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▶ ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーションの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】２つのＲＩＮＧドメインを含む融合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/62 20060101AFI20240214BHJP
C07K 19/00 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/864 20060101ALI20240214BHJP
C07K 16/00 20060101ALI20240214BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/13 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/54 20060101ALI20240214BHJP
C12N 15/12 20060101ALI20240214BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240214BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240214BHJP
A61K 48/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 35/76 20150101ALI20240214BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240214BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 25/28 20060101ALI20240214BHJP
A61P 25/14 20060101ALI20240214BHJP
A61P 31/12 20060101ALI20240214BHJP
A61P 31/18 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/62 Z
C07K19/00 ZNA
C12N15/864 100Z
C07K16/00
C12N9/10
C12N15/13
C12N15/54
C12N15/12
A61K38/02
A61K31/7088
A61K48/00
A61K35/76
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P25/00
A61P31/00
A61P43/00 105
A61P25/28
A61P25/14
A61P31/12
A61P31/18
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550577
(86)(22)【出願日】2022-02-22
(85)【翻訳文提出日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 EP2022054370
(87)【国際公開番号】W WO2022175549
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】2102471.6
(32)【優先日】2021-02-22
(33)【優先権主張国・地域又は機関】GB
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＰＹＴＨＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】521246116
【氏名又は名称】ユナイテッド キングダム リサーチ アンド イノベーション
【氏名又は名称原語表記】ＵＮＩＴＥＤ ＫＩＮＧＤＯＭ ＲＥＳＥＡＲＣＨ ＡＮＤ ＩＮＮＯＶＡＴＩＯＮ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】キス レオ
(72)【発明者】
【氏名】クリフト ディーン
(72)【発明者】
【氏名】ルプターク ヤクブ
(72)【発明者】
【氏名】ジェイムス レオ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA07
4C084AA13
4C084BA02
4C084BA41
4C084DC02
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA03
4C084ZA16
4C084ZA22
4C084ZB21
4C084ZB31
4C084ZB33
4C084ZC55
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB11
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086EA16
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA01
4C086ZA03
4C086ZA16
4C086ZA22
4C086ZB21
4C086ZB31
4C086ZB33
4C086ZC55
4C087AA01
4C087AA02
4C087BC83
4C087CA12
4C087NA14
4C087ZA01
4C087ZA03
4C087ZA16
4C087ZA22
4C087ZB21
4C087ZB31
4C087ZB33
4C087ZC55
4H045AA11
4H045AA30
4H045BA41
4H045CA40
4H045DA76
4H045DA89
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、細胞内でのタンパク質分解に使用するのに適した少なくとも２つのＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質、及び該融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトに関する。本発明はまた、これらの融合タンパク質及び核酸を含む組成物、並びに治療における融合タンパク質及び核酸コンストラクトの使用に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、
タンパク質標的化ドメインと、
を含む融合タンパク質。
【請求項2】
前記融合タンパク質は、コイルドコイルドメイン及びＢ－ボックスドメインから選択されるドメインを含まない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項3】
前記融合タンパク質は、コイルドコイルドメインを含まず、かつＢ－ボックスドメインを含まない、請求項１又は２に記載の融合タンパク質。
【請求項4】
前記タンパク質標的化ドメインは、前記第１のＲＩＮＧドメイン及び前記第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端ドメインに位置する、請求項１～３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項5】
前記第１のＲＩＮＧドメイン及び前記第２のＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭポリペプチドから誘導される、請求項１～４のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項6】
前記ＴＲＩＭポリペプチドは、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２８、及びＴＲＩＭ３２からなる群から選択される、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項7】
前記第１のＲＩＮＧドメイン及び前記第２のＲＩＮＧドメインは、同じＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導される、請求項６に記載の融合タンパク質。
【請求項8】
前記融合タンパク質は、２つのＲＩＮＧドメインを含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項9】
前記タンパク質標的化ドメインは、ＰＲＹＳＰＲＹドメイン、抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体ミメティックであり、ここで、前記抗体フラグメントは、好ましくはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ｄＡＢ、それらのＶＬフラグメント、それらのＶＨフラグメント、及びそれらのＶＨＨフラグメントからなる群から選択される、請求項１～８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項10】
前記第１のＲＩＮＧドメインと、前記第２のＲＩＮＧドメインとの間、及び／又は前記第２のＲＩＮＧドメインと、前記タンパク質標的化配列との間にリンカー配列を更に含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸コンストラクト。
【請求項12】
第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含む、核酸コンストラクト。
【請求項13】
前記コンストラクトは、コイルドコイルドメインをコードしないか、Ｂ－ボックスドメインをコードしないか、又はコイルドコイルドメイン及びＢ－ボックスドメインをコードすることはない、請求項１２に記載の核酸コンストラクト。
【請求項14】
ベクターの形態における、請求項１１～１３のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項15】
前記ベクターは、ウイルス性送達ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項１４に記載の核酸コンストラクト。
【請求項16】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸と、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤とを含む医薬組成物。
【請求項17】
神経障害、感染症、又はトリヌクレオチドリピート障害を処置する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸を被験体に投与することを含む、方法。
【請求項18】
抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体若しくはその抗体フラグメントをコードする核酸コンストラクトを同時に又は任意の順序で逐次的に投与することを更に含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
医薬として使用される、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクト。
【請求項20】
神経障害、好ましくはアルツハイマー病若しくはハンチントン病を処置するか、ウイルス感染症、好ましくはＨＩＶ感染症を処置するか、又はトリヌクレオチドリピート障害を処置する、請求項１９に記載の使用される融合タンパク質。
【請求項21】
細胞内のタンパク質を分解する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを前記細胞に導入することを含む、方法。
【請求項22】
前記細胞への前記融合タンパク質又は前記核酸の導入を、トランスフェクション又は形質導入によって、好ましくはベクター、注入、又はエレクトロポレーションを使用することによって行う、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
試料中のタンパク質を分解する方法であって、請求項１～１０のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項１１～１５のいずれか一項に記載の核酸コンストラクトを前記試料に導入することを含む、方法。
【請求項24】
抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体若しくはその抗体フラグメントをコードする核酸を前記細胞又は前記試料に導入することを更に含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、細胞内でのタンパク質分解に使用するのに適した融合タンパク質及び核酸コンストラクトに関する。本発明はまた、これらの融合タンパク質及び核酸を含む組成物、並びに治療における融合タンパク質及び核酸コンストラクトの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
タンパク質分解は天然に細胞内で行われ、ミスフォールドしたタンパク質の発生を防ぎ、細胞応答を媒介する内因性の機構を提供する。タンパク質分解についての主な経路は、ユビキチン－プロテアソーム系（ＵＰＳ）を経由するものである。ＵＰＳを操作してこの系の方向を変えて、細胞内での狙い通りのタンパク質分解をもたらし得ることは、研究、創薬、及び治療薬における応用に多大な可能性を秘めている。
【0003】
標的タンパク質を選択的に枯渇させることで、細胞レベルでのタンパク質の機能及び動的なタンパク質相互作用の研究が可能となる。このような選択的な枯渇は、特に創薬において使用され、ここで、「タンパク質分解誘導キメラ分子」（ＰＲＯＴＡＣ）として知られる小分子を使用してタンパク質分解の方向を変えて、標的タンパク質の選択的な枯渇を誘導することができる（非特許文献１）。同様に、「Ｔｒｉｍ－Ａｗａｙ」等の技術は、ＵＰＳの特定の構成要素であるＴＲＩＭ２１として知られるＥ３ユビキチンリガーゼを利用して、抗体に結合された標的タンパク質を選択的に枯渇させる（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５）。これらの新たに出現したツール及び創薬プラットフォームにより、翻訳後の環境におけるタンパク質相互作用の研究が可能となり、遺伝子操作に関連する、表現型に関する洞察を得ることができず、かつ費用及び時間がかかる可能性のある多くの制限が回避される。
【0004】
さらに、狙い通りのタンパク質分解は、治療用途における使用（非特許文献６）、特に過剰なタンパク質産生又は異常なタンパク質凝集に関連する疾患における使用に可能性を秘めている。治療方略として狙い通りのタンパク質分解を使用すると、薬物のオフターゲット効果を最小限に抑え、全身的な薬物曝露を回避又は低減することができる。
【0005】
内因性の細胞タンパク質分解機序を利用する可能性があるにもかかわらず、この理論的アプローチを実施化することは困難であることが分かっている。Ｅ３ユビキチンリガーゼ等の主要な酵素を含むＵＰＳの多くは未だに特徴が明らかにされておらず、既存のツールには、実用を不適なものとする重大な制限がある。例えば、ＰＲＯＴＡＣは効力が低い場合があり、十分な分解を誘導するには高濃度を必要とし得る（非特許文献７）。Ｅ３ユビキチンリガーゼの動員を可能にし、かつ標的タンパク質に結合して分解するＰＲＯＴＡＣとして使用するのに適したバインダーの特定も課題である（非特許文献８）。Ｔｒｉｍ－Ａｗａｙベースのアプローチは、単量体タンパク質及び小さなオリゴマーの分解には適さないという点でも制限がある。
【0006】
したがって、細胞内のタンパク質を選択的に分解するのに使用することができる更なる融合タンパク質及び対応する核酸コンストラクトが求められている。このような融合タンパク質は、特に治療及び研究の場の両方で有用であると考えられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Schapira et al. (2019) Nature Reviews Drug Discovery, 18:949-963
【非特許文献2】Clift et al. (2017) Cell, 172:1692-1706
【非特許文献3】bioRxivのdoi: https://doi.org/10.1101/2020.07.28.225359からプレプリントとして入手可能である（かつZeng et al (2021) Natural Structural & Molecular Biology vol 28, 278-289として現在出版されている）Zeng et al. (2020)
【非特許文献4】Castro-Dopico, T., et al. (2019). Immunity 50, 1099-1114 e1010
【非特許文献5】Chen, X et al. (2019). Genome Biology 20, 19
【非特許文献6】Wu, T, et al. (2020) Nature Structural & Molecular Biology, 27:605-614
【非特許文献7】Buckley et al. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 53:2312-30 (2014)
【非特許文献8】Chopra, Sadok and Collins (2019) Drug Discov Today Technol, 31:5-13
【発明の概要】
【0008】
本発明は、細胞内でのタンパク質分解に適した融合タンパク質及びそのようなタンパク質をコードする核酸コンストラクトに関する。詳細には、融合タンパク質は、２つのＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む。
【0009】
第１の態様において、本発明は、
第１のＲＩＮＧドメインと、
第２のＲＩＮＧドメインと、
タンパク質標的化ドメインと、
を含む融合タンパク質を提供する。
第１のＲＩＮＧドメインと、
第２のＲＩＮＧドメインと、
タンパク質標的化ドメインと、
を含む融合タンパク質を提供する。
【0010】
第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは二量体化することが可能である。本発明は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有する融合コンストラクトを提供する。
【0011】
本発明者らは、二量体化することが可能な少なくとも２つのＲＩＮＧドメインを含むコンストラクトを提供することによって、この融合タンパク質が同様に２つのＲＩＮＧドメインを含む別の融合タンパク質に近接したときに、十分な自己ユビキチン化が起こって、効率的なタンパク質分解が可能となることを明らかにした。各融合タンパク質の２つのＲＩＮＧドメインは二量体化し、そして各融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が近接したときに、例えばＦｃ、オリゴマータンパク質、又は短い配列リピートを有するタンパク質上で共局在したときに、一方のＲＩＮＧ二量体は他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能である。ＲＩＮＧドメインは自己ユビキチン化活性を有する。したがって、融合コンストラクトは自己ユビキチン化が可能である。
【0012】
タンパク質標的化ドメインは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインに対して、標的タンパク質上に第２の融合タンパク質とともに共局在したときに、第１の融合タンパク質の第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインによって形成されるＲＩＮＧ二量体と、第１の融合タンパク質の第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインによって形成されるＲＩＮＧ二量体との間の距離が８ｎｍ～１０ｎｍの範囲内、好ましくはおよそ９ｎｍとなるように配置され得る。
【0013】
融合タンパク質の別個のドメインは、ＲＩＮＧドメイン－ＲＩＮＧドメイン－タンパク質標的化ドメインの順序で提供され得る。一実施の形態において、タンパク質標的化ドメインは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置し得る。
【0014】
一実施の形態において、融合タンパク質は、コイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスドメインを含まない。更なる実施の形態において、融合タンパク質は、コイルドコイルドメインかＢ－ボックスドメインのどちらかを含まない。一実施の形態において、融合タンパク質は、Ｂ－ボックスを含むが、好ましくはコイルドコイルドメインを含まず、例えば、融合タンパク質は、ＲＩＮＧドメインとタンパク質標的化ドメインとの間にＢ－ボックスドメインを含んでいてもよい。
【0015】
一実施の形態において、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインはＴＲＩＭポリペプチドから誘導される。ＴＲＩＭポリペプチドは、限定されるものではないが、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２８、及びＴＲＩＭ３２を含む群から選択され得る。第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは、同じＴＲＩＭポリペプチドから誘導され得る。好ましくは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭ２１ポリペプチドから誘導される。好ましくは、融合タンパク質は２つのＲＩＮＧドメインを含む。
【0016】
一実施の形態において、タンパク質標的化ドメインは、ＰＲＹＳＰＲＹドメインである。別の実施の形態において、タンパク質標的化ドメインは、抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックである。好ましくは、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ｄＡＢ、それらのＶＬフラグメント、それらのＶＨフラグメント、及びそれらのＶＨＨフラグメント等のｓｄＡｂ（すなわち、ナノボディ）からなる群から選択される。より好ましくは、タンパク質標的化ドメインはｓｃＦＶ又はＶＨＨである。
【0017】
融合タンパク質は、各ドメイン間にリンカー配列を含み得る。融合タンパク質は、第１のＲＩＮＧドメインと第２のＲＩＮＧドメインとの間のリンカー配列、及び／又は第２のＲＩＮＧドメインとタンパク質標的化配列との間のリンカー配列を含み得る。
【0018】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様の融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトを提供する。
【0019】
本発明の第３の態様は、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含む、核酸コンストラクトを提供する。
【0020】
一実施の形態において、上記核酸は、コイルドコイルドメインをコードしないか、Ｂ－ボックスドメインをコードしないか、又はコイルドコイルドメインかＢ－ボックスドメインのどちらかをコードしない。一実施の形態において、上記核酸は更にＢ－ボックスドメインをコードするが、好ましくは、コイルドコイルドメインをコードしない。
【0021】
本発明の第２の態様及び第３の態様の核酸コンストラクトは、ベクターの形態であってもよい。ベクターは、ウイルス性送達ベクター又は非ウイルス性送達ベクター、好ましくは、アデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターを含むウイルス性送達ベクターであり得る。
【0022】
本発明の第４の態様は、本発明の第１の態様、第２の態様、又は第３の態様の融合タンパク質又は核酸コンストラクトを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を更に含んでいてもよい。
【0023】
本発明の第５の態様は、神経障害、ウイルス感染症、又はトリヌクレオチドリピート障害を処置する方法であって、本発明の第１の態様、第２の態様、若しくは第３の態様の融合タンパク質若しくは核酸、又は本発明の第４の態様の医薬組成物を被験体に投与することを含む、方法を提供する。
【0024】
処置される神経障害は、アルツハイマー病又はハンチントン病であり得る。処置される感染症は、ウイルス感染症、例えばＨＩＶ感染症であり得る。トリヌクレオチドリピート障害としては、限定されるものではないが、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、及び脊髄小脳失調症が挙げられる。
【0025】
上記方法は、抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体若しくはその抗体フラグメントをコードする核酸コンストラクトを同時に又は任意の順序で逐次的に投与することを更に含み得る。
【0026】
本発明の第７の態様は、医薬として使用される本発明の第１の態様、第２の態様、又は第３の態様の融合タンパク質又は核酸を提供する。
【0027】
一実施の形態において、融合タンパク質又は核酸は、神経障害の処置において使用され得る。神経障害は、アルツハイマー病又はハンチントン病等の障害であり得る。
【0028】
一実施の形態において、融合タンパク質又は核酸は、感染症の処置において使用され得る。感染症は、ＨＩＶ感染症等のウイルス感染症であり得る。
【0029】
一実施の形態において、融合タンパク質又は核酸は、トリヌクレオチドリピート障害の処置において使用され得る。トリヌクレオチドリピート障害としては、限定されるものではないが、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、及び脊髄小脳失調症が挙げられる。
【0030】
本発明の第８の態様は、医薬の製造における本発明の第１の態様、第２の態様、又は第３の態様の融合タンパク質又は核酸の使用を提供する。医薬は、上記のように神経障害、感染症、又はトリヌクレオチドリピート障害の処置において使用され得る。
【0031】
本発明の第９の態様は、本発明の第１の態様、第２の態様、又は第３の態様の融合タンパク質又は核酸を細胞に導入することを含む、細胞内のタンパク質を分解する方法を提供する。一実施の形態において、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞である。この方法は更に、トランスフェクション又は形質導入によって、好ましくはベクター、エレクトロポレーション、又は注入を使用することによって、タンパク質又は核酸を細胞に導入することを含み得る。
【0032】
上記方法は更に、抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体若しくはその抗体フラグメントをコードする核酸を細胞に導入することを含み得る。
【0033】
本発明の第１０の態様は、本発明の第１の態様、第２の態様、又は第３の態様の融合タンパク質又は核酸を試料に導入することを含む、試料中のタンパク質を分解する方法を提供する。この方法は更に、トランスフェクション又は形質導入によって、好ましくはベクター、エレクトロポレーション、又は注入を使用することによって、タンパク質又は核酸を試料に導入することを含み得る。
【0034】
上記方法は更に、抗体若しくはその抗体フラグメント、又は抗体若しくはその抗体フラグメントをコードする核酸、又はこれらをコードする核酸を細胞又は試料に導入することを含み得る。
【0035】
本発明の第２の態様及びそれ以降の態様の全ての好ましい特徴は、必要な変更を加えて第１の態様の場合と同様である。
【図面の簡単な説明】
【0036】
【図1】ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖伸長の開始の構造を示す図である。ａ）Ｕｂ－Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造の側面図及び上面図（Ｕｂ－Ｒ、Ｕｂ（赤色）、Ｒ（青色）、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ、Ｕｂｅ２Ｎ（緑色）、Ｕｂ（橙色）、Ｕｂｅ２Ｖ２（ティール色））。略画として描かれた鎖は、非対称単位を表す。ｂ）ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖伸長の開始の標準モデル。ｃ）ｂ）に示されるＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖伸長の標準モデルを表す略画図。対称的な片割れ（Symmetry mates）は、表示の横に「’」によって示される。Ｕｂ（ユビキチン）、Ｕｂ－Ｒ（ユビキチン－ＲＩＮＧ）。
【図2】ユビキチン化の化学的機構を示す図である。ａ）Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ／Ｕｂｅ２Ｖ２の活性部位の拡大領域（Ｕｂｅ２Ｎ（緑色）、ドナーＵｂ（橙色）、アクセプターＵｂ（赤色）、Ｕｂｅ２Ｖ２（ティール色））。ｂ）アクセプターリジンの活性化についての化学式。ｃ）Ｕｂｅ２Ｎ／Ｖ２によるジユビキチン形成の酸係数（ｐＫａ）、ｄ）ＫＭ、及びｅ）ｋｃａｔを、ベストフィット＋標準誤差として表す。Ｕｂ（ユビキチン）。
【図3】トランスでのＲＩＮＧアンカー型ユビキチン化の機構を示す図である。ａ）Ｕｂ－Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造の標準モデルの表面描写（Ｕｂ－Ｒ、Ｕｂ（赤色）、Ｒ（青色）、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ、Ｕｂｅ２Ｎ（緑色）、Ｕｂ（橙色）、Ｕｂｅ２Ｖ２（ティール色））。ｂ）生化学的アッセイにおいて使用されるＴＲＩＭ２１コンストラクトのドメイン構成。ｃ）ＴＲＩＭ２１コンストラクト（青色）による基質（Ｆｃ、灰色）結合の略画モデル。ｄ）１００ｎＭのＵｂ－ＴＲＩＭ２１コンストラクトの基質（Ｆｃ）誘導性自己ユビキチン化アッセイ。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。＊（アスタリスク）は、精製中に除去することができなかったＴＲＩＭ２１分解産物を示す。ウェスタンブロットは、ｎ＝３の独立して行われた実験を表すものである。原始データにはトリミングされていないブロットが提供される。Ｕｂ（ユビキチン）；Ｒ（ＲＩＮＧ）；Ｂ（ボックス）；ＣＣ（コイルドコイル）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）；ｋＤａ（キロダルトン）。
【図4】シスでのＲＩＮＧアンカー型ユビキチン化の機構を示す図である。ａ）シスでのユビキチン化の場合、ＲＩＮＧアンカー型（青色）ユビキチン鎖（赤色）は、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ／Ｕｂｅ２Ｖ２（Ｕｂｅ２Ｎ（緑色）、Ｕｂ（橙色）、Ｕｂｅ２Ｖ２（ティール色））上の活性部位に到達するのに十分な長さでなければならない。この鎖は２つの異なる経路に行き渡ることができ、一方はここに示されており、もう一方は示されていない。ユビキチン鎖を、ＰｙＭｏｌを使用してＵｂ－Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造及びＫ６３連結型Ｕｂ２構造（２ＪＦ５３４）を使用してモデル化した。ｂ）１００ｎＭのＵｂｎ－ＴＲＩＭ２１コンストラクトの基質（Ｆｃ）誘導性自己ユビキチン化アッセイ。反応物を３７℃で５分間インキュベートした。ウェスタンブロットは、ｎ＝３の独立して行われた実験を表すものである。原始データにはトリミングされていないブロットが提供される。Ｕｂ（ユビキチン）；Ｒ（ＲＩＮＧ）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）；ｋＤａ（キロダルトン）。
【図5】触媒的ＲＩＮＧトポロジーが狙い通りのタンパク質分解を駆動することを示す図である。ａ）ＧＦＰ－Ｆｃ（それぞれ緑色及び灰色）上でのＴＲＩＭ２１（青色）のトポロジーを示す略画図。ｂ）、ｃ）ＧＦＰ－Ｆｃ分解アッセイ。ｂ）ＧＦＰ－Ｆｃ及び一連のＴＲＩＭ２１コンストラクトを一過的に発現するＲＰＥ－１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞のウェスタンブロット。ウェスタンブロットは、ｎ＝２の独立して行われた実験を表すものである。ｃ）ＧＦＰ－Ｆｃ及び一連のＴＲＩＭ２１コンストラクトを一過的に発現するＲＰＥ－１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞の緑色蛍光のフローサイトメトリー分析を示す。エレクトロポレーション後に、各細胞集団を２つに分け、ＭＧ１３２又はＤＭＳＯのいずれかで処理した。データは平均±平均の標準誤差として表される。グラフ内の各データ点は、生物学的に独立して行われた１つの実験を表す（ｎ＝３（ｍＣｈ－ＣＣ－ＰＳ、Ｒ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ、Ｒ－ＰＳの場合）又はｎ＝４（Ｒ－Ｂ－Ｃ－Ｃ－ＰＳ、Ｒ－Ｒ－ＰＳ））。対応のない両側スチューデントｔ検定を行って、ｍＣｈ－ＣＣ－ＰＲＹＳＰＲＹに対する蛍光減少の有意性を評価した（Ｐ値：Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＲＹＳＰＲＹ、０．０７９７（ｎｓ）；Ｒ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＲＹＳＰＲＹ、０．０２３６６（ｎｓ）；Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、０．４９６４（ｎｓ）；Ｒ－Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、０．００３５（＊＊））。ｄ、ｅ）ＮＩＨ ３Ｔ３ ＧＦＰ－Ｃａｖ－１ノックイン細胞におけるカベオリン－１－ｍＥＧＦＰ（Ｃａｖ１－ＧＦＰ）のＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。ｄ）には、正規化されたＧＦＰ蛍光（エラーバーは４つの画像の±ＳＥＭを表す）を示し、ｅ）には、実験後のウェスタンブロットを示す。ｄ、ｅ）におけるデータは、ｎ＝２の独立した実験を表すものである。原始データにはトリミングされていないブロット及び生データが提供される。Ｒ（ＲＩＮＧ）；Ｂ（ボックス）；ＣＣ（コイルドコイル）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）；ｍＣｈ（ｍＣｈｅｒｒｙ）；ｋＤａ（キロダルトン）；ｎｓ（有意ではない）。
【図6】ウイルス上でのＴＲＩＭタンパク質の集合を示す図である。ウイルスカプシド上でのＴＲＩＭ５（ａ、ｂ）及びＴＲＩＭ２１（ｃ、ｄ）の集合体の略画モデル。ａ）クライオ電子線トモグラフィーによって画像化したＨＩＶ－１カプシド上でのＴＲＩＭ５の六角形の集合体を示す。ｃ）アデノウイルスカプシド上でのＴＲＩＭ２１：抗体複合体の集合体（アデノウイルスでの測定値は６Ｂ１Ｔに基づく）。ｂ、ｄ）ウイルスカプシド上でのＴＲＩＭタンパク質の集合体がどのようにして触媒的ＲＩＮＧトポロジーの形成を可能にするかを視覚化した略画。Ｒ（ＲＩＮＧ）；Ｂ（ボックス）；ＣＣ（コイルドコイル）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）；Ｕｂ（ユビキチン）。
【図7】様々なＴＲＩＭ２１コンストラクトの距離についての構造モデルを示す図である。ａ）生化学的アッセイ及び細胞アッセイにおいて使用されるＴＲＩＭ２１コンストラクトのドメイン構成。生化学的実験の場合、ＴＲＩＭ２１のＮ末端をモノユビキチン化した。ｂ）Ｆｃ（灰色、２ＩＷＧ）と複合体を形成したＴＲＩＭ２１ ＰＲＹＳＰＲＹ（青色）の構造。示されている距離は、一方のＮ末端Ｈｉｓから他方のＮ末端Ｈｉｓまでに及ぶ。ｃ）ＴＲＩＭ５ａ－Ｂ－ボックス－コイルドコイル（青色、４ＴＮ３）の構造。ＴＲＩＭ２１及びＴＲＩＭ５ａのコイルドコイルは配列ごとによく整列しており、挿入を示さない。したがって、ＴＲＩＭ５ａ－コイルドコイルは、ＴＲＩＭ２１の対応する領域に適したモデルである。示されている距離は、一方のＢ－ボックスのＮ末端から他方のＢ－ボックスのＮ末端までに及ぶ。ｄ）ユビキチン鎖伸長の開始時のＵｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ：Ｆｃの構造モデル。本発明者らのＵｂＲ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２（７ＢＢＤ、Ｕｂ－Ｒ、Ｕｂ（赤色）及びＲ（青色）；Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ、Ｕｂｅ２Ｎ（緑色）及びＵｂ（橙色）；Ｕｂｅ２Ｖ２（ティール色））構造（標準モデルとして）を、ＴＲＩＭ２１－ＰＲＹＳＰＲＹ：Ｆｃ構造上に重ね合わせた。線はＲＩＮＧとＰＲＹＳＰＲＹとの間のリンカーを示す。Ｕｂ（ユビキチン）、Ｒ（ＲＩＮＧ）。
【図8】Ｕｂｅ２Ｄ１が触媒的ＲＩＮＧトポロジーを介してＴＲＩＭ２１ユビキチン化を媒介することができないことを示す図である。０．５μＭのＵｂｅ２Ｄ１の存在下での１００ｎＭのＵｂ－ＴＲＩＭ２１のＦｃ誘導性自己ユビキチン化アッセイ。ウェスタンブロットは、ｎ＝２の独立して行われた実験を表す。Ｕｂ（ユビキチン）；Ｒ（ＲＩＮＧ）；Ｂ（ボックス）；ＣＣ（コイルドコイル）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）；ｋＤａ（キロダルトン）。
【図9】第２のＲＩＮＧドメイン（Ｒ２）のＮ末端に配置された第１のＲＩＮＧドメイン（Ｒ１）と、第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に配置されたタンパク質標的化ドメイン（ＰＴ）とを含む、本発明による融合タンパク質コンストラクトの理論的構造を示す図である。
【図10】狙い通りのタンパク質分解が改善されたＴＲＩＭ２１コンストラクトを示す図である。ａ）１０μＭの濃度での様々なＴＲＩＭ２１コンストラクトのＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２による非アンカー型ユビキチン鎖の触媒作用。６０分後の反応のＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅゲルを示す。ｂ）一過的に発現されたＴＲＩＭ２１コンストラクトを使用した、ＲＰＥ１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞における内因性ＩＫＫαのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。ｃ）エレクトロポレーション反応において２μＭの濃度のＲ－Ｒ－ＰＳタンパク質を使用した、ＲＰＥ１ ＷＴ細胞又はＲＰＥ１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞のいずれかにおける内因性Ｅｒｋ１キナーゼのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。ＲＰＥ－１細胞における内因性ＴＲＩＭ２１は、Ｅｒｋ１の効率的なＴｒｉｍ－Ａｗａｙには通常３時間～４時間かかることとなる。ｄ）ＧＦＰに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体及び様々なＴＲＩＭ２１コンストラクトを使用した、ＲＰＥ１細胞において異所的に発現された単量体ＥＧＦＰのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。４．５時間後の相対ＧＦＰ強度を示す。Ｔ２１（ＴＲＩＭ２１）；Ｒ（ＲＩＮＧ）；Ｂ（ボックス）；ＣＣ（コイルドコイル）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）。
【図11】狙い通りのタンパク質分解を示す図である。ａ）リアルタイム蛍光顕微鏡法を使用してモニタリングされたカベオリン－１－ＥＧＦＰの分解。ｂ）アッセイ終了時のコンストラクトのレベルを示すウェスタンブロット。ｃ）アッセイ終了時の抗ＧＦＰ抗体のレベルを示すウェスタンブロット。Ｔ２１（ＴＲＩＭ２１）；Ｔ２１Ｒ（ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ）；ＰＳ（ＰＲＹＳＰＲＹ）。
【図12】狙い通りのタンパク質分解を示す図である。リアルタイム蛍光顕微鏡法を使用してモニタリングされたＨ２Ｂ－ＥＧＦＰの分解。Ｕｂ（ユビキチン）、Ｔ２１Ｒ（ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ）。
【発明を実施するための形態】
【0037】
本発明者らは、少なくとも２つのＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質が、標的タンパク質のタンパク質分解を可能にする触媒的ＲＩＮＧトポロジーの一部を形成することが可能であることを見出した。この構造を含む２つの融合タンパク質が共局在すると、特定のＲＩＮＧトポロジーが誘導され得るため、自己ユビキチン化及びそれに続くタンパク質分解が可能となる。融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有する酵素として機能し、少なくとももう１つのＲＩＮＧドメイン（例えば、共局在した第２の融合タンパク質由来）は、ユビキチン鎖を形成する反応において基質として機能する。３つのＲＩＮＧドメインは、標的タンパク質のタンパク質分解を可能にする触媒的ＲＩＮＧトポロジーを形成する。このトポロジーは、ヘテロ二量体Ｅ２酵素Ｕｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２を使用してＴＲＩＭ２１上にユビキチン鎖を形成するのに必要とされる。
【0038】
この融合タンパク質を使用して、全長のＴＲＩＭポリペプチドが使用された場合よりも、特にＴＲＩＭ２１ポリペプチドが使用された場合よりも幅広い標的を標的とすることができる。特に、この融合タンパク質を使用して、単量体タンパク質及び二量体タンパク質を含む小さなオリゴマーを標的とすることができる。タンパク質標的としては、限定されるものではないが、キナーゼ、転写因子、又はその他の疾患原因タンパク質が挙げられる。さらに、本発明の融合タンパク質は、１つのＲＩＮＧドメインのみを含む全長のＴＲＩＭ２１ポリペプチドを使用するコンストラクトよりも生産が容易である。この融合タンパク質はまた、野生型ＴＲＩＭ２１を使用するよりも高い活性を有し得て、タンパク質の枯渇においてより迅速かつより効率的に機能し得る。２つのＲＩＮＧドメインを含む融合タンパク質は、１つのＲＩＮＧドメインのみを含む対応する融合タンパク質よりも効率的な標的タンパク質のデグレーダーであり得る。
【0039】
融合タンパク質と、標的タンパク質と、任意に該標的タンパク質に対する抗体とは複合体を形成し、該複合体の分解及び該タンパク質の枯渇が可能となる。
【0040】
したがって、本発明は、
第１のＲＩＮＧドメインと、
第２のＲＩＮＧドメインと、
タンパク質標的化ドメインと、
を含む融合タンパク質を提供する。
第１のＲＩＮＧドメインと、
第２のＲＩＮＧドメインと、
タンパク質標的化ドメインと、
を含む融合タンパク質を提供する。
【0041】
第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは、二量体化することが可能である。本発明の融合タンパク質はＥ３ユビキチンリガーゼ活性を有する。ＲＩＮＧドメインは自己ユビキチン化活性を有し得る。第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメイン並びにタンパク質標的化ドメインは、この融合タンパク質が第３のＲＩＮＧドメインとともに共局在したときに、触媒的ＲＩＮＧトポロジーを得ることができるように配置される。
【0042】
「触媒的ＲＩＮＧトポロジー」とは、酵素のＲＩＮＧと、基質のＲＩＮＧとの間におよそ９ｎｍの離隔をもたらし、１つのＲＩＮＧ二量体が酵素として機能し、かつ少なくとも１つの更なるＲＩＮＧがユビキチン化の基質として機能する構造を意味する。
【0043】
各ドメイン間にリンカー配列が設けられていてもよい。一実施形態において、タンパク質標的化ドメインは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端にある。融合タンパク質の別個のドメインを、図９に示されるＲＩＮＧドメイン－ＲＩＮＧドメイン－タンパク質標的化ドメインの順序で設けることができ、ここでは、第１のＲＩＮＧドメインは、第２のＲＩＮＧドメインのＮ末端に設けられており、タンパク質標的化ドメインは、第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に設けられている。このような実施形態において、第１のＲＩＮＧドメインのアミノ酸配列は、第２のＲＩＮＧドメインのＮ末端に連結されており、タンパク質標的化ドメインは、第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端ドメインに連結されている。本発明による融合タンパク質は、追加のＮ末端アミノ酸配列及び／又はＣ末端アミノ酸配列、及び／又はＲＩＮＧドメインとタンパク質標的化ドメインとの間に位置する追加のドメインを有してもよい。
【0044】
融合タンパク質のＲＩＮＧドメインは、あらゆる適切なポリペプチドから誘導され得る。ＲＩＮＧドメインは当該技術分野において既知であり、Freemont PS et al (1991)著の「新規システインリッチ配列モチーフ（A novel cysteine-rich sequence motif.）」 Cell 64: 483-484に記載されており、Ｅ３リガーゼとして機能する（Meroni G and Roux G著の「「単一タンパク質ＲＩＮＧフィンガー」Ｅ３ユビキチンリガーゼの新規クラスであるＴＲＩＭ／ＲＢＣＣ（TRIM/RBCC, a novel class of 'single protein RING finger' E3 ubiquitin ligases）」 (2005) BioEssays 27, 11:1147-1157）。
【0045】
本発明の融合タンパク質において使用されるＲＩＮＧドメインは、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有する。ＴＲＩＭ２１のＲＩＮＧドメインはＥ３ユビキチンリガーゼであり、ユビキチン結合酵素を基質に向ける。ＲＩＮＧ（リアリー・インタレスティング・ニュー・ジーン（Really Interesting New Gene））ドメインファミリーのメンバーは、典型的には、コンセンサス配列Ｃｙｓ－Ｘ２－Ｃｙｓ－Ｘ（９－３９）－Ｃｙｓ－Ｘ（１－３）－Ｈｉｓ－Ｘ（２－３）－（Ａｎｓ／Ｃｙｓ／Ｈｉｓ）－Ｘ２－Ｃｙｓ－Ｘ（４－４８）－Ｃｙｓ－Ｘ２－Ｃｙｓ（Deshaies RJ et al and Joazeiro C et al著の「ＲＩＮＧドメインＥ３ユビキチンリガーゼ（RING Domain E3 Ubiquitin Ligases）」, Annu. Rev. Biochem (2009) 78:399-434）を有する。ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼドメインは様々なタンパク質に見出される。他のＲＩＮＧドメインとしては、哺乳動物Ｘ連鎖アポトーシス阻害タンパク質（protein X-linked mammalian inhibitor of apoptosis）（ＸＩＡＰ）由来のＲＩＮＧドメイン及びＤＥＲ３／Ｈｒｄ１のＲＩＮＧドメインが挙げられる。したがって、融合タンパク質における他のタンパク質ファミリーに由来するＲＩＮＧドメインの使用も包含される。ＲＩＮＧドメインは自己ユビキチン化することが可能であり、すなわち、自己ユビキチン化活性を有し得る。
【0046】
好ましくは、融合タンパク質のＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭポリペプチドから誘導される。ＴＲＩＭファミリーには、多数のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼが含まれる（Marin, I.著の「ＴＲＩＭユビキチンリガーゼの起源及び多様化（Origin and diversification of TRIM ubiquitin ligases.）」 PLoS One 7, e50030 (2012)）。好ましい実施形態において、ＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭ２１ポリペプチド、好ましくはヒトＴＲＩＭ２１から誘導される。ヒトＴＲＩＭ２１の配列は、配列番号１に示される（Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ１９４７４）。
MASAARLTMMWEEVTCPICLDPFVEPVSIECGHSFCQECISQVGKGGGSVCPVCRQRFLL
KNLRPNRQLANMVNNLKEISQEAREGTQGERCAVHGERLHLFCEKDGKALCWVCAQSRKH
RDHAMVPLEEAAQEYQEKLQVALGELRRKQELAEKLEVEIAIKRADWKKTVETQKSRIHA
EFVQQKNFLVEEEQRQLQELEKDEREQLRILGEKEAKLAQQSQALQELISELDRRCHSSA
LELLQEVIIVLERSESWNLKDLDITSPELRSVCHVPGLKKMLRTCAVHITLDPDTANPWL
ILSEDRRQVRLGDTQQSIPGNEERFDSYPMVLGAQHFHSGKHYWEVDVTGKEAWDLGVCR
DSVRRKGHFLLSSKSGFWTIWLWNKQKYEAGTYPQTPLHLQVPPCQVGIFLDYEAGMVSF
YNITDHGSLIYSFSECAFTGPLRPFFSPGFNDGGKNTAPLTLCPLNIGSQGSTDY（配列番号１）
MASAARLTMMWEEVTCPICLDPFVEPVSIECGHSFCQECISQVGKGGGSVCPVCRQRFLL
KNLRPNRQLANMVNNLKEISQEAREGTQGERCAVHGERLHLFCEKDGKALCWVCAQSRKH
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【0047】
ヒトＴＲＩＭ２１のＲＩＮＧドメインは、配列番号１に示されるヒトＴＲＩＭ２１配列の少なくともアミノ酸３～アミノ酸８１、好ましくは配列番号１に示されるヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸１～アミノ酸８５を含む。ヒトＴＲＩＭ２１のアミノ酸１～アミノ酸８５を含むＲＩＮＧドメインは、配列：
MASAARLTMMWEEVTCPICLDPFVEPVSIECGHSFCQECISQVGKGGGSVCPVCRQRFLLKNLRPNRQLANMVNNLKEISQEARE（配列番号２）
を含む。
MASAARLTMMWEEVTCPICLDPFVEPVSIECGHSFCQECISQVGKGGGSVCPVCRQRFLLKNLRPNRQLANMVNNLKEISQEARE（配列番号２）
を含む。
【0048】
したがって、本発明の一実施形態において、ＲＩＮＧドメインは、配列番号２のアミノ酸３～アミノ酸８１、好ましくは配列番号２のアミノ酸残基１～アミノ酸残基８１、より好ましくは配列番号２の配列又はその変異体を含む。好ましくは、変異体配列は、ＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト（Human Genome Mapping Project））によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）のデフォルトパラメーターを使用して、アミノ酸レベルで参照配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、配列番号２の変異体配列は、アミノ酸レベルで配列番号２の配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、更により好ましくは９５％（更により好ましくは少なくとも９９％）の同一性を有し得る。
【0049】
当該技術分野において既知である「同一性」は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列又は２つ以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当該技術分野において、同一性は、場合によっては、そのような配列の文字列間の一致によって決定される、ポリペプチド配列又はポリヌクレオチド配列の間の配列関連性（相同性）の程度も意味する。２つのポリペプチド配列又は２つのポリヌクレオチド配列の間の同一性を測定する方法は多数存在するが、同一性を決定するのに一般的に使用される方法はコンピュータープログラムにおいて体系化されている。２つの配列間の同一性を決定するのに好ましいコンピュータープログラムとしては、限定されるものではないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, et al., Nucleic acids Research, 12, 387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、及びＦＡＳＴＡ（Atschul et al., J. Molec. Biol. 215, 403 (1990)）が挙げられる。
【0050】
幾つかの実施形態において、ＴＲＩＭ２１以外のＴＲＩＭポリペプチド由来のＲＩＮＧドメインを使用することができ、例えば、ＴＲＩＭ５、ＴＲＩＭ７、ＴＲＩＭ１９、ＴＲＩＭ２５、ＴＲＩＭ２８、及び／又はＴＲＩＭ３２由来のＲＩＮＧドメイン、好ましくはＴＲＩＭ５由来のＲＩＮＧドメインを使用することができる。
【0051】
融合タンパク質は、少なくとも２つのＲＩＮＧドメイン、すなわち２つ、３つ、又はそれより多くのドメインを含み、好ましくは、融合物は、２つ又は３つのＲＩＮＧドメイン、より好ましくは２つのＲＩＮＧドメインを含む。ＲＩＮＧドメインは、互いに二量体化してＲＩＮＧ二量体を形成することが可能な配列を有する。好ましくは、ＲＩＮＧドメインは同じ配列を含む。一実施形態において、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインはどちらも配列番号２の配列を含む。ＲＩＮＧドメインが異なる配列を含む場合、少なくとも第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインの配列は、互いに二量体化してＲＩＮＧ二量体を形成することが可能であるべきである。一実施形態において、第１のＲＩＮＧドメインは配列番号２の配列を含み、かつ第２のＲＩＮＧドメインは配列番号２の変異体配列を含むか、又はその逆も同様である。変異体配列は、配列番号２の配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９５％（更により好ましくは少なくとも９９％）の同一性を有し得る。
【0052】
タンパク質標的化ドメインは、融合タンパク質を、対象のタンパク質とも呼称される分解される標的タンパク質に誘導する。タンパク質標的化ドメインは、標的タンパク質、又は標的タンパク質に結合する抗体若しくはそのフラグメント若しくは抗体ミメティックに結合し、「タンパク質結合ドメイン」とも呼称され得る。タンパク質標的化ドメインは、標的タンパク質に直接結合して融合タンパク質－標的タンパク質複合体を形成するか、又は標的タンパク質に結合する抗体、その抗体フラグメント、若しくは抗体ミメティックに結合して融合タンパク質－抗体－標的タンパク質複合体を形成するかのいずれかであり得る。タンパク質標的化ドメインは、好ましくは、２つのＲＩＮＧドメインのＣ末端に接続される。
【0053】
一実施形態において、タンパク質標的化ドメインは、ＰＲＹＳＰＲＹドメインである。このような実施形態において、融合タンパク質は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、ＰＲＹＳＰＲＹドメインとを含む。ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、好ましくは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する。
【0054】
一実施形態において、タンパク質標的化ドメインがＰＲＹＳＰＲＹドメインである場合、融合タンパク質は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、ＰＲＹＳＰＲＹドメインとを含み、ここで、このタンパク質は、コイルドコイルドメインもＢ－ボックスドメインも含まない。ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、好ましくは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する。
【0055】
好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端にあるＰＲＹＳＰＲＹドメインとを含み、ここで、ＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導される。好ましくは、融合タンパク質は、ＰＲＹＳＰＲＹドメインと、第２のＲＩＮＧドメインとの間に位置するＴＲＩＭから誘導されるコイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスドメインを含まず、より好ましくは、融合タンパク質は、コイルドコイルドメイン配列もＢ－ボックスドメイン配列も一切含まない。
【0056】
ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、ＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１、より好ましくはヒトＴＲＩＭ２１から誘導され得る。ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、配列番号１に示されるヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列の２８６位～３３７位及び３３９位～４６５位のＰＲＹ領域及びＳＰＲＹ領域から構成される。
【0057】
好ましくは、ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、配列：
AVHITLDPDTANPWLILSEDRRQVRLGDTQQSIPGNEERFDSYPMVLGAQHFHSGKHYWEVDVTGKEAWDLGVCR
DSVRRKGHFLLSSKSGFWTIWLWNKQKYEAGTYPQTPLHLQVPPCQVGIFLDYEAGMVSFYNITDHGSLIYSFSECAFTGPLRPFFSPGFNDGGKNTAPLTLCPL（配列番号３）
を含む。
AVHITLDPDTANPWLILSEDRRQVRLGDTQQSIPGNEERFDSYPMVLGAQHFHSGKHYWEVDVTGKEAWDLGVCR
DSVRRKGHFLLSSKSGFWTIWLWNKQKYEAGTYPQTPLHLQVPPCQVGIFLDYEAGMVSFYNITDHGSLIYSFSECAFTGPLRPFFSPGFNDGGKNTAPLTLCPL（配列番号３）
を含む。
【0058】
本発明の一実施形態において、ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、配列番号３の配列又はその変異体を含む。好ましくは、変異体配列は、ＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）のデフォルトパラメーターを使用して、アミノ酸レベルで参照配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、配列番号３の変異体配列は、アミノ酸レベルで配列番号３の配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９５％（更により好ましくは少なくとも９９％）の同一性を有し得る。
【0059】
融合タンパク質のＰＲＹＳＰＲＹドメインは、抗体のＦｃ又はその抗体フラグメント、例えばヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に結合する。融合タンパク質は、標的タンパク質に結合される抗体に結合する。
【0060】
Ｆｃは二量体であるため、２つのＰＲＹＳＰＲＹドメインによって結合され得る。第１の融合タンパク質のＰＲＹＳＰＲＹドメインはＦｃの単量体の一方に結合するのに対し、第２の融合タンパク質のＰＲＹＳＰＲＹドメインはＦｃの第２の単量体に結合する。これにより２つの融合タンパク質が共局在し、各融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が近接するため、一方の融合タンパク質の一方のＲＩＮＧ二量体は、他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能である。
【0061】
本発明の更なる実施形態において、タンパク質標的化ドメインは、抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックである。好ましくは、抗体フラグメント分子は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦＶ、ｄＡＢ、それらのＶＬフラグメント、それらのＶＨフラグメント、及びそれらのＶＨＨフラグメント等のｓｄＡｂ（すなわち、ナノボディ）からなる群から選択される。好ましくは、ｓｃＦＶ又はＶＨＨである。
【0062】
好ましい一実施形態において、融合タンパク質は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、ＶＨＨドメインとを含み、ここで、ＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導され、ここで、ＶＨＨは、対象のタンパク質に結合し、好ましくは、ＶＨＨは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端にある。好ましくは、融合タンパク質は、ＶＶＨドメインと、第２のＲＩＮＧドメインとの間に位置するＴＲＩＭから誘導されるコイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスドメインを含まず、より好ましくは、融合タンパク質は、コイルドコイルドメイン配列もＢ－ボックスドメイン配列も一切含まない。
【0063】
融合タンパク質の抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックは、標的タンパク質に特異的に結合する。融合タンパク質は、分解される標的タンパク質に、標的タンパク質の標的配列で直接結合する。多くのタンパク質はオリゴマー（又は少なくとも二量体）であるか、又はタンパク質複合体の一部であるため、第１の融合タンパク質の抗体ドメインは、オリゴマー又はタンパク質複合体の単量体の１つに結合することができ、一方、第２の融合タンパク質の抗体ドメインは、オリゴマー又はタンパク質複合体の第２の単量体に結合する。これにより２つの融合タンパク質が共局在し、各融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が近接するため、一方の融合タンパク質の一方のＲＩＮＧ二量体は、他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能である。
【0064】
一実施形態において、標的タンパク質は、病原性形態及び非病原性形態を有するタンパク質であり得る。タンパク質標的化ドメインは、病原性形態のタンパク質に結合するが、非病原性形態のタンパク質には結合しない。標的タンパク質の病原性形態はリピートドメインを含んでいてもよく、又はタンパク質の多量体形態である。
【0065】
標的タンパク質は、ハンチンチン及びタウから構成される群から選択される細胞内タンパク質であり得る。細胞内タンパク質がハンチンチンである場合、一実施形態において、融合タンパク質のタンパク質標的ドメインはハンチンチンのポリグルタミン酸配列に結合する。
【0066】
好ましくは、融合タンパク質は、第２のＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとの間に位置するＴＲＩＭ２１のＢ－ボックスドメインかコイルドコイルドメインのどちらかを含まない。融合タンパク質は、第２のＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとの間に位置する任意のタンパク質から誘導されるＢ－ボックスドメインかコイルドコイルドメインのどちらかを含まなくてもよい。一実施形態において、融合タンパク質は、ＴＲＩＭ２１から誘導されるＢ－ボックスドメイン等のＢ－ボックスドメインを含まず、好ましくは、任意のタンパク質から誘導されるＢ－ボックスドメインを含まない。一実施形態において、融合物は、ＴＲＩＭ２１から誘導されるコイルドコイルドメインを含まず、好ましくは、任意のタンパク質から誘導されるコイルドコイルドメインを含まない。
【0067】
ヒトＴＲＩＭ２１のＢ－ボックスドメインは、配列番号１に示されるヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸９１～アミノ酸１２８を含む。ヒトＴＲＩＭ２１のコイルドコイルドメインは、配列番号１に示されるヒトＴＲＩＭ２１アミノ酸配列のアミノ酸１２８～アミノ酸２３８を含む。
【0068】
Ｂ－ボックスドメインは、配列：
RCAVHGERLHLFCEKDGKALCWVCAQSRKHRDHAMVPL（配列番号４）
を含み得る。
RCAVHGERLHLFCEKDGKALCWVCAQSRKHRDHAMVPL（配列番号４）
を含み得る。
【0069】
したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４の配列もその変異体も含まない。
【0070】
コイルドコイルドメインは、配列：
EEAAQEYQEKLQVALGELRRKQELAEKLEVEIAIKRADWKKTVETQKSRIHAEFVQQKNFLVEEEQRQLQELEKDEREQLRILGEKEAKLAQQSQALQELISELDRRCHS（配列番号５）
を含み得る。
EEAAQEYQEKLQVALGELRRKQELAEKLEVEIAIKRADWKKTVETQKSRIHAEFVQQKNFLVEEEQRQLQELEKDEREQLRILGEKEAKLAQQSQALQELISELDRRCHS（配列番号５）
を含み得る。
【0071】
したがって、一実施形態において、融合タンパク質は、配列番号５の配列もその変異体も含まない。
【0072】
好ましくは、融合タンパク質は、配列番号４及び配列番号５の配列もそれらの機能的変異体も含まない。好ましくは、変異体配列は、ＨＧＭＰ（ヒトゲノムマッピングプロジェクト）によって提供されるＢＬＡＳＴコンピュータープログラム（Atschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)）のデフォルトパラメーターを使用して、アミノ酸レベルで参照配列に対して少なくとも６０％の同一性を有する。より好ましくは、配列番号４又は配列番号５の変異体配列は、アミノ酸レベルで配列番号４又は配列番号５の配列に対して、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは９５％（更により好ましくは少なくとも９９％）の同一性を有し得る。
【0073】
第２のＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとの間にコイルドコイルドメインかＢ－ボックスドメインのどちらかを含まないことによって、融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が、標的タンパク質（又は標的タンパク質に結合する抗体）上で共局在した第２の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体と近接することを可能にする手助けとなる。これは、一方の融合タンパク質の一方のＲＩＮＧ二量体が、他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能であることを意味する。
【0074】
しかしながら、幾つかの実施形態において、融合コンストラクトは、コイルドコイルドメイン、Ｂ－ボックスドメイン、又はコイルドコイルドメイン及びＢ－ボックスドメインを含んでいてもよい。コイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスが融合タンパク質において存在するならば、これらはタンパク質標的化ドメイン及びＲＩＮＧドメインから十分な距離に位置するはずであるため、第１の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体と、標的タンパク質（又は標的タンパク質に結合する抗体）上で共局在した第２の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体とは、例えば両者が同じＦｃに結合される場合に依然として近接して、ＲＩＮＧ二量体が相互間でユビキチン化を媒介することを可能にし得る。
【0075】
２つのＲＩＮＧドメイン及びタンパク質標的化ドメインを、リンカー配列によって隔離することができる。リンカー配列は、ＴＲＩＭポリペプチドの配列から誘導されてもよく、ここで、リンカー配列は、ＴＲＩＭポリペプチドのコイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスドメインをコードしない。
【0076】
他の実施形態において、当該技術分野において既知である標準的なリンカー配列を使用することもでき、例えば、ポリグリシン又はポリセリンのアミノ酸配列を使用することができる。リンカーの長さは様々なサイズであり得る。しかしながら、２つのＲＩＮＧドメイン間のリンカー配列は、融合タンパク質に柔軟性を与え、存在する２つのＲＩＮＧドメインの二量体化を可能にするのに十分な長さであるべきである。一実施形態において、タンパク質標的化ドメインと、ＲＩＮＧドメインとの間のリンカー配列は、１アミノ酸から５０アミノ酸の間の長さ、好ましくは１アミノ酸から３５アミノ酸の間、１アミノ酸から３０アミノ酸の間、１アミノ酸から２５アミノ酸の間、１アミノ酸から２０アミノ酸の間、１アミノ酸から１５アミノ酸の間、又は１アミノ酸から１０アミノ酸の間の長さである。より好ましくは、リンカーは、１アミノ酸～６アミノ酸の長さであり、例えば、１アミノ酸、２アミノ酸、３アミノ酸、４アミノ酸、５アミノ酸、又は６アミノ酸の長さである。幾つかの実施形態において、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインとの間にはリンカーが存在しなくてもよい。
【0077】
ＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとの間のリンカー配列は、標的タンパク質（又は標的タンパク質に結合する抗体）上で共局在したときに、第１の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が、第２の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体に近接することを可能にするのに十分な長さであるべきである。リンカーは、第２タンパク質のＲＩＮＧドメインとの触媒的ＲＩＮＧトポロジーの形成を可能にするのに十分な長さであるべきである。
【0078】
例えば、タンパク質標的化ドメインがＰＲＹＳＰＲＹドメインである場合、ＰＲＹＳＰＲＹドメインと、ＲＩＮＧドメインとの間のリンカーは、第１の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体が、Ｆｃに結合されたときに、同様にＦｃに結合された第２の融合タンパク質のＲＩＮＧ二量体に近接する長さであるべきである。好ましくは、２つのＲＩＮＧ二量体は、Ｆｃに結合されたときに、互いにおよそ８ｎｍ～１０ｎｍ離れて位置し、好ましくは互いに９ｎｍ以内に位置する。
【0079】
２つの二量体の離隔は、実施例に示されるように、例えばＸ線結晶学を使用して複合体の構造を決定し、この構造におけるＲＩＮＧ間の距離を測定することにより決定することができる。この距離は、第１の融合タンパク質の酵素のＲＩＮＧと、第２の融合タンパク質の基質のＲＩＮＧとの間の間隔である。
【0080】
一実施形態において、タンパク質標的化ドメインと、ＲＩＮＧドメインとの間のリンカー配列は、５アミノ酸から５０アミノ酸の間の長さ、好ましくは５アミノ酸から４０アミノ酸の間、５アミノ酸から３０アミノ酸の間、５アミノ酸から２５アミノ酸の間、１０アミノ酸から２５アミノ酸の間、１５アミノ酸から２５アミノ酸の間、１５アミノ酸から２０アミノ酸の間、又は１０アミノ酸から２０アミノ酸の間の長さである。より好ましくは、リンカーは、１０アミノ酸から２０アミノ酸の間の長さである。
【0081】
一実施形態において、リンカー配列は、ＴＲＩＭポリペプチドの配列から誘導されてもよく、ここで、リンカー配列は、ＴＲＩＭポリペプチドのコイルドコイルドメイン及び／又はＢ－ボックスドメインをコードしない。例えば、ＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとの間に設けられたリンカー配列は、配列ＧＴＱＧＥＲＧＬＫＫＭＬＲＴＣ（配列番号４０）を含み得る。一実施形態において、この配列は、配列ＧＴＱＧＥＲＧＬＫＫＭＬＲＴＣ（配列番号４０）からなる。
【0082】
したがって、本発明の一実施形態は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置するＰＲＹＳＰＲＹドメインと、配列ＧＴＱＧＥＲＧＬＫＫＭＬＲＴＣ（配列番号４０）を含むＲＩＮＧドメインとＰＲＹＳＰＲＹドメインとの間のリンカー配列とを含む融合タンパク質を含み、ここで、ＲＩＮＧドメイン及びＰＲＹＳＰＲＹドメインは、ＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導され、好ましくは、融合タンパク質は、コイルドコイルドメインもＢ－ボックスドメインも含まない。好ましくは、ＲＩＮＧドメインは、配列番号２の少なくともアミノ酸１～アミノ酸８１、より好ましくはアミノ酸１～アミノ酸８５、又はそれらの機能的変異体を含む。好ましくは、ＰＲＹＳＰＲＹドメインは、配列番号３の配列又はその機能的変異体を含む。
【0083】
「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は、共有結合により互いに連結された２つ以上の部分を有し、各部分が、同じであっても又は異なっていてもよい特定の特性を有するポリペプチドである、ポリペプチドを指す。この特性は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ又はｉｎ ｖｉｖｏでの活性等の生物学的特性であってもよい。この特性はまた、標的抗原への結合、反応の触媒作用等のような単純な化学的特性又は物理的特性であってもよい。２つの部分は、単一のペプチド結合によって直接連結されていてもよく、又は１つ以上のアミノ酸残基を含むペプチドリンカーを介して連結されていてもよい。一般に、２つの部分及びリンカーは互いにリーディングフレーム内にある。
【0084】
本書における「融合タンパク質」という用語は、一般的には、水素結合若しくは塩橋を含む化学的手段によって、又はタンパク質合成によるペプチド結合によって、又はその両方によって互いにつながった１つ以上のタンパク質を意味する。典型的には、融合タンパク質は、当該技術分野において標準的なＤＮＡ組換え技術によって調製されることになり、本明細書において組換え融合タンパク質と呼称される場合がある。
【0085】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質をコードする核酸コンストラクトを提供する。核酸コンストラクトは、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含み得る。
【0086】
好ましくは、核酸コンストラクトは、タンパク質標的化ドメインが第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する融合タンパク質をコードする。好ましくは、この核酸は、Ｂ－ボックスドメイン及び／又はコイルドコイルドメインをコードする配列を含まない。核酸コンストラクトはまた、ＲＩＮＧドメイン間及び／又はＲＩＮＧドメインとタンパク質標的化ドメインとの間に位置する任意のリンカー配列をコードし得る。
【0087】
本発明の一実施形態において、核酸コンストラクトは、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含み得て、ここで、核酸コンストラクトは、Ｂ－ボックスドメインをコードする配列もコイルドコイルドメインをコードする配列も含まない。核酸コンストラクトは、上記のように、ＲＩＮＧドメイン及びタンパク質標的化ドメインをコードし得る。
【0088】
好ましい実施形態において、核酸コンストラクトは、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、ＰＲＹＳＰＲＹドメインをコードする第３の核酸配列とを含み、ここで、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭ、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導される。より好ましくは、核酸コンストラクトは、ＴＲＩＭ由来の、好ましくは任意のポリペプチドから誘導されるＢ－ボックスドメイン及び／又はコイルドコイルドメインをコードする配列を含まず、なおもより好ましくは、この融合物は、ＴＲＩＭから誘導される、好ましくは任意のポリペプチドから誘導されるＢ－ボックスドメインもコイルドコイルドメインもいずれも含まない。
【0089】
一実施形態において、核酸コンストラクトは、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、ＶＨＨをコードする第３の核酸配列とを含み、ここで、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインは、ＴＲＩＭ、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導され、ＶＨＨは、対象のタンパク質に結合する。より好ましくは、核酸コンストラクトは、ＴＲＩＭ由来の、好ましくは任意のポリペプチドから誘導されるＢ－ボックスドメイン及び／又はコイルドコイルドメインをコードする配列を含まず、なおもより好ましくは、この融合物は、ＴＲＩＭから誘導される、好ましくは任意のポリペプチドから誘導されるＢ－ボックスドメインもコイルドコイルドメインもいずれも含まない。
【0090】
核酸コンストラクトは、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置するＰＲＹＳＰＲＹドメインをコードする第３の核酸配列と、配列ＧＴＱＧＥＲＧＬＫＫＭＬＲＴＣ（配列番号４０）を含むリンカー配列をコードする第４の核酸配列とを含み得て、ここで、ＲＩＮＧドメイン及びＰＲＹＳＰＲＹドメインは、ＴＲＩＭポリペプチド、好ましくはＴＲＩＭ２１から誘導され、好ましくは、この核酸は、コイルドコイルドメインをコードする配列もＢ－ボックスドメインをコードする配列も含まない。好ましくは、第１の核酸配列及び第２の核酸配列は、配列番号２の少なくともアミノ酸１～アミノ酸８１、より好ましくはアミノ酸１～アミノ酸８５、又はそれらの機能的変異体を含むＲＩＮＧドメインをコードする。好ましくは、第３の核酸配列は、配列番号３の配列又はその機能的変異体を含むＰＲＹＳＰＲＹドメインをコードする。
【0091】
本発明はまた、これらの核酸コンストラクトによってコードされる融合タンパク質を提供する。
【0092】
これらの核酸コンストラクトは、ベクター、例えば、発現ベクターの形態で提供されてもよく、中でも、染色体ベクター、エピソーマルベクター、及びウイルス由来のベクター、例えば、細菌性プラスミドから、バクテリオファージから、トランスポゾンから、酵母エピソームから、挿入エレメントから、酵母染色体エレメントから、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、及びレトロウイルス等のウイルスから誘導されるベクター、並びにそれらの組合せから誘導されるベクター、例えばプラスミド並びにコスミド及びファージミド等のバクテリオファージの遺伝エレメントから誘導されるベクターを挙げることができる。一般に、核酸を維持し、増やし、又は発現して宿主においてポリペプチドを発現するのに適したあらゆるベクターをこの点での発現に使用することができる。ベクターは、上記定義の複数の、例えば２つ以上の核酸コンストラクトを含んでいてもよい。好ましくは、ベクターはウイルス性送達ベクター、好ましくはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はレンチウイルスベクターである。
【0093】
本発明の核酸コンストラクトは、好ましくは、核酸の発現を制御するプロモーター又は他の調節配列を含む。プロモーター又は他の調節配列は、融合タンパク質のドメインをコードする核酸配列に作動可能に連結され得る。核酸の発現を制御するプロモーター及び他の調節配列は特定されており、当該技術分野において既知である。当業者であれば、プロモーター又は他の調節配列の全体を利用する必要がない場合があることに留意するであろう。最小限の必須の調節エレメントだけが必要とされる場合があり、実際、そのようなエレメントを使用してキメラ配列又は他のプロモーターを構築することができる。
【0094】
「核酸コンストラクト」という用語は、一般に、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はクローニングによって得られる若しくは化学合成によって生成されるｍＲＮＡ等のＲＮＡであり得るあらゆる長さの核酸を指す。ＤＮＡは一本鎖であっても又は二本鎖であってもよい。一本鎖ＤＮＡは、コーディングセンス鎖であってもよく、又は非コーディング鎖若しくはアンチセンス鎖であってもよい。治療用途の場合、核酸コンストラクトは、好ましくは、処置される被験体において発現することが可能な形態である。
【0095】
本発明はまた、そのような核酸コンストラクトを含む宿主細胞を提供する。
【0096】
本発明はまた、本発明の融合タンパク質を調製する方法であって、上記の核酸コンストラクト又はベクターを含む宿主細胞を上記宿主細胞が融合タンパク質を産生するような条件下で培養又は維持することを含み、任意に融合タンパク質を単離することを更に含む、方法を提供する。
【0097】
本発明の融合タンパク質又は核酸コンストラクトを含む医薬組成物も提供される。医薬組成物は、様々な薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤を含んでいてもよい。適切な薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤は当該技術分野において既知である。本発明の医薬組成物は、限定されるものではないが、静脈内投与、筋肉内投与、経口投与、腹腔内投与、又は局所投与を含む、当該技術分野において既知であるあらゆる適切な方法によって投与されるものであってもよい。好ましい実施形態において、医薬組成物は、液剤、ゲル剤、粉剤、錠剤、カプセル剤、又はフォーム剤の形態で調製され得る。
【0098】
本発明の融合タンパク質及び核酸コンストラクトを医薬として治療に使用することができる。一実施形態において、本発明はまた、神経障害、例えばアルツハイマー病又はハンチントン病の処置を提供する。他の実施形態において、本発明は、感染症、例えばＨＩＶ等のウイルス感染症の処置を提供する。更なる実施形態において、本発明は、トリヌクレオチドリピート障害、特にトリヌクレオチドリピートが遺伝子のコーディング配列内に存在するトリヌクレオチドリピート障害の処置を提供する。本発明の融合タンパク質又は核酸コンストラクトを用いて処置することができるトリヌクレオチドリピート障害としては、ハンチントン病、歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症、及び脊髄小脳失調症が挙げられる。
【0099】
神経障害、感染症、又はトリヌクレオチドリピート障害の処置は、本発明の融合タンパク質、核酸、又は医薬組成物を被験体に投与することを含む。
【0100】
一実施形態において、処置は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質を投与することを含む。好ましくは、タンパク質標的化ドメインは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する。好ましくは、投与される融合タンパク質は、コイルドコイルドメインもＢ－ボックスドメインも含まない。
【0101】
本発明の一実施形態において、処置は、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含む核酸コンストラクトを投与することを含む。好ましくは、核酸コンストラクトは、タンパク質標的化ドメインが第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する融合タンパク質をコードする。好ましくは、投与される核酸コンストラクトは、Ｂ－ボックスドメインをコードする配列もコイルドコイルドメインをコードする配列も含まない。
【0102】
処置される障害がアルツハイマー病等の神経障害である場合、タンパク質標的化ドメインは、タウを標的とする配列をコードし得る。一実施形態において、タンパク質標的化ドメインは、タウに特異的に結合する抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックをコードし得る。処置される障害がハンチントン病である場合、タンパク質標的化ドメインは、ハンチンチンを標的とする配列をコードし得る。一実施形態において、タンパク質標的化ドメインは、ハンチンチンのポリグルタミン酸配列に特異的に結合する抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックをコードし得る。
【0103】
本発明による核酸コンストラクトを、送達ベクターによって投与することもできる。送達ベクターとしては、当該技術分野において既知であるアデノウイルス送達ベクター、レトロウイルス送達ベクター、又はレンチウイルス送達ベクター等のウイルス性送達ベクターが挙げられる。他の非ウイルス性送達ベクターとしては、当該技術分野において既知であるリポソーム送達ベクターを含む脂質送達ベクターが挙げられる。
【0104】
処置としては、予防（未然防止）及び治療的処置の両方が挙げられる。「処置する（treat）」、「処置している（treating）」、又は「処置（treatment）」という用語（又は同等の用語）は、個体の病態の重症度が低減されるか、又は少なくとも部分的に改善若しくは寛解すること、及び／又は少なくとも１つの臨床症状の幾らかの軽減、緩和、若しくは減少が達成され、及び／又は病態の進行に抑制若しくは遅延が見られ、及び／又は疾患若しくは病気の発症の未然防止若しくは遅延が見られることを意味する。
【0105】
「患者」、「個体」、又は「被験体」という用語には、本明細書に記載される融合タンパク質又は核酸コンストラクトによる予防的処置又は治療的処置のいずれかを受けるヒト被験体及び他の哺乳動物被験体が挙げられる。哺乳動物被験体としては、霊長類、例えば非ヒト霊長類が挙げられる。哺乳動物被験体としては、限定されるものではないが、ウサギ並びにラット及びマウス等の齧歯動物等の、研究において一般的に使用される実験動物も挙げられる。
【0106】
本発明の融合タンパク質及び核酸コンストラクトを、例えば細胞内又は試料中のタンパク質の分解の研究ツールとして使用することもできる。
【0107】
したがって、本発明の一実施形態において、本発明の融合タンパク質又は核酸を投与することを含む、細胞内のタンパク質を分解する方法が提供される。細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞であってもよい。
【0108】
本発明の更なる実施形態は、本発明の融合タンパク質又は核酸コンストラクトを試料に導入することを含む、試料中のタンパク質を分解する方法を提供する。
【0109】
一実施形態において、細胞内又は試料中のタンパク質を分解する方法は、第１のＲＩＮＧドメインと、第２のＲＩＮＧドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質を投与することを含む。好ましくは、タンパク質標的化ドメインは、第１のＲＩＮＧドメイン及び第２のＲＩＮＧドメインのＣ末端に位置する。好ましくは、投与される融合タンパク質は、コイルドコイルドメインもＢ－ボックスドメインも含まない。
【0110】
本発明の一実施形態において、細胞内又は試料中のタンパク質を分解する方法は、第１のＲＩＮＧドメインをコードする第１の核酸配列と、第２のＲＩＮＧドメインをコードする第２の核酸配列と、タンパク質標的化ドメインをコードする第３の核酸配列とを含む核酸コンストラクトを投与することを含む。好ましくは、投与される核酸コンストラクトは、Ｂ－ボックスドメインをコードする配列もコイルドコイルドメインをコードする配列も含まない。
【0111】
対象のタンパク質を標的とする抗体、その抗体フラグメント、若しくは抗体ミメティック、又は抗体、その抗体フラグメント、若しくは抗体ミメティックをコードする核酸を、細胞又は試料に投与することもできる。「対象のタンパク質」とは、分解の対象となるタンパク質である。抗体、その抗体フラグメント、又は抗体ミメティックは、対象のタンパク質に特異的に結合し得る。
【0112】
上記方法は、内因的にＴＲＩＭ２１を発現しない細胞内のタンパク質を分解するのに特に有用である。上記方法は、細胞内タンパク質を分解するのに特に有用である。しかしながら、幾つかの実施形態において、例えばウイルス等の病原体を標的とする場合、抗体は細胞外で対象のタンパク質に結合することになる。抗体－標的は細胞内に移行して、ここで、融合タンパク質が抗体－標的に結合してタンパク質を分解することになる。
【0113】
融合タンパク質又は核酸を、例えばマイクロインジェクションを含む注入による若しくはエレクトロポレーションによるトランスフェクションによって、又は例えばウイルス性送達ベクター、例えばＡＡＶベクターの使用による形質導入によって細胞に導入することができる。融合タンパク質及び核酸コンストラクトを細胞に導入するのに適した他の送達技術は、当該技術分野において既知である。
【0114】
「～を含む群から選択される（selected from the group comprising）」という語句は、これらが本明細書において存在する場合、「～からなる群から選択される（selected from the group consisting of）」という語句で置き換えることができ、その逆もまた同様である。
【0115】
本明細書において引用された全ての出版物の内容は、本発明の属する技術水準をより完全に説明するのに、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。
【0116】
本発明は、以下の実施例を参照することにより更に理解されるであろう。
【実施例】
【0117】
実施例１：Ｅ２ヘテロ二量体Ｕｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２と複合体を形成したモノユビキチン化ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインの構造
材料及び方法
プラスミド：細菌性発現コンストラクト：Ｕｂｅ２Ｖ２及びＴＲＩＭ２１発現コンストラクトを全長でｐＯＰ－ＴＧベクターにクローニングし、全長のＴＲＩＭ２１コンストラクトをＨＬＴＶベクターにクローニングした。Ｕｂｅ２ＮコンストラクトをｐＯＰ－ＴＳにクローニングし、Ｕｂｅ１をｐＥＴ２１にクローニングし、ユビキチンをｐＥＴ１７ｂにクローニングした。Ｕｂｅ２Ｄ１をｐＥＴ２８ａにクローニングした。Ｕｂ４／３／２－ＴＲＩＭ２１コンストラクトをクローニングするのに、線状のＵｂ３配列をコドン最適化し、合成ＤＮＡとして注文し（Integrated DNA technologies、米国アイオワ州、コーラルビル）、ＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１コンストラクトに挿入した。ｍＲＮＡを産生する全てのコンストラクトをｐＧＥＭＨＥベクターにクローニングした。コンストラクトをギブソンアセンブリーによってクローニングし、突然変異誘発ＰＣＲによって突然変異を挿入した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＩＭ２１ΔＲＩＮＧ－Ｂｏｘの場合、ＴＲＩＭ２１３８２－１４２８をＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによって切り出した。ｍＣｈｅｒｒｙを有する７４３ｂｐの断片をＶ６０（ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１、Clonetech）からＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出し、両方の断片をｐＧＥＭＨＥにライゲーションした。精製タンパク質／発現ｍＲＮＡの配列を配列番号６～配列番号３８に示す。
材料及び方法
プラスミド：細菌性発現コンストラクト：Ｕｂｅ２Ｖ２及びＴＲＩＭ２１発現コンストラクトを全長でｐＯＰ－ＴＧベクターにクローニングし、全長のＴＲＩＭ２１コンストラクトをＨＬＴＶベクターにクローニングした。Ｕｂｅ２ＮコンストラクトをｐＯＰ－ＴＳにクローニングし、Ｕｂｅ１をｐＥＴ２１にクローニングし、ユビキチンをｐＥＴ１７ｂにクローニングした。Ｕｂｅ２Ｄ１をｐＥＴ２８ａにクローニングした。Ｕｂ４／３／２－ＴＲＩＭ２１コンストラクトをクローニングするのに、線状のＵｂ３配列をコドン最適化し、合成ＤＮＡとして注文し（Integrated DNA technologies、米国アイオワ州、コーラルビル）、ＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１コンストラクトに挿入した。ｍＲＮＡを産生する全てのコンストラクトをｐＧＥＭＨＥベクターにクローニングした。コンストラクトをギブソンアセンブリーによってクローニングし、突然変異誘発ＰＣＲによって突然変異を挿入した。ｍＣｈｅｒｒｙ－ＴＲＩＭ２１ΔＲＩＮＧ－Ｂｏｘの場合、ＴＲＩＭ２１３８２－１４２８をＰＣＲによって増幅し、ＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩによって切り出した。ｍＣｈｅｒｒｙを有する７４３ｂｐの断片をＶ６０（ｐｍＣｈｅｒｒｙ－Ｃ１、Clonetech）からＡｇｅＩ及びＥｃｏＲＩによって切り出し、両方の断片をｐＧＥＭＨＥにライゲーションした。精製タンパク質／発現ｍＲＮＡの配列を配列番号６～配列番号３８に示す。
【0118】
組換えタンパク質の発現及び精製：ユビキチン－ＴＲＩＭ２１、ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ（残基１～残基８５）、Ｕｂｅ２Ｎ、及びＵｂｅ２Ｖ２のコンストラクトをエシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＢＬ２１ ＤＥ３細胞において発現させた。ユビキチン及びＵｂｅ１をエシェリキア・コリＲｏｓｅｔｔａ２ ＤＥ３細胞において発現させた。全ての細胞を、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．５％のグルコース、及び１００μｇ・ｍＬ－１のアンピシリン（及びＲｏｓｅｔｔａ２細胞における発現の場合は３５μｇ・ｍＬ－１のクロラムフェニコール）を補充した２ｘＴＹ培地において成長させた。細胞を０．７のＯＤ６００で誘導した。ＴＲＩＭタンパク質の場合は、０．５ｍＭのＩＰＴＧ及び１０μＭのＺｎＣｌ２を用いて誘導を行い、ユビキチン及びＵｂｅ１の場合は、０．２ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導を行い、Ｅ２酵素の場合は、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて誘導を行った。遠心分離後に、細胞を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２０％のＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Novagen）、及びｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Roche、スイス）中に再懸濁した。溶解を超音波処理によって行った。ＴＲＩＭタンパク質及びＵｂｅ２Ｖ２をＮ末端ＧＳＴタグとともに発現させ、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＤＴＴ中で平衡化したグルタチオンセファロース樹脂（GE Healthcare）を介して精製した。タグをビーズ上で４℃にて一晩切断した。ユビキチン－ＴＲＩＭ２１コンストラクトの場合には、溶離液に１０ｍＭのイミダゾールを補充し、これを０．２５ｍＬのＮｉ－ＮＴＡビーズ上に流してＨｉｓタグ付きＴＥＶを除去した。Ｕｂｅ２Ｎ及びＵｂｅ１をＮ末端のＨｉｓタグとともに発現させ、Ｎｉ－ＮＴＡ樹脂を介して精製した。タンパク質を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、及び３００ｍＭのイミダゾール中で溶出させた。Ｕｂｅ２Ｎの場合、試料を５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、及び２０ｍＭのイミダゾールに対して透析することによって、ＨｉｓタグのＴＥＶ切断を一晩実施した。その後、Ｈｉｓタグ付きＴＥＶプロテアーゼをＮｉ－ＮＴＡ樹脂によって除去した。切断により、組換え発現されたＴＲＩＭタンパク質にはＮ末端トリペプチドの痕跡（ＧＳＨ）が、Ｕｂｅ２ＮにはＮ末端Ｇの痕跡が、Ｕｂｅ２Ｖ２にはＮ末端ＧＳＱＥＦの痕跡が残った。最後に、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＤＴＴ中でＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５プレップグレードカラム（GE Healthcare）上でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【0119】
全長のＴＲＩＭ２１（Ｕｂ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ又はＵｂ－Ｒ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ）をエシェリキア・コリＢＬ２１ ＤＥ３細胞においてＨｉｓ－リポイル融合タンパク質として発現させた。２ｘＴＹ中の細胞を０．８のＯＤ６００まで成長させ、０．５ｍＭのＩＰＴＧ及び１０μＭのＺｎＣｌ２で誘導した。細胞を更に１８℃、２２０ｒｐｍで一晩インキュベートした。遠心分離後に、細胞を１００ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、２０％のＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Novagen）、２０ｍＭのイミダゾール、及びｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤（Roche、スイス）中に再懸濁した。溶解を超音波処理によって行った。Ｈｉｓ－アフィニティー精製を上記のように実施した。その直後に、タンパク質をＳ２００ ２６／６０カラム（５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ中で平衡化）に適用して、可溶性凝集物を除去した。濃度決定後に、ＴＥＶプロテアーゼを使用してＨｉｓ－リポイルタグを一晩切断した。全長ＴＲＩＭ２１はタグがないと不安定であるため、タンパク質を更に精製せずにアッセイに使用した。
【0120】
ユビキチン精製を、Pickart labによって確立されたプロトコル（Pickart, C. M. & Raasi, S.著の「ポリユビキチン鎖の制御された合成（Controlled synthesis of polyubiquitin chains.）」 Methods Enzymol 399, 21-36, (2005)）に従って実施した。超音波処理による細胞溶解後に（溶解バッファー：５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１ｍｇ・ｍＬ－１のリゾチーム（Sigma Aldrich、米国セントルイス）、０．１ｍｇ・ｍＬ－１のＤＮアーゼ（Sigma Aldrich、米国セントルイス））、０．５％の総濃度の過塩素酸を撹拌中の溶解物に４℃で加えた。（乳白色の）溶解物を撹拌機において４℃で更に３０分間インキュベートして、沈殿を完了させた。次に、溶解物を４℃で３０分間遠心分離（５００００×ｇ）した。上清を３Ｌの５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ＮａＯＡｃ）（ｐＨ４．５）に対して一晩透析（３５００ＭＷＣＯ）した。その後、２０ｍＬのＳＰカラム（GE Healthcare）を使用する陽イオン交換クロマトグラフィーを介してＮａＣｌ勾配（５０ｍＭのＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）中０ｍＭ→１０００ｍＭのＮａＣｌ）を使用してＵｂを精製した。最後に、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）中でＨｉＬｏａｄ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ７５プレップグレードカラム（GE Healthcare）上でサイズ排除クロマトグラフィーを実施した。
【0121】
全てのタンパク質を少量（３０μＬ～１００μＬ）に分けて急速冷凍し、－８０℃で貯蔵した。
【0122】
イソペプチド連結型Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂの形成：Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２ＡへのＷＴユビキチンのチャージングを、通常のＥ１媒介性のチャージングとして、しかしＫ８７の脱プロトン化を確実にする高いｐＨで実施した。イソペプチドチャージング反応を、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１０．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、３ｍＭのＡＴＰ、０．８μＭのＵｂｅ１、１００μＭのＵｂｅ２Ｎ、及び１３０μＭのユビキチン中で３７℃にて４時間行った。コンジュゲーション後に、Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂを、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）及び１５０ｍＭのＮａＣｌ中で平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ Ｓ７５ ２６／６０、GE Healthcare）によって精製した。
【0123】
結晶化：全体で、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＤＴＴ中の５ｍｇ・ｍＬ－１のヒトＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１１－８５、Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂ、及びＵｂｅ２Ｖ２を、１７℃でのシッティングドロップ（５００ｎＬのタンパク質を５００ｎＬのリザーバー溶液と混合した）においてスパースマトリックススクリーニングに供した。Ｍｏｒｐｈｅｕｓ ＩＩスクリーン（Gorrec, F.著の「ＭＯＲＰＨＥＵＳ ＩＩタンパク質結晶化スクリーン（The MORPHEUS II protein crystallization screen.）」 Acta Crystallogr F Struct Biol Commun 71, 831-837, (2015)）において、０．１ＭのＭＯＰＳＯ／ビス－トリス（ｐＨ６．５）、１２．５％（重量／容量）のＰＥＧ４Ｋ、２０％（容量／容量）の１，２，６－ヘキサントリオール、各０．０３ＭのＬｉ、Ｎａ、及びＫ中で結晶を得た。
【0124】
Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造の場合、２０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ８．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び１ｍＭのＤＴＴ中の１０ｍｇ・ｍＬ－１のＴＲＩＭ２１１－８５、Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂ、Ｕｂｅ２Ｖ２、及びＵｂを、１７℃でのシッティングドロップ（２００ｎＬのタンパク質を２００ｎＬのリザーバー溶液と混合した）においてスパースマトリックススクリーニングに供した。Ｍｏｒｐｈｅｕｓ ＩＩＩスクリーン（Sammak, S. et al.著の「ｃ－ＭＹＣ：ＭＡＸ ｂＨＬＨＺｉｐ複合体のアポ型の結晶構造及び核磁気共鳴研究により、ＤＮＡの不存在下でヘリックス塩基性領域が明らかになる（Crystal Structures and Nuclear Magnetic Resonance Studies of the Apo Form of the c-MYC:MAX bHLHZip Complex Reveal a Helical Basic Region in the Absence of DNA.）」 Biochemistry 58, 3144-3154, (2019)）において、０．１Ｍのビシン／トリズマ塩基（ｐＨ８．５）、１２．５％（重量／容量）のＰＥＧ １０００、１２．５％（重量／容量）のＰＥＧ ３３５０、１２．５％（容量／容量）のＭＰＤ、０．２％（重量／容量）の各麻酔性アルカロイド（塩酸リドカイン・Ｈ２Ｏ、塩酸プロカイン、塩酸プロパラカイン、塩酸テトラカイン）中で結晶を得た。追加の凍結保護剤を使用せずに結晶を急速冷凍させて、データ収集した。
【0125】
結晶データ収集、構造解析、及び精密化：０．９７６２Åの波長のＥｉｇｅｒ２ ＸＥ １６Ｍ検出器を備えたDiamond Light Sourceのビームラインｉ０３でデータを収集した。ＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１１－８５：Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２の場合、回折画像をＸＤＳ（Kabsch, W. Xds. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 125-132, (2010)）を使用して２．２Åの分解能まで処理した。結晶は空間群番号５（Ｃ２）に属し、各成分は非対称単位中に単一のコピーとして存在する。生データの分析により、データに中程度の異方性があることが明らかになった。Ｐｈｅｎｉｘスイート（Adams, P. D. et al.著の「ＰＨＥＮＩＸ：巨大分子構造解析用の包括的なＰｙｔｈｏｎベースのシステム（PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution.）」 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 66, 213-221, (2010)）に実装されたＰＨＡＳＥＲ－ＭＲを使用した分子置換によって構造を解析した。サーチモデルとしては、６Ｓ５３からのＴＲＩＭ２１－ＲＩＮＧ及びＵｂｅ２Ｎ（Kiss, L. et al.著の「トリイオン性アンカー機構は、ＴＲＩＭリガーゼにおけるＵｂｅ２Ｎ特異的な動員及びＫ６３鎖のユビキチン化を駆動する（A tri-ionic anchor mechanism drives Ube2N-specific recruitment and K63-chain ubiquitination in TRIM ligases.）」 Nat Commun 10, 4502, (2019)）、１ＵＢＱからのユビキチン（Vijay-Kumar, S., Bugg, C. E. & Cook, W. J.著の「１．８Åの分解能で精密化されたユビキチンの構造（Structure of ubiquitin refined at 1.8 A resolution.）」 J Mol Biol 194, 531-544, (1987)）、並びに１Ｊ７４からのＵｂｅ２Ｖ２（Moraes, T. F. et al.著の「ヒトユビキチン結合酵素複合体ｈＭｍｓ２－ｈＵｂｃ１３の結晶構造（Crystal structure of the human ubiquitin conjugating enzyme complex, hMms2-hUbc13.）」 Nat Struct Biol 8, 669-673, (2001)）を用いた。モデル構築及び実空間精密化をｃｏｏｔ（Emsley, P. & Cowtan, K.著の「Ｃｏｏｔ：分子グラフィックス用のモデル構築ツール（Coot: model-building tools for molecular graphics.）」 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60, 2126-2132, (2004)）において実行し、精密化をｐｈｅｎｉｘ－ｒｅｆｉｎｅ（Afonine, P. V. et al.著の「ｐｈｅｎｉｘ．ｒｅｆｉｎｅを用いた自動化された結晶学的構造精密化に向けて（Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine.）」 Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 68, 352-367, (2012)）を使用して実行した。マップの分解能があまり良くない部分で、データの異方性が観察される可能性がある。全ての界面では明確な高分解能の密度が示されるが、特にＵｂｅ２Ｖ２（チェインＡ）の溶媒チャネルの隣にある部分は構築が困難であることが判明した。この構造は、アクセッションコード７ＢＢＤ［http://doi.org/10.2210/pdb7BBD/pdb］でProtein Data Bankに寄託されている。
【0126】
Ｕｂｅ２ＮＣ８７Ｋ／Ｋ９２Ａ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２の場合、回折画像をＸＤＳを使用して２．５４Åの分解能まで処理した。結晶は空間群番号１４５（Ｐ３２）に属し、各成分は非対称単位中に３回存在し、これは並進非結晶学的対称性によって関連付けられる。Ｐｈｅｎｉｘスイートに実装されたＰＨＡＳＥＲ－ＭＲによって構造を解析した。使用したサーチモデルは、６Ｓ５３からのＵｂｅ２Ｎ、１ＵＢＱからのユビキチン、及び１Ｊ７４からのＵｂｅ２Ｖ２であった。モデル構築及び実空間精密化をｃｏｏｔにおいて実行し、精密化を、ｐｈｅｎｉｘ－ｒｅｆｉｎｅを使用して実行した。この構造は、アクセッションコード７ＢＢＦ［http://doi.org/10.2210/pdb7BBF/pdb］でProtein Data Bankに寄託されている。
【0127】
結果
本発明者らは、基質結合ユビキチン鎖がどのように形成され得るかを理解することに着手した。原則として、ＴＲＩＭタンパク質のユビキチン鎖伸長は、そのＲＩＮＧドメインのみに依存する。ＴＲＩＭ２１（及びＴＲＩＭ５α）の場合には、Ｅ２酵素Ｕｂｅ２Ｗとの相互作用に際してＮ末端モノユビキチン化を経た後に、ＴＲＩＭ ＲＩＮＧ自体が基質になる。したがって、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ及びその鎖形成性のＥ２ヘテロ二量体Ｕｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２による基質結合ユビキチン化に取り組むことを試みた。結晶化試験において、Ｎ末端でモノユビキチン化されたＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメイン（ＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１１－８５、すなわちＵｂ－Ｒ）、イソペプチド連結型の非加水分解性のユビキチンチャージされたＵｂｅ２Ｎコンジュゲート（Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ）及びＵｂｅ２Ｖ２を使用した。この複合体の原子構造を２．２Åの分解能で解析したところ、非対称単位中にＵｂ－Ｒ、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ、及びＵｂｅ２Ｖ２のコピーをそれぞれ１つずつ有していた（データは示していない）。本発明者らのモデルにおいて結晶対称性を利用することによって、天然に存在するＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧホモ二量体を作成した（図１ａ）。ＲＩＮＧは閉構造でＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂに結合し、Ｕｂｅ２ＮはＵｂｅ２Ｖ２とともにヘテロ二量体を形成する。結晶格子内の更なる相互作用を分析したところ、ＴＲＩＭ２１に連結したユビキチンは対称性関連複合体のＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２と追加的に接し（図１ｂ）、これによりＲＩＮＧに結合したユビキチンは、そのＫ６３が活性部位を向くように配向され、求核攻撃の準備が整うことが判明した（図１ｂ、図１ｃ）。したがって、本発明者らの構造は、自己アンカー型ユビキチン鎖伸長の準備が整ったユビキチンプライミングされたＲＩＮＧのスナップショットを表す。
本発明者らは、基質結合ユビキチン鎖がどのように形成され得るかを理解することに着手した。原則として、ＴＲＩＭタンパク質のユビキチン鎖伸長は、そのＲＩＮＧドメインのみに依存する。ＴＲＩＭ２１（及びＴＲＩＭ５α）の場合には、Ｅ２酵素Ｕｂｅ２Ｗとの相互作用に際してＮ末端モノユビキチン化を経た後に、ＴＲＩＭ ＲＩＮＧ自体が基質になる。したがって、本発明者らは、ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ及びその鎖形成性のＥ２ヘテロ二量体Ｕｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２による基質結合ユビキチン化に取り組むことを試みた。結晶化試験において、Ｎ末端でモノユビキチン化されたＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメイン（ＵｂＧ７５／７６Ａ－ＴＲＩＭ２１１－８５、すなわちＵｂ－Ｒ）、イソペプチド連結型の非加水分解性のユビキチンチャージされたＵｂｅ２Ｎコンジュゲート（Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ）及びＵｂｅ２Ｖ２を使用した。この複合体の原子構造を２．２Åの分解能で解析したところ、非対称単位中にＵｂ－Ｒ、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ、及びＵｂｅ２Ｖ２のコピーをそれぞれ１つずつ有していた（データは示していない）。本発明者らのモデルにおいて結晶対称性を利用することによって、天然に存在するＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧホモ二量体を作成した（図１ａ）。ＲＩＮＧは閉構造でＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂに結合し、Ｕｂｅ２ＮはＵｂｅ２Ｖ２とともにヘテロ二量体を形成する。結晶格子内の更なる相互作用を分析したところ、ＴＲＩＭ２１に連結したユビキチンは対称性関連複合体のＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２と追加的に接し（図１ｂ）、これによりＲＩＮＧに結合したユビキチンは、そのＫ６３が活性部位を向くように配向され、求核攻撃の準備が整うことが判明した（図１ｂ、図１ｃ）。したがって、本発明者らの構造は、自己アンカー型ユビキチン鎖伸長の準備が整ったユビキチンプライミングされたＲＩＮＧのスナップショットを表す。
【0128】
実施例２：ユビキチン化の化学的機構
材料及び方法
ジユビキチン形成の速度論：精製タンパク質を上記のように得た。ジユビキチン形成の速度論的測定値をミカエリス－メンテン及びｐＫａ分析について測定した。実験をパルスチェイス形式で行い、その際、最初の反応ではＵｂｅ２Ｎ～Ｈｉｓ－Ｕｂが生成され、これをＵｂ１－７４によって追跡した。これらの条件下で、Ｕｂ１－７４は、Ｅ１酵素にチャージされ得ないため、アクセプターとしてのみ機能する。一方、Ｈｉｓタグ付きのユビキチンはドナーとして機能する。理論的には、Ｈｉｓ－Ｕｂがアクセプターとして機能する可能性もあるが、高濃度のＵｂ１－７４はアクセプターとしてのＨｉｓ－Ｕｂに競り勝つ。最初に、全ての様々なコンストラクトについての反応の線形範囲を決定して、後に初速度（ｖ０）の代表としてこの軌道上の１つの点だけを測定した。ミカエリス－メンテン速度論については、以下の長さを使用し：ＷＴ、３分；Ｄ１１９Ａ、１００分；Ｄ１１９Ｎ、３０分；Ｎ１２３Ａ、３分；Ｄ１２４Ａ、３分、ｐＫａ測定については、以下の通りであった：ＷＴ、４０秒；Ｄ１１９Ａ、５分；Ｄ１１９Ｎ、６０秒；Ｎ１２３Ａ、４０秒；Ｄ１２４Ａ、４０秒。
材料及び方法
ジユビキチン形成の速度論：精製タンパク質を上記のように得た。ジユビキチン形成の速度論的測定値をミカエリス－メンテン及びｐＫａ分析について測定した。実験をパルスチェイス形式で行い、その際、最初の反応ではＵｂｅ２Ｎ～Ｈｉｓ－Ｕｂが生成され、これをＵｂ１－７４によって追跡した。これらの条件下で、Ｕｂ１－７４は、Ｅ１酵素にチャージされ得ないため、アクセプターとしてのみ機能する。一方、Ｈｉｓタグ付きのユビキチンはドナーとして機能する。理論的には、Ｈｉｓ－Ｕｂがアクセプターとして機能する可能性もあるが、高濃度のＵｂ１－７４はアクセプターとしてのＨｉｓ－Ｕｂに競り勝つ。最初に、全ての様々なコンストラクトについての反応の線形範囲を決定して、後に初速度（ｖ０）の代表としてこの軌道上の１つの点だけを測定した。ミカエリス－メンテン速度論については、以下の長さを使用し：ＷＴ、３分；Ｄ１１９Ａ、１００分；Ｄ１１９Ｎ、３０分；Ｎ１２３Ａ、３分；Ｄ１２４Ａ、３分、ｐＫａ測定については、以下の通りであった：ＷＴ、４０秒；Ｄ１１９Ａ、５分；Ｄ１１９Ｎ、６０秒；Ｎ１２３Ａ、４０秒；Ｄ１２４Ａ、４０秒。
【0129】
最初に、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．０）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＭｇＣｌ２、３ｍＭのＡＴＰ、６０μＭのＨｉｓ－ユビキチン、１μＭのＧＳＴ－Ｕｂｅ１（Boston Biochem）、及び４０μＭのＵｂｅ２Ｎ中でＵｂｅ２Ｎのチャージングを実施した。反応物を３７℃で１２分間インキュベートし、その後使用するまで４℃で貯蔵した（１時間以内）。
【0130】
ミカエリス－メンテン速度論分析の場合は、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ中で、示された量のＵｂ１－７４（０μＭ～４００μＭ）を用いて反応を行ったのに対して、ｐＫａの決定の場合は、５０ｍＭのＴｒｉｓ及び示されたｐＨ（７．０～１０．５）、５０ｍＭのＮａＣｌ、及び２５０ｍＭのＵｂ１－７４中で行った。バッファーとは別に、反応混合物には２．５μＭのＵｂｅ２Ｖ２が含まれていた。２０分の１に希釈して反応物中２μＭのＵｂｅ２Ｎにしたチャージング混合物の添加によって反応を開始した。４×ＬＤＳローディングバッファーを添加することにより反応を停止させた。試料を９０℃で２分間煮沸し、ＬＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ＬｉＣｏｒシステムを介して抗Ｈｉｓ抗体（Clontech、６３１２１２、１：５０００）を用いてウェスタンブロットを実施したところ、以下の種の検出につながった：Ｈｉｓ－Ｕｂ、Ｈｉｓ－Ｕｂ－Ｕｂ１－７４、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｈｉｓ－Ｕｂ、Ｕｂｅ２Ｎ～（Ｈｉｓ－Ｕｂ）２（Ｕｂｅ２Ｎ～Ｈｉｓ－Ｕｂと同様のユビキチン化速度を示すチャージング反応の副産物）、及びＥ１－Ｈｉｓ－Ｕｂ。Ｈｉｓ－Ｕｂ－Ｕｂ１－７４の濃度を、Ｈｉｓ－Ｕｂ－Ｕｂ１－７４の値を検出された全てのバンドの合計で割り、これに反応物中のＨｉｓ－Ｕｂの総濃度（３μＭ）を掛けることによって求めた。実験を技術的三連で行った。ミカエリス－メンテン速度論データを、等式（１）：
Ｖ＝（Ｅｔ×ｋｃａｔ×Ｓ）／（ＫＭ×Ｓ） （１）
（式中、Ｖは測定された速度であり、Ｅｔは活性部位の総濃度（２μＭ）であり、Ｓは基質濃度である）にフィッティングした。曲線をフィッティングしてｋｃａｔ及びＫＭを決定した。ｐＫａを決定するのに、データを、６５に示される等式（２）：
Ｖ＝（ＶＨＡ×１０－ｐＨ＋ＶＡ－×１０－ｐＫａ）／（１０－ｐＫａ＋１０－ｐＨ） （２）
（式中、Ｖは測定された速度であり、ＶＡ－は塩基性種の速度であり、ＶＨＡは酸性種の速度である）にフィッティングした。
Ｖ＝（Ｅｔ×ｋｃａｔ×Ｓ）／（ＫＭ×Ｓ） （１）
（式中、Ｖは測定された速度であり、Ｅｔは活性部位の総濃度（２μＭ）であり、Ｓは基質濃度である）にフィッティングした。曲線をフィッティングしてｋｃａｔ及びＫＭを決定した。ｐＫａを決定するのに、データを、６５に示される等式（２）：
Ｖ＝（ＶＨＡ×１０－ｐＨ＋ＶＡ－×１０－ｐＫａ）／（１０－ｐＫａ＋１０－ｐＨ） （２）
（式中、Ｖは測定された速度であり、ＶＡ－は塩基性種の速度であり、ＶＨＡは酸性種の速度である）にフィッティングした。
【0131】
結果
触媒作用の前の系の２．２Åの分解能の表示を捕らえたため、ユビキチン転移の詳細な分析を行うことができた。ＲＩＮＧにより促進されたＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂ閉構造において、Ｕｂｅ２Ｎにチャージされたユビキチンが見出され得るため、ドナーユビキチンを表す（図１）。対称性関連複合体のＲＩＮＧに結合したユビキチンはＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２によって捕捉され、その求核性Ｋ６３のＮζＨ３基はドナーユビキチンＣ末端の求電子性カルボニルから４．８Åに配置される（図２ａ）。興味深いことに、このアクセプターユビキチンのＫ６３はＵｂｅ２ＮのＤ１１９との直接的な相互作用を示す（図２ａ）。これは、Ｄ１１９がアクセプターユビキチン上のＫ６３を脱プロトン化することにより、これが求核攻撃されるよう活性化されることを示唆している。実際、Ｕｂｅ２Ｄにおける対応する残基（Ｄ１１７）は、入り込むアクセプターリジンの配置及び／又は活性化に関与していることが示唆されている（Plechanovova, A., Jaffray, E. G., Tatham, M. H., Naismith, J. H. & Hay, R. T.著の「触媒作用が起こる寸前のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ及びユビキチンが負荷されたＥ２の構造（Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis.）」 Nature 489, 115-120, (2012)）。
触媒作用の前の系の２．２Åの分解能の表示を捕らえたため、ユビキチン転移の詳細な分析を行うことができた。ＲＩＮＧにより促進されたＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂ閉構造において、Ｕｂｅ２Ｎにチャージされたユビキチンが見出され得るため、ドナーユビキチンを表す（図１）。対称性関連複合体のＲＩＮＧに結合したユビキチンはＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２によって捕捉され、その求核性Ｋ６３のＮζＨ３基はドナーユビキチンＣ末端の求電子性カルボニルから４．８Åに配置される（図２ａ）。興味深いことに、このアクセプターユビキチンのＫ６３はＵｂｅ２ＮのＤ１１９との直接的な相互作用を示す（図２ａ）。これは、Ｄ１１９がアクセプターユビキチン上のＫ６３を脱プロトン化することにより、これが求核攻撃されるよう活性化されることを示唆している。実際、Ｕｂｅ２Ｄにおける対応する残基（Ｄ１１７）は、入り込むアクセプターリジンの配置及び／又は活性化に関与していることが示唆されている（Plechanovova, A., Jaffray, E. G., Tatham, M. H., Naismith, J. H. & Hay, R. T.著の「触媒作用が起こる寸前のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ及びユビキチンが負荷されたＥ２の構造（Structure of a RING E3 ligase and ubiquitin-loaded E2 primed for catalysis.）」 Nature 489, 115-120, (2012)）。
【0132】
ユビキチン化の化学的機構（図２ｂ）を調査するのに、ジユビキチン形成の速度論を測定した。この反応の酸係数（ｐＫａ）は、その求核剤Ｋ６３のプロトン化状態のみに依存するはずである。様々なｐＨで行われた反応のユビキチン化速度を、１つの滴定可能な基を仮定した等式に当てはめると、Ｕｂｅ２Ｎの場合に８．３のｐＫａが明らかになり（図２ｃ）、これはＳＵＭＯ－Ｅ２ Ｕｂｅ２Ｉの場合に観察されたものに匹敵する（Yunus, A. A. & Lima, C. D.著の「ＳＵＭＯ経路におけるリジン活性化及びＥ２媒介性コンジュゲーションの機能解析（Lysine activation and functional analysis of E2-mediated conjugation in the SUMO pathway.）」 Nat Struct Mol Biol 13, 491-499, (2006)）。これは、遊離リジンζ－アミノ基の場合の１０．５のｐＫａよりも大幅に低く（Lide, D. R.著の「ＣＲＣの化学及び物理ハンドブック：化学データ及び物理データのすぐに参照することができる参考書（CRC handbook of chemistry and physics: a ready-reference book of chemical and phyical data.）」 Vol. 72 (CRC Press, 1991)）、これにより、約７．３４の生理学的ｐＨでの触媒作用とは不適合であることとなる（Llopis, J., McCaffery, J. M., Miyawaki, A., Farquhar, M. G. & Tsien, R. Y.著の「緑色蛍光タンパク質を用いた単一の生細胞におけるサイトゾル、ミトコンドリア、及びゴルジのｐＨの測定（Measurement of cytosolic, mitochondrial, and Golgi pH in single living cells with green fluorescent proteins.）」 Proc Natl Acad Sci U S A 95, 6803-6808 (1998)）。Ｄ１１９をアラニン又はアスパラギンのいずれかに突然変異させた。それというのも、どちらも塩基として機能し得ないからであるが、アスパラギンは依然としてＫ６３に結合し配向することができた。どちらの突然変異体もｐＫａを約９まで増加させた（図２ｃ）。生理学的ｐＨでは、Ｕｂｅ２ＮＤ１１９Ａ／ＮはＫＭを控え目にそれぞれ約４倍及び約７倍増加させた（図２ｄ）。アラニンへの突然変異はｋｃａｔを１００分の１に減少させ、アスパラギンへの突然変異はこれを３０分の１に減少させたことから（図２ｅ）、基質ターンオーバーがリジン求核剤の配向にも依存することが示唆される。けれども、この触媒速度は、生理学的ｐＨ下では効率的なユビキチン鎖形成をもたらさない（データは示していない）。これらの観察を総合すると、Ｄ１１９が、入り込むアクセプターリジンを脱プロトン化して触媒作用を可能にする塩基であることが立証される。
【0133】
ユビキチンと他のタンパク質との間の相互作用は、ループイン構造又はループアウト構造のいずれかで見られるユビキチンのβ１－β２ループの特定の構造に依存することが明らかになっている（Hospenthal, M. K., Freund, S. M. & Komander, D. 著の「非定型ユビキチン鎖の集合、分析、及び構成（Assembly, analysis and architecture of atypical ubiquitin chains.）」 Nat Struct Mol Biol 20, 555-565, (2013)）。これらの動きによりユビキチンのコア構造が変化し、その後の構造選択により、ユビキチンは多くの様々な結合相手と相互作用することが可能となる（Lange, O. F. et al.著の「溶液中のＲＤＣ由来ユビキチンアンサンブルから明らかになったマイクロ秒までの認識ダイナミクス（Recognition dynamics up to microseconds revealed from an RDC-derived ubiquitin ensemble in solution.）」 Science 320, 1471-1475, (2008)）。本発明者らの構造において、ドナーユビキチンβ１－β２ループがそのループイン配置であり、ループアウトが閉構造の形成と不適合であることが判明した（データは示していない）。反対に、アクセプターユビキチンはループアウト配置になっており（データは示していない）、これがユビキチンにおけるデフォルト状態であると考えられる（Hospenthal et al. 2013）。ドナーユビキチン及びアクセプターユビキチンはまた異なるＢ因子プロファイルを有し（データは示していない）、これは、恐らく触媒作用におけるそれらの異なる役割の幾つかの他の側面を反映している。興味深いことに、β１－β２ループ構造は、カリン－ＲＩＮＧ－リガーゼ（ＣＲＬ）を活性化する際にＮｅｄｄ８等のユビキチン様タンパク質においても重要であると考えられる（Baek, K. et al.著の「ＮＥＤＤ８は、多価のカリン－ＲＩＮＧ－ＵＢＥ２Ｄユビキチンライゲーション集合体の核をなす（NEDD8 nucleates a multivalent cullin-RING-UBE2D ubiquitin ligation assembly.）」 Nature 578, 461-466, (2020)）。
【0134】
ＲＩＮＧ Ｅ３は、通常は非常に動的であるＥ２～Ｕｂ種を閉構造にロックすることによって機能し、それにより触媒作用の準備が整えられる（図２ａ）。本発明者らの以前に決定したＴＲＩＭ２１ Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ構造（Kiss, L. et al.著の「トリイオン性アンカー機構は、ＴＲＩＭリガーゼにおけるＵｂｅ２Ｎ特異的な動員及びＫ６３鎖のユビキチン化を駆動する（A tri-ionic anchor mechanism drives Ube2N-specific recruitment and K63-chain ubiquitination in TRIM ligases.）」 Nat Commun 10, 4502, (2019)）と比較して、ドナーユビキチンＣ末端と、Ｕｂｅ２Ｎ活性部位との間に殆ど違いは示されない（データは示していない）。それにもかかわらず、Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ閉構造の形成だけでは触媒作用にとって不十分であるのは、これにはアクセプターユビキチンに結合し配向するＵｂｅ２Ｖ２の存在も必要とされるからである。２．５Åの分解能で解析したＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２複合体を分析することによって（データは示していない）、Ｕｂｅ２Ｖ２がアクセプターユビキチンをどのように配置するかについて更なる洞察を得た。結晶対称性を起こすことによって、この構造は、Ｋ６３がＵｂｅ２Ｎの活性部位に向けられるようなＵｂｅ２Ｖ２によるアクセプターユビキチンの配向（データは示していない）、すなわち、様々な結晶格子において解析された酵母Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２の構造と同等の配向を示す（Eddins, M. J., Carlile, C. M., Gomez, K. M., Pickart, C. M. & Wolberger, C.著の「ユビキチンに共有結合したＭｍｓ２－Ｕｂｃ１３は、連結特異的なポリユビキチン鎖形成の構造基盤を明らかにする（Mms2-Ubc13 covalently bound to ubiquitin reveals the structural basis of linkage-specific polyubiquitin chain formation.）」 Nat Struct Mol Biol 13, 915-920, (2006)）。ＲＩＮＧが存在しないと、ドナーユビキチンは閉構造をとらないため、本発明者らのＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造は不活性な複合体を表す。本発明者らのＵｂ－Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造との整列（データは示していない）により、Ｕｂｅ２Ｎ及びＵｂｅ２Ｖ２は互いにより密集することから、アクセプターユビキチンとＵｂｅ２Ｎとの間に追加の接触が生じ（図２ａ）、それにより求核剤Ｋ６３が活性部位に対してはるかに近く（７．５Åに対して４．８Å）に配置されることが明らかとなる。これが達成されるのは、Ｕｂｅ２ＮのＮ１２３及びＤ１２４が、それぞれユビキチンＫ６３のアミド並びにＳ５７及びＱ６２の側鎖を介してユビキチンと接触するためである（図２ａ）。突然変異体Ｕｂｅ２ＮＮ１２３Ａ及びＵｂｅ２ＮＤ１２４Ａについてのｋｃａｔにおける約３分の１への減少（図２ｅ）は、これらの残基の機能が求核剤の配向に役立つことによってユビキチン化反応を微調整することであると示唆している。まとめると、ユビキチン鎖形成の過程で捕らえられた本発明者らの構造の特徴は、Ｕｂｅ２Ｎを活性化してユビキチンを放出させると同時に、Ｕｂｅ２Ｖ２がアクセプターユビキチンを正確に配向させることによって、ＲＩＮＧ Ｅ３がどのように触媒作用を促進するかについての機構的な洞察をもたらす。
【0135】
実施例３：ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン化の機構
材料及び方法
ユビキチン鎖形成アッセイ：ユビキチン鎖形成アッセイを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍＭのＤＴＴ中で実施した。反応成分は、２ｍＭのＡＴＰ、０．２５μＭのＵｂｅ１、８０μＭのユビキチン、０．５μＭのＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２、又はＵｂｅ２Ｄ１とともに、示された濃度のＥ３であった。示された時点で試料を採取し、ＬＤＳサンプルバッファーを４℃で添加することによって反応を停止させた。試料を９０℃で２分間煮沸し、ＬＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ウェスタンブロットにおいて、ユビキチン鎖を抗Ｕｂ－ＨＲＰ（Santa Cruz、ｓｃ８０１７－ＨＲＰ Ｐ４Ｄ１、１：５０００）を使用して検出し、ＴＲＩＭ２１をウサギ抗ＴＲＩＭ２１ＰＲＹＳＰＲＹＤ１０１Ｄ（ST番号９２０４）（１：１０００）によって検出し、Ｆｃをヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃブロード（broad）５２１１－８００４（１：２０００）によって検出した。
材料及び方法
ユビキチン鎖形成アッセイ：ユビキチン鎖形成アッセイを、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２、及び０．５ｍＭのＤＴＴ中で実施した。反応成分は、２ｍＭのＡＴＰ、０．２５μＭのＵｂｅ１、８０μＭのユビキチン、０．５μＭのＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２、又はＵｂｅ２Ｄ１とともに、示された濃度のＥ３であった。示された時点で試料を採取し、ＬＤＳサンプルバッファーを４℃で添加することによって反応を停止させた。試料を９０℃で２分間煮沸し、ＬＤＳ－ＰＡＧＥによって分離した。ウェスタンブロットにおいて、ユビキチン鎖を抗Ｕｂ－ＨＲＰ（Santa Cruz、ｓｃ８０１７－ＨＲＰ Ｐ４Ｄ１、１：５０００）を使用して検出し、ＴＲＩＭ２１をウサギ抗ＴＲＩＭ２１ＰＲＹＳＰＲＹＤ１０１Ｄ（ST番号９２０４）（１：１０００）によって検出し、Ｆｃをヤギ抗ヒトＩｇＧ－Ｆｃブロード（broad）５２１１－８００４（１：２０００）によって検出した。
【0136】
結果
次に、ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖がどのように形成されるかを理解しようと試みた。本発明者らの結晶構造において、１つのＲＩＮＧ二量体は、モノユビキチン化された別のＲＩＮＧの伸長をトランスに媒介するように配置されている（図１ｂ、図１ｃ、図３ａ）。重要なことに、本発明者らの結晶構造においてはＲＩＮＧ自体との接触は観察され得なかったため、この機構は、ＲＩＮＧアンカー型アクセプターユビキチンのＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２への結合のみに依存している。したがって、異なるＲＩＮＧドメイン（酵素及び基質）の相対的なトポロジーは殆どが触媒界面によって規定されることから、酵素のＲＩＮＧと基質のＲＩＮＧと間には約９ｎｍの離隔がもたらされる（図３ａ）。この配置を触媒的ＲＩＮＧトポロジーと呼称し、ここで、１つのＲＩＮＧ二量体は酵素として機能し、かつ少なくとも１つの更なるＲＩＮＧはユビキチン化についての基質として機能する。アクセプターユビキチンとＲＩＮＧとの間（約３ｎｍ離れている）のリンカー、及びＴＲＩＭリガーゼにおけるＲＩＮＧと隣の（Ｂ－ボックス）ドメインとの間（約３．５ｎｍ離れている）のリンカーは追加の柔軟性を与える可能性が高いため、このトポロジーは硬直ではない（図３ａ、図３ｂ）。本発明者らの構造において、プライミングユビキチンはＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２結合表面に到達することができないため、ＴＲＩＭ２１アンカー型鎖伸長の開始はシスでは起こり得ないことが明らかである（図３ａ）。これと一致して、本発明者らは、ＴＲＩＭ５に関する以前の研究（Fletcher, A. J. et al.著の「レトロウイルスカプシド上の三価のＲＩＮＧ集合体はＴＲＩＭ５のユビキチン化及び自然免疫シグナル伝達を活性化する（Trivalent RING Assembly on Retroviral Capsids Activates TRIM5 Ubiquitination and Innate Immune Signaling.）」 Cell Host Microbe 24, 761-775 e766, (2018)）に沿って、トランスでのＴＲＩＭ２１のユビキチン転移が原理的に起こり得ることを見出した（データは示していない）。
次に、ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖がどのように形成されるかを理解しようと試みた。本発明者らの結晶構造において、１つのＲＩＮＧ二量体は、モノユビキチン化された別のＲＩＮＧの伸長をトランスに媒介するように配置されている（図１ｂ、図１ｃ、図３ａ）。重要なことに、本発明者らの結晶構造においてはＲＩＮＧ自体との接触は観察され得なかったため、この機構は、ＲＩＮＧアンカー型アクセプターユビキチンのＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２への結合のみに依存している。したがって、異なるＲＩＮＧドメイン（酵素及び基質）の相対的なトポロジーは殆どが触媒界面によって規定されることから、酵素のＲＩＮＧと基質のＲＩＮＧと間には約９ｎｍの離隔がもたらされる（図３ａ）。この配置を触媒的ＲＩＮＧトポロジーと呼称し、ここで、１つのＲＩＮＧ二量体は酵素として機能し、かつ少なくとも１つの更なるＲＩＮＧはユビキチン化についての基質として機能する。アクセプターユビキチンとＲＩＮＧとの間（約３ｎｍ離れている）のリンカー、及びＴＲＩＭリガーゼにおけるＲＩＮＧと隣の（Ｂ－ボックス）ドメインとの間（約３．５ｎｍ離れている）のリンカーは追加の柔軟性を与える可能性が高いため、このトポロジーは硬直ではない（図３ａ、図３ｂ）。本発明者らの構造において、プライミングユビキチンはＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２結合表面に到達することができないため、ＴＲＩＭ２１アンカー型鎖伸長の開始はシスでは起こり得ないことが明らかである（図３ａ）。これと一致して、本発明者らは、ＴＲＩＭ５に関する以前の研究（Fletcher, A. J. et al.著の「レトロウイルスカプシド上の三価のＲＩＮＧ集合体はＴＲＩＭ５のユビキチン化及び自然免疫シグナル伝達を活性化する（Trivalent RING Assembly on Retroviral Capsids Activates TRIM5 Ubiquitination and Innate Immune Signaling.）」 Cell Host Microbe 24, 761-775 e766, (2018)）に沿って、トランスでのＴＲＩＭ２１のユビキチン転移が原理的に起こり得ることを見出した（データは示していない）。
【0137】
自己アンカー型ユビキチン化についてのＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインの空間要件を実験的に調査するのに、基質依存性ユビキチン化アッセイを確立した。ＴＲＩＭ２１は、溶液中の偏性二量体であるＦｃによって動員され、２つのＰＲＹＳＰＲＹ（ＰＳ）ドメインによって結合され得る（図７）。触媒的ＲＩＮＧトポロジーを試験するのに、利用可能なＲＩＮＧの数及びＦｃに結合したときのそれらの互いの距離が異なる一連のモノユビキチン化ＴＲＩＭ２１コンストラクトを設計した（図３ｂ、図７）。バックグラウンド活性を抑制するのに、ＴＲＩＭ２１を低濃度（１００ｎＭ又は５０ｎＭ）で使用し、反応物を５分間しかインキュベートしなかった。全長のＴＲＩＭタンパク質は、それらのコイルドコイルドメインを介して逆平行ホモ二量体を形成することから、Ｆｃに結合された場合でも２つのＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインの約１７ｎｍの離隔がもたらされる（図７）。したがって、本発明者らのモデルによれば、Ｆｃ単独の添加は触媒的ＲＩＮＧトポロジーを誘導しないはずである（図３ｃ）。実際、Ｆｃの添加は、全長のＵｂ－ＴＲＩＭ２１（Ｕｂ－ＲＩＮＧ－ボックス－コイルドコイル－ＰＲＹＳＰＲＹ、すなわちＵｂ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ、図３ｄ）のユビキチン化を刺激しなかった。追加のＲＩＮＧドメインを付加して、全長のタンパク質を構成的ＲＩＮＧ二量体（Ｕｂ－Ｒ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ）にしたとしても、触媒的ＲＩＮＧトポロジーの形成は排除され（図３ｃ）、Ｆｃの添加時に自己ユビキチン化の誘導は観察されない（図３ｄ、図７）。次の工程として、Ｂ－ボックス及びコイルドコイルを欠いたＴＲＩＭ２１コンストラクト（Ｕｂ－Ｒ－ＰＳ及びＵｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＳ）を設計した。Ｆｃは、２つのこれらのコンストラクトを動員することができ、それにより、触媒的ＲＩＮＧトポロジーに必要とされる距離である約９ｎｍ以内（図３ｃ、図７）にそれらのＲＩＮＧが位置する（図３ａ、図３ｃ）。ＦｃをＵｂ－Ｒ－ＰＳに添加すると、弱い自己ユビキチン化がもたらされた。この低レベルの活性は、Ｕｂ－Ｒ－ＰＳが単量体ＲＩＮＧを酵素として提供することができるにすぎないのに対し、第２のＵｂ－Ｒ－ＰＳ上の単量体ＲＩＮＧが基質として機能するためである可能性が高い。ＴＲＩＭ ＲＩＮＧ二量体化がリガーゼ活性を大幅に増加させることは既知である。したがって、Ｕｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＳコンストラクトを使用してこれらの実験を繰り返した。これにより、Ｆｃが２つのＲＩＮＧ二量体を近接させることになるため、本発明者らの結晶構造において観察される触媒的ＲＩＮＧトポロジーが基質結合時に形成し得るはずであることが予測された（図３ａ、図３ｃ）。実際、ＦｃをＵｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＳに添加すると、ＴＲＩＭ２１アンカー型ユビキチン鎖の効率的な形成がもたらされた（図３ｄ）。重要なことに、アンカー型ユビキチン化が非常に効率的に起こったのに対し、遊離ユビキチン鎖は殆ど観察され得なかった（データは示していない）。自己ユビキチン化はリガーゼによって動員されるＥ２～Ｕｂしか必要としないため、これにより、遊離ユビキチン鎖形成に対するその高い効率が説明される。それというのも、後者はＥ２～Ｕｂ及び（ポリ）ユビキチンの両方の動員を必要とすることとなるからである。実際、Ｕｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＳは、低下したＴＲＩＭ２１濃度でも、本発明者らの基質誘導性ユビキチン化アッセイ（substrate-induced ubiquitination assay）において効率的に働いた（データは示していない）。したがって、基質結合によって触媒的ＲＩＮＧトポロジーの形成を誘導すると、自己アンカー型ユビキチン鎖の堅牢かつ選択的な形成が可能となる。さらに、触媒的ＲＩＮＧトポロジーは、活性酵素（二量体ＲＩＮＧ）及び正しく配置された基質（第３のＲＩＮＧ）の個別の要件が満たされた場合にのみ達成される。
【0138】
次に、シスユビキチン化が立体的に可能になるには、ＴＲＩＭ２１アンカー型ユビキチン鎖がどれ程の長さである必要があるかを検討した。本発明者らのＵｂ－Ｒ：Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ：Ｕｂｅ２Ｖ２構造を使用して、ＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインにコンジュゲートされたＫ６３連結型ユビキチン鎖の数を増加させたモデルを作成した。これらのモデルでは、シスでの自己ユビキチン化には４つのユビキチン分子の鎖が必要かつ十分であることが示唆された（図４ａ）。したがって、プライミングユビキチンの付加後に、鎖が更にシスで伸長され得る前に、３つのユビキチン分子をトランスで付加しなければならない。これと一致して、本発明者らのＦｃ依存性ＴＲＩＭ２１ユビキチン化実験においては、非常に長いＴＲＩＭ２１アンカー型ユビキチン鎖又は１つ、２つ、若しくは３つのユビキチン分子を有する種のみが観察された（図３ｄ）。４つ目のユビキチンが付加されると、トランスからシスへの切り替えが予想されるため、反応ははるかに速く進行することから、テトラユビキチン種が急速に消費されて、これが長鎖に変換されると考えられる。上記の実験において、２つのＵｂ－Ｒ－Ｒ－ＰＳコンストラクトがそれらのＦｃへの結合によって共局在して、触媒的ＲＩＮＧトポロジーの要件を満たした場合にのみ自己ユビキチン化が起こった（図３ｃ、図３ｄ）。トランスからシスへの自己ユビキチン化の切り替えを実験的に確認するのに、Ｎ末端が最大４つの線状に接続されたユビキチン分子に融合されたＴＲＩＭ２１ Ｒ－Ｒ－ＰＳコンストラクトを作製した。それらの高い構造類似性のため、線状の鎖は長さ及び柔軟性においてＫ６３連結型ユビキチン鎖を十分に模倣するものと推定された。これらの新しいコンストラクトを試験したところ、テトラユビキチンで修飾されたＴＲＩＭ２１のみが自己ユビキチン化に関してＦｃとは無関係であることが観察された（図４ｂ）。全ての他のより短いコンストラクトは、最初にトランスで自己ユビキチン化した後にシスに切り替わる必要があることによって、速度制限されたままであった。この生化学的データは、トランスでのＲＩＮＧアンカー型ユビキチン化の開始を示す本発明者らの構造、及びポリユビキチン化されたＲＩＮＧのシスでの伸長の本発明者らのモデルと一致する。
【0139】
最後に、触媒的ＲＩＮＧトポロジーが、Ｕｂｅ２Ｎに特有の配置であるのか、それとも他のＥ２酵素とも働く配置であるのかを検討した。したがって、Ｆｃの添加が、非常に柔軟な性質のＥ２酵素であるＵｂｅ２Ｄ１の存在下でＵｂ－ＴＲＩＭ２１の自己ユビキチン化を誘導し得るかどうかを試験した。しかしながら、反応時間を延長した後でも、ＴＲＩＭ２１修飾は殆ど検出されなかったのに対し、遊離ユビキチン鎖が観察され得た（図８）。したがって、本発明者らの構造において観察される触媒的ＲＩＮＧトポロジーはＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２に特有であり、ＴＲＩＭ２１の細胞機能にＵｂｅ２Ｄ１ではなくこの酵素が必要とされる理由が説明される。さらに、これにより、ＴＲＩＭ２１、及びＴＲＩＭ５等の他のＴＲＩＭが、最初に活性化されたときにＫ４８ではなくＫ６３に連結されたユビキチン鎖を構築する理由が説明され得る。それらの活性化機構、すなわち触媒的ＲＩＮＧトポロジーの誘導のみがＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２を使用することによって自己アンカー型Ｋ６３鎖の形成をもたらす。まとめると、これらのデータにより、Ｕｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２によるＴＲＩＭ２１の自己ユビキチン化の背後にある駆動力として、触媒的トランスＲＩＮＧトポロジーの形成が特定される。
【0140】
実施例４：触媒的ＲＩＮＧトポロジーは狙い通りのタンパク質分解を駆動する
材料及び方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及びＲＮＡ精製：ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、コンストラクトをｐＧＥＭＨＥベクターにクローニングした（Liman, E. R., Tytgat, J. & Hess, P.著の「多量体ｃＤＮＡの構築によって決定される哺乳類Ｋ＋チャネルのサブユニット化学量論（Subunit stoichiometry of a mammalian K+ channel determined by construction of multimeric cDNAs.）」 Neuron 9, 861-871, (1992)）。ＡｓｃＩを使用してプラスミドを線状化した。キャップ化（しかし、ポリＡテール化ではない）ｍＲＮＡを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（New England Biolabs）を製造業者の使用説明書に従って使用してＴ７ポリメラーゼを用いて合成した。精製タンパク質／発現ｍＲＮＡの配列を配列番号６～配列番号３８に示す。
材料及び方法
ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写及びＲＮＡ精製：ｍＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写のために、コンストラクトをｐＧＥＭＨＥベクターにクローニングした（Liman, E. R., Tytgat, J. & Hess, P.著の「多量体ｃＤＮＡの構築によって決定される哺乳類Ｋ＋チャネルのサブユニット化学量論（Subunit stoichiometry of a mammalian K+ channel determined by construction of multimeric cDNAs.）」 Neuron 9, 861-871, (1992)）。ＡｓｃＩを使用してプラスミドを線状化した。キャップ化（しかし、ポリＡテール化ではない）ｍＲＮＡを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ（商標）Ｔ７ ＡＲＣＡ ｍＲＮＡキット（New England Biolabs）を製造業者の使用説明書に従って使用してＴ７ポリメラーゼを用いて合成した。精製タンパク質／発現ｍＲＮＡの配列を配列番号６～配列番号３８に示す。
【0141】
細胞系統：ＮＩＨ３Ｔ３－カベオリン－１－ＥＧＦＰ（Shvets, E., Bitsikas, V., Howard, G., Hansen, C. G. & Nichols, B. J.著の「動的カベオラはバルク膜タンパク質を排除し、過剰なスフィンゴ糖脂質の選別に必要とされる（Dynamic caveolae exclude bulk membrane proteins and are required for sorting of excess glycosphingolipids.）」 Nat Commun 6, 6867, (2015)）を、１０％の仔ウシ血清及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ培地（Gibco；３１９６６０２１）中で培養した。ＲＰＥ－１細胞（ATCC）を、１０％の仔ウシ血清及びペニシリン－ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地（Gibco；１０５６５０１８）中で培養した。
【0142】
全ての細胞を５％のＣＯ２加湿雰囲気において３７℃で成長させ、マイコプラズマが存在しないことを定期的に確認した。ＮＩＨ３Ｔ３細胞の性別は雄性である。ＲＰＥ－１細胞の性別は雌性である。エレクトロポレーション後に、抗生物質を含まない１０％の仔ウシ血清を補充した培地中で細胞を成長させた。ＩｎｃｕＣｙｔｅ（Sartorius）によるライブイメージングの場合は、細胞培養培地を１０％の仔ウシ血清及びＧｌｕｔａＭＡＸ（Gibco；３５０５００６１）を補充したＦｌｕｏｒｏｂｒｉｔｅ（Gibco；Ａ１８９６７０１）に置き換えた。
【0143】
ＲＰＥ－１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞を、Integrated DNA technologies（IDT）製のＡｌｔ－Ｒ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して、カスタム設計のｃｒＲＮＡ配列（ＡＴＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＣＣＡＣＧＡＡ）（配列番号３９）を用いて作製した。ｃｒＲＮＡ－ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の形態のガイドＲＮＡを、組換えＣａｓ９タンパク質（IDT番号１０８１０６０）と集合させ、Ａｌｔ－Ｒ Ｃａｓ９エレクトロポレーションエンハンサー（IDT番号１０７５９１５）と一緒にＲＰＥ－１細胞内にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの２日後に、細胞を９６ウェルプレートに１ウェル当たり１個の細胞でプレーティングし、単一細胞クローンをウェスタンブロッティングによってＴＲＩＭ２１タンパク質についてスクリーニングした。検出可能なＴＲＩＭ２１タンパク質を含まず、かつＴｒｉｍ－ＡｗａｙアッセイにおいてＴＲＩＭ２１ノックアウト表現型が確認された単一クローンを選択した。
【0144】
プロテアソーム阻害実験の場合、ＭＧ１３２（Sigma；Ｃ２２１１）を２５μＭの最終濃度で使用した。
【0145】
ｍＲＮＡからの一過的なタンパク質発現：タンパク質発現レベルの正確な制御を可能にするのに、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写されたｍＲＮＡからコンストラクトを発現させた。Ｎｅｏｎトランスフェクションシステム（Neon Transfection system）（Invitrogen）を使用したエレクトロポレーションによってｍＲＮＡを細胞内に送達した。各エレクトロポレーション反応では、１０．５μｌの再懸濁バッファーＲ中に懸濁した８×１０５個のＲＰＥ－１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞又はＮＩＨ３Ｔ３－カベオリン１－ＥＧＦＰ細胞を、２μＬの水中の示されたｍＲＮＡと混合した。エレクトロポレーション後に、細胞を抗生物質不含のＤＭＥＭ培地又は１０％のＦＢＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ－１２培地へと移し、５時間インキュベートし続けた後に細胞を採取した。典型的には、エレクトロポレーションの３０分後から発現を検出することができ、これは約２４時間持続した。
【0146】
Ｔｒｉｍ－Ａｗａｙ：各エレクトロポレーション反応では、１０．５μｌの再懸濁バッファーＲ中に懸濁した８×１０５個のＮＩＨ ３Ｔ３ Ｃａｖ１ノックイン細胞を、２μｌのＰＢＳ中で希釈した示された量の抗体混合物と混合した。エレクトロポレーションの直前にｍＲＮＡを添加して、潜在的なＲＮアーゼ活性による分解を制限した。Ｖｈｈ－Ｆｃ（ＷＴ又はＰＲＹＳＰＲＹ結合欠損Ｈ４３３Ａ突然変異体）及びＴＲＩＭ２１をコードするＣａｖ１－ＧＦＰ ｍＲＮＡをエレクトロポレーションした。細胞ｍＲＮＡ混合物を１０μｌのＮｅｏｎエレクトロポレーションピペットチップ（Neon electroporation pipette tips）（Invitrogen）に取り込み、以下の設定を使用してエレクトロポレーションした：１４００Ｖ、２０ｍｓ、２パルス（Clift, D. et al.著の「内因性タンパク質の鋭敏かつ急速な分解方法（A Method for the Acute and Rapid Degradation of Endogenous Proteins.）」 Cell 171, 1692-1706 e1618, (2017)（非特許文献２）及びClift, D., So, C., McEwan, W. A., James, L. C. & Schuh, M.著の「Ｔｒｉｍ－Ａｗａｙによる内因性タンパク質の鋭敏かつ急速な分解（Acute and rapid degradation of endogenous proteins by Trim-Away.）」 Nat Protoc 13, 2149-2175, (2018)に記載されている通り）。エレクトロポレーションされた細胞を１０％のＦＢＳを補充した抗生物質不含のＦｌｕｏｒｏｂｒｉｇｈｔ培地に移し、インキュベーターにおいて５時間インキュベートした後に、細胞を採取して免疫ブロッティングを行った。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）（essenbioscience）を使用してＧＦＰ蛍光を測定し、コントロール（Ｖｈｈ－ＦｃＨ４３３Ａ）に対して正規化した。以下の抗体を使用してタンパク質検出を実施した：Ｆｃ：ヤギ抗ｈＩｇＧ Ｆｃブロード（broad）５２１１－８００４（１：２０００）、ＴＲＩＭ２１：ウサギ抗ＴＲＩＭ２１ Ｄ１０１Ｄ（ST番号９２０４）（１：１０００）、ビンキュリン：ウサギ抗ビンキュリンＥＰＲ８１８５ ａｂ２１７１７１（１：５００００）、カベオリン－１：ウサギ抗Ｃａｖ１（BD：６１００５９、１：１０００）。
【0147】
ｍＥＧＦＰ－Ｆｃ分解アッセイ：ｍＥＧＦＰ－Ｆｃ分解アッセイでは、上記のように、０．４μＭのｍＥＧＦＰ－ＦｃのｍＲＮＡを１．２μＭの示されたＴＲＩＭ２１のｍＲＮＡと一緒に８×１０５個の細胞にエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションされた細胞を１０％のＦＢＳを補充した抗生物質不含のＤＭＥＭに移した。ウェスタン分析のみの場合、細胞をインキュベーターにおいて５時間インキュベートした後に採取した。フローサイトメトリー分析では、細胞の半分を取り、２５μＭのＭＧ１３２で処理し、一方、残りの半分をＤＭＳＯで処理した。次いで、細胞をインキュベーターにおいて５時間インキュベートした後に採取した。細胞を固定した後にフローサイトメトリーにかけた。Ｔｒｉｍ－Ａｗａｙの場合と同じ抗体を使用した（上記参照）。
【0148】
フローサイトメトリー：細胞を固定した後にフローサイトメトリーを行った。このために、細胞をＦＡＣＳ固定液（ＰＢＳ中４％のホルムアルデヒド、２ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、室温で３０分間インキュベートした。その後、細胞を遠心分離し、ＦＡＣＳバッファー（ＰＳＢ中２％のＦＢＳ、５ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁し、使用するまでアルミホイルに包んで４℃で貯蔵した。フローサイトメトリーを、Ｅｃｌｉｐｓｅ（iCyt）Ａ０２－００５８を使用して実施した。前方散乱及び側方散乱を使用して細胞を測定して、生細胞を評価した。さらに、緑色蛍光を測定した。前方散乱及び側方散乱に基づいて生細胞を選択し、生細胞のＧＦＰ蛍光中央値のみを使用して更なる分析を行った。
【0149】
結果
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの自己アンカー型ユビキチン化に必要なＲＩＮＧトポロジーを確立したので、次に、これと同じ配置が細胞内のＴＲＩＭ２１活性に必要とされるかどうかを調査した。利用可能なＲＩＮＧの数、及びＦｃに結合した場合のそれらの互いの距離を制御する、上記と同様の細胞発現用の一連のＴＲＩＭ２１コンストラクトを設計した（図５ａ）。狙い通りのタンパク質分解実験において、これらのコンストラクトをＧＦＰタグ付きＦｃと一緒にＴＲＩＭ２１ノックアウトＲＰＥ－１細胞において発現させ、ＴＲＩＭ２１活性についての読み取り値としてＧＦＰ－Ｆｃ分解をモニタリングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｃと結合した場合にアンカー型の鎖を形成することができないことと一致して、全長のＴＲＩＭ２１は細胞内でＧＦＰ－Ｆｃを分解しなかった（図５ｂ、図５ｃ）。Ｎ末端に別のＲＩＮＧを付加することによって分解を回復することはできなかった。それというのも、この場合に、ＲＩＮＧは二量体であるがコイルドコイルによって依然として分離されており、その結果、「基質」のＲＩＮＧがユビキチン化に利用可能でないからであると思われる。したがって、ＲＩＮＧ二量体化は細胞のＴＲＩＭ２１活性にとって十分ではない。Ｒ－ＰＳコンストラクトにおいて、ＲＩＮＧは約９ｎｍ以内にあるため、本発明者らの構造によって規定される活性と適合可能な範囲内にある（図３ａ）。それにもかかわらず、分解を観察することができなかった（図５ｂ、図５ｃ）。それというのも、ＲＩＮＧが単一の二量体を形成し得るためであるか、又は一方の単量体ＲＩＮＧが酵素として機能し、かつ他方のＲＩＮＧが基質として機能する必要があるためであるかのいずれかである可能性が高い。これは、本発明者らの生化学的実験における同等のコンストラクトの非効率的な自己ユビキチン化と一致している（図３ｄ）。Ｒ－Ｒ－ＰＳのみが効率的なＧＦＰ－Ｆｃ分解を示した（図５ｂ、図５ｃ）。このコンストラクトがＦｃと結合すると、２つのＲＩＮＧ二量体が近接して形成し得るため、一方のＲＩＮＧ二量体が他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能であり、したがって、触媒的ＲＩＮＧトポロジーの要件が完全に満たされる。全てのコンストラクトは同等のレベルで発現し、古典的なＴｒｉｍ－Ａｗａｙの狙い通りのタンパク質分解アッセイにおいて活性であったことから（図５ｄ、図５ｅ）、唯一の違いはＲＩＮＧドメインの数及びＧＦＰ－Ｆｃコンストラクトと結合したときの相対距離であることが示唆される。これは、同様のコンストラクトが基質結合時に強力な自己ユビキチン化を示すという本発明者らの生化学的データとも一致する（図３ｄ）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｃ誘導性自己ユビキチン化アッセイにより、細胞活性についての良好な予測がもたらされる。したがって、ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖伸長の開始の本発明者らの結晶構造は、この過程が生理学的状況においてどのように機能し得るかを正確に視覚化している。
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの自己アンカー型ユビキチン化に必要なＲＩＮＧトポロジーを確立したので、次に、これと同じ配置が細胞内のＴＲＩＭ２１活性に必要とされるかどうかを調査した。利用可能なＲＩＮＧの数、及びＦｃに結合した場合のそれらの互いの距離を制御する、上記と同様の細胞発現用の一連のＴＲＩＭ２１コンストラクトを設計した（図５ａ）。狙い通りのタンパク質分解実験において、これらのコンストラクトをＧＦＰタグ付きＦｃと一緒にＴＲＩＭ２１ノックアウトＲＰＥ－１細胞において発現させ、ＴＲＩＭ２１活性についての読み取り値としてＧＦＰ－Ｆｃ分解をモニタリングした。ｉｎ ｖｉｔｒｏでＦｃと結合した場合にアンカー型の鎖を形成することができないことと一致して、全長のＴＲＩＭ２１は細胞内でＧＦＰ－Ｆｃを分解しなかった（図５ｂ、図５ｃ）。Ｎ末端に別のＲＩＮＧを付加することによって分解を回復することはできなかった。それというのも、この場合に、ＲＩＮＧは二量体であるがコイルドコイルによって依然として分離されており、その結果、「基質」のＲＩＮＧがユビキチン化に利用可能でないからであると思われる。したがって、ＲＩＮＧ二量体化は細胞のＴＲＩＭ２１活性にとって十分ではない。Ｒ－ＰＳコンストラクトにおいて、ＲＩＮＧは約９ｎｍ以内にあるため、本発明者らの構造によって規定される活性と適合可能な範囲内にある（図３ａ）。それにもかかわらず、分解を観察することができなかった（図５ｂ、図５ｃ）。それというのも、ＲＩＮＧが単一の二量体を形成し得るためであるか、又は一方の単量体ＲＩＮＧが酵素として機能し、かつ他方のＲＩＮＧが基質として機能する必要があるためであるかのいずれかである可能性が高い。これは、本発明者らの生化学的実験における同等のコンストラクトの非効率的な自己ユビキチン化と一致している（図３ｄ）。Ｒ－Ｒ－ＰＳのみが効率的なＧＦＰ－Ｆｃ分解を示した（図５ｂ、図５ｃ）。このコンストラクトがＦｃと結合すると、２つのＲＩＮＧ二量体が近接して形成し得るため、一方のＲＩＮＧ二量体が他方のＲＩＮＧ二量体のユビキチン化を媒介するのに利用可能であり、したがって、触媒的ＲＩＮＧトポロジーの要件が完全に満たされる。全てのコンストラクトは同等のレベルで発現し、古典的なＴｒｉｍ－Ａｗａｙの狙い通りのタンパク質分解アッセイにおいて活性であったことから（図５ｄ、図５ｅ）、唯一の違いはＲＩＮＧドメインの数及びＧＦＰ－Ｆｃコンストラクトと結合したときの相対距離であることが示唆される。これは、同様のコンストラクトが基質結合時に強力な自己ユビキチン化を示すという本発明者らの生化学的データとも一致する（図３ｄ）。したがって、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＦｃ誘導性自己ユビキチン化アッセイにより、細胞活性についての良好な予測がもたらされる。したがって、ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖伸長の開始の本発明者らの結晶構造は、この過程が生理学的状況においてどのように機能し得るかを正確に視覚化している。
【0150】
実施例５
本発明者らが説明する触媒的ＲＩＮＧトポロジーは、ＴＲＩＭタンパク質が高次集合を起こすことができ、本発明がＴＲＩＭ２１由来のＲＩＮＧドメインに適用可能であるだけでなく、他のポリペプチド由来のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼもまた、融合タンパク質に含めるのに適したＲＩＮＧドメインであることを示すデータと一致している。
本発明者らが説明する触媒的ＲＩＮＧトポロジーは、ＴＲＩＭタンパク質が高次集合を起こすことができ、本発明がＴＲＩＭ２１由来のＲＩＮＧドメインに適用可能であるだけでなく、他のポリペプチド由来のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼもまた、融合タンパク質に含めるのに適したＲＩＮＧドメインであることを示すデータと一致している。
【0151】
ＴＲＩＭ５αの場合には、タンパク質をＨＩＶカプシドとともにインキュベートしたときに、３つのＴＲＩＭ５α ＲＩＮＧが近接する（Ganser-Pornillos, B. K. et al.著の「抑制的ＴＲＩＭ５αタンパク質の六角形の集合体（Hexagonal assembly of a restricting TRIM5alpha protein.）」 Proc Natl Acad Sci USA 108, 534-539, (2011)、Wagner, J. M. et al.著の「Ｂ－ボックス２ドメイン媒介性のレトロウイルス抑制因子ＴＲＩＭ５αの高次集合の機構（Mechanism of B-box 2 domain-mediated higher-order assembly of the retroviral restriction factor TRIM5alpha.）」 Elife 5,.16309 (2016)、Li, Y. L. et al.著の「霊長類のＴＲＩＭ５タンパク質は、ＨＩＶ－１カプシド上に六角形の網目を形成する（Primate TRIM5 proteins form hexagonal nets on HIV-1 capsids.）」 Elife 5, 16269 (2016)）（図６ａ、図６ｂ）。この配置は、本発明者らが説明する触媒的ＲＩＮＧトポロジーを満たすこととなり、ＴＲＩＭ５αがレトロウイルスを抑制し、自己アンカー型Ｋ６３ユビキチン化を介して自然免疫応答を活性化する能力と一致すると考えられる（Stremlau, M. et al.著の「細胞質体成分のＴＲＩＭ５αは、旧世界ザルのＨＩＶ－１感染を抑制する（The cytoplasmic body component TRIM5alpha restricts HIV-1 infection in Old World monkeys.）」 Nature 427, 848-853, (2004)、Sayah, D. M., Sokolskaja, E., Berthoux, L. & Luban, J.著の「ＴＲＩＭ５へのシクロフィリンＡのレトロトランスポジションにより、ＨＩＶ－１に対するフクロウザルの耐性が説明される（Cyclophilin A retrotransposition into TRIM5 explains owl monkey resistance to HIV-1.）」 Nature 430, 569-573, (2004)、Fletcher, A. J. et al.著の「ＴＲＩＭ５αは、Ｌｙｓ６３連結型ユビキチン鎖をアンカーし、逆転写を抑制するのにＵｂｅ２Ｗを必要とする（TRIM5alpha requires Ube2W to anchor Lys63-linked ubiquitin chains and restrict reverse transcription.）」 EMBO J 34, 2078-2095, (2015)、Pertel, T. et al.著の「ＴＲＩＭ５は、レトロウイルスのカプシド格子に対する自然免疫センサーである（TRIM5 is an innate immune sensor for the retrovirus capsid lattice.）」 Nature 472, 361-365, (2011)）。多数のＴＲＩＭ分子についての機能的要件はまた、ＴＲＩＭ２１によるアデノウイルスの強力な抗体媒介性中和には、ウイルスにつき結合される多数の抗体が必要とされるという事実によって示唆されている（McEwan, W. A. et al.著の「ＴＲＩＭ２１によるウイルス中和及び永続性画分の調節（Regulation of virus neutralization and the persistent fraction by TRIM21.）」 J Virol 86, 8482-8491, (2012)）。さらに、ＴＲＩＭ２１は基質誘導性のクラスター形成によって活性化され、その結果、基質上に多数のＴＲＩＭ２１：抗体複合体が得られることが示された（Zeng, J. et al.著の「基質誘導性のクラスター形成によって、病原体及びタンパク質のＴｒｉｍ－Ａｗａｙが活性化される（Substrate-induced clustering activates Trim-Away of pathogens and proteins.）」 doi: https://doi.org/10.1101/2020.07.28.225359 (2020)でのプレプリント、及び現在はZeng et al (2021) Natural Structural & Molecular Biology vol 28, 278-289として出版されている（非特許文献３））。ＲＩＮＧがコイルドコイルのどちらかの末端に位置する独特のＴＲＩＭ構成、及び抗体のヒンジ領域によってもたらされる柔軟性は、ウイルスの表面上に結合したＴＲＩＭ２１分子を互いに結合可能にする上で重要となり得る（図６ｃ）。ウイルス上で触媒的ＲＩＮＧトポロジーを満たすには、２つのＲＩＮＧが二量体化する必要があり、３つ目のＲＩＮＧはＲＩＮＧ二量体から約９ｎｍ以内にある必要があり、こうして、自己アンカー型ユビキチン化及びその後のウイルスの中和が可能となる（図６ｄ）。高次集合は、ＴＲＡＦ６等の多くの他のＫ６３ユビキチン鎖形成性のＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼ（Napetschnig, J. & Wu, H.著の「ＮＦ－κＢシグナル伝達の分子基盤（Molecular basis of NF-kappaB signaling.）」 Annu Rev Biophys 42, 443-468, (2013)）、ＲＩＰＬＥＴ（Cadena, C. et al.著の「自然免疫におけるＥ３リガーゼＲＩＰＬＥＴのユビキチン依存性及び非依存性の役割（Ubiquitin-Dependent and -Independent Roles of E3 Ligase RIPLET in Innate Immunity.）」 Cell 177, 1187-1200 e1116, (2019)）等と関連しているため、本明細書で示される機構は、したがって、ＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼの領域内でより広範囲に見出される可能性が高いことが提案される。
【0152】
実施例６：
内因性標的タンパク質（キナーゼＩＫＫ及びキナーゼＥｒｋ１を含む）のタンパク質分解を、様々なＴＲＩＭコンストラクトを使用して評価した。ここで、ＲはＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインであり、ＰＳはＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹ抗体結合ドメインであり、ＣＣはコイルドコイルドメインであり、ＢはＢ－ボックスドメインであり、Ｔ２１は全長ＴＲＩＭである。
内因性標的タンパク質（キナーゼＩＫＫ及びキナーゼＥｒｋ１を含む）のタンパク質分解を、様々なＴＲＩＭコンストラクトを使用して評価した。ここで、ＲはＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインであり、ＰＳはＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹ抗体結合ドメインであり、ＣＣはコイルドコイルドメインであり、ＢはＢ－ボックスドメインであり、Ｔ２１は全長ＴＲＩＭである。
【0153】
Ａ）１０μＭの濃度での様々なＴＲＩＭ２１コンストラクト（Ｌｉｐ－Ｔ２１、Ｒ－ＰＳ、Ｒ－Ｒ－ＰＳ）のＵｂｅ２Ｎ／Ｕｂｅ２Ｖ２による非アンカー型ユビキチン鎖の触媒作用を働かせた。ユビキチン化アッセイを（Kiss et al. (2021) Nature Communications, vol 12(1):1220）において記載されるように実施した。図１０ａに、６０分後の反応のＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅゲルを示す。
【0154】
Ｂ）一過的に発現されたＴＲＩＭ２１コンストラクト（Ｒ－Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ、Ｒ－Ｂ－ＣＣ－ＰＳ、Ｒ－Ｒ－ＰＳ、及びＲ－ＰＳ）を使用したＲＰＥ１ ＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞における内因性ＩＫＫαのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。それぞれのＴＲＩＭ２１コンストラクトをコードする１．２μＭのｍＲＮＡを、２μＬの容量において１４０ｎｇのウサギαＩＫＫ ＩｇＧ（Abcam、ａｂ１６９７４３）と混合した。次いで、このエレクトロポレーション混合物を、８×１０５個のＲＰＥ－１ ＴＲＩＭ２１ノックアウトを含む１０．５μＬに加えた。細胞：ｍＲＮＡ：ＩｇＧ混合物を１０μＬのＮｅｏｎエレクトロポレーションピペットチップ（Invitrogen）に取り込み、以下の設定を使用してエレクトロポレーションした：１４００Ｖ、２０ｍｓ、２パルス（Ｎｅｏｎエレクトロポレーター（Neon Electroporator））。エレクトロポレーションした細胞を１０％のＦＢＳを補充した抗生物質不含のＦｌｕｏｒｏｂｒｉｇｈｔ培地に移し、インキュベーターにおいて５時間インキュベートし続けた後に、細胞を採取して免疫ブロッティングを行った。結果を図１０ｂに示す。
【0155】
Ｃ）エレクトロポレーション反応において２．４μＭの濃度のＲ－Ｒ－ＰＳタンパク質及び０．５μＭの濃度のαＥｒｋ１抗体を使用したＲＰＥ１ ＷＴ細胞又はＴＲＩＭ２１ノックアウト細胞のいずれかにおける内因性Ｅｒｋ１キナーゼのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。エレクトロポレーションを上記のＢ）に記載されるように実施した。１時間後に細胞を採取してウェスタンブロット分析を行った。ＲＰＥ－１細胞における内因性ＴＲＩＭ２１は、Ｅｒｋ１の効率的なＴｒｉｍ－Ａｗａｙには通常３時間～４時間かかることとなる。
【0156】
Ｄ）ＧＦＰに対するモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体（０．５μＭ）及び様々なＴＲＩＭ２１コンストラクト（２．４μＭ）を使用したＲＰＥ１細胞において異所的に発現された単量体ＥＧＦＰのＴｒｉｍ－Ａｗａｙ。エレクトロポレーションを上記のＢ）に記載されるように実施した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ（商標）（essenbioscience）を使用してＧＦＰ蛍光を測定した。図１０ｄに、４．５時間後の相対ＧＦＰ強度を示す。
【0157】
結果
図１０における結果は、ＲＲコンストラクト（すなわち、２つのＲＩＮＧドメインを含むコンストラクト）が、単一のＲＩＮＧコンストラクトと比較して、標的タンパク質の分解においてより効率的であったことを示している。
図１０における結果は、ＲＲコンストラクト（すなわち、２つのＲＩＮＧドメインを含むコンストラクト）が、単一のＲＩＮＧコンストラクトと比較して、標的タンパク質の分解においてより効率的であったことを示している。
【0158】
実施例７：
材料及び方法
デグレーダーとしてのＴＲＩＭコンストラクトの能力を更に評価するのに、ＴＲＩＭコンストラクトによるＥＧＦＰ融合タンパク質（カベオリン－１－ＥＧＦＰ）の分解を評価した。
材料及び方法
デグレーダーとしてのＴＲＩＭコンストラクトの能力を更に評価するのに、ＴＲＩＭコンストラクトによるＥＧＦＰ融合タンパク質（カベオリン－１－ＥＧＦＰ）の分解を評価した。
【0159】
レポーターコンストラクト（カベオリン－１－ｍＥＧＦＰ）を安定的に発現するＲＰＥ－１細胞をレンチウイルス形質導入によって作製し、ＧＦＰ陽性細胞選別によって選択した。次いで、細胞を、モノクローナルマウス抗ＧＦＰ抗体９Ｆ９．Ｆ９及び示されたＴＲＩＭ２１精製タンパク質コンストラクトの混合物により、それぞれ１μＭ及び６μＭの最終エレクトロポレーションチップ濃度でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に細胞をプレーティングし、ＩｎｃｕＣｙｔｅ生細胞イメージングシステムを用いてカベオリン－１－ｍＥＧＦＰ蛍光をモニタリングした。データを総細胞面積及びＰＢＳコントロールに対して正規化する。エレクトロポレーションの３時間後に、細胞をＲＩＰＡバッファー中で溶解し、Ｊｅｓｓシンプルウェスタンシステム（Jess simple western system）（Biotechne）を使用して、抗ＰＲＹＳＰＲＹ（Ｄ１Ｏ１Ｄ）及び抗マウスＩｇＧ抗体で溶解物をプロービングした。
【0160】
Ｈｉｓ－リポイル－Ｔ２１は全長ＴＲＩＭ２１である。Ｔ２１Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ及びＴ２１Ｒ－Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹは、ＴＲＩＭ２１のＰＲＹＳＰＲＹ抗体結合ドメインに融合された１つのＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメイン（Ｔ２１Ｒ－）又は２つのＲＩＮＧ（Ｔ２１Ｒ－Ｒ－）である。Ｈｉｓ－ＰＲＹＳＰＲＹはＰＲＹＳＰＲＹドメイン単独である。
【0161】
結果
抗ＧＦＰ抗体はカベオリン－１－ｍＥＧＦＰに結合し、内因性細胞ＴＲＩＭ２１（抗ＧＦＰ）又は抗ＧＦＰ抗体とともに６倍過剰で同時エレクトロポレーションされた外因性ＴＲＩＭ２１タンパク質（Ｈｉｓ－リポイル－Ｔ２１、Ｔ２１Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、Ｔ２１Ｒ－Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、及びＨｉｓ－ＰＲＹＳＰＲＹ）のいずれかを動員する。
抗ＧＦＰ抗体はカベオリン－１－ｍＥＧＦＰに結合し、内因性細胞ＴＲＩＭ２１（抗ＧＦＰ）又は抗ＧＦＰ抗体とともに６倍過剰で同時エレクトロポレーションされた外因性ＴＲＩＭ２１タンパク質（Ｈｉｓ－リポイル－Ｔ２１、Ｔ２１Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、Ｔ２１Ｒ－Ｒ－ＰＲＹＳＰＲＹ、及びＨｉｓ－ＰＲＹＳＰＲＹ）のいずれかを動員する。
【0162】
Ｔ２１Ｒ－Ｒ－コンストラクトは、より迅速でより効率的な分解を駆動する。カベオリン－１－ＥＧＦＰの分解を、リアルタイム蛍光顕微鏡法を使用してモニタリングする（図１１ａ）。ウェスタンブロットは、実験終了時に、内因性ＴＲＩＭ２１及び外因性のエレクトロポレーションされたＴＲＩＭ２１だけでなく、エレクトロポレーションされた抗ＧＦＰ抗体（ＩｇＧ－ＨＣ及びＩｇＧ－ＬＣ）のレベルも示している（図１１ｂ及び図１１ｃ）。
【0163】
これらの結果は、ＲＲコンストラクト（すなわち、２つのＲＩＮＧドメインのコンストラクト）が、単一のＲＩＮＧのコンストラクトよりも標的タンパク質のより迅速かつより効率的なデグレーダーであることを示している。
【0164】
実施例８：
デグレーダーとしてのＴＲＩＭコンストラクトの能力を更に評価するのに、様々なＴＲＩＭコンストラクトによるＥＧＦＰ融合タンパク質（Ｈ２Ｂ－１－ＥＧＦＰ）の分解を評価した。
デグレーダーとしてのＴＲＩＭコンストラクトの能力を更に評価するのに、様々なＴＲＩＭコンストラクトによるＥＧＦＰ融合タンパク質（Ｈ２Ｂ－１－ＥＧＦＰ）の分解を評価した。
【0165】
柔軟なリンカーによって抗ＧＦＰナノボディｖｈｈＧＦＰ４に融合された様々なＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメインコンストラクトを、カスタム合成、ＰＣＲ、及びＥ．コリでの細菌発現用のカスタムｐＯＰＴベクターへのギブソンアセンブリーの組合せを使用して作製した。コンストラクトＴ２１Ｒ、コンストラクトＴ２１ＲＲ、及びコンストラクトＴ２１Ｒ（Ｄｅａｄ－Ｍ７２Ｅ、Ｉ１８Ｒ）を、Ｎ末端にヘキサヒスチジン－ＳＵＭＯタグを備えた融合タンパク質として発現させ、これを精製中に切断して、Ｔｒｉｍ２１の未修飾Ｎ末端を得た。ＵｂＴ２１ＲＲをＣ末端ヘキサヒスチジンタグとともに発現させ、これを精製中に切断した。タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィーを使用する標準的な方法を使用して精製した。
【0166】
レポーターコンストラクト（Ｈ２Ｂ－ｍＥＧＦＰ）を安定的に発現するＲＰＥ－１細胞をレンチウイルス形質導入により作製し、ＧＦＰ陽性細胞選別によって選択した。次いで、細胞を、示されたＴ２１Ｒ－ｖｈｈＧＦＰ４精製タンパク質コンストラクトにより、１．６μＭの最終エレクトロポレーションチップ濃度でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーションの直後に細胞をプレーティングし、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージングシステムを使用してＨ２Ｂ－ｍＥＧＦＰ蛍光をモニタリングした。データを総細胞面積及びバッファーコントロールに対して正規化する。
【0167】
Ｔ２１Ｒ及びＴ２１Ｒ－Ｔ２１Ｒは、ｖｈｈＧＦＰ４に融合された１つのＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧドメイン（Ｔ２１Ｒ－）又は２つのＲＩＮＧ（Ｔ２１Ｒ－Ｒ）である。Ｕｂ－Ｔ２１Ｒ－Ｒは、Ｎ末端ユビキチンドメインを有するｖｈｈＧＦＰ４に融合された２つのＲＩＮＧである。Ｔ２１Ｒ（ｄｅａｄ）は、ｖｈｈＧＦＰ４に融合されたＩ１８Ｒ及びＭ７２Ｅの点突然変異を有する１つのＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧである。突然変異ＲＩＮＧドメインを有するこのコンストラクトは二量体化することもユビキチンに結合することもできないため、触媒的に不活性である。
【0168】
結果
様々なＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧコンストラクトが、抗ＧＦＰナノボディを介してＨ２Ｂ－ｍＥＧＦＰに動員される。リアルタイム蛍光顕微鏡法を使用してＨ２Ｂ－ＥＧＦＰの分解をモニタリングする（図１２）。Ｔ２１Ｒ－Ｒ－コンストラクトは、より迅速でより効率的な分解を駆動する。
様々なＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧコンストラクトが、抗ＧＦＰナノボディを介してＨ２Ｂ－ｍＥＧＦＰに動員される。リアルタイム蛍光顕微鏡法を使用してＨ２Ｂ－ＥＧＦＰの分解をモニタリングする（図１２）。Ｔ２１Ｒ－Ｒ－コンストラクトは、より迅速でより効率的な分解を駆動する。
【0169】
これらの結果は、ＲＲコンストラクト（すなわち、２つのＲＩＮＧドメインのコンストラクト）が、単一のＲＩＮＧのコンストラクトよりも標的タンパク質のより迅速かつより効率的なデグレーダーであることを示している。これらの結果は、ＲＩＮＧ－ＲＩＮＧ融合タンパク質をナノボディ標的化ドメインに融合させることができることから、単一のＲＩＮＧコンストラクトを使用する場合よりもより活性なデグレーダーが得られることを示している。これは、二重ＲＩＮＧ融合物の治療薬が単一ＲＩＮＧ融合物の治療薬よりも優れている可能性があることを示唆している。
【0170】
まとめ
２つのＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質を開発した。これらの実験からの結果は、このような融合タンパク質が生理学的環境において狙い通りのタンパク質分解が可能であることを裏付けている。したがって、このような融合タンパク質及びそれをコードする核酸コンストラクトは、治療用途及び研究用途の両方において、細胞内のタンパク質の分解に使用するのに適している。
２つのＲＩＮＧ Ｅ３リガーゼドメインと、タンパク質標的化ドメインとを含む融合タンパク質を開発した。これらの実験からの結果は、このような融合タンパク質が生理学的環境において狙い通りのタンパク質分解が可能であることを裏付けている。したがって、このような融合タンパク質及びそれをコードする核酸コンストラクトは、治療用途及び研究用途の両方において、細胞内のタンパク質の分解に使用するのに適している。
【0171】
本明細書において、本発明者らは、ＲＩＮＧ Ｅ３アンカー型ユビキチン鎖形成を理解するための構造的枠組みを提供する。本発明者らは、ユビキチンがチャージされたヘテロ二量体Ｅ２酵素Ｕｂｅ２Ｎ～Ｕｂ／Ｕｂｅ２Ｖ２によりモノユビキチン化されたＴＲＩＭ２１ ＲＩＮＧ（Ｕｂ－Ｒ）の結晶構造におけるこの過程のスナップショットを捕らえることができた（図１）。これは、Ｕｂｅ２Ｎ Ｄ１１９によるアクセプターリジンの脱プロトン化によって例示されるアクセプターユビキチンの化学的活性化を示している（図２）。最も重要なことには、本発明者らの構造は、伸長反応に必要とされるドメイン配置、言い換えると、モノユビキチン化ＲＩＮＧのＫ６３連結型ＲＩＮＧアンカー型ユビキチン鎖への拡張を可能にする触媒的ＲＩＮＧ Ｅ３トポロジーを明らかにしている（図３、図４）。この配置において、２つのＲＩＮＧは二量体を形成し、３つ目のＲＩＮＧドメインに対して酵素として機能し、３つ目のＲＩＮＧドメインはこの反応における基質として機能する。Ｅ２活性部位における全ての重要な触媒的残基を最適に配置するには硬直性が必要とされる一方で（図２）、基質アンカー型ユビキチン鎖の形成には、ＴＲＩＭタンパク質の独特なトポロジーによってもたらされるドメイン間の構造的柔軟性が必要である可能性が高いことが観察されている（図３）。ＴＲＩＭ２１の基質誘導性自己ユビキチン化は、遊離ユビキチン鎖形成とは対照的に、低いリガーゼ濃度でも非常に効率的である（図３）。これは、より高い反応効率のため、生理学的ユビキチンシグナルが遊離鎖としてではなく、主に基質上で生成される可能性があることを意味する。
【0172】
本発明者らのデータは、最初にＲＩＮＧアンカー型Ｋ６３鎖がトランス機構において形成され、ここで、ＲＩＮＧ二量体がＵｂｅ２Ｎ～Ｕｂ分子を活性化し、それによりＥ３リガーゼとして機能することを立証している。追加のモノユビキチン化ＲＩＮＧはユビキチン化についての基質として機能し、ドナーユビキチンを受容する（図３）。４つのユビキチン分子がトランスでＲＩＮＧに付加された後に初めて、シスでのユビキチン鎖形成に十分な長さの鎖になる（図４）。シスでのユビキチン鎖の伸長ははるかに高速で起こるが、トランス配置の初期の必要性は、基質の不存在下でＴＲＩＭ２１活性を抑制する重要な調節機構を表し得る。ＴＲＩＭ２１又はＴＲＩＭ５αの場合には、活性化は基質結合によって駆動され、これはトランスのユビキチン化に必要とされる。興味深いことに、ＲＢＲ（RING-in between-RING）リガーゼＨＯＩＰによる線状ユビキチン鎖での基質修飾はその相手であるＲＢＲ ＨＯＩＬによって調節され、これは３つの全てのＬＵＢＡＣ成分のＨＯＩＰ、ＨＯＩＬ、及びＳＨＡＲＰＩＮをモノユビキチン化する。次いで、これらのユビキチンプライマーは、ＨＯＩＰによってシスで伸長され、そのため基質のトランスユビキチン化が競り勝つ（Fuseya, Y. et al.著の「ＨＯＩＬ－１Ｌリガーゼは、ＬＵＢＡＣのモノユビキチン化を介して免疫シグナル伝達及び細胞死を調節する（The HOIL-1L ligase modulates immune signalling and cell death via monoubiquitination of LUBAC.）」 Nat Cell Biol 22, 663-673, (2020)）。したがって、ユビキチン化のシス機構とトランス機構との間の切り替えは、多くの異なる種類のＥ３リガーゼによって利用される制御系である可能性がある。
【0173】
本発明者らの構造において観察された触媒的ＲＩＮＧトポロジーにより、細胞内のＴＲＩＭ２１媒介性の狙い通りのタンパク質分解についての要件が予測される（図５）。基質が認識されると、ＴＲＩＭ２１はそのＮ末端にＫ６３連結型ユビキチン鎖を形成する（Fletcher, A. J., Mallery, D. L., Watkinson, R. E., Dickson, C. F. & James, L. C.著の「逐次ユビキチン化酵素及び脱ユビキチン化酵素は、ＴＲＩＭ２１の二重のセンサー機能及びエフェクター機能を同期する（Sequential ubiquitination and deubiquitination enzymes synchronize the dual sensor and effector functions of TRIM21.）」 Proc Natl Acad Sci USA 112, 10014-10019, (2015)）。このＫ６３連結型ユビキチン鎖を失うと、ウイルスの中和、免疫シグナル伝達、及びＴｒｉｍ－Ａｗａｙが妨げられる（Kiss, L. et al. 著の「トリイオン性アンカー機構は、ＴＲＩＭリガーゼにおけるＵｂｅ２Ｎ特異的な動員及びＫ６３鎖のユビキチン化を駆動する（A tri-ionic anchor mechanism drives Ube2N-specific recruitment and K63-chain ubiquitination in TRIM ligases.）」 Nat Commun 10, 4502, (2019)）。本発明者らのＧＦＰ－Ｆｃ分解実験は、これらの条件下で触媒的ＲＩＮＧトポロジーを形成することができるＴＲＩＭ２１コンストラクト（Ｒ－Ｒ－ＰＳ）のみが分解を可能にすることを示している（図５）。興味深いことに、その基質に対するＥ３リガーゼＣＲＬＶＨＬの特定の配向が、狙い通りのタンパク質分解に重要であることも明らかにされた（B. E. et al.著の「異なるＰＲＯＴＡＣ基質特異性は、動員されたＥ３リガーゼの配向によって規定される（Differential PROTAC substrate specificity dictated by orientation of recruited E3 ligase.）」 Nat Commun 10, 131, (2019)）。
【0174】
このデータはまた、２つのＲＩＮＧドメインを含むＴＲＩＭコンストラクトが、１つのＲＩＮＧドメインを含むコンストラクトよりもより効率的な標的タンパク質のデグレーダーであったことを立証している（図１０～図１２）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【配列表】
【国際調査報告】