特表 2024-507536 複数の臓器の移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの検出方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-20

(54)【発明の名称】複数の臓器の移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの検出方法

(51)【国際特許分類】

   C12Q 1/68 20180101AFI20240213BHJP

   C12Q 1/6844 20180101ALN20240213BHJP

   C12Q 1/6853 20180101ALN20240213BHJP

【ＦＩ】

C12Q1/68

C12Q1/6844

C12Q1/6853

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550565

(86)(22)【出願日】2022-02-24

(85)【翻訳文提出日】2023-10-04

(86)【国際出願番号】 US2022017707

(87)【国際公開番号】W WO2022182878

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/153,800

(32)【優先日】2021-02-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＰＹＴＨＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】513156537

【氏名又は名称】ナテラ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(72)【発明者】

【氏名】デムコ，ザカリー

(72)【発明者】

【氏名】アフメッド，エバド

(72)【発明者】

【氏名】スウェナートン，ライアン

(72)【発明者】

【氏名】ヴァン フムレン，ポール

【テーマコード（参考）】

4B063

【Ｆターム（参考）】

4B063QA01

4B063QA13

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ42

4B063QR40

4B063QR62

4B063QR72

4B063QS25

4B063QS36

(57)【要約】

本開示は、ＤＮＡを増幅及び配列決定する方法を提供し、本方法は、複数の臓器の同時移植又は順次移植を含む１つ以上の臓器の移植を受けている移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、２００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを得て、配列決定リードに基づいて、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の量が、移植拒絶反応又は移植傷害を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを決定することと、を含む。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ＤＮＡを増幅及び配列決定する方法であって、
（ａ）１つ以上の臓器の移植を受けている移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、前記抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、
（ｂ）２００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座で標的増幅を行うことであって、前記標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、
（ｃ）前記増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを得て、前記配列決定リードに基づいて、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、
（ｄ）前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応又は移植傷害を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを決定することと、を含む、方法。

【請求項2】

前記移植レシピエントが、ヒト対象である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記移植レシピエントが、膵臓、腎臓、肝臓、心臓、腸管、胸腺、及び子宮から選択される複数の移植された臓器を受けている、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記１つ以上の移植された臓器が、同じ移植ドナー由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記１つ以上の移植された臓器が、異なる移植ドナー由来である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項6】

前記移植レシピエントが、２つ以上の臓器の同時移植を受けている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記移植レシピエントが、２つ以上の臓器の順次移植を受けている、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記移植レシピエントが、腎臓及び膵臓の同時移植（ＳＰＫ）を受けている、請求項６に記載の方法。

【請求項9】

前記移植レシピエントが、腎臓及び肝臓の同時移植、腎臓及び心臓の同時移植、腎臓及び肺の同時移植、膵臓及び肝臓の同時移植、又は心臓及び肺の同時移植を受けている、請求項６に記載の方法。

【請求項10】

前記カットオフ閾値が、全無細胞ＤＮＡのうちのドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記カットオフ閾値が、ドナー由来無細胞ＤＮＡのコピー数又はその機能である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記カットオフ閾値が、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量のセットである、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記カットオフ閾値が、ドナー由来無細胞ＤＮＡの設定濃度である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

前記標的増幅が、ＰＣＲを含み、前記２００～５０，０００のプライマー対が、順方向ＰＣＲプライマー及び逆方向ＰＣＲプライマーを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記標的増幅が、１，０００～１０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において１，０００～１０，０００の標的遺伝子座で標的増幅を行って、増幅産物を得ることを含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記標的遺伝子座が、一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

高スループット配列決定を行う前に、前記増幅産物にタグを付着させることを更に含み、前記タグが、配列決定適合性アダプターを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

標的増幅を行う前に、前記抽出された無細胞ＤＮＡにタグを付着させることを更に含み、前記タグが、増幅のためのアダプターを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記タグが、試料特異的バーコードを含み、前記方法が、高スループット配列決定の前に、複数の試料からの前記増幅産物をプールすることと、前記高スループット配列決定の間に、単一の実行で前記増幅産物のプールを一緒に配列決定することと、を更に含む、請求項１７又は１８に記載の方法。

【請求項20】

同じ移植レシピエントについてステップ（ａ）～（ｄ）を長期的に繰り返すことと、前記移植レシピエントにおける前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的な変化を決定することと、を更に含む、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項21】

前記移植レシピエントにおける前記ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の前記長期的な変化に基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記方法が、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

移植傷害及び／又は移植拒絶反応の迅速な検出は、同時多臓器移植又は順次移植のいずれかによる、複数の臓器の移植レシピエントにとって依然として課題である。従来の生検ベースの検査は、侵襲性で高価であり、移植傷害及び／又は移植拒絶反応の診断の遅れにつながる可能性がある。

【発明の概要】

【発明が解決しようとする課題】

【0002】

したがって、従来の生検ベースの検査よりも感度が高く、より特異的な多臓器の移植レシピエントに対する非侵襲性の移植拒絶反応の検査が必要とされている。

【課題を解決するための手段】

【0003】

本発明は、ＤＮＡを増幅及び配列決定する方法に関し、複数の臓器の同時移植又は順次移植を含む１つ以上の臓器の移植を受けている移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、２００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して配列決定リードを得、配列決定リードに基づいて、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応又は移植傷害を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを決定することと、を含む。

【発明を実施するための形態】

【0004】

Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｋｉｄｎｅｙ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｉｎｊｕｒｙ ｂｙ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ ｖｉａ Ｍａｓｓｉｖｅｌｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ」，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ－Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題され、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４０６０３として２０１９年７月３日に出願されたＷＯ２０２０／０１０２５５は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0005】

「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題され、２０２０年５月２９日に出願された米国仮出願第６３／０３１，８７９号は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0006】

本発明は、複数の臓器の同時移植又は順次移植を含む１つ以上の臓器の移植を受けている移植レシピエントの生体試料から抽出された無細胞ＤＮＡを増幅及び配列決定する方法に関し、これは、移植拒絶反応又は移植傷害を決定するのに有用である。いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）移植レシピエントの血液、血漿、血清、又は尿試料から無細胞ＤＮＡを抽出することであって、抽出された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、（ｂ）２００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において２００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、（ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して配列決定リードを得、配列決定リードに基づいて、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、（ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能が、移植拒絶反応又は移植傷害を示すカットオフ閾値を超えているかどうかを決定することと、を含む。

【0007】

いくつかの実施形態において、移植ドナーは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植ドナーは、非ヒト哺乳動物対象（例えば、ブタ）である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒト対象である。

【0008】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、膵臓、腎臓、肝臓、心臓、腸、胸腺、造血細胞、及び子宮を含むがこれらに限定されない、１つ以上の移植された臓器を受けている。

【0009】

いくつかの実施形態において、複数の臓器は、同じ移植ドナーに由来する。いくつかの実施形態において、複数の臓器は、異なる移植ドナーに由来する。

【0010】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、複数の臓器の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、複数の臓器の順次移植を受けている。

【0011】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び膵臓（ＳＰＫ）の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び膵臓（ＰＡＫ）の順次移植を受けている。

【0012】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び肝臓の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び心臓の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び肺の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、膵臓及び肝臓の同時移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、心臓及び肺の同時移植を受けている。

【0013】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び肝臓の順次移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び心臓の順次移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓及び肺の順次移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、膵臓及び肝臓の順次移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、心臓及び肺の順次移植を受けている。

【0014】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、全無細胞ＤＮＡの量のうちドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージ、例えば、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％である。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、移植される臓器の種類に従って調整される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、移植される臓器の数に従って調整される。

【0015】

いくつかの実施形態において、腎臓移植を受けている移植レシピエントのカットオフ閾値は、全無細胞ＤＮＡの量のうちのドナー由来無細胞ＤＮＡの量の１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％である。

【0016】

いくつかの実施形態において、心臓移植を受けている移植レシピエントのカットオフ閾値は、全無細胞ＤＮＡの量のうちドナー由来無細胞ＤＮＡの量の０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％である。

【0017】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能である。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの相対量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの相対量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、移植レシピエントの体重、ＢＭＩ、又は血液量を乗じた又は除した、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの相対量又は絶対量として表される。

【0018】

いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％）及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対量（コピー／ｍＬ）の両方を組み合わせる２閾値アルゴリズムは、特にｃｆＤＮＡレベルが高い場合における検出の改善を通して、試験感度を改善することを目的として適用される。いくつかの実施形態において、新しい２閾値アルゴリズムでは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率カットオフは、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、又は０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１．０％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、又は２．０％であり、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量カットオフは、１０ｃｐ／ｍＬ、又は１５ｃｐ／ｍ、又は２０ｃｐ／ｍＬ、又は２５ｃｐ／ｍＬ、又は３０ｃｐ／ｍＬ、又は３５ｃｐ／ｍＬ、又は４０ｃｐ／ｍＬ、又は４５ｃｐ／ｍＬ、又は５０ｃｐ／ｍＬ、又は６０ｃｐ／ｍＬ、又は７０ｃｐ／ｍＬ、又は８０ｃｐ／ｍＬ、又は９０ｃｐ／ｍＬ、又は１００ｃｐ／ｍＬ、又は１１０ｃｐ／ｍＬ、又は１２０ｃｐ／ｍＬ、又は１３０ｃｐ／ｍＬ、又は１４０ｃｐ／ｍＬ、又は１５０ｃｐ／ｍＬである。いくつかの実施形態において、いずれかの閾値を超える試料は、ＡＲ又は移植傷害のリスクが高いとみなされた。いくつかの実施形態において、両方の閾値を超える試料は、ＡＲ又は移植傷害のリスクが高いとみなされた。

【0019】

いくつかの実施形態において、標的増幅は、ＰＣＲを含み、プライマー対は、２００～５０，０００、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００対の順方向及び逆方向ＰＣＲプライマーを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、増幅産物を得るために、５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００，又は２０，０００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～２０，０００、又は１，０００～１０，０００、又は２００～５００、又は５００～１，０００、又は１，０００～２，０００、又は２，０００～５，０００、又は５，０００～１０，０００、又は１０，０００～２０，０００、又は２０，０００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことを含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、標的遺伝子座は、一塩基多型（ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）（ＳＮＰ）を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、本方法は、高スループット配列決定を行う前に、増幅産物にタグを付着させることを更に含み、タグが、配列決定適合性アダプターを含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅を行う前に、抽出された無細胞ＤＮＡにタグを付着させることを更に含み、タグが、増幅のためのアダプターを含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、タグは、試料特異的バーコードを含み、本方法は、高スループット配列決定の前に複数の試料からの増幅産物をプールすることと、高スループット配列決定の間に単一の実行で増幅産物のプールを一緒に配列決定することと、を更に含む。

【0024】

いくつかの実施形態において、本方法は、同じ移植レシピエントについてステップ（ａ）～（ｄ）を長期的に繰り返すことと、当該移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的な変化を決定することと、を更に含む。

【0025】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量又はその機能の長期的な変化に基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡ又はその機能の量の増加を考慮して、免疫抑制療法を増加させることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントにおけるドナー由来無細胞ＤＮＡ又はその機能の量の減少を考慮して、免疫抑制療法を減少させることを更に含む。

【0026】

いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナーの遺伝子型を決定することを含まない。

【0027】

本明細書に記載される方法は、全てのタイプの移植拒絶反応又は移植傷害を非常に正確に評価する。２つ以上の採血管を含み得る単一の採血から、本明細書に記載される方法の特定の実施形態は、患者の血液中の複数の移植された臓器からのドナーｃｆＤＮＡの量を測定する。多数の一塩基多型（ＳＮＰ）（例えば、１３，０００超のＳＮＰ）及び高度なバイオインフォマティクスを使用して、これらの実施形態は、ドナー及びレシピエントｃｆＤＮＡを差別化して、移植レシピエントの血液中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ、又はドナー由来無細胞ＤＮＡの量、又はその機能などの結果を提供することができる。

【0028】

いくつかの実施形態において、例えば、トレーサーＤＮＡ、又は内部キャリブレーションＤＮＡは、以下のうちの１つ以上が事前に知られているＤＮＡの組成物を指す：長さ、配列、ヌクレオチド組成、量、又は生物学的起源。トレーサーＤＮＡは、ヒト対象に由来する生体試料に添加して、当該試料中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するのに役立てることができる。また、生体試料自体以外の反応混合物に添加することもできる。

【0029】

いくつかの実施形態において、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）は、同じ種の２つのメンバーのゲノム間で異なり得る単一ヌクレオチドを指す。この用語の使用は、各バリアントが生じる頻度のいかなる制限も意味しない。

【0030】

いくつかの実施形態において、例えば、配列は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ配列又は遺伝子配列を指す。これは、個体におけるＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子又は鎖の一次物理的構造を指し得る。これは、そのＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子内に見出されるヌクレオチドの配列、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子に対する相補鎖を指し得る。これは、コンピュータでのその表現としてのＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子に含まれる情報を指し得る。

【0031】

いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子座は、個体のＤＮＡ若しくはＲＮＡ上の特定の目的領域を指し、１つ以上のＳＮＰ、可能性のある挿入若しくは欠失の部位、又はいくつかの他の関連する遺伝子変異の部位を含むが、これらに限定されない。疾患関連ＳＮＰはまた、疾患関連遺伝子座を指し得る。

【0032】

いくつかの実施形態において、例えば、多型対立遺伝子、別名「多型遺伝子座」は、遺伝子型が所与の種内の個体間で変化する対立遺伝子又は遺伝子座を指す。多型対立遺伝子のいくつかの例としては、一塩基多型（ＳＮＰ）、短いタンデム反復、欠失、重複及び反転が挙げられる。

【0033】

いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子は、特定の遺伝子座を占めるヌクレオチド又はヌクレオチド配列を指す。

【0034】

いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子データ、別名「遺伝子型データ」は、１つ以上の個体のゲノムの態様を記述するデータを指す。これは、遺伝子座の１つ又は１セット、部分的又は全体的な配列、部分的又は全体的な染色体、又はゲノム全体を指し得る。これは、１つ又は複数のヌクレオチドの同一性を指し得、これは、一連の連続したヌクレオチド、又はゲノム内の異なる位置からのヌクレオチド、又はそれらの組み合わせを指し得る。遺伝子型データはコンピュータ上であるが、配列中の物理的ヌクレオチドを化学的にコードされた遺伝子データとみなすことも可能である。遺伝子型データは、個体「に関する」、個体「の」、個体「での」、個体「からの」又は個体「に関する」と言うことができる。遺伝子型データは、遺伝物質に対してこれらの測定が行われる遺伝子型決定プラットフォームからの出力測定を指し得る。

【0035】

いくつかの実施形態において、例えば、遺伝物質、別名「遺伝子試料」は、核酸（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡを含む）を含む１つ以上の個体からの、組織又は血液などの物理的物質を指す

【0036】

いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子データは、１つ以上の対立遺伝子のセットに関する遺伝子型データのセットを指す。これは、段階的なハプロタイプのデータを指し得る。これは、ＳＮＰ同一性を指し得、挿入、欠失、反復及び変異を含む、核酸の配列データを指し得る。

【0037】

いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子状態とは、１つ以上の対立遺伝子のセットにおける遺伝子の実際の状態を指す。これは、対立遺伝子データによって説明される遺伝子の実際の状態を指し得る。

【0038】

いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子の比率又は対立遺伝子比率は、試料又は個体中に存在する遺伝子座における各対立遺伝子の量間の比率を指す。試料が配列決定によって測定された場合、対立遺伝子の比率は、遺伝子座における各対立遺伝子にマッピングする配列リードの比率を指し得る。試料が強度ベースの測定方法によって測定された場合、対立遺伝子比率は、測定方法によって推定される、その遺伝子座に存在する各対立遺伝子の量の比率を指し得る。

【0039】

いくつかの実施形態において、例えば、対立遺伝子数は、特定の遺伝子座にマッピングする配列の数を指し、その遺伝子座が多型である場合、対立遺伝子の各々にマッピングする配列の数を指す。各対立遺伝子がバイナリ方式でカウントされる場合、対立遺伝子数は整数となる。対立遺伝子が確率的にカウントされる場合、対立遺伝子数は、分数であってもよい。

【0040】

いくつかの実施形態において、例えば、プライマー、別名「ＰＣＲプローブ」は、ＤＮＡ分子が同一又はほぼ同一であり、プライマーが標的多型遺伝子座にハイブリダイズするように設計された領域を含み、ＰＣＲ増幅などの増幅を可能にするように設計されたプライミング配列を含む、単一のＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）又はＤＮＡ分子（ＤＮＡオリゴマー）の集合体を指す。プライマーはまた、分子バーコードを含んでいてもよい。プライマーは、個々の分子ごとに異なるランダム領域を含んでいてもよい。

【0041】

いくつかの実施形態において、例えば、ハイブリッド捕捉プローブは、ＰＣＲ又は直接合成などの様々な方法によって生成され、試料中の特定の標的ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の１つの鎖に相補的であることを意図している、場合によっては修飾された任意の核酸配列を指す。外因性ハイブリッド捕捉プローブを調製した試料に添加し、変性－アニールプロセスを通じてハイブリダイゼーションして、外因性－内因性断片の二本鎖を形成してもよい。次いで、これらの二本鎖は、様々な手段によって試料から物理的に分離され得る。

【0042】

いくつかの実施形態において、例えば、配列リードは、クローン配列決定方法を使用して測定した、ヌクレオチド塩基の配列を表すデータを指す。クローン配列決定は、単一の、又はクローンの、又はクラスターの１つの元のＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子を表す配列データを生成し得る。配列リードはまた、ヌクレオチドが正しく呼び出された可能性を示す配列の各塩基位置に、関連する品質スコアを有し得る。

【0043】

いくつかの実施形態において、例えば、配列リードをマッピングすることは、特定の生物のゲノム配列における配列リードの起点の位置を決定するプロセスである。配列リードの起点の位置は、リード及びゲノム配列のヌクレオチド配列の類似性に基づく。

【0044】

いくつかの実施形態において、例えば、ドナー起源のＤＮＡ又はＲＮＡとは、元々遺伝子型が移植ドナーのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡ又はＲＮＡを指す。ドナーは、ヒト又は非ヒト哺乳動物（例えば、ブタ）であり得る。

【0045】

いくつかの実施形態において、例えば、レシピエント起源のＤＮＡ又はＲＮＡとは、元々遺伝子型が移植レシピエントのものと本質的に同等であった細胞の一部であったＤＮＡ又はＲＮＡを指す。

【0046】

いくつかの実施形態において、例えば、移植レシピエント血漿とは、同種移植片又は異種移植片を受けている患者、例えば、臓器移植レシピエントの女性からの血液の血漿部分を指す。

【0047】

いくつかの実施形態において、例えば、遺伝子座に対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡの優先的濃縮、又は遺伝子座におけるＤＮＡ若しくはＲＮＡの優先的濃縮とは、遺伝子座に対応する濃縮前ＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物中のＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のパーセンテージよりも高い、遺伝子座に対応する濃縮後ＤＮＡ若しくはＲＮＡ混合物中のＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のパーセンテージをもたらす任意の技術を指す。この技術は、遺伝子座に対応するＤＮＡ又はＲＮＡ分子の選択的増幅を含んでもよい。この技術は、遺伝子座に対応しないＤＮＡ又はＲＮＡ分子を除去することを含んでもよい。この技術は、方法の組み合わせを含んでもよい。濃縮度は、遺伝子座に対応する濃縮後混合物中のＤＮＡ又はＲＮＡ分子のパーセンテージを、遺伝子座に対応する濃縮前混合物中のＤＮＡ又はＲＮＡ分子のパーセンテージで割ったものとして定義される。優先的濃縮は、複数の遺伝子座で行われてもよい。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２０を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２００を超える。本開示のいくつかの実施形態において、濃縮度は２，０００を超える。優先的濃縮が複数の遺伝子座で行われる場合、濃縮度は、遺伝子座のセット中の全ての遺伝子座の平均濃縮度を指し得る。

【0048】

いくつかの実施形態において、例えば、増幅とは、ＤＮＡ又はＲＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指す。

【0049】

いくつかの実施形態において、例えば、選択的増幅とは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の領域に対応する、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の分子、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子のコピー数を増加させる技術を指し得る。また、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの非標的分子又は領域を増加させるよりも、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの特定の標的化分子、又はＤＮＡ若しくはＲＮＡの標的化領域のコピー数を増加させる技術を指し得る。選択的増幅は、優先的濃縮方法であり得る。

【0050】

いくつかの実施形態において、例えば、ユニバーサルプライミング配列とは、例えば、ライゲーション、ＰＣＲ、又はライゲーション媒介ＰＣＲによって標的ＤＮＡ分子の集団に付加され得るＤＮＡ配列を指す。標的分子の集団に加えられると、ユニバーサルプライミング配列に特異的なプライマーを使用して、単一の増幅プライマー対を使用して標的集団を増幅することができる。ユニバーサルプライミング配列は、標的配列に関連する必要はない。

【0051】

いくつかの実施形態において、例えば、ユニバーサルアダプター、又は「ライゲーションアダプター」若しくは「ライブラリタグ」とは、標的二本鎖ＤＮＡ分子の集団の５’末端及び３’末端に共有結合することができるユニバーサルプライミング配列を含むＤＮＡ分子である。アダプターの添加は、ＰＣＲ増幅が行われ得る標的集団の５’末端及び３’末端にユニバーサルプライミング配列を提供し、単一の増幅プライマー対を使用して、標的集団由来の全ての分子を増幅する。

【0052】

いくつかの実施形態において、例えば、標的化とは、ＤＮＡ若しくはＲＮＡの混合物中の遺伝子座のセットに対応するＤＮＡ若しくはＲＮＡの分子を選択的に増幅するか又は別様に優先的に濃縮するために使用される方法を指す。

【0053】

移植拒絶反応又は移植傷害を監視するためのドナー由来無細胞ＤＮＡの分析
一態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の量を定量する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含み、各プライマー対が、１００ｂｐ以下の標的配列を増幅するように設計される、行うことと、増幅産物中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む。

【0054】

別の態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の量を定量する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、抽出ステップが、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む。

【0055】

別の態様において、本発明は、移植レシピエントの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）を検出する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、本方法は、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことを更に含む。いくつかの実施形態において、ユニバーサル増幅は、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する。

【0057】

いくつかの実施形態において、移植ドナーは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植ドナーは、非ヒト哺乳動物対象（例えば、ブタ）である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。

【0058】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、臓器移植、組織移植、細胞移植、及び流体移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、造血細胞、及び輸血から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。

【0059】

いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡの合計に対するドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを決定することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液試料の体積単位当たりのドナー由来無細胞ＤＮＡの量を決定することを含む。

【0060】

いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの定量された量を使用して、移植の活性拒絶反応（ａｃｔｉｖｅ ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ）の発生又は発生の可能性を検出することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。

【0061】

いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、７５ｂｐ以下の標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。

【0062】

いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも２，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも５，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１０，０００の多型遺伝子座で増幅することを含む。

【0063】

いくつかの実施形態において、方法は、多型遺伝子座である標的遺伝子座における１つ以上の対立遺伝子の量を測定することを更に含む。いくつかの実施形態において、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座は、単一反応において増幅される。

【0064】

いくつかの実施形態において、定量ステップは、マイクロアレイを使用して増幅された標的遺伝子座を検出することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、マイクロアレイを使用することを含まない。

【0065】

いくつかの実施形態において、標的増幅は、（ｉ）少なくとも５００～５０，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも５００～５０，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル又はタグ特異的プライマー５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座を同時に増幅することを含む。

【0066】

更なる態様において、本発明は、移植レシピエント内の移植拒絶反応又は移植傷害の尤度を決定する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含み、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が多いほど、移植拒絶反応又は移植傷害の尤度が高いことを示す。

【0067】

更なる態様において、本発明は、移植レシピエント内の移植が急性拒絶反応を起こしていると診断する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含み、１％超（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）の量のｄｄ－ｃｆＤＮＡは、移植が急性拒絶反応を起こしていることを示す。

【0068】

いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。

【0069】

いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。

【0070】

更なる態様において、本発明は、対象における免疫抑制療法を監視する方法に関し、本方法は、移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、抽出されたＤＮＡのユニバーサル増幅を行うことと、５００～５０，０００のプライマー対を使用して、単一反応体積において５００～５０，０００の標的遺伝子座での標的増幅を行うことであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む、行うことと、増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定することと、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含み、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化が、移植状態を示す。

【0071】

いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。

【0072】

いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化がないこと又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。

【0073】

いくつかの実施形態において、１％を超える（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が、急性拒絶反応を起こしていることを示す。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。

【0074】

いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。

【0075】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナー及び／又は移植レシピエントの遺伝子型を決定することを含まない。

【0076】

いくつかの実施形態において、本方法は、多型遺伝子座である標的遺伝子座における１つ以上の対立遺伝子の量を測定することを更に含む。

【0077】

いくつかの実施形態において、標的遺伝子座は、少なくとも１，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも２，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも５，０００の多型遺伝子座、又は少なくとも１０，０００の多型遺伝子座を含む。

【0078】

いくつかの実施形態において、約５０～１００ｂｐ長、又は約５０～９０ｂｐ長、又は約６０～８０ｂｐ長、又は約６０～７５ｂｐ長、又は約６５ｂｐ長のアンプリコンにおいて増幅される標的遺伝子座。

【0079】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、膵島細胞移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、心臓弁移植、又は皮膚移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。

【0080】

いくつかの実施形態において、抽出ステップは、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、白血球の破裂から配置レシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を更に含む。

【0081】

いくつかの実施形態において、ユニバーサル増幅ステップは、破裂した白血球から放出されるレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する。

【0082】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植後に移植レシピエントから複数の生体試料を長期的に採取することと、採取した各試料についてステップ（ａ）～（ｅ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントからの血液試料を、約３ヶ月、又は約６ヶ月、又は約１２ヶ月、又は約１８ヶ月、又は約２４ヶ月などの期間にわたって採取及び分析することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから、約１週間、又は約２週間、又は約３週間、又は約１ヶ月、又は約２ヶ月、又は約３ヶ月などの間隔で血液試料を採取することを含む。

【0083】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間を用いて非ＡＲに対する急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の感度を有する。

【0084】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で非ＡＲ対するＡＲを同定する際に、少なくとも６０％、又は少なくとも６５％、又は少なくとも７０％、又は少なくとも７５％、又は少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％の特異性を有する。

【0085】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で非ＡＲ対するＡＲを同定する際に、少なくとも０．８、又は０．８５、又は少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５の曲線下面積（ＡＵＣ）を有する。

【0086】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間で正常で安定した同種移植片（ＳＴＡ）に対するＡＲを同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の感度を有する。

【0087】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間でＳＴＡに対するＡＲを同定する際に、少なくとも８０％、又は少なくとも８５％、又は少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の特異性を有する。

【0088】

いくつかの実施形態において、本方法は、１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値及び９５％の信頼区間でＳＴＡに対するＡＲを同定する際に、少なくとも０．８、又は０．８５、又は少なくとも０．９、又は少なくとも０．９５、又は少なくとも０．９８、又は少なくとも０．９９のＡＵＣを有する。

【0089】

いくつかの実施形態において、本方法は、０．５％以下のブランク上限（ＬｏＢ）、及び０．５％以下の検出限界（ＬｏＤ）によって決定される感度を有する。いくつかの実施形態において、ＬｏＢは、０．２３％以下であり、ＬｏＤは、０．２９％以下である。いくつかの実施形態において、感度は、定量限界（ＬｏＱ）によって更に決定される。いくつかの実施形態において、ＬｏＱは、ＬｏＤの１０倍であり、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも５倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．５倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．２倍大きくてもよく、ＬｏＱは、ＬｏＤよりも１．１倍大きくてもよく、又はＬｏＱは、ＬｏＤ以上でもよい。いくつかの実施形態において、ＬｏＢは、０．０４％以下であり、ＬｏＤは、０．０５％以下であり、かつ／又はＬｏＱは、ＬｏＤに等しい。

【0090】

いくつかの実施形態において、本方法は、対応するスパイク試行レベルの関数として、測定されたドナー分率の線形回帰分析から得られた線形性値を評価することによって決定される精度を有し、線形性値が、Ｒ２値であり、Ｒ２値が、約０．９８～約１．０である。いくつかの実施形態において、Ｒ２値は、０．９９９である。いくつかの実施形態において、本方法は、スロープ値及びインターセプト値を計算するために、対応する試行スパイクレベルの関数として、測定されたドナー分率に対して線形回帰を使用することによって決定される精度を有し、スロープ値が、約０．９～約１．２であり、インターセプト値が、約－０．０００１～約０．０１である。いくつかの実施形態において、スロープ値は、約１であり、インターセプト値は、約０である。

【0091】

いくつかの実施形態において、本方法は、変動係数（ＣＶ）を計算することによって決定される精度を有し、ＣＶが、約１０．０％未満である。ＣＶは、約６％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約４％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約２％未満である。いくつかの実施形態において、ＣＶは、約１％未満である。

【0092】

いくつかの実施形態において、ＡＲは、抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）である。いくつかの実施形態において、ＡＲは、Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）である。いくつかの実施形態において、ＡＲは、急性細胞性拒絶反応（ＡＣＲ）である。

【0093】

本明細書において、移植レシピエントからの試料中の移植ドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の検出方法が更に開示される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、移植レシピエントは、哺乳動物である。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒトである。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、膵島細胞移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、骨髄移植、心臓弁移植、又は皮膚移植から選択される移植を受けている。いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ＳＰＫ移植を受けている。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントに対して、移植手術の日、又は移植手術後、移植手術の最大１年後に行われてもよい。

【0094】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエントの血液試料からドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の標的遺伝子座を増幅する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、を含む。

【0095】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエントからの血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）を検出する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）増幅された標的遺伝子座を標的遺伝子座に特異的にハイブリダイズするプローブと接触させることと、ｅ）標的遺伝子座とプローブとの結合を検出し、それによって、血液試料内のｄｄ－ｃｆＤＮＡを検出することと、を含む。いくつかの実施形態において、プローブは、検出可能なマーカーで標識される。

【0096】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエント内の移植拒絶反応の尤度を決定する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が多いほど、移植拒絶反応の尤度が高いことを示す。

【0097】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、移植レシピエント内の移植が急性拒絶反応を起こしていると診断する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、１％超（又は１．１％、又は１．２％、又は１．３％、又は１．４％、又は１．５％、又は１．６％、又は１．７％、又は１．８％、又は１．９％、又は２．０％）の量のｄｄ－ｃｆＤＮＡは、移植が急性拒絶反応を起こしていることを示す。

【0098】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、移植拒絶反応は、抗体媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、移植拒絶反応は、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応である。いくつかの実施形態において、１％未満（又は０．９％、又は０．８％、又は０．７％、又は０．６％、又は０．５％）のｄｄ－ｃｆＤＮＡの量は、移植が境界性拒絶反応を起こしているか、他の損傷を受けているか、又は安定しているかのいずれかを示す。

【0099】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示されるのは、対象における免疫抑制療法を監視する方法であり、本方法は、ａ）移植レシピエントの血液試料からＤＮＡを抽出することであって、ＤＮＡが、移植細胞及び移植レシピエントの両方に由来する無細胞ＤＮＡを含む、抽出することと、ｂ）標的遺伝子座での抽出されたＤＮＡを濃縮することであって、標的遺伝子座が、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座を含む５０～５０００の標的遺伝子座を含む、濃縮することと、ｃ）標的遺伝子座を増幅することと、ｄ）レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することと、を含み、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化が、移植状態を示す。いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応を示し、免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。

【0100】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、標的遺伝子座は、約５０～１００ｂｐ長、又は約６０～８０ｂｐ長のアンプリコンで増幅される。いくつかの実施形態において、アンプリコンは、約６５ｂｐ長である。

【0101】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、レシピエント血液試料中の移植ＤＮＡの量及びレシピエントＤＮＡの量を測定することを更に含む。

【0102】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、移植ドナー及び移植レシピエントの遺伝子型を決定することを含まない。

【0103】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、マイクロアレイを使用して増幅された標的遺伝子座を検出することを更に含む。

【0104】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、多型遺伝子座及び非多型遺伝子座は、単一反応において増幅される。

【0105】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法では、ＤＮＡは、標的遺伝子座で優先的に濃縮される。

【0106】

いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座における試料中のＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数の環状化前プローブ（ｐｒｅ－ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）を得ることであって、各プローブが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、プローブの３’及び５’末端が、少数の塩基によって、遺伝子座の多型部位から分離されているＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計され、少数の塩基が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、又はこれらの組み合わせである、得ることと、環状化前プローブを試料からのＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ＤＮＡポリメラーゼを使用して、ハイブリダイズしたプローブ末端間のギャップを埋めることと、環状化前プローブを環状化することと、環状化プローブ（ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚｅｄ ｐｒｏｂｅ）を増幅することと、を含む。

【0107】

いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座におけるＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数のライゲーション媒介ＰＣＲプローブを得ることであって、各ＰＣＲプローブが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、上流及び下流ＰＣＲプローブが、ＤＮＡの一方の鎖上の、少数の塩基によって遺伝子座の多型部位から分離されているＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、又はそれらの組み合わせである、得ることと、ライゲーション媒介ＰＣＲプローブを第１の試料からのＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ＤＮＡポリメラーゼを使用してライゲーション媒介ＰＣＲプローブ間のギャップを埋めることと、ライゲーション媒介ＰＣＲプローブをライゲーションすることと、ライゲーションされたライゲーション媒介ＰＣＲプローブを増幅することと、を含む。

【0108】

いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座においてＤＮＡを優先的に濃縮することは、多型遺伝子座を標的とする複数のハイブリッド捕捉プローブを得ることと、ハイブリッド捕捉プローブを試料中のＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ハイブリダイズしていないＤＮＡのいくつか又は全てをＤＮＡの第１の試料から物理的に除去することと、を含む。

【0109】

いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位に隣接しているが、重複していない領域にハイブリダイズするように設計される。いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位に隣接しているが、重複していない領域にハイブリダイズするように設計され、隣接する捕捉プローブの長さは、約１２０塩基未満、約１１０塩基未満、約１００塩基未満、約９０塩基未満、約８０塩基未満、約７０塩基未満、約６０塩基未満、約５０塩基未満、約４０塩基未満、約３０塩基未満、及び約２５塩基未満からなる群から選択され得る。いくつかの実施形態において、ハイブリッド捕捉プローブは、多型部位と重複する領域にハイブリダイズするように設計され、複数のハイブリッド捕捉プローブが、各多型遺伝子座について少なくとも２つのハイブリッド捕捉プローブを含み、各ハイブリッド捕捉プローブが、その多型遺伝子座における異なる対立遺伝子に相補的であるように設計される。

【0110】

いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座でＤＮＡを優先的に濃縮することは、複数の内側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、内側順方向プライマーの３’末端が、多型部位から上流の、少数の塩基によって多型部位から分離されているＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、又は３１～６０塩基対からなる群から選択される、得ることと、任意選択的に、複数の内側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、内側逆方向プライマーの３’末端が、多型部位から上流の、少数の塩基によって多型部位から分離されているＤＮＡ領域にハイブリダイズするように設計され、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、又は３１～６０塩基対からなる群から選択される、得ることと、内側プライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせることと、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅して、アンプリコンを形成することと、を含む。

【0111】

いくつかの実施形態において、本方法はまた、複数の外側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側順方向プライマーが、内側順方向プライマーから上流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、得ることと、任意選択的に、複数の外側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側逆方向プライマーが、内側逆方向プライマーからすぐ下流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、得ることと、第１のプライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせること、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅することと、を含む。

【0112】

いくつかの実施形態において、本方法はまた、複数の外側逆方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側逆方向プライマーが、内側逆方向プライマーから下流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、得ることと、任意選択的に、複数の外側順方向プライマーを得ることであって、各プライマーが、多型遺伝子座のうちの１つを標的とし、外側順方向プライマーが、内側順方向プライマーからすぐ上流のＤＮＡの領域にハイブリダイズするように設計される、得ることと、第１のプライマーをＤＮＡにハイブリダイズさせること、ポリメラーゼ連鎖反応を使用してＤＮＡを増幅することと、を含む。

【0113】

いくつかの実施形態において、第１の試料を調製することは、第１の試料中のＤＮＡにユニバーサルアダプターを付加することと、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して第１の試料中のＤＮＡを増幅することと、を更に含む。いくつかの実施形態において、アンプリコンの少なくとも一部は、１００ｂｐ未満、９０ｂｐ未満、８０ｂｐ未満、７０ｂｐ未満、６５ｂｐ未満、６０ｂｐ未満、５５ｂｐ未満、５０ｂｐ未満、又は４５ｂｐ未満であり、分率は、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、又は９９％である。

【0114】

いくつかの実施形態において、ＤＮＡの増幅は、１つ又は複数の個々の反応体積で行われ、各個々の反応体積が、１００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、１，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、１０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、２０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、５０，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対、又は１００，０００超の異なる順方向及び逆方向プライマー対を含む。

【0115】

いくつかの実施形態において、試料を調製することは、試料を複数の部分に分割することを更に含み、各部分のＤＮＡが、複数の多型遺伝子座のサブセットで優先的に濃縮される。いくつかの実施形態において、内側プライマーは、望ましくないプライマー二重鎖を形成する可能性が高いプライマー対を同定し、望ましくないプライマー二重鎖を形成する可能性が高いと同定されたプライマーの対のうちの少なくとも１つを複数のプライマーから除去することによって選択される。いくつかの実施形態において、内側プライマーは、標的化された多型遺伝子座の上流又は下流のいずれかにハイブリダイズするように設計されている領域を含み、任意選択的に、ＰＣＲ増幅を可能にするように設計されたユニバーサルプライミング配列を含む。いくつかの実施形態において、プライマーの少なくともいくつかは、個々のプライマー分子ごとに異なるランダム領域を更に含む。いくつかの実施形態において、プライマーの少なくともいくつかは、分子バーコードを更に含む。

【0116】

いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）標的遺伝子座を含む核酸試料に対して多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、（ｉ）少なくとも１，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも１，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル若しくはタグ特異的プライマーのいずれかを使用して、少なくとも１，０００の異なる標的遺伝子座を同時に増幅して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することと、（ｂ）増幅産物を配列決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、マイクロアレイを使用することを含まない。

【0117】

いくつかの実施形態において、本方法は、（ａ）標的遺伝子座を含む無細胞ＤＮＡ試料に対して多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行って、（ｉ）少なくとも１，０００の異なるプライマー対、又は（ｉｉ）少なくとも１，０００の標的特異的プライマー及びユニバーサル若しくはタグ特異的プライマーのいずれかを使用して、少なくとも１，０００の異なる標的遺伝子座を同時に増幅して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することと、（ｂ）増幅産物を配列決定することと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、マイクロアレイを使用することを含まない。

【0118】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から遺伝子型データ得ることも含む。いくつかの実施形態において、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から遺伝子型データを得ることは、ドナー及びレシピエントからのＤＮＡを調製することを含み、調製することが、調製されたＤＮＡを得るために複数の多型遺伝子座でＤＮＡを優先的に濃縮することと、任意選択的に、調製されたＤＮＡを増幅することと、複数の多型遺伝子座での調製された試料中のＤＮＡを測定することと、を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、染色体上の複数の多型遺伝子座の対立遺伝子数の予測される確率の結合分布モデルを構築することは、移植ドナー及び移植レシピエントの一方又は両方から得られた遺伝子データを使用して行われる。いくつかの実施形態において、第１の試料は、移植レシピエント血漿から単離されており、移植レシピエントから遺伝子型データを得ることは、調製された試料に対して行われたＤＮＡ測定からレシピエント遺伝子型データを推定することによって行われる。

【0120】

いくつかの実施形態において、優先的濃縮は、２倍以下、１．５倍以下、１．２倍以下、１．１倍以下、１．０５倍以下、１．０２倍以下、１．０１倍以下、１．００５倍以下、１．００２倍以下、１．００１倍以下、及び１．０００１倍以下からなる群から選択される倍率の、調製された試料と第１の試料との間の対立遺伝子バイアスの平均度（ａｖｅｒａｇｅ ｄｅｇｒｅｅ）をもたらす。いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座は、ＳＮＰである。いくつかの実施形態において、調製された試料中のＤＮＡの測定は、配列決定によって行われる。

【0121】

いくつかの実施形態において、診断ボックスは、移植レシピエントにおける移植状態を決定するのを助けるために開示され、診断ボックスは、開示される方法の調製及び測定ステップを実行することが可能である。

【0122】

いくつかの実施形態において、対立遺伝子数は、バイナリではなく、確率的である。いくつかの実施形態において、複数の多型遺伝子座での調製された試料中のＤＮＡの測定値を使用して、移植が１つ又は複数の連鎖したハプロタイプを受け継いでいるかどうかを決定する。

【0123】

いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の確率の結合分布モデルを構築することは、染色体中の異なる位置で染色体が交差する確率に関するデータを使用して、その染色体上の多型対立遺伝子間の依存性をモデル化することによって行われる。いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の結合分布モデルを構築することと、各々の仮説の相対確率を決定するステップは、参照染色体の使用を必要としない方法を用いて行われる。

【0124】

いくつかの実施形態において、各仮説の相対確率を決定することは、調製された試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の推定分率を利用する。いくつかの実施形態において、対立遺伝子数の確率を計算し、各仮説の相対確率を決定する際に使用される調製された試料からのＤＮＡ測定値は、一次遺伝子データを含む。いくつかの実施形態において、最大確率を有する仮説に対応する移植状態の選択は、最大尤度推定値又は最大事後推定値を使用して実行される。

【0125】

いくつかの実施形態において、移植状態を呼び出すことはまた、結合分布モデル及び対立遺伝子数確率を使用して決定された状態仮説の各々の相対確率と、リード数分析からなる群から得られた統計技術を使用して計算された状態仮説の各々の相対確率とを組み合わせることと、ヘテロ接合率、ドナー遺伝情報が使用される場合にのみ利用可能な統計量、特定のドナー／レシピエント状況についての正規化された遺伝子型シグナルの確率、第１の試料又は調製された試料の推定移植分率を使用して計算される統計量、及びそれらの組み合わせを比較することと、を含む。

【0126】

いくつかの実施形態において、信頼度推定値は、呼び出された移植状態について計算される。いくつかの実施形態において、本方法はまた、呼び出された移植状態に基づいて臨床措置（ｃｌｉｎｉｃａｌ ａｃｔｉｏｎ）をとることを含む。

【0127】

いくつかの実施形態において、決定された移植状態を表示するレポートは、本方法を使用して生成される。いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法とともに使用されるように設計された移植状態を決定するためのキットが開示され、本キットは、複数の内側順方向プライマー及び任意選択的に複数の内側逆方向プライマーを含み、プライマーの各々は、標的染色体及び任意選択的に更なる染色体に上の多型部位のうちの１つからすぐ上流及び／又は下流のＤＮＡの領域ハイブリダイズするように設計され、ハイブリダイゼーション領域は、少数の塩基によって多型部位から分離されており、少数が、１、２、３、４、５、６～１０、１１～１５、１６～２０、２１～２５、２６～３０、３１～６０、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される。

【0128】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、より短いｃｆＤＮＡを選択するための選択ステップを含む。

【0129】

いくつかの実施形態において、本明細書に開示される方法は、ｃｆＤＮＡを濃縮するためのユニバーサルアプリケーションステップを含む。

【0130】

いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量がカットオフ閾値を上回るという決定は、移植の急性拒絶反応を示す。機械学習を使用して、拒絶反応と非拒絶反応とを判定してもよい。

【0131】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％）として表される。

【0132】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量として表される。

【0133】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量に、移植レシピエントの体重又は血液量を乗じたものとして表される。

【0134】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、患者の体重又は血液量を考慮に入れる。

【0135】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、以下のうちの１つ以上を考慮に入れる：血漿の体積当たりのドナーゲノムコピー、血漿の体積当たりの無細胞ＤＮＡ収率、ドナー身長、ドナー体重、ドナー年齢、ドナー性別、ドナー民族性、ドナー臓器質量、ドナー臓器、生体対死亡ドナー、関連対無関連ドナー、レシピエント身長、レシピエント体重、レシピエント年齢、レシピエント性別、レシピエント民族性、クレアチニン、ｅＧＦＲ（糸球体濾過率の推定値）、ｃｆＤＮＡメチル化、ＤＳＡ（ドナー特異的抗体）、ＫＤＰＩ（腎臓ドナープロファイル指標）、薬剤（免疫抑制、ステロイド、血液希釈剤など）、感染症（ＢＫＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＵＴＩ、ＴＴＶ）、レシピエント及び／又はドナーＨＬＡ対立遺伝子又はエピトープミスマッチ、腎臓同種移植病理学のＢａｎｆｆ分類、並びに正当対監視又はプロトコル生検。

【0136】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされる。

【0137】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケールされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。

【0138】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。

【0139】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケールされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケールされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケールされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケールされたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。

【0140】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。

【0141】

多重増幅
いくつかの実施形態において、本方法は、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列を決定する前に、１つの反応混合物中の複数の多型遺伝子座を増幅するための多重増幅反応を行うことを含む。

【0142】

特定の例示的な実施形態において、核酸配列データは、多重増幅反応を用いて作成される一連のアンプリコンの複数のコピーの高スループットＤＮＡ配列決定を行うことによって作成され、一連のアンプリコンの各々のアンプリコンは、多型遺伝子座のセットの少なくとも１つの多型遺伝子座に広がり、このセットの多型遺伝子座の各々が増幅される。例えば、これらの実施形態において、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００の多型遺伝子座（例えば、ＳＮＰ遺伝子座）にわたってアンプリコンを増幅する多重ＰＣＲを実行してもよい。この多重反応は、単一の反応として、又は異なる部分集合の多重反応のプールとして設定することができる。本明細書で提供される多重反応方法（例えば、本明細書に開示される大規模マルチプレックスＰＣＲ）は、改良された多重化、したがって、感度レベルを達成するのに役立つように増幅反応を行う例示的なプロセスを提供する。

【0143】

いくつかの実施形態において、増幅は、直接多重化ＰＣＲ、連続ＰＣＲ、ネスティッドＰＣＲ、二重ネスティッドＰＣＲ、片側及び片側半（ｏｎｅ－ａｎｄ－ａ－ｈａｌｆ ｓｉｄｅｄ）ネスティッドＰＣＲ、完全ネスティッドＰＣＲ、片側完全ネスティッドＰＣＲ、片側ネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、ヘミネスティッドＰＣＲ、三重ヘミネスティッドＰＣＲ、セミネスティッドＰＣＲ、片側セミネスティッドＰＣＲ、逆セミネスティッドＰＣＲ法、又は片側ＰＣＲを用いて行われ、これらは、２０１２年１１月２１日に出願された米国出願第１３／６８３，６０４号、米国公開第２０１３／０１２３１２０号、２０１１年１１月１８日に出願された米国出願第１３／３００，２３５号、米国公開第２０１２／０２７０２１２号及び２０１４年５月１６日に出願された米国出願第６１／９９４，７９１号（これらは全て、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される。

【0144】

いくつかの実施形態において、マルチプレックスＰＣＲが使用される。いくつかの実施形態において、核酸試料において標的遺伝子座を増幅する方法は、（ｉ）核酸試料と、少なくとも１００、２００、５００、１，０００、２，０００、５，０００、１０，０００、２０，０００、５０，０００、又は１００，０００の異なる標的遺伝子座を同時にハイブリダイズするプライマーのライブラリとを接触させ、単一反応混合物を生成することと、（ｉｉ）この反応混合物をプライマー伸長反応条件（例えばＰＣＲ条件）に供して、標的アンプリコンを含む増幅産物を生成することとを伴う。いくつかの実施形態において、標的遺伝子座の少なくとも５０、６０、７０、８０、９０、９５、９６、９７、９８、９９、又は９９．５％が増幅される。様々な実施形態において、増幅産物の６０、５０、４０、３０、２０、１０、５、４、３、２、１、０．５、０．２５、０．１、又は０．０５％未満が、プライマーダイマーである。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態である（例えば、固相ではなく液相に溶解する）。いくつかの実施形態において、プライマーは、溶液状態であり、固体支持体に固定されていない。いくつかの実施形態において、プライマーは、マイクロアレイの一部ではない。

【0145】

特定の実施形態において、多重増幅反応は、反応の少なくとも１／２について、制限されたプライマー条件で行われる。いくつかの実施形態において、制限されたプライマー濃度は、多重反応のうちの反応の１／１０、１／５、１／４、１／３、１／２、又は全てで使用される。ＰＣＲなどの増幅反応において制限されたプライマー条件を達成する上で考慮すべき因子が、本明細書で提供される。

【0146】

特定の実施形態において、多重増幅反応は、例えば、２，５００～５０，０００の多重反応を含んでいてもよい。特定の実施形態において、以下の範囲の多重反応が行われる。範囲の下限で１００、２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００から、範囲の上限で２００、２５０、５００、１０００、２５００、５０００、１０，０００、２０，０００、２５０００、５００００及び１００，０００まで。

【0147】

一実施形態において、マルチプレックスＰＣＲアッセイは、１つ以上の染色体上の潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ又は他の多型若しくは非多型遺伝子座を増幅するように設計され、これらのアッセイは、単一反応で使用され、ＤＮＡを増幅する。ＰＣＲアッセイの数は、５０～２００ＰＣＲアッセイ、２００～１，０００ＰＣＲアッセイ、１，０００～５，０００ＰＣＲアッセイ又は５，０００～２０，０００ＰＣＲアッセイ（それぞれ、５０～２００反応分、２００～１，０００反応分、１，０００～５，０００反応分、５，０００～２０，０００反応分、２０，０００より多い反応分）であってもよい。一実施形態において、少なくとも１０，０００ＰＣＲアッセイ（１０，０００反応分）のマルチプレックスプールは、潜在的にヘテロ接合性のＳＮＰ遺伝子座単一反応を増幅し、血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料から得られたｃｆＤＮＡを増幅するように設計される。各遺伝子座のＳＮＰ頻度は、クローンによって、又はアンプリコンを配列決定するいくつかの他の方法によって決定されてもよい。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡ試料は、２つの試料に分割され、並行な５，０００反応分のアッセイが行われる。別の実施形態において、元々のｃｆＤＮＡ試料は、ｎ個の試料に分割され、並行な（約１０，０００／ｎ）反応分のアッセイが行われ、ここで、ｎは、２～１２又は１２～２４又は２４～４８又は４８～９６である。

【0148】

一実施形態において、本明細書に開示される方法は、高効率な高度に多重化された標的化ＰＣＲを使用してＤＮＡを増幅し、その後、高スループット配列決定によって、各標的遺伝子座での対立遺伝子頻度を決定する。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする１つの技術は、互いにハイブリダイズする可能性が低いプライマーを設計することを伴う。ＰＣＲプローブは、典型的にはプライマーと呼ばれ、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００、又は少なくとも５０，０００の潜在的なプライマー対との間の潜在的に有害な相互作用又はプライマーと試料ＤＮＡとの間の意図していない相互作用の熱力学的モデルを作成し、次いで、このモデルを用いて、プール中の他の設計と不適合な設計を除外することによって選択される。高度に多重化された標的化ＰＣＲを高効率な方法で行うことを可能にする別の技術は、標的化ＰＣＲに対して、部分的又は完全なネスティング手法を用いることである。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１，０００、少なくとも２，０００、少なくとも５，０００、少なくとも１０，０００、少なくとも２０，０００又は少なくとも５０，０００のプライマーの多重化が可能になり、得られた大部分のＤＮＡを含む増幅ＤＮＡは、配列決定されると、標的遺伝子座にマッピングする。これらの手法の１つ又は組み合わせを用いることで、単一のプールにおいて多数のプライマーの多重化が可能になり、得られた増幅ＤＮＡは、標的遺伝子座にマッピングする５０％より多い、８０％より多い、９０％より多い、９５％より多い、９８％より多い、又は９９％より多いＤＮＡ分子を含む。

【0149】

マルチプレックスＰＣＲから得られた遺伝子データを分析するために、バイオインフォマティクス法が使用される。本明細書に開示される方法に有用及び関連するバイオインフォマティクス法は、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１８／００２５１０９号に見出すことができる。

【0150】

高スループット配列決定
いくつかの実施形態において、アンプリコンの配列は、高スループット配列決定を行うことにより決定される。

【0151】

移植レシピエント及び／又は移植ドナーの遺伝子データは、これらに限定されないが、遺伝子型決定マイクロアレイ及び高スループット配列決定を含む群から得られるツール及び／又は技術を使用して、適切な遺伝子材料を測定することによって、分子状態から電子状態に変換され得る。いくつかの高スループット配列決定法としては、Ｓａｎｇｅｒ ＤＮＡ配列決定、パイロシーケンシング、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＯＬＥＸＡプラットフォーム、ＩＬＬＵＭＩＮＡのゲノムアナライザ、又はＡＰＰＬＩＥＤ ＢＩＯＳＹＳＴＥＭの４５４配列決定プラットフォーム、ＨＥＬＩＣＯＳのＴＲＵＥ ＳＩＮＧＬＥ ＭＯＬＥＣＵＬＥ ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧプラットフォーム、ＨＡＬＣＹＯＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲの電子顕微鏡配列決定法、又は任意の他の配列決定法が挙げられる。いくつかの実施形態において、高スループット配列決定は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）上で行われ、続いて、ヒト参照ゲノムへの脱多重化及びマッピングが行われる。これらの方法は全て、ＤＮＡの試料に格納された遺伝子データを、処理される途中のメモリデバイスに典型的に格納される遺伝子データのセットに物理的に変換する。

【0152】

いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、マイクロアレイ分析を行うことによって決定される。一実施形態において、マイクロアレイは、ＩＬＬＵＭＩＮＡ ＳＮＰマイクロアレイ、又はＡＦＦＹＭＥＴＲＩＸ ＳＮＰマイクロアレイであってもよい。

【0153】

いくつかの実施形態において、選択的に濃縮されたＤＮＡの配列は、定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）又はデジタルドロップレットＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）分析を行うことによって決定される。ｑＰＣＲは、特定の時間（概して増幅サイクルごとに）における蛍光の強度を測定し、標的分子（ＤＮＡ）の相対量を決定する。ｄｄＰＣＲは、各分子が１つのドロップレット内にあるため、実際の分子数（標的ＤＮＡ）を測定し、したがってそれを別個の「デジタル」測定値とする。これは、ｄｄＰＣＲが試料の陽性分率、すなわち適切な増幅により蛍光している液滴の数を測定するため、絶対的な定量を提供する。この陽性分率は、鋳型核酸の初期量を正確に示す。

【0154】

トレーサーＤＮＡ及びその使用
試料中の全ｃｆＤＮＡの量を推定するためのトレーサーＤＮＡは、２０２０年５月２９日に出願され、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題された米国仮出願第６３／０３１，８７９号に記載されている（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、非ヒト起源のＤＮＡ分子を含む。

【0155】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、約５０～５００ｂｐ、又は約７５～３００ｂｐ、又は約１００～２５０ｂｐ、又は約１２５～２００ｂｐ、又は約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐ、又は約５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。

【0156】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、同じ又は実質的に同じ長さを有するＤＮＡ分子、例えば約１２５ｂｐ、又は約１６０ｂｐ、又は約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる長さを有するＤＮＡ分子、例えば、約１２５ｂｐの長さを有する第１のＤＮＡ分子、約１６０ｂｐの長さを有する第２のＤＮＡ分子、及び約２００ｂｐの長さを有する第３のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有するＤＮＡ分子を使用して、試料中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定する

【0157】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは標的配列を含み、標的配列は、プライマーの対に結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡの少なくとも一部は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対はまた、バーコードを含むトレーサーＤＮＡの一部を増幅することもできる。

【0158】

いくつかの実施形態において、バーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。

【0159】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、内在性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。

【0160】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、複数の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、プライマーの第１の対に結合可能なプライマー結合部位の第１の対の間に位置する第１のバーコードと、プライマーの第２の対に結合可能なプライマー結合部位の第２の対の間に位置する第２のバーコードを含む、第１の標的配列を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２の標的配列は、ＳＮＰ遺伝子座を含む内因性配列をバーコードで置き換えることによって、１つ以上の内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計される。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、任意のバーコードである。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のバーコードは、第１又は第２のプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡ内の第１及び／又は第２の標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。

【0161】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、同じ又は実質的に同じ配列を有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、異なる配列を有するＤＮＡ分子を含む。

【0162】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡは、第１の標的配列を含む第１のＤＮＡと、第２の標的配列を含む第２のＤＮＡとを含む。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に位置する異なるバーコードを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に配置された異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、同じ長さ又は実質的に同じ長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、同じプライマー結合部位の間に配置された異なるバーコードを有し、異なるバーコードは、異なる長さを有する。いくつかの実施形態において、第１の標的配列及び第２の標的配列は、異なる内因性ヒトＳＮＰ遺伝子座に基づいて設計され、したがって、異なるプライマー結合部位を含む。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて同じ又は実質的に同じである。いくつかの実施形態において、第１のＤＮＡの量及び第２のＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡにおいて異なる。

【0163】

トレーサーＤＮＡを使用した全無細胞ＤＮＡの量の決定
特定の実施形態において、トレーサーＤＮＡを使用して、本明細書に記載の方法の正確さ及び精度を改善し、より広い入力範囲にわたる定量に役立ち、異なるサイズ範囲での異なるステップの効率を評価し、及び／又は入力材料の断片サイズ分布を計算することができる。

【0164】

本発明のいくつかの実施形態は、生体試料中の全無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡが、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡに由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む方法に関する。

【0165】

いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡを全血試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡを血漿試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡを添加することと、を含む。

【0166】

いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡを添加することを更に含む。

【0167】

いくつかの実施形態において、試料中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡのＮＯＲ（バーコードによって識別可能）、試料ＤＮＡのＮＯＲ、及び血漿試料に添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのＮＯＲと試料ＤＮＡのＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、バーコードのＮＯＲと対応する内因性ゲノム配列のＮＯＲとの間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、この情報を血漿体積とともに使用して、血漿の体積当たりのｃｆＤＮＡの量を計算することもできる。いくつかの実施形態において、これらは、ドナーＤＮＡのパーセンテージを乗じて、全ドナーｃｆＤＮＡ及び血漿の体積当たりのドナーｃｆＤＮＡを計算することができる。

【0168】

したがって、一態様において、本発明は、生体試料中の全無細胞ＤＮＡの量を定量する方法に関し、本方法は、ａ）生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して全無細胞ＤＮＡの量を定量することと、を含む。

【0169】

更なる態様において、移植レシピエントの生体試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量する方法に関し、本方法は、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することであって、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される、定量することと、を含む。

【0170】

更なる態様において、本発明は、移植拒絶反応又は移植傷害の発生又は発生の可能性を決定する方法に関し、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積において１００以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）増幅産物を高スループット配列決定によって配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することであって、全無細胞ＤＮＡの量が、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される、定量することと、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を閾値と比較することによって、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応又は移植傷害の発生又は発生の可能性を決定することであって、閾値が、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定される、決定することと、を含む。

【0171】

いくつかの実施形態において、閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの配列決定リード数の関数である。

【0172】

いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の範囲外である場合、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。

【0173】

いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を全血試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、血漿抽出の後及び無細胞ＤＮＡの単離の前に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を血漿試料に添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、単離された無細胞ＤＮＡにアダプターを連結して、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物を得ることと、アダプター連結ＤＮＡを含む組成物に、第１のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することと、を含む。

【0174】

いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の前に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、標的増幅の後に、第２のトレーサーＤＮＡ組成物を添加することを更に含む。

【0175】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる配列を有する複数のＤＮＡ分子を含む。

【0176】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる濃度を有する複数のＤＮＡ分子を含む。

【0177】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、異なる長さを有する複数のＤＮＡ分子を使用して、試料中の無細胞ＤＮＡのサイズ分布を決定する。

【0178】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、非ヒト起源の複数のＤＮＡ分子を含む。

【0179】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、各々標的配列を含み、標的配列は、プライマー対のうちの１つに結合可能なプライマー結合部位の対の間に位置するバーコードを含む。いくつかの実施形態において、バーコードは、同じプライマー対によって増幅可能な対応する内因性ゲノム配列の逆相補体を含む。

【0180】

いくつかの実施形態において、トレーサーＤＮＡのリード数と試料ＤＮＡのリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。いくつかの実施形態において、バーコードのリード数と対応する内因性ゲノム配列のリード数との間の比率を使用して、全無細胞ＤＮＡの量を定量する。

【0181】

いくつかの実施形態において、標的配列に、内因性ゲノム配列が片側又は両側で隣接している。いくつかの実施形態において、標的配列に、非内因性配列が片側又は両側で隣接している。

【0182】

いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、合成二本鎖ＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５０～５００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、７５～３００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１００～２５０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、１２５～２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約２００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１６０ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、約１２５ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。いくつかの実施形態において、第１及び／又は第２のトレーサーＤＮＡ組成物は、５００～１，０００ｂｐの長さを有するＤＮＡ分子を含む。

【0183】

いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも２００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも５００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも２，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも５，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。いくつかの実施形態において、標的増幅は、単一反応体積において少なくとも１０，０００個の多型又はＳＮＰ遺伝子座を増幅することを含む。

【0184】

いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約３５～２００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約５０～１００ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６０～７５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。いくつかの実施形態において、各プライマー対は、約６５ｂｐの標的配列を増幅するように設計される。

【0185】

いくつかの実施形態において、移植レシピエントは、ヒト対象である。いくつかの実施形態において、移植は、ヒト移植である。いくつかの実施形態において、移植は、ブタ移植である。いくつかの実施形態において、移植は、非ヒト動物からの移植である。

【0186】

いくつかの実施形態において、移植は、臓器移植、組織移植、又は細胞移植である。いくつかの実施形態において、移植は、腎臓移植、肝臓移植、膵臓移植、腸管移植、心臓移植、肺移植、心臓／肺移植、胃移植、精巣移植、陰茎移植、卵巣移植、子宮移植、胸腺移植、顔面移植、手移植、脚移植、骨移植、骨髄移植、角膜移植、皮膚移植、膵島細胞移植、心臓弁移植、血管移植、又は輸血である。

【0187】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植拒絶反応を、抗体媒介性移植拒絶反応、Ｔ細胞媒介性移植拒絶反応、移植片傷害、ウイルス感染、細菌感染、又は境界性拒絶反応として決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、１つ以上のがんの可能性を定量することを更に含む。がんスクリーニング、検出、及びモニタリングは、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号に開示されており、それらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。他の実施形態において、本発明は、患者をスクリーニングして、１つ以上のがん治療に対する患者の予測される応答性又は耐性を決定することに関する。この決定は、標的遺伝子の野生型対変異型の存在、又は場合によっては標的遺伝子の増加又は過剰発現を決定することによって行うことができる。そのような標的スクリーニングの例としては、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＥＧＦＲ、ＡＬＫ、ＫＩＴ等が挙げられる。例えば、様々なＫＲＡＳ変異が本発明によるスクリーニングに好適であり、これらに限定されないが、Ｇ１２Ｃ、Ｇ１２Ｄ、Ｇ１２Ｖ、Ｇ１３Ｃ、Ｇ１３Ｄ、Ａ１８Ｄ、Ｑ６１Ｈ、Ｋ１１７Ｎを含む。加えて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ特許公開第２０１５／１６４４３２号、同第２０１７／１８１２０２号、同第２０１８／０８３４６７号、及び同第２０１９／２００２２８号。

【0188】

いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、レシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー及び／又はレシピエント遺伝子型の事前の知識なしに行われる。いくつかの実施形態において、本方法を実施する前に、ドナー又はレシピエントのいずれかの遺伝子型決定は必要とされない。

【0189】

いくつかの実施形態において、生体試料は、血液試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、血漿試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、血清試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、尿試料である。いくつかの実施形態において、生体試料は、リンパ液である。いくつかの実施形態において、試料は、固形組織試料である。

【0190】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから複数の生体試料を長期的に収集することと、収集した各試料についてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すこととを更に含む。

【0191】

いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液試料中のドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡの合計に対するドナー由来無細胞ＤＮＡのパーセンテージを決定することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を決定することを含む。いくつかの実施形態において、定量ステップは、血液試料の体積単位当たりのドナー由来無細胞ＤＮＡの量を決定することを含む。

【0192】

別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける移植を、急性拒絶反応を生じているものとして診断する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、閾値を超えるドナー由来無細胞ＤＮＡの量は、移植が急性拒絶反応を生じていることを示し、閾値は、全無細胞ＤＮＡの量に従って決定され、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。

【0193】

別の態様において、本発明は、移植レシピエントにおける免疫抑制療法をモニタリングする方法であって、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、時間間隔にわたるドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルの変化は、移植状態を示し、ドナー由来無細胞ＤＮＡのレベルは、全無細胞ＤＮＡの量に応じてスケーリングされ、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。

【0194】

いくつかの実施形態において、本方法は、時間間隔にわたるｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルに基づいて免疫抑制療法を調整することを更に含む。

【0195】

いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの増加は、移植拒絶反応又は移植傷害を示し、免疫抑制療法の調整の必要性を示す。いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡのレベルの変化がないこと又は減少は、移植の寛容性又は安定性、及び免疫抑制療法の調整の必要性を示す。

【0196】

いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡを濃縮し、白血球の破裂から配置レシピエント由来無細胞ＤＮＡの量を減少させるサイズ選択を更に含む。

【0197】

いくつかの実施形態において、本方法は、溶解又は損傷した白血球に由来するレシピエント由来無細胞ＤＮＡよりも、ドナー由来無細胞ＤＮＡを優先的に増幅する、ユニバーサル増幅ステップを更に含む。

【0198】

いくつかの実施形態において、本方法は、移植後に移植レシピエントから複数の血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を長期的に収集することと、収集した各試料についてステップ（ａ）～（ｄ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントからの血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を、約３ヶ月、又は約６ヶ月、又は約１２ヶ月、又は約１８ヶ月、又は約２４ヶ月などの期間にわたって採取及び分析することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、移植レシピエントから、約１週間、又は約２週間、又は約３週間、又は約１ヶ月、又は約２ヶ月、又は約３ヶ月などの間隔で血液、血漿、血清、固形組織、又は尿試料を採取することを含む。

【0199】

いくつかの実施形態において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量がカットオフ閾値を上回るという決定は、移植の急性拒絶反応を示す。機械学習を使用して、拒絶反応と非拒絶反応とを判定してもよい。機械学習は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１９８１として２０１９年７月１６日に出願された、ＷＯ２０２０／０１８５２２、名称「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ ｆｏｒ ｃａｌｌｉｎｇ Ｐｌｏｉｄｙ Ｓｔａｔｅｓ ｕｓｉｎｇ ａ Ｎｅｕｒａｌ Ｎｅｔｗｏｒｋ」に開示されており、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリングされる。

【0200】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡのパーセンテージ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ％）として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量として表される。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、血液試料の体積単位当たりのｄｄ－ｃｆＤＮＡの量又は絶対量に、移植レシピエントの体重、ＢＭＩ又は血液量を乗じたものとして表される。

【0201】

いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、患者の体重、ＢＭＩ又は血液量を考慮に入れる。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、以下のうちの１つ以上を考慮に入れる：血漿の体積当たりのドナーゲノムコピー、血漿の体積当たりの無細胞ＤＮＡ収率、ドナー身長、ドナー体重、ドナー年齢、ドナー性別、ドナー民族性、ドナー臓器質量、ドナー臓器、生体対死亡ドナー、ドナーとレシピエントとの家族関係（又はその欠如）、レシピエント身長、レシピエント体重、レシピエント年齢、レシピエント性別、レシピエント民族性、クレアチニン、ｅＧＦＲ（糸球体濾過率の推定値）、ｃｆＤＮＡメチル化、ＤＳＡ（ドナー特異的抗体）、ＫＤＰＩ（腎臓ドナープロファイル指標）、薬剤（免疫抑制、ステロイド、血液希釈剤など）、感染症（ＢＫＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＵＴＩ）、レシピエント及び／又はドナーＨＬＡ対立遺伝子又はエピトープミスマッチ、腎臓同種移植病理学のＢａｎｆｆ分類、並びに正当対監視又はプロトコル生検。

【0202】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の感度が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。

【0203】

いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも５０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも６０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも７５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも８５％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９０％であり、信頼区間は９５％である。いくつかの実施形態において、本方法は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、血液試料中の全ｃｆＤＮＡの量に従ってスケーリング又は調整されたカットオフ閾値を上回る場合、非急性拒絶反応（ｎｏｎ－ＡＲ）に対して急性拒絶反応（ＡＲ）を同定する際の特異性が少なくとも９５％であり、信頼区間は９５％である。

【0204】

全無細胞ＤＮＡの量を使用して移植拒絶反応又は移植傷害を呼び出すための閾値の調整
本発明のいくつかの実施形態は、移植レシピエントの生体試料におけるドナー由来無細胞ＤＮＡの量を定量する方法であって、ａ）移植レシピエントの生体試料から無細胞ＤＮＡを単離することであって、単離された無細胞ＤＮＡが、ドナー由来無細胞ＤＮＡ及びレシピエント由来無細胞ＤＮＡを含み、第１のトレーサーＤＮＡ組成物が、無細胞ＤＮＡの単離の前又は後に添加される、単離することと、ｂ）１００個以上の異なるプライマー対を使用して、単一反応体積における１００個以上の異なる標的遺伝子座での標的増幅を行うことと、ｃ）高スループット配列決定により増幅産物を配列決定して、配列決定リードを生成することと、ｄ）ドナー由来無細胞ＤＮＡの量及び全無細胞ＤＮＡの量を定量することとを含み、全無細胞ＤＮＡの量は、第１のトレーサーＤＮＡ組成物に由来する配列決定リードを使用して定量される方法に関する。

【0205】

いくつかの実施形態は、血漿量当たりのドナーＤＮＡの固定閾値、又は本明細書に記載されるように調整又はスケーリングされたもの等の固定されていないもののいずれかを使用する。これを決定する方法は、トレーニングデータセットを使用してパフォーマンスを最大化するアルゴリズムを構築することに基づいてもよい。また、患者の体重、年齢、又は他の臨床的要因などの他のデータを考慮してもよい。

【0206】

いくつかの実施形態において、本方法は、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量を使用して、移植拒絶反応又は移植傷害の発生又は発生の可能性を決定することを更に含む。いくつかの実施形態において、ドナー由来無細胞ＤＮＡの量をカットオフ閾値と比較して、移植拒絶反応又は移植傷害の発生又は発生の可能性を決定し、カットオフ閾値を全無細胞ＤＮＡの量に従って調整又はスケーリングする。いくつかの実施形態において、カットオフ閾値は、ドナー由来無細胞ＤＮＡのリード数の関数である。

【0207】

いくつかの実施形態において、本方法は、より正確に移植拒絶反応又は移植傷害を評価するために、試料中の全ｃｆＤＮＡの量を考慮したスケーリング又は動的閾値メトリックを適用することを含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値を上回る場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。いくつかの実施形態において、本方法は、全無細胞ＤＮＡの量が所定の値未満である場合に、試料にフラグを立てることを更に含む。

【0208】

実施例
実施例１
この非限定的な実施例のワークフローは、Ｓｉｇｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．８（１）：１９（２０１９）に開示されているワークフローに対応する（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。

【0209】

血液試料
男性及び女性の成人又は若年成人の患者が、関連した、若しくは関連していない生体ドナー、又は関連していない死亡したドナーから腎臓を移植された。移植手術後の患者の採血の時点は、同種移植片生検の時点、又はラボプロトコルに基づいて事前に指定された様々な時間間隔であった。典型的には、試料は生検マッチングされ、臨床的機能障害及び生検時、又はプロトコル生検時（この時点では、ほとんどの患者は臨床的機能障害を有していなかった）に採血された。加えて、一部の患者は、移植後に連続血液採取を受けた。試験試料の選択は、（ａ）適切な血漿が利用可能であること、及び（ｂ）試料が生検情報と関連付けられているかに基づく。完全な３００試料コホートのうち、７２．３％は、生検の日に採血された。

【0210】

血液試料中のｄｄ－ｃｆＤＮＡ測定
無細胞ＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて血漿試料から抽出し、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋキット（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ、ＵＳＡ）で製造業者の指示に従って定量した。無細胞ＤＮＡを、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているＮａｔｅｒａライブラリプレップキットを使用して、ライブラリ調製に入力した。ライブラリをプラトーにするために、１８サイクルのライブラリ増幅の修正を伴った。精製されたライブラリは、Ａｂｂｏｓｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ ５４５：４４６－４５１（２０１７）に記載されているように、ＬａｂＣｈｉｐ ＮＧＳ ５ｋを使用して定量した。標的の濃縮は、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｅｎａｔ．Ｄｉａｇｎ．３２：１２３３－１２４１（２０１２）に記載の修正バージョンを使用して、１３，３９２の一塩基多型（ＳＮＰ）を標的として、大規模多重化ＰＣＲ（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ－ＰＣＲ）（ｍｍＰＣＲ）を使用して達成した。次いで、試料当たり１０００万～１１００万リードで、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ ２５００ Ｒａｐｉｄ Ｒｕｎ（登録商標）で５０サイクルの単一末端でアンプリコンを配列決定した。

【0211】

ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲの統計分析
各試料において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定し、拒絶状態と相関させ、結果をｅＧＦＲと比較した。該当する場合、全ての統計的検定は両側であった。有意性は、ｐ＜０．０５に設定した。患者におけるｄｄ－ｃｆＤＮＡの分布は、群間で激しく歪んでいたため、データは、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定、続いてＤｕｎｎ多重比較検定を用いて、Ｈｏｌｍ補正ありで分析した。ｅＧＦＲ（ｍｇ／ｄＬでの血清クレアチニン）は、成人及び小児患者について前述のように計算した。簡単に述べると、ｅＧＦＲ＝１８６×血清クレアチニン^{－１．１５４}×年齢^{－０．２０３}×（黒人の場合は１．２１０）×（女性の場合は０．７４２）である。

【0212】

拒絶マーカーとしてのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ^２）のパフォーマンスを評価するために、試料をＡＲ群及び非拒絶反応群（ＢＬ＋ＳＴＡ＋ＯＩ）に分けた。この分類を使用して、以下の所定のカットオフを使用して、試料をＡＲとして分類した：ｄｄ－ｃｆＤＮＡについては１％超、ｅＧＦＲについては６０．０未満。

【0213】

各マーカーの性能パラメータ（感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）、陰性予測値（ＮＰＶ）及び曲線下面積（ＡＵＣ））を計算するために、ブートストラップ法を使用して、患者内の反復測定を考慮した。簡単に説明すると、各ブートストラップステップにおいて、各患者から単一の試料を選択した。患者間の独立性を仮定することにより、パフォーマンスパラメータ及びその標準誤差を計算した。これを１０，０００回繰り返した。最終信頼区間は、標準正規分位のブートストラップ標準誤差の平均を有するパラメータのブートストラップ平均を用いて計算した。感度及び特異性の標準誤差は、二項分布を仮定して計算し、ＰＰＶ及びＮＰＶについては正規近似を使用し、ＡＵＣについてはＤｅＬｏｎｇ法を使用した。パフォーマンスは、プロトコル生検と同時に採取された試料からなるサブコホートを含む、一致した生検を有する全ての試料について計算した。

【0214】

ドナータイプ（生存する関連者、生存する非関連者、及び死亡した非関連者）によるｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの差異もまた評価した。有意性は、上述のように、Ｋｒｕｓｋａｌ－Ｗａｌｌｉｓ順位和検定を用いて決定された。経時的なｄｄ－ｃｆＤＮＡの相互変動及び内部変動を、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ上の対数変換を用いた混合効果モデルを使用して評価し、患者内及び患者間の標準偏差の９５％信頼区間（ＣＩ）を、尤度プロファイル法を使用して計算した。

【0215】

事後分析は、（ａ）ＮＰＶを最大化するための異なるｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値、並びに（ｂ）ＡＲ診断のためのＰＰＶを改善し得る経験的拒絶ゾーンを定義するためのｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びｅＧＦＲを組み合わせたものを評価した。全ての分析は、ＦＳＡ（Ｄｕｎｎ検定の場合）、ｌｍｅ４（混合効果モデリングの場合）、及びｐＲＯＣ（ＡＵＣ計算の場合）パッケージを使用してＲ ３．３．２を用いて行った。

【0216】

生検試料
任意選択的に、腎生検を、病理学者によって盲検様式で分析し、活性拒絶反応（ＡＲ）について２０１７年のＢａｎｆｆ分類によって等級付けし、移植内Ｃ４ｄ染色を行って、急性体液性拒絶反応を評価した。活動性尿路感染症（ＵＴＩ）又は他の感染症の症例では、生検は行わなかった。移植「傷害」は、その以前の定常状態ベースライン値からの血清クレアチニンの２０％超の増加、及び活性拒絶（ＡＲ）、境界性拒絶（ＢＬ）、又は他の傷害（ＯＩ）（例えば、薬物毒性、ウイルス感染）のいずれかとして分類される関連する生検として定義された。活性拒絶反応は、最低でも以下の基準によって定義された：（１）間質性炎症（ｉ）スコア＞２を伴う尿細管炎（ｔ）スコア＞２若しくは血管変化（ｖ）スコア＞０のいずれかからなるＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、（２）糸球体炎（ｇ）スコア＞０若しくは尿細管周囲毛細血管炎スコア（ｐｔｃ）＞０若しくはｖ＞０を有し、Ｃ４ｄ＝２の原因不明の急性尿細管壊死／血栓性微小血管障害（ＡＴＮ／ＴＭＡ）を伴う、陽性ドナー特異的抗体（ＤＳＡ）からなるＣ４ｄ陽性抗体媒介拒絶反応（ＡＢＭＲ）、又は（３）ｇ＋ｐｔｃ≧２かつＣ４ｄが０若しくは１のいずれかである原因不明のＡＴＮ／ＴＭＡを伴う陽性ＤＳＡからなるＣ４ｄ陰性ＡＢＭＲ。境界変化（ＢＬ）は、説明される原因（例えば、ポリオマウイルス関連腎症（ＰＶＡＮ）／感染性原因／ＡＴＮ）なしで、ｔ１＋ｉ０、又はｔ１＋ｉ１、又はｔ２＋ｉ０によって定義された。ＢＬ変化に使用される他の基準は、ｇ＞０及び／若しくはｐｔｃ＞０、又はＤＳＡを伴わないｖ＞０、又はＣ４ｄ若しくは陽性ＤＳＡ、又は非ゼロｇ又はｐｔｃスコアを伴わない陽性Ｃ４ｄであった。正常（ＳＴＡ）同種移植片は、Ｂａｎｆｆスキーマによって定義されるような顕著な損傷病理の不在によって定義された。

【0217】

実施例２
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。実施例１に記載のワークフローは、２０２０年５月２９日に出願された、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｄｏｎｏｒ Ｄｅｒｉｖｅｄ Ｃｅｌｌ－Ｆｒｅｅ ＤＮＡ」と題する米国仮出願第６３／０３１，８７９号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、無細胞ＤＮＡの抽出の前に血漿試料にＳＮＰ遺伝子座を各々含有する１つ以上のトレーサーＤＮＡを添加することによって修正される。ｍｍＰＣＲ標的濃縮ステップの間、ＳＮＰ遺伝子座を標的とするプライマー対もまた、トレーサーＤＮＡを増幅する。試料中の全ｃｆＤＮＡの量は、トレーサーＤＮＡの配列リード数（バーコードによって識別可能）、試料ＤＮＡの配列リード数、及び血漿試料に添加されたトレーサーＤＮＡの既知の量を使用して推定される。

【0218】

実施例３
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。実施例１に記載のワークフローを使用して、同時膵腎移植（ｐａｎｃｒｅａｓ－ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）（ＳＰＫ）レシピエント及び順次腎移植後膵移植（ｐａｎｃｒｅａｓ ａｆｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ）（ＰＡＫ）レシピエントからの血漿試料を処理及び分析する。１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡ又は１．５％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ閾値は、安定した移植片を有する移植レシピエントからの急性拒絶反応を有するＳＰＫ移植レシピエントを首尾よく同定した。

【0219】

実施例４
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。

【0220】

同種移植拒絶反応の早期検出は、移植レシピエントの管理を成功させるために重要である。組織生検は、活性拒絶反応（ＡＲ）の診断のための「ゴールドスタンダード」であるが、侵襲性であり、再現性が低い。血清クレアチニンの変化などの従来の非侵襲性バイオマーカーは、ＡＲを検出するために利用可能であるが、感度及び特異性が低いために制限される。したがって、ＡＲを検出するための高い精度を有する新しい非侵襲性マーカーが必要とされている。

【0221】

ドナー由来無細胞ＤＮＡ分率（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％））は、同種移植拒絶反応を検出するための有望な非侵襲性バイオマーカーである。しかしながら、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％）は、高レベルの循環ｃｆＤＮＡによって人工的に低下させることができ、これは、肥満である患者、最近手術を受けた患者、医学的合併症を有する患者、又は特定の薬剤を受けている患者で生じ得る。これは、偽陰性の結果につながる可能性がある。

【0222】

最近、２つの研究は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対量が、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％）よりもＡＲを検出するためのより良い性能を示し得ることを示す予備的な証拠を提供した。本明細書では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％）及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対量（コピー／ｍＬ）の両方を組み合わせた新しい２閾値アルゴリズムを利用したアッセイからの結果を提示し、特にｃｆＤＮＡレベルが高い場合における検出の改善を通して、試験感度を増加させることを目的とする。

【0223】

この研究には、同種移植管理を受けている４１人の患者が含まれ、日常的な臨床ケアの一部としてｄｄ－ｃｆＤＮＡ検査を受けた。１８歳未満の患者、妊娠している患者、登録から２週間以内に腎臓以外の臓器移植又は輸血を行った患者は除外した。

【0224】

臨床検査は、１３，０００を超える一塩基多型を標的とする、大規模多重化ＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を使用してｃｆＤＮＡを増幅することによって行った。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率は、Ａｌｔｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１０３：２６５７－２６６５（２０１９）に従って測定した。ｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対濃度を較正して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの量（ｃｐ／ｍＬ）を得た。新しい２閾値アルゴリズムは、以前に検証されたｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率カットオフ（１％以上は拒絶反応のリスクを示す）と、以前に確立された７８ｃｐ／ｍＬ以上のｄｄ－ｃｆＤＮＡ量カットオフとを組み合わせた。いずれかの閾値を超える試料は、ＡＲのリスクが高いとみなした。

【0225】

マッチした生検結果（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験の４週間以内に行われた原因生検について）は、１６人の患者で利用可能であり、１６人中１４人は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ試験の２週間以内に行われた。生検試料は、Ｂａｎｆｆ ２０１７分類を使用して標準的な慣行に従って、病理学者によって分析及び等級付けされた。生検のない試料は、臨床評価に基づいて、活性拒絶反応を有しないもの（血清クレアチニン及び他の臨床指標に従って安定している）として分類された。ＡＲは、行われた１６回中９回の生検（５６％）で見出され、５回はＴ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、１回は抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）、３回は混合型（ＡＢＭＲ／ＴＣＭＲ）に分類された。

【0226】

試料では、４１人の患者について、各アルゴリズムの感度及び特異性を計算した。≧１％ ｄｄ－ｃｆＤＮＡカットオフに基づいて、元の方法では、感度が７／９（７７．８％、９５％ ＣＩ：４０．０～９７．２％）、及び特異性が２９／３２（９０．６％、９５％ ＣＩ：７５．０～９８．０％）であった。２閾値アルゴリズムをデータセットに適用すると、感度が９／９（１００％、９５％ ＣＩ：６６．４～１００％）、及び特異性が２８／３２（８７．５％、９５％ ＣＩ：７１．０～９６．５％）であった。

【0227】

本発明者らの結果は、同種移植の拒絶反応状態を評価するためにｄｄ－ｃｆＤＮＡ量及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率の両方を使用すると、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率のみを使用するよりも性能を向上させることができることを示唆している。予想と一致して、新しい閾値の導入に応じて呼び出しが変化した３人の患者は、高い全ｃｆＤＮＡレベルを有し、したがって、ドナー分率の低下は、１％ドナー分率カットオフのみを使用する場合、２つの事例で偽陰性の結果につながった。

【0228】

結論として、この研究は、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ閾値の量と以前に検証されたｄｄ－ｃｆＤＮＡ（％）閾値との組み合わせが、高い特異性を維持しながら、腎同種移植患者におけるＡＲの検出において改善された感度を生み出すことができることを示唆している。

【0229】

実施例５
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。

【0230】

背景：ドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の分率及び量の両方が、同種移植拒絶反応に関連することが示されている。本研究では、２つの変数の組み合わせに対するこれらの変数の各々の相対予測力を調べ、腎同種移植の生検における活性拒絶反応を検出するために両方の変数を組み込んだアルゴリズムを開発した。

【0231】

方法：マイクロアレイ由来の遺伝子発現及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの結果を用いて収集された最初の４２６の連続指標生検試料を含めた。意図された臨床使用をシミュレートするための除外した後、３６７試料を分析した。生検は、分子顕微鏡診断システム（ＭＭＤｘ）及び組織学（Ｂａｎｆｆ ２０１９）を使用して評価した。ロジスティック回帰分析では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率及び量を組み合わせることで、いずれか一方に予測値を追加するかどうかを調べた。最初の連続した１４９試料を使用して２閾値アルゴリズムを開発し、次の２１８試料を使用してアルゴリズムを検証した。

【0232】

結果：回帰において、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率及び量の組み合わせは、いずれかの変数単独よりも有意に予測的であることがわかった（ｐ値０．００９及び＜０．０００１）。試験セットにおいて、２変数システムのＡＵＣは０．８８であり、２閾値アルゴリズムの性能は、分子診断については感度８３．１％及び特異性８１．０％、組織診断については感度７３．５％及び特異性８０．８％を示した。

【0233】

結論：腎臓移植患者におけるこの前向き生検マッチ多部位ｄｄ－ｃｆＤＮＡ研究では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率及び量の組み合わせると、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率又は量のいずれか単独よりも強力であることが見出され、両方の変数を組み込んだ新規の２閾値アルゴリズムを検証した。

【0234】

実施例６
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。

【0235】

背景：同時膵腎移植（ＳＰＫＴｘ）における膵臓移植状態は、現在、非特異的生化学マーカー（典型的には、アミラーゼ及び／又はリパーゼ）によって評価されている。早期膵臓移植拒絶反応を検出するのに優れた感度を有する非侵襲性バイオマーカーを同定することは、ＳＰＫＴｘ管理を改善する可能性がある。

【0236】

方法：ここで、本発明者らは、ＳＰＫＴｘレシピエントのコホートにおける膵臓移植の生検で証明された急性拒絶反応を予測する際のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の性能を探索するためのパイロット研究を開発した。本発明者らは、Ｐｒｏｓｐｅｒａ（商標）試験（Ｎａｔｅｒａ，Ｉｎｃ．）を使用して、生検とマッチした少なくとも１つの血漿試料を有する３６人のＳＰＫＴｘレシピエントにおけるｄｄ－ｃｆＤＮＡを測定した。ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、全ｃｆＤＮＡの分率（分率、％）及びレシピエントの血漿中の濃度（量；コピー／ｍＬ）の両方として報告された。

【0237】

結果：膵臓の生検で証明された急性拒絶反応（Ｐ－ＢＰＡＲ）がない場合、ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、ＳＰＫＴｘ後の最初の４５日以内に採取された試料において、その後測定されたものと比較して、有意に高かった（中央値（％）：１．００対０．３０、中央値がそれぞれ１２８．２対５３．３（ｃｐ／ｍＬ）、ｐ＝０．００１）。４５日目以降に得られた試料において、Ｐ－ＢＰＡＲ試料は、安定した試料よりも有意に高いｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率（０．８３対０．３０％、ｐ＝０．００６）及び量（８１．３対５３．３ｃｐ／ｍＬ、ｐ＝０．００１）を示した。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量をｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率とともに組み込むこと、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率単独を上回り、活性拒絶反応を検出する。特に、７０ｃｐ／ｍＬのカットオフ量を使用すると、ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、Ｐ－ＢＰＡＲの診断については８５．７％の感度及び９３．７％の特異性でＰ－ＢＰＡＲを検出した。これは、現在のバイオマーカーよりも正確であった（ｄｄ－ｃｆＤＮＡのＡＵＣは、リパーゼの０．７４及びアミラーゼの０．４６と比較して、０．８９であった）。

【0238】

結論：単純な非侵襲性血液検査によるｄｄ－ｃｆＤＮＡの測定は、ＳＰＫＴｘ患者の移植管理に役立つように臨床診療に組み込むことができる。

【0239】

実施例７
この実施例は例示にすぎず、当業者は、本明細書に開示される発明が様々な他の方法で実施され得ることを理解するであろう。

【0240】

同時膵腎移植（ＳＰＫＴｘ）は、１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）及び末期腎疾患（ＥＳＲＤ）を有する患者にとって最良の治療法選択肢と考えられている。糖尿病性腎症は、持続的な高血糖によって引き起こされる微小血管合併症であり、ＥＳＲＤの主な原因の１つである。ＳＰＫＴｘは、正常血糖を再確立し、したがって、微小血管合併症及び大血管合併症の予測されるリスクの低減につながるため、インスリン依存性糖尿病を有する患者における予後及び健康状態を有意に改善することができる。

【0241】

膵臓移植拒絶反応は、移植不全の主な原因であり、急性拒絶反応の発生率は、最初の１２ヶ月で最大２１％になる。移植拒絶反応を評価するための現在のツールは、移植片の外分泌機能（例えば、アミラーゼ、リパーゼ）又は内分泌機能（例えば、血糖、ＨｂＡ１Ｃ、Ｃ－ペプチド）を評価する臨床検査に依存している。驚くべきことに、これらの検査は、天然の膵臓の外分泌機能がほとんどの患者で保存されているため、非常に非特異的であり、したがって、これらのパラメータのいずれかの上昇も、膵臓移植拒絶反応に関連していない可能性がある。膵臓移植片生検は、急性拒絶反応の診断の判断基準である。しかしながら、生検は、かなりの割合の合併症を有する侵襲的処置であり、しばしば、移植機能不全の存在にもかかわらず、実施することができないか、又は有意な情報が得られない（最大３９％の時間）。したがって、最終的にＳＰＫＴｘ移植レシピエントの管理を改善することができる、同種移植の状態を評価し傷害／拒絶反応を監視するための、非侵襲性のドナー特異的な動的バイオマーカーに対する明確なニーズが存在する。

【0242】

いくつかの研究は、固形臓器移植（肺、腎臓、心臓、肝臓）のレシピエントの血液中のドナー由来無細胞ＤＮＡ（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ）の測定が、同種移植拒絶反応のリスクと非拒絶反応のリスクを区別することができることを実証している。ＳＰＫＴｘ移植レシピエントにおける拒絶反応のリスクを評価するためのｄｄ－ｃｆＤＮＡの可能性を評価する研究は限られている。このパイロット研究では、Ｐｒｏｓｐｅｒａ（商標）試験の性能を評価した。これは、ＳＮＰベースのｍｍＰＣＲ法を使用して、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの割合及び量の両方を測定し、移植片の状態について組織学的にプロファイリングされた３６人のＳＰＫ移植レシピエントにおける拒絶反応のリスクを評価した。

【0243】

材料及び方法
研究設計及び患者集団。この分析には、膵臓生検と対応付けられた血漿試料（ｎ＝４１）が含まれた。ｄｄ－ｃｆＤＮＡの定量に対するドナー関連及び手術直後の合併症の影響の可能性を説明するために、ＳＰＫ移植の前及び４５日後に別々に採取された試料を検討した。合計４１個の移植片生検のうち、１８個が移植後４５日以内に採取され、２３個が移植後４５日以降に採取された。

【0244】

患者の試料。膵臓移植片の生検は、プロトコルに従って又は原因に基づいてのいずれかで行われた。センターのプロトコルに従って、原因生検は、患者が膵臓酵素（アミラーゼ及び／又はリパーゼ）において持続的な（４８時間以上離れた２回以上の測定）上昇（正常値の２倍以上）を示した場合に適応された。試料は、超音波ガイド経皮ニードルパンチによって得られ、２０１１ Ｂａｎｆｆ基準に従って分類された。分析目的で、生検は、「拒絶反応なし」又は拒絶反応として更に再分類され、後者は、Ｂａｎｆｆカテゴリ：不確定、Ｔ細胞媒介性拒絶反応（ＴＣＭＲ）、及び抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）を含む。ｄｄ－ｃｆＤＮＡの誤解を招く解釈を避けるため、生検の実施前、膵臓移植片の生検の日に、全血及び血清試料を得た。全血試料を使用してｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルを測定し、血清試料を使用してアミラーゼ（Ｕ／ｌ）、リパーゼ（Ｕ／ｌ）、クレアチニン（ｍｇ／ｄＬ）、及び抗グルタミン酸脱炭酸酵素抗体（ＧＡＤ）を測定した。加えて、血清試料を、Ｌｉｆｅｃｏｄｅｓ ＬｉｆｅＳｃｒｅｅｎ Ｄｅｌｕｘｅフロービーズアッセイ（Ｉｍｍｕｃｏｒ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して、ＨＬＡクラスＩ及びＩＩドナー特異的抗体（ＤＳＡ）についてスクリーニングした。ＨＬＡ抗体のスクリーニングが陽性である患者において、Ｌｉｆｅｃｏｄｅｓ Ｓｉｎｇｌｅ Ａｎｔｉｇｅｎビーズアッセイ（Ｉｍｍｕｃｏｒ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ，ＵＳＡ）を使用して抗体の特異性を決定した。Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃａｔａｌｕｎｙａのプロトコルに従って、平均蛍光強度（ＭＦＩ）が１５００を超えるＤＳＡを陽性とみなした。Ａ／Ｂ／ＤＲＢ１ ＨＬＡ遺伝子座は、全ての患者においてＤＳＡについて考慮されたが、ＤＱＢ１／ＤＰ１／Ｃ ＨＬＡ遺伝子座は、利用可能な場合にのみＤＳＡについて考慮された。

【0245】

Ｐｒｏｓｐｅｒａ（商標）試験を使用したｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルの評価。全血をＰＡＸｇｅｎｅ血液ｃｃｆＤＮＡ ＤＮＡチューブ（ＱＩＡＧＥＮ（著作権））に採取し、製造業者の指示に従って全血を２回遠心分離することによって血漿試料を得た。次いで、血漿を、試料処理まで－８０Ｃで保管した。大規模多重ＰＣＲ（ｍｍＰＣＲ）を使用して、１３，９２６のＳＮＰを標的として、血漿試料中のｃｆＤＮＡを増幅し、続いて、Ａｌｔｕｇ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１０３：２６５７－２６６５（２０１９）に記載されているようにアンプリコンを配列決定した（Ｐｒｏｓｐｅｒａ（商標），Ｎａｔｅｒａ Ｉｎｃ．，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）。試料は、４ｍＬ未満の血漿を有する試料を除いて（９回の追加のＰＣＲサイクルを有する）、標準的なＣＬＩＡプロトコルに従って実行した。ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルは、全ｃｆＤＮＡの分率（％、中央値［ＩＱＲ］）として、及びレシピエントの血漿中の濃度（コピー／ｍＬ、中央値［ＩＱＲ］）として報告された。

【0246】

統計解析。中央値測定値の比較は、Ｍａｎｎ－Ｗｈｉｔｎｅｙ Ｕ検定を使用して行った。Ｐ値＜０．０５を統計的に有意とみなした。必要に応じて、多重検定用にＢｅｎｊａｍｉｎｉ－Ｈｏｃｈｂｅｒｇ（ＢＨ）調整を使用してＰ値を調整した。ＲＯＣ曲線を構築し、様々な閾値について感度、特異性、陽性予測値（ＰＰＶ）及び陰性予測値（ＮＰＶ）を計算した。統計分析は、ＳｃｉＰｙ及びｓｔａｔｓｍｏｄｅｌｓパッケージ（Ｐｙｔｈｏｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，バージョン，（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｐｙｔｈｏｎ．ｏｒｇ／ｐｓｆ／）を使用して、Ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語で行った。連続変数のグラフィカル表現は、中央値及び四分位範囲［ＩＱＲ］として示される。

【0247】

ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及び膵臓移植拒絶反応。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率の中央値は、拒絶反応を有しない患者と比較した場合（０．５２％［ＩＱＲ：０．２１～０．７８］）、生検で証明された膵臓移植片の急性拒絶反応を有する患者（Ｐ－ＢＰＡＲ、１．０５％［０．８１～１．６７］）で有意に高かった（ｐ＝０．０００４）。同様に、Ｐ－ＢＰＡＲを有する患者では、中央値絶対ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、拒絶反応を有しない患者（５１．５ｃｐ／ｍＬ［ＩＱＲ：２２．２～７６．７）と比較した場合、有意に高かった（１０３．７０ｃｐ／ｍＬ［ＩＱＲ：７６．７０～１８９．８０］）（ｐ＝０．０００７）。これらのデータは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率と量の両方が、ＳＰＫＴｘレシピエントにおける膵臓移植拒絶反応と非拒絶状態とを区別できることを示唆している。

【0248】

ドナー及び手術関連臓器損傷の潜在的な交絡因子を探索するために、本発明者らは、移植の前及び４５日後のｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルを比較した。拒絶反応のない患者では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率及びｄｄ－ｃｆＤＮＡの絶対量は、４５日後に生検を行った患者と比較して、手術後早期で有意に高かった（それぞれ中央値％１．００対０．３０、ｐ＝０．００１；それぞれ中央値１２８．２対３５．３ｃｐ／ｍＬ、ｐ＝０．００１）。ＳＰＫＴｘ後の最初の４５日間、非拒絶反応試料とＢＰＡＲを有する試料との間に、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量の分率（ｐ＝０．１２０）又はｄｄ－ｃｆＤＮＡ量（ｐ＝０．２９０）として、ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルに統計的な差はなかった。対照的に、移植後４５日以降に採取された生検マッチ血液試料では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ量の両方が、ＢＰＡＲコホート（０．８３％［ＩＱＲ０．６７～１．５８］、８１．３ｃｐ／ｍＬ［ＩＱＲ７３．４～１５２．０］）において、非拒絶反応コホート（それぞれ０．３０％［ＩＱＲ０．１４～０．５２］、ｐ＝０．００６、及び３５．３ｃｐ／ｍＬ［ＩＱＲ１９．５～５５．０］、ｐ＝０．００１）と比較して有意に高かった。急性拒絶群から不確定生検を除外した場合、ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルは、非拒絶反応の事例と比較して、依然として有意に上昇していた（拒絶反応０．８１％［０．５２～０．８３］に対して非拒絶反応０．３０％［０．１４～０．５２］、ｐ＝０．０３１）。これらのデータは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの分率と量の両方が、移植後４５日以降の移植拒絶反応と非拒絶状態とを区別することができることを示唆している。

【0249】

次に、膵臓移植拒絶反応と非拒絶反応とを正確に区別するであろうｄｄ－ｃｆＤＮＡの最適なカットオフ値を特定することを目的とした。本発明者らは、ａ）１％のｄｄ－ｃｆＤＮＡのカットオフ、及びｂ）ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率カットオフ（１％以上）と７８ｃｐ／ｍＬ以上のｄｄ－ｃｆＤＮＡ量カットオフとを組み合わせた２閾値アルゴリズムを適用することによって、腎臓同種移植拒絶反応を検出する際の２つの最近発表された閾値の能力を評価した。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率のみを使用した感度は、２８．６％（２／７）であった。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率とｄｄ－ｃｆＤＮＡ量とを組み合わせた２閾値アルゴリズムを使用する場合、感度は、５７．１％（４／７）でかなり高かった。特異性は、それぞれ１００％及び９３．７％で、両方のカットオフについて優れていた。７０ｃｐ／ｍＬのｄｄ－ｃｆＤＮＡ量カットオフ値を使用する場合、ＰＰＶ８５．７％の及び９３．７％のＮＰＶとともに、９３．７％の高い特異性を維持しながら、感度が８５．７％（６／７）に増加した。

【0250】

ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びＤＳＡ。移植後４５日以降に採取された生検のうちの１つのみが、抗体媒介性拒絶反応（ＡＢＭＲ）を特徴としたが、３人の患者が循環ＤＳＡを有することが見出された。本発明者らは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率が、ＤＳＡについて試験で陽性であった試料（０．８３％［０．８２～２．５］）では、試験で陰性であった試料（０．３９％［０．１８～０．５５］、ｐ＝０．０２２）に対して有意に上昇したことを見出した。同様に、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量が、ＤＳＡについて試験で陽性であった試料（９４．２ｃｐ／ｍＬ［８４．７～２６４．１］）では、試験で陰性であった試料（４８．１ｃｐ／ｍＬ［２１．０～６３．０］、ｐ＝０．０２４）に対して有意に上昇したことを見出した。

【0251】

他のバイオマーカーと比較したｄｄ－ｃｆＤＮＡの性能。次に、本発明者らは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡの性能を、移植片監視の評価に使用されている従来の臨床試験と比較しようとした。本発明者らは、膵臓生検と同時に採取された血液試料中のアミラーゼ及びリパーゼのレベルを測定した。アミラーゼレベルは、拒絶反応群と非拒絶反応群との間で有意に変化しなかったが（ｐ＝０．４０）、リパーゼは、非拒絶反応群と比較して、拒絶反応群で有意に高かった（ｐ＝０．０３８）。本発明者らは、移植後４５日以降の膵臓移植片生検の組織病理学的結果に基づいて、移植拒絶反応と非拒絶反応とを区別する際のアミラーゼ、リパーゼ、及びｄｄ－ｃｆＤＮＡ（分率及び量）の診断能力を比較した。膵臓移植拒絶反応と非拒絶反応とを区別する際のこれらのバイオマーカーの計算されたＡＵＣは、以下のとおりであった：（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量：０．８９）、（ｄｄ－ｃｆＤＮＡ分率：０．８４）、（リパーゼ：０．７４）、（アミラーゼ：０．４６）。これらのデータは、ｄｄ－ｃｆＤＮＡが、ＳＰＫＴｘレシピエントにおける膵臓拒絶反応と非拒絶反応とを区別するために伝統的に使用されるマーカーアッセイよりも優れていることを示唆する。ｄｄ－ｃｆＤＮＡ及びリパーゼを同時に組み合わせる試みがｄｄ－ｃｆＤＮＡの性能を向上させなかったことに言及することは注目に値する。

【0252】

考察：このパイロット研究は、ＳＰＫＴｘレシピエントにおける膵臓移植拒絶反応を診断するためのｄｄ－ｃｆＤＮＡの性能を初めて探索するものである。本発明者らは、安定した患者の間で、ｄｄ－ｃｆＤＮＡレベルが、４５日以降に行われたものと比較して、移植後最初の４５日間に上昇することを見出した。この初期の期間（４５日以内）の間、ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、Ｐ－ＢＰＡＲと非拒絶反応とを区別することができなかった。関連して、移植後４５日以降に行われた生検では、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ量は、それぞれ８５％及び９３％の感度及び特異性で、Ｐ－ＢＰＡＲを有する生検と急性拒絶反応を有しない生検とを区別することができる。更に、ｄｄ－ｃｆＤＮＡは、現在利用可能なバイオマーカーであるアミラーゼ及びリパーゼよりも優れた性能を示した。注目すべきことに、リパーゼとｄｄ－ｃｆＤＮＡとを組み合わせても、ｄｄ－ｃｆＤＮＡ単独と比較して診断精度は向上しなかった。

【国際調査報告】