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特表2024-507871動力学的生理活性足場及びＣＮＳ損傷後のその治療的使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】動力学的生理活性足場及びＣＮＳ損傷後のその治療的使用
(51)【国際特許分類】
C07K 7/06 20060101AFI20240214BHJP
C07K 7/08 20060101ALI20240214BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 38/18 20060101ALI20240214BHJP
A61P 25/00 20060101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C07K7/06 ZNA
C07K7/08
C07K14/00
A61K38/18
A61P25/00
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550590
(86)(22)【出願日】2022-02-23
(85)【翻訳文提出日】2023-10-19
(86)【国際出願番号】 US2022017490
(87)【国際公開番号】W WO2022182737
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】63/152,498
(32)【優先日】2021-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】500041019
【氏名又は名称】ノースウェスタン ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】110001173
【氏名又は名称】弁理士法人川口國際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】アルバレス・ピント，ザイダ
(72)【発明者】
【氏名】スタップ，サミュエル・アイザック
【テーマコード（参考）】
4C084
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084BA31
4C084DB52
4C084DB54
4C084DB59
4C084NA14
4C084ZA01
4C084ZA02
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA10
4H045BA15
4H045BA16
4H045BA17
4H045BA18
4H045EA20
4H045FA10
(57)【要約】
本願では、ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）、ＰＡを含む超分子集合体、ＰＡを含む組成物、及びその使用方法を提供する。所定の実施形態において、本願では、ＩＫＶＡＶＰＡと成長因子ミメティックＰＡを含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、神経系損傷の治療方法で使用される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
少なくとも２種のペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体であって、前記少なくとも２種のペプチド両親媒性分子が、ａ．疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶ（配列番号１）を含む生理活性ペプチドを含む少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と；
ｂ．少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む、前記超分子集合体。
【請求項2】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、０．３未満の蛍光異方性値を含む、請求項１に記載の超分子集合体。
【請求項3】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、４ｓ－１未満のプロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）を含む、請求項１又は２に記載の超分子集合体。
【請求項4】
前記疎水性セグメントが、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項5】
前記疎水性セグメントが、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含む、請求項４に記載の超分子集合体。
【請求項6】
前記構造ペプチドセグメントが、Ａ２Ｇ２を含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項7】
前記荷電ペプチドセグメントが、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項8】
前記生理活性ペプチドが、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている、請求項１～７のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項9】
前記リンカーが、単一グリシン（Ｇ）残基である、請求項８に記載の超分子集合体。
【請求項10】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項11】
前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、Ｖ２Ａ２又はＡ２Ｇ２を含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項12】
前記成長因子ミメティック配列が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ミメティック配列、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティック配列、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ミメティック配列、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ミメティック配列、又はネトリン１ミメティック配列である、請求項１１に記載の超分子集合体。
【請求項13】
前記成長因子ミメティック配列が、ＦＧＦ２ミメティック配列である、請求項１２に記載の超分子集合体。
【請求項14】
前記ＦＧＦ２ミメティック配列が、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）を含む、請求項１３に記載の超分子集合体。
【請求項15】
前記成長因子ミメティック配列が、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている、請求項１２～１４のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項16】
前記リンカーが、単一グリシン（Ｇ）残基である、請求項１５に記載の超分子集合体。
【請求項17】
前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項18】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の超分子集合体。
【請求項19】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項１８に記載の超分子集合体。
【請求項20】
請求項１～１９のいずれか一項に記載の超分子集合体を含む組成物。
【請求項21】
ａ．疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶ（配列番号１）を含む生理活性ペプチドを含む少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と；ｂ．少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む組成物であって、
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が相互作用し、前記組成物内で超分子集合体を形成する、前記組成物。
【請求項22】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、０．３未満の蛍光異方性値を含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項23】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、４ｓ－１未満のプロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）を含む、請求項２１又は２２に記載の組成物。
【請求項24】
前記疎水性セグメントが、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項25】
前記疎水性セグメントが、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含む、請求項２４に記載の組成物。
【請求項26】
前記構造ペプチドセグメントが、Ａ２Ｇ２を含む、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項27】
前記荷電ペプチドセグメントが、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項28】
前記生理活性ペプチドが、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項29】
前記リンカーが、単一グリシン（Ｇ）残基である、請求項２８に記載の組成物。
【請求項30】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項31】
前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、ＶＶＡＡ又はＡＡＧＧを含む構造ペプチドセグメントと、ＥＥ、ＥＥＥ、又はＥＥＥＥを含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項32】
前記成長因子ミメティック配列が、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ミメティック配列、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティック配列、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ミメティック配列、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ミメティック配列、又はネトリン１ミメティック配列である、請求項３１に記載の組成物。
【請求項33】
前記成長因子ミメティック配列が、ＦＧＦ２ミメティック配列である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項34】
前記ＦＧＦ２ミメティック配列が、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）を含む、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記成長因子ミメティック配列が、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている、請求項３１～３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項36】
前記リンカーが、単一グリシン（Ｇ）残基である、請求項３５に記載の超分子集合体。
【請求項37】
前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項２１～３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項38】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項２１～３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項39】
前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子が、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項40】
対象における神経系損傷の治療方法で使用するための、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項41】
前記神経系損傷が、中枢神経系損傷である、請求項４０に記載の組成物。
【請求項42】
前記中枢神経系損傷が、脊髄損傷である、請求項４１に記載の組成物。
【請求項43】
対象における神経系損傷の治療方法であって、請求項２１～３９のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に提供することを含む、前記方法。
【請求項44】
前記神経系損傷が、中枢神経系損傷である、請求項４３に記載の方法。
【請求項45】
前記中枢神経系損傷が、脊髄損傷である、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
連邦政府からの資金援助に関する声明
本発明は、空軍研究所から授与された契約番号ＦＡ８６５０－１５－２－５５１８、国立老化研究所から授与された助成金番号Ｒ０１ＮＳ１０４２１９、並びに国立神経疾患・脳卒中研究所から授与された助成金番号Ｒ２１ＮＳ１０７７６１及びＲ２１ＮＳ１０７７６１－０１Ａ１による政府支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
本発明は、空軍研究所から授与された契約番号ＦＡ８６５０－１５－２－５５１８、国立老化研究所から授与された助成金番号Ｒ０１ＮＳ１０４２１９、並びに国立神経疾患・脳卒中研究所から授与された助成金番号Ｒ２１ＮＳ１０７７６１及びＲ２１ＮＳ１０７７６１－０１Ａ１による政府支援を受けて行われた。政府は本発明に対して一定の権利を有する。
【0002】
関連出願に関する声明
本出願は、２０２１年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，４９８号の優先権を主張するものであり、その全内容はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６３／１５２，４９８号の優先権を主張するものであり、その全内容はあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【0003】
本願では、ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）、ＰＡを含む超分子集合体、ＰＡを含む組成物、及びその使用方法を提供する。所定の実施形態において、本願では、ＩＫＶＡＶＰＡと成長因子ミメティックＰＡを含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、神経系損傷の治療方法で使用される。
【背景技術】
【0004】
損傷した軸索は、成人中枢神経系（ＣＮＳ）で再生することができないため、外傷性損傷後のヒトにおける永久麻痺を回避するための治療法の開発は、依然として大きな課題である。治療用カーゴを送達するために特定の細胞を標的とするナノ構造や、細胞外スペースで生理活性足場として機能する材料を使用する方法が、シグナル伝達ストラテジーとして台頭しつつある。しかし、送達されるカーゴから高い生理活性が得られるようにこのようなナノ構造のデザインを最適化する方法が解明されていないため、成功が限られており、これまでのところ、非常に有効な治療法は存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0005】
所定の態様において、本願では、超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、本願では、少なくとも２種のペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、前記少なくとも２種のペプチド両親媒性分子は、疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを含む生理活性ペプチドを含む少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、０．３未満の蛍光異方性値を含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、４ｓ－１未満のプロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）を含む。
【課題を解決するための手段】
【0006】
所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ａ２Ｇ２を含む。所定の実施形態において、前記荷電ペプチドセグメントは、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む。所定の実施形態において、前記生理活性ペプチドは、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている。所定の実施形態において、前記リンカーは、単一グリシン（Ｇ）残基である。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む。
【0007】
所定の実施形態において、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、Ｖ２Ａ２、Ａ２Ｇ２を含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ミメティック配列、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティック配列、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ミメティック配列、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ミメティック配列、又はネトリン１ミメティック配列である。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、ＦＧＦ２ミメティック配列である。例えば、所定の実施形態において、前記ＦＧＦ２ミメティック配列は、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチドは、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている。所定の実施形態において、前記リンカーは、単一グリシン（Ｇ）残基である。
【0008】
所定の実施形態において、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。
【0009】
所定の態様において、本願では、組成物を提供する。所定の実施形態において、本願では、本願に記載するような超分子集合体を含む組成物を提供する。所定の実施形態において、本願では、疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを含む生理活性ペプチドを含む少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む組成物を提供する。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、相互作用し、前記組成物内に超分子集合体を形成する。
【0010】
所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、０．３未満の蛍光異方性値を含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、４ｓ－１未満のプロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）を含む。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む。例えば、所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ａ２Ｇ２を含む。所定の実施形態において、前記荷電ペプチドセグメントは、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む。所定の実施形態において、前記生理活性ペプチドは、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている。所定の実施形態において、前記リンカーは、単一グリシン（Ｇ）残基である。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む。
【0011】
所定の実施形態において、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、Ｖ２Ａ２又はＡ２Ｇ２を含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ２、Ｅ３、又はＥ４を含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ミメティック配列、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティック配列、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ミメティック配列、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ミメティック配列、又はネトリン１ミメティック配列である。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、ＦＧＦ２ミメティック配列である。所定の実施形態において、前記ＦＧＦ２ミメティック配列は、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチドは、リンカーにより前記荷電ペプチドセグメントと連結されている。所定の実施形態において、前記リンカーは、単一グリシン（Ｇ）残基である。
【0012】
所定の実施形態において、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含み、前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。
【0013】
本願に記載する組成物は、対象における神経系損傷の治療方法で使用することができる。所定の実施形態において、前記神経系損傷は、中枢神経系損傷である。例えば、所定の実施形態において、前記中枢神経系損傷は、脊髄損傷である。
【0014】
所定の態様において、本願では、対象における神経系損傷の治療方法を提供する。所定の実施形態において、本願では、対象における神経系損傷の治療方法として、本願に記載する組成物を前記対象に提供することを含む方法を提供する。所定の実施形態において、前記神経系損傷は、中枢神経系損傷である。所定の実施形態において、前記中枢神経系損傷は、脊髄損傷である。
【0015】
添付の資料と図面を参照すると、本開示の他の態様及び実施形態にも想到されよう。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1A】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図1B】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図1C-1E】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図2A-2B】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2C】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2D】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2E-2F】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2G-2H】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2I-2J】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図3A】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3B-3C】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3D-3F】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3G】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3H】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3I】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3J】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3K】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3L】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図4A-4B】図４Ａ～４Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、血管新生に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群における横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）Ａの各群の横断面切片における血管面積分率、灌流血管長、及び分岐数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２を注入した動物の病巣の中心におけるＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞の蛍光画像；ＣＤ３１－血管（緑）、ＢｒｄＵ－新たに生成された細胞（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及び生理食塩水（シャム）を投与した群におけるｍｍ２当たりＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＣＤ３１タンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｂ及びＤでは各群６匹に対応し、Ｅでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｃ）２５μｍ。
【図4C-4E】図４Ａ～４Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、血管新生に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群における横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）Ａの各群の横断面切片における血管面積分率、灌流血管長、及び分岐数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２を注入した動物の病巣の中心におけるＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞の蛍光画像；ＣＤ３１－血管（緑）、ＢｒｄＵ－新たに生成された細胞（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及び生理食塩水（シャム）を投与した群におけるｍｍ２当たりＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＣＤ３１タンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｂ及びＤでは各群６匹に対応し、Ｅでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｃ）２５μｍ。
【図5A-5B】図５Ａ～５Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ニューロン生存と機能回復に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群に対応する横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）を示し、破線は、灰白質（角）を示す。（Ｂ）Ａの切片の前角領域の高倍率画像；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（左）；ＣｈＡＴ－運動ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（右）。（Ｃ）横断面切片当たりのＮｅｕＮ＋細胞数（左）とＣｈＡＴ＋細胞数（右）を示すドットプロット（データ点は、各群６匹、１匹当たり８切片の合計４８切片に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）インビボ実験の実験タイムライン（上）と、歩行運動のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）（下）（エラーバーは各群３８匹に対応する；＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１全ＰＡ群ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｂ）２５μｍ。
【図5C-5D】図５Ａ～５Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ニューロン生存と機能回復に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群に対応する横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）を示し、破線は、灰白質（角）を示す。（Ｂ）Ａの切片の前角領域の高倍率画像；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（左）；ＣｈＡＴ－運動ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（右）。（Ｃ）横断面切片当たりのＮｅｕＮ＋細胞数（左）とＣｈＡＴ＋細胞数（右）を示すドットプロット（データ点は、各群６匹、１匹当たり８切片の合計４８切片に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）インビボ実験の実験タイムライン（上）と、歩行運動のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）（下）（エラーバーは各群３８匹に対応する；＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１全ＰＡ群ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｂ）２５μｍ。
【図6A-6C】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図6D-6F】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図6G-6J】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図7】各種ＩＫＶＡＶＰＡの化学構造（左）と質量スペクトル（右）を示す。
【図8】各種ＩＫＶＡＶＰＡの時間に対する根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を表すプロットを示す。
【図9】ｈＮＰＣをオルニチンコーティング上で培養したものと、ラミニン及びＩＫＶＡＶＰＡのライブラリーで処理したものにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１の正規化値の棒グラフを示す（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【図10A-10B】図１０Ａ～１０Ｃは、超分子運動とインビトロ細胞シグナル伝達に及ぼすカルシウムの影響を示す。（Ａ）カルシウムの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）におけるＩＫＶＡＶＰＡ２溶液とＩＫＶＡＶＰＡ５溶液の異方性（エラーバーは３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｂ）Ａに記載した条件で培養したｈＮＰＣの代表的な蛍光顕微鏡写真。（Ｃ）カルシウム（Ｃａ２＋）の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２又はＩＫＶＡＶＰＡ５で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１のＷＢ結果（左）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（右）（カルシウム単独（＋）を対照として使用した；エラーバーは、各条件３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。スケールバー：１０ｍｍ。
【図10C】図１０Ａ～１０Ｃは、超分子運動とインビトロ細胞シグナル伝達に及ぼすカルシウムの影響を示す。（Ａ）カルシウムの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）におけるＩＫＶＡＶＰＡ２溶液とＩＫＶＡＶＰＡ５溶液の異方性（エラーバーは３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｂ）Ａに記載した条件で培養したｈＮＰＣの代表的な蛍光顕微鏡写真。（Ｃ）カルシウム（Ｃａ２＋）の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２又はＩＫＶＡＶＰＡ５で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１のＷＢ結果（左）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（右）（カルシウム単独（＋）を対照として使用した；エラーバーは、各条件３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。スケールバー：１０ｍｍ。
【図11A-11B】図１１Ａ～１１Ｃは、種々のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリのクライオＴＥＭ画像と貯蔵弾性率を示す。（Ａ）９５：５、（Ｂ）９０：１０、及び（Ｃ）８０：２０のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１又はＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（左）と貯蔵弾性率（右）（データ点は、各条件３回の反復実験に対応する；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定による）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図11C】図１１Ａ～１１Ｃは、種々のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリのクライオＴＥＭ画像と貯蔵弾性率を示す。（Ａ）９５：５、（Ｂ）９０：１０、及び（Ｃ）８０：２０のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１又はＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（左）と貯蔵弾性率（右）（データ点は、各条件３回の反復実験に対応する；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定による）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図12A-12E】図１２Ａ～１２Ｆは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡコアセンブリシステムの特性決定を示す。ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の（Ａ）ＳＡＸＳ散乱パターン、（Ｂ）ＷＡＸＳプロファイル、及び（Ｃ）ＦＴ－ＩＲ。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の高倍率ネガティブＴＥＭ画像。（Ｅ）Ｄに記載した条件の繊維幅（エラーバーは、各条件５０本の繊維に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｆ）種々の百分率のＩＫＶＡＶＰＡ２、ＦＧＦ２ＰＡ１、ＦＧＦ２ＰＡ２及びそのコアセンブリの６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）プロット（左）と、ＦＧＦ２ＰＡ（オレンジ色）及びＩＫＶＡＶＰＡ２とのそのコアセンブリ（赤）の写真（右）（エラーバーは、各条件３回の反復実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．そのコアセンブリ試料、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：１００ｎｍ。
【図12F】図１２Ａ～１２Ｆは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡコアセンブリシステムの特性決定を示す。ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の（Ａ）ＳＡＸＳ散乱パターン、（Ｂ）ＷＡＸＳプロファイル、及び（Ｃ）ＦＴ－ＩＲ。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の高倍率ネガティブＴＥＭ画像。（Ｅ）Ｄに記載した条件の繊維幅（エラーバーは、各条件５０本の繊維に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｆ）種々の百分率のＩＫＶＡＶＰＡ２、ＦＧＦ２ＰＡ１、ＦＧＦ２ＰＡ２及びそのコアセンブリの６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）プロット（左）と、ＦＧＦ２ＰＡ（オレンジ色）及びＩＫＶＡＶＰＡ２とのそのコアセンブリ（赤）の写真（右）（エラーバーは、各条件３回の反復実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．そのコアセンブリ試料、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：１００ｎｍ。
【図13A-13D】図１３Ａ～１３Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した脊髄の透明化を示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２の（Ａ）化学構造と、（Ｂ）質量スペクトル。（Ｃ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２のクライオＴＥＭ画像。（Ｄ）組織を透明化する前（非透明化）及び後（透明化）にＰＡを注入したマウス脊髄の写真。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２を１％のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１又はＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（いずれも赤）を注入したマウス脊髄（緑）の完全な顕微鏡写真再構成である。スケールバー：（Ｃ）１００ｎｍ及び（Ｅ）１０００μｍ。
【図13E】図１３Ａ～１３Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した脊髄の透明化を示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２の（Ａ）化学構造と、（Ｂ）質量スペクトル。（Ｃ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２のクライオＴＥＭ画像。（Ｄ）組織を透明化する前（非透明化）及び後（透明化）にＰＡを注入したマウス脊髄の写真。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２を１％のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１又はＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（いずれも赤）を注入したマウス脊髄（緑）の完全な顕微鏡写真再構成である。スケールバー：（Ｃ）１００ｎｍ及び（Ｅ）１０００μｍ。
【図14A】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図14B】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図14C-14D】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図15A】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15B】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15C-15D】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15E-15F】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図16A】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16B】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16C】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16D-16E】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図17A-17B】図１７Ａ～１７Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した動物の足跡解析を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の損傷から３箇月後の歩行時マウス後肢位置の代表的な写真。（Ｂ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２を投与した動物の脊髄に病巣を形成するために使用した衝撃力を表す棒グラフ（データ点は、解析した３８匹を示す；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す）。（Ｃ）Ｂにプロットした種々の条件で注入した動物の代表的な足跡。（Ｄ、Ｅ）Ｂに記載した種々の条件で注入した動物の（Ｄ）ｍｍで表したストライド長と、（Ｅ）ｍｍで表したストライド幅を表す棒グラフ（データ点は、各条件３８匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【図17C-17E】図１７Ａ～１７Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した動物の足跡解析を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の損傷から３箇月後の歩行時マウス後肢位置の代表的な写真。（Ｂ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２を投与した動物の脊髄に病巣を形成するために使用した衝撃力を表す棒グラフ（データ点は、解析した３８匹を示す；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す）。（Ｃ）Ｂにプロットした種々の条件で注入した動物の代表的な足跡。（Ｄ、Ｅ）Ｂに記載した種々の条件で注入した動物の（Ｄ）ｍｍで表したストライド長と、（Ｅ）ｍｍで表したストライド幅を表す棒グラフ（データ点は、各条件３８匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【発明を実施するための形態】
【0017】
定義
本願に記載する実施形態の実施又は試験には、本願に記載するものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を使用することができるが、本願では所定の好ましい方法、組成物、装置及び材料について記載する。しかし、本願の材料及び方法について記載する前に、当然のことながら、本願に記載する特定の分子、組成物、手法又はプロトコルは、日常的な実験及び最適化に従って変更することができるので、本発明は、これらの特定の分子等に制限されない。同じく当然のことながら、本明細書で使用する用語は、特定の態様又は実施形態のみについて説明することを目的とし、本願に記載する実施形態の範囲を制限するものではない。
本願に記載する実施形態の実施又は試験には、本願に記載するものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を使用することができるが、本願では所定の好ましい方法、組成物、装置及び材料について記載する。しかし、本願の材料及び方法について記載する前に、当然のことながら、本願に記載する特定の分子、組成物、手法又はプロトコルは、日常的な実験及び最適化に従って変更することができるので、本発明は、これらの特定の分子等に制限されない。同じく当然のことながら、本明細書で使用する用語は、特定の態様又は実施形態のみについて説明することを目的とし、本願に記載する実施形態の範囲を制限するものではない。
【0018】
特に定義しない限り、本願で使用する全科学技術用語は、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者に広く理解されていると同一の意味である。しかし、矛盾する場合には、定義を含めて本明細書を優先する。したがって、本願に記載する実施形態については、以下の定義を適用する。
【0019】
文脈からそうでないことが明らかな場合を除き、本願及び特許請求の範囲で使用する単数形の不定冠詞と定冠詞は複数の言及を含む。したがって、例えば、「ペプチド両親媒性分子」と言う場合には、１個以上のペプチド両親媒性分子と当業者に公知のその均等物を意味し、他の用語についても同様である。
【0020】
本願で使用する「含む」なる用語とその活用形は、指定される１以上の特徴、要素、方法工程等の存在を意味し、他の１以上の特徴、要素、方法工程等の存在を排除しない。逆に、「～から構成される」なる用語とその活用形は、指定される１以上の特徴、要素、方法工程等の存在を意味し、通常付随する不純物を除き、指定外の１以上の特徴、要素、方法工程等を排除する。「～から本質的に構成される」なる用語は、指定される１以上の特徴、要素、方法工程等と、組成物、システム又は方法の基本的性質に実質的に影響を与えない他の１以上の特徴、要素、方法工程等を意味する。本願に記載する多くの実施形態は、開放的な「～を含む」なる用語を使用して記載する。このような実施形態は、複数の閉鎖的な「～から構成される」及び／又は「～から本質的に構成される」実施形態も包含し、これらの実施形態は、特許請求の範囲又は明細書で「～を含む」なる用語を使用して言い換えることもできる。
【0021】
「アミノ酸」なる用語は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及びアミノ酸アナログを意味し、それらの構造から可能な場合には、特に指定しない限り、いずれもそれらのＤ体及びＬ体として存在する。
【0022】
天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ又はＡ）、アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）、システイン（Ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）、グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）、リジン（Ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（Ｓｅｒ又はＳ）、トレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）、チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）が挙げられる。
【0023】
非天然アミノ酸としては、限定されないが、アゼチジンカルボン酸、２－アミノアジピン酸、３－アミノアジピン酸、β－アラニン、ナフチルアラニン（「ｎａｐｈ」）、アミノプロピオン酸、２－アミノ酪酸、４－アミノ酪酸、６－アミノカプロン酸、２－アミノヘプタン酸、２－アミノイソ酪酸、３－アミノイソ酪酸、２－アミノピメリン酸、ｔｅｒｔ－ブチルグリシン（「ｔＢｕＧ」）、２，４－ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’－ジアミノピメリン酸、２，３－ジアミノプロピオン酸、Ｎ－エチルグリシン、Ｎ－エチルアスパラギン、ホモプロリン（「ｈＰｒｏ」又は「ｈｏｍｏＰ」）、ヒドロキシリジン、アロヒドロキシリジン、３－ヒドロキシプロリン（「３Ｈｙｐ」）、４－ヒドロキシプロリン（「４Ｈｙｐ」）、イソデスモシン、アロイソロイシン、Ｎ－メチルアラニン（「ＭｅＡｌａ」又は「Ｎｉｍｅ」）、Ｎ－メチルグリシンをはじめとするＮ－アルキルグリシン（「ＮＡＧ」）、Ｎ－メチルイソロイシン、Ｎ－メチルペンチルグリシンをはじめとするＮ－アルキルペンチルグリシン（「ＮＡＰＧ」）、Ｎ－メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン（「Ｎｏｒｖａｌ」）、ノルロイシン（「Ｎｏｒｌｅｕ」）、オクチルグリシン（「ＯｃｔＧ」）、オルニチン（「Ｏｒｎ」）、ペンチルグリシン（「ｐＧ」又は「ＰＧｌｙ」）、ピペコリン酸、チオチプロリン（「ＴｈｉｏＰ」又は「ｔＰｒｏ」）、ホモリジン（「ｈＬｙｓ」）、及びホモアルギニン（「ｈＡｒｇ」）が挙げられる。
【0024】
「アミノ酸アナログ」なる用語は、Ｃ末端カルボキシ基、Ｎ末端アミノ基及び側鎖生理活性基の１種以上が可逆的若しくは不可逆的に化学的にブロックされているか、又は他の方法で別の生理活性基に改変されている天然又は非天然アミノ酸を意味する。例えば、アスパラギン酸（β－メチルエステル）は、アスパラギン酸のアミノ酸アナログであり、Ｎ－エチルグリシンは、グリシンのアミノ酸アナログであり、アラニンカルボキサミドは、アラニンのアミノ酸アナログである。他のアミノ酸アナログとしては、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ－（カルボキシメチル）システイン、Ｓ－（カルボキシメチル）システインスルホキシド及びＳ－（カルボキシメチル）システインスルホンが挙げられる。
【0025】
本願で使用する「ペプチド」なる用語は、ペプチド結合により相互に連結されたアミノ酸のオリゴマー～短鎖ポリマーを意味する。他のアミノ酸ポリマー（例えば、タンパク質、ポリペプチド等）とは対照的に、ペプチドは、約５０アミノ酸長以下である。ペプチドは、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、及び／又は修飾アミノ酸を含むことができる。ペプチドは、天然に存在するタンパク質のサブ配列でもよいし、非天然（人工）配列でもよい。
【0026】
本願で使用する「人工」なる用語は、人為的に設計又は作製され、天然には存在しない組成物及びシステムを意味する。例えば、人工ペプチド、ペプトイド又は核酸は、非天然配列を含むペプチド、ペプトイド又は核酸（例えば、天然に存在するタンパク質又はその断片に対して１００％の一致度をもたないペプチド）である。
【0027】
本願で使用する場合に、「保存的」アミノ酸置換とは、ペプチド又はポリペプチド中のアミノ酸を、サイズや電荷等の化学的性質が類似する別のアミノ酸で置換することを意味する。本開示の目的では、以下の８群の各々が、相互に保存的置換であるアミノ酸を含む。
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）；並びに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。
１）アラニン（Ａ）及びグリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）及びグルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、及びトリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）及びトレオニン（Ｔ）；並びに
８）システイン（Ｃ）及びメチオニン（Ｍ）。
【0028】
天然に存在する残基は、共通の側鎖性質に基づいて、例えば、極性正荷電（又は塩基性）（ヒスチジン（Ｈ）、リジン（Ｋ）、及びアルギニン（Ｒ））；極性負荷電（又は酸性）（アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））；極性中性（セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ））；非極性脂肪族（アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ））；非極性芳香族（フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ））；プロリン及びグリシン；並びにシステインに分類することができる。本願で使用する場合に、「半保存的」アミノ酸置換とは、ペプチド又はポリペプチド中のアミノ酸を同一分類内の別のアミノ酸で置換することを意味する。
【0029】
所定の実施形態において、特に指定しない限り、保存的又は半保存的アミノ酸置換は、天然残基に似た化学的性質を有する非天然アミノ酸残基も包含することができる。これらの非天然残基は、一般的に生体系における合成ではなく、化学的ペプチド合成により取り込まれる。これらの例としては、限定されないが、ペプチドミメティクス及びアミノ酸部分の他の逆転又は反転配列が挙げられる。本願に記載する実施形態は、所定の実施形態では、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、及び／又はアミノ酸アナログに限定することができる。
【0030】
非保存的置換は、ある分類のメンバーを別の分類のメンバーに交換することを含むことができる。
【0031】
本願で使用する「配列一致度」なる用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）がモノマーサブユニットの同一の連続組成を有する程度を意味する。「配列類似度」なる用語は、２つのポリマー配列（例えば、ペプチド、ポリペプチド、核酸等）が保存的及び／又は半保存的アミノ酸置換のみにおいて相違する程度を意味する。「配列一致度百分率」（又は「配列類似度百分率」）は、（１）２つの配列を最適に整列させて比較枠（例えば、長いほうの配列の長さ、短いほうの配列の長さ、指定枠等）で比較し、（２）一致する（又は類似する）モノマーを含む（例えば、両方の配列に同一のアミノ酸が存在する、両方の配列に類似するアミノ酸が存在する）位置数を求め、マッチ位置数とし、（３）マッチ位置数を比較枠（例えば、長いほうの配列の長さ、短いほうの配列の長さ、指定枠）内の合計位置数で除し、（４）結果に１００を乗じて配列一致度百分率又は配列類似度百分率を得ることにより計算される。例えば、ペプチドＡ及びＢがいずれも２０アミノ酸長であり、１箇所を除く全位置のアミノ酸が同一であるならば、ペプチドＡとペプチドＢは、９５％の配列一致度を有する。一致しない位置のアミノ酸が同一の生物物理学的特徴を有していたならば（例えば、どちらも酸性であったならば）、ペプチドＡとペプチドＢは、１００％の配列類似度を有するであろう。別の例として、ペプチドＣが２０アミノ酸長であり、ペプチドＤが１５アミノ酸長であり、ペプチドＤにおける１５個のアミノ酸のうちの１４個がペプチドＣの一部のアミノ酸と同一であるならば、ペプチドＣ及びＤは、７０％の配列一致度を有するが、ペプチドＤは、ペプチドＣの最適比較枠に対して９３．３％の配列一致度を有する。本願で「配列一致度百分率」（又は「配列類似度百分率」）を計算する目的では、整列させた配列にギャップがある場合には、その位置のミスマッチとみなす。
【0032】
参照配列番号に対して特定の百分率の配列一致度又は類似度（例えば、少なくとも７０％）を有するとして本願に記載する全ポリペプチドは、前記参照配列に対して上限数の置換（又は末端欠失）を有するとして表すこともできる。例えば、配列番号Ｚ（例えば、１００アミノ酸）に対して少なくともＹ％（例えば、９０％）の配列一致度を有する配列は、配列番号Ｚに対してＸ（例えば、１０）箇所までの置換を有することができ、したがって、「配列番号Ｚに対してＸ（例えば、１０）箇所以下の置換を有する」として表すこともできる。
【0033】
本願で使用する「ナノファイバー」なる用語は、一般的に直径１００ナノメートル未満の（例えば、長さが幅又は直径よりも著しく大きい）細長形又は糸状フィラメントを意味する。
【0034】
本願で使用する「超分子」（例えば、「超分子複合体」、「超分子相互作用」、「超分子繊維」、「超分子ポリマー」等）なる用語は、分子（例えば、ポリマー、巨大分子等）間の非共有結合的相互作用と、その結果として形成される多成分集合体、複合体、システム、及び／又は繊維を意味する。
【0035】
本願で使用する「自己集合する」及び「自己集合」なる用語は、成分部分から別個の非ランダムな凝集構造が形成されることを意味し、前記集合は、成分（例えば、分子）に固有の化学的又は構造的性質と吸引力のみに起因するこれらの成分のランダムな運動により自然に生じる。
【0036】
本願で使用する「ペプチド両親媒性分子」なる用語は、最低限で疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント及び／又は荷電ペプチドセグメント（多くの場合にはその両方）を含む分子を意味する。所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド、成長因子ミメティックペプチド）を含む。所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、リンカー（例えば、Ｇ）を含む。ペプチド両親媒性分子は、生理的ｐＨで正味の正電荷又は正味の負電荷のいずれかの正味電荷を発現することができ、あるいは、両性イオン性とすることができる（即ち、正電荷と負電荷の両方をもつ）。所定のペプチド両親媒性分子は、（１）（例えば、炭素数６以上のアシル基を含む）疎水性非ペプチドセグメント、（２）構造ペプチドセグメント、（３）荷電ペプチドセグメント、及び（４）生理活性ペプチドセグメント（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド、成長因子ミメティックペプチド）から構成されるか又はこれらを含む。
【0037】
本願及び添付の特許請求の範囲で使用する、「親油性部分」又は「疎水性部分」なる用語は、ペプチド両親媒性分子の一方の末端（例えば、Ｃ末端、Ｎ末端）に配置された部分（例えば、アシル、エーテル、スルホンアミド、又はホスホジエステル部分）を意味し、本願及び他の文献で親油性又は疎水性セグメント又は成分と言う場合もある。疎水性セグメントは、水又は別の極性溶媒系において両親媒性挙動と凝集体（又はナノスフェア又はナノファイバー）形成を提供するために十分な長さを有するべきである。したがって、本願に記載する実施形態に関して、疎水性成分は、式：Ｃｎ－１Ｈ２ｎ－１Ｃ（Ｏ）－（式中、ｎ＝２～２５である。）の直鎖アシル鎖１本を含むことが好ましい。所定の実施形態において、直鎖アシル鎖は、親油基（飽和又は非飽和炭素）、パルミチン酸である。他方、アシル鎖の代わりに、ステロイド、リン脂質及びフルオロカーボン等の他の親油基を使用してもよい。
【0038】
「構造ペプチド」又は「構造ペプチドセグメント」なる用語は、本願では同義に使用され、ペプチド両親媒性分子の一部であって、一般的に疎水性セグメントと荷電ペプチドセグメントの間に配置された部分を意味する。構造ペプチドは一般に、隣接する構造ペプチドセグメントの構造ペプチドセグメントと共に水素結合又は他の安定化相互作用（例えば、疎水性相互作用、ファンデルワールス相互作用等）を形成する傾向により選択された非極性非荷電側鎖（例えば、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｐｈｅ（Ｆ））を含む３～１０アミノ酸残基から構成される。所定の実施形態において、構造ペプチドセグメントは、αヘリックス及び／又はβシート二次構造を形成する傾向を有する。所定の実施形態において、構造ペプチドセグメントを有するペプチド両親媒性分子の集合体は、顕微鏡により試験した場合に線状若しくは２Ｄ構造を示し、及び／又は円二色性（ＣＤ）測定により試験した場合にαヘリックス及び／若しくはβシート特徴を示す。
【0039】
所定の実施形態において、構造ペプチドセグメントは、αヘリックス及び／又はβシート二次構造を形成する傾向が低い。例えば、所定の実施形態において、構造ペプチドセグメントは、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下である。所定の実施形態において、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下の構造ペプチドセグメントを有するペプチド両親媒性分子の集合体は、低秩序特徴（例えば、低剛性βシートコンフォメーション等の低秩序二次構造）を示す。このようなＰＡは、内部運動の程度が比較的高く、動力学的超分子集合体を形成することができるので、有利であると思われる。所定の実施形態において、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下の構造ペプチドセグメント（例えば、Ａ２Ｇ２、ＧＧＧＧ）を有するペプチド両親媒性分子のナノファイバーは、ランダムコイル構造を形成する傾向を示す。
【0040】
本願で使用する「ベータ（β）シート形成ペプチドセグメント」なる用語は、（例えば、ＣＤにより分析した場合に）βシート様特徴を示す傾向を有する構造ペプチドセグメントを意味する。所定の実施形態において、ベータ（β）シート形成ペプチドセグメントにおけるアミノ酸は、ベータシート二次構造を形成するその傾向により選択される。２０種の天然に存在するアミノ酸から選択される適切なアミノ酸残基の例としては、（それらのベータシートを形成する傾向の順に）Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｌａ（Ａ）、及びＧｌｙ（Ｇ）が挙げられる。他方、同様のベータシート形成傾向の非天然アミノ酸を使用してもよい。ベータシートを形成するように相互作用することが可能なペプチドセグメント及び／又はベータシートを形成する傾向を有するペプチドセグメントは、公知である（例えば、その開示内容全体を本願に援用するＭａｙｏ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６），５：１３０１－１３１５参照）。
【0041】
本願で使用する「荷電ペプチドセグメント」なる用語は、ペプチド両親媒性分子の一部であって、荷電アミノ酸残基、又は生理的条件下で正味の正電荷若しくは負電荷を有するアミノ酸残基の含有率が高い部分（例えば、＞５０％、＞７５％等）を意味する。荷電ペプチドセグメントは、酸性（例えば、負荷電）、塩基性（例えば、正荷電）、又は両性イオン性（例えば、酸性残基と塩基性残基の両方を有する）とすることができる。
【0042】
本願で使用する「カルボキシリッチペプチドセグメント」、「酸性ペプチドセグメント」、及び「負荷電ペプチドセグメント」なる用語は、カルボン酸側鎖（例えば、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ａｓｐ（Ｄ）、又は非天然アミノ酸）を提示する側鎖を有する１個以上のアミノ酸残基を含むペプチド両親媒性分子のペプチド配列を意味する。カルボキシリッチペプチドセグメントは、任意に１個以上の他の（例えば、非酸性）アミノ酸残基を含むことができる。当技術分野における通常の知識を有する者に自明の通り、酸性側鎖を有する非天然アミノ酸残基、又はペプチドミメティクスを使用することもできる。このセグメントには、約２～約７アミノ酸、及び／又は約３若しくは４アミノ酸が存在することができる。
【0043】
本願で使用する「アミノリッチペプチドセグメント」、「塩基性ペプチドセグメント」、及び「正荷電ペプチドセグメント」なる用語は、正荷電酸性側鎖（例えば、Ａｒｇ（Ｒ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、又は非天然アミノ酸、又はペプチドミメティクス）を提示する側鎖を有する１個以上のアミノ酸残基を含むペプチド両親媒性分子のペプチド配列を意味する。塩基性ペプチドセグメントは、任意に１個以上の他の（例えば、非塩基性）アミノ酸残基を含むことができる。当技術分野における通常の知識を有する者に自明の通り、塩基性側鎖を有する非天然アミノ酸残基を使用することもできる。このセグメントには、約２～約７アミノ酸、及び／又は約３若しくは４アミノ酸が存在することができる。
【0044】
本願で使用する「生理活性ペプチド」なる用語は、これと会合した配列、分子、又は超分子複合体の作用を仲介するアミノ酸配列を意味する。生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）を含むペプチド両親媒性分子及び構造（例えば、ナノファイバー）は、前記生理活性ペプチドの機能を示す。所定の実施形態において、生理活性アミノ酸配列ＩＫＶＡＶ（配列番号１）を含む「生理活性ペプチド」を本願では「ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子」又は「ＩＫＶＡＶＰＡ」と言う。所定の実施形態において、「生理活性ペプチド」は、成長因子ミメティックペプチド配列を含むペプチドである。成長因子ミメティックペプチド配列を含む生理活性ペプチドを本願では「成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子」又は「成長因子ミメティックＰＡ」と言う。
【0045】
本願で使用する「生体適合性」なる用語は、細胞又は生体に非毒性の材料及び物質を意味する。所定の実施形態では、ある物質を細胞にインビトロで添加した場合に、細胞死が約１０％以下、通常では５％未満、より一般的には１％未満であるならば、その物質を「生体適合性」とみなす。
【0046】
本願でポリマー、ハイドロゲル、及び／又は創傷被覆材について使用される「生分解性」とは、生理的条件に曝露されると、分解又は他の方法で「崩壊」する組成物を意味する。所定の実施形態において、生分解性物質は、細胞機序、酵素分解、化学的プロセス、加水分解等により崩壊する。所定の実施形態において、創傷被覆材又はコーティングは、生分解性を提供する加水分解性エステル結合を含む。
【0047】
本願で使用する「生理的条件」なる用語は、組織の細胞内液又は細胞外液中で遭遇する可能性のある範囲の化学的（例えば、ｐＨ、イオン強度）及び生化学的（例えば、酵素濃度）条件を意味する。大半の組織で、生理的ｐＨは、約７．０～７．４である。
【0048】
本願で使用する「治療する」、「治療」及び「治療用」なる用語は、特定の病態又は疾患状態（例えば、ＣＮＳ損傷）を現在発症又は発病している対象において、前記病態、疾患状態、又はその症状の量若しくは重度を軽減することを意味する。この用語は、必ずしも完全な治療（例えば、病態、疾患又はその症状の完全な解消）を意味しない。「治療」は、（例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物における）疾患の治療薬又は技術の任意の投与又は適用を包含し、疾患の抑制、その発症の阻止、疾患の緩和、退縮の誘導、機能損失、喪失若しくは低下の回復若しくは修復、又は非効率的なプロセスの刺激を含む。
【0049】
本願で使用する「予防する」、「予防」及び「予防用」なる用語は、特定の病態又は疾患状態（例えば、ＣＮＳ損傷）を現在発症又は発病していない対象において、前記病態又は疾患状態が生じる確率を減らすことを意味する。この用語は、必ずしも完全又は絶対的な予防を意味しない。例えば、「ＣＮＳ損傷を予防する」とは、ＣＮＳ損傷を現在発症していないか又は診断されていない対象において、ＣＮＳ損傷が生じる確率を減らすことを意味する。「ＣＮＳ損傷を予防する」ために、組成物又は方法は、ＣＮＳ損傷の確率を減らすことだけが必要とされ、その可能性を完全に阻止する必要はない。「予防」は、（例えば、ヒトをはじめとする哺乳動物における）発症の確率を減らすための治療薬又は技術の任意の投与又は適用を包含する。このような確率は、集団又は個体について評価することができる。
【0050】
本願で使用する「併用投与」及び「併用投与する」なる用語は、少なくとも２種の薬剤又は療法（例えば、本願に記載する超分子集合体と、１種以上の治療剤）を対象に投与することを意味する。所定の実施形態において、２種以上の薬剤又は療法の併用投与は、同時である。他の実施形態では、第１の薬剤／療法を第２の薬剤／療法の前に投与する。当業者に自明の通り、使用される種々の薬剤又は療法の製剤化及び／又は投与経路は多種多様とすることができる。併用投与の適切な投与量は、当業者が容易に決定することができる。所定の実施形態において、薬剤又は療法を併用投与する場合には、夫々の薬剤又は療法を単独で投与するのに適した投与量よりも低い投与量で投与される。したがって、薬剤若しくは療法の併用投与により、潜在的に有害な（例えば、毒性の）薬剤の必要投与量が減るような実施形態、及び／又は２種以上の薬剤の併用投与の結果として、他の薬剤の併用投与により薬剤の１種の有益な効果に対する対象の感受性が高まる場合には、併用投与が特に望ましい。
【0051】
詳細な説明
本願では、ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）、ＰＡを含む組成物、ＰＡを含む超分子集合体、及びその使用方法を提供する。
本願では、ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）、ＰＡを含む組成物、ＰＡを含む超分子集合体、及びその使用方法を提供する。
【0052】
所定の態様において、本願では、ペプチド両親媒性分子を提供する。所定の実施形態において、本願に記載する実施形態のペプチド両親媒性分子及び組成物は、（所定の実施形態では、当技術分野で従来開示又は使用されていない技術（例えば、メッシュスクリーン押出）によりナノファイバーの整列を実施するが、）当業者に周知の製造技術を使用して合成され、親油性セグメントを形成するために、ペプチドのＮ末端（又はＣ末端）に標準アミノ酸の代わりに脂肪酸を付加する以外は、標準固相ペプチド合成法により合成することが好ましい。合成は一般的にＣ末端から開始し、Ｒｉｎｋアミドレジン（レジンから切断後にペプチドのＣ末端に－ＮＨ２基が得られる）、又はＷａｎｇレジン（Ｃ末端に－ＯＨ基が得られる）を使用してアミノ酸を順次付加する。したがって、本願に記載する所定の実施形態は、－Ｈ、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＣＯＮＨ２、及び－ＮＨ２から構成される群から選択することができるＣ末端部分を有するペプチド両親媒性分子を包含する。
【0053】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、ペプチドに連結された疎水性セグメント（即ち、疎水性テール）を含む。所定の実施形態において、前記ペプチドは、構造ペプチドセグメントを含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、水素結合形成セグメント、又はベータシート形成セグメントである。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、ランダムコイル構造を形成する傾向を有する（例えば、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下である）。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、秩序二次構造を形成する傾向が低いため、内部運動レベルが比較的高い。
【0054】
所定の実施形態において、前記ペプチドは、荷電セグメント（例えば、酸性セグメント、塩基性セグメント、両性イオン性セグメント等）を含む。所定の実施形態において、前記ペプチドは更に、可溶性、フレキシビリティ、セグメント間の距離等を増すためにリンカー又はスペーサーセグメントを含む。所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、疎水性セグメントとは反対側のペプチドの末端にスペーサーセグメント（例えば、ペプチド及び／又は非ペプチドスペーサー）を含む。所定の実施形態において、前記スペーサーセグメントは、ペプチド及び／又は非ペプチドエレメントを含む。所定の実施形態において、前記スペーサーセグメントは、１個以上の生理活性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオール等）を含む。所定の実施形態では、リンカーセグメント（例えば、ペプチド（例えば、ＧＧ）又は非ペプチド（例えば、アルキル、ＯＥＧ、ＰＥＧ等）リンカー）により、各種セグメントを連結することができる。
【0055】
前記親油性又は疎水性セグメントは、一般的に最後のアミノ酸カップリング後にペプチドのＮ又はＣ末端に付加され、アシル結合を介してＮ又はＣ末端アミノ酸に連結される脂肪酸又は他の酸から構成される。水溶液中で、ＰＡ分子は（例えば、円筒形ミセル（別称ナノファイバー）として）自己集合し、その中心部に親油性セグメントを埋没させ、表面に生理活性ペプチドを提示する。所定の実施形態において、前記構造ペプチドは、分子間水素結合を生じ、ミセルの長軸に平行に配向するベータシートを形成する。所定の実施形態において、前記構造ペプチドは、分子間水素結合が弱いため、ナノファイバーの内側に低剛性のベータシートコンフォメーションが得られる。
【0056】
所定の実施形態では、十分な長さ（例えば、２炭素長、３炭素長、４炭素長、５炭素長、６炭素長、７炭素長、８炭素長、９炭素長、１０炭素長、１１炭素長、１２炭素長、１３炭素長、１４炭素長、１５炭素長、１６炭素長、１７炭素長、１８炭素長、１９炭素長、２０炭素長、２１炭素長、２２炭素長、２３炭素長、２４炭素長、２５炭素長、２６炭素長、２７炭素長、２８炭素長、２９炭素長、３０炭素長以上、又はその間の任意範囲）の疎水性（例えば、炭化水素及び／若しくはアルキル／アルケニル／アルキニルテール、又はコレステロール等のステロイド）セグメントがペプチドセグメント（例えば、ペプチド、構造ペプチドセグメント及び荷電ペプチドセグメント）と共有結合し、ペプチド両親媒性分子となる。所定の実施形態では、複数のこのようなＰＡが水（又は水溶液）中で自己集合し、ナノ構造（例えば、ナノファイバー）となる。種々の実施形態では、ペプチドセグメントと疎水性セグメントの相対長の結果として、種々のＰＡ分子形状とナノ構造アーキテクチャが得られる。例えば、ペプチドセグメントの幅が広く、疎水性セグメントの幅が狭いと、一般に円錐形分子形状となり、ＰＡの集合体に影響を与える（例えば、その開示内容全体を本願に援用するＪ．Ｎ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｆｏｒｃｅｓ；２ｎｄ ｅｄ．；Ａｃａｄｅｍｉｃ：Ｌｏｎｄｏｎ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９２参照）。他の分子形状も、集合体及びナノ構造アーキテクチャに同様の影響を与える。
【0057】
所定の実施形態では、ペプチド両親媒性分子の水溶液の自己集合を誘導するために、溶液のｐＨを変化（増減）させてもよいし、カルシウム等の多価イオンや、荷電ポリマー又は他の巨大分子を溶液に添加してもよい。
【0058】
所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、非ペプチドセグメント（例えば、アルキル／アルケニル／アルキニル基）である。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数４～２５（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５）の（例えば、飽和）アルキル鎖、フッ素化セグメント、フッ素化アルキルテール、複素環、芳香族セグメント、π共役セグメント、シクロアルキル、オリゴチオフェン等を含む。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数２～３０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０）の（例えば、飽和）アシル／エーテル鎖を含む。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む。所定の実施形態において、前記疎水性セグメントは、炭素数１６のアルキル鎖（Ｃ１６）を含む。
【0059】
所定の実施形態において、ＰＡは、１個以上のペプチドセグメントを含む。ペプチドセグメントは、天然アミノ酸、修飾アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸アナログ、ペプチドミメティクス、又はその組み合わせを含むことができる。所定の実施形態において、ペプチドセグメントは、本願に記載するペプチド配列の１種以上に対して少なくとも５０％の（例えば、保存的又は半保存的な）配列一致度又は類似度を含む。
【0060】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、荷電ペプチドセグメントを含む。前記荷電セグメントは、酸性、塩基性、又は両性イオン性とすることができる。
【0061】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、酸性ペプチドセグメントを含む。例えば、所定の実施形態において、前記酸性ペプチドは、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又はそれ以上）の酸性残基（Ｄ及び／又はＥ）を配列に含む。所定の実施形態において、前記酸性ペプチドセグメントは、７残基長までを含み、少なくとも５０％の酸性残基を含む。所定の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘａ）１－７を含み、式中、各Ｘａは、独立してＤ又はＥである。所定の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ２－４を含む。例えば、所定の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ２を含む。所定の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ３を含む。他の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、Ｅ４を含む。
【0062】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、塩基性ペプチドセグメントを含む。例えば、所定の実施形態において、前記酸性ペプチドは、１個以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個又はそれ以上）の塩基性残基（Ｒ、Ｈ、及び／又はＫ）を配列に含む。所定の実施形態において、前記塩基性ペプチドセグメントは、７残基長までを含み、少なくとも５０％の塩基性残基を含む。所定の実施形態において、酸性ペプチドセグメントは、（Ｘｂ）１－７を含み、式中、各Ｘｂは、独立してＲ、Ｈ、及び／又はＫである。
【0063】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、構造ペプチドセグメントを含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、ベータシート形成セグメントである。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、水素結合が弱く、二次構造をもたない。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、水素結合が弱く、剛性ベータシートコンフォメーションよりもランダムコイル構造を形成する傾向を有する。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｇ、及びＡ残基の１種以上の含有率が高い。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、アラニン及びバリンリッチペプチドセグメント（例えば、Ｖ２Ａ２、Ｖ３Ａ３、Ａ２Ｖ２、Ａ３Ｖ３、又はＶ残基とＡ残基の他の組み合わせ等）を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、４個以上の連続するＡ及び／若しくはＶ残基、又はその保存的若しくは半保存的置換を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ｖ２Ａ２を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、アラニン及びグリシンリッチペプチドセグメント（例えば、Ａ２Ｇ２、Ａ３Ｇ３、又はＡ残基とＧ残基の他の組み合わせ等）を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ａ２Ｇ２を含む。所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、グリシンリッチペプチドセグメントを含む。例えば、所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、Ｇ３又はＧ４を含む。
【0064】
所定の実施形態において、前記構造ペプチドセグメントは、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下（例えば、４未満、３．９未満、３．８未満、３．７未満、３．６未満、３．５未満、３．４未満、３．３未満、３．２未満、３．１未満、３．０未満、２．９未満、２．８未満、２．７未満、２．６未満、２．５未満、２．４未満、２．３未満、２．２未満、２．１未満、２．０未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、又は１未満）である。
【0065】
βシートコンフォメーションを形成する総傾向は、構造ペプチドセグメント中の各アミノ酸のβシートコンフォメーション形成傾向の総和として計算することができる。各アミノ酸のβシートコンフォメーション形成傾向と、その計算方法は、例えば、Ｆｕｊｉｗａｒａ，Ｋ．，Ｔｏｄａ，Ｈ．＆ Ｉｋｅｇｕｃｈｉ，Ｍ．Ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｅ ｏｆ α－ｈｅｌｉｃａｌ ａｎｄ β－ｓｈｅｅｔ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌｌ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄ ｔｙｐｅ．ＢＭＣ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １２，１８（２０１２）に記載されており、その開示内容全体を本願に援用する。典型的な数値を下表１に示す。構造ペプチドセグメントのβシートコンフォメーションを形成する総傾向を計算するためには、表１の各アミノ酸の「総残基数」の列に示す数値を総和する。例えば、Ａ２Ｇ２構造ペプチドセグメントの場合、βシートコンフォメーションを形成する総傾向は、０．７５＋０．７５＋０．６７＋０．６７＝２．８４である。構造ペプチドセグメントは、βシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下となるように、任意の適切な数及び組み合わせのアミノ酸を含むことができる。
【0066】
【表1】
【0067】
所定の実施形態において、構造ペプチドセグメントのβシートコンフォメーションを形成する総傾向が４以下であるならば、前記構造ペプチドセグメント内のアミノ酸は、隣接分子との相互作用が弱いと判断される。例えば、前記構造ペプチドセグメントは、弱い水素結合能を示すことができる。したがって、このような構造ペプチドセグメントと、このようなセグメントを含むペプチド両親媒性分子は、より動力学的な超分子集合体を形成することができる。例えば、Ａ２Ｇ２構造ペプチドセグメントは、剛性ベータシートコンフォメーションではなく、ランダムコイル構造を示すことができる。
【0068】
所定の実施形態において、生理活性ペプチド両親媒性分子（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子）は、蛍光異方性値が比較的低い。異方性は、下式を使用して計算される。
【0069】
【数1】
【0070】
所定の実施形態において、前記生理活性ペプチド両親媒性分子（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子）は、蛍光異方性値が０．３未満（例えば、０．３未満、０．２９未満、０．２５未満、０．２４未満、０．２３未満、０．２２未満、０．２１未満、又は０．２未満）である。
【0071】
所定の実施形態において、前記生理活性ペプチド両親媒性分子（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子）は、プロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）が比較的低い。プロトン緩和速度が低いほど、運動性が高いことを意味し、内部運動度の高い動力学的超分子集合体を形成し易くなる。例えば、ＩＫＶＡＶ配列中のＫ残基のｅ炭素に結合したメチレンプロトンの緩和速度は、横緩和核磁気共鳴（Ｔ２－ＮＭＲ）スペクトロスコピーにより測定することができる。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、プロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）が４ｓ－１未満である。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、プロトン緩和速度（１Ｈ－Ｒ２）が３ｓ－１未満である。
【0072】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、非ペプチドスペーサー又はリンカーセグメントを含む。所定の実施形態において、前記非ペプチドスペーサー又はリンカーセグメントは、疎水性セグメントと反対側のペプチドの末端に配置される。所定の実施形態において、前記スペーサー又はリンカーセグメントは、生理活性基の連結部位を提供する。所定の実施形態において、前記スペーサー又はリンカーセグメントは、ＰＡの官能基化のための反応性基（例えば、アルケン、アルキン、アジド、チオール、マレイミド等）を提供する。所定の実施形態において、前記スペーサー又はリンカーは、ＣＨ２、Ｏ、（ＣＨ２）２Ｏ、Ｏ（ＣＨ２）２、ＮＨ、及びＣ＝Ｏ基の実質的に線状鎖（例えば、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨ、ＣＨ２（Ｏ（ＣＨ２）２）２ＮＨＣＯ（ＣＨ２）２ＣＣＨ等）である。所定の実施形態において、スペーサー又はリンカーは更に、他の生理活性基、置換基、分岐等を含む。所定の実施形態において、前記リンカーセグメントは、単一グリシン（Ｇ）残基である。
【0073】
本願に記載する材料で使用するのに適したペプチド両親媒性分子と、ＰＡ及び関連材料の作製方法、ＰＡで使用するためのアミノ酸配列、並びにＰＡと共に利用される材料は、以下の特許、即ち、米国特許第９，０４４，５１４号、米国特許第９，０４０，６２６号、米国特許第９，０１１，９１４号、米国特許第８，７７２，２２８号、米国特許第８，７４８，５６９号、米国特許第８，５８０，９２３号、米国特許第８，５４６，３３８号、米国特許第８，５１２，６９３号、米国特許第８，４５０，２７１号、米国特許第８，２３６，８００号、米国特許第８，１３８，１４０号、米国特許第８，１２４，５８３号、米国特許第８，１１４，８３５号、米国特許第８，１１４，８３４号、米国特許第８，０８０，２６２号、米国特許第８，０７６，２９５号、米国特許第８，０６３，０１４号、米国特許第７，８５１，４４５号、米国特許第７，８３８，４９１号、米国特許第７，７４５，７０８号、米国特許第７，６８３，０２５号、米国特許第７，５５４，０２１号、米国特許第７，５４４，６６１号、米国特許第７，５３４，７６１号、米国特許第７，４９１，６９０号、米国特許第７，４５２，６７９号、米国特許第７，３７１，７１９号、米国特許第７，０３０，１６７に記載されており、いずれもその開示内容全体を本願に援用する。
【0074】
ＰＡ超分子構造の特性（例えば、形状、剛性、親水性等）は、ペプチド両親媒性分子の成分の種類（例えば、親油性セグメント、酸性セグメント、構造ペプチドセグメント、生理活性セグメント等）によって異なる。例えば、ＰＡ成分部分の種類を調整することにより、ナノファイバー、ナノスフェア、中間形状、及び他の超分子構造が達成される。所定の実施形態では、集合後操作（例えば、加熱／冷却、延伸等）により、ＰＡの超分子ナノ構造の特性を変化させる。
【0075】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、（ａ）炭素数８～２４のアルキル鎖を含む疎水性テールと、（ｂ）（例えば、Ａ２Ｇ２又はＧ４を含む）構造ペプチドセグメントと、（ｃ）（例えば、Ｅ２－Ｅ４を含む）荷電セグメントを含む。所定の実施形態では、本願に記載する範囲内の任意のＰＡであって、本願に記載する成分を含むもの、又は当業者に想到される範囲内の任意のＰＡを本願で利用できる。
【0076】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、生理活性部分（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）を含む。特定の実施形態において、生理活性部分は、ＰＡのＣ末端又はＮ末端の最末端セグメントである。所定の実施形態において、前記生理活性部分は、前記荷電セグメントの末端に連結されている。所定の実施形態において、前記生理活性部分は、集合したＰＡ構造（例えば、ナノファイバー）の表面に露出されている。生理活性部分は、一般的にペプチドであるが、これに限定されない。
【0077】
所定の実施形態において、前記生理活性部分は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）で同定されるペプチドである。例えば、前記生理活性部分は、コラーゲン、エラスチン、フィブロネクチン、又はラミニンに存在するペプチド配列とすることができる。所定の実施形態において、前記生理活性部分は、ラミニンに存在するペプチド配列である。例えば、前記生理活性部分は、ラミニン－１、ラミニン－２、ラミニン－３、ラミニン－４、ラミニン－５、ラミニン－６、ラミニン－７、ラミニン－８、ラミニン－９、ラミニン－１０、ラミニン－１１、ラミニン－１２、ラミニン－１３、ラミニン－１４、又はラミニン－１５に存在することができる。所定の実施形態において、前記生理活性部分は、ラミニン－１に存在するペプチド配列である。特定の実施形態において、前記生理活性部分は、ペプチド配列ＩＫＶＡＶ（配列番号１）である。所定の実施形態において、前記生理活性部分は、組換えペプチドである。所定の実施形態において、生理活性部分は、着目ペプチド又はポリペプチド（例えば、ＥＣＭタンパク質）と結合するペプチド配列である。
【0078】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に向かって又はＮ末端からＣ末端に向かって）生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）と、（例えば、Ｅ２－４等を含む）荷電セグメントと、（例えば、Ａ２Ｇ２、Ｇ４を含む）構造ペプチドセグメントと、（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含む）疎水性テールを含む。
【0079】
所定の実施形態において、ペプチド両親媒性分子は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に向かって又はＮ末端からＣ末端に向かって）生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド）と、（例えば、Ｇ等を含む）フレキシブルリンカーと、（例えば、Ｅ２－４等を含む）荷電セグメントと、（例えば、Ａ２Ｇ２、Ｇ４を含む）構造ペプチドセグメントと、（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含む）疎水性テールを含む。
【0080】
所定の実施形態において、本願では、前記生理活性ペプチドとしてＩＫＶＡＶを含む生理活性ＰＡ（本願では「ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子」とも言う）を提供する。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に向かって又はＮ末端からＣ末端に向かって）ＩＫＶＡＶと、（例えば、Ｅ２－４を含む）荷電セグメントと、（例えば、Ａ２Ｇ２、Ｇ４を含む）構造ペプチドセグメントと、（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含む）疎水性テールを含む。所定の実施形態において、前記ペプチド両親媒性分子は、更にリンカーを含む。例えば、所定の実施形態において、前記ペプチド両親媒性分子は、前記生理活性ペプチド（例えば、ＩＫＶＡＶ）を前記荷電ペプチドセグメントと連結する単一グリシン残基を含む。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｇ４Ｅ４ＧＩＫＶＡＶを含む。
【0081】
所定の実施形態において、前記生理活性部分は、成長因子ミメティックペプチドである。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチドは、成長因子ミメティック配列を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）ミメティック配列、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティック配列、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）ミメティック配列、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）ミメティック配列、又はネトリン１ミメティック配列である。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティック配列は、ＦＧＦ２ミメティック配列である。所定の実施形態において、前記ＦＧＦ２ミメティック配列は、ＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）を含む。
【0082】
所定の実施形態において、本願では、前記生理活性ペプチドとして成長因子ミメティック配列を含む生理活性ＰＡを提供する。このようなペプチド両親媒性分子を本願では「成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子」と言う。
【0083】
所定の実施形態において、本願では、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に向かって又はＮ末端からＣ末端に向かって）成長因子ミメティックペプチド配列と、（例えば、Ｅ２－４等を含む）荷電セグメントと、（例えば、Ａ２Ｇ２、Ｖ２Ａ２を含む）構造ペプチドセグメントと、（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含む）疎水性テールを含む成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を提供する。所定の実施形態において、前記ペプチド両親媒性分子は、更にリンカーを含む。例えば、所定の実施形態において、前記ペプチド両親媒性分子は、前記成長因子ミメティックペプチド配列を前記荷電ペプチドセグメントと連結する単一グリシン残基を含む。
【0084】
所定の実施形態において、本願では、（例えば、Ｃ末端からＮ末端に向かって又はＮ末端からＣ末端に向かって）成長因子ミメティックペプチド配列と、（例えば、Ｇ等を含む）フレキシブルリンカーと、（例えば、Ｅ２－４等を含む）荷電セグメントと、（例えば、Ａ２Ｇ２、Ｖ２Ａ２を含む）構造ペプチドセグメントと、（例えば、炭素数８～２４のアルキル鎖を含む）疎水性テールを含む成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を提供する。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、Ｃ１６Ｖ２Ａ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ又はＣ１６Ａ２Ｇ２Ｅ４ＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲを含む。
【0085】
所定の実施形態において、ＰＡは、更に前記疎水性テールを前記ＰＡのペプチド部分と連結するための結合セグメント又は残基（例えば、Ｇ）を含む。
【0086】
所定の実施形態において、本願では、少なくとも２種の本願に記載するようなペプチド両親媒性分子を含む組成物を提供する。所定の実施形態において、本願では、少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む組成物を提供する。所定の実施形態において、本願では、疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを含む生理活性ペプチドを含む少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む組成物を提供する。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、ＡＡＧＧを含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ４を含む荷電ペプチドセグメントと、リンカー（例えば、Ｇ）と、ＩＫＶＡＶペプチド配列を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、Ｖ２Ａ２又はＡ２Ｇ２を含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４を含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む。所定の実施形態において、前記少なくとも１種のＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と前記少なくとも１種の成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は相互作用し、前記組成物内に超分子集合体を形成する。
【0087】
所定の実施形態において、本願では、少なくとも２種の本願に記載するペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、超分子集合体は、ナノファイバーである。所定の実施形態において、本願では、少なくとも２種の本願に記載するような生理活性ペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、本願では、ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、本願では、疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、荷電ペプチドセグメント、及びアミノ酸配列ＩＫＶＡＶを含む生理活性ペプチドを含むＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子と、成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子を含む超分子集合体を提供する。所定の実施形態において、前記ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、ＡＡＧＧを含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ４を含む荷電ペプチドセグメントと、リンカー（例えば、Ｇ）と、ＩＫＶＡＶペプチド配列を含む。所定の実施形態において、前記成長因子ミメティックペプチド両親媒性分子は、炭素数８～２４のアルキル鎖（Ｃ８－２４）を含む疎水性セグメントと、Ｖ２Ａ２又はＡ２Ｇ２を含む構造ペプチドセグメントと、Ｅ２、Ｅ３又はＥ４を含む荷電ペプチドセグメントと、成長因子ミメティックペプチド配列を含む。
【0088】
所定の実施形態では、生理活性部分（例えば、ＩＫＶＡＶペプチド両親媒性分子）を含む第１の型のＰＡと、成長因子ミメティックＰＡから超分子集合体（例えば、ナノファイバー等のナノ構造）を集合させる。所定の実施形態において、本願に記載する組成物又は超分子集合体（例えば、ナノファイバー等のナノ構造）は、ＩＫＶＡＶＰＡと成長因子ミメティックＰＡのモル比が約９０：１０である。所定の実施形態において、ＩＫＶＡＶＰＡ：成長因子ミメティックＰＡのモル比は、約９９：１、約９８：２、約９７：３、約９６：４、約９５：５、約９４：６、約９３：７、約９２：８、約９１：９、約９０：１０、約８９：１１、約８８：１２、約８７：１３、約８６：１４、又は約８５：１５である。所定の実施形態において、ＩＫＶＡＶＰＡと成長因子ミメティックの比は、ナノファイバー材料の機械的特性（例えば、液体又はゲル）と、前記材料がどのような条件下で種々の特性を帯びるか（例えば、生理的条件に曝露するとゲル化する、生理的条件に曝露すると液化する等）を決定する。
【0089】
所定の実施形態において、本願に記載する組成物及び超分子集合体は、更に１種以上の充填剤ＰＡを含む。「充填剤ＰＡ」又は「希釈剤ＰＡ」なる用語は、本願では同義に使用され、本願に記載するような疎水性セグメント、構造ペプチドセグメント、及び荷電ペプチドセグメントを含むが、生理活性部分を含まない（例えば、前記ＩＫＶＡＶペプチド配列を含まない、前記成長因子ミメティックペプチド配列を含まない等）ＰＡを意味する。所定の実施形態において、充填剤ＰＡは、分子の末端（例えば、表面に提示される末端）に高度に荷電したグルタミン酸残基を有する非生理活性ＰＡ分子である。これらの負荷電ＰＡは、イオン架橋によりナノファイバー間にゲル化を生じさせることができる。所定の実施形態において、充填剤ＰＡは、分子の末端（例えば、表面に提示される末端）に高度に荷電したリジン残基を有する非生理活性ＰＡ分子である。これらの正荷電ＰＡは、塩基性条件下でゲル化を生じさせることができる。充填剤ＰＡは、ナノファイバー溶液のゲル化能を維持しながら、他の生理活性ＰＡ分子をナノファイバーマトリックスに組込むことを可能にする。所定の実施形態では、前記溶液をアニールして粘度を増加させると共にゲル力学を強化する。これらの充填剤ＰＡは、例えば、その開示内容全体を本願に援用する米国特許第８，７７２，２２８号に記載されている配列（例えば、Ｃ１６－ＶＶＶＡＡＡＥＥＥ）を有する。
【0090】
所定の実施形態において、本願に記載するＰＡナノファイバーは、断面径が小さい（例えば、＜２５ｎｍ、＜２０ｎｍ、＜１５ｎｍ、約１０ｎｍ等）。所定の実施形態では、ナノファイバーの断面径が小さいため（直径約１０ｎｍ）、ナノファイバーを脳実質に侵入させることができる。
【0091】
所定の実施形態において、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、対象における神経系損傷の治療又は予防に利用される。所定の実施形態において、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体（例えば、ナノファイバー）は、対象における神経系損傷の治療方法に使用することができる。例えば、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、脳と脊髄を含む中枢神経系（ＣＮＳ）、又は脳と脊髄の外側の神経及び神経節を含む末梢神経系（ＰＮＳ）の損傷の治療又は予防方法で使用することができる。所定の実施形態において、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、対象におけるＣＮＳ又はＰＮＳの損傷の治療又は予防に使用することができる。所定の実施形態において、前記損傷は、脊髄損傷である。前記脊髄損傷は、頸椎、腰椎、胸椎、仙椎又は任意のその組み合わせとすることができる。
【0092】
前記損傷は、外傷性損傷とすることができる。外傷性損傷とは、外傷（例えば、自動車事故、転倒、暴力、スポーツ損傷、外科損傷等に起因するもの等の外傷）に起因する損傷を意味する。例えば、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、外傷性脊髄損傷の治療に使用することができる。別の例として、本願に記載するＰＡ、組成物、及び超分子集合体は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の治療に使用することができる。あるいは、前記損傷は、非外傷性損傷でもよい。例えば、前記損傷は、例えば、がん、多発性硬化症、炎症、関節炎、脊柱管狭窄症、腫瘍、失血等に起因するＣＮＳ（例えば、脳及び／又は脊髄）又はＰＮＳの非外傷性損傷とすることができる。
【0093】
所定の実施形態では、外傷性脊髄損傷を有する疑いのある対象に、本願に記載するようなＰＡ及び／又は超分子集合体（例えば、ナノファイバー）を含む組成物を提供する。例えば、１箇所以上の身体領域（例えば、手、腕、脚、足等）における感覚消失及び／若しくは運動制御不能、低血圧、血圧調節不能、体温調節不能、損傷領域よりも下位の発汗不能、慢性痛、並びに／又は脊髄浮腫を含む１種以上の症状を示す対象に前記組成物を提供することができる。前記損傷を治療するために前記組成物を前記対象に提供することができる。所定の実施形態において、前記損傷の治療は、前記損傷に関連する１種以上の症状の悪化を予防することができる。所定の実施形態において、前記損傷の治療は、前記損傷の重度を軽減すること、及び／又は前記損傷に関連する１種以上の症状を解消することができる。所定の実施形態において、前記組成物は、血管新生、神経再生、機能回復を促進するため、及び／又は脊髄損傷後の障害を制限するために使用される。
【0094】
前記組成物は、損傷（例えば、外傷性脊髄損傷）後の任意の適切な時点で前記損傷を治療するために対象に提供することができる。例えば、前記組成物は、前記損傷から２４時間以内（例えば、損傷から２４時間以内、１２時間以内、１０時間以内、９時間以内、８時間以内、７時間以内、６時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、２時間以内、又は１時間以内）に前記対象に提供することができる。所定の実施形態において、前記組成物は、損傷又は損傷の診断後２４時間超の時間が経過した後に前記対象に提供することができる。
【0095】
前記組成物は、対象の年齢、対象の体重、損傷の重度等を含む因子に応じて任意の適切な量を投与することができる。前記組成物は、損傷に適した他の治療又は損傷の重度の悪化を予防するための予防手段と併用して投与することができる。
【0096】
所定の実施形態において、本願に記載する組成物は、対象に送達するように製剤化される。本願に記載する組成物の適切な投与経路としては、限定されないが、局所、皮下、経皮、皮内、病巣内、関節内、腹腔内、膀胱内、経粘膜、歯肉、歯内、蝸牛内、経鼓膜、臓器内、硬膜外、髄腔内、筋肉内、静脈内、血管内、骨内、眼球周囲、腫瘍内、及び脳室内投与が挙げられる。所定の実施形態において、前記ＰＡ組成物は、非経口投与される。所定の実施形態において、非経口投与は、髄腔内投与、脳室内投与、又は実質内投与により実施される。本願に記載するＰＡ組成物は、単独活性剤として投与することもできるし、対象における神経系損傷の治療に使用される他の薬剤等の他の医薬品と併用投与することもできる。
【実施例】
【0097】
［実施例１］生理活性足場における超分子運動は、脊髄損傷からの回復を促進する。
【0098】
概要：本実施例では、２種の異なるシグナルを含むペプチド両親媒性分子の超分子ポリマーについて記載する。これらの超分子ポリマーを重症脊髄損傷のマウスモデルで試験した。第１のシグナルは、膜貫通型受容体ｂ１インテグリンを活性化させ、第２のシグナルは、塩基性線維芽細胞増殖因子２受容体を活性化させる。非生理活性ドメインにおける両親媒性モノマーのペプチド配列を突然変異させることにより、足場フィブリル内の分子の運動を活発にし、血管成長、軸索再生、ミエリン化、運動ニューロンの生存、神経膠症の抑制、及び機能回復に顕著な変化を生じた。したがって、分子の内部運動を調整することにより、前記分子の集合による細胞のシグナル伝達を最適化することができる。
【0099】
緒言：
細胞の薬理的シグナル伝達は、通常では特定の応答を活性化又は抑制するタンパク質と有機低分子の強い結合により進行する。治療用カーゴを送達するために特定の細胞を標的とするナノ構造や、細胞外スペースで生理活性足場として機能する材料を使用する方法が、シグナル伝達ストラテジーとして台頭しつつある。受容体のシグナルを担持する材料の分子デザインと、このようなシグナルと人工足場内の分子の運動の関係は、この分野で開発が進んでいない領域である。本実施例では、神経幹細胞からニューロンへの分化を促進して軸索を伸長させるラミニンシグナルＩＫＶＡＶと、受容体ＦＧＦＲ１を活性化させ、細胞増殖及び生存を促進する線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティックペプチドＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）との２種類の異なる直交性の生物学的シグナルを統合するナノスケールフィブリルの超分子足場について記載する。水性媒体中で非共有結合的に共重合して超分子フィブリルを形成するアルキルテールを有する２種類の異なるペプチド（ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）と呼ぶ）の末端にこれらの２種類のシグナルを配置した。本実施例では、重度脊髄損傷（ＳＣＩ）のマウスモデルにおける後肢麻痺後に機能回復をインビボで復元するために潜在的足場療法の物理的性質を改変する種々のドメインについて調査した。損傷した軸索は、成人中枢神経系（ＣＮＳ）で再生することができないため、外傷性損傷後のヒトにおける永久麻痺を回避するＳＣＩ療法の開発は、依然として大きな課題である。本実施例では、両方の生物学的シグナルを同一密度に維持しながら、これらのドメインのテトラペプチド配列を僅かに突然変異させると、インビトロで細胞の生物学的応答と、インビボでマウスにおけるＳＣＩからの機能回復を劇的に変えられることが発見された。
細胞の薬理的シグナル伝達は、通常では特定の応答を活性化又は抑制するタンパク質と有機低分子の強い結合により進行する。治療用カーゴを送達するために特定の細胞を標的とするナノ構造や、細胞外スペースで生理活性足場として機能する材料を使用する方法が、シグナル伝達ストラテジーとして台頭しつつある。受容体のシグナルを担持する材料の分子デザインと、このようなシグナルと人工足場内の分子の運動の関係は、この分野で開発が進んでいない領域である。本実施例では、神経幹細胞からニューロンへの分化を促進して軸索を伸長させるラミニンシグナルＩＫＶＡＶと、受容体ＦＧＦＲ１を活性化させ、細胞増殖及び生存を促進する線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）ミメティックペプチドＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ（配列番号２）との２種類の異なる直交性の生物学的シグナルを統合するナノスケールフィブリルの超分子足場について記載する。水性媒体中で非共有結合的に共重合して超分子フィブリルを形成するアルキルテールを有する２種類の異なるペプチド（ペプチド両親媒性分子（ＰＡ）と呼ぶ）の末端にこれらの２種類のシグナルを配置した。本実施例では、重度脊髄損傷（ＳＣＩ）のマウスモデルにおける後肢麻痺後に機能回復をインビボで復元するために潜在的足場療法の物理的性質を改変する種々のドメインについて調査した。損傷した軸索は、成人中枢神経系（ＣＮＳ）で再生することができないため、外傷性損傷後のヒトにおける永久麻痺を回避するＳＣＩ療法の開発は、依然として大きな課題である。本実施例では、両方の生物学的シグナルを同一密度に維持しながら、これらのドメインのテトラペプチド配列を僅かに突然変異させると、インビトロで細胞の生物学的応答と、インビボでマウスにおけるＳＣＩからの機能回復を劇的に変えられることが発見された。
【0100】
結果：
夫々同一の２種のシグナルを提示する種々の物理的性質を有するナノファイバー形超分子ポリマーを調査するために、物理的挙動を制御するテトラペプチドドメインをアミノ酸Ｖ、Ａ及びＧの種々の配列とした種々のＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１～ＰＡ８）のライブラリーを合成した（使用したＰＡとそれらのペプチド配列の一覧については、図１Ａ、図７、及び表１参照）。フィブリル内の分子がそれらの水素結合密度の結果として分子間凝集力の高いβシートを形成する傾向に影響を与えるという点に鑑み、これらのアミノ酸を選択した。これらの相互作用の結果、フィブリル内のＰＡ分子の運動性が抑制される。例えば、Ｖ２Ａ２（ＰＡ１）は、そのバリン含量によりβシート構造を形成する傾向が高いが、Ａ２Ｇ２（ＰＡ２）は、潜在的に低秩序セグメントであり、二次構造を形成しない（図１Ａ参照）。その他の配列は、中間レベルの運動の潜在的候補として選択した。全ＩＫＶＡＶＰＡは、このセグメントと生理活性シグナルの間に高い水溶性を提供する配列Ｅ４Ｇを利用した。
夫々同一の２種のシグナルを提示する種々の物理的性質を有するナノファイバー形超分子ポリマーを調査するために、物理的挙動を制御するテトラペプチドドメインをアミノ酸Ｖ、Ａ及びＧの種々の配列とした種々のＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１～ＰＡ８）のライブラリーを合成した（使用したＰＡとそれらのペプチド配列の一覧については、図１Ａ、図７、及び表１参照）。フィブリル内の分子がそれらの水素結合密度の結果として分子間凝集力の高いβシートを形成する傾向に影響を与えるという点に鑑み、これらのアミノ酸を選択した。これらの相互作用の結果、フィブリル内のＰＡ分子の運動性が抑制される。例えば、Ｖ２Ａ２（ＰＡ１）は、そのバリン含量によりβシート構造を形成する傾向が高いが、Ａ２Ｇ２（ＰＡ２）は、潜在的に低秩序セグメントであり、二次構造を形成しない（図１Ａ参照）。その他の配列は、中間レベルの運動の潜在的候補として選択した。全ＩＫＶＡＶＰＡは、このセグメントと生理活性シグナルの間に高い水溶性を提供する配列Ｅ４Ｇを利用した。
【0101】
【表2】
【0102】
クライオ透過型電子顕微鏡法（クライオＴＥＭ）の結果、全ＩＫＶＡＶＰＡは、水中で超分子重合後にナノファイバーを形成することが分かった（図１Ｂ）。更に、シンクロトロンＸ線溶液小角散乱（ＳＡＸＳ）法によると、フィラメントと球形ミセルの混合物を示唆するＰＡ５（傾き＝－０．２）を除き、ギニエ領域の傾きは、－１～－１．７の範囲であり、フィラメントの形成が確認された（図１Ｄ）。ＭＡＲＴＩＮＩ力場（１３）を使用する粗視化分子動力学（ＣＧ－ＭＤ）シミュレーションにより、ライブラリーの各種集合体の物理的挙動を比較した（図８）。これらのシミュレーションによると、各種ＩＫＶＡＶＰＡ繊維内の分子は、内部動力学の程度が異なると予想された（図１Ｂ）。シミュレーションの最後の５ｍｓ間のＰＡ分子の平均変位の尺度である根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）として定義されるパラメーターの数値をシミュレーションにより求めた処、分子が（ナノメートルのオーダーの）十分な距離にわたって内部で位置を変える能力には差があることが示唆された（図１Ｃ）。これらのシミュレーションによると、ＰＡ２繊維中の分子は実際に、Ｇ残基のみを含むＰＡ５と同様に内部運動度が高いと判断される。広角Ｘ線分析（ＷＡＸＳ）からも、ＲＭＳＦ値の低いもの（ＰＡ２及びＰＡ５）を除く全ＩＫＶＡＶＰＡに内部秩序（ｄ格子面間隔４．６５Åのβシートブラッグピーク）が存在することが分かった（図１Ｅ）。
【0103】
各種ＩＫＶＡＶＰＡ間の動力学の差を精査するために、１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）をＰＡナノファイバー内に封入して内部疎水性コアのミクロ粘度を測定することにより、蛍光偏光解消度（ＦＤ）を測定した。ＰＡ２とＰＡ５は異方性値が最低であり（夫々０．２１及び０．１８）、最も動力学的な超分子集合体を形成したと判断され、ＰＡ４は、動力学性が中間であり（０．３０）、その他のＰＡは、超分子運動性が低かった（０．４０～０．３７）（図２Ａ）。横緩和核磁気共鳴（Ｔ２－ＮＭＲ）スペクトロスコピーを使用してＩＫＶＡＶエピトープにおける分子動力学も測定した。これらの実験では、（２．６９～２．９９百万分率で観測される）ＩＫＶＡＶ配列中のＫ残基のｅ炭素に結合したメチレンプロトンの緩和速度（Ｈε）を測定した。ＩＫＶＡＶＰＡ１は、最高の緩和速度（低運動度）を示し、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びＰＡ５は、ＩＫＶＡＶＰＡライブラリーのうちで緩和速度が最低であり（夫々１Ｈ－Ｒ２＝２．７±０．１及び２．６±０．００３ｓ－１）、より高い運動度に一致した（図２Ｂ及び表２）。ＦＤ結果に一致し、ＩＫＶＡＶＰＡ４は、ＰＡ１とＰＡ２（又はＰＡ５）の中間レベルの超分子運動を示す。総合すると、シミュレーションと、ＦＤ、ＷＡＸＳ及びＴ２－ＮＭＲ測定は、調査した分子のライブラリーにおける３レベルの超分子運動に一致する。
【0104】
【表3】
【0105】
超分子運動及びインビトロ生理活性
ＩＫＶＡＶシグナルがＩＫＶＡＶＰＡのライブラリーにおいて同等に生理活性であるか否かを調べるためにインビトロ実験を実施した。ＩＫＶＡＶＰＡの生理活性を立証するために、ヒト胚性幹細胞に由来する神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）を溶液中の各種ＩＫＶＡＶＰＡ繊維又は組換えタンパク質ラミニンで処理した（図２Ｃ）。ＰＡフィラメントは、細胞と密接に会合し、それらの表面がシグナルを提示すると、受容体を活性化させることができる。
ＩＫＶＡＶシグナルがＩＫＶＡＶＰＡのライブラリーにおいて同等に生理活性であるか否かを調べるためにインビトロ実験を実施した。ＩＫＶＡＶＰＡの生理活性を立証するために、ヒト胚性幹細胞に由来する神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）を溶液中の各種ＩＫＶＡＶＰＡ繊維又は組換えタンパク質ラミニンで処理した（図２Ｃ）。ＰＡフィラメントは、細胞と密接に会合し、それらの表面がシグナルを提示すると、受容体を活性化させることができる。
【0106】
活性形特異抗体ＨＵＴＳ４を使用して各種ＩＫＶＡＶＰＡとラミニンの存在下で発現される膜貫通型受容体β１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の活性化を評価した。受容体の細胞内シグナル伝達経路の活性化も検証した。蛍光共焦点顕微鏡法とウェスタンブロット（ＷＢ）分析の結果、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びＰＡ５は、その他のＩＫＶＡＶＰＡ、ＩＫＶＡＶペプチド、及び対照としてのラミニン又はオルニチンコーティングに比較して実質的に高濃度の活性ＩＴＧＢ１と下流エフェクターであるインテグリン結合キナーゼ（ＩＬＫ）及びリン酸化焦点接着キナーゼ（ｐ－ＦＡＫ）を誘導することが分かった（図２Ｄ及びＥ、並びに図９）。ＰＡ４では中間レベルの活性化が認められ、ライブラリーにおけるその他のＰＡに比較してその中間の超分子運動に相関した。ＶＶＩＡＫスクランブル配列を示すＰＡは、ＩＴＧＢ１の細胞活性化が最低であった。更に、ＩＴＧＢ１抗体で前処理すると、全ＩＫＶＡＶＰＡでｈＮＰＣの結合が阻止され、ＩＫＶＡＶ－ＩＴＧＢ１相互作用がこのプロセスを仲介していることが示唆された。
【0107】
ｈＮＰＣを各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理すると、ニューロン形のβチューブリンがアップレギュレートされた（ＴＵＪ１＋）が、（ニューロン分化関与を反映する）この誘導率は、２種類の最も動力学的な超分子フィブリルであるＩＫＶＡＶＰＡ２及びＰＡ５で特に高かった（夫々２０．５±１％及び２０．７±１．２％）（図２Ｆ～Ｈ）。ＩＫＶＡＶＰＡ４は中間のニューロン分化関与（ＰＡ４：１４±１．２％）を示したが、それ以外のＩＫＶＡＶＰＡは、ＴＵＪ１＋神経細胞の誘導率が低かった（ＰＡ１：８．２±０．７％、ＰＡ３：７．５±０．６％、ＰＡ６：７．９±１．３％、ＰＡ７：７．４±０．６％、及びＰＡ８：７．５±０．５％）。ピューロマイシンに基づくタンパク質合成分析法（ＳＵｎＳＥＴ法）を使用することにより、全条件で同様のタンパク質翻訳レベルとなることが検証されたので、観測された差は代謝作用に関係しないことが確認された。
【0108】
生理活性が最高のＩＫＶＡＶＰＡ（ＰＡ２及びＰＡ５）を負荷電ＰＡ繊維と静電的に架橋する５ｍＭのＣａＣｌ２と混合してｈＮＰＣを処理し、インビトロ実験を実施した。Ｃａ２＋を添加すると超分子運動が抑制されることがＦＤ及びＴ２－ＮＭＲ実験により確認された（図２Ｉ）。Ｃａ２＋イオンを媒体に添加することにより超分子運動を低下させると、ＩＴＧＢ１とその下流の細胞内経路（ＩＬＫ、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ）の活性化も低下した（図２Ｊ及び図１０ａ～１０ｃ）。これらの結果から、ＩＫＶＡＶＰＡの非生理活性ドメインにおけるテトラペプチドアミノ酸配列に突然変異が導入されているので、動力学とインビトロ生理活性の間に強い正の相関があることが分かった。
【0109】
ＳＣＩモデル：軸索再成長とグリア性瘢痕の形成
次に、デュアルシグナルフィブリルがＳＣＩ後の機能回復をインビボで強化する能力について試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ６、ＰＡ７及びＰＡ８では低レベルのインビトロ生理活性しか認められなかったので、これらのＰＡは、ＦＧＦ２ＰＡと併用しなかった。両方のシグナルを同時に提示するナノファイバーも試験したので、二元システムは、混和性であると共に、損傷部位に注入して生理液と接触させると、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成する必要があった。ＩＫＶＡＶＰＡ２のみが、ＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２と特に９０：１０のモル比で混合したときに、混和性であると共に、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成することができた（図３Ａ～Ｃ、図１１Ａ～１１Ｃ、表３）。更に、どちらのＦＧＦ２ＰＡも単独では高度に凝集した短繊維を形成し、ＰＡ１、ＰＡ４又はＰＡ５等の他のＩＫＶＡＶＰＡとの不混和性に更に寄与した。
次に、デュアルシグナルフィブリルがＳＣＩ後の機能回復をインビボで強化する能力について試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ６、ＰＡ７及びＰＡ８では低レベルのインビトロ生理活性しか認められなかったので、これらのＰＡは、ＦＧＦ２ＰＡと併用しなかった。両方のシグナルを同時に提示するナノファイバーも試験したので、二元システムは、混和性であると共に、損傷部位に注入して生理液と接触させると、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成する必要があった。ＩＫＶＡＶＰＡ２のみが、ＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２と特に９０：１０のモル比で混合したときに、混和性であると共に、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成することができた（図３Ａ～Ｃ、図１１Ａ～１１Ｃ、表３）。更に、どちらのＦＧＦ２ＰＡも単独では高度に凝集した短繊維を形成し、ＰＡ１、ＰＡ４又はＰＡ５等の他のＩＫＶＡＶＰＡとの不混和性に更に寄与した。
【0110】
【表4】
【0111】
混和性で同様の機械的性質を有するゲルを形成するＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２の二元システムをインビボ実験に進めた（図３Ａ及び図１２）。ＳＣＩの樹立マウスモデル（２０）で重度挫傷から２４時間後に９０：１０モル比のＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリの生理食塩水溶液をマウスの脊髄に注入した。生理活性が最高の単独シグナルシステムであるＩＫＶＡＶＰＡ２を全インビボ実験で対照として使用した。全ＰＡ溶液は、脊髄に送達するとその場でゲル化し、損傷領域に局在した。生理活性足場の生分解を時間の関数として追跡・定量するために、ＰＡ分子をＡｌｅｘａ ６４７色素で蛍光標識した。損傷の２４時間後に蛍光材料を脊髄に注入し、１週間後、２週間後、４週間後、６週間後及び１２週間後に、スピニングディスク共焦点顕微鏡法を使用して脊髄を完全に再構成することによりそれらの体積を測定した（図３Ｄ参照）。軟材料は、移植後１～１２週間以内に徐々に生分解し、３種類の実験材料の間に生分解速度の差は認められなかった（図３Ｅ及び図１３参照）。
【0112】
随意運動機能を仲介する皮質脊髄路（ＣＳＴ）を追跡するために、感覚運動皮質の損傷から１０週間後にビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ）を両側注入により投与した（図３Ｆ）。全ＰＡ群及びシャム（生理食塩水単独注入）群で損傷から１２週間後に順行性標識ＣＳＴ軸索再成長を評価した。この方法では、近位病巣辺縁以遠まで再成長した標識軸索数を定量することが必要であった。ＩＫＶＡＶＰＡ１と、その表面に生理活性シグナルをもたないＰＡ繊維（「主鎖ＰＡ」）を対照として注入した。
【0113】
生理食塩水を注入したマウスでは、病巣内に軸索の再成長は殆ど認められなかったが、ＩＫＶＡＶＰＡ１では、軸索の若干の再成長が認められ、繊維は低い運動性を示した（図３Ｇ及び図１４）。他方、ＩＫＶＡＶＰＡ２を単独又は（ＩＫＶＡＶＰＡ２と同一のＡ２Ｇ２非生理活性ドメインを有する）ＦＧＦ２ＰＡ２とのコアセンブリとして注入したマウスでは、シャム条件に比較して軸索再成長の多少の増加が認められた。これに対して、（Ａ２Ｇ２の代わりにＶ２Ａ２非生理活性ドメインを含む）ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２のコアセンブリを注入すると、病巣部位全体に強い皮質脊髄路軸索再成長を生じ、その遠位辺縁も超えるに至った（図３Ｇ及びＨ、並びに図１５）。この群において、病巣内の総軸索再成長は、ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリを使用した群の２倍であり、シャム群の５０倍であった（図３Ｉ）。セロトニン軸索（５ＨＴ）も歩行運動機能に役割を果たすと思われるが、同様に病巣中心部内で再成長し、ＣＳＴと同様の傾向を示した（図１６）。
【0114】
理論に拘泥する意図はないが、ＣＳＴ及び５ＨＴ軸索再成長が認められたのは、軸索再生の強い障害である顕著なアストロサイト瘢痕の不在が一因であると考えられる。シャム群及び主鎖ＰＡ群では、病巣の辺縁に高レベルのＧＦＡＰを発現する反応性アストロサイトの稠密集団としてこの障害が認められたが、全生理活性ＰＡ群では、グリア性瘢痕の密度が低かった（図３Ｈ、図１６）。これらの結果に一致し、ＷＢ分析によると、生理活性が最高のコアセンブリ（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１）のみでは、より高濃度の成長関連タンパク質４３（ＧＡＰ－４３）が再生中の軸索の成長円錐に存在することが分かった（図３Ｊ）。
【0115】
次に、損傷から３箇月後にＰＡ足場が皮質脊髄路軸索の再ミエリン化を誘導できるか否かを調べた。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１では、病巣内に高レベルのミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）が検出され、特に再成長した軸索に巻き付いていた（図３Ｊ及びＫ）。更に、この条件下では、病巣内の多くの成長中の軸索が高レベルのラミニンと低レベルのフィブロネクチンに関連していることが認められ、線維化コアの縮小を示唆している（図３Ｋ及びＬ、図１５）。これらの組織学的・生化学的所見は、２種類の生理活性シグナルを担持する２種類の超分子コアセンブリ間の物理的な差が、損傷後の神経再生アウトカムを著しく強化できることを示唆している。
【0116】
ＳＣＩモデル：血管新生、細胞生存及び機能回復
損傷部位の血管新生に及ぼす両方のデュアルシグナルコアセンブリの影響は、完全に解剖学的・機能的な再生に重要であるので、次にこの影響について調査した。未損傷組織切片に比較して、シャムマウスの横断面脊髄切片は、病巣の中心から体軸方向に２．０ｍｍ超延びる組織変性度が顕著であることが判明した。この場合には、未損傷対照に比較して血管面積分率、血管長、及び分岐の有意低下が認められた（図４Ａ及びＢ）。内皮細胞膜に取り込まれる親油性カルボシアニン色素である１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）を含有するグルコース溶液を経心腔的に注入することにより、機能的血管網の存在を調査した（図４Ａ）。ＰＡ足場を投与した群では、腹部組織構造が高度に保存されており、機能的血管網が維持されていることが判明した。生理活性が最高のコアセンブリを投与すると、特に背側領域で血管面積分率、血管長、及び分岐が増加した（図４Ａ及びＢ）。これらのパラメーターは、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群と低生理活性コアセンブリ群（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）で有意な差がなく、ミメティックＦＧＦ２血管新生シグナルは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で最適に機能していないと考えられた。
損傷部位の血管新生に及ぼす両方のデュアルシグナルコアセンブリの影響は、完全に解剖学的・機能的な再生に重要であるので、次にこの影響について調査した。未損傷組織切片に比較して、シャムマウスの横断面脊髄切片は、病巣の中心から体軸方向に２．０ｍｍ超延びる組織変性度が顕著であることが判明した。この場合には、未損傷対照に比較して血管面積分率、血管長、及び分岐の有意低下が認められた（図４Ａ及びＢ）。内皮細胞膜に取り込まれる親油性カルボシアニン色素である１，１’－ジオクタデシル－３，３，３’，３’－テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩（ＤｉＩ）を含有するグルコース溶液を経心腔的に注入することにより、機能的血管網の存在を調査した（図４Ａ）。ＰＡ足場を投与した群では、腹部組織構造が高度に保存されており、機能的血管網が維持されていることが判明した。生理活性が最高のコアセンブリを投与すると、特に背側領域で血管面積分率、血管長、及び分岐が増加した（図４Ａ及びＢ）。これらのパラメーターは、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群と低生理活性コアセンブリ群（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）で有意な差がなく、ミメティックＦＧＦ２血管新生シグナルは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で最適に機能していないと考えられた。
【0117】
病巣内の血管の起源を突き止めるために、損傷後第１週の間にチミジンアナログである５’－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を腹腔内に注入した。損傷から１２週間後に生理活性が最高のコアセンブリ群の病巣内に新たに形成された血管が認められた。これは、他の全群の試料に比較してＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞数が有意に増加していること（図４Ｃ及びＤ）と、ＷＢ分析（図４Ｅ）により確認された。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２コアセンブリとＩＫＶＡＶＰＡ２単独では、非常に僅かではあるが、シャム群に比較すると有意な血管形成の増加を生じた。
【0118】
ニューロン生存、脊髄回路の維持及び局所機能に及ぼす両方のデュアルシグナルコアセンブリの影響を調査した。天然ＦＧＦ２は、ＳＣＩ後のニューロン生存率の上昇に関係があると思われる。生理活性が最高のコアセンブリ群の横断面脊髄切片は、未損傷対照群と同様に背側領域で新たに生成された血管の近傍にＮｅｕＮ＋ニューロンを示した（図５Ａ）。更に、ＰＡを利用した場合には、同時にＣｈＡＴ＋（運動ニューロン）でもあるニューロン（ＮｅｕＮ＋細胞）のみが前角で検出され、生理活性が最高のシステムでは他の群に比較して有意に多数であった（図５Ｂ及びＣ）。どの群でも病巣内に二重ＢｒｄＵ＋／ＮｅｕＮ＋ニューロンは認められず、局所的な神経発生の不在が示唆された。
【0119】
観測された軸索再生、血管新生、及び局所神経細胞生存が受傷動物の行動改善に繋がったか否かを評価した。この目的では、損傷後１２週間の間に全群でＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃｏｒｅ（ＢＭＳ）オープンフィールド歩行運動スコアと足跡解析による歩行運動回復を評価した（図５Ｄ及び図１７）。損傷から１週間後以降に、全ＰＡ群はシャム群に比較して有意な持続的行動改善を示した。興味深いことに、損傷から３週間後に、生理活性が最高のコアセンブリを投与したマウスは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入したマウス（夫々４．４±０．５及び４．３±０．５）に比較して有意な機能回復（５．９±０．５）を示した（図５Ｄ）。足跡の定量によると、生理活性が最高のコアセンブリを投与したマウスは、ストライド長及び幅が他の群に比較して有意に大きいことが判明した（図１７）。総合すると、これらのデータは、デュアルシグナルシステムで認められた神経細胞生存と機能回復が、夫々の非生理活性テトラペプチドの化学組成の差に驚くほど関係していることを示唆している。
【0120】
ヒト内皮細胞及び神経前駆細胞でのインビトロ結果
上記結果を踏まえ、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して両方のコアセンブリにおけるＦＧＦ２シグナルのインビトロ生理活性を評価した。天然ＦＧＦ２は、内皮細胞増殖及び網形成を強化する。生理活性が最高のコアセンブリ又はＦＧＦ２タンパク質上でＨＵＶＥＣを培養すると、４８時間以内に血管様毛細管網の広範な分岐と形成が認められた（図６Ａ及びＢ）。ＷＢ分析も実施し、ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２のコアセンブリで認められたインビトロ生理活性がＦＧＦ２細胞内シグナル伝達経路と関係しているか否かを検証した。生理活性が最高のコアセンブリ又は天然ＦＧＦ２で処理したＨＵＶＥＣは、内皮細胞の増殖と移動を活性化させるｐ－ＦＧＦＲ１及び下流タンパク質ｐ－ＥＲＫ１／２の濃度が高いことが判明した（図６Ｃ）。スクランブルＦＧＦ２ミメティック配列を含むシステムは、生理活性を全く示さなかった。
上記結果を踏まえ、ヒト臍帯静脈血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を使用して両方のコアセンブリにおけるＦＧＦ２シグナルのインビトロ生理活性を評価した。天然ＦＧＦ２は、内皮細胞増殖及び網形成を強化する。生理活性が最高のコアセンブリ又はＦＧＦ２タンパク質上でＨＵＶＥＣを培養すると、４８時間以内に血管様毛細管網の広範な分岐と形成が認められた（図６Ａ及びＢ）。ＷＢ分析も実施し、ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２のコアセンブリで認められたインビトロ生理活性がＦＧＦ２細胞内シグナル伝達経路と関係しているか否かを検証した。生理活性が最高のコアセンブリ又は天然ＦＧＦ２で処理したＨＵＶＥＣは、内皮細胞の増殖と移動を活性化させるｐ－ＦＧＦＲ１及び下流タンパク質ｐ－ＥＲＫ１／２の濃度が高いことが判明した（図６Ｃ）。スクランブルＦＧＦ２ミメティック配列を含むシステムは、生理活性を全く示さなかった。
【0121】
両方のコアセンブリにおけるＩＫＶＡＶシグナルとＦＧＦ２シグナルの同時生理活性を立証するために、二重陽性ＥｄＵ＋／ＳＯＸ２＋と、ＩＴＧＢ１及びｐＦＧＦＲ－１の誘導を定量することにより、ｈＮＰＣ増殖に及ぼすこれらの分子の影響をインビトロで評価した（図６Ｄ～Ｆ）。これらの実験によると、生理活性の低いコアセンブリにおけるＦＧＦ２シグナルは、ほぼ非機能的であるが、ＩＫＶＡＶシグナルはどちらのコアセンブリでも機能的に維持されると思われる。これらの結果は、ＳＣＩ実験における所見と一致する。
【0122】
超分子運動に関する物理的実験とコンピューターシミュレーション
ＦＧＦ２ＰＡにおいてアルキルテールに続くテトラペプチドをＶ２Ａ２からＡ２Ｇ２に突然変異させた場合のインビトロ及びインビボ生理活性の低下の潜在的な物理的理由について調査した。これらの２種類のコアセンブリにおけるＦＧＦ２ＰＡ分子間の動力学の差をＴ２－ＮＭＲスペクトロスコピーとＦＤにより試験した（図６Ｇ～Ｉ）。ＦＧＦ２ミメティックシグナルのみに存在するＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの緩和速度を測定した。この速度は生理活性が最高のコアセンブリのほうが遅く、シグナル伝達ペプチドにおける超分子運動が活発であると判断された（１Ｈ－Ｒ２＝生理活性が低いほうのコアセンブリの８０．９±１８．９ｓ－１に対して４９．３±１１ｓ－１）（図６Ｇ及びＨ）。Ｃｙ３色素で共有結合的に標識したＦＧＦ２ＰＡ分子を使用して前記２種類のコアセンブリのＦＤ実験を実施した（クライオＴＥＭ画像によると、色素は超分子集合体を破壊しなかった）。生理活性が最高のコアセンブリのほうが低い異方性が検出され、ナノファイバー内のＦＧＦ２シグナル分子の運動性が高いと判断された（図６Ｉ）。
ＦＧＦ２ＰＡにおいてアルキルテールに続くテトラペプチドをＶ２Ａ２からＡ２Ｇ２に突然変異させた場合のインビトロ及びインビボ生理活性の低下の潜在的な物理的理由について調査した。これらの２種類のコアセンブリにおけるＦＧＦ２ＰＡ分子間の動力学の差をＴ２－ＮＭＲスペクトロスコピーとＦＤにより試験した（図６Ｇ～Ｉ）。ＦＧＦ２ミメティックシグナルのみに存在するＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの緩和速度を測定した。この速度は生理活性が最高のコアセンブリのほうが遅く、シグナル伝達ペプチドにおける超分子運動が活発であると判断された（１Ｈ－Ｒ２＝生理活性が低いほうのコアセンブリの８０．９±１８．９ｓ－１に対して４９．３±１１ｓ－１）（図６Ｇ及びＨ）。Ｃｙ３色素で共有結合的に標識したＦＧＦ２ＰＡ分子を使用して前記２種類のコアセンブリのＦＤ実験を実施した（クライオＴＥＭ画像によると、色素は超分子集合体を破壊しなかった）。生理活性が最高のコアセンブリのほうが低い異方性が検出され、ナノファイバー内のＦＧＦ２シグナル分子の運動性が高いと判断された（図６Ｉ）。
【0123】
ＣＧ－ＭＤシミュレーションによると、生理活性が最高のコアセンブリのほうがＦＧＦ２ＰＡ分子のＲＭＳＦ値が高く、上記Ｔ２－ＮＭＲ及びＦＤ結果が裏付けられた。シミュレーションによると、運動性（ＲＭＳＦ値）の分布からＦＧＦ２ＰＡ分子はどちらのコアセンブリでもクラスターを形成する（生理活性が最高のシステムのほうがやや大きい）ことも判明した（図６Ｊ）。システムの一方における生理活性の低下は、シグナルを担持する２種のＰＡ分子間のコアセンブリの程度の差に起因すると考えられる。しかし、アルキルテールにおけるメチレン単位の１Ｄ１Ｈ－ＮＭＲ、拡散整列スペクトロスコピー（ＤＯＳＹ）、及びＴ２－ＮＭＲによると、どちらのシステムでもコアセンブリが生じたと判断される（表４）。
【0124】
【表5】
【0125】
ＩＫＶＡＶＰＡのみを含むシステムでは、（ＦＧＦ２ＰＡ１に存在する）テトラペプチドＶ２Ａ２は運動性が最低であったので、ＦＧＦ２ＰＡ１分子のほうが高い運動度で得られた結果は、直感的予想に反していた。ＩＫＶＡＶＰＡ２とのコアセンブリにおいてＦＧＦ２ＰＡ２分子のほうが低い運動性となったのは、両方の分子に存在する同一のテトラペプチド間の水素結合と側鎖接触による相互作用が大きいためであると思われた。一方、生理活性の高いＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１コアセンブリの２種の分子には２種類の異なるテトラペプチドが存在するため、両種の分子間に強い相互作用が生じず、より高い超分子運動度に繋がらなかったと思われる。
【0126】
ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ２の強い相互作用と低運動性は、ＦＧＦ２ＰＡ２をＩＫＶＡＶＰＡ２に付加した場合にＣＤスペクトルがほぼ不変であることから証明される。一方、相互作用性の低いＦＧＦ２ＰＡ１をＩＫＶＡＶＰＡ２に付加した場合には、ＣＤスペクトルは変化したので、二次構造の破壊が示唆される。したがって、ＦＧＦ２ＰＡ１分子でＮＭＲにより検出された高い運動性は、フィブリル内のクラスターの並進運動又はフィブリルを出入りするシグナル伝達クラスターの垂直運動の自由度が高いことを示していると考えられる。
【0127】
追加結果：
コアセンブリ特性決定
ＩＫＶＡＶＰＡ２を各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）とコアセンブリすると、どちらのシステムもモル比９０：１０で長いリボン状の構造を形成した（図３Ｂ）。コアセンブリ後の形態変化は、ＳＡＸＳ及びＷＡＸＳプロファイルとＦＴ－ＩＲスペクトルにより裏付けられた。ＳＡＸＳプロファイルによると、ギニエ領域の傾きは、ＩＫＶＡＶＰＡ２では－１．２であり、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２では－１．６であり、円筒形繊維（－１．０）からリボン（－２．０）への遷移の程度が異なると判断された。更に、ＰＡコアセンブリ（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）は、ＷＡＸＳで一貫したβシートスペーシングを示し、これは、ＦＴ－ＩＲスペクトルにより裏付けられ、アミドＩ領域にＩＫＶＡＶＰＡ２と同様のβシート識別特性を示した。コアセンブリのネガティブ染色による高倍率透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によると、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２は、夫々１３．７±０．３ｎｍ及び１５．６±０．２ｎｍの平均繊維幅であった。どちらのシステムの繊維幅もその主要部分単独（ＩＫＶＡＶＰＡ２＝１０．６±０．１ｎｍ）よりも著しく大きく、システムにＦＧＦ２ＰＡを付加したためであると考えられた。６００ｎｍでの光散乱強度（光学密度）（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ）に基づいて、ＩＫＶＡＶＰＡ２に取り込まれたＦＧＦ２ＰＡの量を分析した。種々のｍｏｌ％のＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１及びＰＡ２）は、同一百分率をＩＫＶＡＶＰＡ２とコアセンブリした場合よりも高い数値を示した。したがって、ＦＧＦ２ＰＡは、単独では溶解度が低いが、ＩＫＶＡＶＰＡ２によりその溶解度が増加し、それらの集合に繋がる。低百分率のＦＧＦ２ＰＡ（５～１０ｍｏｌ％）とＩＫＶＡＶＰＡ２のコアセンブリの場合、Ｏ．Ｄ．は、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独（ＦＧＦ２ＰＡ０ｍｏｌ％）と同等の数値を示し、溶液中に遊離しているＦＧＦ２ＰＡよりも有意に低かった。
コアセンブリ特性決定
ＩＫＶＡＶＰＡ２を各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）とコアセンブリすると、どちらのシステムもモル比９０：１０で長いリボン状の構造を形成した（図３Ｂ）。コアセンブリ後の形態変化は、ＳＡＸＳ及びＷＡＸＳプロファイルとＦＴ－ＩＲスペクトルにより裏付けられた。ＳＡＸＳプロファイルによると、ギニエ領域の傾きは、ＩＫＶＡＶＰＡ２では－１．２であり、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２では－１．６であり、円筒形繊維（－１．０）からリボン（－２．０）への遷移の程度が異なると判断された。更に、ＰＡコアセンブリ（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２）は、ＷＡＸＳで一貫したβシートスペーシングを示し、これは、ＦＴ－ＩＲスペクトルにより裏付けられ、アミドＩ領域にＩＫＶＡＶＰＡ２と同様のβシート識別特性を示した。コアセンブリのネガティブ染色による高倍率透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によると、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２は、夫々１３．７±０．３ｎｍ及び１５．６±０．２ｎｍの平均繊維幅であった。どちらのシステムの繊維幅もその主要部分単独（ＩＫＶＡＶＰＡ２＝１０．６±０．１ｎｍ）よりも著しく大きく、システムにＦＧＦ２ＰＡを付加したためであると考えられた。６００ｎｍでの光散乱強度（光学密度）（Ｏ．Ｄ．６００ｎｍ）に基づいて、ＩＫＶＡＶＰＡ２に取り込まれたＦＧＦ２ＰＡの量を分析した。種々のｍｏｌ％のＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１及びＰＡ２）は、同一百分率をＩＫＶＡＶＰＡ２とコアセンブリした場合よりも高い数値を示した。したがって、ＦＧＦ２ＰＡは、単独では溶解度が低いが、ＩＫＶＡＶＰＡ２によりその溶解度が増加し、それらの集合に繋がる。低百分率のＦＧＦ２ＰＡ（５～１０ｍｏｌ％）とＩＫＶＡＶＰＡ２のコアセンブリの場合、Ｏ．Ｄ．は、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独（ＦＧＦ２ＰＡ０ｍｏｌ％）と同等の数値を示し、溶液中に遊離しているＦＧＦ２ＰＡよりも有意に低かった。
【0128】
ＳＣＩモデルにおけるＰＡ対照：
ＩＫＶＡＶＰＡ１繊維、ＩＫＶＡＶＰＡ４繊維、及びその表面に生理活性シグナルをもたないＰＡ繊維（主鎖ＰＡ）を対照として注入した。主鎖ＰＡを注入したマウスでは、病巣内の軸索再成長は殆ど認められなかったが、ＩＫＶＡＶＰＡ１では軸索の若干の再成長が認められた。興味深いことに、ＩＫＶＡＶＰＡ４は、（ＩＫＶＡＶＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２の）中間の超分子運動と生理活性を有することがインビトロで判明したが、インビボでも中間レベルの軸索再成長を示した。
ＩＫＶＡＶＰＡ１繊維、ＩＫＶＡＶＰＡ４繊維、及びその表面に生理活性シグナルをもたないＰＡ繊維（主鎖ＰＡ）を対照として注入した。主鎖ＰＡを注入したマウスでは、病巣内の軸索再成長は殆ど認められなかったが、ＩＫＶＡＶＰＡ１では軸索の若干の再成長が認められた。興味深いことに、ＩＫＶＡＶＰＡ４は、（ＩＫＶＡＶＰＡ１とＩＫＶＡＶＰＡ２の）中間の超分子運動と生理活性を有することがインビトロで判明したが、インビボでも中間レベルの軸索再成長を示した。
【0129】
コアセンブリシステム上のｈＮＰＣ
ＰＡコーティング上にｈＮＰＣを播種した処、１週間試験した全ＰＡ条件で同様に接着・生存することが判明した。播種したｈＮＰＣ数は全条件で同様であったが、ｈＮＰＣをＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１上で培養した場合又は天然ＦＧＦ２と共に培養した場合には、増殖するＥｄＵ＋及びＳＯＸ２＋細胞の百分率が増加し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独又は市販ラミニン上で細胞を培養した場合には、この百分率が有意に低下した（図６Ｅ）。１週間後に、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１は、天然ＦＧＦ２タンパク質と同程度までの多数のＳＯＸ２＋細胞のプールを維持した。逆に、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びラミニン上に播種した細胞は、ニューロン前駆細胞であるＰＡＸ６＋の百分率が増加し、細胞の分化が進んでいると判断された。次に、ＩＴＧＢ１及びＦＧＦＲ－１の発現をＷＢにより追跡することにより、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１で観測された生理活性が実際に夫々ＩＴＧＢ１及びＦＧＦＲ－１と関係しているか否かを試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１上に播種したｈＮＰＣ又は天然ＦＧＦ２で処理したｈＮＰＣではｐ－ＦＧＦＲ１が高度に発現されたが、活性ＩＴＧＢ１は、ＩＫＶＡＶＰＡ２を含む全ＰＡ条件で培養した細胞で有意に高レベルを示した。ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ１のコアセンブリ上に播種した細胞と、ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリ上に播種した細胞の間には、表現型プロファイルの差も認められた。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１は、天然ＦＧＦ２で処理したラミニンコーティング上に播種した細胞と同様に、神経幹細胞マーカーＳＯＸ２、ニューロンマーカーβチューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）、及び有糸分裂後マーカーＰＨ３のより高度の発現を誘発した。
ＰＡコーティング上にｈＮＰＣを播種した処、１週間試験した全ＰＡ条件で同様に接着・生存することが判明した。播種したｈＮＰＣ数は全条件で同様であったが、ｈＮＰＣをＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１上で培養した場合又は天然ＦＧＦ２と共に培養した場合には、増殖するＥｄＵ＋及びＳＯＸ２＋細胞の百分率が増加し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独又は市販ラミニン上で細胞を培養した場合には、この百分率が有意に低下した（図６Ｅ）。１週間後に、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１は、天然ＦＧＦ２タンパク質と同程度までの多数のＳＯＸ２＋細胞のプールを維持した。逆に、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びラミニン上に播種した細胞は、ニューロン前駆細胞であるＰＡＸ６＋の百分率が増加し、細胞の分化が進んでいると判断された。次に、ＩＴＧＢ１及びＦＧＦＲ－１の発現をＷＢにより追跡することにより、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１で観測された生理活性が実際に夫々ＩＴＧＢ１及びＦＧＦＲ－１と関係しているか否かを試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１上に播種したｈＮＰＣ又は天然ＦＧＦ２で処理したｈＮＰＣではｐ－ＦＧＦＲ１が高度に発現されたが、活性ＩＴＧＢ１は、ＩＫＶＡＶＰＡ２を含む全ＰＡ条件で培養した細胞で有意に高レベルを示した。ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ１のコアセンブリ上に播種した細胞と、ＩＫＶＡＶＰＡ２とＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリ上に播種した細胞の間には、表現型プロファイルの差も認められた。ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１は、天然ＦＧＦ２で処理したラミニンコーティング上に播種した細胞と同様に、神経幹細胞マーカーＳＯＸ２、ニューロンマーカーβチューブリンＩＩＩ（ＴＵＪ１）、及び有糸分裂後マーカーＰＨ３のより高度の発現を誘発した。
【0130】
コアセンブリシステムの１Ｈ－ＮＭＲ、ＤＯＳＹ及び緩和ＮＭＲ
１Ｈ－ＮＭＲスペクトルによると、どちらのコアセンブリでも、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独に比較してメチレンプロトンに由来するピークが広幅で低強度であることが判明し、これらの結果はＤＯＳＹにより確認された。Ｔ２－ＮＭＲを使用してプロトン緩和速度データも取得し、コアセンブリではＩＫＶＡＶＰＡ２に比較して著しく高い数値が検出された（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１：１Ｈ－Ｒ２＝５９．６±１．９ｓ－１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２：１Ｈ－Ｒ２＝５２．７±１．７ｓ－１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２：１Ｈ－Ｒ２＝６．４±０．１ｓ－１）。これらの結果から、どちらのシステムでも両方のシグナルのコアセンブリが生じると判断される。
１Ｈ－ＮＭＲスペクトルによると、どちらのコアセンブリでも、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独に比較してメチレンプロトンに由来するピークが広幅で低強度であることが判明し、これらの結果はＤＯＳＹにより確認された。Ｔ２－ＮＭＲを使用してプロトン緩和速度データも取得し、コアセンブリではＩＫＶＡＶＰＡ２に比較して著しく高い数値が検出された（ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１：１Ｈ－Ｒ２＝５９．６±１．９ｓ－１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２：１Ｈ－Ｒ２＝５２．７±１．７ｓ－１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２：１Ｈ－Ｒ２＝６．４±０．１ｓ－１）。これらの結果から、どちらのシステムでも両方のシグナルのコアセンブリが生じると判断される。
【0131】
考察
本実施例では、超分子運動が活発であることが物理分析及びコンピューター解析により立証され、したがって、マウスモデルでＳＣＩからの機能回復の向上が期待される生理活性足場について記載する。非共有結合的に重合された生理活性分子の一次元足場では、多価効果が効果的シグナル伝達のために受容体をクラスター化するのに役立つと予想された。超分子足場の内部構造が自由な運動を制限し、そのフィブリル軸に垂直な受容体に優先的にシグナルを方向付けることも予想された。しかし、この取り組みにおける驚くべき発見は、ベンチで測定した生理活性フィブリル内の分子運動の強度が、軸索再成長、ニューロン生存、血管再生、及びＳＣＩからの機能回復の向上と相関したことである。コンピューターシミュレーションと実験データは、集合体の内部で又は集合体から受容体部位まで垂直方向にナノメートルの規模で並進することにより、生理活性が増強することを示唆している。理論に拘泥する意図はないが、高度に機敏で物理的に可塑性の超分子足場は、迅速な形状揺らぎ下の細胞膜に存在する受容体にシグナル伝達するのに有効であると考えられる。ＥＣＭのタンパク質環境と分子動力学的足場の相互作用がより有利であるという観点から、回復の原因を広義に説明することもできる。要するに、本願に記載する足場は、治療用超分子ポリマーの生理活性を最適化させるために動力学の構造デザインに絶好の機会を提供する。
本実施例では、超分子運動が活発であることが物理分析及びコンピューター解析により立証され、したがって、マウスモデルでＳＣＩからの機能回復の向上が期待される生理活性足場について記載する。非共有結合的に重合された生理活性分子の一次元足場では、多価効果が効果的シグナル伝達のために受容体をクラスター化するのに役立つと予想された。超分子足場の内部構造が自由な運動を制限し、そのフィブリル軸に垂直な受容体に優先的にシグナルを方向付けることも予想された。しかし、この取り組みにおける驚くべき発見は、ベンチで測定した生理活性フィブリル内の分子運動の強度が、軸索再成長、ニューロン生存、血管再生、及びＳＣＩからの機能回復の向上と相関したことである。コンピューターシミュレーションと実験データは、集合体の内部で又は集合体から受容体部位まで垂直方向にナノメートルの規模で並進することにより、生理活性が増強することを示唆している。理論に拘泥する意図はないが、高度に機敏で物理的に可塑性の超分子足場は、迅速な形状揺らぎ下の細胞膜に存在する受容体にシグナル伝達するのに有効であると考えられる。ＥＣＭのタンパク質環境と分子動力学的足場の相互作用がより有利であるという観点から、回復の原因を広義に説明することもできる。要するに、本願に記載する足場は、治療用超分子ポリマーの生理活性を最適化させるために動力学の構造デザインに絶好の機会を提供する。
【0132】
材料及び方法
ペプチド両親媒性分子ナノ構造の特性決定：
合成及び精製
ＰＡ合成及び調製：リンクアミドＭＢＨＡレジンを担体としてＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波ペプチド合成装置を使用して標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成法により、各種ＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ３：Ｃ１６ＶＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ４：Ｃ１６ＡＶＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ５：Ｃ１６ＡＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ６：Ｃ１６ＧＧＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ７：Ｃ１６ＶＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ８：Ｃ１６ＡＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ）、各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ及びＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）、それらのスクランブル配列として各種ｓｃｒ－ＩＫＶＡＶＰＡ（ＶＶＩＡＫＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ及びＶＶＩＡＫＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ）及び各種ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ（ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ及びｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ）、並びに主鎖ＰＡ（Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥ）を合成した（材料名と対応するペプチド配列の一覧については、表１参照；Ｃ１６は、パルミトイル基である）。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸４当量、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４当量、及びシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ）８当量を使用して自動カップリング反応を実施した。
ペプチド両親媒性分子ナノ構造の特性決定：
合成及び精製
ＰＡ合成及び調製：リンクアミドＭＢＨＡレジンを担体としてＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波ペプチド合成装置を使用して標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成法により、各種ＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ３：Ｃ１６ＶＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ４：Ｃ１６ＡＶＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ５：Ｃ１６ＡＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ６：Ｃ１６ＧＧＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ７：Ｃ１６ＶＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ８：Ｃ１６ＡＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ）、各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ及びＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）、それらのスクランブル配列として各種ｓｃｒ－ＩＫＶＡＶＰＡ（ＶＶＩＡＫＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ及びＶＶＩＡＫＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ）及び各種ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ（ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ及びｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ）、並びに主鎖ＰＡ（Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥ）を合成した（材料名と対応するペプチド配列の一覧については、表１参照；Ｃ１６は、パルミトイル基である）。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸４当量、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４当量、及びシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ）８当量を使用して自動カップリング反応を実施した。
【0133】
２０％４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液でＦｍｏｃ基を除去した。９５％ＴＦＡ、２．５％水、２．５％トリイソプロピルシラン（ＴＩＳ）の標準溶液を使用してレジンからペプチドを切断し、冷エーテルで沈殿させた。次に、各種ＩＫＶＡＶＰＡ、それらのスクランブル配列、及び主鎖ＰＡについては、島津モデルＰｒｏｍｉｎｅｎｃｅモジュラーＨＰＬＣシステム、ＬＣ－２０ＡＰ送液ユニット２台、ＳＰＤ－Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器及びＦＲＣ－１０Ａフラクションコレクターで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８カラム（Ｃ１８固定相、５μｍ、細孔径１１０Å、１５０×３０ｍｍ）を使用し、０．１％（ｖ／ｖ）ＮＨ４ＯＨを含有するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントを溶離液として流速２５．０ｍＬ／分で使用して逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により塩基性条件下で精製を実施した。各種ＦＧＦ２ＰＡとそれらのスクランブル配列については、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｋｉｎｅｔｅｘ Ｃ８カラム（Ｃ８固定相、５μｍ、細孔径１００Å、１５０×３０ｍｍ）を使用して酸性条件下（０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡを含有する水溶液／ＣＨ３ＣＮ溶液）で精製した。Ａｇｉｌｅｎｔモデル１２００ Ｉｎｆｉｎｉｔｙ Ｓｅｒｉｅｓ二元ＬＣグラジエントシステムで、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ４μｍ Ｐｒｏｔｅｏ ９０Åカラム（Ｃ１２固定相、４μｍ、細孔径９０Å、１×１５０ｍｍ）又はＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｇｅｍｉｎｉ Ｃ１８（Ｃ１８固定相、５μｍ、細孔径１１０Å、１５０×１ｍｍ）を使用し、夫々０．１％（ｖ／ｖ）ギ酸又はＮＨ４ＯＨを含有するＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮグラジエントを溶離液として流速５０μＬ／分で使用して液体クロマトグラフィー－質量分析法（ＬＣ－ＭＳ）により、凍結乾燥した各種ＰＡの純度を分析した。Ａｇｉｌｅｎｔモデル６５１０四重極飛行時間型ＬＣ－ＭＳでポジティブスキャンモードのエレクトロスプレーイオン化質量（ＥＳＩ－質量）分析法を実施した。
【0134】
色素を共有結合した各種ＰＡについては、上記配列のＣ末端に夫々システイン又はアジドリジンを付加し、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２と、Ｃｙ３で標識した各種ＦＧＦ２ＰＡを合成した。精製した各種ＩＫＶＡＶＰＡをトリス（２－カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）塩酸塩（ＰＡに対して５当量）のｐＨ８のトリス緩衝液溶液に溶解し、マレイミドで官能基化したＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）－６４７（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）と反応させた。精製した各種ＦＧＦ２ＰＡをＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解し、ジベンゾシクロオクチンで官能基化したＣｙ３－ＤＢＣＯ（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ）と反応させた。色素で標識した各種最終ＰＡ生成物をＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥し、使用時まで保管した。
【0135】
ＰＡコアセンブリ作製
インビトロ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌの溶液で再構成し、細胞適合性と材料コンシステンシーを確保するために、１ＭのＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨ７．４に調整した。種々の生理活性ＰＡを種々のｍｏｌ％で混合し（表３参照）、１０秒間ずつ３回に分けて１０％強度でホーン型超音波装置により超音波処理した。ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールした後、全試料を均等且つ制御下に加熱・冷却するためのサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を使用して２７℃の最終温度に達するように毎分１℃の割合でゆっくりと冷却した。ＰＡをコーティングした担体を作製するために、２４ウェル、１２ウェル、若しくは６ウェルポリスチレン細胞培養プレート又は１２ｍｍ及び１８ｍｍガラスカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３７℃で３時間コーティングした。次にプレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、４時間乾燥した。表面全体に薄く均等な材料コーティング（アニールした各種ＰＡ（１重量％）８～３０μＬ）を押し出すようにピペットを移動させることにより、各種ＰＡをカバースリップ又は組織培養プレートに塗布した。ＰＡコーティングを室温で３時間インキュベートした。プレートをその後の使用前に培地で静かにリンスした。色素で標識した各種ＰＡの実験では、Ｃｙ３で標識した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表３参照）。
インビトロ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌの溶液で再構成し、細胞適合性と材料コンシステンシーを確保するために、１ＭのＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨ７．４に調整した。種々の生理活性ＰＡを種々のｍｏｌ％で混合し（表３参照）、１０秒間ずつ３回に分けて１０％強度でホーン型超音波装置により超音波処理した。ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールした後、全試料を均等且つ制御下に加熱・冷却するためのサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を使用して２７℃の最終温度に達するように毎分１℃の割合でゆっくりと冷却した。ＰＡをコーティングした担体を作製するために、２４ウェル、１２ウェル、若しくは６ウェルポリスチレン細胞培養プレート又は１２ｍｍ及び１８ｍｍガラスカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３７℃で３時間コーティングした。次にプレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、４時間乾燥した。表面全体に薄く均等な材料コーティング（アニールした各種ＰＡ（１重量％）８～３０μＬ）を押し出すようにピペットを移動させることにより、各種ＰＡをカバースリップ又は組織培養プレートに塗布した。ＰＡコーティングを室温で３時間インキュベートした。プレートをその後の使用前に培地で静かにリンスした。色素で標識した各種ＰＡの実験では、Ｃｙ３で標識した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表３参照）。
【0136】
インビボ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１ｍｇ／１００μｌの濃度となるように０．９％（ｗ／ｖ）滅菌等張塩化ナトリウム生理食塩水（Ｒｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で再構成した。次に、得られたＰＡ溶液に滅菌１Ｍ ＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨを７．４に調整した後、ＩＫＶＡＶＰＡ２と１０ｍｏｌ％のＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリを加えた（表３参照）。混合後、溶液を超音波処理し、アニールした。色素で標識したＰＡの実験では、Ａｌｅｘａ－６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２を１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表３参照）。
【0137】
透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
ネガティブ染色ＴＥＭ標本を作製するために、グロー放電処理済みグリッド（カーボン膜付き３００メッシュ銅、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の光沢側にＰＡ試料溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌをＭｉｌｌｉＱ水で１０倍に希釈した希釈液で１重量％ＰＡに調製したもの）７μＬを滴下した後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスして過剰の塩を除去した。次に、濾過した２重量％酢酸ウラニル水溶液でグリッドを染色し、風乾した。Ｇａｔａｎ ８３１ ＣＣＤカメラを搭載し、ＬａＢ６フィラメントを使用する加速電圧１００ｋＶのＪＥＯＬ１２３０顕微鏡でＴＥＭイメージングを実施した。イメージング中に試料安定化のためにコールドフィンガーを取り入れた。
ネガティブ染色ＴＥＭ標本を作製するために、グロー放電処理済みグリッド（カーボン膜付き３００メッシュ銅、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の光沢側にＰＡ試料溶液（１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌをＭｉｌｌｉＱ水で１０倍に希釈した希釈液で１重量％ＰＡに調製したもの）７μＬを滴下した後、ＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスして過剰の塩を除去した。次に、濾過した２重量％酢酸ウラニル水溶液でグリッドを染色し、風乾した。Ｇａｔａｎ ８３１ ＣＣＤカメラを搭載し、ＬａＢ６フィラメントを使用する加速電圧１００ｋＶのＪＥＯＬ１２３０顕微鏡でＴＥＭイメージングを実施した。イメージング中に試料安定化のためにコールドフィンガーを取り入れた。
【0138】
クライオ透過型電子顕微鏡法（クライオＴＥＭ）
ＦＥＩモデルＶｉｔｒｏｂｏｔ ＭａｒｋＩＶ（ＦＥＩ）を使用してクライオＴＥＭ用プランジ凍結試料を作製した。プラズマ洗浄したＴＥＭグリッド（レース状カーボン膜付き３００メッシュ銅、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に試料溶液（［ＰＡ］＝０．０５～０．１重量％水溶液）７μＬを滴下し、Ｖｉｔｒｏｂｏｔに取り付けたピンセットで固定した。室温で湿度１００％の環境中で標本をブロッティングし（ブロット強度：３、合計ブロット回数：１～２、待機時間：０．５～１秒、ブロット時間：３秒、ドレン時間：０～１秒）、液体窒素で冷却した液体エタンリザーバーに浸漬させた。ガラス状にした試料を液体窒素中で保存した後、Ｇａｔａｎ ６２６クライオＴＥＭホルダーに移した。Ｇａｔａｎ ８３１ ＣＣＤカメラを搭載し、ＬａＢ６フィラメントにより加速電圧１００ｋＶで作動するＪＥＯＬ１２３０電子顕微鏡を使用してクライオＴＥＭ画像を取得した。
ＦＥＩモデルＶｉｔｒｏｂｏｔ ＭａｒｋＩＶ（ＦＥＩ）を使用してクライオＴＥＭ用プランジ凍結試料を作製した。プラズマ洗浄したＴＥＭグリッド（レース状カーボン膜付き３００メッシュ銅、Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に試料溶液（［ＰＡ］＝０．０５～０．１重量％水溶液）７μＬを滴下し、Ｖｉｔｒｏｂｏｔに取り付けたピンセットで固定した。室温で湿度１００％の環境中で標本をブロッティングし（ブロット強度：３、合計ブロット回数：１～２、待機時間：０．５～１秒、ブロット時間：３秒、ドレン時間：０～１秒）、液体窒素で冷却した液体エタンリザーバーに浸漬させた。ガラス状にした試料を液体窒素中で保存した後、Ｇａｔａｎ ６２６クライオＴＥＭホルダーに移した。Ｇａｔａｎ ８３１ ＣＣＤカメラを搭載し、ＬａＢ６フィラメントにより加速電圧１００ｋＶで作動するＪＥＯＬ１２３０電子顕微鏡を使用してクライオＴＥＭ画像を取得した。
【0139】
走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
パラホルムアルデヒド（２．０％，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とグルタルアルデヒド（２．５％，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をリン酸緩衝生理食塩水（１×，Ｇｉｂｃｏ）に溶解した混液で、細胞が接着している状態又は接着していない状態のＰＡコーティングを２０分間固定した。固定液を除去し、２００プルーフエタノール（Ｄｅｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の濃度を漸増させた（３０→１００％）エタノール溶液のグラジエント中で試料をインキュベートすることにより、水をエタノールに交換した。臨界点乾燥（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｓａｍｄｒｉ－７９５）を使用して過剰の水を除去した。十分な交換が行われるように２０分間のパージサイクルを使用した。カーボン粘着テープ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、場合によってはカーボン接着剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、得られた脱水試料をスタブにマウントした。試料に約１０ｎｍのオスミウム（Ｆｉｌｇｅｎ，ＯＰＣ－６０Ａ）をコーティングし、イメージングのために試料表面を導電性にした。全画像は、日立ＳＵ８０３０ＳＥＭ機器により加速電圧２ｋＶで撮影した。
パラホルムアルデヒド（２．０％，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）とグルタルアルデヒド（２．５％，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）をリン酸緩衝生理食塩水（１×，Ｇｉｂｃｏ）に溶解した混液で、細胞が接着している状態又は接着していない状態のＰＡコーティングを２０分間固定した。固定液を除去し、２００プルーフエタノール（Ｄｅｃｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）の濃度を漸増させた（３０→１００％）エタノール溶液のグラジエント中で試料をインキュベートすることにより、水をエタノールに交換した。臨界点乾燥（Ｔｏｕｓｉｍｉｓ Ｓａｍｄｒｉ－７９５）を使用して過剰の水を除去した。十分な交換が行われるように２０分間のパージサイクルを使用した。カーボン粘着テープ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、場合によってはカーボン接着剤（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、得られた脱水試料をスタブにマウントした。試料に約１０ｎｍのオスミウム（Ｆｉｌｇｅｎ，ＯＰＣ－６０Ａ）をコーティングし、イメージングのために試料表面を導電性にした。全画像は、日立ＳＵ８０３０ＳＥＭ機器により加速電圧２ｋＶで撮影した。
【0140】
Ｘ線散乱法
米国アルゴンヌ国立研究所（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に所在する先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）のデュポン・ノースウェスタン大学・ダウ協同参入チームシンクロトロン研究センター（ＤｕＰｏｎｔ－Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ－Ｄｏｗ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ（ＤＮＤ－ＣＡＴ）Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）のビームライン５－ＩＤ－ＤでＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、Ｘ線中角散乱（ＭＡＸＳ）、Ｘ線広角散乱（ＷＡＸＳ）実験を実施した。試料溶液（ＮａＣｌとＫＣｌの水溶液（［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ及び［ＫＣｌ］＝３ｍＭ）中［ＰＡ］＝１～３ｗ／ｖ％（約６～１０ｍＭ））１００～１５０μＬを一定直径のキャピラリーフローセルに導入し、０．５秒、２秒、３秒又は１０秒の照射時間でＸ線を照射した。試料測定中に試料をキャピラリー内でシリンジポンプにより１０μＬ／ｓｅｃ秒の速度で振動させ、ビーム過剰照射による損傷を防いだ。トリプルエリア検出器システムにより１７ｋｅＶ（ｌ＝０．８３Å）のＸ線エネルギーでデータを採取した。０．００２３９０＜ｑ＜４．４５７８Å－１の区間で散乱強度を記録した。波数ベクトルｑは、ｑ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）として定義され、式中、θは、散乱角である。取得した２Ｄ散乱データを次に、ＧＳＡＳ－ＩＩソフトウェアでビーム中心の周囲の方位角積分により、波数ベクトルに対する１Ｄ強度のプロットに変換した。１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌを含有する試料からバックグラウンド散乱パターンを得た。次に、このバックグラウンドデータを実験データから差し引いた。ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェアで稼働するＩｒｅｎａソフトウェアパッケージを使用して全データを解析した。
米国アルゴンヌ国立研究所（Ａｒｇｏｎｎｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に所在する先端放射光施設（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｐｈｏｔｏｎ Ｓｏｕｒｃｅ）のデュポン・ノースウェスタン大学・ダウ協同参入チームシンクロトロン研究センター（ＤｕＰｏｎｔ－Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ－Ｄｏｗ Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ａｃｃｅｓｓ Ｔｅａｍ（ＤＮＤ－ＣＡＴ）Ｓｙｎｃｈｒｏｔｒｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）のビームライン５－ＩＤ－ＤでＸ線小角散乱（ＳＡＸＳ）、Ｘ線中角散乱（ＭＡＸＳ）、Ｘ線広角散乱（ＷＡＸＳ）実験を実施した。試料溶液（ＮａＣｌとＫＣｌの水溶液（［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ及び［ＫＣｌ］＝３ｍＭ）中［ＰＡ］＝１～３ｗ／ｖ％（約６～１０ｍＭ））１００～１５０μＬを一定直径のキャピラリーフローセルに導入し、０．５秒、２秒、３秒又は１０秒の照射時間でＸ線を照射した。試料測定中に試料をキャピラリー内でシリンジポンプにより１０μＬ／ｓｅｃ秒の速度で振動させ、ビーム過剰照射による損傷を防いだ。トリプルエリア検出器システムにより１７ｋｅＶ（ｌ＝０．８３Å）のＸ線エネルギーでデータを採取した。０．００２３９０＜ｑ＜４．４５７８Å－１の区間で散乱強度を記録した。波数ベクトルｑは、ｑ＝（４π／λ）ｓｉｎ（θ／２）として定義され、式中、θは、散乱角である。取得した２Ｄ散乱データを次に、ＧＳＡＳ－ＩＩソフトウェアでビーム中心の周囲の方位角積分により、波数ベクトルに対する１Ｄ強度のプロットに変換した。１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌを含有する試料からバックグラウンド散乱パターンを得た。次に、このバックグラウンドデータを実験データから差し引いた。ＩｇｏｒＰｒｏソフトウェアで稼働するＩｒｅｎａソフトウェアパッケージを使用して全データを解析した。
【0141】
円二色性（ＣＤ）スペクトロスコピー
Ｈ２Ｏ（塩不含試料）又は１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌを含有する緩衝液（高塩濃度）で各ＰＡ試料を０．０１～０．０４重量％の濃度まで希釈した。光路長０．５ｍｍの石英セルを使用してＪＡＳＣＯモデルＪ－８１５分光偏光計でＣＤスペクトルを記録した。感度を標準モードに設定し、毎分１００ｎｍのスキャン速度で連続スキャンモードを使用した。測定が飽和しないように、各試料の高圧（ＨＴ）電圧を記録した。３回の測定の累積を使用し、緩衝液試料をバックグラウンドとして差し引き、最終スペクトルを得た。モル平均分子量を使用して最終スペクトルを各試料の最終濃度に正規化した。
Ｈ２Ｏ（塩不含試料）又は１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌを含有する緩衝液（高塩濃度）で各ＰＡ試料を０．０１～０．０４重量％の濃度まで希釈した。光路長０．５ｍｍの石英セルを使用してＪＡＳＣＯモデルＪ－８１５分光偏光計でＣＤスペクトルを記録した。感度を標準モードに設定し、毎分１００ｎｍのスキャン速度で連続スキャンモードを使用した。測定が飽和しないように、各試料の高圧（ＨＴ）電圧を記録した。３回の測定の累積を使用し、緩衝液試料をバックグラウンドとして差し引き、最終スペクトルを得た。モル平均分子量を使用して最終スペクトルを各試料の最終濃度に正規化した。
【0142】
フーリエ変換赤外（ＦＴ－ＩＲ）スペクトロスコピー
Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ３７ＦＴ－ＩＲスペクトロメーターでＦＴ－ＩＲスペクトルを記録した。重水（Ｄ２Ｏ）で試料を調製し、５０μｍの間隔を空けた２枚のＣａＦ２ウインドウの間に挟んだ。最終スペクトルは、１ｃｍ－１分解能で２５回のスキャンの結果とし、大気中のＣＯ２とＨ２Ｏをバックグラウンドとして差し引いた。
Ｂｒｕｋｅｒ Ｔｅｎｓｏｒ ３７ＦＴ－ＩＲスペクトロメーターでＦＴ－ＩＲスペクトルを記録した。重水（Ｄ２Ｏ）で試料を調製し、５０μｍの間隔を空けた２枚のＣａＦ２ウインドウの間に挟んだ。最終スペクトルは、１ｃｍ－１分解能で２５回のスキャンの結果とし、大気中のＣＯ２とＨ２Ｏをバックグラウンドとして差し引いた。
【0143】
蛍光偏光解消法
アニールしたＰＡの水溶液（［ＰＡ］＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）１００μＬを１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ；１．４ｍＭ）のＴＨＦ溶液（２μＬ）に加え、混合液を２５℃で３０分間インキュベートした。その後、混合液をＫＣｌとＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、２５℃で１０～３０分間インキュベートし、ＤＰＨ（１．４μＭ）を包埋したＰＡ（３００μＭ）の溶液を得た。次に、ＣａＣｌ２の存在下でＩＫＶＡＶＰＡ２（Ａ２Ｇ２）又はＩＫＶＡＶＰＡ５（Ｇ４）を得るために、ＰＡ：ＣａＣｌ２のモル比が６：１となるように、ＤＰＨを包埋したＰＡの水溶液に５ｍＭのＣａＣｌ２を加えた。電源１８Ａの３００Ｗキセノンアークランプを搭載したＩＳＳモデルＰＣ１スペクトロフルオロメーターでＤＰＨを３３６ｎｍで励起し、４５０ｎｍで発光を記録した。励起スリット幅と発光スリット幅は１ｍｍに設定した（帯域幅８ｎｍ）。下式を使用して異方性を計算した。
アニールしたＰＡの水溶液（［ＰＡ］＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）１００μＬを１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ；１．４ｍＭ）のＴＨＦ溶液（２μＬ）に加え、混合液を２５℃で３０分間インキュベートした。その後、混合液をＫＣｌとＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、２５℃で１０～３０分間インキュベートし、ＤＰＨ（１．４μＭ）を包埋したＰＡ（３００μＭ）の溶液を得た。次に、ＣａＣｌ２の存在下でＩＫＶＡＶＰＡ２（Ａ２Ｇ２）又はＩＫＶＡＶＰＡ５（Ｇ４）を得るために、ＰＡ：ＣａＣｌ２のモル比が６：１となるように、ＤＰＨを包埋したＰＡの水溶液に５ｍＭのＣａＣｌ２を加えた。電源１８Ａの３００Ｗキセノンアークランプを搭載したＩＳＳモデルＰＣ１スペクトロフルオロメーターでＤＰＨを３３６ｎｍで励起し、４５０ｎｍで発光を記録した。励起スリット幅と発光スリット幅は１ｍｍに設定した（帯域幅８ｎｍ）。下式を使用して異方性を計算した。
【0144】
【数2】
【0145】
蛍光試験用Ｃｙ３官能基化ＦＧＦ２ＰＡ試料
Ｃｙ３ ＤＢＣＯ色素で官能基化した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％添加し、モル比９０：１０のＩＫＶＡＶ／ＦＧＦ２混合物のＰＡ水溶液（［ＰＡ］ｔｏｔａｌ＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）を調製した。この溶液１００μＬをＫＣｌとＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、システムを２５℃で１０分間インキュベートして平衡化させた。ＰＡと色素の最終濃度は、夫々３００μＭ及び０．３μＭとした。Ｃｙ３を５３５ｎｍで励起させ、５７５ｎｍで発光を記録した。
Ｃｙ３ ＤＢＣＯ色素で官能基化した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％添加し、モル比９０：１０のＩＫＶＡＶ／ＦＧＦ２混合物のＰＡ水溶液（［ＰＡ］ｔｏｔａｌ＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）を調製した。この溶液１００μＬをＫＣｌとＮａＣｌの水溶液（１９００μＬ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）で希釈し、システムを２５℃で１０分間インキュベートして平衡化させた。ＰＡと色素の最終濃度は、夫々３００μＭ及び０．３μＭとした。Ｃｙ３を５３５ｎｍで励起させ、５７５ｎｍで発光を記録した。
【0146】
レオロジー
インビトロ試験について上述した方法を使用してＰＡ材料を作製した。全レオロジー試験にＭＣＲ３０２レオメーター（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）を使用した。インビトロ及びインビボ条件をシミュレーションするように、計器ステージを３７℃に設定した。ＰＡ溶液（１５０μＬ）を試料ステージに滴下し、材料の上方に配置した２５ｍｍコーンプレートの下面に２５ｍＭのＣａＣｌ２溶液３０μＬをピペットで分注した。プレートを測定位置までゆっくりと下げ、保湿カラーを使用して試料プランジャーを取り囲み、各４５分間の実験中に試料が蒸発しないようにした。実験毎に、１０［ｒａｄ／ｓ］の一定の角周波数と０．１％歪で試料を３０分間平衡化させた。プラトーに達した後に貯蔵弾性率と損失弾性率（Ｇ’及びＧ”）を記録した。
インビトロ試験について上述した方法を使用してＰＡ材料を作製した。全レオロジー試験にＭＣＲ３０２レオメーター（Ａｎｔｏｎ Ｐａａｒ）を使用した。インビトロ及びインビボ条件をシミュレーションするように、計器ステージを３７℃に設定した。ＰＡ溶液（１５０μＬ）を試料ステージに滴下し、材料の上方に配置した２５ｍｍコーンプレートの下面に２５ｍＭのＣａＣｌ２溶液３０μＬをピペットで分注した。プレートを測定位置までゆっくりと下げ、保湿カラーを使用して試料プランジャーを取り囲み、各４５分間の実験中に試料が蒸発しないようにした。実験毎に、１０［ｒａｄ／ｓ］の一定の角周波数と０．１％歪で試料を３０分間平衡化させた。プラトーに達した後に貯蔵弾性率と損失弾性率（Ｇ’及びＧ”）を記録した。
【0147】
光学密度（Ｏ．Ｄ．）
インビトロ試験について上述した方法を使用してＰＡ材料を作製した。ＰＡ溶液を更に１×生理食塩水で総体積３００μＬまで希釈した。これらの懸濁液１００μＬを９６ウェルプレートの３個のウェルにピペットで分注し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３セルイメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して６００ｎｍでそれらの光学密度を記録した。
インビトロ試験について上述した方法を使用してＰＡ材料を作製した。ＰＡ溶液を更に１×生理食塩水で総体積３００μＬまで希釈した。これらの懸濁液１００μＬを９６ウェルプレートの３個のウェルにピペットで分注し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ３セルイメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して６００ｎｍでそれらの光学密度を記録した。
【0148】
ガラス表面へのＩＫＶＡＶペプチドの固定化
ホウケイ酸ガラスカバースリップ（直径１２ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を合成ＩＫＶＡＶペプチドで修飾した。ホウケイ酸ガラスカバースリップを２％（ｖ／ｖ）マイクロ９０洗剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で６０℃にて３０分間洗浄し、蒸留水で６回リンスし、エタノールでリンスした後、乾燥した。カバースリップをＯ２で３０秒間プラズマエッチング（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ ＰＤＣ－００１－ＨＰ）した後、すぐに（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中で１５分間インキュベートした。その後、カバースリップをエタノールで２回、水で２回リンスした後、オーブン乾燥した。次に、２％ＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）の１．２５ｍｇ／ｍＬ溶液中５０ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＩＫＶＡＶペプチドを調製した。カバースリップをこの溶液の存在下に４０℃で３．５時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップを１００％酢酸無水物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２Ｍ塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び０．２Ｍ重炭酸ナトリウムで順次洗浄した。過剰の水でリンスした後、試料を４Ｍ尿素中で１０分間、次いで１Ｍ ＮａＣｌ中で１０分間超音波処理した後、過剰量の水でリンスし、１００℃で１時間乾燥した。
ホウケイ酸ガラスカバースリップ（直径１２ｍｍ；Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を合成ＩＫＶＡＶペプチドで修飾した。ホウケイ酸ガラスカバースリップを２％（ｖ／ｖ）マイクロ９０洗剤（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）で６０℃にて３０分間洗浄し、蒸留水で６回リンスし、エタノールでリンスした後、乾燥した。カバースリップをＯ２で３０秒間プラズマエッチング（Ｈａｒｒｉｃｋ Ｐｌａｓｍａ ＰＤＣ－００１－ＨＰ）した後、すぐに（３－アミノプロピル）トリエトキシシラン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）の２％（ｖ／ｖ）エタノール溶液中で１５分間インキュベートした。その後、カバースリップをエタノールで２回、水で２回リンスした後、オーブン乾燥した。次に、２％ＤＭＦ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する１－エチル－３－（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（Ａｃｒｏｓ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）の１．２５ｍｇ／ｍＬ溶液中５０ｎｍｏｌ／ｍＬとなるようにＩＫＶＡＶペプチドを調製した。カバースリップをこの溶液の存在下に４０℃で３．５時間インキュベートした。インキュベーション後、カバースリップを１００％酢酸無水物（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、２Ｍ塩酸（Ｆｉｓｈｅｒ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、及び０．２Ｍ重炭酸ナトリウムで順次洗浄した。過剰の水でリンスした後、試料を４Ｍ尿素中で１０分間、次いで１Ｍ ＮａＣｌ中で１０分間超音波処理した後、過剰量の水でリンスし、１００℃で１時間乾燥した。
【0149】
ＮＭＲ実験
スイープ幅６ｋＨｚ及び１６ｋデータ点のＤｏｔｙ拡散プローブを使用するＴｅｃｍａｇ ＮＭＲスペクトロメーターで６００ＭＨｚにて又はＱＣＩ－Ｆクライオプローブを搭載したＢｒｕｃｋｅｒ Ｎｅｏシステムで６００ＭＨｚにてＮＭＲスペクトルを取得した。
スイープ幅６ｋＨｚ及び１６ｋデータ点のＤｏｔｙ拡散プローブを使用するＴｅｃｍａｇ ＮＭＲスペクトロメーターで６００ＭＨｚにて又はＱＣＩ－Ｆクライオプローブを搭載したＢｒｕｃｋｅｒ Ｎｅｏシステムで６００ＭＨｚにてＮＭＲスペクトルを取得した。
【0150】
９／１比のＨ２Ｏ／Ｄ２Ｏ（Ｄ２Ｏは、０．０５重量％の３－（トリメチルシリル）プロピオン－２，２，３，３－ｄ４酸ナトリウム塩を含有する）にＴＦＡ－ｄを添加したものを溶媒として使用して各種ＩＫＶＡＶＰＡのＮＭＲスペクトルを２５℃で記録した。化学シフトを百万分率（ｐｐｍ）で報告する。１Ｈ、１Ｈ－Ｇｃｏｓｙ、１Ｈ、１３Ｃ－ｇＨＳＣＱＡＤ、ＴＯＣＳＹ及びＮＯＥＳＹを使用して構造帰属を実施した。多重度は、一重線（ｓ）、二重線（ｄ）、多重線（ｍ）、二重線の二重線（ｄｄ）、二重線の二重線の二重線（ｄｄｄ）、三重線（ｔ）、四重線（ｑ）として表す。９０°パルス幅は１５μｓとし、典型的なスペクトルは３２回のスキャンを要した。芳香族プロトンを含むエピトープは、１０ｍｏｌ％しか存在していなかったので、芳香族シグナル強度の正確な推定には更にスキャン（５１２回）が必要であった。
【0151】
最大勾配強度を５３．５Ｇ／ｃｍとして勾配強度の数値を１６段階で変化させ、双極パルス対パルス系列で長手方向渦電流遅延を使用したパルス磁場勾配ＮＭＲにより拡散係数を測定した。ピーク強度Ｉを測定し、ステシカル・タナー（Ｓｔｅｊｓｋａｌ－Ｔａｎｎｅｒ）の式：
【0152】
【数3】
【0153】
ストークス・アインシュタイン（Ｓｔｏｋｅｓ－Ｅｉｎｓｔｅｉｎ）の式から以下のように回転半径Ｒｇを計算した。
【0154】
【数4】
可変ループで遅延時間を０．２ｍｓとし、カー・パーセル・ギル・メイブーム（Ｃａｒｒ－Ｐｕｒｃｅｌｌ－Ｇｉｌｌ－Ｍｅｉｂｏｏｍ）のパルス系列を使用してスピン－スピン緩和速度を測定した。ピーク強度データを以下のように指数関数にフィットさせた。
【0155】
【数5】
【0156】
ピーク帰属
ＩＫＶＡＶＰＡ１：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９２－１．０１（ｍ，２４Ｈ，４ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．２５（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４９（ｍ，９Ｈ，３ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．６７（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．２４（ｍ，３Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．５９（ｍ，３Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（β）Ｈ），２．８１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），３．８８（ｍ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），３．９７（ｍ，４Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２），４．０１（ｍ，３Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．３８－４．５（ｍ，６Ｈ，Ｇｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２，３ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６２－４．７５（ｍ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ２）．
ＩＫＶＡＶＰＡ２：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９２－０．９６（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．０１（ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．２１－１．３３（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．４９（ｍ，９Ｈ，３ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．６６（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（β）Ｈ２），１．７２（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（γ）Ｈ２），１．８５（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．２５（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１－４．３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ），４．４－４．５（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．６０－４．６７（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．７１－４．８６（ｍ，１２Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２，３ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ３：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．９３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．９９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），１．０４－１．１６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２５－１．３２（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．５１（ｍ，６Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３）１．５９－１．６３（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），１．８０（ｄｑ，Ｊ＝１２．９，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（β）Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．３９（ｍ，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），３．８６－４．０１（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５５－４．６２（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．７７－４．８２（ｍ，６Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．８６－４．９２（ｍ，３Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．９８－５．０１（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ４：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９１－１．０６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２１－１．２８（ｍ ２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４５－１．５１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），１．５６（ｍ，６Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３）１．７１（ｄｑ，Ｊ＝１２．９，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（β）Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１３（ｍ，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１４－４．２２（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．２４－４．２９（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．４３－４．５２（ｍ，６Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．６２－４．６８（ｍ，３Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．７３－４．８６（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ５：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．７８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９０－０．９４（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１９－１．２９（ｍ ２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４４－１．４９（ｍ，１１Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，Ａｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８８（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．１１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１３－４．２９（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．４１－４．４７（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．６２－４．６７（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．７２－４．７９（ｍ，２Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｇｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．７３－４．８６（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ６：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９３－１．０６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２３－１．２１（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４６－１．５１（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．７９－１．９３（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０９－２．２０（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．６２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．４５－４，４９（ｍ，５Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６１－４．７１（ｍ，４Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．７９－４．８２（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ７：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．８９－１．０３（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１７－１．２４（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．３８－１．５４（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８４－１．９１（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０１－２．１１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．２９－４．３５（ｍ，５Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝７．１２Ｈｚ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６７－４．７３（ｍ，４Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．７２－４．８１（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８８（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ８：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９１－１．０６（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１１－１．２０（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．２９－１．４４（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８１－１．９２（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０２－２．１４（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．２１－４．３０（ｍ，４Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２），４．５４－４．６２（ｍ，５Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．６９－４．８４（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８６－４．９１（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ１：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．６Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９２－１．０１（ｍ，２４Ｈ，４ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．２５（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４９（ｍ，９Ｈ，３ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．６７（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．２４（ｍ，３Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．５９（ｍ，３Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（β）Ｈ），２．８１（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），３．８８（ｍ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），３．９７（ｍ，４Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２），４．０１（ｍ，３Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．３８－４．５（ｍ，６Ｈ，Ｇｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２，３ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６２－４．７５（ｍ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ２）．
ＩＫＶＡＶＰＡ２：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．５Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．４Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９２－０．９６（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．０１（ｄｄ，Ｊ＝１０．９Ｈｚ，６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（γ）Ｈ３），１．２１－１．３３（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４５（ｄ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．４９（ｍ，９Ｈ，３ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．６６（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（β）Ｈ２），１．７２（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（γ）Ｈ２），１．８５（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．２５（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．５２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１－４．３（ｍ，２Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ），４．４－４．５（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．６０－４．６７（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．７１－４．８６（ｍ，１２Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２，３ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ３：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．９３（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．９９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），１．０４－１．１６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２５－１．３２（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．５１（ｍ，６Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３）１．５９－１．６３（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），１．８０（ｄｑ，Ｊ＝１２．９，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（β）Ｈ），２．２５（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．３９（ｍ，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．６６（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），３．８６－４．０１（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５５－４．６２（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．７７－４．８２（ｍ，６Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．８６－４．９２（ｍ，３Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．９８－５．０１（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ４：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８０（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９１－１．０６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２１－１．２８（ｍ ２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４５－１．５１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），１．５６（ｍ，６Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３）１．７１（ｄｑ，Ｊ＝１２．９，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（β）Ｈ），１．８３（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２），２．１３（ｍ，４Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．７（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１４－４．２２（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．２４－４．２９（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．４３－４．５２（ｍ，６Ｈ，３ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．６２－４．６８（ｍ，３Ｈ，２ｘＡｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．７３－４．８６（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ５：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．７８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．３Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９０－０．９４（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１９－１．２９（ｍ ２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４４－１．４９（ｍ，１１Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，Ａｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８８（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２），２．１１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．５４（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１３－４．２９（ｍ，５Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．４１－４．４７（ｍ，２Ｈ，２ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ），４．６２－４．６７（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．７２－４．７９（ｍ，２Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ，Ｇｌｙ－Ｃ（α）Ｈ２），４．７３－４．８６（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ６：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８２（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８８（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９３－１．０６（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．２３－１．２１（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．４６－１．５１（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．７９－１．９３（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０９－２．２０（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．６２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１７（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．４５－４，４９（ｍ，５Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５５（ｄ，Ｊ＝７．３３Ｈｚ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６１－４．７１（ｍ，４Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．７９－４．８２（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８７（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ７：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８４（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８９（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．８９－１．０３（ｍ，１８Ｈ，３ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１７－１．２４（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．３８－１．５４（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８４－１．９１（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０１－２．１１（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．７２（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．１４（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．２１（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１６．７Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．２９－４．３５（ｍ，５Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．５１（ｄ，Ｊ＝７．１２Ｈｚ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ），４．６７－４．７３（ｍ，４Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．７２－４．８１（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８８（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
ＩＫＶＡＶＰＡ８：１Ｈ－ＮＭＲ（６００ＭＨｚ，ＴＦＡ－ｄ１）：δ０．８５（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．２Ｈｚ，Ｐａｌ－ＣＨ３），０．８６（ｔ，３Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（δ）Ｈ３），０．９１－１．０６（ｍ，１２Ｈ，２ｘＶａｌ－Ｃ（γ）Ｈ３，３Ｈ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ３），１．１１－１．２０（ｍ，２４Ｈ，ｓｅｖｅｒａｌ Ｐａｌ－ＣＨ２），１．２９－１．４４（ｍ，２０Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（β）Η２，４ｘＡｌａ－Ｃ（β）Ｈ３），１．８１－１．９２（ｍ，２Ｈ，Ｐａｌ－Ｃ（α）Η２，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．０２－２．１４（ｍ，８Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（γ）Η２），２．６５（ｔ，２Ｈ，Ｊ＝７．１Ｈｚ，Ｌｙｓ－Ｃ（ε）－Ｈ２），４．０９（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（α）Ｈ２），４．１３（ｄ，１Ｈ，Ｊ＝１７．１Ｈｚ，Ｉｌｅ－Ｃ（β）Ｈ２），４．２１－４．３０（ｍ，４Ｈ，４ｘＧｌｕ－Ｃ（α）Ｈ２），４．５４－４．６２（ｍ，５Ｈ，Ａｌａ－Ｃ（α）Ｈ），４．６９－４．８４（ｍ，２Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ，Ｌｙｓ－Ｃ（α）Ｈ），４．８６－４．９１（ｍ，１Ｈ，Ｖａｌ－Ｃ（α）Ｈ）．
【0157】
拡散整列スペクトロスコピー（ＤＯＳＹ）
ＰＡ材料を混合し（９０ｍｏｌ％のＩＫＶＡＶＰＡ２＋１０ｍｏｌ％の各種ＦＧＦ２ＰＡ）、上述したように超音波処理した後、凍結乾燥した。次に、標準５ｍｍＮＭＲチューブで０．２５ｍＭのトリメチルシリルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）を化学シフト基準及び強度標準とし、試料をＤ２Ｏ水に溶解し、濃度６ｍＭのＮａＯＤ１当量に可溶化させた。２０分間超音波処理後、試料を８０℃で３０分間アニールした後、室温までゆっくりと冷却した。勾配パルス幅２ｍｓ及び拡散遅延時間１００ｍｓとし、最大勾配強度を５３Ｇ／ｃｍとして刺激エコーパルス系列を使用したパルス磁場勾配ＮＭＲにより拡散係数を測定した。
ＰＡ材料を混合し（９０ｍｏｌ％のＩＫＶＡＶＰＡ２＋１０ｍｏｌ％の各種ＦＧＦ２ＰＡ）、上述したように超音波処理した後、凍結乾燥した。次に、標準５ｍｍＮＭＲチューブで０．２５ｍＭのトリメチルシリルプロパンスルホン酸ナトリウム（ＤＳＳ）を化学シフト基準及び強度標準とし、試料をＤ２Ｏ水に溶解し、濃度６ｍＭのＮａＯＤ１当量に可溶化させた。２０分間超音波処理後、試料を８０℃で３０分間アニールした後、室温までゆっくりと冷却した。勾配パルス幅２ｍｓ及び拡散遅延時間１００ｍｓとし、最大勾配強度を５３Ｇ／ｃｍとして刺激エコーパルス系列を使用したパルス磁場勾配ＮＭＲにより拡散係数を測定した。
【0158】
１．シミュレーション手順
Ａｖｏｇａｄｒｏで各種ＰＡを構築し、パルミトイルテールを付加するためのｍａｒｔｉｎｉｚｅ．ｐｙの修正バージョンとペプチドのコイルドコイル二次構造を使用してＭＡＲＴＩＮＩ粗視化（ＣＧ）力場表示に変換した。（脂肪族テールから最も遠い）最後から２個のＥ残基とエピトープ内のＫ及びＲ残基は荷電性であり、最初から２個のＥ残基は過去のシミュレーションで繊維形成に理想的であることが分かっていたので、中性とみなした。最終電荷は、ＩＫＶＡＶＰＡでは－１とし、ＦＧＦ２ＰＡでは＋３とする。ＣＧ水とシステムを中和するのに十分なイオンで溶媒和した２１．５×２１．５×２１．５ｎｍ３の立方体ボックスで２段階に分けてシミュレーションを行った。先ず、最小分子間間隙を３Åとして３００のＩＫＶＡＶＰＡをボックスにランダムに配置した。こうすると、５０ｍＭの濃度が得られる（ＩＫＶＡＶＰＡでは７．３～７．８重量％）。これは、自己集合シミュレーションを加速するために広く使用されている濃度範囲内であり、使用する実験システムよりも１０倍まで高くすることができる。これらのシステムを１０μｓ間平衡化させた（図８）。形成された繊維をボックスの中心に置き、３３のＦＧＦ２ＰＡ（１０ｍｏｌ％）を繊維の周囲に３Åの最小間隙でランダムに付加した。次に、これらのシステムをシステム毎に５回の独立したシミュレーションで１０μｓ間平衡化させた。
Ａｖｏｇａｄｒｏで各種ＰＡを構築し、パルミトイルテールを付加するためのｍａｒｔｉｎｉｚｅ．ｐｙの修正バージョンとペプチドのコイルドコイル二次構造を使用してＭＡＲＴＩＮＩ粗視化（ＣＧ）力場表示に変換した。（脂肪族テールから最も遠い）最後から２個のＥ残基とエピトープ内のＫ及びＲ残基は荷電性であり、最初から２個のＥ残基は過去のシミュレーションで繊維形成に理想的であることが分かっていたので、中性とみなした。最終電荷は、ＩＫＶＡＶＰＡでは－１とし、ＦＧＦ２ＰＡでは＋３とする。ＣＧ水とシステムを中和するのに十分なイオンで溶媒和した２１．５×２１．５×２１．５ｎｍ３の立方体ボックスで２段階に分けてシミュレーションを行った。先ず、最小分子間間隙を３Åとして３００のＩＫＶＡＶＰＡをボックスにランダムに配置した。こうすると、５０ｍＭの濃度が得られる（ＩＫＶＡＶＰＡでは７．３～７．８重量％）。これは、自己集合シミュレーションを加速するために広く使用されている濃度範囲内であり、使用する実験システムよりも１０倍まで高くすることができる。これらのシステムを１０μｓ間平衡化させた（図８）。形成された繊維をボックスの中心に置き、３３のＦＧＦ２ＰＡ（１０ｍｏｌ％）を繊維の周囲に３Åの最小間隙でランダムに付加した。次に、これらのシステムをシステム毎に５回の独立したシミュレーションで１０μｓ間平衡化させた。
【0159】
全可視化は、ビジュアル・モレキュラー・ダイナミクス（ＶＭＤ）を使用して実施した。シミュレーションの解析にも使用したＧＲＯＭＡＣＳ ５．０．４で粗視化分子動力学（ＣＧ－ＭＤ）シミュレーションを実施した。静電作用の比誘電率１５と、レナード・ジョーンズ（Ｌｅｎｎａｒｄ－Ｊｏｎｅｓ）相互作用のポテンシャルシフトに基づく反応場を使用した分子間相互作用に１．１ｎｍのカットオフを使用した。５０００ステップまで又は原子間力が２０００ｐＮ未満に収束するまで全システムを最小化した。温度（３０３Ｋ，τＴ＝１ｐｓ）に速度リスケーリングアルゴリズムを使用し、圧力（１ｂａｒ，τＰ＝３ｐｓ）にベレンゼン法を使用するＮＰＴアンサンブルで２５ｆｓの時間ステップを使用して自己集合シミュレーションを実施した。１０μｓの有効時間に対応する１００，０００，０００ステップでシミュレーションを実施した。
【0160】
同一クラスター内のＰＡのカットオフ距離を０．６ｎｍとすることにより、クラスター化を測定した（図６Ｊ）。根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）により表した場合に５μｓ後に平衡化されるシステムを使用し、５回のシミュレーションの最後の５μｓ間の根平均二乗揺らぎ（ＲＭＳＦ）を使用して動力学を測定した。したがって、ＦＧＦ２ＰＡによっては最後の５μｓの前に繊維と結合せず、結果に遮蔽効果があったため、このようなシステムは、この分析では除外した。可視化のために、ＲＭＳＦをβ係数に変換し、比較可能な色コードが得られるように全結果を正規化した。
【0161】
２．インビトロ細胞培養
ヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）培養
１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加した完全培地（Ｅｎｄｏ ＧＲＯ－ＶＥＧＦ完全培地キット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＴ－７５細胞培養フラスコでヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）（ドナープール，ＬＯＮＺＡ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を各実験（Ｐ２－Ｐ４）で７０～８０％コンフルエンスまで増殖させた。培地を３日毎に交換した。
ヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）培養
１％ペニシリン－ストレプトマイシンを添加した完全培地（Ｅｎｄｏ ＧＲＯ－ＶＥＧＦ完全培地キット、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用してＴ－７５細胞培養フラスコでヒト臍帯静脈（ＨＵＶＥＣ）（ドナープール，ＬＯＮＺＡ，Ａｌｌｅｎｄａｌｅ，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）を各実験（Ｐ２－Ｐ４）で７０～８０％コンフルエンスまで増殖させた。培地を３日毎に交換した。
【0162】
ＨＵＶＥＣ処理及びコーティング
ＰＡコアセンブリを無血清培地に溶解することにより処理液を調製した。処理液当たりのＦＧＦ２ＰＡの総濃度は０．５μＭとした。ＦＧＦ２天然タンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を再懸濁し、０．２５ｎＭで使用した。ウェスタンブロット実験では、ＨＵＶＥＣを１２ウェルプレートで約１５０，０００個／ウェルの密度で２日間インビトロ培養した後に処理した。処理液を２時間～２日間インビトロで加えた後、細胞溶解液を回収するか又は細胞を固定した。ＰＡコーティングでは、ＰＡをカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）又は「ＰＡコアセンブリ作製」のセクションに記載したような組織培養プレートに塗布した。調査した全条件について各条件３枚ずつ３回の独立した実験を実施した。
ＰＡコアセンブリを無血清培地に溶解することにより処理液を調製した。処理液当たりのＦＧＦ２ＰＡの総濃度は０．５μＭとした。ＦＧＦ２天然タンパク質（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を再懸濁し、０．２５ｎＭで使用した。ウェスタンブロット実験では、ＨＵＶＥＣを１２ウェルプレートで約１５０，０００個／ウェルの密度で２日間インビトロ培養した後に処理した。処理液を２時間～２日間インビトロで加えた後、細胞溶解液を回収するか又は細胞を固定した。ＰＡコーティングでは、ＰＡをカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）又は「ＰＡコアセンブリ作製」のセクションに記載したような組織培養プレートに塗布した。調査した全条件について各条件３枚ずつ３回の独立した実験を実施した。
【0163】
ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）培養
神経前駆細胞（ＮＰＣ）をヒト胚性幹細胞ＨＵＥＳ６４（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から分化させた（図２Ｃ参照）。要約すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をコーティングしたプレートにｍＴＥＳＲ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を分注し、幹細胞を７０％コンフルエントまで増殖させ、二重ＳＭＡＤ阻害剤（ＳＢ４３１５４２，ＤＮＳＫ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌとＬＤＮ－１９３１８９，Ｔｏｃｒｉｓ）を含有するＮ２Ｂ２７培地（ＮＥＡＡ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎ２及びＢ２７を添加した５０％ＤＭＥＭ：Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ；Ｇｉｂｃｏ）に交換して１２日間培養し、神経前駆細胞の生成を誘導した。５日目から１２日目まで培地にラミニンを添加することにより、神経化を強化した。次に、神経ロゼット選択試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で神経ロゼットを分離してＮＰＣを得、ｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したＮ２Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）培地で増殖させた。各種ＰＡプラットフォームでの実験に備え、ＮＰＣをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で剥離させ、ｈｙｃｌｏｎｅペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とアスコルビン酸（０．２μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２＋Ｎ２＋Ｂ２７培地を分注した個々のプラットフォームで培養した。
神経前駆細胞（ＮＰＣ）をヒト胚性幹細胞ＨＵＥＳ６４（Ｈａｒｖａｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から分化させた（図２Ｃ参照）。要約すると、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）をコーティングしたプレートにｍＴＥＳＲ培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を分注し、幹細胞を７０％コンフルエントまで増殖させ、二重ＳＭＡＤ阻害剤（ＳＢ４３１５４２，ＤＮＳＫ ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌとＬＤＮ－１９３１８９，Ｔｏｃｒｉｓ）を含有するＮ２Ｂ２７培地（ＮＥＡＡ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、Ｎ２及びＢ２７を添加した５０％ＤＭＥＭ：Ｆ１２、５０％Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ；Ｇｉｂｃｏ）に交換して１２日間培養し、神経前駆細胞の生成を誘導した。５日目から１２日目まで培地にラミニンを添加することにより、神経化を強化した。次に、神経ロゼット選択試薬（ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で神経ロゼットを分離してＮＰＣを得、ｂＦＧＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を添加したＮ２Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）培地で増殖させた。各種ＰＡプラットフォームでの実験に備え、ＮＰＣをＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で剥離させ、ｈｙｃｌｏｎｅペニシリン－ストレプトマイシン（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）とアスコルビン酸（０．２μｇ／ｍＬ；Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２＋Ｎ２＋Ｂ２７培地を分注した個々のプラットフォームで培養した。
【0164】
ヒト神経前駆細胞（ｈＮＰＣ）培養物の各種ＩＫＶＡＶＰＡによる処理又はＰＡコアセンブリコーティングへの播種
ＩＫＶＡＶＰＡ処理では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートのオルニチンコーティング（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上でｈＮＰＣを夫々５００，０００個／ウェル及び８０，０００個／ウェルの密度で培養した。ｈＮＰＣを溶液中で６０ｍＭのＩＫＶＡＶＰＡ（［ＰＡ］＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）又は組換えラミニンタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。ＰＡ：ＣａＣｌ２比が６：１となるように、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びＩＫＶＡＶＰＡ５を５ｍＭのＣａＣｌ２と混合し、ｈＮＰＣを処理した。２Ｄ実験では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートの各種ＩＫＶＡＶＰＡ又はラミニンコーティング上でｈＮＰＣを上記密度で培養した。コアセンブリ実験では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートの各種コアセンブリＰＡコーティング上でｈＮＰＣを夫々４００，０００個／ウェル及び５０，０００個／ウェルの密度で培養した。
ＩＫＶＡＶＰＡ処理では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートのオルニチンコーティング（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）上でｈＮＰＣを夫々５００，０００個／ウェル及び８０，０００個／ウェルの密度で培養した。ｈＮＰＣを溶液中で６０ｍＭのＩＫＶＡＶＰＡ（［ＰＡ］＝６ｍＭ、［ＫＣｌ］＝３ｍＭ、［ＮａＣｌ］＝１５０ｍＭ）又は組換えラミニンタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬ）で処理した。ＰＡ：ＣａＣｌ２比が６：１となるように、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びＩＫＶＡＶＰＡ５を５ｍＭのＣａＣｌ２と混合し、ｈＮＰＣを処理した。２Ｄ実験では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートの各種ＩＫＶＡＶＰＡ又はラミニンコーティング上でｈＮＰＣを上記密度で培養した。コアセンブリ実験では、６ウェルプレートと２４ウェルプレートの各種コアセンブリＰＡコーティング上でｈＮＰＣを夫々４００，０００個／ウェル及び５０，０００個／ウェルの密度で培養した。
【0165】
ｈｙｃｌｏｎｅペニシリン－ストレプトマイシンとアスコルビン酸を添加したＤＭＥＭ：Ｆ１２＋Ｎ２＋Ｂ２７培地をｈＮＰＣに週４回補充した。インビトロで２４時間後、７２時間後、１週間後又は２週間後に、夫々ＷＢ又はＩＣＣ用に細胞溶解液を回収又は固定した。調査した全条件について各条件３枚ずつ少なくとも３回の独立した実験を実施した。
【0166】
翻訳の表面検知（ＳＵｎＳＥＴ）
各種ＩＫＶＡＶＰＡ処理液の存在下で培養したｈＮＰＣに３７℃でピューロマイシン（２０μＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０分間パルスした。ピューロマイシンパルスの２時間前に翻訳阻害剤対照としてシクロヘキシミド（１００ｍｇ／ｍＬ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で細胞を前処理した。タンパク質抽出物３０μｇを取得し、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸステインフリーゲル（４～２０％グラジエント，ＢＩＯ－ＲＡＤ）にロードした。総タンパク質シグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出し、抗ピューロマイシン抗体（マウス抗ピューロマイシン１：５０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて新たに合成されたタンパク質をウェスタンブロットにより検出した。
各種ＩＫＶＡＶＰＡ処理液の存在下で培養したｈＮＰＣに３７℃でピューロマイシン（２０μＭ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を１０分間パルスした。ピューロマイシンパルスの２時間前に翻訳阻害剤対照としてシクロヘキシミド（１００ｍｇ／ｍＬ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で細胞を前処理した。タンパク質抽出物３０μｇを取得し、Ｍｉｎｉ－ＰＲＯＴＥＡＮ ＴＧＸステインフリーゲル（４～２０％グラジエント，ＢＩＯ－ＲＡＤ）にロードした。総タンパク質シグナルをＣｈｅｍｉＤｏｃＴＭ ＸＲＳ＋（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）で検出し、抗ピューロマイシン抗体（マウス抗ピューロマイシン１：５０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて新たに合成されたタンパク質をウェスタンブロットにより検出した。
【0167】
細胞生存率アッセイ
ＨＵＶＥＣとｈＮＰＣを各種ＰＡコアセンブリシステムで２日間～２週間インビトロにて処理又は培養した。培地を除去し、細胞を１×ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回リンスした。カルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー１生死アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、細胞生存率を評価した。カルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー１のＨＢＳＳ溶液を室温（ＲＴ）で２０分間各ウェルに加えた。溶液を除去し、試料をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で３回リンスした後、カバースリップをイメージングに備えて封入した。
ＨＵＶＥＣとｈＮＰＣを各種ＰＡコアセンブリシステムで２日間～２週間インビトロにて処理又は培養した。培地を除去し、細胞を１×ＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で１回リンスした。カルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー１生死アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用し、細胞生存率を評価した。カルセインＡＭ／エチジウムホモダイマー１のＨＢＳＳ溶液を室温（ＲＴ）で２０分間各ウェルに加えた。溶液を除去し、試料をＨＢＳＳ（Ｇｉｂｃｏ）で３回リンスした後、カバースリップをイメージングに備えて封入した。
【0168】
ＥｄＵ分析
ｈＮＰＣ増殖アッセイでは、チミジンアナログである５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）２μＭを培養培地に２４時間取り込ませた。細胞を指定時点で室温にて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。固定後、試料をＰＢＳで２回洗浄した後、（５０ｍＭ原液から分取した）１１ｍＭのＣｕＳＯ４と（０．５ｍｇ／ｍＬのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品から分取した）１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５５５アジドを含有するＣｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ細胞増殖キットで室温にて暗所で３０分間染色した。次に、染色カクテルを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、下記免疫蛍光プロトコルに従う抗ウサギＳＯＸ２抗体と、５μｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のＰＢＳ溶液でｈＮＰＣを室温にて２０分間対比染色した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、イメージングに備えてＩｍｍｕ－Ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で封入した。
ｈＮＰＣ増殖アッセイでは、チミジンアナログである５－エチニル－２’－デオキシウリジン（ＥｄＵ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）２μＭを培養培地に２４時間取り込ませた。細胞を指定時点で室温にて４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。固定後、試料をＰＢＳで２回洗浄した後、（５０ｍＭ原液から分取した）１１ｍＭのＣｕＳＯ４と（０．５ｍｇ／ｍＬのＴｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ製品から分取した）１μｇ／ｍＬのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ－５５５アジドを含有するＣｌｉｃｋ－ｉＴ（登録商標）ＥｄＵ細胞増殖キットで室温にて暗所で３０分間染色した。次に、染色カクテルを除去し、細胞をＰＢＳで洗浄した。次に、下記免疫蛍光プロトコルに従う抗ウサギＳＯＸ２抗体と、５μｇ／ｍＬの４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ，Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）のＰＢＳ溶液でｈＮＰＣを室温にて２０分間対比染色した。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、イメージングに備えてＩｍｍｕ－Ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で封入した。
【0169】
４．インビボ試験：
全動物飼育及び処置は、実験動物の人道的管理と使用に関する米国公衆衛生局規範（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。全処置は、ノースウェスタン大学動物実験委員会（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
全動物飼育及び処置は、実験動物の人道的管理と使用に関する米国公衆衛生局規範（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ Ｐｏｌｉｃｙ ｏｎ Ｈｕｍａｎｅ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ａｎｉｍａｌｓ）に従って実施した。全処置は、ノースウェスタン大学動物実験委員会（Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔｅｒｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により承認された。
【0170】
外科処置
全実験は、ノースウェスタン大学のシンプソン・クエリー研究所（Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｑｕｅｒｒｅｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で実施した。ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）１８２匹をこの試験の対象とした（シャム群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ１群：Ｎ＝１２、主鎖ＰＡ群：Ｎ＝１２、ＩＫＶＡＶＰＡ４群：Ｎ＝６）。試験で使用した動物の年齢は、１０～１６週齢とした。８回の独立したインビボ実験を実施し（損傷＋ＰＡ注入）、８回の実験の各々で厳密に同齢の動物に、シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の少なくとも４群の主要処理群を注入した。２．５％イソフルランガスと酸素を使用して動物に麻酔した。椎弓切除を行い、脊髄レベルＴ１０－Ｔ１１の脊髄を露出させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｍｐａｃｔｏｒシステム（ＩＨ－０４００，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用し、衝撃力を８５ｋｄｙｎとし、持続時間を６０秒として重度挫傷作成を実施した。受傷後、９ｍｍ創傷クリップ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して皮膚を縫合し、体温を維持するように温熱パッドの上で動物を回復させた。１２週間の全実験期間中、毎日手動で腹圧排尿を行った。
全実験は、ノースウェスタン大学のシンプソン・クエリー研究所（Ｓｉｍｐｓｏｎ Ｑｕｅｒｒｅｙ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）で実施した。ＣＤ１マウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ）１８２匹をこの試験の対象とした（シャム群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群：Ｎ＝３８、ＩＫＶＡＶＰＡ１群：Ｎ＝１２、主鎖ＰＡ群：Ｎ＝１２、ＩＫＶＡＶＰＡ４群：Ｎ＝６）。試験で使用した動物の年齢は、１０～１６週齢とした。８回の独立したインビボ実験を実施し（損傷＋ＰＡ注入）、８回の実験の各々で厳密に同齢の動物に、シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の少なくとも４群の主要処理群を注入した。２．５％イソフルランガスと酸素を使用して動物に麻酔した。椎弓切除を行い、脊髄レベルＴ１０－Ｔ１１の脊髄を露出させた。Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｈｏｒｉｚｏｎ Ｓｐｉｎａｌ Ｃｏｒｄ Ｉｍｐａｃｔｏｒシステム（ＩＨ－０４００，Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ）を使用し、衝撃力を８５ｋｄｙｎとし、持続時間を６０秒として重度挫傷作成を実施した。受傷後、９ｍｍ創傷クリップ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して皮膚を縫合し、体温を維持するように温熱パッドの上で動物を回復させた。１２週間の全実験期間中、毎日手動で腹圧排尿を行った。
【0171】
動物適格・除外基準
受傷から２４時間後に全マウスをオープンフィールド環境で評価し、何らかの後肢運動（ＢＭＳスコアで０よりも高いスコア）を示す動物を試験から除外した。この適格基準に合格したマウスをＰＡ注入用実験群にランダムに割り当てた後、それらの実験条件を隠してブラインド評価した。
受傷から２４時間後に全マウスをオープンフィールド環境で評価し、何らかの後肢運動（ＢＭＳスコアで０よりも高いスコア）を示す動物を試験から除外した。この適格基準に合格したマウスをＰＡ注入用実験群にランダムに割り当てた後、それらの実験条件を隠してブラインド評価した。
【0172】
注入手順
ＳＣＩから２４時間後に、他の文献（１９）に記載されているように表面張力を低下させるためにＳｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングしたガラスキャピラリーマイクロピペット（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（外径１００μｍ）を使用して（ＮａＣｌの０．９％滅菌溶液に１重量％を溶解した）各種ＰＡを注入した。Ｍｉｃｒｏ４マイクロシリンジポンプコントローラー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）による制御下のメスルアーアダプター（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してキャピラリーをＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けた。イソフルラン麻酔下に、オートクリップを外し、損傷部位を露出させた。損傷から２４時間後に、脊柱の椎弓切除はそのままであり、受傷により形成された傷が見えた。Ｋｏｐｆ社の脳定位固定装置を使用し、マイクロピペットを病巣の直ぐ背側に配置した。脊髄の背側表面から測定して７５０μｍの深さまでマイクロピペットを下降させ、希釈した両親媒性分子溶液４～６μＬを１μＬ／分の速度で注入した。脊髄内に（腹側から背側に）ＰＡの軌跡を残すように、マイクロピペットを２５０μｍ間隔で引き上げた。注入の終わりに、ピペットを更に２～３分間停止させて材料をゲル化させた後に引き上げ、切開部を９ｍｍ創傷クリップで閉じた。
ＳＣＩから２４時間後に、他の文献（１９）に記載されているように表面張力を低下させるためにＳｉｇｍａｃｏｔｅ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）をコーティングしたガラスキャピラリーマイクロピペット（Ｓｕｔｔｅｒ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）（外径１００μｍ）を使用して（ＮａＣｌの０．９％滅菌溶液に１重量％を溶解した）各種ＰＡを注入した。Ｍｉｃｒｏ４マイクロシリンジポンプコントローラー（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）による制御下のメスルアーアダプター（Ｗｏｒｌｄ Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用してキャピラリーをＨａｍｉｌｔｏｎシリンジに取り付けた。イソフルラン麻酔下に、オートクリップを外し、損傷部位を露出させた。損傷から２４時間後に、脊柱の椎弓切除はそのままであり、受傷により形成された傷が見えた。Ｋｏｐｆ社の脳定位固定装置を使用し、マイクロピペットを病巣の直ぐ背側に配置した。脊髄の背側表面から測定して７５０μｍの深さまでマイクロピペットを下降させ、希釈した両親媒性分子溶液４～６μＬを１μＬ／分の速度で注入した。脊髄内に（腹側から背側に）ＰＡの軌跡を残すように、マイクロピペットを２５０μｍ間隔で引き上げた。注入の終わりに、ピペットを更に２～３分間停止させて材料をゲル化させた後に引き上げ、切開部を９ｍｍ創傷クリップで閉じた。
【0173】
後肢歩行運動評価
Ｂａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）の歩行運動オープンフィールド評点スケールを使用して運動機能を評価した。熟練試験員が２人１組で各動物を５～１０分間評価し、定義されたスコアを各後肢に割り当てた。足跡解析では、マウスの後肢を染料に浸した。幅の狭いランウェイ（長さ８０ｃｍ及び幅４ｃｍ）を白紙で覆い、動物を歩行させた。後肢による一歩の開始から終了までの距離としてストライド長を定義した。左足つま先の最も外側から右足つま先の最も外側までの距離としてストライド幅を定義した。全測定値は各側で連続３歩について測定し、平均した。
Ｂａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）の歩行運動オープンフィールド評点スケールを使用して運動機能を評価した。熟練試験員が２人１組で各動物を５～１０分間評価し、定義されたスコアを各後肢に割り当てた。足跡解析では、マウスの後肢を染料に浸した。幅の狭いランウェイ（長さ８０ｃｍ及び幅４ｃｍ）を白紙で覆い、動物を歩行させた。後肢による一歩の開始から終了までの距離としてストライド長を定義した。左足つま先の最も外側から右足つま先の最も外側までの距離としてストライド幅を定義した。全測定値は各側で連続３歩について測定し、平均した。
【0174】
順行性ＢＤＡ皮質脊髄路トレーシング
灌流の１４日前に、各条件６匹ずつを使用して皮質脊髄路をトレーシングした。酸素中２．５％濃度のイソフルランガスを使用して動物に麻酔した。脳定位固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）を使用して各マウスの頭部を固定した。外科手術用メス刃を使用して頭蓋の正中線に沿って頭皮を８ｍｍ切開した。運動皮質の領域である各半球に１０％ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ、分子量＝１０，０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）０．２５μＬを注入した。以下の座標を使用した。ブレグマから吻側－尾側：±０．０ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ；側方：±１．０ｍｍ、１．５ｍｍ；深さ：０．７ｍｍ。ＢＤＡを検出するために、ストレプトアビジンと５５５のコンジュゲートで標識した二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で切片を処理した。
灌流の１４日前に、各条件６匹ずつを使用して皮質脊髄路をトレーシングした。酸素中２．５％濃度のイソフルランガスを使用して動物に麻酔した。脳定位固定装置（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）を使用して各マウスの頭部を固定した。外科手術用メス刃を使用して頭蓋の正中線に沿って頭皮を８ｍｍ切開した。運動皮質の領域である各半球に１０％ビオチン化デキストランアミン（ＢＤＡ、分子量＝１０，０００、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）０．２５μＬを注入した。以下の座標を使用した。ブレグマから吻側－尾側：±０．０ｍｍ、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ；側方：±１．０ｍｍ、１．５ｍｍ；深さ：０．７ｍｍ。ＢＤＡを検出するために、ストレプトアビジンと５５５のコンジュゲートで標識した二次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で切片を処理した。
【0175】
ＢｒｄＵ注入
２４時間後にＰＡを脊髄に注入し、各条件６匹ずつを使用し、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を７日間（１日１パルス）腹腔内に（体重１０ｇ当たり５ｍｇ）注入した。ＰＡ注入から１２週間後に免疫組織化学法（ラット抗ＢｒｄＵ、１：１０００、Ａｂｃａｍ）によりＢｒｄＵ取り込みを分析した。
２４時間後にＰＡを脊髄に注入し、各条件６匹ずつを使用し、５－ブロモ－２’－デオキシウリジン（ＢｒｄＵ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を７日間（１日１パルス）腹腔内に（体重１０ｇ当たり５ｍｇ）注入した。ＰＡ注入から１２週間後に免疫組織化学法（ラット抗ＢｒｄＵ、１：１０００、Ａｂｃａｍ）によりＢｒｄＵ取り込みを分析した。
【0176】
ＤｉＩ標識
深麻酔後で灌流の直前に、従来記載されているように（２１）、５ｗ／ｖ％のグルコースを含有するＰＢＳ溶液に２０μＬ／ｍＬのＤｉＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解して各条件６匹ずつに経心腔的に注入した。その直後に、４％のパラホルムアルデヒドを含有する等張溶液（ｐＨ７．４の０．４Ｍリン酸緩衝液にＰＦＡを溶解したもの）を使用して動物を経心腔的に灌流した。
深麻酔後で灌流の直前に、従来記載されているように（２１）、５ｗ／ｖ％のグルコースを含有するＰＢＳ溶液に２０μＬ／ｍＬのＤｉＩ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を溶解して各条件６匹ずつに経心腔的に注入した。その直後に、４％のパラホルムアルデヒドを含有する等張溶液（ｐＨ７．４の０．４Ｍリン酸緩衝液にＰＦＡを溶解したもの）を使用して動物を経心腔的に灌流した。
【0177】
動物犠牲死及び組織処理
二酸化炭素の過剰投与を使用すると共に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とそれに続いて４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する等張溶液（ｐＨ７．４の０．４Ｍリン酸緩衝液）を経心腔的に灌流して全動物を犠牲死させた。脊髄を４％ＰＦＡで４～６時間固定し、３０％のスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで終夜固定した。次に、３０％のスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１５％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で脊髄を凍結させ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０クライオスタットで厚さ４０μｍに薄切した。
二酸化炭素の過剰投与を使用すると共に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）とそれに続いて４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する等張溶液（ｐＨ７．４の０．４Ｍリン酸緩衝液）を経心腔的に灌流して全動物を犠牲死させた。脊髄を４％ＰＦＡで４～６時間固定し、３０％のスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳで終夜固定した。次に、３０％のスクロース（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）と１５％のゼラチン（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有するＰＢＳ中で脊髄を凍結させ、Ｌｅｉｃａ ＣＭ１８５０クライオスタットで厚さ４０μｍに薄切した。
【0178】
５．インビトロ及びインビボ用バイオアッセイ
免疫蛍光法
免疫蛍光法では、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＨＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するブロッキングバッファー中で固定済みの一次培養物又はフリーフローティング組織切片（厚さ４０μｍ）をインキュベートした。試料を一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。Ａｌｅｘａ－４８８、Ａｌｅｘａ－５５５及び／又はＡｌｅｘａ－６４７（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を二次抗体として使用した。ＤＡＰＩ（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して核を染色した。最後に、イメージングに備えてＩｍｍｕ－Ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液で試料をカバースリップに封入した。
免疫蛍光法
免疫蛍光法では、０．０２％Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ＮＨＳ（Ｇｉｂｃｏ）及び１×ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ）を含有するブロッキングバッファー中で固定済みの一次培養物又はフリーフローティング組織切片（厚さ４０μｍ）をインキュベートした。試料を一次抗体と共に４℃で終夜インキュベートした。Ａｌｅｘａ－４８８、Ａｌｅｘａ－５５５及び／又はＡｌｅｘａ－６４７（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を二次抗体として使用した。ＤＡＰＩ（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用して核を染色した。最後に、イメージングに備えてＩｍｍｕ－Ｍｏｕｎｔ（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）溶液で試料をカバースリップに封入した。
【0179】
ウェスタンブロット（ＷＢ）
Ｈａｌｔプロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してインビトロ及びインビボ試料からタンパク質を抽出した。その後、インビボ試験では、ホーン型超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎ）を使用して脊髄組織を超音波処理し、組織を破砕した。Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用し、使用した全試料のタンパク質含有量を求めた。細胞培養又は組織から得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に電気泳動で転写した。５％スキムミルク溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して膜を３０分～１時間ブロックし、一次抗体と共に終夜インキュベートした。対応するＨＲＰ標識二次抗体（１：１０００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を室温で１時間使用した。Ｒａｄｉａｎｃｅ生物発光ＥＣＬ基質（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してタンパク質シグナルを検出した。Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓイメージャーを使用して膜をイメージングし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデンシトメトリー分析を実施した。
Ｈａｌｔプロテアーゼ・ホスファターゼ阻害剤カクテル（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を添加したＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用してインビトロ及びインビボ試料からタンパク質を抽出した。その後、インビボ試験では、ホーン型超音波装置（Ｂｒａｎｓｏｎ）を使用して脊髄組織を超音波処理し、組織を破砕した。Ｐｉｅｒｃｅ（登録商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を使用し、使用した全試料のタンパク質含有量を求めた。細胞培養又は組織から得られたタンパク質抽出物をＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲルにより分離し、ニトロセルロース膜（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）に電気泳動で転写した。５％スキムミルク溶液（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して膜を３０分～１時間ブロックし、一次抗体と共に終夜インキュベートした。対応するＨＲＰ標識二次抗体（１：１０００，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を室温で１時間使用した。Ｒａｄｉａｎｃｅ生物発光ＥＣＬ基質（Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してタンパク質シグナルを検出した。Ａｚｕｒｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓイメージャーを使用して膜をイメージングし、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用してデンシトメトリー分析を実施した。
【0180】
免疫蛍光法及びウェスタンブロット用抗体
以下の一次抗体をインビトロ及び／又はインビボ試験に使用した。ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００，Ｄａｋｏ，Ｚ０３３４）、ウサギ抗ラミニンＢ１（１：１０００，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗アクチン（１：２０００，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ２０６６）、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：２０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９７１６６）、ヤギ抗５ＨＴ（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ｍａｂ６６０４７）、ウサギ抗ＣＤ３１（１：１００，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，５５０２７４）、マウス抗ニューロフィラメント（ＮＦ，１：２０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ１５９２）、ウサギ抗ＧＡＰ４３（１：２０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８９４５）、ヤギ抗Ｓｏｘ２（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１１０１４５）、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５コンジュゲート（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｓ３２３５５）、ウサギ抗ＰＨ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９７０１）、ラット抗ＢｒｄＵ（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ６３２６）、ウサギ抗ＭＢＰ（１：５００，Ａｂｃａｍ，ａｂ４０３９０）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ３７７）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ１４４Ｐ）、ウサギ抗ＦＧＦＲ１（１：５００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３４７２）、ｐ－ＦＧＦＲ１（１：５００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３４７１）、マウス抗ＩＴＧＢ１（１：２５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，クローンＨＵＴＳ－４，ＭＡＢ２０７９Ｚ）、ウサギ抗ｐ－ＥＲＫ１／２（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１９６８８３）、ＴＵＪ１（１：２０００，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，８０２００１及び８０１２１３）、マウス抗Ｐａｘ６（１：５００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＤ２．３８）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：５００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１５５８０）、ウサギ抗ネスチン（１：１０００ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢＤ６９）、ウサギ抗ＩＬＫ（１：５００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３８６２）、ウサギ抗ｐ－ＦＡＫ（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３２８１Ｓ）、ウサギ抗ＦＡＫ（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３２８５Ｓ）。
以下の一次抗体をインビトロ及び／又はインビボ試験に使用した。ウサギ抗ＧＦＡＰ（１：１０００，Ｄａｋｏ，Ｚ０３３４）、ウサギ抗ラミニンＢ１（１：１０００，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウサギ抗アクチン（１：２０００，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ，Ａ２０６６）、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：２０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９７１６６）、ヤギ抗５ＨＴ（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ｍａｂ６６０４７）、ウサギ抗ＣＤ３１（１：１００，ＢＤ Ｐｈａｒｍｉｇｅｎ，５５０２７４）、マウス抗ニューロフィラメント（ＮＦ，１：２０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ１５９２）、ウサギ抗ＧＡＰ４３（１：２０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，８９４５）、ヤギ抗Ｓｏｘ２（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１１０１４５）、ストレプトアビジンＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５コンジュゲート（１：５００，Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｓ３２３５５）、ウサギ抗ＰＨ３（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，９７０１）、ラット抗ＢｒｄＵ（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ６３２６）、ウサギ抗ＭＢＰ（１：５００，Ａｂｃａｍ，ａｂ４０３９０）、マウス抗ＮｅｕＮ（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＭＡＢ３７７）、ヤギ抗ＣｈＡＴ（１：１０００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢ１４４Ｐ）、ウサギ抗ＦＧＦＲ１（１：５００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３４７２）、ｐ－ＦＧＦＲ１（１：５００，Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３４７１）、マウス抗ＩＴＧＢ１（１：２５０，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，クローンＨＵＴＳ－４，ＭＡＢ２０７９Ｚ）、ウサギ抗ｐ－ＥＲＫ１／２（１：１０００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１９６８８３）、ＴＵＪ１（１：２０００，Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，８０２００１及び８０１２１３）、マウス抗Ｐａｘ６（１：５００，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＤ２．３８）、ウサギ抗Ｋｉ６７（１：５００，Ａｂｃａｍ，ａｂ１５５８０）、ウサギ抗ネスチン（１：１０００ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＡＢＤ６９）、ウサギ抗ＩＬＫ（１：５００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３８６２）、ウサギ抗ｐ－ＦＡＫ（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ，３２８１Ｓ）、ウサギ抗ＦＡＫ（１：１０００，Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，３２８５Ｓ）。
【0181】
血管分析
インビトロ管腔構造形成及びインビボ血管新生を評価するために、１）血管面積分率、２）血管長、及び３）分岐数を自動計算するようにＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）スクリプトを設定した。画像を処理し、二値化し、解析した。着目領域内のＣＤ３１／ＢｒｄＵ二重陽性細胞の量を定量することにより、インビボで新たに形成された血管を同定した。マウス１匹当たり病巣内の８断面でＤｉＩ染色を使用して機能的血管を同定した。この解析では各投与群につき６匹を使用した。定量した断面を、ＤｉＩ染色された病巣内の最初の連続断面として選択した。
インビトロ管腔構造形成及びインビボ血管新生を評価するために、１）血管面積分率、２）血管長、及び３）分岐数を自動計算するようにＩｍａｇｅＪ（Ｆｉｊｉ）スクリプトを設定した。画像を処理し、二値化し、解析した。着目領域内のＣＤ３１／ＢｒｄＵ二重陽性細胞の量を定量することにより、インビボで新たに形成された血管を同定した。マウス１匹当たり病巣内の８断面でＤｉＩ染色を使用して機能的血管を同定した。この解析では各投与群につき６匹を使用した。定量した断面を、ＤｉＩ染色された病巣内の最初の連続断面として選択した。
【0182】
神経突起追跡
ＢＤＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｎ７１６７）を使用して標識するか又は５ＨＴ（Ａｂｃａｍ）で染色した軸索を従来記載されているように（２１）Ｉｍａｒｉｓ（登録商標）ソフトウェアバージョン９．３により定量した。ＳＣＩ病巣の近位辺縁（ＰＢ）から遠位辺縁（ＤＢ）まで縦断面脊髄切片を横切るように一定間隔で線を引き、実験条件を知らせていない研究者により、引いた線と交差する軸索数を計数した。ＢＤＡ又は５ＨＴ染色が濃い脊髄の中央を通る複数の断面を１匹毎に計数し、１匹当たり１箇所当たりの合計交差数として表した。これらの解析では、各投与群につき６匹を使用した。
ＢＤＡ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，Ｎ７１６７）を使用して標識するか又は５ＨＴ（Ａｂｃａｍ）で染色した軸索を従来記載されているように（２１）Ｉｍａｒｉｓ（登録商標）ソフトウェアバージョン９．３により定量した。ＳＣＩ病巣の近位辺縁（ＰＢ）から遠位辺縁（ＤＢ）まで縦断面脊髄切片を横切るように一定間隔で線を引き、実験条件を知らせていない研究者により、引いた線と交差する軸索数を計数した。ＢＤＡ又は５ＨＴ染色が濃い脊髄の中央を通る複数の断面を１匹毎に計数し、１匹当たり１箇所当たりの合計交差数として表した。これらの解析では、各投与群につき６匹を使用した。
【0183】
分解試験及び組織透明化
ＩＫＶＡＶ配列をＡｌｅｘａ－６４７（ｃｌｉｃｋ）蛍光色素で共有結合的に標識することにより、受傷脊髄に注入したＰＡの分解試験を実施した。ＰＡ注入後の種々の時点（２週間、４週間、６週間及び１２週間）で脊髄を灌流し、抽出し、ベンジルアルコール－安息香酸ベンジル（ＢＡＢＢ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して透明化した。透明化後、脊髄組織は、４８８ｎｍで蛍光発光した。スピニングディスク共焦点顕微鏡法を使用して完全な再構成を行い、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用して解析した。これらの試験では、各投与群及び各時点につき３本の脊髄を使用した。
ＩＫＶＡＶ配列をＡｌｅｘａ－６４７（ｃｌｉｃｋ）蛍光色素で共有結合的に標識することにより、受傷脊髄に注入したＰＡの分解試験を実施した。ＰＡ注入後の種々の時点（２週間、４週間、６週間及び１２週間）で脊髄を灌流し、抽出し、ベンジルアルコール－安息香酸ベンジル（ＢＡＢＢ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して透明化した。透明化後、脊髄組織は、４８８ｎｍで蛍光発光した。スピニングディスク共焦点顕微鏡法を使用して完全な再構成を行い、Ｉｍａｒｉｓソフトウェアを使用して解析した。これらの試験では、各投与群及び各時点につき３本の脊髄を使用した。
【0184】
イメージング
ＧａＡｓＰ検出器を搭載したニコンＡ１Ｒ共焦点レーザー走査型顕微鏡、ニコンＷ１デュアルカムスピニングディスク共焦点顕微鏡及びニコンＡ１ＲＭＰ＋多光子共焦点レーザー顕微鏡を使用し、蛍光細胞、切片又は完全透明化脊髄試料を可視化・イメージングした。ニコンＴｉ２広視野顕微鏡を使用し、脊髄のより大きな断面を取得した。
ＧａＡｓＰ検出器を搭載したニコンＡ１Ｒ共焦点レーザー走査型顕微鏡、ニコンＷ１デュアルカムスピニングディスク共焦点顕微鏡及びニコンＡ１ＲＭＰ＋多光子共焦点レーザー顕微鏡を使用し、蛍光細胞、切片又は完全透明化脊髄試料を可視化・イメージングした。ニコンＴｉ２広視野顕微鏡を使用し、脊髄のより大きな断面を取得した。
【0185】
画像定量及び解析
インビトロ細胞定量では、画像ファイルをＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ（１．５１）ソフトウェアにインポートし、「粒子解析」及び「セルカウンター」機能を使用し、指定領域内の合計細胞数を測定した。フリーフローティング免疫染色法を使用して連続組織切片をＮｅｕＮとＣｈＡＴで染色し、ニコンＥｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して定量した。灰白質の４つの角の全てでＮｅｕＮ染色された最初の断面として病巣の吻側及び尾側辺縁を選択した。１匹当たり病巣内の８断面を選択し、１断面当たりのニューロン数として表した。ニコンＧａｓＰ Ｒ１共焦点顕微鏡で自動マルチチャンネル画像取得、画像スティッチング、及びｚスタック再構成（厚さ３６～４０ｍｍ）を行い、全条件についてＮｅｕＮ及びＣｈａｔマーカーに選択された断面全体をイメージングした。
インビトロ細胞定量では、画像ファイルをＮＩＨ Ｉｍａｇｅ Ｊ（１．５１）ソフトウェアにインポートし、「粒子解析」及び「セルカウンター」機能を使用し、指定領域内の合計細胞数を測定した。フリーフローティング免疫染色法を使用して連続組織切片をＮｅｕＮとＣｈＡＴで染色し、ニコンＥｌｅｍｅｎｔｓソフトウェアを使用して定量した。灰白質の４つの角の全てでＮｅｕＮ染色された最初の断面として病巣の吻側及び尾側辺縁を選択した。１匹当たり病巣内の８断面を選択し、１断面当たりのニューロン数として表した。ニコンＧａｓＰ Ｒ１共焦点顕微鏡で自動マルチチャンネル画像取得、画像スティッチング、及びｚスタック再構成（厚さ３６～４０ｍｍ）を行い、全条件についてＮｅｕＮ及びＣｈａｔマーカーに選択された断面全体をイメージングした。
【0186】
ＮＩＨ Ｆｉｊｉソフトウェアを使用し、ＧＦＡＰで染色された組織切片の蛍光強度を分析した。この分析には、上記各種顕微鏡で一定の露出設定でスキャンした画像を使用した。シングルチャンネル免疫蛍光画像を使用し、各画像で選択した領域に沿って蛍光陽性画素数を分析した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアの「Ｐｌｏｔ Ｐｒｏｆｉｌｅ」機能を使用し、引いた線に沿う位置に関する平均画素値を得た。距離に対してＧＦＡＰをプロットするために、マウス１匹当たり脊髄の中央を通る５断面を計数した。各投与群につき６匹を画像定量に使用した。
【0187】
統計分析
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．１２）を使用してデータを解析した。各統計分析では、正規分布の迅速な同定のために、Ｑ－Ｑプロット又は周波数分布プロット（ヒストグラム）を使用した。シャピロ・ウィルク（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｗｉｌｋ）検定とダゴスティーノ・ピアソン（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）オムニバス正規性検定を使用し、サンプルデータがガウス分布にフィットするか否かも試験した。実験群ペア間の比較は、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施した。３群以上の比較は、一元配置分散分析とボンフェローニ法による独立ペアワイズ事後解析を使用して実施した。二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法により、ＰＡ投与群と生理食塩水投与群又はＰＡ群間でマウスＢＭＳ行動スコアを比較した。統計的検定法と、定義及び実験数を含むパラメーターは、対応する図面の説明で報告する。インビトロデータは、棒グラフを使用して表した。エラーバーは、実験当たり３０画像と各条件３回の独立した実験に相当する。インビボデータは、ドットプロットを使用して表し、各データ点は、インビボ動物１匹又は組織切片１枚の数値を表す（全染色実験では、６匹の異なる動物に由来する組織を使用してＩＣＣを独立して繰り返し、同等の結果を得た。各群１匹当たり厚さ３６～４０ｍｍの画像８枚を撮影した）。特に指定しない限り、全データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェア（バージョン９．１２）を使用してデータを解析した。各統計分析では、正規分布の迅速な同定のために、Ｑ－Ｑプロット又は周波数分布プロット（ヒストグラム）を使用した。シャピロ・ウィルク（Ｓｈａｐｉｒｏ Ｗｉｌｋ）検定とダゴスティーノ・ピアソン（Ｄ’Ａｇｏｓｔｉｎｏ－Ｐｅａｒｓｏｎ）オムニバス正規性検定を使用し、サンプルデータがガウス分布にフィットするか否かも試験した。実験群ペア間の比較は、対応のないスチューデントのｔ検定を使用して実施した。３群以上の比較は、一元配置分散分析とボンフェローニ法による独立ペアワイズ事後解析を使用して実施した。二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法により、ＰＡ投与群と生理食塩水投与群又はＰＡ群間でマウスＢＭＳ行動スコアを比較した。統計的検定法と、定義及び実験数を含むパラメーターは、対応する図面の説明で報告する。インビトロデータは、棒グラフを使用して表した。エラーバーは、実験当たり３０画像と各条件３回の独立した実験に相当する。インビボデータは、ドットプロットを使用して表し、各データ点は、インビボ動物１匹又は組織切片１枚の数値を表す（全染色実験では、６匹の異なる動物に由来する組織を使用してＩＣＣを独立して繰り返し、同等の結果を得た。各群１匹当たり厚さ３６～４０ｍｍの画像８枚を撮影した）。特に指定しない限り、全データは、平均±平均の標準誤差（ＳＥＭ）として表した。
【図1A】
【図1B】
【図1C-1E】
【図2A-2B】
【図2C】
【図2D】
【図2E-2F】
【図2G-2H】
【図2I-2J】
【図3A】
【図3B-3C】
【図3D-3F】
【図3G】
【図3H】
【図3I】
【図3J】
【図3K】
【図3L】
【図4A-4B】
【図4C-4E】
【図5A-5B】
【図5C-5D】
【図6A-6C】
【図6D-6F】
【図6G-6J】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10A-10B】
【図10C】
【図11A-11B】
【図11C】
【図12A-12E】
【図12F】
【図13A-13D】
【図13E】
【図14A】
【図14B】
【図14C-14D】
【図15A】
【図15B】
【図15C-15D】
【図15E-15F】
【図16A】
【図16B】
【図16C】
【図16D-16E】
【図17A-17B】
【図17C-17E】
【図18】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-13
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0016】
【図1A】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図1B】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図1C-1E】図１Ａ～１Ｅは、調査したＩＫＶＡＶＰＡ分子のライブラリーを示す。（Ａ）使用した各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の具体的な化学構造と、ＩＫＶＡＶ生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示。（Ｂ）前記ライブラリーにおける各種ＩＫＶＡＶＰＡのクライオＴＥＭ顕微鏡写真と、これらの写真に対応する個々のＩＫＶＡＶＰＡフィラメントのＲＭＳＦ値の色コード表示。（Ｃ）各種ＩＫＶＡＶＰＡ分子の平均ＲＭＳＦ値の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立したシミュレーションに対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）各種ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーのＳＡＸＳパターン及び（Ｅ）ＷＡＸＳプロファイル（散乱強度は重ならないようにするために縦方向にずらせ、１．３５Å付近のβシートスペーシングに対応するブラッグピークをグレーの枠内に示す）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図2A-2B】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2C】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2D】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2E-2F】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2G-2H】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図2I-2J】図２Ａ～２Ｊは、ｈＮＰＣシグナル伝達にインビトロで及ぼす超分子運動の影響を示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡナノファイバーの分子グラフィックス表示であり、蛍光偏光解消測定でプローブとして使用したＤＰＨの化学構造と位置を示す（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ溶液の蛍光異方性の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；ｎ．ｓ．有意差なし、＊＊＊Ｐ＜０．０００１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｂ）ＩＫＶＡＶペプチド配列の化学構造であり、ＮＭＲにより観測したＫ残基を強調表示する（上）；調査した各種ＩＫＶＡＶＰＡのＫ緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１、＃Ｐ＜０．０５、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２、及び＋Ｐ＜０．０５、＋＋＋Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ｈＮＰＣに使用した分化条件。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＩＴＧＢ１－受容体（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）ラミニンと各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、ＩＬＫ及びＴＵＪ１のＷＢ結果。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ２、ＰＡ４及びＰＡ５で処理したｈＮＰＣの代表的な共焦点顕微鏡写真；ネスチン－幹細胞（赤）、ＳＯＸ２－幹細胞（緑）、ＴＵＪ１－ニューロン（白）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｇ、Ｈ）各種ＩＫＶＡＶＰＡで処理したＳＯＸ２＋／ネスチン＋幹細胞（Ｇ）とＴＵＪ１＋神経細胞（Ｈ）の百分率の棒グラフ（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｉ）カルシウムイオンの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２ナノファイバーで得られた蛍光異方性（左）及びＫ残基緩和時間（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）Ｃａ２＋の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ、ＦＡＫ、及びＩＬＫのＷＢ結果。スケールバー：（Ｄ）１０ｍｍ、（Ｆ）１００ｍｍ。
【図3A】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3B-3C】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3D-3F】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3G】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3H】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3I】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3J】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3K】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図3L】図３Ａ～３Ｌは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ＳＣＩ後の皮質脊髄路軸索の成長に差を生じることを示す。（Ａ）使用した２種類のＰＡ分子の化学構造。（Ｂ）２種類の生理活性シグナルを提示する超分子ナノファイバーの分子グラフィックス表示（上）；ＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１及びＦＧＦ２ＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（下）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）及び各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＦＧＦ２ＰＡ２（青））との夫々のコアセンブリの貯蔵弾性率。（Ｄ）Ａｌｅｘａ ６４７で共有結合的に標識したＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）を注入した脊髄（緑）の蛍光顕微鏡写真。（Ｅ）移植後時間の関数としてのＰＡ足場体積のドットプロット。（Ｆ）ＢＤＡ及びＰＡ注入部位を示す模式図（左）；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＢＤＡで標識したニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された脳皮質（右上）と、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された横断面脊髄切片（右下）の蛍光顕微鏡写真。（Ｇ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｈ）Ｇにおける切片の代表的な拡大画像。（Ｉ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｊ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群におけるＧＡＰ４３及びＭＢＰタンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｋ）ＢＤＡで標識した軸索再成長（赤）の代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）（左）と、ラミニン（白）（右）も認められる。（Ｌ）Ｊに記載した条件下のラミニン及びフィブロネクチン発現のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊＊Ｐ＜０．００ｖｓ．シャム群１及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｅでは各群３匹に対応し、Ｊ及びＬでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ｄ、Ｇ）１５００μｍ、（Ｆ）２５μｍ（上）及び２００μｍ（下）、（Ｈ）１００μｍ、並びに（Ｋ）２μｍ。
【図4A-4B】図４Ａ～４Ｅは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、血管新生に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群における横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）Ａの各群の横断面切片における血管面積分率、灌流血管長、及び分岐数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２を注入した動物の病巣の中心におけるＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞の蛍光画像；ＣＤ３１－血管（緑）、ＢｒｄＵ－新たに生成された細胞（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及び生理食塩水（シャム）を投与した群におけるｍｍ２当たりＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＣＤ３１タンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｂ及びＤでは各群６匹に対応し、Ｅでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｃ）２５μｍ。
【図4C-4E】図４Ａ～４Ｅは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、血管新生に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群における横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）Ａの各群の横断面切片における血管面積分率、灌流血管長、及び分岐数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃Ｐ＜０．００１、＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｃ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２を注入した動物の病巣の中心におけるＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞の蛍光画像；ＣＤ３１－血管（緑）、ＢｒｄＵ－新たに生成された細胞（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及び生理食塩水（シャム）を投与した群におけるｍｍ２当たりＢｒｄＵ＋／ＣＤ３１＋細胞数のドットプロット（＊Ｐ＜０．０５、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＣＤ３１タンパク質のＷＢ結果（左）と、正規化値のドットプロット（右）（＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。データ点は、Ｂ及びＤでは各群６匹に対応し、Ｅでは各群４匹に対応する。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｃ）２５μｍ。
【図5A-5B】図５Ａ～５Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ニューロン生存と機能回復に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群に対応する横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）を示し、破線は、灰白質（角）を示す。（Ｂ）Ａの切片の前角領域の高倍率画像；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（左）；ＣｈＡＴ－運動ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（右）。（Ｃ）横断面切片当たりのＮｅｕＮ＋細胞数（左）とＣｈＡＴ＋細胞数（右）を示すドットプロット（データ点は、各群６匹、１匹当たり８切片の合計４８切片に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）インビボ実験の実験タイムライン（上）と、歩行運動のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）（下）（エラーバーは各群３８匹に対応する；＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１全ＰＡ群ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｂ）２５μｍ。
【図5C-5D】図５Ａ～５Ｄは、夫々同一の２種の生理活性配列を有する２種類の化学的に異なるＰＡ足場が、ニューロン生存と機能回復に差を生じることを示す。（Ａ）未損傷群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びシャム群に対応する横断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）を示し、破線は、灰白質（角）を示す。（Ｂ）Ａの切片の前角領域の高倍率画像；ＮｅｕＮ－ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（左）；ＣｈＡＴ－運動ニューロン（緑）、ＤｉＩで標識した血管（赤）、及びＤＡＰＩ－核（青）（右）。（Ｃ）横断面切片当たりのＮｅｕＮ＋細胞数（左）とＣｈＡＴ＋細胞数（右）を示すドットプロット（データ点は、各群６匹、１匹当たり８切片の合計４８切片に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｄ）インビボ実験の実験タイムライン（上）と、歩行運動のＢａｓｓｏ Ｍｏｕｓｅ Ｓｃａｌｅ（ＢＭＳ）（下）（エラーバーは各群３８匹に対応する；＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１全ＰＡ群ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｂ）２５μｍ。
【図6A-6C】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図6D-6F】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図6G-6J】図６Ａ～６Ｊは、異なる超分子運動を示す２種類のＰＡ足場間の細胞シグナル伝達の差をインビトロで検証するデータを示す。（Ａ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣの共焦点顕微鏡写真；アクチン－サイトスケルトン（赤）、ＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ）ラミニン＋ＦＧＦ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２単独、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２で処理したＨＵＶＥＣにおける分岐数の棒グラフ。（Ｃ）Ｂの条件を使用したＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及び活性ＥＲＫ１／２（ｐ－ＥＲＫ１／２）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２のコーティング上のｈＮＰＣの共焦点顕微鏡写真；ＥＤＵ増殖マーカー（赤）、ＳＯＸ２－神経幹細胞マーカー（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｅ）各種コーティング上のＥＤＵ＋／ＳＯＸ２＋細胞の百分率の棒グラフ。（Ｆ）ＷＢ結果（左）と、全ＦＧＦＲ１（ＦＧＦＲ１）に対する活性ＦＧＦＲ１（ｐ－ＦＧＦＲ１）及びｂ１インテグリン（ＩＴＧＢ１）の正規化値の棒グラフ（右）。（Ｇ）６．８１ｐｐｍのＦＧＦ２ミメティックシグナルに含まれるＹ及びＷアミノ酸における芳香族プロトンの１Ｈ－ＮＭＲスピン－スピン緩和時間（実線は、単回帰最良線形フィットである）。（Ｈ）Ｇで測定した芳香族緩和時間の棒グラフ（エラーバーは各条件３回の実験に対応する；＊Ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定による）。（Ｉ）Ｃｙ３色素で化学的に修飾したＦＧＦ２ＰＡの蛍光異方性（エラーバーは、３回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｊ）ＦＧＦ２ＰＡのクラスターにおけるＲＭＳＦ値の色コード表示（左）及び対応する棒グラフ（右）（ＩＫＶＡＶＰＡ２分子を透明グレーで示し、分かり易くするためにイオンと水分子は除去し、シミュレーションボックスを青で示す）（エラーバーは、５回の独立したシミュレーションに対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、スチューデントのｔ検定による）。エラーバーは、Ｂ及びＥでは各条件３回の独立した実験に対応し、Ｃ及びＦでは４回の独立した実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ラミニン＋ＦＧＦ２及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による。スケールバー：（Ａ）２００μｍ、（Ｄ）１００μｍ。
【図7】各種ＩＫＶＡＶＰＡの化学構造（左）と質量スペクトル（右）を示す。
【図8】各種ＩＫＶＡＶＰＡの時間に対する根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を表すプロットを示す。
【図9】ｈＮＰＣをオルニチンコーティング上で培養したものと、ラミニン及びＩＫＶＡＶＰＡのライブラリーで処理したものにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１の正規化値の棒グラフを示す（エラーバーは、３回の独立した分化に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５、＃＃Ｐ＜０．０１、＃＃＃Ｐ＜０．００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ５、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【図10A-10B】図１０Ａ～１０Ｃは、超分子運動とインビトロ細胞シグナル伝達に及ぼすカルシウムの影響を示す。（Ａ）カルシウムの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）におけるＩＫＶＡＶＰＡ２溶液とＩＫＶＡＶＰＡ５溶液の異方性（エラーバーは３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｂ）Ａに記載した条件で培養したｈＮＰＣの代表的な蛍光顕微鏡写真。（Ｃ）カルシウム（Ｃａ２＋）の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２又はＩＫＶＡＶＰＡ５で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１のＷＢ結果（左）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（右）（カルシウム単独（＋）を対照として使用した；エラーバーは、各条件３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。スケールバー：１０ｍｍ。
【図10C】図１０Ａ～１０Ｃは、超分子運動とインビトロ細胞シグナル伝達に及ぼすカルシウムの影響を示す。（Ａ）カルシウムの不在下（Ｎｏ Ｃａ２＋）又は存在下（Ｃａ２＋）におけるＩＫＶＡＶＰＡ２溶液とＩＫＶＡＶＰＡ５溶液の異方性（エラーバーは３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。（Ｂ）Ａに記載した条件で培養したｈＮＰＣの代表的な蛍光顕微鏡写真。（Ｃ）カルシウム（Ｃａ２＋）の不在下（－）又は存在下（＋）にＩＫＶＡＶＰＡ２又はＩＫＶＡＶＰＡ５で処理したｈＮＰＣにおけるＩＴＧＢ１、ｐ－ＦＡＫ／ＦＡＫ、ＩＬＫ、及びＴＵＪ１のＷＢ結果（左）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（右）（カルシウム単独（＋）を対照として使用した；エラーバーは、各条件３回の独立した実験に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、スチューデントのｔ検定による）。スケールバー：１０ｍｍ。
【図11A-11B】図１１Ａ～１１Ｃは、種々のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリのクライオＴＥＭ画像と貯蔵弾性率を示す。（Ａ）９５：５、（Ｂ）９０：１０、及び（Ｃ）８０：２０のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１又はＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（左）と貯蔵弾性率（右）（データ点は、各条件３回の反復実験に対応する；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定による）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図11C】図１１Ａ～１１Ｃは、種々のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリのクライオＴＥＭ画像と貯蔵弾性率を示す。（Ａ）９５：５、（Ｂ）９０：１０、及び（Ｃ）８０：２０のモル比のＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＰＡ１又はＰＡ２）のコアセンブリのクライオＴＥＭ顕微鏡写真（左）と貯蔵弾性率（右）（データ点は、各条件３回の反復実験に対応する；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す、＊Ｐ＜０．０５、スチューデントの両側ｔ検定による）。スケールバー：２００ｎｍ。
【図12A-12E】図１２Ａ～１２Ｆは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡコアセンブリシステムの特性決定を示す。ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の（Ａ）ＳＡＸＳ散乱パターン、（Ｂ）ＷＡＸＳプロファイル、及び（Ｃ）ＦＴ－ＩＲ。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の高倍率ネガティブＴＥＭ画像。（Ｅ）Ｄに記載した条件の繊維幅（エラーバーは、各条件５０本の繊維に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｆ）種々の百分率のＩＫＶＡＶＰＡ２、ＦＧＦ２ＰＡ１、ＦＧＦ２ＰＡ２及びそのコアセンブリの６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）プロット（左）と、ＦＧＦ２ＰＡ（オレンジ色）及びＩＫＶＡＶＰＡ２とのそのコアセンブリ（赤）の写真（右）（エラーバーは、各条件３回の反復実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．そのコアセンブリ試料、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：１００ｎｍ。
【図12F】図１２Ａ～１２Ｆは、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡコアセンブリシステムの特性決定を示す。ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の（Ａ）ＳＡＸＳ散乱パターン、（Ｂ）ＷＡＸＳプロファイル、及び（Ｃ）ＦＴ－ＩＲ。（Ｄ）ＩＫＶＡＶＰＡ２（緑）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１（赤）及びＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（青）の高倍率ネガティブＴＥＭ画像。（Ｅ）Ｄに記載した条件の繊維幅（エラーバーは、各条件５０本の繊維に対応する；＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｆ）種々の百分率のＩＫＶＡＶＰＡ２、ＦＧＦ２ＰＡ１、ＦＧＦ２ＰＡ２及びそのコアセンブリの６００ｎｍにおける光学密度（Ｏ．Ｄ．）プロット（左）と、ＦＧＦ２ＰＡ（オレンジ色）及びＩＫＶＡＶＰＡ２とのそのコアセンブリ（赤）の写真（右）（エラーバーは、各条件３回の反復実験に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．そのコアセンブリ試料、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：１００ｎｍ。
【図13A-13D】図１３Ａ～１３Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した脊髄の透明化を示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２の（Ａ）化学構造と、（Ｂ）質量スペクトル。（Ｃ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２のクライオＴＥＭ画像。（Ｄ）組織を透明化する前（非透明化）及び後（透明化）にＰＡを注入したマウス脊髄の写真。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２を１％のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１又はＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（いずれも赤）を注入したマウス脊髄（緑）の完全な顕微鏡写真再構成である。スケールバー：（Ｃ）１００ｎｍ及び（Ｅ）１０００μｍ。
【図13E】図１３Ａ～１３Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した脊髄の透明化を示す。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２の（Ａ）化学構造と、（Ｂ）質量スペクトル。（Ｃ）Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２のクライオＴＥＭ画像。（Ｄ）組織を透明化する前（非透明化）及び後（透明化）にＰＡを注入したマウス脊髄の写真。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２を１％のＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７で標識し、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１又はＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２（いずれも赤）を注入したマウス脊髄（緑）の完全な顕微鏡写真再構成である。スケールバー：（Ｃ）１００ｎｍ及び（Ｅ）１０００μｍ。
【図14A】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図14B】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図14C-14D】図１４Ａ～１４Ｄは、ＣＳＴ軸索再成長に及ぼす各種ＩＫＶＡＶＰＡの影響を示す。（Ａ）主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、ＢＤＡで標識した軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）、遠位辺縁（ＤＢ）、及び病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｂ）Ａの切片の代表的な拡大画像。（Ｃ）病巣部位と、各指定位置で交差する軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは、各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＋Ｐ＜０．０５、＋＋Ｐ＜０．０１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ１及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ４群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｄ）シャム群、主鎖ＰＡ群、ＩＫＶＡＶＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２群、及びＩＫＶＡＶＰＡ４群のＧＦＡＰのＷＢ結果（下）と、正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．主鎖ＰＡ、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ）１００μｍ。
【図15A】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15B】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15C-15D】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図15E-15F】図１５Ａ～１５Ｆは、軸索再成長とグリア性瘢痕形成に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、及びＩＫＶＡＶＰＡ２単独を注入した動物の縦断面脊髄切片の蛍光画像；ＢＤＡで標識した下降軸索（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）；白い縦破線は、近位辺縁（ＰＢ）と遠位辺縁（ＤＢ）を示す。（Ｂ）Ａに記載した条件の病巣の中心におけるＢＤＡで標識した軸索（赤）の詳細画像であり、白い縦破線は、病巣の中心部分（ＬＣ）を示す。（Ｃ）Ａに記載した条件下において病巣辺縁内のＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）及びＤＡＰＩ－核（青）で染色された縦断面脊髄切片の代表的な画像。（Ｄ）Ａの条件を使用したＷＢ結果（下）と、ＧＦＡＰの正規化タンパク質濃度を表す対応する棒グラフ（上）（データ点は、各条件４匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．００１ｖｓ．シャム群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＢＤＡで標識した軸索（赤）、ＧＦＡＰ－アストロサイト（緑）、及びＤＡＰＩ－核（青）を病巣の中心で撮影した代表的な３Ｄ蛍光顕微鏡写真。（Ｆ）ＩＫＶＡＶＰＡ２群においてＢＤＡで標識した軸索再成長の３Ｄ顕微鏡写真再構成であり、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ、緑）による被覆（上）と、ラミニン（白）（下）も認められる。スケールバー：（Ａ、Ｃ）１００μｍ、（Ｂ）５０μｍ、及び（Ｅ、Ｆ）２μｍ。
【図16A】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16B】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16C】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図16D-16E】図１６Ａ～１６Ｅは、セロトニン作動性ニューロン再成長に及ぼすＩＫＶＡＶＰＡ２と各種ＦＧＦ２ＰＡのコアセンブリの影響を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群及びＩＫＶＡＶＰＡ２群における縦断面脊髄切片の蛍光顕微鏡写真；ラミニン－ＥＣＭ（緑）、５ＨＴ－セロトニン作動性ニューロン（赤）及びＤＡＰＩ－核（青）。（Ｂ、Ｃ）Ａの切片の（Ｂ）近位辺縁（ＰＢ）及び（Ｃ）遠位辺縁（ＤＢ）の代表的な拡大画像であり、白い縦破線は、ＰＢ及びＤＢを示す。（Ｄ）病巣部位と、各指定位置で交差する５ＨＴ軸索数を計数するために使用した縦線の模式図（上）；交差する軸索数のプロット（下）（エラーバーは各群６匹に対応する；＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．シャム群及び＃Ｐ＜０．０５ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２群とＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群、二元配置分散分析の反復測定とボンフェローニ法による）。（Ｅ）ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１における病巣中心（ＬＣ）の代表的な拡大画像。スケールバー：（Ａ）１５００μｍ及び（Ｂ、Ｃ）１００μｍ（Ｅ）５０μｍ。
【図17A-17B】図１７Ａ～１７Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した動物の足跡解析を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の損傷から３箇月後の歩行時マウス後肢位置の代表的な写真。（Ｂ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２を投与した動物の脊髄に病巣を形成するために使用した衝撃力を表す棒グラフ（データ点は、解析した３８匹を示す；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す）。（Ｃ）Ｂにプロットした種々の条件で注入した動物の代表的な足跡。（Ｄ、Ｅ）Ｂに記載した種々の条件で注入した動物の（Ｄ）ｍｍで表したストライド長と、（Ｅ）ｍｍで表したストライド幅を表す棒グラフ（データ点は、各条件３８匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【図17C-17E】図１７Ａ～１７Ｅは、デュアルシグナルコアセンブリを注入した動物の足跡解析を示す。（Ａ）シャム群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２群の損傷から３箇月後の歩行時マウス後肢位置の代表的な写真。（Ｂ）生理食塩水（シャム）、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１、ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ２、ＩＫＶＡＶＰＡ２を投与した動物の脊髄に病巣を形成するために使用した衝撃力を表す棒グラフ（データ点は、解析した３８匹を示す；ｎ．ｓ．は、有意差なしを表す）。（Ｃ）Ｂにプロットした種々の条件で注入した動物の代表的な足跡。（Ｄ、Ｅ）Ｂに記載した種々の条件で注入した動物の（Ｄ）ｍｍで表したストライド長と、（Ｅ）ｍｍで表したストライド幅を表す棒グラフ（データ点は、各条件３８匹に対応する；＊＊＊Ｐ＜０．０００１ｖｓ．シャム群及び＃＃＃Ｐ＜０．０００１ｖｓ．ＩＫＶＡＶＰＡ２＋ＦＧＦ２ＰＡ１群、一元配置分散分析とボンフェローニ法による）。
【手続補正2】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0100】
結果：
夫々同一の２種のシグナルを提示する種々の物理的性質を有するナノファイバー形超分子ポリマーを調査するために、物理的挙動を制御するテトラペプチドドメインをアミノ酸Ｖ、Ａ及びＧの種々の配列とした種々のＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１～ＰＡ８）のライブラリーを合成した（使用したＰＡとそれらのペプチド配列の一覧については、図１Ａ、図７、及び表２参照）。フィブリル内の分子がそれらの水素結合密度の結果として分子間凝集力の高いβシートを形成する傾向に影響を与えるという点に鑑み、これらのアミノ酸を選択した。これらの相互作用の結果、フィブリル内のＰＡ分子の運動性が抑制される。例えば、Ｖ２Ａ２（ＰＡ１）は、そのバリン含量によりβシート構造を形成する傾向が高いが、Ａ２Ｇ２（ＰＡ２）は、潜在的に低秩序セグメントであり、二次構造を形成しない（図１Ａ参照）。その他の配列は、中間レベルの運動の潜在的候補として選択した。全ＩＫＶＡＶＰＡは、このセグメントと生理活性シグナルの間に高い水溶性を提供する配列Ｅ４Ｇを利用した。
夫々同一の２種のシグナルを提示する種々の物理的性質を有するナノファイバー形超分子ポリマーを調査するために、物理的挙動を制御するテトラペプチドドメインをアミノ酸Ｖ、Ａ及びＧの種々の配列とした種々のＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１～ＰＡ８）のライブラリーを合成した（使用したＰＡとそれらのペプチド配列の一覧については、図１Ａ、図７、及び表２参照）。フィブリル内の分子がそれらの水素結合密度の結果として分子間凝集力の高いβシートを形成する傾向に影響を与えるという点に鑑み、これらのアミノ酸を選択した。これらの相互作用の結果、フィブリル内のＰＡ分子の運動性が抑制される。例えば、Ｖ２Ａ２（ＰＡ１）は、そのバリン含量によりβシート構造を形成する傾向が高いが、Ａ２Ｇ２（ＰＡ２）は、潜在的に低秩序セグメントであり、二次構造を形成しない（図１Ａ参照）。その他の配列は、中間レベルの運動の潜在的候補として選択した。全ＩＫＶＡＶＰＡは、このセグメントと生理活性シグナルの間に高い水溶性を提供する配列Ｅ４Ｇを利用した。
【手続補正3】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0101】
【表2】
【手続補正4】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0103】
各種ＩＫＶＡＶＰＡ間の動力学の差を精査するために、１，６－ジフェニル－１，３，５－ヘキサトリエン（ＤＰＨ）をＰＡナノファイバー内に封入して内部疎水性コアのミクロ粘度を測定することにより、蛍光偏光解消度（ＦＤ）を測定した。ＰＡ２とＰＡ５は異方性値が最低であり（夫々０．２１及び０．１８）、最も動力学的な超分子集合体を形成したと判断され、ＰＡ４は、動力学性が中間であり（０．３０）、その他のＰＡは、超分子運動性が低かった（０．４０～０．３７）（図２Ａ）。横緩和核磁気共鳴（Ｔ２－ＮＭＲ）スペクトロスコピーを使用してＩＫＶＡＶエピトープにおける分子動力学も測定した。これらの実験では、（２．６９～２．９９百万分率で観測される）ＩＫＶＡＶ配列中のＫ残基のｅ炭素に結合したメチレンプロトンの緩和速度（Ｈε）を測定した。ＩＫＶＡＶＰＡ１は、最高の緩和速度（低運動度）を示し、ＩＫＶＡＶＰＡ２及びＰＡ５は、ＩＫＶＡＶＰＡライブラリーのうちで緩和速度が最低であり（夫々１Ｈ－Ｒ２＝２．７±０．１及び２．６±０．００３ｓ－１）、より高い運動度に一致した（図２Ｂ及び表３）。ＦＤ結果に一致し、ＩＫＶＡＶＰＡ４は、ＰＡ１とＰＡ２（又はＰＡ５）の中間レベルの超分子運動を示す。総合すると、シミュレーションと、ＦＤ、ＷＡＸＳ及びＴ２－ＮＭＲ測定は、調査した分子のライブラリーにおける３レベルの超分子運動に一致する。
【手続補正5】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0104】
【表3】
【手続補正6】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0109】
ＳＣＩモデル：軸索再成長とグリア性瘢痕の形成
次に、デュアルシグナルフィブリルがＳＣＩ後の機能回復をインビボで強化する能力について試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ６、ＰＡ７及びＰＡ８では低レベルのインビトロ生理活性しか認められなかったので、これらのＰＡは、ＦＧＦ２ＰＡと併用しなかった。両方のシグナルを同時に提示するナノファイバーも試験したので、二元システムは、混和性であると共に、損傷部位に注入して生理液と接触させると、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成する必要があった。ＩＫＶＡＶＰＡ２のみが、ＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２と特に９０：１０のモル比で混合したときに、混和性であると共に、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成することができた（図３Ａ～Ｃ、図１１Ａ～１１Ｃ、表４）。更に、どちらのＦＧＦ２ＰＡも単独では高度に凝集した短繊維を形成し、ＰＡ１、ＰＡ４又はＰＡ５等の他のＩＫＶＡＶＰＡとの不混和性に更に寄与した。
次に、デュアルシグナルフィブリルがＳＣＩ後の機能回復をインビボで強化する能力について試験した。ＩＫＶＡＶＰＡ１、ＰＡ３、ＰＡ４、ＰＡ６、ＰＡ７及びＰＡ８では低レベルのインビトロ生理活性しか認められなかったので、これらのＰＡは、ＦＧＦ２ＰＡと併用しなかった。両方のシグナルを同時に提示するナノファイバーも試験したので、二元システムは、混和性であると共に、損傷部位に注入して生理液と接触させると、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成する必要があった。ＩＫＶＡＶＰＡ２のみが、ＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２と特に９０：１０のモル比で混合したときに、混和性であると共に、同様の機械的性質を有するハイドロゲルを形成することができた（図３Ａ～Ｃ、図１１Ａ～１１Ｃ、表４）。更に、どちらのＦＧＦ２ＰＡも単独では高度に凝集した短繊維を形成し、ＰＡ１、ＰＡ４又はＰＡ５等の他のＩＫＶＡＶＰＡとの不混和性に更に寄与した。
【手続補正7】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0110】
【表4】
【手続補正8】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0123】
ＣＧ－ＭＤシミュレーションによると、生理活性が最高のコアセンブリのほうがＦＧＦ２ＰＡ分子のＲＭＳＦ値が高く、上記Ｔ２－ＮＭＲ及びＦＤ結果が裏付けられた。シミュレーションによると、運動性（ＲＭＳＦ値）の分布からＦＧＦ２ＰＡ分子はどちらのコアセンブリでもクラスターを形成する（生理活性が最高のシステムのほうがやや大きい）ことも判明した（図６Ｊ）。システムの一方における生理活性の低下は、シグナルを担持する２種のＰＡ分子間のコアセンブリの程度の差に起因すると考えられる。しかし、アルキルテールにおけるメチレン単位の１Ｄ１Ｈ－ＮＭＲ、拡散整列スペクトロスコピー（ＤＯＳＹ）、及びＴ２－ＮＭＲによると、どちらのシステムでもコアセンブリが生じたと判断される（表５）。
【手続補正9】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0124】
【表5】
【手続補正10】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0132】
材料及び方法
ペプチド両親媒性分子ナノ構造の特性決定：
合成及び精製
ＰＡ合成及び調製：リンクアミドＭＢＨＡレジンを担体としてＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波ペプチド合成装置を使用して標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成法により、各種ＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ３：Ｃ１６ＶＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ４：Ｃ１６ＡＶＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ５：Ｃ１６ＡＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ６：Ｃ１６ＧＧＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ７：Ｃ１６ＶＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ８：Ｃ１６ＡＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ）、各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ及びＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）、それらのスクランブル配列として各種ｓｃｒ－ＩＫＶＡＶＰＡ（ＶＶＩＡＫＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ及びＶＶＩＡＫＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ）及び各種ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ（ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ及びｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ）、並びに主鎖ＰＡ（Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥ）を合成した（材料名と対応するペプチド配列の一覧については、表２参照；Ｃ１６は、パルミトイル基である）。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸４当量、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４当量、及びシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ）８当量を使用して自動カップリング反応を実施した。
ペプチド両親媒性分子ナノ構造の特性決定：
合成及び精製
ＰＡ合成及び調製：リンクアミドＭＢＨＡレジンを担体としてＣＥＭモデルＬｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅマイクロ波ペプチド合成装置を使用して標準フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）固相ペプチド合成法により、各種ＩＫＶＡＶＰＡ（ＩＫＶＡＶＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ３：Ｃ１６ＶＡＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ４：Ｃ１６ＡＶＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ５：Ｃ１６ＡＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ６：Ｃ１６ＧＧＧＧＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ７：Ｃ１６ＶＡＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ、ＩＫＶＡＶＰＡ８：Ｃ１６ＡＶＡＡＥＥＥＥＧＩＫＶＡＶ）、各種ＦＧＦ２ＰＡ（ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ及びＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＹＲＳＲＫＹＳＳＷＹＶＡＬＫＲ）、それらのスクランブル配列として各種ｓｃｒ－ＩＫＶＡＶＰＡ（ＶＶＩＡＫＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ及びＶＶＩＡＫＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＶＶＩＡＫ）及び各種ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ（ｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ１：Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ及びｓｃｒ－ＦＧＦ２ＰＡ２：Ｃ１６ＡＡＧＧＥＥＥＥＧＷＲＳＫＫＹＳＬＹＹＶＡＳＲＲ）、並びに主鎖ＰＡ（Ｃ１６ＶＶＡＡＥＥ）を合成した（材料名と対応するペプチド配列の一覧については、表２参照；Ｃ１６は、パルミトイル基である）。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸４当量、Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）４当量、及びシアノ（ヒドロキシイミノ）酢酸エチル（Ｏｘｙｍａ ｐｕｒｅ）８当量を使用して自動カップリング反応を実施した。
【手続補正11】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0135】
ＰＡコアセンブリ作製
インビトロ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌの溶液で再構成し、細胞適合性と材料コンシステンシーを確保するために、１ＭのＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨ７．４に調整した。種々の生理活性ＰＡを種々のｍｏｌ％で混合し（表４参照）、１０秒間ずつ３回に分けて１０％強度でホーン型超音波装置により超音波処理した。ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールした後、全試料を均等且つ制御下に加熱・冷却するためのサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を使用して２７℃の最終温度に達するように毎分１℃の割合でゆっくりと冷却した。ＰＡをコーティングした担体を作製するために、２４ウェル、１２ウェル、若しくは６ウェルポリスチレン細胞培養プレート又は１２ｍｍ及び１８ｍｍガラスカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３７℃で３時間コーティングした。次にプレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、４時間乾燥した。表面全体に薄く均等な材料コーティング（アニールした各種ＰＡ（１重量％）８～３０μＬ）を押し出すようにピペットを移動させることにより、各種ＰＡをカバースリップ又は組織培養プレートに塗布した。ＰＡコーティングを室温で３時間インキュベートした。プレートをその後の使用前に培地で静かにリンスした。色素で標識した各種ＰＡの実験では、Ｃｙ３で標識した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表４参照）。
インビトロ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１５０ｍＭのＮａＣｌと３ｍＭのＫＣｌの溶液で再構成し、細胞適合性と材料コンシステンシーを確保するために、１ＭのＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨ７．４に調整した。種々の生理活性ＰＡを種々のｍｏｌ％で混合し（表４参照）、１０秒間ずつ３回に分けて１０％強度でホーン型超音波装置により超音波処理した。ＰＡ溶液を８０℃で３０分間アニールした後、全試料を均等且つ制御下に加熱・冷却するためのサーモサイクラー（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ＰＣＲ Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ）を使用して２７℃の最終温度に達するように毎分１℃の割合でゆっくりと冷却した。ＰＡをコーティングした担体を作製するために、２４ウェル、１２ウェル、若しくは６ウェルポリスチレン細胞培養プレート又は１２ｍｍ及び１８ｍｍガラスカバースリップ（Ｇｅｒｍａｎ Ｇｌａｓｓ，Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ）にポリ－Ｄ－リジン（０．０１ｍｇ／ｍＬ，Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）を３７℃で３時間コーティングした。次にプレートをＭｉｌｌｉＱ水で３回リンスし、４時間乾燥した。表面全体に薄く均等な材料コーティング（アニールした各種ＰＡ（１重量％）８～３０μＬ）を押し出すようにピペットを移動させることにより、各種ＰＡをカバースリップ又は組織培養プレートに塗布した。ＰＡコーティングを室温で３時間インキュベートした。プレートをその後の使用前に培地で静かにリンスした。色素で標識した各種ＰＡの実験では、Ｃｙ３で標識した各種ＦＧＦ２ＰＡを１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表４参照）。
【手続補正12】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0136】
インビボ実験では、凍結乾燥後に、ＰＡ粉末を１ｍｇ／１００μｌの濃度となるように０．９％（ｗ／ｖ）滅菌等張塩化ナトリウム生理食塩水（Ｒｉｃｃａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ）で再構成した。次に、得られたＰＡ溶液に滅菌１Ｍ ＮａＯＨ１μＬを添加してｐＨを７．４に調整した後、ＩＫＶＡＶＰＡ２と１０ｍｏｌ％のＦＧＦ２ＰＡ１又はＦＧＦ２ＰＡ２のコアセンブリを加えた（表４参照）。混合後、溶液を超音波処理し、アニールした。色素で標識したＰＡの実験では、Ａｌｅｘａ－６４７で標識したＩＫＶＡＶＰＡ２を１ｍｏｌ％でそれらの対応する非標識ＰＡとコアセンブリした（表４参照）。
【手続補正13】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７Ｃ－１７Ｅ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図17C-17E】
【国際調査報告】