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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-20
(54)【発明の名称】エレクトロポレーション用緩衝液
(51)【国際特許分類】
C12N 15/87 20060101AFI20240213BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240213BHJP
C12M 1/00 20060101ALI20240213BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240213BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240213BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240213BHJP
C12N 5/071 20100101ALN20240213BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20240213BHJP
A61P 37/02 20060101ALN20240213BHJP
A61P 35/00 20060101ALN20240213BHJP
【ＦＩ】
C12N15/87 Z
C12N5/10
C12M1/00 A
A61K35/17
A61P43/00 111
C12N5/0783
C12N5/071
C12N1/00 U
A61P37/02
A61P35/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550575
(86)(22)【出願日】2022-02-28
(85)【翻訳文提出日】2023-08-22
(86)【国際出願番号】 US2022018154
(87)【国際公開番号】W WO2022183109
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】63/154,050
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/184,908
(32)【優先日】2021-05-06
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】508087044
【氏名又は名称】プレシゲン，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000659
【氏名又は名称】弁理士法人広江アソシエイツ特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】バトマン，ブライアン
(72)【発明者】
【氏名】スローン，ロバート
(72)【発明者】
【氏名】ロバーツ，スティーブン
(72)【発明者】
【氏名】グリーン，テャド
(72)【発明者】
【氏名】ソ，ヴィンセント
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B029AA24
4B029BB11
4B029CC01
4B065AA93Y
4B065AA94X
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA03
4B065BB02
4B065BB14
4B065BB38
4B065BC01
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087AA03
4C087BB65
4C087CA04
4C087NA13
4C087ZB07
4C087ZB26
4C087ZC02
(57)【要約】
溶媒、糖、塩化物塩、及び緩衝剤を含む、エレクトロポレーション緩衝液。特定の実施形態では、溶媒が、水であり、糖が、グルコース又はマンニトールであり、塩化物塩が、塩化カリウム（ＫＣｌ）又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）であり、緩衝剤が、リン酸ナトリウム、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である。エレクトロポレーションの方法であって、単離された真核細胞、細胞に対して外因性である生体物質、及び前述の緩衝液を含む懸濁液に電流を印加することを含む、方法。そのような方法を使用して産生された、組換え細胞。１つ以上のチャンバと、１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極対であって、各電界が、１つのチャンバに対応する、電極対と、フローチャネルと、を備える、エレクトロポレーション装置。前述のエレクトロポレーション装置を利用することを含む、エレクトロポレーションのための方法。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
溶媒、糖、塩化物塩、及び緩衝剤を含む、緩衝液。
【請求項2】
前記溶媒が、水であり、前記糖が、グルコース又はマンニトールであり、前記塩化物塩が、塩化カリウム（ＫＣｌ）又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）であり、前記緩衝剤が、リン酸ナトリウム、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）である、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項3】
水、グルコース又はマンニトール、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びリン酸ナトリウムから本質的になる、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項4】
約１０ｍＭ～約５０ｍＭの量のグルコース又はマンニトールを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項5】
約１ｍＭ～約３０ｍＭの量のＫＣｌを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項6】
約５ｍＭ～約５０ｍＭの量のＭｇＣｌ２を含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項7】
約５０ｍＭ～約１６０ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項8】
約１ｍＭ～約３０ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項9】
総緩衝液体積の約０体積％～約２．５体積％の量のＤＭＳＯを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項10】
水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の緩衝液。
【請求項11】
水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウムから本質的になる、請求項１０に記載の緩衝液。
【請求項12】
水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース若しくはマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウム、並びに約５ｍＭ～約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び／又は前記緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯから本質的になる、請求項１０に記載の緩衝液。
【請求項13】
エレクトロポレーションの方法であって、単離された真核細胞、前記細胞に対して外因性である生体物質、及び請求項１に記載の緩衝液を含む懸濁液に電流を印加することを含む、方法。
【請求項14】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記生体物質が、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項16】
請求項１３に記載の方法を使用して産生された、組換え細胞。
【請求項17】
前記細胞が、組換えＴ細胞である、請求項１６に記載の組換え細胞。
【請求項18】
疾患又は障害の治療のための医薬品の調製における、請求項１７に記載の組換えＴ細胞の使用。
【請求項19】
１つ以上のチャンバと、前記１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極対であって、各電界が、１つのチャンバに対応する、電極対と、フローチャネルと、を備える、エレクトロポレーション装置。
【請求項20】
請求項１９に記載のエレクトロポレーション装置を利用することを含む、エレクトロポレーションのための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、電流を使用して生物学的に活性な物質を細胞に送達することができる緩衝液、緩衝液を使用して生物学的に活性な物質を細胞に導入するための方法、及び緩衝液を含むキットに関する。
【0002】
参照による援用
本明細書における全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が各々参照によりその全体が援用されると具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に援用される。本明細書で定義される用語と援用される参照における用語との間に矛盾がある場合、本明細書で定義される用語が優先される。
本明細書における全ての刊行物、特許、及び特許出願は、個々の刊行物、特許、又は特許出願が各々参照によりその全体が援用されると具体的かつ個別に示されているかのように、それらの全体が参照により本明細書に援用される。本明細書で定義される用語と援用される参照における用語との間に矛盾がある場合、本明細書で定義される用語が優先される。
【背景技術】
【0003】
外因性生体物質を細胞に導入するための主な方法は、エレクトロポレーション（ＥＰ）である。この方法は、細胞の特性及び機能の遺伝子操作、改変、又は他の操作のために一般的に使用されている。エレクトロポレーションの間、生体物質は緩衝液に溶解され、次いで、電流を利用して細胞内に導入される。このプロセスでは、細胞膜は、短い電気パルスの作用によって透過性にされ、したがって、生物学的に活性な物質が細胞に入ることを可能にし、このプロセスは「トランスフェクション」として知られている。
【0004】
エレクトロポレーションの間、生体物質が細胞内にトランスフェクトされる効率及び／又はトランスフェクトされた細胞のその後の生存率は、望ましくないほど低くなり得る。この低いトランスフェクション効率及び／又は低いエレクトロポレーション後生存率は、以下を含むいくつかの要因に起因し得る：エレクトロポレーション条件（例えば、印加電圧、細胞取り扱いの持続時間及び性質）；使用される緩衝液の組成；導入される生体物質の性質；宿主細胞集団の健康状態、年齢、及び固有の生存率；細胞型；細胞密度（溶液中）；細胞コンフルエンシー；細胞分裂速度、細胞脆弱性、細胞周期相（例えば、増殖、分裂、又は静止細胞）；接触阻害に対する細胞感受性など。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
多くのエレクトロポレーション緩衝液は、望ましくないトランスフェクション効率を提供し、及び／又は望ましくないほど多数の化学成分を含み、そのうちのいくつかは、細胞生存率又はトランスフェクション効率に有害であり得る。したがって、当該技術分野では、簡素化及び／又は最適化されたエレクトロポレーション緩衝液、すなわち、含有する全体的な成分がより少ないが、それでも高いトランスフェクション効率及び対応してトランスフェクト細胞の高い生存率を達成することができる緩衝液の必要性がある。
【課題を解決するための手段】
【0006】
本明細書において、エレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液が提供され、これは、市販の多くのエレクトロポレーション緩衝液よりも少ない化学成分を含むが、驚くほど高いトランスフェクション効率及びエレクトロポレーション後細胞生存率を達成することができる。緩衝液は、細胞への生体物質の取り込みを最大化しながら、細胞への害を最小化するように最適化された化学成分の相乗的な組み合わせ及び濃度を提供することによってこれを達成する。
【0007】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、エレクトロポレーションによって細胞集団をトランスフェクトすることができる。特定の実施形態では、細胞は、真核細胞である。特定の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。特定の実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及び／又はリンパ球（例えば、Ｂ細胞及びＴ細胞）である。
【0008】
したがって、本発明は、部分的には、溶媒、糖、１つ以上の塩化物塩、及び１つ以上の緩衝剤を含む緩衝液に関する。いくつかのそのような実施形態では、溶媒は、水であり、糖は、グルコース又はマンニトールであり、１つ以上の塩化物塩は、塩化カリウム（ＫＣｌ）及び／若しくは塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含み、かつ／又は１つ以上の緩衝剤は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎａ２ＨＰＯ４（二塩基性リン酸ナトリウム）、ＮａＨ２ＰＯ４（一塩基性リン酸ナトリウム）、及び／若しくはＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨ２ＰＯ４（本明細書では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４若しくはリン酸ナトリウムと互換的に称される）との組み合わせを含む。特定の実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯ及び／又はＨＥＰＥＳを含まない。
【0009】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、グルコース及び／又はマンニトール、ＫＣｌ及び／又はＭｇＣｌ２、並びにリン酸ナトリウムを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、グルコース及び／又はマンニトール、ＫＣｌ及び／又はＭｇＣｌ２、リン酸ナトリウム、並びにＨＥＰＥＳ及び／又はＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0010】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のグルコースは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約３０ｍＭ又は約３１ｍＭの量で存在する。
【0011】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のマンニトールは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態ではマンニトールは、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、マンニトールは、約３０ｍＭ又は約３１ｍＭの量で存在する。
【0012】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のＫＣｌは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＫＣｌは、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＫＣｌは、約５ｍＭ又は約１０ｍＭの量で存在する。
【0013】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約６ｍＭ～約４５ｍＭ、約７ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約３５ｍＭ、約９ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約１０ｍＭ又は約１５ｍＭの量で存在する。
【0014】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のリン酸ナトリウムは、約５０ｍＭ～約１６０ｍＭ、約６０ｍＭ～約１５０ｍＭ、約７０ｍＭ～約１４０ｍＭ、約７５ｍＭ～約１３０ｍＭ、約８０ｍＭ～約１２５ｍＭ、約９０ｍＭ～約１２５ｍＭ、又は約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、リン酸ナトリウムは、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、リン酸ナトリウムは、約９０ｍＭ又は約１０５ｍＭの量で存在する。
【0015】
いくつかの実施形態では、緩衝液中のＨＥＰＥＳは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約５ｍＭ～約１０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約５ｍＭ又は約１０ｍＭの量で存在する。
【0016】
いくつかの実施形態では、緩衝液中に存在するＤＭＳＯの量は、緩衝液の総体積の０体積％～約２．５体積％、約０．１体積％～約５体積％、約１体積％～約５体積％、約２体積％～約５体積％、約３体積％～約５体積％、又は約４体積％～約５体積％の量で存在する。
【0017】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウム、並びに０ｍＭ～約１０ｍＭ若しくは約５ｍＭ～約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び／又は緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【0018】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭのグルコース又はマンニトール、約１０ｍＭのＫＣｌ、約２０ｍＭのＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭのリン酸ナトリウム、及び約５ｍＭのＨＥＰＥＳを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭのグルコース又はマンニトール、約１０ｍＭのＫＣｌ、約２０ｍＭのＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭのリン酸ナトリウム、約５ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0019】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約３１ｍＭのグルコース又はマンニトール、約５ｍＭのＫＣｌ、約１５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭのリン酸ナトリウムを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３１ｍＭのグルコース又はマンニトール、約５ｍＭのＫＣｌ、約１５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭのリン酸ナトリウム、並びに約５ｍＭ～約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び／又は緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0020】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭのグルコース又はマンニトール、約５ｍＭのＫＣｌ、約１５ｍＭのＭｇＣｌ２、約９０ｍＭのリン酸ナトリウム、及び約１０ｍＭのＨＥＰＥＳを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭのグルコース又はマンニトール、約５ｍＭのＫＣｌ、約１５ｍＭのＭｇＣｌ２、約９０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、及び緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0021】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、細胞内浸透圧よりも低い浸透圧を有する。特定のそのような実施形態では、浸透圧は、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏであり得る。
【0022】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、約１０．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍの導電率を有する。
【0023】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．０～約７．１のｐＨを有する。
【0024】
本発明はまた、部分的には、エレクトロポレーションの方法に関し、単離された真核細胞、細胞に対して外因性である生体物質、及び本発明の緩衝液を含む懸濁液に電流を印加することを含む。懸濁液への電流の印加は、細胞への生体物質の導入を容易にする。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態では、生体物質は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む。
【0025】
いくつかの実施形態では、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも２×１０８個の細胞、少なくとも３×１０８個の細胞、少なくとも４×１０８個の細胞、少なくとも５×１０８個の細胞、少なくとも６×１０８個の細胞、少なくとも７×１０８個の細胞、少なくとも８×１０８個の細胞、少なくとも９×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、少なくとも６×１０９個の細胞、少なくとも７×１０９個の細胞、少なくとも８×１０９個の細胞、少なくとも９×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、少なくとも２×１０１０個の細胞、少なくとも３×１０１０個の細胞、少なくとも４×１０１０個の細胞、少なくとも５×１０１０個の細胞、少なくとも６×１０１０個の細胞、少なくとも７×１０１０個の細胞、少なくとも８×１０１０個の細胞、少なくとも９×１０１０個の細胞、少なくとも１×１０１１個の細胞、少なくとも２×１０１１個の細胞、少なくとも３×１０１１個の細胞、少なくとも４×１０１１個の細胞、少なくとも５×１０１１個の細胞、少なくとも６×１０１１個の細胞、少なくとも７×１０１１個の細胞、少なくとも８×１０１１個の細胞、少なくとも９×１０１１個の細胞、少なくとも１×１０１２個の細胞、少なくとも２×１０１２個の細胞、少なくとも３×１０１２個の細胞、少なくとも４×１０１２個の細胞、少なくとも５×１０１２個の細胞、少なくとも６×１０１２個の細胞、少なくとも７×１０１２個の細胞、少なくとも８×１０１２個の細胞、又は少なくとも９×１０１２個の細胞が、エレクトロポレーションプロセスに関与する。
【0026】
本発明はまた、部分的には、トランスフェクション効率を増加させる方法に関し、本方法は、単離された真核細胞及び細胞に対して外因性である生体物質を、本発明の緩衝液と組み合わせて、それによって、懸濁液を形成することと、懸濁液に電流を印加し、それによって、細胞への生体物質の導入を容易にすることと、を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法を使用する場合のトランスフェクション効率は、対照緩衝液を使用する場合の方法よりも少なくとも１．３５倍高いことが測定される。特定の実施形態では、生体物質は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む。特定の実施形態では、細胞は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞である。
【0027】
本発明はまた、部分的には、トランスフェクトされた細胞の回収率を増加させる方法に関し、本方法は、単離された真核細胞及び細胞に対して外因性である生体物質を、本発明の緩衝液と組み合わせて、それによって、懸濁液を形成することと、懸濁液に電流を印加し、それによって、細胞への生体物質の導入を容易にすることと、を含む。いくつかの実施形態では、そのような方法を使用する場合のトランスフェクトされた細胞の回収率は、対照緩衝液を使用する場合の方法よりも少なくとも１．５３倍高いことが測定される。特定の実施形態では、生体物質は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む。特定の実施形態では、細胞は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞である。
【0028】
本発明はまた、本発明の緩衝液を利用する方法を使用して生成された組換え細胞にも部分的に関連する。いくつかの実施形態では、細胞は、組換えヒト免疫細胞である。特定の実施形態では、細胞は、組換えリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、組換えＴ細胞である。
【0029】
本発明はまた、部分的には、本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生された組換えＴ細胞を使用する免疫療法の方法に関する。
【0030】
本発明はまた、部分的には、本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用する免疫療法の方法に関する。
【0031】
本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬品の調製における本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生された組換えＴ細胞の使用に関する。
【0032】
本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬品の調製における本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の使用に関する。
【0033】
本発明はまた、部分的には、エレクトロポレーションで使用するためのキットに関する。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の緩衝液と、点滴器、ピペット、又はキュベットと、を含む。特定の実施形態では、キットは、緩衝液及び他の成分を安全に輸送するための好適な包装を更に含む。
【0034】
本発明はまた、部分的には、エレクトロポレーション装置に関し、１つ以上のチャンバと、１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極対であって、各電界が１つのチャンバに対応する、電極対と、フローチャネルと、を備える。いくつかの実施形態では、装置は、入口ポートと、出口ポートと、入口ポート及び出口ポートをフローチャネルに接続する隣接するフローチャネルと、を更に備える。
【0035】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、回収プロセス中にフローチャネルから１つ以上のチャンバのうちの少なくとも１つに液体媒体をポンピングするためのポンプを更に備え、液体媒体が、入口ポートで得られる。特定の実施形態では、ポンプは、１つ以上のチャンバをフローチャネルに接続する１つ以上のバルブを更に備え得る。特定の実施形態では、１つ以上のバルブは、一度に１つずつ開くことが可能であり得る。特定の実施形態では、１つ以上のバルブは、流体の一方向の流れのみを可能にする。特定の実施形態では、１つ以上のバルブの各々は、１つ以上のチャンバのうちの１つのチャンバに対応する。特定の実施形態では、１つ以上のバルブは、ピンチバルブ又はピンチタイプのバルブである。特定の実施形態では、１つ以上のバルブは、ばね運動、レバー運動、又はピストン運動を使用して動作する。特定の実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、１つ以上のバルブに向かって狭くなる形状を有する。
【0036】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置はまた、１つ以上のチャンバに通じるその表面上の１つ以上の開口部と、１つ以上のチャンバ間の気流を接続する１つ以上の開口部の下の気流チャネルと、を含み得る。特定の実施形態では、エレクトロポレーション装置は、空気流チャネルをエレクトロポレーション装置の外部に接続するベント又はエアフィルタを更に含む。特定の実施形態では、エレクトロポレーション装置は、１つ以上の開口部を覆うように構成されたシールを更に含む。
【0037】
エレクトロポレーション装置のいくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、チャンバの一方の側に配置された第１の電極と、そのチャンバの反対側に位置する第２の電極と、を含む、一対の電極を備える。特定のそのような実施形態では、各電極は、その対応するチャンバの内側の内部部分と、その対応するチャンバの外側の外部部分と、を備える。特定の実施形態では、内部部分は、楕円形の面を有し得、金コーティングを備える。特定の実施形態では、各電極対は、電気回路に接続するように構成される。特定の実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、約０．１ｍｍ～約２０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１０ｍｍ、約１ｍｍ～約７ｍｍ、又は約１ｍｍ～約４ｍｍのギャップ距離を含む。特定の実施形態では、各チャンバは、約４ｍｍ未満のギャップ距離を含む。
【0038】
エレクトロポレーション装置のいくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、少なくとも約５０μＬ、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約１５０少なくとも約μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約２５０μＬ、少なくとも約３００μＬ、少なくとも約３５０μＬ、少なくとも約４００μＬ、少なくとも約４５０μＬ、少なくとも約１５０μＬ、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約５５０μＬ、少なくとも約６００μＬ、少なくとも約６５０μＬ、少なくとも約７００μＬ、少なくとも約７５０μＬ、少なくとも約８００μＬ、少なくとも約８５０μＬ、少なくとも約９００μＬ、少なくとも約９５０μＬ、又は少なくとも約１０００μＬ（１．０ｍＬ）の体積を格納するように構成され得る。特定のそのような実施形態では、チャンバは、少なくとも約２５０μＬ又は少なくとも約５００μＬの体積を格納するように構成される。特定の実施形態では、１つ以上のチャンバは、組み合わせて、エレクトロポレーションのための液体懸濁液中に、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約１．０ｍＬ、少なくとも約１．２ｍＬ、少なくとも約１．４ｍＬ、少なくとも約１．６ｍＬ、少なくとも約１．８ｍＬ、少なくとも約２．０ｍＬ、少なくとも約２．２ｍＬ、少なくとも約２．４ｍＬ、少なくとも約２．６ｍＬ、少なくとも約２．８ｍＬ、少なくとも約３．０ｍＬ、少なくとも約３．２ｍＬ、少なくとも約３．４ｍＬ、少なくとも約３．６ｍＬ、少なくとも約３．８ｍＬ、少なくとも約４．０ｍＬ、少なくとも約４．２ｍＬ、少なくとも約４．４ｍＬ、少なくとも約４．６ｍＬ、少なくとも約４．８ｍＬ、少なくとも約５．０ｍＬ、少なくとも約５．２ｍＬ、少なくとも約５．４ｍＬ、少なくとも約５．６ｍＬ、少なくとも約５．８ｍＬ、少なくとも約６．０ｍＬ、少なくとも約６．２ｍＬ、少なくとも約６．４ｍＬ、少なくとも約６．６ｍＬ、少なくとも約６．８ｍＬ、又は少なくとも約７．０ｍＬの細胞を格納するように構成される。特定のそのような実施形態では、１つ以上のチャンバは、組み合わせて、エレクトロポレーションのための液体懸濁液中に、少なくとも２ｍＬ、少なくとも２．４ｍＬ、少なくとも３．２ｍＬ、少なくとも４ｍＬ、少なくとも４．８ｍＬ、少なくとも５．６ｍＬ、又は少なくとも６．４ｍＬの細胞を格納するように構成される。
【0039】
本発明はまた、部分的には、本発明の装置を使用するエレクトロポレーションのための方法にも関連する。いくつかの実施形態では、本方法は、一対の電極を使用して、チャンバに電界を生成することを含む。特定の実施形態では、本方法は、装置の１つ以上のチャンバに接続された１つ以上のバルブを開き、それによって、細胞回収プロセスを実行することを更に含む。本方法の特定の実施形態では、各バルブは、一度に１つずつ開かれる。特定の実施形態では、本方法は、１つ以上のバルブに接続された１つ以上のフローチャネルを使用して、緩衝液及び細胞を１つ以上の出口ポートに輸送することを更に含む。特定の実施形態では、本方法は、１つ以上のポンプを使用して、フローチャネルから少なくとも１つのチャンバに液体媒体をポンプすることを更に含み、液体媒体が、１つ以上の入口ポートで得られる。特定の実施形態では、本方法は、２つ以上のチャンバをフローチャネルに排出することを更に含む。特定の実施形態では、本方法は、緩衝液を含む１つ以上のチャンバに通じるエレクトロポレーション装置の１つ以上の開口部に細胞を堆積させることと、各開口部にシールを適用することと、エレクトロポレーション装置をドッキングステーションに挿入することによって、１つ以上の電極対を少なくとも１つの回路に接続することと、を更に含む。
【0040】
本発明はまた、部分的には、本発明の緩衝液及びＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスを使用するエレクトロポレーションの方法に関する。
【0041】
本発明はまた、部分的には、本発明のエレクトロポレーション装置における本発明の緩衝液の使用に関する。特定の実施形態では、使用は、本発明のエレクトロポレーション方法を含む。
【0042】
本発明はまた、部分的には、エレクトロポレーションのためのシステムに関し、本発明の緩衝液と、本発明の装置と、を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、表２及び３から選択される緩衝液（例えば、表２に示される緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３）を含む。特定の実施形態では、装置は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置を含む。特定の実施形態では、システムは、細胞（例えば、Ｔ細胞などのリンパ球）をトランスフェクトするために使用される。特定の実施形態では、システムは、同じ装置及び市販のエレクトロポレーション緩衝液を含むシステムと比較して、より高い細胞トランスフェクション効率を生成する。
【図面の簡単な説明】
【0043】
本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に記載される。以下の説明には図面を伴い、全てが、記載される緩衝液及び使用方法がどのように具現化され得るかを理解するのに有用であり得る非限定的な実施例によって与えられる。
【0044】
【図1】３つのドナー（ドナー１、２、及び３と呼ばれる）から採取された細胞に対する、対照エレクトロポレーション緩衝液とともに、３つのエレクトロポレーション緩衝液（緩衝液１、２、及び３と呼ばれる）の収率（％）を示すグラフである。
【図2】ドナー１の細胞に対する、３つの試料エレクトロポレーション緩衝液（緩衝液１、２、及び３）並びに対照エレクトロポレーション緩衝液の全体的なエレクトロポレーション性能を示すグラフである。エレクトロポレーション性能の結果は、生存率（％）、回収率（％）、トランスフェクション（％）、及び収率（％）に関して提供される。
【図3】ドナー２の細胞に対する、３つの試料エレクトロポレーション緩衝液（緩衝液１、２、及び３）並びに対照エレクトロポレーション緩衝液のエレクトロポレーション性能を示すグラフである。エレクトロポレーション性能の結果は、生存率（％）、回収率（％）、トランスフェクション（％）、及び収率（％）に関して提供される。
【図4】ドナー３の細胞に対する、３つの試料エレクトロポレーション緩衝液（緩衝液１、２、及び３）並びに対照エレクトロポレーション緩衝液のエレクトロポレーション性能を示すグラフである。エレクトロポレーション性能の結果は、生存率（％）、回収率（％）、トランスフェクション（％）、及び収率（％）に関して提供される。
【図5】ドナー１及びドナー２の細胞に対する、３つの試料エレクトロポレーション緩衝液（緩衝液１、２、及び３）並びに対照エレクトロポレーション緩衝液のエレクトロポレーション性能を示すグラフである。エレクトロポレーション性能の結果は、ＣＡＲ２構築物の取り込みの収率（％）に関して提供される。
【発明を実施するための形態】
【0045】
最小成分エレクトロポレーション緩衝液、使用方法、及びキットが提供される。緩衝液は、その中に溶解又は懸濁される生体物質を電流を介して細胞集団に導入することを容易にすることができる。より詳細に説明されるように、開示される緩衝液の実施形態は、対照緩衝液と比較して、改善されたトランスフェクション効率、細胞生存率、及び／又は細胞収率で細胞集団に生体物質を導入することができる。更に、開示された最小緩衝液成分が、高いトランスフェクション効率に十分であることは予想外である。緩衝液の最小成分は、エレクトロポレーション緩衝液の品質を生成及び制御するリソースを節約する。
【0046】
本発明をより詳細に説明する前に、本発明は、説明される特定の場合に限定されるものではないことが理解されるべきである。また、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためのものにすぎず、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【0047】
範囲及び定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用され得るが、代表的な例示的な方法及び材料がここに記載される。
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載されるものに類似又は同等の任意の方法及び材料も、本発明の実施又は試験において使用され得るが、代表的な例示的な方法及び材料がここに記載される。
【0048】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限との間の下限の単位の１０分の１までの各介在値、及び記載された範囲内の任意の他の記載された値又は介在値は、本発明内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限及び下限は、独立して、より小さい範囲内に含まれてもよく、また、記載された範囲内の任意の特定の除外された制限に従うことを条件として、本発明内に包含される。記載された範囲が限定の一方又は両方を含む場合、それらの含まれる限定のいずれか又は両方を除外する範囲も、同様に本発明に含まれる。
【0049】
本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「１つ以上」という語句はまた、少なくとも１つを意味し、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【0050】
本明細書で使用される場合、「及び／又は」及び「それらの任意の組み合わせ」という用語、並びにそれらの文法的等価物は、互換的に使用され得る。単に例示的な目的のために、以下の「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」又は「Ａ、Ｂ、Ｃ、又はそれらの任意の組み合わせ」という語句は、「個別的にＡ、個別的にＢ、個別的にＣ、Ａ及びＢ、Ｂ及びＣ、Ａ及びＣ、並びにＡ、Ｂ、及びＣ」を意味することができる。
【0051】
本明細書で使用される場合、参照数値及びその文法的等価物に関連して「約」という用語は、数値自体と、その数値からプラス又はマイナス１０％の値の範囲とを含む。例えば、「約１０」の量は、１０及び９～１１の任意の量を含む。例えば、参照数値に関連して「約」という用語はまた、その値からプラス又はマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、又は１％の範囲の値を含むことができる。いくつかの場合では、全体にわたって開示される数値は、「約」という用語に具体的に言及することなく、その数値を「約」とすることができる。例えば、「約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ」などの語句は、「約４５ｍＭ、約４０ｍＭ、約３５ｍＭ」などを意味する。
【0052】
本明細書で使用される場合、「細胞」という用語は、核酸（例えば、１つ以上の遺伝子産物（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子産物）をコードするヌクレオチド配列を含む発現ベクター）のレシピエントとして使用され得る、又は使用されている原核細胞又は真核細胞を指し、核酸によって遺伝子改変された元の細胞の任意の子孫を含む。「組換え細胞」又は「遺伝子組換え細胞」は、外因性核酸が導入された細胞である。
【0053】
本明細書で使用される場合、「生体物質（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｍａｔｅｒｉａｌ）」という用語は、生体源に由来する物質を指す。本発明による「生体物質」は、単離又は精製された核酸（一本鎖又は二本鎖のいずれかにかかわらず、ＲＮＡ及びＤＮＡを含み、それらのハイブリッド形態及びキメラ形態も含む）、タンパク質、ペプチド、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）、又は他の天然ポリマーからなり得る。生体物質は、目的の特定の核酸を含む動物、植物、細菌、酵母、又はウイルス性の物質であり得る。
【0054】
本明細書で使用される場合、「外因性」という用語及びその文法的等価物は、参照元とは異なる供給源に由来することを意味する。例えば、「外因性」核酸を含む免疫細胞は、免疫細胞自体ではない供給源からの核酸を含む免疫細胞である。核酸は、異なる免疫細胞由来又はいくつかの他の細胞由来であってもよい。核酸は、異なる生物又は更には種、例えば、真核生物、細菌、植物、又は酵母の供給源に由来してもよい。
【0055】
本明細書で使用される場合、「組換え」という用語及びその文法的等価物は、特定の生体物質（例えば、核酸又はペプチド）が、天然のシステムに見られる内因性の生体物質と区別可能な構築物をもたらす、クローニング、制限、及び／又はライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。一般に、構造コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから又は一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞に含まれる組換え転写単位又は無細胞転写及び翻訳システムから発現され得る合成核酸を提供することができる。そのような配列は、典型的には、真核生物遺伝子に存在する内部非翻訳配列又はイントロンによって中断されないオープンリーディングフレームの形態で提供され得る。関連する配列を含むゲノムＤＮＡは、組換え遺伝子又は転写単位の形成にも使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレームから５’側又は３’側に存在してもよく、そのような配列は、コード領域の操作又は発現を妨げず、実際には、様々なメカニズムによって所望の産物の産生を調節するように作用することができる。
【0056】
本明細書で使用される場合、「組換え核酸」という用語は、天然に存在しない核酸を指し、例えば、ヒトの介入を介して、別途分離された配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成又は単離された核酸セグメントの人工的な操作（例えば、遺伝子工学技術）のいずれかによって達成される。これは、典型的には、配列認識部位を導入又は除去しながら、同じアミノ酸又は保存アミノ酸をコードする冗長コドン（ｒｅｄｕｎｄａｎｔ ｃｏｄｏｎ）でコドンを置き換えるように行われる。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に結合して、所望の機能の組み合わせを生成するように行われる。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学合成又は単離された核酸セグメントの人工的な操作（例えば、遺伝子工学技術）のいずれかによって達成される。
【0057】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、化合物、核酸、ポリペプチド、又は細胞が天然に存在する環境とは異なる環境にある化合物、核酸、ポリペプチド、又は細胞を指す。
【0058】
本開示を読むと当業者には明らかであろうように、本明細書に記載及び例証される個々の実施形態の各々は、本発明の範囲又は趣旨から逸脱することなく、他の様々な場合のいずれかの特徴から容易に分離され得るか、又はこれらと組み合わされ得る別個のコンポーネント及び特徴を有する。任意の列挙された方法は、列挙されたイベントの順序、又は論理的に可能な任意の他の順序で実行され得る。
【0059】
エレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液
本明細書に開示される緩衝液は、これらの緩衝液が他の既知のエレクトロポレーション緩衝液と比較して含まれる成分が少ないにもかかわらず、トランスフェクション能力の向上を含む改善された特性を有することが見出された。
本明細書に開示される緩衝液は、これらの緩衝液が他の既知のエレクトロポレーション緩衝液と比較して含まれる成分が少ないにもかかわらず、トランスフェクション能力の向上を含む改善された特性を有することが見出された。
【0060】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水などの溶媒を含む。いくつかの実施形態では、水は、精製及び／又は滅菌され得る。例えば、水は、脱イオン化（例えば、容量性脱イオン化又は電気脱イオン化）、逆浸透、炭素濾過、精密濾過、限外濾過、及び／又は紫外線滅菌を受け得る。いくつかの実施形態では、水は、脱イオン化される。いくつかの実施形態では、水は、「注射用水」と呼ばれる品質の水であり、「注射用滅菌水」としても知られている。注射用水は、一般に、蒸留又は逆浸透によって作製される。注射用水は、「Ｈ２Ｏ」と化学的に示され、約５．０～約７．０、好ましくは約５．５のｐＨを有する、滅菌された非発熱性の溶質を含まない水の調製物である。
【0061】
いくつかの実施形態では、溶媒は、総緩衝液体積の０．１～９９．９体積％を構成する。例えば、溶媒は、総緩衝液体積の少なくとも約０．１体積％、１体積％、５体積％、１０体積％、１５体積％、２０体積％、２５体積％、３０体積％、３５体積％、４０体積％、４５体積％、５０体積％、５５体積％、６０体積％、６５体積％、７０体積％、７５体積％、８０体積％、８５体積％、９０体積％、９５体積％、９９体積％、又は９９．１体積％を構成し得る。
【0062】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、溶質、例えば、糖又は糖に由来する有機化合物（例えば、糖アルコール）を含む。緩衝液が糖を含む実施形態では、糖は、単糖、二糖、及び／又は多糖を含み得る。いくつかの実施形態では、糖は、単糖、例えば、グルコース、フルクトース、及び／又はガラクトースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、二糖、例えば、スクロース、ラクトース、及びマルトースを含む。いくつかの実施形態では、糖は、多糖、例えば、セルロース又はデンプンを含む。緩衝液が糖アルコールを含む実施形態では、糖アルコールは、マンニトール、ソルビトール、キシリトール、ラクチトール、イソマルト、マルチトール、及び／又は水素化デンプン加水分解物（ＨＳＨ）を含み得る。
【0063】
いくつかの実施形態では、糖は、約５０ミリモル濃度（ｍＭ）未満の量で存在する。例えば、糖は、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、糖は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３６ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３５ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３４ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３３ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約３０ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約３０．１ｍＭ～約３１．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約３０．２ｍＭ～約３１．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約３０．３ｍＭ～約３１．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約３０．４ｍＭ～約３１．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約３０．５ｍＭ～約３１．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約３０．６ｍＭ～約３１．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約３０．７ｍＭ～約３１．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約３０．８ｍＭ～約３１．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０．９ｍＭ～約３１．１ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、糖は、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。
【0064】
いくつかの実施形態では、糖は、グルコースである。これらの実施形態では、グルコースは、約５０ミリモル濃度（ｍＭ）未満の量で存在し得る。例えば、グルコースは、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、グルコースは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３６ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３５ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３４ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３３ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約３０ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約３０．１ｍＭ～約３１．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約３０．２ｍＭ～約３１．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約３０．３ｍＭ～約３１．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約３０．４ｍＭ～約３１．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約３０．５ｍＭ～約３１．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約３０．６ｍＭ～約３１．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約３０．７ｍＭ～約３１．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約３０．８ｍＭ～約３１．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０．９ｍＭ～約３１．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、グルコースは、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約３０ｍＭ又は３１ｍＭの量で存在する。
【0065】
いくつかの実施形態では、糖は、マンニトールである。これらの実施形態では、マンニトールは、約５０ミリモル濃度（ｍＭ）未満の量で存在し得る。例えば、マンニトールは、約４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約１０ｍＭ～約４０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、又は約２５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量で存在する。特定の実施形態では、マンニトールは、約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３６ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３５ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３４ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３３ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約３０ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約３０．１ｍＭ～約３１．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約３０．２ｍＭ～約３１．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約３０．３ｍＭ～約３１．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約３０．４ｍＭ～約３１．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約３０．５ｍＭ～約３１．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約３０．６ｍＭ～約３１．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約３０．７ｍＭ～約３１．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約３０．８ｍＭ～約３１．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０．９ｍＭ～約３１．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、マンニトールは、約２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、３０ｍＭ、３１ｍＭ、３２ｍＭ、３３ｍＭ、３４ｍＭ、又は３５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、グルコースは、約３０ｍＭ又は３１ｍＭの量で存在する。
【0066】
いくつかの実施形態では、ＥＰ緩衝液は、１つ以上の塩化物塩、例えば、塩化カリウム（ＫＣｌ）及び／又は塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）を含む。
【0067】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、１つ以上の緩衝剤、例えば、二塩基性リン酸ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、一塩基性リン酸ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）、又はＮａ２ＨＰＯ４とＮａＨＰＯ４との組み合わせ（互換的に、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４若しくはリン酸ナトリウムと称される）を更に含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン若しくはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン（「Ｔｒｉｓ」）、及び／又はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のうちの１つ以上を更に含む。他の実施形態では、緩衝液は、市販のエレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液に一般的に見出される１つ以上の緩衝剤が特に除外される。例えば、いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯ、Ｔｒｉｓ、及び／又はＨＥＰＥＳのうちの１つ以上を除外する。
【0068】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、溶媒、１つ以上の塩化物塩、及び１つ以上の緩衝剤を含む。いくつかのそのような実施形態では、溶媒は、水であり、糖は、グルコース又はマンニトールであり、１つ以上の塩化物塩は、ＫＣｌ及び／若しくはＭｇＣｌ２を含み、並びに／又は１つ以上の緩衝剤は、ＨＥＰＥＳ、ＤＭＳＯ、及び／又はリン酸ナトリウムを含む。特定の実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯ及び／又はＨＥＰＥＳを含まない。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、グルコース及び／又はマンニトール、ＫＣｌ及び／又はＭｇＣｌ２、並びにリン酸ナトリウムを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、グルコース及び／又はマンニトール、ＫＣｌ及び／又はＭｇＣｌ２、リン酸ナトリウム、並びにＨＥＰＥＳ及び／又はＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0069】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳを含む。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯを含む。
【0070】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４から本質的になる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳから本質的になる。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯから本質的になる。
【0071】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、及びＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４からなる。いくつかの実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及びＨＥＰＥＳからなる。他の実施形態では、緩衝液は、水（Ｈ２Ｏ）、グルコース、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、ＨＥＰＥＳ、及びＤＭＳＯからなる。
【0072】
いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．０～８．０、６．５～８．０、７．０～８．０、７．５～８．０、６．０～７．５、６．０～７．０、６．０～６．５、６．５～７．５、又は６．５～７．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝剤は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨを有する。
【0073】
いくつかの実施形態では、１つ以上の緩衝剤を含む緩衝液は、約６．０～８．０、６．５～８．０、７．０～８．０、７．５～８．０、６．０～７．５、６．０～７．０、６．０～６．５、６．５～７．５、又は６．５～７．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。
【0074】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｎａ２ＨＰＯ４及び／又はＮａＨ２ＰＯ４の一方又は両方を含む。緩衝液が両方の緩衝剤を含む実施形態では、２つの比（すなわち、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）は、約１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、９：１、８：１、７：１、６：１ ５：１、４：１、３：１、２：１、又は２：３であり得る。
【0075】
いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
【0076】
いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４及びＮａＨ２ＰＯ４（「Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４」又は「リン酸ナトリウム」とも称される）の混合物は、緩衝液中に、約５０ｍＭ及び１６０ｍＭ、６０ｍＭ～１５０ｍＭ、７０ｍＭ～１４０ｍＭ、７５ｍＭ～１３０ｍＭ、８０ｍＭ～１２５ｍＭ、９０ｍＭ～１２５ｍＭ、９０ｍＭ～１２０ｍＭ、９０ｍＭ～１１５ｍＭ、又は９０ｍＭ～１０５ｍＭの範囲の量で存在し得る。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、約９５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１１０ｍＭ、約１０１ｍＭ～約１０９ｍＭ、約１０２ｍＭ～約１０８ｍＭ、約１０３ｍＭ～約１０７ｍＭ、約１０４ｍＭ～約１０６ｍＭ、約１０４．１ｍＭ～約１０５．９ｍＭ、約１０４．２ｍＭ～約１０５．８ｍＭ、約１０４．３ｍＭ～約１０５．７ｍＭ、約１０４．４ｍＭ～約１０５．６ｍＭ、約１０４．５ｍＭ～約１０５．５ｍＭ、約１０４．６ｍＭ～約１０５．４ｍＭ、約１０４．７ｍＭ～約１０５．３ｍＭ、約１０４．８ｍＭ～約１０５．２ｍＭ、又は約１０４．９ｍＭ～約１０５．１ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８６ｍＭ～約９４ｍＭ、約８７ｍＭ～約９３ｍＭ、約８８ｍＭ～約９２ｍＭ、約８９ｍＭ～約９１ｍＭ、約８９．１ｍＭ～約９０．９ｍＭ、約８９．２ｍＭ～約９０．８ｍＭ、約８９．３ｍＭ～約９０．７ｍＭ、約８９．４ｍＭ～約９０．６ｍＭ、約８９．５ｍＭ～約９０．５、約８９．６ｍＭ～約９０．４ｍＭ、約８９．７ｍＭ～約９０．３ｍＭ、約８９．８ｍＭ～約９０．２ｍＭ、又は約８９．９ｍＭ～約９０．１ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、約９０ｍＭ又は約１０５ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、少なくとも５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、又は１００ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、８０ｍＭ、８１ｍＭ、８２ｍＭ、８３ｍＭ、８４ｍＭ、８５ｍＭ、８６ｍＭ、８７ｍＭ、８８ｍＭ、８９ｍＭ、９０ｍＭ、９１ｍＭ、９２ｍＭ、９３ｍＭ、９４ｍＭ、９５ｍＭ、９６ｍＭ、９７ｍＭ、９８ｍＭ、９９ｍＭ、１００ｍＭ、１０１ｍＭ、１０２ｍＭ、１０３ｍＭ、１０４ｍＭ、１０５ｍＭ、１０６ｍＭ、１０７ｍＭ、１０８ｍＭ、１０９ｍＭ、１１０ｍＭ、１１１ｍＭ、１１２ｍＭ、１１３ｍＭ、１１４ｍＭ、１１５ｍＭ、１１６ｍＭ、１１７ｍＭ、１１８ｍＭ、１１９ｍＭ、又は１２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４は、９０ｍＭ又は１０５ｍＭの量で存在する。
【0077】
緩衝液がＫＣｌを含む実施形態では、ＫＣｌは、約３０ｍＭ未満の量で存在し得る。例えば、ＫＣｌは、約２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭ、又は約５ｍＭ～約１５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、又は約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、約９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、又は約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、又は１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＫＣｌは、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＫＣｌは、約５ｍＭ又は１０ｍＭの量で存在する。
【0078】
いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＫＣｌは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
【0079】
緩衝液がＭｇＣｌ２を含む実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５０ｍＭ未満の量で存在し得る。例えば、ＭｇＣｌ２は、約４５ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、又は５ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ～約５０ｍＭ、約６ｍＭ～約４５ｍＭ、約７ｍＭ～約４０ｍＭ、約８ｍＭ～約３５ｍＭ、約９ｍＭ～約３０ｍＭ、約１０ｍＭ～約２５ｍＭ、又は約１５ｍＭ～約２５ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約１９ｍＭ、約１２ｍＭ～約１８ｍＭ、約１３ｍＭ～約１７ｍＭ、約１４ｍＭ～約１６ｍＭ、約１４．１ｍＭ～約１５．９ｍＭ、約１４．２ｍＭ～約１５．８ｍＭ、約１４．３ｍＭ～約１５．７ｍＭ、約１４．４ｍＭ～約１５．６ｍＭ、約１４．５ｍＭ～約１５．５ｍＭ、約１４．６ｍＭ～約１５．４ｍＭ、１４．７ｍＭ～約１５．３ｍＭ、１４．８ｍＭ～約１５．２ｍＭ、又は約１４．９ｍＭ～約１５．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１６ｍＭ～約２４ｍＭ、約１７ｍＭ～約２３ｍＭ、約１８ｍＭ～約２２ｍＭ、約１９ｍＭ～約２１ｍＭ、約１９．１ｍＭ～約２０．９ｍＭ、約１９．２ｍＭ～約２０．８ｍＭ、約１９．３ｍＭ～約２０．７ｍＭ、約１９．４ｍＭ～約２０．６ｍＭ、約１９．５ｍＭ～約２０．５ｍＭ、約１９．６ｍＭ～約２０．４ｍＭ、約１９．７ｍＭ～約２０．３ｍＭ、約１９．８ｍＭ～約２０．２ｍＭ、又は約１９．９ｍＭ～約２０．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、１５ｍＭ、１６ｍＭ、１７ｍＭ、１８ｍＭ、１９ｍＭ、２０ｍＭ、２１ｍＭ、２２ｍＭ、２３ｍＭ、２４ｍＭ、２５ｍＭ、２６ｍＭ、２７ｍＭ、２８ｍＭ、２９ｍＭ、又は３０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約１５ｍＭ又は２０ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約１０ｍＭ又は約１５ｍＭの量で存在する。
【0080】
いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＭｇＣｌ２は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
【0081】
緩衝液がＨＥＰＥＳを含む実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約３０ｍＭ未満の量で存在し得る。例えば、ＨＥＰＥＳは、約２５ｍＭ、２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、５ｍＭ、４ｍＭ、３ｍＭ、２ｍＭ、１ｍＭ、０．５ｍＭ、又は０．１ｍＭ未満の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約１ｍＭ～約３０ｍＭ、約２ｍＭ～約２５ｍＭ、約３ｍＭ～約２０ｍＭ、約４ｍＭ～約１５ｍＭ、約５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、又は約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、又は約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約５ｍＭ～約１０ｍＭの量で存在する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約０．１ｍＭ、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、１１ｍＭ、１２ｍＭ、１３ｍＭ、１４ｍＭ、又は１５ｍＭの量で存在する。特定の実施形態では、ＨＥＰＥＳは、０ｍＭ、約５ｍＭ、又は約１０ｍＭの量で存在する。
【0082】
いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。
【0083】
緩衝液がＤＭＳＯを含む実施形態では、ＤＭＳＯは、総緩衝液体積の５体積％、４体積％、３体積％、２体積％、１体積％、０．９体積％、０．８体積％、０．７体積％、０．６体積％、０．５体積％、０．４体積％、０．３体積％、０．２体積％、又は０．１体積％以下の量で存在し得る。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、総緩衝液体積の約０体積％～約２．５体積％存在する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、総緩衝液体積の約０．１体積％～５体積％、１体積％～５体積％、２体積％～５体積％、３体積％～５体積％、又は４体積％～５体積％の範囲の量で存在する。
【0084】
いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。他の実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液に全く含まれない。
【0085】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＨＥＰＥＳなどの１つ以上の他の成分に加えて、又はその代わりに、Ｔｒｉｓを含んでもよい。特定の実施形態では、Ｔｒｉｓは、約１ｍＭ～１Ｍ、１０ｍＭ～５００ｍＭ、２５ｍＭ～２５０ｍＭ、又は５０ｍＭ～１００ｍＭの範囲の量で存在する。特定の実施形態では、Ｔｒｉｓは、約１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭ、７５ｍＭ、８０ｍＭ、８５ｍＭ、９０ｍＭ、９５ｍＭ、又は１００ｍＭの量で存在する。
【0086】
特定の実施形態では、緩衝液中のＴｒｉｓのｐＨは、ＨＣｌなどの１つ以上の塩を添加することによって調節され得る。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓは、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｉｓは、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、又は７．９のｐＨを有する。他の実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液に全く含まれない。
【0087】
特定の実施形態では、緩衝液は、５０ｍＭ以下の量の糖、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、１６０ｍＭ以下の量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭ以下の量のＫＣｌ、２０ｍＭ以下の量のＭｇＣｌ２、及び総緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
【0088】
特定の実施形態では、緩衝液は、少なくとも約１５ｍＭの量の糖、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、少なくとも約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、少なくとも約２ｍＭの量のＫＣｌ、少なくとも１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び総緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
【0089】
特定の実施形態では、緩衝液は、約１５ｍＭ～約３５ｍＭの範囲の量の糖、約５ｍＭ～約１０ｍＭの範囲の量のＫＣｌ、約１０．５ｍＭ～約２０ｍＭの範囲の量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭ～約１０５ｍＭの範囲の量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、２５ｍＭ以下の量のＨＥＰＥＳ、及び総緩衝液体積の５体積％以下の量のＤＭＳＯを含む。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、単糖及び／又は糖アルコールを含み得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、マンニトール及び／又はグルコースである。これらの実施形態のいくつかにおいて、糖は、グルコースである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＤＭＳＯを含まない。
【0090】
特定の実施形態では、緩衝液は、約１５ｍＭの量のグルコース、約６ｍＭの量のＫＣｌ、約１０．５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、約１５ｍＭの範囲の量のＨＥＰＥＳ、及び総緩衝液体積の約２．５体積％の量のＤＭＳＯを含む。
【0091】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、及び約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウムを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭ～約３５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約５ｍＭ～約１５ｍＭの量のＫＣｌ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭ～約１２０ｍＭの量のリン酸ナトリウム、並びに０ｍＭ～約１０ｍＭ若しくは約５ｍＭ～約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び／又は緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【0092】
特定の実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約１５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１２０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、並びに約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特に除外される。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約２５ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトール、約１５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約２５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１２０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、並びに緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0093】
特定の実施形態では、緩衝液のｐＨは調整され得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、６．５～８のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．０～７．６のｐＨに調節される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、又は約７．０～約７．２のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．９～７．２又は約７．０～７．１のｐＨに調整される。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約７．０～約７．１のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、又は８．０のｐＨに調整される。特定の実施形態では、緩衝液は、約７．０又は７．１のｐＨに調整される。
【0094】
特定の実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ミリシーメンス／センチメートル（ｍｓ／ｃｍ）～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍ、又は約１３．０ｍｓ／ｃｍ～約１６．０ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、又は約１３．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、約１０．０ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍの導電率を有する。
【0095】
いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約１３．３ｍｓ／ｃｍ～約１５．３ｍｓ／ｃｍ、約１３．４ｍｓ／ｃｍ～約１５．２ｍｓ／ｃｍ、約１３．５ｍｓ／ｃｍ～約１５．１ｍｓ／ｃｍ、約１３．６ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１３．７ｍｓ／ｃｍ～約１４．９ｍｓ／ｃｍ、約１３．８ｍｓ／ｃｍ～約１４．８ｍｓ／ｃｍ、約１３．９ｍｓ／ｃｍ～約１４．７ｍｓ／ｃｍ、約１４．０ｍｓ／ｃｍ～約１４．６ｍｓ／ｃｍ、約１４．１ｍｓ／ｃｍ～約１４．５ｍｓ／ｃｍ、又は約１４．２ｍｓ／ｃｍ～約１４．４ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約１０．６ｍｓ／ｃｍ～約１２．６ｍｓ／ｃｍ、約１０．７ｍｓ／ｃｍ～約１２．５ｍｓ／ｃｍ、約１０．８ｍｓ／ｃｍ～約１２．４ｍｓ／ｃｍ、約１０．９ｍｓ／ｃｍ～約１２．３ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１２．２ｍｓ／ｃｍ、約１１．１ｍｓ／ｃｍ～約１２．１ｍｓ／ｃｍ、約１１．２ｍｓ／ｃｍ～約１２．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．３ｍｓ／ｃｍ～約１１．９ｍｓ／ｃｍ、約１１．４ｍｓ／ｃｍ～約１１．８ｍｓ／ｃｍ、又は約１１．５ｍｓ／ｃｍ～約１１．７ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約１１．８ｍｓ／ｃｍ～約１３．８ｍｓ／ｃｍ、約１１．９ｍｓ／ｃｍ～約１３．７ｍｓ／ｃｍ、約１２．０ｍｓ／ｃｍ～約１３．６ｍｓ／ｃｍ、約１２．１ｍｓ／ｃｍ～約１３．５ｍｓ／ｃｍ、約１２．２ｍｓ／ｃｍ～約１３．４ｍｓ／ｃｍ、約１２．３ｍｓ／ｃｍ～約１３．３ｍｓ／ｃｍ、約１２．４ｍｓ／ｃｍ～約１３．２ｍｓ／ｃｍ、約１２．５ｍｓ／ｃｍ～約１３．１ｍｓ／ｃｍ、約１２．６ｍｓ／ｃｍ～約１３．０ｍｓ／ｃｍ、又は約１２．７ｍｓ／ｃｍ～約１２．９ｍｓ／ｃｍである。いくつかの実施形態では、緩衝液の導電率は、約７．０ｍｓ／ｃｍ、約７．１ｍｓ／ｃｍ、約７．２ｍｓ／ｃｍ、約７．３ｍｓ／ｃｍ、約７．４ｍｓ／ｃｍ、約７．５ｍｓ／ｃｍ、約７．６ｍｓ／ｃｍ、約７．７ｍｓ／ｃｍ、約７．８ｍｓ／ｃｍ、約７．９ｍｓ／ｃｍ、約８．０ｍｓ／ｃｍ、約８．１ｍｓ／ｃｍ、約８．２ｍｓ／ｃｍ、約８．３ｍｓ／ｃｍ、約８．４ｍｓ／ｃｍ、約８．５ｍｓ／ｃｍ、約８．６ｍｓ／ｃｍ、約８．７ｍｓ／ｃｍ、約８．８ｍｓ／ｃｍ、約８．９ｍｓ／ｃｍ、約９．０ｍｓ／ｃｍ、約９．１ｍｓ／ｃｍ、約９．２ｍｓ／ｃｍ、約９．３ｍｓ／ｃｍ、約９．４ｍｓ／ｃｍ、約９．５ｍｓ／ｃｍ、約９．６ｍｓ／ｃｍ、約９．７ｍｓ／ｃｍ、約９．８ｍｓ／ｃｍ、約９．９ｍｓ／ｃｍ、約１０．０ｍｓ／ｃｍ、約１０．１ｍｓ／ｃｍ、約１０．２ｍｓ／ｃｍ、約１０．３ｍｓ／ｃｍ、約１０．４ｍｓ／ｃｍ、約１０．５ｍｓ／ｃｍ、約１０．６ｍｓ／ｃｍ、約１０．７ｍｓ／ｃｍ、約１０．８ｍｓ／ｃｍ、約１０．９ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．１ｍｓ／ｃｍ、約１１．２ｍｓ／ｃｍ、約１１．３ｍｓ／ｃｍ、約１１．４ｍｓ／ｃｍ、約１１．５ｍｓ／ｃｍ、約１１．６ｍｓ／ｃｍ、約１１．７ｍｓ／ｃｍ、約１１．８ｍｓ／ｃｍ、約１１．９ｍｓ／ｃｍ、約１２．０ｍｓ／ｃｍ、約１２．１ｍｓ／ｃｍ、約１２．２ｍｓ／ｃｍ、約１２．３ｍｓ／ｃｍ、約１２．４ｍｓ／ｃｍ、約１２．５ｍｓ／ｃｍ、約１２．６ｍｓ／ｃｍ、約１２．７ｍｓ／ｃｍ、約１２．８ｍｓ／ｃｍ、約１２．９ｍｓ／ｃｍ、約１３．０ｍｓ／ｃｍ、約１３．１ｍｓ／ｃｍ、約１３．２ｍｓ／ｃｍ、約１３．３ｍｓ／ｃｍ、約１３．４ｍｓ／ｃｍ、約１３．５ｍｓ／ｃｍ、約１３．６ｍｓ／ｃｍ、約１３．７ｍｓ／ｃｍ、約１３．８ｍｓ／ｃｍ、約１３．９ｍｓ／ｃｍ、約１４．０ｍｓ／ｃｍ、約１４．１ｍｓ／ｃｍ、約１４．２ｍｓ／ｃｍ、約１４．３ｍｓ／ｃｍ、約１４．４ｍｓ／ｃｍ、約１４．５ｍｓ／ｃｍ、約１４．６ｍｓ／ｃｍ、約１４．７ｍｓ／ｃｍ、約１４．８ｍｓ／ｃｍ、約１４．９ｍｓ／ｃｍ、約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１５．１ｍｓ／ｃｍ、約１５．２ｍｓ／ｃｍ、約１５．３ｍｓ／ｃｍ、約１５．４ｍｓ／ｃｍ、約１５．５ｍｓ／ｃｍ、約１５．６ｍｓ／ｃｍ、約１５．７ｍｓ／ｃｍ、約１５．８ｍｓ／ｃｍ、約１５．９ｍｓ／ｃｍ、又は約１６．０ｍｓ／ｃｍである。特定の実施形態では、緩衝液の導電率は、約１１．６、１２．８、又は１４．３である。
【0096】
いくつかの実施形態では、緩衝液の浸透圧は、トランスフェクトされる細胞の浸透圧（すなわち、「細胞内浸透圧」としても知られている）よりも低い。いくつかの実施形態では、緩衝液の浸透圧は、約２５０ミリオスモル／キログラム（ｍＯｓｍ／ｋｇ）Ｈ２Ｏ～約１２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約９００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの範囲である。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約１１００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約９００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約７００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約５００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。特定のそのような実施形態では、浸透圧は、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏであり得る。
【0097】
いくつかの実施形態では、浸透圧は、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約３３９．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２７９．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２８２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３０２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２９１．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。
【0098】
いくつかの実施形態では、浸透圧は、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３０５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３１０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３１５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３２０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３２５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３５５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３６５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３９５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。特定の実施形態では、浸透圧は、約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約３６２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏである。
【0099】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、
水と、
約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、約９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭ、又は約１０ｍＭの量のＫＣｌと、
約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１６ｍＭ～約２４ｍＭ、約１７ｍＭ～約２３ｍＭ、約１８ｍＭ～約２２ｍＭ、約１９ｍＭ～約２１ｍＭ、約１９．１ｍＭ～約２０．９ｍＭ、約１９．２ｍＭ～約２０．８ｍＭ、約１９．３ｍＭ～約２０．７ｍＭ、約１９．４ｍＭ～約２０．６ｍＭ、約１９．５ｍＭ～約２０．５ｍＭ、約１９．６ｍＭ～約２０．４ｍＭ、約１９．７ｍＭ～約２０．３ｍＭ、約１９．８ｍＭ～約２０．２ｍＭ、約１９．９ｍＭ～約２０．１ｍＭ、又は約２０ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約９５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１１０ｍＭ、約１０１ｍＭ～約１０９ｍＭ、約１０２ｍＭ～約１０８ｍＭ、約１０３ｍＭ～約１０７ｍＭ、約１０４ｍＭ～約１０６ｍＭ、約１０４．１ｍＭ～約１０５．９ｍＭ、約１０４．２ｍＭ～約１０５．８ｍＭ、約１０４．３ｍＭ～約１０５．７ｍＭ、約１０４．４ｍＭ～約１０５．６ｍＭ、約１０４．５ｍＭ～約１０５．５ｍＭ、約１０４．６ｍＭ～約１０５．４ｍＭ、約１０４．７ｍＭ～約１０５．３ｍＭ、約１０４．８ｍＭ～約１０５．２ｍＭ、約１０４．９ｍＭ～約１０５．１ｍＭ、又は約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、
０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５ｍＭの量のＨＥＰＥＳと、を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
水と、
約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、約９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭ、又は約１０ｍＭの量のＫＣｌと、
約１０ｍＭ～約３０ｍＭ、約１５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１６ｍＭ～約２４ｍＭ、約１７ｍＭ～約２３ｍＭ、約１８ｍＭ～約２２ｍＭ、約１９ｍＭ～約２１ｍＭ、約１９．１ｍＭ～約２０．９ｍＭ、約１９．２ｍＭ～約２０．８ｍＭ、約１９．３ｍＭ～約２０．７ｍＭ、約１９．４ｍＭ～約２０．６ｍＭ、約１９．５ｍＭ～約２０．５ｍＭ、約１９．６ｍＭ～約２０．４ｍＭ、約１９．７ｍＭ～約２０．３ｍＭ、約１９．８ｍＭ～約２０．２ｍＭ、約１９．９ｍＭ～約２０．１ｍＭ、又は約２０ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約９５ｍＭ～約１１５ｍＭ、約１００ｍＭ～約１１０ｍＭ、約１０１ｍＭ～約１０９ｍＭ、約１０２ｍＭ～約１０８ｍＭ、約１０３ｍＭ～約１０７ｍＭ、約１０４ｍＭ～約１０６ｍＭ、約１０４．１ｍＭ～約１０５．９ｍＭ、約１０４．２ｍＭ～約１０５．８ｍＭ、約１０４．３ｍＭ～約１０５．７ｍＭ、約１０４．４ｍＭ～約１０５．６ｍＭ、約１０４．５ｍＭ～約１０５．５ｍＭ、約１０４．６ｍＭ～約１０５．４ｍＭ、約１０４．７ｍＭ～約１０５．３ｍＭ、約１０４．８ｍＭ～約１０５．２ｍＭ、約１０４．９ｍＭ～約１０５．１ｍＭ、又は約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、
０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５ｍＭの量のＨＥＰＥＳと、を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0100】
特定の実施形態では、緩衝液は、約６．０～約８．０、約６．１～約７．９、約６．２～約７．８、約６．３～約７．７、約６．４～約７．６、約６．５～約７．５、約６．６～約７．４、約６．７～約７．３、約６．８～約７．２、約６．９～約７．１、又は約７．０のｐＨに調整される。特定の実施形態では、緩衝液は、約１３．３ｍｓ／ｃｍ～約１５．３ｍｓ／ｃｍ、約１３．４ｍｓ／ｃｍ～約１５．２ｍｓ／ｃｍ、約１３．５ｍｓ／ｃｍ～約１５．１ｍｓ／ｃｍ、約１３．６ｍｓ／ｃｍ～約１５．０ｍｓ／ｃｍ、約１３．７ｍｓ／ｃｍ～約１４．９ｍｓ／ｃｍ、約１３．８ｍｓ／ｃｍ～約１４．８ｍｓ／ｃｍ、約１３．９ｍｓ／ｃｍ～約１４．７ｍｓ／ｃｍ、約１４．０ｍｓ／ｃｍ～約１４．６ｍｓ／ｃｍ、約１４．１ｍｓ／ｃｍ～約１４．５ｍｓ／ｃｍ、約１４．２ｍｓ／ｃｍ～約１４．４ｍｓ／ｃｍ、又は約１４．３ｍｓ／ｃｍの導電率を有する。特定の実施形態では、緩衝液は、約３３０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約３３９．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３４０．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの導電率を有する。
【0101】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭの量のグルコース、約１０ｍＭの量のＫＣｌ、約２０ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、及び約５ｍＭの量のＨＥＰＥＳから本質的になるか、又はそれからなる。特定のそのような実施形態では、緩衝液は、約７．０のｐＨ、約１４．３ｍｓ／ｃｍの導電率、及び約３４０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特に除外される。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭの量のグルコース、約１０ｍＭの量のＫＣｌ、約２０ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約１０５ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、約５ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0102】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、
水と、
約２６ｍＭ～約３６ｍＭ、約２７ｍＭ～約３５ｍＭ、約２８ｍＭ～約３４ｍＭ、約２９ｍＭ～約３３ｍＭ、約３０ｍＭ～約３２ｍＭ、約３０．１ｍＭ～約３１．９ｍＭ、約３０．２ｍＭ～約３１．８ｍＭ、約３０．３ｍＭ～約３１．７ｍＭ、約３０．４ｍＭ～約３１．６ｍＭ、約３０．５ｍＭ～約３１．５ｍＭ、約３０．６ｍＭ～約３１．４ｍＭ、約３０．７ｍＭ～約３１．３ｍＭ、約３０．８ｍＭ～約３１．２ｍＭ、約３０．９ｍＭ～約３１．１ｍＭ、又は約３１ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５．０ｍＭの量のＫＣｌと、
約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約１９ｍＭ、約１２ｍＭ～約１８ｍＭ、約１３ｍＭ～約１７ｍＭ、約１４ｍＭ～約１６ｍＭ、約１４．１ｍＭ～約１５．９ｍＭ、約１４．２ｍＭ～約１５．８ｍＭ、約１４．３ｍＭ～約１５．７ｍＭ、約１４．４ｍＭ～約１５．６ｍＭ、約１４．５ｍＭ～約１５．５ｍＭ、約１４．６ｍＭ～約１５．４ｍＭ、１４．７ｍＭ～約１５．３ｍＭ、１４．８ｍＭ～約１５．２ｍＭ、約１４．９ｍＭ～約１５．１ｍＭ、又は約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８６ｍＭ～約９４ｍＭ、約８７ｍＭ～約９３ｍＭ、約８８ｍＭ～約９２ｍＭ、約８９ｍＭ～約９１ｍＭ、約８９．１ｍＭ～約９０．９ｍＭ、約８９．２ｍＭ～約９０．８ｍＭ、約８９．３ｍＭ～約９０．７ｍＭ、約８９．４ｍＭ～約９０．６ｍＭ、約８９．５ｍＭ～約９０．５、約８９．６ｍＭ～約９０．４ｍＭ、約８９．７ｍＭ～約９０．３ｍＭ、約８９．８ｍＭ～約９０．２ｍＭ、約８９．９ｍＭ～約９０．１ｍＭ、又は約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
水と、
約２６ｍＭ～約３６ｍＭ、約２７ｍＭ～約３５ｍＭ、約２８ｍＭ～約３４ｍＭ、約２９ｍＭ～約３３ｍＭ、約３０ｍＭ～約３２ｍＭ、約３０．１ｍＭ～約３１．９ｍＭ、約３０．２ｍＭ～約３１．８ｍＭ、約３０．３ｍＭ～約３１．７ｍＭ、約３０．４ｍＭ～約３１．６ｍＭ、約３０．５ｍＭ～約３１．５ｍＭ、約３０．６ｍＭ～約３１．４ｍＭ、約３０．７ｍＭ～約３１．３ｍＭ、約３０．８ｍＭ～約３１．２ｍＭ、約３０．９ｍＭ～約３１．１ｍＭ、又は約３１ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５．０ｍＭの量のＫＣｌと、
約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約１９ｍＭ、約１２ｍＭ～約１８ｍＭ、約１３ｍＭ～約１７ｍＭ、約１４ｍＭ～約１６ｍＭ、約１４．１ｍＭ～約１５．９ｍＭ、約１４．２ｍＭ～約１５．８ｍＭ、約１４．３ｍＭ～約１５．７ｍＭ、約１４．４ｍＭ～約１５．６ｍＭ、約１４．５ｍＭ～約１５．５ｍＭ、約１４．６ｍＭ～約１５．４ｍＭ、１４．７ｍＭ～約１５．３ｍＭ、１４．８ｍＭ～約１５．２ｍＭ、約１４．９ｍＭ～約１５．１ｍＭ、又は約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８６ｍＭ～約９４ｍＭ、約８７ｍＭ～約９３ｍＭ、約８８ｍＭ～約９２ｍＭ、約８９ｍＭ～約９１ｍＭ、約８９．１ｍＭ～約９０．９ｍＭ、約８９．２ｍＭ～約９０．８ｍＭ、約８９．３ｍＭ～約９０．７ｍＭ、約８９．４ｍＭ～約９０．６ｍＭ、約８９．５ｍＭ～約９０．５、約８９．６ｍＭ～約９０．４ｍＭ、約８９．７ｍＭ～約９０．３ｍＭ、約８９．８ｍＭ～約９０．２ｍＭ、約８９．９ｍＭ～約９０．１ｍＭ、又は約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【0103】
特定の実施形態では、緩衝液は、約６．１～約８．１、約６．２～約８．０、約６．３～約７．９、約６．４～約７．８、約６．５～約７．７、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、約７．０～約７．２、又は約７．１のｐＨに調整される。特定の実施形態では、緩衝液は、約１０．６ｍｓ／ｃｍ～約１２．６ｍｓ／ｃｍ、約１０．７ｍｓ／ｃｍ～約１２．５ｍｓ／ｃｍ、約１０．８ｍｓ／ｃｍ～約１２．４ｍｓ／ｃｍ、約１０．９ｍｓ／ｃｍ～約１２．３ｍｓ／ｃｍ、約１１．０ｍｓ／ｃｍ～約１２．２ｍｓ／ｃｍ、約１１．１ｍｓ／ｃｍ～約１２．１ｍｓ／ｃｍ、約１１．２ｍｓ／ｃｍ～約１２．０ｍｓ／ｃｍ、約１１．３ｍｓ／ｃｍ～約１１．９ｍｓ／ｃｍ、約１１．４ｍｓ／ｃｍ～約１．８ｍｓ／ｃｍ、約１１．５ｍｓ／ｃｍ～約１１．７ｍｓ／ｃｍ、約１１．６ｍｓ／ｃｍの導電率を有する。特定の実施形態では、緩衝液は、約２７０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２７９．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２８０．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。
【0104】
特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３１ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、並びに約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４を含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定のそのような実施形態では、緩衝液は、約７．１のｐＨ、約１１．６ｍｓ／ｃｍの導電率、及び約２８０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、ＨＥＰＥＳ及びＤＭＳＯのうちの１つ以上は、緩衝液から特に除外される。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３１ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、並びに約５ｍＭ～約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、及び／又は緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれらからなるか、又はそれからなる。
【0105】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、
水と、
約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５．０ｍＭの量のＫＣｌと、
約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約１９ｍＭ、約１２ｍＭ～約１８ｍＭ、約１３ｍＭ～約１７ｍＭ、約１４ｍＭ～約１６ｍＭ、約１４．１ｍＭ～約１５．９ｍＭ、約１４．２ｍＭ～約１５．８ｍＭ、約１４．３ｍＭ～約１５．７ｍＭ、約１４．４ｍＭ～約１５．６ｍＭ、約１４．５ｍＭ～約１５．５ｍＭ、約１４．６ｍＭ～約１５．４ｍＭ、１４．７ｍＭ～約１５．３ｍＭ、１４．８ｍＭ～約１５．２ｍＭ、約１４．９ｍＭ～約１５．１ｍＭ、又は約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８６ｍＭ～約９４ｍＭ、約８７ｍＭ～約９３ｍＭ、約８８ｍＭ～約９２ｍＭ、約８９ｍＭ～約９１ｍＭ、約８９．１ｍＭ～約９０．９ｍＭ、約８９．２ｍＭ～約９０．８ｍＭ、約８９．３ｍＭ～約９０．７ｍＭ、約８９．４ｍＭ～約９０．６ｍＭ、約８９．５ｍＭ～約９０．５、約８９．６ｍＭ～約９０．４ｍＭ、約８９．７ｍＭ～約９０．３ｍＭ、約８９．８ｍＭ～約９０．２ｍＭ、約８９．９ｍＭ～約９０．１ｍＭ、又は約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、
０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭ、又は約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳと、を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
水と、
約２０ｍＭ～約４０ｍＭ、約２５ｍＭ～約３５ｍＭ、約２６ｍＭ～約３４ｍＭ、約２７ｍＭ～約３３ｍＭ、約２８ｍＭ～約３２ｍＭ、約２９ｍＭ～約３１ｍＭ、約２９．１ｍＭ～約３０．９ｍＭ、約２９．２ｍＭ～約３０．８ｍＭ、約２９．３ｍＭ～約３０．７ｍＭ、約２９．４ｍＭ～約３０．６ｍＭ、約２９．５ｍＭ～約３０．５ｍＭ、約２９．６ｍＭ～約３０．４ｍＭ、約２９．７ｍＭ～約３０．３ｍＭ、約２９．８ｍＭ～約３０．２ｍＭ、約２９．９ｍＭ～約３０．１ｍＭ、又は約３０ｍＭの量のグルコース及び／又はマンニトールと、
０～約１５ｍＭ、０～約１０ｍＭ、約１ｍＭ～約９ｍＭ、約２ｍＭ～約８ｍＭ、約３ｍＭ～約７ｍＭ、約４ｍＭ～約６ｍＭ、約４．１ｍＭ～約５．９ｍＭ、約４．２ｍＭ～約５．８ｍＭ、約４．３ｍＭ～約５．７ｍＭ、約４．４ｍＭ～約５．６ｍＭ、約４．５ｍＭ～約５．５ｍＭ、約４．６ｍＭ～約５．４ｍＭ、約４．７ｍＭ～約５．３ｍＭ、約４．８ｍＭ～約５．２ｍＭ、約４．９ｍＭ～約５．１ｍＭ、又は約５．０ｍＭの量のＫＣｌと、
約５ｍＭ～約２５ｍＭ、約１０ｍＭ～約２０ｍＭ、約１１ｍＭ～約１９ｍＭ、約１２ｍＭ～約１８ｍＭ、約１３ｍＭ～約１７ｍＭ、約１４ｍＭ～約１６ｍＭ、約１４．１ｍＭ～約１５．９ｍＭ、約１４．２ｍＭ～約１５．８ｍＭ、約１４．３ｍＭ～約１５．７ｍＭ、約１４．４ｍＭ～約１５．６ｍＭ、約１４．５ｍＭ～約１５．５ｍＭ、約１４．６ｍＭ～約１５．４ｍＭ、１４．７ｍＭ～約１５．３ｍＭ、１４．８ｍＭ～約１５．２ｍＭ、約１４．９ｍＭ～約１５．１ｍＭ、又は約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２と、
約８０ｍＭ～約１００ｍＭ、約８５ｍＭ～約９５ｍＭ、約８６ｍＭ～約９４ｍＭ、約８７ｍＭ～約９３ｍＭ、約８８ｍＭ～約９２ｍＭ、約８９ｍＭ～約９１ｍＭ、約８９．１ｍＭ～約９０．９ｍＭ、約８９．２ｍＭ～約９０．８ｍＭ、約８９．３ｍＭ～約９０．７ｍＭ、約８９．４ｍＭ～約９０．６ｍＭ、約８９．５ｍＭ～約９０．５、約８９．６ｍＭ～約９０．４ｍＭ、約８９．７ｍＭ～約９０．３ｍＭ、約８９．８ｍＭ～約９０．２ｍＭ、約８９．９ｍＭ～約９０．１ｍＭ、又は約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４と、
０～約２０ｍＭ、約５ｍＭ～約１５ｍＭ、約６ｍＭ～約１４ｍＭ、約７ｍＭ～約１３ｍＭ、約８ｍＭ～約１２ｍＭ、約９ｍＭ～約１１ｍＭ、約９．１ｍＭ～約１０．９ｍＭ、約９．２ｍＭ～約１０．８ｍＭ、約９．３ｍＭ～約１０．７ｍＭ、約９．４ｍＭ～約１０．６ｍＭ、約９．５ｍＭ～約１０．５ｍＭ、９．６ｍＭ～約１０．４ｍＭ、約９．７ｍＭ～約１０．３ｍＭ、約９．８ｍＭ～約１０．２ｍＭ、約９．９ｍＭ～約１０．１ｍＭ、又は約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳと、を含むか、それから本質的になるか、又はそれからなる。
【0106】
特定の実施形態では、緩衝液は、約６．１～約８．１、約６．２～約８．０、約６．３～約７．９、約６．４～約７．８、約６．５～約７．７、約６．６～約７．６、約６．７～約７．５、約６．８～約７．４、約６．９～約７．３、約７．０～約７．２、又は約７．１のｐＨに調整される。特定の実施形態では、緩衝液は、約１１．８ｍｓ／ｃｍ～約１３．８ｍｓ／ｃｍ、約１１．９ｍｓ／ｃｍ～約１３．７ｍｓ／ｃｍ、約１２．０ｍｓ／ｃｍ～約１３．６ｍｓ／ｃｍ、約１２．１ｍｓ／ｃｍ～約１３．５ｍｓ／ｃｍ、約１２．２ｍｓ／ｃｍ～約１３．４ｍｓ／ｃｍ、約１２．３ｍｓ／ｃｍ～約１３．３ｍｓ／ｃｍ、約１２．４ｍｓ／ｃｍ～約１３．２ｍｓ／ｃｍ、約１２．５ｍｓ／ｃｍ～約１３．１ｍｓ／ｃｍ、約１２．６ｍｓ／ｃｍ～約１３．０ｍｓ／ｃｍ、約１２．７ｍｓ／ｃｍ～約１２．９ｍｓ／ｃｍ、又は約１２．８ｍｓ／ｃｍの導電率を有する。特定の実施形態では、緩衝液は、約２８２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約３０２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、２８７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２８９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．５ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．６ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．４ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．７ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．３ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．８ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、約２９１．９ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ～約２９２．１ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏ、又は約２９２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの導電率を有する。
【0107】
特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、並びに約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。特定のそのような実施形態では、緩衝液は、約７．１のｐＨ、約１２．８ｍｓ／ｃｍの導電率、及び約２９２ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ２Ｏの浸透圧を有する。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯは、緩衝液から特に除外される。特定の実施形態では、緩衝液は、水、約３０ｍＭの量のグルコース、約５ｍＭの量のＫＣｌ、及び約１５ｍＭの量のＭｇＣｌ２、約９０ｍＭの量のＮａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４、約１０ｍＭの量のＨＥＰＥＳ、並びに緩衝液の総体積の約２．５体積％以下の量のＤＭＳＯを含むか、本質的にそれからなるか、又はそれからなる。
【0108】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上から選択される。特定の実施形態では、緩衝液は、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される。
【0109】
いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジ（又は、カセット）と併せて使用される。ＷＯ２０２１／０９６９３６（２０２０年１１月１１日出願）及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号（２０２０年１１月１１日出願）を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。この装置は、様々な遺伝子療法及び細胞療法の迅速な製造を可能にするように設計されている。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）は、１回の操作で大量の細胞をエレクトロポレーションするための高スループット、半閉鎖型エレクトロポレーションシステムである。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）システムは、処理時間及び汚染リスクを大幅に削減することにより、現在のエレクトロポレーションデバイスに比べて進歩している。例えば、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒは、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの、分散型キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化ソリューションとして利用され得る。
【0110】
本発明の緩衝液は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及び／又はカートリッジ（又はカセット）における緩衝液を使用してエレクトロポレーションを実施する場合、高い細胞トランスフェクション効率を生み出すのに驚くほど効果的である。ＷＯ２０２１／０９６９３６号（２０２０年１１月１１日出願）及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい。
【0111】
方法及びそれらの方法を使用して産生された組換え細胞
本発明の別の態様では、本発明による緩衝液を利用して、電流を介して、細胞に生物学的に活性な物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する方法（すなわち、エレクトロポレーション）が提供される。本方法は、単離された真核細胞、細胞に対して外因性である生体物質、及び本発明の緩衝液を含む懸濁液に電流を印加することを含む。この懸濁液は、本発明の緩衝液に、ヒトから得られた細胞を外因性生体物質とともに組み合わせることによって形成される。電気の適用は、細胞への生体物質の導入を容易にする。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態では、生体物質は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む。特定の実施形態では、細胞は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞である。
本発明の別の態様では、本発明による緩衝液を利用して、電流を介して、細胞に生物学的に活性な物質（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）を導入する方法（すなわち、エレクトロポレーション）が提供される。本方法は、単離された真核細胞、細胞に対して外因性である生体物質、及び本発明の緩衝液を含む懸濁液に電流を印加することを含む。この懸濁液は、本発明の緩衝液に、ヒトから得られた細胞を外因性生体物質とともに組み合わせることによって形成される。電気の適用は、細胞への生体物質の導入を容易にする。いくつかの実施形態では、真核細胞は、ヒト細胞である。特定の実施形態では、生体物質は、核酸、ポリペプチド、ペプチド、及び／又はリボ核タンパク質を含む。特定の実施形態では、細胞は、リンパ球、例えば、Ｔ細胞である。
【0112】
特定の実施形態では、電圧パルスは、最大１～１０ｋＶ＊ｃｍ－１の電界強度、５～２５０μｓの持続時間、及び少なくとも２Ａ＊ｃｍ－２の電流密度を有し得る。特定の実施形態では、電圧パルスは、生物学的に活性な物質（例えば、ＤＮＡ）を動物及びヒト細胞の細胞核に直接トランスフェクトすることを可能にする。特定の実施形態では、電圧パルスに続いて、中断することなく、２～１４Ａ＊ｃｍ－２、好ましくは最大５Ａ＊ｃｍ－２の電流密度、及び１～１００ｍｓの持続時間を有する電流フローも適用され得る。
【0113】
本発明による方法を使用して、細胞（動物細胞の核を含む）への生物学的に活性な物質のトランスフェクションを最適化することができる。この場合、生物学的に活性な物質（例えば、核酸、ポリペプチドなど）を、高効率で静止動物細胞又は分裂動物細胞に導入することができる。
【0114】
いくつかの実施形態では、細胞は、緩衝液に１０分未満曝露される。例えば、細胞は、９分間未満、８分間未満、７分間未満、６分間未満、５分間未満、４分間未満、３分間未満、２分間未満、又は１分間未満、緩衝液に曝露され得る。
【0115】
いくつかの実施形態では、本方法は、初代ヒト血液細胞、ヒト血液の多能性前駆細胞、並びに初代ヒト線維芽細胞及び内皮細胞に生物学的活性物質を導入するために使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト血液細胞、例えば、免疫細胞であってもよい。特定の実施形態では、免疫細胞は、好中球、好酸球、好塩基球、肥満細胞、単球、マクロファージ、樹状細胞、ナチュラルキラー細胞、及びリンパ球（Ｂ細胞及びＴ細胞）、又はそれらのいくつかの組み合わせである。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞である。特定の実施形態では、細胞は、患者から得られる。
【0116】
いくつかの実施形態では、生体物質は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、酵素、ＲＮＰ、又はそれらのいくつかの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、生体物質は、細胞に対して異種である。いくつかの実施形態では、生体物質は、部分的又は完全に合成である。
【0117】
いくつかの実施形態では、核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡから選択される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、ｃＤＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｓＲＮＡ、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、核酸は、組換え核酸である。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ポリペプチド、タンパク質、酵素、抗体、抗体断片、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、ペプチドは、組換えペプチドである。
【0118】
本発明の緩衝液を利用する方法は、特に他のエレクトロポレーション緩衝液を利用する方法と比較して、望ましく高いトランスフェクション収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液によるトランスフェクション収率の少なくとも約１．１倍である。例えば、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液の収率よりも、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、２．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０倍高い可能性がある。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液の収率よりも、５倍を超える、例えば、６、７、８、９、又は１０倍高い可能性がある。特定の実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクション収率は、対照（従来技術）緩衝液の収率よりも、１．３５、１．４１、１．４６、１．９７、１．９８、２．０５、２．１２、２．４０、又は２．４４倍高い。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクション収率は、対照緩衝液を使用した場合よりも少なくとも１．３５倍高い。
【0119】
本発明の緩衝液を利用する方法は、特に他のエレクトロポレーション緩衝液を利用する方法と比較して、望ましく高いトランスフェクト細胞の回収収率をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクトされた細胞の回収収率は、対照（従来技術）緩衝液を用いたトランスフェクト細胞の回収収率の少なくとも約１．１倍である。例えば、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクト細胞の回収収率は、対照（従来技術）の緩衝液の収率よりも、約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、２．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、又は５．０倍高い可能性がある。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクト細胞の回収収率は、対照（従来技術）緩衝液の収率よりも５倍を超える可能性がある。特定の実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクト細胞の回収収率は、対照（従来技術）緩衝液の収率よりも、１．５３、１．６６、１．７２、１．８０、２．０６、２．１７、２．２３、２．３４、又は２．６１倍高い。いくつかの実施形態では、本発明の緩衝液を用いたトランスフェクト細胞の回収収率は、対照緩衝液を使用した場合よりも少なくとも１．５３倍高い。
【0120】
本発明はまた、部分的には、トランスフェクション効率を増加させる方法に関し、本方法は、単離された真核細胞及び細胞に対して外因性である生体物質を、本発明の緩衝液と組み合わせて、それによって、懸濁液を形成することと、懸濁液に電流を印加し、それによって、細胞への生体物質の導入を容易にすることと、を含む。
【0121】
本発明はまた、部分的には、トランスフェクトされた細胞の回収率を増加させる方法に関し、本方法は、単離された真核細胞及び細胞に対して外因性である生体物質を、本発明の緩衝液と組み合わせて、それによって、懸濁液を形成することと、懸濁液に電流を印加し、それによって、細胞への生体物質の導入を容易にすることと、を含む。
【0122】
本発明の別の態様では、組換え細胞が提供される。これらの細胞は、本明細書に記載される方法を使用して産生され、診断及び／又は分析方法、並びにエクスビボ遺伝子療法（例えば、免疫療法及び／又はＣＡＲ－Ｔ療法）のための生物学的産物の産生に非常に好適である。いくつかの実施形態では、組換え免疫細胞は、本発明の方法を使用して産生される。いくつかの実施形態では、細胞は、組換えヒト免疫細胞である。特定の実施形態では、細胞は、組換えリンパ球である。特定の実施形態では、細胞は、組換えＴ細胞である。特定の実施形態では、組換え免疫細胞は、改変Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、改変Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＡＲ－Ｔ細胞は、治療目的で患者に投与される。
【0123】
本発明はまた、部分的には、本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生された組換えＴ細胞を使用する免疫療法の方法に関する。
【0124】
本発明はまた、部分的には、本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞を使用する免疫療法の方法に関する。
【0125】
本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬品の調製における本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生された組換えＴ細胞の使用に関する。
【0126】
本発明はまた、疾患又は障害の治療のための医薬品の調製における本発明の緩衝液を利用する方法を使用して産生されたＣＡＲ Ｔ細胞の使用に関する。
【0127】
エレクトロポレーション装置及びその使用方法
本発明の別の態様では、エレクトロポレーション装置、並びに装置の使用が提供される。いくつかの実施形態では、装置は、エレクトロポレーションプロセス中に緩衝液及び細胞を格納するように構成された１つ以上のチャンバと、エレクトロポレーションプロセス中に１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極対であって、各電界が１つのチャンバに対応する、電極対と、エレクトロポレーションプロセス後の細胞回収プロセス中に細胞を輸送するように構成されたフローチャネルと、を備える。いくつかの実施形態では、装置は、入口ポートと、出口ポートと、入口ポート及び出口ポートをフローチャネルに接続する隣接するフローチャネルと、を更に備える。
本発明の別の態様では、エレクトロポレーション装置、並びに装置の使用が提供される。いくつかの実施形態では、装置は、エレクトロポレーションプロセス中に緩衝液及び細胞を格納するように構成された１つ以上のチャンバと、エレクトロポレーションプロセス中に１つ以上のチャンバ内に電界を生成するように構成された１つ以上の電極対であって、各電界が１つのチャンバに対応する、電極対と、エレクトロポレーションプロセス後の細胞回収プロセス中に細胞を輸送するように構成されたフローチャネルと、を備える。いくつかの実施形態では、装置は、入口ポートと、出口ポートと、入口ポート及び出口ポートをフローチャネルに接続する隣接するフローチャネルと、を更に備える。
【0128】
いくつかの実施形態では、装置は、１つのチャンバ、２つのチャンバ、３つのチャンバ、４つのチャンバ、５つのチャンバ、６つのチャンバ、７つのチャンバ、８つのチャンバ、９つのチャンバ、１０のチャンバ、又は１０以上のチャンバを備える。特定の実施形態では、装置は、連続流又はマイクロ流体システムを利用する。
【0129】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、回収プロセス中にフローチャネルから少なくとも１つのチャンバに液体媒体をポンピングするためのポンプを更に備え、液体媒体が、入口ポートで得られる。いくつかの実施形態では、ポンプは、１つ以上のチャンバをフローチャネルに接続する１つ又は複数のバルブを備える。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバルブは、一度に１つずつ開かれる。いくつかの実施形態では、１つ又は複数のバルブは、流体の一方向の流れのみを可能にする。いくつかの実施形態では、各バルブは、１つのチャンバに対応する。いくつかの実施形態では、チャンババルブに対応する各バルブは、ピンチバルブ又はピンチタイプのバルブである。いくつかの実施形態では、バルブの各々は、ばね運動、レバー運動、又はピストン運動を使用して動作する。
【0130】
いくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバは、所与のチャンバを含み、電極対の各電極は、所与のチャンバの対向する両側に位置し、電極対の各電極は、所与のチャンバの内側の内部部分及び所与のチャンバの外側の外部部分の両方を含む。
【0131】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、入口ポートと、出口ポートと、入口ポート及び出口ポートをフローチャネルに接続する１つ以上の隣接するフローチャネルと、を更に備える。
【0132】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、回収プロセス中にフローチャネルから少なくとも１つのチャンバに液体媒体をポンピングするためのポンプを更に備え、液体媒体が、入口ポートで得られる。
【0133】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、１つ以上のチャンバに通じる１つ以上の開口部を含む表面と、開口部の下にあり、チャンバ間に気流を接続する気流チャネルと、を更に備える。
【0134】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、空気流チャネルをエレクトロポレーション装置の外部に接続するベント又はエアフィルタを更に含む。
【0135】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、１つ以上の開口部を覆うように構成されたシールを更に含む。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置の各チャンバは、それぞれのバルブに向かって狭くなる形状を備える。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置は、一対の電極を更に含み、電極対の各電極は、各チャンバの対向する両側に位置する。電極対における２つの電極間の距離は、「ギャップ距離」又は「分離距離」と称される。この距離は、チャンバの幅にわたる。
【0136】
いくつかの実施形態では、１つ以上のチャンバの各々は、約０．１ミリメートル（ｍｍ）～約２０ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１０ｍｍ、約１ｍｍ～約７ｍｍ、又は約１ｍｍ～約４ｍｍのギャップ距離を含む。いくつかの実施形態では、ギャップ距離は、約０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍ、４．５ｍｍ、５．０ｍｍ、５．５ｍｍ、６．０ｍｍ、６．５ｍｍ、７．０ｍｍ、７．５ｍｍ、又は８．０ｍｍである。いくつかの実施形態では、ギャップ距離は、約２．５ｍｍ、２．６ｍｍ、２．７ｍｍ、２．８ｍｍ、２．９ｍｍ、３．０ｍｍ、３．１ｍｍ、３．２ｍｍ、３．３ｍｍ、３．４ｍｍ、３．５ｍｍ、３．６ｍｍ、３．７ｍｍ、３．８ｍｍ、３．９ｍｍ、又は４．０ｍｍである。いくつかの実施形態では、ギャップ距離は、約４ｍｍ未満、約３．５ｍｍ未満、約３．０ｍｍ未満、約２．５ｍｍ未満、約２．０ｍｍ未満、約１．５ｍｍ未満、又は約１．０ｍｍ未満である。いくつかの実施形態では、約４．０ｍｍ未満のギャップ距離は、本明細書に提供される緩衝液のエレクトロポレーション性能を改善する。
【0137】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置の電極対の各電極は、所与のチャンバの内側の内部部分と、所与のチャンバの外側の外部部分と、を含み、各電極対は、電気回路に接続するように構成される。いくつかの実施形態では、所与のチャンバの内側の内部部分は、楕円形の面を有し、金コーティングを含む。
【0138】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置の各チャンバは、少なくとも約５０マイクロリットル（μＬ）、少なくとも約１００μＬ、少なくとも約１５０少なくとも約μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約２５０μＬ、少なくとも約３００μＬ、少なくとも約３５０μＬ、少なくとも約４００μＬ、少なくとも約４５０μＬ、少なくとも約１５０μＬ、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約５５０μＬ、少なくとも約６００μＬ、少なくとも約６５０μＬ、少なくとも約７００μＬ、少なくとも約７５０μＬ、少なくとも約８００μＬ、少なくとも約８５０μＬ、少なくとも約９００μＬ、少なくとも約９５０μＬ、又は少なくとも約１０００μＬ（１．０ｍＬ）の体積を格納するように構成される。
【0139】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーション装置のチャンバは、組み合わせて、エレクトロポレーションのための液体懸濁液中に、少なくとも約５００μＬ、少なくとも約１．０ミリリットル（ｍＬ）、少なくとも約１．２ｍＬ、少なくとも約１．４ｍＬ、少なくとも約１．６ｍＬ、少なくとも約１．８ｍＬ、少なくとも約２．０ｍＬ、少なくとも約２．２ｍＬ、少なくとも約２．４ｍＬ、少なくとも約２．６ｍＬ、少なくとも約２．８ｍＬ、少なくとも約３．０ｍＬ、少なくとも約３．２ｍＬ、少なくとも約３．４ｍＬ、少なくとも約３．６ｍＬ、少なくとも約３．８ｍＬ、少なくとも約４．０ｍＬ、少なくとも約４．２ｍＬ、少なくとも約４．４ｍＬ、少なくとも約４．６ｍＬ、少なくとも約４．８ｍＬ、少なくとも約５．０ｍＬ、少なくとも約５．２ｍＬ、少なくとも約５．４ｍＬ、少なくとも約５．６ｍＬ、少なくとも約５．８ｍＬ、少なくとも約６．０ｍＬ、少なくとも約６．２ｍＬ、少なくとも約６．４ｍＬ、少なくとも約６．６ｍＬ、少なくとも約６．８ｍＬ、又は少なくとも約７．０ｍＬの細胞を格納するように構成される。
【0140】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションプロセスに関与する細胞は、少なくとも１×１０８個の細胞、少なくとも２×１０８個の細胞、少なくとも３×１０８個の細胞、少なくとも４×１０８個の細胞、少なくとも５×１０８個の細胞、少なくとも６×１０８個の細胞、少なくとも７×１０８個の細胞、少なくとも８×１０８個の細胞、少なくとも９×１０８個の細胞、少なくとも１×１０９個の細胞、少なくとも２×１０９個の細胞、少なくとも３×１０９個の細胞、少なくとも４×１０９個の細胞、少なくとも５×１０９個の細胞、少なくとも６×１０９個の細胞、少なくとも７×１０９個の細胞、少なくとも８×１０９個の細胞、少なくとも９×１０９個の細胞、少なくとも１×１０１０個の細胞、少なくとも２×１０１０個の細胞、少なくとも３×１０１０個の細胞、少なくとも４×１０１０個の細胞、少なくとも５×１０１０個の細胞、少なくとも６×１０１０個の細胞、少なくとも７×１０１０個の細胞、少なくとも８×１０１０個の細胞、少なくとも９×１０１０個の細胞、少なくとも１×１０１１個の細胞、少なくとも２×１０１１個の細胞、少なくとも３×１０１１個の細胞、少なくとも４×１０１１個の細胞、少なくとも５×１０１１個の細胞、少なくとも６×１０１１個の細胞、少なくとも７×１０１１個の細胞、少なくとも８×１０１１個の細胞、少なくとも９×１０１１個の細胞、少なくとも１×１０１２個の細胞、少なくとも２×１０１２個の細胞、少なくとも３×１０１２個の細胞、少なくとも４×１０１２個の細胞、少なくとも５×１０１２個の細胞、少なくとも６×１０１２個の細胞、少なくとも７×１０１２個の細胞、少なくとも８×１０１２個の細胞、又は少なくとも９×１０１２個の細胞からなる群から選択される集団を含む。
【0141】
いくつかの実施形態では、本発明の装置は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジを含む（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。上記のように、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置は、様々な遺伝子療法及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。装置は、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの分散型ＣＡＲ Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化ソリューションとして利用され得る。
【0142】
いくつかの実施形態では、本発明の装置は、エレクトロポレーションの方法において使用され、本方法は、一対の電極を使用してチャンバ内に電界を生成することによってエレクトロポレーションプロセスを実行することであって、チャンバが、エレクトロポレーションプロセス中に緩衝液及び細胞を格納するように構成される、実行することと、チャンバに接続されたバルブを開くこと並びにバルブに接続されたフローチャネルを使用して緩衝液及び細胞を出口ポートに輸送することによって細胞回収プロセスを実行することであって、チャンバ、電極対、バルブ、出口ポート、及びフローチャネルが各々、エレクトロポレーション装置内に位置する、実行することと、を含む。
【0143】
いくつかの実施形態では、細胞回収プロセスを実行するステップは、ポンプの使用により、フローチャネルからチャンバに液体媒体をポンピングすることを更に含み、液体媒体が、入口ポートで得られ、入口ポート及び出口ポートが、エレクトロポレーション装置内の隣接するフローチャネルによってフローチャネルに接続される。
【0144】
いくつかの実施形態では、細胞回収プロセスは、チャンバをフローチャネルに排出することを更に含み、チャンバ内の圧力は、チャンバと別のチャンバとの間に延びる空気フローチャネルに接続されたベント又はエアフィルタを介して維持される。
【0145】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションの方法は、緩衝液を保持するチャンバにつながる開口部に細胞を堆積させることと、開口部にシールを適用することと、例えば、エレクトロポレーション装置をドッキングステーションに挿入することによって、電極対を少なくとも１つの回路に接続することと、を更に含む。
【0146】
いくつかの実施形態では、本方法は、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を利用する。特定の実施形態では、本方法は、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３を利用する。
【0147】
いくつかの実施形態では、本方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実施される（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。特定の実施形態では、本方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実行され、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を利用する。特定の実施形態では、本方法は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置で実行され、（表２に示される）緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３を利用する。
【0148】
エレクトロポレーションシステム
本発明の別の態様では、エレクトロポレーションのためのシステムが提供される。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、本明細書に記載されるエレクトロポレーション装置と、本明細書に記載されるエレクトロポレーション緩衝液と、を含む。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジを含む（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。上記のように、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置は、様々な遺伝子療法及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。デバイスは、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの分散型ＣＡＲ Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化ソリューションとして利用され得る。
本発明の別の態様では、エレクトロポレーションのためのシステムが提供される。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、本明細書に記載されるエレクトロポレーション装置と、本明細書に記載されるエレクトロポレーション緩衝液と、を含む。いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションシステムは、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置及びカートリッジを含む（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。上記のように、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）エレクトロポレーション装置は、様々な遺伝子療法及び細胞療法のための迅速な製造を可能にするように設計されている。デバイスは、インビボでがん抗原を標的とするように再プログラムされたＴ細胞のＵｌｔｒａＣＡＲ－Ｔ（商標）製造などの分散型ＣＡＲ Ｔ細胞製造のためのスケールアップ及び商業化ソリューションとして利用され得る。
【0149】
いくつかの実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上に由来する緩衝液を更に含む。特定の実施形態では、エレクトロポレーションのためのシステムは、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される緩衝液を含む。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイス及び緩衝液１、２、又は３のうちの１つを含むシステムは、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイス及び対照緩衝液を含むシステムと比較して、驚くほど高い細胞トランスフェクション効率をもたらすことが見出されている。
【0150】
キット
本発明の別の態様では、キットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の緩衝液と、点滴器、ピペット、又はキュベットと、を含む。キットは、本明細書に記載される緩衝液のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、キットは、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明による緩衝液及び他の好適な試薬で満たされた１つ以上の容器及び／又はデバイスを含む。例えば、キットは、目的の核酸を含むベクターを更に含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、点滴器、ピペット、及び／又はキュベットを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アリコートされた容器に包装されてもよく、又は原液として包装されてもよい。
本発明の別の態様では、キットが提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の緩衝液と、点滴器、ピペット、又はキュベットと、を含む。キットは、本明細書に記載される緩衝液のうちのいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、表２及び３に示される例示的な緩衝液のうちの１つ以上を含む。特定の実施形態では、キットは、緩衝液１、緩衝液２、又は緩衝液３から選択される緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、キットは、本発明による緩衝液及び他の好適な試薬で満たされた１つ以上の容器及び／又はデバイスを含む。例えば、キットは、目的の核酸を含むベクターを更に含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、点滴器、ピペット、及び／又はキュベットを含み得る。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アリコートされた容器に包装されてもよく、又は原液として包装されてもよい。
【0151】
いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液及び任意の追加の試薬及び／又はデバイスを安全に輸送するための包装を更に含む。いくつかの実施形態では、キットは、緩衝液の内容物及び任意の追加の試薬に関する情報を含む。更に、キットは、書面資料、例えば、ユーザマニュアル又はよくある質問への回答を含み得る。
【実施例】
【0152】
以下の非限定的な実施例は、記載される実施形態を更に説明するために提供され、本発明の範囲を限定するものではない。
【0153】
実施例１：リン酸ナトリウム緩衝剤の調製
一塩基性リン酸対二塩基性リン酸の比率への影響を調べるために、異なる比率の０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏの代替緩衝剤を０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と組み合わせて試験し、エレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液の性能に対するその比率の影響を評価した。表１は、Ｎａ２ＨＰＯ４対ＮａＨ２ＰＯ４の比率及びそれらに対応するｐＨを提供する。ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ（２７．６ｇ／Ｌ）の第１の０．２Ｍストック溶液及びＮａ２ＨＰＯ４（２８．４ｇ／Ｌ）の第２の０．２Ｍストック溶液を調製した。表１に提供されるように、第１のストック溶液を第２のストック溶液と組み合わせた。次いで、得られた混合物を更に２００ｍＬの総体積に希釈して、室温で必要なｐＨの０．１Ｍリン酸緩衝液を生成した。
一塩基性リン酸対二塩基性リン酸の比率への影響を調べるために、異なる比率の０．２Ｍ ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏの代替緩衝剤を０．２Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４と組み合わせて試験し、エレクトロポレーション（ＥＰ）緩衝液の性能に対するその比率の影響を評価した。表１は、Ｎａ２ＨＰＯ４対ＮａＨ２ＰＯ４の比率及びそれらに対応するｐＨを提供する。ＮａＨ２ＰＯ４－Ｈ２Ｏ（２７．６ｇ／Ｌ）の第１の０．２Ｍストック溶液及びＮａ２ＨＰＯ４（２８．４ｇ／Ｌ）の第２の０．２Ｍストック溶液を調製した。表１に提供されるように、第１のストック溶液を第２のストック溶液と組み合わせた。次いで、得られた混合物を更に２００ｍＬの総体積に希釈して、室温で必要なｐＨの０．１Ｍリン酸緩衝液を生成した。
【表1】
【0154】
上記のような様々なリン酸ナトリウム緩衝剤を、約５０ｍＭ～約１６０ｍＭの量の緩衝液中で評価した。結果は、リン酸ナトリウム緩衝剤のｐＨが約ｐＨ６．８５～約ｐＨ７．７の範囲内にある場合、性能に悪影響を及ぼさなかったことを示す。
【0155】
実施例２：例示的な緩衝液の調製（１～３７）
表２及び３は、調製した例示的な緩衝液の組成を示す。緩衝液１～２０は、グルコースを含み（表２）、緩衝液２１～３７は、マンニトールを含む（表３）。これらの緩衝液のうちの３つ（本明細書では緩衝液１、２、及び３と称される）を、その後、対照緩衝液（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液、カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）に対して試験した。実施例３を参照されたい。
表２及び３は、調製した例示的な緩衝液の組成を示す。緩衝液１～２０は、グルコースを含み（表２）、緩衝液２１～３７は、マンニトールを含む（表３）。これらの緩衝液のうちの３つ（本明細書では緩衝液１、２、及び３と称される）を、その後、対照緩衝液（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液、カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）に対して試験した。実施例３を参照されたい。
【表2】
【表3】
【0156】
実施例３：緩衝液１、２、及び３の特性
表４は、実施例２で調製した３つの例示的な緩衝液（緩衝液１、２、及び３）、並びに対照緩衝液（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液、カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）の組成、ｐＨ、導電率、及び浸透圧を提供する。
表４は、実施例２で調製した３つの例示的な緩衝液（緩衝液１、２、及び３）、並びに対照緩衝液（Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液、カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）の組成、ｐＨ、導電率、及び浸透圧を提供する。
【表4】
【0157】
実施例４：緩衝液１、２、及び３を使用したＣＡＲ構築物のドナー細胞へのトランスフェクション
緩衝能の機能としてのエレクトロポレーション中の細胞のトランスフェクション及び生存率を試験するために、３人のドナーから初代ヒトリンパ球を得た。標準的なアフェレーシス・ロイコパック及びＰＢＭＣ濃縮を使用して、リンパ球を単離した。Ａ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｕｋｏｐａｋ ＰＢＭＣ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４０９：９９－１０６（Ｊｕｌｙ ２０１４）、Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ，“Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２６：２３０－２３８、Ｌ．Ｔｒａｊｍａｎ，“Ｌｅｕｋｏｐａｋ１０１：Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ，”を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。
緩衝能の機能としてのエレクトロポレーション中の細胞のトランスフェクション及び生存率を試験するために、３人のドナーから初代ヒトリンパ球を得た。標準的なアフェレーシス・ロイコパック及びＰＢＭＣ濃縮を使用して、リンパ球を単離した。Ａ．Ｇａｒｃｉａ ｅｔ ａｌ．，“Ｌｅｕｋｏｐａｋ ＰＢＭＣ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｆｏｒ Ｐｒｅｐａｒｉｎｇ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｍａｔｅｒｉａｌ ｔｏ Ｓｕｐｐｏｒｔ Ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｔｅｓｔｉｎｇ Ｐｒｏｇｒａｍｓ，”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．４０９：９９－１０６（Ｊｕｌｙ ２０１４）、Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ，“Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２６：２３０－２３８、Ｌ．Ｔｒａｊｍａｎ，“Ｌｅｕｋｏｐａｋ１０１：Ａ Ｂｒｉｅｆ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ，”を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。
【0158】
およそ等しい数のリンパ球を、緩衝液１、２、３及び対照緩衝液に懸濁し、次いで、実質的に同一のエレクトロポレーション条件下で、第１のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ１）をコードする核酸ベクターでトランスフェクトした。緩衝液１、２、及び３の組成を表２に示す。使用した対照緩衝液は、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液（カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）であった。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスを使用して、エレクトロポレーションを実行した（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。エレクトロポレーションの直後に、試料を回収培地フラスコに移した。
【0159】
実験の結果を、表５に示す。これらの結果は、フローサイトメトリー、生存率分析、及び細胞計数を含む標準的な分析技術を使用して得た。（例えば、Ｇ．Ｄｅ Ｌｉｂｅｒｏ，“Ｔ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２ｄ ｅｄ．（２００９）を参照、参照により本明細書に援用される）。「生存率」は、エレクトロポレーション前の生存細胞の割合（％）を提供し、「細胞の回収率」は、エレクトロポレーション後も生存していた細胞の割合（％）であり、「トランスフェクション」は、核酸でトランスフェクトされた細胞の割合（％）であり、「トランスフェクト細胞の収率」は、回収され、トランスフェクトされた生体物質を含有する細胞の割合（％）である。
【表5】
【0160】
表５に示すように、３つの緩衝液（緩衝液１、２、及び３）は、対照緩衝液よりも有意に高い収率（％）を有した。図１及び図２を参照すると、例えば、ドナー１から採取したリンパ球において、緩衝液１、２、及び３は、トランスフェクション収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも２．０５、１．９８、及び２．４４倍高くなり、対応するトランスフェクト細胞の回収収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも２．２３、２．０６、及び２．６１倍高くなった。図１及び図３を参照すると、ドナー２から採取したリンパ球において、緩衝液１、２、及び３は、トランスフェクション収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも１．３５、１．４６、及び１．４１倍高くなり、対応するトランスフェクト細胞の回収収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも１．５３、１．７２、及び１．６６倍高くなった。図１及び図４を参照すると、ドナー３から採取したリンパ球において、緩衝液１、２、及び３は、トランスフェクション収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも１．９７、２．４０、及び２．１２倍高くなり、対応するトランスフェクト細胞の回収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも１．８０、２．３４、及び２．１７倍高くなった。
【0161】
実施例５：緩衝液１、２、及び３を使用したＣＡＲ構築物のドナー細胞へのトランスフェクション
実施例４と同様に、ほぼ等しい数のリンパ球を、緩衝液１、２、３及び対照緩衝液に懸濁した。緩衝液１、２及び３の組成を表２に示し、リン酸ナトリウム緩衝剤の調製を実施例２に示す。使用した対照緩衝液は、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液（カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）であった。
実施例４と同様に、ほぼ等しい数のリンパ球を、緩衝液１、２、３及び対照緩衝液に懸濁した。緩衝液１、２及び３の組成を表２に示し、リン酸ナトリウム緩衝剤の調製を実施例２に示す。使用した対照緩衝液は、Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ（商標）Ｉｎｇｅｎｉｏ（商標）エレクトロポレーション溶液（カタログ番号ＭＩＲ－５０１１７；Ｍｉｒｕｓ Ｂｉｏ ＬＬＣ、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）（「対照１」）であった。
【0162】
次いで、懸濁されたリンパ球を、実質的に同一のエレクトロポレーション条件下で、第２のキメラ抗原受容体構築物（ＣＡＲ２）をコードする核酸ベクターでトランスフェクトした。ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスを使用して、エレクトロポレーションを実行した（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。エレクトロポレーションの直後に、試料を回収培地フラスコに移した。
【0163】
表６に示される実験の結果は、実施例４に提供されるように、フローサイトメトリー及び細胞計数を含む標準的な分析技術を使用して得られた。
【表6】
【0164】
表６に示すように、ＣＡＲ２構築物でうまくトランスフェクトされ回収されたリンパ球の割合（％）は、緩衝液１、２、及び３の各々を使用すると、対照緩衝液を使用した場合よりも有意に高かった。具体的には、図５を参照すると、緩衝液１、２、及び３は、（ドナー１から採取されたリンパ球の）トランスフェクト細胞の収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも２．４１、２．５１、及び１．８９倍高くなった。同様に、緩衝液１、２、及び３は、（ドナー２から採取されたリンパ球の）トランスフェクト細胞の収率が、それぞれ、対照緩衝液よりも１．３７、１．８７、及び１．６４倍高くなった。
【0165】
実施例６：ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスにおけるトランスフェクション及びトランスフェクト細胞の収率
トランスフェクション効率（トランスフェクション％）及び生存率（トランスフェクト細胞の収率（％））の評価のために、初代ヒトリンパ球細胞を、２人のドナーから採取し、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスでエレクトロポレーションすることができる。およそ等しい数のリンパ球を、緩衝液１、２、３、又は市販の緩衝液（例えば、以下の６つの市販の緩衝液のうちの１つなど）に懸濁することができる：ａ）対照緩衝液２：Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１６５－２６７６、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ｂ）対照緩衝液３：Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム緩衝液（カタログ番号ＭＰＫ－１００２５、ＵＳＡ）；ｃ）対照緩衝液４：Ｃｅｌｅｔｒｉｘ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１２０７、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０９ Ｕ．Ｓ．）；ｄ）対照緩衝液５：ＢＴＸｐｒｅｓｓ（登録商標）高性能エレクトロポレーション溶液（カタログ番号４５－０８０３、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ ０１７４６）；ｅ）対照緩衝液６：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１７０－０７６－６２５、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ ９５１３４）；及びｆ）対照緩衝液７：Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ真核細胞のためのエレクトロポレーション緩衝液（製造番号９４０００２００１、品番ＥＷ－３６２０５－６０、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ ６００６１）。
トランスフェクション効率（トランスフェクション％）及び生存率（トランスフェクト細胞の収率（％））の評価のために、初代ヒトリンパ球細胞を、２人のドナーから採取し、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスでエレクトロポレーションすることができる。およそ等しい数のリンパ球を、緩衝液１、２、３、又は市販の緩衝液（例えば、以下の６つの市販の緩衝液のうちの１つなど）に懸濁することができる：ａ）対照緩衝液２：Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１６５－２６７６、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）；ｂ）対照緩衝液３：Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム緩衝液（カタログ番号ＭＰＫ－１００２５、ＵＳＡ）；ｃ）対照緩衝液４：Ｃｅｌｅｔｒｉｘ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１２０７、Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ ２０１０９ Ｕ．Ｓ．）；ｄ）対照緩衝液５：ＢＴＸｐｒｅｓｓ（登録商標）高性能エレクトロポレーション溶液（カタログ番号４５－０８０３、Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ，ＭＡ ０１７４６）；ｅ）対照緩衝液６：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）エレクトロポレーション緩衝液（カタログ番号１７０－０７６－６２５、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ ９５１３４）；及びｆ）対照緩衝液７：Ｃｏｌｅ－Ｐａｒｍｅｒ Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ真核細胞のためのエレクトロポレーション緩衝液（製造番号９４０００２００１、品番ＥＷ－３６２０５－６０、Ｖｅｒｎｏｎ Ｈｉｌｌｓ，ＩＬ ６００６１）。
【0166】
細胞を、実質的に同一のエレクトロポレーション条件下で、ＣＡＲ構築物（例えば、ＣＡＲ１又はＣＡＲ２）を含む同じ核酸ベクターでトランスフェクトする。任意の既知のエレクトロポレーションデバイス、例えば、Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ（登録商標）、Ｎｅｏｎ（登録商標）トランスフェクションシステム、Ｃｅｌｅｔｒｉｘ（登録商標）エレクトロポレーター、ＮｅｐａＧｅｎｅ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｂｕｌｌｄｏｇ Ｂｉｏ（登録商標）高電圧エレクトロポレーター、ＣｙｔｏＦｌｅｘ（登録商標）エレクトロポレーター、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）エレクトロポレーター、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）エレクトロポレーター、又は文献に記載のものを含む任意の他の既知の若しくは市販のエレクトロポレーションデバイスを使用して、トランスフェクションを実行することができる。例えば、Ｊ．Ｇｅｈｌ，“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ，ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｆｏｒ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｒｅｓｅａｒｃｈ．”Ａｃｔａ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．，１７７：４３７－４４７（２００３）、Ｍ．Ｓ．Ｖｅｎｓｌａｕｓｋａｓ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｂｉｏａｃｔｉｖｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｂｙ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，”Ｅｕｒ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．，４４：２７７－２８９（２０１５）、Ｊ．Ｓｈｉ，ａｔ ａｌ．，“Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３（１１）：３０４４（２０１８）、Ｍ．Ｂ．Ｆｏｘ，ｅｔ ａｌ．，“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｄｅｖｉｃｅｓ：ａ ｒｅｖｉｅｗ，”Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ ＆ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍ．，３８５：４７４（２００６）、Ｓ．Ｍｏｖａｈｅｄ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ｃｅｌｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ，”Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，１０：７０３－７３４（２０１１）、Ｃ．Ａ．Ｌｉｓｓａｎｄｒｅｌｌｏ，ｅｔ ａｌ．，“Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ－ｆｌｏｗ ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍＲＮＡ ｉｎｔｏ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ，”Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０：１８０４５（２０２０），Ｊ．Ｊ．Ｓｈｅｒｂａ，ｅｔ．Ａｌ，“Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｎ ｃｅｌｌ ｖｉａｂｉｌｉｔｙ ａｎｄ ｅｌｅｃｔｒｏ－ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ，”Ｓｃｉ Ｒｅｐ，１０：３０５３（２０２０）を参照されたい（これらの各々は、参照により本明細書に援用される）。更に、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスを使用して、エレクトロポレーションを実行することができる（ＷＯ２０２１／０９６９３６及び米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号を参照されたい）。緩衝液中でエレクトロポレーションした直後に、試料を回収培地に移すことができる。
【0167】
表７は、ＵｌｔｒａＰｏｒａｔｏｒ（商標）デバイスで実行した場合の、これらの実験から得られ得る予想されるトランスフェクション効率及びトランスフェクト細胞の収率を示す。これらは、実施例４に提供されるように、フローサイトメトリー及び細胞計数を含む標準的な分析技術を使用して得ることができる。
【表7】
【0168】
表７に示すように、緩衝液１、２、及び３は、各々、対照緩衝液２～７と比較して、統計的に有意に高いトランスフェクション収率（％）及びトランスフェクト細胞の収率（％）を有することが予想される。トランスフェクション収率（％）及びトランスフェクト細胞の収率（％）は、（対照緩衝液と比較して）５％高い～５０％超高い範囲であり得る。
【0169】
参考文献
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ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９９８４（２０２０年１１月１１日出願、Ｓｈｕｙｕａｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ，ＷＯ２０２１／０９６９３６として公開、名称“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ”）．
米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号（２０２０年１１月１１日出願）．
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Ｊ．Ｓｈｉ，ａｔ ａｌ．，“Ａ Ｒｅｖｉｅｗ ｏｎ Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ－Ｂａｓｅｄ Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２３（１１）：３０４４（２０１８）．
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Ｄ．Ｍ．Ｗａｒｄ，“Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，”Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ２６：２３０－２３８．
ＰＣＴ／ＵＳ２０２０／０５９９８４（２０２０年１１月１１日出願、Ｓｈｕｙｕａｎ Ｚｈａｎｇ ｅｔ．ａｌ，ＷＯ２０２１／０９６９３６として公開、名称“Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ ａｐｐａｒａｔｕｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ”）．
米国特許付与前出願公開第２０２１／０１３９８３７（Ａ１）号（２０２０年１１月１１日出願）．
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】