特表 2024-507873 エクソソームの単離方法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】エクソソームの単離方法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/071 20100101AFI20240214BHJP

   A61K 47/46 20060101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N5/071

A61K47/46

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023550596

(86)(22)【出願日】2022-02-23

(85)【翻訳文提出日】2023-09-07

(86)【国際出願番号】 US2022017554

(87)【国際公開番号】W WO2022182782

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/152,784

(32)【優先日】2021-02-23

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501326584

【氏名又は名称】バージニア テック インテレクチュアル プロパティーズ インコーポレーテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100114775

【弁理士】

【氏名又は名称】高岡 亮一

(74)【代理人】

【識別番号】100121511

【弁理士】

【氏名又は名称】小田 直

(74)【代理人】

【識別番号】100202751

【弁理士】

【氏名又は名称】岩堀 明代

(74)【代理人】

【識別番号】100208580

【弁理士】

【氏名又は名称】三好 玲奈

(74)【代理人】

【識別番号】100191086

【弁理士】

【氏名又は名称】高橋 香元

(72)【発明者】

【氏名】マーシュ，スペンサー

(72)【発明者】

【氏名】プリダム，ケヴィン ジェイ．

(72)【発明者】

【氏名】ジョーダン，リンダ ジェーン

(72)【発明者】

【氏名】ゴーディー，ロバート ジー．

【テーマコード（参考）】

4B065

4C076

【Ｆターム（参考）】

4B065AA90X

4B065AA93X

4B065AC20

4B065BA30

4B065CA43

4B065CA44

4B065CA46

4C076AA95

4C076EE56

(57)【要約】

本明細書の特定の例示的な実施形態では、カゼインを含むものなどの生体液からエクソソームを単離する方法が記載される。
【選択図】図２

【特許請求の範囲】

【請求項1】

生体液からエクソソームを単離する方法であって、
ａ．生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに適した条件下で前記生体液を遠心分離することと、
ｂ．前記分離された脂肪を前記生体液から除去することと、
ｃ．ステップ（ｂ）の後、残った生体液を１回または複数回遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に任意の顕著に分離された脂肪をスキミングすることと、
ｄ．ステップ（ｃ）の後に前記残った生体液を濾過することと、
ｅ．任意選択的に（ｄ）の後に１回または複数回超遠心分離ステップを実行することと、
ｆ．約１０ｍＭ～約１００ｍＭのＥＤＴＡを用いて、摂氏約３０～４２度で、（ｄ）または任意選択的に（ｅ）の後、任意選択的に約１５～１２０分間、二価カチオンをキレート化することと、
ｇ．（ｆ）の後、任意選択的にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得て、ここで、前記保持液は任意選択的に１回または複数回の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または－８０℃で保存され、前記保持液が任意選択的に超遠心分離されるか、または－８０℃で保存された後、任意選択的にカラム分離によって前記保持液の画分を分離することと、
を含み、
前記方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが、両方は含まない、前記方法。

【請求項2】

二価カチオンのキレート化が約３０ｍＭのＥＤＴＡで起こる、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

二価カチオンのキレート化が摂氏約３７度で起こる、請求項１に記載の方法。

【請求項4】

前記生体液が哺乳動物の乳である、請求項１に記載の方法。

【請求項5】

前記生体液が低温殺菌されていない、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

ステップ（ａ）及び（ｂ）を合わせて１～５回繰り返す、請求項１に記載の方法。

【請求項7】

ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、またはそれらの任意の組み合わせが、摂氏約４度で実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項8】

（ａ）が、前記生体液を約２，０００～３，０００ｒｃｆで遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項9】

（ａ）が、前記生体液を約２，５００ｒｃｆで遠心分離することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項10】

ステップ（ａ）が、１～３回繰り返される、請求項１に記載の方法。

【請求項11】

（ｂ）が、第１の遠心分離とそれに続く第２の遠心分離を含む、請求項１に記載の方法。

【請求項12】

前記第１の遠心分離が、前記残りの生体液を約１３，５００～１５，５００ｒｃｆで約４５～７５分間遠心分離することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記第１の遠心分離が、前記残りの生体液を約１４，５００ｒｃｆで約６０分間遠心分離することを含む、請求項１１に記載の方法。

【請求項14】

前記第２の遠心分離が、前記第１の遠心分離後に残った前記生体液に対して行われ、前記第２の遠心分離が、約２４，８００～２６，８００ｒｃｆで約４５～７５分間行われる、請求項１１に記載の方法。

【請求項15】

前記第２の遠心分離が、前記第１の遠心分離後に残った前記生体液に対して行われ、前記第２の遠心分離が、約２５，８００ｒｃｆで約６０分間行われる、請求項１４に記載の方法。

【請求項16】

前記第２の遠心分離が１～３回繰り返され、各繰り返しは直前の前記遠心分離からの前記残りの生体液に対して行われる、請求項１１に記載の方法。

【請求項17】

（ｄ）が、約０．４５ミクロンフィルタ～約０．２２ミクロンフィルタの範囲の直列した１つまたは複数のフィルタを通して前記残りの生体液を濾過することを含む、請求項１に記載の方法。

【請求項18】

（ｄ）が、約０．４５ミクロンフィルタを通して前記残りの生体液を濾過し、続いて約０．２２ミクロンフィルタを通して前記残りの生体液を濾過することを含む、請求項１７に記載の方法。

【請求項19】

（ｅ）が、２つ以上の連続する超遠心分離ステップを含み、各ステップは前の超遠心分離からの前記残りの生体液に対して実行される、請求項１に記載の方法。

【請求項20】

（ｅ）が、約４５，０００～５５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約６５，０００～７５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約９０，０００～１１０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

（ｅ）が、約５０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約７０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約１００，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の方法。

【請求項22】

前記１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数が、それぞれ約４５～７５分間実施される、請求項１９に記載の方法。

【請求項23】

前記１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数が、それぞれ約６０分間実施される、請求項１９に記載の方法。

【請求項24】

（ｅ）が、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される、請求項１に記載の方法。

【請求項25】

（ｅ）が、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される、請求項１に記載の方法。

【請求項26】

（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、約２５０ｋＤａ～約７５０ｋＤａの範囲のカットオフを有する限外濾過膜を使用して行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項27】

（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、２５０ｋＤａの限外濾過膜を使用して行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項28】

（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、毎分約５～１５ｍＬの流量で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項29】

（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、毎分約１０ｍＬの流量で行われる、請求項１に記載の方法。

【請求項30】

ステップ（ｇ）において、前記残りの生体液の量がタンジェンシャルフローフィルトレーション前のその開始体積の約１０パーセントに達すると、前記保持液が好適な緩衝液でダイアフィルトレーションされる、請求項１に記載の方法。

【請求項31】

前記保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した場合、前記保持液を超遠心分離することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記超遠心分離が、摂氏約４度で、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間行われる、請求項３１に記載の方法。

【請求項33】

前記超遠心分離が、摂氏約４度で、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間行われる、請求項３１に記載の方法。

【請求項34】

前記保持液が、開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した後、かつカラム分離前に、前記保持液が－８０℃で保存される、請求項３０に記載の方法。

【請求項35】

前記方法が、乳の開始量の少なくとも７．５パーセント、８パーセント、８．５パーセント、９パーセント、９．５パーセント、１０パーセント、１０．５パーセント、１１パーセント、１１．５パーセント、１２パーセント、１２．５パーセント、１３パーセント、１３．５パーセント、１４パーセント、１４．５パーセント、１５パーセント、１５．５パーセント、１６パーセント、１６．５パーセント、１７パーセント、１７．５パーセント、１８パーセント、１８．５パーセント、１９パーセント、１９．５パーセント、または少なくとも２０パーセントであるエクソソーム濃縮物を生成する、請求項１に記載の方法。

【請求項36】

前記方法が、先行請求項のいずれか一項に記載の方法から得られる製剤のエクソソームに、１つまたは複数のカーゴを搭載することをさらに含む、請求項１に記載の方法。

【請求項37】

エクソソームを含む製剤であって、請求項１～３６のいずれか一項に記載の方法によって少なくとも部分的に製造される、前記製剤。

【請求項38】

１つまたは複数の前記エクソソームに１つまたは複数のカーゴが搭載される、請求項３７に記載の製剤。

【請求項39】

請求項３８に記載される製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。

【請求項40】

前記１つまたは複数のカーゴが治療用カーゴである、請求項３９に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年２月２３日に出願された「エクソソーム単離方法」と題する同時係属中の米国仮特許出願第６３／１５２，７８４号の利益及び優先権を主張するものであり、その内容は参照により全体が本明細書に組み込まれる。

【0002】

連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＨＬ１６１２３７、ＨＬ０５６７２８、及びＨＬ１４１８５５に基づく政府の支援によりなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

【0003】

本明細書に開示される主題は、一般に、エクソソームの単離及び調製に関する。

【背景技術】

【0004】

エクソソームは、細胞によって放出される膜結合ナノ小胞であり、長距離細胞間シグナル伝達の進化的に保存された機構として機能する （Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ、２０１７）。ヒト及び他の哺乳類では、エクソソームはほぼすべての細胞型によって細胞外環境に分泌され、血液、リンパ、尿、乳を含むほとんどの生体液に豊富に含まれている（Ｇｙｏｒｇｙ，Ｂ．Ｓ．（２０１１）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－ａｒｔ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２６６７）。エクソソームは直径５０～１５０ｎｍと比較的均一で小さいサイズであり、ＣＤ８１、ＣＤ９、シンテニンを含む多くのタンパク質の優先的な発現を示すが、カルネキシンなどの他のタンパク質では示さない （Ｖｌａｓｓｏｖ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ： Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．ＢＢＡ－Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，９４０－９４７）。そうは言っても、エクソソームの構成要素は、それらが分泌される細胞の種類及び／または生理学的状態を反映して、大幅に変化する可能性がある（Ｂｌａｓｅｒ ＭＣ，Ａ．Ｅ．（２０１８）．Ｒｏｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｆｒｏｎｔ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ）。エクソソームカーゴには、脂質、タンパク質、及びヌクレオチド配列（例えば、マイクロＲＮＡ）が含まれ、これらは内部にカプセル化されるか、受容体や小胞膜上の接着分子などの外部部分として存在する可能性がある（Ｒａｎａ，Ｓ．Ｚ．（２０１１）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ： ａ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，５５９－５６２）インビボで生体シグナル伝達分子を輸送及び保護するエクソソームの能力は、薬物送達プラットフォームとして利用できることが明らかになり、製薬業界の注目を集めている。この魅力は、皮膚バリアなどの組織境界を通過する特定のエクソソーム集団の独特の能力によってさらに強化される（Ｃａｒｒａｓｃｏ Ｅ，Ｓ．－Ｈ．Ｇ．（２０１９）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２７５８），ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ（Ｙａｎｇ Ｔ，Ｍ．Ｐ．（２０１５）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００３－２０１４），ａｎｄ ｇｕｔ－ｂｌｏｏｄ ｂａｒｒｉｅｒ （Ｖａｓｈｉｓｈｔ Ｍ，Ｒ．Ｐ．（２０１７）．Ｃｕｒｃｕｍｉｎ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｉｌｋ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｒｅｓｉｓｔｓ ｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９９３－１００７）。エクソソームはまた、免疫監視を逃れているようであり、個体間及び種間で自家的に導入された場合でも免疫学的に良好な忍容性を示すことが報告されている（Ａｎｔｅｓ ＴＪ，Ｍ．Ｒ．（２０１８）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｏ ｉｎｊｕｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｕｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｌｏａｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）－薬物送達の安全性を向上させるための新しい手段として臨床に応用できる可能性への関心がさらに高まっている。エクソソームの臨床的及び実際的な使用に対する制限は、特に大量の場合、費用対効果の高い精製方法が利用できないことである。したがって、エクソソーム単離の改善された方法、特に工業規模のエクソソーム調製に拡張できる方法の必要性が存在する。

【0005】

本出願におけるいずれの文献の引用または特定も、かかる文献が本発明の先行技術として利用可能であることを承認するものではない。

【発明の概要】

【0006】

本明細書の特定の例示的な実施形態では、生体液からエクソソーム（小細胞外小胞とも呼ばれる）を単離する方法が記載されており、この方法は、生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに好適な条件下で生体液を遠心分離するステップと、分離した脂肪を生体液から除去するステップと、ステップ（ｂ）の後、残りの生体液を１回以上遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に顕著に分離した脂肪をスキミングするステップと、ステップ（ｃ）の後に残りの生体液を濾過し、任意選択で、（ｄ）の後に１回以上の超遠心分離ステップを実行するステップと、（ｄ）または場合により（ｅ）の後に、場合により約１５～１２０分間、摂氏約３０～４２度で、約１０ｍＭ～約１００ｍＭのＥＤＴＡを用いて二価カチオンをキレートするステップと、（ｆ）の後、任意にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得るステップであって、保持液は任意選択で１つまたは複数の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または、－８０℃で保存され、任意選択で保持液が超遠心分離、または－８０℃で保存された後に、任意選択でカラム分離によって保持液を分別するステップと、を含み、本方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが両方ではない。

【0007】

特定の例示的な実施形態では、二価カチオンキレート化は、約３０ｍＭのＥＤＴＡで生じる。

【0008】

特定の例示的な実施形態では、二価カチオンキレート化は、摂氏約３７度で生じる。

【0009】

特定の例示的な実施形態では、約３７度での二価イオンのキレート化は、６０分間生じる。

【0010】

特定の例示的な実施形態では、生体液は哺乳動物の乳である。

【0011】

特定の例示的な実施形態では、生体液は低温殺菌されていない。

【0012】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を合わせて１～５回繰り返す。

【0013】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、またはそれらの任意の組み合わせは、摂氏約４度で実行される。

【0014】

特定の例示的な実施形態では、（ａ）は、生体液を約２，０００～３，０００ｒｃｆで遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、（ａ）は、生体液を約２，５００ｒｃｆで遠心分離することを含む。

【0015】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）を１～３回繰り返す。

【0016】

特定の例示的な実施形態では、（ｂ）は、第１の遠心分離とそれに続く第２の遠心分離を含む。特定の例示的な実施形態では、第１の遠心分離は、残りの生体液を約１３，５００～１５，５００ｒｃｆで約４５～７５分間遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、第１の遠心分離は、残りの生体液を約１４，５００ｒｃｆで約６０分間遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離は、第１の遠心分離後に残った生体液に対して行われ、第２の遠心分離は、約２４，８００～２６，８００ｒｃｆで約４５～７５分間行われる。特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離は、第１の遠心分離後に残った生体液に対して行われ、第２の遠心分離は、約２５，８００ｒｃｆで約６０分間行われる。特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離が１～３回繰り返され、各繰り返しは直前の遠心分離からの残りの生体液に対して行われる。

【0017】

特定の例示的な実施形態では、（ｄ）は、連続して約０．４５ミクロンフィルタ～約０．２２ミクロンフィルタの範囲の直列した１つまたは複数のフィルタを通して残りの生体液を濾過することを含む。特定の例示的な実施形態では、（ｄ）は、約０．４５ミクロンフィルタを通して残りの生体液を濾過し、続いて約０．２２ミクロンフィルタを通して残りの生体液を濾過することを含む。

【0018】

特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、２つ以上の連続する超遠心分離ステップを含み、各ステップは前の超遠心分離からの残りの生体液に対して実行される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約４５，０００～５５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約６５，０００～７５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約９０，０００～１１０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約５０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約７０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約１００，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数は、それぞれ約４５～７５分間実施される。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数は、それぞれ約６０分間実施される。

【0019】

特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される。

【0020】

特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、約２５０ｋＤａ～約７５０ｋＤａの範囲のカットオフを有する限外濾過膜を使用して行われる。特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、２５０ｋＤａの限外濾過膜を使用して行われる。

【0021】

特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、毎分約５～１５ｍＬの流量で行われる。特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、毎分約１０ｍＬの流量で行われる。

【0022】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ｇ）において、残りの生体液の量がタンジェンシャルフローフィルトレーション前の開始体積の約１０パーセントに達すると、保持液が好適な緩衝液でダイアフィルトレーションされる。

【0023】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した場合、保持液を超遠心分離するステップをさらに含む。特定の例示的な実施形態では、超遠心分離は、摂氏約４度で、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間行われる。特定の例示的な実施形態では、超遠心分離は、摂氏約４度で、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間行われる。

【0024】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した場合に、保持液を超遠心分離するステップを含まない。特定の例示的な実施形態では、保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した後、かつカラム分離前に、保持液は－８０℃で保存される。

【0025】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、乳の開始量の少なくとも７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または少なくとも２０パーセントであるエクソソーム濃縮物を生成する。

【0026】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、先行請求項のいずれか一項に記載の方法から得られる製剤のエクソソームに、１つまたは複数のカーゴを搭載することをさらに含む。

【0027】

本明細書のある例示的な実施形態では、製剤、場合によっては医薬製剤が記載され、製剤は、本明細書に記載の方法によって少なくとも部分的にまたは全体が製造される。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数のエクソソームに１つまたは複数のカーゴが装填される。

【0028】

本明細書のある例示的な実施形態では、エクソソームを含む製剤、及び／または本明細書に記載のエクソソーム単離方法によって製造される製剤などの本明細書に記載の製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む方法が記載される。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数のカーゴは治療用カーゴである。

【0029】

これら及び例示的な実施形態の他の態様、目的、特徴、及び利点は、例示的な実施形態の以下の詳細な説明を考慮することで当業者に明白となろう。

【図面の簡単な説明】

【0030】

本発明の特徴及び長所の理解は、図解実施形態を明らかにする以下の詳細な記述を参照することによって得られ、その中で、発明の原理が利用され得、以下の図面が付随する。

【図1】乳からエクソソームを単離する超遠心分離ベースの方法の一実施形態におけるステップの概要。

【図2】乳からエクソソームを単離するタンジェンシャルフローフィルトレーションベースの方法の一実施形態におけるステップの概要。

【図3】Ａ～Ｅは、エクソソーム精製のための超遠心分離に基づくプロトコルの実施形態。図３Ａは、このＳＥＣ濾過ステップ中に収集された連続的なナノドロップ画分であり、タンパク質濃度がｍｇ／ｍｌでｙ軸に示されている。図３Ｂは、エクソソームマーカーＣＤ－８１、ＣＤ－９及びシンテニン、並びに非エクソソームマーカーカゼイン、Ａｒｆ６（微小胞マーカー）及びカルネキシン（細胞膜マーカー）のウェスタンブロット。ピークのエクソソームＳＥＣ画分は画分８と９の間に発生。カゼインを含む夾雑タンパク質が画分１２以降で優勢になる。ＨｅＬａ細胞からのライセートが比較対照として含まれる。図３Ｃは、エクソソーム分離株のＮａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ分析データ。図３Ｄは、最終的なエクソソーム分離株及び（図３Ｅ）カゼイン分離株のネガティブ染色電子顕微鏡観察。図３Ｄは、最終的なエクソソーム分離株及び（図３Ｅ）カゼイン分離株のネガティブ染色電子顕微鏡観察。

【図4】Ａ～Ｄは、ＴＦＦに基づくプロトコルの分析の概要。図４Ａは、最適化されたＴＦＦ－ＵＣプロトコルから得られるナノドロップは、関連するエクソソーム及びタンパク質画分を示す。図４Ｂは、エクソソームマーカーＣＤ－８１、ＣＤ－９及びシンテニン、並びに干渉タンパク質マーカーカゼイン、微小胞マーカーＡｒｆ６及びカルネキシンのウェスタンブロット分析。これらの結果は、タンパク質または微小胞を妨害することなく、高純度のエクソソームであることを示している。（図４Ｃ）エクソソーム分離株のＮａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ分析データ。ＮＴＡ分析で示される濃度（図４Ｄ）ピークＳＥＣ画分におけるエクソソームの超高密度蓄積及び（図４Ｄ）ピークタンパク質画分における高レベルのカゼインマクロ構造を示す、最終分離株のネガティブ染色電子顕微鏡検査

【図5】分離された乳エクソソームへのカルセインの取り込み。ＴＦＦベースの方法で生成されたＳＥＣ画分を含むピークエクソソームをＨｅｐｅｓ緩衝液で１：１０に希釈した。画像は、Ｃａｌｃｅｉｎ－ＡＭでの１、２、３、及び４時間のインキュベーションによる取り込みを示している。色素の取り込みは、細胞外小胞がエステラーゼ活性を含み、脱エステル化されたカルセイン分子を保持できることを示唆している。

【図6】乳エクソソームの単離を示す代表的な写真及びＴＥＭ画像。左上の写真画像は乳の開始量（１Ｌ）を示し、左下の写真画像はＴＦＦベースのエクソソーム単離によって取得されたエクソソーム濃縮物の典型的な単離後の体積約１２５ｍＬを示している。右のＴＥＭ画像は、ＴＦＦで単離されたエクソソームの代表的な高倍率画像を示している。挿入されたＴＥＭ画像は、標準エクソソームの高倍率を示している。代表的なＴＥＭ画像はＳＥＣ後であり、エクソソームには図４Ａの画分番号８．５が含まれている。

【図7】Ａ及びＢは、超遠心分離プロトコル中のエクソソームの損失の概要。ＵＣプロトコル中に大量のエクソソームが失われるため、ＵＣスピンの削減と手順にＴＦＦを組み込む必要性を強調している。図７Ａは、ＳＥＣで分離した１００，０００ｒｃｆペレットのヒストグラムを示し、下にピーク画分８．０～９．０のネガティブ染色されたＥＭ画像を示す。図７Ｂは、ＳＥＣで分離した７０，０００ｒｃｆペレットのヒストグラムを示し、下にピーク画分８．０～９．０のネガティブ染色されたＥＭ画像を示す。

【図8】１３０，０００ＲＣＦスピン後の超遠心分離プロトコル中のエクソソームの損失の概要。ＵＣプロトコルの終了時には多数のエクソソームが上清中に残されており、効率を最適化するために干渉タンパク質のＴＦＦ削減の必要性を強調している。

【図9】Ａ～Ｄは、エクソソーム試料に対する温度支援キレート化の様々な側面の影響。生の「ゴールドスタンダード」従来のＵＣ単離エクソソームインサートは、高いカゼインミセル構造を示す。図９Ｂは、ＳＥＣまたはＴＦＦ濾過のいずれかを利用しないＥＤＴＡ処理と組み合わせた完全な「ゴールドスタンダード」の従来の単離。図９Ｃは、３７℃で１時間、ＥＤＴＡ処理を行わずにＳＥＣ濾過を行った本開示の改変ＵＣプロトコルによる結果。図９Ｄは、室温（２０℃）で３０ｍＭ ＥＤＴＡで処理し、ＳＥＣ濾過した本開示の改変ＵＣプロトコルの結果。

【図10】３７℃での１０～１００ｍＭ ＥＤＴＡ処理では、全体的なエクソソームの損失だけでなく、ブラックボックスで示すようにエクソソームの超微細構造への損傷が発生し、エクソソーム単離の効率も低下する。

【図11A】超遠心分離法の実施形態によるヒト母乳からのエクソソームの単離。各画分におけるエクソソームまたはタンパク質の濃度（ｘ軸）をｍｇ／ｍＬ（ｙ軸）で示すグラフを示す。

【図11B】超遠心分離法の実施形態によるヒト母乳からのエクソソームの単離。エクソソーム分離株のＮａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ分析データを示す。

【図11C】超遠心分離法の実施形態によるヒト母乳からのエクソソームの単離。単離されたエクソソームの高倍率ＴＥＭ画像（図１１Ｃ）及び様々なエクソソーム画分の代表的なＴＥＭ画像（図１１Ｄ）を示す。

【図11D】超遠心分離法の実施形態によるヒト母乳からのエクソソームの単離。単離されたエクソソームの高倍率ＴＥＭ画像（図１１Ｃ）及び様々なエクソソーム画分の代表的なＴＥＭ画像（図１１Ｄ）を示す。

【図12】単離されたエクソソームに対するＳＥＣ後の保存の影響を示す代表的なＴＥＭ画像。保存条件はＴＥＭ画像の下に指定されている

【図13】Ａ及びＢは、ＳＥＣ前に保存した後の単離されたエクソソームの代表的なＴＥＭ画像である。図１３Ａは、－８０℃で保存していない新鮮な単離エクソソームを示す。図１３Ｂは、ＴＦＦ後及びＳＥＣ前－８０℃でＳＥＣ処理前に６か月間保存された単離エクソソームを示す。

【0031】

ここでの図は説明のみを目的としており、必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではない。

【発明を実施するための形態】

【0032】

本開示を詳細に説明する前に、本開示は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される専門用語が特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。

【0033】

他に定義されない限り、本明細書中で使用するすべての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載の方法及び物質と同様もしくは同等の任意の方法及び物質を本開示の実践または試験において使用することもできるが、好ましい方法及び物質は、これから説明される。

【0034】

本明細書で引用されるすべての刊行物及び特許は、それらの刊行物が引用される方法及び／または材料を開示及び説明するためである。係るすべての刊行物及び特許は、各個別の刊行物または特許が、参照することにより具体的かつ個別に組み込まれるように、参照することにより本明細書に組み込まれる。係る参照による組み込みは、引用された刊行物及び特許に記載されている方法及び／または材料に明示的に限定され、引用された刊行物及び特許の辞書編集上の定義には拡張されない。引用した刊行物及び特許における辞書編集上の定義で、本出願において明示的に繰り返していないものは、そのように取り扱われるべきではなく、添付の特許請求の範囲に登場する用語を定義するものとして読まれるべきではない。任意の刊行物の引用は、出願日前のその開示に対するものであり、本開示の範囲が先行開示のためにそのような刊行物に先行する権利がないことの承認として解釈すべきではない。さらに、提供される出版物の日付は、実際の出版日とは異なる場合があり、別々に確認する必要があり得る。

【0035】

本開示を読むと当業者には明らかであるように、本明細書に記載及び例示される個々の実施形態のそれぞれは、本開示の範囲または趣旨から逸脱することなく、他のいくつかの実施形態のうちのいずれかの特徴から容易に切り離されるか、または組み合わされ得る別個の成分及び特徴を有する。任意の列挙される方法は、列挙される事象の順で、または論理的に可能な任意の他の順序で行うことができる。

【0036】

範囲が表される場合、さらなる態様は、該１つの特定の値から、及び／または該他の特定の値までを含む。値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値から下限値の間の各介在値、並びにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本開示に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、より小さい範囲内に独立して含まれてもよく、表示範囲内の任意の具体的に除外された値に従って本発明内にも包含される。表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。例えば、表示範囲が１つまたは両方の限界値を含む場合、それらの含まれる限定値の片方または両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれ、例えば、「ｘ～ｙ」という表現は、「ｘ」～「ｙ」の範囲、及び「ｘ」超と「ｙ」未満を含む。本範囲は、例えば、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以下」などの上限として表すこともでき、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲、並びに「ｘ未満」、「ｙ未満」、及び「ｚ未満」の範囲も含むと解釈されるべきである。同様に、「約ｘ、ｙ、ｚ、またはそれ以上」という表現は、「約ｘ」、「約ｙ」、及び「約ｚ」の特定の範囲、並びに「ｘよりも大きい」、「ｙより大きい」、及び「ｚより大きい」の範囲も含むと解釈されるべきである。また、「ｘ」及び「ｙ」は数値である「約「ｘ」～「ｙ」」という表現は、「約「ｘ」～約「ｙ」」を含む。

【0037】

比率、濃度、量、及び他の数値データは、本明細書では範囲形式で表現され得ることに留意されたい。範囲のそれぞれの終点が、他の終点と関連してだけではなく、他の終点とは無関係でも、意味を表わすことが、更に理解されることになる。また、本明細書に開示されているいくつかの値があり、各々の値は、値自体に加えてその特定の値の「約（ａｂｏｕｔ）」としても本明細書に開示されているということが理解される。例えば、「１０」という値が開示されている場合、「約１０」も開示される。本明細書では、範囲は、「約（ａｂｏｕｔ）」である１つの特定の値から、及び／または「約（ａｂｏｕｔ）」である別の特定の値までのものとして表すことができる。同様に、先行の「約（ａｂｏｕｔ）」を使用して値が近似値として表される場合、特定の値がさらなる態様を形成することが理解される。例えば、「約１０」という値が開示されている場合、「１０」も開示される。

【0038】

係る範囲形式が便宜上、及び簡略に使用され、したがって、範囲の制限として明示的に記載された数値のみを含むのではなく、あたかも各数値及び部分的な範囲が明示的に指定されるかのように、その範囲内に包含されたすべての個々の数値または部分的な範囲も含むと柔軟に解釈されるべきであることを理解されたい。例示すると、「約０．１％～５％」という数値範囲は、明示的に記載された約０．１％～約５％の値だけでなく、示された範囲内の個々の値（例えば、約１％、約２％、約３％、及び約４％）及び部分範囲（例えば、約０．５％～約１．１％、約５％～約２．４％、約０．５％～約３．２％、及び約０．５％～約４．４％、及びその他の可能なサブ範囲）も含むものと解釈されるべきである。
一般的な定義

【0039】

他に定義されない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語と技術の定義は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ，ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，４^ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２）（Ｇｒｅｅｎ ａｎｄ Ｓａｍｂｒｏｏｋ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８７）（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．）；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９５）（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ，ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．）：Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ ２０１３（Ｅ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ ｅｄ．）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（１９８７）（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．）；Ｂｅｎｊａｍｉｎ Ｌｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ ＩＸ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｊｏｎｅｓ ａｎｄ Ｂａｒｔｌｅｔ，２００８（ＩＳＢＮ ０７６３７５２２２３）；Ｋｅｎｄｒｅｗ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｈｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ．，１９９４（ＩＳＢＮ ０６３２０２１８２９）；Ｒｏｂｅｒｔ Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｂｙ ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ ９７８０４７１１８５７１０）；Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９４），Ｍａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ４ｔｈｅｄ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．１９９２）；及びＭａｒｔｅｎ Ｈ．Ｈｏｆｋｅｒ ａｎｄ Ｊａｎ ｖａｎ Ｄｅｕｒｓｅｎ，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，２^ｎｄｅｄｉｔｉｏｎ（２０１１）に見出され得る。

【0040】

本明細書で使用する場合、文脈上明らかに別段に示されている場合を除き、「ある、１つの（ａ：不定冠詞）」、「ある、１つの（ａｎ：不定冠詞）」及び「この、その（ｔｈｅ：定冠詞）」という単数形には、単数及び複数両方の言及物が含まれる。

【0041】

本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「実質的に」等は、パラメータ、量、時間的持続時間等の測定可能な変数に関連して使用される場合、以下の変化を包含することを意味する。及び実験誤差内の値を含む特定の値から（これは、例えば所与のデータセット、当該技術分野で認められた標準によって、及び／または例えば所与の信頼区間（例えば平均からの９０％、９５％、またはそれ以上の信頼区間）を用いて決定することができる）指定された値からの＋／－１０％以下、＋／－５％以下、＋／－１％以下、及び＋／－０．１％以下の変動など、そのような変動が適切である限り、開示された発明を実行する。本明細書で使用される場合、「約」、「およそ」、「または約」、及び「実質的に」という用語は、問題の量または値が、本明細書の特許請求の範囲に記載されるまたは教示されるものと同等の結果または効果をもたらす正確な値、またはある値であり得ることを意味し得る。つまり、量、サイズ、配合、パラメータ、及びその他の量と特性は正確ではなく、またその必要もないが、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、及び同等の結果または効果が得られるような当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて近似値及び／またはそれより大きくまたは小さくてもよいことが理解される。状況によっては、同等の結果または効果をもたらす値を合理的に決定できない場合がある。一般に、量、サイズ、配合、パラメータ、または他の量もしくは特徴は、そのように明示的に述べられているか否かにかかわらず、「約」、「およそ」、または「ほぼ」である。「約」、「およそ」、または「または約」が定量値の前に使用される場合、特に明記しない限り、パラメータには特定の定量値自体も含まれることが理解される。

【0042】

本明細書で使用される場合、「任意選択」または「任意選択に」という用語は、後に記載される事象または状況が発生する場合と発生しない場合があり、説明には当該の事象または状況が発生する場合と発生しない場合が含まれることを意味する。

【0043】

端点による数値範囲の記載には、記載された端点だけでなく、それぞれの範囲内に包含されるすべての数値及び分数が含まれる。

【0044】

本明細書で使用される場合、「生体試料」は、全細胞及び／または生細胞及び／または細胞破片を含み得る。生体試料には「生体液」が含まれ得る（または生体液に由来し得る）。本発明は、生体液が羊水、房水、硝子生体液、胆汁、血清、母乳、脳脊髄液、耳垢（ｃｅｒｕｍｅｎ）（耳垢（ｅａｒｗａｘ））、乳び、糜粥、内リンパ、外リンパ、滲出液、糞便、女性精液、胃酸、胃液、リンパ、粘液（鼻水、痰を含む）、心嚢液、腹膜液、胸水、膿、ダイオウ、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、喀痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物、及びそれらの１つ以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養物、生体液、生体液からの細胞培養物を含む。生体液は、例えば穿刺、または他の収集またはサンプリング手順によって哺乳動物から得ることができる。

【0045】

「対象」、「個体」、または「患者」は本明細書では同義に使用され、脊椎動物、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトを指す。哺乳類としては、マウス、サル、ヒト、家畜、狩猟動物、及び愛玩動物が挙げられるが、これらに限定されない。インビボで得られたまたはインビトロで培養された生物学的実体の組織、細胞、及びそれらの後代もまた包含される。

【0046】

以下、様々な実施形態について説明する。特定の実施形態は、網羅的な説明または本明細書で論じるより広範な態様への限定を意図したものではないことに留意されたい。特定の実施形態に関連して説明される一態様は、必ずしもその実施形態に限定されるわけではなく、他の任意の実施形態でも実施することができる。本明細書を通して、「一実施形態（ｏｎｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「一実施形態（ａｎ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「例示的実施形態（ａｎ ｅｘａｍｐｌｅ ｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」への言及は、実施形態に関連して説明されている特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。このため、本明細書全体の多様な場所で「一実施形態では」、「ある実施形態では」または「例示的実施形態では」という句の出現は、必ずしも全て同じ態様を言及しているわけではないが、そうである場合もある。さらに、特定の特徴、構造、または特色は、１つまたは複数の実施形態における、本開示から当業者には明らかであろう任意の好適な方法で組み合わせることができる。さらに、本明細書に記載されるいくつかの実施形態は、他の実施形態に含まれるいくつかの特徴を含むが、他の特徴は含まないが、異なる実施形態の特徴の組み合わせは本発明の範囲内にあることを意味する。例えば、添付の特許請求の範囲では、請求された実施形態のいずれも任意の組み合わせで使用することができる。

【0047】

この本明細書に記載される全ての刊行物、公告された特許書類、及び特許出願は、各個別の刊行物、公告された特許書類、または特許出願が、明確かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
概要

【0048】

エクソソームは、細胞によって放出される膜結合ナノ小胞であり、長距離細胞間シグナル伝達の進化的に保存された機構として機能する（Ｂｏｕｌａｎｇｅｒ、２０１７）。ヒト及び他の哺乳類では、エクソソームはほぼすべての細胞型によって細胞外環境に分泌され、血液、リンパ、尿、乳を含むほとんどの生体液に豊富に含まれている、小細胞外小胞である（Ｇｙｏｒｇｙ，Ｂ．Ｓ．２０１１）．Ｍｅｍｂｒａｎｅ ｖｅｓｉｃｌｅｓ，ｃｕｒｒｅｎｔ ｓｔａｔｅ－ｏｆ－ｔｈｅ－ａｒｔ：ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ．Ｃｅｌｌｕｌａｒ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｌｉｆｅ ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２６６７）。エクソソームは直径５０～１５０ｎｍと比較的均一で小さいサイズであり、ＣＤ８１、ＣＤ９、シンテニンを含む多くのタンパク質の優先的な発現を示すが、カルネキシンなどの他のタンパク質では示さない（Ｖｌａｓｓｏｖ，Ａ．Ｍ．（２０１２）．Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ，ａｎｄ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｏｔｅｎｔｉａｌｓ．ＢＢＡ－Ｇｅｎｅｒａｌ Ｓｕｂｊｅｃｔｓ，９４０－９４７）。そうは言っても、エクソソームの構成要素は、それらが分泌される細胞の種類及び／または生理学的状態を反映して、大幅に変化する可能性がある（Ｂｌａｓｅｒ ＭＣ，Ａ．Ｅ．（２０１８）．Ｒｏｌｅｓ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ Ｍｉｎｅｒａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｆｒｏｎｔ Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ Ｍｅｄ．）。エクソソームカーゴには、脂質、タンパク質、及びヌクレオチド配列（例えば、マイクロＲＮＡ）が含まれ、これらは内部にカプセル化されるか、受容体や小胞膜上の接着分子などの外部部分として存在する可能性がある（Ｒａｎａ，Ｓ．Ｚ．（２０１１）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｔａｒｇｅｔ ｃｅｌｌ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍａｌ ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎｓ：ａ ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ．Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｏｃ Ｔｒａｎｓ，５５９－５６２）。インビボで生体シグナル伝達分子を輸送及び保護するエクソソームの能力は、薬物送達プラットフォームとして利用できることが明らかになり、製薬業界の注目を集めている。この魅力は、皮膚バリアなどの組織境界を通過する特定のエクソソーム集団の独特の能力によってさらに強化される（Ｃａｒｒａｓｃｏ Ｅ，Ｓ．－Ｈ．Ｇ．（２０１９）．Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｎ Ｃｕｔａｎｅｏｕｓ Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｈａｉｒ Ｆｏｌｌｉｃｌｅ Ｄｙｎａｍｉｃｓ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ，２７５８），ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ－ｂａｒｒｉｅｒ（Ｙａｎｇ Ｔ，Ｍ．Ｐ．（２０１５）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００３－２０１４），ａｎｄ ｇｕｔ－ｂｌｏｏｄ ｂａｒｒｉｅｒ（Ｖａｓｈｉｓｈｔ Ｍ，Ｒ．Ｐ．（２０１７）．Ｃｕｒｃｕｍｉｎ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｍｉｌｋ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｒｅｓｉｓｔｓ ｈｕｍａｎ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｏｓｓｅｓｓｅｓ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｉｎ ｖｉｔｒｏ．Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，９９３－１００７）。エクソソームはまた、免疫監視を逃れているようであり、個体間及び種間で自家的に導入された場合でも免疫学的に良好な忍容性を示すことが報告されている（Ａｎｔｅｓ ＴＪ，Ｍ．Ｒ．（２０１８）．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｏ ｉｎｊｕｒｅｄ ｔｉｓｓｕｅ ｕｓｉｎｇ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｌｏａｋｉｎｇ ａｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｄｉｓｐｌａｙ．Ｊ Ｎａｎｏｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）－薬物送達の安全性を向上させるための新しい手段として臨床に応用できる可能性への関心がさらに高まっている。

【0049】

生体液からエクソソームを分離する方法は数多くあるが、現在の「ゴールドスタンダード」技術は超遠心分離（ＵＣ）に基づいている。これらの方法には通常、分画遠心分離ステップ及び／または密度勾配ＵＣベースの分離を含む。ただし、エクソソームを大量に生成する能力は、複数のＵＣステップが必要であることと、ＵＣが少量しかスピンできないという事実によって制限される。さらに、繰り返しのＵＣスピン中に加えられるせん断力が、エクソソームの構造的完全性に悪影響を与える可能性があることも残されている（Ｔａｙｌｏｒ ＤＤ，Ｓ．Ｓ．（２０１５）．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｉｎｇ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ ｉｍｐａｃｔ ｄｏｗｎ－ｓｔｒｅａｍ ａｎａｌｙｓｅｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃａｒｇｏｅｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，３－１０）。エクソソーム単離中に物理的厳密性がそれほど高くない他の技術としては、限外濾過、タンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、及びポリエチレングリコール沈殿ベースの方法が挙げられる。それぞれの使用法は十分に文書化されており、大多数のグループは１つの単独の方法ではなく、これらのアプローチを組み合わせて使用している（Ｐｉｎ Ｌｉ，Ｍ．Ｋ．（２０１７）．Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｅｘｏｓｏｍｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ，７８９－８０４；Ｅｓｃｕｄｉｅｒ．（２００５）．Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ ｄｅｒｉｖｅｄ ｅｘｏｓｏｍｅｓ：ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｐｈａｓｅ Ｉ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｔｒｉａｌ．Ｊ ｔｒａｎｓｌ．ｍｅｄ，１－１３；Ｒｏｏｄ．（２０１０）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｔｈｒｅｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｕｒｉｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ ｔｏ ｉｄｅｎｔｉｆｙ ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ ｎｅｐｈｒｏｔｉｃ ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｋｉｄｎｅｙ Ｉｎｔ，８１０－８１６； ａｎｄ Ａｎ Ｍ．，Ｗ．Ｊ．（２０１８）．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ａｎ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｖｅｒｓｕｓ ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｓｅｒｕｍ．Ｊ Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｒｅｓ，３５９９－３６０５）。

【0050】

したがって、エクソソームの臨床的及び実際的な使用に対する明らかな制限は、特に大量の場合の費用対効果の高い精製方法が存在することと、改善されたエクソソーム単離方法、特に工業規模のエクソソーム調製に拡張できる方法の必要性が存在することである。

【0051】

そうは言っても、本明細書に開示される実施形態は、エクソソームの大規模な収量を提供できる、エクソソーム、特に乳エクソソームの単離及び／または精製の方法及び技術を提供することができる。本開示の他の組成物、化合物、方法、特徴、及び／または利点は、以下の図面及び発明を実施するための形態、及び実施例を検討することにより当業者に明らかになるであろう。このような追加の組成物、化合物、方法、特徴、及び利点のすべてがこの説明に含まれ、本開示の範囲内に含まれることが意図される。

【0052】

エクソソームの単離方法
近年、哺乳類の乳にはエクソソームが豊富に含まれており、これらの小さな細胞外小胞の大規模生産源となる可能性があることが認識されるようになった。ウシ乳は乳業によって大量に生産され、広く消費されており、一般に人間の免疫学的耐容性が良い。さらに、乳エクソソームは腸から血液循環に入り、脳、心臓、腸、肺などの様々な臓器に移動することが報告されてい（Ｗｏｌｆ Ｔ，Ｂ．Ｓ．（２０１５）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｃｏ－２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒａｔ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ＩＥＣ－６ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ，２２０１－２２０６）、これらは、カーゴ（治療薬を含むがこれに限定されない）を搭載したエクソソームの経口投与の基礎を提供できる特性である。そうは言っても、乳にはタンパク質、ミネラル、脂質、その他の高分子の多様な混合物が含まれている。乳成分の複雑さにより、これらの細胞外小胞の精製に大きな課題が生じる。カゼインタンパク質は乳の主要成分であり、全乳タンパク質の約８０％を占める。カゼインは、リン酸カルシウム及び他の乳タンパク質と大きなコロイド複合体に凝集して、カゼインミセルと呼ばれるものを形成する。これらのミセルは直径約１０ｎｍであり、さらに合体してより大きな凝固構造を形成することができる（Ｂｈａｔ，Ｍ．Ｔ．（２０１６）．Ｃａｓｅｉｎ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｓｐｅｃｔｓ．Ｉｎｔｅｃｈ）。カゼインミセル凝集体は、静水圧相互作用を介してエクソソームに結合し、捕らえられ、汚染された乳タンパク質からの分離を妨げると考えられている；乳由来エクソソーム調製物の透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析によって確認された観察結果（Ｓｅｄｙｋｈ ＳＥ、Ｂ．Ｅ．（２０２０）．Ｍｉｌｋ Ｅｘｏｓｏｍｅｓ：Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ，ａｎｄ Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ ｏｆ Ｕｓｅ．Ｉｎ Ｃ．Ｊ．Ｄｅ Ｂｏｎａ Ａ．Ｇ．，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｈｅａｌｔｈ．Ｉｎｔｅｃｈ Ｏｐｅｎ）。その結果、乳から高純度のエクソソームを単離する現在の方法は、カゼインなどの混在タンパク質によって制限される。本明細書のいくつかの実施形態では、乳タンパク質から構造的及び機能的に無傷のエクソソームを高収率で分離する、特定の温度でのＣａ^２＋及び他の二価カチオンのキレート化を組み込むことを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、カゼインミセル可溶化ステップは、エクソソーム単離のためのＵＣベース及び／またはＴＦＦ及びＳＥＣ濾過ステップを伴う方法に含めることができ、それによって、乳から精製された高品質エクソソームの大規模生産の基礎が提供される。

【0053】

特定の例示的な実施形態では、生体液からエクソソームを単離する方法が記載されており、（ａ）生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに好適な条件下で生体液を遠心分離するステップと、（ｂ）分離した脂肪を生体液から除去するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の後、残りの生体液を１回以上遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に顕著に分離した脂肪をスキミングするステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に残りの生体液を濾過するステップと、（ｅ）任意選択で、（ｄ）の後に１回以上の超遠心分離ステップを実行するステップと、（ｆ）（ｄ）または場合により（ｅ）の後に、同等のキレート化濃度で、摂氏約３０～４２度で、場合により約１５～１２０分間、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）及び／または１，２－ビス（ｏ－アミノフェノキシ）エタン－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）、エチレングリコール－ビス（β－アミノエチルエーテル）－Ｎ，Ｎ，Ｎ′，Ｎ′－テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸ナトリウム、及びニトロフェンを含むが、これらに限定されない他のキレート剤により二価カチオンをキレートするステップと、（ｇ）（ｆ）の後、任意にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得るステップであって、保持液は任意選択で１つまたは複数の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または、－８０℃で保存され、任意選択で保持液が超遠心分離、または－８０℃で保存された後に、任意選択でカラム分離によって保持液を分別するステップと、を含み、本方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが両方ではない。例えば、図１～２を参照のこと。

【0054】

いくつかの実施形態では、イオン濃度を低下させる方法において透析を使用することができる。いくつかの実施形態では、キレート剤は二価カチオンキレート剤である。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡ及び／または他のキレート剤であり、限定されないが、等価のキレート化濃度で含まれるＢＡＰＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸ナトリウム、ニトロフェンが挙げられる。いくつかの実施形態では、キレート剤の濃度は、約１０ｍＭ～約１００ｍＭの範囲であり得る。いくつかの実施形態では、キレート剤はＥＤＴＡであり、約３０ｍＭで存在する。いくつかの実施形態では、二価カチオンキレート化は、摂氏約３７度で生じる。いくつかの実施形態では、二価カチオンキレート化は、摂氏約３７度で生じ、約６０分間実行される。

【0055】

特定の実施例では、実施形態は、生体液からエクソソームを単離する方法であり、（ａ）生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに好適な条件下で生体液を遠心分離するステップと、（ｂ）分離した脂肪を生体液から除去するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の後、残りの生体液を１回以上遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に顕著に分離した脂肪をスキミングするステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に残りの生体液を濾過するステップと、（ｅ）任意選択で、（ｄ）の後に１回以上の超遠心分離ステップを実行するステップと、（ｆ）（ｄ）または場合により（ｅ）の後に、場合により約１５～１２０分間、摂氏約３０～４２度、約３０ｍＭでのＥＤＴＡを用いて二価カチオンをキレートするステップと、（ｇ）（ｆ）の後、任意にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得るステップであって、保持液は任意選択で１つまたは複数の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または、－８０℃で保存され、任意選択で保持液が超遠心分離、または－８０℃で保存された後に、任意選択でカラム分離によって保持液を分別するステップと、を含み、本方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが両方ではない。

【0056】

特定の実施例では、実施形態は、生体液からエクソソームを単離する方法であり、（ａ）生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに好適な条件下で生体液を遠心分離するステップと、（ｂ）分離した脂肪を生体液から除去するステップと、（ｃ）ステップ（ｂ）の後、残りの生体液を１回以上遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に顕著に分離した脂肪をスキミングするステップと、（ｄ）ステップ（ｃ）の後に残りの生体液を濾過するステップと、（ｅ）任意選択で、（ｄ）の後に１回以上の超遠心分離ステップを実行するステップと、（ｆ）（ｄ）または場合により（ｅ）の後に、場合により約６０分間、摂氏約３７度、約３０ｍＭでのＥＤＴＡを用いて二価カチオンをキレートするステップと、（ｇ）（ｆ）の後、任意にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得るステップであって、保持液は任意選択で１つまたは複数の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または、－８０℃で保存され、任意選択で保持液が超遠心分離、または－８０℃で保存された後に、任意選択でカラム分離によって保持液を分別するステップと、を含み、本方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが両方ではない。

【0057】

いくつかの実施形態では、（ｆ）は約３０℃、３０．５℃、３１℃、３１．５℃、３２℃、３２．５℃、３３℃、３３．５℃、３４℃、３４．５℃、３５℃、３５．５℃、３６℃、３６．５℃、３７℃、３７．５℃、３８℃、３８．５℃、３９℃、３９．５℃、４０℃、４０．５℃、４１℃、４１．５℃、または約４２℃で実行される。

【0058】

いくつかの実施形態では、（ｆ）は、約５分、６分、７分、８分、９分、１０分、１１分、１２分、１３分、１４分、１５分、１６分、１７分、１８分、１９分、２０分、２１分、２２分、２３分、２４分、２５分、２６分、２７分、２８分、２９分、３０分、３１分、３２分、３３分、３４分、３５分、３６分、３７分、３８分、３９分、４０分、４１分、４２分、４３分、４４分、４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、６１分、６２分、６３分、６４分、６５分、６６分、６７分、６８分、６９分、７０分、７１分、７２分、７３分、７４分、７５分、７６分、７７分、７８分、７９分、８０分、８１分、８２分、８３分、８４分、８５分、８６分、８７分、８８分、８９分、９０分、９１分、９２分、９３分、９４分、９５分、９６分、９７分、９８分、９９分、１００分、１０１分、１０２分、１０３分、１０４分、１０５分、１０６分、１０７分、１０８分、１０９分、１１０分、１１１分、１１２分、１１３分、１１４分、１１５分、１１６分、１１７分、１１８分、１１９分、１２０分、１２１分、１２２分、１２３分、１２４分、１２５分、１２６分、１２７分、１２８分、１２９分、１３０分、１３１分、１３２分、１３３分、１３４分、１３５分、１３６分、１３７分、１３８分、１３９分、１４０分、１４１分、１４２分、１４３分、１４４分、１４５分、１４６分、１４７分、１４８分、１４９分、１５０分、１５１分、１５２分、１５３分、１５４分、１５５分、１５６分、１５７分、１５８分、１５９分、１６０分、１６１分、１６２分、１６３分、１６４分、１６５分、１６６分、１６７分、１６８分、１６９分、１７０分、１７１分、１７２分、１７３分、１７４分、１７５分、１７６分、１７７分、１７８分、１７９分、または約１８０分間まで実行される。

【0059】

いくつかの実施形態では、ＥＤＴＡ、ＢＡＰＤＴＡ、ＥＧＴＡ、クエン酸ナトリウム、ニトロペン及び／または同様のものなどのキレート剤の濃度は、約０ｍＭ、１０．５ｍＭ、１１ｍＭ、１１．５ｍＭ、１２ｍＭ、１２．５ｍＭ、１３ｍＭ、１３．５ｍＭ、１４ｍＭ、１４．５ｍＭ、１５ｍＭ、１５．５ｍＭ、１６ｍＭ、１６．５ｍＭ、１７ｍＭ、１７．５ｍＭ、１８ｍＭ、１８．５ｍＭ、１９ｍＭ、１９．５ｍＭ、２０ｍＭ、２０．５ｍＭ、２１ｍＭ、２１．５ｍＭ、２２ｍＭ、２２．５ｍＭ、２３ｍＭ、２３．５ｍＭ、２４ｍＭ、２４．５ｍＭ、２５ｍＭ、２５．５ｍＭ、２６ｍＭ、２６．５ｍＭ、２７ｍＭ、２７．５ｍＭ、２８ｍＭ、２８．５ｍＭ、２９ｍＭ、２９．５ｍＭ、３０ｍＭ、３０．５ｍＭ、３１ｍＭ、３１．５ｍＭ、３２ｍＭ、３２．５ｍＭ、３３ｍＭ、３３．５ｍＭ、３４ｍＭ、３４．５ｍＭ、３５ｍＭ、３５．５ｍＭ、３６ｍＭ、３６．５ｍＭ、３７ｍＭ、３７．５ｍＭ、３８ｍＭ、３８．５ｍＭ、３９ｍＭ、３９．５ｍＭ、４０ｍＭ、４０．５ｍＭ、４１ｍＭ、４１．５ｍＭ、４２ｍＭ、４２．５ｍＭ、４３ｍＭ、４３．５ｍＭ、４４ｍＭ、４４．５ｍＭ、４５ｍＭ、４５．５ｍＭ、４６ｍＭ、４６．５ｍＭ、４７ｍＭ、４７．５ｍＭ、４８ｍＭ、４８．５ｍＭ、４９ｍＭ、４９．５ｍＭ、５０ｍＭ、５０．５ｍＭ、５１ｍＭ、５１．５ｍＭ、５２ｍＭ、５２．５ｍＭ、５３ｍＭ、５３．５ｍＭ、５４ｍＭ、５４．５ｍＭ、５５ｍＭ、５５．５ｍＭ、５６ｍＭ、５６．５ｍＭ、５７ｍＭ、５７．５ｍＭ、５８ｍＭ、５８．５ｍＭ、５９ｍＭ、５９．５ｍＭ、６０ｍＭ、６０．５ｍＭ、６１ｍＭ、６１．５ｍＭ、６２ｍＭ、６２．５ｍＭ、６３ｍＭ、６３．５ｍＭ、６４ｍＭ、６４．５ｍＭ、６５ｍＭ、６５．５ｍＭ、６６ｍＭ、６６．５ｍＭ、６７ｍＭ、６７．５ｍＭ、６８ｍＭ、６８．５ｍＭ、６９ｍＭ、６９．５ｍＭ、７０ｍＭ、７０．５ｍＭ、７１ｍＭ、７１．５ｍＭ、７２ｍＭ、７２．５ｍＭ、７３ｍＭ、７３．５ｍＭ、７４ｍＭ、７４．５ｍＭ、７５ｍＭ、７５．５ｍＭ、７６ｍＭ、７６．５ｍＭ、７７ｍＭ、７７．５ｍＭ、７８ｍＭ、７８．５ｍＭ、７９ｍＭ、７９．５ｍＭ、８０ｍＭ、８０．５ｍＭ、８１ｍＭ、８１．５ｍＭ、８２ｍＭ、８２．５ｍＭ、８３ｍＭ、８３．５ｍＭ、８４ｍＭ、８４．５ｍＭ、８５ｍＭ、８５．５ｍＭ、８６ｍＭ、８６．５ｍＭ、８７ｍＭ、８７．５ｍＭ、８８ｍＭ、８８．５ｍＭ、８９ｍＭ、８９．５ｍＭ、９０ｍＭ、９０．５ｍＭ、９１ｍＭ、９１．５ｍＭ、９２ｍＭ、９２．５ｍＭ、９３ｍＭ、９３．５ｍＭ、９４ｍＭ、９４．５ｍＭ、９５ｍＭ、９５．５ｍＭ、９６ｍＭ、９６．５ｍＭ、９７ｍＭ、９７．５ｍＭ、９８ｍＭ、９８．５ｍＭ、９９ｍＭ、９９．５ｍＭ、まで／または約１００ｍＭである。

【0060】

特定の例示的な実施形態では、生体液はカゼインを含有する。特定の例示的な実施形態では、生体液は哺乳動物の乳である。特定の例示的な実施形態では、生体液は低温殺菌されていない。いくつかの実施形態では、哺乳動物の乳は低温殺菌されていない。いくつかの実施形態では、哺乳動物の乳は低温殺菌されている。いくつかの実施形態では、哺乳動物の乳は、ウシ乳、ヒツジ乳、ブタ乳、ラクダ乳、ウマ乳、キャプラ乳、ヒト乳及び／または同様のものである。

【0061】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を合わせて１～５回繰り返す。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）及び（ｂ）を合わせて１、２、３、４または５回繰り返す。

【0062】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、またはそれらの任意の組み合わせは、摂氏４度または約４度で実行される。

【0063】

特定の例示的な実施形態では、（ａ）は、生体液を約２，５００ｒｃｆで遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、（ａ）は、生体液を約２，０００～３，０００ｒｃｆで遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、（ａ）は、生体液を約２０００ｒｃｆ、２０１０ｒｃｆ、２０２０ｒｃｆ、２０３０ｒｃｆ、２０４０ｒｃｆ、２０５０ｒｃｆ、２０６０ｒｃｆ、２０７０ｒｃｆ、２０８０ｒｃｆ、２０９０ｒｃｆ、２１００ｒｃｆ、２１１０ｒｃｆ、２１２０ｒｃｆ、２１３０ｒｃｆ、２１４０ｒｃｆ、２１５０ｒｃｆ、２１６０ｒｃｆ、２１７０ｒｃｆ、２１８０ｒｃｆ、２１９０ｒｃｆ、２２００ｒｃｆ、２２１０ｒｃｆ、２２２０ｒｃｆ、２２３０ｒｃｆ、２２４０ｒｃｆ、２２５０ｒｃｆ、２２６０ｒｃｆ、２２７０ｒｃｆ、２２８０ｒｃｆ、２２９０ｒｃｆ、２３００ｒｃｆ、２３１０ｒｃｆ、２３２０ｒｃｆ、２３３０ｒｃｆ、２３４０ｒｃｆ、２３５０ｒｃｆ、２３６０ｒｃｆ、２３７０ｒｃｆ、２３８０ｒｃｆ、２３９０ｒｃｆ、２４００ｒｃｆ、２４１０ｒｃｆ、２４２０ｒｃｆ、２４３０ｒｃｆ、２４４０ｒｃｆ、２４５０ｒｃｆ、２４６０ｒｃｆ、２４７０ｒｃｆ、２４８０ｒｃｆ、２４９０ｒｃｆ、２５００ｒｃｆ、２５１０ｒｃｆ、２５２０ｒｃｆ、２５３０ｒｃｆ、２５４０ｒｃｆ、２５５０ｒｃｆ、２５６０ｒｃｆ、２５７０ｒｃｆ、２５８０ｒｃｆ、２５９０ｒｃｆ、２６００ｒｃｆ、２６１０ｒｃｆ、２６２０ｒｃｆ、２６３０ｒｃｆ、２６４０ｒｃｆ、２６５０ｒｃｆ、２６６０ｒｃｆ、２６７０ｒｃｆ、２６８０ｒｃｆ、２６９０ｒｃｆ、２７００ｒｃｆ、２７１０ｒｃｆ、２７２０ｒｃｆ、２７３０ｒｃｆ、２７４０ｒｃｆ、２７５０ｒｃｆ、２７６０ｒｃｆ、２７７０ｒｃｆ、２７８０ｒｃｆ、２７９０ｒｃｆ、２８００ｒｃｆ、２８１０ｒｃｆ、２８２０ｒｃｆ、２８３０ｒｃｆ、２８４０ｒｃｆ、２８５０ｒｃｆ、２８６０ｒｃｆ、２８７０ｒｃｆ、２８８０ｒｃｆ、２８９０ｒｃｆ、２９００ｒｃｆ、２９１０ｒｃｆ、２９２０ｒｃｆ、２９３０ｒｃｆ、２９４０ｒｃｆ、２９５０ｒｃｆ、２９６０ｒｃｆ、２９７０ｒｃｆ、２９８０ｒｃｆ、２９９０ｒｃｆ、～／または約３０００ｒｃｆで遠心分離することを含む。

【0064】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ａ）を１～３回繰り返す。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）を１～３回繰り返す。

【0065】

特定の例示的な実施形態では、（ｂ）は、第１の遠心分離とそれに続く第２の遠心分離を含む。特定の例示的な実施形態では、第１の遠心分離は、残りの生体液を約１４，５００ｒｃｆで約６０分間遠心分離することを含む。特定の例示的な実施形態では、第１の遠心分離は、残りの生体液を約１３，５００ｒｃｆ～約１５，５００ｒｃｆで約４５～７５分間遠心分離することを含む。いくつかの実施形態では、第１の遠心分離は、残りの生体液を約１３５００ｒｃｆ、１３５５０ｒｃｆ、１３６００ｒｃｆ、１３６５０ｒｃｆ、１３７００ｒｃｆ、１３７５０ｒｃｆ、１３８００ｒｃｆ、１３８５０ｒｃｆ、１３９００ｒｃｆ、１３９５０ｒｃｆ、１４０００ｒｃｆ、１４０５０ｒｃｆ、１４１００ｒｃｆ、１４１５０ｒｃｆ、１４２００ｒｃｆ、１４２５０ｒｃｆ、１４３００ｒｃｆ、１４３５０ｒｃｆ、１４４００ｒｃｆ、１４４５０ｒｃｆ、１４５００ｒｃｆ、１４５５０ｒｃｆ、１４６００ｒｃｆ、１４６５０ｒｃｆ、１４７００ｒｃｆ、１４７５０ｒｃｆ、１４８００ｒｃｆ、１４８５０ｒｃｆ、１４９００ｒｃｆ、１４９５０ｒｃｆ、１５０００ｒｃｆ、１５０５０ｒｃｆ、１５１００ｒｃｆ、１５１５０ｒｃｆ、１５２００ｒｃｆ、１５２５０ｒｃｆ、１５３００ｒｃｆ、１５３５０ｒｃｆ、１５４００ｒｃｆ、１５４５０ｒｃｆ、または約１５５００ｒｃｆで約４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、６１分、６２分、６３分、６４分分、６５分、６６分、６７分、６８分、６９分、７０分、７１分、７２分、７３分、７４分、または約７５分間遠心分離することを含む。

【0066】

特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離は、第１の遠心分離後に残った生体液に対して行われ、第２の遠心分離は、約２５，８００ｒｃｆで約６０分間行われる。特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離は、第１の遠心分離後に残った生体液に対して行われ、第２の遠心分離は、約２４，８００～約２６，８００ｒｃｆで約４５～約７５分間行われる。いくつかの実施形態では、第２の遠心分離は、第１の遠心分離後に残った生体液に対して行われ、第２の遠心分離は、約２４８００ｒｃｆ、２４８５０ｒｃｆ、２４９００ｒｃｆ、２４９５０ｒｃｆ、２５０００ｒｃｆ、２５０５０ｒｃｆ、２５１００ｒｃｆ、２５１５０ｒｃｆ、２５２００ｒｃｆ、２５２５０ｒｃｆ、２５３００ｒｃｆ、２５３５０ｒｃｆ、２５４００ｒｃｆ、２５４５０ｒｃｆ、２５５００ｒｃｆ、２５５５０ｒｃｆ、２５６００ｒｃｆ、２５６５０ｒｃｆ、２５７００ｒｃｆ、２５７５０ｒｃｆ、２５８００ｒｃｆ、２５８５０ｒｃｆ、２５９００ｒｃｆ、２５９５０ｒｃｆ、２６０００ｒｃｆ、２６０５０ｒｃｆ、２６１００ｒｃｆ、２６１５０ｒｃｆ、２６２００ｒｃｆ、２６２５０ｒｃｆ、２６３００ｒｃｆ、２６３５０ｒｃｆ、２６４００ｒｃｆ、２６４５０ｒｃｆ、２６５００ｒｃｆ、２６５５０ｒｃｆ、２６６００ｒｃｆ、２６６５０ｒｃｆ、２６７００ｒｃｆ、２６７５０ｒｃｆ、２６８００ｒｃｆで約４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、６１分、６２分、６３分、６４分分、６５分、６６分、６７分、６８分、６９分、７０分、７１分、７２分、７３分、７４分、または約７５分間行われる。

【0067】

特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離が１～３回繰り返され、各繰り返しは直前の遠心分離からの残りの生体液に対して行われる。特定の例示的な実施形態では、第２の遠心分離が１、２または３回繰り返され、各繰り返しは直前の遠心分離からの残りの生体液に対して行われる。

【0068】

特定の例示的な実施形態では、（ｄ）は、約０．４５ミクロンフィルタ～約０．２２ミクロンフィルタの範囲の直列した１つまたは複数のフィルタを通して残りの生体液を濾過することを含む。いくつかの実施形態では、直列の各フィルタは、０．２２ミクロン、０．２３ミクロン、０．２４ミクロン、０．２５ミクロン、０．２６ミクロン、０．２７ミクロン、０．２８ミクロン、０．２９ミクロン、０．３ミクロン、０．３１ミクロン、０．３２ミクロン、０．３３ミクロン、０．３４ミクロン、０．３５ミクロン、０．３６ミクロン、０．３７ミクロン、０．３８ミクロン、０．３９ミクロン、０．４ミクロン、０．４１ミクロン、０．４２ミクロン、０．４３ミクロン、０．４４ミクロン、または０．４５ミクロンのフィルタから独立して選択される。いくつかの実施形態では、直列のフィルタの数は、１～１０の範囲であり、例えば、直列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のフィルタである。いくつかの実施形態では、直列のフィルタはすべて同じサイズでカットオフされる。いくつかの実施形態では、直列の少なくとも２つのフィルタは同じサイズのカットオフを有する。いくつかの実施形態では、直列の少なくとも２つのフィルタは異なるサイズのカットオフを有する。いくつかの実施形態では、直列の全てのフィルタが異なるサイズのカットオフを有する。いくつかの実施形態では、サイズ排除は、直列のフィルタに沿って大から小へと減少する。例えば、直列の３つのフィルタでは、第１のフィルタは０．４５ミクロンのフィルタ、第２のフィルタは０．３ミクロンのフィルタ、最後のフィルタは０．２２フィルタであり得る。直列フィルタの他の構成は、本明細書の説明を考慮すれば理解されるであろう。いくつかの実施形態では、直列のフィルタはすべて同じ材料である。いくつかの実施形態では、直列のフィルタはすべて異なる材料である。いくつかの実施形態では、直列の少なくとも２つのフィルタはすべて同じ材料である。いくつかの実施形態では、少なくとも２つのフィルタは異なる材料でできている。例示的なフィルタとしては、膜フィルタ（例えば、ポリエーテルスルホン膜フィルタ、ポリフッ化ビニリデン膜フィルタ、セルロース膜フィルタ、混合セルロースエステル膜フィルタ、酢酸セルロース膜フィルタ、硝酸セルロース膜フィルタ、ポリアミド膜フィルタ、ポリカーボネート膜フィルタ、ポリテトラフルオロエチレン膜フィルタ、ポリプロピレン膜フィルタ、ニトロセルロース膜フィルタ及び／または同様のもの）、ガラス繊維またはビーズフィルタ及び／または同様のものなどが挙げられるが、これらに限定されない。

【0069】

特定の例示的な実施形態では、（ｄ）は、約０．４５ミクロンフィルタを通して残りの生体液を濾過し、続いて約０．２２ミクロンフィルタを通して残りの生体液を濾過することを含む。

【0070】

特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、２つ以上の連続する超遠心分離ステップを含み、各ステップは前の超遠心分離からの残りの生体液に対して実行される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、２～１０（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０）直列超遠心分離ステップを含み、各ステップは前の超遠心分離からの残りの生体液に対して実行される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約５０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約７０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約１００，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約４５，０００～約５５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約６５，０００～約７５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約９０，０００～約１１０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約４５，０００～約５５，０００ｒｃｆ（例えば、約４５０００ｒｃｆ、４５１００ｒｃｆ、４５２００ｒｃｆ、４５３００ｒｃｆ、４５４００ｒｃｆ、４５５００ｒｃｆ、４５６００ｒｃｆ、４５７００ｒｃｆ、４５８００ｒｃｆ、４５９００ｒｃｆ、４６０００ｒｃｆ、４６１００ｒｃｆ、４６２００ｒｃｆ、４６３００ｒｃｆ、４６４００ｒｃｆ、４６５００ｒｃｆ、４６６００ｒｃｆ、４６７００ｒｃｆ、４６８００ｒｃｆ、４６９００ｒｃｆ、４７０００ｒｃｆ、４７１００ｒｃｆ、４７２００ｒｃｆ、４７３００ｒｃｆ、４７４００ｒｃｆ、４７５００ｒｃｆ、４７６００ｒｃｆ、４７７００ｒｃｆ、４７８００ｒｃｆ、４７９００ｒｃｆ、４８０００ｒｃｆ、４８１００ｒｃｆ、４８２００ｒｃｆ、４８３００ｒｃｆ、４８４００ｒｃｆ、４８５００ｒｃｆ、４８６００ｒｃｆ、４８７００ｒｃｆ、４８８００ｒｃｆ、４８９００ｒｃｆ、４９０００ｒｃｆ、４９１００ｒｃｆ、４９２００ｒｃｆ、４９３００ｒｃｆ、４９４００ｒｃｆ、４９５００ｒｃｆ、４９６００ｒｃｆ、４９７００ｒｃｆ、４９８００ｒｃｆ、４９９００ｒｃｆ、５００００ｒｃｆ、５０１００ｒｃｆ、５０２００ｒｃｆ、５０３００ｒｃｆ、５０４００ｒｃｆ、５０５００ｒｃｆ、５０６００ｒｃｆ、５０７００ｒｃｆ、５０８００ｒｃｆ、５０９００ｒｃｆ、５１０００ｒｃｆ、５１１００ｒｃｆ、５１２００ｒｃｆ、５１３００ｒｃｆ、５１４００ｒｃｆ、５１５００ｒｃｆ、５１６００ｒｃｆ、５１７００ｒｃｆ、５１８００ｒｃｆ、５１９００ｒｃｆ、５２０００ｒｃｆ、５２１００ｒｃｆ、５２２００ｒｃｆ、５２３００ｒｃｆ、５２４００ｒｃｆ、５２５００ｒｃｆ、５２６００ｒｃｆ、５２７００ｒｃｆ、５２８００ｒｃｆ、５２９００ｒｃｆ、５３０００ｒｃｆ、５３１００ｒｃｆ、５３２００ｒｃｆ、５３３００ｒｃｆ、５３４００ｒｃｆ、５３５００ｒｃｆ、５３６００ｒｃｆ、５３７００ｒｃｆ、５３８００ｒｃｆ、５３９００ｒｃｆ、５４０００ｒｃｆ、５４１００ｒｃｆ、５４２００ｒｃｆ、５４３００ｒｃｆ、５４４００ｒｃｆ、５４５００ｒｃｆ、５４６００ｒｃｆ、５４７００ｒｃｆ、５４８００ｒｃｆ、５４９００ｒｃｆ、または約５５０００ｒｃｆ）で行われる超遠心分離ステップ、約６５，０００～約７５，０００ｒｃｆ（例えば、約６５０００ｒｃｆ、６５１００ｒｃｆ、６５２００ｒｃｆ、６５３００ｒｃｆ、６５４００ｒｃｆ、６５５００ｒｃｆ、６５６００ｒｃｆ、６５７００ｒｃｆ、６５８００ｒｃｆ、６５９００ｒｃｆ、６６０００ｒｃｆ、６６１００ｒｃｆ、６６２００ｒｃｆ、６６３００ｒｃｆ、６６４００ｒｃｆ、６６５００ｒｃｆ、６６６００ｒｃｆ、６６７００ｒｃｆ、６６８００ｒｃｆ、６６９００ｒｃｆ、６７０００ｒｃｆ、６７１００ｒｃｆ、６７２００ｒｃｆ、６７３００ｒｃｆ、６７４００ｒｃｆ、６７５００ｒｃｆ、６７６００ｒｃｆ、６７７００ｒｃｆ、６７８００ｒｃｆ、６７９００ｒｃｆ、６８０００ｒｃｆ、６８１００ｒｃｆ、６８２００ｒｃｆ、６８３００ｒｃｆ、６８４００ｒｃｆ、６８５００ｒｃｆ、６８６００ｒｃｆ、６８７００ｒｃｆ、６８８００ｒｃｆ、６８９００ｒｃｆ、６９０００ｒｃｆ、６９１００ｒｃｆ、６９２００ｒｃｆ、６９３００ｒｃｆ、６９４００ｒｃｆ、６９５００ｒｃｆ、６９６００ｒｃｆ、６９７００ｒｃｆ、６９８００ｒｃｆ、６９９００ｒｃｆ、７００００ｒｃｆ、７０１００ｒｃｆ、７０２００ｒｃｆ、７０３００ｒｃｆ、７０４００ｒｃｆ、７０５００ｒｃｆ、７０６００ｒｃｆ、７０７００ｒｃｆ、７０８００ｒｃｆ、７０９００ｒｃｆ、７１０００ｒｃｆ、７１１００ｒｃｆ、７１２００ｒｃｆ、７１３００ｒｃｆ、７１４００ｒｃｆ、７１５００ｒｃｆ、７１６００ｒｃｆ、７１７００ｒｃｆ、７１８００ｒｃｆ、７１９００ｒｃｆ、７２０００ｒｃｆ、７２１００ｒｃｆ、７２２００ｒｃｆ、７２３００ｒｃｆ、７２４００ｒｃｆ、７２５００ｒｃｆ、７２６００ｒｃｆ、７２７００ｒｃｆ、７２８００ｒｃｆ、７２９００ｒｃｆ、７３０００ｒｃｆ、７３１００ｒｃｆ、７３２００ｒｃｆ、７３３００ｒｃｆ、７３４００ｒｃｆ、７３５００ｒｃｆ、７３６００ｒｃｆ、７３７００ｒｃｆ、７３８００ｒｃｆ、７３９００ｒｃｆ、７４０００ｒｃｆ、７４１００ｒｃｆ、７４２００ｒｃｆ、７４３００ｒｃｆ、７４４００ｒｃｆ、７４５００ｒｃｆ、７４６００ｒｃｆ、７４７００ｒｃｆ、７４８００ｒｃｆ、７４９００ｒｃｆ、または約７５０００ｒｃｆ）で行われる超遠心分離ステップ、約９０，０００～約１１０，０００ｒｃｆ（例えば、９００００ｒｃｆ、９０１００ｒｃｆ、９０２００ｒｃｆ、９０３００ｒｃｆ、９０４００ｒｃｆ、９０５００ｒｃｆ、９０６００ｒｃｆ、９０７００ｒｃｆ、９０８００ｒｃｆ、９０９００ｒｃｆ、９１０００ｒｃｆ、９１１００ｒｃｆ、９１２００ｒｃｆ、９１３００ｒｃｆ、９１４００ｒｃｆ、９１５００ｒｃｆ、９１６００ｒｃｆ、９１７００ｒｃｆ、９１８００ｒｃｆ、９１９００ｒｃｆ、９２０００ｒｃｆ、９２１００ｒｃｆ、９２２００ｒｃｆ、９２３００ｒｃｆ、９２４００ｒｃｆ、９２５００ｒｃｆ、９２６００ｒｃｆ、９２７００ｒｃｆ、９２８００ｒｃｆ、９２９００ｒｃｆ、９３０００ｒｃｆ、９３１００ｒｃｆ、９３２００ｒｃｆ、９３３００ｒｃｆ、９３４００ｒｃｆ、９３５００ｒｃｆ、９３６００ｒｃｆ、９３７００ｒｃｆ、９３８００ｒｃｆ、９３９００ｒｃｆ、９４０００ｒｃｆ、９４１００ｒｃｆ、９４２００ｒｃｆ、９４３００ｒｃｆ、９４４００ｒｃｆ、９４５００ｒｃｆ、９４６００ｒｃｆ、９４７００ｒｃｆ、９４８００ｒｃｆ、９４９００ｒｃｆ、９５０００ｒｃｆ、９５１００ｒｃｆ、９５２００ｒｃｆ、９５３００ｒｃｆ、９５４００ｒｃｆ、９５５００ｒｃｆ、９５６００ｒｃｆ、９５７００ｒｃｆ、９５８００ｒｃｆ、９５９００ｒｃｆ、９６０００ｒｃｆ、９６１００ｒｃｆ、９６２００ｒｃｆ、９６３００ｒｃｆ、９６４００ｒｃｆ、９６５００ｒｃｆ、９６６００ｒｃｆ、９６７００ｒｃｆ、９６８００ｒｃｆ、９６９００ｒｃｆ、９７０００ｒｃｆ、９７１００ｒｃｆ、９７２００ｒｃｆ、９７３００ｒｃｆ、９７４００ｒｃｆ、９７５００ｒｃｆ、９７６００ｒｃｆ、９７７００ｒｃｆ、９７８００ｒｃｆ、９７９００ｒｃｆ、９８０００ｒｃｆ、９８１００ｒｃｆ、９８２００ｒｃｆ、９８３００ｒｃｆ、９８４００ｒｃｆ、９８５００ｒｃｆ、９８６００ｒｃｆ、９８７００ｒｃｆ、９８８００ｒｃｆ、９８９００ｒｃｆ、９９０００ｒｃｆ、９９１００ｒｃｆ、９９２００ｒｃｆ、９９３００ｒｃｆ、９９４００ｒｃｆ、９９５００ｒｃｆ、９９６００ｒｃｆ、９９７００ｒｃｆ、９９８００ｒｃｆ、９９９００ｒｃｆ、１０００００ｒｃｆ、１００１００ｒｃｆ、１００２００ｒｃｆ、１００３００ｒｃｆ、１００４００ｒｃｆ、１００５００ｒｃｆ、１００６００ｒｃｆ、１００７００ｒｃｆ、１００８００ｒｃｆ、１００９００ｒｃｆ、１０１０００ｒｃｆ、１０１１００ｒｃｆ、１０１２００ｒｃｆ、１０１３００ｒｃｆ、１０１４００ｒｃｆ、１０１５００ｒｃｆ、１０１６００ｒｃｆ、１０１７００ｒｃｆ、１０１８００ｒｃｆ、１０１９００ｒｃｆ、１０２０００ｒｃｆ、１０２１００ｒｃｆ、１０２２００ｒｃｆ、１０２３００ｒｃｆ、１０２４００ｒｃｆ、１０２５００ｒｃｆ、１０２６００ｒｃｆ、１０２７００ｒｃｆ、１０２８００ｒｃｆ、１０２９００ｒｃｆ、１０３０００ｒｃｆ、１０３１００ｒｃｆ、１０３２００ｒｃｆ、１０３３００ｒｃｆ、１０３４００ｒｃｆ、１０３５００ｒｃｆ、１０３６００ｒｃｆ、１０３７００ｒｃｆ、１０３８００ｒｃｆ、１０３９００ｒｃｆ、１０４０００ｒｃｆ、１０４１００ｒｃｆ、１０４２００ｒｃｆ、１０４３００ｒｃｆ、１０４４００ｒｃｆ、１０４５００ｒｃｆ、１０４６００ｒｃｆ、１０４７００ｒｃｆ、１０４８００ｒｃｆ、１０４９００ｒｃｆ、１０５０００ｒｃｆ、１０５１００ｒｃｆ、１０５２００ｒｃｆ、１０５３００ｒｃｆ、１０５４００ｒｃｆ、１０５５００ｒｃｆ、１０５６００ｒｃｆ、１０５７００ｒｃｆ、１０５８００ｒｃｆ、１０５９００ｒｃｆ、１０６０００ｒｃｆ、１０６１００ｒｃｆ、１０６２００ｒｃｆ、１０６３００ｒｃｆ、１０６４００ｒｃｆ、１０６５００ｒｃｆ、１０６６００ｒｃｆ、１０６７００ｒｃｆ、１０６８００ｒｃｆ、１０６９００ｒｃｆ、１０７０００ｒｃｆ、１０７１００ｒｃｆ、１０７２００ｒｃｆ、１０７３００ｒｃｆ、１０７４００ｒｃｆ、１０７５００ｒｃｆ、１０７６００ｒｃｆ、１０７７００ｒｃｆ、１０７８００ｒｃｆ、１０７９００ｒｃｆ、１０８０００ｒｃｆ、１０８１００ｒｃｆ、１０８２００ｒｃｆ、１０８３００ｒｃｆ、１０８４００ｒｃｆ、１０８５００ｒｃｆ、１０８６００ｒｃｆ、１０８７００ｒｃｆ、１０８８００ｒｃｆ、１０８９００ｒｃｆ、１０９０００ｒｃｆ、１０９１００ｒｃｆ、１０９２００ｒｃｆ、１０９３００ｒｃｆ、１０９４００ｒｃｆ、１０９５００ｒｃｆ、１０９６００ｒｃｆ、１０９７００ｒｃｆ、１０９８００ｒｃｆ、１０９９００ｒｃｆ、または約１１００００ｒｃｆ）で行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの任意の組み合わせを含む。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数は、それぞれ約６０分間実施される。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数は、それぞれ約４５～７５分間実施される。特定の例示的な実施形態では、１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数は、それぞれ約４５分、４６分、４７分、４８分、４９分、５０分、５１分、５２分、５３分、５４分、５５分、５６分、５７分、５８分、５９分、６０分、６１分、６２分、６３分、６４分、６５分、６６分、６７分、６８分、６９分、７０分、７１分、７２分、７３分、７４分、または約７５分間実施される。

【0071】

特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約１３０，０００ｒｃｆで約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約１１５，０００～約１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される。特定の例示的な実施形態では、（ｅ）は、約１１５，０００～約１４５，０００ｒｃｆ（例えば、１１５０００ｒｃｆ、１１５１００ｒｃｆ、１１５２００ｒｃｆ、１１５３００ｒｃｆ、１１５４００ｒｃｆ、１１５５００ｒｃｆ、１１５６００ｒｃｆ、１１５７００ｒｃｆ、１１５８００ｒｃｆ、１１５９００ｒｃｆ、１１６０００ｒｃｆ、１１６１００ｒｃｆ、１１６２００ｒｃｆ、１１６３００ｒｃｆ、１１６４００ｒｃｆ、１１６５００ｒｃｆ、１１６６００ｒｃｆ、１１６７００ｒｃｆ、１１６８００ｒｃｆ、１１６９００ｒｃｆ、１１７０００ｒｃｆ、１１７１００ｒｃｆ、１１７２００ｒｃｆ、１１７３００ｒｃｆ、１１７４００ｒｃｆ、１１７５００ｒｃｆ、１１７６００ｒｃｆ、１１７７００ｒｃｆ、１１７８００ｒｃｆ、１１７９００ｒｃｆ、１１８０００ｒｃｆ、１１８１００ｒｃｆ、１１８２００ｒｃｆ、１１８３００ｒｃｆ、１１８４００ｒｃｆ、１１８５００ｒｃｆ、１１８６００ｒｃｆ、１１８７００ｒｃｆ、１１８８００ｒｃｆ、１１８９００ｒｃｆ、１１９０００ｒｃｆ、１１９１００ｒｃｆ、１１９２００ｒｃｆ、１１９３００ｒｃｆ、１１９４００ｒｃｆ、１１９５００ｒｃｆ、１１９６００ｒｃｆ、１１９７００ｒｃｆ、１１９８００ｒｃｆ、１１９９００ｒｃｆ、１２００００ｒｃｆ、１２０１００ｒｃｆ、１２０２００ｒｃｆ、１２０３００ｒｃｆ、１２０４００ｒｃｆ、１２０５００ｒｃｆ、１２０６００ｒｃｆ、１２０７００ｒｃｆ、１２０８００ｒｃｆ、１２０９００ｒｃｆ、１２１０００ｒｃｆ、１２１１００ｒｃｆ、１２１２００ｒｃｆ、１２１３００ｒｃｆ、１２１４００ｒｃｆ、１２１５００ｒｃｆ、１２１６００ｒｃｆ、１２１７００ｒｃｆ、１２１８００ｒｃｆ、１２１９００ｒｃｆ、１２２０００ｒｃｆ、１２２１００ｒｃｆ、１２２２００ｒｃｆ、１２２３００ｒｃｆ、１２２４００ｒｃｆ、１２２５００ｒｃｆ、１２２６００ｒｃｆ、１２２７００ｒｃｆ、１２２８００ｒｃｆ、１２２９００ｒｃｆ、１２３０００ｒｃｆ、１２３１００ｒｃｆ、１２３２００ｒｃｆ、１２３３００ｒｃｆ、１２３４００ｒｃｆ、１２３５００ｒｃｆ、１２３６００ｒｃｆ、１２３７００ｒｃｆ、１２３８００ｒｃｆ、１２３９００ｒｃｆ、１２４０００ｒｃｆ、１２４１００ｒｃｆ、１２４２００ｒｃｆ、１２４３００ｒｃｆ、１２４４００ｒｃｆ、１２４５００ｒｃｆ、１２４６００ｒｃｆ、１２４７００ｒｃｆ、１２４８００ｒｃｆ、１２４９００ｒｃｆ、１２５０００ｒｃｆ、１２５１００ｒｃｆ、１２５２００ｒｃｆ、１２５３００ｒｃｆ、１２５４００ｒｃｆ、１２５５００ｒｃｆ、１２５６００ｒｃｆ、１２５７００ｒｃｆ、１２５８００ｒｃｆ、１２５９００ｒｃｆ、１２６０００ｒｃｆ、１２６１００ｒｃｆ、１２６２００ｒｃｆ、１２６３００ｒｃｆ、１２６４００ｒｃｆ、１２６５００ｒｃｆ、１２６６００ｒｃｆ、１２６７００ｒｃｆ、１２６８００ｒｃｆ、１２６９００ｒｃｆ、１２７０００ｒｃｆ、１２７１００ｒｃｆ、１２７２００ｒｃｆ、１２７３００ｒｃｆ、１２７４００ｒｃｆ、１２７５００ｒｃｆ、１２７６００ｒｃｆ、１２７７００ｒｃｆ、１２７８００ｒｃｆ、１２７９００ｒｃｆ、１２８０００ｒｃｆ、１２８１００ｒｃｆ、１２８２００ｒｃｆ、１２８３００ｒｃｆ、１２８４００ｒｃｆ、１２８５００ｒｃｆ、１２８６００ｒｃｆ、１２８７００ｒｃｆ、１２８８００ｒｃｆ、１２８９００ｒｃｆ、１２９０００ｒｃｆ、１２９１００ｒｃｆ、１２９２００ｒｃｆ、１２９３００ｒｃｆ、１２９４００ｒｃｆ、１２９５００ｒｃｆ、１２９６００ｒｃｆ、１２９７００ｒｃｆ、１２９８００ｒｃｆ、１２９９００ｒｃｆ、１３００００ｒｃｆ、１３０１００ｒｃｆ、１３０２００ｒｃｆ、１３０３００ｒｃｆ、１３０４００ｒｃｆ、１３０５００ｒｃｆ、１３０６００ｒｃｆ、１３０７００ｒｃｆ、１３０８００ｒｃｆ、１３０９００ｒｃｆ、１３１０００ｒｃｆ、１３１１００ｒｃｆ、１３１２００ｒｃｆ、１３１３００ｒｃｆ、１３１４００ｒｃｆ、１３１５００ｒｃｆ、１３１６００ｒｃｆ、１３１７００ｒｃｆ、１３１８００ｒｃｆ、１３１９００ｒｃｆ、１３２０００ｒｃｆ、１３２１００ｒｃｆ、１３２２００ｒｃｆ、１３２３００ｒｃｆ、１３２４００ｒｃｆ、１３２５００ｒｃｆ、１３２６００ｒｃｆ、１３２７００ｒｃｆ、１３２８００ｒｃｆ、１３２９００ｒｃｆ、１３３０００ｒｃｆ、１３３１００ｒｃｆ、１３３２００ｒｃｆ、１３３３００ｒｃｆ、１３３４００ｒｃｆ、１３３５００ｒｃｆ、１３３６００ｒｃｆ、１３３７００ｒｃｆ、１３３８００ｒｃｆ、１３３９００ｒｃｆ、１３４０００ｒｃｆ、１３４１００ｒｃｆ、１３４２００ｒｃｆ、１３４３００ｒｃｆ、１３４４００ｒｃｆ、１３４５００ｒｃｆ、１３４６００ｒｃｆ、１３４７００ｒｃｆ、１３４８００ｒｃｆ、１３４９００ｒｃｆ、１３５０００ｒｃｆ、１３５１００ｒｃｆ、１３５２００ｒｃｆ、１３５３００ｒｃｆ、１３５４００ｒｃｆ、１３５５００ｒｃｆ、１３５６００ｒｃｆ、１３５７００ｒｃｆ、１３５８００ｒｃｆ、１３５９００ｒｃｆ、１３６０００ｒｃｆ、１３６１００ｒｃｆ、１３６２００ｒｃｆ、１３６３００ｒｃｆ、１３６４００ｒｃｆ、１３６５００ｒｃｆ、１３６６００ｒｃｆ、１３６７００ｒｃｆ、１３６８００ｒｃｆ、１３６９００ｒｃｆ、１３７０００ｒｃｆ、１３７１００ｒｃｆ、１３７２００ｒｃｆ、１３７３００ｒｃｆ、１３７４００ｒｃｆ、１３７５００ｒｃｆ、１３７６００ｒｃｆ、１３７７００ｒｃｆ、１３７８００ｒｃｆ、１３７９００ｒｃｆ、１３８０００ｒｃｆ、１３８１００ｒｃｆ、１３８２００ｒｃｆ、１３８３００ｒｃｆ、１３８４００ｒｃｆ、１３８５００ｒｃｆ、１３８６００ｒｃｆ、１３８７００ｒｃｆ、１３８８００ｒｃｆ、１３８９００ｒｃｆ、１３９０００ｒｃｆ、１３９１００ｒｃｆ、１３９２００ｒｃｆ、１３９３００ｒｃｆ、１３９４００ｒｃｆ、１３９５００ｒｃｆ、１３９６００ｒｃｆ、１３９７００ｒｃｆ、１３９８００ｒｃｆ、１３９９００ｒｃｆ、１４００００ｒｃｆ、１４０１００ｒｃｆ、１４０２００ｒｃｆ、１４０３００ｒｃｆ、１４０４００ｒｃｆ、１４０５００ｒｃｆ、１４０６００ｒｃｆ、１４０７００ｒｃｆ、１４０８００ｒｃｆ、１４０９００ｒｃｆ、１４１０００ｒｃｆ、１４１１００ｒｃｆ、１４１２００ｒｃｆ、１４１３００ｒｃｆ、１４１４００ｒｃｆ、１４１５００ｒｃｆ、１４１６００ｒｃｆ、１４１７００ｒｃｆ、１４１８００ｒｃｆ、１４１９００ｒｃｆ、１４２０００ｒｃｆ、１４２１００ｒｃｆ、１４２２００ｒｃｆ、１４２３００ｒｃｆ、１４２４００ｒｃｆ、１４２５００ｒｃｆ、１４２６００ｒｃｆ、１４２７００ｒｃｆ、１４２８００ｒｃｆ、１４２９００ｒｃｆ、１４３０００ｒｃｆ、１４３１００ｒｃｆ、１４３２００ｒｃｆ、１４３３００ｒｃｆ、１４３４００ｒｃｆ、１４３５００ｒｃｆ、１４３６００ｒｃｆ、１４３７００ｒｃｆ、１４３８００ｒｃｆ、１４３９００ｒｃｆ、１４４０００ｒｃｆ、１４４１００ｒｃｆ、１４４２００ｒｃｆ、１４４３００ｒｃｆ、１４４４００ｒｃｆ、１４４５００ｒｃｆ、１４４６００ｒｃｆ、１４４７００ｒｃｆ、１４４８００ｒｃｆ、１４４９００ｒｃｆ、または約１４５０００ｒｃｆ）で、約９０～１５０分間（例えば、９０分、９１分、９２分、９３分、９４分、９５分、９６分、９７分、９８分、９９分、１００分、１０１分、１０２分、１０３分、１０４分、１０５分、１０６分、１０７分、１０８分、１０９分、１１０分、１１１分、１１２分、１１３分、１１４分、１１５分、１１６分、１１７分、１１８分、１１９分、１２０分、１２１分、１２２分、１２３分、１２４分、１２５分、１２６分、１２７分、１２８分、１２９分、１３０分、１３１分、１３２分、１３３分、１３４分、１３５分、１３６分、１３７分、１３８分、１３９分、１４０分、１４１分、１４２分、１４３分、１４４分、１４５分、１４６分、１４７分、１４８分、１４９分、または約１５０分間）行われる最終超遠心分離ステップを含み、得られた液体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な量の好適な溶液中で再懸濁される。

【0072】

特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、５００ｋＤａの限外濾過膜を使用して行われる。特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、約２５０ｋＤａ～約７５０ｋＤａの範囲の分画分子量を有する限外濾過膜を使用して行われる。いくつかの実施形態では、約２５０ｋＤａ、２６０ｋＤａ、２７０ｋＤａ、２８０ｋＤａ、２９０ｋＤａ、３００ｋＤａ、３１０ｋＤａ、３２０ｋＤａ、３３０ｋＤａ、３４０ｋＤａ、３５０ｋＤａ、３６０ｋＤａ、３７０ｋＤａ、３８０ｋＤａ、３９０ｋＤａ、４００ｋＤａ、４１０ｋＤａ、４２０ｋＤａ、４３０ｋＤａ、４４０ｋＤａ、４５０ｋＤａ、４６０ｋＤａ、４７０ｋＤａ、４８０ｋＤａ、４９０ｋＤａ、５００ｋＤａ、５１０ｋＤａ、５２０ｋＤａ、５３０ｋＤａ、５４０ｋＤａ、５５０ｋＤａ、５６０ｋＤａ、５７０ｋＤａ、５８０ｋＤａ、５９０ｋＤａ、６００ｋＤａ、６１０ｋＤａ、６２０ｋＤａ、６３０ｋＤａ、６４０ｋＤａ、６５０ｋＤａ、６６０ｋＤａ、６７０ｋＤａ、６８０ｋＤａ、６９０ｋＤａ、７００ｋＤａ、７１０ｋＤａ、７２０ｋＤａ、７３０ｋＤａ、７４０ｋＤａ、または約７５０ｋＤａの分画分子量を有する限外濾過膜の分画分子量。

【0073】

特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、毎分約１０ｍＬの流量で行われる。特定の例示的な実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、毎分約５ｍＬ～１５ｍＬの範囲の流量で行われる。いくつかの実施形態では、（ｇ）のタンジェンシャルフローフィルトレーションは、約５ｍＬ／分、約５．５ｍＬ／分、約６ｍＬ／分、約６．５ｍＬ／分、約７ｍＬ／分、約７．５ｍＬ／分、約８ｍＬ／分、約８．５ｍＬ／分、約９ｍＬ／分、約９．５ｍＬ／分、約１０ｍＬ／分、約１０．５ｍＬ／分、約１１ｍＬ／分、約１１．５ｍＬ／分、約１２ｍＬ／分、約１２．５ｍＬ／分、約１３ｍＬ／分、約１３．５ｍＬ／分、約１４ｍＬ／分、約１４．５ｍＬ／分、または約１５ｍＬ／分の流量で行われる。

【0074】

特定の例示的な実施形態では、ステップ（ｇ）において、残りの生体液の量がタンジェンシャルフローフィルトレーション前の開始体積の約１０パーセントに達すると、保持液が好適な緩衝液でダイアフィルトレーションされる。

【0075】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した場合、保持液を超遠心分離するステップをさらに含む。特定の例示的な実施形態では、保持液の超遠心分離は、摂氏約４度で、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間行われる。特定の例示的な実施形態では、保持液の超遠心分離は、約１１５，０００～約１４５，０００ｒｃｆ（例えば、１１５０００ｒｃｆ、１１５０５０ｒｃｆ、１１５１００ｒｃｆ、１１５１５０ｒｃｆ、１１５２００ｒｃｆ、１１５２５０ｒｃｆ、１１５３００ｒｃｆ、１１５３５０ｒｃｆ、１１５４００ｒｃｆ、１１５４５０ｒｃｆ、１１５５００ｒｃｆ、１１５５５０ｒｃｆ、１１５６００ｒｃｆ、１１５６５０ｒｃｆ、１１５７００ｒｃｆ、１１５７５０ｒｃｆ、１１５８００ｒｃｆ、１１５８５０ｒｃｆ、１１５９００ｒｃｆ、１１５９５０ｒｃｆ、１１６０００ｒｃｆ、１１６０５０ｒｃｆ、１１６１００ｒｃｆ、１１６１５０ｒｃｆ、１１６２００ｒｃｆ、１１６２５０ｒｃｆ、１１６３００ｒｃｆ、１１６３５０ｒｃｆ、１１６４００ｒｃｆ、１１６４５０ｒｃｆ、１１６５００ｒｃｆ、１１６５５０ｒｃｆ、１１６６００ｒｃｆ、１１６６５０ｒｃｆ、１１６７００ｒｃｆ、１１６７５０ｒｃｆ、１１６８００ｒｃｆ、１１６８５０ｒｃｆ、１１６９００ｒｃｆ、１１６９５０ｒｃｆ、１１７０００ｒｃｆ、１１７０５０ｒｃｆ、１１７１００ｒｃｆ、１１７１５０ｒｃｆ、１１７２００ｒｃｆ、１１７２５０ｒｃｆ、１１７３００ｒｃｆ、１１７３５０ｒｃｆ、１１７４００ｒｃｆ、１１７４５０ｒｃｆ、１１７５００ｒｃｆ、１１７５５０ｒｃｆ、１１７６００ｒｃｆ、１１７６５０ｒｃｆ、１１７７００ｒｃｆ、１１７７５０ｒｃｆ、１１７８００ｒｃｆ、１１７８５０ｒｃｆ、１１７９００ｒｃｆ、１１７９５０ｒｃｆ、１１８０００ｒｃｆ、１１８０５０ｒｃｆ、１１８１００ｒｃｆ、１１８１５０ｒｃｆ、１１８２００ｒｃｆ、１１８２５０ｒｃｆ、１１８３００ｒｃｆ、１１８３５０ｒｃｆ、１１８４００ｒｃｆ、１１８４５０ｒｃｆ、１１８５００ｒｃｆ、１１８５５０ｒｃｆ、１１８６００ｒｃｆ、１１８６５０ｒｃｆ、１１８７００ｒｃｆ、１１８７５０ｒｃｆ、１１８８００ｒｃｆ、１１８８５０ｒｃｆ、１１８９００ｒｃｆ、１１８９５０ｒｃｆ、１１９０００ｒｃｆ、１１９０５０ｒｃｆ、１１９１００ｒｃｆ、１１９１５０ｒｃｆ、１１９２００ｒｃｆ、１１９２５０ｒｃｆ、１１９３００ｒｃｆ、１１９３５０ｒｃｆ、１１９４００ｒｃｆ、１１９４５０ｒｃｆ、１１９５００ｒｃｆ、１１９５５０ｒｃｆ、１１９６００ｒｃｆ、１１９６５０ｒｃｆ、１１９７００ｒｃｆ、１１９７５０ｒｃｆ、１１９８００ｒｃｆ、１１９８５０ｒｃｆ、１１９９００ｒｃｆ、１１９９５０ｒｃｆ、１２００００ｒｃｆ、１２００５０ｒｃｆ、１２０１００ｒｃｆ、１２０１５０ｒｃｆ、１２０２００ｒｃｆ、１２０２５０ｒｃｆ、１２０３００ｒｃｆ、１２０３５０ｒｃｆ、１２０４００ｒｃｆ、１２０４５０ｒｃｆ、１２０５００ｒｃｆ、１２０５５０ｒｃｆ、１２０６００ｒｃｆ、１２０６５０ｒｃｆ、１２０７００ｒｃｆ、１２０７５０ｒｃｆ、１２０８００ｒｃｆ、１２０８５０ｒｃｆ、１２０９００ｒｃｆ、１２０９５０ｒｃｆ、１２１０００ｒｃｆ、１２１０５０ｒｃｆ、１２１１００ｒｃｆ、１２１１５０ｒｃｆ、１２１２００ｒｃｆ、１２１２５０ｒｃｆ、１２１３００ｒｃｆ、１２１３５０ｒｃｆ、１２１４００ｒｃｆ、１２１４５０ｒｃｆ、１２１５００ｒｃｆ、１２１５５０ｒｃｆ、１２１６００ｒｃｆ、１２１６５０ｒｃｆ、１２１７００ｒｃｆ、１２１７５０ｒｃｆ、１２１８００ｒｃｆ、１２１８５０ｒｃｆ、１２１９００ｒｃｆ、１２１９５０ｒｃｆ、１２２０００ｒｃｆ、１２２０５０ｒｃｆ、１２２１００ｒｃｆ、１２２１５０ｒｃｆ、１２２２００ｒｃｆ、１２２２５０ｒｃｆ、１２２３００ｒｃｆ、１２２３５０ｒｃｆ、１２２４００ｒｃｆ、１２２４５０ｒｃｆ、１２２５００ｒｃｆ、１２２５５０ｒｃｆ、１２２６００ｒｃｆ、１２２６５０ｒｃｆ、１２２７００ｒｃｆ、１２２７５０ｒｃｆ、１２２８００ｒｃｆ、１２２８５０ｒｃｆ、１２２９００ｒｃｆ、１２２９５０ｒｃｆ、１２３０００ｒｃｆ、１２３０５０ｒｃｆ、１２３１００ｒｃｆ、１２３１５０ｒｃｆ、１２３２００ｒｃｆ、１２３２５０ｒｃｆ、１２３３００ｒｃｆ、１２３３５０ｒｃｆ、１２３４００ｒｃｆ、１２３４５０ｒｃｆ、１２３５００ｒｃｆ、１２３５５０ｒｃｆ、１２３６００ｒｃｆ、１２３６５０ｒｃｆ、１２３７００ｒｃｆ、１２３７５０ｒｃｆ、１２３８００ｒｃｆ、１２３８５０ｒｃｆ、１２３９００ｒｃｆ、１２３９５０ｒｃｆ、１２４０００ｒｃｆ、１２４０５０ｒｃｆ、１２４１００ｒｃｆ、１２４１５０ｒｃｆ、１２４２００ｒｃｆ、１２４２５０ｒｃｆ、１２４３００ｒｃｆ、１２４３５０ｒｃｆ、１２４４００ｒｃｆ、１２４４５０ｒｃｆ、１２４５００ｒｃｆ、１２４５５０ｒｃｆ、１２４６００ｒｃｆ、１２４６５０ｒｃｆ、１２４７００ｒｃｆ、１２４７５０ｒｃｆ、１２４８００ｒｃｆ、１２４８５０ｒｃｆ、１２４９００ｒｃｆ、１２４９５０ｒｃｆ、１２５０００ｒｃｆ、１２５０５０ｒｃｆ、１２５１００ｒｃｆ、１２５１５０ｒｃｆ、１２５２００ｒｃｆ、１２５２５０ｒｃｆ、１２５３００ｒｃｆ、１２５３５０ｒｃｆ、１２５４００ｒｃｆ、１２５４５０ｒｃｆ、１２５５００ｒｃｆ、１２５５５０ｒｃｆ、１２５６００ｒｃｆ、１２５６５０ｒｃｆ、１２５７００ｒｃｆ、１２５７５０ｒｃｆ、１２５８００ｒｃｆ、１２５８５０ｒｃｆ、１２５９００ｒｃｆ、１２５９５０ｒｃｆ、１２６０００ｒｃｆ、１２６０５０ｒｃｆ、１２６１００ｒｃｆ、１２６１５０ｒｃｆ、１２６２００ｒｃｆ、１２６２５０ｒｃｆ、１２６３００ｒｃｆ、１２６３５０ｒｃｆ、１２６４００ｒｃｆ、１２６４５０ｒｃｆ、１２６５００ｒｃｆ、１２６５５０ｒｃｆ、１２６６００ｒｃｆ、１２６６５０ｒｃｆ、１２６７００ｒｃｆ、１２６７５０ｒｃｆ、１２６８００ｒｃｆ、１２６８５０ｒｃｆ、１２６９００ｒｃｆ、１２６９５０ｒｃｆ、１２７０００ｒｃｆ、１２７０５０ｒｃｆ、１２７１００ｒｃｆ、１２７１５０ｒｃｆ、１２７２００ｒｃｆ、１２７２５０ｒｃｆ、１２７３００ｒｃｆ、１２７３５０ｒｃｆ、１２７４００ｒｃｆ、１２７４５０ｒｃｆ、１２７５００ｒｃｆ、１２７５５０ｒｃｆ、１２７６００ｒｃｆ、１２７６５０ｒｃｆ、１２７７００ｒｃｆ、１２７７５０ｒｃｆ、１２７８００ｒｃｆ、１２７８５０ｒｃｆ、１２７９００ｒｃｆ、１２７９５０ｒｃｆ、１２８０００ｒｃｆ、１２８０５０ｒｃｆ、１２８１００ｒｃｆ、１２８１５０ｒｃｆ、１２８２００ｒｃｆ、１２８２５０ｒｃｆ、１２８３００ｒｃｆ、１２８３５０ｒｃｆ、１２８４００ｒｃｆ、１２８４５０ｒｃｆ、１２８５００ｒｃｆ、１２８５５０ｒｃｆ、１２８６００ｒｃｆ、１２８６５０ｒｃｆ、１２８７００ｒｃｆ、１２８７５０ｒｃｆ、１２８８００ｒｃｆ、１２８８５０ｒｃｆ、１２８９００ｒｃｆ、１２８９５０ｒｃｆ、１２９０００ｒｃｆ、１２９０５０ｒｃｆ、１２９１００ｒｃｆ、１２９１５０ｒｃｆ、１２９２００ｒｃｆ、１２９２５０ｒｃｆ、１２９３００ｒｃｆ、１２９３５０ｒｃｆ、１２９４００ｒｃｆ、１２９４５０ｒｃｆ、１２９５００ｒｃｆ、１２９５５０ｒｃｆ、１２９６００ｒｃｆ、１２９６５０ｒｃｆ、１２９７００ｒｃｆ、１２９７５０ｒｃｆ、１２９８００ｒｃｆ、１２９８５０ｒｃｆ、１２９９００ｒｃｆ、１２９９５０ｒｃｆ、１３００００ｒｃｆ、１３００５０ｒｃｆ、１３０１００ｒｃｆ、１３０１５０ｒｃｆ、１３０２００ｒｃｆ、１３０２５０ｒｃｆ、１３０３００ｒｃｆ、１３０３５０ｒｃｆ、１３０４００ｒｃｆ、１３０４５０ｒｃｆ、１３０５００ｒｃｆ、１３０５５０ｒｃｆ、１３０６００ｒｃｆ、１３０６５０ｒｃｆ、１３０７００ｒｃｆ、１３０７５０ｒｃｆ、１３０８００ｒｃｆ、１３０８５０ｒｃｆ、１３０９００ｒｃｆ、１３０９５０ｒｃｆ、１３１０００ｒｃｆ、１３１０５０ｒｃｆ、１３１１００ｒｃｆ、１３１１５０ｒｃｆ、１３１２００ｒｃｆ、１３１２５０ｒｃｆ、１３１３００ｒｃｆ、１３１３５０ｒｃｆ、１３１４００ｒｃｆ、１３１４５０ｒｃｆ、１３１５００ｒｃｆ、１３１５５０ｒｃｆ、１３１６００ｒｃｆ、１３１６５０ｒｃｆ、１３１７００ｒｃｆ、１３１７５０ｒｃｆ、１３１８００ｒｃｆ、１３１８５０ｒｃｆ、１３１９００ｒｃｆ、１３１９５０ｒｃｆ、１３２０００ｒｃｆ、１３２０５０ｒｃｆ、１３２１００ｒｃｆ、１３２１５０ｒｃｆ、１３２２００ｒｃｆ、１３２２５０ｒｃｆ、１３２３００ｒｃｆ、１３２３５０ｒｃｆ、１３２４００ｒｃｆ、１３２４５０ｒｃｆ、１３２５００ｒｃｆ、１３２５５０ｒｃｆ、１３２６００ｒｃｆ、１３２６５０ｒｃｆ、１３２７００ｒｃｆ、１３２７５０ｒｃｆ、１３２８００ｒｃｆ、１３２８５０ｒｃｆ、１３２９００ｒｃｆ、１３２９５０ｒｃｆ、１３３０００ｒｃｆ、１３３０５０ｒｃｆ、１３３１００ｒｃｆ、１３３１５０ｒｃｆ、１３３２００ｒｃｆ、１３３２５０ｒｃｆ、１３３３００ｒｃｆ、１３３３５０ｒｃｆ、１３３４００ｒｃｆ、１３３４５０ｒｃｆ、１３３５００ｒｃｆ、１３３５５０ｒｃｆ、１３３６００ｒｃｆ、１３３６５０ｒｃｆ、１３３７００ｒｃｆ、１３３７５０ｒｃｆ、１３３８００ｒｃｆ、１３３８５０ｒｃｆ、１３３９００ｒｃｆ、１３３９５０ｒｃｆ、１３４０００ｒｃｆ、１３４０５０ｒｃｆ、１３４１００ｒｃｆ、１３４１５０ｒｃｆ、１３４２００ｒｃｆ、１３４２５０ｒｃｆ、１３４３００ｒｃｆ、１３４３５０ｒｃｆ、１３４４００ｒｃｆ、１３４４５０ｒｃｆ、１３４５００ｒｃｆ、１３４５５０ｒｃｆ、１３４６００ｒｃｆ、１３４６５０ｒｃｆ、１３４７００ｒｃｆ、１３４７５０ｒｃｆ、１３４８００ｒｃｆ、１３４８５０ｒｃｆ、１３４９００ｒｃｆ、１３４９５０ｒｃｆ、１３５０００ｒｃｆ、１３５０５０ｒｃｆ、１３５１００ｒｃｆ、１３５１５０ｒｃｆ、１３５２００ｒｃｆ、１３５２５０ｒｃｆ、１３５３００ｒｃｆ、１３５３５０ｒｃｆ、１３５４００ｒｃｆ、１３５４５０ｒｃｆ、１３５５００ｒｃｆ、１３５５５０ｒｃｆ、１３５６００ｒｃｆ、１３５６５０ｒｃｆ、１３５７００ｒｃｆ、１３５７５０ｒｃｆ、１３５８００ｒｃｆ、１３５８５０ｒｃｆ、１３５９００ｒｃｆ、１３５９５０ｒｃｆ、１３６０００ｒｃｆ、１３６０５０ｒｃｆ、１３６１００ｒｃｆ、１３６１５０ｒｃｆ、１３６２００ｒｃｆ、１３６２５０ｒｃｆ、１３６３００ｒｃｆ、１３６３５０ｒｃｆ、１３６４００ｒｃｆ、１３６４５０ｒｃｆ、１３６５００ｒｃｆ、１３６５５０ｒｃｆ、１３６６００ｒｃｆ、１３６６５０ｒｃｆ、１３６７００ｒｃｆ、１３６７５０ｒｃｆ、１３６８００ｒｃｆ、１３６８５０ｒｃｆ、１３６９００ｒｃｆ、１３６９５０ｒｃｆ、１３７０００ｒｃｆ、１３７０５０ｒｃｆ、１３７１００ｒｃｆ、１３７１５０ｒｃｆ、１３７２００ｒｃｆ、１３７２５０ｒｃｆ、１３７３００ｒｃｆ、１３７３５０ｒｃｆ、１３７４００ｒｃｆ、１３７４５０ｒｃｆ、１３７５００ｒｃｆ、１３７５５０ｒｃｆ、１３７６００ｒｃｆ、１３７６５０ｒｃｆ、１３７７００ｒｃｆ、１３７７５０ｒｃｆ、１３７８００ｒｃｆ、１３７８５０ｒｃｆ、１３７９００ｒｃｆ、１３７９５０ｒｃｆ、１３８０００ｒｃｆ、１３８０５０ｒｃｆ、１３８１００ｒｃｆ、１３８１５０ｒｃｆ、１３８２００ｒｃｆ、１３８２５０ｒｃｆ、１３８３００ｒｃｆ、１３８３５０ｒｃｆ、１３８４００ｒｃｆ、１３８４５０ｒｃｆ、１３８５００ｒｃｆ、１３８５５０ｒｃｆ、１３８６００ｒｃｆ、１３８６５０ｒｃｆ、１３８７００ｒｃｆ、１３８７５０ｒｃｆ、１３８８００ｒｃｆ、１３８８５０ｒｃｆ、１３８９００ｒｃｆ、１３８９５０ｒｃｆ、１３９０００ｒｃｆ、１３９０５０ｒｃｆ、１３９１００ｒｃｆ、１３９１５０ｒｃｆ、１３９２００ｒｃｆ、１３９２５０ｒｃｆ、１３９３００ｒｃｆ、１３９３５０ｒｃｆ、１３９４００ｒｃｆ、１３９４５０ｒｃｆ、１３９５００ｒｃｆ、１３９５５０ｒｃｆ、１３９６００ｒｃｆ、１３９６５０ｒｃｆ
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【0076】

特定の例示的な実施形態では、任意に保持液を分画する前に、保持液は超遠心分離されない。これらの実施形態では、保持液は、カラム分離によって任意に実施される分別の前に、約－８０℃で保存される。

【0077】

保持液の任意の分画は、カラム分離（サイズ、電荷、親和性、結合力、または他の方法または分離戦略に基づく）を含むがこれらに限定されない任意の好適な方法によって行うことができる。エクソソームを含む画分は保存することができる。

【0078】

特定の例示的な実施形態では、本方法は、乳などの生体液の開始量の少なくとも７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または少なくとも２０パーセントであるエクソソーム濃縮物を生成する。特定の例示的な実施形態では、本方法は、乳などの生体液の開始量の約７パーセント、７．５パーセント、８パーセント、８．５パーセント、９パーセント、９．５パーセント、１０パーセント、１０．５パーセント、１１パーセント、１１．５パーセント、１２パーセント、１２．５パーセント、１３パーセント、１３．５パーセント、１４パーセント、１４．５パーセント、１５パーセント、１５．５パーセント、１６パーセント、１６．５パーセント、１７パーセント、１７．５パーセント、１８パーセント、１８．５パーセント、１９パーセント、１９．５パーセント、または約２０パーセントであるエクソソーム濃縮物を生成する。

【0079】

エクソソーム搭載
特定の例示的な実施形態では、本方法は本明細書に記載の方法から得られる製剤のエクソソームに、１つまたは複数のカーゴを搭載することをさらに含む。エクソソームは、任意の適切な方法で充填することができる。本明細書に記載の方法によって調製されたものなどの乳エクソソームを充填する例示的な方法は、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／０２８４３９、特に８３～８７ページに記載されている方法のいずれかである。

【0080】

代表的なカーゴ
乳エクソソームには、好適なまたは所望のカーゴを充填することができる。いくつかの実施形態では、カーゴ（複数可）は治療用化合物または分子である。例示的なカーゴには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、ホルモン、免疫調節薬、解熱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛薬、鎮痙薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬、放射線増感剤、化学療法剤、造影剤、免疫原、抗がん剤、それらの任意の組み合わせ、及び／または同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0081】

特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ＡＣＴ－１１ペプチドを含むがこれに限定されないペプチドである。特定の例示的な実施形態では、カーゴは、ＡＣＴ－１１－Ｉペプチドを含むがこれに限定されないペプチドである。他のペプチドカーゴには、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／０２８４３９、特に６７～８２、８５、及び１０６～１１１ページに記載されているものが含まれる。いくつかの実施形態では、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／０２８４３９の８１～８６ページに記載されているように、カーゴ化合物はエステル化されている。いくつかの実施形態では、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／０２８４３９の８１～８６ページに記載されているように、カーゴ化合物は複数のエステル化を有する。

【0082】

例示的なホルモンには、アミノ酸由来ホルモン（例えば、メラトニン及びチロキシン）、低分子ペプチドホルモン及びタンパク質ホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン放出ホルモン、バソプレシン、インスリン、成長ホルモン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、及び甲状腺刺激ホルモン）、エイコサノイド（例えば、アラキドン酸、リポキシン、プロスタグランジン）、プリン（例えば、ＡＴＰ）、酵素（例えば、クレアチン）、ステロイドホルモン（例えば、エストラジオール、テストステロン、テトラヒドロテストステロン、コルチゾール）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0083】

例示的な免疫調節剤には、プレドニゾン、アザチオプリン、６－ＭＰ、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、インターロイキン（例えば、ＩＬ－２、ＩＬ－７、及びＩＬ－１２）、サイトカイン（例えば、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ－ａ、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－ε、ＩＦＮ－Ｋ、ＩＦＮ－ω、及びＩＦＮ－γ）、顆粒球コロニー刺激因子、及びイミキモド）、ケモカイン（例えば：ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、及びＣＸＣＬ７）、シトシンリン酸－グアノシン、オリゴデオキシヌクレオチド、グルカン、抗体、及びアプタマー）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0084】

例示的な解熱薬には、非ステロイド性抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、アスピリン及び関連サリチル酸塩（例えば、サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、及びサリチル酸ナトリウム）、パラセタモール／アセトアミノフェン、メタミゾール、ナブメトン、フェナゾン、キニーネが挙げられるが、これらに限定されない。

【0085】

例示的な抗不安薬には、ベンゾジアゼピン（例えば、アルプラゾラム、ブロマゼパム、クロルジアゼポキシド、クロナゼパム、クロラゼプ酸、ジアゼパム、フルラゼパム、ロラゼパム、オキサゼパム、テマゼパム、トリアゾラム、及びトフィソパム）、セロトニン作動性抗うつ薬（例えば、選択的セロトニン再取り込み阻害薬、三環系抗うつ薬、及びモノアミンオキシダーゼ阻害薬）、テムギコルリル、ファボモチゾール、セランク、ブロマンタン、エモキシピン、アザピロン、バルビツール酸塩、ヒドロキシジン、プレガバリン、イソ吉草酸、及びベータ遮断薬が挙げられるが、これらに限定されない。

【0086】

例示的な抗精神病薬には、ベンペリドール、ブロムペリドール、ドロペリドール、ハロペリドール、モペロン、ピパンペロン、チミペロン、フルスピリレン、ペンフルリドール、ピモジド、アセプロマジン、クロルプロマジン、シアメマジン、ジキシラジン、フルフェナジン、レボメプロマジン、メソリダジン、ペラジン、ペリシアジン、ペルフェナジン、ピポチアジン、プロクロルペラジン、プロマジン、プロメタジン、プロチペンジル、チオプロペラジン、チオリダジン、トリフルオペラジン、トリフルプロマジン、クロルプロチキセン、クロペンチキソール、フルペンチキソール、チオチキセン、ズクロペンチキソール、クロチアピン、ロキサピン、プロチペンジル、カルピプラミン、クロカプラミン、モリンドン、モサプラミン、スルピリド、ベラリプリド、アミスルプリド、アモキサピン、アリピプラゾール、アセナピン、クロザピン、ブロナンセリン、イロペリドン、ルラシドン、メルペロン、ネモナプリド、オランザピン、パリペリドン、ペロスピロン、クエチアピン、レモキシプリド、リスペリドン、セルチンドール、トリミプラミン、ジプラシドン、ゾテピン、アルストニー、ビフェプルノックス、ビトペルチン、ブレクスピプラゾール、カンナビジオール、カリプラジン、ピマバンセリン、ポマグルメタドメチオニル、バビカセリン、ザノメリン、及びジクロナピンが挙げられるが、これらに限定されない。

【0087】

例示的な鎮痛剤には、パラセタモール／アセトアミノフェン、非ステロイド性抗炎症剤（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、オピオイド（例えば、モルヒネ、コデイン、オキシコドン、ヒドロコドン、ジヒドロモルヒネ、ペチジン、ブプレノルフィン）、トラマドール、ノルエピネフリン、フルピルチン、ネフォパム、オルフェナドリン、プレガバリン、ガバペンチン、シクロベンザプリン、スコポラミン、メタドン、ケトベミドン、ピリトラミド、アスピリン及び関連サリチル酸塩（例えば：サリチル酸コリン、サリチル酸マグネシウム、サリチル酸ナトリウム）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0088】

例示的な鎮痙薬には、メベベリン、パパベリン、シクロベンザプリン、カリソプロドール、オルフェナドリン、チザニジン、メタキサロン、メトカルバモール、クロルゾキサゾン、バクロフェン、ダントロレン、バクロフェン、チザニジン、及びダントロレンが挙げられるが、これらに限定されない。好適な抗炎症薬には、プレドニゾン、非ステロイド系抗炎症薬（例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェン、及びニメスリド）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、及び免疫選択的抗炎症誘導体（例えば、顎下腺ペプチド－Ｔ及びその誘導体）が含まれるが、これらに限定されない。

【0089】

例示的な抗ヒスタミン薬には、Ｈ１受容体アンタゴニスト（例えば、アクリバスチン、アゼラスチン、ビラスチン、ブロムフェニラミン、ブクリジン、ブロモジフェンヒドラミン、カルビノキサミン、セチリジン、クロルプロマジン、シクリジン、クロルフェニラミン、クレマスチン、シプロヘプタジン、デスロラタジン、デクスブロムフェニルアミン、デクスクロルフェニラミン、ジメンヒドリナート、ジメチンデン、ジフェンヒドラミン、ドキシルアミン、エバスチン、エンブラミン、フェキソフェナジン、ヒドロキシジン、レボセチリジン、ロラタジン、メクリジン、ミルタザピン、オロパタジン、オルフェナドリン、フェニンダミン、フェニラミン、フェニルトロキサミン、プロメタジン、ピリラミン、クエチアピン、ルパタジン、トリペレナミン、トリプロリジン）、Ｈ２－受容体アンタゴニスト（例えば、シメチジン、ファモチジン、ラフチジン、ニザチジン、ラニチジン、及びロキサチジン）、トリトクアリン、カテキン、クロモグリケート、ネドクロミル、及びｐ２－アドレナリン作動性アゴニスト）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0090】

例示的な抗感染症薬には、アメーバ系殺虫剤（例えば、ニタゾキサニド、パロモマイシン、メトロニダゾール、チニダゾール、クロロキン、ミルテフォシン、アムホテリシンｂ、及びヨードキノール）、アミノグリコシド（例えば、パロモマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、及びネオマイシン）、駆虫薬（例えば、ピランテル、メベンダゾール、イベルメクチン、プラジカンテル、アルベンダゾール、チアベンダゾール、オキサムニキン）、抗真菌薬（例えば、アゾール系抗真菌薬（例えば、イトラコナゾール、フルコナゾール、ポサコナゾール、ケトコナゾール、クロトリマゾール、ミコナゾール、ボリコナゾール）、エキノキャンディ（例えば、カスポファンギン、アニデュラファンギン、及びミカファンギン）、グリセオフルビン、テルビナフィン、フルシトシン、及びポリエン（例えば、ナイスタチン、アムホテリシンｂ）、抗マラリア薬（例えば、ピリメタミン／スルファドキシン、アルテメテル／ルメファントリン、アトバクオン／プロクアニル、キニーネ、ヒドロキシクロロキン、メフロキン、クロロキン、ドキシサイクリン、ピリメタミン、及びハロファントリン）、抗結核薬（例えば、アミノサリチル酸塩（例えば、アミノサリチル酸）、イソニアジド／リファンピン、イソニアジド／ピラジナミド／リファンピン、ベダキリン、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、及びサイクロセリン）、抗ウイルス薬（例えば、アマンタジン、リマンタジン、アバカビル／ラミブジン、エムトリシタビン／テノホビル、コビシスタット／エルビテグラビル／エムトリシタビン／テノホビル、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノホビル、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン、ラミブジン／ジドブジン、エムトリシタビン／テノホビル、エムトリシタビン／ロピナビル／リトナビル／テノホビル、インターフェロンアルファ－２ｖ／リバビリン、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、マラビロック、ラルテグラビル、ドルテグラビル、エンフビルチド、ホスカルネット、フォミビルセン、オセルタミビル、ザナミビル、ネビラピン、エファビレンツ、エトラビリン、リルピビリン、デラビルジン、ネビラピン、エンテカビル、ラムイブジン、アデホビル、ソホスブビル、ジダノシン、テノホビル、アバカビル、ジドブジン、スタブジン、エムトリシタビン、ザルシタビン、テルビブジン、シメプレビル、ボセプレビル、テラプレビル、ロピナビル／リトナビル、ホスアンプレナビル、ダルナビル、リトナビル、チプラナビル、アタザナビル、ネルフィナビル、アンプレナビル、インディナビル、サキナビル、リバビリン、バラシクロビル、アシクロビル、ファムシクロビル、ガンシクロビル、及びバルガンシクロビル）、カルバペネム類（例、ドリペネム、メロペネム、エルタペネム、及びシラスタチン／イミペネム）、セファロスポリン類（例えば、セファドロキシル、セフラジン、セファゾリン、セファレキシン、セフェピム、セフラロリン、ロラカルベフ、セフォテタン、セフロキシ）私、セフプロジル、ロラカルベフ、セフォキシチン、セファクロル、セフチブテン、セフトリアキソン、セフォタキシム、セフポドキシム、セフジニル、セフィキシム、セフジトレン、セフィゾキシム、及びセフタジジム）、グリコペプチド系抗生物質（例えば、バンコマイシン、ダルババンシン、オリタバンシン、及びテラバンシン）、グリシルサイクリン系薬剤（例えば、チゲサイクリン）、ハンセン病薬（例えば、クロファジミン及びサリドマイド）、リンコマイシン及びその誘導体（例えば、クリンダマイシン及びリンコマイシン）、マクロライド及びその誘導体（例えば、テリスロマイシン、フィダキソマイシン、エリスロマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、及びトロアンドマイシン）、リネゾリド、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、リファキシミン、クロラムフェニコール、ホスホマイシン、メトロニダゾール、アズトレオナム、バシトラシン、ペニシリン類（アモキシシリン、アンピシリン、バカンピシリン、カルベニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、アモキシシリン／クラブラン酸、アンピシリン／スルバクタム、ピペラシリン／タゾバクタム、クラブラン酸／チカルシリン、ペニシリン、プロカインペニシリン、オキサシリン、ジクロキサック）イリン、ナフシリン）、キノロン類（例えば、ロメフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、モキシフロキサシン、シノキサシン、ナリジクス酸、エノキサシン、グレパフロキサシン、ガチフロキサシン、トロバフロキサシン、及びスパルフロキサシン）、スルホンアミド（例えば、スルファメトキサゾール／トリメトプリム、スルファサラジン、スルファソキサゾール）、テトラサイクリン（例えば、ドキシサイクリン、デメクロサイクリン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン／サリチル酸、ドキシサイクリン／オメガ－３多価不飽和脂肪酸、及びテトラサイクリン）、及び尿中抗感染症薬（例えば、ニトロフラントイン、メテナミン、ホスホマイシン、シノキサシン、ナリジクス酸、トリメトプリム、及びメチレンブルー）が挙げられるが、それらに限定されない。

【0091】

例示的な化学療法薬には、パクリタキセル、ブレンツキシマブベドチン、ドキソルビシン、５－ＦＵ（フルオロウラシル）、エベロリムス、ペメトレキセド、メルファラン、パミドロン酸、アナストロゾール、エキセメスタン、ネララビン、オファツムマブ、ベバシズマブ、ベリノスタット、トシツモマブ、カルムスチン、ブレオマイシン、ボスチニブ、ブスルファン、アレムツズマブ、イリノテカン、バンデタニブ、ビカルタミド、ロムスチン、ダウノルビシン、クロファラビン、カボザンチニブ、ダクチノマイシン、ラムシルマブ、シタラビン、シトキサン、シクロホスファミド、デシタビン、デキサメタゾン、ドセタキセル、ヒドロキシ尿素、ダカルバジン、リュープロリド、エピルビシン、オキサリプラチン、アスパラギナーゼ、エストラムスチン、セツキシマブ、ビスモデギブ、アスパラギナーゼＥｒｗｉｎｉａ、クリサンテミン、アミホスチン、エトポシド、フルタミド、トレミフェン、フルベストラント、レトロゾール、デガレリクス、プララトレキサート、メトトレキサート、フロクスウリジン、オビヌツズマブ、ゲムシタビン、アファチニブ、イマチニブ、メシラート、カルムスチン、エリブリン、トラスツズマブ、アルトレタミン、トポテカン、ポナチニブ、イダルビシン、イホスファミド、イブルチニブ、アキシチニブ、インターフェロンアルファ－２ａ、ゲフィチニブ、ロミデプシン、イクサベピロン、ルキソリチニブ、カバジタキセル、ａｄｏ－トラスツズマブエムタンシン、カーフィルゾミブ、クロラムブシル、サルグラモスチム、クラドリビン、ミトタン、ビンクリスチン、プロカルバジン、メゲストロール、トラメチニブ、メスナ、ストロンチウム－８９塩化物、メクロレタミン、マイトマイシン、ブスルファン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ビノレルビン、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、ソラフェニブ、ニルタミド、ペントスタチン、タモキシフェン、ミトキサントロン、ペグアスパルガーゼ、デニロイキンジフチトクス、アリトレチノイン、カルボプラチン、ペルツズマブ、シスプラチン、ポマリドミド、プレドニゾン、アルデスロイキン、メルカプトプリン、ゾレドロン酸、レナリドミド、リツキシマブ、オクトレオチド、ダサチニブ、レゴラフェニブ、ヒストレリン、スニチニブ、シルツキシマブ、オマセタキシン、チオグアニン（チオグアニン（ｔｉｏｇｕａｎｉｎｅ））、ダブラフェニブ、エルロチニブ、ベキサロテン、テモゾロミド、チオテパ、サリドマイド、ＢＣＧ、テムシロリムス、ベンダムスチン塩酸塩、トリプトレリン、亜ヒ酸、ラパチニブ、バルルビシン、パニツムマブ、ビンブラスチン、ボルテゾミブ、トレチノイン、アザシチジン、パゾパニブ、テニポシド、ロイコボリン、クリゾチニブ、カペシタビン、エンザルタミド、イピリムマブ、ゴセレリン、ボリノスタット、イデラリシブ、セリチニブ、アビラテロン、エポチロン、タフルポシド、アザチオプリン、ドキシフルリジン、ビンデシン、及び全トランス型レチノイン酸が挙げられるが、これらに限定されない。

【0092】

好適な放射線増感剤には、５－フルオロウラシル、白金類似体（例えば、シスプラチン、カルボプラチン、及びオキサリプラチン）、ゲムシタビン、ＤＮＡトポイソメラーゼＩ標的薬物（例えば、カンプトテシン誘導体（例えば、トポテカン及びイリノテカン））上皮成長因子受容体遮断ファミリー薬剤（例えば、セツキシマブ、ゲフィチニブ）、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、Ｌ－７７８－１２３）、ＣＯＸ－２阻害剤（例えば、ロフェコキシブ、セレコキシブ、及びエトリコキシブ）、ｂＦＧＦ及びＶＥＧＦ標的化剤（例、ベバズシマブ及びサリドマイド）、ＮＢＴＸＲ３、ニモラル、トランスクロセチン酸ナトリウム、ＮＶＸ－１０８、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、Ｋｖｏｌｓ，Ｌ．Ｋ．．，Ｊ Ｎｕｃｌ Ｍｅｄ２００５；４６：１８７Ｓ―１９０Ｓも参照されたい。

【0093】

カーゴとして運ばれる、または単離されたエクソソームの外表面に付着する免疫原の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、コンコレパス・コンコレパス・ヘモシアニン（ＣＣＨ）（ブルーキャリア免疫原性タンパク質とも）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、及びジフテリア、破傷風、百日咳、麻疹、おたふく風邪、風疹、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、髄膜炎菌性疾患（例えば：髄膜炎）、ヒトパピローマウイルス水痘、狂犬病、インフルエンザ、ロトウイルス、ＨＩＶ、マラリア、及びコロナウイルス疾患などの疾患を引き起こす病原体に対する免疫応答を生成するために使用される抗原などが挙げられ得る。

【0094】

乳エクソソーム製剤とキット
また、本明細書には、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される、ある量、有効量、及び／または最小有効量、及び／または治療有効量のカーゴ搭載乳エクソソームなどの１つまたは複数の乳エクソソームを含有することができる医薬製剤、及び薬学的に許容される担体または賦形剤が記載される。本明細書のある例示的な実施形態では、エクソソームを含む製剤が記載されており、本製剤は、前述の段落のいずれか１つ及び／または以下の実施例など、本明細書の他の場所に記載されている方法のいずれか１つによって少なくとも部分的に生成される。本明細書のある例示的な実施形態では、前述の段落のいずれか１つ及び／または以下の実施例など、本明細書の他の場所に記載されている製剤を対象に投与することを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、対象に投与される製剤には、例えば、本明細書の他の場所に記載される、及び／または本明細書の他の場所に記載される方法によって調製されるいずれかの乳エクソソームが含まれる。いくつかの実施形態では、乳エクソソームは、カーゴを搭載した乳エクソソームである。

【0095】

いくつかの実施形態では、乳エクソソームまたはその製剤が投与される対象は、疾患または障害を有する。例示的な疾患または障害には、がん、ウイルス感染、細菌感染、寄生虫感染、外部及び内部の創傷及び組織損傷、がん、虚血性及び／または低酸素性損傷（例えば、心筋梗塞、虚血性損傷創傷及び／または脳卒中）、多発性硬化症、乾癬、強皮症、座瘡、湿疹、または皮膚及び／または結合組織の疾患、心臓疾患または障害、神経変性疾患または障害、神経障害、アテローム性動脈硬化症、上皮透過性及び／または血管新生（例えば、血管新生または脈管形成）、呼吸窮迫症候群（ＲＤＳ）、再灌流傷害、皮膚血管傷または奇形、黄斑変性、ブルッフ膜を通る脈絡毛細血管の新生血管新生、糖尿病性網膜症、（炎症性及び炎症関連疾患及び障害）及び放射線皮膚炎が挙げられるが、これらに限定されない。

【0096】

創傷は、慢性的な創傷または完全に治癒していないように見える創傷であり得る。例えば、３か月以内に治らない傷は慢性的であると言われる。慢性創傷には、糖尿病性足潰瘍、虚血性潰瘍、静脈性潰瘍、静脈性下腿潰瘍、静脈うっ滞、動脈性、圧迫性、血管炎性、感染性、褥瘡、熱傷、外傷性潰瘍、壊疽性及び混合性潰瘍が挙げられる。慢性創傷には、慢性炎症、欠損及び過剰な肉芽組織分化、及び再上皮化及び創傷閉鎖の不全、並びにより長い修復時間を特徴とする創傷が挙げられる。慢性創傷には、角膜潰瘍を含む眼潰瘍が含まれ得る。創傷治癒及び組織再生における開示された発明の使用には、ヒト、農業動物、スポーツ動物及びペット動物が含まれ得る。

【0097】

組織損傷は、例えば、切り傷、擦り傷、圧迫創傷、伸展傷害、裂傷傷、圧壊傷、噛み傷、すり傷、弾丸傷、爆発傷、ボディピアス、刺し傷、外科的傷、外科的介入、医療介入、細胞、組織、または臓器移植後の宿主拒絶反応、薬学的効果、薬学的副作用、褥瘡、放射線傷害、放射線疾患、美容皮膚傷、内臓傷害、疾患過程（例えば、喘息、がん）、感染症、伝染性病原体、発育過程、成熟過程（例えば、座瘡）、遺伝子異常、発育異常、環境毒素、アレルゲン、頭皮損傷、顔面損傷、顎損傷、性器損傷、関節損傷、排泄器官損傷、足損傷、指損傷、足指損傷、骨損傷、目の損傷、角膜損傷、筋肉損傷、脂肪組織損傷、肺損傷、気道損傷、ヘルニア、肛門損傷、杭打ち、耳損傷、皮膚損傷、腹部損傷、網膜損傷、目の損傷、角膜損傷、腕の損傷、脚の損傷、運動障害、背中の損傷、出生時の損傷、早産の損傷、中毒咬傷、刺され、バリア機能の損傷、内皮バリア機能の損傷、上皮バリア機能の損傷、腱損傷、靱帯損傷、心臓外傷、心臓弁損傷、血管系損傷、軟骨損傷、リンパ系損傷、頭蓋脳外傷、脱臼、食道穿孔、瘻孔、爪損傷、異物、骨折、凍傷、手の損傷、熱ストレス障害、裂傷、頸部損傷、自己－切断、ショック、外傷性軟部組織損傷、脊髄損傷、脊髄損傷、捻挫、挫傷、腱損傷、靱帯損傷、軟骨損傷、胸部損傷、歯の損傷、外傷、神経系損傷、火傷、熱傷、風火傷、日焼け、化学熱傷、老化、動脈瘤、脳卒中、外科的放射線傷害、消化管傷害、梗塞、または虚血性傷害によって生じ得る。

【0098】

心臓の疾患及び障害としては、心筋梗塞、心筋症（例えば、肥大型心筋症）、不整脈、うっ血性心不全が挙げられるが、これらに限定されない。提供された組成物の再生効果は、心臓の膜興奮性及びイオン過渡現象に有益な変化をもたらし得る。人間の心臓の機能異常を引き起こす可能性のある不整脈には、様々な異なる種類がある。不整脈には、徐脈、頻脈、交互脈、自動性欠損、リエントリー性不整脈、細動、房室結節性不整脈、心房性不整脈及び誘発性拍動、ＱＴ延長症候群、ＱＴ短縮症候群、ブルガダ症候群、心房性期外収縮、徘徊性心房ペースメーカー、多巣性心房性頻脈、心房粗動、心房細動、上室性頻拍、房室結節リエントリー性頻脈は発作性上室性頻脈の最も一般的な原因である、接合部調律、接合部性頻脈、早発接合部複合体、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群、ロウン・ガノン・レビン症候群、心室期外収縮とも呼ばれる心室性期外収縮（ＰＶＣ）、交互脈及び不一致交互脈、加速された固有心室調律、単形性心室頻拍、多形性心室頻拍、心室細動、ＰＲ延長として現れる第１度心ブロック、第２度心ブロック、１型２度心臓ブロック、２型２度心臓ブロック、３度心臓ブロック、及び、いくつかの副経路障害（例えば、ウォルフ・パーキンソン・ホワイト症候群（ＷＰＷ））が挙げられるが、これらに限定されない。

【0099】

神経変性疾患及び神経障害には、認知症、アルツハイマー病、パーキンソン病及び関連するＰＤ疾患、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、運動ニューロン疾患、統合失調症、脊髄小脳失調症、プリオン病、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、多発性硬化症、てんかん及びその他の発作性疾患、及びハンチントン病が挙げられるが、それらに限定されない。

【0100】

炎症性疾患及び炎症関連疾患及び障害は、喘息、湿疹、副鼻腔炎、アテローム性動脈硬化症、関節炎（関節リウマチを含むがこれらに限定されない）、炎症性腸疾患、皮膚及び全身性肥満細胞症、乾癬、及び多発性硬化症であり得る。本明細書で使用される場合、用語「炎症性障害」には、炎症によって少なくとも部分的に引き起こされる、または悪化する疾患または障害が含まれ得、これは一般に、影響を受けた組織や臓器における血流の増加、浮腫、免疫細胞の活性化（例えば、増殖、サイトカイン産生、強化食菌作用）、熱、発赤、腫れ、痛み、及び／または機能喪失を特徴とする。炎症の原因は、物理的損傷、化学物質、微生物、組織壊死、がん、またはその他の病原体や状態に起因し得る。

【0101】

炎症性障害には、急性炎症性障害、慢性炎症性障害、及び再発性炎症性障害が含まれる。急性炎症性障害は一般に比較的短期間であり、約数分～約１日、２日間続くが、数週間続く場合もある。急性炎症性疾患の特徴には、血流の増加、生体液及び血漿タンパク質の浸出（浮腫）、好中球などの白血球の遊走が含まれる。慢性炎症性障害は、一般に、より長期間、例えば、数週間～数ヶ月～数年以上続き、組織学的にリンパ球及びマクロファージの存在、並びに血管及び結合組織の増殖と関連している。再発性炎症性疾患には、一定期間後に再発する疾患、または周期的に発症する疾患が含まれる。いくつかの炎症性疾患は、１つまたは複数のカテゴリーに分類される。例示的な炎症性疾患には、アテローム性動脈硬化症；関節炎；炎症によって促進されるがん；喘息；自己免疫性ブドウ膜炎；養子免疫反応；皮膚炎；多発性硬化症；糖尿病の合併症；骨粗鬆症；アルツハイマー病；脳性マラリア；出血熱；自己免疫疾患；及び炎症性腸疾患が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、炎症性障害は、いくつかの態様では、狼瘡、関節リウマチ、及び自己免疫性脳脊髄炎から選択される自己免疫障害である。

【0102】

いくつかの実施形態では、炎症性障害は脳関連炎症性障害である。「脳関連炎症性」障害という用語は、本明細書では、対象の脳における炎症によって、少なくとも部分的に引き起こされる、またはその起源もしくは悪化する炎症性障害のサブセットを指すために使用される。

【0103】

本明細書で使用される場合、「医薬製剤」とは、薬学的に許容される担体または賦形剤と、活性剤、化合物、または成分との組み合わせを指し、組成物をインビトロ、インビボ、またはエクスビボでの診断、治療、または予防的使用に適したものにする。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体または賦形剤」とは、一般に安全で、無毒であり、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではない、医薬製剤を調製するのに有用な担体または賦形剤を指し、獣医学用途及びヒト医薬用にも許容される、担体または賦形剤を含む。本明細書及び特許請求の範囲で使用される、「薬学的に許容される担体または賦形剤」は、係る担体または賦形剤を、両方及び１つまたは複数含む。カーゴが存在する場合、場合により、カーゴは薬学的に許容される塩として医薬製剤中に存在することができる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、活性成分など、本明細書の他の箇所でより詳細に記載される、カーゴ搭載乳エクソソームなどの１つまたは複数の乳エクソソームを含むことができる。

【0104】

いくつかの実施形態では、カーゴは、活性成分の薬学的に許容される塩として存在する。本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」とは、その対イオンが、薬学的用量の塩で投与される対象に対して非毒性である任意の酸または塩基付加塩を指す。好適な塩には、水素酸塩、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルコロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、リンゴ酸塩、フタル酸塩、及びパモ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0105】

本明細書に記載の医薬製剤は、それを必要とする対象に、それを必要とする対象への任意の好適な方法または経路を介して投与することができる。好適な投与経路には、耳（ａｕｒｉｃｕｌａｒ）（耳（ｏｔｉｃ））、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、副鼻腔内、気管内、腸内、硬膜外、羊水外、体外関節内、血液透析、浸潤、間質性、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆管内、気管支内、嚢状内、心臓内、軟骨内、尾内、空洞内、体腔内、脳内、槽内、角膜間、歯冠内（歯）、冠内、体内、海綿体、皮内、円板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、シナル内、脊髄内、関節滑液嚢内、肘頭腱内包、精巣内、髄腔内、胸腔内、管内、腫瘍内、中耳内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内ボーラス、点滴静注、脳室内、膀胱内、硝子体内、イオン泳動、洗浄、喉頭、鼻、鼻腔胃、閉塞ドレッシング・テクニック、目、経口、中咽頭、ｏｔｈｅｒ、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸（吸入）、眼球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、鼓膜、尿管、尿道、及び／または腟投与、及び／または上記の投与経路のいずれかの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されず、それは治療される疾患及び／または活性成分（複数可）及び／またはカーゴに典型的には依存する。

【0106】

本明細書の他の箇所でより詳細に記載される、カーゴ搭載乳エクソソームなどの１つまたは複数の乳エクソソームは、活性成分または活性剤などの成分を医薬製剤中に、それを必要とする対象に提供することができる。したがって、薬学的に許容される塩の形態であるカーゴを含む、本明細書の他の場所でより詳細に記載されるカ搭載乳エクソソームなどの、１つまたは複数の乳エクソソームを含有する医薬製剤も記載される。好適な塩には、水素酸塩、ヨウ化物、硝酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、イソニコチン酸塩、乳酸塩、サリチル酸塩、酸クエン酸塩、酒石酸塩、オレイン酸塩、タンニン酸塩、パントテン酸塩、酒石酸水素塩、アスコルビン酸塩、コハク酸塩、マレイン酸塩、ゲンチシン酸塩、フマル酸塩、グルコン酸塩、グルコロン酸塩（ｇｌｕｃａｒｏｎａｔｅ）、サッカラート、ギ酸塩、安息香酸塩、グルタミン酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ－トルエンスルホン酸塩、樟脳スルホン酸塩、ナフタレンスルホン酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、リンゴ酸塩、フタル酸塩、及びパモ酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。

【0107】

本明細書で使用される場合、「剤」とは、生物学的に活性であることができる、またはそれが投与される対象に対して生物学的及び／または生理学的効果を誘発することができる任意の物質、化合物、分子等を指す。本明細書で使用される場合、「活性剤」または「活性成分」とは、生物学的に活性である、またはそれが投与される対象に対して生物学的または生理学的効果を誘発する物質、化合物、分子を指す。換言すれば、「活性剤」または「活性成分」は、組成物の効果の全体または一部が寄与する成分または組成物の成分を指す。剤は一次活性剤であり得、換言すれば、組成物の効果の全体または一部が寄与する組成物の成分（複数可）であり得る。剤は二次活性剤であり得、換言すれば、組成物の効果の追加の部分及び／または他が寄与する組成物の成分（複数可）であり得る。いくつかの実施形態では、活性剤は、乳エクソソームまたはカーゴ搭載乳エクソソームである。いくつかの実施形態では、活性剤は、カーゴを搭載した乳エクソソームのカーゴを含むか、そのカーゴである。

【0108】

特定の実施形態では、乳エクソソームは、本明細書の他の場所に記載される任意の方法によって調製される。特定の実施形態では、カーゴ搭載乳エクソソームは記載されるものである、及び／または本明細書の他の場所に記載される任意の方法によって調製される。

【0109】

いくつかの実施形態では、乳エクソソームまたはその製剤は、対象に乳エクソソームまたはその配合物を投与するための材料に含まれる。材料の非限定的な例としては、包帯、ステミストリップ、縫合糸、ステープル、または移植片（例えば皮膚移植片）などの創傷の治療に使用されるものが挙げられる。他の例示的な材料としては、医療機器またはインプラント（またはその構成要素）が挙げられる。医療用インプラントの非限定的な例には、義肢、乳房インプラント、陰茎インプラント、精巣インプラント、義眼、顔面インプラント、人工関節、心臓弁補綴物、血管補綴物、歯科補綴物、顔面補綴物、傾斜ディスク弁、ケージドボール弁、人工耳、人工鼻、ペースメーカー、人工内耳、ステント、シャント、カテーテル、フィルタ、メッシュ、フィラー（例、脂肪及び真皮フィラー）、及び代用皮膚（例、ブタ異種移植片／豚皮、ＢＩＯＢＲＡＮＥ、培養ケラチノサイト）、及び／または同様のものが挙げられるが、これらに限定されない。

【0110】

薬学的に許容される担体及び二次成分及び剤
医薬製剤は、薬学的に許容される担体を含むことができる。好適な薬学的に許容される担体には、水、乳及び乳製品（例えば、カゼイン、アイスクリーム、カスタード、クリーマーなど）、塩溶液、アルコール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロースまたはデンプンなどの炭水化物、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、及びポリビニルピロリドン（これらは活性組成物と有害に反応しない）が挙げられるが、これらに限定されない。

【0111】

医薬製剤は滅菌し、所望の場合、活性化合物と有害に反応しない、潤滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与えるための塩、緩衝液、着色、香料及び／または芳香物質などの剤と混合することができる。

【0112】

いくつかの実施形態では、医薬製剤はまた、限定されないが、例えば、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、ホルモン、免疫調節薬、解熱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛薬、鎮痙薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬、化学療法薬、及びそれらの任意の組み合わせを含む生物薬剤または分子を含むがこれらに限定されない、有効量の二次活性剤を含むことができる。
有効量

【0113】

いくつかの実施形態では、一次活性剤（例えば、乳エクソソーム、カーゴ搭載乳エクソソーム、及び／またはカーゴ）及び／または任意の二次薬剤の量は、有効量、最小有効量、及び／または治療有効量であり得る。本明細書で使用される場合、「有効量」とは、１つまたは複数の治療効果または所望の効果を達成する、医薬製剤中に含まれる一次薬剤及び／または任意の二次薬剤の量を指す。本明細書で使用される場合、「最小有効」量とは、１つまたは複数の治療効果または所望の効果を達成する、医薬製剤中に含まれる一次薬剤及び／または任意の二次薬剤の最小量を指す。本明細書で使用される場合、「治療有効量」とは、１つまたは複数の治療効果を達成する、医薬製剤中に含まれる一次薬剤及び／または任意の二次薬剤の量を指す。

【0114】

本明細書の他の場所に記載される、医薬製剤中に含まれる一次及び任意の二次活性剤の有効量、最小有効量、及び／または治療有効量は、ゼロではない約０～１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｐｇ、ｎｇ、μｇ、ｍｇ、もしくはｇの範囲の量、またはこれらの範囲内の任意の数値または部分範囲であり得る。

【0115】

いくつかの実施形態では、有効量、最小有効量、及び／または治療有効量は、それぞれが、ゼロではない約０～１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ｐＭ、ｎＭ、μＭ、ｍＭ、もしくはＭの範囲の量、またはこれらの範囲内の任意の数値または部分範囲であり得る、有効濃度、最小有効濃度、及び／または治療有効濃度であり得る。

【0116】

他の実施形態では、一次及び任意の二次活性剤の有効量、最小有効量、及び／または治療有効量は、ゼロではない約０～１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００ＩＵの範囲の量、またはこれらの範囲内の任意の数値もしくは部分範囲であり得る。

【0117】

いくつかの実施形態では、医薬製剤中に存在する一次及び／または任意の二次活性剤は、ゼロではない、約０～０．００１、０．００２、０．００３、０．００４、０．００５、０．００６、０．００７、０．００８、０．００９、０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４１、０．４２、０．４３、０．４４、０．４５、０．４６、０．４７、０．４８、０．４９、０．５、０．５１、０．５２、０．５３、０．５４、０．５５、０．５６、０．５７、０．５８、０．５９、０．６、０．６１、０．６２、０．６３、０．６４、０．６５、０．６６、０．６７、０．６８、０．６９、０．７、０．７１、０．７２、０．７３、０．７４、０．７５、０．７６、０．７７、０．７８、０．７９、０．８、０．８１、０．８２、０．８３、０．８４、０．８５、０．８６、０．８７、０．８８、０．８９、０．９、０．９１、０．９２、０．９３、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７、０．９８、０．９～１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％ｗ／ｗ、ｖ／ｖ、もしくはｗ／ｖ、またはこれらの範囲内の任意の数値もしくは部分範囲であり得る。

【0118】

細胞または細胞集団が医薬製剤中に（例えば、二次活性剤として）存在するいくつかの実施形態では、細胞の有効量は、約１または２細胞から１×１０^１／ｍＬ、１×１０^２０／ｍＬ以上、例えば、約１×１０^１／ｍＬ、１×１０^２／ｍＬ、１×１０^３／ｍＬ、１×１０^４／ｍＬ、１×１０^５／ｍＬ、１×１０^６／ｍＬ、１×１０^７／ｍＬ、１×１０^８／ｍＬ、１×１０^９／ｍＬ、１×１０^１０／ｍＬ、１×１０^１１／ｍＬ、１×１０^１２／ｍＬ、１×１０^１３／ｍＬ、１×１０^１４／ｍＬ、１×１０^１５／ｍＬ、１×１０^１６／ｍＬ、１×１０^１７／ｍＬ、１×１０^１８／ｍＬ、１×１０^１９／ｍＬ、～／または約１×１０^２０／ｍＬ、またはこれらの範囲内の任意の数値または部分範囲であり得る。

【0119】

いくつかの実施形態では、量または有効量（特に感染性粒子が送達される場合（例えば、一次または二次因子としてのウイルスまたはウイルス様粒子、例えばカーゴとして））、有効量のウイルス粒子を、力価（単位体積当たりのプラーク形成単位）またはＭＯＩ（感染多重度）として発現させることができる。いくつかの実施形態では、有効量は、ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり約１×１０^１粒子～ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり１×１０^２０／粒子以上、例えば、ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり約１×１０^１、１×１０^２、１Ｘ１０^３、１Ｘ１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８、１×１０^１９～／１×１０^２０粒子であり得る。いくつかの実施形態では、有効力価は、ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり約１×１０^１変換単位～ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり１×１０^２０／変換単位以上、例えば、ｐＬ、ｎＬ、μＬ、ｍＬ、またはＬあたり約１×１０^１、１×１０^２、１×１０^３、１×１０^４、１×１０^５、１×１０^６、１×１０^７、１×１０^８、１×１０^９、１×１０^１０、１×１０^１１、１×１０^１２、１×１０^１３、１×１０^１４、１×１０^１５、１×１０^１６、１×１０^１７、１×１０^１８、１×１０^１９、～／または約１×１０^２０変換単位または任意の数値またはこれらの範囲内の部分範囲であり得る。いくつかの実施形態では、医薬製剤のＭＯＩは、約０．１～１０以上の範囲、例えば、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９、６、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、７、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、７．６、７．７、７．８、７．９、８、８．１、８．２、８．３、８．４、８．５、８．６、８．７、８．８、８．９、９、９．１、９．２、９．３、９．４、９．５、９．６、９．７、９．８、９．９、１０以上、またはこれらの範囲内の任意の数値または部分範囲であり得る。

【0120】

いくつかの実施形態では、医薬製剤中に含まれる本明細書に記載の１つまたは複数の活性剤の量または有効量は、それを必要とする対象の体重に基づいて約１ｐｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇの範囲、または医薬製剤を投与できる特定の患者集団の平均体重であり得る。

【0121】

医薬製剤中に二次剤が含まれる実施形態では、二次活性剤の有効量は、とりわけ、二次剤、一次剤、投与経路、対象の年齢、疾患、疾患の段階に応じて変化し、これは当業者の通常の知識の一つであろう。

【0122】

医薬製剤中に任意に存在する場合、二次活性剤は、医薬製剤中に含めることができるか、または化合物、その誘導体、またはその医薬製剤と同時にまたは逐次的に投与できる独立した化合物または医薬製剤として存在することができる。

【0123】

いくつかの実施形態において、二次活性剤の有効量は、任意に存在する場合、医薬製剤中に存在する全活性剤の、ゼロではない、約０～１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％ｗ／ｗ、ｖ／ｖ、もしくはｗ／ｖ、または、これらの範囲内の任意の数値もしくは部分範囲である。追加の実施形態において、二次活性剤の有効量は、全医薬製剤の、ゼロではない、約０～１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９％ｗ／ｗ、ｖ／ｖ、もしくはｗ／ｖ、または、これらの範囲内の任意の数値もしくは部分範囲である。

【0124】

剤形
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤は、剤形で提供することができる。剤形は、それを必要とする対象に投与することができる。剤形は、それを必要とする対象の所定の部位で、有効濃度などの特定の濃度を効果的に生成することができる。本明細書で使用される場合、「用量」、「単位用量」、または「投薬量」は、対象における使用に適した物理的に別個の単位を指すことができ、各単位は、所定量の一次活性剤、及び任意に存在する二次活性成分を含有し、及び／またはその投与に関連して所望の応答を生じるように計算されたその医薬製剤を指し得る。いくつかの実施形態では、所定の部位は投与部位の近位にある。いくつかの実施形態では、所定の部位は投与部位の遠位にある。いくつかの場合では、剤形は、対象体内の特定の領域または位置に到達するのに必要な最終意図量よりも多量の、医薬製剤中に存在する１つまたは複数の活性成分を含有し、第１及び第２の通過代謝を介して活性成分の損失を補う。

【0125】

剤形は、任意の適切な経路による投与に適合させることができる。適切な経路には、経口（頬側または舌下を含む）、直腸、眼内、吸入、鼻内、局所（頬側、舌下、または経皮を含む）、膣、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、鼻内、及び皮内が挙げられるが、これらに限定されない。他の適切な経路については、本明細書の他の場所で説明される。このような製剤は、当技術分野で知られている任意の方法によって調製することができる。

【0126】

経口投与に適した剤形は、カプセル、ペレットまたは錠剤、粉末または顆粒、水性または非水性液体の溶液または懸濁液；食用のフォームまたはホイップ、または水中油型液体エマルションまたは油中水型液体エマルションなどの個別の投与単位にすることができる。いくつかの実施形態では、経口投与に適した医薬製剤はまた、医薬製剤に風味付与、保存、着色、または医薬製剤の分散を助ける１つまたは複数の薬剤を含む。経口投与用に調製された剤形は、泡、スプレー、または溶液として送達できる溶液の形態であってもよい。剤形は、それを必要とする対象に投与することができる。必要に応じて、本明細書に記載の剤形はマイクロカプセル化することができる。

【0127】

剤形は、任意の成分の放出を延長または持続するように調製することもできる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の化合物、分子、組成物、ベクター、ベクター系、細胞、またはそれらの組み合わせは、放出が遅延される成分であり得る。いくつかの実施形態では、一次活性剤は、その放出が遅延される成分である。いくつかの実施形態では、任意の二次活性剤は、その放出が遅延される成分であり得る。成分の放出を遅らせるための適切な方法には、ポリマー、ワックス、ゲルなどの材料に成分をコーティングまたは埋め込むことが含まれるが、これらに限定されない。遅延放出剤形は、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍ ｔａｂｌｅｔｓ，」ｅｄｓ．Ｌｉｂｅｒｍａｎｅｔ．ａｌ．（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９８９）、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ－Ｔｈｅｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ」，２０ｔｈｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２０００及び「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ」，６ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｎｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，（Ｍｅｄｉａ，ＰＡ：Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，１９９５）などの標準参考文献に記載されているように調製することができる。これらの参考文献は、錠剤及びカプセル、並びに錠剤及びペレット、カプセル、及び顆粒の遅延放出剤形を調製するための賦形剤、材料、機器、及びプロセスに関する情報を提供する。遅延放出は、約１時間～約３か月以上であり得る。

【0128】

好適なコーティング材料の例としては、例えば、セルロースアセテートフタレート、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、及びヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートスクシネートなどのセルロースポリマー、ポリビニルアセテートフタレート、アクリル酸ポリマー及びコポリマー、並びに、ＥＵＤＲＡＧＩＴ（登録商標）（Ｒｏｔｈ Ｐｈａｒｍａ、Ｗｅｓｔｅｒｓｔａｄｔ、ドイツ）の商品名で市販されているメタクリル樹脂、ゼイン、セラック、並びに多糖類が挙げられるが、これらに限定されない。

【0129】

所望の放出プロフィールを生成するために、コーティングは、水不溶性／水溶性非ポリマー賦形剤の有無にかかわらず、異なる比率の水溶性ポリマー、水不溶性ポリマー、及び／またはｐＨ依存性ポリマーを用いて形成され得る。コーティングは、錠剤（コーティングされたビーズの有無にかかわらず圧縮されたもの）、カプセル（コーティングされたビーズの有無にかかわらず）、ビーズ、粒子組成物、懸濁状に製剤化された「成分そのまま」を含むがこれらに限定されない剤形（マトリックスまたは単純）、またはスプリンクル剤形としてのいずれかで実施されるが、これらに限定されない。

【0130】

必要に応じて、本明細書に記載の剤形はリポソームであり得る。これらの実施形態では、一次活性成分（複数可）及び／または任意の二次活性成分（複数可）及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩がリポソームに組み込まれる。したがって、剤形がリポソームである実施形態では、医薬製剤はリポソーム製剤である。リポソーム製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0131】

局所投与に適した剤形は、軟膏、クリーム、懸濁液、ローション、粉末、溶液、ペースト、ゲル、スプレー、エアゾール、またはオイルとして製剤化することができる。目または他の外部組織、例えば、口または皮膚の治療のためのいくつかの実施形態では、医薬製剤は局所軟膏またはクリームとして適用される。軟膏に配合する場合、一次活性成分、任意の二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩を、パラフィン系または水混和性軟膏基剤とともに製剤化することができる。他の実施形態では、一次及び／または二次活性成分は、水中油型クリーム基剤または油中水型クリーム基剤を用いてクリームに製剤化することができる。口内への局所投与に適した剤形には、トローチ（ｌｏｚｅｎｇｅ）、トローチ（ｐａｓｔｉｌｌｅ）、マウスウォッシュが挙げられる。

【0132】

経鼻投与または吸入投与に適した剤形には、エアロゾル、溶液、懸濁液滴、ゲル、または乾燥粉末が挙げられる。いくつかの実施形態では、一次活性成分、任意の二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩は、吸入に適合した剤形であり得、微粉化によって得られるか、または得ることが可能である粒子サイズが低減された形態である。いくつかの実施形態では、サイズが低減された（例えば、微粉化された）化合物またはその塩もしくは溶媒和物の粒子サイズは、当技術分野で公知の適切な方法によって測定される約０．５～約１０ミクロンのＤ_５０値によって定義される。吸入による投与に適した剤形には、粒子ダストまたはミストも含まれる。担体または賦形剤が点鼻スプレーまたは点鼻薬として投与するための液体である好適な剤形には、活性（一次及び／または二次）成分の水溶液または油溶液／懸濁液が含まれ、これは様々なタイプの定量加圧エアロゾル、ネブライザー、または吸入器によって生成され得る。経鼻／吸引製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0133】

いくつかの実施形態では、剤形は、吸入による投与に適したエアロゾル製剤である。これらの実施形態のいくつかでは、エアロゾル製剤は、必要に応じて、一次活性成分、二次活性成分、及び／またはその薬学的に許容される塩の溶液または微細懸濁液、及び薬学的に許容される水性または非水性溶媒を含む。エアロゾル製剤は、密封容器内の滅菌形態で１回または複数回の投与量で提供され得る。これらの実施形態のいくつかでは、密封容器は、容器の内容物が使い果たされた後に廃棄されることを意図した、単回用量または複数回用量の経鼻または定量バルブを備えたエアロゾルディスペンサー（例えば、定量吸入器）である。

【0134】

エアロゾル剤形がエアロゾルディスペンサーに含まれる場合、ディスペンサーは、圧縮空気、二酸化炭素、またはヒドロフルオロカーボンを含むがこれらに限定されない有機噴射剤などの加圧下の適切な噴射剤を含有する。他の実施形態におけるエアロゾル製剤剤形は、ポンプ噴霧器内に含まれる。加圧エアロゾル製剤はまた、一次活性成分、任意の二次活性成分、及び／またはその薬学的に許容される塩の溶液または懸濁液を含有することもできる。さらなる実施形態では、エアロゾル製剤は、例えば製剤の安定性及び／または味及び／または微粒子質量特性（量及び／またはプロフィール）を改善するために組み込まれる共溶媒及び／または改質剤も含有する。エアロゾル製剤の投与は、１日１回または１日に数回、例えば、１日２、３、４、または８回であり得、毎回１、２、３またはそれ以上の用量が送達される。エアロゾル製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0135】

吸入投与に好適な及び／または適合されたいくつかの剤形では、医薬製剤は乾燥粉末吸入可能製剤である。一次活性剤、任意の二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩に加えて、そのような剤形は、乳糖、グルコース、トレハロース、マンニトール、及び／またはデンプンなどの粉末基剤を含有することができる。これらのいくつかの実施形態では、一次活性剤、任意の二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩は、粒子サイズが低減された形態である。さらなる実施形態では、Ｌ－ロイシンまたは別のアミノ酸、セロビオースオクタ酢酸、及び／またはステアリン酸マグネシウムまたはステアリン酸カルシウムなどのステアリン酸の金属塩などの性能調整剤。いくつかの実施形態では、エアロゾル製剤は、エアロゾルの各定量投与量が、本明細書に記載される組成物、化合物、ベクター（複数可）、分子、細胞、及びそれらの組み合わせのうちの１つまたは複数などの所定量の活性成分を含むように手配される。ここで。

【0136】

膣内投与に適した剤形は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、またはスプレー製剤として提供され得る。直腸投与に適した剤形には、坐剤または浣腸剤が挙げられる。経膣製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0137】

非経口投与に適合した及び／または注射に適合した製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、対象の血液で組成物を等張にする溶質を含有することができる、水性及び／または非水性の滅菌注射溶液、並びに懸濁化剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられ得る。非経口投与に適した剤形は、密封されたアンプルまたはバイアルを含むがこれらに限定されない、単一単位用量または複数単位用量の容器で提供することができる。用量を凍結乾燥し、滅菌担体に再懸濁して、投与前に用量を再構成することができる。いくつかの実施形態では、即時注射溶液及び懸濁液は、滅菌粉末、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。非経口製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。

【0138】

いくつかの実施形態では、剤形は、一単位用量あたり、所定量の一次活性剤、任意の二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩を含有する。一実施形態では、一次活性剤、二次活性成分、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩の所定量は、有効量、最小効果量、及び／または治療有効量であり得る。他の実施形態では、一次活性剤、二次活性剤、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩の所定量は、活性成分の有効量の適切な画分であり得る。
共同療法及び併用療法

【0139】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤（複数可）は、併用治療または併用療法の一部である。併用治療には、本明細書に記載の医薬製剤及び追加の治療モダリティが含まれ得る。追加の治療モダリティは、化学療法、生物学的治療、手術、放射線、食事の調節、環境の調節、身体活動の調節、及びそれらの組み合わせであり得る。

【0140】

いくつかの実施形態では、共同療法または併用療法にはさらに、ポリヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、抗体、アプタマー、リボザイム、ホルモン、免疫調節薬、解熱薬、抗不安薬、抗精神病薬、鎮痛薬、鎮痙薬、抗炎症薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬、放射線増感剤、化学療法剤、造影剤、免疫原、抗がん剤、それらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0141】

医薬製剤の投与
本明細書に記載の医薬製剤またはその剤形は、毎時、毎日、毎月、または毎年（例えば、毎時、毎日、毎月、または毎年１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０回、またはそれ以上）投与することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬製剤またはその剤形は、数分～数時間、あるいは数日の範囲の期間にわたって連続的に投与することができる。本明細書に記載の医薬製剤の連続投与を提供するのに有効な装置及び剤形は当技術分野で知られており、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、投与される最初の１つまたはいくつかの初期量は、その後の用量よりも高い用量であり得る。これは、当技術分野では通常、それぞれ負荷用量及び維持用量と呼ばれる。いくつかの実施形態では、医薬製剤は、対象を医薬製剤から徐々に離脱させるか、または対象に医薬製剤を徐々に導入するために、経時的に用量が漸減（増加または減少）するように投与することができる。

【0142】

前述のように、剤形は、一単位用量あたり、所定量の一次活性剤、任意の二次活性剤、及び／または必要に応じてその薬学的に許容される塩を含有することができる。これらのいくつかの実施形態では、所定量は、有効成分の有効量の適切な画分であり得る。したがって、そのような単位用量は、１日、１か月、または１年に１回または複数回（例えば、１日、１か月、または１年に１、２、３、４、５、６回、またはそれ以上）投与され得る。このような医薬製剤は、当技術分野でよく知られている任意の方法によって調製され得る。

【0143】

共同療法または複数の医薬製剤が対象に送達される場合、異なる療法または製剤を逐次にまたは同時に投与することができる。逐次投与は、投与の間にかなりの時間、例えば、約１５、２０、３０、４５、６０分以上が経過する投与である。逐次投与における投与間の時間は、各投与に存在する活性剤に応じて、約数時間、数日、数か月、さらには数年であり得る。同時投与は、２つ以上の製剤を同時にまたは実質的に同時に（例えば、数秒以内またはわずか数分間隔で）投与することを指し、製剤を同時に投与することが意図されている。

【0144】

キット
本明細書に記載される化合物、組成物、製剤、及び／もしくはエクソソームのいずれか、またはそれらの組み合わせは、組み合わせキットとして提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に記載の方法に従って乳エクソソームを調製するために使用される１つまたは複数のフィルタ、チューブ、デバイスなどを含む。本明細書で使用される「組み合わせキット」または「部品のキット」という用語は、中に含まれる複数の要素または有効成分などの単一要素の組み合わせを、包装、販売、取引、送達、及び／または投与するために使用される化合物、組成物、製剤、粒子、細胞及び任意の追加の構成要素を指す。このような追加の構成要素には、パッケージ、シリンジ、ブリスターパッケージ、ボトル等が挙げられるが、これらに限定されない。キットに含まれる本明細書に記載の化合物、組成物、製剤、粒子、細胞の１つまたは複数、またはそれらの組み合わせ（例えば薬剤）が同時に投与される場合、組み合わせキットは、医薬製剤（例えば、錠剤）など単一の製剤中または別個の製剤中に活性剤を含むことができる。本明細書に記載の化合物、組成物、製剤、粒子、及び細胞、またはそれらの組み合わせ及び／またはキット構成要素が同時に投与されない場合、組み合わせキットは、各剤または他の構成要素を別個の医薬製剤中に含むことができる。別個のキット構成要素は、単一のパッケージに含めることも、キット内の別のパッケージに含めることもできる。

【0145】

いくつかの実施形態では、組み合わせキットはまた、有形の発現媒体上に印刷された、またはそうでなければ有形の発現媒体に含まれる説明書を含む。説明書は、本明細書に記載される化合物、組成物、製剤、粒子、及び／またはエクソソームの内容物、またはそれに含まれるそれらの任意の組み合わせに関する情報、本明細書に記載される化合物、組成物、製剤（例えば、医薬製剤）粒子、及び／またはエクソソームの内容物、またはそれに含まれるそれらの任意の組み合わせに関する安全性情報、中に含まれる化合物（複数可）及び／または医薬製剤の用量、使用のための指示及び／または推奨される治療計画（複数可）に関する情報を提供することができる。いくつかの実施形態では、説明書は、本明細書の他の場所に記載される方法に従って乳エクソソームを調製する方法についての指示を提供する。いくつかの実施形態では、説明書は、本明細書に記載の化合物、組成物、製剤、粒子、及び細胞、またはそれらの組み合わせを、それを必要とする対象に投与するための指示を提供することができる。

【実施例】

【0146】

ここまで本開示の実施形態を説明してきたが、一般に、以下の実施例は本開示のいくつかの追加の実施形態を説明する。本開示の実施形態は、以下の実施例及び対応する本文及び図に関連して説明されるが、本開示の実施形態をこの説明に限定する意図はない。反対に、本開示の精神及び実施形態の範囲内に含まれる全ての代替形、修正形、及び同等物を網羅することを意図するものである。以下の実施例は、当業者に、本明細書に開示され特許請求される方法を実施する方法及びプローブを使用する方法の完全な開示及び説明を提供するために提示される。数字（例えば、量、温度など）については、精度を確保するように努めてあるが、ある程度の誤差と偏差は考慮されたい。別段に示されていない限り、部は、重量部であり、温度は、℃であり、圧力は、大気圧または大気圧近傍である。標準の温度及び圧力は２０℃及び１気圧と定義されている。

【0147】

実施例１ウシ乳からのエクソソームの単離
結果
最適化された超遠心分離ベースの単離プロトコル
乳から精製エクソソームを単離するために、２つの異なるプロトコルを最適化した。各プロトコルの重要なステップは、３０ｍＭ ＥＤＴＡを使用した、３７℃で１時間の二価陽イオンキレート化によるカゼインミセル構造の化学的可溶化のタイミングであった。第１のプロトコルは、超遠心分離（ＵＣ）ベースの方法と呼ばれる（図１）。第２の組み込まれたタンジェンシャルフローフィルトレーション（ＴＦＦ）は、以後ＴＦＦベースの方法と呼ばれる（図２）。ＵＣベースの方法では、最終セファロースカラム（ＳＥＣ）濾過ステップの前に一次キレート化ステップを配置することによって、高レベルのエクソソーム収率及び純度を達成した（図３Ａ～３Ｅ）。図３Ａのヒストグラムは、ＳＥＣ濾過中に収集された連続画分を示し、ｙ軸はナノドロップによって測定されたタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を示す。ウェスタンブロッティングでは、ピークのエクソソームＳＥＣ画分、すなわち画分８．５及び９．０にはカルネキシン（細胞膜マーカー）、Ａｒｆ６（微小胞マーカー）、及びカゼインに対応するバンドが存在しないことに関連して、エクソソームマーカーＣＤ８１、ＣＤ９、及びシンテニンのシグナルが示された（図３Ｂ）。エクソソームタンパク質マーカーは、後のＳＥＣ画分１５～１８には存在していない（例えば、図３Ｂ）。図３Ｃのナノ粒子追跡分析（ＮＴＡ）グラフは画分８．５から測定され、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって示されるように、エクソソームが最も豊富であった（図３Ｄ）。ＮＴＡ分析では、１ｍＬあたり約１×１０^１３粒子の濃度でエクソソーム（モード約１３３ｎｍ）と一致する粒子サイズが示された。図３ＤのＴＥＭ画像は、ピークＳＥＣ画分における高密度に詰まったエクソソームのネガティブ染色を示している。図３Ｅは、画分１７のカゼインのマクロ構造を示しており、これらの画分に見られる典型的なカゼインミセルが、高倍率で挿入図に示されている。まとめると、ＴＥＭ、ＮＴＡ、及びウェスタンブロッティングにより、ピークＳＥＣ画分８．０～９．０に非常に高密度で純粋かつ超微細構造的に決定的なエクソソームが存在することが確認され、カゼイン及びカゼインミセル凝集体に対応する低レベルのタンパク質シグナル及び粒子状物質であり、これは後のＳＥＣ画分で見られる。注目すべき点は、ＵＣベースのプロトコルの開始時の典型的な開始量１０００ｍＬの乳から、これらの最終的な超高密度エクソソーム濃縮物は平均７５ｍＬ（＋／－１０ｍＬ）、すなわち乳の開始量の７．５％を構成する（図６）。

【0148】

ＵＣ中に加えられるせん断力は、エクソソームの構造に悪影響を与え得ると考えられている（ＭｏｇｉＫ，２０１８）（Ｌａｓｓｅｒ Ｃ，２０１２）。我々の観察は、ＵＣが乳からのエクソソームの収量と純度に影響を与える可能性があることも示唆している。７０，０００ＲＣＦ及び１００，０００ＲＣＦスピンからのペレットの組成物を、ＵＣベースの方法の１３０，０００ＲＣＦスピン後にＴＦＦ濃縮された上清とともに、それぞれ図７Ａ～７Ｂ及び８に示す。これらのサンプルのＳＥＣ濾過とそれに続くＴＥＭは、これらのサンプルすべてに多数のエクソソームが存在することを示している。これらのペレット及び上清は廃棄されるため、最適化されたＵＣベースの方法では、これらの画分に存在する多数の細胞外小胞が失われる。さらに、ＳＥＣから生じるピーク画分中の汚染カゼインのレベルが最適化された方法と比べて高かったため、これらの低速スピンをスキップして１３０，０００ｒｃｆスピンに直接移動することはできない（データは示さず）。

【0149】

最適化されたＴＦＦベースの単離プロトコル
ＵＣベースの方法における図７Ａ～７Ｂ及び８に示されるエクソソームの損失により、代替アプローチとしてＴＦＦを検討することにした。我々の研究から開発されたＴＦＦベースのエクソソーム単離のための最適化されたプロトコルを図２に要約する。ＴＦＦ後の連続ＳＥＣ画分のタンパク質濃度から得られたヒストグラムを図４Ａに示しており、タンパク質濃度がｍｇ／ｍＬでＹ軸に示されている。ＴＦＦベースのプロトコルの結果は多くの点でＵＣベースの方法と類似していたが、カゼイン可溶化ステップはＴＦＦ濾過の前に最適に配置され、最終収率がＵＣベースの方法より約１００％多かったことがわかった。ピークエクソソームＳＥＣ画分のウェスタンブロッティングは、微小胞マーカーカルネキシン及びＡｒｆ６の不在とともに、エクソソームマーカーＣＤ８１、ＣＤ９及びシンテニンの存在、及び後のＳＥＣ画分、例えば、画分１７と比較してカゼインの大幅な減少を示した（図４Ｂ）。示されるＮＴＡ分析は、ピーク画分８．５からのものであり、最終溶液１ｍＬあたり１×１０１３個を超える粒子の濃度での１００ｎｍのモードを示す（図４Ｃ）。ヒストグラムの下のＴＥＭ画像（図４Ｄ）は、ピークＳＥＣ画分（８．５及び９．０）における高濃度で純粋なエクソソーム溶液を示しているが、その後のＳＥＣ画分のＴＥＭは、高レベルのカゼインミセル凝集体を示した（図４Ｅ）。ＴＦＦベースのプロトコルでは、乳１０００ｍｌあたり、ピーク画分で平均２００ｍｌ（＋／－１０ｍＬ）のエクソソーム濃縮物、すなわち、乳の開始量の２０％が提供された。

【0150】

図５は、ＴＦＦベースの方法によって生成された、１：１０に希釈されたＨｅｐｅｓ緩衝液に懸濁されたピークＳＥＣ画分におけるカルセイン標識エクソソームの共焦点光学切片を示す。画像は、脱エステル化によって活性化されるまで非蛍光性の色素であるＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭでの１、２、３、及び４時間のインキュベーションから得られた取り込みを示している。斑状蛍光シグナルは、我々のエクソソーム濃縮物中の細胞外小胞がエステラーゼ活性を含み、脱エステル化されたカルセイン分子を保持できることを示唆している。カルセインシグナルのレベルは、インキュベーションが長くなるほど強くなり、色素の蓄積保持と単離されたエクソソームの構造的／機能的完全性を示唆している。カルセインの蛍光と保持の同様のパターンが、ＵＣベースのプロトコルを使用して単離されたエクソソームで観察された（データは示さず）。

【0151】

最適化されたプロトコルからの逸脱の影響
比較のため、図９Ａは、ＵＣベースの方法を使用して単離されたエクソソームの典型的なＴＥＭ陰性染色の外観を示し、この方法は最適化されたプロトコルで実施されるような、最終的なカゼイン可溶化及びＳＥＣ濾過ステップは行われない。エクソソームは超微細構造的に明らかであるが、最適化されたプロトコルよりも密度が大幅に低くなる。エクソソームにはカゼインミセルも豊富に含まれている。図９Ｂ～９Ｄは、我々の最適化されたプロトコルのＳＥＣ濾過（図９Ｂ）、二価カチオンキレート化（図９Ｃ）及び／または３７℃の温度（図９Ｄ）の側面が省略された場合の、エクソソーム密度及びカゼイン汚染に関する他の次善の結果の例を示す。二価カチオンキレート化または３７℃温度でのインキュベーションが実行されなかった場合、これらの同じＳＥＣ画分のカゼインに対応するカゼインミセル及び２０～２５ｋＤａのゲルバンドの超微細構造の存在によって証明されるように、ピークＳＥＣ画分におけるエクソソーム密度が減少し、カゼイン汚染が増加した。また、３０ｍＭ未満のＥＤＴＡ濃度、３７℃未満の温度、６０分より短いインキュベーション期間、及びＵＣベース及びＴＦＦベースの方法のそれぞれｐｒｅ－ＳＥＣまたはｐｒｅ－ＴＦＦ以外のプロトコルの様々な段階でのカゼイン可溶化ステップの実施でのカゼイン可溶化の影響も調査した。最適なプロトコルからのこれらすべてが逸脱することにより、図９Ａ～９Ｄに示されるものと同様に、より低いエクソソーム密度及び増加したカゼイン汚染レベルを示すピークＳＥＣ画分をもたらした（データは示さず）。３０ｍＭのＥＤＴＡ中で最大２時間のインキュベーションは、有害ではないものの、エクソソームの収率及び可溶化に関してそれ以上の利益をもたらさないように見え、その一方で、３０ｍＭを超えるＥＤＴＡ濃度では、エクソソームの超微細構造に水疱状の変形が生じた（図１０）。

【0152】

考察
ＥＶサブタイプの存在の違い、及びタンパク質性凝集体の汚染を含む、異なる単離プロトコルによって生成されるエクソソームの純度の変動は、この分野の進歩を妨げる問題である（Ｖａｓｗａｎｉ Ｋ．，２０１９）。汚染の問題は、乳からエクソソームを単離する場合に特に懸念され、カゼインミセル及びカゼインを含有する高次ポリマー構造が、エクソソーム画分の精製中に日常的に共沈殿する（ｙａｍａｕｃｈｉ Ｍ，２０１９）。この実施例は、少なくとも、エクソソーム分離株における夾雑タンパク質の負担を大幅に軽減するアプローチを実証する。このアプローチの中心となるのは、カゼインミセル構造の可溶化を促進する３７℃での二価カチオンキレート処理の戦略的展開である。この１時間の処理を、本明細書に記載されるＴＦＦベース及びＵＣベースのプロトコルの特定の時点で使用すると、カゼインを含む凝集体からのエクソソームの高効率な分離を達成することができる。３０ｍＭ未満の濃度のＥＤＴＡの使用及び３７℃未満の温度でのインキュベーションを含む、最適化されたプロトコルから逸脱すること、並びに図１～２に特定されるもの以外の方法の段階でキレート化ステップを展開することにより、分離されたエクソソームの純度は低く、乳タンパク質による汚染レベルは高くなる。

【0153】

この分野へのさらなる障害は、エクソソームを安価かつ効率的に大規模に生産する能力が現時点では限られていることである。通常、開始時に大量の生体液または組織（血漿、尿、脂肪組織など）、または培地を必要とし、それでも最終的なエクソソーム分離株の収率は控えめになる傾向にある（Ｌａｓｓｅｒ Ｃ，２０１２）。この方法により、費用対効果が高く簡単な一連のステップで、乳から大量の精製エクソソームを高密度で生成することができる。実際、エクソソームが体積で乳のかなりの部分を占める程度は、我々の研究の予想外の結果であった。乳には細胞外小胞がこの程度まで詰め込まれており、その多くには情報伝達またはシグナル伝達の可能性を持つｍｉＲＮＡやその他の分子が含まれていることが文献で報告されている（Ｇｏｌａｎ－Ｇｅｒｓｔｌ Ｒ．，２０１７）という事実は、発達上の指導的機能と哺乳類の看護の栄養的機能の興味深い新見解となった。

【0154】

ＴＦＦベースの方法及びＵＣベースの方法から得られる絶対収率の違いは注目に値する。ＴＦＦベースの方法から得られるピークＳＥＣ画分におけるエクソソームの超高密度の蓄積（例えば、図６）は、乳の開始体積の約２０％に相当する。ＵＣベースの方法は、開始体積の約７．５％と依然として優れたエクソソーム濃縮物をもたらす（図３Ａ～３Ｅ）。そうは言っても、我々のＥＭ分析は、ＵＣベースの方法の収率がより低いことは、図７～８に示すように、このプロトコルのより低い効率による可能性があることを示唆している。ＴＦＦベースの方法で得られる収量が大きいことを考慮すると、ＴＦＦベースの方法が好ましいアプローチであるように思われる。この優先度は、２つの方法で生成されたエクソソームの純度及び単位体積あたりの粒子密度が同等であることを示すウェスタンブロッティング及びＮＴＡの結果によって補強される。さらに考慮すべき点は、ＴＦＦ分離を組み込んだプロトコルは、複数のＵＣステップに依存するプロトコルよりも本質的に拡張性が高い可能性があり、最終的には工業規模での乳からのエクソソームの生産の基盤となる可能性があることである。

【0155】

これらの方法で生成された大量の純粋なエクソソームは、低分子薬剤やペプチド、高分子薬剤、ｍｉＲＮＡなどのカーゴをエクソソームにロードするための技術的アプローチの開発を含む、進行中の実験及び方法の実験のための十分な基礎となる。動物モデルにおける安全かつ効果的な薬物送達は、ドキソルビシン（Ｙａｎｇ Ｔ．，２０１５）、（Ｔｉａｎ Ｔ．，２０１４）、クルクミン（Ｚｈｕａｎｇ Ｘ．、２０１１）、及びパクリタキセル（Ａｇｒａｗａｌ ＡＫ、２０１７）、並びにｓｉＲＮＡ（Ａｌｖａｒｅｚ－Ｅｒｖｉｔｉ Ｌ．，２０１１）及びｍｉＲＮＡ（Ｗａｎｇ Ｆ．，２０１８）、（Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ．，２０１４）を含むエクソソームによってカーゴされた薬物について示されている。文献で報告されている外因性分子をエクソソームに搭載するための技術には、エレクトロポレーション、超音波処理、凍結融解、押出成形及び膜けん化（Ｍｏｍｅｎ－Ｈｅｒａｖｉ Ｆ．，２０１４）、（Ｈａｎｅｙ Ｍ．Ｊ．，２０１５）が挙げられる。ある程度効果的ではあるものの、このような技術の欠点はエクソソーム膜への損傷であり、薬物の保持力及び細胞への治療用カーゴの効果的な送達が低下させることである。我々の単離プロトコルの様々な反復によるエクソソーム画分のＥＭ分析の結果は、エクソソーム膜が機械的及び化学的破壊に敏感であり得ることを示唆している（例えば、図９Ａ～９Ｄ及び１０）。さらに、薬物搭載に対する新規かつ比較的穏やかなアプローチが、図５のカルセイン保持アッセイによって示唆されており、エクソソームへの外因性分子の取り込みと保持が、搭載された分子にエステル基を追加することによって強化される可能性がある。コネキシン４３（Ｃ×４３）カルボキシル末端に基づく短い治療用ペプチドのデータ（Ｊｉａｎｇ Ｊ．、２０１９）は、エステル化がエクソソーム薬物搭載の戦略となり得ることを示唆している。エクソソームの取り込みを促進するためにカーゴ化合物がエステル化される実施形態は、国際特許出願公開ＷＯ２０２０／０２８４３９の８１～８６ページに記載されている。

【0156】

エクソソームは、超音波標的化マイクロバブル破壊などのシステムと組み合わされている多くのグループによって薬物送達デバイスとして（Ｓｕｎ Ｗ、２０１９）、神経疾患の単純な薬物担体として（Ｙａｎｇ Ｔ．，２０１５）利用されてきたほか、直接送達のために細胞集団を特異的に標的とするためにデザイナー細胞により操作されている（Ｋｏｊｉｍａ Ｒ，２０１８）エクソソームをＤＤＤとして利用する最も有望な方法は、エクソソームカーゴの特異的送達のために目的のマーカーを特異的に上方制御するために、単離後にエクソソーム表面を操作することである（Ｓｉ Ｙ，２０２０）。他のグループは、単純に搭載されたカーゴでエクソソームを経口的に適用し、医薬品カーゴの送達に非常に効果的な単純な投与方法を示している（Ａｇｒａｗａｌ ＡＫ，２０１７）。ＤＤＤとしてのエクソソームは、以前のレビューで広範にレビューされている（Ｖａｄｅｒ Ｐ，２０１６）。本明細書に記載及び実証された方法は、工業的及び臨床的に適切な量のエクソソームの生産を促進することができる。

【0157】

追加の方法
エクソソームの単離－超遠心分離ベースの方法
図１は、最適化されたＵＣベースのプロトコルの手順をまとめたものである。４℃で殺菌されていない乳を、Ｈｏｍｅｓｔｅａｄ Ｃｒｅａｍｅｒｙ ｏｆ Ｗｉｒｔｚ，ＶＡから入手した。キレート化及び温度処理に至るまでのすべてのその後のステップは４℃で実行した。乳を滅菌大型ポリプロピレン遠心分離管（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７５００７５８５）に移し、５，０００ｒｃｆ（Ｓｏｒｖａｌ ＴＸ－４００ ７５００３６２９ローターを備えたＳｏｒｖａｌ Ｌｅｇｅｎｄ Ｘ１Ｒ遠心分離機）で３０分間遠心分離した。脂肪（クリーム）は、上清（ＳＮ）からデカントするか、濾紙で泡立てて取り除くことによって除去した。残ったＳＮを新しい容器に移し、ペレットを廃棄した。これらの手順を２～３回繰り返して、確実に脱脂させた。次いで、乳を２５０ｍＬの遠心分離容器（Ｎａｌｇｅｎｅ）に移し、１４，５００ｒｃｆ（ＪＬＡ１６．２５ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２６ＸＰ遠心分離機）で６０分間遠心分離した。次いで、ＳＮを２５０ｍＬのポリプロピレン（Ｂｅｃｋｍａｎｎ）に移し、２２，６００ｒｃｆ（ＪＬＡ１６．２５ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２６ＸＰ遠心分離機）で６０分間遠心分離した。各遠心分離の後、ＳＮをデカントし、ペレットを廃棄し、目に見える脂肪をすべて取り除いた。この遠心分離、脂肪除去及びＳＮデカントステップを２２，６００ｒｃｆで３～４回繰り返した。次いで、ＳＮを０．４５μｍ及び０．２２μｍフィルタ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して連続的に濾過し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ３５５６３１超遠心分離管に移し、５６，０００ｒｃｆ（ＪＡ２５．５ローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｖａｎｔｉ Ｊ－２６ＸＰ遠心分離機）で６０分間遠心分離した。これらの低速遠心分離の後、ペレットを廃棄し、ＳＮを新しい３５５６３１ Ｂｅｃｋｍａｎｎ管に移し、７０，０００ｒｃｆ（ＳＷ．３２．Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心機）で６０分間遠心分離した。次いで、ＳＮを新しいＢｅｃｋｍａｎｎ３５５６３１管に移し、１００，０００ｒｃｆ（ＳＷ．３２．Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心機）で６０分間遠心分離した。得られたＳＮをさらに１３０，０００ｒｃｆ（ＳＷ．３２．Ｔｉローターを備えたＢｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心機）で１２０分間遠心分離した。次いで、得られたペレットを２～３ｍｌのＨｅｐｅｓ緩衝液（１００ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ６．７）に４℃で一晩溶解した（ペレット１０体積％）。翌朝、溶液を粉砕し、５００μＬにアリコートした。これらのアリコートは、さらに使用するまで－８０℃で保存した。氷上で解凍した後、ＥＤＴＡをアリコートに３０ｍＭの濃度まで添加し、溶液を３７℃で６０分間インキュベートした。次に、溶液をＩＺＯＮ ｑＥＶオリジナル７０ｎｍセファロースカラム（１００６８８１）に通した。得られた画分のタンパク質濃度を、標準的な方法及びブランク対照溶液としてＨｅｐｅｓ緩衝液を使用し、２６０／２８０分光光度法によりＮａｎｏｄｒｏｐ２０００ソフトウェアを実行するＮａｎｏｄｒｏｐ２０００ｃを使用して分析した。タンパク質の定量後、サンプルをアリコートし、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0158】

エクソソームの単離－タンジェンシャルフローフィルトレーションベースのプロトコル
図２は、最適化されたＴＦＦベースのプロトコルの手順をまとめたものである。４℃の殺菌されていない乳をＨｏｍｅｓｔｅａｄ Ｃｒｅａｍｅｒｙ ｏｆ Ｗｉｒｔｚ，ＶＡから入手し、滅菌大型ポリプロピレン遠心管（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、７５００７５８５）に移し、ミリポア０．４５ｕｍ及び０．２２ｕｍフィルタにより得られたＳＮの濾過まで、上記のＵＣベースの方法と同様に、同一の低速遠心分離及び脂肪スキミングステップで処理した。次いで、得られた溶液を３０ｍＭ ＥＤＴＡで３７℃で６０分間処理した。処理後、５００ｋＤａ ＭｉｄｉＫｒｏｓ ＴＦＦフィルタ（Ｒｅｐｌｉｇｅｎ）上のＲｅｐｌｉｇｅｎ ＫｒｏｓＦｌｏ ＴＦＦシステムを１０ｍＬ／分で使用して溶液を濾過した。溶液が開始体積の約１０％に達したら、ＵＣベースの方法の場合と同様に、溶液を約１０倍体積の標準Ｈｅｐｅｓ緩衝液組成物でさらにダイアフィルトレーションした。次に、このＴＦＦ保持液が開始体積の約２０％に達したら、カラム分離前に溶液を－８０℃で保存した。他の実施例では、ＴＦＦ保持液が開始体積の約２０％に達した後、溶液をＢｅｃｋｍａｎｎ３５５６３１管に移し、Ｂｅｃｋｍａｎｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｏｐｔｉｍａ Ｌ－１００ＸＰ超遠心分離機においてＳＷ．３２．Ｔｉローターを使用して４℃で１３０，０００ｒｃｆで１２０分間超遠心分離した。得られたペレットを出発体積の約１０％（約２．５ｍＬ）の緩衝液に再懸濁し、この溶液に４℃で一晩溶解させた。翌朝、溶液を粉砕し、５００μＬ体積にアリコートした。－８０℃での保存または保持液の超遠心分離の後、ＩＺＯＮ ｑＥＶオリジナル７０ｎｍセファロースカラム（１００６８８１）で溶液を分離し、得られた画分を上記のＵＣベースの方法で説明したようにＮａｎｏｄｒｏｐ及び分光光度法で分析した。タンパク質の定量後、サンプルを画分でアリコートし、さらに使用するまで－８０℃で保存した。

【0159】

ゲル電気泳動及びウェスタンブロッティング
電気泳動用のサンプルを調製するために、サンプルを、０．０５％ベータ－メルカプトエタノール（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するＬａｍｅｌｌｉのサンプルバッファー（ＢｉｏＲａｄ）と混合した。次にサンプルを５分間煮沸し、６．２５ｍｇのタンパク質を４％～２０％Ｂｉｏｒａｄ無染色ゲル（ＢｉｏＲａｄ－５６７８０９３）の各レーンにロードした。電気泳動は、Ｂｉｏｒａｄモジュール（ＣＲＩＴＥＲＩＯＮ Ｃｅｌｌ １３５ＢＲ００３０８７６）で標準泳動用緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ）中で２００Ｖで４０分間実施した。次に、Ｂｉｏ－Ｒａｄイメージャー（ＢｉｏＲａｄ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｈｏｏｄ ＩＩＩ７３１ＢＲ００６２２）で、５分間の活性化イメージングを使用して、ステインフリーゲルをイメージングした。ゲルからのタンパク質の転写は、Ｂｉｏ－Ｒａｄトランスブロットターボを使用し、標準転写緩衝液（２５ｍＭトリス、１９２ｍＭグリシン、０．０１％ＳＤＳ）中で２５Ｖ、１．０Ａで３０分間、ＰＶＤＦ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ ＩＰＦＬ０００１０）膜上に実行した。続いて、膜を室温（ＲＴ）で１時間乾燥させ、タンパク質を固定させた。次に、ＰＶＤＦ転写膜をメタノールで再水和し、蒸留水で洗浄し、ＴＢＳＴ（２０ｍＭＴｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、０．１％Ｔｗｅｅｎ－２０、ｐＨ７．６）中の３％魚皮ゼラチン抽出物（ＦＳＥ）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）で、室温で１時間ブロックした。一次抗体の一晩インキュベーションは製造業者の指示に従って実施し、ＴＢＳＴ中の３％ＦＳＥで希釈し、４℃で一晩放置した。使用した抗体：ＣＤ８１（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、５６０３９Ｓ）、ＴＳＧ－１０１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＭＡ１－２３２９６）、ＣＤ９（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢ５００－４９４）、Ｃａｌｎｅｘｉｎ（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＡＢ２３０１）、カゼイン（Ａｂｃａｍ、ａｂ１６６５９６）、ＡＲＦ６（Ｎｏｖｕｓ、ＮＢＰ１－５８３１０）、Ｓｙｎｔｅｎｉｎ－１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＳＣ－１００３３６）、関連する二次抗体：抗マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏ、７１５－０３５－１５０）及び抗ウサギ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、４０５０－０５）。次いで、膜をオービタルシェーカー（ＶＷＲモデル１００ １０Ｍ０２１９Ｇ）上で室温で５分間、ＴＢＳＴ中で５回洗浄して、結合していない抗体を除去した。洗浄後、膜を、１：１ＴＢＳＴ：３％ＦＳＥで１：２０，０００に希釈した二次抗体中で室温で１時間インキュベートし、次いでシェーカー上で５分間、ＴＢＳＴで５回洗浄した。次に、ブロット膜をＴｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｉｃｏ活性化緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって５分間活性化し、化学検出設定の下でＢｉｏｒａｄイメージャーで画像化した。バンドは、ＩｍａｇｅＬａｂバージョン６．１（ＢｉｏＲａｄ）の濃度測定分析を使用して定量化した。

【0160】

Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＮＴＡ）分析を、ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００で実行した。ＳＥＣ後に得られたエクソソーム濃縮物をＨｅｐｅｓ緩衝液で１：１０に希釈し、Ｂｒａｎｓｏｎ２５１０バスソニケーターで室温で１分間バス超音波処理してサンプルの凝集を減少させた。次に、エクソソームを希釈し（サンプルに応じて１：１０００～１：１０，０００）、１ｍＬシリンジに加え、シリンジポンプにセットしてＮＴＡフローセルにロードした。各サンプルを、ＮＴＡソフトウェア（バージョン３．４）で１０に設定した一定の流量で、４０５ｎｍレーザーを使用して３回連続した１分間のビデオ録画で分析した。流量はソフトウェアで設定され、単位を含まない。すべてのビデオをＮＴＡソフトウェアでまとめて分析し、データは生の形式で収集及び保存した。

【0161】

共焦点顕微鏡分析
ＳＥＣエクソソーム濃縮物をＨｅｐｅｓ緩衝液で１：１０に希釈し、１０μＭのＣａｌｃｅｉｎ－ＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃ１４３０）とともに１、２、３または４時間間隔で３７℃でインキュベートした。インキュベートした後、小胞外色素をセファロースＧ５０カラム（ＵＳＡ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ １４１５－１６０１）で除去し、Ｈｅｐｅｓ緩衝液で予め平衡化した。次いで、この溶液６μＬを顕微鏡スライド（Ｐｒｅｍｉｅｒｅ７５×２５×１ｍｍ、９１０５）上に分注し、カバースリップをかけた（Ｆｉｓｈｅｒｂｒａｎｄ、１２５４１Ａ）。カルセイン強度と色素保持率は、この溶液に懸濁した粒子で、４８８レーザー、ＨｙＤ、１ＡＵ、スライドあたり６フィールドの走査周波数７００Ｈｚを備えたＬｅｉｃａ ＳＰ８共焦点顕微鏡で６３倍の対物レンズ（オイル、１．４ＮＡ）を使用した光学切片によって直接監視した。

【0162】

透過型電子顕微鏡－ネガティブ染色
ホルムバールでコーティングされた２００メッシュの銅グリッド（電子顕微鏡サイエンス、ＦＣＦ２００－ＣＵ）を、Ｐｅｌｃｏグロー放電ユニット（Ｐｅｌｃｏ）で０．２９ｍＢＡＲで１分間グロー放電させた。０．１％ポリ－Ｌ－リジンをグリッドに１分間適用し、その後過剰な溶液をワットマン＃１濾紙で取り除いた。グリッドを１０μＬのｍｉｌｌｉ－Ｑ水で２回洗浄し、過剰な液体を濾紙で除去した。次いで、グリッドを室温で一晩乾燥させた。調製したＳＥＣエクソソーム濃縮物１０μＬをグリッドに５分間適用することにより、サンプルをロードした。過剰な溶液を濾紙で吸い取り、サンプルを１０μＬのウランレス染色液（電子顕微鏡サイエンス、２２４０９）で室温で１分間ネガティブ染色した。その後、余分な染色を吸い取った。次いで、グリッドを室温で一晩乾燥させた後、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）で画像化した。ネガティブに染色された調製物のイメージングを、ＦＥＩ Ｔｅｃｎａｉ Ｇ２０ Ｂｉｏｔｗｉｎ ＴＥＭで１２０ｋＶで実行し、画像はＥａｇｌｅ ４Ｋ ＨＳカメラを使用してキャプチャした。

【0163】

実施例１の参考文献
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【0201】

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【0202】

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【0203】

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【0204】

Ｗｏｌｆ Ｔ，Ｂ．Ｓ．（２０１５）．Ｔｈｅ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｏｆ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｉｓ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｙ ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａ Ｃａｃｏ－２ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｒａｔ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ ＩＥＣ－６ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ，２２０１－２２０６．

【0205】

Ｙａｍａｕｃｈｉ Ｍ，Ｓ．Ｋ．（２０１９）．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｏｓｏｍｅｓ ｆｒｏｍ ｒａｗ ｂｏｖｉｎｅ ｍｉｌｋ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｖ Ｉｎｄ Ｐｈａｒｍ，３５９－３６４．

【0206】

Ｙａｎｇ Ｔ，Ｍ．Ｐ．（２０１５）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ－ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００３－２０１４．

【0207】

Ｙａｎｇ Ｔ．，Ｍ．Ｐ．（２０１５）．Ｅｘｏｓｏｍｅ ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ ｄｒｕｇｓ ａｃｒｏｓｓ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ ｂｒａｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ Ｄａｎｉｏ Ｒｅｒｉｏ．Ｐｈａｒｍ Ｒｅｓ，２００３－２０１４．

【0208】

Ｚｅｍｐｌｅｎｉ Ｊ，Ａ．－Ｌ．Ａ．（２０１７）．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｖｅｓｉｃｌｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃａｒｇｏｓ ｆｒｏｍ ｂｏｖｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ｍｉｌｋ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ ａｎｄ ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｉｎｆａｎｔｓ．Ｊ Ｎｕｔｒ，３－１０．

【0209】

Ｚｈｕａｎｇ Ｘ．，Ｘ．Ｘ．（２０１１） Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｆ ｂｒａｉｎ ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｂｙ ｄｅｌｉｖｅｒｉｎｇ ｅｘｏｓｏｍｅ ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ ｄｒｕｇｓ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｎａｓａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｅｒ．，１７６９－１７７９．

【0210】

実施例２－ヒト母乳からのエクソソームの単離
この実施例は少なくとも、本明細書の他の場所に記載される超遠心分離法を使用したヒト母乳からの乳エクソソームの単離を実証する（例えば、図１を参照）。乳を収集した後、エクソソームを単離する前に、乳サンプルを－８０℃で６か月間保存した。ヒト乳エクソソームは、ＵＣベースの単離方法を使用して単離した。例えば、図１１及び関連する議論は本明細書の他の場所で参照されたい。図１１Ａ～１１Ｄは、超遠心分離法の一実施形態によるヒト母乳からのエクソソームの単離の結果を示す。図１１Ａは、各画分におけるエクソソームまたはタンパク質の濃度（ｘ軸）をｍｇ／ｍＬ（ｙ軸）で示すグラフを示す。図１１Ｂは、エクソソーム分離株のＮａｎｏｓｉｇｈｔ Ｔｒａｃｋｅｒ分析データを示す。図１１Ｃ～１１Ｄは、単離されたエクソソームの高倍率ＴＥＭ画像（図１１Ｃ）及び様々なエクソソーム画分の代表的なＴＥＭ画像（図１１Ｄ）を示す。

【0211】

実施例３ 分離された乳エクソソームに対するＳＥＣ前及びＳＥＣ後の保存の影響
この実施例は、乳エクソソームに対するＳＥＣ前保存及びＳＥＣ後保存の影響を評価する。２つの別個の分析、つまり、ＳＥＣ前の保存とＳＥＣ前の保存を使用した。理論に束縛されるものではないが、ゲル分離前のエクソソームはより安定していると考えられているため、ＳＥＣ前の保存は重要である。図１２に示される結果については、サンプルは、ＴＦＦ後、ＳＥＣ前に、－８０℃で最長３ヶ月保存した。次いで、ＳＥＣを実行し、サンプルを、図１２の各代表的なＴＥＭ画像の下に示される期間、４℃で保存した。図１３Ａ～１３Ｂに示される結果については、サンプルは、－８０℃でまったく保存されていなかったか（図１３Ａ）、またはＴＦＦ後に－８０℃で保存したが、ＳＥＣ処理前にＳＥＣ前に６ヶ月間保存した（図１３Ｂ）新鮮なサンプルであった。６か月サンプルのＴＥＭは、ＳＥＣ処理前の長期保存が可能であることを少なくとも示している。スクロース、ラクトース、またはトレハロースを含む凍結保護剤の使用も、我々の単離されたエクソソームを－８０℃で保存するために使用できることが企図される。
＊＊＊

【0212】

記載される本発明の方法、医薬組成物及びキットの種々の修正及び変形は、本発明の範囲及び主旨から逸脱することなく当業者には明白である。本発明を特定の実施形態に関連して記載してきたが、特許請求の範囲に記載されるような本発明は、さらなる修正が可能であり、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、当業者に明らかである本発明を実施するための記載の手法の様々な修正は、本発明の範囲内であると意図される。本出願は、一般に本発明の原理に従う、本発明の任意の変形例、用途、または適合を対象とすることを目的としており、本開示からのそのような逸脱を含むことは、本発明が関連する既知または慣例的実践の範囲内であり、以上で記載される不可欠な特徴に適用され得ることを理解されるであろう。

【0213】

本発明のさらなる属性、特徴、及び実施形態は、開示される発明の以下の番号付けされた態様を参照することによって理解され得る。前述の態様のいずれかにおける開示への参照は、実施可能な先行態様の任意の組み合わせにおける適切な先行開示によって認識されるように、任意の先行番号付き態様及び任意の数の先行態様の任意の組み合わせに適用可能である。次の番号付きの態様が提供される。
１．生体液からエクソソームを単離する方法であって、
ａ．生体液の１つまたは複数の他の成分から脂肪を分離するのに適した条件下で前記生体液を遠心分離することと、
ｂ．前記分離された脂肪を前記生体液から除去することと、
ｃ．ステップ（ｂ）の後、残った生体液を１回または複数回遠心分離し、ステップ（ｃ）の各遠心分離後に任意の顕著に分離された脂肪をスキミングすることと、
ｄ．ステップ（ｃ）の後に前記残った生体液を濾過することと、
ｅ．任意選択的に（ｄ）の後に１回または複数回超遠心分離ステップを実行することと、
ｆ．約１０ｍＭ～約１００ｍＭのＥＤＴＡを用いて、摂氏約３０～４２度で、任意選択的に（ｄ）または任意選択的に（ｅ）の後、任意選択で約１５～１２０分間、二価カチオンをキレート化することと、
ｇ．（ｆ）の後、任意選択的にタンジェンシャルフローフィルトレーションを行って保持液を得ることであって、前記保持液は任意選択的に１回または複数回の超遠心分離ステップによって超遠心分離されるか、または－８０℃で保存され、前記保持液が任意選択的に超遠心分離されるか、または－８０℃で保存された後、任意選択的にカラム分離によって前記保持液の画分を分離することと、を含み、
前記方法は、ステップ（ｅ）またはステップ（ｇ）を含むが、両方は含まない、前記方法。
２．二価カチオンのキレート化が約３０ｍＭのＥＤＴＡで起こる、態様１に記載の方法。
３．二価カチオンのキレート化が摂氏約３７度で起こる、態様１または２の方法。
４．前記生体液が哺乳動物の乳である、態様１～３のいずれか１つに記載の方法。
５．前記生体液が低温殺菌されていない、態様１～４のいずれか１つに記載の方法。
６．ステップ（ａ）及び（ｂ）を合わせて１～５回繰り返す、態様１～５のいずれか１つに記載の方法。
７．ステップ（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｇ）、またはそれらの任意の組み合わせが、摂氏約４度で実行される、態様１～６のいずれか１つに記載の方法。
８．（ａ）が、前記生体液を約２，０００～３，０００ｒｃｆで遠心分離することを含む、態様１～７のいずれか１つに記載の方法。
９．（ａ）が、前記生体液を約２，５００ｒｃｆで遠心分離することを含む、態様１～８のいずれか１つに記載の方法。
１０．ステップ（ａ）が、１～３回繰り返される、態様１～９のいずれか１つに記載の方法。
１１．（ｂ）が、第１の遠心分離とそれに続く第２の遠心分離を含む、態様１～１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記第１の遠心分離が、前記残りの生体液を約１３，５００～１５，５００ｒｃｆで約４５～７５分間遠心分離することを含む、態様１１に記載の方法。
１３．前記第１の遠心分離が、前記残りの生体液を約１４，５００ｒｃｆで約６０分間遠心分離することを含む、態様１１または１２に記載の方法。
１４．前記第２の遠心分離が、前記第１の遠心分離後に残った前記生体液に対して行われ、前記第２の遠心分離が、約２４，８００～２６，８００ｒｃｆで約４５～７５分間行われる、態様１１～１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記第２の遠心分離が、前記第１の遠心分離後に残った前記生体液に対して行われ、前記第２の遠心分離が、約２５，８００ｒｃｆで約６０分間行われる、態様１４に記載の方法。
１６．前記第２の遠心分離が１～３回繰り返され、各繰り返しは直前の前記遠心分離からの前記残りの生体液に対して行われる、態様１１～１５に記載の方法。
１７．（ｄ）が、約０．４５ミクロンフィルタ～約０．２２ミクロンフィルタの範囲の直列した１つまたは複数のフィルタを通して前記残りの生体液を濾過することを含む、態様１～１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．（ｄ）が、約０．４５ミクロンフィルタを通して前記残りの生体液を濾過し、続いて約０．２２ミクロンフィルタを通して前記残りの生体液を濾過することを含む、態様１７に記載の方法。
１９．（ｅ）が、２つ以上の連続する超遠心分離ステップを含み、各ステップは前の超遠心分離からの前記残りの生体液に対して実行される、態様１～１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．（ｅ）が、約４５，０００～５５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約６５，０００～７５，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約９０，０００～１１０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む、態様１９に記載の方法。
２１．（ｅ）が、約５０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約７０，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、約１００，０００ｒｃｆで行われる超遠心分離ステップ、またはそれらの組み合わせを含む、態様１９または２０に記載の方法。
２２．前記１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数が、それぞれ約４５～７５分間実施される、態様１９～２１のいずれか１つに記載の方法。
２３．前記１つまたは複数の超遠心分離ステップのうちの１つまたは複数が、それぞれ約６０分間実施される、態様１９～２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．（ｅ）が、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される、態様１９～２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．（ｅ）が、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間実施される最終超遠心ステップを含み、得られた流体は廃棄され、残りのペレットは、（ｆ）の前に好適な溶液の好適な量に再懸濁される、態様１～２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、約２５０ｋＤａ～約７５０ｋＤａの範囲のカットオフを有する限外濾過膜を使用して行われる、態様１～２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、約２５０ｋＤａの限外濾過膜を使用して行われる、態様１～２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、毎分約５～１５ｍＬの流量で行われる、態様１～２７のいずれか１つに記載の方法。
２９．（ｇ）の前記タンジェンシャルフローフィルトレーションが、毎分約１０ｍＬの流量で行われる、態様１～２８のいずれか１つに記載の方法。
３０．ステップ（ｇ）において、前記残りの生体液の量がタンジェンシャルフローフィルトレーション前のその開始体積の約１０パーセントに達すると、前記保持液が好適な緩衝液でダイアフィルトレーションされる、態様１～２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記保持液が開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した場合、前記保持液を超遠心分離することをさらに含む、態様３０に記載の方法。
３２．前記超遠心分離が、摂氏約４度で、約１１５，０００～１４５，０００ｒｃｆで約９０～１５０分間行われる、態様３１に記載の方法。
３３．前記超遠心分離が、摂氏約４度で、約１３０，０００ｒｃｆで約１２０分間行われる、態様３１または３２に記載の方法。
３４．前記保持液が、開始ダイアフィルトレーション量の約２０パーセントに達した後、かつカラム分離前に、前記保持液が－８０℃で保存される、態様３０に記載の方法。
３５．前記方法が、乳の開始量の少なくとも７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、または少なくとも２０パーセントであるエクソソーム濃縮物を生成する、態様１～３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．前記方法が、先行請求項のいずれか一項に記載の方法から得られる製剤のエクソソームに、１つまたは複数のカーゴを搭載することをさらに含む、態様１～３５のいずれか１つに記載の方法。
３７．エクソソームを含む製剤であって、態様１～３６のいずれか１つに記載の方法によって少なくとも部分的に製造される、前記製剤。
３８．１つまたは複数の前記エクソソームに１つまたは複数のカーゴが搭載される、態様３７に記載の製剤。
３９．態様３８に記載される製剤を、それを必要とする対象に投与することを含む、方法。
４０．前記１つまたは複数のカーゴが治療用カーゴである、態様３９に記載の方法。

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図12】

【図13A】

【図13B】

【国際調査報告】