特表 2024-507616 神経変性疾患に対するバイオマーカに関する方法および組成物

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】神経変性疾患に対するバイオマーカに関する方法および組成物

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/68 20060101AFI20240214BHJP

   G01N 33/50 20060101ALI20240214BHJP

   G01N 33/15 20060101ALI20240214BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

G01N33/68

G01N33/50 Z

G01N33/15 Z

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023527275

(86)(22)【出願日】2021-10-29

(85)【翻訳文提出日】2023-06-26

(86)【国際出願番号】 IB2021000754

(87)【国際公開番号】W WO2022090804

(87)【国際公開日】2022-05-05

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】523161217

【氏名又は名称】アナカリプシス セラピューティクス，アイケーイー

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ライドアウト，ハーディー ジェイ．

【テーマコード（参考）】

2G045

【Ｆターム（参考）】

2G045AA25

2G045CA11

2G045CA25

2G045DA36

2G045FB03

(57)【要約】

【解決手段】複数のバイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断することにより、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがある個体において臨床決定を下すための方法を本明細書において提供する。
【選択図】図５Ａ

【特許請求の範囲】

【請求項1】

神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、前記神経変性疾患または障害に進行する危険性がある個体において臨床決定を下すための方法であって、
ａ）前記神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、前記神経変性疾患または障害に進行する危険性がある前記個体から得られた生体試料に対してアッセイを行って、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断する工程と、
ｂ）ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９の前記レベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて前記臨床決定を下す工程と
を含む方法。

【請求項2】

前記臨床決定が、前記個体に対する予後を判断することである、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記臨床決定が、臨床試験に対する前記個体の適格性を判断することである、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記臨床決定が、臨床試験を設計することである、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記臨床試験が、前臨床試験、第Ｉ相臨床試験、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記臨床決定が、薬物スクリーニングに関係している、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

前記臨床決定が、用量設定に関係している、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

前記臨床決定が、臨床試験における薬物の効能を判断することである、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

前記臨床決定が、治験化合物の標的結合を測定することである、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

前記臨床決定が、治験化合物の臨床試験のための除外基準、選定基準またはそれら両方を判断することである、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

前記臨床決定が、前記個体が前記神経変性疾患または障害を発症する危険性を判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記臨床決定が、前記個体における前記神経変性疾患または障害の病期を判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項13】

前記臨床決定が、前記個体における前記神経変性疾患または障害の重症度を判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項14】

前記臨床決定が、神経変性疾患または障害治療を判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項15】

前記臨床決定が、前記神経変性疾患または障害治療のエンドポイントを判断することを含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９の前記レベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて、前記神経変性疾患または障害治療に対する前記個体の反応性を判断することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項17】

前記神経変性疾患または障害治療に対する前記個体の反応性を判断することが、前記神経変性疾患または障害治療に対する有害反応の可能性を判断することを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記神経変性疾患または障害治療に対する前記個体の反応性を判断することが、前記神経変性疾患または障害治療に対する有益反応の可能性を判断することを含む、請求項１６に記載の方法。

【請求項19】

ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９の前記レベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて、前記神経変性疾患または障害治療を修正することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項20】

前記個体が前記神経変性疾患または障害治療を受けた後、前記個体からの生体試料に工程（ａ）から（ｃ）を繰り返すことと、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９の前記レベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化の監視により、前記神経変性疾患または障害治療の有効性を監視することと、をさらに含む、請求項１４に記載の方法。

【請求項21】

前記神経変性疾患または障害治療は、小分子、免疫療法、遺伝子治療、非薬物療法、抗体、抗原結合フラグメント、ＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、および、それらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１４から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】

前記アッセイでは、総タンパク質、リン酸化タンパク質または凝集タンパク質を測定する、請求項１から請求項２１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】

前記凝集タンパク質が、アモルファス凝集、オリゴマー、フィブリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２２に記載の方法。

【請求項24】

前記レベルが濃度である、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

前記レベルが、総タンパク質に対するリン酸化の比率である、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

前記ＬＲＲＫ２が総ＬＲＲＫ２である、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

前記ＬＲＲＫ２がｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

前記ＬＲＲＫ２がｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

前記アルファシヌクレインが、総アルファシヌクレインである、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

前記アルファシヌクレインが、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記アルファシヌクレインが、凝集アルファシヌクレインである、請求項１に記載の方法。

【請求項32】

前記Ｒａｂ８ａが総Ｒａｂ８ａである、請求項１に記載の方法。

【請求項33】

前記Ｒａｂ８ａがｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである、請求項１に記載の方法。

【請求項34】

前記Ｒａｂ１０が総Ｒａｂ１０である、請求項１に記載の方法。

【請求項35】

前記Ｒａｂ１０がｐＴ７３－Ｒａｂ１０である、請求項１に記載の方法。

【請求項36】

前記Ｒａｂ１２が総Ｒａｂ１２である、請求項１に記載の方法。

【請求項37】

前記Ｒａｂ１２がｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である、請求項１に記載の方法。

【請求項38】

前記Ｒａｂ２９が総Ｒａｂ２９である、請求項１に記載の方法。

【請求項39】

前記Ｒａｂ２９がｐＴ７１－Ｒａｂ２９である、請求項１に記載の方法。

【請求項40】

工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項41】

工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項42】

工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９のレベルを判断することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項43】

前記アッセイがイムノアッセイである、請求項１に記載の方法。

【請求項44】

前記アッセイが、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光法、吸光度およびクロマトグラフィーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項45】

前記アッセイが酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である、請求項１に記載の方法。

【請求項46】

前記ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質に対する抗体を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項47】

前記ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質に対する抗体を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項48】

前記ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項49】

前記ＥＬＩＳＡが、単一のウェル内の総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む、請求項４５に記載の方法。

【請求項50】

前記生体試料が、全血、特定の血球サブタイプ、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、皮膚およびエクソソームからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項51】

前記特定の血球サブタイプが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および赤血球からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。

【請求項52】

前記神経変性疾患または障害が、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核症候群、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症およびシヌクレイノパチーからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。

【請求項53】

前記神経変性疾患または障害が、パーキンソン病である、請求項１に記載の方法。

【請求項54】

前記パーキンソン病が、家族性パーキンソン病である、請求項５２に記載の方法。

【請求項55】

前記パーキンソン病が、散発性パーキンソン病である、請求項５２に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

相互参照
本願は、２０２０年１０月３０日提出のギリシャ出願第２０２００１００６６０号の利益を主張するものであり、上記出願は、参照により全体として組み込まれる。

【発明の概要】

【0002】

本明細書において、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体における臨床決定を下すための方法であって、ａ）神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料に対してアッセイを行って、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断する工程と、ｃ）ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づき臨床決定を下す工程とを含む方法を提供する。本明細書において、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体における臨床決定を下すための方法であって、ａ）神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体から得られた生体試料に対してアッセイを行って、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断する工程と、ｂ）ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づき臨床決定を下す工程とを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、個体に対する予後を判断することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、臨床試験に対する個体の適格性を判断することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、臨床試験を設計することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床試験が、前臨床試験、第Ｉ相臨床試験、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験からなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、薬物スクリーニングに関係している方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、用量設定に関係している方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、臨床試験における薬物の効能を判断することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、治験化合物の標的結合を測定することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、治験化合物の臨床試験のための除外基準、選定基準またはそれら両方を判断することである方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、個体が神経変性疾患または障害を発症する危険性を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、個体における神経変性疾患または障害の病期を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、個体における神経変性疾患または障害の重症度を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、神経変性疾患または障害治療を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、臨床決定が、神経変性疾患または障害治療のエンドポイントを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて、神経変性疾患または障害治療に対する個体の反応性を判断することをさらに含む方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害治療に対する個体の反応性を判断することが、神経変性疾患または障害治療に対する有害反応の可能性を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害治療に対する個体の反応性を判断することが、神経変性疾患または障害治療に対する有益反応の可能性を判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて、神経変性疾患または障害治療を修正することをさらに含む方法を提供する。さらに、本明細書において、個体が神経変性疾患または障害治療を受けた後、個体からの生体試料により工程（ａ）から（ｃ）を繰り返すことと、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化を監視することにより、神経変性疾患または障害治療の有効性を監視することと、をさらに含む方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害治療は、小分子、免疫療法、遺伝子治療、非薬物療法、抗体、抗原結合フラグメント、ＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物、および、それらの組み合わせからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイでは、総タンパク質、リン酸化タンパク質または凝集タンパク質を測定する方法を提供する。さらに、本明細書において、凝集タンパク質が、アモルファス凝集、オリゴマー、フィブリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、レベルが濃度である方法を提供する。さらに、本明細書において、レベルが、総タンパク質に対するリン酸化の比率である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２が総ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２がｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２がｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、総アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、凝集アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ８ａが総Ｒａｂ８ａである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ８ａがｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１０が総Ｒａｂ１０である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１０がｐＴ７３－Ｒａｂ１０である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１２が総Ｒａｂ１２である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１２がｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ２９が総Ｒａｂ２９である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ２９がｐＴ７１－Ｒａｂ２９である方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイがイムノアッセイである方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイが、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光法、吸光度法およびクロマトグラフィーからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイが酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、単一のウェル内の総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、生体試料が、全血、特定の血球サブタイプ、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、皮膚およびエクソソームからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、特定の血球サブタイプが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および赤血球からなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害が、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核症候群、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症およびシヌクレイノパチーからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害が、パーキンソン病である方法を提供する。さらに、本明細書において、パーキンソン病が、家族性パーキンソン病である方法を提供する。さらに、本明細書において、パーキンソン病が、散発性パーキンソン病である方法を提供する。

【0003】

本明細書において、ａ）神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料に対してアッセイを行って、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断する工程とを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイでは、総タンパク質、リン酸化タンパク質または凝集タンパク質を測定する方法を提供する。さらに、本明細書において、凝集タンパク質が、アモルファス凝集、ダイマー、オリゴマー、フィブリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、レベルが濃度である方法を提供する。さらに、本明細書において、レベルが、総タンパク質に対するリン酸化の比率である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２が総ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２がｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＬＲＲＫ２がｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、総アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、アルファシヌクレインが、凝集アルファシヌクレインである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ８ａが総Ｒａｂ８ａである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ８ａがｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１０が総Ｒａｂ１０である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１０がｐＴ７３－Ｒａｂ１０である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１２が総Ｒａｂ１２である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ１２がｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ２９が総Ｒａｂ２９である方法を提供する。さらに、本明細書において、Ｒａｂ２９がｐＴ７１－Ｒａｂ２９である方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、工程ｂ）が、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９のレベルを判断することを含む方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイがイムノアッセイである方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイが、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光法、吸光度法およびクロマトグラフィーからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、アッセイが酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）である方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、ＥＬＩＳＡが、単一のウェル内の総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９に対する抗体を含む方法を提供する。さらに、本明細書において、生体試料が、全血、特定の血球サブタイプ、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、皮膚およびエクソソームからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、特定の血球サブタイプが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および赤血球からなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害が、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核症候群、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症およびシヌクレイノパチーからなる群より選択される方法を提供する。さらに、本明細書において、神経変性疾患または障害が、パーキンソン病である方法を提供する。さらに、本明細書において、パーキンソン病が、家族性パーキンソン病である方法を提供する。さらに、本明細書において、パーキンソン病が、散発性パーキンソン病である方法を提供する。

【0004】

参照による組み込み
本明細書において記載される公報、特許および特許出願はすべて、個々の公報、特許または特許出願の各々が、参照により組み込まれると特定して個別に示された場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。

【図面の簡単な説明】

【0005】

本特許または本出願ファイルは、少なくとも１枚のカラー図面を含んでいる。カラー図面付きの本特許または特許出願公開公報のコピーは、申請および所定の手数料の納付により庁から提供される。

【図1】本明細書に記載されている方法の概略図である。

【図2A】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図2B】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図2C】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図2D】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図2E】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図2F】末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を示す図である。

【図3A】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3B】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3C】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3D】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3E】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3F】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図3G】細胞株およびヒトＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを示す図である。

【図4】健康な対照被験者または特発性パーキンソン病（ＰＤ）の被験者もしくはＰＤを有する場合とそうでない場合のＧ２０１９Ｓ ＬＲＲＫ２突然変異キャリアから得られたＰＢＭＣの抽出物におけるＴｈｒ７３のＲａｂ１０（上部パネル）および総Ｒａｂ１０（下部パネル）のリン酸化のウェスタンブロットを示す図である。

【図5A】ＰＢＭＣ抽出物からのウェスタン免疫ブロットのバンド強度の定量化を示す図である。

【図5B】ＰＢＭＣ抽出物からのウェスタン免疫ブロットのバンド強度の定量化を示す図である。

【図6】ＰＢＭＣ抽出物に対して行われたウェスタン免疫ブロットを示す図である。

【図7A】さまざまな希釈倍率（１：２７、１：９および１：３）での総ＬＲＲＫ２の定量化を示す図である。

【図7B】さまざまな希釈倍率（１：２７、１：９および１：３）でのｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２の定量化を示す図である。

【図7C】さまざまなＣＳＦ試料条件でのｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルの定量化を示す図である。

【図8】ＭＬｉ－２処理後のｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルを示す図である。

【図9】過剰発現したＷＴヒトＬＲＲＫ２の検出における２種類の希釈剤を比較したデータを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0006】

神経変性疾患および障害は、中枢神経系または末梢神経系の構造および機能の進行性変性により特徴づけられる疾患および障害の異種群を含む。効果的な処置および臨床意思決定には、関連するタンパク質マーカーのレベルおよび変化を正確に検出することが必要である。本明細書において、神経変性疾患および障害に関連するバイオマーカと、神経変性疾患および障害に関連するバイオマーカを検出する方法、ならびに、神経変性疾患または障害を有する疑いがあるか、これを有する個体のための臨床決定用に当該バイオマーカを用いる方法とを説明する。

【0007】

特定の用語
本開示を通して、さまざまな実施形態が範囲形式で表示されている。範囲形式での記載は、便宜および簡潔さのために過ぎず、いかなる実施形態の範囲に対しても確固たる限定とは解釈されるべきでないことは理解されねばならない。よって、範囲の記載は、文脈上明らかに別の意味に解されるのでない限り、あり得るすべての部分範囲、および、その範囲内の下限の単位の小数第１位まで個々の数値を特定して開示したものと考えられねばならない。例えば、１から６までといった範囲の記載は、１から３まで、１から４まで、１から５まで、２から４まで、２から６まで、３から６までなどといった部分範囲、および、その範囲内の、例えば、１．１、２、２．３、５および５．９などの個々の数値を特定して開示したものと考えられねばならない。これは、範囲の広さに関わらず該当する。これらの介在範囲の上限および下限は、より狭い範囲に独立して含まれていてもよく、かつ、本発明内にも包含されているが、記述された範囲において特定して除外された任意の限界に従うものとする。記述された範囲がこれら限界の一方または両方を含む場合、それら含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、文脈上明らかに別の意味に解されるのでない限り、本発明に含まれる。

【0008】

本明細書において用いられる用語は、特定の実施形態のみを説明する目的のものであり、いかなる実施形態をも限定する意図はない。本明細書において用いられているように、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示すのでない限り、複数形をも含むものと意図されている。さらに、本明細書で用いられる場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および／または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、記述されている特徴、整数、工程、動作、構成要素および／または成分の存在を特定するが、１つ以上の他の特徴、整数、工程、動作、構成要素、成分および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではないことは理解されるであろう。本明細書において用いられているように、「および／または」という用語は、関連する列挙項目のうちの１つ以上のあらゆるすべての組み合わせを含む。

【0009】

特定して記述されているか、文脈上明白でない限り、本明細書において用いられているように、ある数字または数字の範囲に関する「約」という用語は、記述されている数字およびそのプラスマイナス１０％の数字、または、ある範囲に対して挙げられている値の挙げられている下限を１０％下回る数字および挙げられている上限を１０％上回る数字を意味するものと理解される。

【0010】

「個体」、「患者」または「被験者」という用語は、言い換え可能に用いられる。用語はいずれも、医療従事者（例えば、医師、正看護師、ナースプラクティショナー、医師助手、用務職員またはホスピス職員）の（例えば、常時または断続的）監督によって特徴づけられる状況を必要とせず、これに限定もされない。さらに、これらの用語は、ヒトまたは動物の被験者を指す。

【0011】

「処置する（Ｔｒｅａｔｉｎｇ）」または「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、治療上の処置と予防のまたは防止する手段との両方を指し、その目的は、対象となる病態または障害の進行を防止するか、停止させるか、減速（減少）させることである。処置の必要な人々には、すでに障害を有する人々のみならず、障害を生じやすい人々、または障害が防止されるべき人々も含まれる。例えば、被験者または哺乳動物は、以下の場合にＡＤに対する「処置」が成功したとされる。すなわち、ある治療量の治療薬の投与を受けた後、被験者が、ＡＤの１つ以上の症状の観測可能かつ／または測定可能な低減もしくは軽減または消失、罹患率および／または死亡率の低下、ならびに生活の質の問題の改善を示す場合である。

【0012】

本明細書において用いられている「抗体」という用語は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫活性部分、例えば、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子を指す。この用語はまた、２本の免疫グロブリン重鎖および２本の免疫グロブリン軽鎖と、全長抗体およびその部分を含むさまざまな形式とを含む抗体を指す。例えば、免疫グロブリン分子、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、ＩｇＧΔＣＨ_２、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ２ＣＨ_３、Ｆ（ａｂ）、ＶＬ、ＶＨ、ｓｃＦｖ４、ｓｃＦｖ３、ｓｃＦｖ２、ｄｓＦｖ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ）２、ジスルフィド結合したＦｖ、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、「ナノボディ」、ダイアボディ、多重特異性抗体、二重特異性抗体、抗イディオタイプ抗体、バイスペシフィック抗体（ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、（限定はされないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧまたはＩｇＭを含む）任意のアイソタイプ、修飾抗体、および、（限定はされないが、非枯渇性ＩｇＧ抗体、Ｔ－ｂｏｄｙまたは抗体のその他のＦｃもしくはＦａｂ変異体を含む）合成抗体を含むものである。

【0013】

他に定義されない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本明細書に記載される方法および組成物が属する分野における当業者により一般に理解されているのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等のあらゆる方法および材料を、本明細書に記載される方法および組成物の実用や試験にも使用可能であるが、代表的かつ例示的な方法および材料を以下に説明する。

【0014】

本開示の方法
パーキンソン病（ＰＤ）といった神経変性疾患または障害は、複雑な疾患および障害であり、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがある個体において臨床決定を下すには、正確かつ包括的なバイオマーカが必要である。本明細書において、ＰＤといった神経変性疾患または障害に関連するバイオマーカと、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがある個体における臨床決定への使用に対して高精度かつ特化したバイオマーカを検出する方法とを説明する。

【0015】

図１は、本明細書に記載されている方法の概略を例示する図である。試料採取工程１０１において、個体から生体試料を採取する。個体は、神経変性疾患または障害（例えば、パーキンソン病）を有していてもよい。いくつかの例において、個体は、神経変性疾患または障害（例えば、パーキンソン病）を有する疑いがある。いくつかの例において、個体は、そのような神経変性疾患または障害を発症する潜在的な遺伝的素因を有していてもよい。いくつかの例において、個体は、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核症候群、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症およびシヌクレイノパチーからなる群より選択される神経変性疾患または障害を有する。いくつかの例において、生体試料は、全血、特定の血球サブタイプ、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、皮膚およびエクソソームからなる群より選択される。いくつかの例において、生体試料は、エクソソームを含まない試料である。いくつかの例において、特定の血球サブタイプは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および赤血球からなる群より選択される。次いで、試料処理工程１０３において、生体試料を分析する。いくつかの例において、試料処理工程は、生体試料からの血球分離またはエクソソーム分離を含む。いくつかの例において、エクソソームは、血漿、血清、尿および脳脊髄液からなる群より抽出される。いくつかの例において、試料処理工程は、タンパク質の抽出を含む。いくつかの例において、試料処理工程は、界面活性剤（例えば、サポニン）または洗剤の使用を含む。いくつかの例において、試料処理工程１０３に続き、アッセイ工程１０５において、バイオマーカについて生体試料を分析する。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、アッセイでは、総タンパク質、リン酸化タンパク質または凝集タンパク質を測定する。いくつかの例において、凝集タンパク質は、アモルファス凝集、ダイマー、オリゴマー、フィブリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの例において、レベルは、濃度である。いくつかの例において、レベルは、総タンパク質に対するリン酸化の比率である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、総ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９を分析する。さまざまなアッセイを用いることができる。いくつかの場合、アッセイは、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、単一分子ＥＬＩＳＡ、化学発光法、吸光度法およびクロマトグラフィーからなる群より選択される。いくつかの場合、アッセイは、イムノアッセイである。いくつかの例において、アッセイは、ＥＬＩＳＡアッセイである。いくつかの場合、アッセイでは、１ミリリットル当たり少なくとももしくは約０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０マイクログラム（ｕｇ／ｍＬ）を上回るタンパク質を検出する。いくつかの場合、アッセイでは、約０．０００１から約１０、０．０００１から約５、０．０００１から約１、０．０００１から約０．１、０．０００２から約１０、０．０００２から約５、０．０００２から約１、０．０００２から約０．１、０．０００５から約１０、０．０００５から約５、０．０００５から約１、０．０００５から約０．１、０．００１から約１０、０．００１から約５、０．００１から約１、０．００１から約０．１、０．００５から約１０、０．００５から約５、０．００５から約１、０．０００５から約０．１、０．０１から約１０、０．０１から約５、０．０１から約１、０．０１から約０．１、０．０５から約１０、０．０５から約５、０．０５から約１または０．０５から約０．１の範囲を検出する。アッセイによるデータを収集および解析してもよい。いくつかの例において、アッセイによるデータを臨床スコアとともに用いる。いくつかの例において、データ、臨床スコアまたはそれら両方に基づき臨床決定を下す。バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を用いて、臨床決定を下すことができる。アッセイの結果を用いて、個人の診断、予後、薬物療法または予防治療を該個体のために判断するのに役立ててもよい。いくつかの例において、臨床決定は、臨床試験における医薬品開発に関する。例えば、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を、臨床試験の設計に影響させるよう用いる。臨床試験の設計について考慮すべき事項は、規模、選定基準、除外基準およびそれらの組み合わせからなる群より選択されてもよい。いくつかの例において、バイオマーカを用いて、治療に対する治療上の反応を予測する。いくつかの例において、バイオマーカを、縦断的研究に影響させるために用いる。いくつかの例において、臨床試験のアウトカムとしてバイオマーカを用いる。いくつかの例において、臨床試験における代替エンドポイントとしてバイオマーカを用いる。バイオマーカは、処置の適用タイミングを判断するために用いられてもよい。臨床試験は、前臨床試験、第Ｉ相臨床試験、第ＩＩ相臨床試験および第ＩＩＩ相臨床試験からなる群より選択されてもよい。

【0016】

本明細書において、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体における臨床決定を下すための方法であって、ａ）神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがあるか、これに進行する危険性がある個体から生体試料を得る工程と、ｂ）生体試料に対してアッセイを行って、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を判断する工程と、ｃ）ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づき臨床決定を下す工程とを含む方法を開示する。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、総ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９を分析する。

【0017】

本明細書において、神経変性疾患または障害を有するか、有する疑いがある個体に対して臨床決定を下すための方法であって、該臨床決定が、個体に対する予後を判断することである方法を提供する。予後は、患者の疾患のアウトカム、回復の見込みまたは疾患がどのように進行するかを判断することを含み得る。

【0018】

いくつかの例において、臨床決定は、個体が神経変性疾患または障害を発症する可能性または危険性を判断することを含む。いくつかの例において、神経変性疾患または障害を発症する可能性または危険性は、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づくものであり、神経変性疾患または障害を発症する可能性が高まるのは、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方が、対照個体のコホートから由来する基準レベル、翻訳後修飾またはそれら両方と比較して上昇した時である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、バイオマーカは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質である。

【0019】

いくつかの例において、神経変性疾患または障害を発症する可能性または危険性が、少なくとももしくは約１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％を上回る割合で高まるのは、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方が、対照個体のコホートに由来する基準レベル、翻訳後修飾またはそれら両方と比較して上昇した時である。いくつかの例において、神経変性疾患または障害を発症する可能性または危険性が、少なくとももしくは約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍または１０倍を上回る倍率で高まるのは、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方が、対照個体のコホートに由来する基準レベル、翻訳後修飾またはそれら両方と比較して上昇した時である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、バイオマーカは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質である。

【0020】

いくつかの例において、神経変性疾患または障害を発症する可能性または危険性を判断するための本明細書に記載の方法は、神経学的検査、精神的試験または脳画像診断（例えば、ＭＲＩ、ＣＴまたはＰＥＴスキャン）を含む方法と比較して改善している。

【0021】

いくつかの例において、臨床決定は、神経変性疾患または障害の重症度を判断することを含む。いくつかの例において、疾患の重症度は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方と相関関係にある。いくつかの例において、疾患の重症度は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方と相関関係にある。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、疾患の重症度は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方と相関関係にある。

【0022】

本明細書において、さまざまな神経変性疾患または障害が想定されている。いくつかの実施形態において、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病、多系統萎縮症（ＭＳＡ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、皮質基底核症候群、アルツハイマー病、前頭側頭型認知症、多発性硬化症（ＭＳ）、大脳皮質基底核変性症、運動ニューロン疾患、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病（ＨＤ）、レビー小体病、フリードライヒ運動失調症およびシヌクレイノパチーからなる群より選択される。いくつかの実施形態において、神経変性疾患または障害は、パーキンソン病である。いくつかの実施形態において、パーキンソン病は、家族性パーキンソン病である。いくつかの実施形態において、パーキンソン病は、散発性パーキンソン病である。

【0023】

本明細書において、個体における臨床決定を下すための方法であって、該臨床決定は、臨床試験に関係している方法を説明する。いくつかの例において、バイオマーカを用いて、臨床試験に関する臨床決定を下す。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、バイオマーカは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質である。

【0024】

いくつかの例において、臨床決定は、臨床試験に対する個体の適格性を判断することを含む。いくつかの例において、該方法を用いて、臨床試験を設計する。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、臨床試験における個体の登録基準に影響する。バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を用いて、臨床試験の規模、除外基準、選定基準またはそれらの組み合わせを判断してもよい。臨床試験においてテストされる治療は、疾患または病態を処置するために規制機関により認可承認された薬物を含む従来の処置とすることができる。あるいは、臨床試験においてテストされる治療は、非認可もしくは非承認薬物または薬物候補である薬剤であるか、いくつかの場合、臨床試験が実施される地域と同じ地域において売り出されていない認可承認された薬剤である。

【0025】

一般に、臨床試験は、数ある中で、（例えば、病態を初期に、または、その再発をいかにして防止するかといった）防止試験と、（例えば、病態の検出といった）スクリーニング試験と、（例えば、病態を診断するためのテストもしくは手順を研究または比較する）診断試験と、（例えば、新たな処置、治療、それらの組み合わせ、または、医療介入の新たなアプローチをテストする）処置試験と、行動試験と、（例えば、快適さおよび／または生活の質を向上させる方法を探り、測定または評価する）生活の質試験と、（例えば、代わりとなる効果的な処置が開発されていない場合の拡張参加または最終手段といった）特例使用試験とに分類されてきた。加えて、試験設計は、数ある中で、（例えば、参加者が試験に参加または試験を離脱する場合、設計により定められた固定基準にしたがった）固定試験と、（例えば、試験中に生成したデータを用いて、試験を設計し、かつ、中間データを用いて、試験の進行とともに該試験を修正する、例えば、投与量、試料サイズ、薬物（治療用）、患者選定基準などを修正してもよく、しばしばベイジアン実験設計を適用して、試験の進行を評価する）適応試験と、「複雑な革新的設計（ｃｏｍｐｌｅｘ ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ ｄｅｓｉｇｎ）」（ＣＩＤ；適応、ベイジアンおよびその他の新規な統計的アプローチの使用を含む；例えば、米国ＦＤＡのＣＩＤパイロットプログラムおよびＣＩＤウェブページ、ならびに、これらの試験において用いられている例および戦略として他の規制機関により用いられている対応する説明を参照のこと）とに分類されてもよい。これらの特徴のいずれかまたはすべてが、本明細書に含まれてもよい。

【0026】

臨床試験のさまざまな特徴には、（例えば、参加者が、さまざまな研究群に無作為に割り当てられる場合といった）無作為化、（例えば、参加者が、選択肢となる処置のいずれを自らが受けるのか知らない場合といった）盲検、（例えば、参加者も研究者も、選択肢となる処置のいずれを自らが受けるのか知らない場合といった）二重盲検、または、（例えば、交互の期間において、複数の処置を（または処置間で）切り替えうる）ダブルダミーが含まれうる。

【0027】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて個体における臨床決定を下すための本明細書に記載の方法は、臨床試験において用いられる薬物の作用機序を判断することを含んでもよい。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、個体または個体のサブセットが、それらの特定の遺伝子構造からするとなぜ反応がよいのかを理解するために用いられる。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、所与の個体に対して、その個体の疾患特性を考慮して適切な治療を選択するために用いてもよい。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、所与の個体に対して、複数の治療が選択可能なときに適切な治療を選択するために用いられる。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、所与の個体に対して、その個体の疾患特性を考慮して特定の治療を選択すべきでないときを決定するために用いてもよい。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、例えば、まず初めに選ばれる特定の薬物を用いるなど慎重に選択された治療を患者が受けた際に、臨床上の寛解または優れた反応を達成するために用いられる。いくつかの例において、臨床決定は、治験化合物の標的結合を測定することである。いくつかの例において、臨床決定は、治験化合物の臨床試験のための除外基準、選定基準またはそれら両方を判断することである。

【0028】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を用いて、臨床決定を下すことができ、該臨床決定は、処置サイクル中に薬物の投薬およびスケジュールを判断することを含む。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を用いて、治療上の有効性を判断する。治療上の有効性は、薬物を含め治療が個体においてどれほどうまく奏功したか、または、個体が処置サイクル中もしくはその最後に処置にどれほどよく反応したかを含んでもよい。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、初めの選択が合理的な治療上の有効性を達成できなかった場合、例えば、機構原理などに基づき次善の選択として考慮されうる代替の治療（薬物）を選択するために用いられる。

【0029】

いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、臨床試験における代替エンドポイントとして用いられる。臨床試験の代替エンドポイントは、患者がどのように感じ、機能し、もしくは、生存するかを直接測定する臨床上意義深いエンドポイントの代わりとして用いられる研究室測定または身体的兆候として定義されてもよい。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、疾患の臨床初期または発症前段階における処置の承認を加速させるための代替エンドポイントとして用いられる。

【0030】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、調査研究において用いることができる。いくつかの実施形態において、調査研究は、縦断的研究である。いくつかの実施形態において、調査研究は、横断的研究である。

【0031】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、検査が処置に対する治療上の反応を予測するか否かを判断するために用いてもよい。例えば、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、ポジティブまたはネガティブベースライン検査が治療上の反応を予測するか否かを判断するために用いてもよい。

【0032】

本明細書では、いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて臨床試験のための個体を選択することが説明されている。いくつかの例において、１つ以上のバイオマーカは、臨床試験のための個体を選択するために用いられる。

【0033】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて臨床試験のための個体を選択した後、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化を監視することができる。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化は、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％を超える減少または増加である。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化は、少なくとももしくは約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍または１０倍を超える減少または増加である。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年後または２年を超えた後に減少または増加する。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年後または２年を超えた後に、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９５％を超えて減少または増加する。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化は、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年後または２年を超えた後に、少なくとももしくは約１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍または１０倍を超えて減少または増加する。

【0034】

バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化は、神経変性疾患または障害のための治療後に監視することができる。いくつかの例において、治療は、小分子、免疫療法、遺伝子治療、非薬物療法、抗体、抗原結合フラグメント、ＲＮＡ阻害剤（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピン型ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、ペプチド模倣物からなる群より選択される。

【0035】

いくつかの例において、臨床決定は、神経変性疾患または障害に対する治療のためのエンドポイントを判断することを含む。いくつかの例において、治療に対する個体の反応性は、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づく。治療に対する個体の反応性を判断することは、治療に対する有害反応の可能性を判断することを含んでもよい。いくつかの例において、治療に対する個体の反応性を判断することは、治療に対する有益反応の可能性を判断することを含む。

【0036】

本明細書において説明する方法は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づく治療を修正するために用いられてもよい。いくつかの例において、治療は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて修正される。いくつかの例において、治療は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質に基づいて修正される。例えば、１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、個体からの生体試料において１回目に測定し、次いで、１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、個体が治療を受けた後に２回目の測定を行う。いくつかの例において、１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を測定することは、１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方の変化の監視により治療の有効性を監視するために用いられる。該変化は、増加であってもよい。いくつかの例において、該変化は、減少である。

【0037】

本明細書では、いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて神経変性疾患または障害に対する治療をいつ導入すべきかを判断するための方法を説明する。バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、症状改善のために処置を導入すること、臨床的進行を減速させること、神経変性疾患または障害の臨床的徴候を防止すること、および、それらの組み合わせからなる群より選択される決定を判断するために用いられてもよい。

【0038】

いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて臨床試験のために選択される個体は、神経変性疾患または障害の症状を示す。いくつかの例において、該症状は、認知変化を含む。認知症状の例として、限定はされないが、精神的退化、思考および理解の困難、夕方の混乱、妄想、見当識障害、健忘症、作り話をすること、精神的錯乱、集中力欠如、新たな記憶形成ができないこと、簡単な計算ができないこと、および、ありふれたものを認識できないことが挙げられる。いくつかの例において、該症状は、認知症を含む。いくつかの例において、該症状は、行動に関するものである。いくつかの例において、行動症状は、攻撃、不穏、セルフケアの困難、易怒性、自分の言葉の無意味な繰り返し、人格の変化、落ち着きのなさ、自制の欠如、ならびに、徘徊および迷子からなる群より選択される。該症状は、怒り、無気力、一般的な不満、孤独および気分のむらといった気分の変化を含み得る。いくつかの例において、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて臨床試験のために選択される個体は、健常者である。

【0039】

いくつかの例において、治療は、バイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて施される。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質である。いくつかの例において、治療は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて施される。いくつかの例において、治療は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方に基づいて最適化される。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、処置前、処置中または処置後に測定される。例えば、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、処置の１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年前または２年を超えた期間前に測定される。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方は、処置の１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、２週間、３週間、４週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１年、２年後または２年が過ぎた後に測定される。

【0040】

本明細書において説明する方法は、生体試料にアッセイを行うことを含み得る。いくつかの例において、生体試料は、全血、特定の血球サブタイプ、血漿、血清、尿、脳脊髄液、涙液、唾液、皮膚およびエクソソームからなる群より選択される。いくつかの例において、生体試料は、エクソソームを含まない試料である。いくつかの例において、生体試料は、エクソソームを含まない脳脊髄液試料である。いくつかの例において、特定の血球サブタイプは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、好中球、リンパ球、単球、好酸球、好塩基球および赤血球からなる群より選択される。生体試料は、静脈採血により得られる血液試料であり得る。生体試料は、指先穿刺採血により得られる血液試料であり得る。生体試料は、医療提供者により、または、被験者により採取できる。該方法は、被験者から生体試料を得ることを含み得る。いくつかの場合、生体試料は、医院または病院での受診中に被験者から採取される。

【0041】

生体試料は、分析前に試料処理工程において処理されてもよい。いくつかの実施形態において、生体試料は、分析前に希釈される。いくつかの実施形態において、生体試料から細胞を抽出する。いくつかの実施形態において、生体試料からエクソソームを抽出する。いくつかの例において、エクソソームは、血漿、血清、尿および脳脊髄液からなる群より抽出される。いくつかの実施形態において、生体試料からタンパク質を抽出する。いくつかの実施形態において、生体試料から核酸を抽出する。いくつかの実施形態において、核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、核酸は、ＲＮＡである。

【0042】

いくつかの実施形態において、生体試料は、有機溶媒、界面活性剤または低張水を用いて処理される。いくつかの実施形態において、生体試料は、有機溶媒、界面活性剤または低張水を用いて、エクソソームからタンパク質を遊離させて処理される。いくつかの実施形態において、前記有機溶媒は、メタノール、アセトン、フェノール、ベンゼンおよびトルエンのうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、前記界面活性剤は、サポニン、トリトンＸ１００、ツイーン２０（Ｔｗｅｅｎ－２０）、３－（［３－コールアミドプロピル］ジメチルアンモニオ）－１－プロパンスルホネート水和物（ＣＨＡＰＳ）細胞抽出緩衝液、ＮＰ－４０、ＳＤＳ、スパン８０およびジギトニンのうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、前記界面活性剤は、サポニンを含む。いくつかの実施形態において、前記低張水は、超高純度ヌクレアーゼフリー水である。

【0043】

いくつかの実施形態において、タンパク質または核酸は、後続の分析に干渉しないあらゆる技術を用いて抽出される。例えば、核酸は、エタノール、メタノールもしくはイソプロピルアルコールを用いたアルコール沈殿、フェノール、クロロホルム、塩化セシウム、または、それらを組み合わせて用いて抽出される。いくつかの実施形態において、核酸は、ナトリウム、カリウムもしくは酢酸アンモニウム、または、ＤＮＡの沈殿に一般的に用いられるその他の塩を用いて抽出される。いくつかの実施形態において、核酸は、カラムベースまたはレジンベースの核酸精製により抽出される。いくつかの実施形態において、タンパク質は、細胞の溶解後に抽出される。いくつかの場合、細胞は、ＲＩＰＡ（ラジオ免疫沈降アッセイ）緩衝液、ＮＰ－４０溶解緩衝液、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶解緩衝液、塩化アンモニウム・カリウム（ＡＣＫ）溶解緩衝液またはその他の溶解緩衝液などの緩衝液を用いて溶解される。また、尿素、ジチオスレイトールまたはその他の変性剤を含み得る緩衝液などの変性緩衝液を用いてもよい。試料をろ過または遠心分離して、脂質および粒子状物質を除去してもよい。また、試料を精製して核酸を除去してもよく、試料をリボヌクレアーゼおよびデオキシリボヌクレアーゼで処理してもよい。いくつかの実施形態において、抽出後、核酸またはタンパク質を保存する。いくつかの例において、後続の分析の前に、核酸を水、トリス緩衝液またはトリスＥＤＴＡ緩衝液中で保存する。例えば、保存は、８℃、４℃、－２０℃または－７０℃未満である。いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質は、１日、２日、３日、４日、５日、６日または７日間保存される。いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質は、１週間、２週間、３週間または４週間保存される。いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質は、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月または１２ヶ月間保存される。いくつかの実施形態において、核酸またはタンパク質は、分析前に希釈される。

【0044】

別の態様において、該方法は、個体からの生体試料に複数のアッセイを行うことを含む。生体試料に行われる複数のアッセイは、複数のバイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を検出することを含んでもよい。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、２つ以上、３つ以上または４つ以上のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６または１６を超える数のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、２つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、３つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、４つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、５つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、６つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、７つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、８つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、９つのバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１０個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１１個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１２個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１３個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１４個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１５個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１６個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１７個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１８個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、１９個のバイオマーカを含む。いくつかの場合、複数のバイオマーカは、２０個のバイオマーカを含む。

【0045】

いくつかの態様において、該方法は、被験者から得られた生体試料に複数のアッセイを行うこと、および、生体試料に存在する複数のバイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を検出することを含む。複数のアッセイは、種々の反応において行うことができる。一例において、種々の反応は、マイクロプレートの種々のウェル内で実施することができる。複数のアッセイは、同一の反応において行うことができる。いくつかの例において、複数のアッセイは、単一のウェル、スポットまたはマイクロプレート内で行われる。一例において、同一の反応は、複数の異なる捕捉抗体を含み得る。あるいは、複数のアッセイは、単一のバイオマーカを検出する少なくとも１つの反応と、１つ以上のバイオマーカを検出する少なくとも１つの反応とを含み得る。複数のアッセイは、複数のイムノアッセイとすることができる。

【0046】

本明細書では、いくつかの実施形態において、タンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を検出するためのアッセイを説明する。いくつかの例において、該アッセイは、総タンパク質を測定する。いくつかの例において、該アッセイは、翻訳後修飾を測定する。翻訳後修飾の例として、グリコシル化、カルボキシル化、脱アミド化、酸化、ヒドロキシル化、Ｏ－硫酸化、アミド化、グリシル化、糖化、アルキル化、アシル化、アセチル化、リン酸化、ビオチン化、ホルミル化、脂質化、ヨウ素化、プレニル化、酸化、パルミトイル化、ホスファチジルイノシトール化、ホスホパンテテイニル化、シアリル化およびセレノイル化が挙げられるが、これらに限定はされない。いくつかの例において、翻訳後修飾は、リン酸化である。いくつかの例において、翻訳後修飾は、特定の部位における自己リン酸化である。いくつかの例において、該アッセイは、凝集タンパク質を測定する。いくつかの例において、凝集タンパク質は、タンパク質の病理学的形態を含む。いくつかの例において、凝集タンパク質は、アモルファス凝集、オリゴマー、フィブリルおよびそれらの組み合わせからなる群より選択される。いくつかの例において、凝集タンパク質は、タンパク質のダイマーを含む。いくつかの例において、ダイマーは、増殖性である。いくつかの例において、ダイマーは、非増殖性である。いくつかの例において、凝集タンパク質は、タンパク質のオリゴマーを含む。いくつかの例において、オリゴマーは、２つ以上のともに相互作用しているタンパク質分子を含む。いくつかの例において、オリゴマーは、鎖状である。いくつかの例において、オリゴマーは、球状である。いくつかの例において、レベルは、濃度である。いくつかの例において、レベルは、タンパク質の量である。いくつかの例において、レベルは、総タンパク質に対する翻訳後修飾されたタンパク質の比率である。例えば、レベルは、総タンパク質に対するリン酸化の比率である。

【0047】

いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、バイオマーカは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方である。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、バイオマーカは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質である。

【0048】

いくつかの例において、凝集アルファシヌクレインは、タンパク質の病理学的形態を含む。いくつかの例において、凝集アルファシヌクレインは、アルファシヌクレインのダイマーを含む。いくつかの例において、アルファシヌクレインのダイマーは、増殖性である。いくつかの例において、アルファシヌクレインのダイマーは、非増殖性である。いくつかの例において、凝集アルファシヌクレインは、アルファシヌクレインのオリゴマーを含む。いくつかの例において、オリゴマーは、２つ以上のともに相互作用しているタンパク質分子を含む。いくつかの例において、オリゴマーは、鎖状である。いくつかの例において、オリゴマーは、球状である。いくつかの例において、凝集アルファシヌクレインは、小さい（非アミロイド）フィブリルを含む。いくつかの例において、凝集アルファシヌクレインは、アミロイド状フィブリルを含む。成熟フィブリルは、Ｘ線回折および円偏光二色性パターンにより明らかにされるように特定のβ－シート構造により特徴づけることができる。

【0049】

いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される３つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される４つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される６つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される７つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される８つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される９つ以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１０以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１１以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１２以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１３以上のタンパク質のレベルを判断することを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９のレベルを判断することを含む。

【0050】

複数のアッセイは、個体に対してテストを行うことを含み得る。いくつかの例において、該テストは、身体的（Ｐｈｙｓｉｃａｌ）テストである。いくつかの例において、該テストは、神経学的テストである。いくつかの例において、アッセイは、認知テストを行うことを含む。アッセイは、身体検査、実験室検査、神経学的平衡試験、神経学的視力試験、神経心理学的記憶試験、神経心理学的問題解決試験、神経心理学的言語能力試験およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるテストを含んでもよい。いくつかの例において、本発明書で説明される方法はさらに、個体の病歴を判断することを含む。いくつかの例において、該テストは、統一パーキンソン病評価スケール（ＵＰＤＲＳ）、ホーン・ヤールの重症度分類、ティネッティテスト、バロー神経研究所（ＢＮＩ）バランススケール、ロンベルグテスト、回転検査法、片足立ちテストおよび継ぎ足歩行テストからなる群より選択される。

【0051】

いくつかの場合、該方法は、複数の時点での個体における複数のバイオマーカのレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を検出することを含む。いくつかの例において、複数の時点は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０を超える数の時点を含む。いくつかの例において、複数の時点のうち少なくとも１つの時点は、前記個体が、神経変性疾患または障害に対する治療を施されたより前の時点を含む。いくつかの例において、複数の時点のうち少なくとも１つの時点は、前記個体が、神経変性疾患または障害に対する治療を施されたより後の時点を含む。

【0052】

いくつかの場合、アッセイは、イムノアッセイまたはリガンドアッセイを含む。いくつかの場合、アッセイは、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、比色イムノアッセイ、均一系イムノアッセイ、非光学式イムノアッセイ、蛍光イムノアッセイ、化学発光イムノアッセイ、電気化学発光イムノアッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）イムノアッセイ、時間分解蛍光イムノアッセイ、側方流動イムノアッセイ、マイクロスポットイムノアッセイ、表面プラズモン共鳴アッセイ、リガンドアッセイ、凝固アッセイ、クロマトグラフィーアッセイ、および、質量分析法と組み合わせた免疫捕捉からなる群より選択される。いくつかの場合、アッセイは、イムノアッセイを含む。いくつかの場合、アッセイは、ウェスタンブロット、ドットブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、化学発光法、吸光度法およびクロマトグラフィーからなる群より選択される。いくつかの場合、イムノアッセイは、シングルプレックス化されている。いくつかの場合、イムノアッセイは、デュアルプレックス化されている。いくつかの場合、イムノアッセイは、マルチプレックス化されている。

【0053】

本明細書において説明される方法は、複数のイムノアッセイを含み得る。いくつかの場合、複数のイムノアッセイは、同一のイムノアッセイ（例えば、４つ以上のＥＬＩＳＡアッセイ）である。複数のイムノアッセイが同一のイムノアッセイであるとき、複数のイムノアッセイの各々は、異なるバイオマーカを検出可能である。複数のイムノアッセイが同一のイムノアッセイであるとき、複数のイムノアッセイの各々は、同一の反応室または異なる反応室において行うことができる。いくつかの例において、複数のイムノアッセイは、同一の反応室において行われる。反応室は、イムノアッセイを行うのに適したあらゆる空間とすることができる。反応室の例として、マイクロプレート内のウェル、マイクロスピンチューブ、円錐形チューブまたは液滴が挙げられるが、これらに限定はされない。

【0054】

いくつかの場合、複数のイムノアッセイは、互いに異なるイムノアッセイである。複数のイムノアッセイが互いに異なるイムノアッセイであるとき、複数のイムノアッセイの各々は、異なるバイオマーカを検出可能である。複数のイムノアッセイが互いに異なるイムノアッセイであるとき、複数のイムノアッセイの各々は、同一の反応室または異なる反応室において行うことができる。いくつかの例において、複数のイムノアッセイは、同一の反応室において行われる。

【0055】

いくつかの実施形態において、本明細書において説明する方法は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を同時に検出するための複数のイムノアッセイを含む。いくつかの実施形態において、本明細書において説明する方法は、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、Ｒａｂ８ａ、Ｒａｂ１０、Ｒａｂ１２およびＲａｂ２９のレベル、翻訳後修飾またはそれら両方を同時に検出するための複数のイムノアッセイを含む。いくつかの例において、ＬＲＲＫ２は、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２である。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、総アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、ｐＳ１２９アルファシヌクレインである。いくつかの例において、アルファシヌクレインは、凝集アルファシヌクレインである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、総Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ８ａは、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａである。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、総Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１０は、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、総Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ１２は、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、総Ｒａｂ２９である。いくつかの例において、Ｒａｂ２９は、ｐＴ７１－Ｒａｂ２９である。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質を同時に検出するための複数のイムノアッセイを含む。いくつかの実施形態において、本明細書で説明する方法は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９を同時に検出するための複数のイムノアッセイを含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、複数のアッセイは、単一の反応室内で行われる。いくつかの例において、反応室は、マイクロプレート内のウェル、マイクロスピンチューブ、円錐形チューブまたは液滴である。いくつかの例において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される３つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される４つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される６つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される７つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される８つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される９つ以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１０以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１１以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１２以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１３以上のタンパク質が、単一の反応室内で検出される。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９が、単一の反応室内で検出される。タンパク質の検出は、同時に起こり得る。

【0057】

本明細書では、いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質を、抗体を用いて検出するための方法を説明する。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質に関する抗体は、アレイ上にマイクロスポットされる。いくつかの例において、アレイは、ウェル内に存在する。例えば、アレイは、マイクロウェルアッセイプレートのウェル内に存在する。マイクロウェルアッセイプレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、４８ウェル、９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロウェルアッセイプレートであってもよい。

【0058】

抗体は、ＥＬＩＳＡなどのイムノアッセイにおいて用いることができる。いくつかの例において、抗体は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質を捕捉できる。いくつかの例において、二次抗体は、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１つ以上のタンパク質を検出する抗体の検出に用いられる。

【0059】

いくつかの例において、抗体または二次抗体は、ビオチン化、蛍光標識、または、酵素標識されている。いくつかの実施形態において、抗体または二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）またはグルコースオキシダーゼ、アレクサフルーア（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ）（登録商標）３５０、アレクサフルーア（登録商標）４０５、アレクサフルーア（登録商標）４８８、アレクサフルーア（登録商標）５３２、アレクサフルーア（登録商標）５４６、アレクサフルーア（登録商標）５５５、アレクサフルーア（登録商標）５６８、アレクサフルーア（登録商標）５９４、アレクサフルーア（登録商標）６４７、アレクサフルーア（登録商標）６８０、アレクサフルーア（登録商標）７５０、ボディパイ（登録商標）ＦＬ、クマリン、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）５、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、オレゴングリーン（登録商標）、パシフィックブルー（商標）、パシフィックグリーン（商標）、パシフィックオレンジ（商標）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド（登録商標）、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、１４Ｃおよび１２５１からなる群より選択される標識により標識化されている。

【0060】

さまざまな種類の抗体を、イムノアッセイに用いることができる。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ定常ドメインを含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４定常ドメイン、または、その変異体を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、抗原結合フラグメントである。いくつかの実施形態において、抗体は、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディまたはミニボディである。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒトである。いくつかの実施形態において、抗体は、ヒト化されている。

【0061】

いくつかの実施形態において、本明細書で説明するＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される２つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される３つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される４つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される５つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される６つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される７つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される８つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される９つ以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１０以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１１以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１２以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、ＥＬＩＳＡアッセイは、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９からなる群より選択される１３以上のタンパク質を検出する。いくつかの実施形態において、総ＬＲＲＫ２、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２、総アルファシヌクレイン、ｐＳ１２９アルファシヌクレイン、凝集アルファシヌクレイン、総Ｒａｂ８ａ、ｐＴ７２－Ｒａｂ８ａ、総Ｒａｂ１０、ｐＴ７３－Ｒａｂ１０、総Ｒａｂ１２、ｐＳ１０６－Ｒａｂ１２、総Ｒａｂ２９およびｐＴ７１－Ｒａｂ２９。

【0062】

いくつかの場合、アッセイは、非イムノアッセイを含む。いくつかの場合、アッセイは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速液体クロマトグラフィー質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ）、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ－ＭＳ）、液体クロマトグラフィー・タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）、免疫組織化学法（ＩＨＣ）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ法（ｑＰＣＲ）、および、それらの組み合わせからなる群より選択される。

【0063】

本明細書において説明するアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）は、タンパク質のさまざまなレベルを検出してもよい。いくつかの場合、アッセイでは、１ミリリットル当たり少なくとももしくは約０．０００１、０．０００２、０．０００３、０．０００４、０．０００５、０．０００６、０．０００７、０．０００８、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０マイクログラム（ｕｇ／ｍＬ）または２０マイクログラム（ｕｇ／ｍＬ）を上回るタンパク質を検出する。いくつかの場合、アッセイでは、約０．０００１から約１０、０．０００１から約５、０．０００１から約１、０．０００１から約０．１、０．０００２から約１０、０．０００２から約５、０．０００２から約１、０．０００２から約０．１、０．０００５から約１０、０．０００５から約５、０．０００５から約１、０．０００５から約０．１、０．００１から約１０、０．００１から約５、０．００１から約１、０．００１から約０．１、０．００５から約１０、０．００５から約５、０．００５から約１、０．０００５から約０．１、０．０１から約１０、０．０１から約５、０．０１から約１、０．０１から約０．１、０．０５から約１０、０．０５から約５、０．０５から約１または０．０５から約０．１の範囲を検出する。

【実施例】

【0064】

以下の実施例は、本発明のさまざまな実施形態を例示することを目的に提供されるものであり、本発明をいかなる形にも限定する意図はない。本実施例は、本明細書で説明されている方法とともに、現在好適な実施形態を表し、例示的であり、かつ、本発明の範囲に対する限定としては意図されていない。特許請求の範囲により定められる本発明の趣旨に包含される本発明に対する変更およびその他の使用は、当業者に想定される。

【0065】

実施例１：パーキンソン病のタンパク質ＬＲＲＫ２、Ｒａｂ ＧＴＰアーゼおよびアルファシヌクレインのレベル、リン酸化、ならびに活性
ＥＬＩＳＡベースのアッセイを行い、パーキンソン病などの神経変性疾患に関与する選択タンパク質の変化を定量化した。

【0066】

パーキンソン病などの神経変性疾患における変化のシグネチャーを生成するために、表１のタンパク質を選択する。

【0067】

【表1】

【0068】

表２に示すように、２つの独立したＰＤコホートの臨床研究に使用された複数のシングルプレックスバイオマーカアッセイにおいて、ＬＲＲＫ２およびＲａｂ１０に変化を観察した。

【0069】

【表2】

【0070】

ウェル内キナーゼ反応におけるモデルペプチド基質を用いたＩｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性を測定した。ペプチドのリン酸化を、各ウェルにおけるＬＲＲＫ２の総量に正規化した。ｉＰＤ患者のＰＢＭＣにおけるＬＲＲＫ２の内因性キナーゼ活性に有意な変化は観察されなかった（図２Ａ）。Ｇ２０１９Ｓ－ＬＲＲＫ２突然変異の罹患キャリア（図２Ｂ）および健常キャリア（図２Ｃ）では、リン酸化は有意に増加した。マン・ホイットニーのＵ検定で、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。ＰＢＭＣにおけるＬＲＲＫ２発現およびｉｎ ｖｉｔｒｏ活性を、男性と女性で比較した（図２Ｄ）。健常対照およびｉＰＤ患者からの試料において、男性からのＰＢＭＣにおける発現のレベルは、女性と比較して高い傾向であることを観察した。マン・ホイットニーのＵ検定で、ｐ＝０．０７（対照）およびｐ＝０．０９（ｉＰＤ）。興味深いことに、Ｇ２０１９Ｓ－ＬＲＲＫ２突然変異のキャリアからのＰＢＭＣにおいて検出されたｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性の増加は、性別ごとに別々に分析すると、男性被験者からのＰＢＭＣでのみ明らかであった（図２Ｅ）。女性のＧ２０１９ＳキャリアのＰＢＭＣからのＬＲＲＫ２の活性には、健常対照との差異がなかった（図２Ｆ）。^＊ｐ＜０．０５。ＰＢＭＣ抽出物におけるＬＲＲＫ２のｉｎ ｖｉｔｒｏキナーゼ活性は、Ｇ２０１９Ｓ突然変異のキャリアにおいて増加することがデータにより示されている。

【0071】

ＥＬＩＳＡによりＳｅｒ９３５残基におけるＬＲＲＫ２のリン酸化を評価した。各試料において、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２に対応するシグナルを、総ＬＲＲＫ２の対応する値（ｎｇ／ｍｌ）に正規化した。組換えヒト全長ＬＲＲＫ２を、量を増加させながら、捕捉用ｃ４１－２クローンを用いて平行なＥＬＩＳＡプレートに固定させ、総（Ｎ２４１Ａ、正規化用）抗体、またはリン酸化（ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２、ＵＤＤ２）抗体を用いて検出した（図３Ａ）。ＷＴ（ＭＬｉ－２による処理有り／無し、１００ｎＭ）またはＳ９３５Ａ－ＬＲＲＫ２を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｔ細胞の抽出物を、捕捉抗体または検出抗体のいずれかとして抗ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２抗体を用いてＥＬＩＳＡにかけた（図３Ｂ）。両方の場合で、Ｓ９３５Ａ－ＬＲＲＫ２または続くＭＬｉ－２キナーゼ阻害剤による脱リン酸化において、シグナルは有意に消失した。健常志願者から新たに分離したＰＢＭＣを、キナーゼ阻害剤ＰＦ－４７５の濃度を上昇させながら１時間にわたり処理し、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡにかけた（図３Ｃ）。リン酸化ＬＲＲＫ２の有意な用量依存的消失を観察した。ＡＮＯＶＡ、テューキーの事後比較で、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１。ｉＰＤ患者のＰＢＭＣにおけるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルは、健常対照と比較して有意に高かった（図３Ｄ）。^＊マン・ホイットニーのＵ検定で、ｐ＜０．０５。対照的に、ＰＤを有する場合とそうでない場合のＧ２０１９Ｓ突然変異キャリアからのＰＢＭＣ抽出物には、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルが健常対照と比較して低いという有意な傾向はなかった（図３Ｅ）。健常対照との比較のために、全Ｇ２０１９Ｓキャリアの値をプールする（図３Ｆ）。ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルおよびさまざまな臨床パラメータを比較した（図３Ｇ）。ｉＰＤ患者では、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２と運動機能スケールＵＰＤＲＳ－ＩＩＩとの間に相関関係はなかった（図示せず）。しかし、ｉＰＤ患者（図３Ｇ、右側パネル）および健常対照（図３Ｇ、中央パネル）において、認知機能検査であるＭｏＣＡでのパフォーマンスは、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルに対して負の相関があった。

【0072】

健常対照被験者もしくは特発性ＰＤ被験者、またはＰＤを有する場合とそうでない場合のＧ２０１９Ｓ ＬＲＲＫ２突然変異キャリアから得られたＰＢＭＣの抽出物中のＴｈｒ７３におけるＲａｂ１０のリン酸化を測定した。ウェスタン免疫ブロット分析によるデータを図４に示す。下側のブロットは、総Ｒａｂ１０レベルについて調べた同一の試料を示している。リン酸化Ｒａｂ１０のバンド強度を総タンパク質レベルに正規化した。図５Ａ～図５Ｂは、ＰＢＭＣ抽出物からのウェスタン免疫ブロットのバンド強度の定量化を示す図である。リン酸化Ｒａｂ１０－Ｔｈｒ７３バンド強度を、総Ｒａｂ１０タンパク質レベルを反映するバンドに正規化した。データは、（Ｔｈｒ７３における）ＬＲＲＫ２基質Ｒａｂ１０のリン酸化が、特発性ＰＤ群のほか、ＰＤを有するＬＲＲＫ２突然変異キャリアにおいて有意に増加したことを示している。

【0073】

各群から選択されたＰＢＭＣ抽出物に対してウェスタン免疫ブロットアッセイを行い、ｐＳ１２９２－ＬＲＲＫ２の発現を示した。ＰＢＭＣ抽出物における当該標的を検出するために、抗体溶液にシグナルブースト試薬を添加し、より感度の高い定量的尺度の必要性を強調した。図６にデータを示す。

【0074】

これらのデータは、ＬＲＲＫ２、アルファシヌクレイン、およびＲａｂ ＧＴＰアーゼの変化が神経変性疾患およびその進行と関連していることを示している。

【0075】

実施例２：マルチプレックス化されたＬＲＲＫ２のＥＬＩＳＡを用いた脳脊髄液（ＣＳＦ）検査
本実施例では、ＣＳＦ中に存在するＬＲＲＫ２がＥＬＩＳＡにより検出可能かどうか、および、１４の計画された抗体標的のうちの２つからなるデュアルプレックスＥＬＩＳＡが総ＬＲＲＫ２およびリン酸化ＬＲＲＫ２を検出可能かどうかを分析する。

【0076】

簡潔に説明すると、総ＬＲＲＫ２（クローンｃ４１－２；Ｍｅｌａｃｈｒｏｉｎｏｕら、２０２０年；またはクローンＭＣ．０２８．８３．７６．２４２）およびｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２（クローンＵＤＤ２；Ｍｅｌａｃｈｒｏｉｎｏｕら、２０２０年を再度参照）を捕捉する抗体スポットを包含するようにＥＬＩＳＡアッセイを設計した。ＬＲＲＫ２のみを捕捉するこのデュアルプレックス形式において、検出試薬として、抗体は、ビオチンに抱合された総ＬＲＲＫ２（クローンＵＤＤ３）に対するものであった。ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２および総ＬＲＲＫ２のレベルを測定した。マルチプレックス化された形式により、両者とも同一のウェル内で定量化されることから、リン酸／総ＬＲＲＫ２の正確な正規化が可能となる。サポニン処理を用いて、エクソソームのＬＲＲＫ２を遊離させることとした。

【0077】

図７Ａは、総ＬＲＲＫ２を示す図である。図７Ｂは、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２を示す図である。図７Ｃに示すように、脳脊髄液細胞外小胞（ＣＳＦ－ＥＶ）、エクソソームが枯渇した脳脊髄液上清（ＣＳＦ－ｓｕｐ）、およびサポニン処理された脳脊髄液（ＣＳＦ－ｓａｐ）を含む種々のＣＳＦ試料条件によるｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２の最終レベルが、観察される。分離された（超遠心分離）エクソソームの抽出物から最大のシグナルが得られた。しかし、この超遠心分離による上清にも有意なシグナルを認めた。このことは、（エクソソーム中ではなく）ＣＳＦ中に「遊離している」検出可能なリン酸化ＬＲＲＫ２が存在することをはっきりと示している。

【0078】

ＬＲＲＫ２キナーゼ活性の強力な選択的阻害剤であるＭＬｉ２とともに（１００ｎＭ、３時間）インキュベートした、健常志願者ドナーからの新鮮なＰＢＭＣを用いて、実験を行った。次いで、ＰＢＭＣ抽出物を希釈して、（総およびｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２を測定する）デュアルプレックステストプレート中でインキュベートした。次に、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２抗体から得たシグナルを総ＬＲＲＫ２からの対応するシグナルに正規化した。ＭＬｉ２によるＬＲＲＫ２活性の阻害により、ＬＲＲＫ２におけるＳｅｒ９３５残基におけるリン酸化の劇的な消失が誘導される（図８）。アッセイ用の陽性対照として、凍結保存されたＰＢＭＣを、ビヒクルまたはキナーゼ阻害剤ＭＬｉ－２とともに（１００ｎＭ、３時間）インキュベートし、次いで、デュアルプレックスＥＬＩＳＡの原型のための細胞を処理した。ＭＬｉ－２により処理した細胞において、ｐＳ９３５－ＬＲＲＫ２レベルは、対照細胞と比較して３分の２減少した（図８）。

【0079】

次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株中で過剰発現したＬＲＲＫ２を用いていくつかの希釈剤を比較することで、各緩衝液における複数の希釈倍率を評価し、かつ、総ＬＲＲＫ２に対する得られた化学発光シグナルを判定した。図９は、過剰発現されたＷＴヒトＬＲＲＫ２の検出における２種類の希釈剤を比較した結果を示す図である。

【0080】

本明細書中で本開示の好適な実施形態を示し、説明したが、そのような実施形態がほんの一例として与えられていることは、当業者であれば自明のことであろう。本開示から逸脱することなく、数多くの変形、変更、および置換えが現在当業者に想定されるであろう。本明細書中で説明した本開示の実施形態のさまざまな代案は、本開示を実施するにあたり使用されてもよいことを理解されるされたい。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定すること、これら特許請求の範囲内の方法および構成、ならびにそれらの均等物が請求項の範囲に包含されることが、意図されている。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図2C】

【図2D】

【図2E】

【図2F】

【図3A】

【図3B】

【図3C】

【図3D】

【図3E】

【図3F】

【図3G】

【図4】

【図5A】

【図5B】

【図6】

【図7A】

【図7B】

【図7C】

【図8】

【図9】

【国際調査報告】