特表 2024-507753 ビールを醸造するための材料及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】ビールを醸造するための材料及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/60 20060101AFI20240214BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 9/88 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/31 20060101ALI20240214BHJP

   C12P 11/00 20060101ALI20240214BHJP

   C12C 11/00 20060101ALI20240214BHJP

   C12C 5/02 20060101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N15/60

C12N1/19 ZNA

C12N9/88

C12N15/31

C12P11/00

C12C11/00 A

C12C5/02

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023548268

(86)(22)【出願日】2022-02-10

(85)【翻訳文提出日】2023-08-07

(86)【国際出願番号】 US2022015947

(87)【国際公開番号】W WO2022173928

(87)【国際公開日】2022-08-18

(31)【優先権主張番号】63/147,963

(32)【優先日】2021-02-10

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/292,226

(32)【優先日】2021-12-21

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】523300746

【氏名又は名称】オメガ イースト ラブズ，リミティド ライアビリティ カンパニー

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100134784

【弁理士】

【氏名又は名称】中村 和美

(72)【発明者】

【氏名】ローラ バーンズ

(72)【発明者】

【氏名】ランス シャナー

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4B128

【Ｆターム（参考）】

4B064CA06

4B064CA19

4B064CA21

4B064CC24

4B064DA10

4B065AA79X

4B065AA79Y

4B065AA80X

4B065AA80Y

4B065BA02

4B065BA23

4B065CA27

4B065CA42

4B128CP10

(57)【要約】

本明細書に記載されるのは、醸造プロセスの中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するための材料及び方法である。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

異種プロモーターに作動可能に連結された酵母β－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐであって、前記β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ。

【請求項2】

前記異種プロモーターが、ＴＤＨ３、ＴＤＨ２、ＣＣＷ１２、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、ＨＨＦ１、ＨＨＦ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＨＴＢ２、ＰＡＢ１、ＡＬＤ６、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＰＯＰ６、ＲＡＤ２７、ＰＳＰ２、ＲＥＶ１、ＭＦＡ１、ＭＦａ２、ＧＡＬ１、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＩＣＬ１、ＩＣＬ２、ＧＡＬ３、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＭＡＬ１１、ＭＡＬ３１、ＭＡＬ３２、ＭＡＬ３３、ＭＲＫ１又はＳＵＣ２プロモーターである、請求項１に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ。

【請求項3】

Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅである、請求項１又は２に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ。

【請求項4】

Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである、請求項１又は２に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ。

【請求項5】

前記β－リアーゼ酵素が、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ。

【請求項6】

醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法であって、前記方法が、冷却された麦芽汁を、請求項１～５のいずれか一項に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることを含む、方法。

【請求項7】

前記３ＳＨの不揮発性形態が、グルタチオン結合３ＳＨ、システイン結合３ＳＨ、又はそれらの組み合わせである、請求項６に記載の方法。

【請求項8】

前記方法が、未改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁と比較して、前記組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁中の遊離３ＳＨが３倍増加することをもたらす、請求項６又は７に記載の方法。

【請求項9】

前記麦芽汁が、接触工程の後に、少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを含む、請求項６～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記方法が、前記接触工程中に、冷却された麦芽汁にホップを加えることを含む、請求項６～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記ホップが、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する、請求項１０に記載の方法。

【請求項12】

前記ホップが、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃ又はＳｉｍｃｏｅホップである、請求項１０又は１１に記載の方法。

【請求項13】

醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法であって、前記方法が、
（ａ）３ＳＨの不揮発性形態を含む植物を加えて、マッシュし、麦芽汁を産生することを含む、マッシュホッピング工程と、
（ｂ）（ａ）によって産生された麦芽汁を沸騰させることと、
（ｃ）麦芽汁を冷却することと、
（ｄ）冷却された麦芽汁と、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓとを、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な時間、接触させることと、を含み、前記組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが、
（ｉ）異種プロモーターに作動可能に連結された活性β－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチド、又は
（ｉｉ）異種プロモーターに作動可能に連結されたシステイン－チオールリアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、方法。

【請求項14】

前記３ＳＨの不揮発性形態が、グルタチオン結合３ＳＨ、システイン結合３ＳＨ、及びそれらの組み合わせである、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料が、ホップである、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項16】

前記ホップが、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する、請求項１５に記載の方法。

【請求項17】

前記ホップが、少なくとも５０００μｇ／ｋｇのグルタチオン３ＳＨを含有する、請求項１５又は１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ホップが、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃ又はＳｉｍｃｏｅホップである、請求項１５～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料が、ブドウ由来生成物である、請求項１３又は１４に記載の方法。

【請求項20】

前記ブドウ由来生成物が、粉砕されたブドウ又はブドウ粉末である、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ブドウ由来生成物が、白ブドウ、赤ブドウ、又はそれらの組み合わせから得られる、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

前記白ブドウが、ＳａｕｖｉｇｎｏｎＢｌａｎｃ、Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ、Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ、Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ、Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ、Ｇｒｏｓ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｋｏｓｈｕ、Ｍａｃｃａｂｅｏ、Ｍｕｓｃａｔ、Ｐｅｔｉｔ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ、Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ、Ｒｉｅｓｌｉｎｇ、Ｓｃｈｅｕｒｅｂｅ、Ｓｅｍｉｌｌｏｎ、Ｓｙｌｖａｎｅｒ、又はＴｏｋａｙである、請求項２１に記載の方法。

【請求項23】

前記赤ブドウが、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、Ｇｒｅｎａｃｈｅ、Ｍｅｒｌｏｔ、又はＰｉｎｏｔ Ｎｏｉｒである、請求項２１に記載の方法。

【請求項24】

前記β－リアーゼが、細菌性β－リアーゼ又は真菌性β－リアーゼである、請求項１３～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記β－リアーゼが、細菌性β－リアーゼである、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記β－リアーゼが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｓｐ．；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．；Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．；Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．；Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；又はＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．に由来する、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記細菌性β－リアーゼが、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＮａＡである、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記真菌性β－リアーゼが、酵母β－リアーゼである、請求項２４に記載の方法。

【請求項29】

前記酵母β－リアーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｔａｐｈｒｉｎｏｍｙｃｏｔｉｎａ、又はＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓに由来する、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記酵母β－リアーゼが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに由来する、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記酵母β－リアーゼが、Ｉｒｃ７である、請求項２８に記載の方法。

【請求項32】

前記Ｉｒｃ７が、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記Ｉｒｃ７が、配列番号１に記載の前記アミノ酸配列を含む、請求項３１又は請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記システイン－チオールリアーゼが、ＰａｔＢである、請求項１３～２３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＰａｔＢが、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｐｅｔｒａｓｉｉ又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来する、請求項３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＰａｔＢが、配列番号８～１４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項３４又は３５に記載の方法。

【請求項37】

前記方法が、前記マッシング工程中に、１ｋｇの製粉用穀物当たり１００グラム未満のホップを加えることを含む、請求項１５～３６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項38】

マッシュホッピング工程が、タンパク質休止を含む、請求項１３～３７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項39】

前記タンパク質休止が、沸騰工程の前に、少なくとも５分間、１３０°Ｆ未満の温度で、前記マッシュを維持することを含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記タンパク質休止が、前記沸騰工程の前に、少なくとも５分間、１００°Ｆ～１２０°Ｆの温度で、前記マッシュを維持することを含む、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項41】

前記タンパク質休止後かつ前記沸騰工程前に、糖化休止を更に含む、請求項３８又は３９に記載の方法。

【請求項42】

前記糖化休止が、前記沸騰工程の前に、少なくとも１５分間、１２０°Ｆ～１６０°Ｆの温度で、前記麦芽汁を維持することを含む、請求項４１に記載の方法。

【請求項43】

前記冷却された麦芽汁をホップと接触させて混合物を生成し、前記混合物を前記組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと接触させることを更に含む、請求項１３～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓが、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである、請求項１３～４３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項45】

前記麦芽汁が、接触工程の後に、少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを含む、請求項１３～４４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項46】

前記接触工程（ｄ）が、４５°Ｆ～１００°Ｆの範囲の温度で、発酵槽内で生じる、請求項１３～４５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項47】

前記方法が、非改変Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた麦芽汁と比較して、前記組換えＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅで発酵させた麦芽汁中の遊離３ＳＨが６倍増加することをもたらす、請求項１３～４６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項48】

異種プロモーターに作動可能に連結された酵母β－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母であって、前記β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む、組換え酵母。

【請求項49】

前記酵母は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属さない、請求項４８に記載の組換え酵母。

【請求項50】

前記酵母が、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅ属、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ属、Ｄｅｋｋｅｒａ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓとも称される）属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属のものである、請求項４８又は４９に記載の組換え酵母。

【請求項51】

前記酵母が、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｖｉｎａｅ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ（以前は、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａｌ又はＣａｎｄｉｄａ ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａと称されていた）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｕｓｔｅｒｓｉａｎｕｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｎｕｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである、請求項４８～５０のいずれか一項に記載の組換え酵母。

【請求項52】

異種プロモーターに作動可能に連結されたシステイン－チオールリアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む、組換え酵母。

【請求項53】

前記異種プロモーターが、ＴＤＨ３、ＴＤＨ２、ＣＣＷ１２、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、ＨＨＦ１、ＨＨＦ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＨＴＢ２、ＰＡＢ１、ＡＬＤ６、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＰＯＰ６、ＲＡＤ２７、ＰＳＰ２、ＲＥＶ１、ＭＦＡ１、ＭＦａ２、ＧＡＬ１、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＩＣＬ１、ＩＣＬ２、ＧＡＬ３、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＭＡＬ１１、ＭＡＬ３１、ＭＡＬ３２、ＭＡＬ３３、ＭＲＫ１、又はＳＵＣ２プロモーターである、請求項５１に記載の組換え酵母。

【請求項54】

前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属する、請求項５１又は５２に記載の組換え酵母。

【請求項55】

前記酵母が、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである、請求項５１～５３のいずれか一項に記載の組換え酵母。

【請求項56】

前記酵母が、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属さない、請求項５１又は５２に記載の組換え酵母。

【請求項57】

前記酵母が、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅ属、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ属、Ｄｅｋｋｅｒａ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓとも称される）属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属のものである、請求項５５に記載の組換え酵母。

【請求項58】

前記酵母が、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｖｉｎａｅ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ（以前は、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａｌ又はＣａｎｄｉｄａ ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａと称されていた）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｕｓｔｅｒｓｉａｎｕｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｎｕｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである、請求項５５又は５６に記載の組換え酵母。

【請求項59】

前記システインチオールリアーゼが、ＰａｔＢである、請求項５１～５７のいずれか一項に記載の組換え酵母。

【請求項60】

前記ＰａｔＢが、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｐｅｔｒａｓｉｉｏｒ又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来する、請求項５８に記載の組換え酵母。

【請求項61】

前記ＰａｔＢが、配列番号８～１４のいずれか１つに記載のヌクレオチド配列と少なくとも８０％同一のヌクレオチド配列を含む、請求項５８又は５９に記載の組換え酵母。

【請求項62】

醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法であって、前記方法が、発酵性糖源を、請求項５１～６０のいずれか一項に記載の組換え酵母と、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることを含む、方法。

【請求項63】

前記３ＳＨの不揮発性形態が、グルタチオン結合３ＳＨ、システイン結合３ＳＨ、又はそれらの組み合わせである、請求項６１に記載の方法。

【請求項64】

前記方法が、未改変酵母で発酵させた発酵性糖と比較して、前記組換え酵母で発酵させた発酵性糖源における遊離３ＳＨが３倍増加することをもたらす、請求項６１又は６２に記載の方法。

【請求項65】

前記発酵性糖源が、麦芽汁である、請求項６４に記載の方法。

【請求項66】

前記麦芽汁が、前記接触工程の後に、少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを含む、請求項６１～６３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項67】

前記方法が、前記接触工程中に、冷却された麦芽汁にホップを加えることを含む、請求項６４又は６５に記載の方法。

【請求項68】

前記ホップが、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する、請求項６６に記載の方法。

【請求項69】

前記ホップが、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃ又はＳｉｍｃｏｅホップである、請求項６６又は６７に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【背景技術】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／１４７，９６４号、及び２０２１年１２月２１日に出願された米国仮特許出願第６３／２９２，２２６号に対する優先権の利益を主張するものであり、これらの開示は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

電子的に提出された情報の参照による組み込み
本出願は、本開示の別個の部分として、コンピュータ可読形態（ファイル名：５６４００＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；サイズ：４２，８０８バイト；作成日：２０２２年２月９日）のシーケンスリストを含み、その全体が参照により組み込まれる。

【0003】

飲料業界ではフルーティーな香りとフローラルな香りが求められており、香味プロファイルを増やすか、又は多様化することで、ビールの香りを向上させるための継続的な取り組みが行われている。メルカプタンとしても知られるチオールは、水素原子に結合した硫黄原子を有する硫黄含有有機化合物である。ワインメーカーは、ワインの香りに寄与するチオールを特定した。１つは、４－メチル－４－スルファニルペンタン－２－オン（４ＭＳＰ、４－メルカプト－４－メチルペンタント－２－オン（４ＭＭＰ）としても知られる）、セイヨウツゲ、黒スグリ、及びリーベ（ｒｉｂｅ）の匂い及び味である。もう１つは、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ；３－メルカプトヘキサノール－１－オール（３ＭＨ）としても知られる）は、多くの場合、エキゾチックであり、パッションフルーツ、ルバーブ、及び柑橘類の匂いがすると説明される。また、３番目は、３－スルファニルヘキシルアセテート（３ＳＨＡ、３－メルカプトヘキシルアセテート（３ＭＨＡ）としても知られている）は、パッションフルーツ及びグアバを連想させる。これらの化合物は、全てＳａｕｖｉｇｎｏｎ ｂｌａｎｃ、Ｒｉｅｓｌｉｎｇ、及び他のワインで顕著であるが、ブドウの遊離型芳香族チオールとしては豊富ではない。これらは、ブドウ果醪に存在する前駆体から、発酵中に形成される。

【0004】

いくつかの品種のホップは、これらのチオールの前駆体形態を大量に含有するが、製品の香り又は風味に寄与する遊離芳香族形態の量は少ない。したがって、ビールの芳香族の可能性を最大化するために、発酵プロセス中に、これらの揮発性の芳香族チオールをその前駆体形態から放出する手段に対する必要性が、当該技術分野では、依然として存在する。

【発明の概要】

【0005】

本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された酵母β－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母も提供し、β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0006】

本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された酵母β－リアーゼ酵素ＩＲＣ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐを提供し、β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む。

【0007】

本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたシステイン－チオールリアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母も提供する。いくつかの実施形態において、システイン－チオールリアーゼはＰａｔＢである。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に由来する。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ、Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ、Ｓ．ｐｅｔｒａｓｉｉ、又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓに由来する。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、Ｓ，ｐｅｔｒａｓｉｉ ｃｒｏｃｅｉｌｙｔｉｃｕｓ又はＳ，ｐｅｔｒａｓｉｉ ｐｅｔｒａｓｉｉに由来する。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号８～１４のいずれか１つと少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号８～１４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含む。

【0008】

いくつかの実施形態において、異種プロモーターは、ＴＤＨ３、ＴＤＨ２、ＣＣＷ１２、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、ＨＨＦ１、ＨＨＦ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＨＴＢ２、ＰＡＢ１、ＡＬＤ６、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＰＯＰ６、ＲＡＤ２７、ＰＳＰ２、ＲＥＶ１、ＭＦＡ１、ＭＦａ２、ＧＡＬ１、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＩＣＬ１、ＩＣＬ２、ＧＡＬ３、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＭＡＬ１１、ＭＡＬ３１、ＭＡＬ３２、ＭＡＬ３３、ＭＲＫ１、又はＳＵＣ２プロモーターである。いくつかの実施形態において、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである。いくつかの実施形態において、β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、β－リアーゼ酵素は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含まない。

【0009】

本開示は、醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法も提供し、本方法は、冷却された麦芽汁と、本明細書に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓとを、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることを含む。いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態は、グルタチオン結合型３ＳＨ又はシステイン結合型３ＳＨ又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、この方法は、非改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁と比較して、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁中の遊離３ＳＨが３倍増加することをもたらす。いくつかの実施形態において、麦芽汁は、接触工程の後に、少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを含む。

【0010】

この方法は、任意選択的に、接触工程中に、ホップを冷却された麦芽汁に加えることを含む。本明細書に記載の方法で使用するための例示的なホップとしては、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃｏｒ又はＳｉｍｃｏｅが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する。

【0011】

本開示は、醸造プロセス中に、不揮発性形態の３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）を遊離３ＳＨに変換する方法も提供し、この方法は、（ａ）３ＳＨの不揮発性形態を含む植物を製粉用穀物に加えて、マッシュ（ｍａｓｈ）し、麦芽汁を産生することを含む、マッシュホッピング（ｍａｓｈ ｈｏｐｐｉｎｇ）工程と、（ｂ）（ａ）によって産生された麦芽汁を沸騰させることと、（ｃ）麦芽汁を冷却することと、（ｄ）冷却した麦芽汁と、本明細書に記載の組換え酵母とを、不揮発性形態の３ＳＨを遊離３ＳＨに変換するのに十分な時間、接触させることと、を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態において、組換え酵母は、異種プロモーターに作動可能に連結されたβ－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓである。いくつかの実施形態において、組換え酵母は、異種プロモーターに作動可能に連結されたシステイン－チオールリアーゼをコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．である。いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態は、グルタチオン結合－３ＳＨ又はシステイン結合－３ＳＨ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、この方法は、非改変酵母で発酵させた麦芽汁と比較して、組換え酵母で発酵させた麦芽汁中の遊離３ＳＨが６倍増加することをもたらす。いくつかの実施形態において、麦芽汁は、接触工程の後に、少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを含む。

【0012】

いくつかの実施形態において、不揮発性形態の３ＳＨを含む植物材料は、ホップである。いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも５０００μｇ／ｋｇのグルタチオン３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨ及び少なくとも５０００μｇ／ｋｇのグルタチオン３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ホップは、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃ又はＳｉｍｃｏｅホップである。

【0013】

いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料は、ブドウ由来生成物である。いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、粉砕されたブドウ又はブドウ粉末である。いくつかの実施形態において、ブドウ由来の製品は、白ブドウ、赤ブドウ、又はそれらの組み合わせから得られる。例示的な白ブドウ品種としては、Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ、Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ、Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ、Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ、Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ、Ｇｒｏｓ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｋｏｓｈｕ、Ｍａｃｃａｂｅｏ、Ｍｕｓｃａｔ、Ｐｅｔｉｔ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ、Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ、Ｒｉｅｓｌｉｎｇ、Ｓｃｈｅｕｒｅｂｅ、Ｓｅｍｉｌｌｏｎ、Ｓｙｌｖａｎｅｒ、及びＴｏｋａｙが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な赤ブドウ品種には、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、Ｇｒｅｎａｃｈｅ、Ｍｅｒｌｏｔ、及びＰｉｎｏｔ Ｎｏｉｒが含まれるが、これらに限定されない。

【0014】

いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、１ｋｇの製粉用穀物当たり１００グラム未満の植物材料を加えることを含む。

【0015】

いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、ホップ及びブドウ由来生成物の両方を製粉用穀物に加えることを含む。

【0016】

いくつかの実施形態において、β－リアーゼは、細菌性β－リアーゼ又は真菌性β－リアーゼである。本開示に従って使用するための例示的な細菌性βリアーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｓｐ．；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．；Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．；Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．；Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；及びＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．を含むが、これに限定されない細菌に由来するいくつかの実施形態において、細菌性β－リアーゼは、Ｅ．ｃｏｌｉ ＴＮａＡである。

【0017】

いくつかの実施形態において、真菌性β－リアーゼは、酵母β－リアーゼである。本開示に従った使用のための例示的な真菌性β－リアーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｔｉｎａ、Ｔａｐｈｒｉｎｏｍｙｃｏｔｉｎａ、及びＳｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔｅｓに由来する。いくつかの実施形態において、酵母β－リアーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ由来である。いくつかの実施形態において、酵母β－リアーゼは、Ｉｒｃ７である。いくつかの実施形態において、Ｉｒｃ７は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％（例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上）同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｉｒｃ７は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0018】

いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、沸騰工程の前に、タンパク質休止（ｐｒｏｔｅｉｎ ｒｅｓｔ）を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質休止は、沸騰工程の前に、少なくとも５分間、１４０°Ｆ未満の温度で、マッシュを維持することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質休止は、沸騰工程の前に、少なくとも１時間、１００°Ｆ～１４０°Ｆの温度で、マッシュを維持することを含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、タンパク質休止後かつ沸騰工程前に、糖化休止を更に含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、この方法は、冷却された麦芽汁をホップと接触させて混合物を産生し、混合物を組換え酵母と接触させることを更に含む。いくつかの実施形態において、組換え酵母はＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである。

【0020】

いくつかの実施形態において、接触工程（ｄ）は、４５°Ｆ～１００°Ｆの範囲の温度で、発酵槽内で生じる。

【図面の簡単な説明】

【0021】

【図1】実施例１に記載のＩＲＣ７対立遺伝子のアラインメントである。

【図2】未改変ＯＹＬ－０８８株と比較して、ＯＹＬ－０８８－ＴＤＨ３－ＩＲＣ７で発酵させたビールにおける遊離３ＳＨレベルが増加していることを示す棒グラフである。

【発明を実施するための形態】

【0022】

多くの植物由来の生成物は、システインＳ共役体前駆体として結合した揮発性チオールを含有し、不揮発性前駆体の揮発性チオール生成物への変換は、食品又は飲料製品の香りに寄与する。揮発性チオールは、セイヨウツゲ、パッションフルーツ、グレープフルーツ、グーズベリー、及びグアバなどの香りをビールなどの発酵飲料に与える役割を果たす。

【0023】

本開示は、醸造プロセスの発酵工程中に、酵母β－リアーゼ酵素（又はシステイン－チオールリアーゼ）を過剰発現するように改変されている酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）が、植物材料中の利用可能な不揮発性チオール（例えば、グルタチオン結合チオール又はシステイン結合チオール）の、より望ましい芳香族（すなわち、揮発性又は遊離）形態への変換を引き起こすという発見に、部分的に、基づいている。

【0024】

本開示は、目的の不揮発性チオールを含む植物材料を製粉用穀物に加えて麦芽汁を産生し、その後、麦芽汁と、β－リアーゼ酵素（又はシステイン－チオールリアーゼ）を過剰発現する改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐとを接触させることを含むマッシング工程を含むために、従来の抽出方法を修正することが、利用可能な不揮発性チオールの揮発性、芳香族形態への高い変換率をもたらすという発見にも、部分的には、基づいている。

【0025】

組換え酵母。
一態様において、本明細書に記載されるのは、異種プロモーターに作動可能に連結されたβ－リアーゼ（又はシステイン－チオールリアーゼ）酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母である。「異種プロモーター」という用語は、本明細書で使用される場合、β－リアーゼ（又はシステイン－チオールリアーゼ）酵素に非天然であるプロモーターを指す。

【0026】

いくつかの実施形態において、酵母はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ属に属さない。いくつかの実施形態において、酵母は、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ属、Ｃａｎｄｉｄａ属、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ属、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ属、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅ属、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ属、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ属、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ属、Ｄｅｋｋｅｒａ（Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓとも称される）属、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ属、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ属に属する。いくつかの実施形態において、酵母は、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｕｖａｒｕｍ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｇｕｉｌｌｅｒｍｏｎｄｉｉ、Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ ｖｉｎａｅ、Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ／Ｌａｃｈａｎｃｅａ ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｓｔａｒｍｅｒｅｌｌａ ｂａｃｉｌｌａｒｉｓ（以前は、Ｃａｎｄｉｄａ ｓｔｅｌｌａｔａｌ又はＣａｎｄｉｄａ ｚｅｍｐｌｉｎｉｎａと称されていた）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ ｌｕｄｗｉｇｉｉ、Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｒｏｕｘｉｉ、Ｄｅｋｋｅｒａ ｂｒｕｘｅｌｌｅｎｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒａ ａｎｏｍａｌａ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｃｕｓｔｅｒｓｉａｎｕｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａａｒｄｅｎｅｎｓｉｓ、Ｂｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ ｎａｎｕｓ、Ｗｉｃｋｅｒｈａｍｏｍｙｃｅｓ ａｎｏｍａｌｕｓ、又はＴｏｒｕｌａｓｐｏｒａ ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉである。

【0027】

別の態様において、本明細書に記載されるのは、異種プロモーターに作動可能に連結されたβ－リアーゼ（又はシステイン－チオールリアーゼ）酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．である。

【0028】

様々な態様において、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓは、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである。

【0029】

β－リアーゼは、通常熱帯の香りと関連する多官能性チオール、又はメルカプタンと呼ばれる揮発性硫黄化合物の放出を担う酵素である。本開示に従って使用するための例示的なβ－リアーゼ酵素には、国際公開第２００７／０９５６８２号に記載されるものが含まれるがこれらに限定されず、その開示はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、β－リアーゼは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ ｓｐ．；Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ．；Ｓｙｍｂｉｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｓｐ．；Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ．；Ｐｒｏｔｅｕｓ ｓｐ．；Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；Ｄｅｓｕｌｆｉｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ．；又はＴｒｅｐｏｎｅｍａ ｓｐ．などの細菌性β－リアーゼである。いくつかの実施形態において、β－リアーゼはトリプトファナーゼ（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０Ａ８５３）である。

【0030】

いくつかの実施形態において、β－リアーゼは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（全ての株）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｂａｙａｎｕｓ並びにＢｒｅｔｔａｎｏｍｙｃｅｓ及びＤｅｋｋｅｒａの種；Ｃａｎｄｉｄａ；Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ；Ｄｅｂａｒｙｏｍｙｃｅｓ；Ｈａｎｓｅｎｉａｓｐｏｒａ、Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ；Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ；Ｍｅｔｓｃｈｎｉｋｏｗｉａ；Ｐｉｃｈｉａ；Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ；Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｄｅｓ；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ又はＺｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓに由来する酵母β－リアーゼなどの真菌β－リアーゼである。いくつかの実施形態において、β－リアーゼはＩＲＣ７である。いくつかの実施形態において、β－リアーゼは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）のアミノ酸配列を含む。

【0031】

いくつかの実施形態において、システイン－チオールリアーゼは、シスタチオニンに対するＫｃａｔ／Ｋｍが、０．７×１０^２分^－１ｍＭ^－１以下（例えば、０．７×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．６×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．４×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．３×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．２×１０^２分^－１ｍＭ^－１、０．１×１０^２分^－１ｍｍＭ^－１以下）である。いくつかの実施形態において、Ｃｙｓ－３Ｍ３ＳＨに対するシステイン－チオールリアーゼＫｃａｔ／Ｋｍは、３×１０^２分^－１ｍＭ^－１以上（例えば、３×１０^２分^－１ｍＭ^－１、３．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、４×１０^２分^－１ｍＭ^－１、４．５×１０^２分^－１、５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、５．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、６×１０^２分^－１ｍＭ^－１、６．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、７×１０^２分^－１ｍＭ^－１、７．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、８×１０^２分^－１ｍＭ^－１、８．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１、９×１０^２分^－１ｍＭ^－１、９．５×１０^２分^－１ｍＭ^－１以上）である。

【0032】

いくつかの実施形態において、システインチオールリアーゼはＰａｔＢである。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属由来である。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（配列番号９）、Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ（配列番号１０）、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ（配列番号８）、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（配列番号１３）、Ｓ．ｐｅｔｒａｓｉｉ（配列番号１１又は配列番号１２）、又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号１４）に由来する。

【0033】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0034】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0035】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0036】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0037】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0038】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結されたＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一である（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）アミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0039】

別の例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に結合したＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母を提供し、ＰａｔＢは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、システインチオールリアーゼ（例えば、ＰａｔＢ）をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母は、ＴｎａＡ酵素をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母よりも約２倍大きい４－メチル－４－スルファニルペンタン－２－オン（４ＭＳＰ）の放出を促進する。

【0041】

「作動可能に連結された」又は「機能的に連結された」という用語は、一方の機能が他方の機能に影響されるように、単一の核酸断片上の核酸配列が関連することを指す。例えば、調節ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように（すなわち、コード配列又は機能的ＲＮＡがプロモーターの転写制御下にあるように）２つの配列が位置する場合、調節ＤＮＡ配列は、ＲＮＡ又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に「作動可能に連結される」又は「関連付けられる」と言われる。コード配列は、センス方向又はアンチセンス方向の調節配列に作動可能に連結され得る。

【0042】

「プロモーター」という用語は、通常、そのコード配列の上流（５’）のヌクレオチド配列を指し、これは、ＲＮＡポリメラーゼ及び適切な転写に必要な他の因子の認識部位を提供することによってコード配列の発現を制御する。「プロモーター」は、場合によっては、ＴＡＴＡボックス及び転写開始部位を特定するのに役立つ他の配列を含む短いＤＮＡ配列である最小限のプロモーターを含み、このプロモーターには、発現を増強するために調節エレメントが加えられる。「プロモーター」は、最小プロモーター＋調節エレメントを含み、コード配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御することができるヌクレオチド配列も指す。このタイプのプロモーター配列は、近位及びより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、しばしばエンハンサーと称される。したがって、「エンハンサー」は、ＤＮＡ配列であり、これは、プロモーター活性を刺激することができ、プロモーターのレベル又は組織特異性を高めるために挿入されたプロモーターの先天性エレメント又は異種エレメントであり得る。両方の向き（正常又は逆転）で動作することができ、プロモーターの上流又は下流のいずれかに移動しても機能することができる。エンハンサー及び他の上流プロモーターエレメントの両方が、それらの効果を媒介する配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質に結合する。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合もあれば、異なるエレメントから構成される場合もあり、自然界に見出される異なるプロモーターに由来する場合もあり、合成ＤＮＡセグメントから構成される場合もある。

【0043】

プロモーターは、タンパク質因子の結合に関与するＤＮＡ配列も含有し得、このタンパク質因子は、生理学的又は発達状態に応答して転写開始の有効性を制御する。「開始部位」は、転写配列の一部である第１のヌクレオチドを取り囲む位置であり、これは、位置＋１としても定義される。この部位に関しては、遺伝子及びその制御領域の他の全ての配列に番号が付けられている。下流の配列（すなわち、３′方向の更にタンパク質をコードする配列）は陽性とし、一方、上流の配列（５′方向の制御領域の大部分）は陰性とする。

【0044】

例示的なプロモーターとしては、ＴＤＨ３、ＴＤＨ２、ＣＣＷ１２、ＰＧＫ１、ＡＤＨ１、ＡＤＨ２、ＣＹＣ１、ＨＨＦ１、ＨＨＦ２、ＴＥＦ１、ＴＥＦ２、ＨＴＢ２、ＰＡＢ１、ＡＬＤ６、ＲＮＲ１、ＲＮＲ２、ＰＯＰ６、ＲＡＤ２７、ＰＳＰ２、ＲＥＶ１、ＭＦＡ１、ＭＦａ２、ＧＡＬ１、ＣＵＰ１、ＭＥＴ２５、ＩＣＬ１、ＩＣＬ２、ＧＡＬ３、ＨＸＴ１、ＨＸＴ２、ＭＡＬ１１、ＭＡＬ３１、ＭＡＬ３２、ＭＡＬ３３、ＭＲＫ１、及びＳＵＣ２プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、プロモーターはＴＤＨ３プロモーターである。

【0045】

例示的な態様において、本開示は、異種プロモーターに作動可能に連結された酵母β－リアーゼ酵素Ｉｒｃ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換え酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）を提供し、β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、β－リアーゼ酵素は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、β－リアーゼ酵素は、配列番号３に記載のアミノ酸配列を含まない。

【0046】

細胞内での酵素の組換え発現及び組換え酵母細胞の遺伝子改変のための技術は、当業者に周知である。通常、そのような技術は、関連する配列を含む核酸構築物を用いる細胞の形質転換を伴う。そのような方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ａｎｄ Ｒｕｓｓｅｌ（２００１）“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，又はＦ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，“Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｇｒｅｅｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ａｎｄ Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８７）のような標準的な手引き書から、知ることができる。真菌宿主細胞の形質転換及び遺伝子改変のための方法は、例えば、欧州特許出願第ＥＰ－Ａ－０６３５５７４号、国際特許公開第９８／４６７７２号、国際特許公開第９９／６０１０２号、国際特許公開第００／３７６７１号、国際特許公開第９０／１４４２３号、欧州特許出願第ＥＰ－Ａ－０４８１００８号、欧州特許出願第ＥＰ－Ａ－０６３５５７４号、及び米国特許第６，２６５，１８６号に記載されており、これらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

【0047】

方法
本開示は、醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法を提供する。一態様において、方法は、発酵性糖源（例えば、冷却麦芽汁）と、本明細書に記載の組換え酵母（例えば、異種プロモーターに作動可能に連結された、配列番号１に記載のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を含む酵母β－リアーゼ酵素ＩＲＣ７をコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．；（又は異種プロモーターに作動可能に連結された、ステイン－チオールリアーゼＰａｔＢをコードするポリヌクレオチドを含む組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．）とを、不揮発性形態の３ＳＨを遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることを含む。

【0048】

別の態様において、本開示は、醸造プロセスの中に不揮発性形態の３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）を遊離３ＳＨに変換する方法を提供し、本方法は、発酵性糖源を、システイン－チオールリアーゼと、不揮発性形態の３ＳＨを遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることを含む。いくつかの実施形態において、システインチオールリアーゼは、接触工程の前に精製される。システインチオールリアーゼの精製は、Ｒｕｄｄｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ，１０：１２５００，２０２０の記載に沿って実施され得、その開示は参照により本明細書に組み込まれる。

【0049】

いくつかの実施形態において、発酵性糖源は、麦芽汁、穀物／穀類、果物ジュース（例えば、ブドウジュース、リンゴジュース／サイダー）、蜂蜜、甘蔗糖、米、又は麹である。

【0050】

いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態は、グルタチオン結合３ＳＨ又はシステイン結合３ＳＨ、又はそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、この方法は、組換え酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）で発酵させた発酵性糖源（例えば、麦芽汁）において、非改変酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）で発酵させた発酵性糖源（例えば、麦芽汁）と比較して、遊離３ＳＨが３倍増加することをもたらす。

【0051】

いくつかの実施形態において、方法は、システイン－チオールリアーゼを用いた発酵性糖源（例えば、麦芽汁）において、システイン－チオールリアーゼを用いない発酵性糖源（例えば、麦芽汁）と比較して、遊離３ＳＨが３倍増加することをもたらす。

【0052】

いくつかの実施形態において、システインチオールリアーゼはＰａｔＢである。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属の種に由来する。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、Ｓ．ｌｕｇｄｕｎｅｎｓｉｓ（配列番号９）、Ｓ．ｄｅｖｒｉｅｓｅｉ（配列番号１０）、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ（配列番号８）、Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ（配列番号１３）、Ｓ．ｐｅｔｒａｓｉｉ（配列番号１１又は配列番号１２）、又はＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号１４）に由来する。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号８に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0054】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号９に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0055】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0059】

いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一（例えば、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、９７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上同一）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＰａｔＢは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0060】

本開示はまた、醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法も提供し、本方法は、（ａ）３ＳＨの不揮発性形態を含む植物を製粉用穀物に加えて、マッシュし、麦芽汁を産生することを含む、マッシュホッピング工程と、（ｂ）（ａ）によって産生された麦芽汁を沸騰させることと、（ｃ）麦芽汁を冷却することと、及び（ｄ）冷却された麦芽汁と、本明細書に記載の組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓとを、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることと、を含む。いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態は、グルタチオン結合３ＳＨ又はシステイン結合３ＳＨ、及びそれらの組み合わせである。

【0061】

いくつかの実施形態において、醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法は、異種プロモーターに作動可能に連結されたシステイン－チオールリアーゼポリヌクレオチドを含む組換え酵母の不在下で行われ得る。この点で、本開示は、醸造プロセス中に、３－スルファニル－１－ヘキサノール（３ＳＨ）の不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換する方法も提供し、本方法は、（ａ）３ＳＨの不揮発性形態を含む植物を製粉用穀物に加えて、マッシュし、麦芽汁を産生することを含む、マッシュホッピング工程と、（ｂ）（ａ）によって産生された麦芽汁を沸騰させることと、（ｃ）麦芽汁を冷却することと、（ｄ）冷却された麦芽汁と、精製システイン－チオールリアーゼとを、３ＳＨの不揮発性形態を遊離３ＳＨに変換するのに十分な条件及び時間、接触させることと、を含む。いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態は、グルタチオン結合３ＳＨ又はシステイン結合３ＳＨ、及びそれらの組み合わせである。

【0062】

「３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料」という語句は、グルタチオン結合３ＳＨ、システイン結合３ＳＨ、又はこれらの組み合わせを含有する任意の植物（又は植物部分）を指す。「植物部分」という用語は、種子、芽、茎、葉、根、花、及び植物組織を含む、植物の全ての構成要素を包含する。いくつかの実施形態において、植物材料は、製粉用穀物に加えられる前に処理されている。植物材料を処理する例示的な方法としては、植物材料を、破砕すること、加圧すること、薄く切ること、混合すること、汁を絞ること、ローラーで延ばすこと、粉砕すること、又はすりつぶすことが挙げられるが、これらに限定されない。

【0063】

いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料は、ホップである。本明細書に記載の方法での使用に適したホップとしては、Ａｍａｒｉｌｌｏ、Ａｐｏｌｌｏ、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃｅｎｔｅｎｎｉａｌ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｃｉｔｒａ、Ｃｌｕｓｔｅｒ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ、Ｃｒｙｓｔａｌ、Ｅｒｏｉｃａ、Ｇａｌｅｎａ、Ｇｌａｃｉｅｒ、Ｇｒｅｅｎｂｕｒｇ、Ｈｏｒｉｚｏｎ、Ｌｉｂｅｒｔｙ、Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ、Ｍｏｕｎｔ Ｈｏｏｄ、Ｍｏｕｎｔ Ｒａｉｎｉｅｒ、Ｎｅｗｐｏｒｔ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｐａｌｉｓａｄｅ、Ｓａｎｔｉａｍ、Ｓｉｍｃｏｅ、Ｓｔｅｒｌｉｎｇ、Ｓｕｍｍｉｔ、Ｔｏｍａｈａｗｋ、Ｕｌｔｒａ、Ｖａｎｇｕａｒｄ、Ｗａｒｒｉｏｒ、Ｗｉｌｌａｍｅｔｔｅ、Ｚｅｕｓ、Ａｄｍｉｒａｌ、Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ Ｇｏｌｄ、Ｂｕｌｌｉｏｎ、Ｃｈａｌｌｅｎｇｅｒ、Ｆｉｒｓｔ Ｇｏｌｄ、Ｆｕｇｇｌｅｓ、Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｈｅｒａｌｄ、Ｎｏｒｔｈｄｏｗｎ、Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｂｒｅｗｅｒ、Ｐｈｏｅｎｉｘ、Ｐｉｌｏｔ、Ｐｉｏｎｅｅｒ、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ、Ｔａｒｇｅｔ、Ｗｈｉｔｂｒｅａｄ Ｇｏｌｄｉｎｇ Ｖａｒｉｅｔｙ（ＷＧＶ）、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ、Ｈｅｒｓｂｒｕｃｋｅｒ、Ｓａａｚ、Ｔｅｔｔｎａｎｇ、Ｓｐａｌｔ、Ｆｅｕｘ－Ｃｏｅｕｒ Ｆｒａｎｃａｉｓ、Ｇａｌａｘｙ、Ｇｒｅｅｎ Ｂｕｌｌｅｔ、Ｍｏｔｕｅｋａ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｇｅｍ、Ｐａｃｉｆｉｃ Ｊａｄｅ、Ｐａｃｉｆｉｃａ、Ｐｒｉｄｅ ｏｆ Ｒｉｎｇｗｏｏｄ、Ｒｉｗａｋａ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｒｏｓｓ、Ｌｕｂｌｉｎ、Ｍａｇｎｕｍ、Ｐｅｒｌｅ、Ｐｏｌｎｉｓｃｈｅｒ Ｌｕｂｌｉｎ、Ｓａｐｈｉｒ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｅｌｅｃｔ、Ｓｔｒｉｓｓｅｌｓｐａｌｔ、Ｓｔｙｒｉａｎ Ｇｏｌｄｉｎｇｓ、Ｔａｒｄｉｆ ｄｅ Ｂｏｕｒｇｏｇｎｅ、Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｂｒａｖｏ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｃｈｅｌａｎ、Ｃｏｍｅｔ、Ｅｌ Ｄｏｒａｄｏ、Ｓａｎ Ｊｕａｎ Ｒｕｂｙ Ｒｅｄ、Ｓａｔｕｓ、Ｓｏｎｎｅｔ Ｇｏｌｄｉｎｇ、Ｓｕｐｅｒ Ｇａｌｅｎａ、Ｔｉｌｌｉｃｕｍ、Ｂｒａｍｌｉｎｇ Ｃｒｏｓｓ、Ｐｉｌｇｒｉｍ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ Ｈｅｒｋｕｌｅｓ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ Ｍａｇｎｕｍ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕｅｒ Ｔａｕｒｕｓ、Ｍｅｒｋｕｒ、Ｏｐａｌ、Ｓｍａｒａｇｄ、Ｈａｌｌｅｒａｔａｕ Ａｒｏｍａ、Ｋｏｈａｔｕ、Ｒａｋａｕ、Ｓｔｅｌｌａ、Ｓｔｉｃｋｌｅｂｒａｃｔ、Ｓｕｍｍｅｒ Ｓａａｚ、Ｓｕｐｅｒ Ａｌｐｈａ、Ｓｕｐｅｒ Ｐｒｉｄｅ、Ｔｏｐａｚ、Ｗａｉ－ｉｔｉ、Ｂｏｒ、Ｊｕｎｇａ、Ｍａｒｙｎｋａ、Ｐｒｅｍｉａｎｔ、Ｓｌａｄｅｋ、Ｓｔｙｒｉａｎ Ａｔｌａｓ、Ｓｔｙｒｉａｎ Ａｕｒｏｒａ、Ｓｔｙｒｉａｎ Ｂｏｂｅｋ、Ｓｔｙｒｉａｎ Ｃｅｌｅｉａ、Ｓｙｂｉｌｌａ、及びＳｏｒａｃｈｉ Ａｃｅホップが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ホップは、Ｃａｓｃａｄｅ、Ｃａｌｙｐｓｏ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｐｅｒｌｅ、Ｔｒｉｐｌｅ Ｐｅａｒｌ、Ｎｕｇｇｅｔ、Ｓａａｚ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ／ＣＴＺ、Ｃｈｉｎｏｏｋ、Ｎｅｌｓｏｎ Ｓａｕｖｉｎ、Ｈａｌｌｅｒｔａｕ Ｂｌａｎｃ、及び／又はＳｉｍｃｏｅホップである。

【0064】

いくつかの実施形態において、ホップは少なくとも約４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する。例えば、いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも約４００μｇ／ｋｇ、少なくとも約４５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約６００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約７００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約８００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約９００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９５０μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１０００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含む。いくつかの実施形態において、ホップは、約４００μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇ、又は約５００μｇ／ｋｇ～約９００μｇ／ｋｇ、又は約６００μｇ／ｋｇ～約８００μｇ／ｋｇ、又は約４００μｇ／ｋｇ～約６００μｇ／ｋｇの範囲の量のシステイン結合３ＳＨを含有する。

【0065】

いくつかの実施形態において、ホップは少なくとも約５０００μｇ／ｋｇのグルタチオン３ＳＨを含有する。例えば、いくつかの実施形態において、ホップは、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１０，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１４，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１４，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１５，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１５，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０，０００μｇ／ｋｇのグルタチオン結合３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ホップは、約５０００μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇ、又は約５５００μｇ／ｋｇ～約９０００μｇ／ｋｇ、又は約６０００μｇ／ｋｇ～約８０００μｇ／ｋｇ、又は約４０００μｇ／ｋｇ～約６０００μｇ／ｋｇ、又は約５０００μｇ／ｋｇ～約８０００μｇ／ｋｇ、又は約８０００μｇ／ｋｇ～約１２，０００μｇ／ｋｇ、又は約１０，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇ、又は約１５，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇの範囲の量のグルタチオン結合３ＳＨを含有する。

【0066】

いくつかの実施形態において、３ＳＨの不揮発性形態を含む植物材料は、ブドウ由来生成物である。好適なブドウ由来生成物は、例えば、粉砕されたブドウ又はブドウ粉末を含む。ブドウ由来生成物は、白ブドウ、赤ブドウ、又はそれらの組み合わせから得られ得る。例示的な白ブドウ品種としては、Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ Ｂｌａｎｃ、Ｃｈａｒｄｏｎｎａｙ、Ｃｈｅｎｉｎ Ｂｌａｎｃ、Ｃｏｌｏｍｂａｒｄ、Ｇｅｗｕｒｚｔｒａｍｉｎｅｒ、Ｇｒｏｓ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｋｏｓｈｕ、Ｍａｃｃａｂｅｏ、Ｍｕｓｃａｔ、Ｐｅｔｉｔ Ｍａｎｓｅｎｇ、Ｐｉｎｏｔ Ｂｌａｎｃ、Ｐｉｎｏｔ Ｇｒｉｓ、Ｒｉｅｓｌｉｎｇ、Ｓｃｈｅｕｒｅｂｅ、Ｓｅｍｉｌｌｏｎ、Ｓｙｌｖａｎｅｒ、及びＴｏｋａｙが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な赤ブドウ品種としては、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｆｒａｎｃ、Ｃａｂｅｒｎｅｔ Ｓａｕｖｉｇｎｏｎ、Ｇｒｅｎａｃｈｅ、Ｍｅｒｌｏｔ、及びＰｉｎｏｔ Ｎｏｉｒが挙げられるが、これらに限定されない。

【0067】

いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、少なくとも約４００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する。例えば、いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、少なくとも約４００μｇ／ｋｇ、少なくとも約４５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約６００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約７００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約８００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８５０μｇ／ｋｇ、少なくとも約９００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約９５０μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約３０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約３５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約４０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約４５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約１０，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１４，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも１４，５００μｇ／ｋｇ、ｋｇ、少なくとも約１５，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１５，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０，００００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２０，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２１，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２１，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２２，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２２，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２３，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２３，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２４，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２４，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２５，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２５，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２６，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２６，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２７，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２７，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２８，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２８，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２９，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも２９，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３０，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３０，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３１，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３１，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３２，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３３，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３３，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３４，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３４，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３５，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３５，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３６，０００μｇ／ｋｇのシステイン結合３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、約４００μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇ、又は約５００μｇ／ｋｇ～約９００μｇ／ｋｇ、又は約６００μｇ／ｋｇ～約８００μｇ／ｋｇ、又は約４００μｇ／ｋｇ～約６００μｇ／ｋｇ、又は約４００μｇ／ｋｇ～約３６，０００μｇ／ｋｇ、又は約２０，０００μｇ／ｋｇ～約３６，０００μｇ／ｋｇ、又は約５，０００μｇ／ｋｇ～約８０００μｇ／ｋｇ、又は約８０００μｇ／ｋｇ～約１２，０００μｇ／ｋｇ、又は約１０，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇ又は約１５，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇの範囲の量のシステイン結合３ＳＨを含有する。

【0068】

いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇのグルタチオン３ＳＨを含有する。例えば、いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、少なくとも約５０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約５５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約６５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約７５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約８５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約９５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１０，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１１，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１２，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１３，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１４，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１４，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１５，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１５，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１６，５０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１７，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１８，５００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，０００μｇ／ｋｇ、少なくとも約１９，５００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも約２０，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３０，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも３５，００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも４０，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも４５，０００μｇ／ｋｇ、又は少なくとも５０，０００μｇ／ｋｇのグルタチオン結合３ＳＨを含有する。いくつかの実施形態において、ブドウ由来生成物は、約５０００μｇ／ｋｇ～約１０００μｇ／ｋｇ、又は約５５００μｇ／ｋｇ～約９０００μｇ／ｋｇ、又は約６０００μｇ／ｋｇ～約８０００μｇ／ｋｇ、又は約４０００μｇ／ｋｇ～約６０００μｇ／ｋｇ、又は約４００μｇ／ｋｇ～約３６，０００μｇ／ｋｇ、又は約２０，０００μｇ／ｋｇ～約５０，０００μｇ／ｋｇ、又は約５０００μｇ／ｋｇ～約８０００μｇ／ｋｇ、又は約８０００μｇ／ｋｇ～約１２，０００μｇ／ｋｇ、又は約１０，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇ、又は約１５，０００μｇ／ｋｇ～約２０，０００μｇ／ｋｇの範囲のグルタチオン結合３ＳＨの量を含有する。

【0069】

いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、グリスト１ｋｇ当たり１００グラム未満の植物材料を加えること（例えば、製粉用穀物１ｋｇ当たり７５グラム未満の植物材料又は製粉用穀物１ｋｇ当たり５０グラム未満の植物材料を加えること）を含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、製粉用穀物１ｋｇ当たり７５～１００グラムの植物材料を加えることを含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、製粉用穀物１ｋｇ当たり５０～７５グラムの植物材料を加えることを含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、製粉用穀物１ｋｇ当たり２５～５０グラムの植物材料を加えることを含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、製粉用穀物１ｋｇ当たり１～２５グラムの植物材料を加えることを含む。いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、ホップ及びブドウ由来生成物の両方を製粉用穀物に加えることを含む。

【0070】

任意選択で、マッシュホッピング工程は、沸騰工程の前のタンパク質休息を含む。例えば、いくつかの実施形態において、タンパク質レストは、マッシュを、沸騰工程の少なくとも５分間（例えば、少なくとも約５分間、又は少なくとも約１０分間、又は少なくとも約１５分間、又は少なくとも約２０分間、又は少なくとも約２５分間、又は少なくとも約３０分間、又は少なくとも約５分間、又は少なくとも約４０分間、又は少なくとも約４５分間、又は少なくとも約５０分間、又は約１時間前に、１２０°Ｆ未満（例えば、１００°Ｆ～１２０°Ｆ）の温度で維持することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質休止は、マッシュを沸騰工程の前の１時間以下の間、１２０°Ｆ未満（例えば、１００°Ｆ～１２０°Ｆの間）の温度で維持することを含む。いくつかの実施形態において、タンパク質休止は、沸騰工程の前に、５分～１時間（又は約５分～約２０分、又は約５分～約１０分、又は約１０分～約３０分、又は約１０分～約１時間）の範囲の時間、１２０°Ｆ未満の温度でマッシュを維持することを含む。

【0071】

いくつかの実施形態において、マッシュホッピング工程は、タンパク質休止後かつ沸騰工程前の糖化休止を更に含む。例えば、いくつかの実施形態において、糖化休止は、沸騰工程の少なくとも１５分間、マッシュを１６０°Ｆ未満（例えば、１４０°Ｆ～１６０°Ｆ）の温度で維持することを含む。いくつかの実施形態において、糖化休止は、マッシュを１６０°Ｆ未満（例えば、１４０°Ｆ～１６０°Ｆ、又は１４８°Ｆ～１５８°Ｆ）の温度で、少なくとも約１５分、又は少なくとも約２０分、又は少なくとも約２５分、又は少なくとも約３０分、又は少なくとも約５分、又は少なくとも約４０分、又は少なくとも約４５分、又は少なくとも約５０分、又は少なくとも約６０分、又は約６５分、又は約７０分、又は約７５分、又は約８０分、又は約８５分、又は約９０分間維持することを含む。いくつかの実施形態において、糖化休止は、マッシュを沸騰工程の前に１５分～９０分（又は約１５分～約３０分、又は約２０分～約６０分、又は約２０分～約４０分、又は約６０分～約９０分）の範囲の時間、１６０°Ｆ未満（例えば、１４０°Ｆ～１６０°Ｆ、又は１４８°Ｆ～１５８°Ｆ）の温度で維持することを含む。

【0072】

様々な実施形態において、方法は、冷却された麦芽汁をホップと接触させて混合物を産生することと、混合物を組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓと接触させることとを更に含む。いくつかの実施形態において、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓはＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓである。

【0073】

いくつかの実施形態において、接触工程は発酵槽内で４５°Ｆ～１００°Ｆの範囲の温度で行われる。いくつかの実施形態において、接触工程は、３日間～１４日間（例えば、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、又は約１４日間）の範囲の期間にわたって生じる。

【0074】

抽出プロセスにおいて他の不揮発性チオール（例えば、グルタチオン結合型又はシステイン結合型、非３ＳＨチオール）を変換する方法も企図される。例えば、本明細書に記載の方法は、グルタチオン結合型又はシステイン結合型－４ＭＳＰ、グルタチオン結合型又はシステイン結合型－３ＳＨ又はグルタチオン結合型又はシステイン結合型－３ＳＨＡ）をそれらの芳香族、遊離型に変換するのに有用であることが企図される。

【0075】

本明細書に記載される方法のいずれにおいても、麦芽汁は、接触工程の後に少なくとも６０ｎｇ／Ｌの遊離３ＳＨを任意に含む。いくつかの実施形態において、麦芽汁は、接触工程の後に、約６０ｎｇ／Ｌ（又は約６５ｎｇ／Ｌ、又は約７０ｎｇ／Ｌ、又は約７５ｎｇ／Ｌ、又は約８０ｎｇ／Ｌ、又は約８５ｎｇ／Ｌ、又は約９０ｎｇ／Ｌ、又は約９５ｎｇ／Ｌ、又は約１００ｎｇ／Ｌ、又は約１１０ｎｇ／Ｌ、又は約１２０ｎｇ／Ｌ、又は約１３０ｎｇ／Ｌ、又は約１４０ｎｇ／Ｌ、又は約１５０ｎｇ／Ｌ、又は約１６０ｎｇ／Ｌ、又は約１７０ｎｇ／Ｌ、又は約１８０ｎｇ／Ｌ、又は約１９０ｎｇ／Ｌ、又は約２００ｎｇ／Ｌ、又は約２５０ｎｇ／Ｌ、又は約３００ｎｇ／Ｌ、又は約３５０ｎｇ／Ｌ、又は約４００ｎｇ／Ｌ、又は約４５０ｎｇ／Ｌ、又は約５００ｎｇ／Ｌ、又は約５５０ｎｇ／Ｌ、又は約６００ｎｇ／Ｌ、又は約６５０ｎｇ／Ｌ、又は約７００ｎｇ／Ｌ、又は約７５０ｎｇ／Ｌ、又は約８００ｎｇ／Ｌ、又は約８５０ｎｇ／Ｌ、又は約９００ｎｇ／Ｌ、又は約９５０ｎｇ／Ｌ、又は約１０００ｎｇ／Ｌ）の遊離３ＳＨを含む。試料中の遊離チオールは、例えば、安定同位体希釈アッセイ及びナノ液体クロマトグラフィータンデム質量分析（Ｎａｎｏ ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって、分析し得る（Ｒｏｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１４６８：１５４－１６３，２０１６、その開示は参照により本明細書に組み込まれる）。試料中の遊離チオールの量を定量する方法は、例えば、誘導体化及び高速液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）（Ｃａｐｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８７：１２２６－１２３１，２０１５、その開示は参照により組み込まれる）。

【0076】

いくつかの実施形態において、この方法は、非改変Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁と比較して、組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓで発酵させた麦芽汁中の遊離３ＳＨが６倍増加することをもたらす。

【実施例】

【0077】

実施例１－組換えＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ
ＴＤＨ３プロモーターエレメントと共にＫＡＮＭＸ４遺伝子を含有する組み込みカセットを、ＩＲＣ７プロモーターと８０ｂｐの相同性を含む配列番号５：５’－ＡＡＡＡＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＡＡＣＴＧＧＡＧＡＧＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＧＡＡＡＴＴＴＴＴＡＡＡＧＴＴＴＡＧＣＡＣＡＣＣＡＴＡＴＡＧ－３’（フォワードプライマー）及び配列番号６：５’－ＴＣＣＡＡＴＡＡＣＡＧＡＣＡＧＴＴＧＣＧＴＡＧＴＡＡＴＡＣＣＡＡＡＣＴＴＣＧＡＴＡＡＣＴＣＧＧＴＡＣＧＡＴＣＡＡＴＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣ－３’（リバースプライマー）を含有するプライマーで増幅した。このカセットをそれぞれのＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ親株ＯＹＬ－０８８（酵母株Ａ．ＵＳ－０５のＷＧＳ（ＳＲＲ８１７３０６７））及びＯＹＬ－０１１（酵母株ＹＭＤ１８７２のＷＧＳ（ＳＲＲ８１７２９４１））に形質転換し、ＩＲＣ７の上流にＫＡＮＭＸ－ＴＤＨ３ｐｒ配列を標的組み込みした。得られたＧ４１８耐性コロニーのＰＣＲ確認は、ＩＲＣ７のＴＤＨ３プロモーター駆動型過剰発現をもたらす、成功した組み込みを検証した。発現されたＩＲＣ７対立遺伝子を更に配列決定し、野生型ＩＲＣ７配列にアラインメントした（図１）。ＳＮＰ及び得られたアミノ酸置換は、以下の表１に記す。

【0078】

【表1】

【0079】

その結果、改変ＯＹＬ－０８８株は、ＩＲＣ７の活性対立遺伝子（配列番号１に示されるアミノ酸配列、配列番号２に示されるポリヌクレオチド配列）を発現するが、修飾ＯＹＬ－０１１株におけるＩＲＣ７をコードするポリヌクレオチドに存在するＳＮＰは、ＩＲＣ７の不活性対立遺伝子（配列番号３に示されるアミノ酸配列、配列番号４に示されるポリヌクレオチド配列）を発現することが、示された。

【0080】

実施例２－抽出方法
小さなパイロット醸造システムを使用して、麦芽汁を「袋で醸造」又はＢＩＡＢ法で調製した。マッシュホップされた試料に対して、二条大麦Ｂｒｅｗｅｒ’ｓ Ｍａｌｔ（Ｂｒｉｅｓｓ Ｍａｌｔｉｎｇ）及びＣａｓｃａｄｅホップ（Ｈｏｐｓｔｅｉｎｅｒ）を、タンパク質休止のため１２０°Ｆで１５分間浸した後、糖化休止のため１４８°Ｆで１５分間加熱した。麦芽汁から穀物とホップを取り出し、沸騰の初めに、体積を目標である１０°Ｐに調整した。麦芽汁を３０分間沸騰させた後、更に１５分間渦巻きスタンドに移した後、フラスコに移して冷却した。得られた麦芽汁（１２°Ｐ）を、ＯＹＬ－０８８、ＯＹＬ－０１１、ＯＹＬ－０８８ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７、又はＯＹＬ－０１１ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７のいずれかで発酵させた。乾燥ホップした試料に対して同じプロセスを行ったが、ホップはマッシュから省略され、その後、発酵の２日目に８ｇ／Ｌ（約２ｌｂ／ｂｂｌ）の同じホップ速度で加えられた。麦芽汁試料及びビール試料を５０ｍｌの円錐管中に収集し、１．５ｍｇ／Ｌのメタ重亜硫酸ナトリウムを試料に加え、試料を直ちに凍結した。試料を、Ｃａｐｏｎｅ ａｌ．（Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．，８７：１２２６－１２３１，２０１５）に記載されているように誘導体化及びＨＰＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって評価し、又はＲｏｌａｎｄ ａｌ．（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ Ａ，１４６８：１５４－１６３，２０１６）に記載されているように安定同位体希釈アッセイ及びナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳによっても評価した。

【0081】

図２に示すように、ＯＹＬ－０８８ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７で発酵させたビール試料では、非修飾株（ＯＹＬ－０８８）と比較して、遊離３ＳＨレベルがほぼ３倍増加した。ＯＹＬ－０１１及びＯＹＬ－０１１ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７で作られた同じビールの３ＳＨレベルは、比較して変化しなかった（ＩＲＣ７の不活性対立遺伝子による）。驚くべきことに、ＯＹＬ－０８８ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７で発酵させたマッシュホップビール試料では、非修飾株（ＯＹＬ－０８８）と比較して、遊離３ＳＨレベルがほぼ６倍増加した。ＯＹＬ－０１１及びＯＹＬ－０１１ ＴＤＨ３－ＩＲＣ７で作られた同じビールの３ＳＨレベルは、比較して変化しなかった（ＩＲＣ７の不活性対立遺伝子による）。

【0082】

上記の結果は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓにおけるβ－リアーゼ過剰発現（具体的には、ＩＲＣ７過剰発現）が遊離３－ＳＨを産生しないという報告を考慮すると、少なくとも部分的には、驚くべきものであった（Ｄｅｎｂｙ ｅｔ ａｌ．、ＷＢＣ Ｃｏｎｎｅｃｔ ２０２０、Ｐｏｓｔｅｒ１５９）。本明細書に記載される実験の過程で、以前の研究がＩＲＣ７の不活性な形態を利用したと決定された。内因性β－リアーゼ活性について細胞抽出物を調べる別の研究（すなわち、過剰発現研究ではない）では、Ｖ３４８Ｌ置換（配列番号１と同じ）を有するＩｒｃ７が不活性であることが決定された（Ｃｕｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｒｂｏｎ－ｓｕｌｆｕｒ β－ｌｙａｓｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ ｇｅｎｅ ＩＲＣ７ ａｆｆｅｃｔ ｔｈｅ ｐｏｌｙｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｔｈｉｏｌ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｃａｐａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｂｒｅｗｅｒｓ ｙｅａｓｔ，”Ｗｏｒｌｄ Ｂｒｅｗｉｎｇ Ｃｏｎｇｒｅｓｓ Ｃｏｎｎｅｃｔ ２０２０，Ｐｏｓｔｅｒ １５７）。予想外に、及び本明細書に示されるように、配列番号１に記載のアミノ酸配列を含むＩｒｃ７は、植物材料中で利用可能な不揮発性チオールを、それらの遊離、芳香族形態に効率的に変換する。加えて、マッシュホッピング工程における活性β－リアーゼの使用は、不揮発性チオールのそれらの遊離形態への変換において顕著な増加をもたらす。

【0083】

実施例３－組換え酵母
ＧブロックをＩＤＴによって合成し、ＨＹＧＢ選択マーカーを有する酵母シャトルベクターにクローニングした。これらのＧブロックは、ＰＧＫ１プロモーター及びＣＹＣ１ターミネーターによる調節下で、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ由来のＰａｔＢ（配列番号８）、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ由来のＩＲＣ７（配列番号１）、又はＳ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ由来のＩＲＣ７（配列番号７）をコードするポリヌクレオチドを含有した。次に、ベクターをラガー醸造株（ＯＹＬ－１０６）に形質転換し、分離株をＹＰＤ－ＨＹＧＢ寒天プレート上で増殖させた。これらの分離株をＹＰＤ＋ＨＹＧＢに接種し、酢酸鉛紙を用いて硫黄産生をアッセイした。酢酸鉛紙は、Ｓ．ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ ＩＲＣ７対立遺伝子で顕著な黒化を示し、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＲＣ７対立遺伝子では少なかったが、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢ対立遺伝子と空のベクター対照ではほとんど又はまったく黒化しなかった。単離物を、小フラスコ発酵のために、２５０ｍｌの乾燥麦芽抽出物培地＋ＨＹＧＢ中で増殖させた。増殖の４８時間後、各増殖培養物を遠心分離し、１０００万細胞／ｍｌを使用して、二条大麦麦芽から調製した３００ｍｌの１５°Ｐ麦芽汁を接種した。発酵を１週間行って、その時点で感覚を行った。Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢ対立遺伝子の結果として生じた感覚的影響は、ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ＩＲＣ７対立遺伝子及び空ベクター対照よりも、顕著に目立った。Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢ発酵の主な芳香族記述子は、全て３ＳＨチオールの特徴である、激しいパッションフルーツ、グアバ、グレープフルーツであった。

【0084】

追加のＰａｔＢ対立遺伝子に対する調査を、上記と同様の方法で行った。Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ、Ｓ．ｃｏｈｎｉｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ（配列番号１４）由来のＰａｔＢ対立遺伝子を有するプラスミドをラガー醸造株（ＯＹＬ－１０６）に形質転換し、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢ対立遺伝子と比較した。得られた麦芽汁発酵を感覚的に評価した。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ ＰａｔＢ対立遺伝子の過剰発現を伴う発酵は、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓのＰａｔＢ対立遺伝子と同等レベルのパッションフルーツ及びグアバの香りをもたらしたが、Ｓ．ａｎｇｉｎｏｓｕｓ及びＳ．ｃｏｈｎｉｉ ＰａｔＢの対立遺伝子の過剰発現を伴う発酵は、過剰発現を伴わない対照発酵と比較して、香りが顕著に増強しなかった。

【0085】

実施例４－チオール放出におけるＰａｔＢシステイン－チオールリアーゼ及びＩｒｃ７、及びＴｎａＡ β－リアーゼ酵素の効果の比較
試験発酵を実施して、Ｉｒｃ７、ＰａｔＢ、及びＴｎａＡ β－リアーゼ酵素の活性及び特異性を評価した。糖化のため、１４８°Ｆで３０分間二条大麦麦芽をマッシュした後、１８０°Ｆで５分間酵素活性を不活化することによって、商業醸造所で麦芽汁を調製した。マッシュの流出物を収集し、３０分間沸騰させた。麦芽抽出物を１５°Ｐに希釈し、７０℃まで冷却してから、ＯＹＬ－０１１、ＯＹＬ－０１１＋Ｉｒｃ７、ＯＹＬ－０１１＋ＰａｔＢ、又はＯＹＬ－０１１＋ＴｎａＡのうちの１つを接種した。硫化水素検出器チューブ（４Ｈ Ｇａｓｔｅｃ）を用いて、発酵フラスコを構成し、発酵を通して放出される累積Ｈ_２Ｓを定量化した。発酵が完了したとき（１１日後）、Ｈ_２Ｓレベルを記録し、得られたビールを遊離チオール３ＳＨ及び４ＭＳＰについて分析した。結果を以下の表２に示す。

【0086】

【表2】

【0087】

上記に示されるように、Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢシステイン－チオールリアーゼを発現する株は、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ Ｉｒｃ７ β－リアーゼを発現する株と比較して、３ＳＨ出力を増強し、Ｈ_２Ｓ出力を減少させた。Ｓ．ｈｏｍｉｎｉｓ ＰａｔＢ対立遺伝子は、既知のβ－リアーゼ活性を有する別の酵素、Ｃ．ａｍａｌｏｎａｔｉｃｕｓ由来のＴｎａＡトリプトファナーゼと比較して、４ＭＳＰの増強も示す。

【図1】

【図2】

【配列表】

2024507753000001.app

【国際調査報告】