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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】新規核酸分子
(51)【国際特許分類】
C12N 15/50 20060101AFI20240214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/14 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/23 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/62 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/31 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/88 20060101ALI20240214BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240214BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/215 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240214BHJP
A61K 9/127 20060101ALI20240214BHJP
A61K 9/107 20060101ALI20240214BHJP
A61K 9/00 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/00 20060101ALN20240214BHJP
C12N 7/00 20060101ALN20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/50
C12N15/13 ZNA
C12N15/14
C12N15/23
C12N15/62 Z
C12N15/31
C12N15/88 Z
A61K31/7088
A61K48/00
A61P31/12
A61P35/00
A61P37/04
A61K39/215
A61K39/00 H
A61P35/02
A61K9/127
A61K9/107
A61K9/00
C12N1/00 Z
C12N7/00
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023547642
(86)(22)【出願日】2022-02-07
(85)【翻訳文提出日】2023-10-04
(86)【国際出願番号】 KR2022001874
(87)【国際公開番号】W WO2022169339
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】10-2021-0017115
(32)【優先日】2021-02-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】516017994
【氏名又は名称】エスティー ファーム カンパニー リミテッド
【住所又は居所原語表記】２３１，Ｈｙｅｏｍｎｙｅｏｋ－ｒｏ，Ｓｉｈｅｕｎｇ－ｓｉ，Ｇｙｅｏｎｇｇｉ－ｄｏ，１５０８６ Ｒｅｐｕｂｌｉｃ ｏｆ Ｋｏｒｅａ
(74)【代理人】
【識別番号】110001818
【氏名又は名称】弁理士法人Ｒ＆Ｃ
(72)【発明者】
【氏名】キム，ギョンジン
(72)【発明者】
【氏名】ヤン，ジュ‐ソン
(72)【発明者】
【氏名】チェ，カン・ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イ，ユン・チェ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C076
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4B065AA99Y
4B065CA45
4C076AA17
4C076AA19
4C076AA95
4C076AA99
4C076CC06
4C076CC27
4C076CC35
4C076FF70
4C084AA13
4C084MA11
4C084MA22
4C084MA24
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZB09
4C084ZB26
4C084ZB27
4C084ZB33
4C085AA03
4C085BA71
4C085BB01
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086MA11
4C086MA22
4C086MA24
4C086NA13
4C086NA14
4C086ZB09
4C086ZB26
4C086ZB27
4C086ZB33
(57)【要約】
本発明は、シグナルペプチドをコードする核酸および抗原をコードする核酸を含むウイルス感染症またはがんの予防または治療用核酸分子に関する。また、本発明は、前記核酸分子を含むウイルス感染症またはがんの予防または治療用ワクチン組成物に関する。本発明に係る核酸分子は、細胞内タンパク質発現率および細胞外部へのタンパク質分泌能に優れている。また、生体内に投与される場合、個体で抗原特異的中和抗体誘導などの体液性免疫力を獲得するようにし、ウイルスの死滅に直接関与する免疫細胞の量を増加させるなどの細胞性免疫力を獲得するようにするので、ウイルス感染症またはがんの予防および治療のためのワクチンとして有用に活用されることができる。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＩｇＥ（イムノグロブリンＥ：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、第ＩＸ因子（ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）およびムチン－様タンパク質１（ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １）からなる群より選択された１つ以上に由来したシグナルペプチドをコードする核酸；および抗原をコードする核酸を含む、ウイルス感染症またはがんの予防または治療用の核酸分子。
【請求項2】
前記シグナルペプチドをコードする核酸は、配列番号２～４、６～８、１０～１２、１４～１６、および１８～２０からなる群より選択された１つ以上である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項3】
前記抗原は、コロナウイルス、腫瘍ウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）、腫瘍－特異的抗原（ｃａｎｃｅｒ ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、腫瘍－関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）および新生抗原エピトープ（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）からなる群より選択された１つ以上に由来したものである、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項4】
前記抗原は、コロナウイルス由来のスパイクタンパク質および膜タンパク質からなる群より選択された１つ以上である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項5】
前記抗原をコードする核酸は、配列番号２２～２５、および２７～３０からなる群より選択された１つ以上である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項6】
前記核酸分子は、Ｔｈ細胞エピトープをコードする核酸を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項7】
前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴＨ ｔｏｘｏｉｄ）および百日咳トキソイド（Ｐｕｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｏｉｄ）からなる群より選択された１つ以上に由来したものである、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項8】
前記Ｔｈ細胞エピトープをコードする核酸は、配列番号４５および４６からなる群より選択された１つ以上である、請求項６に記載の核酸分子。
【請求項9】
前記ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項10】
前記コロナウイルス感染症は、重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＥＲＳ）およびコロナウイルス感染症－１９（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ－２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）からなる群より選択された１つ以上である、請求項９に記載の核酸分子。
【請求項11】
前記がんは、固形がん腫および血液がん腫からなる群より選択された１つ以上である、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項12】
前記がんは、胃がん、肺がん、肝がん、大腸がん、結腸がん、腎臓がん、小腸がん、膵臓がん、脳腫瘍、骨がん、皮膚がん、表皮がん腫、扁平上皮がん、乳がん、硬化性腺症、頭頸部がん、食道がん、咽頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肉腫、前立腺がん、子宮がん、子宮頸部がん、卵巣がん、腟がん、外陰がん、尿道がん、膀胱がん、陰茎がん、精巣がん、血液がん、血管肉腫、白血病、リンパ腫、線維腺腫、およびこれらの転移がんからなる群より選択される１つ以上である、請求項１１に記載の核酸分子。
【請求項13】
請求項１に記載の核酸分子を含む、ウイルス感染症またはがんの予防または治療用のワクチン組成物。
【請求項14】
前記核酸分子は、伝達体に担持または連結されたものである、請求項１３に記載のワクチン組成物。
【請求項15】
前記伝達体は、リポソーム基盤伝達体、脂質基盤伝達体、ポリマー基盤伝達体および脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子からなる群より選択された１つ以上である、請求項１４に記載のワクチン組成物。
【請求項16】
前記伝達体は、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、フィトソーム（ｐｈｙｔｏｓｏｍｅ）、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、脂質－様ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、脂質エマルション（ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、脂質ミセル（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｅｌｌｅ）、ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、ポリマー性ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ナノスフィア（ｎａｎｏsｐｈｅｒｅ）、ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）、ポリマー性ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅ）、脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｐｏｌｙｍｅｒ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、カチオン性ナノエマルション（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、アニオン性ナノエマルション（ａｎｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）およびリポポリプレックス（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘ）からなる群より選択された１つ以上である、請求項１５に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、シグナルペプチドをコードする核酸および抗原をコードする核酸を含むウイルス感染症またはがんの予防または治療用核酸分子に関する。また、本発明は、前記核酸分子を含むウイルス感染症またはがんの予防または治療用ワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【0002】
現在、ワクチンは、多様な方法で開発されて製造されており、具体的な種類としては、病原体を弱毒化された状態で注入する弱毒化／生ワクチン（ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｖａｃｃｉｎｅ）、病原体そのものではなく疾病を引き起こす原因物質（毒素）を非活性化させて作ったトキソイドワクチン（ｔｏｘｏｉｄ ｖａｃｃｉｎｅ）、抗原として認識される抗原決定部位に相当する部分のみを別に抽出して作ったサブユニットワクチン（ｓｕｂｕｎｉｔ ｖａｃｃｉｎｅ）、遺伝子情報を利用してエピトープのみを別に生産して作った組換えワクチン（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｖａｃｃｉｎｅ）などがある。
【0003】
上述したワクチンの中でも、組換えワクチンは、エピトープの以外に他の成分は含まれないため安全性が高いという長所があり、特に、ｍＲＮＡからなる核酸ワクチンは生産速度が速く低費用であり、細胞媒介免疫（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）および体液免疫（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）の両方に対して免疫反応を誘導することができるという点で多くの利点がある。また、抗原の多様な構成成分のうち免疫反応を誘導する特定エピトープのみを選別して使用するなど、ワクチンの構成を多様にデザインすることができるところ、ウイルス感染症、がんなどの多様な疾病の予防または治療に有用に活用されている。
【0004】
一例として、ウイルス感染症としては、風邪、インフルエンザ、水痘、口唇ヘルペスなど比較的軽い症状を見せることから、狂犬病、エボラ、マールブルク、クリミア・コンゴ出血熱ウイルス病、ＡＩＤＳ、鳥インフルエンザ、ＳＡＲＳ、ＣＯＶＩＤ－１９、がんなどの深刻な副作用および後遺症を引き起こす重症疾患を有することができる。よって、感染後に発現された症状を緩和させて治療するより症状の発現を予防することが主要な問題であることによって、ウイルス感染症を予防するためのワクチンの開発が活発に行われている。
【0005】
また、がんワクチンと関連しては、ウイルス感染によって発病するがんだけでなく、細胞の突然変異によって発病するがんに対しても、予防、治療などの用途でがんワクチンが研究および開発されている。がん細胞は、正常細胞には存在しない腫瘍－特異的抗原が存在するが、がんワクチンは、このような腫瘍－特異的抗原を通じてがん細胞特異的免疫反応を誘導することでがん細胞が過剰増殖される前に死滅させる。一部のがんワクチンは、患者オーダーメード型で製作されることもあり、患者のがん細胞遺伝子を分析することで、がんを誘発した突然変異遺伝子を捜し出し、これによりコードされる新生抗原エピトープ（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）に翻訳されるｍＲＮＡをワクチンで製造して投与する場合、該当患者にのみ強力な免疫反応を誘導することができ、オーダーメード型精密医薬で開発が可能であるという長所がある。
【0006】
ただし、ｍＲＮＡワクチンなどの核酸ワクチンは、作用機序の特性上タンパク質への発現効率が非常に重要であり、タンパク質の発現程度によってワクチンの効能が決定されるところ、多様な疾病をターゲットにするだけでなく、タンパク質発現能もまた向上した物質の開発が要求されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明は、シグナルペプチドをコードする核酸および抗原をコードする核酸を含むウイルス感染症またはがんの予防または治療用核酸分子、および前記核酸分子を含むワクチン組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【0008】
本発明において開示されているそれぞれの説明および実施形態は、それぞれの他の説明および実施形態にも適用されることができる。すなわち、本発明において開示されている多様な要素のすべての組み合わせが本発明の範疇に属する。また、下記に記述された具体的な叙述によって本発明の範疇が制限されると見られない。
【0009】
また、本明細書において特に正義されていない用語に対しては、本発明の属する技術分野において通常的に使用される意味を有するものと理解されなければならないだろう。また、文脈上、特に定義しない場合であれば、単数は複数を含み、複数は単数を含む。
【0010】
本発明の一様態は、シグナルペプチドをコードする核酸および抗原をコードする核酸を含む、ウイルス感染症またはがんの予防または治療用核酸分子を提供する。
【0011】
用語「シグナルペプチド」は、タンパク質合成初期にタンパク質のＮ－末端に存在するペプチドを意味し、シグナル配列（ｓｉｇｎａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、ターゲティング配列（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｉｇｎａｌ）、局在化シグナル（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ）、局在化配列（ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）、リーダー配列（ｌｅａｄｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）またはリーダーペプチド（ｌｅａｄｅｒ ｐｅｐｔｉｄｅ）などとも呼ばれる。本発明に係るシグナルペプチドは、核酸分子のタンパク質発現および分泌を増加させる役割を遂行することができる。このとき、本明細書において、前記「タンパク質発現」または「タンパク質発現率」は、「タンパク質翻訳」、「タンパク質翻訳率」、「抗原発現」、「抗原発現率」などと同一の意味で相互交換的に使用されることができる。
【0012】
具体的に、前記シグナルペプチドは、ＩｇＥ（イムノグロブリンＥ：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、第ＩＸ因子（ｆａｃｔｏｒ ＩＸ）およびムチン－様タンパク質１（ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＭＬＰ１）からなる群より選択された１つ以上に由来したものであってよいが、これに制限されるものではない。
【0013】
また、前記シグナルペプチドは、ＩｇＥに由来した配列番号１、アルブミンに由来した配列番号５、ＩＦＮ－γに由来した配列番号９、第ＩＸ因子に由来した配列番号１３、およびＭＬＰ１に由来した配列番号１７で表示されるペプチドからなる群より選択された１つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。
【0014】
また、前記シグナルペプチドをコードする核酸は、配列番号２～４、６～８、１０～１２、１４～１６、および１８～２０からなる群より選択された１つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。
【0015】
用語「抗原」は、特異的抗体生産、サイトカイン分泌などの免疫反応を誘発するタンパク質を意味し、前記抗原は、コロナウイルス、腫瘍ウイルス（ｏｎｃｏｖｉｒｕｓ）、腫瘍－特異的抗原（ｔｕｍｏｒ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ）、腫瘍－関連抗原（ｔｕｍｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ）および新生抗原エピトープ（ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ ｅｐｉｔｏｐｅ）からなる群より選択された１つ以上に由来したものであってよい。
【0016】
前記コロナウイルスの具体的な例として、アルファコロナウイルス属（α－ＣｏＶ、ａｌｐｈａＣｏＶ、ａｌｐｈａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ベータコロナウイルス属（β－ＣｏＶ、ｂｅｔａＣｏＶ、ｂｅｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）、ガンマコロナウイルス属（γ－ＣｏＶ、ｇａｍｍａＣｏＶ、ｇａｍｍａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）またはデルタコロナウイルス属（δ－ＣｏＶ、ｄｅｌｔａＣｏＶ、ｄｅｌｔａｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）に属するものであってよく、さらに具体的に、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、Ｂａｔ－ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ（ＳＬ）－ＺＣ４５、Ｂａｔ－ＳＬ ＺＸＣ２１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＫＵ－１、ＭＨＶ－Ａ５９またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２であってよいが、これに制限されるものではない。
【0017】
さらに具体的に、前記抗原は、コロナウイルス由来のスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）および膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択された１つ以上であってよい。
【0018】
さらに具体的に、前記抗原は、コロナウイルス由来のスパイクタンパク質（ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）および膜タンパク質（ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）からなる群より選択された１つ以上であってよい。本発明に係るコロナウイルスのスパイクタンパク質は、免疫反応を誘導して中和抗体生成能を増加させる役割を遂行することができ、前記膜タンパク質は、ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の機能を向上させるなどの免疫反応を誘導してウイルスに感染した細胞を死滅させる役割を遂行することができる。
【0019】
前記腫瘍ウイルスは、腫瘍（がん）の原因になるウイルスを意味し、具体的な例として、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｖｉｒｕｓ）、ＨＣＶ（Ｃ型肝炎ウイルス：Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ）、ＨＴＬＶ（ヒトＴリンパ球向性ウイルス：Ｈｕｍａｎ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｔｒｏｐｉｃ ｖｉｒｕｓ）、ＨＰＶ（ヒトパピローマウイルス：Ｈｕｍａｎ ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓｅｓ）、ＨＨＶ－８（カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス：Ｋａｐｏｓｉ´ｓ ｓａｒｃｏｍａ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ）、ＭＣＶ（メルケル細胞ポリオーマウイルス：Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）またはＥＢＶ（エプスタイン・バーウイルス：Ｅｐｓｔｅｉｎ－Ｂａｒｒ ｖｉｒｕｓ）であってよいが、これに制限されるものではない。
【0020】
また、前記「腫瘍－特異的抗原」、「腫瘍－関連抗原」および「新生抗原エピトープ」は、正常細胞には存在せず、がん細胞にのみ特異的に存在する抗原またはエピトープを意味する。具体的な例として、フレームシフト突然変異（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ）、スプライス変異（ｓｐｌｉｃｅ ｖａｒｉａｎｔ）、遺伝子融合（ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ）、内因性レトロエレメント（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｒｅｔｒｏｅｌｅｍｅｎｔ）など、がん細胞特異的な突然変異によって誘発された突然変異遺伝子、または前記突然変異遺伝子から発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質であってよい。
【0021】
また、前記抗原は、配列番号２１および２６からなる群より選択された１つ以上のアミノ酸配列であってよく；前記抗原をコードする核酸は、配列番号２２～２５、および２７～３０からなる群より選択された１つ以上の核酸配列であってよいが、これに制限されるものではない。
【0022】
本発明に係る核酸分子は、Ｔｈ細胞エピトープをコードする核酸を含むことができる。
【0023】
用語「Ｔｈ細胞エピトープ」は、Ｔｈ細胞によって認識されてＴｈ細胞による免疫反応を誘導するペプチドを意味し、前記「Ｔｈ細胞（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ）」は、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ヘルパーＴリンパ球、ヘルパーＴ細胞などとも呼ばれる免疫細胞を意味する。本発明に係るＴｈ細胞エピトープは、Ｔｈ細胞による免疫反応を誘導して中和抗体生成能を増加させる役割を遂行することができ、具体的に、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、ＩＬ－１０、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３などの多様なサイトカインを分泌し、これによりＢ細胞の抗体生成、細胞毒性Ｔ細胞の活性化、メモリーＴ細胞の活性化、マクロファージを始めとした食細胞の抗バクテリア活性促進などの免疫反応を遂行することができる。
【0024】
具体的に、前記Ｔｈ細胞エピトープは、破傷風トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）、ジフテリアトキソイド（ＤＴＨ ｔｏｘｏｉｄ）および百日咳トキソイド（Ｐｕｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｏｉｄ）からなる群より選択された１つ以上に由来したペプチドであってよい。前記トキソイドは、毒性は除去されたが免疫反応を誘導する免疫原性が残っている物質を意味し、「破傷風トキソイド（Ｔｅｔａｎｕｓ ｔｏｘｏｉｄ）」は、破傷風菌であるクロストリジウム・テタニー（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ）が生産する神経毒素であるテタノスパスミン（ｔｅｔａｎｏｓｐａｓｍｉｎ）に由来したもの、「ジフテリアトキソイド（ＤＴＨ Ｔｏｘｏｉｄ）」は、コリネバクテリウム・ジフテリア（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）が生産する外毒素に由来したもの、「百日咳トキソイド（Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ ｔｏｘｏｉｄ）」は、百日咳菌であるボルデテラ・パーツシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）が生産するペプチドグリカン切片に由来したものであってよい。また、前記Ｔｈ細胞エピトープは、マクロファージあるいは樹状細胞のような抗原提示細胞のＭＨＣ クラス ＩＩによって提示され、Ｔｈ細胞のＴ細胞受容体（Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）によって感知されて刺激シグナルを伝達するペプチド配列で構成されたエピトープを含むことができる。
【0025】
また、前記Ｔｈ細胞エピトープは、切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）をコードする核酸を追加で含むことができ、また前記抗原とＴｈ細胞エピトープとの間に切断部位をコードする核酸配列を追加で含むことができる。前記用語「切断部位（ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ）」は、タンパク質分解酵素によって切断されるペプチドを意味する。本発明においては、前記核酸分子から発現されたタンパク質が酵素によって認識された部位が切断されることができるようにする役割を遂行し、これを通じて核酸分子に連結された各シグナルペプチド、抗原および／またはＴｈ細胞エピトープが本発明に係る役割を遂行できるようにする。前記切断部位は、細胞内に存在する内因性酵素によって切断されることができ、具体的に、フーリンプロテアーゼ（ｆｕｒｉｎｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ）または口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断部位によって切断されることができるが、これに制限されるものではない。
【0026】
また、前記Ｔｈ細胞エピトープは、配列番号４４のアミノ酸配列であってよく；前記Ｔｈ細胞エピトープをコードする核酸は、配列番号４５および４６からなる群より選択された１つ以上の核酸配列であってよいが、これに制限されるものではない。
【0027】
用語「ウイルス感染症」（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）は、ウイルスが人体の器官や組織で増殖した結果で生じる疾病を意味する。
【0028】
具体的に、前記ウイルス感染症は、コロナウイルス感染症であってよい。前記コロナウイルス感染症の具体的な例として、重症急性呼吸器症候群（Ｓｅｖｅｒｅ Ａｃｕｔｅ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＳＡＲＳ）、中東呼吸器症候群（Ｍｉｄｄｌｅ Ｅａｓｔ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ、ＭＥＲＳ）およびコロナウイルス感染症－１９（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ－２０１９、ＣＯＶＩＤ－１９）からなる群より選択された１つ以上であってよいが、コロナウイルス感染による疾病である限り、これに制限されるものではない。
【0029】
また、前記ウイルス感染症は、がんであってよい。前記がんの具体的な例として、固形がん腫および血液がん腫からなる群より選択された１つ以上であってよく、前記固形がん腫としては、肝がん（Ｈｅｐａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａ）、子宮頸部がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ ｃａｎｃｅｒ）、肛門がん（ａｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、陰茎がん（ｐｅｎｉｓ ｃａｎｃｅｒ）、外陰がん（ｖｕｌｖａ ｃａｎｃｅｒ）、腟がん（ｖａｇｉｎａｌ ｃａｎｃｅｒ）、中咽頭がん（ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ）、カポシ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ´ｓ ｓａｒｃｏｍａ）、鼻咽頭がん（ｎａｓｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、多発性キャッスルマン病（ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｒｉｃ Ｃａｓｔｌｅｍａｎ´ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、原発性滲出液リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ）またはメルケル細胞がん（Ｍｅｒｋｅｌ ｃｅｌｌ ｃａｒｃｉｎｏｍａ）などであってよく、前記血液がん腫としては、Ｔ細胞白血病（Ｔ－ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ）、原発性滲出液リンパ腫（ｐｒｉｍａｒｙ ｅｆｆｕｓｉｏｎ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、バーキットリンパ腫（Ｂｕｒｋｉｔｔ´ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）、ホジキンリンパ腫（Ｈｏｄｇｋｉｎ´ｓ ｌｙｍｐｈｏｍａ）または移植後リンパ増殖性疾患（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ ｌｙｍｐｈｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ ｄｉｓｅａｓｅ）などであってよいが、腫瘍ウイルス感染によるものである限り、これに制限されるものではない。
【0030】
また、本発明に係る核酸分子が予防することができるがんには、具体的な例として、固形がん腫および血液がん腫からなる群より選択された１つ以上であってよく、前記固形がん腫としては、胃がん、肺がん、肝がん、大腸がん、結腸がん、腎臓がん、小腸がん、膵臓がん、脳腫瘍、骨がん、皮膚がん、表皮がん腫、扁平上皮がん、乳がん、硬化性腺症、頭頸部がん、食道がん、咽頭がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、神経芽細胞腫、黒色腫、肉腫、前立腺がん、子宮がん、子宮頸部がん、卵巣がん、腟がん、外陰がん、尿道がん、膀胱がん、陰茎がん、精巣がん、線維腺腫またはこれらの転移がんなどであってよく、前記血液がん腫としては、血液がん、血管肉腫、白血病、リンパ腫、またはこれらの転移がんなどであってよいが、これに制限されるものではない。
【0031】
また、本発明に係る核酸分子は、ワクチン製造用核酸分子であってよく、ウイルス感染症またはがんの予防または治療用ワクチンの製造用核酸分子であってよい。
【0032】
用語「予防」は、本発明に係る核酸分子によってウイルス感染症またはがんが抑制または遅延するすべての行為を意味する。
【0033】
用語「治療」は、本発明に係る核酸分子によってウイルス感染症またはがんの症状が好転または完治されるすべての行為を意味する。
【0034】
用語「核酸分子」は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、前記核酸分子において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドだけでなく、糖または塩基部位が変形されたアナログ（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の核酸分子の配列は変異することができ、前記変異は、１つ以上のヌクレオチドの付加、欠失、非保存的な置換または変形を含む。
【0035】
また、核酸配列およびアミノ酸配列を含む、本発明において利用されるすべての配列は、生物学的に均等活性を有する変異を考慮すると、配列リストに記載した配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解析される。前記用語「実質的な同一性」は、本発明の配列と任意の他の配列を最大限対応するように整列（ａｌｉｇｎ）し、当業界において通常的に利用されるアルゴリズムを利用して整列された配列を分析した場合に、最小６０％の相同性、さらに具体的に７０％の相同性、さらに具体的に８０％の相同性、最も具体的に９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の相同性を示す配列を意味する。
【0036】
したがって、本発明の配列番号１～５９で表示される配列と高い相同性を有する配列、例えば、その相同性が７０％以上、具体的に８０％以上、さらに具体的に９０％以上の高い相同性を有する配列も本発明の範囲に含まれるものと解析されなければならない。
【0037】
前記核酸分子は、本発明に係るシグナルペプチド、抗原および／またはＴｈ細胞エピトープを次のような構造で含むことができる：５´－［シグナルペプチド］－［抗原］－３´または５´－［シグナルペプチド］－［抗原］－［Ｔｈ細胞エピトープ］－３´。
【0038】
このとき、前記シグナルペプチド、抗原および／またはＴｈ細胞エピトープは、上述した順序に制限されるものではなく、本発明に係る役割を遂行することができる限り、その順序には制限がない。
【0039】
また、前記シグナルペプチド、抗原および／またはＴｈ細胞エピトープは、前記核酸分子に単数または複数で含まれることができ、タンパク質の発現率が減少しない限り、その数には制限がない。
【0040】
また、前記核酸分子は、前記シグナルペプチド、抗原および／またはＴｈ細胞エピトープの以外に、タンパク質への発現のための一般的な核酸配列、具体的な例として、７－メチルグアノシン（７－ｍｅｔｈｙｌｇｕａｎｏｓｉｎｅ）を含む５´－ＣＡＰ、Ｋｏｚａｋ配列、開始コドン、終止コドン、アデノシン（ａｄｅｎｏｓｉｎｅ）を含む３´－ポリＡテール（３´－Ｐｏｌｙ Ａ ｔａｉｌ）などを含むことができる。
【0041】
本発明の他の一様態は、前記核酸分子を含む、ウイルス感染症またはがんの予防または治療用ワクチン組成物を提供する。
【0042】
このとき、前記「核酸分子」、「ウイルス感染症」および「がん」に対する説明は、前述のとおりである。
【0043】
用語「予防」は、本発明に係るワクチン組成物の投与によってウイルス感染症またはがんが抑制または遅延するすべての行為を意味する。
【0044】
用語「治療」は、本発明に係るワクチン組成物の投与によってウイルス感染症またはがんの症状が好転または完治されるすべての行為を意味する。
【0045】
用語「ワクチン」は、個体に免疫を与える抗原を含有した生物学的な製剤であって、感染症の予防のために個体に注射するか経口投与することで個体の生体に免疫が生じるようにする免疫原または抗原性物質を言う。前記ワクチンは、ＲＮＡワクチンであってよく、具体的にｍＲＮＡワクチンであってよい。用語「ｍＲＮＡワクチン」は、抗原の遺伝子のうち一部を人工的に複製した後、これを投与することで免疫反応を引き起こすワクチンを意味する。このようなｍＲＮＡワクチンは、既存のタンパク質ワクチンに比べて多様な長所を持つが、まず、純粋な標的抗原の遺伝情報のみで合成製作が可能であるため、危険な病原体を直接取り扱う必要がなく、毒性誘発に必要な遺伝子のうち一部のみを使用するので、投与されても別に毒性を表す恐れがなく、ｍＲＮＡのみから構成される単純さのため急に発生する感染病または多様な突然変異に対するワクチンを速かに開発することができるというなどの多様な長所を持っている。
【0046】
具体的に、本発明に係るウイルス感染症またはがんの予防または治療用ワクチン組成物は、コロナウイルス感染症および／またはがんの予防または治療用として使用されることができ、コロナウイルス、腫瘍ウイルス、腫瘍－特異的抗原、腫瘍－関連抗原および／または新生抗原エピトープに対する免疫能を有するものであってよい。前記コロナウイルスの具体的な例として、アルファコロナウイルス属、ベータコロナウイルス属、ガンマコロナウイルス属またはデルタコロナウイルス属、さらに具体的な例として、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、Ｂａｔ－ＳＡＲＳ－ｌｉｋｅ（ＳＬ）－ＺＣ４５、Ｂａｔ－ＳＬ ＺＸＣ２１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＫＵ－１、ＭＨＶ－Ａ５９またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２などであってよく、前記腫瘍ウイルスの具体的な例として、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ、ＨＰＶ、ＨＨＶ－８、ＭＣＶまたはＥＢＶなどであってよいが、これに制限されるものではない。
【0047】
また、前記ワクチン組成物に含まれる前記核酸分子は、伝達体に担持されるか、または連結されたものであってよく、前記伝達体は、リポソーム基盤伝達体、脂質基盤伝達体、ポリマー基盤伝達体および脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子からなる群より選択された１つ以上であってよいが、これに制限されるものではない。前記伝達体の具体的な例として、リポソーム（ｌｉｐｏｓｏｍｅ）、フィトソーム（ｐｈｙｔｏｓｏｍｅ）、エトソーム（ｅｔｈｏｓｏｍｅ）、脂質ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、脂質－様ナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、脂質エマルション（ｌｉｐｉｄ ｅｍｕｌｓｉｏｎ）、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ）、脂質ミセル（ｌｉｐｉｄ ｍｉｃｅｌｌｅ）などのリポソーム基盤伝達体または脂質基盤伝達体；ポリマーソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｓｏｍｅ）、ポリマー性ナノ粒子（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、デンドリマー（ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ナノスフィア（ｎａｎｏsｐｈｅｒｅ）、ポリプレックス（ｐｏｌｙｐｌｅｘ）、ポリマー性ミセル（ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ ｍｉｃｅｌｌｅ）などのポリマー基盤伝達体；または脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子（ｌｉｐｉｄ－ｐｏｌｙｍｅｒ ｈｙｂｒｉｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ）、カチオン性ナノエマルション（ｃａｔｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、アニオン性ナノエマルション（ａｎｉｏｎｉｃ ｎａｎｏｅｍｕｌｓｉｏｎ）、リポポリプレックス（ｌｉｐｏｐｏｌｙｐｌｅｘ）などの脂質－ポリマーハイブリッドナノ粒子であってよいが、これに制限されるものではない。
【0048】
本発明のワクチン組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むことができる。前記用語「薬学的に許容可能な担体」は、任意のすべての溶媒、分散媒質、コーティング剤、抗原補強剤、安定剤、賦形剤、希釈剤、保存剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張性作用剤、吸着遅延剤などを含む。前記担体の具体的な例として、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、マルチトール、澱粉、グリセリン、アラビアガム、アルジネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウムおよび鉱物油を有することができるが、これに制限されるものではない。
【0049】
また、本発明のワクチン用組成物は、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルション、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用されることができる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤することができる。
【0050】
前記ワクチン組成物は、多様な形態で個体に投与されることができる。前記「投与」は、皮下投与、筋肉内投与、皮内投与、腹膜内投与、静脈投与、鼻腔投与、経皮投与、非経口投与および経口投与などで遂行されることができるが、これに制限されるものではない。
【0051】
前記ワクチン組成物は、免疫反応を改善または強化させるために１つ以上のアジュバンドなどを含むことができる。適切なアジュバンドには、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の合成アナログ、非メチル化されたシチジン－グアニジン型のオリゴ核酸、ペプチド、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、酸化アルミニウムおよびＭａｒｃｏｌ ５２のようなミネラルオイルまたは植物性オイル、および１つ以上の乳化剤で構成された組成物またはリゾレシチン、多価カチオン、多価アニオンのような表面活性物質などが含まれる。
【0052】
本発明のまた他の一様態は、前記ワクチン組成物をこれを必要とする個体に投与するステップを含む、個体でウイルス感染症またはがんに対する免疫反応を生成する方法を提供する。
【0053】
このとき、前記「ワクチン組成物」、「ウイルス感染症」、「がん」および「投与」に対する説明は、前述のとおりである。
【0054】
用語「個体」は、ウイルスに感染する可能性があるか、感染した個体、またはがんが発病する可能性があるか、発病した個体をすべて含み、ヒト、任意の非ヒト動物、魚類または植物類などを制限なく含むことができる。前記非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、霊長類、犬、牛、馬、豚、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、モルモットなどであってよい。本明細書において、前記「個体」は、「対象体」または「患者」と相互交換的に使用されることができる。
【0055】
用語「免疫反応」は、抗原の導入に対する反応への個体免疫系が活性化されることを意味する。このとき、前記免疫反応は、細胞媒介免疫（ｃｅｌｌ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）または体液免疫（ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ）、または両方の形態であってよい。
【0056】
前記免疫反応生成方法において、本発明のワクチン組成物は、有効量の有効成分、すなわち本発明に係る核酸分子を薬学的に許容可能な担体およびアジュバンドとともに含むことができる。用語「有効量」は、前記ワクチン組成物が投与される個体でウイルス感染症またはがんに対して特異的免疫反応を誘導するに十分な量であることを意味する。前記有効量は、当分野の熟練者によって容易に決定されることができ、例えば、動物における通常の実験を通じて決定されることができる。
【0057】
本発明のまた他の一様態は、前記ワクチン組成物を、これを必要とする個体に投与するステップを含む、個体でウイルス感染症またはがんを予防または治療する方法を提供する。
【0058】
このとき、前記「ワクチン組成物」、「ウイルス感染症」、「がん」、「個体」、「投与」、「予防」および「治療」に対する説明は、前述のとおりである。
【発明の効果】
【0059】
本発明に係る核酸分子は、細胞内タンパク質発現率および細胞外部へのタンパク質分泌能に優れている。また、生体内に投与される場合、個体で抗原特異的中和抗体誘導などの体液性免疫力を獲得するようにし、ウイルスの死滅に直接関与する免疫細胞の量を増加させるなどの細胞性免疫力を獲得するようにするので、ウイルス感染症またはがんの予防および治療のためのワクチンとして有用に活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【0060】
【図1】各シグナルペプチドと抗原タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質（以下、「スパイクタンパク質」と命名する）が融合された、ｍＲＮＡ核酸分子の電気泳動結果を見せるイメージである。「ｓｓＲＮＡ ｌａｄｄｅｒ」はｍＲＮＡのサイズを測定するためのサイズマーカーであり、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずにスパイクタンパク質のみ含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ ＳＰ」は、アルブミン由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ ＳＰ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＳＰ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｍｕｃｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果である。
【図2】各シグナルペプチドと抗原タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス膜タンパク質（以下、「膜タンパク質」と命名する）が融合された、ｍＲＮＡ核酸分子の電気泳動結果を見せるイメージである。「ｓｓＲＮＡ ｌａｄｄｅｒ」は、ｍＲＮＡのサイズを測定するためのサイズマーカーであり、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずに膜タンパク質のみ含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ」は、アルブミン由来シグナルペプチドおよび膜タンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチドおよび膜タンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチドおよび膜タンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＭＬＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよび膜タンパク質が含まれた核酸分子に関する結果である。また、「Ｗｉｌｄ ＳＰ」は、各シグナルペプチドを野生型コドンに最適化した結果、「Ｙｅａｓｔ ｏｐｔｉ．ＳＰ」は、各シグナルペプチドを酵母コドンに最適化した結果である。
【図3】各シグナルペプチドと抗原タンパク質としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質（以下、「スパイクタンパク質」と命名する）、Ｔｈ細胞エピトープが融合された、ｍＲＮＡ核酸分子の電気泳動結果を見せるイメージである。「ｓｓＲＮＡ ｌａｄｄｅｒ」は、ｍＲＮＡのサイズを測定するためのサイズマーカーであり、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずにスパイクタンパク質のみ含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ ＳＰ」は、アルブミン由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ ＳＰ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＳＰ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｍｕｃｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果である。
【図4】細胞で発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質（以下、「スパイクタンパク質」と命名する）の量を見せるイメージであって、各核酸分子で形質感染された細胞溶解物に含まれているタンパク質の量に関する。「Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、核酸分子で形質感染されていない細胞（陰性対照群）に関する結果、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずにスパイクタンパク質のみ含まれた核酸分子に関する結果、「ＩｇＥ」は、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ ＳＰ」は、アルブミン由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ ＳＰ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＳＰ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｍｕｃｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果である。
【図5a】細胞で発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質（以下、「スパイクタンパク質」と命名する）の量を見せるイメージである。「ｍｅｄｉａ」は、各核酸分子で形質感染された細胞培養培地に含まれているタンパク質の量に関し、「ｌｙｓａｔｅ」は、各核酸分子で形質感染された細胞溶解物に含まれているタンパク質の量に関する。「Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、核酸分子で形質感染されていない細胞（陰性対照群）に関する結果、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずにスパイクタンパク質のみ含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ ＳＰ」は、アルブミン由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ ＳＰ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＳＰ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果、「Ｍｕｃｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびスパイクタンパク質が含まれた核酸分子に関する結果である。
【図5c】細胞で発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質（以下、「スパイクタンパク質」と命名する）の量を見せるイメージである。「ｍｅｄｉａ」は、各核酸分子で形質感染された細胞培養培地に含まれているタンパク質の量に関し、「ｌｙｓａｔｅ」は、各核酸分子で形質感染された細胞溶解物に含まれているタンパク質の量に関する。「Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ」は、核酸分子で形質感染されていない細胞（陰性対照群）に関する結果、「Ｎｏ ＳＰ」は、シグナルペプチドが含まれずにスパイクタンパク質およびＴｈ細胞エピトープのみ含まれた核酸分子に関する結果、「Ａｌｂｕｍｉｎ ＳＰ」は、アルブミン由来シグナルペプチド、スパイクタンパク質およびＴｈ細胞エピトープが含まれた核酸分子に関する結果、「ＩＦＮ－γ ＳＰ」は、ＩＦＮ－γ由来シグナルペプチド、スパイクタンパク質およびＴｈ細胞エピトープが含まれた核酸分子に関する結果、「Ｆａｃｔｏｒ ＩＸ ＳＰ」は、第ＩＸ因子由来シグナルペプチド、スパイクタンパク質およびＴｈ細胞エピトープが含まれた核酸分子に関する結果、「Ｍｕｃｉｎ ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ＳＰ」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチド、スパイクタンパク質およびＴｈ細胞エピトープが含まれた核酸分子に関する結果である。
【図6a】細胞内で発現されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質の量を見せるイメージであって、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子で形質感染された細胞に対する結果である（「ＳＴＰ２１０４」）。「Ｓ０」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を意味し、「Ｓ１」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質のサブユニット１を意味する。「α／β－チューブリン」は、ローディングコントロールとして使用した。
【図6b】細胞の培養液で検出されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質の量を見せるグラフであって、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子で形質感染された細胞に対する結果である。前記核酸分子は、０．１または０．０５ｇ／Ｌの濃度で使用した。
【図7】マウスで形成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質特異的結合抗体の量を見せるグラフであって、２次（ブースター）接種した後、３週目に測定した結果である。各抗体の量は、エンドポイント力価（ｅｎｄｐｏｉｎｔ ｔｉｔｅｒ）で示した。「Ａｇ１＋ＬＮＰ１」は、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子に関する結果、「Ａｇ２＋ＬＮＰ１」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子に関する結果、「Ａｇ３＋ＬＮＰ１」は、ＩｇＥ由来シグナルペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質およびＴｈ細胞エピトープを含む核酸分子に関する結果である。また、「ＲＢＤ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｔａｌ ＩｇＧ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質のうちＲＢＤ（受容体結合ドメイン：ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に特異的な抗体の量に関する結果であり、「Ｓ１ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏｔａｌ ＩｇＧ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質のうちサブユニット１（Ｓ１）に特異的な抗体の量に関する結果である。
【図8】マウスで形成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質特異的中和抗体の量を見せるグラフであって、ＰＲＮＴ（プラーク減少中和試験：Ｐｌａｑｕｅ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｅｓｔ）５０値をＬｏｇ値に変換して示した。「Ａｇ１＋ＬＮＰ１」は、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子に関する結果、「Ａｇ２＋ＬＮＰ１」は、ＭＬＰ１由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子に関する結果、「Ａｇ３＋ＬＮＰ１」は、ＩｇＥ由来シグナルペプチド、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質およびＴｈ細胞エピトープを含む核酸分子に関する結果、「Ｍｏｃｋ」は、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水：Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）に関する結果である。
【図9a】マウスで形成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質特異的結合抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ）の量を見せるグラフであって、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスに関する結果である。１次（プライム）接種した後、４週目に測定した結果であって、各抗体の量は、光学密度（Ｏ．Ｄ．）で示した。「ＲＢＤ ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質のうちＲＢＤ（受容体結合ドメイン：ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の量は免疫接種量によって増加することを示唆する結果、「Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の量は免疫接種量によって増加することを示唆する結果である。本ｍＲＮＡワクチンの免疫注射による生体内ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体割合の増加は、Ｔｈ２タイプの体液性免疫反応が優勢に誘導されることを意味する。
【図9b】マウスで形成されたＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質特異的結合抗体（ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａアイソタイプ）の量を見せるグラフであって、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスに関する結果である。２次（ブースター）接種した後、３週目に測定した結果であって、各抗体の量は、光学密度（Ｏ．Ｄ．）で示した。「ＲＢＤ ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質のうちＲＢＤ（受容体結合ドメイン：ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の量は免疫接種量によって増加することを示唆する結果、「Ｓ ｐｒｏｔｅｉｎ」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質に特異的なＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ抗体の量は免疫接種量によって増加することを示唆する結果である。本ｍＲＮＡワクチンの免疫注射による生体内ＩｇＧ１／ＩｇＧ２ａ抗体割合の増加は、Ｔｈ２タイプの体液性免疫反応が優勢に誘導されることを意味する。
【図10】マウスで形成された胚中心（Ｇｅｒｍｉｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ；ＧＣ）Ｂ細胞の量を見せるグラフであって、ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスに関する結果である。体液性免疫反応は、メモリーＢ細胞と寿命が長い形質細胞を生成するために、胚中心（ＧＣ）でＢ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞（濾胞性ヘルパーＴ細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｈｅｌｐｅｒ Ｔ ｃｅｌｌｓ；ＴＦＨ細胞）の特殊集団間の相互作用を必要とする。ＧＣ Ｂ細胞とＴＦＨ細胞との間の分子クロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）は、各細胞類型の生存、増殖および分化に影響を及ぼす。
【図11】マウスで形成されたＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ＋細胞）の量を見せるグラフである。ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスから脾腫細胞を分離してスパイク全体アミノ酸配列に対して１５ｍｅｒ長さのペプチドを９ｍｅｒ重複するように合成した後、５個のグループでペプチドプールを構成し（ペプチド１～５）、そのうちからペプチドプール２で脾腫細胞を試験管で刺激したフローサイトメトリー分析に関する結果である。
【図12】マウスで形成されたＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ＋細胞）の量を見せるグラフである。ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスから脾腫細胞を分離して、前述のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチドプール２で刺激して得た結果である。
【図13】マウスで形成されたＣＤ８＋効果（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）メモリーＴ細胞（ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ－細胞）の量を見せてグラフである。ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスから脾腫細胞を分離して、前述のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチドプール２で刺激して得た結果である。
【図14】マウスで形成されたＩＦＮ－γ分泌細胞の数をＥＬＩＳｐｏｔで分析した結果を見せるグラフである。ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウス脾腫から分離した脾腫細胞でＩＦＮ－γを分泌する細胞の数に関する結果である。「ＮＣ」は、陰性対照群（Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ）でペプチドで刺激せずに得た結果、「ＰＰ２」は、前述のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチドプール２で刺激して得た結果である。
【図15】マウスで形成されたＩＦＮ－γ分泌細胞のＩＦＮ－γ染色程度を活性度で見せるグラフである。ＩｇＥ由来シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質を含む核酸分子が１、５または１０μｇで投与されたマウスから脾腫細胞を分離して前述のようなＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチドプール２で刺激して得た結果である。
【発明を実施するための形態】
【0061】
本発明に対しては、下記の実施例に基づいて、より詳細に説明されるはずであるが、これは、本発明の権利範囲を制限しようとするものではない。また、当該技術分野において通常の知識を有する者であれば、本発明の趣旨を害しない範囲内で本発明に対して多様な変形および修正を加えることができるはずである。
【0062】
実施例１．ワクチン用核酸分子の製造
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、細胞免疫原性および中和抗体生成誘導能に優れ、特にタンパク質への発現率が有意に増加した核酸分子を製造した。
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、細胞免疫原性および中和抗体生成誘導能に優れ、特にタンパク質への発現率が有意に増加した核酸分子を製造した。
【0063】
具体的に、本発明に係る核酸分子が生体内に投与される場合、抗原タンパク質への発現率が増加されて免疫反応を引き起こす細胞免疫原性が増加し、これにより、人体内の中和抗体が短い時間内に多い量で生成されることができ、さらに、Ｔｈ細胞による免疫反応が効率的に誘導されてサイトカイン分泌能が増加することで、ウイルス感染症またはがんに対して極大化した予防および／または治療効能を示す。
【0064】
前記目的を達成するために、核酸分子には、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）、Ｔｈ細胞エピトープ（Ｔ ｈｅｌｐｅｒ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）などを含ませ、予防および／または治療効能誘導を目的とする特定抗原を含ませた。前記ペプチド、タンパク質などの塩基配列およびアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋで確保し、前記ＧｅｎＢａｎｋで確保した野生型配列に対してヒトまたは酵母のコドンに最適化を遂行することで、抗原タンパク質発現効率が増進した核酸分子を製造した。コドン最適化は、タンパク質をコードする遺伝子がよく発現できるように各個体が選好するコドンになるように変更して最適化させることで、ＧＣ含量、繰り返した塩基配列、転写効率、発現量、タンパク質の折りたたみ、ｍＲＮＡ二次構造など多数の要因を考慮して遂行される。前記要因間の相互関連性がコドン最適化結果において多様に影響を及ぼすので、目的とする水準の発現量を示し得るｍＲＮＡ配列を製作することは、難しい場合が多くて非常に難しい。
【0065】
また、前記核酸分子のＧＣ含量とｍＲＮＡ ２次構造の自由エネルギーを計算してタンパク質発現量などを予測したが、前記ｍＲＮＡ ２次構造の自由エネルギーが増加すると、構造の安定性が低くなり構造が容易に崩壊するところ、リボソームによる認識効率が増加されることにつれタンパク質発現率が増加することができる。
【0066】
このとき、前記シグナルペプチド、抗原、Ｔｈ細胞エピトープなどは、次のように構成して核酸分子をデザインした：５´－［シグナルペプチド］－［抗原］－３´または５´－［シグナルペプチド］－［抗原］－［Ｔｈ細胞エピトープ］－３´。
【0067】
実施例１－１．シグナルペプチド製作
タンパク質発現率に優れたワクチン用核酸分子を製造するために、まず、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＳＰ）を製作した。
タンパク質発現率に優れたワクチン用核酸分子を製造するために、まず、シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ、ＳＰ）を製作した。
【0068】
具体的に、ヒト由来のＩｇＥ（イムノグロブリンＥ：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｅ）、アルブミン（ａｌｂｕｍｉｎ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－γ）、第ＩＸ因子（ｆａｃｔｏｒ ＩＸ、Ｆ ＩＸ）、ムチン－様タンパク質１（ｍｕｃｉｎ－ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ １、ＭＬＰ１）など、互いに異なる５種類のタンパク質に由来したシグナルペプチドを確保した。これらのシグナルペプチドの配列を多様に変異させ、そのうちから抗原タンパク質の発現率に優れた配列を選別した。その結果は、下記表１に示した。例えば、配列番号３の核酸配列は、ＩｇＥ由来のシグナルペプチドをヒトに対してコドン最適化させた形態である。
【0069】
【表1】
【0070】
実施例１－２．抗原製作
実施例１－２－１．「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質製作
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、１つの例示として、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスである「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の抗原を使用した。
実施例１－２－１．「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質製作
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、１つの例示として、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスである「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の抗原を使用した。
【0071】
具体的に、宿主細胞の受容体認識、細胞膜融合、中和抗体誘導など感染および病原性に中心的な役割を遂行すると知られているスパイクタンパク質（Ｓｐｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｓ）を使用した。以後、前記実施例１－１による方法でコドン最適化を遂行し、その結果は、下記表２に示した。例えば、配列番号２３の核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質抗原をヒトに対してコドン最適化させた形態であり、配列番号２５の核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質抗原をヒトに対してコドン最適化させたことと酵母に対してコドン最適化させたことをすべて有する形態である。
【0072】
【表2】
【0073】
結果的に、酵母コドンとヒトコドンをすべて有する形態がヒト細胞でウイルス抗原の発現率が高く、目的とする感染症の予防効果にも優れる程度で示すことを確認した。
【0074】
よって、以後のワクチン用核酸分子の製造に使用する抗原としては、酵母コドンとヒトコドンをすべて有する形態である配列番号２５の核酸を使用した。
【0075】
実施例１－２－２．「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」膜タンパク質製作
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、１つの例示として、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスである「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の抗原を使用した。
ウイルス感染症またはがんの予防に使用され得るワクチン候補物質を開発するために、１つの例示として、ＣＯＶＩＤ－１９を引き起こすウイルスである「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」の抗原を使用した。
【0076】
具体的に、コロナウイルスの多様な変異体間に遺伝子を比較したとき、よく保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）遺伝子である膜タンパク質（Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎ、Ｍ）を使用した。以後、前記実施例１－１による方法でコドン最適化を遂行し、その結果は、下記表３に示した。例えば、配列番号２８の核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質抗原をヒトに対してコドン最適化させた形態であり、配列番号３０の核酸配列は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質抗原をヒトに対してコドン最適化させたことと酵母に対してコドン最適化させたことをすべて有する形態である。
【0077】
【表3】
【0078】
結果的に、酵母コドンとヒトコドンをすべて有する形態がヒト細胞で抗原の発現率が高く、目的とする感染症の予防効果にも優れる程度で示すことを確認した。
【0079】
よって、以後のワクチン用核酸分子の製造に使用する抗原としては、酵母コドンとヒトコドンをすべて有する形態である配列番号３０の核酸を使用した。
【0080】
実施例１－３．シグナルペプチドおよび抗原の融合
実施例１－３－１．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質利用
タンパク質発現効率が増加した核酸分子を製造するために、まず、前記実施例１－１を通じて確保した５種のシグナルペプチドと前記実施例１－２－１を通じて確保したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を融合させた核酸分子を製造した。
実施例１－３－１．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質利用
タンパク質発現効率が増加した核酸分子を製造するために、まず、前記実施例１－１を通じて確保した５種のシグナルペプチドと前記実施例１－２－１を通じて確保したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスのスパイクタンパク質を融合させた核酸分子を製造した。
【0081】
具体的に、前記スパイクタンパク質は、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有する形態を使用し、これは、下記表４に整理した。
【0082】
【表4】
【0083】
以後、前記核酸分子をｍＲＮＡで合成するために、１０Ｘ Ｔ７ ＲＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｂｕｆｆｅｒ（ダインバイオ、カタログ＃ＤＹＰ１６４７）、２ｍＭ ＡＴＰ、２ｍＭ ＵＴＰ、２ｍＭ ＣＴＰ、２ｍＭ ＧＴＰ、３．２ｍＭ Ｃｌｅａｎｃａｐ ＡＧ（トライリンク、カタログ＃Ｎ－７１１３－１０）、５％ ＤＭＳＯ（シグマアルドリチカタログ＃４７２３０１－５００ＭＬ）、１０ｍｇ／Ｌ抗原（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクタンパク質）ＤＮＡ転写鋳型、８００Ｕ／ｍＬ組換えＲＮａｓｅ阻害タンパク質（タカラカタログ＃２３１６Ａ）、２Ｕ／ｍＬ酵母無機ピロホスファターゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィックカタログ＃ＥＦ０２２１）、２５００Ｕ／ｍＬ Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ（ダインバイオカタログ＃ｄｙ１６７０）を混合した。前記転写反応混合物を３７℃で２時間の間インキュベーションした。ｍＲＮＡの合成可否は、ロンザＧｅｌＳｔａｒＴＭ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ ｇｅｌ Ｓｔａｉｎ（カタログ＃５０５３５）を添加した１％アガロースゲルを利用して電気泳動を進行して確認した。一方、合成した前記ｍＲＮＡをＡＫＴＡ（サイティバ、ＡＫＴＡ ａｖａｎｔ）でＯｌｉｇｏ（ｄＴ）カラム（ビアセパレーション、カタログ＃３１１．１２１９－２）を使用して精製し、以後のｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ実験に使用した。
【0084】
その結果、図１から見られるように、各シグナルペプチドと抗原タンパク質が融合された核酸分子のすべては、約４，１１９ｎｔのサイズでバンドを示すことを確認した。これは、各シグナルペプチドと抗原タンパク質をすべて含むサイズであるので、本実施例において合成したワクチン用ｍＲＮＡ核酸分子はよく製造され、完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が確保されたことを確認した。
【0085】
実施例１－３－２．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」膜タンパク質利用
タンパク質発現効率が増加した核酸分子を製造するために、まず、前記実施例１－１を通じて確保した４種のシグナルペプチドと前記実施例１－２－２を通じて確保したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの膜タンパク質を融合させた核酸分子を製造し、これは、下記表５に整理した。
タンパク質発現効率が増加した核酸分子を製造するために、まず、前記実施例１－１を通じて確保した４種のシグナルペプチドと前記実施例１－２－２を通じて確保したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの膜タンパク質を融合させた核酸分子を製造し、これは、下記表５に整理した。
【0086】
【表5】
【0087】
以後、前記実施例１－３－１による方法で、前記核酸分子をｍＲＮＡで合成した後、その合成可否を確認し、また合成されたｍＲＮＡを精製した。
【0088】
その結果、図２から見られるように、各シグナルペプチドと抗原タンパク質が融合された核酸分子のすべては、約１，１０７ｎｔのサイズでバンドを示すことを確認した。これは、各シグナルペプチドと抗原タンパク質をすべて含むサイズであるので、本実施例において合成したワクチン用ｍＲＮＡ核酸分子はよく製造され、完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が確保されたことを確認した。
【0089】
実施例１－４．Ｔｈ細胞エピトープ製作
細胞免疫原性およびこれによる免疫反応誘導能が増加したワクチン用核酸分子を製造するために、まず、Ｔｈ細胞エピトープを製作した。
細胞免疫原性およびこれによる免疫反応誘導能が増加したワクチン用核酸分子を製造するために、まず、Ｔｈ細胞エピトープを製作した。
【0090】
具体的に、Ｔｈ細胞エピトープは１つの例示であって、破傷風トキソイドに由来したＴｈ細胞エピトープ（Ｔｅｔａｎｕｓ Ｔｏｘｏｉｄ Ｔｈ ｃｅｌｌ ｅｐｉｔｏｐｅ、ＴＴＴｈ）を使用した。また、前記ＴＴＴｈは、互いに異なる配列を有する切断部位（Ｃｌｅａｖａｇｅ ｓｉｔｅ、ＣＳ）で連結されるようにした。前記切断部位を含むＴｈ細胞エピトープは終止コドンを含ませ、次のようにデザインしてＯＲＦのＣ－末端に位置するように構成した：５´－［ＣＳ１］－［ＴＴＴｈ１］－［ＣＳ２］－［ＴＴＴｈ２］－［終止コドン］－３´。前記構成に対応する具体的なアミノ酸配列は次のとおりである：
５´－［ＲＱＫＲ］－［ＩＤＫＩＳＤＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩ］－［ＰＫＫＲ］－［ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ］－５´。以後、前記実施例１－１による方法でコドン最適化を遂行し、これは、下記表６に整理した。例えば、配列番号４６の核酸配列は、ＴＴＴｈをヒトに対してコドン最適化させた形態である。
５´－［ＲＱＫＲ］－［ＩＤＫＩＳＤＶＳＴＩＶＰＹＩＧＰＡＬＮＩ］－［ＰＫＫＲ］－［ＮＮＦＴＶＳＦＷＬＲＶＰＫＶＳＡＳＨＬＥ］－５´。以後、前記実施例１－１による方法でコドン最適化を遂行し、これは、下記表６に整理した。例えば、配列番号４６の核酸配列は、ＴＴＴｈをヒトに対してコドン最適化させた形態である。
【0091】
【表6】
【0092】
結果的に、ヒトのコドンを有する形態がヒト細胞でＴｈ細胞エピトープ発現率が高く、目的とするワクチン効果にも優れる程度で示すことを確認した。
【0093】
実施例１－５．シグナルペプチド、抗原およびＴｈ細胞エピトープの融合
実施例１－５－１．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質利用
前記実施例１－１～１－３などを通じて、タンパク質発現率が高いことと立証されたシグナルペプチドは、酵母のコドンを有する形態であって、タンパク質発現率が高いことと立証された抗原「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質は、酵母およびヒトのコドンをすべて有する形態であることを確認した。このように確認されたシグナルペプチド配列および抗原配列にＴｈ細胞エピトープ配列を融合して核酸分子を製造した。その配列は、下記表７に整理した。
実施例１－５－１．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質利用
前記実施例１－１～１－３などを通じて、タンパク質発現率が高いことと立証されたシグナルペプチドは、酵母のコドンを有する形態であって、タンパク質発現率が高いことと立証された抗原「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」スパイクタンパク質は、酵母およびヒトのコドンをすべて有する形態であることを確認した。このように確認されたシグナルペプチド配列および抗原配列にＴｈ細胞エピトープ配列を融合して核酸分子を製造した。その配列は、下記表７に整理した。
【0094】
【表7】
【0095】
以後、前記実施例１－３－１による方法で、前記核酸分子をｍＲＮＡで合成し、ｍＲＮＡの合成可否を確認し、また合成されたｍＲＮＡを精製した。
【0096】
その結果、図３から見られるように、各シグナルペプチドと抗原タンパク質が融合された核酸分子のすべては、約４，１１９ｎｔのサイズでバンドを示すことを確認した。これは、各シグナルペプチド、抗原タンパク質およびＴｈ細胞エピトープをすべて含むサイズであるので、本実施例において合成したワクチン用ｍＲＮＡ核酸分子はよく製造され、完全性（ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ）が確保されたことを確認した。
【0097】
実施例１－５－２．抗原として「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」膜タンパク質利用
前記実施例１－１～１－３などを通じて、タンパク質発現率が高いことと立証されたシグナルペプチドは、野生型のコドンを有するか、酵母のコドンを有する形態であり、タンパク質発現率が高いことと立証された抗原「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」膜タンパク質は、酵母およびヒトのコドンをすべて有する形態であることを確認した。このように確認されたシグナルペプチド配列および抗原配列にＴｈ細胞エピトープ配列を融合して核酸分子を製造した。その配列は、下記表８に整理した。
前記実施例１－１～１－３などを通じて、タンパク質発現率が高いことと立証されたシグナルペプチドは、野生型のコドンを有するか、酵母のコドンを有する形態であり、タンパク質発現率が高いことと立証された抗原「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２」膜タンパク質は、酵母およびヒトのコドンをすべて有する形態であることを確認した。このように確認されたシグナルペプチド配列および抗原配列にＴｈ細胞エピトープ配列を融合して核酸分子を製造した。その配列は、下記表８に整理した。
【0098】
【表8】
【0099】
実施例２．シグナルペプチドを含むワクチン用核酸分子の効果
実施例２－１．ワクチン用核酸分子のタンパク質発現量分析
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質発現率を分析した。通常的にｉｎ ｖｉｔｒｏで高発現特性を示す場合、ｉｎ ｖｉｖｏで高免疫原性を示し、これによりワクチンの効能が増加すると知られている。前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１または１－５－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、いずれも酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）、アルブミン由来（配列番号８）、インターフェロンガンマ由来（配列番号１２）、第ＩＸ因子由来（配列番号１６）またはＭＬＰ１由来（配列番号２０）のものを使用し、Ｔｈ細胞エピトープとしては、ヒトコドンに最適化されたもの（配列番号４６）を使用して製造した。
実施例２－１．ワクチン用核酸分子のタンパク質発現量分析
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでタンパク質発現率を分析した。通常的にｉｎ ｖｉｔｒｏで高発現特性を示す場合、ｉｎ ｖｉｖｏで高免疫原性を示し、これによりワクチンの効能が増加すると知られている。前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１または１－５－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、いずれも酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）、アルブミン由来（配列番号８）、インターフェロンガンマ由来（配列番号１２）、第ＩＸ因子由来（配列番号１６）またはＭＬＰ１由来（配列番号２０）のものを使用し、Ｔｈ細胞エピトープとしては、ヒトコドンに最適化されたもの（配列番号４６）を使用して製造した。
【0100】
具体的に、ＨＥＫ－２９３Ｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５８６）細胞を１０％ＦＢＳおよび１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐが含まれたＤＭＥＭ培地で培養し、４×１０５細胞／ウェルのＨＥＫ－２９３Ｔ細胞に前記実施例によって製造した核酸分子を約０．１または０．０５ｇ／Ｌの濃度で形質感染させた。このとき、前記核酸分子は、伝達体として脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）に担持した形態であるｍＲＮＡ－ＬＮＰで製剤化して使用した。形質感染が完了した後、前記核酸分子の細胞内タンパク質発現およびこれによる細胞外へのタンパク質分泌程度を当業界に知られている方法によってウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡを通じて分析した。ウェスタンブロットは、前記形質感染された細胞の溶解物（ｌｙｓａｔｅ）に対して、１次抗体としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＲＢＤポリクローナル抗体（Ｅ－ＡＢ－Ｖ１００６、Ｅｌａｂｓｃｉｅｎｃｅ）を使用し、２次抗体としてはＨＲＰ－接合二次抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ－ｒａｂｂｉｔ ＩｇＧ；ＡＢｃｌｏｎａｌ）を使用して遂行した。ＥＬＩＳＡは、前記形質感染された細胞の培養培地（ｍｅｄｉａ）に対してＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２スパイクＳ１タンパク質ＥＬＩＳＡキット（ＲＫ０４１５４、ＡＢｃｌｏｎａｌ）を使用して遂行した。
【0101】
一方、抗原として使用したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質は、サブユニット１（Ｓ１）およびサブユニット２（Ｓ２）で構成されており、細胞感染に主要役割を遂行すると知られているＲＢＤ（受容体結合ドメイン：ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ）はＳ１に位置している。ウェスタンブロットに使用した１次抗体がスパイクタンパク質のＲＢＤドメインをターゲットするものであるところ、スパイク全体タンパク質（Ｓ０、１９０ ｋＤａ）が探知されるか、またはスパイクタンパク質の中でもＲＢＤドメインが位置したサブユニット１（Ｓ１、１２０ ｋＤａ）が探知されるかを確認することで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のスパイクタンパク質の発現および分泌量を分析した。
【0102】
その結果、図４から見られるように、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質を含み、ＩｇＥ、アルブミン、ＩＦＮ－γ、第ＩＸ因子またはＭＬＰ１由来シグナルペプチドを含む核酸分子は、細胞内でタンパク質への発現がよく行われることを確認した。
【0103】
また、図５ａおよび５ｂから見られるように、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質を含み、アルブミン、ＩＦＮ－γ、第ＩＸ因子またはＭＬＰ１由来シグナルペプチドを含む核酸分子は、細胞内でタンパク質への発現がよく行われ、細胞内で発現されたタンパク質が細胞外に円滑に分泌することを確認した。
【0104】
また、図５ｃおよび５ｄから見られるように、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質を含み、アルブミン、ＩＦＮ－γ、第ＩＸ因子またはＭＬＰ１由来シグナルペプチドを含み、Ｔｈ細胞エピトープを含む核酸分子は、細胞内でタンパク質への発現がよく行われることを確認し、細胞内で発現されたタンパク質が細胞外に円滑に分泌することを確認した。
【0105】
特に、前記シグナルペプチドを含む核酸分子の場合、培養培地に含まれているタンパク質の量が細胞溶解物に含まれているタンパク質量より多いことを確認した。また、前記シグナルペプチドを含む核酸分子とこれを含まない核酸分子とのタンパク質発現量を比較するとき、培養培地ではシグナルペプチドを含む核酸分子のタンパク質量がさらに多く、細胞溶解物ではシグナルペプチドを含まない核酸分子のタンパク質量がさらに多いことを確認した。これを通じて前記シグナルペプチドによってスパイクタンパク質の細胞外分泌が促進できることを確認した。
【0106】
また、図６ａから見られるように、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質およびＩｇＥ由来シグナルペプチドを含む核酸分子は、細胞内においても発現がよく行われることを確認した。
【0107】
また、図６ｂから見られるように、本発明に係るＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質を含む核酸分子は、細胞内で発現がよく行われることによって、相当な量のタンパク質が細胞外に分泌することをスパイクタンパク質ＥＬＩＳＡを通じて確認した。互いに異なる濃度のｍＲＮＡ－ＬＮＰ ｓｔｏｃｋ試料に対して、０．１ｇ／Ｌ試料で形質感染された細胞では、約６．３２ｎｇ／ｍＬのタンパク質が発現および分泌し、０．０５ｇ／Ｌ試料で形質感染された細胞では、約７．７１ｎｇ／ｍＬのタンパク質が発現および分泌することで、類似した量のスパイク抗原タンパク質量であることを確認した。
【0108】
前記結果は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成され、各シグナルペプチドおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質を抗原として含む本発明に係る核酸分子は、細胞内で高い効率でタンパク質として発現され、特に、発現されたタンパク質が細胞外に分泌することがあるので、このように分泌した抗原タンパク質は、生体内に存在する他の免疫細胞を刺激して細胞性または体液性免疫反応を誘導することができるという点を見せる。よって、本発明に係る核酸分子は、生体内に投与時に目的とするワクチン機能を発揮することができる。
【0109】
実施例２－２．ワクチン用核酸分子の体液性免疫増強効果
前記実施例１において製造した核酸分子の免疫効能を確認するために、前記核酸分子が生体内に投与される場合に、抗原に対する体液性免疫反応を引き起こして実際ウイルス感染症に対する予防効果を示すのかを確認した。前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１または実施例１－５－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）またはＭＬＰ１由来（配列番号２０）のものを使用し、Ｔｈ細胞エピトープとしては、ヒトコドンに最適化されたもの（配列番号４６）を使用して製造した。
前記実施例１において製造した核酸分子の免疫効能を確認するために、前記核酸分子が生体内に投与される場合に、抗原に対する体液性免疫反応を引き起こして実際ウイルス感染症に対する予防効果を示すのかを確認した。前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１または実施例１－５－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）またはＭＬＰ１由来（配列番号２０）のものを使用し、Ｔｈ細胞エピトープとしては、ヒトコドンに最適化されたもの（配列番号４６）を使用して製造した。
【0110】
具体的に、前記核酸分子をｍＲＮＡ－ＬＮＰで製剤化し、これを６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（６匹）に４週間隔で２回（１次：プライム、２次：ブースター）にわたって太股の上部に筋肉注射した後、３週目に犠牲にさせた。このとき、前記核酸分子は、１、５または１０μｇ／個体の濃度で注射した。対照群としては、ＰＢＳを注射した。
【0111】
以後、前記免疫化されたマウスの血清で抗原としてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質に対する特異的結合抗体または中和抗体の水準をＥＬＩＳＡまたはＰＲＮＴ（Ｐｌａｑｕｅ Ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ Ｔｅｓｔ）アッセイを通じて測定した。ＥＬＩＳＡのための１次抗体としては、抗－マウスＩｇＧ１－（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）抗体または抗－マウスＩｇＧ２ａ－（Ｎｏｖｕｓ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、ＣＯ、ＵＳＡ）抗体を使用した。
【0112】
また、前記免疫化されたマウスから脾腫細胞を分離し、前記脾腫細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチドを２ｍｇ／ｍｌの濃度で処理して２４時間の間培養した。培養が完了した後、各特異的抗体で免疫染色してフローサイトメトリー分析を遂行した。
【0113】
その結果、図７～９ｂから見られるように、前記核酸分子の接種後には、マウスでＲＢＤまたはスパイク全体タンパク質に対する結合抗体が高い水準で生成されることを確認した。また、生成される結合抗体および中和抗体の量は、前記核酸分子に対して濃度依存的に増加することを確認し（図７～９ｂ）、１次接種に比べて２次接種後に生成される中和抗体の量は、約２倍以上増加することを確認した（図９ａおよび図９ｂ）。
【0114】
また、図１０から見られるように、前記核酸分子が１０μｇ／個体の濃度でマウスに接種される場合、胚中心（ｇｅｒｍｉｎａｌ ｃｅｎｔｅｒ、ＧＣ）に存在するＢ細胞（ＧＣ Ｂ細胞、ＧＬ７＋ ＣＤ１９＋細胞）の数が接種されないマウスに比べて有意に増加することを確認した。胚中心（ＧＣ）ではメモリーＢ細胞および寿命が長い形質細胞（ｐｌａｓｍａ ｃｅｌｌ）を生成するために、濾胞性ヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ細胞）と呼ばれるＣＤ４＋ Ｔ細胞とＢ細胞が相互作用する。このようなＧＣ Ｂ細胞とＴＦＨ細胞との間の相互作用は、各細胞類型の生存、増殖および分化に影響を及ぼす。
【0115】
前記結果は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成された前記核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質に対する体液性免疫反応を効率的に誘導することができ、これによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症に対する予防、改善または治療に有用に活用できることを示唆する。
【0116】
実施例２－３．ワクチン用核酸分子の細胞性免疫増強効果
実施例２－３－１．Ｔ細胞増加
前記実施例１において製造した核酸分子の免疫効能を確認するために、前記核酸分子が生体内に投与される場合に抗原に対する細胞性免疫反応を引き起こして、実際ウイルス感染症に対する予防効果を示すのかを確認した。細胞性免疫反応の一種として、エフェクターメモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞などのＴ細胞の生成を増加させることができるのかを確認した。エフェクターメモリーＴ細胞は、病原体進入部位で即時的であるが持続しない防御を提供し、セントラルメモリーＴ細胞は、２次リンパ器官で増殖して新たなエフェクター細胞を生成することで、免疫反応を維持する。
実施例２－３－１．Ｔ細胞増加
前記実施例１において製造した核酸分子の免疫効能を確認するために、前記核酸分子が生体内に投与される場合に抗原に対する細胞性免疫反応を引き起こして、実際ウイルス感染症に対する予防効果を示すのかを確認した。細胞性免疫反応の一種として、エフェクターメモリーＴ細胞およびセントラルメモリーＴ細胞などのＴ細胞の生成を増加させることができるのかを確認した。エフェクターメモリーＴ細胞は、病原体進入部位で即時的であるが持続しない防御を提供し、セントラルメモリーＴ細胞は、２次リンパ器官で増殖して新たなエフェクター細胞を生成することで、免疫反応を維持する。
【0117】
また、前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）のものを使用して製造した核酸分子に対する効果を確認した。
【0118】
具体的に、前記実施例２－２および２－３による方法で、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成された本発明に係る核酸分子をマウスに注射し、前記免疫化されたマウスから脾腫細胞を分離した後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチド（ペプチドプール２）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で処理した後、フローサイトメトリー分析を遂行した。ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ４＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ＋細胞）、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞（ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ＋細胞）、ＣＤ８＋エフェクター（ｅｆｆｅｃｔｏｒ）メモリーＴ細胞（ＣＤ８＋細胞のうちＣＤ４４ｈｉｇｈ＋およびＣＤ６２Ｌ－細胞）の割合を分析した。
【0119】
その結果、図１１ないし１３から見られるように、前記核酸分子がマウスに接種される場合、ＣＤ４＋セントラルメモリーＴ細胞、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞およびＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞などの細胞性免疫に寄与する細胞集団の割合が接種されないマウスに比べて有意に増加することを確認した。
【0120】
前記結果は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成された前記核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質に対する細胞性免疫反応を効率的に誘導することができ、これによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症に対する予防、改善または治療に有用に活用できることを示唆する。
【0121】
実施例２－３－２．ＩＦＮ－γ分泌細胞増加
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、細胞性免疫反応の一種として、ＩＦＮ－γ分泌細胞の生成を増加させることができるのかを確認した。ＩＦＮ－γは、生来の抗ウイルス反応を担当する重要な構成要素であり、主に、ＮＫ細胞または生来のリンパ球タイプ１細胞によって生成される。このような免疫細胞によるＩＦＮ－γ生成が行われない場合、生体内でウイルス複製が増加するようになる。
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、細胞性免疫反応の一種として、ＩＦＮ－γ分泌細胞の生成を増加させることができるのかを確認した。ＩＦＮ－γは、生来の抗ウイルス反応を担当する重要な構成要素であり、主に、ＮＫ細胞または生来のリンパ球タイプ１細胞によって生成される。このような免疫細胞によるＩＦＮ－γ生成が行われない場合、生体内でウイルス複製が増加するようになる。
【0122】
また、前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１または実施例１－５－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）またはＭＬＰ１由来（配列番号２０）のものを使用し、Ｔｈ細胞エピトープとしては、ヒトコドンに最適化されたもの（配列番号４６）を使用して製造した。
【0123】
具体的に、前記実施例２－２によって免疫化されたマウスから脾腫細胞を分離し、前記脾腫細胞にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質由来ペプチド（ペプチドプール２）を２ｍｇ／ｍｌの濃度で処理して４８時間の間培養した。培養が完了した後、ＩＦＮ－γ分泌細胞をＥＬＩＳｐｏｔ ｂａｓｉｃキット（Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ Ｓｔｒａｎｄ、Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して検出した。
【0124】
その結果、図１４および１５から見られるように、前記核酸分子がマウスに接種される場合、ＩＦＮ－γ分泌細胞の数は接種されないマウスに比べて顕著に増加することを確認した（図１４）。また、前記細胞によるＩＦＮ－γの活性も約３０００倍以上顕著に増加することを確認した（図１５）。
【0125】
前記結果は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成された前記核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質に対する細胞性免疫反応を効率的に誘導することができ、これによりＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症に対する予防、改善または治療に有用に活用できることを示唆する。
【0126】
実施例２－３－３．プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）分析
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、細胞性免疫反応の一種として、メモリーＴ細胞による中和抗体の生成を増加させ得るのかを確認した。プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）分析は、ウイルスに対するウイルス中和および保護抗体を測定し、ワクチンの免疫原性を評価するのに当たり、広く認められるアプローチ方式である。
前記実施例１において製造した核酸分子の効能を確認するために、細胞性免疫反応の一種として、メモリーＴ細胞による中和抗体の生成を増加させ得るのかを確認した。プラーク減少中和力価（ＰＲＮＴ）分析は、ウイルスに対するウイルス中和および保護抗体を測定し、ワクチンの免疫原性を評価するのに当たり、広く認められるアプローチ方式である。
【0127】
また、前記実施例１において製造した核酸分子の中でも、実施例１－３－１において製造した核酸分子に対する効果を確認した。このとき、抗原としては、酵母コドンおよびヒトコドンをすべて有するＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイク全体タンパク質（配列番号２１）を使用し、シグナルペプチドとしては、酵母コドンに最適化されたものであって、ＩｇＥ由来（配列番号４）のものを使用して製造した核酸分子に対する効果を確認した。
【0128】
具体的に、前記実施例２－２によって免疫化されたマウスから分離した血清にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス（ＮＣＣＰ ４３３２６、Ｓ－ｔｙｐｅ）を４．５×１０２ＰＦＵ／ｍｌの濃度で添加して１時間の間培養した。以後、前記血清－ウイルス培養物をＶｅｒｏ Ｅ６細胞（ＡＴＣＣ、カタログ番号ＣＲＬ－１５８６）に添加して１時間の間培養することで、前記細胞をウイルスに感染させ、当業界に知られている方法によってＰＲＮＴを分析アッセイを遂行した。ＰＲＮＴ力価は、Ｋａｒｂｅｒ方法を用いて計算し、中和用量ＮＤ５０で表示した（ｌｏｇ１０ＮＤ５０＝ｍ－Δ（Σ－０．５）、ここで、ｍは、最高希釈のｌｏｇ１０を示し、Δは希釈係数のｌｏｇ１０を示し、Σはウイルス－血清接種物／ウイルス対照によって生成されたプラークの平均数を示す）。
【0129】
【表9】
【0130】
その結果、前記表９から見られるように、前記核酸分子がマウスに接種される場合、１次接種後には、中和抗体の生成量が対照群と類似した水準であったが、２次接種後には、中和抗体生成量が顕著に増加することを確認した。このような効果は、個体当たり５または１０μｇが投与された場合、特に優れることを確認した。
【0131】
前記結果は、ｍＲＮＡ－ＬＮＰ製剤で構成された前記核酸分子は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルススパイクタンパク質に対する中和抗体を効率的に生成することができ、このため、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス感染症に対する予防、改善または治療に有用に活用できることを示唆する。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図5c】
【図5d】
【図6a】
【図6b】
【図7】
【図8】
【図9a】
【図9b】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【配列表】
【国際調査報告】