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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-20
(54)【発明の名称】多能性幹細胞から造血性内皮細胞を生産する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/071 20100101AFI20240213BHJP
C12N 5/077 20100101ALI20240213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240213BHJP
C12N 5/0783 20100101ALI20240213BHJP
C12N 15/09 20060101ALN20240213BHJP
C12N 15/864 20060101ALN20240213BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240213BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240213BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240213BHJP
【ＦＩ】
C12N5/071
C12N5/077
C12N5/10
C12N5/0783
C12N15/09 110
C12N15/864 100Z
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/62 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547485
(86)(22)【出願日】2022-02-17
(85)【翻訳文提出日】2023-08-04
(86)【国際出願番号】 EP2022053985
(87)【国際公開番号】W WO2022175401
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102297.5
(32)【優先日】2021-02-18
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517122578
【氏名又は名称】アダプティミューン・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ガルシア－アレグリア エヴァ
【テーマコード（参考）】
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AB01
4B065AC20
4B065BA02
4B065BB13
4B065BB14
4B065BB19
4B065BB20
4B065BB40
(57)【要約】
本発明は、造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の生産に関する。中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を順次培養することにより、ＩＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させる。次いで、ＨＥＣへの分化を誘導するために、第１及び第２の造血性内皮（ＨＥ）誘導培地で中胚葉細胞を順次培養することにより、中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させる。ＨＥＣはさらに、造血前駆細胞（ＨＰＣ）及び前駆Ｔ細胞へと分化させることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の集団を生産する方法であって、（ａ）中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を順次培養することにより、前記ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させることであって、
前記第１の中胚葉誘導培地は、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、
前記第２の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、
前記第３の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害する、前記ｉＰＳＣの集団を分化させること、ならびに、
（ｂ）ＨＥＣへの分化を誘導するために、第１及び第２のＨＥ誘導培地で前記中胚葉細胞を順次培養することにより、前記中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させることであって、
前記第１のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、
前記第２のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する、前記中胚葉細胞を分化させること
を含む、前記方法。
【請求項2】
工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、間質細胞または血清の非存在下で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
中胚葉分化を促進するのに好適な条件下で前記ｉＰＳＣの集団を培養することにより、前記ｉＰＳＣを中胚葉細胞へと分化させる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
前記第１の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項5】
前記第１の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰを補充した既知組成栄養培地からなる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記ｉＰＳＣは、前記第１の中胚葉誘導培地で１日間培養される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項7】
前記第２の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ及びＦＧＦを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項8】
前記第２の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ及びＦＧＦを補充した既知組成栄養培地からなる、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ｉＰＳＣは、前記第２の中胚葉誘導培地で１日間培養される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項10】
前記第３の中胚葉誘導培地は、アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項11】
前記第３の中胚葉誘導培地は、アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を補充した既知組成栄養培地からなる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記ｉＰＳＣは、前記第３の中胚葉誘導培地で２日間培養される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項13】
前記ｉＰＳＣは、前記中胚葉細胞を生産するために、前記第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で４日間培養される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項14】
前記中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６、及びＰＤＧＦαＲから選択される１つ以上の中胚葉マーカーを発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
前記集団中の中胚葉細胞は、前記第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地での培養後に精製されない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
造血性内皮（ＨＥ）分化を促進するのに好適な条件下で前記中胚葉細胞の集団を培養することにより、前記中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項17】
前記第１のＨＥ誘導培地は、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項18】
前記第１のＨＥ誘導培地は、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを補充した既知組成栄養培地からなる、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記第２のＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項20】
前記第２のＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ、ＦＧＦ及びＶＥＧＦを補充した既知組成栄養培地からなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項21】
前記ＦＧＦはＦＧＦ２（ｂＦＧＦ）である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項22】
前記ＢＭＰはＢＭＰ４である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項23】
アクチビンはアクチビンＡである、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項24】
前記ＧＳＫ３阻害剤はＣＨＩＲ－９９０２１である、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項25】
前記ＨＥＣはＣＤ３４＋表現型を示す、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項26】
前記ＨＥＣはＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－表現型を示す、請求項２５に記載の方法。
【請求項27】
前記集団中のＨＥＣは、前記ＨＥ誘導培地での培養後に精製されない、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項28】
工程（ｉ）及び（ｉｉ）は、前記集団中の細胞の精製または単離をせずに行われる、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項29】
（ｃ）造血分化を促進するのに好適な条件下で前記ＨＥＣの集団を培養することにより、前記ＨＥＣをＨＰＣへと分化させることをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項30】
前記ＨＥＣを造血誘導培地で培養してＨＰＣへの分化を誘導する、請求項２９に記載の方法。
【請求項31】
前記造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）もしくはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路を刺激する、及び／または（ｉｉ）ＶＥＧＦＲもしくはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激する、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
前記造血誘導培地は、ＳＣＦ及びＶＥＧＦの一方または両方を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項33】
前記造血誘導培地は、ＳＣＦ及びＶＥＧＦを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項34】
前記造血誘導培地は、（ｉｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｖ）ＦＬＴ３またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｖ）ＩＧＦ１ＲまたはＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｖｉ）インターロイキン（ＩＬ）活性を示す、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項35】
前記造血誘導培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３及びＩＬ－６を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項36】
前記造血誘導培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＩＬ－７を含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項37】
前記造血誘導培地は、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ＳＨＨ、ＥＰＯ、アンギオテンシンＩＩ及びロサルタンのうちの１つ以上を欠いている、請求項３１～３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項38】
前記造血誘導培地は、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、前記１つ以上の分化因子は、ＳＣＦ及び／またはＶＥＧＦからなる、請求項３１～３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項39】
前記造血誘導培地は、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり、（ｉ）前記１つ以上の分化因子は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３及びＩＬ－６からなるか、または（ｉｉ）前記１つ以上の分化因子は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＩＬ－７からなる、請求項３１～３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項40】
前記造血誘導培地中の前記分化因子は、（ｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＩＬ－７、または（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、及びＩＬ－６である、請求項３９に記載の方法。
【請求項41】
前記ＨＰＣはＣＤ３４＋表現型を示す、請求項２９～４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項42】
前記ＨＰＣはＣＤ３４＋ＣＤ４５＋表現型を示す、請求項４１に記載の方法。
【請求項43】
前記ＨＰＣは、胸腺リンパ球新生ＨＰＣ（ｔＨＰＣ）を含む、請求項２９～４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項44】
前記ｔＨＰＣはＣＤ３４＋ＣＤ７＋表現型を示す、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記ＨＥＣは、前記ＨＰＣを生産するために、前記造血誘導培地で１６～２８日間培養される、請求項２９～４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項46】
前記ＨＰＣの集団を精製することを含む、請求項２９～４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項47】
（ｄ）前記ＨＰＣの集団を前駆Ｔ細胞へと分化させることをさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項48】
前記ＨＰＣの集団をリンパ系増大培地で培養して前記前駆Ｔ細胞を生産することを含む方法により、前記ＨＰＣを分化させる、請求項４７に記載の方法。
【請求項49】
前記前駆Ｔ細胞はＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型を有する、請求項４７または請求項４８に記載の方法。
【請求項50】
前記前駆Ｔ細胞を成熟させて二重陽性ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生産することをさらに含む、請求項４７～４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項51】
前記前駆Ｔ細胞の集団をＴ細胞成熟培地で培養して前記二重陽性ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を生産することを含む方法により、前記前駆Ｔ細胞を成熟させる、請求項５０に記載の方法。
【請求項52】
前記二重陽性ＣＤ８＋ＣＤ４＋Ｔ細胞を活性化及び増大させて、ＣＤ８＋単陽性表現型またはＣＤ４＋単陽性表現型を有するＴ細胞の集団を生産することを含む、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項53】
前記Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞に特異的に結合する、請求項５０～５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項54】
前記標的抗原は腫瘍抗原である、請求項５３に記載の方法。
【請求項55】
前記Ｔ細胞は、前記腫瘍抗原を発現するがん細胞に特異的に結合する、請求項５４に記載の方法。
【請求項56】
前記ｉＰＳＣは、ドナー個体から取得されたＴ細胞に由来する、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項57】
前記ドナー個体から取得された前記Ｔ細胞は、前記標的抗原に特異的である、請求項５６に記載の方法。
【請求項58】
前記ドナー個体から取得された前記Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項59】
抗原受容体をコードする異種核酸を前記ｉＰＳＣ、前記ＨＥＣ、前記ＨＰＣ、または前記前駆Ｔ細胞に導入することをさらに含む、請求項１～５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項60】
前記抗原受容体をコードする前記異種核酸は、発現ベクターに含まれている、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記発現ベクターは、レンチウイルスベクターまたはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項６０に記載の方法。
【請求項62】
前記異種核酸は、遺伝子編集系を使用して、前記ｉＰＳＣ、前記ＨＥＣ、前記造血性前駆細胞、または前記前駆Ｔ細胞のゲノムに組み込まれる、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記遺伝子編集系はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９またはＡＡＶである、請求項６２に記載の方法。
【請求項64】
前記抗原受容体はＴＣＲである、請求項５９～６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
前記ＴＣＲは、親和性向上型ＴＣＲである、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
前記ＴＣＲは、非ＭＨＣ制限型ＴＣＲである、請求項６４に記載の方法。
【請求項67】
前記ＴＣＲは、細胞によって発現される標的抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合するか、またはＭＨＣ提示とは無関係に細胞によって発現される標的抗原もしくはそのペプチドに特異的に結合する、請求項６４～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
前記ＴＣＲは、前記がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合するか、またはＭＨＣ提示とは無関係にがん細胞によって発現される腫瘍抗原もしくはそのペプチド断片に特異的に結合する、請求項６７に記載の方法。
【請求項69】
前記抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＮＫＣＲである、請求項６４～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
前記ＣＡＲまたは前記ＮＫＣＲは、細胞によって発現される標的抗原に特異的に結合する、請求項６９に記載の方法。
【請求項71】
前記ＣＡＲまたは前記ＮＫＣＲは、がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに特異的に結合する、請求項７０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、例えば免疫療法用のＴ細胞を生成する際に使用するための、造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の生産に関する。
【背景技術】
【0002】
免疫療法薬は、長期生存の見込みがあり、がん処置の様相を変容させようとしている（ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０１４ Ｏｃｔ；４０（９）：１０５６－６４）。患者集団及び腫瘍型の範囲を拡大するための新しい免疫調整薬に対する、明らかな満たされていない医療ニーズが存在する。さらに、抗腫瘍応答の大きさ及び持続時間を向上させるために、新しい薬剤が必要とされている。これらの薬剤の開発は、過去２０年間でＴ細胞免疫を制御する基本原理の理解が深まったことから可能になっている（Ｓｈａｒｍａ ａｎｄ Ａｌｌｉｓｏｎ，Ｃｅｌｌ．２０１５ Ａｐｒ ９；１６１（２）：２０５－１４）。これには通常、ＭＨＣ分子によって提示される腫瘍関連ペプチド抗原を認識する腫瘍特異的ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞が必要である。様々なワクチン接種ストラテジー及びｅｘ ｖｉｖｏで増大した腫瘍浸潤リンパ球の養子移入は、いくつかの事例において、腫瘍特異的Ｔ細胞が末期がんを処置できることを示した（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ｓｅｐ；１０（９）：９０９－１５）。
【0003】
しかし、現在の養子Ｔ細胞療法は、好適な患者及び腫瘍特異的Ｔ細胞の不足によって制限されており、免疫療法で効果的に使用するための治療上十分かつ機能的な抗原特異的Ｔ細胞が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
本発明者らは、高収量で迅速かつ再現性のある分化をもたらす、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を造血性内皮細胞に分化させるプロセスを開発した。これは、例えば、免疫療法で使用するためのＴ細胞などの臨床グレードの血液細胞の生産に有用であり得る。
【0005】
本発明の第１の態様は、造血性内皮細胞（ＨＥＣ）の集団を生産する方法であって、
（ａ）中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を順次培養することにより、ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させること、ならびに、
（ｂ）ＨＥＣへの分化を誘導するために、第１及び第２の造血性内皮（ＨＥ）誘導培地で中胚葉細胞を順次培養することにより、中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させること
を含む方法を提供する。
（ａ）中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地で人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を順次培養することにより、ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させること、ならびに、
（ｂ）ＨＥＣへの分化を誘導するために、第１及び第２の造血性内皮（ＨＥ）誘導培地で中胚葉細胞を順次培養することにより、中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させること
を含む方法を提供する。
【0006】
第１の中胚葉誘導培地は、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激する。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４を含み得る。第２の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する。例えば、第２の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４及びｂＦＧＦを含み得る。第３の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害する。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ４、ｂＦＧＦ、アクチビン、及びＣＨＩＲ－９９０２１を含み得る。
【0007】
第１のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する。例えば、第１のＨＥ誘導培地は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含み得る。第２のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する。例えば、第２のＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含み得る。
【0008】
工程（ａ）及び（ｂ）は、集団中の細胞の精製または単離をせずに行われ得る。
【0009】
第１の態様の方法は、
（ｃ）造血分化を促進するのに好適な条件下でＨＥＣの集団を培養することにより、ＨＥＣをＨＰＣへと分化させること
をさらに含み得る。
（ｃ）造血分化を促進するのに好適な条件下でＨＥＣの集団を培養することにより、ＨＥＣをＨＰＣへと分化させること
をさらに含み得る。
【0010】
上記の工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、定義された培養培地で、フィーダー細胞、間質細胞、血清、または他の未定義の培地サプリメントの非存在下で行われ得る。
【0011】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように生産されるＨＰＣは、Ｔ細胞の生産に使用され得る。
【0012】
第１の態様の方法は、
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＴ細胞前駆細胞へと分化させること、及び
（ｖ）前駆Ｔ細胞を成熟させてＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生産すること
をさらに含み得る。
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＴ細胞前駆細胞へと分化させること、及び
（ｖ）前駆Ｔ細胞を成熟させてＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団を生産すること
をさらに含み得る。
【0013】
第１の態様の方法は、
（ｖｉ）ＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化及び増大させて、ＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団またはＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生産すること
をさらに含み得る。
（ｖｉ）ＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を活性化及び増大させて、ＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞の集団またはＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を生産すること
をさらに含み得る。
【0014】
他の実施形態では、本明細書に記載されるＨＰＣは、ＮＫ細胞の生産に使用され得る。第１の態様の方法は、
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＮＫ細胞へと分化させること
をさらに含み得る。
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＮＫ細胞へと分化させること
をさらに含み得る。
【0015】
他の実施形態では、本明細書に記載されるように生産されるＨＰＣは、Ｂ細胞の生産に使用され得る。第１の態様の方法は、
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＢ細胞へと分化させること
をさらに含み得る。
（ｉｖ）ＨＰＣの集団をＢ細胞へと分化させること
をさらに含み得る。
【0016】
本発明のこれら及び他の態様及び実施形態については、以下でより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【0017】
【図1】ｉＰＳＣからＴ細胞を生成するための６段階法の一例の概略図を示す。
【図2】ｉＰＳＣからＴ細胞を生成するための６段階法の第１段階及び第２段階の概略図を示す。
【図3】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用して、手作業で解体したｉＰＳＣコロニーから分化した、またはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて単一細胞で継代されたＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）の収量を示す。
【図4】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用して、手作業で解体したｉＰＳＣコロニーから分化した、またはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて単一細胞で継代されたＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞（ＨＰＣ）の収量を示す。
【図5】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用して、手作業で解体したｉＰＳＣコロニーから分化した、またはＡｃｃｕｔａｓｅ溶液を用いて単一細胞で継代されたＣＤ７＋細胞（前駆Ｔ細胞）の収量を示す。
【図6】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用し、分化の６日目にＶｅｒｓｅｎｅ（商標）溶液を用いて細胞クラスターとして継代されたｉＰＳＣから分化したＨＥＣにおけるＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ４３及びＣＤ７３の発現を示す。
【図7A】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用した、Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）継代ｉＰＳＣからの分化の１３日目のＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）及びＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞（ＨＰＣ）の収量を示す。
【図7B】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用し、第４段階のＶｅｒｓｅｎｅ（商標）継代ｉＰＳＣを使用して生成されたＣＤ３４＋細胞から取得されたＴ細胞前駆体の増大倍率を示す。
【図8】本発明のプロトコルを使用した培養下の活性なヒト造血性内皮（ＨＥ）の代表的な写真を示す。
【図9】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用した培養下の造血前駆細胞（ＨＳＰＣ）の生成において観察された代表的な差異を示す。ＨＥから出現する丸い浮遊細胞（ＨＳＰＣ）の数は、代替プロトコルで増加した。
【図10】４つの独立した実験において代替プロトコルを使用した場合の、対照プロトコルと比較した、ＣＤ３４＋前駆細胞の磁気単離後の生存率の向上を示す（＊＊ｐ＝０．００２１、二元配置ＡＮＯＶＡ）。
【図11】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用したＣＤ３４＋磁気単離の前及び後のＣＤ３４＋／ＣＤ４５＋細胞の代表的な表現型を示す。
【図12】本発明のプロトコル（「代替」）を使用した３つの独立した実験に基づく、対照プロトコルと比較した、面積当たりの標的細胞の収量及び総収量における有意な増加を示す（二元配置ＡＮＯＶＡ、ＧｒａｐｈＰａｄソフトウェア、ｐ値は図に示されている）。
【図13】本発明のプロトコル（「代替」（薄い陰影））と対照プロトコル（濃い陰影）を使用して単離されたＣＤ３４＋細胞の統合ＦＡＣＳヒストグラムを示す。代替プロトコルは、より高いレベルのＣＤ７３を有する高ＣＤ３４＋細胞を生成する対照プロトコルと比較すると、ＣＤ７３内皮マーカーの発現がなく、主に低ＣＤ３４＋細胞を生成した。
【図14】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルで生成されたＣＤ３４＋細胞の３週間及び５週間の培養後のＴ前駆細胞の代表的な表現型の比較を示す。同様の表現型が観察された。両方のプロトコルが、経時的にＴＣＲのレベルが上昇したＴ細胞を生成することができた。
【図15】本発明のプロトコル（「代替」）または対照プロトコルを使用した２１日目のリンパ系細胞の収量及び増大倍率を示す。代替プロトコルで生成されたＣＤ３４＋細胞からのリンパ系細胞の成長の増加が観察された。各ドットは、培養下の異なるＴＣＲ＋編集細胞株を表す。
【発明を実施するための形態】
【0018】
本発明は、２Ｄ組織培養容器内の支持基質上で培養される人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から造血性内皮細胞（ＨＥＣ）を生産するための効率的かつ再現性のあるプロセスに関する。
【0019】
本明細書に記載される方法は、以前の方法に比して増加したＨＥＣの収量及び純度を提供する。本明細書に記載される方法によって生産されたＨＥＣは、他の方法によって生産されたＨＥＣに比して収量が増加したＨＰＣへと分化し得る。本明細書に記載される方法によって生産されたＨＥＣは、ＣＤ７３発現が低いか、または陰性であり得る。ＣＤ７３発現は、造血能を持たない内皮系列の特徴であり、ＣＤ７３発現が低いまたは陰性であることは、リンパ系細胞を含むあらゆる種類の血液細胞を生成する能力を持つＨＥＣを示し得る。ＣＤ７発現は、本明細書に記載される方法によって生成されたＨＥＣの子孫であるＨＰＣにおいて増加し得る。ＣＤ７発現は、ＨＰＣが胸腺細胞系列（すなわち、初期段階の胸腺細胞）に傾倒しており、さらにＴ細胞に分化できることを示す。
【0020】
好ましくは、本明細書に記載される方法は、細胞選別またはゲーティングなどの精製工程を用いない。これにより、単一の培養容器でのＨＥＣの生産が可能になる。
【0021】
好ましくは、ｉＰＳＣを、定義された培養培地で、フィーダー細胞、ＯＰ９－Ｄｌ４間質細胞などの間質細胞、血清、または他の未定義の培地サプリメントの非存在下で、ＨＥＣへと分化させる。これにより、臨床グレードの細胞産物の生産が可能になり、本明細書に記載されるように生産されるＨＥＣは、例えば、免疫療法で使用するためのＴ細胞の生産に有用であり得る。
【0022】
人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、非多能性の完全に分化したドナーまたは前駆体細胞に由来する多能性細胞である。ｉＰＳＣは、ｉｎ ｖｉｔｒｏで自己複製可能であり、未分化表現型を呈し、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）のいずれかの胎児または成体細胞型へと分化できる可能性がある。ｉＰＳＣの集団はクローン性、すなわち、単一の共通祖先細胞の子孫である遺伝的に同一の細胞であり得る。
【0023】
ｉＰＳＣは、次の多能性関連マーカー：ＰＯＵ５ｆ１（Ｏｃｔ４）、Ｓｏｘ２、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ－４、Ｔｒａ－１－６０、ＫＬＦ４及びｃ－ｍｙｃのうちの１つ以上、好ましくはＰＯＵ５ｆ１、ＮＡＮＯＧ及びＳＯＸ２のうちの１つ以上を発現し得る。ｉＰＳＣは、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｓｏｘ１７、ＦｏｘＡ２、αＦＰ、Ｓｏｘ１、ＮＣＡＭ、ＧＡＴＡ６、ＧＡＴＡ４、Ｈａｎｄ１及びＣＤＸ２など、特定の分化運命に関連するマーカーを欠いている場合がある。特に、ｉＰＳＣは、内胚葉運命に関連するマーカーを欠いている場合がある。
【0024】
好ましくは、ｉＰＳＣはヒトＩＰＳＣ（ｈｉＰＳＣ）である。
【0025】
いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ＨＬＡ遺伝子または免疫原性もしくはＧＶＨＤに関連する他の遺伝子を不活性化または欠失させるために遺伝子編集されてもよく、例えばＴＣＲ、ＣＡＲまたはＮＫＣＲなどの外因性抗原受容体をコードする核酸を含むように遺伝子編集されてもよい。
【0026】
ＩＰＳＣは、ドナー個体などの供給源から取得された体細胞または他の前駆体細胞であり得るドナー細胞に由来するか、またはドナー細胞からリプログラミングされ得る。ドナー細胞は、哺乳動物の、好ましくはヒトの細胞であり得る。好適なドナー細胞としては、成体線維芽細胞及び血液細胞、例えば、ＨＰＣ、単核細胞、ＣＤ３４＋臍帯血細胞、またはＴ細胞などの末梢血細胞が挙げられる。
【0027】
本明細書に記載されるようにｉＰＳＣへとリプログラミングするために好適なドナー細胞は、ドナー個体から取得され得る。いくつかの実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載されるような生産の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体と同じ人物であり得る（自己由来処置）。他の実施形態では、ドナー個体は、本明細書に記載されるような生産の後にＴ細胞が投与されるレシピエント個体とは異なる人物であり得る（同種異系処置）。例えば、ドナー個体は、がんを患うレシピエント個体とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）が適合する（ドネーションの前か後かを問わない）健康な個体であり得る。他の実施形態では、ドナー個体は、レシピエント個体とＨＬＡが適合しなくてもよい。好ましくは、ドナー個体は新生児（新生子）であり得、例えば、ドナー細胞は、臍帯血のサンプルから取得され得る。
【0028】
好適なドナー個体は、好ましくは、伝染性ウイルス（例えばＨＩＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ）及び外来性作用因子（例えば細菌、マイコプラズマ）を有せず、既知の遺伝子異常を有しない。
【0029】
いくつかの実施形態では、リプログラミングのためのＨＰＣなどの末梢血細胞の集団は、ドナー個体から取得された血液サンプル、好ましくは臍帯サンプルから単離され得る。ＨＰＣ及び他の末梢血細胞の単離のための好適な方法は、当技術分野で周知であり、例えば、磁気活性化細胞選別（例えば、Ｇａｕｄｅｒｎａｃｋ ｅｔ ａｌ １９８６ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ９０ １７９を参照のこと）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ：例えば、Ｒｈｅｉｎｈｅｒｚ ｅｔ ａｌ（１９７９）ＰＮＡＳ ７６ ４０６１を参照のこと）、及び細胞パニング（例えば、Ｌｕｍ ｅｔ ａｌ（１９８２）Ｃｅｌｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ ７２ １２２を参照のこと）を含む。ＨＰＣは、血液細胞のサンプル中で、ＣＤ３４の発現によって同定され得る。他の実施形態では、リプログラミングのための線維芽細胞の集団は、コラゲナーゼまたはトリプシンを使用した分散及び適切な細胞培養条件での増殖後の皮膚生検から単離され得る。
【0030】
いくつかの実施形態では、ＩＰＳＣは、抗原特異的Ｔ細胞に由来し得る。例えば、Ｔ細胞は、クラス１のＭＨＣと複合体を形成して提示される、腫瘍抗原などの抗原に結合するαβＴＣＲをコードする核酸を含み得る。ｉＰＳＣの生成に使用される抗原特異的Ｔ細胞は、樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチドエピトープを有する多様なＴ細胞集団をスクリーニングすることによって、またはがん患者の腫瘍サンプルから単離することによって取得され得る。
【0031】
ドナー細胞は、典型的には、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２及びＫｌｆ４などのリプログラミング因子を細胞に導入することによってｉＰＳＣにリプログラミングされる。リプログラミング因子は、タンパク質でもコード核酸でもよく、プラスミド、トランスポゾン、またはより好ましくはウイルストランスフェクションもしくは直接タンパク質送達を含む任意の好適な技法によって、分化細胞に導入され得る。他のリプログラミング因子、例えば、Ｋｌｆ－１、Ｋｌｆ－２、Ｋｌｆ－４及びＫｌｆ－５などのＫｌｆ遺伝子；Ｃ－ｍｙｃ、Ｌ－ｍｙｃ及びＮ－ｍｙｃなどのＭｙｃ遺伝子；Ｎａｎｏｇ；ＳＶ４０ラージＴ抗原；Ｌｉｎ２８；ならびにｐ５３などの遺伝子を標的とする低分子ヘアピン（ｓｈＲＮＡ）も、誘導効率を高めるために細胞に導入され得る。リプログラミング因子の導入後、ドナー細胞が培養され得る。多能性マーカーを発現する細胞は、ｉＰＳＣの集団を生産するために単離及び／または精製され得る。ｉＰＳＣの生産のための技法は当技術分野で周知である（Ｙａｍａｎａｋａ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ ２００７；４４８：３１３－７、Ｙａｍａｎａｋａ ６ ２００７ Ｊｕｎ ７；１（１）：３９－４９、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊｕｌ ３１；４５４（７２０４）：６４６－５０、Ｔａｋａｈａｓｈｉ Ｃｅｌｌ．２００７ Ｎｏｖ ３０；１３１（５）：８６１－７２． Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ Ｎａｔｕｒｅ．２００８ Ｊａｎ １０；４５１（７１７５）：１４１－６、Ｋｉｍｅｔ ｅｔ ａｌ Ｃｅｌｌ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ．２００９ Ｊｕｎ ５；４（６）：４７２－６、Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ，２００９．９９９９（９９９Ａ）：ｐ． Ｎ／Ａ、Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ ２０１６；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｖ． ２０１６ Ａｕｇ；１２（４）：３９４－４２０、Ｂａｇｈｂａｄｅｒａｎｉ ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｏｒｔｓ，５（４），６４７－６５９）。
【0032】
ｉＰＳＣの培養及び維持のためには、従来の技法を用いることができる（Ｖａｌｌｉｅｒ，Ｌ．ｅｔ ａｌ Ｄｅｖ． Ｂｉｏｌ．２７５，４０３－４２１（２００４）、Ｃｏｗａｎ，Ｃ．Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ．３５０，１３５３－１３５６（２００４）、Ｊｏａｎｎｉｄｅｓ，Ａ．ｅｔ ａｌ．Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４，２３０－２３５（２００６）Ｋｌｉｍａｎｓｋａｙａ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ ３６５，１６３６－１６４１（２００５）、Ｌｕｄｗｉｇ，Ｔ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４，１８５－１８７（２００６））。本件の方法で使用するＩＰＳＣは、規定の条件下またはフィーダー細胞上で成長させることができる。例えば、ｉＰＳＣは、培養ディッシュにおいて、適切な密度（例えば１０５～１０６細胞／６０ｍｍディッシュ）で、照射されたマウス胎児線維芽細胞（ＭＥＦ）などのフィーダー細胞層上で、または適切な基質において、フィーダー馴化済みもしくは定義されたｉＰＳＣ維持培地で、従来どおりに培養され得る。本件の方法で使用するｉＰＳＣは、解体されたコロニーとして手作業で、酵素溶液を用いて単一細胞として、またはキレート剤を用いて細胞クラスターとして継代され得る。いくつかの実施形態では、ｉＰＳＣは、ｍＴｅＳＲ（商標）１もしくはｍＴｅＳＲ（商標）ｐｌｕｓ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）またはＥ８ ｆｌｅｘ（Ｌｉｆｅ Ｔｈｅｒｍｏ）培養培地などのｉＰＳＣ維持培地において、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）またはビトロネクチンなどのＥＣＭタンパク質上で継代され得る。
【0033】
中胚葉段階を含む上述の２工程プロセスを使用してｉＰＳＣをＨＥＣへと分化させる。例えば、ある方法は、
（ａ）ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させること、及び
（ｂ）中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させること
を含み得る。
（ａ）ｉＰＳＣの集団を中胚葉細胞へと分化させること、及び
（ｂ）中胚葉細胞をＨＥＣへと分化させること
を含み得る。
【0034】
好ましくは、ＨＥＣをさらにＨＰＣへと分化させる。例えば、ある方法は、
（ｃ）ＨＥＣをＨＰＣの集団へと分化させること
をさらに含み得る。
（ｃ）ＨＥＣをＨＰＣの集団へと分化させること
をさらに含み得る。
【0035】
工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）はすべて、Ｔ細胞能のあるＨＰＣを生産するために細胞の集団から細胞または部分集団を精製することなく行われ得る。工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）は、血清及びＯＰ９－Ｄｌ４間質細胞などの間質細胞を使用せずに行われ得る。例えば、本明細書に記載される分化工程（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）を行うために、細胞の集団を同じ培養容器に留めてもよく、培養培地の交換のみに供してもよい。
【0036】
本明細書に記載される方法の工程における細胞集団の分化及び成熟は、分化因子のセットを補充した培養培地で細胞を培養することによって誘導される。各培養培地について挙げられる分化因子のセットは、好ましくは網羅的であり、培地は他の分化因子を欠いていてもよい。好ましい実施形態では、培養培地は既知組成培地である。例えば、培養培地は、後述するように、有効量の１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。既知組成栄養培地は、１つ以上の無血清培養培地サプリメントを補充した基本培地を含み得る。
【0037】
分化因子は、哺乳動物細胞の分化を媒介するシグナル伝達経路を調整、例えば促進または阻害する因子である。分化因子は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、ＷｎｔまたはＢＭＰシグナル伝達経路のうちの１つ以上を調整する成長因子、サイトカイン、及び小分子を含み得る。分化因子の例としては、アクチビン／Ｎｏｄａｌ、ＦＧＦ、ＢＭＰ、レチノイン酸、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＧＦβリガンド、ＧＤＦ、ＬＩＦ、インターロイキン、ＧＳＫ－３阻害剤、及びホスファチジルイノシトール３－キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤が挙げられる。
【0038】
本明細書に記載される培地のうちの１つ以上で使用される分化因子には、ＴＧＦβリガンド、例えばアクチビン、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＧＳＫ－３阻害剤（例えばＣＨＩＲ－９９０２１）、インターロイキン、ならびにＩＧＦ－１及びアンギオテンシンＩＩなどのホルモンが含まれる。分化因子は、培地で培養される細胞におけるシグナル伝達経路を調整するのに有効な量で、本明細書に記載される培地に存在し得る。
【0039】
いくつかの実施形態では、培養培地中の、上記または下記に挙げる分化因子を、同じシグナル伝達経路に対して同じ効果（すなわち刺激または阻害）を及ぼす因子によって置き換えてもよい。好適な因子は、当技術分野で公知であり、タンパク質、核酸、抗体、及び小分子を含む。
【0040】
各工程中の細胞集団の分化の程度は、分化中の細胞の集団における１つ以上の細胞マーカーの発現をモニター及び／または検出することによって決定され得る。例えば、分化度の高い細胞型に特徴的なマーカーの発現の増加、または分化度の低い細胞型に特徴的なマーカーの発現の減少が決定され得る。細胞マーカーの発現は、免疫細胞化学、免疫蛍光、ＲＴ－ＰＣＲ、イムノブロッティング、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、及び酵素分析を含む任意の好適な技法によって決定され得る。好ましい実施形態では、マーカーが細胞表面上で検出可能であれば、細胞はマーカーを発現すると言える。例えば、本明細書においてマーカーを発現しないと記載される細胞は、マーカー遺伝子の活発な転写及び細胞内発現を示す可能性があるが、細胞の表面に検出可能なレベルのマーカーは存在しない可能性がある。
【0041】
本明細書に記載される方法の一工程によって生産される、部分的に分化した細胞、例えば機能的なＴ細胞以外の細胞、例えば中胚葉細胞、ＨＥＣ（すなわちＨＥ細胞）、ＨＰＣ、Ｔ細胞前駆体またはＤＰ Ｔ細胞の集団は、次の分化工程の前に培養する、維持する、または増大させることができる。部分的に分化した細胞は、任意の簡便な技法によって増大させることができる。
【0042】
細胞は、フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質でコーティングされた表面または基質上で、フィーダー細胞の非存在下で単層において培養することができる。細胞培養に好適な技法は当技術分野で周知である（例えば、Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｃ．Ｈｅｌｇａｓｏｎ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．Ｕ．Ｓ．（１５ Ｏｃｔ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９５４５１、Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｓ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｕ．Ｓ．（９ Ｄｅｃ ２００４）ＩＳＢＮ：１５８８２９２２２３、Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｂａｓｉｃ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ Ｉｎｃ（２ Ａｕｇ ２００５）ＩＳＢＮ：０４７１４５３２９３、Ｈｏ ＷＹ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ．（２００６）３１０：４０－５２、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ（ｅｄ．Ｒ．Ｌａｎｚａ）ＩＳＢＮ：０１２４３６６４３０）Ｂａｓｉｃ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｊ．Ｐｏｌｌａｒｄ ａｎｄ Ｊ．Ｍ．Ｗａｌｋｅｒ（１９９７）、‘Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ’ｂｙ Ａ．Ｄｏｙｌｅ ａｎｄ Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）、‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ’ｂｙ Ａ．Ｃｈｉｕ ａｎｄ Ｍ．Ｒａｏ（２００３）、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｂｅｄｓｉｄｅ’ｂｙ Ａ．Ｂｏｎｇｓｏ（２００５）、Ｐｅｔｅｒｓｏｎ＆Ｌｏｒｉｎｇ（２０１２）Ｈｕｍａｎ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｕａｌ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｇｕｉｄｅ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、及び‘Ｈｕｍａｎ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ’ｂｙ Ｋ．Ｔｕｒｋｓｅｎ（２００６）を参照のこと）。培地及びその成分は、商業的供給源（例えばＧｉｂｃｏ、Ｒｏｃｈｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｅｕｒｏｐａ ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から取得され得る。上記の培養工程では、標準的な哺乳動物細胞培養条件、例えば３７℃、５％または２１％の酸素、５％の二酸化炭素を用いることができる。培地は２日おきに交換し、細胞を重力によって沈降させることが好ましい。
【0043】
細胞は培養容器内で培養され得る。好適な細胞培養容器は、当技術分野で周知であり、培養プレート、ディッシュ、フラスコ、バイオリアクター、及びマルチウェルプレート、例えば６ウェル、１２ウェルまたは９６ウェルプレートを含む。
【0044】
培養容器は、例えば、フィブロネクチン、ラミニンまたはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質で容器の１つ以上の表面をコーティングすることによって、組織培養のために処理されることが好ましい。培養容器は、標準的技法を使用して、例えば本明細書に記載されるコーティング溶液と共にインキュベートすることによって組織培養のために処理してもよく、または商業的供給者から前処理されたものを取得してもよい。
【0045】
第１段階では、中胚葉分化を促進する好適な条件下でｉＰＳＣの集団を培養することにより、ｉＰＳＣが中胚葉細胞へと分化し得る。例えば、中胚葉細胞への分化を誘導するために、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地でｉＰＳＣ細胞を順次培養してもよい。
【0046】
好適な第１の中胚葉誘導培地は、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰを含み得る。
【0047】
好適な第２の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し得る。例えば、第２の中胚葉誘導培地は、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４及びＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦを含み得る。
【0048】
好適な第３の中胚葉誘導培地は、（ｉ）ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し、かつ（ｉｉｉ）グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βを阻害し得る。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、アクチビン、好ましくはアクチビンＡ、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。
【0049】
第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は、上記の分化因子以外の分化因子を欠いていてもよい。
【0050】
ＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３、及び／またはＳＭＡＤ２及びＳＭＡＤ３媒介細胞内シグナル伝達経路は、第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第１のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。第１のＴＧＦβリガンドはアクチビンであり得る。アクチビン（アクチビンＡ：ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６２４核酸参照配列ＮＭ＿００２１９２．２ ＧＩ：６２９５３１３７、アミノ酸参照配列ＮＰ＿００２１８３．１ ＧＩ：４５０４６９９）は、アクチビン／Ｎｏｄａｌ経路の刺激を介して様々な細胞効果を及ぼす二量体ポリペプチドである（Ｖａｌｌｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ １１８：４４９５－４５０９（２００５））。アクチビンは、商業的供給源（例えばＳｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される培地中のアクチビンの濃度は、０．１～１０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0051】
第２及び第３の中胚葉誘導培地の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性は、培地中の線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）の存在によって提供され得る。線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）は、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）に結合することによって細胞の成長、増殖、及び細胞分化を刺激するタンパク質因子である。好適な線維芽細胞成長因子は、ＦＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＦＧＦ１～ＦＧＦ１４及びＦＧＦ１５～ＦＧＦ２３のいずれか１つを含む。好ましくは、ＦＧＦは、ＦＧＦ２（別称ｂＦＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、ＦＧＦ７（別称ケラチノサイト成長因子（またはＫＧＦ）、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）、またはＦＧＦ１０（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２２４７、核酸配列ＮＭ＿００２００６．３ ＧＩ：４１３５２６９４、アミノ酸配列ＮＰ＿００１９９７．４ ＧＩ：４１３５２６９５）である。最も好ましくは、線維芽細胞成長因子はＦＧＦ２である。
【0052】
好都合なことに、本明細書に記載される培地中のＦＧＦ２などのＦＧＦの濃度は、０．５～５０ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬであり得る。ＦＧＦ２、ＦＧＦ７及びＦＧＦ１０などの線維芽細胞成長因子は、慣例的な組換え技法を使用して生産するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。
【0053】
ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９、及び／またはＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５及びＳＭＡＤ９媒介細胞内シグナル伝達経路は、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地によって、培地中の第２のＴＧＦβリガンドの存在を通じて刺激され得る。
【0054】
第２のＴＧＦβリガンドは、骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）であり得る。骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）は、骨形態形成タンパク質受容体（ＢＭＰＲ）に結合し、ＳＭＡＤ１、ＳＭＡＤ５、及びＳＭＡＤ９によって媒介される経路を通じて細胞内シグナル伝達を刺激する。好適な骨形態形成タンパク質は、ＢＭＰファミリーのいずれかのメンバー、例えばＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６またはＢＭＰ７を含む。好ましくは、第２のＴＧＦβリガンドは、ＢＭＰ２（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５０、核酸配列ＮＭ＿００１２００．２ ＧＩ：８０８６１４８４；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１．１ ＧＩ：４５５７３６９）またはＢＭＰ４（ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６５２、核酸配列ＮＭ＿００１２０２．３ ＧＩ：１５７２７６５９２；アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９３．２ ＧＩ：１５７２７６５９３）である。好適なＢＭＰはＢＭＰ４を含む。好都合なことに、本明細書に記載される培地中のＢＭＰ２またはＢＭＰ４などの骨形態形成タンパク質の濃度は、１～５００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬであり得る。ＢＭＰは、慣例的な組換え技法を使用して生産するか、または商業的供給者（例えばＲ＆Ｄ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＵＳＡ、Ｓｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から取得することができる。
【0055】
第３の中胚葉誘導培地中のＧＳＫ３β阻害活性は、培地中のＧＳＫ３β阻害剤の存在によって提供され得る。ＧＳＫ３β阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（遺伝子ＩＤ ２９３２：ＥＣ２．７．１１．２６）の活性を阻害する。好ましい阻害剤は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３βの活性を特異的に阻害する。好適な阻害剤としては、ＣＨＩＲ９９０２１（６－（（２－（（４－（２，４－ジクロロフェニル）－５－（４－メチル－１Ｈ－イミダゾール－２－イル）ピリミジン－２－イル）アミノ）エチル）アミノ）ニコチノニトリル；Ｒｉｎｇ Ｄ．Ｂ．ｅｔ ａｌ．，Ｄｉａｂｅｔｅｓ，５２：５８８－５９５（２００３））アルステルパウロン、ケンパウロン、ＢＩＯ（６－ブロモインジルビン－３’－オキシム（Ｓａｔｏ ｅｔ ａｌ Ｎａｔ Ｍｅｄ．２００４ Ｊａｎ；１０（１）：５５－６３）、ＳＢ２１６７６３（３－（２，４－ジクロロフェニル）－４－（１－メチル－１Ｈ－インドール－３－イル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン）、リチウム及びＳＢ４１５２８６（３－［（３－クロロ－４－ヒドロキシフェニル）アミノ］－４－（２－ニトロフェニル）－１Ｈ－ピロール－２，５－ジオン；Ｃｏｇｈｌａｎ ｅｔ ａｌ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ．２０００ Ｏｃｔ；７（１０）：７９３－８０３）が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＧＳＫ３β阻害剤はＣＨＩＲ９９０２１である。好適なグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤は、商業的供給者（例えばＳｔｅｍｇｅｎｔ Ｉｎｃ．ＭＡ ＵＳＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＭＩ ＵＳＡ、Ｓｅｌｌｅｃｋｃｈｅｍ，ＭＡ ＵＳＡ）から取得することができる。例えば、第３の中胚葉誘導培地は、０．１～１００μＭ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または９５μＭのいずれか、好ましくは１～１０μＭ、例えば約３μＭまたは約１０μＭのＧＳＫ３β阻害剤、例えばＣＨＩＲ９９０２１を含み得る。
【0056】
好ましい実施形態では、第１、第２、及び第３の中胚葉誘導培地は既知組成培地である。例えば、第１の中胚葉誘導培地は、有効量のＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４を補充した既知組成栄養培地からなることができ、第２の中胚葉誘導培地は、有効量の、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦとを補充した既知組成栄養培地からなることができ、第３の中胚葉誘導培地は、有効量のアクチビン、好ましくはアクチビンＡ、例えば１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡと、ＢＭＰ、好ましくはＢＭＰ４、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、好ましくはｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）、例えば５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、ＧＳＫ３阻害剤、好ましくはＣＨＩＲ－９９０２１、例えば３μＭのＣＨＩＲ－９９０２１とを補った既知組成栄養培地からなることができる。
【0057】
既知組成培地（ＣＤＭ）は、特定の成分、好ましくは既知の化学構造をもつ成分のみを含む、細胞を培養するための栄養溶液である。ＣＤＭは、フィーダー細胞、間質細胞、血清、及びｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）のような複雑な細胞外マトリックスなどの未定義の成分を含めた未定義の成分または構成成分を欠いている。例えば、ＣＤＭは、ＤＬＬ１またはＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを発現するＯＰ９細胞などの間質細胞を含まない。
【0058】
ＣＤＭまたは既知組成栄養培地は、既知組成基本培地を含み得る。好適な既知組成基本培地としては、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、ハムＦ１２、改良されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｐｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ Ｆｏｃｕｓ（２００３），２５ ３－６）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ Ｅ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ ａｌ Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８９，１３９－１４２（１９７４））、ＲＰＭＩ－１６４０（Ｍｏｏｒｅ，Ｇ．Ｅ．ａｎｄ Ｗｏｏｄｓ Ｌ．Ｋ．，（１９７６）Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ．３，５０３－５０８）、及びＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が挙げられる。
【0059】
基本培地は、培地中に無血清培養培地サプリメント及び／または追加の成分を補充してもよい。好適なサプリメント及び追加の成分は上述されており、Ｌ－グルタミンまたはＧｌｕｔａＭＡＸ－１（商標）などの代替物、アスコルビン酸、モノチオールグリセロール（ＭＴＧ）、ヒト血清アルブミン、例えばＣｅｌｌａｓｔｉｍ（商標）（Ｍｅｒｃｋ／Ｓｉｇｍａ）及びＲｅｃｏｍｂｕｍｉｎ（商標）（ａｌｂｕｍｅｄｉｘ．ｃｏｍ）などの組換えヒト血清アルブミン、インスリン、トランスフェリン、ならびに２－メルカプトエタノールを含み得る。基本培地には、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｅｒｕｍ Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ（ＫＯＳＲ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などの血清代替物を補充してもよい。
【0060】
ｉＰＳＣは、中胚葉細胞の集団を生産するために、第１の中胚葉誘導培地で１～３６時間、例えば６、７、８、９、１０、１１．１２．１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間のいずれか、好ましくは約２４時間培養され、次いで第２の中胚葉誘導培地で１～３６時間、例えば６、７、８、９、１０、１１．１２．１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３または２４時間のいずれか、好ましくは約２４時間培養され、次いで第３の中胚葉誘導培地で３６～６０時間、例えば３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２または５３時間のいずれか、好ましくは約４８時間培養され得る。
【0061】
中胚葉細胞は、中胚葉系列に傾倒している部分的に分化した前駆細胞であり、適切な条件下で間葉（線維芽細胞）、筋肉、骨、脂肪、血管、及び造血系のすべての細胞型へと分化できる。中胚葉細胞は、１つ以上の中胚葉マーカーを発現し得る。例えば、中胚葉細胞は、Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ、Ｇｏｏｓｅｃｏｉｄ、Ｍｉｘｌ１、ＫＤＲ、ＦｏｘＡ２、ＧＡＴＡ６及びＰＤＧＦαＲのうちのいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つすべてを発現し得る。
【0062】
第２段階では、ＨＥ分化を促進する好適な条件下で中胚葉細胞の集団を培養することにより、中胚葉細胞が造血性内皮（ＨＥ）細胞へと分化し得る。例えば、ｉＰＳＣ由来の中胚葉細胞は、第１のＨＥ誘導培地で培養され、次いで第２のＨＥ誘導培地で培養され得る。
【0063】
好適な第１のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し得る。例えば、第１のＨＥ誘導培地は、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含み得る。好適な第２のＨＥ誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有し得る。例えば、第２のＨＥ誘導培地は、ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びｂＦＧＦを含み得る。
【0064】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ受容体に結合し、脈管形成及び血管新生を刺激するＰＤＧＦファミリーのタンパク質因子である。好適なＶＥＧＦは、ＶＥＧＦファミリーのいずれかのメンバー、例えばＶＥＧＦ－Ａ～ＶＥＧＦ－Ｄ及びＰＩＧＦのうちのいずれか１つを含む。好ましくは、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ－Ａ（別称ＶＥＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７４２２、核酸配列ＮＭ＿００１０２５３６６．２、アミノ酸配列ＮＰ＿００１０２０５３７．２）である。好ましくは、ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路は、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ／Ｆｌｋ－１）媒介シグナル伝達経路である。ＶＥＧＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される第１または第２のＨＥ誘導培地中のＶＥＧＦの濃度は、１～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約５、７、１０、１２、１５、１７、２０、２５、３０、３５、４０、４５または５０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約１５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0065】
第１または第２のＨＥ誘導培地のいくつかの例では、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激するＶＥＧＦアクチベーターまたはアゴニストによって置き換えられ得る。好適なＶＥＧＦアクチベーターは、当技術分野で公知であり、グレムリンなどのタンパク質（Ｍｉｔｏｌａ ｅｔ ａｌ（２０１０）Ｂｌｏｏｄ １１６（１８）３６７７－３６８０）、ｓｈＲＮＡなどの核酸（例えば、Ｔｕｒｕｎｅｎ ｅｔ ａｌ Ｃｉｒｃ Ｒｅｓ．２００９ Ｓｅｐ １１；１０５（６）：６０４－９）、ＣＲＩＳＰＲベースのプラスミド（例えば、ＶＥＧＦ ＣＲＩＳＰＲ活性化プラスミド；Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＵＳＡ）、抗体及び小分子を含む。
【0066】
幹細胞因子（ＳＣＦ）は、ＫＩＴ受容体（ＫＩＴ癌原遺伝子、受容体チロシンキナーゼ）（ＣＤ１１７；ＳＣＦＲ）に結合するサイトカインであり、造血に関与する。ＳＣＦ（別名ＫＩＴＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：４２５４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８９９．５またはＮＭ＿０３９９４．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８９０．１またはＮＰ＿００３９８５．５を有し得る。ＳＣＦは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載されるＨＥ誘導培地中のＳＣＦの濃度は、１～１０００ｎｇ／ｍＬ、例えば約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約１００ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0067】
好ましい実施形態では、第１及び第２のＨＥ誘導培地は既知組成培地である。例えば、第１のＨＥ誘導培地は、有効量のＶＥＧＦ、例えば１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと、ＦＧＦ、例えば５ｎｇ／ｍＬのＦＧＦとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。第２のＨＥ誘導培地は、有効量のＶＥＧＦ、例えば１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと、ＦＧＦ、例えば５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、ＳＣＦ、例えば１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。好ましくは、中胚葉細胞は、既知組成栄養培地及び２つの分化因子からなる第１のＨＥ誘導培地（ここで、２つの分化因子はｂＦＧＦ及びＶＥＧＦである）、及び既知組成栄養培地及び３つの分化因子からなる第２のＨＥ誘導培地（ここで、３つの分化因子はｂＦＧＦ、ＳＣＦ及びＶＥＧＦである）で培養される。
【0068】
好適な既知組成栄養培地は上述されており、グルタミン、アスコルビン酸及びモノチオグリセロールを場合により補充したＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または後述のようにアルブミン、インスリン、セレントランスフェリン、及び脂質を補充したＩＭＤＭなどの基本培地を含む。
【0069】
中胚葉細胞は、ＨＥＣの集団を生産するために、ＨＥ誘導培地で２～６日間、例えば２、３、４、５または６日間のいずれか、好ましくは約４日間培養され得る。
【0070】
造血性内皮細胞（ＨＥＣ）は、適切な条件下で造血系列へと分化する能力を有する、一過性の特殊化された種類の内皮細胞である。ＨＥＣは、ＣＤ３４を発現する場合があり、いくつかの実施形態では、ＣＤ７３またはＣＸＣＲ４（ＣＤ１８４）を発現しない場合がある。例えば、いくつかの実施形態では、ＨＥＣは、表現型ＣＤ３４＋ＣＤ７３－、またはＣＤ３４＋ＣＤ７３－ＣＸＣＲ４－を有し得る。
【0071】
第３段階では、造血分化を促進する好適な条件下でＨＥＣの集団を培養することにより、造血性内皮細胞（ＨＥＣ）が造血前駆細胞（ＨＰＣ）へと分化し得る。例えば、ＨＥＣは、造血誘導培地で培養され得る。
【0072】
好適な造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）もしくはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路、及び／または（ｉｉ）ＶＥＧＦＲもしくはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路、好ましくはＶＥＧＦＲ２もしくはＶＥＧＦＲ２媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ－Ａ及び／またはＳＣＦを含み得る。
【0073】
好ましくは、造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路、及び（ｉｉ）ＶＥＧＦＲまたはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路、好ましくはＶＥＧＦＲ２またはＶＥＧＦＲ２媒介シグナル伝達経路の両方を刺激する。例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ－Ａ及びＳＣＦを含み得る。
【0074】
いくつかの実施形態では、好適な造血誘導培地は、（ａ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｂ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｃ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｄ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｅ）ＩＧＦ１Ｒ及び／またはＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｆ）インターロイキン（ＩＬ）活性を示し得る。例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、及びＩＬ－６（表３参照）を含んでもよく、または造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及びＩＬ－７（表４参照）を含んでもよい。
【0075】
他の実施形態では、好適な造血誘導培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路、（ｉｉ）ＶＥＧＦＲ及び／またはＶＥＧＦＲ媒介シグナル伝達経路、好ましくはＶＥＧＦＲ２及び／またはＶＥＧＦＲ２媒介シグナル伝達経路、（ｉｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路、（ｉｖ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路、（ｖ）ＩＧＦ１Ｒ及び／またはＩＧＦ１Ｒ媒介シグナル伝達経路、（ｖｉ）ＳＭＡＤ１、５及び９及び／またはＳＭＡＤ１、５及び９媒介シグナル伝達経路、（ｖｉｉ）ヘッジホッグ及び／またはヘッジホッグシグナル伝達経路、（ｖｉｉｉ）ＥｐｏＲ及び／またはＥｐｏＲ媒介シグナル伝達経路、ならびに（ｉｘ）ＡＧＴＲ２及び／またはＡＧＴＲ２媒介シグナル伝達経路を刺激し得る。好適な造血誘導培地はまた、ＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１））及び／またはＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１））媒介シグナル伝達経路を阻害し得る。好適な造血誘導培地は、インターロイキン（ＩＬ）活性及びＦＧＦ活性も有し得る。
【0076】
例えば、造血誘導培地は、分化因子：ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストを含み得る。好適な造血誘導培地の一例は、以下の表１に示す第３段階培地である。
【0077】
トロンボポエチン（ＴＰＯ）は、血小板の生産を調節する糖タンパク質ホルモンである。ＴＰＯ（別名ＴＨＰＯ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：７０６６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００４６０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００４５１．１を有し得る。ＴＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＴＰＯの濃度は、３～３００ｎｇ／ｍＬ、好ましくは約３０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0078】
Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンドまたはＦＬＴ３Ｌ）は、ＦＬＴ３受容体に結合する造血活性を有するサイトカインであり、前駆細胞の増殖及び分化を刺激する。Ｆｌｔ３リガンド（別名ＦＬＴ３ＬＧ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２３２３）は、参照核酸配列ＮＭ＿００１２０４５０２．２及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００１１９１４３１．１を有し得る。Ｆｌｔ３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＦｌｔ３リガンドの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０または２４０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0079】
インターロイキン（ＩＬ）は、免疫の発達及び機能において重要な役割を果たすサイトカインである。造血誘導培地中のＩＬには、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、及びＩＬ－１１が含まれ得る。
【0080】
ＩＬ－３（別名ＩＬ３またはＭＣＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６２）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００５８８．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５７９．２を有し得る。ＩＬ－３は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－３の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０または２４０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0081】
ＩＬ－６（別名ＩＬ６またはＨＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６００．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００５９１．５を有し得る。ＩＬ－６は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－６の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．１、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または９５ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0082】
ＩＬ－７（別名ＩＬ７、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５７４）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００８８０．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００８７１．１を有し得る。ＩＬ－７は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－７の濃度は、０．１～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．１、０．２５、０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または９５ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約１０ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0083】
ＩＬ－１１（別名ＡＧＩＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３５８９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６４１．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６３２．１を有し得る。ＩＬ－１１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＬ－１１リガンドの濃度は、０．５～１００ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．５、０．７５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または９５ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0084】
インスリン様成長因子１（ＩＧＦ－１）は、チロシンキナーゼＩＧＦ－１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）及びインスリン受容体に結合するホルモンであり、複数のシグナル伝達経路を活性化する。ＩＧＦ－１（別名ＩＧＦまたはＭＧＦ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３４７９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００６１８．５及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００６０９．１を有し得る。ＩＧＦ－１は、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＩＧＦ－１の濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０または２４０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0085】
ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）は、脊椎動物の器官形成を調節するヘッジホッグシグナル伝達経路のリガンドである。ＳＨＨ（別名ＴＰＴまたはＨＨＧ１、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：６４６９）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００１９３．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００１８４．１を有し得る。ＳＨＨは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ Ｇｍｂｈ，ＤＥ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＳＨＨの濃度は、０．２５～２５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０または１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０または２４０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約２５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0086】
エリスロポエチン（ＥＰＯ）は、エリスロポエチン受容体（ＥｐｏＲ）に結合する糖タンパク質サイトカインであり、赤血球形成を刺激する。ＥＰＯ（別名ＤＢＡＬ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：２０５６）は、参照核酸配列ＮＭ＿０００７９９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿０００７９０．２を有し得る。ＥＰＯは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のＥＰＯの濃度は、０．０２～２０Ｕ／ｍＬ、例えば約０．０２５、０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１３、１５、１７、または１９Ｕ／ｍＬのいずれか、好ましくは約２Ｕ／ｍＬであり得る。
【0087】
アンギオテンシンＩＩは、アンギオテンシンＩに対するアンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）の作用によって形成されるヘプタペプチドホルモンである。アンギオテンシンＩＩは、血管収縮を刺激する。アンギオテンシンＩ及びＩＩは、参照核酸配列ＮＭ＿００００２９．４及び参照アミノ酸配列ＮＰ＿００００２０．１を有し得るアンギオテンシノーゲン（別名ＡＧＴ、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１８３）の切断によって形成される。アンギオテンシンＩＩは、商業的供給源（例えばＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ、Ｔｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ）から容易に入手可能である。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩの濃度は、０．０５～５０ｎｇ／ｍＬ、例えば約０．０５、０．０７５、０．１、０．５、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０または５０ｎｇ／ｍＬのいずれか、好ましくは約５ｎｇ／ｍＬであり得る。
【0088】
アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト（ＡＲＢ）は、ＡＴ１受容体（ＡＧＴＲ１；遺伝子ＩＤ １８５）の活性化を選択的にブロックする化合物である。好適なＡＴ１アンタゴニストとしては、ロサルタン（２－ブチル－４－クロロ－１－｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）－４－ビフェニリル］メチル｝－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール）、バルサルタン（（２Ｓ）－３－メチル－２－（ペンタノイル｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）ビフェニル－４－イル］メチル｝アミノ）ブタン酸）、及びテルミサルタン（４’［（１，４’－ジメチル－２’－プロピル［２，６’－ビ－１Ｈ－ベンズイミダゾール］－１’－イル）メチル］［１，１’－ビフェニル］－２－カルボン酸が挙げられる。いくつかの好ましい実施形態では、ＡＴ１アンタゴニストはロサルタンである。好適なＡＴ１アンタゴニストは、商業的供給者（例えばＴｏｃｒｉｓ，ＵＳＡ、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．ＭＩ ＵＳＡ）から取得することができる。好都合なことに、本明細書に記載される造血誘導培地中のアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストの濃度は、１～１０００μＭ、例えば約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００μＭのいずれか、好ましくは約１００μＭであり得る。
【0089】
いくつかの好ましい実施形態では、好適な造血誘導培地は、（ａ）ＳＭＡＤ１、５及び９媒介シグナル伝達経路、例えば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、例えばＢＭＰ４、（ｂ）ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）などのヘッジホッグシグナル伝達経路、（ｃ）エリスロポエチン（ＥＰＯ）などのＥｐｏＲ媒介シグナル伝達経路、及び／または（ｄ）アンギオテンシンなどのＡＧＴＲ２媒介シグナル伝達経路を刺激する分化因子を欠いている場合がある。好適な造血誘導培地は、ＡＧＴＲ１（アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１））媒介シグナル伝達経路を阻害する分化因子、例えばアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト（ＡＲＢ）、例えばロサルタン（２－ブチル－４－クロロ－１－｛［２’－（１Ｈ－テトラゾール－５－イル）－４－ビフェニリル］メチル｝－１Ｈ－イミダゾール－５－イル）メタノール）、及び線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）活性を有する分化因子、例えばｂＦＧＦ（ＦＧＦ２）などのＦＧＦを欠いている場合もある。例えば、造血誘導培地は、ＢＭＰ、ＦＧＦ．ＳＨＨ、ＥＰＯ、アンギオテンシン及びロサルタンを欠いている場合がある。
【0090】
好ましい実施形態では、造血誘導培地は既知組成培地である。
【0091】
いくつかの実施形態では、造血誘導培地は、有効量の、例えば１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと、例えば１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦと、例えば３０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）と、例えば２５ｎｇ．／ｍＬのＦｌｔ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と、例えば２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３と、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６と、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－７と、例えば５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１１と、例えば２５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１と、ＢＭＰ、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４と、ＦＧＦ、例えば５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦと、例えば２５ｎｇ／ｍＬのソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）と、例えば２ｕ／ｍＬのエリスロポエチン（ＥＰＯ）と、例えば１０μｇ／ｍＬのアンギオテンシンＩＩと、アンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニスト、例えば１００μＭのロサルタンとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。他の実施形態では、造血誘導培地は、有効量の、例えば１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと、例えば１００ｎｇ／ｍｌのＳＣＦとを補充した既知組成栄養培地からなり得る。他の実施形態では、造血誘導培地は、有効量の、例えば１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦと、例えば１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦと、例えば３０ｎｇ／ｍＬのトロンボポエチン（ＴＰＯ）と、例えば２５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）と、例えば２５ｎｇ／ｍＬのＩＬ－３と、例えば１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ－６と、例えば２５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ－１と、場合により、例えば１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ－７とを補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適な造血誘導培地は、他の分化因子を欠いていてもよい。例えば、造血誘導培地は、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなることができ、ここで、１つ以上の分化因子は、ＳＣＦ及び／またはＶＥＧＦからなる（すなわち、培地は、ＳＣＦ及びＶＥＧＦ以外の分化因子を含まない）。造血誘導培地の他の例は、１つ以上の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなることができ、ここで、１つ以上の分化因子は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１及びＩＬ－７からなる（すなわち、培地は、ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６及びＩＧＦ－１；またはＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＧＦ－１及びＩＬ－７以外の分化因子を含まない）。
【0092】
好適な既知組成栄養培地は上述されており、グルタミン、アスコルビン酸及びモノチオグリセロール（ＭＴＧ）を場合により補充したＳｔｅｍＰｒｏ（商標）－３４（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、または後述のようにアルブミン、インスリン、セレントランスフェリン、及び脂質を補充したＩＭＤＭなどの基本培地を含む。
【0093】
ＨＥＣは、ＨＰＣの集団を生産するために、造血誘導培地で８～３５日間、好ましくは１２～２８日間または１６～２８日間、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６または２７日間のいずれか、例えば約１６日間培養され得る。
【0094】
ＨＰＣ（別名、造血幹細胞及び造血前駆細胞またはＨＳＰＣ）は、造血系列に傾倒している多分化能幹細胞であり、単球、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＴＩＬ、及びＴ細胞を含む、骨髄系列及びリンパ系系列を含む、すべての血液細胞型へのさらなる造血分化が可能である。ＨＰＣはＣＤ３４を発現し得る。
【0095】
いくつかの実施形態では、ＨＰＣは、胸腺細胞ＨＰＣ（ｔＨＰＣ）を含み得る。ＨＰＣの集団は、ＨＰＣ、胸腺細胞ＨＰＣ、またはＨＰＣと胸腺細胞ＨＰＣとの両方を含み得る。胸腺細胞ＨＰＣは、胸腺細胞系列（すなわち、初期段階の胸腺細胞）に傾倒しており、Ｔ細胞へのさらなる分化が可能な前駆細胞である。ｔＨＰＣは、ＣＤ３４及びＣＤ７を発現する場合があり、すなわち、ｔＨＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋表現型を示す場合がある。
【0096】
ＨＰＣは、ＣＤ１１７、ＣＤ１３３、ＣＤ４５及びＦＬＫ１（別称ＫＤＲまたはＶＥＧＦＲ２）を同時発現する場合があり、ＣＤ３８及び他の系列特異的マーカーの発現について陰性であり得る。例えば、ＨＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋ＣＤ４５＋ＦＬＫ１＋ＣＤ３８－のうちの１つ以上、好ましくはすべてを示し得る。胸腺細胞ＨＰＣは、ＣＤ３４＋ＣＤ７＋ＣＤ１３３＋ＣＤ４５＋ＦＬＫ１＋ＣＤ３８－のうちの１つ以上、好ましくはすべてを示し得る。
【0097】
ＨＥＣ及びＨＰＣは、分化中の細胞の集団からの個々の細胞または細胞のサブセットの中間精製または単離をせずに、ｉＰＳＣから生成され得る。例えば、特定のクラス、種類、系列または表現型の細胞は、分化中の細胞の集団における他の細胞から分離されない場合がある。逆に、分化中の細胞の集団中で、特定のクラス、種類、系列または表現型に属さない細胞は、特定のクラス、種類、系列または表現型をもつ集団中の細胞から分離されない場合がある。精製または単離の工程は、集団中で特定のクラス、種類、系列または表現型を示す細胞の割合を増加させ得る。このような工程は、本明細書に記載される方法において、造血性内皮細胞を生産するために不必要である。細胞精製または単離の技法は、磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）及びミクロ流体細胞選別などの細胞選別またはゲーティング技法を含み、当技術分野で十分に確立されている。
【0098】
本明細書に記載される異なる培養培地を使用して分化を推進することで、単一の培養容器において、本明細書に記載されるようなＨＥＣへとｉＰＳＣの集団を分化させることができる。ＨＥＣへと分化できる標的細胞は、分化中に集団中の非標的細胞から分離されない場合がある。例えば、標的細胞の濃度または割合を高めるために、標的細胞または非標的細胞が細胞集団から単離されない場合がある。
【0099】
ＨＥＣからＨＰＣを生成した後、ＣＤ３４などの１つ以上の細胞表面マーカーを発現するＨＰＣは、さらなる分化に供される前に、例えば磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）または他の細胞精製もしくは単離技法により、集団中の他の細胞から精製または単離され得る。例えば、ＣＤ３４＋ＨＰＣの集団が精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、ＨＥ誘導培地で８日間、例えば８～１０日間の培養後に精製され得る。ＣＤ３４＋ＨＰＣは、１１日間の分化後、例えば、分化法の１１日目～１７日目、すなわち１１、１２、１３、１４、１５、１６、及び１７日目に精製され得る。
【0100】
好ましくは、本明細書に記載されるように生産されるＨＰＣは、Ｔ細胞の集団を生成するために使用される。Ｔ細胞の集団は、
上述のようにｉＰＳＣの集団をＨＥＣへと分化させること、
上述のようにＨＥＣの集団をＨＰＣへと分化させること、及び
ＨＰＣをＴ細胞前駆体へと分化させること
を含む方法によって生産され得る。
上述のようにｉＰＳＣの集団をＨＥＣへと分化させること、
上述のようにＨＥＣの集団をＨＰＣへと分化させること、及び
ＨＰＣをＴ細胞前駆体へと分化させること
を含む方法によって生産され得る。
【0101】
造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、リンパ系分化を促進する好適な条件下でＨＰＣの集団を培養することにより、前駆Ｔ細胞へと分化し得る。例えば、造血前駆細胞は、リンパ系増大培地で培養され得る。
【0102】
造血前駆細胞（ＨＰＣ）は、ＯＰ９－Ｄｌ４間質細胞などの間質細胞、フィーダー細胞または血清の非存在下で、前駆Ｔ細胞及びＤＰ（二重陽性）Ｔ細胞へと分化し得る。
【0103】
リンパ系増大培地は、前駆Ｔ細胞へのＨＰＣのリンパ系分化を促進する細胞培養培地である。
【0104】
好適なリンパ系増大培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＭＰＬ（ＣＤ１１０）及び／またはＭＰＬ（ＣＤ１１０）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｖ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、リンパ系増大培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＰＯ及びＩＬ７を含み得る。
【0105】
好ましい実施形態では、リンパ系増大培地は既知組成培地である。例えば、リンパ系増大培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なリンパ系増大培地は、当技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）リンパ系増大サプリメント（カタログ番号９９１５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を含む。
【0106】
ＨＰＣは、前駆Ｔ細胞への分化中に表面上で培養され得る。例えば、ＨＰＣは、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。
【0107】
好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。
【0108】
表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。
【0109】
いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンド、ビトロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及びＶＣＡＭ１などの細胞表面接着タンパク質を含むコーティングを有し得る。いくつかの実施形態では、ＨＰＣ培養用の表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えばＤＬＬ４などのＮｏｔｃｈリガンドを含み、細胞外マトリックスタンパク質または細胞表面接着タンパク質を含まないコーティングを有し得る。
【0110】
表面は、表面をコーティング溶液と接触させることにより、細胞外マトリックスタンパク質、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、及び／または細胞表面接着タンパク質でコーティングされ得る。例えば、コーティング溶液は、表面をコーティングするために好適な条件下で、表面上でインキュベートされ得る。条件は、例えば、室温で約２時間を含み得る。細胞外マトリックスタンパク質及びＮｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子を含むコーティング溶液は、商業的供給者から入手可能である（ＳｔｅｍＳｐａｎ（商標）リンパ系分化コーティング材料；カタログ番号９９２５；Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）。
【0111】
ＨＰＣは、基質上のリンパ系増大培地で、ＨＰＣを前駆Ｔ細胞に分化させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、ＨＰＣは、２～６週間または２～４週間、２～５週間、好ましくは３週間培養され得る。
【0112】
前駆Ｔ細胞は、αβＴ細胞、γδＴ細胞、組織常在性Ｔ細胞、及びＮＫ Ｔ細胞を生じさせることができる多分化能リンパ球生成前駆細胞である。前駆Ｔ細胞は、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にαβＴ細胞系列に傾倒し得る。前駆Ｔ細胞は、ｉｎ ｖｉｖｏで胸腺に定着することができる可能性があり、胸腺におけるｐｒｅ－ＴＣＲ選択の後にαβＴ細胞系列に傾倒することができる可能性がある。前駆Ｔ細胞は、サイトカイン生産ＣＤ３＋Ｔ細胞に成熟することができる可能性もある。
【0113】
前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５及びＣＤ７を発現する場合があり、すなわち、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋ＣＤ７＋表現型を有する場合がある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ２５、及びＣＤ２を同時発現する場合もある。例えば、前駆Ｔ細胞は、ＣＤ５＋、ＣＤ７＋ＣＤ４４＋、ＣＤ２５＋ＣＤ２＋表現型を有し得る。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ４５を同時発現する場合もある。前駆Ｔ細胞は、ＣＤ３、ＣＤ４、及びＣＤ８の発現、例えば細胞表面発現を欠く場合がある。
【0114】
第５段階では、Ｔ細胞成熟を促進する好適な条件下で前駆Ｔ細胞の集団を培養することにより、前駆Ｔ細胞がＴ細胞へと成熟し得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、Ｔ細胞成熟培地で培養され得る。
【0115】
Ｔ細胞成熟培地は、成熟型Ｔ細胞への前駆Ｔ細胞の成熟を促進する細胞培養培地である。好適なＴ細胞成熟培地は、（ｉ）ｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）を刺激し、及び／またはｃＫＩＴ受容体（ＣＤ１１７；ＫＩＴ受容体チロシンキナーゼ）媒介シグナル伝達経路を刺激し、（ｉｉ）ＦＬＴ３及び／またはＦＬＴ３媒介シグナル伝達経路を刺激し、かつ（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）活性を有し得る。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、分化因子ＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、及びＩＬ７を含み得る。
【0116】
好ましい実施形態では、Ｔ細胞成熟培地は既知組成培地である。例えば、Ｔ細胞成熟培地は、有効量の上記の分化因子を補充した既知組成栄養培地からなり得る。好適なＴ細胞成熟培地は、当技術分野で周知であり、Ｓｔｅｍｓｐａｎ（商標）Ｔ細胞成熟サプリメント（カタログ番号９９３０；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）を補ったＳｔｅｍｓｐａｎ（商標）ＳＦＥＭ ＩＩ（カタログ番号９６０５；ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ Ｉｎｃ，ＣＡ）、ならびにＥｘＣｅｌｌｅｒａｔｅヒトＴ細胞増大培地（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）のようなＰＢＭＣ及びＣＤ３＋細胞の増大に好適な他の培地を含む。他の好適なＴ細胞成熟培地には、本明細書の他の箇所に記載されるような、ＩＴＳ、アルブミン及び脂質を補充し、有効量の上記の分化因子をさらに補充した、ＩＭＤＭなどの基本培地が含まれ得る。
【0117】
前駆Ｔ細胞は表面上で培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、培養容器、ビーズ、または他の生体材料もしくはポリマーの表面上で培養され得る。
【0118】
好ましくは、表面は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達を刺激する因子、例えば、デルタ様１（ＤＬＬ１）またはデルタ様４（ＤＬＬ４）などのＮｏｔｃｈリガンドでコーティングされ得る。好適なＮｏｔｃｈリガンドは、当技術分野で周知であり、商業的供給者から入手可能である。表面は、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニンもしくはコラーゲンなどの細胞外マトリックスタンパク質、及び／またはＶＣＡＭ１などの１つ以上の細胞表面接着タンパク質でコーティングされてもよい。好適なコーティングは、当技術分野で周知であり、本明細書の他の箇所に記載されている。
【0119】
前駆Ｔ細胞は、基質上のＴ細胞成熟培地で、前駆Ｔ細胞をＴ細胞に成熟させるのに十分な時間にわたって培養され得る。例えば、前駆Ｔ細胞は、１～４週間、好ましくは１～２週間培養され得る。
【0120】
Ｔ細胞（別名、Ｔリンパ球）は、細胞性免疫において中心的な役割を果たす白血球である。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、他のリンパ球から区別され得る。
【0121】
Ｔ細胞には数種類あり、各種類が異なる機能を有する。
【0122】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、ＣＤ４表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、適応免疫系において重要な役割を果たし、Ｔ細胞サイトカインを放出して免疫応答の抑制または調節を助けることによって他の免疫細胞の活動を助ける。これらは、細胞傷害性Ｔ細胞の活性化及び成長に不可欠である。
【0123】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、ＣＴＬ、キラーＴ細胞、細胞溶解性Ｔ細胞）は、ＣＤ８表面糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞として知られている。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊するように作用する。ほとんどのＣＤ８＋Ｔ細胞は、クラスＩのＭＨＣ分子によって感染細胞もしくは損傷細胞の表面に提示される特定の抗原を認識できる、またはＭＨＣによる提示とは無関係に特定の抗原もしくはそのペプチドを認識し得るＴＣＲを発現し、そのようなＴ細胞は、本発明の方法に従って生産され得る。抗原及びＭＨＣ分子へのＴＣＲ及びＣＤ８糖タンパク質の特異的結合は、Ｔ細胞を介した感染細胞または損傷細胞の破壊をもたらす。
【0124】
本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、成熟型ＣＤ３＋Ｔ細胞であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４５及びＣＤ２８も発現し得る。
【0125】
本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、γδＴ細胞、αβＴ細胞、またはＮＫＴ細胞であり得る。
【0126】
いくつかの好ましい実施形態では、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、αβＴ細胞である。前駆Ｔ細胞の成熟（第５段階）の後、Ｔ細胞の集団は、主に二重陽性（ＤＰ）ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る。
【0127】
第６段階では、単陽性ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはより好ましくは単陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞を生産するように、またはその割合を増加させるように、Ｔ細胞の集団を活性化及び／または増大させることができる。Ｔ細胞を活性化及び増大させるための好適な方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｔ細胞は、適切な培養条件下でＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニストに曝露され得る。好適なＴＣＲアゴニストとしては、ビーズまたは樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子（ＭＨＣ－ペプチド複合体）上に提示されるペプチドなどのリガンド、及び抗ＴＣＲ抗体などの可溶性因子、例えば抗体ＣＤ２８抗体、及びＭＨＣ－ペプチド四量体、五量体またはデキストラマーなどの多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体が挙げられる。
【0128】
活性化とは、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激されたＴ細胞の状態を指す。活性化は、誘導されたサイトカイン生産、及び検出可能なエフェクター機能にも関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂を起こしているＴ細胞を指す。
【0129】
抗ＴＣＲ抗体は、εＣＤ３、αＣＤ３またはαＣＤ２８のような、ＴＣＲの成分に特異的に結合し得る。ＴＣＲ刺激に好適な抗ＴＣＲ抗体は、当技術分野で周知であり（例えばＯＫＴ３）、商業的供給者（例えばｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ ＣＯ ＵＳＡ）から入手可能である。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及びＩＬ２、ＩＬ－７、またはＩＬ１５への曝露によって活性化され得る。より好ましくは、Ｔ細胞は、抗αＣＤ３抗体及び抗αＣＤ２８抗体への曝露によって活性化される。活性化は、ＣＤ１４＋単球の存在下でも非存在下でも起こり得る。Ｔ細胞は、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズによって活性化され得る。例えば、ＰＢＭＣあるいはＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋細胞を含むＴ細胞サブセットは、フィーダー細胞（抗原提示細胞）または抗原を用いずに、抗体でコーティングされたビーズ、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）Ｈｕｍａｎ Ｔ－Ａｃｔｉｖａｔｏｒ ＣＤ３／ＣＤ２８（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）などの抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた磁気ビーズを使用して活性化され得る。他の実施形態では、ＣＤ３、ＣＤ２８、及びＣＤ２細胞表面リガンドと結合する可溶性四量体抗体複合体、例えば、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２ Ｔ Ｃｅｌｌ ＡｃｔｉｖａｔｏｒまたはＨｕｍａｎ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔ Ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｏｒを使用して、Ｔ細胞を活性化することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞は、場合により抗ＣＤ２８抗体と組み合わせて、ＭＨＣ－ペプチド複合体、好ましくは多量体ＭＨＣ－ペプチド複合体で活性化され得る。
【0130】
キメラ抗原受容体を発現するＴ細胞は、受容体に対する可溶性抗原を使用して活性化され得る。抗原は、多量体形態でもよく、またはビーズの表面上にあってもよく、場合により、抗ＣＤ２８抗体などの抗ＴＣＲ抗体と併せて使用されてもよい。
【0131】
いくつかの実施形態では、二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＩＬ－１５を補充した、本明細書に記載されるＴ細胞成熟培地で培養され得る。培地には、上述のように、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アゴニスト、例えば１つ以上の抗ＴＣＲ抗体、例えば抗αＣＤ３抗体、及び抗αＣＤ２８抗体をさらに補充してもよい。
【0132】
二重陽性ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞は、増大した集団を生産するための任意の簡便な技法を使用して培養され得る。好適な培養系には、攪拌タンクファーメンター、エアリフトファーメンター、ローラーボトル、培養バッグまたはディッシュ、及び他のバイオリアクター、特に中空糸バイオリアクターが含まれる。そのような系の使用は、当技術分野で周知である。
【0133】
本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、標的抗原と結合する抗原受容体を発現し得る。例えば、抗原受容体は、腫瘍抗原を発現するがん細胞に特異的に結合し得る。Ｔ細胞は、後述するように、例えば免疫療法において有用であり得る。
【0134】
抗原受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であり得る。ＴＣＲは、典型的には、インバリアントＣＤ３鎖分子との複合体として発現される可変性の高いアルファ（α）鎖及びベータ（β）鎖を含む、ジスルフィド結合した膜固定型ヘテロ二量体タンパク質である。これらの種類のＴＣＲを発現するＴ細胞は、α：β（またはαβ）Ｔ細胞と呼ばれる。少数のＴ細胞は、可変のガンマ（γ）鎖及びデルタ（δ）鎖を含む代替的なＴＣＲを発現し、γδＴ細胞と呼ばれる。
【0135】
好適なＴＣＲは、腫瘍抗原のペプチド断片を提示するがん細胞の表面上の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）に特異的に結合する。ＭＨＣは、獲得免疫系に「外来」分子を認識させる細胞表面タンパク質のセットである。タンパク質は細胞内で分解され、ＭＨＣによって細胞の表面に提示される。ウイルスまたはがん関連ペプチドなどの「外来」ペプチドを提示するＭＨＣは、適切なＴＣＲを有するＴ細胞によって認識され、細胞破壊経路を促進する。がん細胞の表面上のＭＨＣは、腫瘍抗原、すなわち、がん細胞には存在するが対応する非がん性細胞には存在しない抗原のペプチド断片を提示し得る。これらのペプチド断片を認識するＴ細胞は、がん細胞に対して細胞傷害性効果を及ぼし得る。
【0136】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞によって発現されるＴＣＲは、天然に発現され得る（すなわち、内因性ＴＣＲ）。例えば、Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）に由来するｉＰＳＣから、本明細書に記載されるように生産され得る。ＴＩＬ、例えば腫瘍常在性ＣＤ３＋ＣＤ８＋細胞は、標準的技法を使用して、がん病態を有する個体から取得することができる。あるいは、樹状細胞などの抗原提示細胞の表面上のクラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチド断片に結合するＴ細胞に由来するｉＰＳＣから、本明細書に記載されるようにＴ細胞を生産してもよく、または、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞の集団を、クラスＩもしくはＩＩのＭＨＣ分子上に提示される標的抗原のペプチド断片への結合についてスクリーニングし、提示されたペプチド断片に結合するＴ細胞を同定してもよい。
【0137】
他の実施形態では、ＴＣＲは、細胞によって天然には発現されない（すなわち、ＴＣＲは外因性または異種である）。好適な異種ＴＣＲは、標的抗原のペプチド断片を提示するクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、がん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するクラスＩまたはＩＩのＭＨＣ分子に特異的に結合する異種αβＴＣＲを発現するように改変され得る。がん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的技法を使用して同定され得る。好ましい腫瘍抗原は、ＮＹ－ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１０及びＭＡＧＥ Ｂ２を含み、最も好ましくはＮＹ－ＥＳＯ－１、ＭＡＧＥ－Ａ４及びＭＡＧＥ－Ａ１０である。
【0138】
好適なＴＣＲは、非従来型のＴＣＲ、例えば、ＣＤ１及びＭＲ１などの単形性抗原提示分子によって提示される非ペプチド抗原を認識してそれに結合する非ＭＨＣ依存性ＴＣＲ、ＮＫＴ細胞ＴＣＲ、ならびに上皮内リンパ球（ＩＥＬ）ＴＣＲを含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＣＲは、ＭＨＣ提示とは無関係に、がん細胞上の標的抗原または標的抗原のペプチド断片を認識し得る。
【0139】
異種ＴＣＲは、合成または人工のＴＣＲ、すなわち天然には存在しないＴＣＲであり得る。例えば、異種ＴＣＲは、腫瘍抗原に対するその親和性またはアビディティを増加させるようにエンジニアリングされ得る（すなわち、親和性向上型ＴＣＲ）。親和性向上型ＴＣＲは、天然に発生するＴＣＲに比した１つ以上の突然変異、例えば、ＴＣＲα鎖及びβ鎖の可変領域の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）における１つ以上の突然変異を含み得る。これらの突然変異は、がん細胞によって発現される腫瘍抗原のペプチド断片を提示するＭＨＣに対するＴＣＲの親和性を増加させる。親和性向上型ＴＣＲを生成する好適な方法は、ファージまたは酵母ディスプレイを使用するＴＣＲ突然変異体のライブラリのスクリーニングを含み、当技術分野で周知である（例えばＲｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００８）１８０（９）：６１１６、Ｓａｎ Ｍｉｇｕｅｌ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ ２８（３）２８１－２８３、Ｓｃｈｍｉｔｔ ｅｔ ａｌ（２０１３）Ｂｌｏｏｄ １２２ ３４８－２５６、Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ（２０１５）Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ５ ９０１を参照のこと）。好ましい親和性向上型ＴＣＲは、腫瘍抗原ＮＹ－ＥＳＯ１、ＰＲＡＭＥ、α－フェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＭＡＧＥ Ａ４、ＭＡＧＥ Ａ１、ＭＡＧＥ Ａ１０及びＭＡＧＥ Ｂ２のうちの１つ以上を発現するがん細胞に結合し得る。
【0140】
あるいは、抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）でもよい。ＣＡＲは、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）などの免疫グロブリン抗原結合ドメインを含むようにエンジニアリングされた人工受容体である。ＣＡＲは、例えば、ＴＣＲ ＣＤ３膜貫通領域及びエンドドメインに融合したｓｃＦｖを含み得る。ｓｃＦｖは、およそ１０～２５アミノ酸の短いリンカーペプチドで接続されている場合がある免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である（Ｈｕｓｔｏｎ Ｊ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８８；８５（１６）：５８７９－５８８３）。リンカーは、柔軟性のためにグリシンリッチであり得、溶解性のためにセリンまたはスレオニンリッチであり得、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、またはその逆に接続し得る。ｓｃＦｖには、タンパク質を小胞体に、続いてＴ細胞表面に導くためのシグナルペプチドが先行する場合がある。ＣＡＲでは、ｓｃＦｖは、ＴＣＲ膜貫通及びエンドドメインに融合していてもよい。可変の配向及び抗原結合を可能にするために、柔軟なスペーサーがｓｃＦｖとＴＣＲ膜貫通ドメインとの間に含まれていてもよい。エンドドメインは、受容体の機能的なシグナル伝達ドメインである。ＣＡＲのエンドドメインは、例えば、ＣＤ３ζ鎖、またはＣＤ２８、４１ＢＢ、もしくはＩＣＯＳなどの受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。ＣＡＲは、例えばＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－４１ＢＢまたはＣＤ３ｚ－ＣＤ２８－ＯＸ４０だがこれらに限定されない、複数のシグナル伝達ドメインを含み得る。
【0141】
ＣＡＲは、がん細胞によって発現される腫瘍特異的抗原に特異的に結合し得る。例えば、Ｔ細胞は、特定のがん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原に特異的に結合するＣＡＲを発現するように改変され得る。がん患者のがん細胞によって発現される腫瘍抗原は、標準的技法を使用して同定され得る。
【0142】
あるいは、抗原受容体は、ＮＫ細胞受容体（ＮＫＣＲ）でもよい。
【0143】
異種ＴＣＲ、ＮＫＣＲまたはＣＡＲなどの異種抗原受容体の発現は、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞の免疫原性特異性を変化させて、それらが、がんを有する個体のがん細胞の表面上に存在する腫瘍抗原などの１つ以上の標的抗原を認識するか、またはその認識の向上を示すようにすることができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞は、異種抗原受容体の非存在下では、がん細胞への結合の低減を示すか、または結合を示さない場合がある。例えば、異種抗原受容体の発現は、抗原受容体を発現しないＴ細胞に比して、Ｔ細胞のがん細胞結合の親和性及び／または特異性を増加させ得る。
【0144】
「異種」という用語は、宿主細胞などの特定の生体系にとって外来であり、その系に天然には存在しないポリペプチドまたは核酸を指す。異種ポリペプチドまたは核酸は、人工的手段、例えば組換え技法を使用して生体系に導入され得る。例えば、ポリペプチドをコードする異種核酸を好適な発現構築物に挿入し、次にこれを使用して宿主細胞を形質転換し、ポリペプチドを生産することができる。異種ポリペプチドまたは核酸は、合成もしくは人工でもよく、または異なる種もしくは細胞型などの異なる生体系に存在してもよい。内因性ポリペプチドまたは核酸は、宿主細胞などの特定の生体系に固有であり、その系に天然に存在する。組換えポリペプチドは、人工的手段により、例えば組換え技法を使用して細胞に導入された異種核酸から発現される。組換えポリペプチドは、細胞内に天然に存在するポリペプチドと同一の場合もあれば、その細胞内に天然に存在するポリペプチドと異なる場合もある。
【0145】
Ｔ細胞は、本明細書に記載される方法におけるいずれかの段階で細胞に異種コード核酸を導入することにより、ＴＣＲまたはＣＡＲなどの異種抗原受容体を発現するように改変され得る。例えば、異種コード核酸は、ｉＰＳＣ、ＨＰＣ、中胚葉細胞、ＨＥＣ、または前駆Ｔ細胞に導入され得る。いくつかの好ましい実施形態では、例えば、本明細書に記載されるようなリンパ系増大培地での２週間の培養（第４段階）の後、リンパ系増大培地中で、抗原受容体をコードする異種核酸を細胞に形質導入してもよい。抗原受容体をコードする異種核酸は、受容体のすべてのサブユニットをコードし得る。例えば、ＴＣＲをコードする核酸は、ＴＣＲα鎖をコードするヌクレオチド配列及びＴＣＲβ鎖をコードするヌクレオチド配列、またはＴＣＲδ鎖をコードするヌクレオチド配列及びＴＣＲγ鎖をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【0146】
核酸は、任意の簡便な技法によって細胞に導入され得る。ｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞に異種核酸を導入するまたは組込む場合、当業者には周知である、ある特定の検討事項を考慮しなければならない。挿入される核酸は、Ｔ細胞での転写を駆動する有効な調節エレメントを含む構築物またはベクター内でアセンブルされるべきである。例えば、核酸構築物の調製、細胞へのＤＮＡの導入、及び遺伝子発現における、核酸の操作及び形質転換のための多くの公知の技法及びプロトコルが、Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９２に詳細に記載されている。いくつかの実施形態では、核酸は、遺伝子編集によって細胞に導入され得る。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系により、標的部位でのＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）を誘導することができ、ＤＳＢの修復により、標的部位で細胞ゲノムに異種核酸を導入してもよく、または、ｒＡＡＶベクターを使用して核酸を導入してもよい（ＡＡＶ媒介遺伝子編集；Ｈｉｒｓｃｈ ｅｔ ａｌ ２０１４ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １１１４ ２９１－３０７）。
【0147】
ｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞に発現ベクターを導入するための好適な技法は、当技術分野で周知であり、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ－デキストラン、電気穿孔、リポソーム媒介トランスフェクション、遺伝子編集、及びワクシニアまたはレンチウイルスなどのレトロウイルスまたは他のウイルスを使用した形質導入を含む。好ましくは、異種抗原受容体をコードする核酸は、ウイルスベクター、最も好ましくはガンマレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、例えばＶＳＶｇ偽型レンチウイルスベクターに含まれ得る。本明細書に記載される方法は、細胞、例えばｉＰＳＣ、ＨＰＣまたは前駆Ｔ細胞の集団に、ウイルスベクターを形質導入して、遺伝子改変細胞の形質導入集団を生産することを含み得る。細胞は、核酸を含むウイルス粒子との接触によって形質導入され得る。形質導入のためのウイルス粒子は、公知の方法に従って生産され得る。例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、ウイルスパッケージング及びエンベロープエレメントをコードするプラスミド、ならびにコード核酸を含むレンチウイルスベクターをトランスフェクトしてもよい。ＶＳＶｇ偽型ウイルスベクターを水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶｇ）のウイルスエンベロープ糖タンパク質Ｇと組み合わせて生産して、偽型ウイルス粒子を生産してもよい。例えば、固相形質導入は、レトロネクチンでコーティングされ、レトロウイルスベクターが予めロードされた組織培養プレートで培養することにより、選択をせずに行うことができる。
【0148】
Ｔ細胞、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＳＰ ＣＤ４＋細胞またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、生産後、単離及び／または精製され得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または抗体でコーティングされた磁気粒子を使用した磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を含め、任意の簡便な技法を使用することができる。
【0149】
Ｔ細胞、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋細胞、ＳＰ ＣＤ４＋細胞またはＳＰ ＣＤ８＋細胞の集団は、増大及び／または濃縮させてもよい。場合により、本明細書に記載されるように生産されるＴ細胞の集団は、使用前に、例えば凍結保存によって貯蔵され得る。
【0150】
Ｔ細胞の集団は、バッファー、担体、希釈剤、防腐剤及び／または薬学的に許容可能な賦形剤のような他の試薬と混合され得る。好適な試薬については、以下でより詳細に説明する。本明細書に記載される方法は、Ｔ細胞の集団を薬学的に許容可能な賦形剤と混合することを含み得る。
【0151】
投与（例えば注入による）に好適な医薬組成物には、抗酸化剤、バッファー、防腐剤、安定化剤、静菌薬、及び製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質を含み得る、水性及び非水性の等張でパイロジェンフリーの無菌注射液、ならびに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の無菌懸濁液が含まれる。このような製剤に使用される好適な等張ビヒクルの例としては、塩化ナトリウム注射液、リンゲル液、または乳酸加リンゲル注射液が挙げられる。好適なビヒクルについては、標準的な薬学の文献、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０に見出すことができる。
【0152】
いくつかの好ましい実施形態では、ＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞、または好ましくはＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得るＴ細胞は、個体への静脈内注入に好適な医薬組成物に配合され得る。
【0153】
本明細書で使用される「薬学的に許容可能な」という用語は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずに対象（例えば、ヒト）の組織と接触させて使用するのに好適であり、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、物質、組成物、及び／または剤形に関する。各担体、賦形剤なども、製剤の他の成分と適合するという意味で「許容可能」でなければならない。
【0154】
本発明の他の態様は、上述の方法によって生産されたＨＥＣの集団、及び上述の方法によって生産されたＨＰＣの集団を提供する。
【0155】
本発明の別の態様は、上述の方法によって生産された、例えばＤＰ ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、ＳＰ ＣＤ４＋Ｔ細胞、またはＳＰ ＣＤ８＋Ｔ細胞であり得る、Ｔ細胞の集団を提供する。
【0156】
Ｔ細胞の集団は、医薬として使用するためのものであり得る。例えば、本明細書に記載される成熟型Ｔ細胞の集団は、がん免疫療法、例えば養子Ｔ細胞療法に使用され得る。
【0157】
養子細胞療法または養子免疫療法は、標的細胞に特異的な抗原受容体を発現するヒトＴリンパ球の養子移入を指す。例えば、ヒトＴリンパ球は、標的細胞で発現される抗原に特異的なＴＣＲ、及び／または標的細胞で発現されるペプチドＭＨＣ複合体に特異的なＴＣＲ、あるいは標的細胞で発現される抗原に特異的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し得る。
【0158】
これは、がんを処置するための腫瘍特異的抗原など、選択された標的に応じて様々な疾患を処置するために使用され得る。養子細胞療法には、ドナーまたは患者の細胞、例えば、白血球の一部を取り出すことが含まれる。次いで、これらの細胞を使用してｉＰＳＣをｉｎ ｖｉｔｒｏで生成し、これらのｉＰＳＣを使用することで、本明細書に記載されるような、標的細胞で発現される抗原に特異的なＴ細胞、及び／または標的細胞上のペプチドＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞が効率的に生成される。Ｔ細胞は、患者が細胞の注入を受ける準備が整うまで、試験、輸送、及び貯蔵の時間を確保するために、増大させ、洗浄し、濃縮し、及び／またはその後に凍結してもよい。
【0159】
本発明の他の態様は、がんを処置するための医薬の製造のための本明細書に記載されるＴ細胞の集団の使用、がんを処置するための本明細書に記載されるＴ細胞の集団、及び、本明細書に記載されるＴ細胞の集団を、それを必要とする個体に投与することを含む、がんの処置の方法を提供する。
【0160】
Ｔ細胞の集団は自己由来であり得る。すなわち、Ｔ細胞は、それらが後に投与されるのと同じ個体から元々取得されたものである（すなわち、ドナーとレシピエント個体とが同じである）。
【0161】
Ｔ細胞の集団は同種異系であり得る。すなわち、Ｔ細胞は、それらが後に投与される個体とは異なる個体から元々取得されたものであり得る（すなわち、ドナーとレシピエント個体とは異なる）。同種異系とは、同じ種に属する異なる動物に由来する移植片を指す。
【0162】
ＧＶＨＤ及び拒絶反応などの他の望ましくない免疫効果を回避するために、ドナー及びレシピエント個体のＨＬＡは適合してもよい。あるいは、ドナー及びレシピエント個体のＨＬＡは適合しなくてもよく、またはドナー個体の細胞内のＨＬＡ遺伝子は、レシピエントとのＨＬＡミスマッチをなくすように、例えば遺伝子編集によって改変されてもよい。
【0163】
レシピエント個体への投与に好適なＴ細胞集団は、ドナー個体から取得された細胞の初期集団を用意することと、細胞をｉＰＳＣへとリプログラミングすることと、レシピエント個体において、場合によりＭＨＣと複合体を形成して提示される、がん細胞またはがん細胞上の抗原もしくは抗原のペプチドに特異的に結合する、αβＴＣＲなどの抗原受容体を発現するＴ細胞へと、ｉＰＳＣを分化させることとを含む方法によって生産され得る。
【0164】
Ｔ細胞の投与後、レシピエント個体は、レシピエント個体のがん細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答を呈し得る。これは、個体のがん病態に対して有益な効果を有し得る。
【0165】
本明細書で使用される場合、「がん」、「新生物」、及び「腫瘍」という用語は同義に使用され、単数形でも複数形でも、宿主生物にとって病的なものとなる悪性形質転換を起こした細胞を指す。
【0166】
原発がん細胞は、十分に確立された技法、特に組織学的検査により、非がん性細胞から容易に区別することができる。本明細書で使用されるがん細胞の定義には、原発がん細胞だけでなく、がん細胞の祖先に由来するあらゆる細胞が含まれる。これには、転移したがん細胞、ならびにがん細胞に由来するｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物及び細胞株が含まれる。通常は固形腫瘍として現れるがんの種類について言及する場合、「臨床的に検出可能」な腫瘍は、腫瘍塊に基づいて、例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、Ｘ線、超音波、もしくは身体検査での触診などの手順によって検出可能であるもの、及び／または患者から取得可能なサンプル中の１つ以上のがん特異的抗原の発現のために検出可能であるものである。
【0167】
がん病態は、悪性がん細胞の異常な増殖によって特徴付けることができ、ＡＭＬ、ＣＭＬ、ＡＬＬ及びＣＬＬなどの白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫及び多発性骨髄腫などのリンパ腫、ならびに肉腫、皮膚癌、黒色腫、膀胱癌、脳癌、乳癌、子宮癌、卵巣癌、前立腺癌、肺癌、大腸癌、子宮頸癌、肝臓癌、頭頸部癌、食道癌、膵癌、腎癌、副腎癌、胃癌、精巣癌、胆嚢及び胆管のがん、甲状腺癌、胸腺癌、骨のがん、及び大脳癌などの固形がん、ならびに原発不明がん（ＣＵＰ）を含み得る。
【0168】
個体内のがん細胞は、個体の正常な体細胞とは免疫学的に異なり得る（すなわち、がん性腫瘍は免疫原性であり得る）。例えば、がん細胞は、個体において、がん細胞によって発現される１つ以上の抗原に対する全身性免疫応答を誘発することができる可能性がある。免疫応答を誘発する腫瘍抗原は、がん細胞に特異的な場合もあれば、個体における１つ以上の正常細胞によって共有される場合もある。
【0169】
本明細書に記載される処置に好適な個体のがん細胞は、抗原を発現する場合があり、及び／またはＴ細胞によって発現される抗原受容体に結合する適正なＨＬＡ型である場合がある。
【0170】
上述のような処置に好適な個体は、哺乳動物であり得る。好ましい実施形態では、個体はヒトである。他の好ましい実施形態では、非ヒト哺乳動物、特に、ヒトにおける治療有効性を実証するためのモデルとして従来使用されている哺乳動物（例えばマウス、霊長類、ブタ、イヌ、またはウサギ動物）を用いることができる。
【0171】
いくつかの実施形態では、個体は、最初のがんの処置の後に最少残存病変（ＭＲＤ）を有し得る。
【0172】
がんを有する個体は、当技術分野で公知の臨床基準に従ってがんの診断を下すのに十分である、少なくとも１つの識別可能な徴候、症状、または検査所見を示し得る。このような臨床基準の例は、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５ｔｈ Ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ ＡＳ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，ＭｃＧｒａｗ－Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２００１などの医学教本に見出すことができる。場合によっては、個体におけるがんの診断は、個体から取得された体液または組織のサンプル中の特定の細胞型（例えば、がん細胞）の同定を含み得る。
【0173】
抗腫瘍効果は、腫瘍成長速度の低下、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、またはがん性病態に関連する様々な生理学的症状の改善によって現れ得る生物学的効果である。「抗腫瘍効果」は、そもそもの腫瘍の発生の防止における、本明細書に記載されるような、本発明の方法に従って取得され得るペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び抗体、さらにはＴ細胞の能力によって現れる場合もある。
【0174】
処置は、ヒトのものか動物のものか（例えば獣医学的用途）を問わず、いくらかの所望の治療効果、例えば、病態の進行の阻害または遅延が達成される、あらゆる処置及び／または療法であり得、進行速度の低下、進行速度の停止、病態の改善、病態の治癒または寛解（部分的か完全かを問わない）、病態の１つ以上の症状及び／または徴候の防止、遅延、軽減または抑止、あるいは処置の非存在下で予想されるものを超えた対象または患者の生存期間の延長を含む。
【0175】
処置は予防的（すなわち予防）でもよい。例えば、がんに罹患しやすい個体、またはその発生もしくは再発のリスクがある個体は、本明細書に記載されるように処置され得る。このような処置は、個体におけるがんの発生または再発を防止するか、または遅延させ得る。
【0176】
特に、処置には、がんの完全寛解を含むがんの成長の阻害、及び／またはがんの転移の阻害が含まれ得る。がんの成長とは、概して、より発達した形態へのがんにおける変化を示す複数の指標のうちのいずれか１つを指す。したがって、がんの成長の阻害を測定するための指標には、がん細胞の生存率の減少、腫瘍体積または形態における（例えば、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）、超音波検査、または他の画像法を使用して決定される）減少、腫瘍成長の遅延、腫瘍血管構造の破壊、遅延型皮膚過敏反応テストの成績の向上、Ｔ細胞の活性の増加、及び腫瘍特異的抗原のレベルの低下が含まれる。本明細書に記載されるように改変されたＴ細胞の投与は、がんの成長、特に対象に既に存在するがんの成長に抵抗する個体の能力を向上させ、及び／または個体におけるがんの成長の傾向を減少させ得る。
【0177】
Ｔ細胞またはＴ細胞を含む医薬組成物は、全身性／末梢性か、所望の作用部位においてかを問わず、非経口を含むがこれに限定されない、例えば注入による、任意の簡便な投与経路によって対象に投与され得る。注入は、針またはカテーテルを介した、好適な組成物中のＴ細胞の投与を含む。典型的には、Ｔ細胞は静脈内または皮下に注入されるが、Ｔ細胞は、筋肉内注射及び硬膜外経路など、他の非経口経路を介して注入されてもよい。好適な注入技法は、当技術分野で公知であり、療法において一般的に使用されている（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．，３１９：１６７６，１９８８を参照のこと）。
【0178】
典型的には、投与される細胞の数は、体重１Ｋｇ当たり約１０５個～約１０１０個、例えば、個体当たり細胞約１、２、３、４、５、６、７、８、または９、×１０５、×１０６、×１０７、×１０８、×１０９、または×１０１０個のいずれか、典型的には個体当たり細胞２×１０８～２×１０１０個であり、典型的には３０分間にわたり、必要に応じて、例えば数日から数週間の間隔で処置を繰り返す。Ｔ細胞、及びＴ細胞を含む組成物の適切な投与量は、患者ごとに異なり得ることが理解されるであろう。最適な投与量を決定することは、一般に、本発明の処置のリスクまたは有害な副作用に対する治療利益のレベルを釣り合わせることを伴う。選択される投与量レベルは、特定の細胞の活性、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、投与経路、投与時間、細胞の喪失または不活性化の比率、処置期間、組み合わせて使用される他の薬物、化合物、及び／または物質、ならびに患者の年齢、性別、体重、病態、全体的な健康状態、及び病歴を含むがこれらに限定されない、種々の因子に依存する。細胞の用量及び投与経路は、最終的には医師の裁量に委ねられるが、一般に、投与量は、実質的に有害（ｈａｒｍｆｕｌ）または有害（ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ）な副作用を引き起こすことなく所望の効果を達成する作用部位での局所濃度を達成するものとなる。
【0179】
Ｔ細胞は単独で投与してもよく、状況によっては、Ｔ細胞の集団のｉｎ ｖｉｖｏでの増大を促進するために、標的抗原、標的抗原を提示するＡＰＣ、ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズ、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及び／またはＩＬ１５と組み合わせてＴ細胞を投与してもよい。組み合わせの投与は、組み合わせた成分の別個、同時、または順次の投与によるものであり得る。
【0180】
Ｔ細胞の集団は、１つ以上の他の療法、例えばＩＬ－２などのサイトカイン、細胞傷害性化学療法、放射線、ならびに抗Ｂ７－Ｈ３、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＴＩＭ３、抗ＫＩＲ、抗ＬＡＧ３、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌ１、及び抗ＣＴＬＡ４抗体などのチェックポイント阻害剤を含む免疫腫瘍薬と組み合わせて投与され得る。組み合わせの投与は、組み合わせた成分の別個、同時、または順次の投与によるものであり得る。
【0181】
１つ以上の他の療法は、任意の簡便な手段によって、好ましくはＴ細胞の投与部位から離れた部位で投与され得る。
【0182】
Ｔ細胞は、処置の過程を通して、１用量で、連続的に、または断続的に（例えば、適切な間隔で分割された用量で）投与され得る。投与の最も効果的な手段及び投与量を決定する方法は、当業者に周知であり、療法に使用される製剤、療法の目的、処置される標的細胞、及び処置される対象に応じて異なる。単回または複数回の投与を行うことができ、用量レベル及びパターンは担当医によって選択される。好ましくは、Ｔ細胞は、５億、１０億、２０億、３０億、４０億、５０億、６０億、７０億、８０億、９０億、１００億、１１０億、１２０億、１３０億、１４０億、１５０億個のいずれかのＴ細胞、例えば少なくとも１×１０９個のＴ細胞の単回輸注で投与される。
【0183】
本発明の他の態様は、上述の方法を使用してＨＥＣの集団を生成する際に使用するためのキット及び試薬を提供する。
【0184】
造血性内皮細胞を生産するためのキットは、以下を含み得る；
ＢＭＰを含む第１の中胚葉誘導培地、
ＢＭＰ及びＦＧＦを含む第２の中胚葉誘導培地、
アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む第３の中胚葉誘導培地、
ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第１のＨＥ誘導培地、ならびに
ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２のＨＥ誘導培地。
ＢＭＰを含む第１の中胚葉誘導培地、
ＢＭＰ及びＦＧＦを含む第２の中胚葉誘導培地、
アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む第３の中胚葉誘導培地、
ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第１のＨＥ誘導培地、ならびに
ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２のＨＥ誘導培地。
【0185】
キットは、本明細書に記載されるようなＨＰＣ誘導培地、例えば、（ｉ）ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む造血誘導培地、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及び場合によりＩＬ－７を含む造血誘導培地、または（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストを含む造血誘導培地のうちの１つをさらに含み得る。
【0186】
本発明の別の態様は、造血性内皮細胞の生産のための上述の培養培地のセットまたはキットの使用も提供し、この培地のセットは、以下を含む；
ＢＭＰを含む第１の中胚葉誘導培地、
ＢＭＰ及びＦＧＦを含む第２の中胚葉誘導培地、
アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む第３の中胚葉誘導培地、
ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第１のＨＥ誘導培地、
ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２のＨＥ誘導培地、ならびに、場合により、
本明細書に記載されるようなＨＰＣ誘導培地、例えば、（ｉ）ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む造血誘導培地、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及び場合によりＩＬ－７を含む造血誘導培地、または（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストを含む造血誘導培地のうちの１つ。
ＢＭＰを含む第１の中胚葉誘導培地、
ＢＭＰ及びＦＧＦを含む第２の中胚葉誘導培地、
アクチビン、ＢＭＰ、ＦＧＦ、及びＧＳＫ３阻害剤を含む第３の中胚葉誘導培地、
ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第１のＨＥ誘導培地、
ＳＣＦ、ＶＥＧＦ及びＦＧＦを含む第２のＨＥ誘導培地、ならびに、場合により、
本明細書に記載されるようなＨＰＣ誘導培地、例えば、（ｉ）ＶＥＧＦ及びＳＣＦを含む造血誘導培地、（ｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＧＦ－１、ＩＬ－３、ＩＬ－６、及び場合によりＩＬ－７を含む造血誘導培地、または（ｉｉｉ）ＶＥＧＦ、ＳＣＦ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、Ｆｌｔ３リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－１１、ＩＧＦ－１、ＢＭＰ、ＦＧＦ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、アンギオテンシンＩＩ、及びアンギオテンシンＩＩ １型受容体（ＡＴ１）アンタゴニストを含む造血誘導培地のうちの１つ。
【0187】
好適な培地については、上記でより詳細に説明している。
【0188】
本明細書の他の箇所に記載されているように、培地には有効量の上記の分化因子を補充してもよい。
【0189】
１つ以上の培養培地は、脱イオン蒸留水に配合され得る。１つ以上の培地は、典型的には、汚染を防止するために、例えば紫外線、加熱、照射または濾過によって使用前に滅菌される。１つ以上の培地は、貯蔵または輸送のために（例えば－２０℃または－８０℃で）凍結され得る。
【0190】
１つ以上の培地は、１倍製剤、またはより濃縮された製剤、例えば２倍～２５０倍濃縮された培地製剤であり得る。１倍製剤では、培地中の各成分が、細胞培養を目的とした濃度、例えば上記の濃度である。濃縮製剤では、成分のうちの１つ以上が、細胞培養を目的としたものよりも高い濃度で存在する。濃縮された培養培地は、当技術分野で周知である。培養培地は、塩沈殿または選択的濾過などの公知の方法を使用して濃縮することができる。濃縮された培地は、水（好ましくは脱イオン及び蒸留したもの）または任意の適切な溶液、例えば食塩水溶液、水性バッファーまたは培養培地により、使用のために希釈され得る。
【0191】
キット内の１つ以上の培地は、気密封止容器に含まれ得る。汚染を防止するために、培養培地の輸送または貯蔵には気密封止容器が好ましい場合がある。容器は、フラスコ、プレート、ボトル、瓶、バイアル、またはバッグなど、任意の好適な容器でよい。
【0192】
本発明の他の態様及び実施形態は、上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という用語に置き換えたもの、ならびに上述の態様及び実施形態の「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という用語に置き換えたものを提供する。
【0193】
文脈上別段の解釈を必要としない限り、本願は、上記の態様及び上述の実施形態のいずれかの相互のあらゆる組み合わせを開示するものであることを理解されたい。同様に、本願は、文脈上別段の解釈を必要としない限り、単独で、または他の態様のいずれかと合わせて、好ましい及び／または任意選択の特徴のあらゆる組み合わせを開示する。
【0194】
上記の実施形態の改変形態、さらなる実施形態、及びそれらの改変形態は、本開示を読めば当業者には明らかとなり、したがって、これらは本発明の範囲内にある。
【0195】
別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本開示の方法の実践または試験においては、本明細書に記載されるものと同様または均等な任意の組成物及び方法が使用され得るが、例示的な組成物及び方法を本明細書に記載する。本明細書に記載される開示の態様及び実施形態のいずれも、組み合わせることができる。例えば、本明細書で開示されるいずれかの従属請求項または独立請求項の主題は、多様に組み合わせることができる（例えば、各従属請求項からの１つ以上の記載事項を、それらが依存する独立請求項に基づいて単一の請求項に組み合わせることができる）。
【0196】
本明細書で提供される範囲には、記載されている特定の範囲内のすべての値、及び特定の範囲の端点付近の値が含まれる。本開示の図及び表は、本明細書で開示されるいずれかの方法の要素を構成し得る範囲及び個別の値も表す。本明細書に記載される濃度は、周囲温度及び周囲圧力で決定される。これは例えば、室温での、またはプロセスの流れの特定の部分における温度及び圧力であり得る。好ましくは、濃度は、２０℃及び圧力１ｂａｒの標準的状態で決定される。「約」という用語は、特定の測定値の平均の標準偏差２以内の値を意味する。
【0197】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに異なる記載がない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ペプチド鎖（ａ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃｈａｉｎ）」への言及は、１つ以上のペプチド鎖への言及であり、当業者に知られているその均等物を含む。
【0198】
本明細書で言及されるすべての文書及び配列データベースエントリーは、あらゆる目的のために、それらの全体において参照により本明細書に組み込まれる。
【0199】
本明細書で使用される「及び／または」は、指定された２つの特徴または構成要素の各々の具体的開示であり、他方の有無にかかわらないものとして解釈されるべきである。例えば、「Ａ及び／またはＢ」は、あたかも各々が本明細書で個別に明記されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）Ａ及びＢの各々の具体的開示として解釈されるべきである。
【実施例】
【0200】
方法
ｈｉＰＳＣ培養
組織培養プラスチック器具を使用し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気のインキュベータ内で３７℃にて、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上のｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地（ＳＣＴ）でｉＰＳＣを培養した。酵素溶液Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）による単一細胞懸濁、及び／またはＥＤＴＡ溶液（Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）Ｇｉｂｃｏ（商標））によって、もしくはＥａｓｙＰａｓｓａｇｅツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して手作業で生成できる細胞クラスターの作出を含む、異なる方法でｉＰＳＣを慣例的に継代した。継代方法に応じて、４８時間の培養のための１０ｕＭのＹ２７６３２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地、または培養の最初の２４時間のための１ＸＣｌｏｎｅＲ（ＳＴＣ）に、ある特定の細胞密度で細胞を播種した。分化のために、ｈｉＰＳＣをＳｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に低い細胞密度で継代し、およそ５日間にわたり、５倍の倍率の顕微鏡下で視野当たり１個のｉＰＳＣコロニーを形成させた。
ｈｉＰＳＣ培養
組織培養プラスチック器具を使用し、５％ＣＯ２、５％Ｏ２雰囲気のインキュベータ内で３７℃にて、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上のｍＴｅＳＲｐｌｕｓ培地（ＳＣＴ）でｉＰＳＣを培養した。酵素溶液Ａｃｃｕｔａｓｅ（商標）、ＳｔｅｍＰｒｏ（商標）による単一細胞懸濁、及び／またはＥＤＴＡ溶液（Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）Ｇｉｂｃｏ（商標））によって、もしくはＥａｓｙＰａｓｓａｇｅツール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して手作業で生成できる細胞クラスターの作出を含む、異なる方法でｉＰＳＣを慣例的に継代した。継代方法に応じて、４８時間の培養のための１０ｕＭのＹ２７６３２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を含む培地、または培養の最初の２４時間のための１ＸＣｌｏｎｅＲ（ＳＴＣ）に、ある特定の細胞密度で細胞を播種した。分化のために、ｈｉＰＳＣをＳｙｎｔｈｅｍａｘ ＩＩ－ＳＣ基質（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に低い細胞密度で継代し、およそ５日間にわたり、５倍の倍率の顕微鏡下で視野当たり１個のｉＰＳＣコロニーを形成させた。
【0201】
多能性幹細胞からのＴ細胞の分化
第１段階及び第２段階の分化のために、代替プロトコル及び対照プロトコルを使用した。
第１段階及び第２段階の分化のために、代替プロトコル及び対照プロトコルを使用した。
【0202】
代替プロトコルでは、０日目に、ｈｉＰＳＣ維持培地（ｍＴｅＳＲｐｌｕｓ）を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄した。６ウェルプレートのウェルでは、２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳ（ＳｔｅｍＰｒｏ３４サプリメントを加えたＳｔｅｍＰｒｏ３４基本培地、ならびにグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、及びモノチオグリセロール（１００μＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ））に、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４をさらに補充し、１日間インキュベートした。容量は培養フラスコの表面積に依存し、典型的には１ｃｍ２当たり０．２ｍＬの培地を加える。１日目に、最終濃度がそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬ及び５ｎｇ／ｍＬになるようにｍＬＢＭＰ４及びｍＬｂＦＧＦを補充した１ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳを培地に追加し、１日間インキュベートした（第１段階培地）。２日目に、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、１ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、及び３μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を補充した２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、さらに４８時間培養した。４日目に、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄して、残留していた第１段階のサイトカインを除去した。５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ及び１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、４８時間インキュベートした（第２段階培地）。次いで、６日目に、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦ、及び１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、さらに４８時間インキュベートした（第２段階培地）。
【0203】
対照プロトコルでは、０日目に、ｈｉＰＳＣ維持培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄した。２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＳｔｅｍＰｒｏ３４；サプリメントを加えたＳｔｅｍＰｒｏ３４基本培地、ならびにペニシリンストレプトマイシン（１％ｖ／ｖ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びグルタミン（２ｍＭ：Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍＬ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）及びモノチオグリセロール（１００μＭ：Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）に、５０ｎｇ／ｍＬのアクチビンをさらに補充したもの）を加え、４時間インキュベートした。容量は培養フラスコのサイズに依存し、典型的には少なくとも２ｍＬ／９ｃｍ２、及び２０ｍＬ／１５０ｃｍ２である。４時間後、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄して、残留していた高濃度のアクチビンＡを除去した。５ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、及び５ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充した２ｍＬのＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、４４時間インキュベートした（第１段階培地）。次いで、新鮮な第１段階培地と培地を交換し、１０μＭのＣＨＩＲ－９９０２１を補充し、さらに４８時間培養した。４日目に、培地を除去し、細胞をＤＭＥＭ／Ｆ１２で２回洗浄して、残留していた第１段階のサイトカインを除去した。次いで、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ及び１５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦを補充したＳｔｅｍＰｒｏ３４ ＰＬＵＳと培地を交換し、４８時間インキュベートした（第２段階培地）。次いで、培地に新鮮な第２段階培地を補給し、細胞をさらに４８時間培養した。
【0204】
８日目に、代替プロトコルと対照プロトコルとの両方の培地を、表３に示すＨＥＭ７．２第３段階培地に交換し、細胞を１１～１４日目まで培養したか（代替プロトコル）、または１６～１８日目まで培養し（対照プロトコル）、１０日目には容器に２倍の培地を入れ、１２日目から４８時間ごとに培地の半供給（１：１（ｖ／ｖ））を行い、懸濁液中の細胞を収集した。典型的には、これには、培地を採取し、遠心分離（３００ｇで１０分）により懸濁液中の細胞を収集し、懸濁細胞を新鮮培地（すなわち０．２ｍｌ／ｃｍ２）での培養に戻すことが含まれた。
【0205】
およそ１１日目から１７日目に、ｈｉＰＳＣ株及び使用したアプローチに応じて、得られた単層から、（採取日の前にフローサイトメトリーによって別々に確認された）ＣＤ３４＋またはＣＤ３４＋ＣＤ７＋細胞を、その後の培養のために単離した。ＣＤ３４＋細胞を、コラゲナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ：２ｍｇ／ｍＬ、３７℃で３０分間）、次にＡｃｃｕｔａｓｅ（ＳＣＴ：３７℃で３０分間）と共に順次インキュベートすることによって採取した。細胞懸濁液を収集し、洗浄し（ＤＭＥＭ／Ｆ１２中、３００ｇで１２分間の遠心分離２回）、その後、磁気活性化ビーズ（ＭＡＣＳ）単離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ：製造元の説明書に従った）によるＣＤ３４＋細胞の単離を行った。
【0206】
ＣＤ３４＋細胞のＭＡＣＳ単離後、これらをＣＳ１０（ＳＣＴ）中で１×１０６細胞／バイアルにて、まず－８０℃で制御された凍結速度において、次いで長期貯蔵のために液体窒素で凍結保存した。
【0207】
持続的なリンパ系の増殖及び分化のために、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ独自の２段階（リンパ系増殖／Ｔ細胞成熟）培地を用いた（製造元の説明書に従った）。
【0208】
結果
クラスターまたは単一細胞として継代したｉＰＳＣ（手作業またはＡｃｃｕｔａｓｅ継代細胞）は、代替プロトコルでは、対照プロトコルよりも増加したＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）及びＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞（ＨＰＣ）の収量を示した（図３及び４）。代替プロトコルは、第４段階（ＨＰＣからｐｒｏ－Ｔ細胞への分化）の終了時に、対照プロトコルよりも増加した収量の前駆Ｔ細胞を生成することも分かった（図５）。６日目までに、代替プロトコルのＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）の表現型は、対照プロトコルのＣＤ３４＋細胞と比して向上したことが観察され、造血系列を示すＣＤ４３＋を発現する細胞の数は増加し、内皮系列を示すＣＤ７３を発現する細胞の数は低減した（図６）。
クラスターまたは単一細胞として継代したｉＰＳＣ（手作業またはＡｃｃｕｔａｓｅ継代細胞）は、代替プロトコルでは、対照プロトコルよりも増加したＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）及びＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞（ＨＰＣ）の収量を示した（図３及び４）。代替プロトコルは、第４段階（ＨＰＣからｐｒｏ－Ｔ細胞への分化）の終了時に、対照プロトコルよりも増加した収量の前駆Ｔ細胞を生成することも分かった（図５）。６日目までに、代替プロトコルのＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）の表現型は、対照プロトコルのＣＤ３４＋細胞と比して向上したことが観察され、造血系列を示すＣＤ４３＋を発現する細胞の数は増加し、内皮系列を示すＣＤ７３を発現する細胞の数は低減した（図６）。
【0209】
Ｖｅｒｓｅｎｅ（商標）溶液を使用してｉＰＳＣをクラスターとして継代すると、代替プロトコルは、対照プロトコルよりも３倍多くのＣＤ３４＋細胞（ＨＥＣ）及び１４倍多くのＣＤ３４＋ＣＤ４５＋細胞（ＨＰＣ）を生成することが分かった（図７Ａ）。前駆Ｔ細胞の増殖も増加することが分かった（図７Ｂ）。
【0210】
ｅＦ１ａ－ＴＣＲ＋編集ｉＰＳＣ細胞株の分化についても、代替プロトコルを使用して試験した。ｅＦ１ａ－ＴＣＲ＋編集ｉＰＳＣ細胞株は、代替プロトコルを使用すると、活性のあるヒト造血性内皮を生成することが観察された（図８）。ＨＥから出現する丸い浮遊細胞（ＨＳＰＣ）の数は、代替プロトコル（図９）では、対照プロトコルと比較して増加した。代替プロトコルによって生成されたＣＤ３４＋前駆細胞は、対照プロトコルと比較して向上した生存率を示すことが分かった（図１０）。代替プロトコルを使用した場合、対照プロトコルと比較して、面積当たりの標的細胞の収量及び総収量における有意な増加が観察された（図１２）。代替プロトコルは、より高いレベルのＣＤ７３を有する高ＣＤ３４＋細胞を生成する対照プロトコルと比較すると、ＣＤ７３内皮マーカーの発現がなく、主に低ＣＤ３４＋細胞を生成することも分かった（図１３）。両方のプロトコルで生成されたＣＤ３４＋からのＴ前駆細胞の表現型は類似していた（図１４）。リンパ系細胞の収量は、対照プロトコルで生成されたＣＤ３４＋細胞と比較して、代替プロトコルで生成されたＣＤ３４＋細胞からの方が高いことが分かった。
【0211】
要約すると、代替プロトコルは、（ｉ）第２段階のＣＤ３４＋細胞の総収量及び純度、（ｉｉ）第３段階のＣＤ３４＋ＣＤ４５＋二重陽性細胞（ＤＰ）及びＣＤ７＋細胞の収量、ならびに（ｉｉｉ）第３段階の終了時の細胞生存率を増加させることが分かった。代替プロトコルは、第２段階及び第３段階のＣＤ７３発現を低減させることが分かり、このことは、細胞において、造血細胞を生成する能力を有するＨＥがより豊富であることを示している。
【表1】
【表2】
【表3】
【表4】
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14-1】
【図14-2】
【図15】
【国際調査報告】