特表 2024-507721 増殖および生体内保存のための改変ＮＫＴ細胞、並びに腫瘍細胞を制御するための使用法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】増殖および生体内保存のための改変ＮＫＴ細胞、並びに腫瘍細胞を制御するための使用法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240214BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240214BHJP

   C12N 15/12 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/85 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/09 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10 ZNA

C12N5/0783

C12N15/12

C12N15/13

C12N15/62 Z

C12N15/85 Z

C12N15/09 Z

A61K48/00

A61P35/00

A61P35/02

A61P43/00 111

A61K35/17

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023547340

(86)(22)【出願日】2022-02-07

(85)【翻訳文提出日】2023-09-20

(86)【国際出願番号】 US2022015525

(87)【国際公開番号】W WO2022170210

(87)【国際公開日】2022-08-11

(31)【優先権主張番号】63/146,693

(32)【優先日】2021-02-07

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】391058060

【氏名又は名称】ベイラー カレッジ オブ メディスン

【氏名又は名称原語表記】ＢＡＹＬＯＲ ＣＯＬＬＥＧＥ ＯＦ ＭＥＤＩＣＩＮＥ

(74)【代理人】

【識別番号】110001656

【氏名又は名称】弁理士法人谷川国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】メテリッサ，レオニド エス．

(72)【発明者】

【氏名】ンガイ，ホ

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

【Ｆターム（参考）】

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4C084AA13

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB271

4C084ZC021

4C084ZC022

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB43

4C087NA05

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4C087ZC02

(57)【要約】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路の活性化因子をコードする発現コンストラクトを有するように改変されたナチュラルキラーＴ細胞に関連している、方法および組成物に関する。Ｗｎｔシグナル伝達活性化因子の発現または外因性活性化因子の添加による活性化は、インビトロにおいて、複数回の腫瘍細胞暴露の間にＮＫＴ増殖を促進し、長期の腫瘍制御を改善する。本開示は、治療用途の、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）と組み合わされたＷｎｔシグナル伝達の外来性活性化因子を発現するように改変されたＮＫＴ細胞、ＮＫＴ細胞集団、およびそれらを作製する方法をさらに包含する。
【選択図】なし

【特許請求の範囲】

【請求項1】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む、遺伝子改変ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞。

【請求項2】

前記転写活性化因子が、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、およびＴＬＥファミリーメンバー１転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）からなる群から選択される、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項3】

前記ＬＥＦ１が、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、請求項２に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項4】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトをさらに含む、請求項１に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項5】

前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ががん抗原を認識する抗原認識ドメインを含む、請求項４に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項6】

前記がん抗原がＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される、請求項５に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項7】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む細胞集団。

【請求項8】

Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、または非改変細胞を含む細胞をさらに含む、請求項７に記載の細胞集団。

【請求項9】

前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団の１０％超である、請求項７に記載の細胞集団。

【請求項10】

前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも５０％含む、請求項７に記載の細胞集団。

【請求項11】

前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞の少なくとも３０パーセントがＬＥＦ１を発現する、請求項７に記載の細胞集団。

【請求項12】

治療有効量の、請求項７に記載の細胞集団。

【請求項13】

（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む、キメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項14】

前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子が、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項15】

前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がＬＥＦ１である、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項16】

前記抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項17】

口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって隔てられた追加のタンパク質のインフレームコード配列をさらに含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項18】

前記抗原認識ドメインがＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項19】

抗原認識ドメインがＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、請求項１６に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項20】

前記細胞内ドメインがＣＤ３－ζ鎖にインフレーム融合された４－１ＢＢというシグナル配列を含む、請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。

【請求項21】

請求項１３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクトを含む、遺伝子改変ＮＫＴ細胞。

【請求項22】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程；および
前記改変ＮＫＴ細胞を培養することで、持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程、
を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法。

【請求項23】

前記改変が、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、前記ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することを含む、請求項２２に記載のＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法。

【請求項24】

前記ＣＡＲがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、請求項２２に記載の方法。

【請求項25】

前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がリンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、請求項２２に記載の方法。

【請求項26】

前記Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子が参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程；および
前記改変ＮＫＴ細胞を培養することで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程、
を含む、ＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。

【請求項28】

前記改変が、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、前記ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することを含む、請求項２７に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。

【請求項29】

前記Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子が参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である、請求項２７に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本願は、２０２１年２月７日に出願された米国仮特許出願第６３／１４６，６９３号に基づく優先権を主張するものであり、当該仮特許出願の全内容は参照により本明細書に援用される。

【0002】

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、アメリカ国立衛生研究所により与えられたＣＡ１１６５４８を基に、政府援助を得てなされたものである。米国政府は本発明において一定の権利を有する。

【0003】

配列表の組み込み
２０２２年２月７日に記録された、９８，８５６バイト（ＭＳ－Ｗｉｎｄｏｗｓオペレーティングシステムで測定）の、「Ｐ３５０４９ＷＯ００＿ＳＴ２５」という名前のファイルに含まれた配列表が、本明細書と共に出願されており、参照によって本明細書に援用される。

【0004】

本開示は、抗原暴露によって生体外で培養増殖する細胞の能力を保存するように、および、ＮＫＴ細胞のセントラルメモリー遺伝子発現シグネチャーを保存するように、ＮＫＴ細胞を改変することに関する。さらに、本開示は、がん治療における生体内残留性のためにＮＫＴ細胞を改変することに関する。

【背景技術】

【0005】

Ｉ型ＮＫＴ細胞（ＮＫＴ）は、インバリアントなＴＣＲα鎖Ｖα２４－Ｊαｌ８を発現し、単形性ＨＬＡクラスＩ様分子ＣＤ１ｄ（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９１２）によって提示された自己由来または微生物由来の糖脂質に対し反応する、進化的に保存された自然リンパ球サブセットである（Ｐｏｒｃｅｌｌｉ ｅｔ ａｌ． Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ （ＴＣＲ） ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｂｙ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ＣＤ４－８－ ａｌｐｈａ／ｂｅｔａ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｓ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｕｓｅ ｏｆ ｓｅｖｅｒａｌ Ｖ ｂｅｔａ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ａｎ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＴＣＲ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ． Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９９３；１７８（１）：１－１６）；Ｌａｎｔｚ ａｎｄ Ｂｅｎｄｅｌａｃ， “Ａｎ ｉｎｖａｒｉａｎｔ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｌｐｈａ ｃｈａｉｎ ｉｓ ｕｓｅｄ ｂｙ ａ ｕｎｉｑｕｅ ｓｕｂｓｅｔ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃｌａｓｓ Ｉ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＣＤ４＋ ａｎｄ ＣＤ４－８－ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｍｉｃｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎｓ，” Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １９９４； １８０（３）： １０９７－ １１０６；Ｂｅｎｄｅｌａｃ Ａ， Ｌａｎｔｚ Ｏ， Ｑｕｉｍｂｙ ＭＥ， Ｙｅｗｄｅｌｌ ＪＷ， Ｂｅｎｎｉｎｋ ＪＲ， Ｂｒｕｔｋｉｅｗｉｃｚ ＲＲ． ＣＤ１ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｍｏｕｓｅ ＮＫ１＋ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９５；２６８（５２１２）：８６３－８６５．；Ｋｉｍ ＥＹ， Ｌｙｎｃｈ Ｌ， Ｂｒｅｎｎａｎ ＰＪ， Ｃｏｈｅｎ ＮＲ， Ｂｒｅｎｎｅｒ ＭＢ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｏｆ ｉＮＫＴ ｃｅｌｌｓ． Ｓｅｍｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１５；２７（ｌ）：２６－３２）。

【0006】

世界的な転写プロファイリング研究により、ＮＫＴは、Ｔ細胞およびＮＫ細胞と特性を共有しているが、別個のリンパ球集団であることが明らかになっている（Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．， ２０１３）。マウスおよびヒトの両方で、ＮＫＴは、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（ダブルポジティブ、ＤＰ）胸腺細胞（ＣＤ８、Ｇｅｎｅ ＩＤ ９２５）の段階にある通常のＴ細胞から分岐する。胸腺上皮細胞による正の選択を受ける通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴは、ＣＤ１ｄ発現ＤＰ胸腺細胞による選択を受ける（Ｇａｐｉｎ Ｌ， Ｍａｔｓｕｄａ ＪＬ， Ｓｕｒｈ ＣＤ， Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ． ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅ ｆｒｏｍ ｄｏｕｂｌｅ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ ｔｈａｔ ａｒｅ ｐｏｓｉｔｉｖｅｌｙ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｂｙ ＣＤｌｄ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００１；２（１０）：９７１－９７８）。正の選択の直後に前骨髄球性白血病Ｚｎフィンガー転写因子（ＰＬＺＦ）が発現されることで、ＮＫＴの胸腺内の増殖と、エフェクター／メモリー様の分化が可能となる（Ｓａｖａｇｅ ＡＫ， ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ ＰＬＺＦ ｄｉｒｅｃｔｓ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｐｒｏｇｒａｍ ｏｆ ｔｈｅ ＮＫＴ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅａｇｅ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２００８；２９（３）：３９１－４０３）。

【0007】

末梢ＮＫＴは寿命が長いリンパ球であり、その胸腺後の維持は、ＩＬ－１５を介した緩慢なホメオスタティック増殖に大部分依存する（Ｍａｔｓｕｄａ ＪＬ， ｅｔ ａｌ． Ｈｏｍｅｏｓｔａｓｉｓ ｏｆ Ｖ ａｌｐｈａ １４ｉ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；３（１０）：９６６－９７４； Ｂａｅｖ ＤＶ， ｅｔ ａｌ． Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ＣＤ４＋ （Ｇｅｎｅ ＩＤ ９２０） ａｎｄ ＣＤ４－ ｓｕｂｓｅｔｓ ｏｆ Ｖａｌｐｈａ２４－ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｂｌｏｏｄ ２００４；１０４（１３）：４１５０－４１５６）。ヒト末梢血中で、ＮＫＴはＣＤ４発現に基づいて２つの主要な機能的サブセットに分化する：ＣＤ４＋およびＣＤ４－（ほとんどがＣＤ８／ＣＤ４－ダブルネガティブ、ＤＮ）（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｌｉｎｅａｇｅｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ Ｖ（ａｌｐｈａ）２４ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００２；１９５（５）：６３７－６４１）。ＣＤ４＋サブセットは、新生児ＮＫＴにおいて高度に濃縮されており、成人においては、ＣＤ４－サブセットと比較してホメオスタティックな分裂が少なく（Ｂａｅｖ ｅｔ ａｌ． ２００４、上記）、このことは、ＣＤ４＋ＮＫＴが、ある特定の条件下における養子移入された治療用ＮＫＴの長期間残留性に寄与している可能性があることを示唆している。しかし、抗原刺激に応答した、例えばα－ガラクトシルセラミド（αＧａｌＣｅｒ）による、ヒトＮＫＴの生体外増殖では、同様の数のＣＤ４＋ＮＫＴおよびＤＮ ＮＫＴが生成される。ＮＫＴはＮＫ様のリニアな（ｌｉｎｅａｒ）分化も示し、ＣＤ１６１発現を獲得し、その後ＣＤ５６発現を獲得する。通常のＴ細胞と同様に、ＣＤ５６の発現は、最終分化および増殖ポテンシャルの喪失と関連している（Ｌｏｚａ ｅｔ ａｌ．， ＮＫＴ ａｎｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫ－Ｉｉｋｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；３２（１２）：３４５３－３４６２）。

【0008】

瘍免疫および免疫療法においてのＮＫＴの潜在的重要性が、マウスにおける複数のがんモデルと、がん患者における初期臨床試験とおいて明らかにされている（ＭｃＥｗｅｎ－Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．， Ｔｈｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｒｏｌｅ ｏｆ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ２０１５；３（５）：４２５－４３５； Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＭＶ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＣＤ Ｉｄ ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｉｔｙ： ｐｒｏｇｒｅｓｓ ａｎｄ ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ． Ｆｒｏｎｔ Ｂｉｏｓｃｉ． ２００９；１４：７９６－８０７； ＥｘｌｅｙＭＡ， Ｎａｋａｙａｍａ Ｔ． ＮＫＴ－ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌｓ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１ １；１４０（２）： １１７－１１８； Ｍｏｔｏｈａｓｈｉ Ｓ， Ｏｋａｍｏｔｏ Ｙ， Ｙｏｓｈｉｎｏ Ｉ， Ｎａｋａｙａｍａ Ｔ． Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｉＮＫＴ ｃｅｌｌ－ｂａｓｅｄ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１１；１４０（２）：１６７－１７６； Ｙａｍａｓａｋｉ Ｋ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｆｔｅｒ ＮＫＴ ｃｅｌｌ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１１；１３８（３）：２５５－２６５； Ｔａｎｉｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｐｒｏｃ． Ｊｐｎ． Ａｃａｄ． Ｓｅｒ． Ｂ Ｐｈｙｓ． Ｂｉｏ． Ｓｃｉ． ２０１５；９１（７）：２９２－３０４）。通常のＴ細胞とは対照的に、ＮＫＴは腫瘍部位に効果的に輸送され、腫瘍を支援するマクロファージの阻害である、ＣＤｌｄ＋腫瘍細胞の直接的な死滅、または、ＮＫ細胞のトランス活性化のいずれかを介して、抗腫瘍反応を仲介することができる（Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ ＬＳ． Ａｎｔｉ－ｔｕｍｏｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｏｆ ｔｙｐｅ Ｉ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ａｇａｉｎｓｔ ＣＤ ｌｄ－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ＣＤ ｌｄ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｃｌｉｎ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２０１１； １４０（２）： １１９－ １２９）。

【0009】

いくつかの研究により、多様な腫瘍型を有する患者において、腫瘍浸潤性または循環性ＮＫＴの数と、疾患転帰の改善との間に、強い正の相関があることが明らかにされている（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ， ｓｕｐｒａ； Ｍｅｔｅｌｉｔｓａ ＬＳ， ｅｔ ａｌ． Ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ ＣＣＬ２． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００４；１９９（９）：１２１３－１２２１； Ｔａｃｈｉｂａｎａ Ｔ， ｅｔ ａｌ． Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒ Ｖａｌｐｈａ２４－ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ： ａ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｆａｃｔｏｒ ｆｏｒ ｐｒｉｍａｒｙ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２００５；ｌｌ（２０）：７３２２－７３２７； Ｍｏｉｌｉｎｇ ＪＷ， ｅｔ ａｌ． Ｌｏｗ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｉｎｖａｒｉａｎｔ ｎａｔｕｒａｌ ｋｉｌｌｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｐｒｅｄｉｃｔ ｐｏｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｏｕｔｃｏｍｅ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｓｑｕａｍｏｕｓ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏ． ２００７ ；２５（７）：８６２－８６８； Ｃａｒｉａｎｉ Ｅ， ｅｔ ａｌ． Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｃｕｒｒｅｎｃｅ ａｆｔｅｒ ｌｉｖｅｒ ｒｅｓｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ． ＰＬｏＳ．Ｏｎｅ． ２０１２；７（３）：ｅ３２４９３．）。逆に、腫瘍進行は、ＮＫＴの細胞数もしくは機能活性（１６）の減少、または、悪性細胞上のＣＤ１ｄ発現のダウンレギュレーションを伴う場合が多い（Ｄｈｏｄａｐｋａｒ ＭＶ， ｅｔ ａｌ． Ａ Ｒｅｖｅｒｓｉｂｌｅ Ｄｅｆｅｃｔ ｉｎ Ｎａｔｕｒａｌ Ｋｉｌｌｅｒ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｓ ｔｈｅ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｅｍａｌｉｇｎａｎｔ ｔｏ Ｍａｌｉｇｎａｎｔ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｍｙｅｌｏｍａ． Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． ２００３；１９７（１２）：１６６７－７６．）。これらの腫瘍エスケープ機構に対抗するために、初代ヒトＮＫＴを生体外で臨床スケールまで増殖させ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のトランスジェニック発現を介してその細胞毒性を腫瘍細胞に対して向け直す方法が解発された（Ｈｅｃｚｅｙ ｅｔ ａｌ．， Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｂｌｏｏｄ １２４（１８）：２８２４－２８３３ （２０１４））。ＣＡＲ Ｔ細胞臨床試験で報告された知見と同様に（Ｋａｌｏｓ ａｎｄ Ｊｕｎｅ， ２０１３； Ｄｏｔｔｉ Ｇ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｖ． ２０１４；２５７（１）：１０７－１２６）、異種間腫瘍モデルにおけるＣＡＲ ＮＫＴ細胞産物の抗腫瘍活性と生体内残留性との間には強い相関がある（Ｈｅｃｚｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４）。しかし、ヒトＮＫＴの、生体外増殖と後の生体内残留性とを支配する機構は、大部分が不明のままであり、ＮＫＴ細胞をベースとするがん免疫療法の合理的設計の妨げとなっている。

【0010】

ＣＤ６２Ｌ＋（セレクチンＬ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ６４０２）セントラルメモリー通常Ｔ細胞が、幹細胞の特性を有し、細胞治療産物の中でより優れた治療活性を有することが、報告により明らかにされており（Ｇｒａｅｆ Ｐ， ｅｔ ａｌ． Ｓｅｒｉａｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｅｌｌ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｃｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｓｔｅｒｎｎｅｓｓ ｏｆ ＣＤＳ（＋）ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ． ２０１４；４１（１）： １１６－１２６ ； Ｗａｎｇ Ｘ， ｅｔ ａｌ． Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｔｔｒｉｂｕｔｅｓ ｏｆ ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ －ｍｏｄｉｆｉｅｄ ＣＤ１９－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｈｕｍａｎ ＣＯＢ＋ ｃｅｎｔｒａｌ ｍｅｍｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｄ ａｔ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｓｃａｌｅ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ２０１２；３５（９）：６８９－７０１； Ｓｏｍｍｅｒｍｅｙｅｒ Ｄ， ｅｔ ａｌ． Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｄｅｆｉｎｅｄ ＣＯＢ ａｎｄ ＣＤ４ （Ｇｅｎｅ ｓｕｂｓｅｔｓ ｃｏｎｆｅｒ ｓｕｐｅｒｉｏｒ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｌｅｕｋｅｍｉａ ２０１５）、生体外培養におけるＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の試験がその後に行われた。

【0011】

２０１６年１０月２７日に公表された国際公開第２０１６／１７２３７２号は、ＮＫＴ細胞のＣＤ６２Ｌ＋サブセットが、ＮＫＴ細胞の生体外増殖と生体内残留性とに必要であることを明らかにした。さらに、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ（ＣＡＲ．ＣＤ１９）を発現するように操作した場合、ＣＤ６２Ｌ＋ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫＴは、ＮＳＧマウスのＢ細胞リンパ腫モデルにおいて持続的な腫瘍退縮をもたらしたが、ＣＤ６２Ｌ－ ＣＡＲ．ＣＤ１９ ＮＫＴはもたらさなかった。ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは、例えばがん患者において優れた治療活性を有するＮＫＴやＣＡＲ－ＮＫＴを作製するために使用できる共刺激性人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）などの特定の共刺激性リガンドを与えると、生体外増殖中に維持することができた。これらの進歩により、生体外で初代ヒトＮＫＴを臨床スケールに増殖し、キメラ抗原受容体のトランスジェニック発現を介し腫瘍細胞に対し細胞傷害性を向け直すための、頑健性のある方法が提供されたが、課題も残っている。生体外における増殖法の改善が引き続き必要である。さらなる課題は、ＣＡＲ ＮＫＴ細胞を治療的に使用する場合に、生体内残留性を保持することに関するものである。

【0012】

ここでは、ＣＤ６２Ｌ＋ ＮＫＴ細胞がセントラルメモリーＣＤ４＋通常Ｔ細胞と同様の遺伝子発現を共有していることが示されている。また、Ｗｎｔシグナル伝達が、ＮＫＴ細胞におけるＣＤ６２Ｌ＋発現の駆動および維持の両方において決定的な役割を果たしており、これらの知見を活用することで、治療薬としてＮＫＴ細胞を開発する際の多くの問題が解決されることが示されている。以下に示すように、生体外での培養および増殖中にＷｎｔシグナル伝達の活性化因子を発現させると、ＣＤ６２Ｌ＋の発現が増加する。Ｗｎｔシグナル伝達が活性化された改変ＮＫＴ細胞は、疲弊の低減を示し、複数回の増殖を行うことが可能である。Ｗｎｔシグナル伝達が活性化された改変ＮＫＴ細胞は、さらに、抗原暴露後もセントラルメモリー細胞発現プロファイルを保存する。重要なこととして、Ｗｎｔシグナル伝達が活性化された改変ＮＫＴ細胞は、生体内残留性と臨床効果の改善をもたらす。

【発明の概要】

【0013】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現コンストラクトを含む、遺伝子改変ＮＫＴ細胞、およびその集団を提供し、包含する。

【0014】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む、複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む細胞集団を提供し、包含する。

【0015】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程；および、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程を提供し、包含する。

【0016】

本開示は、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列、並びに（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列、を発現するようにＮＫＴ細胞を改変することを提供し、包含する。

【0017】

本開示はまた、培養したＮＫＴ細胞に、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質発現コンストラクトをトランスフェクトまたは形質導入する工程；および、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで、持続的な発現能を有するＮＫＴ細胞集団を作製する工程を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法を提供し、包含する。

【0018】

また、キメラ抗原受容体コード配列と、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子 コード配列と、を含むキメラ抗原受容体発現コンストラクトが、本開示によって包含され、提供される。

【0019】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と その改変ＮＫＴ細胞を培養することで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減されたＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法をさらに提供し、包含する。

【0020】

本開示は、さらに、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、培養したＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入する工程を含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。

【0021】

本開示は、さらに、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質発現コンストラクトで、培養したセントラルメモリーＮＫＴ細胞を改変する工程と；前記改変されたセントラルメモリーＮＫＴ細胞を培養することで、抗原暴露後の減少に対する耐性を有する改変セントラルメモリーＮＫＴ細胞を作製する工程と、を含む、セントラルメモリーＮＫＴ細胞を抗原暴露後の減少から維持する方法を提供し、包含する。

【0022】

本開示は、さらに、Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子であるタンパク質をコードする配列を発現するように、発現コンストラクトでＮＫＴ細胞を改変する工程と その改変ＮＫＴ細胞を培養することで前記転写活性化因子を発現させる工程と、反復的な暴露後にセントラルメモリーＮＫＴ細胞の特性である増殖能および細胞毒性を保持する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法を提供し、包含する。

【0023】

本開示は、さらに、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトでＮＫＴ細胞を改変する工程と、反復的な暴露後にセントラルメモリーＮＫＴ細胞の特性である増殖能および細胞毒性を保持する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法を提供し、包含する。

【0024】

本開示は、さらに、生体外培養用のＮＫＴ細胞を得ることと、前記ＮＫＴ細胞を、αＧａｌＣｅｒパルスＰＢＭＣまたはαＧａｌＣｅｒ担持ａＡＰＣと、Ｗｎｔリガンド、ＧＳＫ３β阻害剤、ＩＬ－２１、ＴＷＳ１１９、Ｗｎｔ経路の小分子活性化因子、またはこれらの組み合わせからなる群から選択される、添加されたＷｎｔシグナル経路活性化因子と、の存在下で培養することと、を含む、治療用のＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を作製する方法を提供し、包含する。

【図面の簡単な説明】

【0025】

添付の図面を参照しながら本開示を開示する。

【0026】

【図1】図１は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴにパーティションされた、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞シグネチャー（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）の濃縮を示す遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）プロットを示しており、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴがセントラルメモリー様ＲＮＡ発現プロファイルを有することを示している（（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。

【0027】

【図2】図２は、７人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および、全ドナーのＬＥＦ１＋細胞の割合の平均±ＳＥＭ（ｂ）（ｎ＝７、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントｔ検定）であり、発現デコンボリューション法から得られた重要な発見を検証している。

【0028】

【図3】図３は、生体外で増殖させたＮＫＴにおいてＬＥＦ１およびＴＣＦ１の共発現を示す３人のドナーからの細胞内フローサイトメトリーの代表的なプロットである。ＮＫＴがＣＤ６２Ｌ－（ａ）集団とＣＤ６２Ｌ＋（ｂ）集団にゲーティングされている。

【0029】

【図4】図４は、細胞をＣＤ６２Ｌ－ＬＥＦ１－集団、ＣＤ６２Ｌ＋ＬＥＦ１－集団、およびＣＤ６２Ｌ＋ＬＥＦ１＋集団（ａ）にゲーティングしている、あるドナーの細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロットであり、ＴＩＭ－３発現の７人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラムが（ｂ）に示されており、全てのドナーのＴＩＭ－３ ＭＦＩの平均値±ＳＥＭが（ｃ）に示されている（ｎ＝７、^＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意差なし、一元配置分散分析とシダックの事後検定）。

【0030】

【図5】図５は、磁気ソートされたＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ－サブセットの、定量ＰＣＲで測定され、ｄｄＣｔ法で算出された、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現に関する４人のドナーの結果のまとめである。Ａｘｉｎ２（ａ）、Ｍｙｃ（ｂ）、およびＴＣＦ７（ｃ）。

【0031】

【図6】図６は、生体外刺激後１２日目の、７－ＴＧＣレポーター（ａ）を形質導入されたＮＫＴ細胞における形質導入およびＷｎｔ活性を示す、細胞内フローサイトメトリーの代表的なドットプロットである。非形質導入ＮＫＴ（ｂ）、７－ＴＧＣ形質導入ＮＫＴ（ｃ）、および１０μＭ Ｗｎｔ活性化因子ＴＷＳ１１９で一晩処理した７－ＴＧＣ形質導入ＮＫＴ（ｃ）の各ドットプロットが示されている。

【0032】

【図7】図７は、４人のドナーのうちの１人からの、ＧＦＰ－サブセットとＧＦＰ＋サブセットにゲーティングされた、ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌ発現の代表的なヒストグラムであり（ａ）、全てのドナーの平均的なＣＤ６２Ｌ＋パーセンテージ（ｂ）（ｎ＝４、^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。

【0033】

【図8】図８は、生体外で１０日間増殖させられ、定量的ＲＴ－ＰＣＲで測定された、ＮＫＴにおけるｍＲＮＡ発現の遺伝子発現の、個々のドナーをそれぞれ含む、３つの独立した実験の要約の要約のプロットである。ＧＡＰＤＨ（Ｇｅｎｅ ＩＤ ２５９７）およびＣＤ１９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９３０）は、それぞれ、ポジティブ発現およびネガティブ発現を示している。ＧＡＰＤＨおよびＣＤ１９の範囲内のＣｔ値を有する遺伝子を、有意に発現されていると見なした。Ｗｎｔ受容体（ＦＲＺ１～ＦＲＺ１０、（ａ）、補助受容体（ＬＲＰ５、６）、およびリガンド（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、およびＷｎｔ８ａ）が示されている。

【0034】

【図9】図９は、ＲＮＡをＫ５６２ベースのａＡＰＣから単離し、定量ＰＣＲを行った、３つの独立した実験の要約の要約のプロットであり、Ｗｎｔリガンド発現（Ｗｎｔ１、Ｗｎｔ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ６、およびＷｎｔ８ａ）が検出されていないことを示している。ＧＡＰＤＨおよびＣＤ１９は、それぞれ、ポジティブ発現およびネガティブ発現を示している。

【0035】

【図10】図１０は、３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｂ）（ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）であり、０日目に開始して３日間、αＧａｌＣｅｒパルス自己ＰＢＭＣによる刺激後に３μＭのＷｎｔ阻害剤ＩＣＧ－００１で処理したＮＫＴを示している。ＣＤ６２Ｌ発現は抗原刺激後１２日目に調べている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。

【0036】

【図11】図１１は、３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｂ）（ｎ＝３、^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定）であり、図１０に示されているように刺激されたが、抗原刺激後０日目、３日目、および７日目に与えられた、ＰＢＳまたは５００ｎｇ／ｍＬのＷｎｔ３ａの３回の別々の投与により処理された、ＮＫＴを示している。ＣＤ６２Ｌ発現は抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーにより調べている。

【0037】

【図12】図１２は、６人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｂ）（ｎ＝６、＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定）であり、図１０に示されているように刺激されたが、抗原刺激後７日目に、ＤＭＳＯまたは５μＭのＴＷＳ１１９の１回の投与により処理された、ＮＫＴを示している。ＣＤ６２Ｌ発現は抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーにより調べている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。

【0038】

【図13】図１３は、αＧａｌＣｅｒパルス自己ＰＢＭＣで刺激され、増殖初期（０日目、１日目、２日目）、増殖後期（６日目、７日目、８日目）、または増殖の全体を通じた（０日目、３日目、８日目）、ＰＢＳまたは５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａの３回の投与により処理された、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴの頻度を示す、代表的なヒストグラムである。ＣＤ６２Ｌ発現は抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーにより調べている。

【0039】

【図14】図１４は、一次刺激後に１２日間のＩＬ－２またはＩＬ－２／ＩＬ－２１との増殖および培養が終わったときのＮＫＴ細胞のフローサイトメトリーの結果を示す、３人のドナーのうちの１人の代表的なヒストグラムである。各群で、ＰＢＳ処理または５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ処理は、抗原刺激後０日目、１日目、および２日目に行われている。

【0040】

【図15】図１５は、図１４に示されているように培養され、抗原刺激後７日目にＤＭＳＯまたは５μＭのＴＷＳ１１９でさらに処理された、ＮＫＴ細胞のＣＤ６２Ｌ発現についての、フローサイトメトリーの結果を示す、３人のドナーのうちの１人の代表的なヒストグラムである。

【0041】

【図16】図１６は、ＮＫＴに、生体外増殖の１０日目にＬＥＦ１を標的とするガイドＲＮＡを有するまたは有さないＣａｓ９をエレクトロポレートした場合の、３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均±ＳＥＭ（ｂ）（ｎ＝３、^＊＊Ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意差なし、スチューデントｔ検定）である。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＬＥＦ１のＫＯを、エレクトロポレーション後３日目の細胞内フローサイトメトリーにより評価している。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ－集団およびＣＤ６２Ｌ＋集団にゲーティングし、ＬＥＦ１発現を解析している。

【0042】

【図17】図１７は、エレクトロポレーション後７日目の抗原刺激前の、エレクトロポレート後ＮＫＴにおける、３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均±ＳＥＭ（ｂ）（ｎ＝３、^＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：有意差なし、対応のあるスチューデントｔ検定）である。

【0043】

【図18】図１８は、抗原刺激後１０日目の、図１７に示されているようなエレクトロポレート後ＮＫＴにおける、３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均±ＳＥＭ（ｂ）（ｎ＝３、^＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：有意差なし、対応のあるスチューデントｔ検定）である。

【0044】

【図19】図１９は、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣを用いた二次刺激の２日後に、ＬＥＦ１のロング型アイソフォーム（Ｒｅｆ ＳＥＱ ＩＤ：ＮＭ＿０１６２６９．５）を過剰発現するガンマレトロウイルスコンストラクト（ＧＦＰ．ＬＥＦ１）、またはＧＦＰ．ＦＦＬｕｃコンストラクトを形質導入した、３人のドナーのうちの１人からの、代表的なドットプロットである。増殖の１２日目に、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価し、ＬＥＦ１発現は別に細胞内フローサイトメトリーにより解析した。

【0045】

【図20】図２０は、図１９に示されているようなＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ形質導入ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１形質導入ＮＫＴにおける、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色およびフローサイトメトリーにより解析された、２人のドナーのうちの１人からの、代表的なヒストグラムである。

【0046】

【図21】図２１は、基礎条件下の、並びにオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、並びにロテノンおよびアンチマイシンＡ（Ｒｏｔ／Ａｎｔ）に応答した、シーホースアッセイにより測定された、ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ形質導入ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１形質導入ＮＫＴの酸素消費速度（ＯＣＲ）のグラフである。結果は、試験された２人のドナーのうちの１人からの代表的なものである。

【0047】

【図22】図２２は、３日毎の１：１比のＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞による反復暴露後の、ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１を形質導入されたＮＫＴの、ＮＫＴ細胞数の変化倍率を示すグラフである。サイクル毎に増殖の変化倍率を示している。

【0048】

【図23】図２３は、図２２に示されているような反復的キリングアッセイの７サイクル目の結果を示すグラフであり、ＮＫＴが１：５０比のＪ３２細胞に３日間暴露されている。腫瘍細胞数が、カウントビーズおよびフローサイトメトリーを用いて求められている。腫瘍減少率が示されている。

【0049】

【図24】図２４は、図２２のような反復的キリングアッセイの５サイクル目の結果を示すグラフである。ＮＫＴは抗原刺激から分離し、計６日間休ませる。ＧＦＰと相関したＴＩＭ－３発現を、フローサイトメトリーで調べている。４人のドナーのうちの１人からの代表的なドットプロット（ａ）、および全ドナーの平均ＴＩＭ－３ ＭＦＩ（ｂ）（ｎ＝４、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意差なし、一元配置分散分析およびシダック事後検定（Ｓｉｄａｋ’ｓ ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ））が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。

【0050】

【図25】図２５は、４人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（ａ）、および全ドナーの平均ＣＤ６２Ｌ割合（ｂ）（ｎ＝４、Ｐ＝０．０７、一元配置分散分析およびシダック事後検定）を示している。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。

【0051】

【図26】図２６は、図２２に記載されているように反復暴露されたＮＫＴのフローサイトメトリーを用いた、ＧＦＰ発現によりモニターされた、形質導入細胞の濃縮のグラフである。

【0052】

【図27】図２７は、本開示の実施形態における例示的なキメラ抗原受容体の図を示している。

【0053】

【図28】図２８は、ＬＥＦ１の共発現をコードする例示的なＣＡＲコンストラクトの図を示している。表示されているように、ＬＥＦ１コード配列が、ＣＤ２８（Ｇｅｎｅ ＩＤ ９４０）もしくは４－１ＢＢ細胞内ドメインの下流、またはＩＬ－１５の下流に、２Ａ配列の後に挿入されている。

【0054】

【図29】図２９は、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣによる二次刺激の２日後の、親ＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトまたはＬＥＦ１含有ＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを形質導入されたＮＫＴ、並びに、増殖の１２日目における、フローサイトメトリーにより測定された、ＣＡＲ．ＧＤ２の細胞表面発現およびＬＥＦ１の細胞内発現のドットプロットを示している。代表的なドットプロットが、２人のドナーのうち１人からの、ＣＡＲ発現に対するＬＥＦ１発現を示している。

【0055】

【図30】図３０は、１：１の細胞対細胞比のＪ３２腫瘍細胞による１回、２回、または７回の暴露後の、親発現コンストラクトまたはＬＥＦ１含有発現コンストラクトを形質導入したＮＫＴの、代表的な結果のドットプロットを示している。ＬＥＦ１含有ＮＫＴ細胞は７サイクル後も高レベルで残存しており、一方で、対照親ＮＫＴ細胞により、過剰発現を超えるＬＥＦ１（ＬＥＦ１ ｏｖｅｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）が反復的な腫瘍細胞死滅後の後期ＮＫＴ増殖を促進するものであることが示されている。

【0056】

【図31】図３１は、１：５０のエフェクター対ターゲット比を用いた腫瘍細胞死滅暴露の実験計画を示している。

【0057】

【図32】図３２は、図３１に示されているようなＮＫＴを腫瘍細胞に１：５０比で暴露した後の、ＮＫＴ増殖の、代表的な結果を示している。ＬＥＦ１を発現するＮＫＴ細胞は、増殖能と、腫瘍細胞を死滅させる能力を保持している。対照的に、ＧＦＰ発現対照細胞は、増殖できておらず、腫瘍細胞減少を示していない。

【0058】

【図33】図３３は、図３２に示された結果のグラフ表示を示している。

【0059】

【図34A】図３４Ａおよび図３４Ｂは、二次刺激の１０日後の遺伝子発現解析の代表的な結果を示している。目的の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）は、共通の表現型／機能によって分類している。図３４Ａのパネルａは、ＮＫＴにおける、ＬＥＦ１過剰発現を介した、遺伝子発現変動を示している。結果が以下の表４に示されている。図３４Ａのパネルｂは、発現の変化倍率（ＬＥＦ１／ＦＦＬｕｃ）を示す遺伝子発現の結果をヒートマップとして示している。図３５Ｂのパネルｃは、Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｂｙ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ＰＡＣ－１ ，” Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７）３＿：２７４－２８３ （２００６）の方法による、セントラルメモリーＴ細胞シグネチャーを示すＧＳＥＡプロットを示している。図３５Ｂのパネルｄは、Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ， ｆｕｎｃｔｉｏｎ， ａｎｄ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｏｆ ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ－１（ｈｉ） ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｈｕｍａｎ ａｄｕｌｔｓ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １８６（７）：４２００－４２１２ （２０１１） ｉｎ ＬＥＦ１－ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ＮＫＴｓの方法による、ＣＤ８Ｔ細胞シグネチャーの濃縮が疲弊レベルの低下を伴うことを示す、ＧＳＥＡプロットを示している。

【図34B】同上

【0060】

【図35A】図３５Ａ～図３５Ｄのパネルａ～ｇは、ＣＡＲ－ＬＥＦ１コンストラクトの設計、およびトランスフェクト後のドナーＮＫＴ細胞のキャラクタリゼーションを示している。図３５Ａのパネルａは、抗ＧＤ２ １４ｇ２ａのｓｃＦｖ、ＣＤ８のヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢの共刺激ドメイン、並びにＣＤ３のζドメインを含有し、２Ａ配列に続きＬＥＦ１を伴う（ＣＡＲ－ＬＥＦ１）、または伴わない（ＣＡＲ）、ＣＡＲ ＬＥＦ１コンストラクトの例示的な設計の模式図を示している。図３５Ａのパネルｂは、２人のドナーのうちの１人からの、ＣＡＲ発現に対するＬＥＦ１発現を示す代表的なドットプロットを示している。図３５Ａのパネルｃは、トリパンブルー色素排除アッセイにより求められたＮＫＴ細胞数を示し、ＬＥＦ１の組み込みがＣＡＲ－ＮＫＴの数的増加を改善することを示す、グラフを示している。図３５Ｂのパネルｄは、１０日間の増殖後のＣＤ６２Ｌ発現の頻度の代表的なヒストグラムを示しており、６人の代表的なドナーの平均を示している。図３５Ｂのパネルｅは、増殖後のＴＩＭ－３陽性細胞の頻度の代表的なヒストグラムを示しており、６人の代表的なドナーの平均を示している。図３５Ｃのパネルｆは、ＣＡＲ－ＮＫＴの短期的な細胞毒性のグラフ解析を示している。ルシフェラーゼ形質導入ＧＤ２＋ＣＨＬＡ－２５５細胞を、ＣＡＲまたはＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴと共培養させている。代表的なドナーの結果が示されている。図３５Ｃのパネルｇは、ＣＡＲ－ＮＫＴからのエフェクターサイトカインの産生のグラフ解析を示している。２人のドナーのうちの１人の代表的な結果が示されている。

【図35B】同上

【図35C】同上

【図35D】同上

【0061】

【図36A】図３６Ａおよび図３６Ｂは、インビボのマウスにおける腫瘍の制御で、ＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴがより優れた効果を有するという結果を示している。図３６Ａは、非形質導入（ＮＴ）対照群、ＣＡＲ．ＧＤ２形質導入細胞（ＣＡＲ）、またはＣＡＲ．ＧＤ２－ＬＥＦ１形質導入細胞（ＣＡＲ－ＬＥＦ１）からの、増殖後ＮＫＴの生物発光画像法を示している。腫瘍成長は、生物発光画像法を用いて週１回モニターされている。図３６Ｂは、カプラン・マイヤー法を用いて作製された、試験マウスの生存率のグラフ表示である。

【図36B】同上

【0062】

対応する参照文字は、いくつかの図面を通して、対応する部分を示している。本明細書に記載された例は、本開示の１または複数の実施形態の例示であるが、いかなる意味においても本開示の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。

【発明を実施するための形態】

【0063】

本願は、遺伝子改変ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ細胞）を対象とする。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞およびＮＫ細胞の両方のいくつかの特徴を共有しているが、通常のＴ細胞とも、またＮＫ細胞とも異なる、別個の細胞型である。ＮＫＴ細胞は、通常のＴ細胞およびＮＫ細胞から多岐にわたる発生をし、ユニークな転写制御因子セットにより駆動される様々な機能を有する。Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ Ｍ， Ｇａｐｉｎ Ｌ． Ｔｈｅ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ｌｉｆｅｓｔｙｌｅ ｏｆ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ．Ｒｅｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ２００２；２（８）：５５７－５６８； Ｇｏｄｆｒｅｙ， ＪＣＩ， ２００４， Ｃｏｈｅｎ ＮＲ， ｅｔ ａｌ． Ｓｈａｒｅｄ ａｎｄ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｐｒｏｇｒａｍｓ ｕｎｄｅｒｌｉｅ ｔｈｅ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｔｕｒｅ ｏｆ ｉＮＫＴ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔｄｍｍｕｎｏｌ． ２０１３；１４（ｌ）：９０－９９．）を参照されたい。Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．は、ＮＫＴ細胞の発生に選択的に影響を与え、ＮＫＴ細胞系統に付随するユニークなプログラム化を反映している、転写因子、シグナル伝達因子、細胞表面分子、サイトカインなどの因子を特定している。その全体が参照によって本明細書に援用される、（Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｒａｉｓｉｎｇ ｔｈｅ ＮＫＴ ｃｅｌｌ ｆａｍｉｌｙ，” Ｎａｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ．， １１（３）：１９７－２０６ （２０１０）（“Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．”）。また、Ｅｎｇｅｌ ａｎｄ Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇ， “Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｖα４ｉ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ，” Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ ３８１， ２０１４）も参照されたい。胸腺におけるＮＫＴ細胞の分化に影響を与える多くの転写因子およびシグナル伝達分子が、そこで発生する他の通常のＴ細胞集団には影響を及ぼさない。本開示中で使用される場合、「Ｔ細胞」という語は、ＮＫＴ細胞と区別可能な通常のＴ細胞に限定される。これらの違いが、刺激に対する反応の違いや、改変による遺伝子発現の増減といった遺伝的変化に繋がり、これが、非ＮＫＴ細胞での結果を予測不可能なものにしている。

【0064】

ＮＫＴ細胞は、全ゲノム転写解析に基づいて識別可能であり、通常の系統およびＮＫ細胞系統から等距離にある。上記のＣｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．を参照されたい。通常のＴ細胞とは、Ｔリンパ球としても知られており、病原体と闘い、免疫応答を制御するという機能を有する重要な細胞型である。これらの細胞の２つの顕著な特徴として、細胞分化中に再編成されることで無数の受容体を形成するＤＮＡセグメントによってコードされた抗原受容体の発現がある。多くの細胞が、この包括的定義のＴ細胞に包含され、例えば、ヘルパーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞）（サブタイプＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＦＨを含む）；細胞傷害性Ｔ細胞（大部分はＣＤ８＋細胞、ＣＴＬとも称される）；メモリーＴ細胞（セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞、およびレジデントメモリーＴ細胞を含む）；制御性Ｔ細胞、および粘膜関連インバリアントＴ細胞などがある。Ｔ細胞の細胞表面マーカーとしては、Ｔ細胞受容体およびＣＤ３が挙げられる。通常、Ｔ細胞はＣＤ５６を発現しない（すなわちＣＤ５６ネガティブである）。

【0065】

ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞はＣＤ５６＋である。ヒトにおいて、ＮＫ細胞は通常、細胞表面マーカーのＣＤ５６、ＣＤ１６１、ＣＤ１１ｂ、ＮＫｐ４６、ＮＫｐ４４、ＣＤ１５８、およびＩＬ－１２Ｒを発現する。ＮＫ細胞が発現する受容体はレパートリーが限定されており、全体的に構造が異なり、そのうちのいくつかはＮＫＴ細胞上にも存在する。ヒトとげっ歯類を比較したとき、ほとんどのＮＫ受容体は高度な保存がなされていない。ＮＫ細胞は、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーのメンバーを発現しており、これらは活性化性であることも阻害性であることもあり、また、ＮＫＧ２ＤおよびＣＤ９４ＮＫＧ２Ａ／Ｃなどのタンパク質のレクチン（炭水化物結合）ファミリーのメンバーである受容体を発現している。ＫＩＲはＮＫＴ細胞上には発現されない。ＮＫ細胞は、ヒトにおいてはＫＩＲ、あるいはマウスにおいてはＬｙ４９、ナチュラルサイトトキシック受容体（ｎａｔｕｒａｌ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）（ＮＣＲ）、ＮＫＧ２Ｄ、およびＣＤ９４：ＮＫＧ２ヘテロ二量体などの、多くの細胞表面受容体によって活性化される。加えて、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－１８、ＩＬ－２、およびＣＣＬＳなどのサイトカインおよびケモカインが、ＮＫ細胞の活性化において重要な役割を果たす。

【0066】

ＮＫＴ細胞は、通常、ＣＤ３＋ＣＤ５６＋細胞として同定でき、Ｔ細胞受容体を発現する。ＮＫＴ細胞は、Ｔ細胞のように、Ｔ細胞受容体およびＣＤ３の各鎖を発現しているが、ＮＫ細胞のようにＣＤ５６およびＣＤ１６１などのマーカーも有している。とはいえ、現在では、ＮＫＴ細胞が別個の細胞系統であるということが、専門家に一般に認められていることである。すなわち、ＮＫＴ細胞は他のＴ細胞とは全く異なるものであり、その挙動と特性は他のＴ細胞の解析からも、またＮＫ細胞の解析からも、予測できない。ＮＫＴ細胞は、通常のＴ細胞やＮＫ細胞とは完全に異なる細胞である。ＮＫＴ細胞系統の特性が独特であるため、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＢ細胞などの他のリンパ球集団でなされた知見では、ＮＫＴ細胞活性化の機能的影響を予測できないことがある。

【0067】

ＮＫＴ細胞は、細胞表面マーカーの発現に基づいて、ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、γδＴ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、単球、および樹状細胞を含む他の細胞型と識別することができる。Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．， “ＯＭＩＰ－０６９： Ｆｏｒｔｙ－Ｃｏｌｏｒ Ｆｕｌｌ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｎｅｌ ｆｏｒ Ｄｅｅｐ Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｏｆ Ｍａｊｏｒ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ Ｂｌｏｏｄ，” Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ ９７Ａ：１０４４－１０５１ （２０２０）； Ｈｅｒｔｏｇｈｓ ｅｔ ａｌ．， ＯＭＩＰ－０６４： Ａ ２７－Ｃｏｌｏｒ Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｎｅｌ ｔｏ Ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅ Ｈｕｍａｎ ＮＫ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｉｎｎａｔｅ Ｌｙｍｐｈｏｉｄ Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ， ＭＡＩＴ Ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ γδ Ｔ Ｃｅｌｌｓ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ Ｐａｒｔ Ａ ９７Ａ：１０１９－１０２３ （２０２０）； Ｓａｈｉｒ ｅｔ ａｌ．， Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ４３ ｃｏｌｏｒ ｐａｎｅｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｕｎｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ Ｔ－ｃｅｌｌ ｓｕｂｓｅｔｓ， Ｂ ｃｅｌｌｓ， ＮＫ ｃｅｌｌｓ， ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ， ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌｓ， ａｎｄ ｉｎｎａｔｅ ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｓｐｅｃｔｒａｌ ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ， Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ２０２０：１－７を参照されたい。

【0068】

ＮＫＴ細胞は、Ｉ型およびＩＩ型という２つの主要なタイプに分けられる。Ｉ型ＮＫＴ細胞またはインバリアントＮＫＴ細胞（「ｉＮＫＴ」）として知られている、ＮＫＴ細胞の最も重要な形態は、インバリアントＴ細胞受容体α鎖（マウスではＶα４ｉまたはヒトではＶα２４ｉ）を有する。Ｉ型ＮＫＴ（ｉＮＫＴ）細胞は、αＧａｌＣｅｒ類似体を搭載したＣＤ１ｄベースの四量体の結合により容易に検出できる。抗原受容体の形態は、不変のα鎖が比較的少数のβ鎖のうちの１つと対をなすことから、レパートリーが限定されている。阻害、または治療用途。このインバリアントな受容体に認識される抗原は糖脂質であり、例えば細菌細胞に存在するものなどである。このインバリアントな受容体は、元は海洋性海綿動物由来の糖脂質であるα－ガラクトシルセラミド（ａ－ＧａｌＣｅｒ）を認識する。この化合物は微生物の糖脂質に類似しており、現在では、前記海綿動物と関連した微生物共生体に由来すると一般に考えられている。ＮＫＴ細胞はＣＤ１ｄ分子上に提示された抗原を必要とする。

【0069】

ＩＩ型ＮＫＴ細胞も、ＣＤ１ｄからの抗原提示を必要とするが、多様化しながらも限定されたＴＣＲレパトアを有する。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、低レベルの転写因子ＰＬＺＦを発現する。Ｉ型ＮＫＴ細胞がα－ＧａｌＣｅｒのみを認識する一方で、ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、スルファチド、リゾスルファチド、リゾＰＣ、およびリゾＧＬ１を認識する。ＩＩ型ＮＫＴ細胞は、ヒトで多く見られるが、マウスでは少なくなる。Ｄｈｏｄｐｋａｒ ａｎｄ Ｋｕｍａｒ， “Ｔｙｐｅ ＩＩ ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｅｍｅｒｇｉｎｇ Ｒｏｌｅ ｉｎ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｄｉｓｅａｓｅ，” Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． １９８（３）：１０１５－１０２１ （２０１７）を参照されたい。

【0070】

ＮＫＴ細胞の活性化には２つの経路が知られている。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄ分子上に提示された抗原を介し、ＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体を通して、刺激に応答する。これは、ＴＣＲシグナルを発生させるＣＤ４やＣＤ８といった補助受容体の関与に依存しておらず、これらの細胞の反応の、共刺激シグナルに対する依存度はいくらか低い。さらに、抗原がＴ細胞受容体と結合しない場合も、ＩＬ－１２およびＩＬ－１８などの自然炎症性刺激を介した、ＮＫＴ細胞が活性化するための機構が存在する。活性化されると、Ｔ細胞は末梢血中に見出される。同様に、ＮＫ細胞も末梢血中に見出される。対照的に、ＮＫＴ細胞の大部分は組織に見出され、例えばＣＣＲ２およびＣＣＲ６が関与する２段階プロセスを介して、末梢血から腫瘍部位へと移動する。この移動に関与する機構はＮＫＴ細胞に特有のものであり、他のリンパ球にも当てはまる一般的機構ではない。

【0071】

ｉＮＫＴ細胞は、他のＴ細胞型と容易に識別できる。表１を参照されたい。増殖させたＴ細胞のほんの一部しか（ＣＤ４ Ｔ細胞サブセット）、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介した活性化後に腫瘍保護的なＴｈ２サイトカイン（ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１３、ＩＬ－１０）を産生できない。Ｔ細胞の大部分（全てのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む）および全てのＮＫ細胞は、抗腫瘍性Ｔｈ１サイトカイン（すなわち、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、ＴＮＦ－α）しか産生しない。対照的に、ＮＫＴ細胞は、Ｔｈ１サイトカインとＴｈ２サイトカインを同時に産生する。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）活性化後に産生されたＴｈｌサイトカインとＴｈ２サイトカインのバランスに応じて、ＮＫＴ細胞は免疫応答を活性化または抑制し得る。このように、ＮＫＴ細胞は、免疫活性化と免疫抑制という、興味深い逆説的な二重機能を有している。対照的に、他の免疫細胞は、例えば病原体と闘うなど、通常は１つの主要な機能を有し、その一方で、他の細胞サブセットが免疫応答の制御に専念する。

【表1】

【0072】

ＮＫＴ細胞も胸腺で発生するが、Ｉ型ＮＫＴ細胞のポジティブセレクションはＣＤ１ｄ陽性胸腺細胞によって媒介される。ＮＫＴ細胞は樹状細胞によるネガティブセレクションも受ける。胸腺におけるＴ細胞およびＮＫＴ細胞の発生と成熟をまとめている、Ｇｏｄｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．の図２を参照されたい。

【0073】

特に記載がない限り、本明細書で使用される全ての専門用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により共通に理解される意味を有する。以下の参考文献は、本発明で使用される多くの用語の一般的な定義を技術の１つ（ｏｎｅ ｏｆ ｓｋｉｌｌ）に提供している：Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （２ｎｄ ｅｄ． １９９４）； Ｔｈｅ Ｃａｍ ｂｒｉｄｇｅ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ （Ｗａｌｋｅｒ ｅｄ．， １９８８）； Ｔｈｅ Ｇｌｏｓｓａｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ， ５ｔｈ Ｅｄ．， Ｒ． Ｒｉｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ． （ｅｄｓ．）， Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ （１９９１）；およびＨａｌｅ ＆ Ｍａｒｈａｍ， Ｔｈｅ Ｈａｒｐｅｒ Ｃｏｌｌｉｎｓ Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９９１）。本明細書で使用される場合、以下の語は、特に指定がない限り、以下でそれらに付与される意味を有する。

【0074】

本明細書で使用される場合、「約」という語は、±１０％を指す。

【0075】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有すること（ｈａｖｉｎｇ）」という語、およびこれらの複合表現は、「含むがこれに限定はされない」を意味する。

【0076】

「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」という語は、「含んでこれに限定される」を意味する。

【0077】

「から実質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」という語は、追加の成分、工程、および／または部分が、特許請求された組成物、方法、または構造の基本的な新規の特徴を実質的に変えない場合に限り、組成物、方法、または構造が、追加の成分、工程、および／または部分を含んでいてもよいことを意味する。

【0078】

本明細書で使用される場合、文脈によって特に明示されていない限り、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は複数形を包含する。例えば、「細胞（ａ ｃｅｌｌ）」または「少なくとも１つの細胞（ａｔ ｌｅａｓｔ ｏｎｅ ｃｅｌｌ）」という語は、その混合物を含む、複数の細胞を含んでよい。

【0079】

「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という語は、米国特許法でそれらに付与されている最も広い意味を有することが意図され、「包含する（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「包含すること（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することがある。

【0080】

「増加する（ｉｎｃｒｅａｓｅ）」は、少なくとも５％、正に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％であってよく、さらには１００％であってもよい。

【0081】

本願を通じて、本開示の種々の実施形態が、範囲形式で示されている場合がある。範囲形式の記述は単なる便宜と簡潔さのためのものであり、本開示の範囲に対する変更を許さない限定と解釈されるべきではないことを理解されたい。したがって、範囲の記述は、その範囲内の個々の数値だけでなく、可能性のある部分範囲の全てを具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、１～６などの範囲の記述は、１、２、３、４、５、および６などの、その範囲内の個々の数値だけでなく、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの部分範囲も具体的に開示していると見なされるべきである。これは、範囲の幅を問わない。

【0082】

本明細書に数値範囲が示される場合は常に、示された範囲内に挙げられるいかなる数字も（分数も整数も）含むことが意図される。第１指示数字と第２指示数字と「の間の範囲」および第１指示数字「から」第２指示数字「までの範囲」という表現は、本明細書では同義的に使用され、第１および第２の指示数字と、それらの間にある全ての分数および整数を含むことが意図される。

【0083】

本明細書で使用される場合、「方法」という語は、所与の課題を達成するためのやり方、手段、手法、および手順を指し、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学の実施者に公知であるか、または、それらによって既知の方法、手段、手法、および手順から容易に開発される、やり方、手段、手法、および手順を含むが、これらに限定はされない。

【0084】

本明細書で使用される場合、「治療」は、治療を受けている個体または細胞の疾病経過を変化させるための臨床的介入を指し、予防のために実施することもできるし、臨床病理の過程で実施することもできる。治療効果としては、疾患の発生または再発の予防、症状の緩和、疾患の任意の直接的または間接的な病理的帰結の低減、転移の予防、疾患増悪速度の減少、病状の改善または軽減、および寛解または予後の改善が挙げられるが、これらに限定はされない。疾患または障害の進行を妨げることで、治療は、罹患したもしくは診断された対象または障害を有する疑いのある対象における障害による悪化を防ぐことができるが、治療はまた、障害のリスクがある、または障害を有する疑いがある対象における障害または障害の症状の発症も防ぐこともある。

【0085】

本明細書で使用される場合、「遺伝子改変ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）」とは、非ネイティブプロモーターの下流に外因性タンパク質または内因性タンパク質をコードする少なくとも１つの組み換え核酸を含む、ＮＫＴ細胞である。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、キメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸を含む。また、キメラ抗原受容体をコードする組み換え核酸とＷｎｔシグナル経路の転写因子のタンパク質配列をコードする組み換え核酸を含むＮＫＴ細胞も提供され、包含されるが、これらの２つのタンパク質コード配列は別々の組み換え核酸構築体中に提供され得る。

【0086】

「内因性」とは、核酸分子またはポリペプチドが、通常は細胞または組織で発現されるものであることを意味する。

【0087】

「外因性」とは、核酸分子またはポリペプチドが、細胞に内因的に存在しないか、過剰発現された場合に得られる機能的効果を達成するのに十分なレベルで存在しないことを意味する。したがって、「外因性」という語は、外来性、異種性、過剰発現された核酸分子およびポリペプチドなどの、細胞において発現されたあらゆる組み換え核酸分子やポリペプチドを包含する。

【0088】

「単離細胞」とは、当該細胞に天然に同伴する分子成分および／または細胞成分から分離された細胞を意味する。

【0089】

「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」という語は、本明細書で使用される場合、免疫エフェクター細胞上に発現され、抗原と特異的に結合するように改変された、人工的なＴ細胞受容体を指す。一般的なＣＡＲの図を図２７ａに示す。各態様において、ＣＡＲは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。ある態様において、ＣＡＲが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを含んで細胞内ドメインを含まないことがあるが、本出願のより多くのＣＡＲが細胞内ドメインを含み、細胞内シグナル伝達をもたらす。

【0090】

「受容体」とは、１または複数のリガンドと選択的に結合する、細胞膜上に存在するポリペプチドまたはその一部を意味する。

【0091】

本明細書で使用される場合、「細胞外ドメイン」という語は、ＣＡＲの細胞外部分を指し、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、および抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサーまたはヒンジ領域を含む。発現されると、シグナルペプチドは取り除かれる場合がある。

【0092】

本明細書で使用される場合、「抗原認識ドメイン」は、通常、特定のがん抗原に特異的な単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。いくつかの態様において、同一細胞に２つ以上のＣＡＲが存在する場合、第２のＣＡＲは別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含んでよい。

【0093】

本明細書で使用される場合、「単鎖可変領域フラグメント」または「ｓｃＦｖ」という語は、ＶＨ：：ＶＬヘテロ二量体を形成するように共有結合した、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）の融合タンパク質である。重鎖（ＶＨ）と軽鎖（ＶＬ）とは、直接繋がっているか、または、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端と連結する、もしくはＶＨのＣ末端をＶＬのＮ末端と連結する、ペプチドをコードするリンカー（例えば、１０、１５、２０、２５アミノ酸）によって繋げられている。リンカーは、通常、可動性のためにグリシンリッチであり、また、溶解性のためにセリンまたはスレオニンリッチである。定常領域が除去され、リンカーが導入されているのにもかかわらず、ｓｃＦｖタンパク質は、元の免疫グロブリンの特異性を保持している。Ｈｕｓｔｏｎ， ｅｔ ａｌ．（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５：５８７９－５８８３， １９８８）に記載されているように、ＶＨコード配列およびＶＬコード配列を含む核酸から、一本鎖Ｆｖポリペプチド抗体を発現させることができる。米国特許第５，０９１，５１３号、同第５，１３２，４０５号、および同第４，９５６，７７８号；並びに米国特許出願公開第２００５０１９６７５４号および同第２００５０１９６７５４号も参照されたい。

【0094】

本明細書で使用される場合、「スペーサー」または「ヒンジ領域」は、組換えタンパク質の所望により存在するリンカー部分であり、さらには、膜貫通ドメインと抗体認識ドメインとの間の短ペプチド断片である。スペーサーまたはヒンジ領域は１～２０アミノ酸であり得る。細胞外ドメイン用のヒンジ領域の例としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧ１由来のヒンジ領域、およびＣＤ３の一部が挙げられる。

【0095】

本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」は、タンパク質が発現された際に、二重層を少なくとも１回通過する、主に非極性アミノ酸残基である、領域である。一般的に、膜貫通ドメインは、１８～２１個のアミノ酸残基によってコードされ、αヘリックス立体構造をとる。本明細書で使用される場合、膜貫通ドメインは、当該技術分野において公知のいかなる種類のものであってもよい。各態様において、膜貫通ドメインは、いくつかの例においてであるが、ＣＤ２８である。他の供給源として、ＣＤ３－Ｃ、ＣＤ４、またはＣＤ８が挙げられる。細胞外ドメインの例示的な組み合わせを図２７ｂに示す。他の好適な膜貫通領域を、ＣＤ１６、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、およびＮＫＧ２ｄから得ることができる。

【0096】

本明細書で使用される場合、「細胞内ドメイン」という語は、細胞内のシグナル伝達を可能にするＣＡＲの細胞内ドメインを指す。一般に、細胞内ドメインは、刺激ドメインと、所望により共刺激ドメインの、２つの部分にさらに分けることができる。共刺激ドメインは、図２７ａでは刺激ドメインのアミノ末端側に配置するように示されているが、本明細書は、アミノ末端側に刺激ドメインがあり、共刺激ドメインが存在する場合はそれに続くものも提供する。最もよく使用される細胞内ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有し、抗原が結合した後に活性化シグナルをＮＫＴ細胞に伝達する、ＣＤ３－ζである。他の好適な刺激ドメインは、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９（Ｇｅｎｅ ＩＤ ３６０４、例えば、４－１ＢＢまたはＣＤ１３７）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５９０６７）、造血細胞シグナルトランスデューサー（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒ）（ＨＣＳＴ、Ｇｅｎｅ ＩＤ １０８７０、例えば、ＤＡＰ１０）、および膜貫通型免疫シグナル伝達アダプター（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｉｍｍｕｎｅ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｄａｐｔｏｒ）（ＴＹＲＯＢＰ、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７３０５；ＤＡＰ１２）から得ることができる。

【0097】

「腫瘍抗原」という語は、本明細書で使用される場合、正常細胞や非新生細胞と比較して、腫瘍細胞上で独自に発現する、または発現に差がある、抗原（例えば、ポリペプチド、糖タンパク質、または糖脂質）を指す。本発明に関連して、腫瘍抗原とは、抗原認識受容体（例えば、ＣＤ１９、Ｍｕｃ－１）が認識可能である、または受容体－リガンド結合（例えば、ＣＤ４７、ＰＤ－Ｌ１／Ｌ２、８７．１１２）を介して免疫応答を抑制することが可能である、腫瘍によって発現されるあらゆるポリペプチドを含む。

【0098】

「組織抗原」とは、腫瘍細胞と比較して、正常または非腫瘍性の細胞または組織上に独自に発現される、または発現差がある、抗原（例えば、ポリペプチドまたは糖タンパク質もしくは糖脂質）を意味する。

【0099】

本明細書で使用される場合、「マーカーの発現が陽性」という語は、イムノアッセイ、ＰＣＲ、またはｑＰＣＲにより、当該マーカーの発現が検出されたことを言う。個々の発現細胞を検出可能であることから、イムノアッセイによる検出が好ましい。発現は、「高」発現または「低」発現とさらに区別できる。

【0100】

本発明の方法において有用な核酸分子としては、本発明のポリペプチドまたはその断片をコードするあらゆる核酸分子が挙げられる。このような核酸分子は、内在性核酸配列と１００％同一である必要はないが、通常は実質的な同一性を示すこととなる。

【0101】

「実質的に同一な」とは、ポリペプチド分子または核酸分子が、参照アミノ酸配列（例えば、本明細書に記載のアミノ酸配列のうちのいずれか１つ）または参照核酸配列（例えば、本明細書に記載の核酸配列のうちのいずれか１つ）に対し少なくとも５０％の同一性を示すことを意味する。このような配列は、比較に使用された配列に対して、アミノ酸レベルで、または核酸において、少なくとも６０％同一であることが好ましく、８０％または８５％同一であることがより好ましく、９０％、９５％、さらには９９％同一であることがより好ましい。内在性配列に対し「実質的な同一性」を有するポリヌクレオチドは、典型的に、挙げられた核酸配列と少なくとも８０％の同一性を共有する。いくつかの態様において、ポリペプチドをコードするコドンの重複性の観点から、同一性を下げることが可能である。１つの態様において、本願の核酸は、本明細書のポリペプチドに対し９０％以上の同一性を有するポリペプチドをコードする。

【0102】

配列同一性は、典型的には、当該技術分野において広く利用できる配列解析ソフトウェアを用いて測定される。このようなソフトウェアは、様々な置換、欠失、および／または他の改変に対し、相同性の程度を割り当てることで、同一または類似の配列同士を一致させる。保存的置換としては、典型的には、以下の群に含まれる置換が挙げられる：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。同一性の程度を求める例示的なアプローチでは、ＢＬＡＳＴプログラムが使用されることがあり、ｅ－３～ｅ－１００の確率スコアは、密接に関連した配列であることを示す。

【0103】

本明細書で使用される場合、「ＮＫＴ細胞の疲弊」とは、感染または疾患の結果として起こる場合がある、ＮＫＴ細胞機能の喪失を指す。ＮＫＴ細胞の疲弊は、ＰＤ－１、ＴＩＭ－３、およびＬＡＧ－３の発現増加、アポトーシス、並びにサイトカイン分泌の減少と関連している。本明細書で使用される場合、「疲弊が低減された」ＮＫＴ細胞は、複数回の増殖を行うことができることによって特徴付けられる。一般に、疲弊が低減されたＮＫＴ細胞は、マーカーであるＬＡＧ－３、ＴＩＭ－３、およびＰＤ－１を発現しないか、または、それらのマーカーを低レベルに発現する。さらに、ＮＫＴ細胞機能を保持し、ＮＫＴ細胞の疲弊を示さない、細胞の例としては、ＣＤ６２Ｌ（＋）細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。本明細書において提供されているように、Ｗｎｔシグナル経路における外来性転写活性化因子を発現する細胞は、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された細胞である。

【0104】

「対象」、「個体」、および「患者」という語は、本明細書では同義的に使用され、哺乳類を含むがこれに限定はされないあらゆる脊椎動物対象を指し、ヒトなどの霊長類が好ましく、マウス、ラット、およびモルモットなどのげっ歯類を含む実験動物などの非ヒト霊長類も包含され；この語は特定の年齢を表すものではない。すなわち、成体および新生児（仔）の個体の両方が包含されることが意図される。

【0105】

「有効量」とは、治療効果を有するのに十分な量を意味する。１つの実施形態では、「有効量」は、新形成の持続的な増殖、成長、または転移（例えば、浸潤、または移動）を、停止する、改善する、または阻害するのに十分な量である。

【0106】

「異種核酸分子またはポリペプチド」とは、細胞または細胞から得られた試料に通常は存在しない、核酸分子（例えば、ｃＤＮＡ分子、ＤＮＡ分子、またはＲＮＡ分子）またはポリペプチドを意味する。この核酸は、別の生物からのものであってもよく、あるいは、例えば、細胞または試料において通常は発現されないｍＲＮＡ分子であってもよい。

【0107】

「免疫応答細胞」とは、免疫応答において機能する細胞、またはその前駆細胞、もしくは子孫を意味する。

【0108】

「単離された」、「純化された」、または「生物学的に純粋な」という語は、物質が、その天然状態で存在する場合に、通常その物質と共に存在する成分を、様々な程度に、含んでいないこと、を言う。「単離する」とは、元の供給源または環境からのある程度の分離を表す。「純化する」とは、単離よりも程度の高い分離を表す。「純化された」または「生物学的に純化された」タンパク質は、いかなる不純物も当該タンパク質の生物学的特性に実質的に影響しないように、または他の有害事象を引き起こさないように、他の物質を十分に含まないものである。すなわち、本発明の核酸またはペプチドは、組換えＤＮＡ技術で作製された場合は、細胞性物質、ウイルス性物質、および培地を実質的に含まないならば、純化されており、あるいは、化学合成された場合は、化学的前駆物質および他の化学物質を含まないならば、純化されている。純度および均一性は、典型的には、分析化学技術、例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを用いて求められる。「純化された」という語は、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に一本のバンド生じることを表すものであることがある。リン酸化やグリコシル化などの修飾を受ける可能性があるタンパク質の場合、修飾の違いにより、異なる単離タンパク質が生じることがあり、それらは別々に純化することができる。

【0109】

「薬剤を得ること」などにおける「得ること」という語は、薬剤（または表示された物質または材料）を購入すること、合成すること、または他の方法で獲得することを包含することが意図される。

【0110】

「改変する」とは、正または負に変化することを意味する。例示的な改変としては、１％、２％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、または１００％の変化が挙げられる。

【0111】

「新形成」とは、細胞または組織の病的増殖と、その後に起こる他の組織または臓器への移動または浸潤によって特徴付けられる疾患を意味する。新形成の成長は、典型的には制御されず進行性であり、正常細胞の増殖を誘発しないであろう条件下でも、正常細胞の増殖停止を引き起こすであろう条件下でも起きる。新形成は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、神経膠、食道、ファロピウス管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿生殖路、尿管、尿道、子宮、および腟からなる群から選択される臓器、またはその組織もしくは細胞型を含むがこれらに限定はされない、種々の細胞型、組織、または臓器に影響を及ぼす可能性がある。新形成は、肉腫、癌腫、または形質細胞腫（形質細胞の悪性腫瘍）などのがんを含む。本発明を使用できる例示的な新生物としては、限定はされないが、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄芽球性白血病、急性前骨髄球性白血病、急性骨髄単球性白血病、急性単球性白血病、急性赤白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病）、真性多血症、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫）、ワルデンストローム・マクログロブリン血症、重鎖病、並びに、肉腫および癌腫などの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、膵がん、乳がん、卵巣がん、前立腺がん、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌（ｎｉｌｅ ｄｕｃｔ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、絨毛癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、子宮がん、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫（ｏｌｉｇｏｄｅｎｒｏｇｌｉｏｍａ）、シュワン細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫、および網膜芽細胞腫）が挙げられる。

【0112】

「機能的に連結された」とは、本明細書で使用される場合、２つ以上の生体分子が、当該生体分子に結び付けられた生物学的な機能、活性、および／または構造が少なくとも保持されるように連結されていることを意味する。ポリペプチドに関しての場合、上記の語は、２つ以上のポリペプチドの連結によって、各ポリペプチド成分の個々の活性のうちのいくつかを少なくとも保持する融合ポリペプチドが得られることを意味する。これらの２つ以上のポリペプチドは、直接連結されてもよいし、リンカーを介して連結されてもよい。核酸に関しての場合、上記の語は、適切な分子（例えば、転写活性化因子タンパク質）が第２ポリヌクレオチドに結合した際に第１ポリヌクレオチドの転写を指示する第２ポリヌクレオチドに隣接して第１ポリヌクレオチドが配置されていることを意味する。

【0113】

本明細書で使用される場合、「細胞集団」とは、複数の細胞を指し、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）集団だけでなく、異なる細胞型の混合物をさらに含んでよい。本明細書で使用される場合、均一（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）集団は、

【0114】

「減少する」とは、少なくとも５％、負に変化することを意味する。変化は、５％、１０％、２５％、３０％、５０％、７５％であってよく、さらには１００％であってもよい。

【0115】

「認識する」とは、選択的に標的と結合することを意味する。ある細胞を認識するＮＫＴ細胞は、典型的には、その細胞によって発現された抗原と結合する受容体を発現している。

【0116】

「参照」または「対照」とは、比較の標準を意味する。例えば、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、ＣＡＲ、またはこれらの組み合わせを発現する細胞の免疫応答が、ＣＡＲ単独を発現する対応する非改変細胞の免疫応答と比較され得る。

【0117】

「類似体」とは、参照ポリペプチドまたは参照核酸分子の機能を有する構造的な関連性があるポリペプチドまたは核酸分子を意味する。

【0118】

「疾患」とは、細胞、組織、または臓器の正常な機能にダメージを与える、またはそれを妨げる、あらゆる状態または障害を意味する。疾患の例としては、新形成または細胞の病原体感染が挙げられる。

【0119】

本明細書で使用される場合、「自律的リボソーム内自己プロセシングペプチド」は、ポリタンパク質を処理して別々のタンパク質にするためのプロテアーゼの必要がない、１８アミノ酸の小ペプチドである。口蹄疫ウイルスで最初に発見され、２つのタンパク質の間のリンカーとして導入された場合、これらのペプチドは、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを可能にする。同様の配列が、ピコルナウイルス科（ｐｉｒｃｏｒｎａｖｉｒａｄａｅ）の他のメンバーで同定されている。ｄｅ Ｆｅｌｉｐｅ， “Ｓｋｉｐｐｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｐｒｏｂｌｅｍ： ｔｈｅ ｎｅｗ ２Ａ ‘ＣＨＹＳＥＬ’ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，” Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：１３ （２００４）を参照されたい。

【0120】

本明細書で使用される場合、「ＩＲＥＳ」は、第２シストロンを翻訳するためのリボソームの内部進入を可能にする配列（約０．５ｋｂ）である配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）である を指す。それぞれのシストロンは、異なる翻訳開始イベントから翻訳される。

【0121】

本明細書で使用される場合、「セントラルメモリーＮＫＴ細胞の特性」という語は、幹細胞の特性を有し、増殖が可能であり、抗原提示細胞に対する細胞毒性を保持する、ＮＫＴ細胞を指す。セントラルメモリー様ＲＮＡ発現プロファイルの代表的なサンプルが、ＣＤ６２Ｌ＋ｉＮＫＴ細胞の場合で、図１に示されている。図１は、セントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞シグネチャーを有する細胞で見られる遺伝子の濃縮を示している（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）。セントラルメモリーＮＫＴ細胞の特性を有する細胞としては、ＣＤ６２Ｌ＋ｉＮＫＴ細胞が挙げられるが、必ずしもこれに限定はされない。セントラルメモリーＮＫＴ細胞集団は、抗原提示細胞による複数回の暴露後も、増殖能（図２２）と細胞毒性（図２３）を保持する。本明細書に示されているように、Ｗｎｔシグナル経路の活性化は、セントラルメモリーＮＫＴ表現型を維持する。対照的に、初期培養を含む、ＮＫＴ細胞 培養中に、ＣＤ６２Ｌ＋ｉＮＫＴ細胞は、セントラルメモリー特性を喪失し、反復的な暴露後に増殖能と細胞毒性を喪失する。

【0122】

本明細書で使用される場合、「操作する」という語は、１または複数の外来性核酸配列を導入するための細胞の遺伝子改変を指す。操作によって導入された外来性核酸配列が、転写および翻訳されることでタンパク質を発現することが好ましい。外来性核酸配列の導入は、形質転換、トランスフェクション、および形質導入を含む、当該技術分野において公知の方法を用いて行うことができる。

【0123】

本明細書で使用される場合、「Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子」という語は、通常、細胞において外因的に発現された場合に、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル経路の下流の遺伝子を活性化するタンパク質を指す。例えば、図１１に示されるようなＷｎｔリガンドの添加は、Ｗｎｔ経路を活性化させ、セントラルメモリー特性を有するＮＫＴ細胞の一例であるＣＤ６２Ｌ＋である細胞の頻度を増加させる。Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子は、ＬＥＦ１などのＷｎｔシグナル伝達の正の制御因子の発現（例えば、実施例６および実施例７、並びに図１９、図２０、図２７などに示される）と、ＧＳＫ３βなどの負の制御因子の阻害（実施例３、図１２ とを含む。また、Ｗｎｔシグナル伝達の転写活性化因子に含まれるものとして、Ｂｌａｇｏｄａｔｓｋｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｗｎｔ Ｐａｔｈｗａｙ Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ ｆｒｏｍ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｏｕｒｃｅｓ： Ｈｉｓｔｏｒｙ， Ｓｔａｔｅ ｏｆ ｔｈｅ Ａｒｔ ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ，” Ｃｅｌｌｓ ９：５８９ （２０２０） ａｎｄ Ｖｅｒｋａａｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｓｍａｌｌ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ ｏｆ β－ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，” ＰＬｏＳ ＯＮＥ ６（４）： ｅ１９１８５ （２０１１）に記載されているものを含むがこれらに限定はされない小分子活性化因子もあり、ＴＷＳ１１９などのＷｎｔシグナル伝達の負の制御因子の阻害剤（実施例３、図１２）も含まれる（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．， Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｓｍａｌｌ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｔｈａｔ ｃｏｎｔｒｏｌ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆａｔｅ，” ＰＮＡＳ １００（１３）：７６３２－７ （２００３）を参照）。

【0124】

本明細書で使用される場合、「増殖因子を発現する」という表現は、１または複数の増殖因子の、通常は異種プロモーターの制御下の、さらには、ＣＨＹＳＥＬ配列の下流のポリタンパク質の一部としてである場合が多い、外因的発現を指す。

【0125】

本明細書は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を発現するように改変された遺伝子改変ＮＫＴ細胞を提供し、包含する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、タンパク質配列ＣＡＲをコードする発現コンストラクトをさらに含む。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、２つの発現コンストラクトを含み、１つ目はＣＡＲの発現をコードするものであり、２つ目はＷｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現をコードするものである。また、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子と、最大３つの追加のタンパク質配列と、をコードするタンパク質を発現する発現コンストラクトが提供される。各態様において、発現コンストラクトは、ＣＡＲと、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子と、を含むポリタンパク質をコードする。ＣＡＲとＷｎｔシグナル経路における転写活性化因子とを含むポリタンパク質をコードする発現コンストラクトは、追加のコード配列（例えば、シストロン）をさらに含んでいてよい。各態様において、ポリタンパク質をコードする発現コンストラクトは、ＣＡＲと、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子と、増殖因子と、を含む。

【0126】

本明細書において提供されているように、各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｉ型ＮＫＴ細胞である。１つの態様において、Ｉ型ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ陽性（ＣＤ６２Ｌ＋）ＮＫＴ細胞である。通常、本開示のＮＫＴ細胞は、ヒト末梢血から単離され、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製するために遺伝子コンストラクトを導入する前に、２０日間未満の培養を経ている。

【0127】

各態様において、本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、細胞マーカーＣＤ４、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４５ＲＯ（Ｇｅｎｅ ＩＤ５７８８）、ＯＸ４０、ＣＣＲ７、およびこれらの組み合わせの発現によってさらに特徴付けられる。これらのマーカーの発現は、ＮＫＴ細胞が抗腫瘍反応を媒介できる腫瘍部位にＮＫＴ細胞を輸送することと密接に結び付いている。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｓ１ＰＲ１、ＩＬ－７Ｒａ、ＩＬ２１Ｒなどであるが、これらに限定はされない、ＮＫＴ細胞の生存および記憶のマーカーを発現する。各態様において、本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、疲弊マーカーであるＴＩＭ－３、ＬＡＧ３、およびＰＤ－１を低レベルで発現する。

【0128】

１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞における発現コンストラクトは、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子および最大３つの追加のタンパク質コード配列のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む。追加のタンパク質コード配列は、それぞれ、それ自身のプロモーターから発現させることができ、または、ある態様では、単一のプロモーターから発現させることができ、また、追加のコード配列の発現は、コードされたタンパク質毎に、配列内リボソーム進入配列（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ｅｎｔｒｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＩＲＥＳ）によって駆動される。

【0129】

１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞における発現コンストラクトは、ポリタンパク質の一部としての、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子および最大３つの追加のタンパク質コード配列のタンパク質配列をコードし、各タンパク質コード配列は、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって互いに隔てられている。１つの態様において、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドは、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列または関連のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）である。

【0130】

本明細書は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、およびＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含むがこれらに限定はされない、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を発現するように改変された遺伝子改変ＮＫＴ細胞を提供し、包含する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0131】

また、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードしており、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のタンパク質配列をコードしている、発現コンストラクトを含む遺伝子改変ＮＫＴ細胞が、本開示によって包含され、提供される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする別々の発現コンストラクトを含む。他の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする単一の発現コンストラクトを含む。さらなる態様において、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、ＣＨＹＳＥＬ配列によって隔てられた単一のポリタンパク質として、またはＩＲＥＳ配列によって隔てられた別々のシストロンとして、コードさせることができる。さらなる態様において、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－７から選択される増殖因子の配列をコードする第３のタンパク質をさらに含むことができる。

【0132】

本開示は、がん抗原を認識する抗体認識ドメインを含むＣＡＲタンパク質を提供し、包含する。各態様において、ＣＡＲは、がん抗原に対する抗体認識ドメインと、スペーサーまたはヒンジ領域と、膜貫通ドメインと、細胞内ドメインと、を含む。１つの態様において、抗体認識ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）である。ある態様では、抗体認識ドメインは、例えば、目的の抗原を発現するがん細胞の細胞表面上のがん抗原に対するものである。各態様において、細胞内ドメインは、Ｔ細胞受容体ｚ鎖（ｚ－ｃｈａｉｎ）に由来するものなどの、刺激ドメインを含む。他の態様において、本明細書の刺激ドメインとしては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、およびＯＸ４０などの共起刺激分子からの細胞内ドメイン、またはＩＬ７およびＩＬ１５などのサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が挙げられるが、これらに限定はされない。各態様において、共起刺激分子は、抗原結合後にＣＡＲによって生産されたＮＫＴ細胞の活性化、増殖、および細胞毒性を増強するために用いられる。特定の態様において、共起刺激分子はＣＤ２８、ＯＸ４０、または４－１ＢＢである。

【0133】

ある態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせてＣＡＲを少なくとも含むように改変される。特定の態様において、特定のＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、２つ以上のＣＡＲの発現を含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、およびＴＬＥ１からなる群から選択される、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現コンストラクトを含む。ある態様において、転写活性化因子は、１または複数のＣＡＲと組み合わせた、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、ＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である。

【0134】

メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、またはＣＤ４４ｖ６などのがん抗原が、本開示によって包含され、提供される。１つの態様において、がん抗原は、ＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される。別の態様において、がん抗原はＣＤ１９である。１つの態様において、がん抗原はＧＤ２である。さらに別の態様において、がん抗原はＧＰＣ３である。

【0135】

また、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択されるがん抗原を認識する２つ以上のＣＡＲ分子を含む遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞が、本開示によって包含され、提供される。２つ以上のＣＡＲ分子を含む遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質を発現するためのコンストラクトをさらに含み、また、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１から選択される増殖因子を発現するための組換え配列をさらに含んでいてよい。発現コンストラクトは別々に作製することもできるが、ＣＨＹＳＥＬ配列を有する１または複数のポリタンパク質発現コンストラクトとして作製することがより好都合である。

【0136】

通常、ＣＡＲの細胞外ドメインは、シグナルペプチド、抗原認識ドメイン、および抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに繋げるスペーサーを含む。抗原認識ドメインは、通常、特定のがん抗原に特異的な単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含むものである。しかし、同一細胞に２つ以上のＣＡＲが存在する場合、第２のＣＡＲは別の特定の抗原に特異的なｓｃＦｖを含む場合がある。がん抗原の例としては、上記の抗原が挙げられる。

【0137】

ポリタンパク質をコードする発現コンストラクトの具体例を図２９のａ～ｌに挙げているが、これらに限定されない。図示されているように、発現コンストラクトは、Ｗｎｔ転写因子であるＬＥＦ１と組み合わせて、がん抗原であるＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３を認識する抗体認識ドメインを含む。また、増殖因子ＩＬ－１５をさらにコードする発現コンストラクトが図示されている。

【0138】

細胞外ドメイン用のヒンジ領域の例としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧｌ由来のヒンジ領域、およびＣＤ３の一部が挙げられる。膜貫通領域は、いかなる種類のものであってもよいが、いくつかの場合ではＣＤ２８である。

【0139】

通常、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、抗原認識および受容体同士のクラスター後の細胞内のシグナル伝達のために利用される。最もよく使用される細胞内ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有し、抗原が結合した後に活性化シグナルをＴ細胞に伝達する、ＣＤ３－ζである。いくつかの実施形態において、ＣＤ３－ζと、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、および／またはＯＸ４０との組み合わせなどの、追加の共刺激シグナル伝達が利用される。

【0140】

各タンパク質を特定の順番で発現する場合の発現コンストラクトが示されているが、本開示はそれに限定はされない。例えば、図２８ｃのコンストラクトは、ＩＬ－１５と、それに連結したＣＡＲと、それに連結したＬＥＦ１を発現するように構成することもでき、ＬＥＦ１と、それに連結したＩＬ－１５と、それに連結したＣＡＲを発現するように構成することもできる。さらに、ｓｃＦＶ配列（ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３、ＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ、またはＧＤ３特異的抗体Ｙ０３５）を、上述のがん抗原の抗体配列と置き換えることができることは、当業者には明らかであろう。同様に、ＬＥＦ１配列は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質であるβカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、またはＴＬＥ１と置き換えることができ、同様に、ＩＬ－１５配列は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびＩＬ－２１のうちのいずれか１つと置き換えることができる。本明細書において提供されているように、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質を発現する遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、培養中のＮＫＴ細胞の疲弊を抑制し、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などによる複数回の暴露後に持続的な発現能を提供する。

【0141】

本開示は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞集団を提供し、包含する。いくつかの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、純化された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団とすることができる。一般的に、ＮＫＴ細胞は、低レベルにではあるが、ＰＢＭＣ中に存在しており、それから入手可能である。ＮＫＴ細胞を、ポジティブセレクション法またはネガティブセレクション法で単離し、増殖させ、本開示のベクターをトランスフェクションまたは形質導入することで、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製することができる。本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、任意の数の細胞を含むことができるが、通常、少なくとも１００，０００個またはそれ以上の細胞の集団である。各態様において、前記集団は、１０^５～１０^１０個の細胞である場合がある。遺伝子改変ＮＫＴ細胞が亜集団である混合集団も包含され、提供される。

【0142】

他の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、細胞亜集団である。ＮＫＴ細胞は、あるいは、前記ＮＫＴ細胞は、Ｂ細胞および／または他の末梢血細胞などの異なる種類の細胞による集団の形態である場合がある。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞などのＴ細胞サブセットの純化集団である場合があり、または、Ｔ細胞サブセット内のＮＫＴ細胞集団である場合がある。本発明の別の実施形態においては、Ｔ細胞は、長期間培養下で維持されたＴ細胞クローンである。Ｔ細胞クローンは、様々な程度にトランスフェクションまたは形質導入される場合がある。特定の実施形態において、Ｔ細胞は、培養下で無限に増殖するＴ細胞クローンである。

【0143】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む、複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む細胞集団を提供し、包含する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、非改変Ｉ型ＮＫＴ細胞、非改変ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、または他の非改変細胞をさらに含む混合集団である。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団のうちの１０％超を構成する。別の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団のうちの２５～３０％である。

【0144】

ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、総細胞集団の、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、総細胞集団の約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約６５％、約１０％～約７０％、約１０％～約７５％、約１０％～約８０％、約１０％～約８５％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～１００％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約３５％、約１５％～約４０％、約１５％～約４５％、約１５％～約５０％、約１５％～約５５％、約１５％～約６０％、約１５％～約６５％、約１５％～約７０％、約１５％～約７５％、約１５％～約８０％、約１５％～約８５％、約１５％～約９０％、約１５％～約９５％、約１５％～１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約６５％、約２０％～約７０％、約２０％～約７５％、約２０％～約８０％、約２０％～約８５％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約３５％、約２５％～約４０％、約２５％～約４５％、約２５％～約５０％、約２５％～約５５％、約２５％～約６０％、約２５％～約６５％、約２５％～約７０％、約２５％～約７５％、約２５％～約８０％、約２５％～約８５％、約２５％～約９０％、約２５％～約９５％、約２５％～１００％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約６５％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～１００％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約６５％、約３５％～約７０％、約３５％～約７５％、約３５％～約８０％、約３５％～約８５％、約３５％～約９０％、約３５％～約９５％、約３５％～１００％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約６５％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～１００％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約６５％、約４５％～約７０％、約４５％～約７５％、約４５％～約８０％、約４５％～約８５％、約４５％～約９０％、約４５％～約９５％、約４５％～１００％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％を構成する。ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、総細胞集団の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％を構成する。

【0145】

本開示は、複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも５０％含む、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を提供し、包含する。

【0146】

ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％含む。ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％含む。

【0147】

ある態様において、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％含む。

【0148】

本開示は、前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＬＥＦ１を発現する、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を提供し、包含する。１つの態様においては、少なくとも３０パーセントの複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＬＥＦ１を発現する。ある態様においては、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞のうちの、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％が、ＬＥＦ１を発現する。ある態様においては、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞のうちの、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約６５％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～１００％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約６５％、約３５％～約７０％、約３５％～約７５％、約３５％～約８０％、約３５％～約８５％、約３５％～約９０％、約３５％～約９５％、約３５％～１００％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約６５％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～１００％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約６５％、約４５％～約７０％、約４５％～約７５％、約４５％～約８０％、約４５％～約８５％、約４５％～約９０％、約４５％～約９５％、約４５％～１００％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％が、ＬＥＦ１を発現する。ある態様においては、前記複数の本開示の遺伝子改変ＮＫＴ細胞のうちの、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％が、ＬＥＦ１を発現する。

【0149】

本開示はまた、本明細書により説明されたような細胞の集団の治療有効量を提供する。

【0150】

本開示は、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列と、を含むキメラ抗原受容体発現コンストラクトを提供する。

【0151】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体発現コンストラクトは、インターロイキン（ＩＬ）のタンパク質コード配列をさらに含む。ある態様において、タンパク質コード配列は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはこれらの組み合わせをコードする。ある態様において、タンパク質コード配列は、ＩＬ－２、ＩＬ－４、およびＩＬ－７、ＩＬ－１５、またはこれらの組み合わせをコードする。一つの態様において、タンパク質コード配列はＩＬ－２をコードする。一つの態様において、タンパク質コード配列はＩＬ－４をコードする。一つの態様において、タンパク質コード配列はＩＬ－７をコードする。一つの態様において、タンパク質コード配列はＩＬ－１５をコードする。一つの態様において、インターロイキン配列はヒト由来である。別の態様において、インターロイキン配列は外来性である。１つの特定の態様において、発現コンストラクトは、ヒトＩＬ－１５のタンパク質コード配列を含む。

【0152】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体発現コンストラクトは、誘導性自殺遺伝子をさらに含む。誘導性自殺遺伝子の非限定例として、誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子およびチミジンキナーゼ（ｓｒ３９ ＴＫ）が挙げられる。一つの態様において、発現コンストラクト内の誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子は、ＡＰ２０１８７、ＡＰＩ９０３、またはこれらの混合物によって活性化される。別の態様において、一つの態様において、発現コンストラクト内のチミジンキナーゼは、ガンシクロビルによって活性化される。一つの態様において、本開示の方法は、誘導性カスパーゼ－９自殺遺伝子を活性化するために、ＡＰ２０１８７、ＡＰＩ９０３、またはこれらの混合物を対象に投与することを含んでよい。別の態様において、本開示の方法は、チミジンキナーゼを活性化するために、ガンシクロビルを対象に投与することを含んでよい。

【0153】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体発現コンストラクトは、ＣＤ３４タグのタンパク質コード配列をさらに含む。

【0154】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクトまたはキメラ抗原受容体発現コンストラクトは、追加成分のタンパク質コード配列をさらに含む。

【0155】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクトは、ポリタンパク質の自律的リボソーム内自己プロセシングを可能にするために、タンパク質コード配列の間に１または複数のリンカーを含む。リンカー配列の非限定例としては、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）由来の「２Ａ」配列ペプチド、および関連のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）由来の「２Ａ」配列ペプチドが挙げられる。一つの態様において、発現コンストラクトは、ＣＡＲコード配列と、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列との間に、第１リンカー配列を含む。別の態様において、発現コンストラクトは、インターロイキン タンパク質コード配列、誘導性自殺遺伝子などの発現コンストラクトの各成分を隔てる、第２、第３、第４、またはそれ以上のリンカー配列を含む。

【0156】

一つの態様において、ＣＡＲコード配列およびＷｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列は、本開示の発現コンストラクト内でインフレームである。別の態様において、ＣＡＲコード配列、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列、およびインターロイキンのタンパク質コード配列は、インフレームである。さらなる態様において、ＣＡＲコード配列、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質コード配列、インターロイキンのタンパク質コード配列、および１または複数の追加のタンパク質コード配列は、インフレームである。

【0157】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクト内のＷｎｔシグナル経路における転写活性化因子は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１）である。別の態様において、転写活性化因子は、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、またはＴＬＥ１である。一つの態様において、ＬＥＦ１配列はヒト由来である。

【0158】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクト内の細胞外ドメイン配列は、抗原認識ドメインと、抗原認識ドメインを膜貫通ドメインに連結するスペーサー／ヒンジドメインと、を含む。別の態様において、細胞外ドメイン配列は、シグナルペプチドをさらに含む。細胞外ドメインのヒンジ領域の非限定例としては、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域、ＩｇＧｌからのヒンジ領域、およびＣＤ３の一部が挙げられる。一つの態様において、細胞外ドメインのヒンジ領域は、ＣＨ８Ｈを含む。

【0159】

特定の態様において、抗原認識ドメインは、単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。特定の態様において、抗原認識ドメインは、キャンセル細胞（ｃａｎｃｅｌ ｃｅｌｌ）の細胞表面上のがん抗原を認識する。がん抗原の非限定例としては、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ－軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体α２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、またはＣＤ４４ｖ６のうちのいずれか１つが挙げられる。いくつかの場合において、抗原認識ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＣＳＰＧ４、ＨＥＲ２、ＣＥＡ、またはメソテリンを認識する。１つの特定の態様において、抗原認識ドメインは、ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。別の特定の態様において、抗原認識ドメインは、ＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。

【0160】

一つの態様において、本開示の発現コンストラクト内の細胞内ドメインは、抗原認識ドメインが標的抗原と結合した後にＮＫＴ細胞増殖およびエフェクター機能のための刺激シグナルを生成するために、Ｔ細胞受容体ζ－鎖由来のものなどの、細胞質内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内ドメインの非限定例としては、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、およびＯＸ４０などの共起刺激分子からの細胞内ドメイン、または、ＩＬ７およびＩＬ１５などのサイトカイン受容体のシグナル伝達成分が挙げられる。ある態様において、共起刺激分子は、抗原結合後にＮＫＴ細胞の活性化、増殖、および細胞毒性を増強するために用いられる。特定の態様において、共起刺激分子はＣＤ２８、ＯＸ４０、および４－１ＢＢである。一つの態様において、本開示のＣＡＲの細胞内ドメインは、抗原認識および受容体同士のクラスター後の細胞内のシグナル伝達のために利用される。一つの態様において、細胞内ドメイン成分は、３つのＩＴＡＭを含有し、抗原が結合した後に活性化シグナルをＮＫＴ細胞に伝達する、ＣＤ３－ζである。ある態様において、ＣＤ３－ζと、ＣＤ２８、４－ＩＢＢ、および／またはＯＸ４０との組み合わせなどの、追加の共刺激シグナル伝達が利用される。１つの特定の態様において、細胞内ドメインは、ＣＤ３－ζ鎖にインフレーム融合された４－１ＢＢのシグナル配列を含む。

【0161】

膜貫通ドメインは、いかなる種類のものであってもよい。一つの態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８の膜貫通ドメインを含む。別の態様において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８の膜貫通ドメインを含む。

【0162】

１つの特定の態様において、ＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトおよびＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトは、以前の報告の通りに作製され（Ｈｅｃｚｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２０１４； Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， Ａ ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ｔ ｃｅｌｌ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｔｈａｔ ａｕｇｍｅｎｔｓ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｒｅｌｅａｓｅ ａｎｄ ｓｕｐｐｏｒｔｓ ｃｌｏｎａｌ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍａｒｙ ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ． ２００５；１２（５）：９３３－９４１）、ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３またはＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａに由来するｓｃＦｖを含有し、それが、ＩｇＧｌヒンジ領域由来の短いスペーサーを介して、ＣＤ８ａ由来の膜貫通ドメインに連結されており、その後に、ζ鎖と融合した４－１ＢＢのシグナル伝達細胞内ドメインが続く。

【0163】

本開示の発現コンストラクトは、このコンストラクトを含有する宿主細胞の選別を可能にする少なくとも１つのマーカーが存在し得る、１または複数のＤＮＡ分子またはコンストラクトとして細胞に導入することができる。このコンストラクトは、遺伝子および調節領域が単離され、必要に応じてライゲーションされ、適切なクローニング用宿主においてクローニングされ、制限または配列決定などの好都合な手段によって解析され得る、従来の方法で作製することができる。コンストラクトは、完成し適切な配列を有することが示されたら、任意の好都合な手段によってＣＴＬに導入されてよい。コンストラクトは、レトロウイルスベクターを含む、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、または単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのような、非複製性の欠損ウイルスゲノムに、インテグレーションおよびパッケージングし、細胞への感染または形質導入を行ってもよい。コンストラクトは、所望により、トランスフェクションのためのウイルス配列を含んでもよい。あるいは、コンストラクトは、融合、エレクトロポレーション、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入されてもよい。宿主細胞を培養液中で成長および増殖させた後にコンストラクトを導入し、その後に、コンストラクトの導入およびコンストラクトの組み込みのための適切な処理を行ってもよい。その後、この細胞を増殖させ、コンストラクト内に存在するマーカーに基づいてスクリーニングする。首尾よく使用され得る各種マーカーとしては、ＨＰＲＴ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性などが挙げられる。

【0164】

本開示はまた、本開示のキメラ抗原受容体発現コンストラクトを含む遺伝子改変ＮＫＴ細胞を提供する。

【0165】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様において、前記方法は、ドナーからＰＢＭＣを単離する工程、ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程、並びに、前記分離されたＮＫＴ細胞を少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程、をさらに提供する。その後、これらの細胞に、本明細書に記載の発現ベクターをトランスフェクションまたは形質導入し、培養することで、増殖能が保存されたＮＫＴ細胞を作製する。

【0166】

各態様において、前記方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0167】

ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、約１～２日間、約１～３日間、約１～４日間、約１～５日間、約１～６日間、約１～７日間、約１～８日間、約１～９日間、約１～１０日間、約１～１１日間、約１～１２日間、約１～１３日間、約１～１４日間、約１～１５日間、約１～１６日間、約１～１７日間、約１～１８日間、約１～１９日間、約１～２０日間、約２～３日間、約２～４日間、約２～５日間、約２～６日間、約２～７日間、約２～８日間、約２～９日間、約２～１０日間、約２～１１日間、約２～１２日間、約２～１３日間、約２～１４日間、約２～１５日間、約２～１６日間、約２～１７日間、約２～１８日間、約２～１９日間、約２～２０日間、約３～４日間、約３～５日間、約３～６日間、約３～７日間、約３～８日間、約３～９日間、約３～１０日間、約３～１１日間、約３～１２日間、約３～１３日間、約３～１４日間、約３～１５日間、約３～１６日間、約３～１７日間、約３～１８日間、約３～１９日間、約３～２０日間、約４～５日間、約４～６、約４～７、約４～８、約４～９、約４～１０、約４～１１、約４～１２、約４～１３日間、約４～１４日間、約４～１５日間、約４～１６日間、約４～１７日間、約４～１８日間、約４～１９日間、約４～２０日間、約５～６日間、約５～７日間、約５～８日間、約５～９日間、約５～１０日間、約５～１１日間、約５～１２日間、約５～１３日間、約５～１４日間、約５～１５日間、約５～１６日間、約５～１７日間、約５～１８日間、約５～１９日間、約５～２０日間、約６～７日間、約６～８日間、約６～９日間、約６～１０日間、約６～１１日間、約６～１２日間、約６～１３日間、約６～１４日間、約６～１５日間、約６～１６日間、約６～１７日間、約６～１８日間、約６～１９日間、約６～２０日間、約７～８日間、約７～９日間、約７～１０日間、約７～１１日間、約７～１２日間、約７～１３、約７～１４、約７～１５、約７～１６、約７～１７、約７～１８、約７～１９日間、約７～２０日間、約８～９日間、約８～１０日間、約８～１１日間、約８～１２日間、約８～１３日間、約８～１４日間、約８～１５、日間 約８～１６日間、約８～１７日間、約８～１８日間、約８～１９日間、約８～２０日間、約９～１０日間、約９～１１日間、約９～１２日間、約９～１３日間、約９～１４日間、約９～１５、日間 約９～１６日間、約９～１７日間、約９～１８日間、約９～１９日間、約９～２０日間、約１０～１１日間、約１０～１２日間、約１０～１３日間、約１０～１４日間、約１０～１５日間、約１０～１６日間、約１０～１７日間、約１０～１８日間、約１０～１９日間、約１０～２０日間、約１１～１２日間、約１１～１３日間、約１１～１４日間、約１１～１５日間、約１１～１６日間、約１１～１７日間、約１１～１８日間、約１１～１９日間、約１１～２０日間、約１２～１３日間、約１２～１４日間、約１２～１５日間、約１２～１６日間、約１２～１７日間、約１２～１８日間、約１２～１９日間、約１２～２０日間、約１３～１４日間、約１３～１５日間、約１３～１６日間、約１３～１７日間、約１３～１８日間、約１３～１９日間、約１３～２０日間、約１４～１５日間、約１４～１６日間、約１４～１７日間、約１４～１８日間、約１４～１９日間、約１４～２０日間、約１５～１６日間、約１５～１７日間、約１５～１８日間、約１５～１９日間、約１５～２０日間、約１６～１７日間、約１６～１８日間、約１６～１９日間、約１６～２０日間、約１７～１８日間、約１７～１９日間、約１７～２０日間、約１８～１９日間、約１８～２０日間、または約１９～２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、または約２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。

【0168】

また、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することで、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製することを含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法が、本開示に包含され、提供される。

【0169】

各態様において、前記方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0170】

ある態様において、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、少なくともＣＡＲを含むように、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変することを含む。特定の態様において、ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、２つ以上のＣＡＲを発現するように、操作される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、およびＴＬＥ１からなる群から選択される、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現コンストラクトを導入することを含む。ある態様において、転写活性化因子は、１または複数のＣＡＲと組み合わせた、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、ＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である。

【0171】

メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ－軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体α２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、またはＣＤ４４ｖ６などのがん抗原を認識するＣＡＲの発現が、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法によって包含され、提供される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変するために導入されるがん抗原は、ＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される。別の態様において、ＣＡＲの抗体認識ドメインは、がん抗原ＣＤ１９を認識するものであった。１つの態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原はＧＤ２である。さらに別の態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原 ＧＰＣ３。発現コンストラクトを導入する方法は当該技術分野において公知である。態様または本開示において、遺伝子改変は、レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した方法を用いて、本開示のコンストラクトを導入することを包含し、提供する。

【0172】

また、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択される２種以上のがん抗原を認識する抗体認識ドメインを有する２つ以上のＣＡＲ分子を発現するように、ＮＫＴ細胞細胞を遺伝子改変する方法が、本開示によって包含され提供される。２つ以上のＣＡＲ分子を有するＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質を発現するためのコンストラクトをさらに含み、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１から選択される増殖因子を発現するための配列をさらに含んでよい。発現コンストラクトは別々に作製することもできるが、上記のようなＣＨＹＳＥＬ配列を有する１または複数のポリタンパク質発現コンストラクトとして作製することがより好都合である。ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、本開示の発現コンストラクトを導入することに先立ち、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を、増殖因子の存在下、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣでの刺激による培養によって、１～３日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、ａＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。

【0173】

ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下での培養によって、１～２０日間、２～２０日間、３～２０日間、４～２０日間、５～２０日間、６～２０日間、７～２０日間、８～２０日間、９～２０日間、１０～２０日間、１１～２０日間、１２～２０日間、１３～２０日間、または１４～２０日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様において、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞は、本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することに先立ち、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下の培養で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、または約１２日間、増殖させられる。

【0174】

ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法の１つの態様において、ＣＡＲ細胞外ドメイン配列は、抗体認識ドメインおよびスペーサードメインを含む。

【0175】

さらなる態様において、得られた遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞の存在下で培養することで増殖させられる。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、集団の一部であり、その集団中の総細胞数が求められ、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と一緒に培養され、１０：１～１：１０の比で提供される。１つの態様において、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団中の総細胞数に対し、１：１の比で提供され得る。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、暴露前に単離される。他の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、混合集団の一部として培養される。１つの態様において、混合集団は、少なくとも１０％の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む。

【0176】

本明細書で提供されるように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、各サイクルが一定期間を置いて実行される、３回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、３～２０回の培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、４回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、５回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、６回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、７回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、９回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。

【0177】

本開示が提供しているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも１日の培養期間の後に、繰り返し増殖させることができる。各態様において、増殖は、１～３日の期間を置いてから実行される。ある態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞または他の抗原提示細胞との培養によるサイクルを繰り返す前に、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、増殖させられる。

【0178】

本開示は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書で提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞および非改変ＮＫＴ細胞の両方に対する選別とすることができ、選別された集団はさらなる培養および増殖に使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、非改変ＮＫＴ細胞および他の細胞型、通常はリンパ球、の両方を含む、混合細胞集団からの遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別である。選別された集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超える遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0179】

本開示は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書において提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、持続的な発現能を有するＩ型ＮＫＴ細胞の選別と、それに続く増殖であり得る。

【0180】

本明細書中で提供された各態様において、選別されたＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超えるＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0181】

また、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖により、総細胞集団の少なくとも２０％を構成する集団を生成することが、提供され、包含される。１つの態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも２回の増殖後に総細胞集団の少なくとも２０％を構成する。

【0182】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、その結果、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団のうちの１０％超を構成する細胞集団を生成する、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法が、本開示において提供され、本開示に包含される。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0183】

ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団の、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～９８％、１０％～９９％、および最大１００％を構成し、非改変ＮＫＴ細胞は、総集団のうちの９９．９％未満を構成する。各態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団のうちの、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～９８％、５０％～９９％、および最大１００％を構成し、非改変ＮＫＴ細胞は、総集団のうちの９９．９％未満を構成する。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0184】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、その結果、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団のうちＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を１０％超含む細胞集団を生成する、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法を提供し、包含する。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0185】

ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％含む。ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％含む。ある態様において、本開示の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％含む。各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0186】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、前記改変ＮＫＴ細胞がある期間培養される、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様においては、培養期間を、約１～２日間、約１～３日間、約１～４日間、約１～５日間、約１～６日間、約１～７日間、約１～８日間、約１～９日間、約１～１０日間、約１～１１日間、約１～１２日間、約１～１３日間、約１～１４日間、約１～１５日間、約１～１６日間、約１～１７日間、約１～１８日間、約１～１９日間、約１～２０日間、約２～３日間、約２～４日間、約２～５日間、約２～６日間、約２～７日間、約２～８日間、約２～９日間、約２～１０日間、約２～１１日間、約２～１２日間、約２～１３日間、約２～１４日間、約２～１５日間、約２～１６日間、約２～１７日間、約２～１８日間、約２～１９日間、約２～２０日間、約３～４日間、約３～５日間、約３～６日間、約３～７日間、約３～８日間、約３～９日間、約３～１０日間、約３～１１日間、約３～１２日間、約３～１３日間、約３～１４日間、約３～１５日間、約３～１６日間、約３～１７日間、約３～１８日間、約３～１９日間、約３～２０日間、約４～５日間、約４～６、約４～７、約４～８、約４～９、約４～１０、約４～１１、約４～１２、約４～１３日間、約４～１４日間、約４～１５日間、約４～１６日間、約４～１７日間、約４～１８日間、約４～１９日間、約４～２０日間、約５～６日間、約５～７日間、約５～８日間、約５～９日間、約５～１０日間、約５～１１日間、約５～１２日間、約５～１３日間、約５～１４日間、約５～１５日間、約５～１６日間、約５～１７日間、約５～１８日間、約５～１９日間、約５～２０日間、約６～７日間、約６～８日間、約６～９日間、約６～１０日間、約６～１１日間、約６～１２日間、約６～１３日間、約６～１４日間、約６～１５日間、約６～１６日間、約６～１７日間、約６～１８日間、約６～１９日間、約６～２０日間、約７～８日間、約７～９日間、約７～１０日間、約７～１１日間、約７～１２日間、約７～１３、約７～１４、約７～１５、約７～１６、約７～１７、約７～１８、約７～１９日間、約７～２０日間、約８～９日間、約８～１０日間、約８～１１日間、約８～１２日間、約８～１３日間、約８～１４日間、約８～１５、日間 約８～１６日間、約８～１７日間、約８～１８日間、約８～１９日間、約８～２０日間、約９～１０日間、約９～１１日間、約９～１２日間、約９～１３日間、約９～１４日間、約９～１５、日間 約９～１６日間、約９～１７日間、約９～１８日間、約９～１９日間、約９～２０日間、約１０～１１日間、約１０～１２日間、約１０～１３日間、約１０～１４日間、約１０～１５日間、約１０～１６日間、約１０～１７日間、約１０～１８日間、約１０～１９日間、約１０～２０日間、約１１～１２日間、約１１～１３日間、約１１～１４日間、約１１～１５日間、約１１～１６日間、約１１～１７日間、約１１～１８日間、約１１～１９日間、約１１～２０日間、約１２～１３日間、約１２～１４日間、約１２～１５日間、約１２～１６日間、約１２～１７日間、約１２～１８日間、約１２～１９日間、約１２～２０日間、約１３～１４日間、約１３～１５日間、約１３～１６日間、約１３～１７日間、約１３～１８日間、約１３～１９日間、約１３～２０日間、約１４～１５日間、約１４～１６日間、約１４～１７日間、約１４～１８日間、約１４～１９日間、約１４～２０日間、約１５～１６日間、約１５～１７日間、約１５～１８日間、約１５～１９日間、約１５～２０日間、約１６～１７日間、約１６～１８日間、約１６～１９日間、約１６～２０日間、約１７～１８日間、約１７～１９日間、約１７～２０日間、約１８～１９日間、約１８～２０日間、または約１９～２０日間とすることで、持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0187】

各態様において、ＮＫＴ細胞を改変する工程を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団から所望の細胞を分離することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、ＣＤ６２Ｌの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別されたＣＤ６２Ｌ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、４－１ＢＢの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別された４－１ＢＢ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。

【0188】

本開示は、ドナーから新鮮ＰＢＭＣを単離する工程、培養に先立ちＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程、少なくともαＧａｌＣｅｒ、および増殖因子の存在下で、少なくとも１日間、前記分離ＮＫＴ細胞を増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様において、増殖因子は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせを含む。１つの態様において、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程は、抗ＮＫＴミクロビーズを用いてＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む。

【0189】

本開示のＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、抗原提示細胞による暴露で少なくとも２倍にさらに増殖させることができる、遺伝子改変細胞集団を作製すること、を提供し、包含する。１つの態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。各態様において、抗原提示細胞は、１０：１比～１：１０比の割合で与えられる。１つの態様において、抗原提示細胞による暴露は、１：１の比で行われる。各態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。

【0190】

本開示のＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける神経芽細胞腫（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｒｎａ）異種移植片内への浸潤物として生体内残留性を示す、持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を提供し、包含する。

【0191】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。１つの態様において、前記方法は、ドナーからＰＢＭＣを単離する工程、ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程、並びに、前記分離されたＮＫＴ細胞を少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程、をさらに提供する。その後、これらの細胞に、本明細書に記載の発現ベクターをトランスフェクションまたは形質導入し、培養することで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減されたＮＫＴ細胞を作製する。

【0192】

各態様において、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0193】

ある態様において、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞は、本明細書において提供されたように、好適な刺激物質（例えば、ａＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で１～２０日間増殖させられる。

【0194】

また、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することで、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製することを含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法、本開示に包含され、提供される。

【0195】

各態様において、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0196】

ある態様において、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、少なくともＣＡＲを含むように、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変することを含む。特定の態様において、ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、２つ以上のＣＡＲを発現するように、操作される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、およびＴＬＥ１からなる群から選択される、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現コンストラクトを導入することを含む。ある態様において、転写活性化因子は、１または複数のＣＡＲと組み合わせた、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、ＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である。

【0197】

メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、またはＣＤ４４ｖ６などのがん抗原を認識するＣＡＲの発現が、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法によって包含され、提供される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変するために導入されるがん抗原は、ＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される。別の態様において、ＣＡＲの抗体認識ドメインは、がん抗原ＣＤ１９を認識するものであった。１つの態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原はＧＤ２である。さらに別の態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原 ＧＰＣ３。発現コンストラクトを導入する方法は当該技術分野において公知である。態様または本開示において、遺伝子改変は、レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した方法を用いて、本開示のコンストラクトを導入することを包含し、提供する。

【0198】

また、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択される２種以上のがん抗原を認識する抗体認識ドメインを有する２つ以上のＣＡＲ分子を発現するように、ＮＫＴ細胞細胞を遺伝子改変する方法が、本開示によって包含され提供される。２つ以上のＣＡＲ分子を有するＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質を発現するためのコンストラクトをさらに含み、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１から選択される増殖因子を発現するための配列をさらに含んでよい。発現コンストラクトは別々に作製することもできるが、上記のようなＣＨＹＳＥＬ配列を有する１または複数のポリタンパク質発現コンストラクトとして作製することがより好都合である。ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、本開示の発現コンストラクトを導入することに先立ち、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を、増殖因子の存在下、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣでの刺激による培養によって、１～３日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、ａＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。

【0199】

ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下での培養によって、１～２０日間、２～２０日間、３～２０日間、４～２０日間、５～２０日間、６～２０日間、７～２０日間、８～２０日間、９～２０日間、１０～２０日間、１１～２０日間、１２～２０日間、１３～２０日間、または１４～２０日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様において、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞は、本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することに先立ち、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下の培養で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、または約１２日間、増殖させられる。

【0200】

ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法の１つの態様において、ＣＡＲ細胞外ドメイン配列は、抗体認識ドメインおよびスペーサードメインを含む。

【0201】

さらなる態様において、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された、得られた遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞またはａＡＰＣなどの抗原提示細胞の存在下での培養により、増殖させられ得る。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、集団の一部であり、その集団中の総細胞数が求められ、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と一緒に培養され、１０：１～１：１０の比で提供される。１つの態様において、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団中の総細胞数に対し、１：１の比で提供され得る。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、暴露前に単離される。他の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、混合集団の一部として培養される。１つの態様において、混合集団は、少なくとも１０％の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む。

【0202】

本明細書で提供されるように、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、各サイクルが一定期間を置いて実行される、３回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、３～２０回の培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、４回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、５回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、６回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、７回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、９回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。

【0203】

本開示が提供しているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも１日の培養期間の後に、繰り返し増殖させることができる。各態様において、増殖は、１～３日の期間を置いてから実行される。ある態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞または他の抗原提示細胞との培養によるサイクルを繰り返す前に、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、増殖させられる。

【0204】

本開示は、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書で提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞および非改変ＮＫＴ細胞の両方に対する選別とすることができ、選別された集団はさらなる培養および増殖に使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、非改変ＮＫＴ細胞および他の細胞型、通常はリンパ球、の両方を含む、混合細胞集団からの遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別である。選別された集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超える遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0205】

本開示は、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書において提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減されたＩ型ＮＫＴ細胞の選別と、それに続く増殖であり得る。

【0206】

本明細書中で提供された各態様において、選別されたＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超えるＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0207】

また、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖により、総細胞集団の少なくとも２０％を構成する集団を生成することが、提供され、包含される。１つの態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも２回の増殖後に総細胞集団の少なくとも２０％を構成する。

【0208】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製し、それにより遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団の１０％超を構成する細胞集団を生成する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞集団におけるＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法が、本開示において提供され、包含される。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0209】

ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞集団内でＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団の、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％を構成する。ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団の約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１０％～約３５％、約１０％～約４０％、約１０％～約４５％、約１０％～約５０％、約１０％～約５５％、約１０％～約６０％、約１０％～約６５％、約１０％～約７０％、約１０％～約７５％、約１０％～約８０％、約１０％～約８５％、約１０％～約９０％、約１０％～約９５％、約１０％～１００％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約１５％～約３５％、約１５％～約４０％、約１５％～約４５％、約１５％～約５０％、約１５％～約５５％、約１５％～約６０％、約１５％～約６５％、約１５％～約７０％、約１５％～約７５％、約１５％～約８０％、約１５％～約８５％、約１５％～約９０％、約１５％～約９５％、約１５％～１００％、約２０％～約２５％、約２０％～約３０％、約２０％～約３５％、約２０％～約４０％、約２０％～約４５％、約２０％～約５０％、約２０％～約５５％、約２０％～約６０％、約２０％～約６５％、約２０％～約７０％、約２０％～約７５％、約２０％～約８０％、約２０％～約８５％、約２０％～約９０％、約２０％～約９５％、約２０％～１００％、約２５％～約３０％、約２５％～約３５％、約２５％～約４０％、約２５％～約４５％、約２５％～約５０％、約２５％～約５５％、約２５％～約６０％、約２５％～約６５％、約２５％～約７０％、約２５％～約７５％、約２５％～約８０％、約２５％～約８５％、約２５％～約９０％、約２５％～約９５％、約２５％～１００％、約３０％～約３５％、約３０％～約４０％、約３０％～約４５％、約３０％～約５０％、約３０％～約５５％、約３０％～約６０％、約３０％～約６５％、約３０％～約７０％、約３０％～約７５％、約３０％～約８０％、約３０％～約８５％、約３０％～約９０％、約３０％～約９５％、約３０％～１００％、約３５％～約４０％、約３５％～約４５％、約３５％～約５０％、約３５％～約５５％、約３５％～約６０％、約３５％～約６５％、約３５％～約７０％、約３５％～約７５％、約３５％～約８０％、約３５％～約８５％、約３５％～約９０％、約３５％～約９５％、約３５％～１００％、約４０％～約４５％、約４０％～約５０％、約４０％～約５５％、約４０％～約６０％、約４０％～約６５％、約４０％～約７０％、約４０％～約７５％、約４０％～約８０％、約４０％～約８５％、約４０％～約９０％、約４０％～約９５％、約４０％～１００％、約４５％～約５０％、約４５％～約５５％、約４５％～約６０％、約４５％～約６５％、約４５％～約７０％、約４５％～約７５％、約４５％～約８０％、約４５％～約８５％、約４５％～約９０％、約４５％～約９５％、約４５％～１００％、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％を構成する。ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、総細胞集団の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％を構成する。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0210】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、その結果、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団のうちＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を１０％超含む細胞集団を生成する、ＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0211】

ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞集団内でＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％含む。ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％～約５５％、約５０％～約６０％、約５０％～約６５％、約５０％～約７０％、約５０％～約７５％、約５０％～約８０％、約５０％～約８５％、約５０％～約９０％、約５０％～約９５％、約５０％～１００％、約５５％～約６０％、約５５％～約６５％、約５５％～約７０％、約５５％～約７５％、約５５％～約８０％、約５５％～約８５％、約５５％～約９０％、約５５％～約９５％、約５５％～１００％、約６０％～約６５％、約６０％～約７０％、約６０％～約７５％、約６０％～約８０％、約６０％～約８５％、約６０％～約９０％、約６０％～約９５％、約６０％～１００％、約６５％～約７０％、約６５％～約７５％、約６５％～約８０％、約６５％～約８５％、約６５％～約９０％、約６５％～約９５％、約６５％～１００％、約７０％～約７５％、約７０％～約８０％、約７０％～約８５％、約７０％～約９０％、約７０％～約９５％、約７０％～１００％、約７５％～約８０％、約７５％～約８５％、約７５％～約９０％、約７５％～約９５％、約７５％～１００％、約８０％～約８５％、約８０％～約９０％、約８０％～約９５％、約８０％～１００％、約８５％～約９０％、約８５％～約９５％、約８５％～１００％、約９０％～約９５％、約９０％～１００％、または約９５％～１００％含む。ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または１００％含む。各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0212】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することでＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、前記改変ＮＫＴ細胞がある期間培養される、ＮＫＴ細胞集団内のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。１つの態様においては、培養期間を、約１～２日間、約１～３日間、約１～４日間、約１～５日間、約１～６日間、約１～７日間、約１～８日間、約１～９日間、約１～１０日間、約１～１１日間、約１～１２日間、約１～１３日間、約１～１４日間、約１～１５日間、約１～１６日間、約１～１７日間、約１～１８日間、約１～１９日間、約１～２０日間、約２～３日間、約２～４日間、約２～５日間、約２～６日間、約２～７日間、約２～８日間、約２～９日間、約２～１０日間、約２～１１日間、約２～１２日間、約２～１３日間、約２～１４日間、約２～１５日間、約２～１６日間、約２～１７日間、約２～１８日間、約２～１９日間、約２～２０日間、約３～４日間、約３～５日間、約３～６日間、約３～７日間、約３～８日間、約３～９日間、約３～１０日間、約３～１１日間、約３～１２日間、約３～１３日間、約３～１４日間、約３～１５日間、約３～１６日間、約３～１７日間、約３～１８日間、約３～１９日間、約３～２０日間、約４～５日間、約４～６、約４～７、約４～８、約４～９、約４～１０、約４～１１、約４～１２、約４～１３日間、約４～１４日間、約４～１５日間、約４～１６日間、約４～１７日間、約４～１８日間、約４～１９日間、約４～２０日間、約５～６日間、約５～７日間、約５～８日間、約５～９日間、約５～１０日間、約５～１１日間、約５～１２日間、約５～１３日間、約５～１４日間、約５～１５日間、約５～１６日間、約５～１７日間、約５～１８日間、約５～１９日間、約５～２０日間、約６～７日間、約６～８日間、約６～９日間、約６～１０日間、約６～１１日間、約６～１２日間、約６～１３日間、約６～１４日間、約６～１５日間、約６～１６日間、約６～１７日間、約６～１８日間、約６～１９日間、約６～２０日間、約７～８日間、約７～９日間、約７～１０日間、約７～１１日間、約７～１２日間、約７～１３、約７～１４、約７～１５、約７～１６、約７～１７、約７～１８、約７～１９日間、約７～２０日間、約８～９日間、約８～１０日間、約８～１１日間、約８～１２日間、約８～１３日間、約８～１４日間、約８～１５、日間 約８～１６日間、約８～１７日間、約８～１８日間、約８～１９日間、約８～２０日間、約９～１０日間、約９～１１日間、約９～１２日間、約９～１３日間、約９～１４日間、約９～１５、日間 約９～１６日間、約９～１７日間、約９～１８日間、約９～１９日間、約９～２０日間、約１０～１１日間、約１０～１２日間、約１０～１３日間、約１０～１４日間、約１０～１５日間、約１０～１６日間、約１０～１７日間、約１０～１８日間、約１０～１９日間、約１０～２０日間、約１１～１２日間、約１１～１３日間、約１１～１４日間、約１１～１５日間、約１１～１６日間、約１１～１７日間、約１１～１８日間、約１１～１９日間、約１１～２０日間、約１２～１３日間、約１２～１４日間、約１２～１５日間、約１２～１６日間、約１２～１７日間、約１２～１８日間、約１２～１９日間、約１２～２０日間、約１３～１４日間、約１３～１５日間、約１３～１６日間、約１３～１７日間、約１３～１８日間、約１３～１９日間、約１３～２０日間、約１４～１５日間、約１４～１６日間、約１４～１７日間、約１４～１８日間、約１４～１９日間、約１４～２０日間、約１５～１６日間、約１５～１７日間、約１５～１８日間、約１５～１９日間、約１５～２０日間、約１６～１７日間、約１６～１８日間、約１６～１９日間、約１６～２０日間、約１７～１８日間、約１７～１９日間、約１７～２０日間、約１８～１９日間、約１８～２０日間、または約１９～２０日間とすることで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0213】

各態様において、ＮＫＴ細胞を改変する工程を含む、ＮＫＴ細胞集団内のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団から所望の細胞を分離することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、ＣＤ６２Ｌの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別されたＣＤ６２Ｌ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、４－１ＢＢの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別された４－１ＢＢ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。

【0214】

本開示は、ドナーから新鮮ＰＢＭＣを単離する工程、培養に先立ちＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程、少なくともαＧａｌＣｅｒ、および増殖因子の存在下で、少なくとも１日間、前記分離ＮＫＴ細胞を増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程を含む、ＮＫＴ細胞集団内のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。１つの態様において、増殖因子は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせを含む。１つの態様において、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程は、抗ＮＫＴミクロビーズを用いてＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む。

【0215】

本開示のＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製する方法は、抗原提示細胞による暴露で少なくとも２倍にさらに増殖させることができる、遺伝子改変細胞集団を作製すること、を提供し、包含する。１つの態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。各態様において、抗原提示細胞は、１０：１比～１：１０比の割合で与えられる。１つの態様において、抗原提示細胞による暴露は、１：１の比で行われる。各態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。

【0216】

本開示のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける神経芽細胞腫異種移植片内への浸潤物としての生体内残留性を示す、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を提供し、包含する。

【0217】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、改変ＮＫＴ細胞を培養することで、セントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様において、前記方法は、ドナーからＰＢＭＣを単離する工程と、ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程と、分離ＮＫＴ細胞を、少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で、少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程と、をさらに提供する。その後、これらの細胞に、本明細書に記載の発現ベクターをトランスフェクションまたは形質導入し、培養することで、セントラルメモリー特性を有するＮＫＴ細胞が作製される。

【0218】

各態様において、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0219】

ある態様において、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞は、本明細書において提供されたように、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で１～２０日間増殖させられる。

【0220】

また、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することで、遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製することを含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法が、本開示に包含され、提供される。

【0221】

各態様において、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現を提供し、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子としては、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、およびＴＬＥ１（Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）が挙げられるが、これらに限定はされない。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、ＬＥＦ１をコードする発現コンストラクトを含む。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＬＥＦ１および増殖因子を発現する。１つの態様において、発現コンストラクトは、ＩＬ－１５、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される増殖因子をさらにコードする。

【0222】

ある態様において、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、少なくともＣＡＲを含むように、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変することを含む。特定の態様において、ＮＫＴ細胞は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現と組み合わせて、２つ以上のＣＡＲを発現するように、操作される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（ＣＴＮＮＢ１）、Ｓｍａｄ３、およびＴＬＥ１からなる群から選択される、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子の発現コンストラクトを導入することを含む。ある態様において、転写活性化因子は、１または複数のＣＡＲと組み合わせた、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、ＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である。

【0223】

メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、メラノーマ優先発現抗原（ＰＲＡＭＥ）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、またはＣＤ４４ｖ６などのがん抗原を認識するＣＡＲの発現が、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法によって包含され、提供される。１つの態様において、ＮＫＴ細胞を遺伝子改変するために導入されるがん抗原は、ＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される。別の態様において、ＣＡＲの抗体認識ドメインは、がん抗原ＣＤ１９を認識するものであった。１つの態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原はＧＤ２である。さらに別の態様において、抗体認識ドメインによって認識されるがん抗原 ＧＰＣ３。発現コンストラクトを導入する方法は当該技術分野において公知である。態様または本開示において、遺伝子改変は、レトロウイルスまたはレンチウイルスを介した方法を用いて、本開示のコンストラクトを導入することを包含し、提供する。

【0224】

また、ＭＡＧＥ、ＰＲＡＭＥ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、κ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＣＤ３８、ＣＤ１３８、ＲＯＲｌ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３／４、ＥＧＦｒ ｖＩＩＩ、癌胎児抗原、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＨＥＲ２、メソテリン、ＴＡＧ７２、ＰＳＭＡ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、Ｂ７－Ｈ６、ＩＬ－１３受容体ａ２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＣＡ９、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＭＷ－ＭＡＡ、ＣＤ１７１、ルイスＹ、Ｇ２５０／ＣＡＩＸ、ＨＬＡ－ＡＩ ＭＡＧＥ Ａｌ、ＨＬＡ－Ａ２ ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＰＳＣ１、葉酸受容体－α、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、８Ｈ９、ＮＣＡＭ、ＶＥＧＦ受容体、５Ｔ４、胎児型ＡｃｈＲ、およびＣＤ４４ｖ６からなる群から選択される２種以上のがん抗原を認識する抗体認識ドメインを有する２つ以上のＣＡＲ分子を発現するように、ＮＫＴ細胞細胞を遺伝子改変する方法が、本開示によって包含され提供される。２つ以上のＣＡＲ分子を有するＮＫＴ細胞の遺伝子改変は、Ｗｎｔシグナル経路タンパク質を発現するためのコンストラクトをさらに含み、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、およびＩＬ－２１から選択される増殖因子を発現するための配列をさらに含んでよい。発現コンストラクトは別々に作製することもできるが、上記のようなＣＨＹＳＥＬ配列を有する１または複数のポリタンパク質発現コンストラクトとして作製することがより好都合である。ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法は、本開示の発現コンストラクトを導入することに先立ち、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を、増殖因子の存在下、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣでの刺激による培養によって、１～３日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様においては、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞を、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下で、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、少なくとも７日間、少なくとも８日間、少なくとも９日間、少なくとも１０日間、少なくとも１１日間、少なくとも１２日間、少なくとも１３日間、少なくとも１４日間、少なくとも１５日間、少なくとも１６日間、少なくとも１７日間、少なくとも１８日間、少なくとも１９日間、または少なくとも２０日間、増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する。

【0225】

ＮＫＴ細胞に本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することを含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、対象からＰＭＢＣを単離することと、ＮＫＴ細胞を単離することと、ＮＫＴ細胞を好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下での培養によって、１～２０日間、２～２０日間、３～２０日間、４～２０日間、５～２０日間、６～２０日間、７～２０日間、８～２０日間、９～２０日間、１０～２０日間、１１～２０日間、１２～２０日間、１３～２０日間、または１４～２０日間増殖させることと、をさらに含んでよい。ある態様において、本開示の方法によって分離されたＮＫＴ細胞は、本明細書に記載の発現コンストラクトを導入することに先立ち、好適な刺激物質（例えば、αＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１）の存在下の培養で、約１日間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、または約１２日間、増殖させられる。

【0226】

ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法の１つの態様において、ＣＡＲ細胞外ドメイン配列は、抗体認識ドメインおよびスペーサードメインを含む。

【0227】

さらなる態様において、セントラルメモリー特性を有する、得られた遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞またはａＡＰＣなどの抗原提示細胞の存在下での培養により、増殖させられ得る。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、集団の一部であり、その集団中の総細胞数が求められ、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と一緒に培養され、１０：１～１：１０の比で提供される。１つの態様において、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団中の総細胞数に対し、１：１の比で提供され得る。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、暴露前に単離される。他の態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、混合集団の一部として培養される。１つの態様において、混合集団は、少なくとも１０％の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む。

【0228】

本明細書で提供されるように、セントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、各サイクルが一定期間を置いて実行される、３回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、３～２０回の培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、４回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、５回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、６回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、７回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。１つの態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、９回を超える培養サイクルに亘り、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞などの抗原提示細胞と培養した後に、少なくとも２倍に増殖する能力を保持する。

【0229】

本開示が提供しているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも１日の培養期間の後に、繰り返し増殖させることができる。各態様において、増殖は、１～３日の期間を置いてから実行される。ある態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞または他の抗原提示細胞との培養によるサイクルを繰り返す前に、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、増殖させられる。

【0230】

本開示は、セントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書で提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞および非改変ＮＫＴ細胞の両方に対する選別とすることができ、選別された集団はさらなる培養および増殖に使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、非改変ＮＫＴ細胞および他の細胞型、通常はリンパ球、の両方を含む、混合細胞集団からの遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別である。選別された集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超える遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0231】

本開示は、セントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞を複数含む細胞集団に対して、１または複数の選別を行うことを、さらに提供する。本明細書において提供されているように、遺伝子改変ＮＫＴ細胞細胞の選別は、セントラルメモリー特性を有するＩ型ＮＫＴ細胞の選別と、それに続く増殖であり得る。

【0232】

本明細書中で提供された各態様において、選別されたＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、さらなる培養と増殖回数の追加のために、使用される。各態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の選別および増殖は、複数回、最大で２０回、行うことができる。本開示の方法は、これにより、１００万倍を超えるＩ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖を提供する。各態様において、上記方法は、少なくとも３回の選別および増殖を提供する。本開示はさらに、少なくとも４回、少なくとも５回、および少なくとも６回の選別および増殖を提供し、包含する。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも７回選別および増殖される。さらなる態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、８回、９回、またはそれ以上の回数、選別および増殖される。

【0233】

また、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞の増殖により、総細胞集団の少なくとも２０％を構成する集団を生成することが、提供され、包含される。１つの態様において、Ｉ型遺伝子改変ＮＫＴ細胞は、少なくとも２回の増殖後に総細胞集団の少なくとも２０％を構成する。

【0234】

Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製し、それにより遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団の１０％超を構成する細胞集団を生成する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法が、本開示において提供され、包含される。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0235】

ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞集団内のセントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～９８％、１０％～９９％、および最大１００％を構成し、非改変ＮＫＴ細胞は総集団のうちの９９．９％未満を構成する。各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0236】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することで持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、その結果、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団のうちＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を１０％超含む細胞集団を生成する、ＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法を提供し、包含する。各態様において、１０％超の持続的な発現能を有する遺伝子改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞を含む。各態様において、総集団は、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む。各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0237】

ある態様において、本開示のＮＫＴ細胞集団内のセントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％含む。ある態様において、本開示のセントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団は、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～９８％、５０％～９９％、および最大１００％を構成し、非改変ＮＫＴ細胞は、総集団のうちの９９．９％未満を構成する 各態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0238】

本開示は、Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と、その改変ＮＫＴ細胞を培養することでセントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、を含み、前記改変ＮＫＴ細胞がある期間培養される、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様において、培養期間は１～２０日間である。各態様において、培養期間は、１～２日間、１～３日間、１～４日間、１～５日間、１～６日間、１～７日間、１～８日間、１～９日間、１～１０日間、１～１１日間、および１～１２日間である 各態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲをさらに発現する。他の態様において、改変ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲおよび外来性増殖因子を発現する。

【0239】

各態様において、ＮＫＴ細胞を改変する工程を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団から所望の細胞を分離することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、ＣＤ６２Ｌの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別されたＣＤ６２Ｌ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。１つの態様において、前記方法は、４－１ＢＢの発現により改変ＮＫＴ細胞を分離することで、選別された４－１ＢＢ（＋）遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を生成することをさらに含む。

【0240】

本開示は、ドナーから新鮮ＰＢＭＣを単離する工程、培養に先立ちＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程と、少なくともαＧａｌＣｅｒ、および増殖因子の存在下で、少なくとも１日間、前記分離ＮＫＴ細胞を増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程と、を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法を提供し、包含する。１つの態様において、増殖因子は、ＩＬ－７、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせを含む。１つの態様において、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程は、抗ＮＫＴミクロビーズを用いてＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む。

【0241】

本開示のセントラルメモリー特性を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞を作製する方法は、抗原提示細胞による暴露で少なくとも２倍にさらに増殖させることができる、遺伝子改変細胞集団を作製すること、を提供し、包含する。１つの態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。各態様において、抗原提示細胞は、１０：１比～１：１０比の割合で与えられる。１つの態様において、抗原提示細胞による暴露は、１：１の比で行われる。各態様において、抗原提示細胞は、ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞である。

【0242】

本開示のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法は、ヒト化ＮＳＧマウスにおける神経芽細胞腫異種移植片内への浸潤物としての生体内残留性を示す、セントラルメモリー特性 遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を提供し、包含する。


実施形態
実施形態１
Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む、遺伝子改変ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞。
実施形態２
前記発現コンストラクトが、前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列と、最大３つの追加のタンパク質コード配列と、を含むポリタンパク質をコードする、実施形態１に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態３
前記ＮＫＴ細胞がＩ型ＮＫＴ細胞である、実施形態１または実施形態２に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態４
ＣＤ６２Ｌ陽性（ＣＤ６２Ｌ＋）細胞である、実施形態１～３のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態５
ＣＤ４、ＣＤ２８、４－１ＢＢ、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＣＲ７、ＯＸ４０、およびこれらの組み合わせからなる群から選択されるマーカーの発現が陽性である、実施形態１～４のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態６
ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、およびＰＤ－１の発現レベルが低い、実施形態１～５のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態７
ＣＤ１６１、ＣＤ５６、ＣＤ２４４、ＴＩＭ－３、ＬＡＧ－３、ＴＣＦ１、およびＰＤ－１の発現が陽性である、実施形態１～６のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態８
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列と、最大３つの追加のタンパク質コード配列とが、自律的リボソーム内自己プロセシングペプチドによって隔てられている、実施形態１～７のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態９
前記自律的リボソーム内自己プロセシングが口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列または関連のシス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）である、実施形態８に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１０
前記転写活性化因子が、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、およびＴＬＥファミリーメンバー１転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）からなる群から選択される、実施形態１～９のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１１
前記ＬＥＦ１が、参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択される、実施形態１０の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１２
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトをさらに含む、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１３
前記キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ががん抗原を認識する抗原認識ドメインを含む、実施形態１２に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１４
前記がん抗原がＣＤ１９、ＧＤ２、およびＧＰＣ３からなる群から選択される、実施形態１３の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１５
前記ポリタンパク質のタンパク質配列がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）のタンパク質コード配列をさらに含む、実施形態２に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１６
前記ポリタンパク質のタンパク質配列が増殖因子のタンパク質コード配列を少なくとも１つさらに含む、実施形態１５に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１７
前記増殖因子がＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１、またはこれらの組み合わせである、実施形態１６に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１８
前記増殖因子がインターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－２１（ＩＬ－２１）、およびインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）からなる群から選択される、実施形態１６に記載の遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態１９
Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする発現コンストラクトを含む複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞を含む細胞集団。
実施形態２０
Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、または非改変細胞を含む細胞をさらに含む、実施形態１９に記載の細胞集団。
実施形態２１
前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団の１０％超である、実施形態１９または実施形態２０に記載の細胞集団。
実施形態２２
前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞が総細胞集団の２５％～３０％である、実施形態２１に記載の細胞集団。
実施形態２３
前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも５０％含む、実施形態１９～２２のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２４
前記複数の遺伝子改変ＮＫＴ細胞の少なくとも３０パーセントがＬＥＦ１を発現する、実施形態１９～２３のいずれか１つに記載の細胞集団。［図３ｂ］
実施形態２５
治療有効量の、実施形態１９～２４のいずれか１つに記載の細胞集団。
実施形態２６
（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む、キメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態２７
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子が、リンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、もしくは転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、実施形態２６に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態２８
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がＬＥＦ１である、実施形態２６に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態２９
前記ＣＡＲコード配列および前記転写活性化因子配列がインフレームであり、前記ＣＡＲと前記ＬＥＦ１コード配列との間に口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに含む、実施形態２６～２８のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３０
前記ＣＡＲコード配列および前記ＬＥＦ１コード配列がインフレームであり、前記ＣＡＲと前記ＬＥＦ１コード配列との間に口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに含む、実施形態２８に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３１
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって隔てられたインフレームのインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）コード配列をさらに含む、実施形態２６～３０のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３２
第２の口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列をさらに含む、実施形態３１に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３３
前記細胞外ドメイン配列が抗原認識ドメインおよびスペーサードメインを含む、実施形態２６～３２のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３４
前記抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、実施形態３３に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３５
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ配列またはＦＭＤＶ ２Ａ関連シス作用性ヒドロラーゼエレメント（ＣＨＹＳＥＬ）配列によって隔てられた追加のタンパク質のインフレームコード配列をさらに含む、実施形態２６～３４のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３６
前記抗原認識ドメインがＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態３４に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３７
前記抗原認識ドメインがＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来の単鎖可変領域フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む、実施形態３４に記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３８
前記細胞内ドメインがＣＤ３－ζ鎖にインフレーム融合された４－１ＢＢというシグナル配列を含む、実施形態２６～３７のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクト。
実施形態３９
実施形態２６～３８のいずれか１つに記載のキメラ抗原受容体発現コンストラクトを含む、遺伝子改変ＮＫＴ細胞。
実施形態４０
Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程と；
前記改変ＮＫＴ細胞を培養することで、持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程と、
を含む、ＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法。
実施形態４１
前記改変が、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、前記ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することを含む、実施形態４０に記載のＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法。
実施形態４２
前記細胞外ドメイン配列が抗原認識ドメインおよびスペーサードメインを含む、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４３
前記抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、実施形態４２に記載の方法。
実施形態４４
前記改変がレトロウイルスまたはレンチウイルスを用いて前記タンパク質発現コンストラクトを形質導入することを含む、実施形態４０～４３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４５
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がリンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、実施形態４０～４４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４６
前記Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子が参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である、実施形態４１に記載の方法。
実施形態４７
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１回目の暴露によって少なくとも２倍に増殖させることをさらに含む、実施形態４０～４６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態４８
前記増殖が、ある期間を置いて、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１または複数のさらなる暴露によって繰り返される、実施形態４７に記載の方法。
実施形態４９
前記期間が１日毎～３日毎である、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５０
前記増殖がさらに２～９回繰り返され、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が持続的な発現能を有するＮＫＴ細胞集団である、実施形態４８に記載の方法。
実施形態５１
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団に対し選別を行って、分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製することをさらに含む、実施形態４０～５０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５２
前記分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＩ型ＮＫＴ細胞である、実施形態５１に記載の方法。
実施形態５３
前記Ｉ型ＮＫＴ細胞が総細胞集団の少なくとも２０％を構成する、実施形態５２に記載の方法。
実施形態５４
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の１０％超を構成する、実施形態４０～５３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５５
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む、実施形態４０～５４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５６
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の５０％超を構成する、実施形態４０～５５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５７
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも１０％含む、実施形態４０～５６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５８
ＣＤ６２Ｌの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態４０～５７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態５９
４－１ＢＢの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態４０～５８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６０
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が、ヒト化ＮＳＧマウスにおける神経芽細胞腫異種移植片内への浸潤物として生体内残留性を示す、実施形態４０～５９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６１
ａ．ドナーからＰＢＭＣを単離する工程；
ｂ．前記ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程；並びに
ｃ．前記分離されたＮＫＴ細胞を少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程、
をさらに含む、実施形態４０～６０のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞の増殖能を維持する方法。
実施形態６２
前記増殖後の集団が培養１２～１４日目に得られる、実施形態６１に記載の方法。
実施形態６３
前記増殖後の遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を、１：１比のＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞による暴露によって少なくとも２倍にさらに増殖させることができる、実施形態６１および実施形態６２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６４
前記分離されたＮＫＴ細胞を、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせをさらに含む培地中で増殖させること、実施形態６１～６３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６５
抗ＮＫＴミクロビーズを用いて、前記ＮＫＴ細胞が前記ＰＢＭＣから分離される、実施形態６１～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６
前記細胞を改変前に３日間増殖させる、実施形態６１～６５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７
前記ＮＫＴ細胞を１０～２０日間増殖させる、実施形態６１～６６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６８
前記分離されたＮＫＴ細胞および前記改変ＮＫＴ細胞の前記合計培養時間が２０日間未満である、実施形態６１～６７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６９
Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子を含むタンパク質コード配列を少なくとも発現するようにＮＫＴ細胞を改変する工程；および
前記改変ＮＫＴ細胞を培養することで、ＮＫＴ細胞の疲弊が低減された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程、
を含む、ＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７０
前記改変が、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、前記ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することを含む、実施形態６９に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７１
前記細胞外ドメイン配列が抗原認識ドメインおよびスペーサードメインを含む、実施形態７０に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７２
前記抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、実施形態７１に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７３
前記改変がレトロウイルスまたはレンチウイルスを用いて前記タンパク質発現コンストラクトを形質導入することを含む、実施形態６９～７２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７４
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がリンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、実施形態６９～７３のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７５
前記Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子が参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である、実施形態６９～７４のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７６
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１回目の暴露によって少なくとも２倍に増殖させることをさらに含む、実施形態６９～７５のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７７
前記増殖が、ある期間を置いて、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１または複数のさらなる暴露によって繰り返される、実施形態７６に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７８
前記期間が１日毎～３日毎である、実施形態７７に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態７９
前記増殖がさらに２～９回繰り返され、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が持続的な発現能を有するＮＫＴ細胞集団である、実施形態７７に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８０
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団に対し選別を行って、分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製することをさらに含む、実施形態６９～７９のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８１
前記分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＩ型ＮＫＴ細胞である、実施形態８０に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８２
前記Ｉ型ＮＫＴ細胞が総細胞集団の少なくとも２０％を構成する、実施形態８１に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８３
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の１０％超を構成する、実施形態６９～８２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８４
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む、実施形態６９～８３のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８５
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の５０％超を構成する、実施形態６９～８４のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８６
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも１０％含む、実施形態６９～８５のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８７
ＣＤ６２Ｌの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態６９～８６のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８８
４－１ＢＢの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態６９～８７のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態８９
ａ．ドナーからＰＢＭＣを単離する工程；
ｂ．前記ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程；並びに
ｃ．前記分離されたＮＫＴ細胞を少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程、
をさらに含む、実施形態６９～８８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９０
前記増殖後の集団が培養１２～１４日目に得られる、実施形態８９に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９１
抗ＮＫＴミクロビーズを用いて、前記ＮＫＴ細胞が前記ＰＢＭＣから分離される、実施形態８９または実施形態９０に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９２
前記分離されたＮＫＴ細胞を、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせをさらに含む培地中で増殖させること、実施形態８９～９１のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９３
前記細胞を改変前に３日間増殖させる、実施形態８９～９２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９４
前記ＮＫＴ細胞を１０～２０日間増殖させる、実施形態８９～９３のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９５
前記分離されたＮＫＴ細胞および前記改変ＮＫＴ細胞の前記合計培養時間が２０日間未満である、実施形態９４に記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態９６
Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子であるタンパク質をコードする配列を発現するように、発現コンストラクトでＮＫＴ細胞を改変する工程；
前記改変ＮＫＴ細胞を培養することで、前記転写活性化因子を発現させる工程；並びに
反復的な暴露後にセントラルメモリーＮＫＴ細胞の特性である増殖能および細胞毒性を保持する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製する工程、
を含む、ＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態９７
前記発現コンストラクトがキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする配列をさらに含み、前記ＣＡＲが細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含む、実施形態９６に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態９８
前記細胞外ドメイン配列が抗原認識ドメインおよびスペーサードメインを含む、実施形態９７に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態９９
前記抗原認識ドメインがＣＤ１９、ＧＤ２、またはＧＰＣ３から選択される抗原に結合する、実施形態９８に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１００
前記改変がレトロウイルスまたはレンチウイルスを用いて前記タンパク質発現コンストラクトを形質導入することを含む、実施形態９６～９９のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞集団中のＮＫＴ細胞の疲弊を低減する方法。
実施形態１０１
前記Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子がリンパ系エンハンサー結合因子１（ＬＥＦ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ５１１７６）、βカテニン（（ＣＴＮＮＢ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ １４９９））、Ｓｍａｄ３（Ｇｅｎｅ ＩＤ ４０８８）、ＨＮＦ１ホメオボックスＡ（ＨＮＦ１Ａ、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９２７（別名ＴＣＦ１）、転写因子７（ＴＣＦ７、Ｇｅｎｅ ＩＤ：６９３２（別名ＴＣＦ１）、またはＴＬＥファミリーメンバー１、転写コリプレッサー（ＴＬＥ１、Ｇｅｎｅ ＩＤ ７０８８）を含む、実施形態９６～１００のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０２
前記Ｗｎｔシグナル経路の転写活性化因子が参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）ＩＤ番号：ＮＰ＿０５７３５３．１、ＮＰ＿００１１２４１８５．１、およびＮＰ＿００１１２４１８６．１からなる群から選択されるＬＥＦ１である、実施形態１０１に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０３
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１回目の暴露によって少なくとも２倍に増殖させることをさらに含む、実施形態９６～１０２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０４
前記増殖が、ある期間を置いて、１：１比のＣＤ１＋Ｊ３２白血病細胞による１または複数のさらなる暴露によって繰り返される、実施形態１０３に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０５
前記期間が１日毎～３日毎である、実施形態１０４に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０６
前記増殖がさらに２～９回繰り返され、前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が持続的な発現能を有するＮＫＴ細胞集団である、実施形態１０５に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０７
前記遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団に対し選別を行って、分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団を作製することをさらに含む、実施形態９６～１０６のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０８
前記分離された遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＩ型ＮＫＴ細胞である、実施形態１０７に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１０９
前記Ｉ型ＮＫＴ細胞が総細胞集団の少なくとも２０％を構成する、実施形態１０８に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１０
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の１０％超を構成する、実施形態９６～１０９のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１１
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が、Ｉ型ＮＫＴ細胞、ＩＩ型ＮＫＴ細胞、照射ＰＢＭＣ細胞、非ＮＫＴ細胞、および非改変細胞を含む、実施形態９６～１１０のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１２
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団が総細胞集団の５０％超を構成する、実施形態９６～１１１のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１３
前記持続的な発現能を有する遺伝子改変ＮＫＴ細胞集団がＣＤ６２Ｌ（＋）ＮＫＴ細胞を少なくとも１０％含む、実施形態９６～１１２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１４
ＣＤ６２Ｌの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態９６～１１３のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１５
４－１ＢＢの発現によって前記改変ＮＫＴ細胞を分離することをさらに含む、実施形態９６～１１４のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１６
前記改変が、（ａ）細胞外ドメイン配列、膜貫通ドメイン配列、および細胞内ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）コード配列と、（ｂ）Ｗｎｔシグナル経路における転写活性化因子のタンパク質配列をコードする配列と、を含む発現コンストラクトを、前記ＮＫＴ細胞にトランスフェクトまたは形質導入することを含む、実施形態９６～１１５のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１７
a.ドナーからＰＢＭＣを単離する工程；
ｂ．前記ＰＢＭＣからＮＫＴ細胞を分離する工程；並びに
ｃ．前記分離されたＮＫＴ細胞を少なくともαＧａｌＣｅｒ、ＩＬ－２、およびＩＬ－２１の存在下で少なくとも１日間増殖させることで、遺伝子改変用のＮＫＴ細胞を準備する工程、
をさらに含む、実施形態９６～１１６のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１８
前記増殖後の集団が培養１２～１４日目に得られる、実施形態１１７に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１１９
前記分離されたＮＫＴ細胞を、ＩＬ－７、ＩＬ－１５、ＩＬ－１２、ＩＬ－２１、ＴＮＦ－α、またはこれらの組み合わせをさらに含む培地中で増殖させること、実施形態１１７または実施形態１１８に記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１２０
前記細胞を改変前に３日間増殖させる、実施形態１１７～１１９のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１２１
前記ＮＫＴ細胞を１０～２０日間増殖させる、実施形態１１７～１２０のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１２２
前記分離されたＮＫＴ細胞および前記改変ＮＫＴ細胞の前記合計培養時間が２０日間未満である、実施形態１１７～１２１のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。
実施形態１２３
抗ＮＫＴミクロビーズを用いて、前記ＮＫＴ細胞が前記ＰＢＭＣから分離される、実施形態１１７～１２２のいずれか１つに記載のＮＫＴ細胞におけるセントラルメモリー特性を維持する方法。

【0243】

ある特定の実施形態を参照しながら本開示を説明してきたが、本開示の範囲から逸脱しないように、特定の状況に適合するように、種々の変更を行ってよく、均等物をその要素と置き換えてよいことは、当業者には理解されことである。したがって、本開示は、本開示を実施するために企図された最良の形態として、開示された特定の実施形態に限定されず、本開示は、添付の特許請求の範囲の範囲および精神に含まれる全ての実施形態を包含することが、意図される。

【0244】

本明細書で引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照によって本明細書に援用される。

【実施例】

【0245】

実施例１：材料および方法
細胞株
Ｋ５６２細胞、Ｄａｕｄｉ細胞、Ｒａｊｉ細胞、Ｒａｍｏｓ細胞、および２９３Ｔ細胞は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（マナッサス、バージニア州）から購入されている。ＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞という細胞株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（マナッサス、バージニア州）から購入されている。全ての株は、ＲＰＭＩ（ハイクローン社（ＨｙＣｌｏｎｅ）、ローガン、ユタ州）中で培養されている。培地は、１０％ＦＢＳ（ライフテクノロジーズ社、カールズバッド、カリフォルニア州）および２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）－Ｉ（ギブコ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を添加されている。廃棄臍帯血ＮＫＴ細胞は、ＭＤアンダーソンがんセンター臍帯血バンクから入手されており、ＭＤアンダーソンがんセンターおよびベイラー医科大学の治験審査委員会によって承認されたプロトコルに従って使用されている。

【0246】

Ｋ５６２細胞株のＢ－８－２クローンは、以前に我々の研究室で得られたものである（Ｔｉａｎ ｅｔ ａｌ．， “ＣＤ６２Ｌ＋ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｈａｖｅ ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ ａｎｔｉｔｕｍｏｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｊ Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ １２６， ２３４１－２３５５ （２０１６））。ＣＨＬＡ－２５５細胞株およびＪｕｒｋａｔ Ｊ３２細胞株は前述の通りのものである（Ｓｅｅｇｅｒ ｅｔ ａｌ．， “Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ， ｇｒｏｗｔｈ， ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｐａｔｔｅｒｎ ａｎｄ ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｔｉｃ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｗｏ ｎｅｗ ｈｕｍａｎ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，” Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ３７， １３６４－１３７１ （１９７７）およびＭａｋｎｉ ｅｔ ａｌ．， “Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ ａｃｔｉｖｅ ｓｕｒｆａｃｅ ＣＤ２ ｂｙ ＤＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ＣＤ２－ＣＤ３＋ Ｊｕｒｋａｔ ｃｅｌｌｓ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ＣＤ３－Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＩＬ－２ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，” Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １４６， ２５２２－２５２９ （１９９１））。ＣＨＬＡ－２５５および２９３ＴはＩＭＤＭ（ハイクローン社）中で培養され、他の全ての株はＲＰＭＩ１６４０（ハイクローン社）中で維持された。２０％ＦＢＳで培養が行われたＣＨＬＡ－２５５培地を除いて、細胞培地は２ｍＭのＧｌｕｔａＭＡＸ－Ｉ（ライフテクノロジーズ社）および１０％ＦＢＳ（ハイクローン社）を添加された。
レトロウイルスコンストラクトおよびレトロウイルス生成

【0247】

ＣＡＲ．ＣＤ１９コンストラクトおよびＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを、以前の報告のように作製する（Ｈｅｃｚｅｙ ｅｔ ａｌ．， （２０１４）； Ｐｕｌｅ ｅｔ ａｌ．， ２００５； ａｎｄ Ｘｕ ｅｔ ａｌ．， “ＮＫＴ Ｃｅｌｌｓ Ｃｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ ａ ＧＤ２－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｃｈｉｍｅｒｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ ａｎｄ ＩＬ１５ Ｓｈｏｗ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｃｅ ａｎｄ Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ Ａｃｔｉｖｉｔｙ ａｇａｉｎｓｔ Ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ，” Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ２５， ７１２６－７１３８ （２０１９））。これらのコンストラクトは、ＣＤ１９特異的抗体ＦＭＣ－６３またはＧＤ２特異的抗体１４Ｇ２ａ由来のｓｃＦｖを含有し、それが、ＩｇＧｌヒンジ領域由来の短スペーサーを介して、ＣＤ８ａ由来の膜貫通ドメインに連結され、その後に、ＣＤ３ζシグナル伝達鎖と融合した４－１ＢＢのシグナル伝達細胞内ドメインが続くものであった。追加のコンストラクトを図２７に示すが、これらは、口蹄疫ウイルス由来の２Ａ配列ペプチドを用いてヒトＬＥＦ１のロング型アイソフォームをコードする配列に連結された表示の遺伝子をさらに含む。図２７ａ～ｄはＣＡＲ．ＧＤ２ ＬＥＦ１コンストラクトを図示している。

【0248】

以前の報告のように、２９３Ｔ細胞に、キメラ抗原を含有するプラスミド、ＲＤ１１４エンベロープをコードするＲＤＦプラスミド、およびＭｏＭＬＶ Ｇａｇ－ＰｏｌをコードするＰｅｇＰａｍ３プラスミドの組み合わせをトランスフェクトすることによりレトロウイルス上清を作製する（Ｖｅｒａ ｅｔ ａｌ．， “Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｋａｐｐａ ｌｉｇｈｔ ｃｈａｉｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ ｋｉｌｌ ｍａｔｕｒｅ Ｂ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｍａｌｉｇｎａｎｔ ｃｅｌｌｓ，” Ｂｌｏｏｄ １０８（１２）：３８９０－３８９７ （２００６））。

【0249】

表示されているように、ＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトは、ＬＥＦ１を、ＣＤ３ζの下流に、ｐ２Ａ配列に隔てられて、含む。非ＣＡＲレトロウイルスコンストラクトは、ＧＦＰ．ホタルルシフェラーゼ（ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ）およびＧＦＰ．ＬＥＦ１を含み、これは、形質導入マーカーとしてのＧＦＰと、ｐ２Ａ配列によってそれと隔てられた過剰発現標的タンパク質とからなる。７－ＴＧＣ Ｗｎｔレポーターコンストラクトをコードするレンチウイルスコンストラクトは、Ｊ．Ｒｏｓｅｎ博士およびＫ．Ｒｏａｒｔｙ博士（ベイラー医科大学（ＢＣＭ））からの好意による贈与品であり、エンベローププラスミドｐＭＤ２．Ｇおよびパッキングプラスミドδ８．２は、Ｋ．Ｓｃｏｔｔ博士およびＹ．－Ｈ．Ｔｓａｎｇ博士（ＢＣＭ）からの好意による贈与品である。レンチウイルス上清を、関連のレンチウイルスコンストラクトであるｐＭＤ２．Ｇおよびδ８．２でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞から作製する。導入効率を高めるため、製造業者のプロトコルに従ってＲｅｔｒｏ－Ｘ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（タカラ・バイオ社（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ））を用いて、レンチウイルス上清を濃縮する。
ＮＫＴ細胞の単離、形質導入、増殖、および選別

【0250】

健常ドナー（少なくとも１８歳）のＰＢＭＣは、メキシコ湾地域血液センター（Ｇｕｌｆ Ｃｏａｓｔ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ）から購入したバフィーコートから勾配遠心分離により単離される。ＮＫＴは、抗ｉＮＫＴミクロビーズ（ミルテニーバイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ））によって純化される。ネガティブＰＢＭＣ画分は、照射（４０Ｇｙ）され、分注される。ＮＫＴは、１００ｎｇ／ｎｉＬのαＧａｌＣｅｒ（協和発酵キリン社）でパルスされた一定分量の自己ＰＢＭＣで刺激される。組換えＩＬ－２（２００Ｕ／ｍｌ、国立がん研究所、フレデリック）が、完全ＲＰＭＩ（ハイクローン社製ＲＰＭＩ１６４０、１０％熱不活化ウシ胎児血清および２ｍＭ ＧｌｕｔａＭＡＸ）中で、一日おきに加えられる。ＮＫＴは、１０日間培養された後、自己ＰＢＭＣ（４０Ｇｙを照射）か、または、表示されている場合はａＡＰＣとしてのＲａｍｏｓ細胞（１００Ｇｙを照射）で、再刺激される。再刺激後３日目に、２４ウェル非組織培養プレートをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（タカラバイオ社）でコートし、洗浄後、図２７に示される上述のコンストラクトを含有する１ｍｌのレトロウイルス上清を摂取し、４６００Ｇで６０分間スピンする。その後、ウイルス上清を除去し、完全培地＋２００Ｕ／ｍｌ ｒｈＩＬ－２中の刺激後ＮＫＴを各ウェルに添加する。４８時間後に細胞をプレートから取り出し、洗浄し、完全ＲＰＭＩ＋２００Ｕ／ｍｌ ＩＬ－２中に１０^６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、播種し、継続的な増殖を行う。ＮＫＴ細胞数はトリパンブルー（ライフテクノロジーズ社）計数で求める。表示されている場合、ＮＫＴまたはＣＡＲ－ＮＫＴは、製造業者の説明書に従って、ＣＤ６２Ｌ－ＰＥ ｍＡｂ（ＧＲＥＧ－５６、ＢＤバイオサイエンス社）および抗ＰＥミクロビーズ（ミルテニー社）で標識後、ＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットに磁気選別される。選別後細胞の表現型はＦＡＣＳにより求めた。
増殖アッセイおよびアポトーシスアッセイ

【0251】

ＮＫＴは、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ；サーモ・フィッシャー社、ウォルサム、マサチューセッツ州）で標識し、αＧａｌＣｅｒパルスＢ－８－２細胞で刺激する。細胞増殖は、６日目に、フローサイトメトリーを用いてＣＴＶ希釈を測定することにより調べる。初期および後期のアポトーシスは、ＮＫＴ刺激後３日目に、それぞれアネキシンＶ染色および７－ＡＡＤ（ＢＤバイオサイエンス社、フランクリン・レイクス、ニュージャージー州）染色後に、フローサイトメトリーを行うことにより、測定する。

【0252】

マルチプレックスサイトカイン定量化アッセイ ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫＴを、１：１のエフェクター：ターゲット（Ｅ：Ｔ）比の、Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞またはＣＨＬＡ－２５５神経芽細胞腫細胞によって、２４時間刺激する。上清を回収し、製造業者のプロトコルに従って、ＭＩＬＬＩＰＬＥＸ ＭＡＰヒトサイトカイン／ケモカインイムノアッセイパネル（ミリポア社）を用いて分析し、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）解析を行う。
フローサイトメトリー

【0253】

免疫表現型検査は、以下のｍＡｂを用いて行う：ＨＬＡ－Ｃ ＥＭＲ８－５、ＣＤ Ｉｄ ＣＤｌｄ４２、ＣＤ８６ ２３３１、４－１ＢＢＬ Ｃ６５－４８５、ＯＸ４０Ｌ ｉｋ－１、ＣＤ３ ＯＫＴ、Ｖａ２４－Ｊａｌ８ ６Ｂ１１、ＣＤ４ ＳＫ３、ＣＤ６２Ｌ ＤＲＥＧ－５６、ＣＤ１３４ ＡＣＴ３５、ＣＤ１３７ ４Ｂ４－１、ＰＤ－１ ＥＨ１２．１、ＧＡＴＡ３ Ｌ５０－８２３（ＢＤバイオサイエンス社）、ＬＡＧ－３ポリクローナル、ＴＥＶＩ－３ ３４４８２３（Ｒ＆Ｄシステム社）、およびウサギ抗ＬＥＦｌ ＥＰ２０３０Ｙ ｍＡｂ（アブカム社）。ＢＤまたはＲ＆Ｄに提案された蛍光色素一致Ａｂおよびアイソタイプ一致Ａｂを、陰性対照として用いる。ＮＫＴ上のＣＡＲ．ＣＤ１９の発現は、抗Ｉｄ（クローン１３６．２０．１）ＣＤ１９－ＣＡＲ特異的ｍＡｂ（Ｔｏｒｉｋａｉ Ｈ， ｅｔ ａｌ． Ｔｏｗａｒｄ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｎｇ ＨＬＡ ｃｌａｓｓ Ｉ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ａｌｌｏｇｅｎｅｉｃ ｄｏｎｏｒｓ． ｆｉ／ｏｏ＜ｉ．２０１３；１２２（８）：１３４１－１３４９）およびヤギ抗マウスＩｇＧ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて求める。
ＮＫＴ細胞表現型分析

【0254】

ＮＫＴ細胞表現型は、以下に対する各モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を用いて評価する：ＣＤ３（ＵＣＨＴ１）、Ｖα２４－Ｊα１８（６Ｂ１１）、ＣＤ４（ＲＰＡ－Ｔ４）、グランザイムＢ（ＧＢ１１）、ＣＤ６２Ｌ（ＤＲＥＧ－５６；ＢＤバイオサイエンス社、サンノゼ、カリフォルニア州）、Ｖβ１１（Ｃ２１；ベックマン・コールター、ブレア、カリフォルニア州）、およびＩＬ－２１Ｒ（１７Ａ１２；バイオレジェンド社（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、およびＢＤバイオサイエンス社）。形質導入後ＮＫＴによるＣＤ１９－ＣＡＲ発現は、Ｂ．Ｊｅｎａ博士（ＭＤアンダーソンがんセンター、ヒューストン、テキサス州）からの贈与品である、抗Ｉｄ ｍＡｂ（１４Ｇ２ａ抗イディオタイプ１Ａ７ ｍＡｂ、クローン１３６．２０．１）（２５）を用いて検出する。細胞内染色は、Ｂｃｌ２ ｍＡｂ（Ｎ４６－４６７；ＢＤバイオサイエンス社）およびＢＩＭ ｍＡｂ（Ｙ３６；アブカム社、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）を含む固定／透過処理液キット（ＢＤバイオサイエンス社）と、その後のヤギ抗ウサギＩｇＧ－ＡＦ４８８二次ｍＡｂ（アブカム社）による染色を用いて、行う。Ｐｈｏｓｆｌｏｗ染色は、Ｓｔａｔ３ ｍＡｂ（ｐＹ７０５；クローン４；ＢＤバイオサイエンス社）を含む、Ｃｙｔｏｆｉｘ緩衝液（ＢＤバイオサイエンス社）およびＰｅｒｍ緩衝液ＩＩＩ（ＢＤバイオサイエンス社）を用いて、行う。Ｓｔａｔ３リン酸化の検出は、ＩＬ－２１処理の１５分後に行う。ＢＤバイオサイエンス社またはＲ＆Ｄシステムズ社に提案された蛍光色素一致抗体およびアイソタイプ一致抗体を、陰性対照として用いる。

【0255】

ミトコンドリア質量は、製造業者のプロトコルに従って、２５ｎＭ ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｄｅｅｐ ＲｅｄまたはＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ Ｇｒｅｅｎ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて測定する。転写因子染色は、ＬＥＦ１のロング型アイソフォームに対するｍＡｂ（Ｃ１２Ａ５）、ＴＣＦ１のロング型アイソフォームに対するｍＡｂ（Ｃ６３Ｄ９；セル・シグナリング・テクノロジー社（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））、およびＬＥＦ１の全アイソフォームに対するｍＡｂ（ＥＰ２０３０Ｙ、アブカム社）を含む、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｘｐ３／Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｓｔａｉｎｉｎｇ Ｂｕｆｆｅｒ Ｓｅｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて、行う。ＢＤバイオサイエンス社、セル・シグナリング・テクノロジー社、またはＲ＆Ｄシステムズ社に提案された、蛍光色素一致ｍＡｂおよびアイソタイプ一致ｍＡｂを、陰性対照として用いる。ＬＳＲ ＩＩ ５レーザーフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）で、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアのバージョン６．０およびＦｌｏｗＪｏ１０．７（ツリー・スター社（Ｔｒｅｅ Ｓｔａｒ））を用いて、解析を行う。

【0256】

ＬＳＲ ＩＩ ５レーザーフローサイトメーター（ＢＤバイオサイエンス社）で、ＢＤ ＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェアのバージョン６．０およびＦｌｏｗＪｏ１０．１（ツリー・スター社、アシュランド、オハイオ州）を用いて、解析を行う。
インビトロ細胞毒性アッセイ

【0257】

親ＮＫＴおよびＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫＴのそれぞれＲａｍｏｓ細胞およびＲａｊｉ細胞に対する細胞毒性は、以前の報告（１３）の通りに、４時間ルシフェラーゼアッセイを用いて評価する。ＣＡＲ．ＧＤ２－ＮＫＴのＣＨＬＡ－２５５細胞に対するＣＡＲ媒介性細胞毒性は、以前の報告（Ｈｅｃｚｅｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｉｎｖａｒｉａｎｔ ＮＫＴ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｐｒｏｖｉｄｅ ａ ｎｏｖｅｌ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓａｆｅ ａｎｄ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｃａｎｃｅｒ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，” Ｂｌｏｏｄ １２４， ２８２４－２８３３ （２０１４））の通りに、４時間ルシフェラーゼアッセイを用いて評価する。
インビトロにおける反復的キリングアッセイ

【0258】

Ｊ３２白血病細胞を、αＧａｌＣｅｒ（１００ｎｇ／ｍＬ）で一晩パルス後、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）染色する。標識後Ｊ３２細胞を、ＩＬ－２（５０Ｕ／ｍＬ）の存在下で、表示のＥ：Ｔ比のＧＦＰ．ＬＥＦ１またはＧＦＰ．ＦＦＬｕｃを形質導入されたＮＫＴと共培養する。３日後、腫瘍の死滅とＮＫＴの細胞増殖を、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ Ａｂｓｏｌｕｔｅ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｂｅａｄｓ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて、フローサイトメトリーによって測定する。前記Ｅ：Ｔ比を再び確立させるためのＮＫＴ細胞数に基づいて、新鮮αＧａｌＣｅｒパルスＪ３２細胞を培養液に加える。この工程を共培養の３日毎に繰り返す。ＮＫＴ細胞の疲弊／メモリー表現型は、Ｊ３２刺激から６日間の休止後に、抗ＰＤ－１ ｍＡｂ、抗ＴＩＭ－３ ｍＡｂ、および抗ＣＤ６２Ｌ ｍＡｂを用いるフローサイトメトリーによって、評価する。
シーホースアッセイ

【0259】

細胞外酸性化速度（ＥＣＡＲ）および酸素消費速度（ＯＣＲ）を、製造業者の取扱説明書に従ってＡｇｉｌｅｎｔ Ｓｅａｈｏｒｓｅ ＸＦｅ９６ Ａｎａｌｙｚｅｒ（アジレント社）を用いて測定する。ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ－ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１－ＮＫＴを、二次刺激後１２日目に、形質導入率の正規化後に評価する。
遺伝子発現解析

【0260】

Ｄｉｒｅｃｔ－ｚｏｌ（商標）ＲＮＡ ＭｉｎｉＰｒｅｐ Ｋｉｔ（ザイモ・リサーチ社（Ｚｙｍｏ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、アービン、カリフォルニア州）を用いて全ＲＮＡを収集する。遺伝子発現解析は、ベイラー医科大学（ＢＣＭ）のＧｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ ＲＮＡ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ Ｃｏｒｅによって、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ Ｐａｎｅｌバージョン２（ナノストリング社（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ）、シアトル、ワシントン州）とｎＣｏｕｎｔｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍを用いて行われる。ｎＳｏｌｖｅｒ３．０ソフトウェア（ナノストリング社）を用いてデータを解析する。２つの培養条件における、ＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットとの間の遺伝子発現レベルの差異を、Ｌｉｎｅａｒ Ｍｏｄｅｌｓ ｆｏｒ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｄａｔａ（Ｌｉｍｍａ）解析パッケージの対応のある調整ｔ統計量を用いて評価する（２６）。
リアルタイム定量ＰＣＲ

【0261】

Ｗｎｔシグナル伝達成分および下流の遺伝子発現を、ＮＫＴにおいて、特異的プライマーを用いるｑＰＣＲによって測定する。簡潔に説明すると、ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（キアゲン社）を用いて、未選別ＮＫＴまたはＣＤ６２Ｌ＋／－選別ＮＫＴからＲＮＡを抽出する。次に、単離したＲＮＡを、Ｐｏｗｅｒ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＲＮＡ－ｔｏ－ＣＴ １－Ｓｔｅｐ Ｋｉｔ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いた逆転写およびｑＰＣＲ反応にかける。ＣＤ６２Ｌ－ＮＫＴと比較したＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴにおけるＷｎｔ標的遺伝子の相対的発現を、ＧＡＰＤＨをハウスキーピング遺伝子としたΔΔＣｔ法を用いて、求める。ＮＫＴおよびＫ５６２人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）上のＷｎｔ受容体、補助受容体、およびリガンドの発現を検出するために、標的遺伝子発現のＣｔ値を、ポジティブコントロール（ＧＡＰＤＨ）およびネガティブコントロール（ＣＤ１９）のＣｔ値と比較する。ＧＡＰＤＨおよびＣＤ１９の範囲内のＣｔ値は、有意に発現されていると見なす。プライマーを表２に挙げる。

【表2-1】

【表2-2】

インビボ実験

【0262】

ＮＳＧマウスはジャクソン研究所から入手し、ＢＣＭの動物飼育施設で維持する。マウスに２×１０^５個のルシフェラーゼ形質導入Ｄａｕｄｉリンパ腫細胞を静脈内（ＩＶ）注射することで、腫瘍成長を開始させる。３日目に、マウスに、４×１０×１０^６個ＣＤ１９－ＣＡＲ－ＮＫＴをＩＶ注射し、その後、ＩＬ－２（１，０００Ｕ／マウス）単独またはＩＬ－２（１，０００Ｕ／マウス）およびＩＬ－２１（５０ｎｇ／マウス）の組み合わせを１日おきに２週間腹腔内（ＩＰ）注射する。ＣＡＲ．ＧＤ２－ＮＫＴの抗神経芽細胞腫効果を試験するため、マウスに、１ｘ１０^６個のルシフェラーゼ形質導入ＣＨＬＡ－２５５神経芽細胞腫細胞を静脈内注射して、腫瘍成長を開始させる。７日目に、マウスに、４ｘ１０^６個のＣＡＲ．ＧＤ２－ＮＫＴを静脈内注射し、その後、ＩＬ－２（２０００Ｕ／マウス）を１日おきに２週間腹腔内注射する。腫瘍成長は生物発光イメージング（Ｓｍａｌｌ Ａｎｉｍａｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｃｏｒｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙ、テキサス・チルドレンズ・ホスピタル）で週１回評価する。
統計

【0263】

連続変数の正規性を評価するために、シャピロ－ウィルク検定が使用される。Ｐ値が０．０５未満である場合、正規性は棄却される。正規分布していないデータについては、２群間の連続変数の差を評価するために、マン・ホイットニーのＵ検定が使用される。連続変数の差を評価するために、２群間の比較には両側性の対のあるスチューデントｔ検定が用いられ、３群以上の比較には一元配置分散分析と検定後のボンフェローニ補正が用いられ、２×２の設定での比較には２元配置分散分析とシダックの事後検定が用いられる。生存率は、２群の比較にＫａｐｌａｎ－Ｍｅｉｅｒ法とログランク（Ｍａｎｔｅｌ－Ｃｏｘ）検定を用いて解析を行う。統計はＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ７（グラフパッド・ソフトウェア社（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）、サンディエゴ、カリフォルニア州）を用いて計算される。Ｐ値が０．０５未満の場合に、差は有意とみなされる。実施例２：ＷＮＴシグナル伝達はＣＤ６２Ｌ＋細胞で上昇しており、ＷＮＴシグナル経路の活性化は疲弊を抑制する

【0264】

遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）プロットにより、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴにおけるセントラルメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞シグネチャー（Ａｂｂａｓ ｅｔ ａｌ．， ２００９）の濃縮が示される。図１を参照されたい。

【0265】

ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴは、ＣＤ６２Ｌ－ＮＫＴと比較して、Ｗｎｔ転写活性化因子ＬＥＦ１の発現レベルが上昇している。αＧａｌＣｅｒパルス自己ＰＢＭＣによる抗原刺激後１２日目に、生体外で増殖させた初代ＮＫＴにおけるＬＥＦ１発現を細胞内フローサイトメトリーにより解析する。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋集団とＣＤ６２Ｌ－集団とにゲーティングし、各群のＬＥＦ１発現を測定する。７人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（左）および全ドナーのＬＥＦ１＋割合の平均±ＳＥＭ（ｎ＝７、右）が示されている。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントｔ検定。図２を参照されたい。図２ｂに示すように、ＬＥＦ１は、ＣＤ６２Ｌ－細胞と比較して、ＣＤ６２Ｌ＋細胞において発現レベルが上昇している。

【0266】

ＬＥＦ１発現はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴとＣＤ６２Ｌ－ＮＫＴの区別になるが、ＴＣＦ１発現はならない。生体外で増殖させたＮＫＴにおけるＬＥＦ１とＴＣＦ１の共発現を、細胞内フローサイトメトリーにより解析する。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ－（左）集団とＣＤ６２Ｌ＋（右）集団にゲーティングする。プロットは、３人のドナーの代表からのものである（図２）。

【0267】

ＬＥＦ１＋ＮＫＴは、ＬＥＦ１－ＮＫＴよりも疲弊が少ない表現型である。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ－ＬＥＦ１－集団、ＣＤ６２Ｌ＋ＬＥＦ１－集団、およびＣＤ６２Ｌ＋ＬＥＦ１＋集団にゲーティングし（図４ａ）、各群のＴＩＭ－３発現を測定する。７人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（図４ｂ）および全ドナーのＴＩＭ－３ ＭＦＩの平均±ＳＥＭ（ｎ＝７、図４ｃ）が示されている。^＊Ｐ＜０．０５、ｎｓ：有意差なし、一元配置分散分析とシダックの事後検定（ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ）。示されているように、疲弊のマーカーであるＴＩＭ－３発現がＬＥＦ１発現細胞で減少している。

【0268】

ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴでは、ＣＤ６２Ｌ－ＮＫＴと比較して、基底Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が上昇している。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットとに磁気ソーティングした後、ＲＮＡを単離する。Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を定量ＰＣＲにより測定し、ｄｄＣｔ法により計算する。４人のドナーの要約を示す（図５）。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。

【0269】

図５は、磁気ソートされたＣＤ６２Ｌ＋サブセットおよびＣＤ６２Ｌ－サブセットの、定量ＰＣＲで測定され、ｄｄＣｔ法で算出された、Ｗｎｔ標的遺伝子の発現に関する４人のドナーの結果のまとめである。Ａｘｉｎ２（ａ）、Ｍｙｃ（ｂ）、およびＴＣＦ７（ｃ）。

【0270】

ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴでは、ＣＤ６２Ｌ－ＮＫＴと比較して、基底Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達が上昇している。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ＋サブセットとＣＤ６２Ｌ－サブセットとに磁気ソーティングした後、ＲＮＡを単離する。Ｗｎｔ標的遺伝子の発現を定量ＰＣＲにより測定し、ｄｄＣｔ法により計算する。４人のドナーの要約を示す（図５：Ａｘｉｎ２（ａ）、Ｍｙｃ（ｂ）、およびＴＣＦ７（ｃ））。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。

【0271】

Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達活性は、７－ＴＧＣレポーターを形質導入したＮＫＴにおいて検出することができる。Ｗｎｔシグナル伝達活性をモニターするために、生体外刺激後の１２日目に、ＮＫＴに７－ＴＧＣレポーターを形質導入する（図６）。形質導入およびＷｎｔ活性は、それぞれｍＣｈｅｒｒｙおよびＧＦＰを検出することにより測定される。非形質導入ＮＫＴ（図６ａ）、７－ＴＧＣ形質導入ＮＫＴ（図６ｂ）、および１０μＭ Ｗｎｔ活性化因子ＴＷＳ１１９で一晩処理した７－ＴＧＣ形質導入ＮＫＴ（図６ｃ）の各ドットプロットが示されている。

【0272】

ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴが、Ｗｎｔ活性を有するサブセットにおいて濃縮される。ｍＣｈｅｒｒｙ＋ＮＫＴを、ＧＦＰ－サブセットとＧＦＰ＋サブセットとにゲーティングし、各群のＣＤ６２Ｌ発現を測定する（図７）。４人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（図７ａ）および全ドナーの平均ＣＤ６２Ｌ＋割合（ｎ＝４、図７ｂ）が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。

【0273】

ＮＫＴは、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を駆動するために必要な成分を発現する。ＮＫＴを生体外で１０日間増殖させた後、ＲＮＡを単離する。Ｗｎｔ受容体、補助受容体、およびリガンドｍＲＮＡ発現を定量ＰＣＲにより測定する。ポジティブ発現およびネガティブ発現を示すために、それぞれＧＡＰＤＨおよびＣＤ１９を用いる。ＧＡＰＤＨおよびＣＤ１９の範囲内のＣｔ値を有する遺伝子を、有意に発現されていると見なす。個別のドナーをそれぞれ用いる、３つの独立した実験の要約を、図８に示す。

【0274】

Ｋ５６２ベースの人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）は、Ｗｎｔ／β－カテニンシグナル伝達を駆動するためのＷｎｔリガンドを発現しない。上記および図８に示されているように、Ｋ５６２ベースのａＡＰＣからＲＮＡを単離した後、定量ＰＣＲを行ってＷｎｔリガンド発現を検出する。３つの独立した実験の要約を示す。

【0275】

基底Ｗｎｔシグナル伝達は、生体外におけるＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの発生に重要である。ＮＫＴを、αＧａｌＣｅｒパルス自己ＰＢＭＣによる刺激後、０日目に開始して３日間、３μＭのＷｎｔ阻害剤ＩＣＧ－００１で処理する。ＣＤ６２Ｌ発現を抗原刺激後１２日目に調べる。３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（左）および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｎ＝３、右）を図１０に示す。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。
実施例３：ＷＮＴシグナル伝達の活性化はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の発生を促進する

【0276】

組み換えＷｎｔ３ａによるＷｎｔシグナル伝達の活性化はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの発生を促進する。ＮＫＴを、実施例２に記載されているように刺激するが、抗原刺激後の０日目、３日目、および７日目に与えられるＰＢＳまたは５００ｎｇ／ｍＬ Ｗｎｔ３ａの３回の別々の投与により処理を行う。抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーによりＣＤ６２Ｌ発現を調べる。３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（左）および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｎ＝３、右）が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。^＊Ｐ＜０．０５、スチューデントｔ検定。図１１は、Ｗｎｔリガンドを介したＷｎｔシグナル伝達の活性化が、ＣＤ６２Ｌ＋である細胞の頻度を増加させることを示している。

【0277】

ＧＳＫ３β阻害を介したＷｎｔシグナル伝達の活性化はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの発生を促進する。ＮＫＴを、実施例２に記載されているように刺激するが、抗原刺激後の７日目にＤＭＳＯまたは５μＭのＧＳＫ３β阻害剤ＴＷＳ１１９の１回投与により処理を行う。抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーによりＣＤ６２Ｌ発現を調べる。６人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（左）および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均（ｎ＝６、右）を図１２に示す。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。^＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントｔ検定。図１２に示すように、Ｗｎｔシグナル経路阻害剤ＧＳＫ３ｂの阻害は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の増加をもたらす。Ｗｕ ａｎｄ Ｐａｎ （２０１０）を参照されたい。すなわち、Ｗｎｔ経路の阻害の阻害はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を増加させる。

【0278】

Ｗｎｔシグナル伝達がＴＣＲ刺激の初期の間に作用すると、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの発生が促進される。ＮＫＴを、αＧａｌＣｅｒパルス自己ＰＢＭＣで刺激し、増殖初期（０日目、１日目、２日目）、増殖後期（６日目、７日目、８日目）、または増殖の全体を通じた（０日目、３日目、８日目）、ＰＢＳまたは５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａの３回の投与により処理する。抗原刺激後１２日目にフローサイトメトリーによりＣＤ６２Ｌ発現を調べ、結果を図１３に示す。
実施例４：ＷＮＴシグナル伝達および増殖因子シグナル伝達が相加的に作用することで、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の発生が促進される

【0279】

Ｗｎｔ３ａがＩＬ－２１と相加的に働くことで、ＣＤ６２Ｌ頻度が増加する。一次刺激後、ＮＫＴをＩＬ－２またはＩＬ－２／ＩＬ－２１と共に１２日間培養する。各群では、抗原刺激後の０日目、１日目、および２日目に、ＰＢＳ処理または５００ｎｇ／ｍｌのＷｎｔ３ａ処理を行う。増殖の終わりに、ＣＤ６２Ｌ発現をフローサイトメトリーにより解析する。３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラムを図１４に示す。
実施例５：ＷＮＴシグナル伝達の喪失はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の頻度を減少させる

【0280】

ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＬＥＦ１ノックアウト（ＫＯ）はＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴの頻度を減少させる。ＮＫＴに、生体外増殖の１０日目に、ＬＥＦ１を標的とするガイドＲＮＡを有するまたは有さないＣａｓ９をエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後の３日目に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＬＥＦ１のＫＯを細胞内フローサイトメトリーにより評価する。ＮＫＴをＣＤ６２Ｌ－集団およびＣＤ６２Ｌ＋集団にゲーティングし、ＬＥＦ１発現を解析する。３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（図１５ａ）および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３、図１５ｂ）が示されている。^＊＊Ｐ＜０．０１、ｎｓ：有意差なし、スチューデントｔ検定。ＬＥＦ１のノックダウンによるＣＤ６２Ｌ＋細胞の頻度減少は、Ｗｎｔシグナル伝達がＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の生成に櫃ようであることを示している。

【0281】

ＬＥＦ１のＫＯは、抗原刺激後のＣＤ６２Ｌ＋サブセットの発生にのみ影響を与える。（エレクトロポレーション後の７日目、図１７ａ）の前の、エレクトロポレーション済みＮＫＴにおけるＣＤ６２Ｌ発現を、フローサイトメトリーで解析する。示されているように、ＬＥＦ１発現の減少は、刺激前のＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞頻度に有意な効果を持たない。対照的に、抗原再刺激の１０日後（二次刺激後の１０日目、図１８）、ＬＥＦ１の喪失は、ＣＤ６２Ｌ＋ＮＫＴ細胞の有意な減少をもたらす。３人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（図１７ａ、図１８ａ）および全ドナーのＣＤ６２Ｌ＋割合の平均±ＳＥＭ（ｎ＝３、図１７ｂおよび図１８ｂ）が示されている。^＊＊Ｐ＜０．０１；ｎｓ：有意差なし、対応のあるスチューデントｔ検定。これらの結果は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化が、抗原刺激後のＣＤ６２Ｌ＋サブセットに必要であることを示している。
実施例６：ＷＮＴシグナル伝達の活性化はＮＫＴ増殖能を維持し、ＮＫＴ細胞の疲弊を軽減する

【0282】

ＮＫＴにおけるＬＥＦ１過剰発現は、ガンマレトロウイルスを用いたアプローチにより達成することができる。ＬＥＦ１のロング型アイソフォームを過剰発現するガンマレトロウイルスコンストラクトをＮＫＴにおける発現用に作製する（図１９、上段、ＧＦＰ．ＬＥＦ１）。ＮＫＴに、αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣを用いた二次刺激の２日後に、ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃコンストラクトまたはＧＦＰ．ＬＥＦ１コンストラクトを形質導入する。増殖の１２日目に、ＧＦＰ発現をフローサイトメトリーで評価し（図１９ａ）、ＬＥＦ１発現は別に細胞内フローサイトメトリーにより解析する（図１９ｂ）。３人のドナーのうちの１人からの代表的なドットプロットが示される。

【0283】

ＬＥＦ１過剰発現はＮＫＴにおけるミトコンドリア質量を増加する。上記で作製されたＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ形質導入ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１形質導入ＮＫＴのミトコンドリア質量を、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ染色およびフローサイトメトリーにより解析する。ＮＫＴを非形質導入（ＧＦＰ－）集団と形質導入（ＧＦＰ＋）集団とにゲーティングし、ＭｉｔｏＴｒａｃｋｅｒ ＤｅｅｐＲｅｄ染色を比較する。２人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラムを図２０に示す。

【0284】

ＬＥＦ１過剰発現はＮＫＴにおけるミトコンドリア容量（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｃａｐａｃｉｔｙ）を増加する。基礎条件下の、並びにオリゴマイシン、ＦＣＣＰ、並びにロテノンおよびアンチマイシンＡ（Ｒｏｔ／Ａｎｔ）に応答した、上記で作製されたＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ形質導入ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１形質導入ＮＫＴの酸素消費速度（ＯＣＲ）を、シーホースアッセイにより測定する。図２１を参照されたい。結果は、試験された２人のドナーのうちの１人からの代表的なものである。

【0285】

ＬＥＦ１過剰発現は反復的抗原暴露後にＮＫＴ細胞増殖能を維持する。ＧＦＰ．ＦＦＬｕｃ形質導入ＮＫＴおよびＧＦＰ．ＬＥＦ１形質導入ＮＫＴを、１：１比のＣＤ１ｄ＋Ｊ３２白血病細胞で３日毎に反復暴露する（図２２の上段に模式図を示す）。サイクル毎にカウントビーズおよびフローサイトメトリーを用いてＮＫＴを計数する。サイクル毎の増殖における変化倍率を図２２の下段に示す。

【0286】

ＬＥＦ１過剰発現は、反復的抗原暴露後にＮＫＴによる腫瘍量の効果的な制御を促進する。上記および図２２における７サイクル目の反復的キリングアッセイの後、ＮＫＴを３日間１：５０比のＪ３２細胞に暴露する。腫瘍細胞数を、カウントビーズおよびフローサイトメトリーを用いて求める。腫瘍減少率を図２３に示す。

【0287】

ＬＥＦ１過剰発現は反復的抗原暴露後にＮＫＴ細胞の疲弊を軽減する。図２２における５サイクル目の反復的キリングアッセイの後に、ＮＫＴを抗原刺激から離し、計６日間休める。その後、ＧＦＰと相関したＴＩＭ－３発現をフローサイトメトリーで調べる。４人のドナーのうちの１人からの代表的なドットプロット（図２４ａ）および全ドナーの平均ＴＩＭ－３ ＭＦＩ（ｎ＝４、図２４ｂ）が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、ｎｓ：有意差なし、一元配置分散分析とシダック事後検定（ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ）。結果を表３に示す。

【表3】

【0288】

ＬＥＦ１過剰発現は反復的抗原暴露後にＣＤ６２Ｌ＋セントラルメモリーＮＫＴを維持する。上記のように、および図２４に示されているようにＮＫＴを休めた後、ＧＦＰ－ＴＩＭ－３^ｈｉ集団、ＧＦＰ＋ＴＩＭ－３^ｈｉ集団、およびＧＦＰ＋ＴＩＭ－３^ｌｏ集団にゲーティングする。各群のＣＤ６２Ｌ発現をフローサイトメトリーで評価する。４人のドナーのうちの１人からの代表的なヒストグラム（図２５ａ）および全ドナーの平均ＣＤ６２Ｌ割合（ｎ＝４、図２５ｂ）が示されている。それぞれのシンボルは個々のドナーを表す。一元配置分散分析とシダックの事後検定（ｐｏｓｔ－ｔｅｓｔ）。

【0289】

（ｙ）ＬＥＦ１を過剰発現するＮＫＴは、反復的抗原暴露の間に、ＧＦＰ．ＦＦｌｕｃ対照細胞に優る選択的有意性を示す。ＮＫＴに、上記および図２２に示されているような反復的暴露を行う。フローサイトメトリーを用いて、形質導入細胞の濃縮をＧＦＰ発現によりモニターする（図２６）。４人のドナーのうちの１人からの代表的な結果が示される。
実施例７：ＬＥＦ１の共発現をコードするＣＡＲコンストラクト

【0290】

ＬＥＦ１の共発現をコードするＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを図２７に図示する。ＬＥＦ１のロング型アイソフォーム（ＮＭ＿０１６２６９．５）を、ＣＤ２８もしくは４－１ＢＢ細胞内ドメインの下流、または存在する場合はＩＬ－１５の下流に、２Ａ配列後に挿入した。

【0291】

各種ＬＥＦ１含有コンストラクトを形質導入したＮＫＴはＬＥＦ１とＣＡＲ．ＧＤ２の両方を発現する。αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣによる二次刺激の２日後、ＮＫＴに、親またはＬＥＦ１含有ＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを形質導入する。増殖の１２日目に、ＣＡＲ．ＧＤ２の細胞表面発現およびＬＥＦ１の細胞内発現をフローサイトメトリーで測定する。代表的なドットプロットが、２人のドナーのうち１人からの、ＣＡＲ発現に対するＬＥＦ１発現を示している。
実施例８：ＬＥＦ１過剰発現は腫瘍細胞死滅後の後期のＮＫＴ増殖を促進する

【0292】

ＣＤ１Ｄ ＮＫＴ細胞を上記のように単離し、１×１０^６個の細胞を１：１比のＪ３２腫瘍細胞に３日毎（例えば、サイクル）に暴露する。３日後、増殖させたＮＫＴ細胞を単離し、Ｊ３２腫瘍細胞による暴露を再開する。結果はＦＡＣＳでソーティングしたものであり、プロットが示されている。示されているように、７サイクル目に、ＬＥＦ１発現ＮＫＴ細胞は増殖能を保持している。図３０を参照されたい。

【0293】

増殖させたＮＫＴ細胞は７サイクル後も有効な腫瘍細胞死滅を保持する。７サイクル後、増殖させたＮＫＴ細胞を単離し、図３１に示されているように１：５０比の腫瘍細胞に暴露する。図３２は、ＧＦＰ．ＦＦＬＵＣまたはＧＦＰ．ＬＥＦ１を形質導入したＮＫＴのドットプロットを示している。図３２のパネルａに示すように、ＬＥＦ１発現細胞は増殖能を保持する。図３２のパネルｂに示すように、ＬＥＦ１発現細胞は腫瘍を死滅させる能力を保持しているが、対照ＮＫＴ細胞は保持していない。図３３は、図３２の結果のグラフ表示である。
実施例９：ＬＥＦ１ ＣＲＩＳＰＲ－ＣＡＳ９遺伝子編集

【0294】

ＬＥＦ１遺伝子に対する２つのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）（配列番号４５ ＣＣＣＧＧＡＡＴＡＡＣＴＣＧＡＧＴＡＧＧ、および配列番号４６ ＧＴＣＡＣＴＧＴＡＡＧＴＧＡＴＧＡＧＧＧ）を、ＣＲＩＳＰＲｓｃａｎアルゴリズムおよびＣＯＳＭＩＤアルゴリズムを用いて設計する（Ｍｏｒｅｎｏ－Ｍａｔｅｏｓ ｅｔ ａｌ．， “ＣＲＩＳＰＲｓｃａｎ： ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｖｏ，” Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １２， ９８２－９８８ （２０１５）およびＣｒａｄｉｃｋ ｅｔ ａｌ．， “ＣＯＳＭＩＤ： Ａ Ｗｅｂ－ｂａｓｅｄ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ ａｎｄ Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ Ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ Ｓｉｔｅｓ，” Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ３， ｅ２１４ （２０１４）。公表されたプロトコルに従ってＮＫＴにおけるＬＥＦ１遺伝子をゲノム的に破壊する（Ｇｕｎｄｒｙ ｅｔ ａｌ．， “Ｈｉｇｈｌｙ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９，” Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ １７， １４５３－１４６１ （２０１６）。簡潔には、特定の遺伝子座に相補的な２０ｎｔの配列をオリゴヌクレオチドプライマーに組み込み、それを用いて、ＰＸ４５８プラスミド（Ｆｅｎｇ Ｚｈａｎｇから贈与；Ａｄｄｇｅｎｅ ４８１３８）からｇＲＮＡ足場を増幅させる。製造業者の取扱説明書に従って、Ｈｉｇｈ－Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（ニュー・イングランド・バイオラボ社）を用いたインビトロ転写を通じて、ｇＲＮＡを鋳型ＤＮＡから作製し、ＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＆ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ－２５キット（ザイモ・リサーチ社）を用いて精製する。Ｎｅｏｎ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（サーモフィッシャー・サイエンティフィック社）を用いて、５μｇのｇＲＮＡおよび１０μｇのＣａｓ９タンパク質（ＰＮＡバイオ社）を、１００μＬのＢｕｆｆｅｒ Ｒ中の２×１０^６個の活性化ＮＫＴに、１６００Ｖ、１０ミリ秒の３回のパルスでエレクトロポレートする。エレクトロポレーション後、ＮＫＴを、１０％ウシ胎児血清を添加した完全ＲＰＭＩ中で一晩インキュベートする。ＮＫＴを次に、２００Ｕ／ｍＬのＩＬ－２を添加した培地中で増殖させる。
実施例１０：ＬＥＦ１過剰発現はセントラルメモリー遺伝子を誘導し、疲弊およびエフェクター表現型に関連した各遺伝子を抑制する

【0295】

ＧＦＰ．ＦＦｌｕｃ ＮＫＴ細胞およびＧＦＰ．ＬＥＦ１ ＮＫＴ細胞を二次刺激の１０日後に回収し、ＧＦＰ陽性細胞をＦＡＣＳで選別する。選別した細胞から単離したＲＮＡをバルクＲＮＡシーケンス解析用に加工する。目的の発現変動遺伝子（ＤＥＧ）は、共通の表現型／機能によって分類される。結果を図３４Ａのパネルａにプロットする。ヒートマップは、ＬＥＦ１－ＧＦＰ＋細胞およびＦＦＬｕｃ－ＧＦＰ＋細胞における発現の変化倍率（ＬＥＦ１／ＦＦＬｕｃ）を示しており、誤発見率（ＦＤＲ）は０．０５未満である（ＰＤＣＤ１の場合、ＦＤＲ＜０．２０）（図３４Ａ、パネルｂ）。６人のドナーについての、共有されている表現型および機能によって分類した結果を、表３に示す。

【0296】

図３４Ｂのパネルｃに示すように、ＬＥＦ１の過剰発現は、セントラルメモリー様トランスクリプトームシグネチャーを誘導し、図３４Ｂのパネルｄに示すように、疲弊が低減されたトランスクリプトームシグネチャーを誘導する。図３４Ｂのパネルｃは、ＬＥＦ１を過剰発現しているＮＫＴにおけるセントラルメモリーＴ細胞シグネチャーの濃縮（Ｊｅｆｆｒｅｙ ｅｔ ａｌ．， ２００６）を示す、ＧＳＥＡプロットを示している。ＬＥＦ１を過剰発現しているＮＫＴにおける、疲弊レベルが低く、ＣＤ８ Ｔ細胞シグネチャーの濃縮を示すＧＳＥＡプロット（Ｄｕｒａｉｓｗａｍｙ ｅｔ ａｌ．、 ２０１１）が、図３４Ｂのパネルｄに示されている。

【表4】

実施例１１：ＣＡＲ－ＬＥＦ１コンストラクトの設計および発現

【0297】

ＣＡＲ ＬＥＦ１コンストラクトの例示的な設計の模式図を、図３５Ａのパネルａに示す。ＣＡＲコンストラクトは、抗ＧＤ２ １４ｇ２ａのｓｃＦｖ、ＣＤ８のヒンジおよび膜貫通ドメイン、４－１ＢＢの共刺激ドメイン、並びにＣＤ３のζドメインを含有し、２Ａ配列に続きＬＥＦ１を伴う（ＣＡＲ－ＬＥＦ１）、または伴わない（ＣＡＲ）。

【0298】

ＣＡＲおよびＬＥＦ１の共発現を測定する。αＧａｌＣｅｒパルスａＡＰＣによる二次刺激の２日後に、ＮＫＴに、親またはＬＥＦ１含有ＣＡＲ．ＧＤ２コンストラクトを形質導入する。１０日間の増殖後、表面のＣＡＲ発現および細胞内のＬＥＦ１発現をフローサイトメトリーで測定する。図３５のパネルｂの、代表的なドットプロットが、２人のドナーのうち１人からの、ＣＡＲ発現に対するＬＥＦ１発現を示している。

【0299】

ＬＥＦ１の組み込みはＣＡＲ－ＮＫＴの数的増殖を改善する。ＮＫＴ細胞数をトリパンブルー色素排除アッセイにより求める。両方の群について、刺激の２日後と１０日後との間の、細胞数の変化倍率を算出する。ＣＡＲ群に対する平均変化倍率±ＳＥＭ（ｎ＝８人のドナー）が示される。^＊＊Ｐ＜０．０１、対応のあるスチューデントｔ検定。結果を図３５Ａのパネルｃに示す。

【0300】

ＬＥＦ１の組み込みはＣＡＲ－ＮＫＴのＣＤ６２Ｌ発現を改善する。１０日間の増殖後、ＣＡＲ＋にゲーティングされたＮＫＴにおいて、フローサイトメトリーにより、ＣＤ６２Ｌ発現を評価する。代表的なヒストグラムおよびＣＤ６２Ｌ割合の平均±ＳＥＭ（ｎ＝６人のドナー）が示される（図３５Ｂのパネルｄ）。^＊Ｐ＜０．０５、対応のあるスチューデントｔ検定。

【0301】

ＬＥＦ１の組み込みはＣＡＲ－ＮＫＴのＴＩＭ－３発現を減少する。１０日間の増殖後、ＣＡＲ＋にゲーティングされたＮＫＴにおいて、フローサイトメトリーにより、ＴＩＭ－３発現を評価する。代表的なヒストグラムおよびＣＡＲ群に対する平均変化倍率±ＳＥＭ（ｎ＝６人のドナー）が示される（図３５Ｂのパネルｅ）。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、対応のあるスチューデントｔ検定。

【0302】

ＬＥＦ１の組み込みはＣＡＲ－ＮＫＴの短期細胞毒性を低減する。ルシフェラーゼ形質導入ＧＤ２＋ＣＨＬＡ－２５５細胞を、ＣＡＲ ＮＫＴまたはＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴと共に４時間共培養する。非形質導入（ＮＴ）ＮＫＴを対照として用い、発光強度から細胞毒性を算出する。１人の被験ドナーからの結果を図３５Ｃのパネルｆに示す。

【0303】

ＬＥＦ１の組み込みはＣＡＲ－ＮＫＴからのエフェクターサイトカインの産生を低減する。ＣＡＲ ＮＫＴおよびＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴを、ＣＨＬＡ－２５５細胞で刺激し、２４時間後に上清を回収する。ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ－４のレベルをＬｕｍｉｎｅｘアッセイで測定する。同様の結果を有する２人の被験ドナーのうちの１人からの結果（図３５Ｃおよび図３５Ｄのパネルｇ）。^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、対応のないスチューデントｔ検定。
実施例１２：ＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴはインビボでより優れた腫瘍制御を媒介する

【0304】

ＮＫＴをＩＬ－２と共に増殖させ、ＣＡＲ．ＧＤ２（ＣＡＲ）またはＣＡＲ．ＧＤ２－ＬＥＦ１（ＣＡＲ－ＬＥＦ１）を形質導入し、非形質導入（ＮＴ）対照群を含む。０日目に、ＮＳＧマウス（１群当たりｎ＝８匹のマウス）に、１×１０^６個のルシフェラーゼ形質導入ＣＨＬＡ－２５５細胞を静脈内注射する。７日目に、マウスに、ＮＴ、ＣＡＲ、またはＣＡＲ－ＬＥＦ１ ＮＫＴ調製物（マウス当たり４×１０^６個のＣＡＲ＋細胞）を静脈内注射する。ＮＫＴ注射の２週間後、ＩＬ－２を週３回腹腔内注射する。腫瘍成長を、生物発光画像法を用いて週１回モニターする。結果を図３６Ａに示す。

【0305】

試験マウスの生存率を、カプラン・マイヤー法を用いて作製する。生存確率の差を、ログランク検定を用いて比較する。^＊＊＊Ｐ＜０．００１。結果を図３６Ｂと、下記の表５に示す。表６は平均とＴ検定による統計解析を示している。

【表5】

【表6】

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34A】

【図34B】

【図35A】

【図35B】

【図35C】

【図35D】

【図36A】

【図36B】

【配列表】

2024507721000001.app

【国際調査報告】