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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】マルチドメイン融合タンパク質及びその応用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240214BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/90 20060101ALI20240214BHJP
C07K 14/435 20060101ALI20240214BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240214BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240214BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240214BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240214BHJP
C07K 16/30 20060101ALI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z ZNA
C12N15/12
C12N15/13
C12N15/63 Z
C12N15/90 Z
C07K14/435
C12P21/08
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/02 C
C07K19/00
C07K16/30
A61P35/00
A61K48/00
A61K38/16
A61K39/395 N
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550320
(86)(22)【出願日】2022-02-17
(85)【翻訳文提出日】2023-09-04
(86)【国際出願番号】 CN2022076610
(87)【国際公開番号】W WO2022174781
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/077282
(32)【優先日】2021-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521309754
【氏名又は名称】浙江道尓生物科技有限公司
(74)【代理人】
【識別番号】110001999
【氏名又は名称】弁理士法人はなぶさ特許商標事務所
(72)【発明者】
【氏名】黄 岩山
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B064DA05
4B064DA14
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4B065CA46
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA01
4C084BA41
4C084DB70
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C085AA14
4C085AA21
4C085BB01
4C085BB11
4C085EE01
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045EA28
4H045FA72
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを含む。本発明で提供する抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質は、１つの抗体融合タンパク質分子において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の機能と、毛細血管の成長を減少させ、転移性疾患を抑制する抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の機能と、ＴＧＦ－βシグナルに対する癌細胞の耐性を解除して免疫応答を強化するＴＧＦ－β受容体の機能を有機的に組み合わせることが可能なため、腫瘍の治療に使用可能である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５のいずれかで示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６～９のいずれかで示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０～１５のいずれかで示されるＣＤＲ３を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０で示されるＣＤＲ３を含むか、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示されるＣＤＲ３を含むか、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示されるＣＤＲ３を含むか、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．８で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示されるＣＤＲ３を含むか、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示されるＣＤＲ３を含むか、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示されるＣＤＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．９で示されるＣＤＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示されるＣＤＲ３を含むことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、更に、フレームワーク領域を含み、前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０～５２のいずれかで示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３～５５のいずれかで示されるＦＲ３、及びアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、を含むことを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列が以下で示されるＦＲ１～ＦＲ４として、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０で示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３で示されるＦＲ３、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１で示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４で示されるＦＲ３、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２で示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４で示されるＦＲ３、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、
アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２で示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５で示されるＦＲ３、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、を含むことを特徴とする請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかで示されるポリペプチドフラグメント、或いは、
ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかと９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み、
及び／又は、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントはアルパカ由来であり、
及び／又は、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントはヒト化されていることを特徴とする請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記ＶＥＧＦ拮抗フラグメントはベバシズマブであり、好ましくは、前記ＶＥＧＦ拮抗フラグメントは、ｃ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかで示されるポリペプチドフラグメント、或いは、
ｄ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかと９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｃ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み、
及び／又は、前記ＶＥＧＦ拮抗フラグメントはネズミ由来であり、
及び／又は、前記ＶＥＧＦ拮抗フラグメントはヒト化されていることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ＴＧＦ－βＲII細胞外領域構造のフラグメントであり、好ましくは、前記ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ｅ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で示されるポリペプチドフラグメント、或いは、
ｆ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４と９０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｅ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み、
及び／又は、前記ＴＧＦ－β結合フラグメントはヒト由来であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記融合タンパク質は、更に、連結ペプチドフラグメントを含み、好ましくは、前記連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含み、より好ましくは、前記連結ペプチドは、Ｇグリシン及び／又はＳセリン及び／又はＡアラニンで構成される柔軟なポリペプチド鎖から選択され、前記連結ペプチドの長さは３～３０個のアミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記連結ペプチドフラグメントは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４～３６のいずれかで示されるポリペプチドフラグメントを含み、及び／又は、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントとＶＥＧＦ拮抗フラグメントの間には連結ペプチドが設けられており、
及び／又は、前記ＶＥＧＦ拮抗フラグメントとＴＧＦ－β結合フラグメントの間には連結ペプチドが設けられていることを特徴とする請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
前記融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを順に含み、及び／又は、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの重鎖のＮ末端に位置し、
及び／又は、前記抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの軽鎖のＮ末端に位置し、
及び／又は、前記ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの重鎖のＣ末端に位置することを特徴とする請求項１～１０のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項12】
前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５～３３のいずれかで示される配列を含み、或いは、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項13】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチド。
【請求項14】
請求項１３に記載の分離したポリヌクレオチドを含む構造体。
【請求項15】
請求項１４に記載の構造体、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれた請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含む発現システム。
【請求項16】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質の作製方法であって、請求項１５に記載の発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させ、分離及び精製することで前記融合タンパク質を提供することを含む方法。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は、請求項１５に記載の発現システムの培養物の、薬物の製造における使用。
【請求項18】
前記薬物は、腫瘍の治療に用いられる薬物から選択され、好ましくは、前記腫瘍は、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、肉腫、頭頸部癌及び鼻咽頭癌から選択されることを特徴とする請求項１７に記載の使用。
【請求項19】
請求項１～１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質、又は請求項１５に記載の発現システムの培養物を含む薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、特に、抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質とその作製方法及び使用に関する。
【背景技術】
【0002】
腫瘍細胞と正常細胞の違いの一つは、成長時の高い代謝要求にある。腫瘍細胞は、血管から栄養物質や酸素が供給されて、代謝産物を処理するとともに、既存の血管上に新生血管の生成を促す。腫瘍から分泌される血管新生促進因子のうち、ヒト血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、とりわけＶＥＧＦ－Ａは、腫瘍の血管新生をもたらす重要な因子である（非特許文献１）。そのため、ＶＥＧＦシグナル経路を阻害することで、多くの腫瘍の進行を制限可能となる。例えば、ベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ，商標名アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）（登録商標））は、ヒト化抗－ＶＥＧＦモノクローナル抗体であって、ＶＥＧＦと結合することで、ＶＥＧＦと内皮細胞表面のＶＥＧＦ受容体（Ｆｌｔ－１及びＫＤＲ）との相互作用を遮断可能である。現在、ベバシズマブモノクローナル抗体は、転移性結腸・直腸癌、末期、転移性或いは再発性の非小細胞肺癌及び再発性膠芽腫等の治療への適用がＦＤＡにより認可されている。
【0003】
トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦ－βはサイトカインの一種であり、細胞の成長、分化、増殖及び生存を調節することで組織の恒常性を維持可能とする。腫瘍の初期段階において、ＴＧＦ－β経路は、細胞周期の停滞やアポトーシスを促進することで腫瘍を制御可能とする。しかし、腫瘍の末期段階になると、ＴＧＦ－βは、細胞傷害性Ｔ細胞を阻害して癌細胞の増殖、浸潤及び転移を促進可能となり、最終的には腫瘍を逃避させてしまう。このような機能の転換は「ＴＧＦ－βパラドックス」と称される。ＴＧＦβシグナル経路は、ＴＨ１細胞からＴｒｅｇｓへの分化を誘導し、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞の活性化を減弱させるとともに、セントラルメモリーＴ細胞の発育を制限して、腫瘍浸潤Ｔ細胞の機能に根本的な影響を及ぼす。哺乳動物において、ＴＧＦ－βには、主に、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２、ＴＧＦ－β３という３種類のサブタイプが存在する。ＴＧＦ－βが高水準で発現することで、腫瘍は免疫監視から逃れられるようになる。また、これと一致して、ＴＧＦ－βが高発現した非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎細胞癌（ＣＲＣ）、胃癌及び前立腺癌には、いずれも腫瘍の進行や予後不良が関係してくる（非特許文献２）。このことは、ＴＧＦ－βとの拮抗が、腫瘍治療における新たな潜在的方向性であることを示している。
【0004】
現在、腫瘍の治療には、免疫チェックポイント阻害剤である抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体が幅広く応用されている。また、抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体であるアベルマブとＴＧＦ－β受容体II（ＴＧＦ－β Ｔｒａｐ）を融合させたＭ７８２４が臨床段階に進んでいる。しかし、抗ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体、ＴＧＦ－βアンタゴニスト及び抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の組み合わせについては、今のところ報告がない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｊｏｓｅｐ Ｇａｒｃｉａほか，２０２０，Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ ８６：１－２
【非特許文献2】Ｍａｒｉｎ－Ａｃｅｖｅｄｏほか，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ＆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，１１：３９，２０１８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0006】
上述した従来技術の欠点に鑑みて、本発明の目的は、従来技術の課題を解決するために、抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質とその作製方法及び使用を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【0007】
上記の目的及び関連するその他の目的を実現するために、本発明は、一の局面において、融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを含む。
【0008】
本発明は、他の局面において、上記の融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。
【0009】
本発明は、他の局面において、構造体を提供する。前記構造体は、上記の分離したポリヌクレオチドを含む。
【0010】
本発明は、他の局面において、発現システムを提供する。前記発現システムは、上記の構造体、又はゲノムに外来遺伝子が組み込まれた上記のポリヌクレオチドを含む。
【0011】
本発明は、他の局面において、上記の融合タンパク質の作製方法を提供する。当該方法は、上記の発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させ、分離及び精製することで前記融合タンパク質を提供することを含む。
【0012】
本発明は、他の局面において、上記の融合タンパク質又は上記の発現システムの培養物の、薬物の製造における使用を提供する。
【0013】
本発明は、他の局面において、上記の融合タンパク質又は上記の発現システムの培養物を含む薬物組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明の発明者は、膨大な探求・研究を通じて、想定外に一種の融合タンパク質分子を発見した。当該融合タンパク質分子は、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の機能と、毛細血管の成長を減少させ、転移性疾患を抑制するＶＥＧＦ拮抗モノクローナル抗体の機能と、腫瘍微小環境においてＴＧＦ－βが引き起こすＴ細胞の機能異常を改善し、免疫応答を強化するＴＧＦ－β受容体の機能を組み合わせることが可能であり、優れた腫瘍抑制効果を有する。これに基づき、本発明を完成させた。
【0016】
本発明は、第１の局面において、融合タンパク質を提供する。前記融合タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを含む。上記の融合タンパク質において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、通常、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断し、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２の発現を向上させることで、腫瘍の成長を抑制するために使用可能である。また、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントは、通常、ＦｃＲｎ受容体と結合可能なＦｃ部分を含み得る。これにより、体内半減期を延長可能にするとともに、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞と結合することで癌細胞を殺傷する作用も奏し得る。また、ＴＧＦ－β結合フラグメントは、腫瘍微小環境において過剰に発現したＴＧＦ－βを除去することで、腫瘍浸潤Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷機能を向上可能とする。
【0017】
本発明で提供する融合タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントを含み得る。通常、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合可能なポリペプチド又はタンパク質フラグメントとすることができる。通常、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、対応する抗体軽鎖が欠如しており、重鎖可変領域に対応するフラグメントのみを有する。抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの結合特性は、通常、当該フラグメントに含まれる３つの相補性決定領域（ＣＤＲ，ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ）により決定可能である。ＣＤＲ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ，ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）と秩序を持って並び得る。ＦＲ領域は結合反応には直接関与しない。これらのＣＤＲは環状構造を形成可能である。ＣＤＲは、これらの間のＦＲが形成するβシートを通じて空間構造内で互いに近接し、抗体の抗原結合部位を構成する。例えば、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１～５のいずれかで示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６～９のいずれかで示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０～１５のいずれかで示されるＣＤＲ３を含み得る。
【0018】
本発明の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．６で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１０で示されるＣＤＲ３を含む。
【0019】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示されるＣＤＲ３を含む。
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１１で示されるＣＤＲ３を含む。
【0020】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント
の相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示されるＣＤＲ３を含む。
の相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１２で示されるＣＤＲ３を含む。
【0021】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示されるＣＤＲ３を含む。
ＩＤ ＮＯ．８で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１３で示されるＣＤＲ３を含む。
【0022】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示されるＣＤＲ３を含む。
ＩＤ ＮＯ．７で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１４で示されるＣＤＲ３を含む。
【0023】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントの相補性決定領域は、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５で示されるＣＤＲ１、ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．９で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示されるＣＤＲ３を含む。
ＩＤ ＮＯ．９で示されるＣＤＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１５で示されるＣＤＲ３を含む。
【0024】
上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、更に、フレームワーク領域（ＦＲ，ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含んでもよい。上述したように、ＣＤＲ領域はＦＲ領域と秩序を持って並び得る。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４を順に含み得る。フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０～５２のいずれかで示されるＦＲ２、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３～５５のいずれかで示されるＦＲ３、及びアミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、を含む。
【0025】
本発明の具体的実施例において、前記フレームワーク領域ＦＲは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５０で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５３で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５１で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５４で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、或いは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４９で示されるＦＲ１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５２で示されるＦＲ２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５５で示されるＦＲ３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．５６で示されるＦＲ４、を含む。
【0026】
本発明の別の具体的実施例において、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ａ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかで示されるポリペプチドフラグメント、或いは、ｂ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかと８０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ａ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み得る。具体的に、上記ｂ）のポリペプチドフラグメントは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかで示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠損又は添加を経て得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個又は１～３個とすることができ
る）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかで示されるポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメントは、例えば、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する能力を有していてもよいし、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断することでＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１経路を遮断可能であってもよいし、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２の発現を向上させる機能を有していてもよいし、腫瘍の成長を抑制する機能を有していてもよい。上記ｂ）の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかと８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の同一性を有していてもよい。通常、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）から入手可能であり、例えば、ＣＤＲ領域をアルパカから入手してもよい。また、通常、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントはヒト化してもよく、例えば、フレームワーク領域をヒトから入手してもよい。
る）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかで示されるポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメントは、例えば、ＰＤ－Ｌ１と特異的に結合する能力を有していてもよいし、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断することでＰＤ－Ｌ１／ＰＤ１経路を遮断可能であってもよいし、Ｔ細胞におけるＩＦＮ－γ及び／又はＩＬ－２の発現を向上させる機能を有していてもよいし、腫瘍の成長を抑制する機能を有していてもよい。上記ｂ）の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントのアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１６～２１のいずれかと８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の同一性を有していてもよい。通常、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、アルパカ（Ｖｉｃｕｇｎａ ｐａｃｏｓ）から入手可能であり、例えば、ＣＤＲ領域をアルパカから入手してもよい。また、通常、上記の抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントはヒト化してもよく、例えば、フレームワーク領域をヒトから入手してもよい。
【0027】
本文中において、配列同一性（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）とは、比較対象の配列における同一残基のパーセンテージを意味する。当該分野において周知の演算ソフトを利用すれば、標的とする２つ又は複数の配列について配列同一性を演算可能である。これらのソフトウェアは、例えばＮＣＢＩから入手できる。
【0028】
本発明で提供する融合タンパク質は、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントを含み得る。通常、上記のＶＥＧＦ拮抗フラグメントは、ＶＥＧＦに拮抗可能なポリペプチド又はタンパク質フラグメントとすることができる。例えば、上記のＶＥＧＦ拮抗フラグメントはモノクローナル抗体等としてもよい。また、例えば、上記のＶＥＧＦ拮抗フラグメントはベバシズマブ等としてもよい。
【0029】
本発明の具体的実施例において、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントは、ｃ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかで示されるポリペプチドフラグメント、ｄ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかと８０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｃ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み得る。具体的に、上記ｄ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかで示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠損又は添加を経て得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかで示されるポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメントは、例えば、ＶＥＧＦに拮抗する機能を有していてもよいし、ＦｃＲｎ受容体と結合可能なＦｃ部分の機能を有していてもよい。これにより、体内半減期を延長可能になるとともに、Ｆｃ受容体を発現するエフェクター細胞と結合することで癌細胞を殺傷する作用を奏することも可能となる。上記ｄ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２２～２３のいずれかと８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の同一性を有していてもよい。通常、上記のＶＥＧＦ拮抗フラグメントは、マウス（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ）から入手可能であり、例えば、ＣＤＲ領域をマウスから入手してもよい。また、通常、上記のＶＥＧＦ拮抗フラグメントはヒト化してもよく、例えば、フレームワーク領域をヒトから入手してもよい。
【0030】
本発明で提供する融合タンパク質は、ＴＧＦ－β結合フラグメントを含み得る。通常、上記のＴＧＦ－β結合フラグメントは、各ＴＧＦ－βの異性体（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３等）に特異的に結合可能である。通常、ＴＧＦ－βの異性
体は、多種類の悪性腫瘍に高発現し、臨床治療効果を悪化させる重要要素の一つとなる可能性が高い。例えば、ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ＴＧＦ－βＲII（ＴＧＦ－β受容体II）細胞外領域構造のフラグメントとしてもよい。
体は、多種類の悪性腫瘍に高発現し、臨床治療効果を悪化させる重要要素の一つとなる可能性が高い。例えば、ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ＴＧＦ－βＲII（ＴＧＦ－β受容体II）細胞外領域構造のフラグメントとしてもよい。
【0031】
本発明の具体的実施例において、ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ｅ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で示されるポリペプチドフラグメント、ｆ）アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４と８０％以上の配列同一性を有しており、且つ、ｅ）で限定したポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメント、を含み得る。具体的に、上記ｆ）のアミノ酸配列とは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で示されるアミノ酸配列が、１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸の置換、欠損又は添加を経て得られるものであるか、或いは、Ｎ－末端及び／又はＣ－末端に１又は複数（具体的には、１～５０個、１～３０個、１～２０個、１～１０個、１～５個、１～３個、１個、２個又は３個とすることができる）のアミノ酸を添加することで得られるものである。且つ、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４で示されるポリペプチドフラグメントの機能を有するポリペプチドフラグメントは、例えば、各ＴＧＦ－βの異性体（例えば、ＴＧＦ－β１、ＴＧＦ－β２及びＴＧＦ－β３等）に結合可能である。これにより、腫瘍微小環境において過剰に発現したＴＧＦ－βを除去可能となり、腫瘍浸潤Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺傷機能を向上させることも可能となる。上記ｆ）のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２４と８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９７％又は９９％以上の同一性を有していてもよい。通常、上記のＴＧＦ－β結合フラグメントは、ヒト（ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ）から入手可能である。
【0032】
本発明で提供する融合タンパク質は、更に、連結ペプチドフラグメントを含んでもよい。通常、前記融合タンパク質は複数の連結ペプチドフラグメントを含むことができ、少なくとも一部のドメイン又は各ドメイン間に連結ペプチドフラグメントが設けられてもよい。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントとＶＥＧＦ拮抗フラグメントの間に連結ペプチドが設けられてもよい。また、例えば、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントとＴＧＦ－β結合フラグメントの間に連結ペプチドが設けられてもよい。通常、上記の連結ペプチドフラグメントは、Ｇ、Ｓ及び／又はＡを豊富に含む（グリシン（Ｇ）、セリン（Ｓ）及び／又はアラニン（Ａ）で主に構成される）適切な長さの柔軟なポリペプチドとすることができる。これにより、隣接するタンパク質のドメインを互いに相対的に自由に移動可能とできる。例えば、前記連結ペプチドフラグメントのアミノ酸配列は、（ＧＳ）ｎ、（ＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＳＧ）ｎ、（ＧＧＧＳ）ｎＡ、（ＧＧＧＧＳ）ｎＡ、（ＧＧＧＧＳ）ｎＧ、（ＧＧＧＧＡ）ｎＡ、（ＧＧＧＧＧ）ｎＡ等の配列を含んでもよい。なお、ｎは１～１０の間の整数から選択される。本発明の具体的実施例において、前記連結ペプチドフラグメントのアミノ酸配列の長さは、３～３０、３～４、４～６、６～８、８～１０、１０～１２、１２～１４、１４～１６、１６～１８、１８～２０、２０～２２、２２～２４、２４～２６、２６～２８又は２８～３０としてもよい。本発明の更に好ましい具体的実施例において、前記連結ペプチドフラグメントは、アミノ酸配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３４～３６のいずれかで示されるポリペプチドフラグメントを含み得る。
【0033】
本発明で提供する融合タンパク質において、融合タンパク質は線形としてもよい。例えば、融合タンパク質は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメント、ＶＥＧＦ拮抗フラグメント、ＴＧＦ－β結合フラグメントを順に含んでもよい。また、融合タンパク質は、モノクローナル抗体と類似の構造を有してもよい。例えば、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの重鎖のＮ末端に位置してもよい。また、例えば、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの軽鎖のＮ末端に位置してもよい。また、例えば、ＴＧＦ－β結合フラグメントは、ＶＥＧＦ拮抗フラグメントの重鎖のＣ末端に位置しても
よい。本発明の具体的実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５～３３のいずれかで示される配列を含み得る。例えば、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列を含み得る。
よい。本発明の具体的実施例において、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５～３３のいずれかで示される配列を含み得る。例えば、前記融合タンパク質のアミノ酸配列は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２６で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２８で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２５及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２７で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３０及びＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ．２９で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３２及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．３３及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２３で示される配列を含み得る。
【0034】
本発明は、第２の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質をコードする分離したポリヌクレオチドを提供する。上記のポリヌクレオチドは、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はｃＤＮＡ等とすることができる。前記分離したポリヌクレオチドを提供する方法は、当業者にとって既知のものとすべきである。例えば、自動ＤＮＡ合成及び／又は組換えＤＮＡ技術等の方法で作製して取得してもよいし、適切な天然源から分離してもよい。
【0035】
本発明は、第３の局面において、構造体を提供する。上記の構造体は、本発明の第２の局面で提供した分離したポリヌクレオチドを含む。上記の構造体を適切に作製する方法は、当業者にとって既知のものとすべきである。例えば、前記構造体は、生体外組換えＤＮＡ技術、ＤＮＡ合成技術、生体内組換え技術等の方法で作製して取得可能であり、より具体的には、上記の分離したポリヌクレオチドを発現ベクターのマルチクローニングサイトに挿入することで作製可能である。本発明における発現ベクターとは、通常、当該分野において熟知されている市販の各種発現ベクター等のことであり、例えば、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）、又はその他のベクターとすることができる。通常、適切なベクターは、少なくとも１つの有機体において役割を発揮する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素部位、及び１又は複数の選択可能なマーカーを含み得る。例えば、これらのプロモーターには、大腸菌のｌａｃ又はｔｒｐプロモーター、λファージのＰＬプロモーター、真核プロモーター（ＣＭＶ主要前初期プロモーター、ＨＳＶチミジンキナーゼプロモーター、初期及び後期ＳＶ４０プロモーター、ピキア・パストリスのメタノールオキシダーゼプロモーターを含む）、及びその他の制御可能な既知の遺伝子が原核又は真核細胞或いはそのウイルス内で発現するプロモーターが含まれ得るが、これらに限らない。マーカー遺伝子は、形質転換した宿主細胞を選択するための表現型及び性状を付与するために使用可能である。例えば、真核細胞培養用のジヒドロ葉酸レダクターゼ、ネオマイシン耐性及び緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、或いは、大腸菌に用いられるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等が含まれ得るが、これらに限らない。上記のポリヌクレオチドを発現する場合には、発現ベクターにエンハンサー配列を含んでもよい。ベクターにエンハンサー配列を挿入すれば、転写が強化される。エンハンサーはＤＮＡのシスエレメントであり、通常は約１０～３００個の塩基対を有している。エンハンサーがプロモーターに作用することで、遺伝子の転写が強化される。
【0036】
本発明は、第４の局面において、発現システムを提供する。上記の融合タンパク質を発現できるよう、前記発現システムは、本発明の第３の局面で提供した構造体、或いは、ゲノムに外来遺伝子が組み込まれた本発明の第２の局面で提供したポリヌクレオチドを含む。上記の発現システムは宿主細胞としてもよい。発現ベクターの発現に適用されるあらゆる細胞は、いずれも宿主細胞となり得る。例えば、宿主細胞は、細菌細胞のような原核細胞、或いは、酵母細胞や糸状真菌細胞のような下等真核細胞、或いは、哺乳動物細胞のような高等真核細胞とすることができる。代表的な例としては、大腸菌、ストレプトマイセス属、サルモネラ・ティフィムリウムの細菌細胞、例えば、酵母、糸状真菌、植物細胞の
ような真菌細胞、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３細胞、或いはＢｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞の動物細胞等がある。構造体を宿主細胞に導入する方法は当業者にとって既知のものとすべきであり、例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等の方法とすることができる。
ような真菌細胞、ショウジョウバエＳ２又はＳｆ９の昆虫細胞、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３細胞、或いはＢｏｗｅｓ悪性黒色腫細胞の動物細胞等がある。構造体を宿主細胞に導入する方法は当業者にとって既知のものとすべきであり、例えば、マイクロインジェクション法、パーティクル・ガン法、電気穿孔法、ウイルス媒介性形質転換法、電子衝撃法、リン酸カルシウム共沈殿法等の方法とすることができる。
【0037】
本発明は、第５の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質の作製方法を提供する。当業者は、適切な方法を選択して前記融合タンパク質を作製可能である。例えば、前記作製方法は以下を含み得る。即ち、本発明の第４の局面で提供した発現システムを適切な条件で培養し、当該発現システムに前記融合タンパク質を発現させて、前記融合タンパク質を含有する培養物を収集する。その後、分離及び精製することで前記融合タンパク質を提供する。
【0038】
本発明は、第６の局面において、薬物の製造における本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質と、本発明の第４の局面で提供した発現システムの培養物の使用を提供する。上記の薬物は、腫瘍の治療に用いられる薬物とすることができる。腫瘍とは、例えば、癌又は固形腫瘍とすることができ、具体的には、肺癌、黒色腫、胃癌、卵巣癌、結腸癌、肝臓癌、腎臓癌、膀胱癌、乳癌、古典的ホジキンリンパ腫、血液悪性腫瘍、肉腫、頭頸部癌及び鼻咽頭癌等とすることができる。また、これらの癌は、初期、中期又は末期とすることができ、例えば転移癌等であってもよい。
【0039】
本発明は、第７の局面において、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質又は本発明の第４の局面で提供した発現システムの培養物を含む薬物組成物を提供する。通常、上記の薬物組成物における融合タンパク質又は培養物の含有量は治療有効量である。本発明において、通常、「治療有効量」とは、適切な投与期間を経たあと、疾病症状の大幅な軽減や、疾病無症状期の頻度及び持続期間の増加、或いは、疾病の苦痛に起因する損傷又は機能喪失の防止が可能となる用量のことである。腫瘍の成長を抑制する能力は、ヒト腫瘍に対する治療効果を予測するための動物モデルシステムで評価可能である。或いは、細胞の成長を抑制する能力を検査することで評価してもよい。このような抑制は、当業者にとって公知の実験を通じて生体外で測定可能である。治療有効量の融合タンパク質、薬物組成物によって、通常は、腫瘍の大きさを縮小することが可能である。或いは、その他の方式で対象の症状を緩和することができる。当業者は、例えば、対象の大きさ、対象症状の重大性、及び選択した特定の組成物又は投与経路といった実際の状況に応じて適切な治療有効量を選択すればよい。治療の処方（例えば、投与量の決定等）は医師により定めてもよい。また、通常考慮する要因には、治療しようとする疾病、患者の個別の状況、送達部位、適用方法及びその他の要因等が含まれるがこれらに限らない。
【0040】
本発明で提供する薬物組成物は、更に、薬学的に許容可能なベクターを含んでもよい。上記のベクターは、各種の賦形剤及び希釈剤を含み得るが、これらのベクター自体は必須の活性成分ではなく、且つ投与後に過度な毒性を有さない。適切なベクターは、当業者が熟知するものとすべきであり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．，１９９１）から、薬学的に許容可能なベクターについての十分な議論を得ることができる。
【0041】
本発明は、第８の局面において、個体に対し、本発明の第１の局面で提供した融合タンパク質、本発明の第４の局面で提供した発現システムの培養物、又は、本発明の第７の局面で提供した薬物組成物を治療有効量だけ投与することを含む治療方法を提供する。
【0042】
本発明において、「治療」には、理想的な薬学的及び／又は生理学的効果をもたらし得る予防的、治愈的又は緩和的な操作が含まれる。治療効果とは、好ましくは、疾病の１又
は複数の症状を医療的に減少させられること、或いは、疾病を完全に除去できること、或いは、疾病の発生を停滞、遅延させられること、及び／又は、疾病の進行又は悪化のリスクを低下させられることを意味する。
は複数の症状を医療的に減少させられること、或いは、疾病を完全に除去できること、或いは、疾病の発生を停滞、遅延させられること、及び／又は、疾病の進行又は悪化のリスクを低下させられることを意味する。
【0043】
本発明において、「個体」には、通常、ヒト、ヒト以外の霊長類又はその他の哺乳動物（例えば、犬、猫、馬、羊、ブタ、牛等）が含まれる。「個体」は、前記製剤、試薬キット又は配合剤を用いて治療することで利益を獲得可能である。
【0044】
本発明において、上記の融合タンパク質、発現システムの培養物又は薬物組成物は、単一の有効成分としてもよいし、併用療法で投与するためにその他の薬剤と併用してもよい。例えば、上記の抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質、発現システムの培養物又は薬物組成物をその他の少なくとも１種類の抗腫瘍薬と組み合わせてもよい。また、例えば、上記の抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質、発現システムの培養物又は薬物組成物をその他の腫瘍特異性抗原を標的とする抗体と組み合わせて使用してもよい。
【0045】
本発明で提供する抗癌活性を有するマルチドメイン融合タンパク質は、１つの抗体融合タンパク質分子において、ＰＤ－Ｌ１／ＰＤ－１の相互作用を遮断する抗ＰＤ－Ｌ１モノクローナル抗体の機能と、毛細血管の成長を減少させ、転移性疾患を抑制する抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の機能と、ＴＧＦ－βシグナルに対する癌細胞の耐性を解除して免疫応答を強化するＴＧＦ－β受容体の機能を有機的に組み合わせることが可能なため、腫瘍の治療に使用可能であり、良好な産業化の展望を有する。
【0046】
以下に、特定の具体的実施例を通じて、本発明の実施形態につき説明する。なお、当業者であれば、本明細書に開示した内容から本発明のその他の利点及び効果を容易に理解可能である。更に、本発明は、その他の異なる具体的実施形態によっても実施又は応用可能である。また、本明細書の各詳細は、異なる視点及び応用に基づき、本発明の精神を逸脱しないことを前提に各種の補足又は変更が可能である。
【0047】
本発明の具体的実施形態について更に記載する前に、理解すべき点として、本発明の保護の範囲は後述する特定の具体的実施方案に限らない。また、更に理解すべき点として、本発明の実施例で使用する用語は特定の具体的実施方案を記載するためのものであって、本発明の保護の範囲を制限するものではない。
【0048】
実施例で数値範囲を示している場合には、本発明において別途説明している場合を除き、各数値範囲の２つの端点及び２つの端点間の任意の数値をいずれも選択可能であると解釈すべきである。また、別途定義している場合を除き、本発明で使用するあらゆる技術及び科学用語は、当業者が一般的に理解する意味と同じである。更に、実施例で使用している具体的方法、デバイス、材料のほかに、当業者による従来技術の理解及び本発明の記載に基づいて、本発明の実施例で述べる方法、デバイス、材料と類似又は同等の従来技術における任意の方法、デバイス及び材料を用いて本発明を実現してもよい。
【0049】
別途説明している場合を除き、本発明で開示する実験方法、検出方法、作製方法は、いずれも当該技術分野において一般的な分子生物学、生化学、クロマチン構造及び分析、分析化学、細胞培養、組換えＤＮＡ技術及び関連分野における一般的技術を用いている。これらの技術は、従来の文献で完全に説明されており、具体的には、Ｓａｍｂｒｏｏｋほか，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，Ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ
ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等の文献を参照すればよい。
Ｐｒｅｓｓ，１９８９ ａｎｄ Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１、Ａｕｓｕｂｅｌほか，ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，
Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７ ａｎｄ ｐｅｒｉｏｄｉｃ
ｕｐｄａｔｅｓ、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、Ｗｏｌｆｆｅ，ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ
ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ ＡＮＤ ＦＵＮＣＴＩＯＮ，Ｔｈｉｒｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９８、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．３０４，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ（Ｐ．Ｍ．Ｗａｓｓａｒｍａｎ ａｎｄ Ａ．Ｐ．Ｗｏｌｆｆｅ，ｅｄｓ．），Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９９、及び、ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌ．１１９，Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｐ．Ｂ．Ｂｅｃｋｅｒ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，１９９９等の文献を参照すればよい。
【実施例1】
【0050】
実施例１融合タンパク質の構築と組換え・発現・作製
ＣＨＯ細胞のコドンバイアスに基づいて、表１のマルチドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）及びＦｃ－ＴＧＦβＲII融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）の各々を塩基配列にそれぞれ変換した。そして、重鎖及び軽鎖のコード配列の５’末端にＨｉｎｄIII酵素切断部位及びＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）をそれぞれ導入し、３’末端に終止コドン及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位を導入して、遺伝子合成（通用生物系統（安徽）有限公司）によりＤＮＡの全長を取得した。次に、合成した重鎖及び軽鎖のコード遺伝子について、ＨｉｎｄIII－ＨＦ（ＮＥＢ社より購入。Ｒ３１０４Ｖ）及びＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ社より購入。Ｒ３１０１Ｖ）によるダブルダイジェストをそれぞれ行い、アガロースゲルＤＮＡ／ＰＣＲ産物少量回収試薬キット（Ｂｉｏｍｉｇａ社より購入）を用いてゲルから切断・回収した。そして、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社より購入。Ｍ０２０２Ｖ）を用い、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩによるダブルダイジェストを同様に行ったｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターと連結することでＴｏｐ１０コンピテント状態に形質転換してから、ＬＢアンピシリン耐性プレートに塗布して培養した。続いて、クローンを選択して鑑定し、シーケンスを確認して、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）をベースとする重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれ構築した。次に、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（Ｂｉｏｍｉｇａ社より購入。ＢＷ－ＰＤ３５１１－０２）を用い、重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれ抽出して、これらを１：１で混合した。そして、１．０ｍｇの混合プラスミドを取り、Ｗａｙｎｅ２９３発現培地（中山康晟社より購入。Ａ２１５０１）を用いて２５ｍＬまで希釈した。続いて、３．０ｍｇのＰＥＩ（線形、２５ＫＤ、ポリサイエンス社）を取り、Ｗａｙｎｅ２９３発現培地を用いて２５ｍｌまで希釈したあとプラスミド溶液に加え、均一に混合してから室温で３０分間培養した。また、対数増殖期のＨｅｋ２９３Ｆ細胞（生存率＞９５％）を取ってカウントした。これを１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清を廃棄してから、４５０ｍＬのＷａｙｎｅ２９３発現培地を用いて細胞を再懸濁した。そして、上記のプラスミド－ＰＥＩ混合物を細胞懸濁液に加え、３７℃、５％ＣＯ２の振とう培養機で７日間培養したあと、遠心分離にかけて上清を取り、後続のタンパク質の精製に用いた。
ＣＨＯ細胞のコドンバイアスに基づいて、表１のマルチドメイン融合タンパク質のアミノ酸配列、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）及びＦｃ－ＴＧＦβＲII融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）の各々を塩基配列にそれぞれ変換した。そして、重鎖及び軽鎖のコード配列の５’末端にＨｉｎｄIII酵素切断部位及びＫｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）をそれぞれ導入し、３’末端に終止コドン及びＥｃｏＲＩ酵素切断部位を導入して、遺伝子合成（通用生物系統（安徽）有限公司）によりＤＮＡの全長を取得した。次に、合成した重鎖及び軽鎖のコード遺伝子について、ＨｉｎｄIII－ＨＦ（ＮＥＢ社より購入。Ｒ３１０４Ｖ）及びＥｃｏＲＩ－ＨＦ（ＮＥＢ社より購入。Ｒ３１０１Ｖ）によるダブルダイジェストをそれぞれ行い、アガロースゲルＤＮＡ／ＰＣＲ産物少量回収試薬キット（Ｂｉｏｍｉｇａ社より購入）を用いてゲルから切断・回収した。そして、Ｔ４リガーゼ（ＮＥＢ社より購入。Ｍ０２０２Ｖ）を用い、ＨｉｎｄIII及びＥｃｏＲＩによるダブルダイジェストを同様に行ったｐＣＤＮＡ３．１（＋）ベクターと連結することでＴｏｐ１０コンピテント状態に形質転換してから、ＬＢアンピシリン耐性プレートに塗布して培養した。続いて、クローンを選択して鑑定し、シーケンスを確認して、ｐＣＤＮＡ３．１（＋）をベースとする重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれ構築した。次に、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（Ｂｉｏｍｉｇａ社より購入。ＢＷ－ＰＤ３５１１－０２）を用い、重鎖及び軽鎖の発現プラスミドをそれぞれ抽出して、これらを１：１で混合した。そして、１．０ｍｇの混合プラスミドを取り、Ｗａｙｎｅ２９３発現培地（中山康晟社より購入。Ａ２１５０１）を用いて２５ｍＬまで希釈した。続いて、３．０ｍｇのＰＥＩ（線形、２５ＫＤ、ポリサイエンス社）を取り、Ｗａｙｎｅ２９３発現培地を用いて２５ｍｌまで希釈したあとプラスミド溶液に加え、均一に混合してから室温で３０分間培養した。また、対数増殖期のＨｅｋ２９３Ｆ細胞（生存率＞９５％）を取ってカウントした。これを１１００ｒｐｍで１０分間遠心分離にかけ、上清を廃棄してから、４５０ｍＬのＷａｙｎｅ２９３発現培地を用いて細胞を再懸濁した。そして、上記のプラスミド－ＰＥＩ混合物を細胞懸濁液に加え、３７℃、５％ＣＯ２の振とう培養機で７日間培養したあと、遠心分離にかけて上清を取り、後続のタンパク質の精製に用いた。
【0051】
【表1】
【実施例2】
【0052】
実施例２マルチドメイン融合タンパク質の精製
２．１ 抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の重鎖のＮ末端に位置する場合
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。次に、１００％の溶出液をコンダクタンス＜３ｍｓ／ｃｍまで希釈し、上清液をｐＨ７．０に調整してからＤＳＰクロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入して、１５％及び１００％でそれぞれ溶出させた（２０ｍＭ ＰＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。これにより、目的のタンパク質である１５％の溶出成分を取得した。また、ＵＶ２８０法でタンパク質濃度を測定した。
２．１ 抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の重鎖のＮ末端に位置する場合
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。次に、１００％の溶出液をコンダクタンス＜３ｍｓ／ｃｍまで希釈し、上清液をｐＨ７．０に調整してからＤＳＰクロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入して、１５％及び１００％でそれぞれ溶出させた（２０ｍＭ ＰＢ、０．５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）。これにより、目的のタンパク質である１５％の溶出成分を取得した。また、ＵＶ２８０法でタンパク質濃度を測定した。
【0053】
２．２ 抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体が抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体の軽鎖のＮ末端に位置する場合
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。次に、１００％の溶出液をコンダクタンス４ｍｓ／ｃｍまで希釈して、Ｓｕｐｅｒ Ｑ（東ソー社）クロマトグラフィーカラムにサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８、溶出液を５００ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）として、３５％及び１００％でそれぞれ溶出させた。そして、フロースルーにより余分な軽鎖を除去して、目的のタンパク質である３５％の溶出成分を取得した。また、ＵＶ２８０法でタンパク質濃度を測定した。
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。次に、１００％の溶出液をコンダクタンス４ｍｓ／ｃｍまで希釈して、Ｓｕｐｅｒ Ｑ（東ソー社）クロマトグラフィーカラムにサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ８、溶出液を５００ｍＭ ＮａＣｌ＋２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ＝８．０）として、３５％及び１００％でそれぞれ溶出させた。そして、フロースルーにより余分な軽鎖を除去して、目的のタンパク質である３５％の溶出成分を取得した。また、ＵＶ２８０法でタンパク質濃度を測定した。
【0054】
純度チェックにはＳＥＣ－ＨＰＬＣ－ＵＶ分析を使用した。検出器はＡｇｉｌｅｎｔ １１００ ＬＣ、検出波長は２１４ｎｍ、流動相は１５０ｍＭ ｐＨ７．０ ＰＢ＋５％イソプロパノール、クロマトグラフィーカラムはＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｉｎｃｒｅａｓｅ ５／１５０ ＧＬ、動作時間は１５分、カラム温度は２５℃とした。検出の結果、純度はいずれも９５％を超えることが示された。
【0055】
ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）及びＦｃ－ＴＧＦβＲII融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）の精製：
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、中和のために１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。
細胞発酵上清をｐＨ７．０に調節してから、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａアフィニティークロマトグラフィーカラム（博格隆生物技術有限公司）にサンプル投入し、平衡溶液を２０ｍＭ
ＰＢ、０．１５Ｍ ＮａＣｌ（ｐＨ＝７．０）として、１００％ ０．１Ｍ Ｇｌｙ－ＨＣｌ（ｐＨ＝３．０）で溶出させた。溶出液には、中和のために１０％ １Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ＝８．５）を予め加えた。
【実施例3】
【0056】
実施例３マルチドメイン融合タンパク質のインビトロでの機能鑑定
３．１ 抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントのインビトロ活性検出：
ＣＤ５Ｌ－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ－ＣＤ１４の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＮ４２８５７．１）を合成し、ＨｉｎｄIII－ＥｃｏＲＩ（タカラ社）を用いて酵素切断したあと、ベクターｐＣＤＮＡ３．１に挿入してｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭを作製した。次に、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１４１４３．２）を鋳型とし、ハイフィデリティー増幅によりＰＤＬ１フラグメントを取得して、組換え連結によりｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭに挿入することでｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を作製した。続いて、ＣＨＯ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にトランスフェクションしてから、Ｇ４１８を用いて１０－１４ｄを選択し、安定細胞系ＣＨＯ－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を産生した。
３．１ 抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体フラグメントのインビトロ活性検出：
ＣＤ５Ｌ－ＯＫＴ３ｓｃＦｖ－ＣＤ１４の遺伝子配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＮ４２８５７．１）を合成し、ＨｉｎｄIII－ＥｃｏＲＩ（タカラ社）を用いて酵素切断したあと、ベクターｐＣＤＮＡ３．１に挿入してｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭを作製した。次に、ヒトＰＤ－Ｌ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＭ＿０１４１４３．２）を鋳型とし、ハイフィデリティー増幅によりＰＤＬ１フラグメントを取得して、組換え連結によりｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭに挿入することでｐＣＤＮＡ３．１－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を作製した。続いて、ＣＨＯ細胞（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にトランスフェクションしてから、Ｇ４１８を用いて１０－１４ｄを選択し、安定細胞系ＣＨＯ－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１を産生した。
【0057】
ヒトＰＤ１遺伝子（ＧｅｎＢａｎｋ：ＮＰ＿００５００９．２）を鋳型とした増幅により取得したフラグメントを、ＨｉｎｄIII－ＢａｍＨＩ（タカラ社）で酵素切断したＰＢ５１３Ｂ１－ｄｕａｌ－ｐｕｒｏベクター（優宝生物社）と組換え連結することで、プラスミドｐＢ－ＰＤ１を作製した。次に、ｐＧＬ４．３０（優宝生物社）を鋳型としてハイフィデリティー増幅し、回収したフラグメントを、ＳｆｉＩ－ＸｂａＩ（タカラ社）で酵素切断したｐＢ－ＰＤ１ベクターと組換え連結することで、ｐＢ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１プラスミドを作製した。プラスミドの作製に成功したあと、エンドトキシンフリープラスミドマキシキット（Ｂｉｏｍｉｇａ社）を用いてプラスミドを抽出し、Ｊｕｒｋａｔ細胞（中国科学院幹細胞バンク）へのトランスフェクションに用いた。中国特許出願公開第１０７０２２５７１Ａ号の方法を参照し、０．１ｍｇ／ｍｌのポリ－Ｄ－リシンを用いてＪｕｒｋａｔ細胞を単層培養状態となるよう処理したあと、リポソームトランスフェクション試薬キット（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ３０００、インビトロジェン社）のトランスフェクション解説に基づき、Ｊｕｒｋａｔ細胞にトランスフェクションした。そして、３日目に、１０％ＦＢＳと２．５μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含有するＲＰＭＩ １６４０培地（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）を用いて加圧スクリーニングを行った。その後、一定時間置きに培地を補充し、細胞生存率が回復してからピューロマイシンの含有量を４μｇ／ｍｌまで徐々に増加させた。これにより、最終的に、モノクローンのＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１細胞株を取得した。
【0058】
ＣＨＯ－ａｎｔｉＣＤ３ＴＭ－ＰＤＬ１及びＪｕｒｋａｔ－ＮＦＡＴ－Ｌｕｃ２ｐ－ＰＤ１細胞を採取してカウントし、細胞密度を４×１０６／ｍｌに調整してから、各細胞を９６ウェルマイクロプレートに１ウェルあたり２５μｌずつ加えた。次に、１％ＢＳＡを用い、実施例２で作製した融合タンパク質サンプルをそれぞれ段階希釈して、５０μｌを細胞に加えた。これを、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈ共培養したあと、１ウェルあたり１０μｌのルシフェラーゼ基質（プロメガ社、Ｅ２６２０）を加え、振とう器で２ｍｉｎ振とうしてから数値を読んだ。操作については、試薬キットの説明通りとした。
【0059】
３．２ ＶＥＧＦ拮抗フラグメントのインビトロ活性検出：
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１．０×１０６細胞でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩培養した。また、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００の説明書に従
って、ｐｃＤＮＡ－ＫＤＲプラスミドが１．０μｇ、ｐＧＬ４．３０プラスミドが４μｇのトランスフェクション系を作製した。４８時間のトランスフェクション後に、細胞は１０ｃｍの細胞培養シャーレいっぱいに増大した。これに、Ｇ４１８を２００μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えた。そして、明らかなクローン群が成長するまで、３日ごとに新鮮な加圧培地に交換した。次に、細胞を消化して９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、モノクローンが成長したあと、０．１μｇ／ｍｌのＶＥＧＦで６時間刺激してから化学発光の状況を検出した。そして、シグナル反応が明らかなクローンを選択し、引き続き増大させるよう培養した。これにより、最終的に、モノクローンのＨＥＫ２９３－ＮＦＡＴ－ＫＤＲを取得した。ＨＥＫ２９３－ＮＦＡＴ－ＫＤＲ細胞は、４万個／ウェルの密度でプレーティングし、アキュターゼで消化した。そして、消化した細胞を収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、上清を廃棄して、分析培養液（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）を加えて細胞を再懸濁した。また、細胞をカウントし、細胞密度が１．６×１０６／ｍｌとなるよう調整してから、１ウェルあたり２５μｌとなるよう９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングした。次に、分析培養液を用いてＶＥＧＦ溶液を調製し、濃度を６０ｎｇ／ｍｌとして、１ウェルあたり２５μｌで細胞培養プレートに加えた。そして、実施例２で作製及び取得した融合タンパク質を分析培養液で調製し、１ウェルあたり２５μｌで細胞培養プレートに加えて、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈインキュベート及び培養した。また、各ウェルに１０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社、Ｅ２６２０）を加え、２分間振とうさせてから、８０μｌの破砕液を酵素標識ホワイトプレートに移し、酵素結合免疫測定装置の数値を読んだ。
ＨＥＫ２９３細胞を６ウェル細胞培養プレートに１ウェルあたり１．０×１０６細胞でプレーティングし、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で一晩培養した。また、トランスフェクション試薬Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００の説明書に従
って、ｐｃＤＮＡ－ＫＤＲプラスミドが１．０μｇ、ｐＧＬ４．３０プラスミドが４μｇのトランスフェクション系を作製した。４８時間のトランスフェクション後に、細胞は１０ｃｍの細胞培養シャーレいっぱいに増大した。これに、Ｇ４１８を２００μｇ／ｍｌ、ハイグロマイシンを１００μｇ／ｍｌ加えた。そして、明らかなクローン群が成長するまで、３日ごとに新鮮な加圧培地に交換した。次に、細胞を消化して９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングし、モノクローンが成長したあと、０．１μｇ／ｍｌのＶＥＧＦで６時間刺激してから化学発光の状況を検出した。そして、シグナル反応が明らかなクローンを選択し、引き続き増大させるよう培養した。これにより、最終的に、モノクローンのＨＥＫ２９３－ＮＦＡＴ－ＫＤＲを取得した。ＨＥＫ２９３－ＮＦＡＴ－ＫＤＲ細胞は、４万個／ウェルの密度でプレーティングし、アキュターゼで消化した。そして、消化した細胞を収集し、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、上清を廃棄して、分析培養液（ＤＭＥＭ＋５％ＦＢＳ）を加えて細胞を再懸濁した。また、細胞をカウントし、細胞密度が１．６×１０６／ｍｌとなるよう調整してから、１ウェルあたり２５μｌとなるよう９６ウェル細胞培養プレートにプレーティングした。次に、分析培養液を用いてＶＥＧＦ溶液を調製し、濃度を６０ｎｇ／ｍｌとして、１ウェルあたり２５μｌで細胞培養プレートに加えた。そして、実施例２で作製及び取得した融合タンパク質を分析培養液で調製し、１ウェルあたり２５μｌで細胞培養プレートに加えて、３７℃、５％ＣＯ２で６ｈインキュベート及び培養した。また、各ウェルに１０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社、Ｅ２６２０）を加え、２分間振とうさせてから、８０μｌの破砕液を酵素標識ホワイトプレートに移し、酵素結合免疫測定装置の数値を読んだ。
【0060】
３．３ ＴＧＦ－β結合フラグメントのインビトロ細胞活性検出：
マウスの乳癌細胞４Ｔ１を細胞が９０％程度を満たすまで培養し（１０ｃｍシャーレ）、パンクレアチンで消化した。そして、細胞を４×１０５個／ウェルで６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、一晩培養した。次に、抽出したｐＧＬ４．４８［ｌｕｃ２Ｐ ＳＢＥ Ｈｙｇｒｏ］プラスミドサンプルをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００で４Ｔ１細胞にトランスフェクションした。そして、トランスフェクションから２４ｈ後に、取得したＴＧＦβ－４Ｔ１細胞をパンクレアチンで消化して１０ｃｍシャーレに移し、１０％ＦＢＳ及び１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、Ｃａｔ ｎｏ．：ａｎｔ－ｈｇ－１）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて細胞を加圧スクリーニングした。続いて、加圧スクリーニングから１０～１５ｄ後のＴＧＦβ－４Ｔ１細胞を２個／ウェルでプレーティングし、モノクローナルスクリーニングを行った。そして、ＴＧＦβ１（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社、１０μｇ、Ｃａｔ ｎｏ．：ＣＡ５９）でモノクローナル細胞を刺激し、モノクローンのトランスフェクション効果を検証して、最終的にＴＧＦβ－４Ｔ１モノクローナル細胞を取得した。
マウスの乳癌細胞４Ｔ１を細胞が９０％程度を満たすまで培養し（１０ｃｍシャーレ）、パンクレアチンで消化した。そして、細胞を４×１０５個／ウェルで６ウェルマイクロプレートにプレーティングし、一晩培養した。次に、抽出したｐＧＬ４．４８［ｌｕｃ２Ｐ ＳＢＥ Ｈｙｇｒｏ］プラスミドサンプルをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）３０００で４Ｔ１細胞にトランスフェクションした。そして、トランスフェクションから２４ｈ後に、取得したＴＧＦβ－４Ｔ１細胞をパンクレアチンで消化して１０ｃｍシャーレに移し、１０％ＦＢＳ及び１５０μｇ／ｍｌのハイグロマイシン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ社、Ｃａｔ ｎｏ．：ａｎｔ－ｈｇ－１）を含有するＲＰＭＩ １６４０培地を用いて細胞を加圧スクリーニングした。続いて、加圧スクリーニングから１０～１５ｄ後のＴＧＦβ－４Ｔ１細胞を２個／ウェルでプレーティングし、モノクローナルスクリーニングを行った。そして、ＴＧＦβ１（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ社、１０μｇ、Ｃａｔ ｎｏ．：ＣＡ５９）でモノクローナル細胞を刺激し、モノクローンのトランスフェクション効果を検証して、最終的にＴＧＦβ－４Ｔ１モノクローナル細胞を取得した。
【0061】
ＴＧＦβ－４Ｔ１細胞が９０％程度を満たすまで成長したあと、２．５ｍｌ程度の０．２５％パンクレアチンを加えて消化した。消化は室温で２ｍｉｎ行った。また、シャーレの壁に付着した細胞をピペッティングし、パンクレアチン溶液内にピペッティングすることで分散させた。全消化過程に要した時間は～５ｍｉｎであった。続いて、完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）を加えて消化を停止させ、細胞が均一に分散するまでピペッティングを続けた。次に、細胞を５０ｍ遠沈管に移し、１０００ｒｐｍで５ｍｉｎ遠心分離にかけた。そして、上清を廃棄し、２ｍｌの完全培地細胞を加えて細胞を再懸濁し、セルカウンターで細胞密度を測定した。続いて、完全培地（ＲＰＭＩ １６４０＋１０％ＦＢＳ）で細胞を希釈し、細胞密度を２×１０５個／ｍｌとした。希釈した細胞（密度２×１０５個／ｍｌ）は、１ウェルあたり１００μｌ、細胞密度を２×１０４個／ウェルとしてプレーティングした（９６ウェルマイクロプレート）。９６ウェルマイクロプレートは、３７℃のインキュベーター内に置いて一晩培養した。また、実施例２で作製した融合タンパク質サンプルをＲＰＭＩ １６４０＋０．２％ＦＢＳ培地（２ｎｇ／ｍｌのＴＧＦβ１を含む）で所定の濃度まで希釈した（各タンパク質サンプルは、希釈後に室温で
１ｈ放置した）。続いて、３７℃のインキュベーターで一晩培養したＴＧＦβ－４Ｔ１細胞から上清を廃棄し、５０μｌのＲＰＭＩ １６４０＋０．２％ＦＢＳ培地を加えてから、５０μｌの異なる濃度のタンパク質溶液を加えた。そして、９６ウェルマイクロプレートを３７℃のインキュベーター内に置いて引き続き３ｈ培養したあと、１０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社、Ｅ２６２０）を加えて３ｍｉｎ振とうし、酵素結合免疫測定装置の数値を読んだ。
１ｈ放置した）。続いて、３７℃のインキュベーターで一晩培養したＴＧＦβ－４Ｔ１細胞から上清を廃棄し、５０μｌのＲＰＭＩ １６４０＋０．２％ＦＢＳ培地を加えてから、５０μｌの異なる濃度のタンパク質溶液を加えた。そして、９６ウェルマイクロプレートを３７℃のインキュベーター内に置いて引き続き３ｈ培養したあと、１０μｌのＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイ試薬（プロメガ社、Ｅ２６２０）を加えて３ｍｉｎ振とうし、酵素結合免疫測定装置の数値を読んだ。
【0062】
各マルチドメイン融合タンパク質の抗ＰＤ－Ｌ１活性、抗ＶＥＧＦ活性、抗ＴＧＦβ活性の測定結果は表２の通りであった。表２から明らかなように、各マルチドメイン融合タンパク質はいずれも良好なインビトロ細胞活性を有していた。
【0063】
【表2】
【実施例4】
【0064】
実施例４ Ｃ５７ＢＬ／６マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の薬物動態学
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをアバスチン（ロシュ社）低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）及び高投与量群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＡＦ－６低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）及び高投与量群（１０ｍｇ／ｋｇ）の４群に分けた。各群は８匹とし、雌雄半々とした。マウスの尾静脈に１回の注射で薬物を投与し、タイミング別に薬物代謝サンプルを横断採取した。採取時間は、投与前及び投与から１ｈ後、６ｈ後、２４ｈ後、４８ｈ後、７８ｈ後、１２０ｈ後、１４４ｈ後、１６８ｈ後、１９２ｈ後、２１６ｈ後とした。そして、薬物代謝サンプル中の血清薬物濃度をＥＬＩＳＡ法で定量的に検出した。ＶＥＧＦをプレートにコーティングし、二次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＦｃとＨＲＰを薬物に結合させて、ＴＭＢ法により検出した。そして、標準曲線のシグナルと濃度値との関係に基づき、回帰して濃度値に変換するとともに、ＰＫ Ｓｏｌｖｅｒソフトの非コンパートメントモデルを用いて主要な薬物動態パラメータを算出した。
Ｃ５７ＢＬ／６マウスをアバスチン（ロシュ社）低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）及び高投与量群（１０ｍｇ／ｋｇ）、ＴＡＦ－６低投与量群（１ｍｇ／ｋｇ）及び高投与量群（１０ｍｇ／ｋｇ）の４群に分けた。各群は８匹とし、雌雄半々とした。マウスの尾静脈に１回の注射で薬物を投与し、タイミング別に薬物代謝サンプルを横断採取した。採取時間は、投与前及び投与から１ｈ後、６ｈ後、２４ｈ後、４８ｈ後、７８ｈ後、１２０ｈ後、１４４ｈ後、１６８ｈ後、１９２ｈ後、２１６ｈ後とした。そして、薬物代謝サンプル中の血清薬物濃度をＥＬＩＳＡ法で定量的に検出した。ＶＥＧＦをプレートにコーティングし、二次抗体Ｇｏａｔ ａｎｔｉ－Ｈｕｍａｎ ＩｇＧ ＦｃとＨＲＰを薬物に結合させて、ＴＭＢ法により検出した。そして、標準曲線のシグナルと濃度値との関係に基づき、回帰して濃度値に変換するとともに、ＰＫ Ｓｏｌｖｅｒソフトの非コンパートメントモデルを用いて主要な薬物動態パラメータを算出した。
【0065】
その結果、図１に示すように、Ｃ５７ＢＬ／６マウスのうちアバスチン及びＴＡＦ－６を投与した高・低投与量群は薬物代謝パラメータが近かった。また、アバスチン低・高投与量群の投与量の値の比は１：１０、Ｃｍａｘの比は１：９．３、ＡＵＣｌａｓｔの比は１：８．９であり、Ｔｍａｘはいずれも１ｈであった。且つ、曝露量（Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔ）の増加は投与量の比例的な増加を示した。また、ＴＡＦ－６低・高投与量群の投与量の値の比は１：１０、Ｃｍａｘの比は１：８．６、ＡＵＣｌａｓｔの比は１：８．５であり、Ｔｍａｘはいずれも１ｈであった。且つ、曝露量（Ｃｍａｘ及びＡＵＣｌａｓｔ）の増加は投与量の比例的な増加を示した。よって、アバスチン及びＴＡＦ－６の高・低投与量群の間で、ＡＵＣ及びＣｍａｘはいずれも投与量の線形相関を示した。アバス
チンとＴＡＦ－６におけるＡＵＣの差は、ＰＤ－Ｌ１標的媒介性の消失効果（ＴＭＤＤ）であると推定される。
チンとＴＡＦ－６におけるＡＵＣの差は、ＰＤ－Ｌ１標的媒介性の消失効果（ＴＭＤＤ）であると推定される。
【実施例5】
【0066】
実施例５ ＰＢＭＣヒト化乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌）細胞を用い、ヒトＰＢＭＣ免疫系でヒト化したマウス（Ｍ－ＮＳＧマウス）の体内にモデルを構築して、本発明におけるマルチドメイン融合タンパク質の体内での薬理効果を測定した。６～８週齢のメスのＭ－ＮＳＧマウスを選別し、マウスにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０＊１０Ｅ６＋マトリゲル２５％）を移植して、７日目にＰＢＭＣ（５＊１０Ｅ６／０．２ｍｌ）を尾静脈に注射したあと、腫瘍体積と体重を観察した。そして、腫瘍体積が１４０～２６０ｍｍ３の間のマウスを選択し、腫瘍体積と体重に基づきランダムに６群に分けた。各群は７匹とし、群分け当日に投与を開始した。また、担癌マウスのうち、腫瘍体積が大きすぎるもの／小さすぎるものは淘汰した。そして、毎週２回、ＰＢＳ、アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ１、ポジティブコントロールとしてテセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（ロシュ社）、ＴＡＦ－６、ＴＡＦ－７及び併用薬を腹腔注射した（方案については表３参照）。投与は３週間程度行った。なお、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ Ｆｃの融合タンパク質（抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体がＦｃのＮ末端に位置する）であり、Ｆｃ－ＴＧＦβＲII融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）は、ヒトＩｇＧ ＦｃとＴＧＦβＲIIの融合タンパク質（ＴＧＦβＲIIがＦｃのＣ末端に位置する）である。
ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ヒト乳癌）細胞を用い、ヒトＰＢＭＣ免疫系でヒト化したマウス（Ｍ－ＮＳＧマウス）の体内にモデルを構築して、本発明におけるマルチドメイン融合タンパク質の体内での薬理効果を測定した。６～８週齢のメスのＭ－ＮＳＧマウスを選別し、マウスにＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞（１０＊１０Ｅ６＋マトリゲル２５％）を移植して、７日目にＰＢＭＣ（５＊１０Ｅ６／０．２ｍｌ）を尾静脈に注射したあと、腫瘍体積と体重を観察した。そして、腫瘍体積が１４０～２６０ｍｍ３の間のマウスを選択し、腫瘍体積と体重に基づきランダムに６群に分けた。各群は７匹とし、群分け当日に投与を開始した。また、担癌マウスのうち、腫瘍体積が大きすぎるもの／小さすぎるものは淘汰した。そして、毎週２回、ＰＢＳ、アイソタイプコントロールとしてＩｇＧ１、ポジティブコントロールとしてテセントリク（Ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）（ロシュ社）、ＴＡＦ－６、ＴＡＦ－７及び併用薬を腹腔注射した（方案については表３参照）。投与は３週間程度行った。なお、ＰＤ－Ｌ１－Ｆｃ融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４７）は、抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体とヒトＩｇＧ Ｆｃの融合タンパク質（抗ＰＤ－Ｌ１シングルドメイン抗体がＦｃのＮ末端に位置する）であり、Ｆｃ－ＴＧＦβＲII融合タンパク質（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４８）は、ヒトＩｇＧ ＦｃとＴＧＦβＲIIの融合タンパク質（ＴＧＦβＲIIがＦｃのＣ末端に位置する）である。
【0067】
群分け前と実験終了前にマウスの眼窩静脈から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加しており、マウスの免疫系のヒト化に成功したことが示された。実験過程において、群３及び群４の動物の体重（毎週２回測定）はほぼ安定しており、実験動物の死亡も発生しなかった。また、群３及び群４の腫瘍体積（毎週２回測定）は、併用投与した群６よりも小さく、且つ、テセントリク（ｔｅｃｅｎｔｒｉｑ）単体に対応する群２よりも著しく小さかった。結果は図２に示す通りであった。
【0068】
【表3】
【実施例6】
【0069】
実施例６ ＰＢＭＣヒト化乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の腫瘍塊をメスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。そして、腫瘍塊を移植してから１日後に、ＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植し、腫瘍が５３ｍｍ３程度まで成長した時点で合計６群に分けて投与した。各群は１０匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉ
ｗ×９）群、ＴＡＦ－６中（６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６高（１８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、テセントリク（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、アバスチン（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。
ヒト乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１の腫瘍塊をメスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。そして、腫瘍塊を移植してから１日後に、ＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植し、腫瘍が５３ｍｍ３程度まで成長した時点で合計６群に分けて投与した。各群は１０匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉ
ｗ×９）群、ＴＡＦ－６中（６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６高（１８ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、テセントリク（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、アバスチン（４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。
【0070】
群分け２日前と実験終了時に眼窩静脈叢から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清の採取及び腫瘍の固定を行った。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析したところ、ＴＡＦ－６低群、ＴＡＦ－６中群、ＴＡＦ－６高群、テセントリク群、アバスチン群の腫瘍増殖抑制率は、それぞれ、４１％、３４％、６０％、２３％、３２％であった。また、テセントリク群を除き、各群の腫瘍体積はいずれもＶｅｈｉｃｌｅ群よりも著しく小さかった（いずれもｐ＜０．０５）。ＴＡＦ－６高群の腫瘍体積はテセントリク群よりも著しく小さく（ｐ＜０．０１）、テセントリク群とアバスチン群の腫瘍体積には有意な差がなかった（ｐ＞０．０５）。結果は図３に示す通りであった。
【0071】
以上述べたように、被験薬ＴＡＦ－６は、ＰＢＭＣヒト化乳癌ＭＤＡ－ＭＢ－２３１皮下移植腫瘍モデルに対し顕著な抗腫瘍作用を有しており、腫瘍の成長を有効に抑制した。また、その抗腫瘍作用はテセントリクよりも著しく優れていた。且つ、腫瘍抑制作用は投与量の増加に伴って強化された。
【0072】
別の同一腫瘍モデルにおける独立した実験では、被験薬と、陽性薬であるＭ７８２４の類似体（本実験室では、Ｍ７８２４の米国特許第９６７６８６３Ｂ２号に基づき作製）との抗腫瘍活性の比較について考察した。各群を６匹とし、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６（４．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８回。後期の投与量は８．４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×４回に調整）群、Ｍ７８２４類似体（３．６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８回。後期の投与量は７．２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×４回に調整）群、アバスチン（３ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８回。後期の投与量は６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×４回に調整）群の４群を設けた。その結果、図４に示すように、同等のモル濃度及び投与量の場合、ＴＡＦ－６の抗腫瘍作用はＭ７８２４類似体よりも著しく優れていた。
【実施例7】
【0073】
実施例７ ＰＢＭＣヒト化肺癌Ｃａｌｕ－６マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ヒト肺癌Ｃａｌｕ－６細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する４日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長した時点で合計７群に分けて投与した。各群は８匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、テセントリク＋アバスチン（５＋５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群とした。腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
ヒト肺癌Ｃａｌｕ－６細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する４日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長した時点で合計７群に分けて投与した。各群は８匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群、テセントリク＋アバスチン（５＋５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×１０）群とした。腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
【0074】
群分け３日前と実験終了時（ＰＧ－Ｄ２３）にマウスの眼窩静脈から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加しており、マウスの免疫系のヒト化に成功したことが示された。
【0075】
治療期間中、各群のマウスは通常通りに摂食及び飲水し、体重はほぼ安定していた。また、実験動物の死亡は発生しなかった。
【0076】
実験終了時（ＰＧ－Ｄ２３）において、ＴＡＦ－６低群、ＴＡＦ－６中群、ＴＡＦ－６高群、テセントリク群、アバスチン群、テセントリク＋アバスチン群の腫瘍増殖抑制率は、それぞれ、６２％、６２％、７５％、１３％、３４％、３２％であった。また、テセントリク群を除き、各群の腫瘍体積はいずれもＶｅｈｉｃｌｅ群よりも著しく小さかった（いずれもｐ＜０．０１）。ＴＡＦ－６低、中、高群の腫瘍体積は、いずれも、テセントリク群、アバスチン群及びテセントリク＋アバスチン群よりもそれぞれ著しく小さかった（いずれもｐ＜０．０１）。結果は、表４及び図５に示す通りであった。
【0077】
以上述べたように、被験薬ＴＡＦ－６は、ＰＢＭＣヒト化肺癌Ｃａｌｕ－６皮下移植腫瘍モデルに対し顕著な抗腫瘍作用を有しており、腫瘍の成長を有効に抑制した。また、腫瘍抑制作用は、テセントリク、アバスチン及びテセントリクとアバスチンの併用よりも著しく優れていた。且つ、腫瘍抑制作用は投与量の増加に伴って強化された。
【0078】
【表4】
【0079】
別の同一腫瘍モデルにおける独立した実験では、被験薬の抗腫瘍活性と、陽性薬であるＭ７８２４の類似体との比較について考察した。各群を６匹とし、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＴＩＷ×８回）群、Ｍ７８２４類似体（６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＴＩＷ×８回）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ＴＩＷ×８回）群の４群を設けた。その結果、図６に示すように、同等のモル濃度及び投与量の場合、ＴＡＦ－６の抗腫瘍作用はＭ７８２４類似体及びアバスチンよりも著しく優れていた。
【実施例8】
【0080】
実施例８ ＰＢＭＣヒト化結腸癌ＨＣＴ１１６マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ＨＣＴ－１１６（ヒト結腸癌）細胞を用い、ヒトＰＢＭＣ免疫系でヒト化したマウス（ＮＯＧマウス）の体内にモデルを構築して、本発明におけるマルチドメイン融合タンパク質の体内での薬理効果を測定した。７～９週齢のメスのＮＯＧマウスを選別し、マウスにＨＣＴ－１１６細胞（３＊１０Ｅ６＋マトリゲル）を移植した。そして、腫瘍細胞の移植から３日目にＰＢＭＣ（５＊１０Ｅ６／０．２ｍｌ）を尾静脈に注射したあと、腫瘍体積及び体重を観察し、腫瘍体積が６０～１００ｍｍ３の間のマウスを選択した。続いて、腫瘍体積と体重に基づき、各群を８匹として、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、テセントリク＋アバスチン（５＋５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群の６群にランダムに分け、群分け当日に投与を開始した。そして、腫瘍体積と体重を毎週２回測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
ＨＣＴ－１１６（ヒト結腸癌）細胞を用い、ヒトＰＢＭＣ免疫系でヒト化したマウス（ＮＯＧマウス）の体内にモデルを構築して、本発明におけるマルチドメイン融合タンパク質の体内での薬理効果を測定した。７～９週齢のメスのＮＯＧマウスを選別し、マウスにＨＣＴ－１１６細胞（３＊１０Ｅ６＋マトリゲル）を移植した。そして、腫瘍細胞の移植から３日目にＰＢＭＣ（５＊１０Ｅ６／０．２ｍｌ）を尾静脈に注射したあと、腫瘍体積及び体重を観察し、腫瘍体積が６０～１００ｍｍ３の間のマウスを選択した。続いて、腫瘍体積と体重に基づき、各群を８匹として、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群、テセントリク＋アバスチン（５＋５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群の６群にランダムに分け、群分け当日に投与を開始した。そして、腫瘍体積と体重を毎週２回測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
【0081】
群分け前と実験終了前にマウスの眼窩静脈から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加しており、マウスの免疫系のヒト化に成功したことが示された。
【0082】
腫瘍の活性抑制は図７に示す通りであった。被験薬ＴＡＦ－６は、ＰＢＭＣヒト化結腸癌ＨＣＴ１１６皮下移植腫瘍モデルに対し顕著な抗腫瘍作用を有しており、腫瘍の成長を有効に抑制した。且つ、高投与量群と中投与量群の腫瘍抑制作用はテセントリクよりも著しく優れていた。また、同じモル濃度及び投与量の場合には、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群をテセントリク＋アバスチン（５＋５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×３）群と比較すると、ＴＡＦ－６については、テセントリク＋アバスチン群に劣らない、ひいてはテセントリク＋アバスチン群よりも優れた治療効果を観察することができた。
【実施例9】
【0083】
実施例９ ＰＢＭＣヒト化肝臓癌Ｈｕｈ－７マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ヒト肝臓癌Ｈｕｈ－７細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する４５日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長した時点で合計５群に分けて投与した。各群は１０匹とし、それぞれ、Ｉｓｏｔｙｐｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、ＴＡＦ－６高（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週２回測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
ヒト肝臓癌Ｈｕｈ－７細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する４５日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５０ｍｍ３程度まで成長した時点で合計５群に分けて投与した。各群は１０匹とし、それぞれ、Ｉｓｏｔｙｐｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、ＴＡＦ－６高（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×８）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週２回測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
【0084】
群分け前と実験終了時にマウスの眼窩静脈叢から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加しており、マウスの免疫系のヒト化に成功したことが示された。
【0085】
投与期間中、各群のマウスは通常通りに摂食及び飲水し、体重はほぼ安定していた。
【0086】
実験終了前（ＰＧ－Ｄ１８）において、ＴＡＦ－６低群、ＴＡＦ－６高群、テセントリク群、アバスチン群の腫瘍増殖抑制率は、それぞれ、５７％、７４％、１８％、６７％であった。また、テセントリク群を除き、各群の腫瘍体積はいずれもＩｓｏｔｙｐｅ群より著しく小さかった（いずれもｐ＜０．０１）。ＴＡＦ－６高群の腫瘍体積はいずれもテセントリク群よりも著しく小さく（いずれもｐ＜０．０１）、アバスチン群の腫瘍体積はテセントリク群よりも著しく小さかった（ｐ＜０．０５）。結果は図８に示す通りであった。
【0087】
以上述べたように、被験薬ＴＡＦ－６は、ＰＢＭＣヒト化肝臓癌Ｈｕｈ－７皮下移植腫瘍モデルに対し顕著な抗腫瘍作用を有しており、腫瘍の成長を有効に抑制した。また、抗腫瘍作用はテセントリクよりも著しく優れていた。且つ、腫瘍抑制作用は投与量の増加に伴って強化された。
【0088】
別の同一腫瘍モデルにおける独立した実験では、被験薬の抗腫瘍活性と、陽性薬であるＭ７８２４の類似体との比較について考察した。各群を６匹として、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９。後期の投与量は１４ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×２に調整）群、Ｍ７８２４類似体（６ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９。後期の投与量は１２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×２に調整）群、アバスチン（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９。後期の投与量は１０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×２に調整）群の４群に分けた。その結果、図９に示すように、ＴＡＦ－６の抗腫瘍作用はＭ７８２４類似体よりも著しく優れていた。
【実施例10】
【0089】
実施例１０ ＰＢＭＣヒト化肉腫ＨＴ１０８０マウス体内におけるマルチドメイン融合タンパク質の抗腫瘍活性
ヒト肉腫ＨＴ１０８０細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する７日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５６ｍｍ３程度まで成長した時点で合計５群に分けて投与した。各群は８匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。
ヒト肉腫ＨＴ１０８０細胞をオスのＮＣＧマウスにおける右側前脇腹部の皮下に移植した。また、腫瘍細胞を移植する７日前にＰＢＭＣ細胞をマウス体内に移植した。そして、腫瘍が５６ｍｍ３程度まで成長した時点で合計５群に分けて投与した。各群は８匹とし、それぞれ、Ｖｅｈｉｃｌｅ群、ＴＡＦ－６低（２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６中（７ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、ＴＡＦ－６高（２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群、テセントリク（５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．、ｔｉｗ×９）群とした。そして、腫瘍体積と体重を毎週測定し、担癌マウスの体重及び腫瘍体積の変化と投与時間との関係を記録した。
【0090】
実験終了時には担癌マウスを安楽死させ、腫瘍を剥離して計量及び撮影するとともに、血清及び腫瘍を採取した。そして、腫瘍増殖抑制率ＴＧＩＴＶ（％）を計算し、統計学的に分析した。
【0091】
群分け前と実験終了時にマウスの眼窩静脈叢から採血したところ、ＦＡＣＳ試験の結果、各群のマウスの末梢血中にヒトＣＤ４５陽性細胞が存在することが示された。且つ、ＣＤ４５の比率は時間とともに増加しており、マウスの免疫系のヒト化に成功したことが示された。
【0092】
実験終了前（ＰＧ－Ｄ１９）において、ＴＡＦ－６低群、ＴＡＦ－６中群、ＴＡＦ－６高群、テセントリク群の腫瘍増殖抑制率は、それぞれ、１９％、３３％、４１％、２８％であった。また、ＴＡＦ－６中群とテセントリク群の腫瘍体積はＶｅｈｉｃｌｅ群より著しく小さかった（いずれもｐ＜０．０５）。且つ、各群の腫瘍体積には有意な差がなかった（ｐ＞０．０５）。結果は図１０に示す通りであった。
【0093】
以上述べたように、本発明は従来技術における様々な欠点を解消しており、高度な産業上の利用価値を有している。
【0094】
上記の実施例は本発明の原理と効果を例示的に説明したものにすぎず、本発明を制限するものではない。本技術を熟知する者であれば、本発明の精神及び範疇を逸脱しないことを前提に、上記の実施例を補足又は変形することが可能である。従って、当業者が本発明に開示される精神及び技術的思想から逸脱することなく完成させるあらゆる等価の補足又は変形もまた本発明の特許請求の範囲に含まれるものとする。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】