酸による無溶媒エステル化
本実験は、（実施例２に記載されるような）ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎからのブタノリシスによって生成され（実施例４に記載されるような）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された２－モノパルミチンが、遊離脂肪酸と共に脂肪酸エステルの混合物を使用することにより首尾よく酵素エステル化されて、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化された、ＯＰＯ、ＯＰＬ及びＬＰＬなどのトリグリセリドの混合物を生成し得ることを実証するために行われた。最終原材料は、ヒト母乳のものと合致するＳｎ－２パルミテート含量（７０％以上）を含有する。
ＯＰＯ／ＯＰＬ／ＬＰＬ原材料産生のための、ブタノリシスから誘導される２－モノパルミチン生成物の、オレイン酸ブチル及びリノール酸による無溶媒エステル化
本実験は、（実施例２に記載されるような）ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎからのブタノリシスによって生成され（実施例４に記載されるような）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された２－モノパルミチンが、遊離脂肪酸と共に脂肪酸エステルの混合物を使用することにより首尾よく酵素エステル化されて、ｓｎ－２位パルミチン酸が富化された、ＯＰＯ、ＯＰＬ及びＬＰＬなどのトリグリセリドの混合物を生成し得ることを実証するために行われた。最終原材料は、ヒト母乳のものと合致するＳｎ－２パルミテート含量（７０％以上）を含有する。
【0193】
化学物質：
オレイン酸ブチル、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
リノール酸、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノパルミチン、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からブタノリシスにより製造、選択的結晶化による無溶媒分画により精製
オレイン酸ブチル、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
リノール酸、９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノパルミチン、ＣｒｉｓｔａｌＧｒｅｅｎ（登録商標）からブタノリシスにより製造、選択的結晶化による無溶媒分画により精製
【0194】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0195】
実験：
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１．５ｇの２－モノパルミチン
３．０７ｇのオレイン酸ブチル（２当量）
２．５５ｇのリノール酸（２当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
３７５ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ（２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去することにより反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチル及びリノール酸は、短行程蒸留又は脱臭によって除去される
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１．５ｇの２－モノパルミチン
３．０７ｇのオレイン酸ブチル（２当量）
２．５５ｇのリノール酸（２当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
３７５ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ（２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去することにより反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチル及びリノール酸は、短行程蒸留又は脱臭によって除去される
【0196】
ＧＣ分析法は、ＯＰＯとＰＯＯとを、並びにＯＰＬとＰＯＬとＯＬＰとを、区別することができないため、最終混合物に対してＬＣ－ＭＳを使用してさらなる分析を行ったところ、ＯＰＬが主要なＴＡＧ（３１％）であり、ｓｎ－２パルミテートが７９％であることが示された。最終ＴＡＧ混合物中のＴＡＧ分布を以下の表５に示す。
【0197】
【表5】
【0198】
結果及び考察
ＬＰＬ及びＯＰＯのレベルが非常に近いことから（１７％対１５％）、遊離脂肪酸と、脂肪酸ブチルエステルとを比較したときに当該酵素の選好性はわずかであることが実証され得る。この選好性は、これらの２種類の形態（オレイン酸形態とリノール酸形態）において脂肪酸が同じではないという事実によるとも考えられる。
ＬＰＬ及びＯＰＯのレベルが非常に近いことから（１７％対１５％）、遊離脂肪酸と、脂肪酸ブチルエステルとを比較したときに当該酵素の選好性はわずかであることが実証され得る。この選好性は、これらの２種類の形態（オレイン酸形態とリノール酸形態）において脂肪酸が同じではないという事実によるとも考えられる。
【0199】
この実施例の主要な結論は、同じ反応において２種類の異なる形態（遊離脂肪酸及びブチルエステル）を混合することで、ｓｎ－１位及びｓｎ－３位にさまざまな脂肪酸を導入することが可能であるということである。
【0200】
実施例７
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭによるトリオレイン含量の高い脂肪に対する無溶媒ブタノリシス
トリオレインが富化された脂肪（高オレイン酸ヒマワリ油）のアルコーリシスを実施して、工業上関連のある出発物質を用いて無溶媒条件で２－モノオレインを生成した。
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭによるトリオレイン含量の高い脂肪に対する無溶媒ブタノリシス
トリオレインが富化された脂肪（高オレイン酸ヒマワリ油）のアルコーリシスを実施して、工業上関連のある出発物質を用いて無溶媒条件で２－モノオレインを生成した。
【0201】
この実験は、高オレイン酸ヒマワリ油が、ｎ－ブタノール及びＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭを使用する反応条件下での、酵素による２－モノオレイン産生に利用可能な、ｓｎ－２オレエート源であり得ることを確認した。
【0202】
化学物質：
１－ブタノール、≧９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
高オレイン酸ヒマワリ油、Ｆｌｏｒｉｎ
１－ブタノール、≧９９％、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
高オレイン酸ヒマワリ油、Ｆｌｏｒｉｎ
【0203】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0204】
手順：
反応
１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに、以下を添加した：
５０ｇの高オレイン酸ヒマワリ油（予め真空下、７０℃で乾燥させたもの）
６２ｍＬの無水ｎ－ブタノール
７．５ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
反応をモニターするために１時間毎に試料を収集した
４時間後、ＴＡＧは観察されず、ごくわずかな量のＤＡＧのみが観察された
酵素を濾過することにより反応を停止させた
反応
１００ｍＬのＳｃｈｏｔｔフラスコに、以下を添加した：
５０ｇの高オレイン酸ヒマワリ油（予め真空下、７０℃で乾燥させたもの）
６２ｍＬの無水ｎ－ブタノール
７．５ｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
反応をモニターするために１時間毎に試料を収集した
４時間後、ＴＡＧは観察されず、ごくわずかな量のＤＡＧのみが観察された
酵素を濾過することにより反応を停止させた
【0205】
実施例８
中間体精製 高オレイン酸ヒマワリ油の無溶媒ブタノリシスによって得られた生成物混合物を選択的に結晶化させる無溶媒分画
この試験は、選択的沈殿による無溶媒分画によって、実施例７に記載のアルコーリシスステップの生成物から２－モノオレインを精製するために実施した。
中間体精製 高オレイン酸ヒマワリ油の無溶媒ブタノリシスによって得られた生成物混合物を選択的に結晶化させる無溶媒分画
この試験は、選択的沈殿による無溶媒分画によって、実施例７に記載のアルコーリシスステップの生成物から２－モノオレインを精製するために実施した。
【0206】
化学物質：
実施例７に記載のアルコーリシスステップから、２．５時間の反応後に、２－モノグリセリド、１，２－ジグリセリド、脂肪酸ｎ－ブチルエステル及びｎ－ブタノールからなる最終反応混合物が得られる
実施例７に記載のアルコーリシスステップから、２．５時間の反応後に、２－モノグリセリド、１，２－ジグリセリド、脂肪酸ｎ－ブチルエステル及びｎ－ブタノールからなる最終反応混合物が得られる
【0207】
手順：
アルコール分解反応をリパーゼの濾過により停止した
濾液をフラスコに移した
わずかに撹拌（回転）させながら、一晩かけてゆっくりと－２０℃までフラスコを冷却させた
形成された沈殿／結晶を、－２０℃での遠心分離及び濾過後に回収した
結晶を回収し、秤量し、分析した
ＧＣ分析は、２－モノオレインと共に、微量のオレイン酸ブチル及びＤＡＧを示した
分画及び濾過により１０ｇの結晶画分を回収した。
アルコール分解反応をリパーゼの濾過により停止した
濾液をフラスコに移した
わずかに撹拌（回転）させながら、一晩かけてゆっくりと－２０℃までフラスコを冷却させた
形成された沈殿／結晶を、－２０℃での遠心分離及び濾過後に回収した
結晶を回収し、秤量し、分析した
ＧＣ分析は、２－モノオレインと共に、微量のオレイン酸ブチル及びＤＡＧを示した
分画及び濾過により１０ｇの結晶画分を回収した。
【0208】
実施例７及び実施例８に記載されるように達成された全プロセス収率は５０％であった。
【0209】
実施例９
ＰＯＰ原材料製造のためのブタノリシスから誘導された２－モノオレイン生成物の、パルミチン酸ブチルによる無溶媒エステル交換
この実験は、（実施例７に記載されているように）高オレイン酸ヒマワリ油からブタノリシスによって生成され、（実施例８に記載されているように）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された、２－モノオレインが、パルミチン酸ブチルの使用により首尾よく酵素エステル交換されて、ＰＯＰを生成し得ることを実証するために実施した。最終原材料は、７０％以上のｓｎ－２オレエート含量を含有する。
ＰＯＰ原材料製造のためのブタノリシスから誘導された２－モノオレイン生成物の、パルミチン酸ブチルによる無溶媒エステル交換
この実験は、（実施例７に記載されているように）高オレイン酸ヒマワリ油からブタノリシスによって生成され、（実施例８に記載されているように）選択的結晶化による無溶媒分画によって精製された、２－モノオレインが、パルミチン酸ブチルの使用により首尾よく酵素エステル交換されて、ＰＯＰを生成し得ることを実証するために実施した。最終原材料は、７０％以上のｓｎ－２オレエート含量を含有する。
【0210】
化学物質：
パルミチン酸ブチル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノオレイン、高オレイン酸ヒマワリ油からブタノリシスによって生成され、選択的結晶化による無溶媒分画によって精製
パルミチン酸ブチル、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ
２－モノオレイン、高オレイン酸ヒマワリ油からブタノリシスによって生成され、選択的結晶化による無溶媒分画によって精製
【0211】
酵素：
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
Ｌｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ，Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ，サーモマイセス・ラヌギノサスのリパーゼをシリカゲル担体（非圧縮性）上に固定化したもの
【0212】
実験：
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１ｇの２－モノオレイン
２．６ｇのパルミチン酸ブチル（３当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
２５０ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去して反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチルは短行程蒸留又は脱臭によって除去される
２５ｍＬフラスコに、以下を添加した：
１ｇの２－モノオレイン
２．６ｇのパルミチン酸ブチル（３当量）
フラスコを５０℃の回転エバポレーターに入れた
撹拌（フラスコを回転させることによる）及び真空（約２０ｍＢａｒ）を適用して、酵素の添加前に混合物を乾燥させた
２５０ｍｇのＬｉｐｏｚｙｍｅ ＴＬ ＩＭ２５％ｗ／ｗ）の添加により反応を開始した
完了するまで（約４時間）、真空下（２０ｍＢａｒ）、５０℃で（フラスコを回転させることによって）撹拌
固定化酵素を濾過により除去して反応を停止した
過剰のオレイン酸ブチルは短行程蒸留又は脱臭によって除去される
【0213】
結果及び考察
この実施例は、効率的な方法でＰＯＰを産生可能であることを示す。他の脂肪酸エステル又は遊離脂肪酸（例えば、ステアリン酸エステル又はステアリン酸）を添加することで、このエステル化ステップで更なるトリグリセリドを生成して、ココアバターのＴＡＧプロファイルに更に良好に合致させることも可能である。次に、最終生成物をココアバター同等物として使用することができる。
この実施例は、効率的な方法でＰＯＰを産生可能であることを示す。他の脂肪酸エステル又は遊離脂肪酸（例えば、ステアリン酸エステル又はステアリン酸）を添加することで、このエステル化ステップで更なるトリグリセリドを生成して、ココアバターのＴＡＧプロファイルに更に良好に合致させることも可能である。次に、最終生成物をココアバター同等物として使用することができる。
【0214】
本明細書で述べる現在の好ましい実施形態に対する様々な変更及び修正が、当業者には明らかとなる点を理解されたい。このような変更及び修正は、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、並びに本発明の付随する利点を減らすことなく、なされてもよい。したがって、このような変更及び修正は、添付の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図1A】
【図1B】
【図2A】
【図2B】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】