特表 2024-507907 リパーゼ固定用のポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】リパーゼ固定用のポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子

(51)【国際特許分類】

   C12N 9/20 20060101AFI20240214BHJP

   C12P 7/6454 20220101ALI20240214BHJP

   C12P 7/64 20220101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12N9/20 ZNA

C12P7/6454

C12P7/64

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023551209

(86)(22)【出願日】2022-02-28

(85)【翻訳文提出日】2023-08-23

(86)【国際出願番号】 EP2022055000

(87)【国際公開番号】W WO2022180273

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】21159635.8

(32)【優先日】2021-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】500586299

【氏名又は名称】ノボザイムス アクティーゼルスカブ

(74)【代理人】

【識別番号】100099759

【弁理士】

【氏名又は名称】青木 篤

(74)【代理人】

【識別番号】100123582

【弁理士】

【氏名又は名称】三橋 真二

(74)【代理人】

【識別番号】100117019

【弁理士】

【氏名又は名称】渡辺 陽一

(74)【代理人】

【識別番号】100141977

【弁理士】

【氏名又は名称】中島 勝

(74)【代理人】

【識別番号】100138210

【弁理士】

【氏名又は名称】池田 達則

(74)【代理人】

【識別番号】100203828

【弁理士】

【氏名又は名称】喜多村 久美

(72)【発明者】

【氏名】パウリ アンドリク

【テーマコード（参考）】

4B064

【Ｆターム（参考）】

4B064AD85

4B064CA05

4B064CA21

4B064CB03

4B064CD04

4B064DA16

(57)【要約】

本発明は、固定化１，３特異的リパーゼ、並びにスチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを含む酵素粒子を提供する。粒子は、トリグリセリドの酵素によるエステル交換、並びに以降の、濾過による酵素及びトリグリセリドの分離に適している。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）５０～９９ｗ／ｗ％の、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマー；並びに
（ｂ）１～２０ｗ／ｗ％の、酵素クラスＥＣ３．１．１．３由来の１，３特異的リパーゼの活性酵素タンパク質
を含む酵素粒子であって、
前記１，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、酵素粒子。

【請求項2】

スチレン及びジビニルベンゼンの前記コポリマーを８０～９９ｗ／ｗ％の量で含む、請求項１に記載の酵素粒子。

【請求項3】

スチレン及びジビニルベンゼンの前記コポリマーは、スチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを１００：１～２：１の比率、好ましくは５０：１～３：１の比率で含む、請求項１又は２に記載の酵素粒子。

【請求項4】

前記１，３特異的リパーゼを１～１５ｗ／ｗ％の活性酵素タンパク質の量で含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項5】

表面積が５～１０００ｍ^２／ｇ；好ましくは表面積が１０～７５０ｍ^２／ｇである、請求項１～４のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項6】

平均細孔サイズが０．０５～０．１μｍ；好ましくは平均細孔サイズが０．１～０．５μｍである、請求項１～５のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項7】

細孔容積が、粒子グラムあたり少なくとも０．５グラムの油、特に粒子グラムあたり少なくとも１グラムの油の油吸収に相当する、請求項１～６のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項8】

平均直径が２００～１２００μｍ；好ましくは平均直径が３００～９００μｍである、請求項１～７のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項9】

前記１，３特異的リパーゼは、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属リパーゼ、好ましくはリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼである、請求項１～８のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項10】

前記１，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性、好ましくは配列番号１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、請求項１～９のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項11】

前記１，３特異的リパーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１～１０のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項12】

スチレン及びジビニルベンゼンの前記コポリマーは、９０％超のスチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを含み；好ましくはスチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットからなる、請求項１～１１のいずれか一項に記載の酵素粒子。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素粒子、及び少なくとも１０％の油又は脂肪を含む粉末又はスラリー／懸濁液。

【請求項14】

酵素によるエステル交換方法であって、トリグリセリド及び遊離脂肪酸又は遊離脂肪酸エステルの混合物を、請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素粒子と接触させることを含む方法。

【請求項15】

エステル化反応における請求項１～１２のいずれか一項に記載の酵素粒子の使用であって、対称型トリグリセリドの生成のために、カルボン酸及びアルコールを前記酵素粒子と接触させることを含み；好ましくは、前記反応はカラム内で実行される、使用。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

配列表の参照
本出願は、参照により本明細書に組み込まれるコンピュータ可読形式の配列表を含む。

【0002】

本発明は、位置的に１，３部位特異的なリパーゼの固定用のポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子に関する。結果として生じるリパーゼ粒子は、酵素によるエステル化／エステル交換において対称型トリグリセリドを調製するのに有用である。

【背景技術】

【0003】

脂肪分解酵素の固定が、長年にわたって知られている。固定化酵素生成物は、有機化合物の酵素による修飾に、例えば有機合成プロセス、植物油エステル交換、バイオディーゼル製造その他に用いられ得る。

【0004】

酵素固定は、酵素が固定されて、そのうえ官能性である担体上への酵素タンパク質の付加であり、酵素は、酵素が接触する液体中に放出（ウォッシュアウト）されない。最も共通して固定される酵素は、異性化反応に用いられるグルコースイソメラーゼ、並びに、例えば、植物油及び有機合成のエステル交換に用いられるリパーゼである。

【0005】

非水性溶液で用いるために、リパーゼは、いくつかの様々な多孔性の無機担体上に、担体の細孔容積中へのリパーゼの水溶液の吸収によって、又は担体の表面への吸着によって、又は吸着及び吸収の双方の組合せによって（その後、乾燥による水除去が続く）、固定され得る。

【0006】

特開平５－２９２９６５号公報は、固定化リパーゼ及びこれを調製する方法を開示している。

【0007】

国際公開第９５／２２６０６号パンフレットは、顆粒形成プロセスに基づく固定プロセスを記載している。

【0008】

国際公開第９９／３３９６４号パンフレットは、酵素が微粒子多孔性担体にアプライされる固定プロセスを記載している。

【0009】

固定化酵素が、廃水処理、医薬の生成、高フルクトースコーンシロップ生産、植物油プロセシング、及び化学物質の合成が挙げられる、種々の産業用途内で連続酵素反応及びバッチ酵素反応の双方に用いられることが知られている。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0010】

第１の態様において、本発明は、（複数の）酵素粒子であって、
（ａ）５０～９９ｗ／ｗ％の、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマー；並びに
（ｂ）１～２０ｗ／ｗ％の、１，３部位特異的リパーゼの活性酵素タンパク質
を含み、
１，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、酵素粒子を提供する。

【0011】

本発明の別の態様において、提供されるのは、酵素によるエステル化及びエステル交換方法であって、遊離脂肪酸／アルコール又はトリグリセリドの混合物を、本発明の酵素粒子と接触させることを含む方法である。

【0012】

本発明の他の態様及び実施形態は、説明及び実施例から明らかにされる。

【0013】

特に明記しない限り、又は文脈から他の何かを意味することが明らかであるならば、全てのパーセンテージは重量パーセンテージ（ｗ／ｗ％）である。

【発明を実施するための形態】

【0014】

発明者らは、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーが、１，３－特異的リパーゼ（例えばリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ）の固定用の有益なポリマー担持体を提供することを見出した。固定化１，３－特異的リパーゼのパフォーマンスは、驚くべきことに、対称型トリグリセリドの生成に良好である。

【0015】

ポリメタクリラートベースの粒子が、吸着によるリパーゼの固定に広く用いられている。なぜなら、リパーゼに対する当該材料の高親和性のためである。同様に、ポリスチレンは、リパーゼのこの種の固定に特に適した材料とみなされない。なぜなら、リパーゼの親和性がより低いため、吸着がより低いためである。これは不運である。なぜなら、比較的高価なメタクリル吸着剤とは対照的に、ポリスチレンは比較的より安価な材料であるためである。

【0016】

発明者らは、本明細書中で、１，３－特異的リパーゼの固定用の、低コストのポリスチレンベースのポリマー担持体を用いることを提示する。当該材料は、粒子中への酵素侵入を可能にし、そして同じタイプにて、以降の酵素反応にとって良好な物質移動状態、及び材料の高い疎水性に起因する有利な水遊離状態を提供する、より大きな孔を有する。利点は、特に、ステアリン－オレイン－ステアリン、及びオレイン－パルミチン－オレインから誘導されるトリグリセリドのような対称型トリグリセリドの生成中に見られる。

【0017】

脂肪／油のリパーゼ触媒エステル交換の使用は、十分に確立されている。反応は、３００～１２００μｍの典型的な粒子サイズを有する固定化酵素で満たされた、１～５メートルの高さを有するカラム内で起こり、油は、一セットのカラムを通って、特定の変換を達成するのに必要とされる総保持時間、ポンプ輸送される。

【0018】

本発明のポリスチレンベースのポリマー担持体を用いる高度に所望される特性は、固定化リパーゼ粒子の機械的強度の向上である。リパーゼ粒子が、高いカラム内に充填される場合、カラムの底部の粒子は、先の粒子の蓄積重量に曝されることとなる。これは、底部での粒子の崩壊、及び結果として起こる、カラムを通る油フローの引下げに至る虞がある。ポリスチレンベースのポリマー担持体でできている粒子は、メタクリラートベースのポリマー担持体と比較して、特に強い。その疎水性性質に起因して、ポリスチレンベースのポリマー担持体はまた、メタクリラートベースのポリマー担持体のような親水性材料と比較して、膨張に対して高度に耐性化している。また、固定化リパーゼ粒子の膨張は、カラムを通る油フローの引下げを引き起こす。

【0019】

別段の指示がない限り、全てのパーセンテージが、本出願の全体を通じて、重量パーセント（ｗ／ｗ％）として示される。

【0020】

酵素粒子
本発明の粒子は、位置的に１，３部位特異的な固定化リパーゼ、並びにスチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを含むか、又はこれからなるポリマー材料からなる。粒子は、油又は脂肪内にカプセル化されて；例えば、油性の粉末又はスラリー／懸濁液を形成してもよい。

【0021】

粒子は好ましくは多孔性である。細孔容積は、粒子グラムあたり少なくとも０．５グラムの油、特に粒子グラムあたり少なくとも１グラムの油の油吸収に相当し得る。細孔容積は、５～１０００ｍ^２／ｇ、１０～１０００ｍ^２／ｇ、特に１０～７００ｍ^２／ｇ、より詳細には１０～５００ｍ^２／ｇの表面積を有し得る。

【0022】

粒子は、容積ベースの粒子サイズ（Ｄ_５０）が２００～１２００μｍ、好ましくは２００～１０００μｍ、より好ましくは３００～９００μｍであり得る。粒子サイズは、レーザー回折粒子サイズアナライザにより測定される。

【0023】

粒子は、６０ｗ／ｗ％超、好ましくは８０ｗ／ｗ％超の量でポリマー材料を含み得る。

【0024】

粉じん特性が低く、且つ／又は用いられることとなるプロセス（例えば、エステル交換プロセス）との適合性が向上した最終生成物を製造するために、結果として生じる粒子は、油と共にスプレーされ得、又は油性の粉末、若しくは粒子を油中にカプセル化するスラリー／懸濁液を得るために油と混ぜ合わされ得る。油は、植物由来の油、例えば、ヒマワリ油、又は粒子が用いられることとなるプロセスと適合する別の油であり得る。少量の油のみが用いられるならば、粒子は、粉じんの量を実質的に引き下げることができるより大きな粒子に凝集され得る。また、油カプセル化粒子はその後、乾燥させることができる。

【0025】

また、粒子は、脂肪と共にスプレーされるか、若しくは混ぜ合わされて、脂肪及び小さな粒子を含有する固体ブロックを生成することができるか、又は押出成形及びペレット化装置によりプロセシングされて、「ビヒクル」として加えられる脂肪をも含み得る大きなペレットを得ることができる。そのような粒子はその後、保存剤、例えば粉末化保存剤でコーティングされ得る。

【0026】

粉じんは、空気動力学径が５０μｍ未満の粒子と定義される。エーロゾル科学において、空気動力学径が５０μｍ超の粒子は、非常に長い間、一般的に空気伝搬性のままでないことが一般に認められている。この文脈において、空気動力学径は、「その幾何学的サイズ、形状、及び真密度に拘わらず、問題となっている粒子と、穏やかな空気中で終末沈降速度が同じ１ｇ／ｃｍ^３の仮定の球密度の直径」と定義される（ＷＨＯ、１９９７）。

【0027】

リパーゼ
本発明に従って固定されることとなるリパーゼは、Ｅｎｚｙｍｅ Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ番号ＥＣ３．１．１．３に従って分類される、位置的に１，３部位特異的なリパーゼ（ｓｎ－１，３－特異的リパーゼ）である（トリアシルグリセロールリパーゼ）。

【0028】

本発明に用いられる位置的に１，３部位特異的なリパーゼの例として、アミノ酸配列同一性が８０％を超える（１，３部位特異的リパーゼ活性を示す）リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ（国際公開第２０１５／１８１１１９号パンフレットも参照）、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼ、リゾプス・デレマリ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｄｅｌｅｍａｒｉ）リパーゼ、マルブランチア・シナモメア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）リパーゼ（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ａｐｐｌ Ｂｉｏｃｈｅｍ，６３（４），ｐｐ４７１－４７８（２０１６）も参照）、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼ、及びそれらの変異型が挙げられる。

【0029】

一実施形態において、リパーゼは、配列番号１に対するアミノ酸配列同一性が８０％超（又は９０％若しくは９５％超）であるリゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ又はその変異型である。好ましい実施形態において、リパーゼは、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼ、例えば配列番号１である。

【0030】

本発明の一実施形態において、酵素粒子は、１，３部位特異的リパーゼを、１～２０ｗ／ｗ％の活性酵素タンパク質の量で含む。別の実施形態において、酵素粒子は、１，３部位特異的リパーゼを、１～２０ｗ／ｗ％の活性酵素タンパク質の量で含む。特定の実施形態において、酵素粒子は、１，３部位特異的リパーゼを、１～１０ｗ／ｗ％の活性酵素タンパク質の量で含む。

【0031】

活性酵素タンパク質は、本明細書中で、リパーゼ活性を示すリパーゼタンパク質の量と定義される。これは、活性ベースの分析酵素アッセイを用いて求めることができる。そのようなアッセイでは、酵素は典型的に、着色した化合物を生成する反応を触媒する。着色した化合物の量は、測定することができて、活性酵素タンパク質の濃度に相関し得る。この技術は、当該技術において周知である。

【0032】

１，３部位特異的リパーゼは、位置２から位置１又は３への自然発生的なアシル移動を触媒する。

【0033】

本発明の目的のために、２つのアミノ酸配列間の配列同一性は、好ましくはバージョン６．６．０以降の、ＥＭＢＯＳＳパッケージ（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実装されている、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８；４４３－４５３）を用いて、「最長の同一性」の出力として求められる。用いたパラメータは、ギャップオープンペナルティが１０、ギャップエクステンションペナルティが０．５、そしてＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。Ｎｅｅｄｌｅプログラムが最長の同一性を報告するために、ｎｏｂｒｉｅｆオプションをコマンドラインに指定しなければならない。「最長の同一性」と標識されるＮｅｅｄｌｅの出力は、以下のように算出される：
（同一の残基×１００）／（アラインメントの長さ－アラインメント内のギャップの総数）

【0034】

ポリマー材料
本発明の粒子は、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを含み、これは、１，３部位特異的リパーゼの吸着用の疎水性表面を提供する。

【0035】

また、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、メタクリル酸メチル、メタクリル酸エチル、メタクリル酸ブチル、メタクリル酸オクタデシル、アクリル酸メチル、アクリル酸エチル、アクリル酸ブチル、及びアクリル酸オクタデシルのような、他のモノマーの残基を含んでもよい。

【0036】

一実施形態において、コポリマーは、９０ｗ／ｗ％超のスチレン及びジビニルベンゼンの残基（ユニット）を含む。好ましくは、コポリマーは、スチレン残基及びジビニルベンゼン残基からなる。

【0037】

一実施形態において、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、スチレン残基及びジビニルベンゼン残基を、１００：１～２：１の比率で；好ましくは５０：１～３：１の比率で；より好ましくは２０：１～３：１の比率で含む。

【0038】

コポリマーは、マクロ多孔性材料、例えば、マクロ多孔性ポリマーマトリックス又はマクロ多孔性ポリマービーズの形態で提供され得る。

【0039】

そのようなマクロ多孔性材料は、コポリマー含有量が少なくとも５０ｗ／ｗ％、好ましくは少なくとも８０ｗ／ｗ％、より好ましくは少なくとも９０ｗ／ｗ％であり得る。最も好ましくは、材料は、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーからなる。材料は、平均粒度が２００～１０００μｍ、例えば３００～９００μｍの範囲内であり得る。

【0040】

好ましい実施形態において、疎水性ポリマーは、平均粒度が２００～１０００μｍの範囲のスチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーからなるマクロ多孔性粒子として提供される。

【0041】

本発明の酵素粒子は、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを、５０～９９ｗ／ｗ％、好ましくは８０～９９ｗ／ｗ％の量で含み得る。

【0042】

粒子の使用
本発明に従う、固定化１，３部位特異的リパーゼを含む粒子は、広範な酵素使用プロセスにおける、例えば、医薬の製造、専門コモディティケミカル、及び植物油プロセシングにおける潜在的な用途を有する。

【0043】

本発明の文脈において調製される固定化酵素は、有機物質の加水分解、合成、又は修飾に用いられ得る。加水分解、合成、又は修飾は、好ましくは、遊離水が本質的にない媒体中で起こる。

【0044】

したがって、本発明は、有機化合物の酵素による修飾プロセスであって、反応媒体中で、前記有機化合物を、本発明に従う固定化酵素製品と接触させることを含むプロセスを包含する。

【0045】

本発明の固定化酵素は、有機化合物の酵素による修飾であって、反応媒体中で、前記有機化合物を、本発明のプロセスによって生成される固定化酵素と接触させることを含む酵素による修飾に用いられ得る。

【0046】

本発明の特定の実施形態において、修飾は、カルボン酸である第１の反応体及びアルコールである第２の反応体を、本発明の固定化リパーゼと接触させることを含むエステル化反応である。カルボン酸は、以下に限定されないが、脂肪酸、乳酸、安息香酸、アクリル酸、及びメタクリル酸からなる群から選択され得、そしてアルコールは、以下に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリオール、例えば、グリセロール、ソルビトール、イソソルビド、キシリトール、グルコシド、例えば、エチルグルコシド及びメチルグルコシド、ネオペンチルアルコール、並びにプロピレングリコールからなる群から選択され得る。

【0047】

修飾は、カルボン酸エステル又はアミドのエナンチオ選択性合成若しくは加水分解が挙げられるキラル再溶媒和；２つのアルデヒド間のアルドール縮合反応；又は固定化酵素によってインサイチュで生成される過カルボン酸によるオレフィン基のエポキシ化であり得る。

【0048】

修飾は、ポリエステル化反応であり得、修飾されることとなる有機化合物は、ヒドロキシカルボン酸又はそのような化合物のオリゴマー、例えば乳酸又は３－ヒドロキシプロパン酸である。又はカルボン酸は、アジピン酸、コハク酸、フマル酸、２，５－フランジカルボン酸、グルカル酸、テレフタル酸、及びイソフタル酸からなる群から選択されるジカルボン酸であり、第２の反応体は、ポリオール、例えば、１，４－ブタンジオール、１，６－ヘキサンジオール、グリセロール、ソルビトール、イソソルビド、ネオペンチルアルコール、若しくはプロピレングリコールからなる群から選択される。

【0049】

別の特定の実施形態において、修飾は、ラクトンを、本プロセスによって生成される固定化リパーゼと接触させることを含む開環重合反応である。調製されるポリマーは、ホモポリマー又はヘテロポリマーであり得る。

【0050】

修飾は、カルボン酸エステルである第１の反応体及びアルコールである第２の反応体を、本プロセスによって生成される固定化リパーゼと接触させることを含むエステル転移反応であり得る。

【0051】

修飾は、カルボン酸エステルである第１の反応体及び第２のカルボン酸エステルである第２の反応体を、本プロセスによって生成される固定化リパーゼと接触させることを含むエステル交換反応であり得る。より特定の実施形態において、修飾は、ポリカルボン酸エステルである第１の反応体及び第２のポリカルボン酸エステルである第２の反応体を、本発明の固定化リパーゼと接触させることを含むエステル交換反応である。

【0052】

２つの異なる脂肪／油のエステル交換によって、エステル交換に由来する脂肪酸位置の変化は、油／脂肪混合物の溶融プロファイルに影響を与えることとなる。これは、ＮＭＲによって測定されて、典型的な範囲１０℃～４０℃内の所与の温度での固体脂肪のパーセンテージとして表される。構成要素の例として、ココナッツファット及びパームステアリンがある。

【0053】

カルボン酸エステルは、以下に限定されないが、脂肪酸、乳酸、グルカル酸、安息香酸、アクリル酸、メタクリル酸のアルキルエステルからなる群から選択され得、アルキルは、メチル、エチル、ブチルであってよく、アルコールは、以下に限定されないが、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ポリオール、例えばグリセロール、アルキルグルコシド、例えば、エチルグルコシド又はメチルグルコシド、ソルビトール、シリコーン及びシリコーン誘導体、イソソルビド、ネオペンチルアルコール、並びにプロピレングリコールからなる群から選択され得る。

【0054】

修飾は、エナンチオピュア化合物を生成する加水分解又は合成であり得る；アミド化反応は、カルボン酸である第１の反応体及びアミンである第２の反応体を、本発明の固定化リパーゼと接触させることを含む。

【0055】

特定の実施形態において、修飾は、本プロセスによって生成される固定化酵素による、エポキシ化剤のインサイチュ生成を含むエポキシ化反応である。

【0056】

本発明の一実施形態において、固定化リパーゼ酵素が、遊離水が本質的にない媒体中でのエステル化、エステル転移、又はエステル交換プロセスに用いられる。エステル転移は、脂肪酸置換に用いられ得、第１の反応体及び第２の反応体を、前記固定化リパーゼと接触させることを含み、これにより置換反応が起こる。

【0057】

第１の反応体は、脂肪酸エステル、好ましくはトリグリセリド又はトリグリセリドの混合物であり得る。

【0058】

第２の反応体は、第１の反応体、好ましくはトリグリセリド又はトリグリセリドの混合物と異なる別の脂肪酸エステルであり得る。さらに、第２の反応体は、アルコール又は遊離脂肪酸であり得る。

【0059】

本発明のこの好ましい実施形態における媒体は、有機溶媒を含むか、又はトリグリセリドから本質的になってもよい。

【0060】

本発明の前記使用は、例えば、化粧品、バイオ燃料その他用のエステルの生成のための、食品、例えば、マーガリン又はカカオバター代用品の生成に応用され得る。

【0061】

プロセス
また、本発明は、本発明の１，３部位特異的リパーゼ粒子によって触媒される反応を行うプロセスであって：
ａ）反応のために反応体を含む反応混合液を調製することと、
ｂ）反応を行うのに有効な条件にて反応混合液を固定化１，３部位特異的リパーゼ粒子と接触させることと
を含むプロセスを提供する。

【0062】

接触は、場合によっては撹拌があるバッチリアクタ内で、又は所望の反応が実行され得る他のあらゆるタイプのリアクタ若しくはリアクタの組合せ内で、固定化１，３部位特異的リパーゼの充填層カラム、固定化リパーゼを保持している連続撹拌タンクリアクタ、固定化酵素の充填層の移動が、反応混合液への並流又は対向流である移動層リアクタに反応混合液を通すことによって行われ得る。

【0063】

反応体は、脂肪アシルドナー及びアルコールを含み得、そして反応は、脂肪酸アルキルエステルを形成し得る。

【0064】

反応体は、少なくとも２つのトリグリセリドを含み得、そして反応は、異なるトリグリセリドを形成し得る。ゆえに、反応は、トリグリセリドの混合物の溶融特性を変えるのに十分な時間実行され得る。

【0065】

本発明は、以下の付番された実施形態によってさらに説明される。

【0066】

実施形態１． （複数の）酵素粒子であって、
（ａ）５０～９９ｗ／ｗ％の、スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマー；並びに
（ｂ）１～２０ｗ／ｗ％の、酵素クラスＥＣ３．１．１．３由来の１，３特異的リパーゼの活性酵素タンパク質
を含む酵素粒子。

【0067】

実施形態２． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーを８０～９９ｗ／ｗ％の量で含む、実施形態１の酵素粒子。

【0068】

実施形態３． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、スチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを１００：１～２：１の比率で含む、実施形態１～２のいずれかの酵素粒子。

【0069】

実施形態４． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、スチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを５０：１～３：１の比率で含む、実施形態１～３のいずれかの酵素粒子。

【0070】

実施形態５． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、スチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを２０：１～３：１の比率で含む、実施形態１～４のいずれかの酵素粒子。

【0071】

実施形態６． １，３特異的リパーゼを１～１５ｗ／ｗ％の活性酵素タンパク質の量で含む、実施形態１～５のいずれかの酵素粒子。

【0072】

実施形態７． 表面積が５～１０００ｍ^２／ｇである、実施形態１～６のいずれかの酵素粒子。

【0073】

実施形態８． 表面積が１０～７５０ｍ^２／ｇである、実施形態１～７のいずれかの酵素粒子。

【0074】

実施形態９． 細孔容積が、粒子グラムあたり少なくとも０．５グラムの油、特に粒子グラムあたり少なくとも１グラムの油の油吸収に相当する、実施形態１～８のいずれかの酵素粒子。

【0075】

実施形態１０． 平均細孔サイズが０．０５～０．１μｍである、実施形態１～９のいずれかの酵素粒子。

【0076】

実施形態１１． 平均細孔サイズが０．１～０．５μｍである、実施形態１～１０のいずれかの酵素粒子。

【0077】

実施形態１２． 平均直径が２００～１２００μｍである、実施形態１～１１のいずれかの酵素粒子。

【0078】

実施形態１３． 平均直径が２００～１０００μｍである、実施形態１～１２のいずれかの酵素粒子。

【0079】

実施形態１４． 平均直径が３００～９００μｍである、実施形態１～１３のいずれかの酵素粒子。

【0080】

実施形態１５． １，３特異的リパーゼは、リゾムコール（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ）属リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0081】

実施形態１６． １，３特異的リパーゼは、リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼである、実施形態１～１５のいずれかの酵素粒子。

【0082】

実施形態１７． １，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも６０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１６のいずれかの酵素粒子。

【0083】

実施形態１８． １，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも８０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１７のいずれかの酵素粒子。

【0084】

実施形態１９． １，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも９０％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１８のいずれかの酵素粒子。

【0085】

実施形態２０． １，３特異的リパーゼは、配列番号１に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有する、実施形態１～１９のいずれかの酵素粒子。

【0086】

実施形態２１． １，３特異的リパーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する、実施形態１～２０のいずれかの酵素粒子。

【0087】

実施形態２２． １，３特異的リパーゼは、クモノスカビ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0088】

実施形態２３． １，３特異的リパーゼは、リゾプス・オリゼ（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ ｏｒｙｚａｅ）リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0089】

実施形態２４． １，３特異的リパーゼは、サーモマイセス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ）属リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0090】

実施形態２５． １，３特異的リパーゼは、サーモマイセス・ラヌギノサス（Ｔｈｅｒｍｏｍｙｃｅｓ ｌａｎｕｇｉｎｏｓｕｓ）リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0091】

実施形態２６． １，３特異的リパーゼは、マルブランチア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ）属リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0092】

実施形態２７． １，３特異的リパーゼは、マルブランチア・シナモメア（Ｍａｌｂｒａｎｃｈｅａ ｃｉｎｎａｍｏｍｅａ）リパーゼである、実施形態１～１４のいずれかの酵素粒子。

【0093】

実施形態２８． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、９０％超のスチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットを含む、実施形態１～２７のいずれかの酵素粒子。

【0094】

実施形態２９． スチレン及びジビニルベンゼンのコポリマーは、スチレンユニット及びジビニルベンゼンユニットからなる、実施形態１～２８のいずれかの酵素粒子。

【0095】

実施形態３０． 実施形態１～２９のいずれかの酵素粒子、及び少なくとも１０％の油又は脂肪を含む粉末又はスラリー／懸濁液。

【0096】

実施形態３１． 酵素によるエステル交換方法であって、トリグリセリド及び遊離脂肪酸又は遊離脂肪酸エステルの混合物を、実施形態１～２９のいずれかに従う酵素粒子と接触させることを含む方法。

【0097】

実施形態３２． 酵素によるエステル化方法であって、カルボン酸及びアルコールを、実施形態１～２９のいずれかの酵素粒子と接触させることを含み；好ましくは、反応はカラム内で実行される、方法。

【0098】

実施形態３３． 酵素によるエステル化による対称型トリグリセリドの生成方法である、実施形態３２の方法。

【0099】

実施形態３４． エステル化反応における実施形態１～２９のいずれかの酵素粒子の使用であって、対称型トリグリセリドの生成のために、カルボン酸及びアルコールを酵素粒子と接触させることを含み；好ましくは、反応はカラム内で実行される、使用。

【実施例】

【0100】

本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきでない。

【0101】

化学物質は、少なくとも試薬グレードの市販品であった。リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有する。

【0102】

実施例１
リゾムコール・ミーヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉ）リパーゼの固定を、吸着工程において、同じ酵素濃度（担体材料のグラムあたりに加えられる活性酵素タンパク質のグラム）を用いて、２つのタイプの粒子／担体上での吸着によって実行した。２つのタイプの粒子／担体は：
（ａ）マクロ多孔性ポリスチレン樹脂／吸着剤（ジビニルベンゼンとのコポリマー）、及び
（ｂ）メタクリラート樹脂／吸着剤（ジビニルベンゼンとのコポリマー）
であった。

【0103】

この方法は、一般的に用いられており、当業者に周知である。簡潔に、液体リパーゼ濃縮物を、固体担体材料と混合して、担体材料と１～２日間接触させたままにした。

【0104】

濾過、及び水による洗浄の後に、生成された固定化酵素粒子（それぞれ、スチレン／ジビニルベンゼン及びメタクリラート／ジビニルベンゼン上のリパーゼ）を、残りの非吸着酵素を含有する上清から分離して、乾燥させた。

【0105】

上清中の残りの酵素の量を測定して、メタクリラート／ジビニルベンゼン粒子上での固定がかなり効率的であり、上清中の残りの酵素が５～１０倍低い濃度となることが示された。ゆえに、スチレン／ジビニルベンゼン粒子上に吸着される酵素の量は、メタクリラート／ジビニルベンゼン粒子上に吸着される量よりもかなり低かった。上清由来の非吸着酵素を回収した。

【0106】

２つのタイプの固定化酵素粒子を用いて、トリグリセリド（トリオレイン、ＯＯＯ）とステアリン酸との間でエステル交換反応を実行して、対称型トリグリセリド（ステアリン－オレイン－ステアリン、ＳＯＳ）を生成した。

【0107】

反応を、固定層リアクタ内で固定化酵素を反応体と接触させることによって実行した。反応を、７５℃にて、反応体をリアクタ（５５％／４５％ステアリン酸：トリグリセリド混合液）に連続的にフィードすることによって実行して、リアクタ由来の放出口の組成（生成物流）を、ＳＯＳ及びＳＳＳ濃度について、ガスクロマトグラフィによって測定した。

【0108】

簡潔に、フィード混合液を調製する手順及びｐＨ調整は、以下の通りであった：
１． ステアリン酸を、８５℃オーブン／水浴内のボトル内で加熱（およそ３時間）。
２． ハイオレイックヒマワリ油を加えて、キャップタイト前にボトルを窒素でパージ。
３． 油混合液を、７５℃オーブン／水浴内で再インキュベート（およそ１時間）。
４． 油混合液を、高剪断ミキサーにより２４０００ｒｐｍにて３０秒間混合。
５． 腐食剤中に加えながら、高剪断混合（固体化を防止するため）。
６． 十分にキャッピングしたボトル内に保存して、窒素でブランケット。

【0109】

ポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子のパフォーマンスを、ＳＯＳ生成物及びＳＳＳ副産物の形成によって測定して、メタクリラート／ジビニルベンゼン粒子と少なくとも同程度に良好であることが見出された。双方のタイプの粒子を用いたエステル交換は、＞２５％のＳＯＳ及び約１～１．１％のＳＳＳをもたらした。

【0110】

２つのタイプの粒子のパフォーマンスは等しかったので、スチレン／ジビニルベンゼン固定化リパーゼのパフォーマンスは、一般的に用いられるメタクリラート／ジビニルベンゼン固定化リパーゼよりも約５～１０倍良好であった。

【0111】

実施例２
反応を、実施例１に用いた２つのタイプの固定化リパーゼ粒子により実行した。反応を、以下の条件下で、カラムモード（連続的）で７５℃にて走らせた：
２ｇの固定化酵素（乾燥パッキング）；
ステアリン酸：ハイオレイックヒマワリ油からなる油混合液（５５：４５の重量比）；並びに
水及び２００ｐｐｍ ＮａＯＨ（４Ｎ）＋０．１％を加えた。

【0112】

ＳＯＳ（ステアリン－オレイン－ステアリン）及びＳＳＳ（ステアリン－ステアリン－ステアリン）への変換を測定した。

【0113】

３ｇ／ｇ／ｈの油混合液流量にて、ＳＯＳ（所望の生成物）への変換は増大し続けた一方、ＳＳＳ（不所望の副産物）は、ポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子について一定のままであった；一方、メタクリラート／ジビニルベンゼン粒子について、ＳＳＳへの変換は、ＳＯＳと同じ速度にて増大し続けた。

【0114】

この結果は、同じタイプの固定化リパーゼを用いて、ＳＯＳに向けたポリスチレン／ジビニルベンゼン粒子の所望の選択性を示す。

【配列表】

2024507907000001.app

【国際調査報告】