特表 2024-507823 免疫監視を増強するために制御性Ｔ細胞を標的化するための材料及び方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】免疫監視を増強するために制御性Ｔ細胞を標的化するための材料及び方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240214BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240214BHJP

   C12Q 1/02 20060101ALI20240214BHJP

   C07K 16/46 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240214BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240214BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240214BHJP

   G01N 33/53 20060101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13

C07K16/28 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12Q1/02

C07K16/46

C12N15/62 Z

C12P21/08

A61P35/00

A61K39/395 T

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550008

(86)(22)【出願日】2022-02-17

(85)【翻訳文提出日】2023-09-29

(86)【国際出願番号】 US2022016707

(87)【国際公開番号】W WO2022178067

(87)【国際公開日】2022-08-25

(31)【優先権主張番号】63/151,636

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,635

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,634

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,633

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/151,631

(32)【優先日】2021-02-19

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】509087759

【氏名又は名称】ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(72)【発明者】

【氏名】グレワル，イクバル，エス．

(72)【発明者】

【氏名】ガネサン，ラジクマール

(72)【発明者】

【氏名】シン，サンジャヤ

(72)【発明者】

【氏名】ディース，サンディー

【テーマコード（参考）】

4B063

4B064

4B065

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B063QA11

4B063QA19

4B063QQ03

4B063QQ08

4B063QQ36

4B063QR08

4B063QR32

4B063QR35

4B063QR48

4B063QR62

4B063QR73

4B063QR77

4B063QS25

4B063QS34

4B064AG27

4B064CA02

4B064CA05

4B064CA06

4B064CA08

4B064CA10

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B064DA13

4B065AA01X

4B065AA01Y

4B065AA57X

4B065AA57Y

4B065AA72X

4B065AA72Y

4B065AA83X

4B065AA83Y

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA44

4B065CA46

4C085AA14

4C085BB31

4C085CC23

4C085DD61

4C085EE01

4C085GG01

4H045AA10

4H045AA30

4H045BA09

4H045CA40

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

(57)【要約】

分子は、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の手段と、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合することができる第２の手段と、を含み、分子は、Ｔｒｅｇ細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、又はそれを枯渇することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

分子であって、
ａ．制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．前記Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、
任意選択で、前記分子が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、分子。

【請求項2】

前記第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項3】

前記第１の抗原が、ＣＤ２５である、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項4】

前記第１の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、請求項１に記載の多重特異性抗体。

【請求項5】

前記第１の結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、請求項４に記載の多重特異性抗体。

【請求項6】

前記第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、請求項１～５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項7】

前記第２の抗原が、ＣＤ３９である、請求項１～６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項8】

前記第２の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項9】

前記第２の結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、請求項８に記載の多重特異性抗体。

【請求項10】

前記第１の結合ドメイン及び／又は前記第２の結合ドメインが、ヒト化されている、請求項１～９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項11】

前記多重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項12】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、請求項１１に記載の多重特異性抗体。

【請求項13】

前記ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、請求項１２に記載の多重特異性抗体。

【請求項14】

前記ＩｇＧ抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む、請求項１２に記載の多重特異性抗体。

【請求項15】

前記抗体が、カッパ軽鎖を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項16】

前記抗体が、ラムダ軽鎖を含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項17】

前記抗体が、モノクローナル抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項18】

前記多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項19】

前記第１の結合ドメインが、ｓｃＦｖ領域であり、前記第２の結合ドメインが、Ｆａｂ領域である、請求項１８に記載の多重特異性抗体。

【請求項20】

前記多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する、請求項１～１９のいずれか一項に記載の多重特異性抗体。

【請求項21】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体をコードする、核酸。

【請求項22】

請求項２１に記載の核酸を含む、ベクター。

【請求項23】

請求項２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項24】

請求項２２に記載のベクターと、そのためのパッケージと、を含む、キット。

【請求項25】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、そのためのパッケージと、を含む、キット。

【請求項26】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と、医薬的に許容される担体と、を含む、医薬組成物。

【請求項27】

請求項２６に記載の医薬組成物を製造する方法であって、前記多重特異性抗体を医薬的に許容される担体と組み合わせて、前記医薬組成物を得ることを含む、方法。

【請求項28】

請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を作製するプロセスであって、前記多重特異性抗体をコードする１つ以上の核酸を宿主細胞に導入することを含み、前記多重特異性抗体が、
ａ．制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．前記Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、プロセス。

【請求項29】

ＣＤ２５を発現する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇する方法であって、前記ＣＤ２５を発現する細胞を含む試料を提供することと、前記試料を請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と接触させることと、ＣＤ２５を発現し、かつ前記多重特異性抗体と結合する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇することと、を含む、方法。

【請求項30】

ＣＤ３９を発現する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇する方法であって、前記ＣＤ３９を発現する細胞を含む試料を提供することと、前記試料を請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と接触させることと、前記ＣＤ３９を発現し、かつ前記多重特異性抗体と結合する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇することと、を含む、方法。

【請求項31】

前記細胞が、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である、請求項２９又は３０に記載の方法。

【請求項32】

前記試料が、血液試料である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記試料が、組織試料である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

Ｔｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と接触させることを含む、方法。

【請求項35】

がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、前記がん細胞及び前記Ｔｒｅｇ細胞を、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体と接触させることを含む、方法。

【請求項36】

がんを有する対象においてがん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項37】

対象においてがんを治療する方法であって、請求項１～２０のいずれか一項に記載の多重特異性抗体を前記対象に投与することを含む、方法。

【請求項38】

前記がんが、固形腫瘍がんである、請求項３６又は請求項３７に記載の方法。

【請求項39】

前記がんが、血液がんである、請求項３６又は請求項３７に記載の方法。

【請求項40】

多重特異性分子であって、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合することができる第１の手段と、前記Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合することができる第２の手段と、を含む、多重特異性分子。

【請求項41】

前記第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、請求項４０に記載の多重特異性分子。

【請求項42】

前記第１の抗原が、ＣＤ２５である、請求項４０～４１のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項43】

前記第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項44】

前記第２の抗原が、ＣＤ３９である、請求項４０～４２のいずれか一項に記載の多重特異性分子。

【請求項45】

１つを超える標的分子と結合する分子を作製するためのプロセスであって、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第１の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、前記Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第２の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、前記第１の抗原及び前記第２の抗原と結合することができる分子を提供する機能を実行する工程と、を含む、プロセス。

【請求項46】

Ｔｒｅｇ細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、又はそれを枯渇する方法であって、前記Ｔｒｅｇ細胞を請求項４０～４５のいずれか一項に記載の分子と接触させることを含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

（関連出願の相互参照）
本出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，６３６号、２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，６３５号、２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，６３４号、２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，６３３号、及び２０２１年２月１９日に出願された米国仮出願第６３／１５１，６３１号の利益を主張し、これらのそれぞれの開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

（電子的に提出された配列表の参照）
本出願は、２８，８９８バイトのサイズで２０２２年２月１４日に作成された１４６２０－６２７－２２８＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔと題されたテキストファイル、本出願とともに提出された配列表を、参照により組み込む。

【0003】

１．分野
本明細書で提供されるのは、制御性Ｔ（regulatory T、Ｔｒｅｇ）細胞上に存在する抗原と結合することができる手段を含む、有用な多重特異性分子及びそれに関連するプロセス、並びに宿主における免疫を調節するため、及び／又はがんなどの疾患若しくは障害を治療するためのその使用である。

【0004】

２．背景
免疫療法の出現は、がんを含む様々な細胞及び組織の治療において改善を導いた。免疫チェックポイント阻害剤、腫瘍特異的ナチュラルキラー（natural killer、ＮＫ）及びＴ細胞関連物、がんワクチン、並びに多くの他の免疫系療法の使用を通じて、様々な形態の抗腫瘍免疫応答を促進することによって、有意な生存利益が臨床において観察されている（Ｍｙｅｒｓ ａｎｄ Ｍｉｌｌｅｒ，（２０２０）．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５７１－０２０－０４２６－７、Ｗａｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，（２０２０），Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ，２０（１１）：６５１－６６８において概説されている）。

【0005】

制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、免疫恒常性及び自己寛容の状態を維持するために免疫系の過剰な活性化を防止する際に機能するＣＤ４＋Ｔリンパ球の動的サブセットである。

【0006】

３．概要
本発明者らは、過剰なＴｒｅｇ活性が抗腫瘍免疫応答を抑制し得ることを認識し、したがって、がんの治療のためにＴｒｅｇを標的化するための理論的根拠を提供する。臨床におけるＴｒｅｇ標的化療法で観察される最適以下の有効性の根底にある主な制限は、抗腫瘍免疫細胞集団の選択的標的化及び同時枯渇の欠如である。したがって、本発明は、抗腫瘍免疫を増強するために、他の免疫細胞集団を温存しながら、Ｔｒｅｇを選択的に枯渇させることができる治療法を開発するという、満たされていない医学的必要性を明らかにした。したがって、本発明の一態様では、本明細書で提供されるのは、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体である。

【0007】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0008】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。

【0009】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（complementarity determining region、ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む。

【0010】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0011】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0012】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0013】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0014】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0015】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、ヒト化されている。

【0016】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。

【0017】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0018】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、抗体は、カッパ軽鎖を含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、抗体は、ラムダ軽鎖を含む。

【0019】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0020】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0021】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインは、Ｆａｂ領域である。

【0022】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する。

【0023】

別の態様では、本明細書で提供される多重特異性抗体をコードする核酸が本明細書で提供される。また、本明細書で提供される多重特異性抗体をコードする核酸を含むベクターも提供される。また、本明細書で提供される多重特異性抗体をコードする核酸を含むベクターを含む宿主細胞も提供される。また、本明細書で提供される多重特異性抗体をコードする核酸を含むベクターと、そのためのパッケージと、を含む、キットも提供される。また、本明細書で提供される多重特異性抗体と、そのためのパッケージと、を含む、キットも提供される。

【0024】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、医薬組成物であって、多重特異性抗体と、医薬的に許容される担体と、を含み、多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、医薬組成物である。

【0025】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0026】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。

【0027】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0028】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0029】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0030】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0031】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0032】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0033】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、ヒト化されている。

【0034】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。

【0035】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0036】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、抗体は、カッパ軽鎖を含む。本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、抗体は、ラムダ軽鎖を含む。

【0037】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0038】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0039】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインは、Ｆａｂ領域である。

【0040】

本明細書で提供される医薬組成物のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する。

【0041】

更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、多重特異性抗体を作製するためのプロセスであって、多重特異性抗体をコードする１つ又は２つ以上の核酸を宿主細胞に導入することを含み、多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、プロセスである。

【0042】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する。

【0043】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。

【0044】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0045】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0046】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する。

【0047】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0048】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含むＶＨと、（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0049】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0050】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、ヒト化されている。

【0051】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。

【0052】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0053】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、抗体は、カッパ軽鎖を含む。本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、抗体は、ラムダ軽鎖を含む。

【0054】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0055】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0056】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインは、Ｆａｂ領域である。

【0057】

本明細書で提供される多重特異性抗体を作製するためのプロセスのいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する。

【0058】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇する方法であって、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９を発現する細胞を含む試料を提供することと、試料を多重特異性抗体と接触させることと、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現し、かつ多重特異性抗体と結合する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇することと、を含み、多重特異性抗体が、ＣＤ２５と結合することができる第１の結合ドメインと、ＣＤ３９と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む、方法である。

【0059】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、試料は、血液試料である。いくつかの実施形態では、試料は、組織試料である。

【0060】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体と接触させることを含む、方法である。

【0061】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体と接触させることを含む、方法である。

【0062】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、がんを有する対象においてがん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法である。

【0063】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象においてがんを治療する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法である。

【0064】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍がんである。いくつかの実施形態では、がんは、血液がんである。

【0065】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性に関与する。

【0066】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。

【0067】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0068】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0069】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0070】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0071】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0072】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0073】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ヒト化されており、かつ／又は第２の結合ドメインはヒト化されている。

【0074】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。

【0075】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0076】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、抗体は、カッパ軽鎖を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、抗体は、ラムダ軽鎖を含む。

【0077】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。

【0078】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。

【0079】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインは、Ｆａｂ領域である。

【0080】

本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する。

【0081】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、多重特異性分子であって、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第１の抗原と結合することができる第１の手段と、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合することができる第２の手段と、を含む、多重特異性分子である。

【0082】

本明細書で提供される分子のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0083】

本明細書で提供される分子のいくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。

【0084】

本明細書で提供される分子のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。

【0085】

本明細書で提供される分子のいくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0086】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、１つを超える標的分子と結合する分子を作製するためのプロセスであって、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第１の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第２の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、第１の抗原及び第２の抗原と結合することができる分子を提供する機能を実行する工程と、を含む、プロセスである。

【0087】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔｒｅｇ細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、又はそれを枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書で提供される分子と接触させることを含む、方法である。

【図面の簡単な説明】

【0088】

４．図面の簡単な説明

【図1】抗腫瘍免疫のＴｒｅｇ媒介抑制の重要な機構を示す。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰをＡＭＰに変換するＴｒｅｇ細胞上で発現されるエクトヌクレオチダーゼであり、ＣＤ７３によって免疫抑制性アデノシンに更に変換される。アデノシンは、エフェクターＴ細胞上に発現されるＡ２ＡＲと結合して、それらの抗腫瘍活性を抑制する。ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞上で構成的に発現される高親和性ヘテロ三量体ＩＬ－２受容体の成分である。ＩＬ－２シンクの形成は、Ｔｒｅｇ上のＩＬ－２ＲとのＩＬ－２結合を伴い、微小環境におけるＩＬ－２の結果として生じる欠如は、増殖及び生存についてこのサイトカインに依存するエフェクターＴ細胞を欠乏させる。

【図2】抗腫瘍免疫を増強するためにＴｒｅｇを枯渇させるためのＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体の設計を示す。ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体は、ＣＤ２５を標的とする単鎖可変断片（single-chain variable fragment、ｓｃＦｖ）及びＣＤ３９を標的とする抗原結合断片（antigen-binding fragment、Ｆａｂ）領域を有するヒトＩｇＧ１骨格上にフォーマット化された。ノブインホール（knob-in-hole、ＫＩＨ）技術を使用して、二重特異性抗体を操作した。ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体の結晶化可能断片（fragment crystallizable、Ｆｃ）領域に変異を導入して、抗体依存性細胞食作用（antibody-dependent cellular phagocytosis、ＡＤＣＰ）活性及び抗体依存性細胞傷害（antibody-dependent cellular cytotoxicity、ＡＤＣＣ）活性を含むＦｃエフェクター機能を増強し、Ｔｒｅｇの枯渇を増大させて抗腫瘍免疫応答を増強した。

【図3】ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体が抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイを介してＴｒｅｇを枯渇させることを示す。エフェクター細胞（ヒトＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１及びＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞）を、試験抗体の存在下、３７℃／５％ＣＯ_２で６時間、６：１のエフェクター対標的比で標的細胞（初代ヒトＴｒｅｇ細胞）と共培養した。標的細胞と結合した試験抗体のＦｃ領域と、ＡＤＣＰエフェクター細胞上に発現されたＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１との結合は、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ活性をもたらし、これをＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬の添加時に定量化した。１２０μｇ／ｍＬの開始抗体濃度及びその後の１．５倍連続希釈を用いて、１０点用量反応曲線を生成した。データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として報告される。誘導倍率（ＲＬＵ）＝ＲＬＵ（試料－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）。ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行った。

【図4】ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体が抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイを介してＴｒｅｇを枯渇させることを示す。エフェクター細胞（ヒトＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８及びＮＦＡＴ誘導性ルシフェラーゼを安定的に発現するＪｕｒｋａｔ細胞）を、試験抗体の存在下、３７℃／５％ＣＯ_２で６時間、６：１のエフェクター対標的比で標的細胞（初代ヒトＴｒｅｇ細胞）と共培養した。標的細胞と結合した試験抗体のＦｃ領域と、ＡＤＣＣエフェクター細胞上に発現されたＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８との結合は、ＮＦＡＴ媒介ルシフェラーゼ活性をもたらし、これをＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼ試薬の添加時に定量した。５０μｇ／ｍＬの開始抗体濃度及びその後の３倍連続希釈を用いて、１０点用量反応曲線を生成した。データは平均±ＳＥＭとして報告される。誘導倍率（ＲＬＵ）＝ＲＬＵ（試料－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）。ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行った。

【図5】ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体が補体カスケードの開始に関与するヒトＣ１ｑタンパク質と結合することを示す。高結合ＭＳＤプレートを試験抗体の段階希釈物（１２点用量反応曲線；２００μｇ／ｍＬ開始抗体濃度；２倍段階希釈）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。アッセイプレートを１×ＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液で洗浄し、続いてブロッキング溶液を室温で１時間振盪しながら添加した。更に洗浄した後、ＭＳＤ ＧＯＬＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ ＮＨＳ－エステルに結合した１０μｇ／ｍＬのヒト精製Ｃ１ｑタンパク質をアッセイプレートに添加し、室温で１時間振盪させた。アッセイプレートを洗浄し、続いて２×ＭＳＤ読み取り緩衝液を添加した後、ＭＳＤ Ｉｍａｇｅｒで読み取ってＲＬＵ値を取得した。データは平均±ＳＥＭとして報告される。ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行った。

【0089】

５．詳細な記述
Ｔｒｅｇは、免疫系の生理学的及び病理学的応答を調節するＣＤ４＋Ｔ細胞の免疫抑制性サブセットである。健康な適応免疫系は、炎症性Ｔ細胞集団と免疫抑制Ｔｒｅｇ集団との最適なバランスによって特徴付けられ、この微妙なバランスを乱すことは、疾患病理をもたらし得る。Ｔｒｅｇ機能の喪失は、自己免疫を誘導し得るが、過剰なＴｒｅｇ活性は、抗腫瘍免疫応答を弱め、腫瘍形成を促進し得る。

【0090】

本開示は、Ｔｒｅｇ上の複数の抗原と結合する新規分子、及びこれらの新規分子の高度な特性に部分的に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される分子は、Ｔｒｅｇ細胞上に存在する第１の抗原と結合することができる第１の手段と、Ｔｒｅｇ細胞上の第２の抗原と結合することができる第２の手段と、を含む。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞抗原上に存在する第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞抗原上に存在する第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。第７節に示すように、本発明の多重特異性分子は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導することができる。

【0091】

５．１定義
本明細書に記載又は参照されている技術及び手順には、当業者が概ねよく理解しているもの、及び／又は当業者が従来の手法を使用して通常採用しているもの、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，３ｄ ｅｄ．２００１）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２００３）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｆｒｏｍ Ｂｅｎｃｈ ｔｏ Ｃｌｉｎｉｃ（Ａｎ ｅｄ．２００９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ａｌｂｉｔａｒ，ｅｄ．２０１０）、及びＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌｓ １ ａｎｄ ２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）に記載されている広く利用されている手法などが含まれる。

【0092】

本明細書中で特に定義されていない限り、本明細書で使用されている技術用語及び科学用語は、当業者によって通常理解される意味を有する。この明細書を解釈するために、以下の用語の説明が適用され、必要に応じて、単数形で使用される用語は複数形も含まれ、その逆もまた同様である。記載された用語の任意の説明が、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合、以下に記載された用語の説明が優先するものとする。

【0093】

「抗体」、「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、本明細書で互換的に使用され、最も広い意味で使用され、具体的には、例えば、以下に記載されるように、モノクローナル抗体（アゴニスト、アンタゴニスト、中和抗体、全長又はインタクトモノクローナル抗体を含む）、ポリエピトープ又はモノエピトープ特異性を有する抗体組成物、ポリクローナル又は一価抗体、多価抗体、及び少なくとも２つのインタクト抗体から形成された多重特異性抗体（例えば、所望の生物学的活性を示す限りにおいて、二重特異性抗体）を包含する。抗体は、ヒト、ヒト化、キメラ、及び／又は親和性成熟されたものであり、並びに他の種、例えば、マウス及びウサギなどからの抗体であり得る。「抗体」という用語は、特定の分子抗原と結合することができ、２つの同一の対のポリペプチド鎖で構成される、ポリペプチドの免疫グロブリンクラス内のＢ細胞のポリペプチド産物を含むことを意図しており、各対は、１つの重鎖（約５０～７０ｋＤａ）及び１つの軽鎖（約２５ｋＤａ）を有し、各鎖の各アミノ末端部分は、約１００～約１３０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、各鎖の各カルボキシ末端部分は、定常領域を含む。例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ，ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９９５）、及びＫｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（３ｄ ｅｄ．１９９７）を参照されたい。具体的な実施形態では、特定の分子抗原は、ポリペプチド又はエピトープを含む、本明細書において提供される抗体によって結合され得る。また、抗体には、合成抗体、組換え産生抗体、ラクダ化抗体又はそれらのヒト化バリアント、細胞内抗体、及び抗イディオタイプの（抗Ｉｄ）抗体が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される「抗体」という用語はまた、Ｆｃ領域及び上記のうちのいずれかの機能的断片（例えば、抗原結合断片）を有する任意の結合分子を含み、機能的断片は、断片が由来する抗体の結合活性の一部又は全部を保持する抗体重鎖又は軽鎖ポリペプチドの一部を指す。機能的断片（例えば、抗原結合断片）の非限定的な例としては、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）（例えば、単一特異性、二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、Ｆ（ａｂ）_２断片、Ｆ（ａｂ’）_２断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｄｓＦｖ）、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、トライアボディ、テトラボディ、及びミニボディが挙げられる。特に、本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、抗原と結合する抗原結合部位（例えば、抗体の１つ又は２つ以上のＣＤＲ）を含む抗原結合ドメイン又は分子を含む。そのような抗体断片は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８９）、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｙｅｒｓ，ｅｄ．，１９９５）、Ｈｕｓｔｏｎ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ ２２：１８９－２２４、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，１９８９，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４９７－５１５；及びＤａｙ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（２ｄ ｅｄ．１９９０）に見出すことができる。本明細書において提供される抗体は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。抗体は、アゴニスト抗体又はアンタゴニスト抗体であり得る。

【0094】

「抗原」とは、抗体が選択的と結合することができる構造である。標的抗原は、ポリペプチド、炭水化物、核酸、脂質、ハプテン、又は他の天然に存在する化合物若しくは合成化合物であり得る。いくつかの実施形態では、標的抗原は、ポリペプチドである。特定の実施形態では、抗原は、細胞と関連し、例えば、細胞上又は細胞内に存在する。

【0095】

「インタクト」抗体とは、抗原結合部位、並びに定常ドメイン（constant domain、ＣＬ）並びに少なくとも重鎖定常領域ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含むものである。定常領域には、ヒト定常領域又はそのアミノ酸配列のバリアントが含まれ得る。特定の実施形態では、インタクト抗体は、１つ又は２つ以上のエフェクター機能を有する。

【0096】

「結合（binds）」又は「結合すること（binding）」という用語は、例えば、複合体を形成することを含む分子間の相互作用を指す。相互作用は、例えば、水素結合、イオン結合、疎水性相互作用、及び／又はファンデルワールス相互作用を含む非共有相互作用であり得る。複合体には、共有結合若しくは非共有結合、相互作用、又は力によって一緒に保持された２つ若しくはそれ以上の分子の結合も含まれる。抗体の単一の抗原結合部位と、抗原などの標的分子の単一のエピトープとの間の非共有相互作用全体の強さが、そのエピトープに対する抗体又は機能的断片の親和性である。一価の抗原に対する結合分子（例えば、抗体）の解離速度（ｋ_ｏｆｆ）と会合速度（ｋ_ｏｎ）との比（ｋ_ｏｆｆ／ｋ_ｏｎ）は、解離定数Ｋ_Ｄであり、親和性とは逆の関係にある。Ｋ_Ｄ値が低いほど、抗体の親和性は高くなる。Ｋ_Ｄの値は、抗体及び抗原の異なる複合体によって様々であり、ｋ_ｏｎ及びｋ_ｏｆｆの両方に依存する。本明細書において提供される抗体の解離定数Ｋ_Ｄは、本明細書で提供されている任意の方法、又は当業者に周知である任意の他の方法を使用して決定することができる。１つの結合部位での親和性は、必ずしも抗体と抗原との間の相互作用の真の強さを反映するものではない。多価抗原などの複数の繰り返し抗原決定基を含む複雑な抗原が、複数の結合部位を含む抗体と接触した場合、ある部位での抗体の抗原との相互作用は、第２部位での反応の確率を増加させるであろう。そのような多価抗体と抗原との間の複数の相互作用の強さは、親和力と呼ばれる。

【0097】

本明細書に記載されている抗体に関連して、「と結合する」、「と特異的に結合する」などの用語、及び類似の用語も本明細書では互換的に使用され、ポリペプチドなどの抗原と特異的に結合する抗原結合ドメインの抗体を指す。抗原と結合するか、又は抗原と特異的に結合する抗体又は抗原結合ドメインは、関連する抗原と交差反応し得る。特定の実施形態では、抗原と結合するか、又は抗原と特異的に結合する抗体又は抗原結合ドメインは、他の抗原と交差反応しない。抗原と結合するか、又は抗原と特異的に結合する抗体又は抗原結合ドメインは、例えば、イムノアッセイ、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）、又は当業者に知られている他の技術によって同定することができる。いくつかの実施形態では、抗体又は抗原結合ドメインは、ラジオイムノアッセイ（radioimmunoassay、ＲＩＡ）及び酵素結合免疫吸着アッセイ（enzyme linked immunosorbent assay、ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を使用して決定される任意の交差反応性抗原よりも高い親和性で抗原と結合する場合、抗原と結合するか、又は抗原と特異的に結合する。典型的には、特異的又は選択的な反応は、バックグラウンドのシグナル又はノイズの少なくとも２倍であり、バックグラウンドの１０倍を超える場合がある。結合特異性に関する考察については、例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ３３２－３６（Ｐａｕｌ，ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．１９８９）を参照されたい。特定の実施形態では、「非標的」タンパク質に対する抗体又は抗原結合ドメインの結合の程度は、例えば、蛍光活性化細胞選別（fluorescence activated cell sorting、ＦＡＣＳ）分析又はＲＩＡによって決定される、その特定の標的抗原に対する抗体又は抗原結合ドメインの結合の約１０％未満である。「特異的結合」、「と特異的に結合する」、又は「と特異的な」などの用語に関しては、結合は、非特異的な相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、概ね結合活性を有していない類似構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似した対照分子、例えば、過剰な非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、標識標的のプローブとの結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合、特異的結合が示される。抗原と結合する抗体又は抗原結合ドメインには、その抗体が、例えば、抗原を標的とした診断又は治療剤として有用であるように、十分な親和性で抗原と結合することが可能なものが含まれる。特定の実施形態では、抗原と結合する抗体又は抗原結合ドメインは、１０００ｎＭ、８００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、１０ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、又は０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋ_Ｄ）を有する。特定の実施形態では、抗体又は抗原結合ドメインは、異なる種に由来する抗原間（例えば、ヒトとカニクイザル種との間）で保存されている抗原のエピトープと結合する。

【0098】

「結合親和性」とは、概して、分子の単一の結合部位（例えば、抗体などの結合タンパク質）と、その結合パートナー（例えば、抗原）との間の非共有相互作用の総和の強さを指す。別段の記載がない限り、本明細書で使用されるとき、「結合親和性」とは、結合対（例えば、抗体及び抗原）のメンバー間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。結合分子Ｘのその結合パートナーＹに対する親和性は、概ね解離定数（Ｋ_Ｄ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当該技術分野において既知である一般的な方法で測定することができる。低親和性抗体は、概ね抗原とゆっくり結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性抗体は、概ね抗原とより速く結合し、より長く結合を維持する傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当該技術分野において既知であり、そのいずれもが本開示の目的のために使用することができる。具体的な例示的実施形態としては、以下のものが挙げられる。一実施形態では、「Ｋ_Ｄ」又は「Ｋ_Ｄ値」は、当該技術分野において既知であるアッセイによって、例えば、結合アッセイによって測定することができる。Ｋ_Ｄは、例えば、目的の抗体のＦａｂバージョン及びその抗原を用いて行われるＲＩＡで測定され得る（Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，１９９９，２９３：８６５－８１）。また、Ｋ_Ｄ又はＫ_Ｄ値は、バイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry、ＢＬＩ）、又は、例えばＯｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）によって、又は、例えばＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００若しくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）による表面プラズモン共鳴（surface plasmon resonance、ＳＰＲ）アッセイを使用することによって、測定することができる。また、「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋ_ｏｎ」は、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）２０００、若しくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）３０００システムを使用して、上述した同じバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術で決定することができる。

【0099】

特定の実施形態では、抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、又は特定の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である一方、鎖の残りの部分が、別の種に由来するか、又は別の抗体クラス若しくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一又は相同である、「キメラ」配列を含むことができるが、それらが所望の生物活性を示す場合に限る（米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８４，８１：６８５１－５５を参照されたい）。

【0100】

特定の実施形態では、抗体は、ネイティブＣＤＲ残基が、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、ウサギ、又は非ヒト霊長類などの非ヒト種（例えば、ドナー抗体）の対応するＣＤＲからの残基に置き換えられている、ヒト免疫グロブリン（例えば、レシピエント抗体）を含むキメラ抗体である、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態の「ヒト化」形態の部分を含み得る。場合によっては、ヒト免疫グロブリンの１つ又は２つ以上のＦＲ領域残基が、対応する非ヒト残基に置き換えられる。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体又はドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体の性能を更に改良するために行われる。ヒト化抗体の重鎖又は軽鎖は、少なくとも１つ又は２つ以上の可変領域の実質的に全てを含むことができ、その場合、ＣＤＲの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部分を含む。更なる詳細については、Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６，３２１：５２２－２５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３－２９、Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１９９２，２：５９３－９６、Ｃａｒｔｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９２，８９：４２８５－８９；米国特許第６，８００，７３８号；同第６，７１９，９７１号；同第６，６３９，０５５号；同第６，４０７，２１３号；及び同第６，０５４，２９７号を参照されたい。

【0101】

特定の実施形態では、抗体は、「完全ヒト抗体」又は「ヒト抗体」の一部を含むことができ、これらの用語は、本明細書で互換的に使用され、ヒト可変領域、及び、例えば、ヒト定常領域を含む、抗体を指す。具体的な実施形態では、これらの用語は、ヒト起源の可変領域及び定常領域を含む抗体を指す。「完全ヒト」抗体は、特定の実施形態では、ポリペプチドと結合し、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン核酸配列の天然に存在する体細胞バリアントである核酸配列によってコードされる、抗体も包含することができる。「完全ヒト抗体」という用語には、Ｋａｂａｔらにより記載されたようにヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に対応する可変領域及び定常領域を有する抗体が含まれる（Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）。「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを使用して作製されたものである。このヒト抗体の定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を除外している。ヒト抗体は、当該技術分野で知られている様々な技術を使用して産生することができ、その中には、ファージディスプレイライブラリ（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２７：３８１；Ｍａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１）及び酵母ディスプレイライブラリ（Ｃｈａｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２００６，１：７５５－６８）が含まれる。また、ヒトモノクローナル抗体の調製には、Ｃｏｌｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ７７（１９８５）、Ｂｏｅｒｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１，１４７（１）：８６－９５、及びｖａｎ Ｄｉｊｋ ａｎｄ ｖａｎ ｄｅ Ｗｉｎｋｅｌ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，２００１，５：３６８－７４に記載されている方法も利用可能である。ヒト抗体は、抗原チャレンジに応答してそのような抗体を産生するように修飾されているが、その内因性遺伝子座が無効化されているトランスジェニック動物、例えば、マウスに抗原を投与することによって調製することができる（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９５，６（５）：５６１－６６、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｎｇ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９７，８（４）：４５５－５８；、並びに、ＸＥＮＯマウス（商標）技術に関する米国特許第６，０７５，１８１号及び同第６，１５０，５８４号を参照されたい）。また、例えばＬｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，２００６，１０３：３５５７－６２（ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術を介して生成されたヒト抗体に関する）も参照されたい。

【0102】

特定の実施形態では、抗体は、「組換えヒト抗体」の部分を含むことができ、この語句には、組換え手段によって調製、発現、作成、若しくは単離されたヒト抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトされた組換え発現ベクターを使用して発現された抗体、組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリから単離された抗体、ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック及び／又はトランス染色体である動物（例えば、マウス又はウシ）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１９９２ ２０：６２８７－６２９５）、又は、ヒト免疫グロブリン遺伝子配列を他のＤＮＡ配列にスプライシングすることを伴う任意の他の手段によって調製、発現、作成、若しくは単離された抗体が含まれる。そのような組換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域及び定常領域を有することができる（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．９１－３２４２を参照されたい）。しかしながら、特定の実施形態では、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又は、ヒトＩｇ配列のトランスジェニックである動物を使用する場合は、インビボ体細胞変異誘発）を受けており、したがって、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系列のＶＨ配列及びＶＬ配列に由来し、関連しているが、インビボでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリ内に天然には存在しない場合がある配列である。

【0103】

特定の実施形態では、抗体は、「モノクローナル抗体」の一部を含むことができ、本明細書で使用されるこの用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、集団を含む個々の抗体は、微量で存在し得る天然に存在する起こり得る変異を除いて同一であり、各モノクローナル抗体は、典型的には、抗原上の単一のエピトープを認識する。具体的な実施形態では、本明細書で使用される「モノクローナル抗体」とは、単一のハイブリドーマ又は他の細胞によって産生される抗体である。「モノクローナル」という用語は、抗体を作製するための特定の方法に限定されるものではない。例えば、本開示で有用なモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって調製され得るか、又は細菌若しくは真核動物若しくは植物細胞で組換えＤＮＡ法を使用して作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）。また、「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９１，３５２：６２４－２８、及びＭａｒｋｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１，２２２：５８１－９７に記載されている技術を使用して、ファージ抗体ライブラリから単離され得る。クローン細胞株及びそれによって発現するモノクローナル抗体を調製するための他の方法は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００２）を参照されたい。

【0104】

典型的な４鎖抗体ユニットは、２本の同一の軽鎖（Ｌ）及び２本の同一の重鎖（Ｈ）で構成されるヘテロ四量体糖タンパク質である。ＩｇＧの場合、４鎖ユニットは、概ね約１５０，０００ダルトンである。各Ｌ鎖は、１つの共有ジスルフィド結合でＨ鎖によって連結され、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖のアイソタイプに応じて１つ又は２つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。また、各Ｈ鎖及びＬ鎖は、規則的間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各Ｈ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（variable domain、ＶＨ）に続いて、α鎖及びγ鎖の各々に３つの定常ドメイン（constant domain、ＣＨ）並びに、μ及びεのアイソタイプには４つのＣＨドメインを有する。各Ｌ鎖は、Ｎ末端に可変ドメイン（variable domain、ＶＬ）に続いて、もう一方の末端に定常ドメイン（ＣＬ）を有する。ＶＬは、ＶＨとアラインメントし、ＣＬは、重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）とアラインメントしている。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間の界面を形成すると考えられる。ＶＨ及びＶＬの対合は、単一の抗原結合部位をともに形成する。異なるクラスの抗体の構造及び特性については、例えば、Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ７１（Ｓｔｉｔｅｓ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，８ｔｈ ｅｄ．１９９４）；ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊａｎｅｗａｙ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，５ｔｈ ｅｄ．２００１）を参照されたい。

【0105】

「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」という用語は、抗原と結合する抗体領域を指す。従来のＩｇＧは通常、２つのＦａｂ領域を含み、各々がＹ字型ＩｇＧ構造の２つのアームのうちの１つに存在する。各Ｆａｂ領域は、典型的には、重鎖及び軽鎖の各々の１つの可変領域及び１つの定常領域で構成されている。より具体的には、Ｆａｂ領域における重鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＨ及びＣＨ１領域であり、Ｆａｂ領域における軽鎖の可変領域及び定常領域は、ＶＬ及びＣＬ領域である。Ｆａｂ領域におけるＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ、及びＣＬは、本開示に従って抗原結合能力を付与するために様々な方式で配置することができる。例えば、ＶＨ領域及びＣＨ１領域は、１つのポリペプチド上にあり、ＶＬ領域及びＣＬ領域は、従来のＩｇＧのＦａｂ領域と同様に、別個のポリペプチド上にあり得る。あるいは、ＶＨ領域、ＣＨ１領域、ＶＬ領域、ＣＬ領域の全てが同じポリペプチド上に存在し、以下の節でより詳細に説明するように、異なる順序で配向することも可能である。

【0106】

「可変領域」、「可変ドメイン」、「Ｖ領域」、又は「Ｖドメイン」という用語は、軽鎖又は重鎖のアミノ末端に概ね位置し、重鎖では約１２０～１３０アミノ酸、軽鎖では約１００～１１０アミノ酸の長さを有する抗体の軽鎖又は重鎖の一部を指し、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合及び特異性に使用される。重鎖の可変領域は、「ＶＨ」と称され得る。軽鎖の可変領域は、「ＶＬ」と称され得る。「可変」という用語は、可変領域の特定のセグメントが、抗体間で配列が大きく異なることを指す。Ｖ領域は、抗原の結合を媒介し、特定の抗原に対する特定の抗体の特異性を決定する。しかしながら、可変領域の１１０アミノ酸のスパン全体では、その可変性は均一ではない。代わりに、Ｖ領域は、各々が約９～１２アミノ酸の長さである「超可変領域」と呼ばれるより大きな可変性（例えば、極端な可変性）のより短い領域によって分離された、約１５～３０アミノ酸のフレームワーク領域（framework region、ＦＲ）と呼ばれるより可変性の低い（例えば、比較的不変の）ストレッチからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は各々４つのＦＲを含み、大部分はβシート構造をとり、３つの超可変領域によって接続され、βシート構造を接続するループを形成し、場合によってはβシート構造の一部を形成する。各鎖内の超可変領域は、ＦＲによってともに近接して保持され、他の鎖の超可変領域とともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（５ｔｈ ｅｄ．１９９１）を参照されたい）。定常領域は、抗体を抗原と結合することには直接関与しないが、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞傷害（complement dependent cytotoxicity、ＣＤＣ）への抗体の関与など、様々なエフェクター機能を示す。可変領域は、異なる抗体間で配列が大きく異なる。具体的な実施形態では、可変領域は、ヒト可変領域である。

【0107】

「Ｋａｂａｔによる可変領域残基番号付け」又は「Ｋａｂａｔにあるようなアミノ酸位置番号付け」という用語、及びその変形は、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．、上記の抗体の編集物の重鎖可変領域又は軽鎖可変領域に使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用して、実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はこれらへの挿入に対応する、より少ない又は追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、残基５２の後に単一のアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）と、残基８２の後に３つの挿入された残基（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）とを含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、所与の抗体に対して、その抗体の配列と「標準」Ｋａｂａｔ番号付け配列とを相同領域でアライメントすることにより、決定することができる。Ｋａｂａｔ番号付けシステムは、可変ドメインの残基（軽鎖の約１～１０７残基、重鎖の約１～１１３残基）を参照する際に概ね使用される（例えば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，上記）。「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」は、免疫グロブリン重鎖定常領域内の残基に言及する際に概ね使用される（例えば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，上記で報告されているＥＵインデックス）。「ＫａｂａｔにあるようなＥＵインデックス」は、ヒトＩｇＧ１ ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。他の番号付けシステムは、例えば、ＡｂＭ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、及びＡＨｏｎによって記載されている。

【0108】

抗体に関して使用される場合の「重鎖」という用語は、約５０～７０ｋＤａのポリペプチド鎖であって、アミノ末端部分が約１２０～１３０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含むものを指す。定常領域は、重鎖定常領域のアミノ酸配列に基づいて、アルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）、及びミュー（μ）と称される５つの明確に異なるタイプ（例えば、アイソタイプ）のうちの１つであり得る。明確に異なる重鎖の大きさは異なり、α、δ、及びγは約４５０個のアミノ酸を含み、μ及びεは約５５０個のアミノ酸を含む。軽鎖と組み合わせられると、これらの明確に異なるタイプの重鎖は、それぞれ５つの周知のクラス（アイソタイプなど）の抗体、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ（ＩｇＧの４つのサブクラス、すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４も含まれる）を生じさせる。

【0109】

抗体に関して使用される場合の「軽鎖」という用語は、約２５ｋＤａのポリペプチド鎖であって、アミノ末端部分が約１００～約１１０個以上のアミノ酸の可変領域を含み、カルボキシ末端部分が定常領域を含むものを指す。軽鎖のおおよその長さは、２１１～２１７アミノ酸である。定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）又はラムダ（λ）と称される２つの異なるタイプがある。

【0110】

本明細書で使用される場合、「超可変領域」、「hypervariable region、ＨＶＲ」、「相補性決定領域」、及び「Complementarity Determining Region、ＣＤＲ」という用語は、互換的に使用される。「ＣＤＲ」は、免疫グロブリン（Ｉｇ又は抗体）ＶＨ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域のうちの１つ（Ｈ１、Ｈ２、若しくはＨ３）、又は抗体ＶＬ β－シートフレームワークの非フレームワーク領域内の３つの超可変領域のうちの１つ（Ｌ１、Ｌ２、若しくはＬ３）を指す。したがって、ＣＤＲは、フレームワーク領域配列内に散在する可変領域配列である。

【0111】

ＣＤＲ領域は、当業者に周知であり、周知の番号付けシステムによって定義されている。例えば、Ｋａｂａｔ相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列の可変性に基づいており、最も一般的に使用されている（例えば、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，上記を参照されたい）。Ｃｈｏｔｈｉａは、それに代えて、構造ループの位置を指す（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１－１７を参照されたい）。Ｋａｂａｔ付番規則を使用して付番されたときのＣｈｏｔｈｉａ ＣＤＲ－Ｈ１ループの末端は、ループの長さに応じてＨ３２からＨ３４まで変化する（これは、Ｋａｂａｔ付番スキームが、Ｈ３５Ａ及びＨ３５Ｂに挿入を配置するためであり、３５Ａも３５Ｂも存在しない場合、ループは３２で終わり、３５Ａのみが存在する場合、ループは３３で終わり、３５Ａ及び３５Ｂの両方が存在する場合、ループは３４で終わる）。ＡｂＭ超可変領域は、Ｋａｂａｔ ＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａ構造ループとの間の妥協案を表し、Ｏｘｆｏｒｄ ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって使用されている（例えばＡｎｔｉｂｏｄｙ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｖｏｌ．２（Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ ａｎｄ Ｄｕｂｅｌ，ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．２０１０）を参照されたい）。「ｃｏｎｔａｃｔ」超可変領域は、利用可能な複合結晶構造の分析に基づく。開発され、広く採用されている別の世界共通の番号付けシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）である（Ｌａｆｒａｎｃ，ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｖ．Ｃｏｍｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３，２７（１）：５５－７７）。ＩＭＧＴは、免疫グロブリン（immunoglobulin、ＩＧ）、Ｔ細胞受容体（T cell receptor、ＴＣＲ）、並びにヒト及び他の脊椎動物の主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＣ）専門の統合情報システムである。本明細書において、ＣＤＲは、アミノ酸配列と、軽鎖又は重鎖内の位置との両方の観点において言及される。免疫グロブリン可変ドメインの構造内のＣＤＲの「位置」は、種の間で保存され、ループと称される構造に存在するため、可変ドメイン配列を構造的特徴に従ってアラインメントする番号付けシステムを使用することにより、ＣＤＲ及びフレームワーク残基は容易に同定される。この情報は、１つの種の免疫グロブリンからのＣＤＲ残基を、典型的にはヒト抗体からのアクセプタフレームワーク内に移植及び置き換えることに使用され得る。Ｈｏｎｅｇｇｅｒ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２００１，３０９：６５７－７０によって、追加の番号付けシステム（ＡＨｏｎ）が開発されている。例えば、Ｋａｂａｔ番号付け及びＩＭＧＴ固有の番号付けシステムを含む番号付けシステム間の対応関係は、当業者に周知である（例えば、Ｋａｂａｔ、上記；Ｃｈｏｔｈｉａ及びＬｅｓｋ、上記；Ｍａｒｔｉｎ、上記；Ｌｅｆｒａｎｃ，ｅｔ ａｌ．、上記、を参照されたい）。これらの超可変領域又はＣＤＲの各々の残基を以下に示す。

【0112】

【表1】

【0113】

所与のＣＤＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて異なり得る。したがって、特に明記しない限り、可変領域などの所与の抗体又はその領域の「ＣＤＲ」及び「相補性決定領域」という用語、並びに抗体又はその領域の個々のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２」）は、本明細書で上述した既知のスキームのうちのいずれかによって定義される相補性決定領域を包含すると理解されるべきである。場合によっては、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、又はＣｏｎｔａｃｔ法で定義されたＣＤＲなど、特定のＣＤＲ又は複数のＣＤＲの同定のためのスキームが指定されている。他の場合には、ＣＤＲの特定のアミノ酸配列が挙げられる。

【0114】

超可変領域は、次のような「拡張超可変領域」を含み得る：ＶＬ内の２４～３６又は２４～３４（Ｌ１）、４６～５６又は５０～５６（Ｌ２）、及び８９～９７又は８９～９６（Ｌ３）、並びにＶＨ内の２６～３５又は２６～３５Ａ（Ｈ１）、５０～６５又は４９～６５（Ｈ２）、及び９３～１０２、９４～１０２、又は９５～１０２（Ｈ３）。

【0115】

「定常領域」又は「定常ドメイン」という用語は、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、Ｆｃ受容体との相互作用などの様々なエフェクター機能を示す軽鎖及び重鎖のカルボキシ末端部分を指す。この用語は、抗原結合部位を含む可変領域である免疫グロブリンの他の部分と比較してより保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常領域は、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３領域、並びに軽鎖のＣＬ領域を含み得る。

【0116】

「フレームワーク」又は「ＦＲ」という用語は、ＣＤＲに隣接する可変領域の残基を指す。ＦＲ残基は、例えば、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、ドメイン抗体、ダイアボディ、直鎖抗体、及び二重特異性抗体中に存在する。ＦＲ残基は、超可変領域残基又はＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。典型的には、ＶＨ領域及びＶＬ領域の各々に４つのＦＲ領域がある。ＶＨにおけるＦＲ領域は、ＶＨ ＦＲ１、ＶＨ ＦＲ２、ＶＨ ＦＲ３、及びＶＨ ＦＲ４（又はＦＲ Ｈ１、ＦＲ Ｈ２、ＦＲ Ｈ３及びＦＲ Ｈ４）である。ＶＬにおけるＦＲ領域は、ＶＬ ＦＲ１、ＶＬ ＦＲ２、ＶＬ ＦＲ３及びＶＬ ＦＲ４（又はＦＲ Ｌ１、ＦＲ Ｌ２、ＦＲ Ｌ３及びＦＲ Ｌ４）である。

【0117】

本明細書において、「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、天然配列Ｆｃ領域、組換えＦｃ領域、及びバリアントＦｃ領域を含む、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は様々であり得るが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、Ｃｙｓ２２６位のアミノ酸残基、又はＰｒｏ２３０位のアミノ酸残基からカルボキシル末端まで伸びると定義されることが多い。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵの番号付けシステムによる残基４４７）は、例えば、抗体の産生若しくは精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組換え操作することによって除去され得る。したがって、インタクト抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基のある抗体とない抗体との混合物を有する抗体集団を含み得る。「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の「エフェクター機能」を有する。例示的な「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、ＣＤＣ、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、貪食作用、細胞表面の受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーションなどが含まれる。そのようなエフェクター機能は、概ね、Ｆｃ領域が結合領域又は結合ドメイン（例えば、抗体可変領域又はドメイン）と組み合わせられることを必要とし、当業者に知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。「バリアントＦｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾（例えば、置換、付加、又は欠失）により、天然配列Ｆｃ領域のアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、バリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換を有しており、例えば、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において、約１～約１０個のアミノ酸置換、又は約１～約５個のアミノ酸置換を有する。本明細書のバリアントＦｃ領域は、天然配列Ｆｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％の相同性、又はそれと少なくとも約９０％の相同性、例えば、それと少なくとも約９５％の相同性を有し得る。

【0118】

抗原又は抗体に関して使用される場合、「バリアント」という用語は、天然又は未修飾の配列と比較して、１つ又は２つ以上（例えば、約１～約２５、約１～約２０、約１～約１５、約１～約１０、又は約１～約５）のアミノ酸配列置換、欠失、及び／又は付加を含むペプチド又はポリペプチドを指し得る。

【0119】

「同一性」という用語は、配列をアラインメント及び比較することによって決定される、２つ若しくはそれ以上のポリペプチド分子又は２つ若しくはそれ以上の核酸分子の配列間の関係を指す。参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列同一性パーセント（％）」は、最大配列同一性パーセントを達成するように、配列同一性の一部としていずれの保存的置換も考慮することなく、配列をアラインメントし、必要に応じてギャップを導入した後の、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性パーセントを決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野における技能の範囲内である様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮ、又はＭＥＧＡＬＩＧＮ（ＤＮＡＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。

【0120】

アミノ酸残基／位置の「修飾」とは、出発アミノ酸配列と比較した一次アミノ酸配列の変化を指し、変化は、当該アミノ酸残基／位置を伴う配列変化から生じる。例えば、典型的な修飾には、残基の別のアミノ酸による置換（例えば、保存的置換又は非保存的置換）、当該残基／位置に隣接する１つ又は２つ以上（例えば、一般的には５個、４個、又は３個未満）のアミノ酸の挿入、及び／又は当該残基／位置欠失が含まれる。

【0121】

本明細書中で使用される場合、「エピトープ」とは、当該技術分野の用語であり、抗体が特異的に結合することができる抗原の局在領域を指す。エピトープは、線状エピトープ又は立体構造エピトープ、非線状エピトープ、又は不連続エピトープであり得る。ポリペプチド抗原の場合、例えば、エピトープは、ポリペプチドの連続したアミノ酸（「線状」エピトープ）であり得るか、又はエピトープは、ポリペプチドの２つ若しくはそれ以上の非連続領域からのアミノ酸（「立体構造」、「非線状」、又は「不連続」エピトープ）を含み得る。概ね、線状エピトープは、二次、三次、又は四次構造に依存する場合もあれば、依存しない場合もあることが当業者によって理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、抗体は、アミノ酸が天然の三次元タンパク質構造に折り畳まれているかどうかにかかわらず、アミノ酸の群と結合する。他の実施形態では、抗体は、エピトープを認識して結合するために、エピトープを構成するアミノ酸残基が特定の立体構造（例えば、屈曲、ねじれ、回転、又はフォールディング）を示すことを必要とする。

【0122】

「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖又は分岐鎖であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により中断されてもよい。この用語はまた、天然に修飾されているか、又は介入によって修飾されているアミノ酸ポリマー、介入の例としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又は任意の他の操作若しくは修飾がある。また、定義には、例えば、非天然アミノ酸を含むがこれらに限定されない、アミノ酸の１つ又は２つ以上の類似体を含むポリペプチド、並びに当該技術分野で知られている他の修飾も含まれる。本開示のポリペプチドは、抗体又は免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーに基づき得るため、特定の実施形態では、「ポリペプチド」は、一本鎖として、又は２つ若しくはそれ以上の関連鎖として生じ得ることが理解される。

【0123】

「ベクター」という用語は、核酸配列を宿主細胞に導入するために、例えば、本明細書に記載されている抗体をコードする核酸配列などの核酸配列を運ぶ又は含むために使用される物質を指す。使用に適用可能なベクターには、例えば、発現ベクター、プラスミド、ファージベクター、ウイルスベクター、エピソーム、及び人工染色体が含まれ、これらは、宿主細胞の染色体に安定的に組み込むことができる選択配列又はマーカーを含み得る。加えて、ベクターは、１つ又は２つ以上の選択可能マーカー遺伝子及び適切な発現制御配列を含み得る。含めることができる選択マーカー遺伝子は、例えば、抗生物質又は毒素への耐性を提供し、補助栄養要求性の欠乏を補完し、又は培養液にない重要な栄養素を供給するものである。発現制御配列は、当該技術分野で周知である構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー、転写ターミネーターなどを含み得る。２つ又はそれ以上の核酸分子を共発現させる場合（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又は抗体ＶＨ及びＶＬ）、両方の核酸分子は、例えば、単一の発現ベクター又は別個の発現ベクターに挿入され得る。単一ベクターでの発現の場合、コード核酸は、１つの共通の発現制御配列に動作可能に連結されるか、又は１つの誘導性プロモーター及び１つの構成的プロモーターなどの異なる発現制御配列に連結され得る。宿主細胞への核酸分子の導入は、当該技術分野で周知である方法を使用して確認することができる。そのような方法としては、例えば、ノーザンブロット又はポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction、ＰＣＲ）によるｍＲＮＡの増幅などの核酸分析、遺伝子産物の発現のための免疫ブロッティング、又は導入した核酸配列若しくはその対応する遺伝子産物の発現を試験するための好適な分析方法が挙げられる。当業者は、核酸分子が所望の産物を産生するのに十分な量で発現されることを理解しており、更に、当業者に周知である方法を使用して十分な発現を得るために発現レベルを最適化することができることを理解している。

【0124】

本明細書で使用する「宿主」という用語は、哺乳動物（例えば、ヒト）などの動物を指す。

【0125】

本明細書で使用される「宿主細胞」という用語は、核酸分子をトランスフェクションされ得る特定の対象細胞、及びそのような細胞の子孫又は潜在的な子孫を指す。そのような細胞の子孫は、核酸分子で遺伝子導入された親細胞とは、宿主細胞ゲノムへの核酸分子の後続の生成又は集積において生じ得る、変異又は環境からの影響により、同一ではないことがある。

【0126】

「単離核酸」とは、核酸、例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又は混合核酸であり、他のゲノムＤＮＡ配列、並びに天然配列に天然に会合するリボソーム及びポリメラーゼなどのタンパク質又は複合体から実質的に分離されたものである。「単離」核酸分子とは、核酸分子の天然の供給源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。更に、ｃＤＮＡ分子などの「単離」核酸分子は、組換え技術によって製造された場合には、他の細胞材料又は培養液を実質的に含まなくてもよく、化学合成された場合には、化学前駆体又は他の化学物質を実質的に含まなくてもよい。具体的な実施形態では、本明細書に記載の抗体をコードする１つ又は２つ以上の核酸分子が単離又は精製される。この用語は、天然に存在する環境から取り出された核酸配列を包含し、組換え又はクローン化されたＤＮＡ単離物、及び化学的に合成された類似体、又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。実質的に純粋な分子には、その分子の単離形態が含まれることがある。

【0127】

「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」又は「核酸」は、本明細書で互換的に使用される場合、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体、又はＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼによって、又は合成反応によってポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びその類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、長さが約２００ヌクレオチド未満であるが、概して必ずしも必須ではなく、短く、概ね一本鎖の合成ポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、相互に排他的なものではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドにも同様に完全に適用できる。本開示の抗体を産生する細胞には、親ハイブリドーマ細胞、並びに抗体をコードする核酸が導入された細菌及び真核宿主細胞が挙げられ得る。特に指定のない限り、本明細書で開示されている任意の一本鎖ポリヌクレオチド配列の左端は、５’末端である。二本鎖ポリヌクレオチド配列の左方向は、５’方向と称される。新生ＲＮＡ転写物の５’から３’への付加の方向は、転写方向と称される。ＲＮＡ転写物の５’から５’末端にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「上流配列」と称され、ＲＮＡ転写物の３’から３’末端にあるＲＮＡ転写物と同じ配列を有するＤＮＡ鎖上の配列領域は、「下流配列」と称される。

【0128】

本明細書で使用するとき、「多重特異性抗体」という用語は、複数の免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む抗体を指し、複数のうちの第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第１のエピトープに対する結合特異性を有し、複数のうちの第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列は、第２のエピトープに対する結合特異性を有する。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、重複しないか、又は実質的に重複しない。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。ある実施形態では、多重特異性抗体は、第３、第４、又は第５の免疫グロブリン可変ドメインを含む。ある実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体分子、三重特異性抗体分子、又は四重特異性抗体分子である。

【0129】

本明細書で使用するとき、「二重特異性抗体」という用語は、２つ以下のエピトープ又は２つの抗原と結合する多重特異性抗体を指す。二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する第１の免疫グロブリン可変ドメイン配列、及び第２のエピトープに対する結合特異性を有する第２の免疫グロブリン可変ドメイン配列によって特徴付けられる。ある実施形態では、第１及び第２のエピトープは、異なる抗原上、例えば、異なるタンパク質（又は多量体タンパク質の異なるサブユニット）上にある。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する重鎖可変ドメイン配列及び軽鎖可変ドメイン配列と、を含む。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有する半抗体又はその断片と、を含む。実施形態では、二重特異性抗体は、第１のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はその断片と、第２のエピトープに対する結合特異性を有するｓｃＦｖ又はその断片と、を含む。

【0130】

本明細書で使用される「医薬的に許容される」という用語は、動物における使用について、より具体的にはヒトにおける使用について、連邦政府又は州政府の規制機関によって承認されているか、又は米国薬局方、欧州薬局方、若しくは他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを意味する。

【0131】

「賦形剤」とは、液体又は固体の充填剤、希釈剤、溶媒、カプセル化材料などの、医薬的に許容される材料、組成物、又はビヒクルを指す。賦形剤としては、例えば、吸収促進剤、抗酸化剤、結合剤、緩衝剤、担体、コーティング剤、着色剤、希釈剤、崩壊剤、乳化剤、拡張剤、充填剤、香味剤、湿潤剤、潤滑剤、香料、防腐剤、推進剤、放出剤、殺菌剤、甘味料、可溶化剤、湿潤剤及びこれらの混合物などのカプセル化材料又は添加剤が挙げられる。また、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全）又はビヒクルを指すことができる。

【0132】

いくつかの実施形態では、賦形剤は、医薬的に許容される賦形剤である。医薬的に許容される賦形剤の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及びその他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（例えば、約１０アミノ酸残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含むその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；並びに／又はＴＷＥＥＮ（商標）、ポリエチレングリコール（polyethylene glycol、ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。医薬的に許容される賦形剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．１９９０）に記載されている。

【0133】

一実施形態では、各成分は、医薬製剤の他の成分と適合性があるという意味で「医薬的に許容される」ものであり、過度の毒性、刺激性、アレルギー反応、免疫原性、又はその他の問題又は合併症がなく、妥当な利点／リスク比に見合って、ヒト及び動物の組織又は器官と接触して使用するために好適である。例えば、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，６ｔｈ ｅｄ．；Ｒｏｗｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．；Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：２００９、Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ａｄｄｉｔｉｖｅｓ，３ｒｄ ｅｄ．；Ａｓｈ ａｎｄ Ａｓｈ Ｅｄｓ．；Ｇｏｗｅｒ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ：２００７、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，２ｎｄ ｅｄ．；Ｇｉｂｓｏｎ Ｅｄ．；ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ ＬＬＣ：Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００９を参照されたい。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される賦形剤は、採用される用量及び濃度で、それにさらされる細胞又は哺乳動物に対して非毒性である。いくつかの実施形態では、医薬的に許容される賦形剤は、ｐＨ緩衝水溶液である。

【0134】

いくつかの実施形態では、賦形剤は、水、及び石油、動物、植物、又は合成物由来のものを含む油、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの無菌液体であってもよい。水は、組成物（例えば、医薬組成物）が静脈内投与される場合の例示的な賦形剤である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液用の液体賦形剤として採用され得る。賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなども挙げることができる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含み得る。組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を取り得る。製剤を含む経口組成物は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含み得る。

【0135】

医薬化合物を含む組成物は、例えば、単離又は精製された形の抗体を、好適な量の賦形剤とともに含み得る。

【0136】

本明細書で使用される「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所望の結果をもたらすのに十分である、本明細書において提供される抗体又は医薬組成物の量を指す。

【0137】

「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では互換的に使用することができる。本明細書で使用される場合、特定の実施形態では、対象は、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）又は霊長類（例えば、サル及びヒト）などの哺乳動物である。具体的な実施形態では、対象は、ヒトである。一実施形態では、対象は、病態又は障害と診断された哺乳動物、例えば、ヒトである。別の実施形態では、対象は、病態又は障害を発症するリスクのある哺乳動物、例えば、ヒトである。

【0138】

「投与する」又は「投与」とは、本明細書に記載されているか、又は当該技術分野で知られている、粘膜、皮内、静脈内、筋肉内、皮下送達、及び／又は他の任意の物理的送達方法などによって、体外に存在する物質を患者に注射又は他の方法で物理的に送達する行為を指す。

【0139】

本明細書で使用される場合、「治療／処置する」、「治療／処置」、及び「治療／処置すること」という用語は、１つ又は２つ以上の治療法を投与することによって生じる、疾患又は病態の進行、重症度、及び／又は持続期間の減少又は寛解を指す。治療は、患者がまだ基礎疾患に罹患している場合があるにもかかわらず、患者に改善が観察されるように、基礎疾患と関連する１つ又は２つ以上の症状の減少、軽減及び／又は緩和があったかどうかを評価することによって決定され得る。「治療／処置すること」という用語は、疾患の管理及び寛解の両方を含む。「管理する」、「管理すること」、及び「管理」という用語は、対象が治療から得られる有益な効果を指し、必ずしも疾患の治癒をもたらすとは限らない。

【0140】

「予防する」、「予防すること」、及び「予防」という用語は、疾患、障害、病態、又は関連する症状の発症（又は再発）の可能性を低減することを指す。

【0141】

「約」及び「おおよそ」という用語は、所与の値又は範囲の２０％以内、１５％以内、１０％以内、９％以内、８％以内、７％以内、６％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、又はそれ未満を指す。

【0142】

本開示及び特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数形を含む。

【0143】

実施形態が「含む」という用語で本明細書に記載される場合は常に、そうでなければ「からなる」及び／又は「から本質的になる」に関して記載される他の類似の実施形態もまた提供されることが理解される。実施形態が「から本質的になる」という語句で本明細書に記載される場合は常に、そうでなければ「からなる」に関して記載される類似の実施形態もまた提供されることも理解される。

【0144】

「ＡとＢの間」又は「Ａ～Ｂの間」などの語句で使用される「間」という用語は、Ａ及びＢの両方を含む範囲を指す。

【0145】

本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢの両方、Ａ又はＢ；Ａ（単独）；及びＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句で使用される「及び／又は」という用語は、以下の各実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）を含むことを意図している。

【0146】

「ＣＤ２５」という用語は、インターロイキン－２受容体アルファ鎖とも呼ばれ、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に発現される。「ＣＤ２５」という用語は、細胞（Ｔｒｅｇ細胞を含む）によって天然に発現されるか、又はそのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞上に発現され得る、任意のＣＤ２５バリアント、アイソフォーム、及び種相同体を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。

【0147】

ＮＴＰＤａｓｅ－１とも呼ばれる「ＣＤ３９」という用語は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に発現されるエクトヌクレオチダーゼである。「ＣＤ３９」という用語は、細胞（Ｔｒｅｇ細胞を含む）によって天然に発現されるか、又はそのポリペプチドをコードする遺伝子若しくはｃＤＮＡでトランスフェクトされた細胞上に発現され得る、任意のＣＤ３９バリアント、アイソフォーム、及び種相同体を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３９は、ヒトＣＤ３９である。

【0148】

５．２．多重特異性分子
本明細書で提供される多重特異性分子は、Ｔｒｅｇ細胞上に存在する抗原と結合することができる結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。いくつかの実施形態では、抗原は、ＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、記載の通りであるか、又は上記の抗体に由来する。

【0149】

上記のドメインに加えて、本明細書で提供される多重特異性分子は、第２の抗原と結合することができる追加のドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、記載の通りであるか、又は上記の抗体に由来する。

【0150】

いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞上に存在する第１の抗原と結合することができる第１の結合ドメインと、Ｔｒｅｇ細胞上に存在する第２の抗原と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原の両方が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性において機能する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ細胞活性を調節することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの選択的枯渇又は阻害を誘導する。いくつかの実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞免疫抑制活性を調節できる多重特異性抗体が本明細書で提供される。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＴｒｅｇ細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を増強することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇの選択的枯渇又は阻害によって抗腫瘍免疫を増強することができる。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＣＤ３９である。いくつかの実施形態では、第１の抗原は、ＣＤ２５であり、第２の抗原は、ＣＤ３９である。

【0151】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される多重特異性分子は、多重特異性抗体である。本明細書で提供される抗体としては、合成抗体、モノクローナル抗体、組換え産生抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体などが挙げられるが、これらに限定されない。

【0152】

一態様では、ＣＤ２５と結合する抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単一ドメイン抗体又はナノボディではない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ヒト化抗体である。

【0153】

一態様では、ＣＤ３９と結合する抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、単一ドメイン抗体又はナノボディではない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ヒト化抗体である。

【0154】

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨ領域を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＬ領域を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含むＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨ領域と、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＬ領域と、を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を有するＣＤ２５と結合する結合ドメインを含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗体のうちのいずれか１つのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と、本明細書に記載される抗体のいずれか１つのＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と、を有するＣＤ２５と結合する結合ドメイン含む、ＣＤ２５二重特異性抗体が本明細書で提供される。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＨ領域、ＶＬ領域、ＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及び／又はＶＬ ＣＤＲ３を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＨ領域を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＬ領域を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＨ領域と、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＬ領域と、を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３と、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３と、を有するＣＤ３９と結合する、第２の結合ドメインを更に含む。

【0155】

特に、本明細書で提供される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち、抗原と免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子が含まれる。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、及びＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）、又はサブクラスであり得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、又はＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４ヌルボディ及びＩｇＧ４抗体のバリアント）などのＩｇＧ抗体である。特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0156】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される様々な多重特異性分子は、エピトープと特異的に結合する能力を保持する抗体断片を含む抗体のバリアント及び／又は誘導体を含む。本明細書で提供される様々な多重特異性分子の他の実施形態では、第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインは、エピトープと特異的に結合する能力を保持する抗体断片を含む抗体のバリアント及び／又は誘導体である。例示的な断片としては、（抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合によって架橋された軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片）、Ｆａｂ’（Ｆａｂ及びヒンジ領域を通る重鎖の追加部分を含む単一の抗結合ドメインを含む抗体断片）、Ｆ（ａｂ’）２（重鎖のヒンジ領域において鎖間ジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ’分子、Ｆａｂ’分子は、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）、二重特異性Ｆａｂ（２つの抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子であり、その各々が異なるエピトープに向けられ得る）、ｓｃＦｖとしても知られる可変領域を含む単鎖Ｆａｂ鎖（１０～２５アミノ酸の鎖によって連結された抗体の単一軽鎖及び重鎖の可変の抗原結合決定領域）、ジスルフィド結合Ｆｖ、又はｄｓＦｖ（ジスルフィド結合によって一緒に連結された抗体の単一軽鎖及び重鎖の可変抗原結合決定領域）、ラクダ化ＶＨ（ＶＨ界面のいくつかのアミノ酸が天然ラクダ抗体の重鎖に見られるものである、抗体の単一重鎖の可変抗原結合決定領域）、二重特異性ｓｃＦｖ（２つの抗原結合ドメインを有するｓｃＦｖ又はｄｓＦｖ分子であり、その各々が異なるエピトープに向けられ得る）、ダイアボディ（第１のｓｃＦｖのＶＨドメインが第２のｓｃＦｖのＶＬドメインと会合し、第１のｓｃＦｖのＶＬドメインが第２のｓｃＦｖのＶＨドメインと会合するときに形成される二量体化ｓｃＦｖ、ダイアボディの２つの抗原結合領域は、同じ又は異なるエピトープに向けられ得る）、トリアボディ（ダイアボディと同様の様式で形成されるが、３つの抗原結合ドメインが単一の複合体中に作製される、三量体化ｓｃＦｖ、３つの抗原結合ドメインは、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）、テトラボディ（ダイアボディと同様の様式で形成されるが、４つの抗原結合ドメインが単一の複合体中に作製される、四量体化ｓｃＦｖ、４つの抗原結合ドメインは、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）が挙げられる。抗体の誘導体はまた、抗体結合部位の１つ又は２つ以上のＣＤＲ配列を含む。ＣＤＲ配列は、２つ又はそれ以上のＣＤＲ配列が存在する場合、足場上で一緒に連結され得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含む抗体断片であり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成できるようにするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーを更に含む。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ、Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ ａｎｄ Ｍｏｏｒｅ ｅｄｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ－Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９－３１５（１９９４）を参照されたい。

【0157】

特定の実施形態では、ＣＤ２５と結合する抗体は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ナノボディを含む。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ＶＨＨ抗体を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ラマ抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単鎖抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単一ドメイン抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ナノボディを含まない。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ＶＨＨ抗体を含まない。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、ラマ抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、多重特異性抗体である。他の実施形態では、ＣＤ２５は、二重特異性抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体の抗原結合断片を含む。他の実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇又は阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を遮断する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を調節する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を調節する。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＴｒｅｇ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、抗腫瘍免疫を増強する。

【0158】

特定の実施形態では、ＣＤ２５と結合する多重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、四重特異性抗体である。一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的と結合する第３の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的と結合する第３の結合ドメインと、（ｄ）第４の標的と結合する第４の結合ドメインと、を含む。

【0159】

別の態様では、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ２５ではない第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体が本明細書で提供される。別の態様では、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９と結合する。

【0160】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、記載の通りであるか、又は上記の抗体に由来する。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの特定の実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの特定の実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡｂＭの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｏｎｔａｃｔの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴの番号付けシステムに従う。

【0162】

いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５エピトープと結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５に特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ２５の抗原に対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ２５のエピトープに対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞の表面に存在する。

【0163】

別の態様では、ＣＤ２５との結合について本明細書に記載のＣＤ２５抗体のいずれかと競合する抗体が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書に記載のＣＤ２５抗体のいずれかと同じエピトープと結合する抗体が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書に記載のＣＤ２５抗体によって結合されたＣＤ２５上のエピトープと重複するＣＤ２５上のエピトープと結合するＣＤ２５抗体が提供される。

【0164】

一態様では、ＣＤ２５への結合についてＣＤ２５参照抗体と競合する抗体が提供される。別の態様では、ＣＤ２５参照抗体と同じＣＤ２５エピトープと結合するＣＤ２５抗体が提供される。別の態様では、ＣＤ２５参照抗体によって結合されたＣＤ２５上のエピトープと重複するＣＤ２５上のエピトープと結合するＣＤ２５抗体が提供される。

【0165】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。

【0166】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９である。

【0167】

特定の実施形態では、ノブインホール（knob-in-hole）形式で本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む、多重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む、二重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む、三重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む、四重特異性抗体が提供される。他の特異性は、当技術分野で周知の方法を使用して、ノブインホール形式で抗体に付加することができる（例えば、ｓｃＦｖをＮ末端又はＣ末端に付加すること）。更に、多重特異性抗体を作製する他の形式及び方法もまた、当技術分野で公知であり、企図される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、二重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、三重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体は、四重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５二重特異性抗体は、多重特異性抗体に含まれ得る。

【0168】

特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、第１のＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインとを含み、第１のＣＤ２５エピトープ及び第２のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、第１のＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインとを含み、第１のＣＤ２５エピトープ及び第２のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性抗体は、第１のＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインとを含み、第１のＣＤ２５エピトープ、第２のエピトープ、及び第３のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、第１のＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインと、第４のエピトープと結合する第４の結合ドメインとを含み、第１のＣＤ２５エピトープ、第２のエピトープは、第３のエピトープ、及び第４のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、第１のＣＤ２５抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ２５抗原及び第２の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、第１のＣＤ２５抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ２５抗原及び第２の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性抗体は、第１のＣＤ２５抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、第３の抗原と結合する第３の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ２５抗原、第２の抗原、及び第３の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、第１のＣＤ２５抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、第３の抗原と結合する第３の結合ドメインと、第４の抗原と結合する第４の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ２５抗原、第２の抗原、第３の抗原、及び第４の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ２５に特異的と結合する。

【0169】

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第３の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第４の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。

【0170】

特定の実施形態では、多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ２５に位置する第１のエピトープ及び第２の標的抗原の第２のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原と結合する第２の結合ドメインとを含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原と特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原と特異的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原上の第１のエピトープと結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原上の第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原上の第１のエピトープと特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原上の第２のエピトープと特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。

【0171】

特定の実施形態では、ＣＤ２５抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に発現される。特定の実施形態では、第２の標的抗原は、ＣＤ２５ではない。特定の実施形態では、第２の標的抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に発現される。Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在するＣＤ２５とのＣＤ２５多重特異性抗体の結合、及びＴｒｅｇ細胞の表面上に存在する第２の標的抗原の結合は、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇又はＴｒｅｇ細胞活性の阻害をもたらすことができる。

【0172】

特定の実施形態では、ＣＤ３９と結合する抗体は、ＶＨ領域及びＶＬ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、単鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、単一ドメイン抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ナノボディを含む。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ＶＨＨ抗体を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ラマ抗体を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、単鎖抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、単一ドメイン抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ナノボディを含まない。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ＶＨＨ抗体を含まない。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗体は、ラマ抗体を含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、多重特異性抗体である。他の実施形態では、ＣＤ３９は、二重特異性抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体の抗原結合断片を含む。他の実施形態では、二重特異性抗体は、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体の抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗体は、Ｔｒｅｇ細胞を枯渇又は阻害する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の活性化を遮断する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、Ｔｒｅｇ細胞の活性を調節する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を調節する。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＴｒｅｇ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９抗体は、抗腫瘍免疫を増強する。

【0173】

特定の実施形態では、ＣＤ３９と結合する多重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、三重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、四重特異性抗体である。一実施形態では、多重特異性ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的と結合する第３の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的と結合する第３の結合ドメインと、（ｄ）第４の標的と結合する第４の結合ドメインと、を含む。

【0174】

別の態様では、（ａ）ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９ではない第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体が本明細書で提供される。別の態様では、（ａ）ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ２５と結合する。

【0175】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、記載の通りであるか、又は上記の抗体に由来する。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの特定の実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの特定の実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0176】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡｂＭの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｏｎｔａｃｔの番号付けシステムに従う。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴの番号付けシステムに従う。

【0177】

いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３９抗原と結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３９エピトープと結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ３９と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９の抗原に対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のエピトープに対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９は、Ｔｒｅｇ細胞の表面に存在する。

【0178】

別の態様では、ＣＤ３９との結合について本明細書に記載のＣＤ３９抗体のいずれかと競合する抗体が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書に記載のＣＤ３９抗体のいずれかと同じエピトープと結合する抗体が本明細書で提供される。別の態様では、本明細書に記載のＣＤ３９抗体によって結合されたＣＤ３９上のエピトープと重複するＣＤ３９上のエピトープと結合するＣＤ３９抗体が提供される。

【0179】

一態様では、ＣＤ３９との結合についてＣＤ３９参照抗体と競合する抗体が提供される。別の態様では、ＣＤ３９参照抗体と同じＣＤ３９エピトープと結合するＣＤ３９抗体が提供される。別の態様では、ＣＤ３９参照抗体によって結合されたＣＤ３９上のエピトープと重複するＣＤ３９上のエピトープと結合するＣＤ３９抗体が提供される。

【0180】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。

【0181】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の標的は、ＣＤ２５である。

【0182】

特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む、多重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む、二重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む、三重特異性抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式で本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む、四重特異性抗体が提供される。他の特異性は、当技術分野で周知の方法を使用して、ノブインホール形式で抗体に付加することができる（例えば、ｓｃＦｖをＮ末端又はＣ末端に付加すること）。更に、多重特異性抗体を作製する他の形式及び方法もまた、当技術分野で公知であり、企図される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体は、二重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体は、三重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体は、四重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３９二重特異性抗体は、多重特異性抗体に含まれ得る。

【0183】

特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、第１のＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９エピトープ及び第２のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、第１のＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９エピトープ及び第２のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性抗体は、第１のＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９エピトープ、第２のエピトープ、及び第３のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、第１のＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインと、第４のエピトープと結合する第４の結合ドメインと、を含み、当該第１のＣＤ３９エピトープ、第２のエピトープは、第３のエピトープ、及び当該第４のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、第１のＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９抗原及び第２の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される二重特異性抗体は、第１のＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９抗原及び第２の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性抗体は、第１のＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、第３の抗原と結合する第３の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９抗原、第２の抗原、及び第３の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、第１のＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、第３の抗原と結合する第３の結合ドメインと、第４の抗原と結合する第４の結合ドメインと、を含み、第１のＣＤ３９抗原、第２の抗原、第３の抗原、及び第４の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ３９抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３９に特異的と結合する。

【0184】

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第３の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第４の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。

【0185】

特定の実施形態では、ＣＤ３９多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ３９に位置する第１のエピトープ及び第２の標的抗原の第２のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ３９抗原と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ３９抗原と特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原と特異的と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ３９抗原上の第１のエピトープと結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原上の第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ３９抗原上の第１のエピトープと特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）第２の標的抗原上の第２のエピトープと特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。

【0186】

特定の実施形態では、ＣＤ３９抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在する。特定の実施形態では、第２の標的抗原は、ＣＤ３９ではない。特定の実施形態では、第２の標的抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に発現される。Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在するＣＤ３９とのＣＤ３９多重特異性抗体の結合、及びＴｒｅｇ細胞の表面上に存在する第２の標的抗原の結合は、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇又はＴｒｅｇ細胞活性の阻害をもたらすことができる。

【0187】

別の態様では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体（「多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体」）が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、二重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、三重特異性抗体である。いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、四重特異性抗体である。

【0188】

いくつかの特定の実施形態では、例えば図２に示すように、以下の第７節で生成される二重特異性抗体が本明細書で提供される。

【0189】

一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的と結合する第３の結合ドメインと、を含む。一実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインと、（ｃ）第３の標的にと合する第３の結合ドメインと、（ｄ）第４の標的と結合する第４の結合ドメインと、を含む。

【0190】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0191】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡｂＭの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｏｎｔａｃｔの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴの番号付けシステムに従う。

【0192】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５抗原と結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５エピトープと結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ＣＤ２５と特異的に結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ２５の抗原に対する結合部位を形成する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ２５のエピトープに対する結合部位を形成する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞の表面に存在する。

【0193】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含む、ＶＨを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＶＬを含む。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む。

【0194】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｋａｂａｔの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｈｏｔｈｉａの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡｂＭの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、Ｃｏｎｔａｃｔの番号付けシステムに従う。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＩＭＧＴの番号付けシステムに従う。

【0195】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９抗原と結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９エピトープと結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９と特異的に結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９の抗原に対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインのＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、ＶＨ ＣＤＲ３、ＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３は、ＣＤ３９のエピトープに対する結合部位を形成する。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９は、Ｔｒｅｇ細胞の表面に存在する。

【0196】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、（ｉ）それぞれ配列番号１のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）それぞれ配列番号２のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含み、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、（ｉ）それぞれ配列番号３のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、（ｉｉ）それぞれ配列番号４のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３のアミノ酸配列を有するＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む。

【0197】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列を含む、ＶＬと、を含み、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、（ｉ）配列番号３のアミノ酸配列を含む、ＶＨと、（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸配列を含む、ＶＬと、を含む。

【0198】

本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５抗原ではなく、第４の標的は、ＣＤ２５抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９抗原ではなく、第４の標的はＣＤ３９抗原ではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ２５エピトープではなく、第４の標的は、ＣＤ２５エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第４の標的は、ＣＤ３９エピトープではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体のいくつかの実施形態では、第３の標的は、ＣＤ３９エピトープではなく、第４の標的はＣＤ３９エピトープではない。

【0199】

特定の実施形態では、標的は、哺乳動物に由来する。特定の実施形態では、標的は、ラットに由来する。特定の実施形態では、標的は、マウスに由来する。特定の実施形態では、標的は、霊長類に由来する。特定の実施形態では、標的は、ヒトに由来する。

【0200】

特定の実施形態では、ノブインホール形式の多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体が提供される。特定の実施形態では、ノブインホール形式の二重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体が提供される。具体的な実施態様では、ノブインホール形式の三重特異性抗体が提供される。具体的な実施態様では、ノブインホール形式の四重特異性抗体が提供される。他の特異性は、当技術分野で周知の方法を使用して、ノブインホール形式で抗体に付加することができる（例えば、ｓｃＦｖをＮ末端又はＣ末端に付加すること）。更に、多重特異性抗体を作製する他の形式及び方法もまた、当技術分野で公知であり、企図される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、二重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、三重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、四重特異性抗体に含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＣＤ２５／ＣＤ３９二重特異性抗体は、多重特異性抗体に含まれ得る。

【0201】

特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、ＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、ＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインと、を含み、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ３９エピトープ、及び第３のエピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、ＣＤ２５エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、ＣＤ３９エピトープと結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第２の結合ドメインと、第３のエピトープと結合する第３の結合ドメインと、第４のエピトープと結合する第４の結合ドメインとを含み、ＣＤ２５エピトープ、ＣＤ３９エピトープ、第３のエピトープ、及び第４エピトープは、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される三重特異性抗体は、ＣＤ２５抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ２５抗体を含む第１の結合ドメインと、ＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含む第２の結合ドメインと、第３の抗原と結合する第３の結合ドメインとを含み、ＣＤ２５抗原、ＣＤ３９抗原、第３の抗原は、同じではない。特定の実施形態では、本明細書で提供される四重特異性抗体は、ＣＤ２５抗原と結合し、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９抗原と結合する本明細書で提供されるＣＤ３９抗体を含み、第３の結合ドメインは、第３の抗原と結合し、第４の結合ドメインは、第４の抗原と結合し、ＣＤ２５抗原、ＣＤ３９抗原、第３の抗原、及び第４の抗原は、同じではない。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体の特定の実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、ＣＤ２５と特異的に結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体の他の実施形態では、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、ＣＤ３９と特異的に結合する。本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体の更に他の実施形態では、ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメインは、ＣＤ２５と特異的に結合し、ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインは、ＣＤ３９と特異的に結合する。

【0202】

いくつかの実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含み、第２の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５抗体は、単一ドメイン抗体又はナノボディではない。いくつかの実施形態では、第３の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。いくつかの実施形態では、第４の結合ドメインは、重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを含む。

【0203】

特定の実施形態では、ＣＤ２５／ＣＤ３９多重特異性抗体又はその抗原結合断片は、ＣＤ２５に位置する第１のエピトープ及びＣＤ３９に位置する第２のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原と結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原と特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９抗原と特異的に結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原上の第１のエピトープと結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９抗原上の第２のエピトープと結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、（ａ）ＣＤ２５抗原上の第１のエピトープと特異的に結合する第１の結合ドメインと、（ｂ）ＣＤ３９抗原上の第２のエピトープと特異的に結合する第２の結合ドメインとを含む、多重特異性抗体が本明細書で提供される。

【0204】

特定の実施形態では、ＣＤ２５抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在する。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗原は、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在する。Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在するＣＤ２５及びＣＤ３９とのＣＤ２５／ＣＤ３９多重特異性抗体の結合は、例えば、がん細胞の死滅をもたらし得る。他の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞の表面上に存在するＣＤ２５及びＣＤ３９とのＣＤ２５／ＣＤ３９多重特異性抗体の結合は、例えば、Ｔｒｅｇ細胞の枯渇及び／又は阻害をもたらし得る。

【0205】

いくつかの実施形態では、配列番号１の第１のＶＨ及び配列番号２の第１のＶＬを含む、Ｔｒｅｇ細胞上の抗原と結合する第１の結合ドメインと、配列番号３の第２のＶＨ及び配列番号４の第２のＶＬを含む、Ｔｒｅｇ細胞上の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、二重特異性抗体が本明細書に提供される。

【0206】

いくつかの実施形態では、配列番号７の第１のポリペプチドと、配列番号８の第２のポリペプチドと、配列番号９の第３のポリペプチドと、を含む、二重特異性抗体が本明細書に提供される。

【0207】

本明細書で提供される抗体は、鳥類及び哺乳動物（例えば、ヒト、サル、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、又はニワトリ）を含む任意の動物起源に由来し得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト又はヒト化モノクローナル抗体である。本明細書で使用される場合、「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、ヒト免疫グロブリンライブラリ又はヒト遺伝子から抗体を発現するマウスから単離された抗体が含まれる。

【0208】

特定の実施形態では、抗体は、完全なマウス抗体である。特定の実施形態では、抗体は、マウス－ヒトキメラ抗体である。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。特定の実施形態では、抗体は、完全なヒト抗体である。他の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト化抗体（例えば、ヒト定常領域及びフレームワーク領域を含む）である。本明細書で提供される抗体は、二重特異性、三重特異性、又はそれ以上の多重特異性であり得る。

【0209】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１０００ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、５０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、４０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、２０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、９ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、８ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、７ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、６ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、５ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、４ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、３ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、２ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、０．０１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ２５と結合する。Ｋ_Ｄ又はＫ_Ｄ値は、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）によって、又は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００若しくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイを使用して、当技術分野で即知の任意の方法によって測定することができる。また、「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００のシステムを用いて、上述したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）という同じ手法で測定することができる。特定の実施形態では、Ｋ_Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５は、ヒトＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５は、カニクイザルＣＤ２５である。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５は、ラットＣＤ２５である。他の実施形態では、ＣＤ２５は、マウスＣＤ２５である。

【0210】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５と特異的に結合し、ＣＤ２５の活性及び／又は発現を調節する（例えば、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を阻害する）ことができる抗体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ＣＤ２５と特異的に結合し、少なくとも１つのＣＤ２５活性を阻害する（部分的に阻害することを含む）、本明細書に記載される抗体である、ＣＤ２５アンタゴニストが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５のそのリガンドとの結合を阻害する（部分的に阻害又は減少させることを含む）。ＣＤ２５活性は、当技術分野で既知又は記載されているものなどのＣＤ２５の任意の活性に関連し得る。特定の実施形態では、ＣＤ２５活性及びＣＤ２５シグナル伝達（又はＣＤ２５媒介シグナル伝達）は、本明細書において互換的に使用される。

【0211】

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２５活性を減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約１０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約２０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約３０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約４０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約５０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約６０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約７０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約８０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約９０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約９５％減弱させる。特定の実施形態では、本明細書に記載させる抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約１５％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載させる抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約２０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載させる抗体は、ＣＤ２５活性を少なくとも約３０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。

【0212】

特定の実施形態では、ＣＤ２５活性の減弱は、本明細書に記載の方法によって評価される。特定の実施形態では、ＣＤ２５活性の減弱は、当業者に即知の方法によって評価される。特定の実施形態では、ＣＤ２５活性の減弱は、いかなる抗ＣＤ２５抗体も存在しない刺激の存在下でのＣＤ２５活性と比較する。特定の実施形態では、ＣＤ２５活性の減弱は、無関係な抗体（例えば、ＣＤ２５と特異的に結合しない抗体）による刺激の存在下でのＣＤ２５活性と比較する。

【0213】

ＣＤ２５活性の非限定的な例は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約１０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約２０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約３０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約４０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約５０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約６０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約７０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約８０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約９０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約９５％減弱させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約１５％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約２０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ２５媒介シグナル伝達を少なくとも約３０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。

【0214】

他の実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１０００ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１００ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、５０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、４０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、３０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、２０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１０ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、９ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、８ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、７ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、６ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、５ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、４ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、３ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、２ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、０．１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又は抗原結合断片は、０．０１ｎＭ未満のＫ_ＤでＣＤ３９と結合する。Ｋ_Ｄ又はＫ_Ｄ値は、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６システムを使用するＯｃｔｅｔ（登録商標）によって、又は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００若しくはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００を使用するＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）によって、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）アッセイを使用して、当技術分野で即知の任意の方法によって測定することができる。また、「オンレート」又は「会合の速度」又は「会合速度」又は「ｋｏｎ」は、例えば、Ｏｃｔｅｔ（登録商標）Ｒｅｄ９６、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－２０００、又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）ＴＭ－３０００のシステムを用いて、上述したバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）又は表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイという同じ手法で測定することができる。特定の実施形態では、Ｋ_Ｄは、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）アッセイによって決定される。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９は、ヒトＣＤ３９である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９は、カニクイザルＣＤ３９である。いくつかの実施形態では、ＣＤ３９は、ラットＣＤ３９である。他の実施形態では、ＣＤ３９は、マウスＣＤ３９である。

【0215】

いくつかの実施形態では、ＣＤ３９と特異的に結合し、ＣＤ３９の活性及び／又は発現を調節する（例えば、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を阻害する）ことができる抗体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、ＣＤ３９と特異的に結合し、少なくとも１つのＣＤ３９活性を阻害する（部分的に阻害することを含む）、本明細書に記載される抗体である、ＣＤ３９アンタゴニストが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９のそのリガンドとの結合を阻害する（部分的に阻害又は減少させることを含む）。ＣＤ３９活性は、当技術分野で既知又は記載されているものなどのＣＤ３９の任意の活性に関連し得る。特定の実施形態では、ＣＤ３９活性及びＣＤ３９シグナル伝達（又はＣＤ３９媒介シグナル伝達）は、本明細書において互換的に使用される。

【0216】

特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９活性を減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約１０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約２０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約３０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約４０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約５０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約６０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約７０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約８０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約９０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約９５％減弱させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約１５％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約２０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９活性を少なくとも約３０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。

【0217】

特定の実施形態では、ＣＤ３９活性の減弱は、本明細書に記載の方法によって評価される。特定の実施形態では、ＣＤ３９活性の減弱は、当業者に即知の方法によって評価される。特定の実施形態では、ＣＤ３９活性の減弱は、いかなる抗ＣＤ３９抗体も存在しない刺激の存在下でのＣＤ３９活性と比較する。特定の実施形態では、ＣＤ３９活性の減弱は、無関係な抗体（例えば、ＣＤ３９と特異的に結合しない抗体）による刺激の存在下でのＣＤ３９活性と比較する。

【0218】

ＣＤ３９活性の非限定的な例は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達である。したがって、特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約１０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約２０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約３０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約４０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約５０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約６０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約７０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約８０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約９０％減弱させる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約９５％減弱させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約１５％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約２０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される抗体は、ＣＤ３９媒介シグナル伝達を少なくとも約３０％～約６５％減弱させる（例えば、部分的に減弱させる）ことができる。

【0219】

当技術分野における任意の公知の二重特異性抗体フォーマットを含む、当技術分野において公知の任意の多重特異性抗体プラットフォーム又はフォーマットを、本開示において使用することができる。

【0220】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、本発明に記載されるものなどの、制御されたＦａｂアーム交換を介して得られたダイアボディ、クロスボディ、又は多重特異性抗体である。

【0221】

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体としては、ヘテロ二量体形成を促進する相補性ＣＨ３ドメインを有するＩｇＧ様分子；組換えＩｇＧ様二重標的化分子（この分子の２つの側面は各々、少なくとも２つの異なる抗体のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部を含む）；ＩｇＧ融合分子（完全長ＩｇＧ抗体が、余分のＦａｂ断片又はＦａｂ断片の一部に融合されている）；Ｆｃ融合分子（一本鎖Ｆｖ分子又は安定化されたダイアボディが、重鎖定常ドメイン、Ｆｃ領域、又はその一部に融合されている）；Ｆａｂ融合分子（異なるＦａｂ断片が一緒に融合されている）；ＳｃＦｖ及びダイアボディベース及び重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）（異なる一本鎖Ｆｖ分子又は異なるダイアボディ又は異なる重鎖抗体（例えば、ドメイン抗体、ナノボディ）が互いに融合されているか、又は別のタンパク質若しくは担体分子に融合されている）が挙げられる。

【0222】

いくつかの実施形態では、相補性ＣＨ３ドメイン分子を有するＩｇＧ様分子としては、Ｔｒｉｏｍａｂ／Ｑｕａｄｒｏｍａ（Ｔｒｉｏｎ Ｐｈａｒｍａ／Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｋｎｏｂｓ－ｉｎｔｏ－Ｈｏｌｅｓ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＣｒｏｓｓＭＡｂｓ（Ｒｏｃｈｅ）及び静電的に調整されたもの（Ａｍｇｅｎ）、ＬＵＺ－Ｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ストランドを交換し操作したドメインボディ（Strand Exchange Engineered Domain body、ＳＥＥＤｂｏｄｙ）（ＥＭＤ Ｓｅｒｏｎｏ）、Ｂｉｃｌｏｎｉｃ（Ｍｅｒｕｓ）、並びにＤｕｏＢｏｄｙ（Ｇｅｎｍａｂ Ａ／Ｓ）が挙げられる。

【0223】

いくつかの実施形態では、組換えＩｇＧ様二重標的化分子としては、Ｄｕａｌ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ（ＤＴ）－Ｉｇ（ＧＳＫ／Ｄｏｍａｎｔｉｓ）、Ｔｗｏ－ｉｎ－ｏｎｅ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｃｒｏｓｓ－ｌｉｎｋｅｄ Ｍａｂｓ（Ｋａｒｍａｎｏｓ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ）、ｍＡｂ２（Ｆ－Ｓｔａｒ）、及びＣｏｖＸ－ｂｏｄｙ（ＣｏｖＸ／Ｐｆｉｚｅｒ）が挙げられる。

【0224】

いくつかの実施形態では、ＩｇＧ融合分子としては、Ｄｕａｌ Ｖａｒｉａｂｌｅ Ｄｏｍａｉｎ（ＤＶＤ）－Ｉｇ（Ａｂｂｏｔｔ）、ＩｇＧ－ｌｉｋｅ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（ＩｍＣｌｏｎｅ／Ｅｌｉ Ｌｉｌｌｙ）、Ｔｓ２Ａｂ（ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ／ＡＺ）、及びＢｓＡｂ（Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ＨＥＲＣＵＬＥＳ（Ｂｉｏｇｅｎ Ｉｄｅｃ）、並びにＴｖＡｂ（Ｒｏｃｈｅ）が挙げられる。

【0225】

いくつかの実施形態では、Ｆｃ融合分子としては、ＳｃＦｖ／Ｆｃ融合体（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）、ＳＣＯＲＰＩＯＮ（Ｅｍｅｒｇｅｎｔ ＢｉｏＳｏｌｕｔｉｏｎｓ／Ｔｒｕｂｉｏｎ，Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ／ＢＭＳ）、二重親和性再標的化技術（Ｆｃ－ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、及び二重（ＳｃＦｖ）２－Ｆａｂ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ－－Ｃｈｉｎａ）を挙げることができる。

【0226】

いくつかの実施形態では、Ｆａｂ融合二重特異性抗体としては、Ｆ（ａｂ）２（Ｍｅｄａｒｅｘ／ＡＭＧＥＮ）、Ｄｕａｌ－Ａｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｂｉｓ－Ｆａｂ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、Ｄｏｃｋ－ａｎｄ－Ｌｏｃｋ（ＤＮＬ）（ＩｍｍｕｎｏＭｅｄｉｃｓ）、Ｂｉｖａｌｅｎｔ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ（Ｂｉｏｔｅｃｎｏｌ）、及びＦａｂ－Ｆｖ（ＵＣＢ－Ｃｅｌｌｔｅｃｈ）が挙げられる。ＳｃＦｖ抗体、ダイアボディに基づく抗体、及びドメイン抗体は、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャ（Bispecific T Cell Engager、ＢｉＴＥ）（Ｍｉｃｒｏｍｅｔ）、タンデムダイアボディ（Tandem Diabody、Ｔａｎｄａｂ）（Ａｆｆｉｍｅｄ）、二重親和性再標的技術（Dual Affinity Retargeting Technology、ＤＡＲＴ）（ＭａｃｒｏＧｅｎｉｃｓ）、一本鎖ダイアボディ（Ａｃａｄｅｍｉｃ）、ＴＣＲ様抗体（ＡＩＴ、ＲｅｃｅｐｔｏｒＬｏｇｉｃｓ）、ヒト血清アルブミンＳｃＦｖ融合体（Ｍｅｒｒｉｍａｃｋ）、及びＣＯＭＢＯＤＹ（Ｅｐｉｇｅｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、二重標的ナノボディ（Ａｂｌｙｎｘ）、二重標的重鎖のみドメイン抗体を含むが、これらに限定されない。

【0227】

本明細書で提供される完全長二重特異性抗体は、無細胞環境でインビトロにおいて又は共発現を使用してのいずれかで、異なる特異性を有する２つの抗体半分子のヘテロ二量体を形成するのに好都合になるように、各半分子において重鎖ＣＨ３界面に置換を導入することによって、例えば、２つの単一特異性二価抗体間でのＦａｂアーム交換（又は半分子交換）を使用して生成することができる。Ｆａｂアーム交換反応は、ジスルフィド結合異性化反応及びＣＨ３ドメインの解離－会合の結果である。単一特異性親抗体のヒンジ領域における重鎖ジスルフィド結合は、低減される。単一特異性親抗体のうちの１つについて生じる遊離システインは、第２の単一特異性親抗体分子のシステイン残基と重鎖内ジスルフィド結合を形成し、同時に、親抗体のＣＨ３ドメインは、解離－会合により開放及び再形成する。ＦａｂアームのＣＨ３ドメインは、ホモ二量体形成よりヘテロ二量体形成を有利にするように操作され得る。得られた産物は、各々が、異なるエピトープ、すなわち、ＣＤ２５上のエピトープ及びＣＤ３９上のエピトープと結合する、２つのＦａｂアーム又は半分子を有する二重特異性抗体である。多重特異性抗体を作製する他の方法は、既知であり、企図される。

【0228】

本明細書で使用するとき、「ホモ二量体形成」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ホモ二量体」は、同一のＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。

【0229】

本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体形成」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖の相互作用を意味する。本明細書で使用するとき、「ヘテロ二量体」は、同一でないＣＨ３アミノ酸配列を有する２本の重鎖を有する抗体を意味する。

【0230】

「ノブインホール（knob-in-hole）」戦略（例えば、国際公開第２００６／０２８９３６号を参照のこと）を使用して、完全長二重特異性抗体を生成することができる。簡潔に述べると、ヒトＩｇＧにおけるＣＨ３ドメインの界面を形成する選択されたアミノ酸は、ヘテロ二量体形成を促進するように、ＣＨ３ドメイン相互作用に影響を及ぼす位置において変異され得る。小さな側鎖を有するアミノ酸（ホール）が、第１の抗原と特異的に結合する抗体の重鎖内に導入され、大きな側鎖を有するアミノ酸（ノブ）が、第２の抗原と特異的に結合する抗体の重鎖内に導入される。２つの抗体の共発現後に、ヘテロ二量体が、「ホール」を有する重鎖と「ノブ」を有する重鎖との優先的な相互作用の結果として形成される。ノブ及びホールを形成する例示的なＣＨ３置換の対は、Ｔ３６６Ｙ／Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、及びＴ３６６Ｗ／Ｔ３６６Ｓ＿Ｌ３６８Ａ＿Ｙ４０７Ｖである（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）。

【0231】

他のストラテジ、例えば、１つのＣＨ３表面における正に荷電した残基及び第２のＣＨ３表面における負に荷電した残基を置換することによる静電的相互作用を使用する重鎖ヘテロ二量体形成の促進が、米国特許出願公開第２０１０／００１５１３３号、米国特許出願公開第２００９／０１８２１２７号、米国特許出願公開第２０１０／０２８６３７号、又は米国特許出願公開第２０１１／０１２３５３２号に記載されるように使用され得る。他のストラテジでは、ヘテロ二量体形成は、米国特許出願公開第２０１２／０１４９８７６号又は米国特許出願公開第２０１３／０１９５８４９号に記載されるように、下記置換：Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５ＡＹ４０７Ｖ／Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３６６Ｉ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｍ＿Ｔ３９４Ｗ／Ｆ４０５Ａ＿Ｙ４０７Ｖ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、Ｌ３５１Ｙ＿Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ｖ Ｋ４０９Ｆ Ｙ４０７Ａ／Ｔ３６６Ａ＿Ｋ４０９Ｆ、又はＴ３５０Ｖ＿Ｌ３５１Ｙ＿Ｆ４０５Ａ Ｙ４０７Ｖ／Ｔ３５０Ｖ＿Ｔ３６６Ｌ＿Ｋ３９２Ｌ＿Ｔ３９４Ｗ（第１の重鎖の第１のＣＨ３ドメインにおける改変位置／第２の重鎖の第２のＣＨ３ドメインにおける改変位置として表現）により促進され得る。

【0232】

上記の方法に加えて、本明細書で提供される二重特異性抗体は、国際公開第２０１１／１３１７４６号に記載の方法に従って、２つの単一特異性ホモ二量体抗体のＣＨ３領域に非対称な変異を導入し、ジスルフィド結合の異性化を可能にするための還元条件下において２つの親単一特異性ホモ二量体抗体から二重特異性ヘテロ二量体抗体を形成することによって、無細胞環境でインビトロにおいて生成され得る。この方法において、第１の単一特異性二価抗体及び第２の単一特異性二価抗体は、ヘテロ二量体の安定性を促進するＣＨ３ドメインにおいてある特定の置換を有するように操作され、これらの抗体は、ヒンジ領域におけるシステインがジスルフィド結合を異性化させるために十分な還元条件下においてともにインキュベートされ、それにより、Ｆａｂアーム交換により二重特異性抗体が生成される。インキュベート条件は、最適には、非還元条件に戻され得る。使用され得る例示的な還元剤は、２－メルカプトエチルアミン（2-mercaptoethylamine、２－ＭＥＡ）、ジチオスレイトール（dithiothreitol、ＤＴＴ）、ジチオエリスリトール（dithioerythritol、ＤＴＥ）、グルタチオン、トリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（tris(2-carboxyethyl)phosphine、ＴＣＥＰ）、Ｌ－システイン、及びベータ－メルカプトエタノールであり、好ましくは、２－メルカプトエチルアミン、ジチオスレイトール、及びトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィンからなる群から選択される還元剤である。例えば、少なくとも２０℃の温度で、少なくとも２５ｍＭの２－ＭＥＡの存在下又は少なくとも０．５ｍＭのジチオスレイトールの存在下で、ｐＨ５～８、例えばｐＨ７．０又はｐＨ７．４で、少なくとも９０分間のインキュベートが使用され得る。

【0233】

いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、一方の結合ドメインはｓｃＦｖ領域であり、他方の結合ドメインはＦａｂ領域である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、二重特異性抗体であり、一方の結合ドメインはＣＤ２５と結合するｓｃＦｖ領域であり、他方の結合ドメインはＣＤ３９と結合するＦａｂ領域である。

【0234】

本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ヒトである。いくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒトである。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインの両方は、ヒトである。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメインは、ヒト化されている。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第２の結合ドメインは、ヒト化されている。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインの両方は、ヒト化されている。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、両方の第１の結合ドメインは、ヒトであり、第２の結合ドメインは、ヒト化されている。本明細書で提供される多重特異性抗体のいくつかの実施形態では、両方の第１の結合ドメインは、ヒト化されており、第２の結合ドメインは、ヒトである。特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体である。

【0235】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、多価である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも３つの抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも５つの抗原と結合することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ２抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ３抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ４抗体である。特定の実施形態では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体である。

【0236】

特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体の一部である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ２５抗原と結合する第１の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される通り、多重特異性抗体は、ＣＤ２５抗原と結合する第１の結合ドメインを含み、第２の標的抗原と結合する第２の結合ドメインを含む。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ２５抗原、第２の標的抗原、及び１つ又は２つ以上の追加の抗原と結合する。本明細書で提供される様々な抗体のいくつかの実施形態では、抗体は、所与の抗原のエピトープと結合する。特定の実施形態では、多重特異性ＣＤ２５抗体は、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体であり、第２の標的は、ＣＤ３９である。

【0237】

特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体の一部である。いくつかの実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ３９抗原と結合する第１の結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される通り、多重特異性抗体は、ＣＤ３９抗原と結合する第１の結合ドメインを含み、第２の標的抗原と結合する第２の結合ドメインを含む。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、ＣＤ３９抗原、第２の標的抗原、及び１つ又は２つ以上の追加の抗原と結合する。本明細書で提供される様々な抗体のいくつかの実施形態では、抗体は、所与の抗原のエピトープと結合する。特定の実施形態では、多重特異性ＣＤ３９抗体は、第２の標的がＣＤ２５である、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体である。

【0238】

いくつかの実施形態では、ＣＤ２５及びＣＤ３９と特異的に結合し、Ｔｒｅｇ細胞活性を調節することができる、多重特異性抗体が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する。いくつかの実施形態では、ＣＤ２５及びＣＤ３９と特異的に結合し、Ｔｒｅｇ細胞免疫抑制活性を調節することができる、多重特異性抗体が本明細書に提供される。特定の実施形態では、Ｔｒｅｇ細胞は、ヒトＴｒｅｇ細胞である。

【0239】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも１０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも２０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも３０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも４０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも５０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも６０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも７０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも８０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも９０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも９５％阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも約１５％～約６５％阻害することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも約２０％～約６５％阻害することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ活性を少なくとも約３０％～約６５％阻害することができる。

【0240】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも１０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも２０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも３０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも４０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも５０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも６０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも７０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも８０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも９０％阻害する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも９５％阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも約１５％～約６５％阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも約２０％～約６５％阻害する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇ免疫抑制活性を少なくとも約３０％～約６５％阻害する。

【0241】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも１０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも２０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも３０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも４０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも５０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも６０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも７０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも８０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも９０％選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも９５％選択的に枯渇させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも約１５％～約６５％選択的に枯渇させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも約２０％～約６５％選択的に枯渇させる。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、Ｔｒｅｇを少なくとも約３０％～約６５％選択的に枯渇させる。

【0242】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも１０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも２０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも３０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも４０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも５０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも６０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも７０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも８０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも９０％増強する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも９５％増強する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも約１５％～約６５％増強する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも約２０％～約６５％増強する。特定の実施形態では、本明細書に記載される多重特異性抗体は、抗腫瘍免疫を少なくとも約３０％～約６５％増強する。

【0243】

５．２．１モノクローナル抗体
本開示の多重特異性抗体は、モノクローナル抗体であるか、又はモノクローナル抗体に由来し得る。モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７５，Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－９７によって最初に記載されたハイブリドーマ法を使用して作製され得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号を参照されたい）によって作製され得る。

【0244】

ハイブリドーマ方法では、マウス、又はハムスターなどの他の適切な宿主動物を、上記で記載した通りに免疫化して、免疫化のために使用されるタンパク質と特異的に結合する抗体を産生するか、又はこれらを産生することが可能なリンパ球を誘発する。代替的に、リンパ球は、インビトロで免疫化され得る。免疫化の後、リンパ球を単離し、次いで、ポリエチレングリコールなどの好適な融合剤を使用して骨髄腫細胞系と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，モノクローナル抗体：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ５９－１０３（１９８６））。

【0245】

このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、特定の実施形態では、融合されていない親骨髄腫細胞（融合パートナーとも称される）の増殖又は生存を阻害する１つ又は２つ以上の物質を含有する、好適な培養培地中に播種し、増殖させる。例えば、親骨髄腫細胞が、酵素であるヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための選択的培養培地は、典型的に、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含み（ＨＡＴ培地）、これらは、ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を防止する。

【0246】

例示的な融合パートナーである骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定的な高レベルの抗体の産生を支援し、融合させていない親細胞に対して選択する選択的培地に感受性である骨髄腫細胞である。例示的な骨髄腫細胞系は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手可能な、ＳＰ－２細胞及び派生細胞、例えば、Ｘ６３－Ａｇ８－６５３細胞などのマウス骨髄腫系、並びにＳａｌｋ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ Ｃｅｌｌ Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から入手可能な、ＭＯＰＣ－２１マウス腫瘍及びＭＰＣ－１１マウス腫瘍に由来する、マウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株もまた、ヒトモノクローナル抗体の産生のために記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１－０５；及びＢｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１－６３）。

【0247】

ハイブリドーマ細胞が増殖する培養培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降、又はＲＩＡ若しくはＥＬＩＳＡなどのインビトロにおける結合アッセイにより決定する。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えば、Ｍｕｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０７：２２０－３９において記載されている、スカッチャード分析により決定することができる。

【0248】

所望の特異性、親和性、及び／又は活性を有する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を同定したら、クローンを、限界希釈手順によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ、上記）。この目的に好適な培養培地は、例えば、ＤＭＥＭ培地又はＲＰＭＩ－１６４０培地を含む。加えて、例えば、細胞のマウスへのｉ．ｐ．注射により、ハイブリドーマ細胞を、インビボにおいて、動物における腹水腫瘍として増殖させ得る。

【0249】

サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体を、例えば、クロマトグラフィ（例えば、プロテインＡ－セファロース又はプロテインＧ－セファロースを使用して）又はイオン交換クロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析などの従来の抗体精製手順により、培養培地、腹水、又は血清から、好適に分離する。

【0250】

モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子と特異的に結合することが可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）、容易に単離され、配列決定される。ハイブリドーマ細胞を、そのようなＤＮＡの供給源として用いることができる。単離したら、ＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いで、普通であれば抗体タンパク質を産生しない大腸菌（E. coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、又は骨髄腫細胞などの宿主細胞にこれらをトランスフェクトして、組換え宿主細胞内のモノクローナル抗体の合成を得ることができる。抗体をコードするＤＮＡの、細菌内の組換え発現についての総説論文は、Ｓｋｅｒｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：２５６－６２、及びＰｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖｓ．１３０：１５１－８８を含む。

【0251】

更なる実施形態では、モノクローナル抗体又は抗体断片は、例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｈａｇｅ Ｄｉｓｐｌａｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ ａｎｄ Ａｉｔｋｅｎ，ｅｄｓ．，２００２）において記載されている技法を使用して作出された抗体ファージライブラリから単離することができる。ファージディスプレイ方法では、機能的な抗体ドメインを、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に提示する。本明細書で記載される抗体を作製するのに使用され得るファージディスプレイ方法の例は、Ｂｒｉｎｋｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８２：４１－５０；Ａｍｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １８４：１７７－１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：９５２－９５８；Ｐｅｒｓｉｃ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ １８７：９－１８；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ５７：１９１－２８０；国際出願第ＧＢ９１／Ｏ１ １３４号；国際公開第９０／０２８０９号、同第９１／１０７３７号、同第９２／０１０４７号、同第９２／１８６１９号、同第９３／１１２３６号、同第９５／１５９８２号、同第９５／２０４０１号、及び同第９７／１３８４４号、並びに米国特許第５，６９８，４２６号、同第５，２２３，４０９号、同第５，４０３，４８４号、同第５，５８０，７１７号、同第５，４２７，９０８号、同第５，７５０，７５３号、同第５，８２１，０４７号、同第５，５７１，６９８号、同第５，４２７，９０８号、同第５，５１６，６３７号、同第５，７８０，２２５号、同第５，６５８，７２７号、同第５，７３３，７４３号及び同第５，９６９，１０８号において開示されているファージディスプレイ方法を含む。

【0252】

原則として、合成抗体クローンは、ファージコートタンパク質へと融合させた、抗体可変領域（Ｆｖ）の多様な断片を表示するファージを含むファージライブラリをスクリーニングすることにより選択される。そのようなファージライブラリを、所望の抗原に対してスクリーニングする。所望の抗原への結合が可能なＦｖ断片を発現するクローンは、抗原へと吸着されるので、ライブラリ内の非結合クローンから分離される。次いで、結合クローンを、抗原から溶離させ、抗原への吸着／溶離の更なるサイクルにより、更に濃縮する。

【0253】

可変ドメインは、例えば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：４３３－５５において記載されている通り、ＶＨ及びＶＬを、短い可撓性ペプチドを介して共有結合的に連結した単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片として、又はＶＨ及びＶＬの各々を定常ドメインへと融合させ、非共有結合的に相互作用させたＦａｂ断片として、ファージ上で機能的に提示されることができる。

【0254】

ＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子のレパートリは、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．、上記において記載されている通り、ＰＣＲにより個別にクローニングされ、ファージライブラリ内でランダムに組換えられることができ、次いで、これらを、抗原結合クローンについて検索することができる。免疫された起源からのライブラリは、ハイブリドーマを構築する必要性を伴うことなく免疫原に高親和性抗体を提供する。代替的に、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＥＭＢＯ Ｊ １２：７２５－３４により記載されているように、ナイーブレパートリをクローニングして、広範にわたる非自己に対するヒト抗体の単一の供給源をもたらし、また、免疫化を伴わない自己抗原に対するヒト抗体の単一の供給源ももたらすことができる。最後に、ナイーブライブラリはまた、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１－８８により記載されている通り、幹細胞に由来する、再配列されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングし、ランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用して、高度に可変性のＣＤＲ３領域をコードし、インビトロにおける再配列を達成することにより、合成により作ることもできる。

【0255】

ライブラリのスクリーニングは、当該技術分野で知られている様々な技術によって達成することができる。例えば、ＣＤ２５（例えば、ＣＤ２５ポリペプチド、断片、又はエピトープ）は、吸着プレートのウェルをコーティングするのに使用することができ、吸着プレートへと固定した宿主細胞上で発現させることもでき、細胞選別において使用することができ、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズによる捕捉のためにビオチンへと複合させることができ、パニングディスプレイライブラリのための他の任意の方法において使用することができる。解離反応速度の遅い（例えば、結合親和性が良好な）抗体の選択は、Ｂａｓｓ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ８：３０９－１４及び国際公開第９２／０９６９０号において記載されているように、長時間の洗浄及び一価ファージディスプレイの使用、並びにＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：７７９－８３において記載されているように、抗原の低コーティング密度の使用により促進することができる。

【0256】

抗体は、目的のファージクローンを選択するための好適な抗原スクリーニング手順に続き、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．、（上記）に記載されている、目的のファージクローン及び好適な定常領域（例えば、Ｆｃ）配列に由来する、ＶＨ配列及び／又はＶＬ配列（例えば、Ｆｖ配列）、又はＶＨ配列及びＶＬ配列に由来する多様なＣＤＲ配列を使用する、全長抗体クローンの構築を設計することにより得ることができる。

【0257】

本明細書で記載される抗体はまた、例えば、キメラ抗体を含み得る。キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。例えば、キメラ抗体は、ヒト抗体の定常領域へと融合させたマウスモノクローナル抗体又はラットモノクローナル抗体の可変領域を含み得る。キメラ抗体を産生するための方法は当該技術分野において既知である。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：１２０２；Ｏｉ ｅｔ ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４：２１４；Ｇｉｌｌｉｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ １２５：１９１－２０２；及び米国特許第５，８０７，７１５号、同第４，８１６，５６７号、同第４，８１６，３９７号、及び同第６，３３１，４１５号を参照されたい。

【0258】

本明細書で記載されるような技術を使用して産生される抗体又は抗原結合断片は、標準的な周知の技術を使用して単離することができる。例えば、抗体又は抗原結合断片は、例えば、プロテインＡ－セファロース、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析、又は親和性クロマトグラフィなど、従来の免疫グロブリン精製手順により、例えば、培養培地、腹水、血清、細胞溶解物、合成反応材料などから好適に分離することができる。本明細書中で使用される場合、「単離」又は「精製」抗体は、抗体が由来する細胞供給源若しくは組織供給源に由来する細胞物質若しくは他のタンパク質を実質的に含まないか、又は化学合成される場合、化学的前駆物質若しくは他の化学物質を実質的に含まない。

【0259】

５．２．２抗体断片
多重特異性抗体本開示は、例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と結合する抗体断片を含む多重特異性抗体を提供する。

【0260】

抗体断片の作製のために様々な手法が開発されている。慣例的に、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２４：１０７－１７；及びＢｒｅｎｎａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２９：８１－８３を参照されたい）。しかしながら、これらの断片は現在、組換え宿主細胞によって直接に作製され得る。Ｆａｂ、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ抗体断片は全てＥ．ｃｏｌｉ又は酵母細胞内で発現及び分泌することができるため、これらの断片の大量生産を可能にする。抗体断片は、上記の抗体ファージライブラリから単離することができる。代替的に、Ｆａｂ’－ＳＨ断片は、Ｅ．ｃｏｌｉから直接回収でき、化学的に結合してＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １０：１６３－６７）。別のアプローチにより、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含む、インビボ半減期が増加したＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片は、例えば、米国特許第５，８６９，０４６号に記載されている。抗体断片の産生のための他の技術は、当業者に明らかであろう。特定の実施形態では、抗体は、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）である（例えば、国際公開第９３／１６１８５号；米国特許第５，５７１，８９４号及び同第５，５８７，４５８号を参照されたい）。Ｆｖ及びｓｃＦｖは、定常領域を欠くインタクトな結合部位を有し、したがって、それらは、インビボでの使用中の非特異的結合の低減に好適であり得る。ｓｃＦｖ融合タンパク質は、ｓｃＦｖのアミノ末端又はカルボキシ末端のいずれかにおいてエフェクタータンパク質の融合を生じるように構築され得る（例えば、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ ｅｄ．，上記を参照されたい）。抗体断片はまた、例えば、上で引用した参考文献に記載されるような「直鎖状抗体」であり得る。かかる直鎖状抗体は、単一特異性であっても、二重特異性などの多重特異性であってもよい。

【0261】

より小さな抗体由来結合構造は、単一可変ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とも呼ばれる別個の可変ドメイン（Ｖドメイン）である。特定の種類の生物、ラクダ科動物及び軟骨魚類は、それらの免疫系の一部としてＦｃ等価ドメイン構造上にマウントされた高親和性単一Ｖ様ドメインを有する。（Ｗｏｏｌｖｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ ５０：９８－１０１；及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．１０１：１２４４４－４９）。Ｖ様ドメイン（ラクダ科ではＶｈＨと呼ばれ、サメではＶ－ＮＡＲと呼ばれる）は、典型的には、標的抗原の空洞への侵入を可能にする長い表面ループを示す。それらはまた、疎水性表面パッチをマスキングすることによって、単離されたＶＨドメインを安定化する。

【0262】

これらのＶｈＨ及びＶ－ＮＡＲドメインは、ｓｄＡｂを操作するために使用されてきた。ヒトＶドメインバリアントは、ファージライブラリからの選択及び他のアプローチを使用して設計されており、安定な高結合ＶＬ及びＶＨ由来ドメインをもたらす。

【0263】

本明細書で提供される抗体には、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、例えば、ＣＤ２５又はＣＤ３９エピトープと結合する抗原結合部位を含有する分子が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子の任意のクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＡ）又は任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）であり得る。特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、又はＩｇＧ４抗体（例えば、ＩｇＧ４ヌルボディ及びＩｇＧ４抗体のバリアント）などのＩｇＧ抗体である。特定の実施形態では、ＩｇＧ抗体は、ＩｇＧ１抗体である。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ抗体は、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む。

【0264】

抗体のバリアント及び誘導体は、例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９エピトープと結合する能力を保持する抗体機能的断片を含む。例示的な機能的断片としては、Ｆａｂ断片（例えば、抗原結合ドメインを含み、ジスルフィド結合によって架橋された軽鎖及び重鎖の一部を含む抗体断片）、Ｆａｂ’（例えば、Ｆａｂ及びヒンジ領域を通る重鎖の追加部分を含む単一の抗原結合ドメインを含む抗体断片）、Ｆ（ａｂ’）２（例えば、重鎖のヒンジ領域において鎖間ジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂ’分子、Ｆａｂ’分子は、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）、二重特異性Ｆａｂ（例えば、２つの抗原結合ドメインを有するＦａｂ分子であり、その各々が異なるエピトープに向けられ得る）、ｓｃＦｖとしても知られる可変領域を含む単鎖（例えば、１０～２５アミノ酸の鎖によって連結された抗体の単一軽鎖及び重鎖の可変の抗原結合決定領域）、ジスルフィド結合Ｆｖ、又はｄｓＦｖ（例えば、ジスルフィド結合によって一緒に連結された抗体の単一軽鎖及び重鎖の可変抗原結合決定領域）、ラクダ化ＶＨ（例えば、ＶＨ界面のいくつかのアミノ酸が天然ラクダ抗体の重鎖に見られるものである、抗体の単一重鎖の可変抗原結合決定領域）、二重特異性ｓｃＦｖ（例えば、２つの抗原結合ドメインを有するｓｃＦｖ又はｄｓＦｖ分子であり、その各々が異なるエピトープに向けられ得る）、ダイアボディ（例えば、第１のｓｃＦｖのＶＨドメインが第２のｓｃＦｖのＶＬドメインと会合し、第１のｓｃＦｖのＶＬドメインが第２のｓｃＦｖのＶＨドメインと会合するときに形成される二量体化ｓｃＦｖ、ダイアボディの２つの抗原結合領域は、同じ又は異なるエピトープに向けられ得る）、トリアボディ（例えば、ダイアボディと同様の様式で形成されるが、３つの抗原結合ドメインが単一の複合体中に作製される、三量体化ｓｃＦｖ、３つの抗原結合ドメインは、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）、テトラボディ（例えば、ダイアボディと同様の様式で形成されるが、４つの抗原結合ドメインが単一の複合体中に作製される、四量体化ｓｃＦｖ、４つの抗原結合ドメインは、同じ又は異なるエピトープに向かい指向され得る）が挙げられる。

【0265】

５．２．３ヒト化抗体
本明細書に記載される多重特異性抗体には、例えば、ヒト化抗体、例えば、脱免疫化ヒト抗体又は複合ヒト抗体が含まれ得る。

【0266】

ヒト化抗体は、ヒトフレームワーク領域及びヒト定常領域の配列を含み得る。例えば、ヒト化抗体は、ヒト定常領域配列を含み得る。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ及びＩｇＥを含む免疫グロブリンの任意のクラス、及びＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４を含む任意のアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ４のバリアント及びＩｇＧ４ヌルボディ）から選択され得る。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、カッパ又はラムダの軽鎖定常配列を含み得る。

【0267】

ヒト化抗体は、ＣＤＲグラフティング（欧州特許第２３９，４００号；国際公開第９１／０９９６７号、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び同第５，５８５，０８９号）、ベニヤリング又はリサーフェシング（欧州特許第５９２，１０６号、同第５１９，５９６号；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２８（４／５）：４８９－４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７（６）：８０５－８１４、及びＲｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ ９１：９６９－９７３）、チェーンシャッフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）、及び例えば、米国特許第６，４０７，２１３号、同第５，７６６，８８６号、国際公開第９３／１７１０５号、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９ ２５（２００２）、Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３５３－６０（２０００）、Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０（３）：２６７ ７９（２０００）、Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７）、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．９（１０）：８９５ ９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５）、Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５５（８）：１７１７－２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ ＪＳ，Ｇｅｎｅ １５０（２）：４０９－１０（１９９４）、及びＰｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３５（３）：９５９－７３（１９９４）を含むが、これらに限定されない、当該分野で公知の様々な技術を使用して産生することができる。米国特許出願公開第２００５／００４２６６４（Ａ１）号（２００５年２月２４日）も参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0268】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、ヒト、カニクイザル、ラット、及びマウスＣＤ２５、並びに／又はＣＤ３９を含む、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と結合するヒト化抗体であり得る。例えば、本開示のヒト化抗体は、本明細書で提供される配列表に示される１つ又は２つ以上のＣＤＲを含み得る。非ヒト抗体をヒト化するための様々な方法が、当該技術分野では知られている。例えば、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入された１つ又は２つ以上のアミノ酸残基を有し得る。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合「インポート」残基と称され、典型的には、「インポート」可変ドメインから取得される。ヒト化は、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｎａｔｕｒｅ ３２１：５２２－２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３２：３２３－２７；及びＶｅｒｈｏｅｙｅｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８８，２３９：１５３４－３６）の方法に従い、超可変領域の配列で、ヒト抗体の対応する配列を置換することにより実施することができる。

【0269】

場合によっては、ヒト化抗体は、親非ヒト抗体（例えば、齧歯動物）の６つのＣＤＲのアミノ酸配列をヒト抗体フレームワークへとグラフトする、ＣＤＲグラフティングにより構築される。例えば、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．は、ＣＤＲの残基の約３分の１だけが実際に抗原と接触することを決定し、これらを「特異性決定残基」又はＳＤＲと呼んだ（Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＦＡＳＥＢ Ｊ．９：１３３－３９）。ＳＤＲグラフティングの技術では、ＳＤＲ残基のみが、ヒト抗体フレームワークにグラフトされる（例えば、Ｋａｓｈｍｉｒｉ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：２５－３４を参照されたい）。

【0270】

ヒト化抗体を作るのに使用される、ヒト可変ドメインの、軽鎖及び重鎖の両方の選択は、抗原性を低減するのに重要であり得る。例えば、いわゆる「ベストフィット」方法に従い、非ヒト（例えば、齧歯動物）抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリの全体に対してスクリーニングする。齧歯動物のヒト配列に最も近いヒト配列は、ヒト化抗体のヒト骨格として選択され得る（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２２９６－３０８；及びＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１－１７）。別の方法は、軽鎖又は重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用することができる（Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：４２８５－８９；及びＰｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１：２６２３－３２）。場合によっては、フレームワークは、最も存在量が多いヒトサブクラスであるＶＬ６亜群Ｉ（ＶＬ６Ｉ）及びＶＨ亜群ＩＩＩ（ＶＨＩＩＩ）のコンセンサス配列に由来する。別の方法では、ヒト生殖細胞系列遺伝子をフレームワーク領域の供給源として使用する。

【0271】

スーパーヒト化と呼ばれるＣＤＲの比較に基づいた代替パラダイムでは、ＦＲの相同性は関係ない。この方法は、非ヒト配列及び機能的ヒト生殖細胞系列遺伝子レパートリを比較することからなる。次いで、マウス配列と同じ又は密接に関連した標準構造をコードする遺伝子が選択される。次に、非ヒト抗体と標準構造を共有する遺伝子のうち、ＣＤＲ内の相同性が最も高い遺伝子をＦＲドナーとして選択する。最後に、非ヒトＣＤＲをこれらのＦＲにグラフトする（例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１１１９－２５参照されたい）。

【0272】

更に、抗体は、抗原に対する親和性及びその他の好ましい生物学的特性を保持したままヒト化されることが概ね望ましい。この目標を達成するために、ある方法によれば、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念のヒト化産物を分析するプロセスによって、ヒト化抗体を調製する。三次元の免疫グロブリンモデルが一般的に利用可能であり、当業者に周知である。選択された免疫グロブリン配列候補について確率の高い三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータプログラムが利用可能である。これらには、例えば、ＷＡＭ（Ｗｈｉｔｅｌｅｇｇ ａｎｄ Ｒｅｅｓ，２０００，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３：８１９－２４）、Ｍｏｄｅｌｌｅｒ（Ｓａｌｉ ａｎｄ Ｂｌｕｎｄｅｌｌ，１９９３，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２３４：７７９－８１５）、Ｓｗｉｓｓ ＰＤＢ Ｖｉｅｗｅｒ（Ｇｕｅｘ ａｎｄ Ｐｅｉｔｓｃｈ，１９９７，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ １８：２７１４－２３）が挙げられる。これらの表示について精査することにより、免疫グロブリン配列候補の機能において残基が示す可能性の高い働きの分析、例えば、免疫グロブリン候補が、その抗原結合能に影響を及ぼす残基についての分析が可能となる。このようにして、標的抗原に対する親和性の増大など、所望の抗体特性が達成されるように、レシピエント配列及びインポート配列から、ＦＲ残基を選択し組み合わせることができる。概して、超可変領域残基は、抗原結合に直接的に、ほとんど実質的に関与する。

【0273】

抗体のヒト化の別の方法は、Ｈｕｍａｎ Ｓｔｒｉｎｇ Ｃｏｎｔｅｎｔ（ＨＳＣ）と呼ばれる抗体のヒト性の測定基準に基づいている。この方法では、マウスの配列とヒト生殖細胞系列遺伝子のレパートリを比較し、その違いをＨＳＣとしてスコアリングする。次いで、標的配列は、全体的な同一性測定を使用して多様なヒト化バリアントを生成するのではなく、そのＨＳＣを最大化することによってヒト化される（Ｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：１９８６－９８）。

【0274】

上記の方法に加えて、経験的な方法を用いてヒト化抗体を生成及び選択することができる。これらの方法には、ヒト化バリアントの大規模なライブラリを生成し、濃縮技術又はハイスループットスクリーニング技術を使用する最適なクローンの選択に基づく方法がある。抗体バリアントは、ファージ、リボソーム、及び酵母ディスプレイライブラリから、並びに細菌コロニースクリーニングによって、単離することができる（例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１０５－１６、Ｄｕｆｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２４：５２３－２９、Ｆｅｌｄｈａｕｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１：１６３７０、及びＳｃｈｌａｐｓｃｈｙ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．Ｄｅｓ．Ｓｅｌ．１７：８４７－６０を参照されたい）。

【0275】

ＦＲライブラリアプローチでは、ＦＲの特定の位置に複数の残基バリアントを導入した後、ライブラリをスクリーニングして、グラフトされたＣＤＲを最もよくサポートするＦＲを選択する。置換される残基は、ＣＤＲ構造に潜在的に寄与すると同定された「バーニア」残基の一部又は全て（例えば、Ｆｏｏｔｅ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：４８７－９９を参照されたい）、又はＢａｃａ ｅｔ ａｌによって同定されたより限定された標的残基のセットからのものを含み得る（１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１０６７８－８４）。

【0276】

ＦＲシャフリングでは、全ＦＲを、選択された残基バリアントのコンビナトリアルライブラリを創出するのではなく、非ヒトＣＤＲと組み合わせる（例えば、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００５，３６：４３－６０を参照されたい）。ライブラリは、結合について、まず、ＶＬをヒト化するのに続き、ＶＨをヒト化する、２ステッププロセスでスクリーニングすることができる。代替的に、１ステップのＦＲシャフリングプロセスを使用することができる。かかるプロセスは、得られた抗体が、発現の増強、親和性の増大、及び熱的安定性を含む、生化学的特性及び物理化学的特性の改善を呈したので、２ステップスクリーニングより効率的であることが示されている（例えば、Ｄａｍｓｃｈｒｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４４：３０４９－６０を参照されたい）。

【0277】

「ヒューマニアリング」方法は、必須の最小特異性決定基（minimum specificity determinant、ＭＳＤ）の実験的同定に基づくものであり、非ヒト断片をヒトＦＲライブラリに順次置き換えし、結合を評価することに基づいている。ヒューマニアリング方法は、非ヒトＶＨ鎖及び非ヒトＶＬ鎖のＣＤＲ３の領域で始まり、ＶＨ及びＶＬの両方の、ＣＤＲ１及びＣＤＲ２を含む、非ヒト抗体の他の領域を、ヒトＦＲへと徐々に置き換える。この手法により、典型的には、エピトープを保持し、ヒトＶセグメントのＣＤＲが明確に異なる複数のサブクラスの抗体を同定する。ヒューマニアリングは、ヒト生殖細胞系列遺伝子抗体に９１～９６％相同な抗体の単離を可能とする（例えば、Ａｌｆｅｎｉｔｏ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ Ｈｅａｌｔｈｔｅｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ’ｓ Ｔｈｉｒｄ Ａｎｎｕａｌ ＰＥＧＳ，Ｔｈｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｕｍｍｉｔ，２００７を参照されたい）。

【0278】

「ヒト操作」方法は、ヒトにおける免疫原性を低減する一方で、元の非ヒト抗体の所望の結合特性を保持する修飾抗体を産生するように、抗体のアミノ酸配列へと特異的変化を施すことにより、マウス抗体又はキメラ抗体若しくは抗体断片などの非ヒト抗体又は抗体断片を変更することを伴う。一般に、技法は、非ヒト（例えば、マウス）抗体のアミノ酸残基を、「低リスク」残基、「中程度のリスク」残基、又は「高リスク」残基として分類することを伴う。分類は、特定の置換を施すことの予測される利益（例えば、ヒトにおける免疫原性のための）を、結果として得られる抗体のフォールディングに置換が影響を及ぼすリスクに対して査定する、グローバルなリスク／有益性の計算を使用して実施する。非ヒト（例えば、マウス）抗体配列の、所与の位置（例えば、低リスク又は中程度のリスク）において置換される、特定のヒトアミノ酸残基は、非ヒト抗体の可変領域に由来するアミノ酸配列を、特異的又はコンセンサスヒト抗体配列の対応する領域とアライメントすることにより選択することができる。非ヒト配列の低リスク又は中リスクの位置にあるアミノ酸残基は、アライメントに応じてヒト抗体配列の対応する残基に置き換えることができる。ヒト操作タンパク質を作製するための技術は、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ７：８０５－１４、米国特許第５，７６６，８８６号、同第５，７７０，１９６号、同第５，８２１，１２３号、及び同第５，８６９，６１９号、並びに国際公開第９３／１１７９４号に詳しく記載されている。

【0279】

複合ヒト抗体は、例えば、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ（商標）テクノロジ（Ａｎｔｉｔｏｐｅ Ｌｔｄ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）を使用して生成することができる。複合ヒト抗体を生成するためには、複数のヒト抗体可変領域配列の断片から、Ｔ細胞エピトープを回避する方法で可変領域配列を設計することで、得られる抗体の免疫原性を最小限に抑える。そのような抗体は、ヒト定常領域配列、例えば、ヒト軽鎖定常領域及び／又はヒト重鎖定常領域を含み得る。

【0280】

脱免疫抗体は、Ｔ細胞エピトープが除去された抗体である。脱免疫抗体を作製する方法が記載されている。例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００９；５２５：４０５－２３、ｘｉｖ，ａｎｄ Ｄｅ Ｇｒｏｏｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４４：１４８－１５３（２００６）を参照されたい）。脱免疫抗体は、Ｔ細胞エピトープ枯渇可変領域及びヒト定常領域を含む。略述すると、抗体のＶＨ及びＶＬをクローニングし、その後、Ｔ細胞増殖アッセイにおいて、抗体のＶＨ及びＶＬに由来する重複ペプチドを調べることにより、Ｔ細胞エピトープを同定する。Ｔ細胞エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩと結合するペプチドを同定するためのインシリコの方法によって同定される。変異は、ヒトＭＨＣクラスＩＩへの結合を無効にするためにＶＨ及びＶＬに導入される。次いで、ＶＨ及びＶＬを利用して、脱免疫化抗体を生成する。

【0281】

５．２．４ヒト抗体
具体的な実施態様では、本明細書で提供される多重特異性抗体は、完全ヒト抗ヒト抗体又はその断片を含む。完全ヒト抗体は、当技術分野で即知の任意の方法によって産生され得る。本明細書で提供されるヒト抗体は、ヒト由来ファージディスプレイライブラリから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列（複数可）を既知のヒト定常ドメイン配列（複数可）と組み合わせることによって構築することができる。あるいは、本開示のヒトモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ法によって作製することができる。ヒトモノクローナル抗体を産生するためのヒト骨髄腫細胞株及びマウス－ヒトヘテロ骨髄腫細胞株は、例えば、Ｋｏｚｂｏｒ，１９８４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３３：３００１－０５；Ｂｒｏｄｅｕｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ５１－６３（１９８７）；及びＢｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：８６－９５に記載されている。

【0282】

免疫化により、内因性免疫グロブリン産生の非存在下でヒト抗体の完全なレパートリを産生することができるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作製することも可能である。ヒト抗体レパートリを発現するトランスジェニックマウスは、多種多様な潜在的薬物標的に対する高親和性ヒト配列モノクローナル抗体を生成するために使用されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ，Ａ．，１９９５，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６（５）：５６１－６６；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ ａｎｄ Ｔａｕｓｓｉｎｇ，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８（４）：４５５－５８；米国特許第６，０７５，１８１号及び第６，１５０，５８４号；並びにＬｏｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１１１７－２５を参照されたい）。

【0283】

あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して指向する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化を介して調製され得る（例えば、そのようなＢリンパ球は個体から回収され得るか、又はインビトロで免疫化され得る）（例えば、Ｃｏｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（１９８５）；Ｂｏｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６－９５；及び米国特許第５，７５０，３７３号を参照されたい）。

【0284】

遺伝子シャッフリングを使用して、非ヒト、例えば、齧歯動物の抗体からヒト抗体を誘導することもでき、この場合、ヒト抗体は出発非ヒト抗体と同様の親和性及び特異性を有する。「エピトープインプリンティング」又は「誘導選択」とも呼ばれるこの方法によれば、本明細書に記載されるファージディスプレイ技術によって取得される非ヒト抗体断片の重鎖又は軽鎖可変領域のいずれかがヒトＶドメイン遺伝子のレパートリで置き換えられ、非ヒト鎖／ヒト鎖ｓｃＦｖ又はＦａｂキメラの集団が作製される。抗原による選択は、非ヒト鎖／ヒト鎖キメラｓｃＦｖ又はＦａｂの単離をもたらし、ここで、ヒト鎖は、一次ファージディスプレイクローン中の対応する非ヒト鎖の除去の際に破壊された抗原結合部位を回復させる例えば、エピトープは、ヒト鎖パートナーの選択をガイド（インプリント）する）。残りの非ヒト鎖を置換するためにプロセスを繰り返すと、ヒト抗体が得られる（例えば、国際公開第９３／０６２１３号、及びＯｓｂｏｕｒｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｅｔｈｏｄｓ ３６：６１－６８を参照されたい）。ＣＤＲグラフティングによる非ヒト抗体の従来のヒト化とは異なり、この技術は、非ヒト起源のＦＲ又はＣＤＲ残基を有さない完全ヒト抗体を提供する。細胞表面抗原に対してマウス抗体をヒト化するための誘導選択の例としては、卵巣がん細胞上に存在する葉酸結合タンパク質（例えば、Ｆｉｇｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５８：９９１－９６を参照されたい）、及び肝細胞がん上で高度に発現されるＣＤ１４７（例えば、Ｂａｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｃａｎｃｅｒ Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．４：１３７４－８０を参照されたい）が挙げられる。

【0285】

ガイドされた選択アプローチの潜在的な欠点は、一方の抗体鎖のシャッフリングが、他方を一定に保ちながらエピトープドリフトをもたらし得ることである。非ヒト抗体によって認識されるエピトープを維持するために、ＣＤＲ保持を適用することができる（例えば、Ｋｌｉｍｋａ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ．８３：２５２－６０、及びＢｅｉｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３－４９を参照されたい）。この方法において、非ヒトＶＨ ＣＤＲ３は、このＣＤＲが抗原結合部位の中心にあり得、抗原認識のための抗体の最も重要な領域であり得るので、一般的に保持される。しかしながら、場合によっては、非ヒト抗体のＶＨ ＣＤＲ３及びＶＬ ＣＤＲ３、並びにＶＨ ＣＤＲ２、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ１が保持されてもよい。

【0286】

５．２．５ Ｆｃ操作
本明細書で提供される抗体をＦｃ操作によって修飾することが望ましい場合がある。特定の実施形態では、抗体のＦｃ領域に対する修飾は、抗体のエフェクター機能の減少又は排除をもたらす。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣである。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＰである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＰ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣである。これは、抗体のＦｃ領域に１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。

【0287】

特定の実施形態では、抗体のＦｃ領域に対する修飾は、抗体のエフェクター機能の増強をもたらす。特定の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及び／又はＣＤＣである。いくつかの実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＰである。他の実施形態では、エフェクター機能は、ＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＡＤＣＰである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能はＡＤＣＰ及びＣＤＣである。一実施形態では、エフェクター機能は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、及びＣＤＣである。これは、抗体のＦｃ領域に１つ又は２つ以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。いくつかの実施形態では、ノブインホール（Knob-in-hole、ＫＩＨ）技術を使用して抗体を操作した。

【0288】

抗体の血清半減期を増加させるために、例えば、米国特許第５，７３９，２７７号に記載されているように、サルベージ受容体結合エピトープを抗体（特に抗体断片）に組み込むことができる。「サルベージ受容体結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期の増加に関与するＩｇＧ分子（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域のエピトープを指す。

【0289】

５．２．６代替え的な結合剤
本開示は、本明細書に開示される抗体と同じエピトープと特異的に結合する非免疫グロブリン結合剤を包含する。いくつかの実施形態では、非免疫グロブリン結合剤は、競合結合アッセイにおいて本開示の抗体を置き換える又は本開示の抗体によって置き換えられる剤として同定される。これらの代替結合剤は、例えば、当該技術分野において既知の操作されたタンパク質スカフォールドのいずれかを含み得る。そのようなスカフォールドとしては、例えば、リガンド結合部位を形成する４つの超可変ループを支持する剛性ベータバレルを特徴とするタンパク質構造である、リポカリンスカフォールドに基づく抗カリンが挙げられる。新規の結合特異性は、機能的ディスプレイ及び誘導選択（guided selection）と組み合わせて、ループ領域における標的ランダム突然変異誘発によって操作され得る（例えば、Ｓｋｅｒｒａ，２００８，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６７７－８３を参照されたい）。他の好適なスカフォールドとしては、例えば、ヒトフィブロネクチンＩＩＩの１０番目の細胞外ドメインに基づくアドネクチン又はモノボディ（例えば、Ｋｏｉｄｅ ａｎｄ Ｋｏｉｄｅ，２００７，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３５２：９５－１０９を参照されたい）；ブドウ球菌タンパク質ＡのＺドメインに基づくアフィボディ（例えば、Ｎｙｇｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００８，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６６８－７６を参照されたい）；アンキリン反復タンパク質に基づくＤＡＲＰｉｎ（例えば、Ｓｔｕｍｐｐ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １３：６９５－７０１を参照されたい）；ヒトＦｙｎタンパク質キナーゼのＳＨ３ドメインに基づくフィノマー（例えば、Ｇｒａｂｕｌｏｖｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８２：３１９６－２０４を参照されたい）；スルフォロブス・アシドラリウス（Sulfolobus acidolarius）のＳａｃ７ｄに基づくアフィチン（例えば、Ｋｒｅｈｅｎｂｒｉｎｋ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３８３：１０５８－６８を参照されたい）；ヒトｙ－Ｂ－クリスタリンに基づくアフィリン（例えば、Ｅｂｅｒｓｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３７２：１７２－８５を参照されたい）；膜受容体タンパク質のＡドメインに基づくアビマー（例えば、Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１５５６－６１を参照されたい）；システインリッチノッチンペプチド（例えば、Ｋｏｌｍａｒ，２００８，ＦＥＢＳ Ｊ．２７５：２６８４－９０を参照されたい）；及び操作されたクニッツ型阻害剤（例えば、Ｎｉｘｏｎ ａｎｄ Ｗｏｏｄ，２００６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ．Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖ．９：２６１－６８）を挙げることができる。概説については、例えば、Ｇｅｂａｕｅｒ ａｎｄ Ｓｋｅｒｒａ，２００９，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１３：２４５－５５を参照されたい。

【0290】

５．２．７抗体バリアント
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される、例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と結合する抗体又は抗原結合断片のアミノ酸配列修飾（複数可）が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性（特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、免疫原性の低下、又は溶解性を含むがこれらに限定されない）を改善することが望ましい場合がある。したがって、本明細書において記載される抗体に加えて、抗体バリアントも調製され得ることが企図される。例えば、抗体バリアントは、適切なヌクレオチド変化を、コードするＤＮＡに導入することによって、及び／又は所望の抗体又はポリペプチドを合成することによって調製することができる。当業者は、アミノ酸変化が、グリコシル化部位の数若しくは位置の変化、又は膜アンカー特性の変更など、抗体の翻訳後プロセス変更し得ることを理解する。

【0291】

いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗体は、例えば、任意のタイプの分子を抗体に共有結合させることによって、化学的に修飾される。抗体誘導体は、例えば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護（protecting/blocking）基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞のリガンド又は他のタンパク質への連結などにより化学的に修飾された抗体を含み得る。多数の化学的修飾のうちのいずれかは、特異的化学開裂、アセチル化、製剤化、ツニカマイシンの代謝的合成などを含むがこれらに限定されない、既知の技法により実行することができる。加えて、抗体は、１つ又は２つ以上の非古典的アミノ酸を含み得る。

【0292】

変異は、抗体又はポリペプチドをコードする１つ又は２つ以上のコドンの置換、欠失、又は挿入であって、天然配列の抗体又はポリペプチドと比較してアミノ酸配列の変化を結果としてもたらす、置換、欠失、又は挿入であり得る。アミノ酸置換は、ロイシンのセリンによる置き換え、例えば、保存的アミノ酸の置き換えなど、あるアミノ酸を類似の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸に置き換えた結果であり得る。当業者に知られている標準的な技術を使用して、例えば、部位特異的変異誘発及びアミノ酸置換をもたらすＰＣＲ媒介変異誘発を含む、本明細書において提供される分子をコードするヌクレオチド配列に変異を導入することができる。挿入又は欠失は、任意選択的に、約１～５のアミノ酸の範囲であり得る。特定の実施形態では、置換、欠失、又は挿入は、元の分子と比較して、２５未満のアミノ酸置換、２０未満のアミノ酸置換、１５未満のアミノ酸置換、１０未満のアミノ酸置換、５未満のアミノ酸置換、４未満のアミノ酸置換、３未満のアミノ酸置換、又は２未満のアミノ酸置換を含む。具体的な実施形態では、置換は、１つ又は２つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる保存的アミノ酸置換である。許容される変異は、配列内に、アミノ酸の挿入、欠失、又は置換を体系的に施し、結果として得られるバリアントを、全長天然配列又は成熟天然配列が呈する活性について調べることにより決定することができる。

【0293】

アミノ酸配列の挿入には、１つの残基から１００以上の残基を含むポリペプチドまでの長さのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。末端挿入の例としては、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が挙げられる。抗体分子の他の挿入バリアントは、抗体のＮ末端又はＣ末端の、酵素（例えば、抗体指向酵素によるプロドラッグ療法）又は抗体の血清半減期を延長するポリペプチドへの融合体を含む。

【0294】

「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、同様の電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるアミノ酸置換である。類似した電荷を持つ側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。代替的に、飽和変異誘発などにより、コード配列の全部又は一部に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた突然変異体の生物活性をスクリーニングして、活性を保持する突然変異体を同定することもできる。変異誘発の後、コードされたタンパク質を発現させ、タンパク質の活性を決定することができる。

【0295】

抗体の生物学的特性における実質的な修飾は、（ａ）置換領域内のポリペプチドの構造骨格、例えば、シート又はヘリックス立体構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷若しくは疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルク、の維持に対するそれらの効果が著明に異なる置換を選択することにより達成することができる。代替的に、保存的（例えば、同様な特性及び／又は側鎖による、アミノ酸群内の）置換は、特性を維持するか、又は特性を著明に変化させないように施すことができる。アミノ酸は、以下に挙げるその側鎖の特性の類似性に応じてグループ化することができる（例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ７３－７５（２ｄ ｅｄ．１９７５）参照）：（１）非極性：Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｍｅｔ（Ｍ）；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；（３）酸性：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；及び（４）塩基性：Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｈｉｓ（Ｈ）。

【0296】

代替的に、天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいてグループに分けられることもある：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖の向きに影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。

【0297】

非保存的置換は、これらのクラスのうちの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーと交換することを伴う。そのような置換残基はまた、保存的置換部位に、又は残りの（非保存的）部位に導入され得る。したがって、一実施形態では、ＣＤ２５エピトープと結合する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体、例えば、以下の第７節に記載される抗体のアミノ酸配列と少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＤ３９エピトープと結合する抗体又はその抗原結合断片は、本明細書に記載の抗体、例えば、以下の第７節に記載される抗体のアミノ酸配列と少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。

【0298】

変形は、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発など、当該技術分野で知られている方法を用いて行うことができる。部位特異的変異誘発（例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９８６，Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．２３７：１－７、及びＺｏｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１０：６４８７－５００を参照されたい）、カセット変異誘発（例えば、Ｗｅｌｌｓ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｇｅｎｅ ３４：３１５－２３を参照されたい）、又は他の公知の技術を、クローニングされたＤＮＡに対して実施して、抗ＣＤ２５及び／又は抗ＣＤ３９抗体バリアントＤＮＡを産生することができる。

【0299】

本明細書で提供される抗体の適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基も、分子の酸化安定性を改善し、異常な架橋を防ぐために、例えば、アラニン又はセリンなど別のアミノ酸で置換することもできる。逆に、システイン結合を抗体に付加して、その安定性を改善することができる（例えば、抗体がＦｖ断片などの抗体断片である場合）。

【0300】

いくつかの実施形態では、本開示の抗体分子は、「脱免疫化」抗体である。「脱免疫化」抗体は、ヒト化抗体又はキメラ抗体に由来する抗体であり、それぞれの元の脱免疫化されていない抗体と比較して、抗体の免疫原性の低減をもたらす、そのアミノ酸配列における１つ又は２つ以上の変化を有する。このような抗体変異体を生成するための手順の１つは、抗体分子のＴ細胞エピトープの同定及び除去を含む。第１の工程では、抗体分子の免疫原性は、当技術分野で即知のいくつかの方法、例えば、Ｔ細胞エピトープのインビトロ決定又はそのようなエピトープのインシリコ予測によって決定することができる。Ｔ細胞エピトープ機能に重要な残基が同定されたら、免疫原性を除去し、抗体活性を保持するために変異を加えることができる。総説については、例えば、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５２５：４０５－２３を参照されたい。

【0301】

５．２．８インビトロ親和性成熟
いくつかの実施形態では、親抗体と比較して、親和性、安定性、又は発現レベルなどの特性が改善された抗体バリアントは、インビトロ親和性成熟によって調製され得る。天然のプロトタイプと同様に、インビトロでの親和性成熟は、変異及び選択の原理に基づいている。抗体のライブラリは、生物（例えば、ファージ、細菌、酵母、又は哺乳動物細胞）の表面上に、又はそれらをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡと関連して（例えば、共有結合又は非共有結合で）表示される。ディスプレイされた抗体を親和性選択することで、その抗体をコードする遺伝情報を持つ生物又は複合体の単離が可能になる。ファージディスプレイなどのディスプレイ法を用いて、２～３回の変異と選択を繰り返すことで、通常、ナノモル台前半の親和性を持つ抗体断片が得られる。親和性成熟された抗体は、標的抗原に対してナノモル又はピコモルの親和性を有し得る。

【0302】

ファージディスプレイは、抗体の表示と選択のための広く普及した方法である。抗体は、Ｆｄ又はＭ１３バクテリオファージの表面に、バクテリオファージコートタンパク質への融合物として表示される。選択は、抗原にさらされて、ファージディスプレイされた抗体を、標的に結合させること、すなわち「パニング」と呼ばれるプロセスを伴う。抗原に結合したファージを回収し、細菌に感染させてファージを産生し、更に選択を繰り返すために使用する。総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００２，Ｍｅｔｈｏｄｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７８：１－３７；及びＢｒａｄｂｕｒｙ ａｎｄ Ｍａｒｋｓ，２００４，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２９０：２９－４９を参照されたい。

【0303】

酵母ディスプレイシステムでは（例えば、Ｂｏｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：５５３－５７、及びＣｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ １：７５５－６８）、抗体は、Ａｇａ１ｐとのジスルフィド結合を介して酵母細胞壁に付着する、酵母凝集素タンパク質Ａｇａ２ｐの接着サブユニットに融合され得る。Ａｇａ２ｐを介したタンパク質のディスプレイは、タンパク質を細胞表面から遠ざけ、酵母細胞壁上の他の分子との相互作用の可能性を最小限にする。磁気分離及びフローサイトメトリーを用いてライブラリをスクリーニングし、親和性又は安定性が改善された抗体を選択する。目的の可溶性抗原への結合は、ビオチン化抗原及びフルオロフォアに複合したストレプトアビジンなどの二次試薬で酵母を標識することによって決定される。抗体の表面発現の変形は、ｓｃＦｖに隣接する血球凝集素又はｃ－Ｍｙｃエピトープタグのいずれかを免疫蛍光標識することで測定できる。発現は、ディスプレイされたタンパク質の安定性と相関することが示されているため、抗体を選択して、安定性と親和性を改善することができる（例えば、Ｓｈｕｓｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：９４９－５６を参照されたい）。酵母ディスプレイの追加の利点は、ディスプレイされたタンパク質が真核生物の酵母細胞の小胞体で折り畳まれ、小胞体シャペロンと品質管理機構が利用されることである。成熟が完了すると、酵母の表面に表示されている間、抗体の親和性を便利に「滴定」することができ、各クローンの発現と精製の必要性がなくなる。酵母表面ディスプレイの理論的な限界は、他のディスプレイ方法に比べて機能的なライブラリのサイズが小さくなる可能性があることである。しかし、最近のアプローチでは、酵母細胞の交配系を利用して、１０^１４サイズと推定されるコンビナトリアル多様性を創出している（例えば、米国特許出願公開第２００３／０１８６３７４号、及びＢｌａｉｓｅ ｅｔ ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ ３４２：２１１－１８参照されたい）。

【0304】

リボソームディスプレイでは、抗体－リボソーム－ｍＲＮＡ（ＡＲＭ）の複合体を生成し、無細胞系で選択する。特定の抗体ライブラリをコードするＤＮＡライブラリは、終止コドンを欠くスペーサー配列と遺伝的に融合している。このスペーサー配列は、翻訳されてもペプチジルｔＲＮＡに付着したままリボソームトンネルを占めるため、目的のタンパク質がリボソームから突出して折り畳まれることになる。得られたｍＲＮＡ、リボソーム、及びタンパク質の複合体は、表面に結合したリガンドと結合し、リガンドとの親和性捕捉により、抗体とそれをコードするｍＲＮＡを同時に単離することができる。その後、リボソームに結合したｍＲＮＡを逆転写してｃＤＮＡに戻し、次いで変異誘発を受け、次回の選択に使用することができる（例えば、Ｆｕｋｕｄａ ｅｔ ａｌ．，２００６，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３４：ｅ１２７を参照されたい）。ｍＲＮＡディスプレイでは、ピューロマイシンをアダプタ分子として用いて、抗体とｍＲＮＡとの間に共有結合を形成する（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：３７５０－５５）。

【0305】

これらの方法は完全にインビトロで行われるため、他の選択技術に比べて主に２つの利点がある。最初に、ライブラリの多様性は、細菌細胞の形質転換効率によって制限されるのではなく、試験管内に存在するリボソーム及び異なるｍＲＮＡ分子の数によってのみ制限される。２番目に、各回の選択の後に、例えば、非プルーフリーディングポリメラーゼによって、ランダムな変異を容易に導入することができ、これは、多様性工程の後にライブラリを変換する必要がないためである。

【0306】

いくつかの実施形態では、哺乳動物のディスプレイシステムを使用することができる。

【0307】

多様性はまた、標的化された方法で、又はランダムな導入を介して、抗体ライブラリのＣＤＲに導入され得る。前者のアプローチには、高レベル又は低レベルの変異誘発を介して抗体の全てのＣＤＲを順次標的にすること、又は体細胞超変異の単離したホットスポット（例えば、Ｈｏ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：６０７－１７）、又は実験的根拠若しくは構造的理由から親和性に影響を与えると疑われる残基を標的にすることが含まれる。また、ＤＮＡシャッフリング又は同様の技術を介して、天然に多様性のある領域を置き換えることで、多様性を導入することもできる（例えば、Ｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４３４９６－５０７、米国特許第５，５６５，３３２号及び同第６，９８９，２５０号を参照されたい）。代替的な技術は、フレームワーク領域残基に伸長する超可変ループを標的とするか（例えば、Ｂｏｎｄ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３４８：６９９－７０９を参照されたい）、ＣＤＲにおけるループ欠失及び挿入を利用するか、又はハイブリダイゼーションに基づく多様化を使用する（例えば、米国特許公開第２００４／０００５７０９号を参照されたい）。ＣＤＲに多様性を生成する追加的な方法は、例えば、米国特許第７，９８５，８４０号に開示されている。抗体ライブラリ及び／又は抗体親和性成熟の生成に使用できる更なる方法は、例えば、米国特許第８，６８５，８９７号及び同第８，６０３，９３０号、並びに米国特許出願公開第２０１４／０１７０７０５号、同第２０１４／００９４３９２号、同第２０１２／００２８３０１号、同第２０１１／０１８３８５５号、及び同第２００９／００７５３７８号に開示されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。

【0308】

ライブラリのスクリーニングは、当該技術分野で知られている様々な技術によって達成することができる。例えば、抗体を、固体支持体、カラム、ピン、若しくはセルロース／ポリ（フッ化ビニリデン）膜／他のフィルターに固定化し、吸着プレートに固定される若しくは細胞選別で使用される宿主細胞に発現させる、又はストレプトアビジンでコーティングされたビーズで捕捉のためにビオチンに複合させる、又はディスプレイライブラリをパニングするための任意の他の方法で使用することができる。

【0309】

インビトロでの親和性成熟法の総説については、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，２００５，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３：１１０５－１６、Ｑｕｉｒｏｚ ａｎｄ Ｓｉｎｃｌａｉｒ，２０１０，Ｒｅｖｉｓｔａ Ｉｎｇｅｎｅｒｉａ Ｂｉｏｍｅｄｉａ ４：３９－５１、及びその中の参考文献を参照されたい。

【0310】

５．２．９抗体修飾
本明細書で提供される、例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と結合する抗体の共有結合修飾は、本開示の範囲内に含まれる。共有結合修飾には、抗体の標的アミノ酸残基を、抗体の選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤と反応させることが含まれる。他の修飾としては、グルタミニル及びアスパラギニル残基のそれぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ７９－８６（１９８３）を参照されたい）、Ｎ末端アミンのアセチル化、並びにＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。

【0311】

本開示の範囲に含まれる本明細書で提供される抗体の他の種類の共有結合修飾には、抗体又はポリペプチドのネイティブなグリコシル化パターンを変更すること（例えば、Ｂｅｃｋ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：４８２－５０１、及びＷａｌｓｈ，２０１０，Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ １５：７７３－８０を参照されたい）、及び、抗体を様々な非タンパク質ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうちの１つに、例えば、米国特許第４，６４０，８３５号、同第４，４９６，６８９号、同第４，３０１，１４４号、同第４，６７０，４１７号、同第４，７９１，１９２号、又は同第４，１７９，３３７号に記載されている方法で連結することが含まれる。

【0312】

本開示の抗体はまた、別の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列、例えば、エピトープタグと融合された抗体を含むキメラ分子を形成するように修飾され得る（例えば、Ｔｅｒｐｅ，２００３，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６０：５２３－３３を参照されたい）、又はＩｇＧ分子のＦｃ領域（例えば、Ａｒｕｆｆｏ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｆｕｓｉｏｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ２２１－４２（Ｃｈａｍｏｗ ａｎｄ Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｄｓ．，１９９９）を参照されたい）と融合したｐＩｇＲと結合する一本鎖抗体を含むキメラ分子を形成するように修飾され得る。

【0313】

例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と結合する本明細書で提供される抗体、及び異種ポリペプチドとを含む融合タンパク質も本明細書で提供される。

【0314】

また、本明細書で提供されるのは、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９抗原と結合する抗体のパネルである。特定の実施形態では、抗体のパネルは、異なる結合速度、異なる解離速度、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９抗原に対する異なる親和性、並びに／又はＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９抗原に対する異なる特異性を有する。いくつかの実施形態では、パネルは、約１０個、約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１２５個、約１５０個、約１７５個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、又は約１０００個以上の抗体を含むか、又はそれからなる。抗体のパネルは、ＥＬＩＳＡなどのアッセイに例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレートで使用することができる。

【0315】

５．２．１０免疫複合体
本開示はまた、合成リンカーによって１つ又は２つ以上の非抗体剤と共有結合された本開示の抗体のいずれか１つを含む複合体を提供する。

【0316】

いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体は、例えば、治療剤（例えば、細胞傷害性剤）、又は診断用も若しくは検出可能な分子と複合されるか、又は組換えにより融合される。複合抗体又は組換え融合抗体は、例えば、疾患若しくは障害の治療又は予防に有用であり得る。複合抗体又は組換え融合抗体は、例えば、疾患若しくは障害の発症、発達、進行、及び／又は重症度の監視あるいは予後のために有用であり得る。

【0317】

このような診断及び検出は、例えば、抗体を検出可能な物質にカップリングさせることにより達成することができ、限定されないが、様々な酵素、例えば、限定されないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼ；補欠分子族、例えば、限定されないが、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチン；蛍光物質、例えば、限定されないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド、又はフィコエリスリン；発光物質、例えば、限定されないが、ルミノール；生体発光物質、例えば、限定されないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、又はエクオリン；化学発光物質、例えば、限定されないが、アクリジニウム系化合物又はＨＡＬＯＴＡＧ；放射性物質、例えば、限定されないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、及び１２１Ｉ，）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、及び１１１Ｉｎ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ及び６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８５Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、又は１１７Ｓｎ；種々の陽電子放出断層撮影を使用する陽電子放出金属；及び非放射性常磁性金属イオンが含まれる。

【0318】

また、本明細書で提供されるのは、異種タンパク質又はポリペプチド（又はその断片、例えば、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、又は約１００アミノ酸のポリペプチド）と組換えにより融合又は化学的に複合（共有結合又は非共有結合）して融合タンパク質を生成する抗体、及びその使用である。特に、本明細書で提供されるのは、本明細書で提供される抗体の抗原結合断片（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及び／又はＣＤＲ３）と、異種タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドと、を含む融合タンパク質である。一実施形態では、抗体が融合される異種タンパク質、ポリペプチド、又はペプチドは、抗体を特定の細胞型に標的化するのに有用である。

【0319】

更に、本明細書で提供される抗体は、精製を容易にするために、ペプチドなどのマーカー又は「タグ」配列と融合させることができる。具体的な実施形態では、マーカー又はタグのアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥベクター（例えば、ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．を参照）に提供されているタグなどのヘキサヒスチジンペプチドであり、その多くが市販されている。例えば、Ｇｅｎｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８２１－２４に記載されているように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の都合のよい精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグとしては、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する血球凝集素（「ＨＡ」）タグ（Ｗｉｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｃｅｌｌ ３７：７６７－７８）、及び「ＦＬＡＧ」タグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0320】

部位（ポリペプチドを含む）を抗体に融合又は複合させる方法が知られている（例えば、Ａｒｎｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｄｒｕｇｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ２４３－５６（Ｒｅｉｓｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｉｎ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ６２３－５３（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，２ｄ ｅｄ．１９８７）；Ｔｈｏｒｐｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｏｆ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ａｇｅｎｔｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｒｅｖｉｅｗ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ａｎｄ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ４７５－５０６（Ｐｉｎｃｈｅｒａ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ Ｆｕｔｕｒｅ Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｕｓｅ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｉｎ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ Ｃａｎｃｅｒ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ ３０３－１６（Ｂａｌｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｈｏｒｐｅ ｅｔ ａｌ．，１９８２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２：１１９－５８；米国特許第５，３３６，６０３号、同第５，６２２，９２９号、同第５，３５９，０４６号、同第５，３４９，０５３号、同第５，４４７，８５１号、同第５，７２３，１２５号、同第５，７８３，１８１号、同第５，９０８，６２６号、同第５，８４４，０９５号、及び同第５，１１２，９４６号、欧州特許第３０７，４３４号、欧州特許第３６７，１６６号、欧州特許第３９４，８２７号、国際公開第９１／０６５７０号、同第９６／０４３８８号、同第９６／２２０２４号、同第９７／３４６３１号、及び同第９９／０４８１３号、Ａｓｈｋｅｎａｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５－３９、Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３１：８４－８６、Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：５５９０－６００、並びにＶｉｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１１３３７－４１を参照されたい）。

【0321】

融合タンパク質は、例えば、遺伝子シャッフリング、モチーフシャッフリング、エクソンシャッフリング、及び／又はコドンシャッフリング（総称して「ＤＮＡシャッフリング」と呼ばれる）の手法で生成され得る。ＤＮＡシャッフリングを使用して、例えば、より高い親和性及びより低い解離速度を有する抗体を含む、本明細書で提供される抗体の活性を変更することができる（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、及び同第５，８３７，４５８号、Ｐａｔｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：７２４－３３、Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６（２）：７６－８２、Ｈａｎｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８７：２６５－７６、及びＬｏｒｅｎｚｏ ａｎｄ Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２４（２）：３０８－１３を参照されたい）。抗体、又はコードされた抗体は、組換えの前に、エラープローンＰＣＲ、ランダムヌクレオチド挿入又は他の方法によるランダム変異誘発を受けることによって変更され得る。本明細書で提供される抗体をコードするポリヌクレオチドは、１つ又は２つ以上の異種分子の１つ又は２つ以上のコンポーネント、モチーフ、セクション、パート、ドメイン、断片などと組換えられ得る。

【0322】

本明細書で提供される抗体は、例えば、米国特許第４，６７６，９８０号に記載されているように、二次抗体と複合して抗体ヘテロ結合体を形成することもできる。

【0323】

本明細書で提供される抗体は、固体支持体に付着させることもでき、これは、標的抗原のイムノアッセイ又は精製に特に有用である。このような固体支持体としては、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、又はポリプロピレンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0324】

リンカーは、細胞内での複合薬剤の放出を促進する「切断性リンカー」であり得るが、非切断性リンカーも本明細書において企図される。本開示の複合体に使用するリンカーとしては、限定されないが、酸不安定性リンカー（例えば、ヒドラゾンリンカー）、ジスルフィド含有リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー（（例えば、アミノ酸、例えば、バリン及び／又はシトルリン、例えば、シトルリン－バリン又はフェニルアラニン－リジンを含むペプチドリンカー）、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー（例えば、Ｃｈａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５２：１２７－３１、及び米国特許第５，２０８，０２０号を参照されたい）、チオエーテルリンカー、又は多剤輸送体を介した耐性を回避するように設計された親水性リンカー（例えば、Ｋｏｖｔｕｎ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７０：２５２８－３７を参照されたい）が挙げられる。

【0325】

抗体及び薬剤の複合体は、ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ－ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホ－ＥＭＣＳ、スルホ－ＧＭＢＳ、スルホ－ＫＭＵＳ、スルホ－ＭＢＳ、スルホ－ＳＩＡＢ、スルホ－ＳＭＣＣ、スルホ－ＳＭＰＢ、及びＳＶＳＢ（スクシンイミジル－（４－ビニルスルホン）ベンゾエート）などの様々な二官能性タンパク質カップリング剤を用いて作製することができる。本開示は更に、抗体及び薬剤の複合体が、当該技術分野で開示されている任意の適切な方法を用いて調製され得ることを企図している（例えば、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ ｅｄ．，２ｄ ｅｄ．２００８）を参照）。

【0326】

抗体及び薬剤の従来のコンジュゲーションストラテジーは、Ｌｙｓ残基のε－アミノ又はＣｙｓ残基のチオール基を伴うランダムなコンジュゲーション化学に基づいており、その結果、不均一な複合体が生じていた。最近開発された技術により、抗体への部位特異的コンジュゲーションが可能になり、結果として、均一な充填量を実現し、抗原結合又は薬物動態が変化した複合体亜集団を回避することができる。これらには、反応性チオール基を提供し、また免疫グロブリンの折り畳み及び組み立てを阻害せず、又は抗原結合を変化させない、重鎖及び軽鎖上の位置でのシステイン置換を含む「チオマブ」の操作が挙げられる（例えば、Ｊｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．３３２：４１－５２；及びＪｕｎｕｔｕｌａ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２６：９２５－３２を参照されたい）。別の方法では、終止コドンＵＧＡを終結からセレノシステイン挿入に再コードすることにより、セレノシステインを抗体配列に共翻訳的に挿入し、他の天然アミノ酸の存在下でセレノシステインの求核性セレノール基での部位特異的な共有結合的複合を可能にする（例えば、Ｈｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０５：１２４５１－５６；及びＨｏｆｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４８（５０）：１２０４７－５７を参照されたい）。

【0327】

５．３．ポリヌクレオチド
特定の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の抗体をコードするポリヌクレオチドを包含する。「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語は、ポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド、並びに追加のコード配列及び／又は非コード配列を含むポリヌクレオチドを包含する。本開示のポリヌクレオチドは、ＲＮＡの形態又はＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡには、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが挙げられ、これは、二本鎖又は一本鎖であり得、一本鎖の場合は、コード鎖又は非コード（アンチセンス）鎖であり得る。

【0328】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、例えば、宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を補助するポリヌクレオチド（例えば、ポリペプチドの輸送を制御するための分泌配列として機能するリーダー配列）と同じ読み枠で融合した、ポリペプチドのコード配列を含む。ポリペプチドは、「成熟」型のポリペプチドを形成させるために宿主細胞によって切断されるリーダー配列を有することができる。

【0329】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、マーカー又はタグ配列と同じ読み枠で融合した、ポリペプチドのコード配列を含む。例えば、いくつかの実施形態では、細菌宿主の場合、マーカー配列は、マーカーと融合したポリペプチドの効率的精製を可能にするベクターによって供給されるヘキサヒスチジンタグである。いくつかの実施形態では、マーカーは、他の親和性タグと併せて使用される。

【0330】

本開示は更に、本明細書に記載されたポリヌクレオチドのバリアントに関し、バリアントは、例えば、断片、類似体、及び／又は誘導体をコードする。特定の実施形態では、本開示は、抗体又はその抗原結合断片を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、及びいくつかの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％又は９９％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチドを提供する。

【0331】

本明細書で使用するとき、「参照ヌクレオチド配列と少なくとも、例えば９５％「同一」のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という語句は、ポリヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドごとに最大５個の点変異を含み得ることを除いて、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることを意味することを意図している。言い換えれば、参照ヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るためには、参照配列のヌクレオチドのうち最大５％が、欠失若しくは別のヌクレオチドで置換され得るか、又は参照配列の全ヌクレオチドのうち最大５％の数のヌクレオチドが、参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’又は３’の末端位置、又はそれらの末端位置の間の任意の場所で起こり得、参照配列のヌクレオチド間で個別に、又は参照配列内の１つ又は２つ以上の隣接グループで散在する。

【0332】

ポリヌクレオチドバリアントは、コード領域、非コード領域、又はその両方に変化を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、サイレント置換、付加、又は欠失をもたらす変化を含むが、コードされたポリペプチドの特性又は活性を変化させない。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、（遺伝子コードの縮重により）ポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらさないサイレント置換を含む。ポリヌクレオチドバリアントは、様々な理由のため、例えば、特定の宿主に対するコドン発現を最適化するため（すなわち、ヒトのｍＲＮＡのコドンを大腸菌などの細菌宿主が好むものに変更する）、産生することができる。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、配列の非コード領域又はコード領域における少なくとも１つのサイレント変異を含む。

【0333】

いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現（又は発現レベル）を調節又は変更するために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を増加させるために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、コードされたポリペプチドの発現を減少させるために産生される。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が増加している。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドバリアントは、親ポリヌクレオチド配列と比較して、コードされたポリペプチドの発現が減少している。

【0334】

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される配列表に列挙されるポリヌクレオチドと少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、いくつかの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0335】

特定の実施形態では、本開示は、本明細書で提供されるポリヌクレオチドから選択されるポリヌクレオチドと少なくとも約８０％同一、少なくとも約８５％同一、少なくとも約９０％同一、少なくとも約９５％同一、いくつかの実施形態では、少なくとも約９６％、９７％、９８％、又は９９％同一のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

【0336】

特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、単離される。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、実質的に純粋である。

【0337】

本明細書に記載のポリヌクレオチドを含むベクター及び細胞も提供される。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、発現ベクターは、ポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む１つ又は２つ以上の発現ベクターを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ポリヌクレオチド分子を含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、１つ又は２つ以上のポリヌクレオチド分子を含む。

【0338】

５．４．抗体を作製する方法又はプロセス
更に別の態様では、本明細書で提供される様々な分子を作製するための方法又はプロセスが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるのは、１つを超える標的分子と結合する分子を作製するためのプロセスであって、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第１の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第２の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、第１の抗原及び第２の抗原と結合することができる分子を提供する機能を実行する工程と、を含む、プロセスである。

【0339】

本明細書で提供される抗体の組換え発現には、抗体又はその抗原結合断片をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築が必要である。本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、又はそれらの断片（必ずしもではないが、重鎖及び／又は軽鎖可変ドメインを含むなど）をコードするポリヌクレオチドが取得され、抗体分子を産生するためのベクターは、当技術分野で周知の技術を使用する組換えＤＮＡ技術によって産生され得る。したがって、抗体をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを発現することによりタンパク質を調製するための方法が、本明細書において記載される。当業者に周知である方法を使用して、抗体コード配列並びに適切な転写及び翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法としては、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及びインビボ遺伝的組換えが挙げられる。プロモーターと作動可能に連結された、本明細書で提供される抗体分子、抗体の重鎖若しくは軽鎖、抗体若しくはその断片の重鎖若しくは軽鎖可変ドメイン、又は重鎖若しくは軽鎖ＣＤＲをコードするヌクレオチド配列を含む複製可能なベクターも提供される。これらのベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み得（例えば、国際公開第８６／０５８０７号及び国際公開第８９／０１０３６号、並びに米国特許第５，１２２，４６４号を参照されたい）、抗体の可変ドメインは、重鎖全体、軽鎖全体、又は重鎖及び軽鎖両方の全体の発現のために、そのようなベクターにクローニングされ得る。

【0340】

発現ベクターは、従来の技術により宿主細胞に移入され、次いで、トランスフェクションされた細胞は、従来の技術により培養されて、本明細書において提供される抗体を産生する。したがって、異種プロモーターと作動可能に連結された、本明細書で提供される抗体若しくはその断片、又はその重鎖若しくは軽鎖又はその断片、あるいは本明細書で提供される単鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞も本明細書で提供される。二本鎖抗体を発現させるための特定の実施形態では、下記で詳述される通り、免疫グロブリン分子全体の発現のために、重鎖及び軽鎖の両方をコードするベクターが、宿主細胞内で共発現され得る。

【0341】

本明細書で提供される融合タンパク質を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系が利用され得る（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号を参照されたい）。そのような宿主発現系は、目的のコード配列が産生され、続いて精製され得るビヒクルを表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換又はトランスフェクションされた場合に、本明細書において提供される抗体分子をインサイチュで発現し得る細胞も表す。これらは、限定されないが、例えば、微生物、例えば、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ発現ベクター、プラスミドＤＮＡ発現ベクター、又はコスミドＤＮＡ発現ベクターにより形質転換した細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．Ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ Ｐｉｃｈｉａ）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ、タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）を感染させるか、又は抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）により形質転換した植物細胞系；又は、哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）若しくは哺乳動物ウイルス由来のプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を含む組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０、及び３Ｔ３細胞）が含まれる。特に組換え抗体分子全体の発現には、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉなどの細菌細胞、又は真核細胞を、組換え抗体分子の発現に使用することができる。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要中間初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと併用することで、抗体の効果的な発現系となる（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８６，Ｇｅｎｅ ４５：１０１；及びＣｏｃｋｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ８：２）。いくつかの実施形態では、本明細書において提供される抗体は、ＣＨＯ細胞内で産生される。特定の実施形態では、ＣＤ２５抗原と免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターによって調節される。特定の実施形態では、ＣＤ３９抗原と免疫特異的に結合する、本明細書で提供される抗体をコードするヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、又は組織特異的プロモーターによって調節される。

【0342】

細菌系では、発現させる抗体分子の意図する用途に応じて、多くの発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、そのような抗体を大量に産生する場合、抗体分子の医薬組成物を生成するために、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターとしては、融合タンパク質が産生されるように、抗体コード配列がｌａｃ Ｚコード領域と、インフレームで、個別に、ベクターへとライゲーションされ得るＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ １２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ ＆ Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３：３１０１－３１０９；Ｖａｎ Ｈｅｅｋｅ ＆ Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３－５５０９）；などが挙げられるが、これに限定されるものではない。ｐＧＥＸベクターは、グルタチオン５－トランスフェラーゼ（glutathione 5-transferase、ＧＳＴ）との融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるためにも使用され得る。概ね、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオンアガロースビーズに吸着及び結合した後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部分から放出され得るように、トロンビン又は第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。

【0343】

昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が用いられる。ウイルスは、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞内で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれ得る。

【0344】

哺乳動物の宿主細胞では、多くのウイルスベースの発現系が利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列が、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーター及び三連リーダー配列とライゲーションされ得る。次いで、インビトロ又はインビボにおける組換えにより、このキメラ遺伝子は、アデノウイルスゲノム内に挿入され得る。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１又はＥ３）への挿入により、感染した宿主において生存可能であり、抗体分子を発現できる組換えウイルスが生じるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ ＆ Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８ １：３５５－３５９）。また、挿入された抗体コード配列を効率的に翻訳するためには、特定の開始シグナルが必要となる場合がある。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンと隣接する配列が含まれる。更に、挿入全体の翻訳を確実にするためには、開始コドンが所望のコード配列のリーディングフレームと一致している必要がある。これらの外因性の翻訳制御シグナル及び開始コドンは、天然及び合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを組み入れることにより、増強され得る（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４を参照されたい）。

【0345】

更に、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望の特定の方法で遺伝子産物を修飾及び処理する宿主細胞株を選択することもできる。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）及び処理（例えば、切断）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質及び遺伝子産物の翻訳後の処理及び修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株又は宿主系を選択することで、発現した外来タンパク質を正しく修飾及び処理することができる。この目的で、一次転写物の適切な処理、グリコシル化、及び遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核性宿主細胞が、使用され得る。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２Ｏ及びＴ４７Ｄ、ＮＳ０（内因性では免疫グロブリン鎖を全く産生しないマウス骨髄腫細胞株）、ＣＲＬ７Ｏ３Ｏ及びＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されるものではない。本明細書において提供される完全ヒトモノクローナル抗体は、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞内で産生される。

【0346】

組換えタンパク質を長期間、高収率で産生するためには、安定した発現を利用することができる。例えば、抗体分子を安定的に発現する細胞株が操作され得る。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、適切な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）及び選択可能マーカーによって制御されるＤＮＡで、宿主細胞を形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後に、操作された細胞は、富化培地中で１～２日間増殖させられ得、次いで、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドの選択マーカーは、選択に耐性を付与し、細胞が、染色体中にプラスミドを安定に組み込み、増殖して増殖巣を形成することを可能にし、次にこの増殖巣は、クローン化して細胞株に増殖することができる。この方法は、抗体分子を発現する細胞株を操作するために有利に使用され得る。そのような操作された細胞株は、抗体分子と直接的又は間接的に相互作用する組成物のスクリーニング及び評価に特に有用であり得る。

【0347】

多数の選択システムを使用することができ、これには、限定されないが、単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９７７，Ｃｅｌｌ １１：２２３）、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ ＆ Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ４８：２０２）、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：８－１７）が含まれ、遺伝子は、それぞれｔｋ－、ｈｇｐｒｔ－、又はａｐｒｔ－細胞で使用することができる。また、代謝拮抗剤耐性も、以下の遺伝子の選択基準として使用され得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７７：３５７；Ｏ’Ｈａｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１５２７）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂｅｒｇ，１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：２０７２）；アミノグリコシドＧ－４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２；及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７；１９９３，ＴＩＢ ＴＥＣＨ １１（５）：ｌ５５－２ １５）；及びハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｇｅｎｅ ３０：１４７）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に知られている方法を、規定通りに適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法については、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；及びＣｈａｐｔｅｒｓ １２ ａｎｄ １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ，ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ－Ｇａｒａｐｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５０：１に記載されている。

【0348】

抗体分子の発現レベルは、ベクターの増幅により増大させることができる（総説については、Ｂｅｂｂｉｎｇｔｏｎ ａｎｄ Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ ｕｓｅ ｏｆ ｖｅｃｔｏｒｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｇｅｎｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｌｏｎｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）を参照のこと）。抗体を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルが上がると、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅された領域は抗体遺伝子と関連しているため、抗体の産生も増加する（Ｃｒｏｕｓｅ ｅｔ ａｌ．，１９８３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２５７）。

【0349】

宿主細胞は、本明細書で提供される２つ又はそれ以上の発現ベクターで共トランスフェクトされ得る。２つ又はそれ以上のベクターは、例えば、重鎖及び軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。代替的に、本発明の抗体の異なる成分ポリペプチド、例えば、重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドの両方をコードし、発現することができる単一のベクターを使用することができる。コード配列は、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡを含み得る。

【0350】

本明細書において提供される抗体分子が、組換え発現により産生されると、これは、免疫グロブリン分子を精製するための当該技術分野で既知である任意の方法、例えば、クロマトグラフィ（例えば、イオン交換クロマトグラフィ、親和性クロマトグラフィ、特に、プロテインＡクロマトグラフィの後における特異的抗原についての親和性クロマトグラフィ、及びサイズ除外カラムクロマトグラフィ）、遠心分離、示差的可溶性によって、又はタンパク質を精製するための他の任意の標準的な技法によって、精製され得る。更に、本明細書において提供される抗体は、精製を促進するために、本明細書に記載されているか、又は他の技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に融合させることができる。

【0351】

５．５．医薬組成物
一態様では、本開示は、本開示の少なくとも１つの抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物を更に提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、治療有効量の本明細書において提供される抗体又はその抗原結合断片と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む。別の態様では、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメイン、及び（ｂ）第２の標的と結合する第２の結合ドメインと、医薬的に許容される担体と、を含む含む、医薬組成物が本明細書で提供される。本明細書で提供される多重特異性抗体のいずれも、医薬組成物において企図される。特定の実施形態では、第２の結合ドメインは、ＣＤ３９と結合する。本明細書で提供される抗体のいずれも、医薬組成物において企図される。

【0352】

別の一般的な態様では、本明細書で提供される多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体と、医薬的に許容される担体とを含む医薬組成物が提供される。特定の実施形態では、多重特異性ＣＤ２５／ＣＤ３９抗体は、単離される。また、医薬組成物を製造する方法が提供され、方法は、多重特異性抗体を医薬的に許容される担体と組み合わせて、医薬組成物を得ることを含む。別の態様では、（ａ）ＣＤ２５と結合する第１の結合ドメイン、及び（ｂ）ＣＤ３９と結合する第２の結合ドメインと、医薬的に許容される担体と、を含む含む、医薬組成物が本明細書で提供される。本明細書で提供される多重特異性抗体のいずれも、医薬組成物において企図される。

【0353】

抗体又はその抗原結合断片を含む医薬組成物は、所望の純度を有するタンパク質を、水溶液又は凍結乾燥若しくは他の乾燥形態の任意の生理学的に許容される賦形剤（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１８ｔｈ ｅｄ．１９８０）を参照されたい）と混合することによって保存用に調製される。

【0354】

本開示の抗体又はその抗原結合断片は、標的細胞／組織への送達に任意の好適な形態で、例えば、マイクロカプセル又はマクロエマルジョンとして（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、上記；Ｐａｒｋ ｅｔ ａｌ．，２００５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １０：１４６－６１、Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ．Ｄｅｌｉｖ．４：１４１－５１）、徐放性製剤として（（Ｐｕｔｎｅｙ ａｎｄ Ｂｕｒｋｅ，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：１５３－５７）、又はリポソームで（Ｍａｃｌｅａｎら，１９９７，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．１１：３２５－３２；Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，２００６，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．８：３９－４５）製剤化することができる。

【0355】

また、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、それぞれ、例えばコアセルベーション法によって、又は界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えばヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ－（メチルメタクリレート）マイクロカプセル内に、コロイド状薬剤送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセルなど）中、又はマクロエマルジョン中に封入することができる。そのような技術は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ（上記）に開示されている。

【0356】

様々な組成物及び送達系が知られており、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片とともに使用することができ、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、抗体又はその抗原結合断片を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－３２）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などが含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、組成物は、制御放出又は徐放系として提供され得る。一実施形態では、制御放出又は徐放を達成するために、ポンプが使用され得る（例えば、Ｌａｎｇｅｒ，上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１－４０、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７－１６、及びＳａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５６９－７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書に記載の抗体又はその抗原結合断片）、又は本明細書で提供される組成物の制御放出若しくは徐放を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ（Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ，ｅｄｓ．，１９７４）；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ ｅｄｓ．，１９８４）；Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１－１２６、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０－９２、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１－５６、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５－１２、米国特許第５，６７９，３７７号、同第５，９１６，５９７号、同第５，９１２，０１５号、同第５，９８９，４６３号、及び同第５，１２８，３２６号、国際公開第９９／１５１５４号及び同第９９／２０２５３号を参照されたい）。徐放性製剤に用いられるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、徐放性製剤中で使用されるポリマーは、不活性で、浸出性不純物を含まず、保存時に安定で、無菌で、生分解性である。

【0357】

更に別の実施形態では、制御放出系又は徐放系を特定の標的組織、例えば、鼻腔又は肺に近接して配置することができ、その結果、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｖｏｌ．２，１１５－３８（１９８４）を参照されたい）。制御放出系については、例えば、Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－３３により議論されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、本明細書に記載の１つ又は２つ以上の抗体又はその抗原結合断片を含む徐放製剤を製造することができる（例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際公開第９１／０５５４８号及び同第９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－８９、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，ＰＤＡ Ｊ．ｏｆ Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．＆ Ｔｅｃｈ．５０：３７２－９７、Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－５４、並びにＬａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９－６０を参照されたい）。

【0358】

５．６．使用方法
更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇する方法であって、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９を発現する細胞を含む試料を提供することと、試料を多重特異性抗体と接触させることと、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現し、かつ多重特異性抗体と結合する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇することと、を含み、多重特異性抗体が、ＣＤ２５と結合することができる第１の結合ドメインと、ＣＤ３９と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む、方法である。いくつかの実施形態では、細胞は、Ｔｒｅｇ細胞である。いくつかの実施形態では、試料は、血液試料である。別の実施形態では、試料は、組織試料である。

【0359】

更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、Ｔｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を本明細書で提供される多重特異性抗体と接触させることを含む、方法である。

【0360】

更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を本明細書で提供される多重特異性抗体と接触させることを含む、方法である。

【0361】

更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、がんを有する対象におけるがん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、本明細書で提供される多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法である。

【0362】

更に別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象においてがんを治療する方法であって、本明細書で提供される多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法である。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍がんである。他の実施形態では、がんは、血液がんである。

【0363】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患又は障害を治療する方法であって、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を対象に投与することを含む、方法である。

【0364】

また、本明細書で提供されるのは、疾患又は障害を治療する方法であって、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片と組み合わせて１つ又は２つ以上の治療剤を対象に投与する、方法である。

【0365】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象における疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片の使用である。

【0366】

別の態様では、本明細書で提供されるのは、対象における疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における、本明細書で提供される医薬組成物の使用である。

【0367】

特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患若しくは状態の予防及び／又は治療に使用するための組成物であり、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患又は状態の予防に使用するための組成物であり、組成物は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患又は状態の治療に使用するための組成物であり、組成物は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、対象は、その治療を必要としている対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有するリスクにある。いくつかの実施形態では、投与は、疾患又は状態の予防、管理、治療又は寛解をもたらす。

【0368】

一実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患若しくは状態の症状の予防及び／又は治療に使用するための組成物であり、組成物は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患又は状態の症状の予防に使用するための組成物であり、組成物は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、疾患又は状態の症状の治療に使用するための組成物であり、組成物は、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を含む。特定の実施形態では、対象は、その治療を必要としている対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有するリスクにある。いくつかの実施形態では、投与は、疾患又は状態の症状の予防又は治療をもたらす。

【0369】

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患若しくは状態を予防及び／又は治療する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患又は状態を予防する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患又は状態を治療する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、その治療を必要としている対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有するリスクにある。いくつかの実施形態では、投与は、疾患又は状態の予防又は治療をもたらす。

【0370】

別の実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患若しくは状態の症状を予防及び／又は治療する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患又は状態の症状を予防する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。一実施形態では、本明細書で提供されるのは、対象において疾患又は状態の症状を治療する方法であり、有効量の本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与することを含む。特定の実施形態では、対象は、その治療を必要としている対象である。いくつかの実施形態では、対象は、疾患又は状態を有する。他の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有するリスクにある。いくつかの実施形態では、投与は、疾患又は状態の症状の予防又は治療をもたらす。

【0371】

また、本明細書で提供されるのは、有効量の本明細書に提供される抗体若しくはその抗原結合断片、又は本明細書に提供される抗体若しくはその抗原結合断片を含む医薬組成物を、対象に投与することによって、疾患若しくは状態を予防及び／又は治療する方法である。一態様では、抗体又はその抗原結合断片は、実質的に精製されている（すなわち、その効果を制限するか、又は望ましくない副作用を生じさせる物質を実質的に含まない）。治療を施される対象は、非霊長類又は霊長類（例えば、ヒト）などの哺乳動物であり得る。一実施形態では、対象は、ヒトである。別の実施形態では、対象は、疾患又は状態を有するヒトである。

【0372】

様々な送達系が知られており、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片）を投与するために使用することができ、リポソーム、微粒子、マイクロカプセルへのカプセル化、抗体又はその抗原結合断片を発現することができる組換え細胞、受容体媒介エンドサイトーシス（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２（１９８７）を参照されたい）、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築などが含まれるが、これらに限定されない。予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片）、又は医薬組成物を投与する方法は、非経口投与（例えば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、及び皮下）、硬膜外及び粘膜（例えば、鼻腔内及び経口経路）が含まれるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片）、又は医薬組成物は、鼻腔内、筋肉内、静脈内、又は皮下に投与される。予防剤若しくは治療剤、又は組成物は、任意の好都合な経路、例えば、注入又はボーラス注射により、上皮又は皮膚粘膜内壁（例えば、口腔粘膜、鼻腔粘膜、直腸粘膜、及び腸粘膜など）を介する吸収により、投与され得、他の生物学的活性剤とともに投与され得る。投与は、全身性又は局所的であり得る。加えて、例えば、吸入器又は噴霧器、及びエアゾール化剤を伴う製剤の使用による肺内投与を採用することもできる。例えば、各々が参照によりそれらの全体で本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０１９，９６８号、同第５，９８５，３２０号、同第５，９８５，３０９号、同第５，９３４，２７２号、同第５，８７４，０６４号、同第５，８５５，９１３号、同第５，２９０，５４０号、及び同第４，８８０，０７８号、及び国際公開第９２／１９２４４号、同第９７／３２５７２号、同第９７／４４０１３号、同第９８／３１３４６号、及び同第９９／６６９０３号を参照されたい。

【0373】

具体的な実施形態では、本明細書において提供される予防剤若しくは治療剤、又は医薬組成物を、治療を必要とする領域に局所投与することが望ましい場合がある。これは、例えば、限定を目的とするものではないが、局所注入により、局所投与により（例えば、鼻内噴霧により）、注射により、又はインプラントを用いて達成され得、当該インプラントは、シラスティック膜などの膜又は繊維を含む、多孔性材料、非多孔性材料、又はゼラチン性材料である。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を投与する場合、抗体又はその抗原結合断片が吸着しない材料を使用するように注意しなければならない。

【0374】

別の実施形態では、本明細書で提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物は、ベシクル、特に、リポソームで送達され得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３、Ｔｒｅａｔ，ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，ｉｂｉｄ．，ｐｐ．３１７－３２７を参照されたい；同書を全般的に参照されたい）。

【0375】

別の実施形態では、本明細書において提供される予防剤若しくは治療剤、又は組成物は、制御放出系又は徐放系で送達されることができる。一実施形態では、ポンプが、制御放出又は徐放を達成するために使用され得る（Ｌａｎｇｅｒ、上記；Ｓｅｆｔｏｎ，１９８７，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８０，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４を参照されたい）。別の実施形態では、ポリマー材料を使用して、予防剤若しくは治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体）、又は本明細書で提供される組成物の制御放出又は徐放を達成することができる（例えば、Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたく、また、Ｌｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７ １：１０５）、米国特許第５，６７９，３７７号、米国特許第５，９１６，５９７号、米国特許第５，９１２，０１５号、米国特許第５，９８９，４６３号、米国特許第５，１２８，３２６号、国際公開第９９／１５１５４号、及び国際公開第９９／２０２５３号も参照されたい）。徐放性製剤に用いられるポリマーの例としては、ポリ（２－ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン－ｃｏ－ビニルアセテート）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ無水物、ポリ（Ｎ－ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド－ｃｏ－グリコリド）（ＰＬＧＡ）、及びポリオルトエステルが挙げられるが、これらに限定されない。実施形態では、徐放製剤中で使用されるポリマーは、不活性であり、浸出性不純物を含まず、保存時に安定であり、無菌であり、かつ生分解性である。更に別の実施形態では、制御放出系又は徐放系を治療標的、すなわち、鼻腔又は肺に近接して配置することができ、その結果、全身用量のほんの一部しか必要としない（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｒｅｌｅａｓｅ、上記，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照のこと）。放出制御系がＬａｎｇｅｒ（１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３）による概説において考察されている。当業者に公知の任意の技術を使用して、本明細書に提供される１つ又は２つ以上の抗体又はその抗原結合断片を含む徐放製剤を製造することができる。例えば、米国特許第４，５２６，９３８号、国際公開第９１／０５５４８号、国際公開第９６／２０６９８号、Ｎｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９６，「Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ａ Ｈｕｍａｎ Ｃｏｌｏｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｘｅｎｏｇｒａｆｔ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ－Ｒｅｌｅａｓｅ Ｇｅｌ，」Ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ３９：１７９－１８９、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，「Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｌｕｎｇ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ Ｌｏｎｇ－Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｅｍｕｌｓｉｏｎｓ，」ＰＤＡ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ５０：３７２－３９７、Ｃｌｅｅｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ Ｃａｒｒｉｅｒｓ ｆｏｒ ａ ｂＦＧＦ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，」Ｐｒｏ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：８５３－８５４、及びＬａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９７，「Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｙ ｆｏｒ Ｌｏｃａｌ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，」Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ’ｌ．Ｓｙｍｐ．Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌ．Ｂｉｏａｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２４：７５９－７６０を参照されたく、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0376】

特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物が予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片）をコードする核酸である場合、核酸を、適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、レトロウイルスベクターの使用により、核酸が、細胞内核酸となるように、ベクターを投与すること（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）により、又は直接注射により、又はマイクロ粒子衝突（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）により、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクション剤によるコーティングの使用により、又は核に侵入することが既知であるホメオボックス様ペプチドと連結して核酸を投与すること（例えば、Ｊｏｌｉｏｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８：１８６４－１８６８を参照されたい）などにより、そのコードされる予防剤又は治療剤の発現を促進するように、核酸を、インビボにおいて投与することができる。代替的に、核酸は、細胞内に導入し、相同組換えによる発現のために、宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる。

【0377】

特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される１つ、２つ又はそれ以上の抗体又はその抗原結合断片を含む。別の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、本明細書で提供される１つ、２つ又はそれ以上の抗体又はその抗原結合断片と、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片以外の予防剤又は治療剤と、を含む。一実施形態では、薬剤は、疾患若しくは状態の予防、管理、治療及び／又は寛解に有用であることが既知であるか、又はこれらのために使用されているか、若しくは現在使用されている。予防剤又は治療剤に加えて、本明細書で提供される組成物はまた、賦形剤を含み得る。

【0378】

本明細書で提供される組成物は、単位剤形の調製に使用され得る医薬組成物（例えば、対象又は患者への投与に好適な組成物）の製造において有用なバルク薬剤組成物を含む。実施形態では、本明細書で提供される組成物は、医薬組成物である。そのような組成物は、予防有効量又は治療有効量の１つ又は２つ以上の予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体若しくはその抗原結合断片、又は他の予防剤若しくは治療剤）と、医薬的に許容される賦形剤と、を含む。医薬組成物は、対象への投与経路に好適であるように製剤化されることができる。

【0379】

具体的な実施形態では、「賦形剤」という用語は、希釈剤、アジュバント（例えば、フロイントアジュバント（完全又は不完全））又はビヒクルを指すこともできる。医薬用賦形剤は、無菌液体、例えば水、及び落花生油、大豆油、鉱油、ゴマ油などの、石油、動物、植物、又は合成起源のものを含む油であり得る。水は、医薬組成物が静脈内投与される場合の代表的な賦形剤である。生理食塩水並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液も、特に注射溶液用の液体賦形剤として採用され得る。好適な医薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセリン、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセリン、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。必要に応じて、組成物は、少量の湿潤剤若しくは乳化剤、又はｐＨ緩衝剤を更に含み得る。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、徐放製剤などの形態を取り得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な賦形剤を含み得る。好適な医薬用賦形剤の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（１９９０）Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡにおいて記載されている。このような組成物は、患者に適切に投与するための形態を提供するために、予防的又は治療的有効量の、例えば、精製された形態の、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片を、適切な量の賦形剤とともに含有するであろう。その製剤は、投与様式に適するべきである。

【0380】

実施形態では、組成物は、日常的な手順に従って、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として製剤化される。典型的には、静脈内投与用の組成物は、滅菌水性等張緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤及び、注射部位の疼痛を和らげるための、リグノカインなどの局所麻酔剤も含み得る。しかしながら、そのような組成物は、静脈内経路以外の経路を介して投与され得る。

【0381】

概して、本明細書で提供される組成物の成分は、例えば、活性薬剤の量を示すアンプル又は小袋などの密封容器内に、乾燥した凍結乾燥粉末又は水分を含まない濃縮物として、個別に、又は単位剤形中に一体に混合して供給される。組成物が注入により投与される場合、組成物は、医薬品グレードの滅菌水又は生理食塩水の入った注入ボトルによって分注され得る。組成物が注射により投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水又は生理食塩水のアンプルを提供することができる。

【0382】

本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、抗体の量を示すアンプル又は小袋などの密封容器内に包装され得る。一実施形態では、抗体又はその抗原結合断片を、密封容器に入った乾燥滅菌した凍結乾燥粉末又は水分を含まない濃縮物として供給して、例えば、水又は生理食塩液で、対象への投与に適切な濃度まで復元させることができる。凍結乾燥された抗体又はその抗原結合断片は、その元の容器内で２～８℃で保存され得、抗体又はその抗原結合断片は、復元後１２時間以内（例えば、６時間以内、５時間以内、３時間以内、又は１時間以内）に投与され得る。代替的な実施形態では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、抗体の量及び濃度を示す密封容器内の液体形態で供給される。

【0383】

本明細書において提供される組成物は、中性形態又は塩形態として製剤化され得る。医薬的に許容される塩としては、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するアニオンなどのアニオンとともに形成される塩、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどに由来するカチオンなどのカチオンとともに形成される塩が挙げられる。

【0384】

疾患又は状態の予防及び／又は治療に有効である、予防剤又は治療剤（例えば、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片）又は本明細書で提供される組成物の量は、標準的な臨床技術によって決定され得る。加えて、最適な用量範囲を識別するのに役立てるために、任意選択的にインビトロアッセイが採用され得る。製剤に用いる正確な用量は、投与経路及び疾患又は状態の重症度にも依存し、医師の判断及び各患者の状況に応じて決定する必要がある。

【0385】

有効用量は、インビトロ又は動物モデル試験系から導出される用量反応曲線から外挿することができる。

【0386】

特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片の用量の患者への投与経路は、経鼻内、筋内、静脈内、皮下、又はこれらの組み合わせであるが、本明細書に記載される他の経路も許容可能である。各用量は、同一の投与経路で投与されても、投与されなくてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、本明細書で提供される同じ又は異なる抗体又はその抗原結合断片の他の用量と同時に、又はその後に、複数の投与経路を介して投与され得る。

【0387】

特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、対象に対して予防的に又は治療的に投与される。本明細書で提供される抗体又はその抗原結合断片は、疾患又は症状を防止する、減少させる、又は寛解させるように、対象に対して予防的に又は治療的に投与され得る。

【0388】

５．７．遺伝子療法
特定の実施形態では、抗体又はその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸は、例えば、遺伝子療法によって疾患、障害、若しくは状態を予防、管理、治療、及び／又は改善するために、本明細書で提供される方法で使用するために対象に投与される。このような療法は、発現された核酸又は発現可能な核酸の対象への投与によって行われる療法を包含する。一実施形態では、核酸は、それらがコードする抗体を産生し、その抗体は予防効果又は治療効果を媒介する。当技術分野で利用可能な組換え遺伝子発現（又は遺伝子療法）のための任意の方法を使用することができる。

【0389】

遺伝子療法の方法の一般的な総説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｙ １２：４８８－５０５、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９９１，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ３：８７－９５、Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３－５９６、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６０：９２６－９３２、及びＭｏｒｇａｎ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１－２１７、Ｍａｙ，１９９３，ＴＩＢＴＥＣＨ １１（５）：１５５－２１５を参照されたい。使用され得る組換えＤＮＡ技術の分野において一般的に公知の方法は、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）、及びＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載されている。

【0390】

特定の実施形態では、組成物は、本明細書で提供される抗体をコードする核酸を含み、核酸は、好適な宿主内で抗体又はキメラタンパク質又はその重鎖若しくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、抗体をコードする領域と作動可能に連結された異種プロモーターなどのプロモーターを有し、プロモーターは誘導性又は構成的であり、任意選択で、組織特異的である。別の特定の実施形態では、抗体をコードする配列及び任意の他の所望の配列が、ゲノム内の所望の部位で相同組換えを促進する領域と隣接し、したがって抗体をコードする核酸の染色体内発現を提供する核酸分子が使用される（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２－８９３５、Ｚｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５－４３８）。いくつかの実施形態では、発現された抗体分子は、単鎖抗体であり、あるいは、核酸配列は、抗体の重鎖及び軽鎖の両方、又はその断片をコードする配列を含む。

【0391】

対象への核酸の送達は、直接的であり得、この場合、対象は核酸又は核酸を運ぶベクターに直接的に曝露され、又は間接的であり得、この場合、細胞は最初にインビトロで核酸で形質転換され、次に対象に移植される。これらの２つのアプローチは、それぞれインビボ又はエクスビボ遺伝子療法として知られている。

【0392】

特定の実施形態では、核酸配列はインビボで直接投与され、そこで配列が発現されてコードされた産物が産生される。これは、当技術分野で公知の多数の方法のいずれかによって、例えば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば、欠損若しくは弱毒化したレトロウイルス又は他のウイルスベクターを用いた感染によって配列が細胞内になるようにベクターを投与することにより（米国特許第４，９８０，２８６号を参照されたい）、又はネイキッドＤＮＡの直接注射により、又はマイクロ粒子衝突（例えば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）により、又は脂質、細胞表面受容体、又はトランスフェクション剤によるコーティング、リポソーム、微粒子、又はマイクロカプセルへのカプセル化により、又は核に侵入することが既知であるペプチドと連結してそれらを投与することによって、受容体媒介エンドサイトーシスを受けるリガンドと連結してそれを投与することなどにより（例えば、Ｗｕ ａｎｄ Ｗｕ，１９８７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：４４２９－４４３２）（これは、受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するために使用することができる）達成され得る。別の実施形態では、リガンドがエンドソームを破壊するための融合性ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする核酸－リガンド複合体を形成することができる。更に別の実施形態では、核酸は、特定の受容体を標的化することによって、細胞特異的な取り込み及び発現のためにインビボで標的とされ得る（例えば、国際公開第９２／０６１８０号、同第９２／２２６３５号、同第９２／２０３１６号、同第９３／１４１８８号、同第９３／２０２２１号を参照されたい）。あるいは、相同組換えによって、核酸を細胞内に導入し、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Ｋｏｌｌｅｒ ａｎｄ Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９３２－８９３５、及びＺｉｊｌｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４２：４３５－４３８）。

【0393】

特定の実施形態では、抗体をコードする核酸配列を含むウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターを使用することができる（Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５８１－５９９を参照されたい）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの組み込みに必要な成分を含む。遺伝子療法に使用される抗体をコードする核酸配列は、対象への遺伝子の送達を容易にする１つ又は２つ以上のベクターにクローニングすることができる。レトロウイルスベクターについての更なる詳細は、Ｂｏｅｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ ６：２９１－３０２に見出され得、これは、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために、造血幹細胞にＭＤＲ１遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載する。遺伝子療法におけるレトロウイルスベクターの使用を説明する他の参考文献は、Ｃｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９３：６４４－６５１、Ｋｌｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｌｏｏｄ ８３：１４６７－１４７３、Ｓａｌｍｏｎｓ ａｎｄ Ｇｕｎｚｂｅｒｇ，１９９３，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：１２９－１４１、及びＧｒｏｓｓｍａｎ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．３：１１０－１１４である。

【0394】

アデノウイルスは、抗体の組換え産生において使用され得る他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するための特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは自然に呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系の他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、及び筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。Ｋｏｚａｒｓｋｙ ａｎｄ Ｗｉｌｓｏｎ，１９９３，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ３：４９９－５０３は、アデノウイルスに基づく遺伝子療法の総説を提示している。Ｂｏｕｔ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ５：３－１０は、アカゲザルの呼吸上皮に遺伝子を導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証した。遺伝子療法におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２：４３１－４３４、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｃｅｌｌ ６８：１４３－１５５、Ｍａｓｔｒａｎｇｅｌｉ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９１：２２５－２３４、国際公開第９４／１２６４９号、及びＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２：７７５－７８３に見出され得る。特定の実施形態では、アデノウイルスベクターが使用される。

【0395】

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も利用することができる（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２０４：２８９－３００及び米国特許第５，４３６，１４６号）。特定の実施形態では、ＡＡＶベクターは、本明細書で提供される抗体を発現するために使用される。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＨドメインをコードする核酸を含む。他の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＬドメインをコードする核酸を含む。特定の実施形態では、ＡＡＶは、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードする核酸を含む。本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、対象には、ＶＨドメインをコードする核酸を含むＡＡＶ及びＶＬドメインをコードする核酸を含むＡＡＶが投与される。他の実施形態では、対象には、ＶＨドメイン及びＶＬドメインをコードする核酸を含むＡＡＶが投与される。特定の実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、過剰発現される。

【0396】

遺伝子療法に対する別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、又はウイルス感染のような方法によって、組織培養中の細胞に遺伝子を導入することを包含する。通常、導入方法には、細胞への選択マーカーの導入が含まれる。次いで、細胞は選択下に置かれ、導入された遺伝子を取り込んで発現している細胞が単離される。次いで、これらの細胞が対象に送達される。

【0397】

この実施形態では、核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に細胞に導入される。このような導入は、当技術分野で即知の任意の方法によって行うことができ、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、微小核体媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などが含まれるが、これらに限定されない。外来遺伝子を細胞に導入するための多くの技術が当技術分野で即知であり（例えば、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ ａｎｄ Ｂｅｈｒ，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：５９９－６１８、Ｃｏｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２１７：６１８－６４４、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｈｅｒ．２９：６９－９２（１９８５）を参照されたい）、レシピエント細胞の必要な発生及び生理学的機能が破壊されないという条件で、本明細書で提供される方法に従って使用することができる。技術は、核酸が細胞で発現可能であるように、例えば、その細胞子孫で遺伝可能及び発現可能であるように、細胞への核酸の安定した導入を提供するものでなければならない。

【0398】

得られた組換え細胞は、当技術分野で即知の様々な方法によって対象に送達することができる。組換え血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）は静脈内に投与され得る。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定され得る。

【0399】

遺伝子療法の目的で核酸を導入することができる細胞には、任意の望ましい利用可能な細胞型が含まれ、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋細胞、肝細胞；血液細胞、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に造血幹細胞又は前駆細胞、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓などから得られるものなどが含まれる。

【0400】

特定の実施形態では、遺伝子療法に使用される細胞は、対象に対して自己由来である。

【0401】

組換え細胞が遺伝子療法に使用される実施形態では、抗体をコードする核酸配列が、細胞又はその子孫で発現可能となるように細胞に導入され、次いで、治療効果を得るために組換え細胞がインビボで投与される。特定の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞が使用される。インビトロで単離及び維持することができる任意の幹細胞並びに／又は前駆細胞は、本明細書で提供される方法のこの実施形態に従って潜在的に使用され得る（例えば、国際公開第９４／０８５９８号、Ｓｔｅｍｐｌｅ ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，１９９２，Ｃｅｌｌ ７ １：９７３－９８５、Ｒｈｅｉｎｗａｌｄ，１９８０，Ｍｅｔｈ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．２１Ａ：２２９、及びＰｉｔｔｅｌｋｏｗ ａｎｄ Ｓｃｏｔｔ，１９８６，Ｍａｙｏ Ｃｌｉｎｉｃ Ｐｒｏｃ．６１：７７１を参照されたい）。

【0402】

特定の実施形態では、遺伝子療法の目的で導入される核酸は、適切な転写誘導因子の存在又は非存在で制御することによって核酸の発現が制御可能であるように、コード領域と作動可能に連結された誘導性プロモーターを含む。

【0403】

５．８．診断アッセイ及び方法
本明細書で提供される抗原と免疫特異的に結合する標識抗体並びにその誘導体及び類似体は、疾患若しくは障害を検出、診断、又は監視するための診断目的に使用することができる。

【0404】

本明細書で提供される抗体は、本明細書に記載されるような、又は当業者に公知のような古典的な免疫組織学的方法を使用して生体試料中の抗原レベルをアッセイするために使用することができる（例えば、Ｊａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０１：９７６－９８５、及びＪａｌｋａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１０５：３０８７－３０９６を参照されたい）。タンパク質遺伝子発現を検出するために有用な他の抗体系の方法としては、免疫測定法、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）及び放射性免疫測定法（ＲＩＡ）が挙げられる。好適な抗体アッセイ標識は当技術分野で公知であり、酵素標識、例えば、グルコースオキシダーゼ；放射性同位体、例えば、ヨウ素（１２５Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１２１Ｉｎ）、及びテクネチウム（９９Ｔｃ）、発光標識、例えば、ルミノール、並びに蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ローダミン、及びビオチンが含まれる。本明細書で提供される１つの態様は、ヒトにおける疾患又は障害の検出及び診断である。

【0405】

対象のサイズ及び使用される画像化システムによって、診断画像を生成するのに必要な画像化部分の量が決定されることが当技術分野では理解されよう。放射性同位元素部分の場合、ヒト対象の場合、注入される放射能の量は通常、約５～２０ミリキュリーの範囲の９９Ｔｃである。次いで、標識された抗体は、特定のタンパク質を含む細胞の位置に蓄積する。インビボ腫瘍画像化は、Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，「Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｅｄ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ．」（Ｃｈａｐｔｅｒ １３ ｉｎ Ｔｕｍｏｒ Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎｃｅｒ，Ｓ．Ｗ．Ｂｕｒｃｈｉｅｌ ａｎｄ Ｂ．Ａ．Ｒｈｏｄｅｓ，ｅｄｓ．，Ｍａｓｓｏｎ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｉｎｃ．（１９８２）に記載されている。

【0406】

使用される標識の種類及び投与の様式を含むいくつかの可変性に依存して、標識抗体が対象の部位に集中することを可能にし、未結合の標識抗体がバックグラウンドレベルまで除去されるまでの投与後の時間間隔は、６～４８時間、又は６～２４時間、又は６～１２時間である。別の実施形態では、投与後の時間間隔は、５～２０日又は５～１０日である。

【0407】

一実施形態では、疾患又は障害の監視は、例えば、最初の診断から１か月後、最初の診断から６か月後、最初の診断から１年後など、疾患又は障害を診断するための方法を繰り返すことによって行われる。

【0408】

標識された分子の存在は、インビボ走査のための当該分野で公知の方法を使用して、対象において検出され得る。これらの方法は、使用される標識の種類に依存する。当業者は、特定の標識を検出するための適切な方法を決定することができるであろう。本明細書で提供される診断方法で使用され得る方法及び装置には、コンピュータ断層撮影法（ＣＴ）、全身走査、例えば、位置放射断層撮影法（ＰＥＴ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、及び超音波検査が含まれるが、これらに限定されない。

【0409】

特定の実施形態では、分子は、放射性同位体で標識され、放射線反応性外科器具を使用して患者内で検出される（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．、米国特許第５，４４１，０５０号）。別の実施形態では、分子は蛍光化合物で標識され、蛍光反応性走査機器を使用して患者内で検出される。別の実施形態では、分子は陽電子放出金属で標識され、陽電子放出断層撮影法を使用して患者内で検出される。更に別の実施形態では、分子は常磁性標識で標識され、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）を使用して患者内で検出される。

【0410】

５．９．キット
また、本明細書で提供されるのは、適切な包装材料に包装された、本明細書で提供される抗体（例えば、抗ＣＤ２５二重特異性抗体、抗ＣＤ３９二重特異性抗体、又はＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体）、又はその組成物（例えば、医薬組成物）を含むキットである。キットは、必要に応じて、構成要素の説明又はその中の構成要素のインビトロ、インビボ、若しくはエキソビボでの使用のための指示書を含むラベル又は添付文書を含む。

【0411】

「包装材料」という用語は、キットの構成要素を収容する物理的構造を指す。包装材料は、構成要素を無菌的に維持することができ、そのような目的のために一般的に使用される材料（例えば、紙、段ボール、ガラス、プラスチック、箔、アンプル、バイアル、チューブなど）から作製することができる。

【0412】

本明細書で提供されるキットは、ラベル又は添付文書を含むことができる。ラベル又は添付文書は、例えば、構成要素、キット、若しくは包装材料（例えば、箱）とは別個に又は添付された、あるいはキット構成要素を含むアンプル、チューブ、又はバイアルなどに添付された、「印刷物」、例えば、紙又はボール紙を含む。ラベル又は添付文書は、コンピュータ可読媒体、例えば、ディスク（例えば、ハードディスク、カード、メモリディスク）、光ディスク、例えば、ＣＤ若しくはＤＶＤ－ＲＯＭ／ＲＡＭ、ＤＶＤ、ＭＰ３、磁気テープ、又は電気的記憶媒体、例えば、ＲＡＭ及びＲＯＭ、又はこれらのハイブリッド、例えば、磁気／光記憶媒体、ＦＬＡＳＨ媒体、記憶型カードを更に含むことができる。ラベル又は添付文書は、製造元情報、ロット番号、製造元所在地、及び日付を識別する情報を含むことができる。

【0413】

本明細書で提供されるキットは、他の構成要素を更に含むことができる。キットの各構成要素は、個々の容器内に封入することができ、様々な容器の全てを単一のパッケージ内に入れることができる。キットは、冷蔵用に設計することもできる。キットは更に、本明細書で提供される抗体、又は本明細書で提供される抗体をコードする核酸を含む細胞を含むように設計することができる。キット中の細胞は、使用の準備ができるまで適切な保存条件下で維持することができる。

【0414】

また、本明細書で提供されるのは、抗原、例えば、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９と免疫特異的に結合する抗体のパネルである。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、異なる結合速度定数、異なる解離速度定数、抗原に対する異なる親和性、及び／又は抗原に対する異なる特異性を有する抗体のパネルである。特定の実施形態では、本明細書で提供されるのは、約１０個、好ましくは約２５個、約５０個、約７５個、約１００個、約１２５個、約１５０個、約１７５個、約２００個、約２５０個、約３００個、約３５０個、約４００個、約４５０個、約５００個、約５５０個、約６００個、約６５０個、約７００個、約７５０個、約８００個、約８５０個、約９００個、約９５０個、又は約１０００個以上の抗体のパネルである。抗体のパネルは、例えば、ＥＬＩＳＡなどのアッセイに例えば、９６ウェル又は３８４ウェルプレートで使用することができる。

【0415】

特に定義されない限り、本明細書で使用されている全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に共通に理解されるものと同じ意味を有している。本明細書に記載のものと同様又は同等の方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。

【0416】

本明細書で使用される場合、数値は、本文書全体を通して範囲形式で提示されることが多い。範囲形式の使用は、単に便宜上及び簡潔さのためであり、文脈が別途明確に示さない限り、本発明の範囲に対する柔軟性のない限定として解釈されるべきではない。したがって、範囲の使用は、文脈が別途明確に示さない限り、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値、並びにそのような範囲内の整数及び範囲内の値又は整数の分数を含む全ての数値又は数値範囲を明示的に含む。この構成は、範囲の広さにかかわらず、本特許文書全体を通して全ての文脈において適用される。したがって、例えば、９０～１００％の範囲への言及は、９１～９９％、９２～９８％、９３～９５％、９１～９８％、９１～９７％、９１～９６％、９１～９５％、９１～９４％、９１～９３％などを含む。９０～１００％の範囲への言及は、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９５％、９７％など、並びに９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％など、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％なども含む。

【0417】

更に、１～３、３～５、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～６０、６０～７０、７０～８０、８０～９０、９０～１００、１００～１１０、１１０～１２０、１２０～１３０、１３０～１４０、１４０～１５０、１５０～１６０、１６０～１７０、１７０～１８０、１８０～１９０、１９０～２００、２００～２２５、２２５～２５０の範囲への言及は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０などを含む。更なる例では、２５～２５０、２５０～５００、５００～１，０００、１，０００～２５００、２５００～５０００、５０００～２５０００、２５０００～５００００の範囲への言及は、任意の数値又はそのような値内の若しくはそのような値を包含する範囲、例えば、２５、２６、２７、２８、２９．．．２５０、２５１、２５２、２５３、２５４．．．５００、５０１、５０２、５０３、５０４．．．などを含む。

【0418】

同様に本明細書で使用される場合、一連の範囲が本文書全体にわたって開示される。一連の範囲の使用は、上限及び下限の範囲を組み合わせて別の範囲を提供することを含む。この構成は、範囲の広さにかかわらず、本特許文書全体を通して全ての文脈において適用される。したがって、例えば、５～１０、１０～２０、２０～３０、３０～４０、４０～５０、５０～７５、７５～１００、１００～１５０などの一連の範囲への言及は、５～２０、５～３０、５～４０、５～５０、５～７５、５～１００、５～１５０、及び１０～３０、１０～４０、１０～５０、１０～７５、１０～１００、１０～１５０、及び２０～４０、２０～５０、２０～７５、２０～１００、２０～１５０などの範囲を含む。

【0419】

簡潔にするために、特定の略語が本明細書で使用される。一例として、アミノ酸残基を表す単一文字の略語がある。アミノ酸及びそれらに対応する３文字及び１文字の略語は以下の通りである：

【0420】

【表2】

【0421】

本発明は、概して、多数の実施形態を説明するために肯定的な言葉を使用して本明細書に開示される。また、本発明には、物質又は材料、方法の工程及び条件、プロトコル、手順、アッセイ又は分析など、特定の主題が完全に又は部分的に除外されている実施形態も具体的に含まれる。したがって、本明細書は、概ね、本発明が含まないものに関して本明細書で表現されていない場合であっても、それでもなお、本発明に明示的に含まれていない態様が本明細書で開示される。

【0422】

本発明の多くの実施形態が説明されてきた。しかしながら、様々な修正が、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく実行され得ることが、理解されるであろう。したがって、以下の実施例は、特許請求の範囲に記載された発明の範囲を説明することを意図しているが、限定するものではない。

【0423】

６．実施形態
本発明は、以下の非限定的な実施形態を提供する。

【0424】

１組の実施形態では、以下が提供される。
Ａ１．分子であって、
ａ．制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、
任意選択で、分子が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、分子。
Ａ２．第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ａ１に記載の多重特異性抗体。
Ａ３．第１の抗原が、ＣＤ２５である、実施形態Ａ１に記載の多重特異性抗体。
Ａ４．第１の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、実施形態Ａ１に記載の多重特異性抗体。
Ａ５．第１の結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ａ４に記載の多重特異性抗体。
Ａ６．第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ７．第２の抗原が、ＣＤ３９である、実施形態Ａ１～Ａ６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ８．第２の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む、実施形態Ａ１～Ａ５のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ９．第２の結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ａ８に記載の多重特異性抗体。
Ａ１０．第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインが、ヒト化されている、実施形態Ａ１～Ａ９のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１１．多重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、実施形態Ａ１～Ａ１０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１２．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、実施形態Ａ１１に記載の多重特異性抗体。
Ａ１３．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態Ａ１２に記載の多重特異性抗体。
Ａ１４．ＩｇＧ抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む、実施形態Ａ１２に記載の多重特異性抗体。
Ａ１５．抗体が、カッパ軽鎖を含む、実施形態Ａ１～Ａ１４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１６．抗体が、ラムダ軽鎖を含む、実施形態Ａ１～Ａ１４のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１７．抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１８．多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態Ａ１～Ａ１６のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ１９．第１の結合ドメインが、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインが、Ｆａｂ領域である、実施形態Ａ１８に記載の多重特異性抗体。
Ａ２０．多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する、実施形態Ａ１～Ａ１９のいずれか１つに記載の多重特異性抗体。
Ａ２１．実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体をコードする、核酸。
Ａ２２．実施形態Ａ２１に記載の核酸を含む、ベクター。
Ａ２３．実施形態Ａ２２に記載のベクターを含む、宿主細胞。
Ａ２４．実施形態Ａ２２に記載のベクターと、そのためのパッケージと、を含む、キット。
Ａ２５．実施形態Ａ１～Ａ２０のいずれか１つに記載の多重特異性抗体と、そのためのパッケージと、を含む、キット。

【0425】

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｂ１．医薬組成物であって、分子と、医薬的に許容される担体と、を含み、分子が
ａ．制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、
任意選択で、分子が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、医薬組成物。
Ｂ２．第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｂ１に記載の医薬組成物。
Ｂ３．第１の抗原が、ＣＤ２５である、実施形態Ｂ１に記載の医薬組成物。
Ｂ４．第１の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、実施形態Ｂ１に記載の医薬組成物。
Ｂ５．第１の結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｂ４に記載の医薬組成物。
Ｂ６．第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ７．第２の抗原が、ＣＤ３９である、実施形態Ｂ１～Ｂ６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ８．第２の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ５のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ９．第２の結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｂ８に記載の医薬組成物。
Ｂ１０．第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインが、ヒト化されている、実施形態Ｂ１～Ｂ９のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１１．多重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、実施形態Ｂ１～Ｂ１０のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１２．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、実施形態Ｂ１１に記載の医薬組成物。
Ｂ１３．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態Ｂ１２に記載の医薬組成物。
Ｂ１４．ＩｇＧ抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む、実施形態Ｂ１２に記載の医薬組成物。
Ｂ１５．抗体が、カッパ軽鎖を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１６．抗体が、ラムダ軽鎖を含む、実施形態Ｂ１～Ｂ１４のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１７．抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態Ｂ１～Ｂ１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１８．多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態Ｂ１～Ｂ１６のいずれか１つに記載の医薬組成物。
Ｂ１９．第１の結合ドメインが、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインが、Ｆａｂ領域である、実施形態Ｂ１８に記載の多重特異性抗体。
Ｂ２０．多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する、実施形態Ｂ１～Ｂ１９のいずれか１つに記載の医薬組成物。

【0426】

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｃ１．分子を作製するためのプロセスであって、分子をコードする１つ又は２つ以上の核酸を宿主細胞に導入することを含み、分子が、
ａ．制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含み、
任意選択で、分子が、多重特異性抗体又はその抗原結合断片である、プロセス。
Ｃ２．第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｃ１に記載のプロセス。
Ｃ３．第１の抗原が、ＣＤ２５である、実施形態Ｃ１に記載のプロセス。
Ｃ４．第１の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、実施形態Ｃ１に記載のプロセス。
Ｃ５．第１の結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｃ４に記載のプロセス。
Ｃ６．第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｃ１～Ｃ５のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ７．第２の抗原が、ＣＤ３９である、実施形態Ｃ１～Ｃ６のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ８．第２の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ５のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ９．第２の結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｃ８に記載のプロセス。
Ｃ１０．第１の結合ドメイン及び／又は第２の結合ドメインが、ヒト化されている、実施形態Ｃ１～Ｃ９のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１１．多重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、実施形態Ｃ１～Ｃ１０のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１２．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、実施形態Ｃ１１に記載のプロセス。
Ｃ１３．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態Ｃ１２に記載のプロセス。
Ｃ１４．ＩｇＧ抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む、実施形態Ｃ１２に記載のプロセス。
Ｃ１５．抗体が、カッパ軽鎖を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１６．抗体が、ラムダ軽鎖を含む、実施形態Ｃ１～Ｃ１４のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１７．抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態Ｃ１～Ｃ１６のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１８．多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態Ｃ１～Ｃ１６のいずれか１つに記載のプロセス。
Ｃ１９．第１の結合ドメインが、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインが、Ｆａｂ領域である、実施形態Ｃ１８に記載のプロセス。
Ｃ２０．多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する、実施形態Ｃ１～Ｃ１９のいずれか１つに記載のプロセス。

【0427】

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｄ１．ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇する方法であって、ＣＤ２５及び／又はＣＤ３９を発現する細胞を含む試料を提供することと、試料を多重特異性抗体と接触させることと、ＣＤ２５及び／若しくはＣＤ３９を発現し、かつ多重特異性抗体と結合する細胞を濃縮、単離、分離、精製、選別、選択、捕捉、検出、又は枯渇することと、を含み、多重特異性抗体が、ＣＤ２５と結合することができる第１の結合ドメインと、ＣＤ３９と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む、方法。
Ｄ２．細胞が、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞である、実施形態Ｄ１に記載の方法。
Ｄ３．試料が、血液試料である、実施形態Ｄ１～Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ４．試料が、組織試料である、実施形態Ｄ１～Ｄ２のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ５．Ｔｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を、
ａ．Ｔｒｅｇ細胞上で発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
Ｄ６．がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、がん細胞及びＴｒｅｇ細胞を、
ａ．Ｔｒｅｇ細胞上で発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体と接触させることを含む、方法。
Ｄ７．がんを有する対象においてがん細胞及びＴｒｅｇ細胞を阻害又は枯渇する方法であって、
ａ．Ｔｒｅｇ細胞上で発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法。
Ｄ８．対象においてがんを治療する方法であって、
ａ．Ｔｒｅｇ細胞上で発現される第１の抗原と結合する第１の結合ドメインと、
ｂ．Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合する第２の結合ドメインと、を含む、多重特異性抗体を対象に投与することを含む、方法。
Ｄ９．がんが、固形腫瘍がんである、実施形態Ｄ７又は実施形態Ｄ８に記載の方法。
Ｄ１０．がんが、血液がんである、実施形態Ｄ７又は実施形態Ｄ８に記載の方法。
Ｄ１１．第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性に関与する、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１２．第１の抗原が、ＣＤ２５である、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１３．第１の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号１に記載のＶＨ相補性決定領域（ＣＤＲ）１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、重鎖可変領域（ＶＨ）と、
（ｉｉ）配列番号２に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、軽鎖可変領域（ＶＬ）と、を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１０のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１４．第１の結合ドメインが、配列番号１のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号２のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｄ１３に記載の方法。
Ｄ１５．第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｄ１～Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１６．第２の抗原が、ＣＤ３９である、実施形態Ｄ１～Ｄ１５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１７．第２の結合ドメインが、
（ｉ）配列番号３に記載のＶＨ ＣＤＲ１、ＶＨ ＣＤＲ２、及びＶＨ ＣＤＲ３を含む、ＶＨと、
（ｉｉ）配列番号４に記載のＶＬ ＣＤＲ１、ＶＬ ＣＤＲ２、及びＶＬ ＣＤＲ３を含む、ＶＬと、を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ１４のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ１８．第２の結合ドメインが、配列番号３のアミノ酸配列を含むＶＨと、配列番号４のアミノ酸配列を含むＶＬと、を含む、実施形態Ｄ１７に記載の方法。
Ｄ１９．第１の結合ドメインが、ヒト化されており、及び／又は第２の結合ドメインが、ヒト化されている、実施形態Ｄ１～Ｄ１８のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２０．多重特異性抗体が、ＩｇＧ抗体である、実施形態Ｄ１～Ｄ１９のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２１．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４抗体である、実施形態Ｄ２０に記載の方法。
Ｄ２２．ＩｇＧ抗体が、ＩｇＧ１抗体である、実施形態Ｄ２１に記載の方法。
Ｄ２３．ＩｇＧ抗体が、Ｆｃエフェクター機能を増強するための変異を有するＦｃ領域を含む、実施形態Ｄ２１に記載の方法。
Ｄ２４．抗体が、カッパ軽鎖を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２５．抗体が、ラムダ軽鎖を含む、実施形態Ｄ１～Ｄ２３のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２６．抗体が、モノクローナル抗体である、実施形態Ｄ１～Ｄ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２７．多重特異性抗体が、二重特異性抗体である、実施形態Ｄ１～Ｄ２５のいずれか１つに記載の方法。
Ｄ２８．第１の結合ドメインが、ｓｃＦｖ領域であり、第２の結合ドメインが、Ｆａｂ領域である、実施形態Ｄ２７に記載の方法。
Ｄ２９．多重特異性抗体が、Ｔｒｅｇの枯渇又は阻害を誘導する、実施形態Ｄ１～Ｄ２８のいずれか１つに記載の方法。

【0428】

別の組の実施形態では、以下が提供される。
Ｅ１．多重特異性分子であって、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に発現される第１の抗原と結合することができる第１の手段と、Ｔｒｅｇ細胞上に発現される第２の抗原と結合することができる第２の手段と、を含む、多重特異性分子。
Ｅ２．第１の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｅ１に記載の多重特異性分子。
Ｅ３．第１の抗原が、ＣＤ２５である、実施形態Ｅ１～Ｅ２のいずれか１つに記載の多重特異性分子。
Ｅ４．第２の抗原が、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性における機能を有する、実施形態Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の多重特異性分子。
Ｅ５．第２の抗原が、ＣＤ３９である、実施形態Ｅ１～Ｅ３のいずれか１つに記載の多重特異性分子。
Ｅ６．１つを超える標的分子と結合する分子を作製するためのプロセスであって、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第１の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、Ｔｒｅｇ細胞の表面上で第２の抗原と結合することができる結合ドメインを取得する機能を実行する工程と、第１の抗原及び第２の抗原と結合することができる分子を提供する機能を実行する工程と、を含む、プロセス。
Ｅ７．Ｔｒｅｇ細胞の成長若しくは増殖を阻害するか、又はそれを枯渇する方法であって、Ｔｒｅｇ細胞を実施形態Ｅ１～Ｅ６のいずれか１つに記載の分子と接触させることを含む、方法。

【実施例】

【0429】

以下は、試験に使用された様々な方法及び材料の説明であり、当業者に本開示の作製及び使用方法の完全な開示及び説明を提供するように記載されており、本発明者らがその開示とみなす範囲を限定することを意図しておらず、また、以下の実験が実施され、実施可能な実験の全てであることを表すことを意図していない。現在形で書かれた例示的な記述は、必ずしも実行されたものではなく、むしろ記述は、本開示の教示に関連するデータなどを生成するために実行できるものであることを理解されたい。使用される数値（例えば、量、パーセンテージなど）についての正確度を保証するための努力はなされているが、多少の実験誤差及び偏差が考慮に入れられるべきである。

【0430】

７．１ 実施例１：二重特異性抗体の設計、操作、及び抗体産生
第１の抗原と結合することができる第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む、例示的な二重特異性抗体を生成し、第１の抗原及び第２の抗原は常駐制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に存在する。具体的には、ＣＤ２５及びＣＤ３９と結合することができる抗原結合ドメインを含む二重特異性ＣＤ２５×ＣＤ３９抗体を生成した。

【0431】

抗ＣＤ２５、抗ＣＤ３９及び抗ＲＳＶ（クローンＢ２１Ｍ、ヌルアーム対照）の可変領域配列を使用して、ノブインホール技術を使用し、ＪＡＷＡ変異を有するヘテロ二量体二重特異性抗体のパネルを生成した。ＣＤ２５×ＣＤ３９の設計を図２に示す。ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体は、ＣＤ２５を標的とする単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及びＣＤ３９を標的とする抗原結合断片（Ｆａｂ）領域を有するヒトＩｇＧ１骨格上にフォーマット化した。ＣＤ３９×ヌル二重特異性抗体を対照として生成した。ノブインホール（ＫＩＨ）技術を使用して、二重特異性抗体を操作した。ＣＤ２５×ＣＤ３９二重特異性抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域に変異を導入して、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を含むＦｃエフェクター機能を増強し、Ｔｒｅｇの枯渇を増大させて抗腫瘍免疫応答を増強した。

【0432】

抗ＣＤ２５抗体の可変領域配列を以下の表１に提供する。抗ＣＤ３９抗体の可変領域配列を以下の表２に提供する。抗ＲＳＶ抗体の可変領域配列を以下の表３に提供する。

【0433】

【表3】

【0434】

【表4】

【0435】

【表5】

【0436】

抗ＣＤ２５ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体（バシリキシマブ）のアミノ酸配列を表４に提供する。抗ＣＤ２５ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体の配向はＬＨである。ＶＬ及びＶＨは、２０個のアミノ酸リンカー（下線）によって接続される。抗ＣＤ３９抗体の重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表５に提供する。抗ＲＳＶ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体のアミノ酸配列を表６に提供する。抗ＲＳＶ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体の配向はＬＨである。ＶＬ及びＶＨは、１８個のアミノ酸リンカー（下線）によって接続される。

【0437】

【表6】

【0438】

【表7】

【0439】

【表8】

【0440】

可変領域をコードする核酸配列を、標準的なＰＣＲ制限酵素ベースの標準的なクローニング技術を使用して、ヒトＩｇＧ１発現カセットの定常領域を含有するカスタム哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、配列決定、検証した。抗ＣＤ２５ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体をコードする核酸配列を以下の表７に提供する。抗ＣＤ３９抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸配列を以下の表８に提供する。抗ＲＳＶ ｓｃＦｖ－Ｆｃ抗体をコードする核酸配列を以下の表９に提供する。

【0441】

【表9】

【0442】

【表10】

【0443】

【表11】

【0444】

二重特異性抗体を、チャイニーズハムスター卵巣細胞株における一過性トランスフェクションによって発現した。抗体を、最初にＭａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａカラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。カラムをＰＢＳ ｐＨ７．２で平衡化し、２ｍＬ／分の流速で発酵上清を装填した。装填後、カラムを４カラム容量のＰＢＳで洗浄し、続いて、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ３．５で溶出した。２８０ｎｍでの吸光度によってモニターされるようなタンパク質ピークを含有する画分をプールし、１％の３Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ９．０を添加することによってｐＨ５．０に中和した。二重特異性ｍＡｂを、ＰＢＳ緩衝剤で平衡化した分取Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）サイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）カラム上で更に精製した。試料の完全性を、エンドトキシン測定、並びに還元及び非還元条件下でのＳＤＳ－ＰＡＧＥによって評価した。

【0445】

７．２ 実施例２：抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイ
アッセイ緩衝液の調製：１．５ｍＬの低ＩｇＧ血清を３６ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０培地に添加して、３７．５ｍＬの９６％ＲＰＭＩ－１６４０／４％低ＩｇＧ血清を作製した。

【0446】

標的細胞の調製：２５μＬの初代ヒトＴｒｅｇ（Ｈｅｍａｃａｒｅ；カタログ番号ＰＢ４２５／１２７ＮＣ－２）を、９６ウェル、白色、平底アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３９１７）のウェルごとに等分し、各ウェルに１２，５００個のＴｒｅｇが含まれるようにした。抗体希釈系列を調製しながら、標的細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１５分間平衡化した。

【0447】

試験抗体の調製：アッセイ緩衝液を希釈剤として使用して、１．５倍抗体連続希釈物を、１２０μｇ／ｍＬの開始抗体濃度で調製した（１０点用量反応）。２５μＬの抗体連続希釈物を、予めプレーティングした標的細胞に添加した。アッセイプレートを室温（ＲＴ）で１５分間インキュベートした。

【0448】

ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１エフェクター細胞の調製：ＦｃγＲＩＩａ－Ｈ ＡＤＣＰバイオアッセイキットは、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した（カタログ番号Ｇ９９９１）。２５μＬのヒトＦｃγＲＩＩａ－Ｈ１３１エフェクター細胞を、既に標的細胞及び試験抗体を含むアッセイプレートの各ウェルに等分し、各ウェルに７５，５００個のエフェクター細胞を入れた。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。

【0449】

Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬の調製：アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１５分間平衡化した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質を１０ｍＬのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ緩衝液で再構成して、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を作製した。７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬をアッセイプレート中の各ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートし、アッセイプレートをシェーカー上でわずかに撹拌し、ルミノメーター（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）を使用して０．５秒／ウェルの積分時間で発光を測定した。加えて、７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を含む３つの空のウェルのバックグラウンドシグナルを測定した。

【0450】

データ分析：バックグラウンドシグナルは、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬のみを含む３つの空のウェルの平均ＲＬＵ（相対発光単位）を取得することによって計算した。誘導倍率を、ＲＬＵ（試料－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）として計算した。データを、誘導倍率（ＲＬＵ）対Ｌｏｇ１０［抗体］としてグラフ化した。ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値を外挿した。結果を図３に示す。

【0451】

７．３ 実施例３：抗体依存性細胞傷害性についてのアッセイ
アッセイ緩衝液の調製：１．４ｍＬの低ＩｇＧ血清を３３．６ｍＬのＲＰＭＩ－１６４０培地に添加して、３５ｍＬの９６％ＲＰＭＩ－１６４０／４％低ＩｇＧ血清を作製した。

【0452】

標的細胞の調製：２５μＬの初代ヒトＴｒｅｇ（Ｈｅｍａｃａｒｅ；カタログ番号ＰＢ４２５／１２７ＮＣ－２）を、９６ウェル、白色、平底アッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ；カタログ番号３９１７）のウェルごとに等分し、各ウェルに１２，５００個のＴｒｅｇが含まれるようにした。抗体希釈系列を調製しながら、標的細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１５分間平衡化した。

【0453】

試験抗体の調製：アッセイ緩衝液を希釈剤として使用して、３倍抗体連続希釈物を、５０μｇ／ｍＬの開始抗体濃度で調製した（１０点用量反応）。２５μＬの抗体連続希釈物を、予めプレーティングした標的細胞に添加した。アッセイプレートは室温で１５分間であった。

【0454】

ＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８エフェクター細胞の調製：ＡＤＣＣレポーターアッセイ、Ｆバリアントキットは、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した（カタログ番号Ｇ９７９０）。２５μＬのヒトＦｃγＲＩＩＩａ－Ｆ１５８エフェクター細胞を、既に標的細胞及び試験抗体を含むアッセイプレートの各ウェルに等分し、各ウェルに７５，５００個のエフェクター細胞を入れた。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２で６時間インキュベートした。

【0455】

Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬の調製：アッセイプレートをインキュベーターから取り出し、室温で１５分間平衡化した。Ｂｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ基質を１０ｍＬのＢｉｏ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ緩衝液で再構成して、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬を作製した。７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬をアッセイプレート中の各ウェルに添加し、室温で２０分間インキュベートし、アッセイプレートをシェーカー上でわずかに撹拌し、ルミノメーター（Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダー）を使用して０．５秒／ウェルの積分時間で発光を測定した。加えて、７５μＬのＢｉｏ－Ｇｌｏ試薬を含む３つの空のウェルのバックグラウンドシグナルを測定した。

【0456】

データ分析：バックグラウンドシグナルは、Ｂｉｏ－Ｇｌｏ試薬のみを含む３つの空のウェルの平均ＲＬＵを取ることによって計算した。誘導倍率を、ＲＬＵ（試料－バックグラウンド）／ＲＬＵ（抗体なし対照－バックグラウンド）として計算した。誘導倍率（ＲＬＵ）対Ｌｏｇ１０［抗体］としてのグラフデータ。ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行い、ＥＣ５０値を外挿した。結果を図４に示す。

【0457】

７．４ 実施例４：ヒトＣ１ｑ結合アッセイ
スルホタグ付きヒトＣ１ｑタンパク質の調製：ヒトＣ１ｑタンパク質（ＯｒｉＧｅｎｅ；カタログ番号ＢＡ１４８）のタグ精製を、ＭＳＤプロトコルに従ってＭＳＤ ＧＯＬＤ ＳＵＬＦＯ－ＴＡＧ ＮＨＳ－Ｅｓｔｅｒを使用して実行した。

【0458】

試験抗体によるＭＳＤプレートのコーティング：希釈剤として１×ＰＢＳを使用して、２００μｇ／ｍＬの開始抗体濃度で２倍抗体段階希釈物を調製した（１２点用量反応）。４０μＬの抗体段階希釈物を、マルチアレイＭＳＤ高結合９６ウェルアッセイプレート（ＭＳＤ；カタログ番号Ｌ１５ＸＢ）に添加した。アッセイプレートをシェーカー上で５分間穏やかに撹拌して、確実に均一に分布させた。アッセイプレートを４℃で一晩インキュベートした。

【0459】

洗浄工程：アッセイプレートをＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（１ｘ）（ＭＳＤ；カタログ番号Ｒ６１ＴＸ－２）で３回洗浄した。

【0460】

ブロッキング工程：１５０μＬのブロッキング溶液を、ＭＳＤ Ｂｌｏｃｋｅｒ Ａキット（ＭＳＤ；カタログ番号Ｒ９３ＡＡ－２）から調製したアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイプレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。

【0461】

洗浄工程：アッセイプレートをＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（１ｘ）で３回洗浄した。

【0462】

スルホタグ付きヒトＣ１ｑタンパク質の添加：２５μＬのスルホタグ付きヒトＣ１ｑタンパク質をアッセイプレートの各ウェルに添加して、１０μｇ／ｍＬの最終濃度を達成した。アッセイプレートを振盪しながら室温で１時間インキュベートした。

【0463】

洗浄工程：アッセイプレートをＭＳＤ Ｔｒｉｓ洗浄緩衝液（１ｘ）で３回洗浄した。

【0464】

読み取り緩衝液の添加：１５０μＬの２×読み取り緩衝液を、ＭＳＤ読み取り緩衝液－Ｔ ４ｘ（ＭＳＤ；カタログ番号Ｒ２９ＴＣ－２）から調製したアッセイプレートの各ウェルに添加した。アッセイプレートをＭＳＤ画像機器上で読み取り、ＲＬＵ値を得た。

【0465】

データ分析：ｌｏｇ（アゴニスト）対応答－可変勾配（４つのパラメータ）の非線形回帰曲線フィッティングを行った。結果を図５に示す。

【0466】

７．５ 実施例５：他の例示的な二重特異性抗体
７．５．１ 例示的な二重特異性抗体の構築
追加の例示的な二重特異性抗体を生成した。例示的な二重特異性抗体は、第１の抗原と結合することができる第１の結合ドメインと、第２の抗原と結合することができる第２の結合ドメインと、を含む。第１の抗原及び第２の抗原の両方は、常在性制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上に存在する。例示的な構築物の１つのセットにおいて、第１の抗原及び第２の抗原は、ＣＤ２５、ＣＤ３９、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＦｏｘＰ３、５’ヌクレオチダーゼ／ＣＤ７３、ＣＤ１０３、ＣＤ１２７、ＣＤ１３４、Ｋｉ６７、ＣＤ６２Ｌ（ＬＥＣＡＭ－１）、ＣＤ４５ＲＡ、ＧＩＴＲ、ＣＤ２２３（ＬＡＧ－３）、ＦＲ４、ＣＤ１９４（ＣＣＲ４）、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ－４）、ＧＡＲＰ（ＬＲＣ３２）、ＯＸ４０、ＬＡＰ、ＩＣＯＳ、ＰＤ１、ＴＣＲ、及びニューロピリン－１からなる群から選択される。

【0467】

一部の構築物では、ノブインホール（ＫＩＨ）技術を使用して二重特異性抗体を操作した。二重特異性抗体の結晶化可能断片（Ｆｃ）領域に変異を導入して、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）活性及び抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を含むＦｃエフェクター機能を増強し、Ｔｒｅｇの枯渇を増強させて抗腫瘍免疫応答を増強した。

【0468】

７．５．２ 例示的な二重特異性抗体についての機能アッセイ
抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）アッセイ及び抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）アッセイを実施して、Ｔｒｅｇの枯渇に対する例示的な二重特異性抗体の効果を試験した。ＡＤＣＰアッセイ及びＡＤＣＣアッセイの手順は、第７．２節及び第７．３節で上述した手順と同様である。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【配列表】

2024507823000001.app

【国際調査報告】