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特表2024-507936新規なクエン酸シンターゼ変異体及びそれを用いたＬ－アミノ酸生産方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】新規なクエン酸シンターゼ変異体及びそれを用いたＬ－アミノ酸生産方法
(51)【国際特許分類】
C12N 15/54 20060101AFI20240214BHJP
C12N 9/10 20060101ALI20240214BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240214BHJP
C12P 13/12 20060101ALI20240214BHJP
C12P 13/06 20060101ALN20240214BHJP
C12P 13/08 20060101ALN20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N15/54
C12N9/10 ZNA
C12N1/21
C12P13/12 A
C12P13/06 E
C12P13/08 D
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023551745
(86)(22)【出願日】2022-03-10
(85)【翻訳文提出日】2023-08-24
(86)【国際出願番号】 KR2022003359
(87)【国際公開番号】W WO2022191635
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】10-2021-0031641
(32)【優先日】2021-03-10
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】514199250
【氏名又は名称】シージェイ チェイルジェダング コーポレイション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】チャン、ジン スク
(72)【発明者】
【氏名】キム、ジュ－ヨン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソン ヘ
(72)【発明者】
【氏名】チェ、ソン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】ユン、ビョン フン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ヒョン ジュン
(72)【発明者】
【氏名】チョ、スン ヒョン
(72)【発明者】
【氏名】イ、ジェミン
(72)【発明者】
【氏名】キム、ソ－ユン
(72)【発明者】
【氏名】イ、イムサン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE03
4B064AE05
4B064AE09
4B064AE16
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA16
4B065AA24X
4B065AA24Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA17
(57)【要約】
本出願は、新規なクエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）変異体、上記変異体を含む微生物及び上記微生物を用いたＬ－アミノ酸生産方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換された、クエン酸シンターゼ変異体。
【請求項2】
前記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項3】
前記変異体は、配列番号３のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の変異体。
【請求項4】
前記変異体は、下記一般式１のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含む、請求項１に記載の変異体：［一般式１］
Ｘ１Ｎ ＨＧＧＤＡＴＸ２ＦＭＮ ＫＶＫＮＫＥＤＧＶＲ ＬＭＧＦＧＨＲＶＹＫ ＮＹＤＰＲＡＡＩＶＫ ＥＴＡＨＥＩＬＥＨＬ ＧＧＤＤＬＬＤＬＡＩ ＫＬＥＥＩＡＬＡＤＤ Ｘ３ＦＩＳＲＫＬＹＰＮ ＶＤＦＹＴＧＬＩＹＲ ＡＭＧＦＰＴＤＦＦＴ ＶＬＦＡＩＧＲＬＰＧ ＷＩＡＨＹＲＥＱＬＧ ＡＡＧＮＨ（配列番号５１）；
ここで、前記一般式１のＸ１はアスパラギンまたはセリンであり、
Ｘ２はアラニンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ３はチロシンまたはシステインである。
【請求項5】
前記変異体は、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の変異体。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項7】
配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換されたクエン酸シンターゼ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、コリネバクテリウム属微生物。
【請求項8】
前記微生物は、Ｌ－バリンまたはＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能を有する、請求項７に記載の微生物。
【請求項9】
前記微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカムである、請求項７に記載の微生物。
【請求項10】
配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換されたクエン酸シンターゼ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸生産方法。
【請求項11】
前記方法は、培養された培地または微生物からＬ－アミノ酸を回収する段階をさらに含む、請求項１０に記載のＬ－アミノ酸生産方法。
【請求項12】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンまたはＬ－メチオニンである、請求項１０に記載のＬ－アミノ酸生産方法。
【請求項13】
配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換されたクエン酸シンターゼ変異体または前記変異体をコードするポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物；それを培養した培地；またはそれらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸生産用組成物。
【請求項14】
前記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンまたはＬ－メチオニンである、請求項１３に記載のＬ－アミノ酸生産用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、新規なクエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）変異体、上記変異体を含む微生物及び上記微生物を用いたＬ－アミノ酸生産方法に関する。
【背景技術】
【0002】
Ｌ－アミノ酸及びその他有用物質を生産するために、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のための多様な研究が行われている。例えば、Ｌ－バリン生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたりまたは生合成に不要な遺伝子を除去することのような目的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１、特許文献２）。
【0003】
一方、クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ；ＣＳ）は、微生物の解糖過程で生成されるアセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を重合してクエン酸を生成する酵素であり、また、ＴＣＡ経路への炭素流入を決定する重要な酵素である。
【0004】
クエン酸シンターゼをコードするｇｌｔＡ遺伝子欠損によるＬ－リシン生産菌株のｐｈｅｎｏｔｙｐｅ変化に関する内容は先行文献に報告されている（非特許文献１）。しかし、ｇｌｔＡ遺伝子欠損菌株の場合、菌株の生長が阻害されるだけでなく、糖消耗速度が大幅に減少して単位時間当たりのリシン生産量が低い短所がある。従って、効果的なＬ－アミノ酸の生産能の増加及び菌株の生長をともに考慮した研究が依然として必要なのが現状である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0005】
【特許文献1】米国特許第８４６５９６２号明細書
【特許文献2】韓国登録特許第１０－２１５３５３４号公報
【特許文献3】韓国登録特許第１０－１９９２－０００７４０１号公報
【特許文献4】米国特許第７６６２９４３号明細書
【特許文献5】米国特許第１０５８４３３８号明細書
【特許文献6】米国特許第１０２７３４９１号明細書
【特許文献7】米国特許第８４２６１７１号明細書
【特許文献8】韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報
【特許文献9】韓国登録特許第１０－１９４７９４５号公報
【非特許文献】
【0006】
【非特許文献1】Ｏｏｙｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．，１０９（８）：２０７０－２０８１，２０１２
【非特許文献2】Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］： ２４４４
【非特許文献3】Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７
【非特許文献4】Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８４４３－４５３
【非特許文献5】Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）
【非特許文献6】Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）
【非特許文献7】Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４
【非特許文献8】［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ／．］（１９８８）ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８：１０７３
【非特許文献9】Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２
【非特許文献10】Ｓｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）
【非特許文献11】Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５
【非特許文献12】Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９
【非特許文献13】Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ， Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，９．５０－９．５１，１１．７
【非特許文献14】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ １３，Ｎｏ．１０，ｐ．７２１－７２６（１９９１）
【非特許文献15】Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ．Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３
【非特許文献16】Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２
【非特許文献17】Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６
【非特許文献18】Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６
【非特許文献19】“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）
【非特許文献20】Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７
【非特許文献21】ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本発明者らは、Ｌ－アミノ酸を高収率で生産するために鋭意努力した結果、新規なクエン酸シンターゼ変異体がＬ－アミノ酸生産能を増加させることを確認することにより、本出願を完成した。
【0008】
本出願の一つの目的は、配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換された、クエン酸シンターゼ変異体を提供することにある。
【0009】
本出願の他の目的は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することにある。
【0010】
本出願の他の目的は、本出願の変異体または上記変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、コリネバクテリウム属微生物を提供することにある。
【0011】
本出願のもう一つの目的は、本出願の微生物を用いてＬ－アミノ酸を生産する方法を提供することにある。
【0012】
本出願のもう一つの目的は、本出願の微生物；本出願の微生物を培養した培地；あるいは、それらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供することにある。
【0013】
発明の効果
本出願のクエン酸シンターゼ変異体を用いる場合、高収率のＬ－アミノ酸生産が可能である。
本出願のクエン酸シンターゼ変異体を用いる場合、高収率のＬ－アミノ酸生産が可能である。
【課題を解決するための手段】
【0014】
これを具体的に説明すると、次の通りである。一方、本出願で開示されたそれぞれの説明及び実施形態は、それぞれの異なる説明及び実施形態にも適用することができる。すなわち、本出願で開示された様々な要素の全ての組み合わせが、本出願の範囲に属する。また、以下に記載される具体的な記述により本出願の範囲が制限されるとは見られない。また、本明細書の全体にわたって多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体として本明細書に参照として組み込まれ、本出願が属する技術分野の水準及び本出願の内容がより明確に説明される。
【0015】
本出願の一つの様態は、配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシンがヒスチジンで置換された、クエン酸シンターゼ変異体を提供することである。
【0016】
本出願の変異体は、上記配列番号１で記載されたアミノ酸配列において配列番号１のアミノ酸配列を基準に４１５番目の位置に対応するアミノ酸はヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）であり、上記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有する変異体であってもよい。例えば、本出願の変異体は、上記配列番号１で記載されたアミノ酸配列において配列番号１のアミノ酸配列を基準に４１５番目の位置に対応するアミノ酸はヒスチジンであり、上記配列番号１で記載されたアミノ酸配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％または９９．９％以上の相同性または同一性を有するアミノ酸配列を有してもよく、含んでもよく、または上記アミノ酸配列で構成されてもよく、必須に構成されてもよい。また、このような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加されたアミノ酸配列を有する変異体も本出願の範囲内に含まれることは自明である。
【0017】
例えば、上記アミノ酸配列のＮ末端、Ｃ末端そして／または内部に本出願の変異体の機能を変更しない配列の追加または欠失、自然に発生し得る突然変異、サイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）または保存的置換を有する場合である。
【0018】
上記「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」は、あるアミノ酸を類似した構造的及び／または化学的性質を有する他のアミノ酸で置換させることを意味する。このようなアミノ酸置換は、一般に、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性及び／又は両親媒性（ａｍｐｈｉｐａｔｈｉｃ ｎａｔｕｒｅ）における類似性に基づいて起こり得る。通常、保存的置換はタンパク質またはポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないか、または影響を及ぼさなくてもよい。
【0019】
本出願において、用語「変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」とは、一つ以上のアミノ酸が保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）及び／又は変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）され、前記変異体の変異前のアミノ酸配列とは異なるが、機能（ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）または特性（ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ）が維持されるポリペプチドを指す。そのような変異体は、一般に、上記ポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸を変形し、前記変形ポリペプチドの特性を評価して同定（ｉｄｅｎｔｉｆｙ）され得る。即ち、変異体の能力は、変異前のポリペプチドに比べて増加したり、変化しないか、または減少されてもよい。また、一部の変異体は、Ｎ末端リーダー配列または膜貫通ドメイン（ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｄｏｍａｉｎ）などの１つ以上の部分が除去された変異体を含んでもよい。他の変異体は、成熟タンパク質（ｍａｔｕｒｅ ｐｒｏｔｅｉｎ）のＮ及び／又はＣ末端から一部分が除去された変異体を含んでもよい。上記用語「変異体」は、変異型、変形、変異型ポリペプチド、変異タンパク質、変異及び変異体などの用語（英文表現ではｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ、ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ、ｍｕｔａｎｔ， ｍｕｔｅｉｎ、ｄｉｖｅｒｇｅｎｔなど）を混用することができ、変異された意味で使用される用語であれば、これに限定されない。本出願の目的上、上記変異体は、配列番号１のアミノ酸配列の４１５番目の位置に対応するアミノ酸であるリシン（Ｌｙｓｉｎｅ，Ｌｙｓ，Ｋ）がヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ，Ｈｉｓ，Ｈ）で置換された変異体であってもよい。
【0020】
また、変異体は、ポリペプチドの特性と二次構造に最小の影響を有するアミノ酸の欠失または付加を含んでもよい。例えば、変異体のＮ末端には翻訳と同時に（ｃｏ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）または翻訳後に（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ）タンパク質の移動（ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ）に関与するシグナル（またはリーダ）配列がコンジュゲートされてもよい。また、上記変異体は、確認、精製、または合成可能に、他の配列またはリンカーとコンジュゲートされてもよい。
【0021】
本出願において、用語「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」または「同一性（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」とは、２つの与えられたアミノ酸配列または塩基配列相互間の類似度を意味し、百分率で表すことができる。用語の相同性及び同一性はしばしば互換的に使用することができる。
【0022】
保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列相同性または同一性は、標準配列アルゴリズムにより決定され、使用されるプログラムにより確立されたデフォルトギャップペナルティが共に使用されてもよい。実質的に、相同性を有したり（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）または同一の（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ）配列は、一般に、配列の全体または一部分と中程度または高いストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ）でハイブリダイズすることができる。ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドにおける一般のコドンまたはコドン縮退性を考慮したコドンを含有するポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションも含まれることが自明である。
【0023】
任意の二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が相同性、類似性または同一性を有するかどうかは、例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ（１９８８）［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５］：２４４４でのようなデフォルトパラメータを用いて「ＦＡＳＴＡ」プログラムなどの既知のコンピュータアルゴリズムを用いて決定されてもよい。または、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルマンプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）（バージョン５．０．０または以降のバージョン）で行われるような、ニードルマン－ウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈ）アルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）を使用して決定されてもよい（ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７（１９８４）），ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮ，ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，［Ｓ．］［Ｆ．，］［ＥＴ ＡＬ，Ｊ ＭＯＬＥＣ ＢＩＯＬ ２１５］：４０３（１９９０）；Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｈｕｇｅ Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，［ＥＤ．，］Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，１９９４、及び［ＣＡＲＩＬＬＯ ＥＴ ＡＬ／．］（１９８８） ＳＩＡＭ Ｊ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍａｔｈ ４８： １０７３を含む）。例えば、国立生物工学情報データベースセンターのＢＬＡＳＴ、またはＣｌｕｓｔａｌＷを用いて相同性、類似性または同一性を決定することができる。
【0024】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの相同性、類似性または同一性は、例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ（１９８１）２：４８２において公知となっているように、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．（１９７０），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．４８：４４３のようなＧＡＰコンピュータプログラムを用いて配列情報を比較することにより決定されてもよい。要約すると、ＧＡＰプログラムは、２つの配列中、より短いものにおける記号の総数であり、類似の配列された記号（即ち、ヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を除した値と定義することができる。ＧＡＰプログラムのためのデフォルトパラメータは、（１）二進法比較マトリックス（同一性のために１、そして非同一性のために０の値を含有する）及びＳｃｈｗａｒｔｚ ａｎｄ Ｄａｙｈｏｆｆ，ｅｄｓ．，Ａｔｌａｓ Ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎｄ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，ｐｐ．３５３－３５８（１９７９）により開示されているように、Ｇｒｉｂｓｋｏｖ ｅｔ ａｌ（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４：６７４５の加重比較マトリックス（またはＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックス）；（２）各ギャップのための３．０のペナルティ及び各ギャップにおいて各記号のための追加の０．１０ペナルティ（またはギャップ開放ペナルティ１０、ギャップ延長ペナルティ０．５）；及び（３）末端ギャップのための無ペナルティを含むことができる。
【0025】
本出願において、用語「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ）」は、ポリペプチドで列挙される位置のアミノ酸残基であるか、またはポリペプチドで列挙される残基と類似または同一または相同のアミノ酸残基を指す。対応する位置のアミノ酸を確認することは、特定の配列を参照する配列の特定のアミノ酸を決定することであってもよい。本出願で使用される「対応する領域」は、一般に、関連タンパク質または比較（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）タンパク質における類似または対応する位置を指す。
【0026】
例えば、任意のアミノ酸配列を配列番号１と整列（ａｌｉｇｎ）し、これに基づいて上記アミノ酸配列の各アミノ酸残基は、配列番号１のアミノ酸残基と対応するアミノ酸残基の数字の位置を参照して番号付けすることができる。例えば、本出願に記載されているような配列整列アルゴリズムは、クエリシーケンス（「参照配列」ともいう）に比べてアミノ酸の位置、または置換、挿入または欠失などの変形が発生する位置を確認することができる。
【0027】
そのような整列には、例えば、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３－４５３）、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ ｅｔ ａｌ．，２０００、Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６－２７７）などを用いることができるが、これに限定されず、当業界に知られている配列整列プログラム、ペアワイズ配列（ｐａｉｒｗｉｓｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）比較アルゴリズムなどを適宜用いることができる。
【0028】
本出願において、用語「クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、微生物の解糖過程で生成されるアセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を重合してクエン酸を生成する酵素である。また、上記酵素はアセチルＣｏＡと４－炭素オキサロ酢酸の分子からの２－炭素アセテート残基の縮合反応を触媒して６－炭素オキサロ酢酸を形成することができる。本出願の用語「クエン酸シンターゼ」は、クエン酸合成酵素、ＣＳ、ＧｌｔＡタンパク質またはＧｌｔＡで混用され得る。本出願において上記ＧｌｔＡは公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。併せて、上記ＧｌｔＡはｇｌｔＡ遺伝子によりコードされるクエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【0029】
本出願の変異体は野生型ポリペプチドに比べてＬ－バリン生産能が増加するようにする活性を有することができる。
【0030】
本出願の変異体は、配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の配列同一性を有するものであってもよい。
【0031】
また、本出願の変異体は、配列番号３のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含んでもよい。上記配列番号３のアミノ酸配列は、配列番号１で記載されたアミノ酸配列のＮ末端から３６２～４１５番目の位置のアミノ酸配列で４１５番目の位置に対応するリシンがヒスチジンで置換されたアミノ酸配列であってもよい。
【0032】
本出願の変異体は、下記一般式１のアミノ酸配列を含んでもよい：
【0033】
［一般式１］
Ｘ１Ｎ ＨＧＧＤＡＴＸ２ＦＭＮ ＫＶＫＮＫＥＤＧＶＲ ＬＭＧＦＧＨＲＶＹＫ ＮＹＤＰＲＡＡＩＶＫ ＥＴＡＨＥＩＬＥＨＬ ＧＧＤＤＬＬＤＬＡＩ ＫＬＥＥＩＡＬＡＤＤ Ｘ３ＦＩＳＲＫＬＹＰＮ ＶＤＦＹＴＧＬＩＹＲ ＡＭＧＦＰＴＤＦＦＴ ＶＬＦＡＩＧＲＬＰＧ ＷＩＡＨＹＲＥＱＬＧ ＡＡＧＮＨ（配列番号５１）
Ｘ１Ｎ ＨＧＧＤＡＴＸ２ＦＭＮ ＫＶＫＮＫＥＤＧＶＲ ＬＭＧＦＧＨＲＶＹＫ ＮＹＤＰＲＡＡＩＶＫ ＥＴＡＨＥＩＬＥＨＬ ＧＧＤＤＬＬＤＬＡＩ ＫＬＥＥＩＡＬＡＤＤ Ｘ３ＦＩＳＲＫＬＹＰＮ ＶＤＦＹＴＧＬＩＹＲ ＡＭＧＦＰＴＤＦＦＴ ＶＬＦＡＩＧＲＬＰＧ ＷＩＡＨＹＲＥＱＬＧ ＡＡＧＮＨ（配列番号５１）
【0034】
ここで、上記一般式１のＸ１はアスパラギンまたはセリンであり、
Ｘ２はアラニンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ３はチロシンまたはシステイン。
Ｘ２はアラニンまたはグルタミン酸であり、
Ｘ３はチロシンまたはシステイン。
【0035】
本出願の変異体は、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有することができる。また、本出願の変異体は、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と９０％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むんでもよく、上記アミノ酸配列で構成されてもよく、必須に構成されてもよい。一例として、本出願の変異体は、配列番号８、１０または１２のアミノ酸配列と９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、または９９．７％以上の配列同一性を有してもよく、上記配列同一性を有するアミノ酸配列を含んでもよく、上記配列同一性を有するアミノ酸配列で構成されてもよく、必須に構成されてもよい。
【0036】
本出願のもう一つの様態は、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドを提供することである。
【0037】
本出願において、用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単位体（ｍｏｎｏｍｅｒ）が共有結合により長く鎖状につながったヌクレオチドの重合体（ｐｏｌｙｍｅｒ）であり、一定の長さ以上のＤＮＡまたはＲＮＡ鎖であって、より具体的には、上記変異体をコードするポリヌクレオチド断片を意味する。
【0038】
本出願のポリヌクレオチドは、配列番号２の核酸塩基配列を基準に１２４３～１２４５番目の位置に対応する塩基はＣＡＣであり、上記配列番号２で記載された核酸塩基配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．７％、または９９．９％以上、１００％未満の相同性または同一性を有する核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含んでもよい。また、このような相同性または同一性を有し、本出願の変異体に対応する効能を示すポリペプチドやタンパク質をコードする配列であれば、一部の配列が欠失、変形、置換、保存的置換または付加された核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドも本出願の範囲内に含まれることは自明である。
【0039】
本出願のポリヌクレオチドは、コドンの縮退性（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）または本出願の変異体を発現させようとする生物において好まれるコドンを考慮し、本出願の変異体のアミノ酸配列を変化させない範囲内でコード領域に多様な変形が行われてもよい。この時、上記相同性または同一性を有する配列において、配列番号１の４１５番目の位置に対応するアミノ酸をコードするコドンは、ヒスチジンをコードするコドンの一つであってもよい。
【0040】
また、本出願のポリヌクレオチドは、公知の遺伝子配列から製造されるプローブ、例えば、本出願のポリヌクレオチド配列の全体または一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる配列であれば、制限なく含まれる。上記「ストリンジェントな条件（ｓｔｒｉｎｇｅｎｔ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は文献（Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９； Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，９．５０－９．５１，１１．７参照）に具体的に記載されている。例えば、相同性または同一性の高いポリヌクレオチド同士、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、または９９％以上の相同性または同一性を有するポリヌクレオチド同士ハイブリダイズし、それより相同性または同一性の低いポリヌクレオチド同士をハイブリダイズしない条件、またはサザンハイブリダイゼーション（ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ）の洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、具体的には、６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳ、より具体的には、６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度で、１回、具体的に２回～３回洗浄する列挙することができる。
【0041】
ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）が可能であっても、２つの核酸が相補的配列を有することを要求する。用語「相補的」は、互いにハイブリダイゼーション可能なヌクレオチド塩基間の関係を記述するのに使用される。例えば、ＤＮＡに関し、アデニンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。従って、本出願のポリヌクレオチドは、また、実質的に類似の核酸塩基配列だけでなく、全体配列に相補的な単離された核酸断片を含んでもよい。
【0042】
具体的には、本出願のポリヌクレオチドと相同性または同一性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーション段階を含むハイブリダイゼーション条件を用い、上述の条件を用いて探知することができる。また、上記Ｔｍ値は６０℃、６３℃または６５℃であってもよいが、これに制限されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
【0043】
上記ポリヌクレオチドをハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、ポリヌクレオチドの長さ及び相補性の程度に依存し、変数は当技術分野においてよく知られている（例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，同上）。
【0044】
一例として、本出願のポリヌクレオチドは、配列番号９、１１または１３の核酸塩基配列を基準に１０８４～１２４５番目の位置の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチド、または、配列番号９、１１、１３または１５の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含んでもよい。
【0045】
本出願のポリヌクレオチドにおいて、上記変異体は、上記他の様態で記載した通りである。
【0046】
本出願の他の一つの様態は、本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを提供することである。上記ベクターは、上記ポリヌクレオチドを宿主細胞で発現させるための発現ベクターであってもよいが、これに制限されない。
【0047】
本出願のベクターは、適切な宿主内で目的ポリペプチドを発現させることができるように、適切な発現調節領域（または発現調節配列）に作動可能に連結された上記目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの塩基配列を含むＤＮＡ製造物を含んでもよい。前記発現調節領域は、転写を開始し得るプロモーター、そのような転写を調節するための任意のオペレーター配列、適切なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、及び転写及び解読の終結を調節する配列を含んでもよい。ベクターは、適切な宿主細胞内に形質転換された後、宿主ゲノムとは無関係に複製または機能することができ、ゲノム自体に統合されてもよい。
【0048】
本出願で使用されるベクターは、特に限定されず、当業界に知られている任意のベクターを利用することができる。通常使用されるベクターの例としては、天然状態または組換え状態のプラスミド、コスミド、ウイルス及びバクテリオファージを挙げることができる。例えば、ファージベクターまたはコスミドベクターとしてｐＷＥ１５、Ｍ１３、ＭＢＬ３、ＭＢＬ４、ＩＸＩＩ、ＡＳＨＩＩ、ＡＰＩＩ、ｔ１０、ｔ１１、Ｃｈａｒｏｎ４Ａ、及びＣｈａｒｏｎ２１Ａなどを用いることができ、プラスミドベクターとしてｐＤＺ系、ｐＢＲ系、ｐＵＣ系、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ系、ｐＧＥＭ系、ｐＴＺ系、ｐＣＬ系及びｐＥＴ系などを用いることができる。具体的には、ｐＤＺ、ｐＤＣ、ｐＤＣＭ２、ｐＡＣＹＣ１７７、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＣＬ、ｐＥＣＣＧ１１７（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｌｅｔｔｅｒｓ ｖｏｌ １３，Ｎｏ．１０，ｐ．７２１－７２６（１９９１）、韓国登録特許第１０－１９９２－０００７４０１号公報）、ｐＵＣ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＷ１１８、ｐＣＣ１ＢＡＣベクターなどを用いることができる。
【0049】
一例として、細胞内における染色体挿入用ベクターを通じて目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを染色体内に挿入することができる。上記ポリヌクレオチドの染色体内への挿入は、当業界に知られている任意の方法、例えば、相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）により行われてもよいが、これに限定されない。前記染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。上記選別マーカーは、ベクターで形質転換された細胞を選別、即ち、目的核酸分子の挿入有無を確認するためのものであり、薬物耐性、栄養要求性、細胞毒性剤に対する耐性または表面ポリペプチドの発現のような選択可能表現型を付与するマーカーが使用される。選択剤（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅａｇｅｎｔ）が処理された環境では、選別マーカーを発現する細胞のみが生存するか、または他の発現形質を示すため、形質転換された細胞を選別することができる。
【0050】
本出願における用語「形質転換」とは、標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞または微生物内に導入し、宿主細胞内で上記ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドが発現できるようにすることを意味する。形質転換されたポリヌクレオチドは、宿主細胞内で発現できる限り、宿主細胞の染色体内に挿入されて位置するか、または染色体外に位置するかに関係なく、それらいずれも含んでもよい。また、前記ポリヌクレオチドは、目的のポリペプチドをコードするＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。上記ポリヌクレオチドは、宿主細胞内に導入されて発現できるものであれば、如何なる形態でも導入されてもよい。例えば、前記ポリヌクレオチドは、自体で発現されるのに必要な全ての要素を含む遺伝子構造体である発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）の形態で宿主細胞に導入されてもよい。上記発現カセットは、通常、上記ポリヌクレオチドに作動可能に連結されているプロモーター（ｐｒｏｍｏｔｅｒ）、転写終結信号、リボソーム結合部位、及び翻訳終結信号を含んでもよい。上記発現カセットは、自己複製可能な発現ベクターの形態であってもよい。また、上記ポリヌクレオチドは、それ自体の形態で宿主細胞に導入され、宿主細胞で発現に必要な配列と作動可能に連結されているものであってもよく、これに制限されない。
【0051】
また、前記において用語「作動可能に連結」されたとは、本出願の目的変異体をコードするポリヌクレオチドの転写を開始及び媒介させるプロモーター配列と上記ポリヌクレオチド配列が機能的に連結されていることを意味する。
【0052】
本出願のベクターにおいて、変異体及びポリヌクレオチドは、上記他の様態で記載した通りである。
【0053】
本出願の他の一つの様態は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを含む、コリネバクテリウム属（Ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ ｏｆ Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）微生物を提供することである。
【0054】
本出願の微生物は、本出願の変異体、上記変異体をコードするポリヌクレオチド、または本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含んでもよい。
【0055】
本出願において、用語「微生物（または、菌株）」は、野生型微生物や天然または人為的に遺伝的変形が起こった微生物を全て含み、外部遺伝子が挿入されたり、内在的遺伝子の活性が強化または不活性化されるなどの原因により、特定の機序が弱化または強化された微生物であり、所望のポリペプチド、タンパク質または産物の生産のために遺伝的変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む微生物であってもよい。
【0056】
本出願の微生物は、本出願の変異体、本出願のポリヌクレオチド及び本出願のポリヌクレオチドを含むベクターのいずれか一つ以上を含む微生物；本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを発現するように変形された微生物；本出願の変異体、または本出願のポリヌクレオチドを発現する微生物（例えば、組換え菌株）；または本出願の変異体活性を有する微生物（例えば、組換え菌株）であってもよいが、これに制限されない。
【0057】
本出願の微生物は、Ｌ－アミノ酸生産能を有する菌株であってもよい。具体的には、本出願の微生物において上記Ｌ－アミノ酸生産能は、Ｌ－バリンまたはＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能であってもよい。
【0058】
本出願の微生物は、天然にＧｌｔＡまたはＬ－アミノ酸生産能を有している微生物、またはＧｌｔＡまたはＬ－アミノ酸生産能のない親株に、本出願の変異体またはこれをコードするポリヌクレオチド（または上記ポリヌクレオチドを含むベクター）が導入されるか、及び／またはＧｌｔＡまたはＬ－アミノ酸生産能が与えられた微生物であってもよいが、これに限定されない。
【0059】
一例として、本出願の微生物は、本出願のポリヌクレオチドまたは本出願のポリヌクレオチドを含むベクターで形質転換され、本出願の変異体を発現する細胞または微生物であり、本出願の目的上、出願の微生物は、本出願の変異体を含みＬ－アミノ酸を生産することができる全ての微生物を含んでもよい。例えば、本出願の菌株は、天然の野生型微生物、またはＬ－アミノ酸を生産する微生物に本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドが導入されることによりＬ－アミノ酸生産能が増加した組換え菌株であってもよい。上記Ｌ－アミノ酸生産能が増加した組換え菌株は、天然の野生型微生物、またはクエン酸シンターゼ非変形微生物（即ち、野生型（配列番号１）タンパク質を発現する微生物または本出願の変異体を発現しない微生物）に比べてＬ－アミノ酸生産能が増加した微生物であってもよいが、これに制限されるものではない。その例として、上記Ｌ－アミノ酸生産能の増加有無を比較する対象菌株である、クエン酸シンターゼ非変形微生物は、ＡＴＣＣ１４０６７菌株、ＡＴＣＣ１３０３２菌株、ＡＴＣＣ１３８６９菌株、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ菌株、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖ菌株またはＣＡ０８－００７２菌株であってもよいが、これに制限されない。
【0060】
一例として、上記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物に比べて、Ｌ－アミノ酸生産能が約１％以上、５％以上、７％以上、約１０％以上、約２０％以上、または約３０％以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約２００％以下、約１５０％以下、約１００％以下、約５０％以下、約４５％以下、約４０％以下または約３０％以下であってもよい）増加したものであってもよいが、変異前の親株または非変形微生物の生酸能に比べて＋値の増加量を有する限り、これに制限されない。他の例として、上記生産能が増加した組換え菌株は、変異前の親株または非変形微生物に比べて、Ｌ－バリン生産能が約１．０１倍以上、約１．０５倍以上、約１．０７倍以上、約１．１倍以上、約１．２倍以上または約１．３倍以上（上限値は特別な制限はなく、例えば、約１０倍以下、約５倍以下、約３倍以下、または約２倍以下であってもよい）増加したものであってもよい。
【0061】
上記用語「約（ａｂｏｕｔ）」は、±０．５、±０．４、±０．３、±０．２、±０．１などを全て含む範囲であり、約という用語に続く数値と同等又は類似の範囲の数値を全て含むが、これに限定されない。
【0062】
本出願において、用語「非変形微生物」とは、微生物に自然に発生し得る突然変異を含む菌株を除外するものではなく、野生型菌株または天然型菌株自体であるか、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化する前の菌株を意味する。例えば、上記非変形微生物は、本明細書に記載のタンパク質変異体が導入されないか、または導入される前の菌株を意味する。上記「非変形微生物」は、「変形前の菌株」、「変異前の微生物」、「非変異菌株」、「非変形菌株」、「非変異微生物」または「基準微生物」と混用され得る。
【0063】
本出願の他の一例として、本出願の微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）、コリネバクテリウム・デセルティ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄｅｓｅｒｔｉ）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、コリネバクテリウム・カルナエ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｃａｌｌｕｎａｅ）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔａｔｉｏｎｉｓ）、コリネバクテリウム・シングラレ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｉｎｇｕｌａｒｅ）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｔｒｉａｔｕｍ）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｍｍｏｎｉａｇｅｎｅｓ）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｏｌｌｕｔｉｓｏｌｉ）、コリネバクテリウム・イミタンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｍｉｔａｎｓ）、コリネバクテリウム・テスツディノリス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｅｓｔｕｄｉｎｏｒｉｓ）またはコリネバクテリウム・フラベッセンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）であってもよい。
【0064】
本出願の微生物は、ＮＣｇｌ２３３５タンパク質がさらに弱化された微生物であってもよい。本出願の微生物は、アセトラクテートシンターゼアイソザイム１サブユニット（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ １ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＩｌｖＮ）、Ｌ－メチオニン／分岐鎖アミノ酸エクスポーター（Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ／ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｘｐｏｒｔｅｒ，ＹｊｅＨ）からなる群から選択されるタンパク質の活性がさらに強化された微生物であってもよい。
【0065】
具体的には、本出願のＬ－バリンを生産する微生物は、さらにＩ１ｖＮ活性強化及び／又はＮＣｇｌ２３３５弱化された微生物であってもよい。また、本出願のＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンを生産する微生物は、さらに ＹｊｅＨ（Ｌ－ｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ／ｂｒａｎｃｈｅｄ－ｃｈａｉｎ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｅｘｐｏｒｔｅｒ）の活性強化された微生物であってもよい。
【0066】
本出願において、用語ポリペプチド活性の「弱化」は、内在的活性に比べて活性が減少または活性がないことを全て含む概念である。上記弱化は、不活性化（ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、欠乏（ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、下方調節（ｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、減少（ｄｅｃｒｅａｓｅ）、低下（ｒｅｄｕｃｅ）、減衰（ａｔｔｅｎｕａｔｉｏｎ）などの用語と混用され得る。
【0067】
上記弱化は、上記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの変異などによりポリペプチド自体の活性が本来微生物が有しているポリペプチドの活性に比べて減少または除去された場合、それをコードするポリヌクレオチドの遺伝子の発現阻害またはポリペプチドへの翻訳（ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ）阻害などにより細胞内で全体的なポリペプチド活性度及び／又は濃度（発現量）が天然型菌株に比べて低い場合、上記ポリヌクレオチドの発現が全く行われていない場合、及び／又はポリヌクレオチドの発現にもかかわらず、ポリペプチドの活性がない場合も含むことができる。上記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異により形質が変化した場合、形質変化前の親株、野生型または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて「不活性化、欠乏、減少、下方調節、低下、減衰」するということは、形質変化前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性に比べて低下したことを意味する。
【0068】
このようなポリペプチドの活性の弱化は、当業界に知られた任意の方法により行うことができるが、これらに限定されるものではなく、当該分野においてよく知られている様々な方法の適用により達成される（例えば、Ｎａｋａｓｈｉｍａ Ｎ ｅｔ ａｌ．，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｅｌｌｕｌａｒ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｇｅｎｅ ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ． Ｉｎｔ Ｊ Ｍｏｌ Ｓｃｉ．２０１４；１５（２）：２７７３－２７９３，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0069】
具体的には、本出願のポリペプチドの弱化は
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードする遺伝子の全部または一部の欠損；
２）ポリペプチドをコードする遺伝子の発現が減少するように発現調節領域（または発現調節配列）の変形；
３）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、上記ポリペプチドを構成するアミノ酸配列の変形（例えば、アミノ酸配列上の１以上のアミノ酸の削除／置換／付加）；
４）ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように、上記ポリペプチドをコードする遺伝子配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が除去または弱化されるように変形されたポリペプチドをコードするように、上記ポリペプチド遺伝子の核酸塩基配列上の１以上の核酸塩基の削除／置換／付加）；
５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
６）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入；
７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な２次構造物を形成させるためにポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加；
８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）；または
９）上記１）～８）から選択された２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
【0070】
例えば、
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
上記１）ポリペプチドをコードする上記遺伝子の一部または全体の欠損は、染色体内の内在的目的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド全体の除去、一部のヌクレオチドが欠失したポリヌクレオチドへの交換、またはマーカー遺伝子への交換であってもよい。
【0071】
また、上記２）発現調節領域（または発現調節配列）の変形は、欠失、挿入、非保存的若しくは保存的置換またはこれらの組合わせにより発現調節領域（または発現調節配列）上の変異発生、又は更に弱い活性を有する配列への交換であってもよい。上記発現調節領域には、プロモーター、オペレータ配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と解読の終結を調節する配列を含むが、これらに限定されるものではない。
【0072】
また、前記３）及び４）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を弱化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列または前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組み合わせで、配列上の変異の発生、またはより弱い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列もしくは活性がないように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これに限定されるものではない。例えば、ポリヌクレオチド配列内の変異を導入して終結コドンを形成することにより、遺伝子の発現を阻害または弱化させてもよいが、これに限定されない。
【0073】
また、前記５）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより低い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換するものであってもよいが、これらに限定されない。
【0074】
前記６）ポリペプチドをコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）の導入は、例えば、文献［Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ－ＲＮＡ ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｖｉｅｗｓ－Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｖｏｌ．１（１）１９８６］を参照することができる。
【0075】
前記７）リボソーム（ｒｉｂｏｓｏｍｅ）の付着が不可能な二次構造物を形成させるために、ポリペプチドをコードする遺伝子のシャイン・ダルガノ（Ｓｈｉｎｅ－Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列の付加はｍＲＮＡ翻訳を不可能にするか、または速度を低下させるものであってもよい。
【0076】
前記８）ポリペプチドをコードする遺伝子配列のＯＲＦ（ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅ）の３’の末端に反対方向に転写されるプロモーターの付加（Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ＲＴＥ）は、前記ポリペプチドをコードする遺伝子の転写体に相補的なアンチセンスヌクレオチドを作って活性を弱化するものであってもよい。
【0077】
本出願において用語、ポリペプチド活性の「強化」とは、ポリペプチドの活性が内在的活性に比べて増加することを意味する。前記強化は、活性化（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）、上方調節（ｕｐ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）、過剰発現（ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）、増加（ｉｎｃｒｅａｓｅ）などの用語と混用され得る。ここで、活性化、強化、上方調節、過剰発現、増加は、本来有していなかった活性を示すこと、または内在的活性または変形前の活性に比べて向上した活性を示すようになることを全て含むことができる。前記「内在的活性」とは、天然または人為的要因による遺伝的変異で形質が変化した場合、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性を意味する。これは、「変形前の活性」と混用され得る。ポリペプチドの活性が、内在的活性に比べて「強化」、「上方調節」、「過剰発現」または「増加」するとは、形質転換前の親株または非変形微生物が本来有していた特定のポリペプチドの活性及び／または濃度（発現量）に比べて向上したことを意味する。
【0078】
前記強化は、外来のポリペプチドを導入するか、または内在的なポリペプチドの活性強化及び／または濃度（発現量）を通じて達成することができる。前記ポリペプチドの活性の強化有無は、当該ポリペプチドの活性度、発現量または当該ポリペプチドから排出される産物の量の増加から確認することができる。
【0079】
前記ポリペプチドの活性の強化は、当技野においてよく知られた様々な方法の適用が可能であり、目的のポリペプチドの活性を改変前の微生物より強化させることができる限り、限定されない。具体的には、分子生物学の日常的な方法である当業者の通常の技術者によく知られた遺伝子工学及び／又はタンパク質工学を利用したものであってもよいが、これに限定されない（例えば、Ｓｉｔｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ．Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ．２０１０，Ｖｏｌ．２．１－１６，Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ２０１２など）。
【0080】
具体的には、本出願のポリペプチド活性の強化は、
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に変形；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加；
２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域を活性の強力な配列で交換；
３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形；
４）ポリペプチド活性が強化されるように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列の変形；
５）ポリペプチド活性が強化されるように前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列の変形（例えば、ポリペプチドの活性が強化されるように変形されたポリペプチドをコードするように前記ポリペプチド遺伝子のポリヌクレオチド配列の変形）；
６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリペプチドまたはそれをコードする外来ポリヌクレオチドの導入；
７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化；
８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形するか、または化学的に変形；または
９）前記１）～８）から選択される２以上の組み合わせであってもよいが、これに特に限定されるものではない。
【0081】
より具体的には、
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
前記１）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの細胞内コピー数の増加は、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが作動可能に連結された、宿主とは無関係に複製して機能し得るベクターの宿主細胞内への導入により達成されることであってもよい。または、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、宿主細胞内の染色体内に１コピーまたは２コピー以上の導入により達成されるものであってもよい。前記染色体内への導入は、宿主細胞内の染色体内に前記ポリヌクレオチドを挿入することができるベクターが宿主細胞内に導入されることにより行うことができるが、これらに限定されない。前記ベクターは、前述の通りである。
【0082】
前記２）ポリペプチドをコードする染色体上の遺伝子発現調節領域（または発現調節配列）を活性の強力な配列での交換は、例えば、前記発現調節領域の活性をさらに強化するように欠失、挿入、非保存的または保存的置換またはそれらの組合せにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有する配列への交換であってもよい。前記発現調節領域は、特にこれに限定されないが、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写及び解読の終結を調節する配列などを含んでもよい。一例として、本来のプロモーターを強力なプロモーターと交換させることであってもよいが、これらに限定されない。
【0083】
公知の強力なプロモーターの例としては、ＣＪ１～ＣＪ７プロモーター（米国特許第７６６２９４３号明細書）、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージＰＲプロモーター、ＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ｇａｐＡプロモーター、ＳＰＬ７プロモーター、ＳＰＬ１３（ｓｍ３）プロモーター（米国登録特許第１０５８４３３８号明細書）、Ｏ２プロモーター（米国特許第１０２７３４９１号明細書）、ｔｋｔプロモーター、ｙｃｃＡプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
【0084】
前記３）ポリペプチドをコードする遺伝子転写体の開始コドンまたは５’－ＵＴＲ領域をコードする塩基配列の変形は、例えば、内在的開始コドンに比べてポリペプチド発現率がより高い他の開始コドンをコードする塩基配列で置換することであってもよいが、これらに限定されない。
【0085】
前記４）及び５）のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列の変形は、ポリペプチドの活性を強化するように、前記ポリペプチドのアミノ酸配列またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を欠失、挿入、非保存的または保存的置換、またはこれらの組み合わせにより配列上の変異の発生、またはより強い活性を有するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列または活性が増加するように改良されたアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列への交換であってもよいが、これらに限定されるものではない。前記交換は、具体的には、相同組換えによりポリヌクレオチドを染色体内に挿入することにより行うことができるが、これらに限定されない。このときに使用されるベクターは、染色体の挿入有無を確認するための選別マーカー（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｍａｒｋｅｒ）をさらに含んでもよい。前記選別マーカーは前述の通りである。
【0086】
前記６）ポリペプチドの活性を示す外来ポリヌクレオチドの導入は、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示すポリペプチドをコードする外来ポリヌクレオチドの宿主細胞内の導入であってもよい。前記外来ポリヌクレオチドは、前記ポリペプチドと同一／類似の活性を示す限り、その由来や配列に制限はない。前記導入に用いられる方法は、公知の形質転換方法を当業者が適宜選択して行うことができ、宿主細胞内で前記導入されたポリヌクレオチドが発現されることによりポリペプチドが生成し、その活性が増加されてもよい。
【0087】
前記７）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのコドン最適化は、内在ポリヌクレオチドが宿主細胞内で転写または翻訳が増加するようにコドン最適化したものであるか、または外来ポリヌクレオチドが宿主細胞内で最適化された転写、翻訳が行われるようにそのコドンを最適化したものであってもよい。
【0088】
また、前記８）ポリペプチドの三次構造を分析して露出部位を選択して変形または化学的に修飾することは、例えば、分析しようとするポリペプチドの配列情報を既知のタンパク質の配列情報が格納されたデータベースと比較することにより、配列の類似性の程度にしたがって、鋳型タンパク質候補を決定し、それに基づいて構造を確認し、変形または化学的に修飾する露出部位を選択して変形または修飾することであってもよい。
【0089】
このようなポリペプチド活性の強化は、対応するポリペプチドの活性または濃度発現量が野生型や変形前の微生物菌株で発現されたポリペプチドの活性または濃度を基準にして増加するか、または当該ポリペプチドから生産される産物の量が増加することであってもよいが、これに限定されるものではない。
【0090】
本出願の微生物においてポリヌクレオチドの一部または全部の変形（例えば、上述したタンパク質変異体をコードするための変形）は、（ａ）微生物内の染色体挿入用ベクターを用いた相同組換えまたは遺伝子はさみ（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ，ｅ．ｇ．，ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９）を用いたゲノム編集及び／または（ｂ）紫外線及び放射線などのような光及び／または化学物質の処理により誘発されてもよいが、これらに限定されない。前記遺伝子の一部または全体の変形方法には、ＤＮＡ組換え技術による方法を含むことができる。例えば、目的遺伝子と相同性のあるヌクレオチド配列を含むヌクレオチド配列またはベクターを前記微生物に注入して相同組換え（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）を起こさせるようにして、遺伝子の一部または全体の欠損がなされてもよい。前記注入されるヌクレオチド配列またはベクターは、優性選別マーカーを含んでもよいが、これらに限定されるものではない。
【0091】
より具体的には、本出願のＬ－バリンを生産する微生物は、配列番号２７のアミノ酸配列で記載されたポリペプチド及び／又は配列番号２８の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含む微生物であってもよい。併せて、本出願のＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンを生産する微生物は、配列番号４７のアミノ酸配列で記載されたポリペプチドを含む及び／又は、配列番号４８の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチドを含む；配列番号３７のアミノ酸配列で記載されたポリペプチド不活性及び／又は配列番号３８の核酸塩基配列で記載されたポリヌクレオチド欠損；からなる群から選択される変異を含む微生物であってもよい。
【0092】
本出願の微生物において、変異体及びポリヌクレオチドなどは、上記他の様態で記載した通りである。
【0093】
本出願の他の一つの様態は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドを含むコリネバクテリウム属微生物を培地で培養する段階を含む、Ｌ－アミノ酸生産方法を提供する。
【0094】
本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、本出願の変異体または本出願のポリヌクレオチドまたは本出願のベクターを含むコリネバクテリウム・グルタミカム菌株を培地で培養する段階を含んでもよい。
【0095】
併せて、本出願のＬ－アミノ酸生産方法において、上記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンまたはＬ－メチオニンであってもよい。
【0096】
本出願において、用語「培養」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適切に調節された環境条件で生育させることを意味する。本出願の培養過程は、当業界に知られている適当な培地と培養条件に応じて行うことができる。このような培養過程は、選択される菌株に応じて当業者が容易に調整して使用することができる。具体的には、前記培養は、回分式、連続式及び／または流加式であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【0097】
本出願において、用語「培地」とは、本出願のコリネバクテリウム属微生物を培養するために必要とする栄養物質を主成分として混合した物質を意味し、生存及び発育に不可欠な水をはじめとする栄養物質及び発育因子などを供給する。具体的には、本出願のコリネバクテリウム属微生物の培養に用いられる培地及びその他の培養条件は、通常の微生物の培養に使用される培地であれば、特に制限なくいずれも使用できるが、本出願のコリネバクテリウム属微生物を適当な炭素源、窒素源、リン源、無機化合物、アミノ酸及び／又はビタミンなどを含有する通常の培地内で好気性条件下で温度、ｐＨ等を調節しながら培養することができる。
【0098】
具体的には、コリネバクテリウム属微生物に対する培養培地は、文献［“Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｌ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ” ｂｙ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｄ．Ｃ．，ＵＳＡ，１９８１）］で見ることができる。
【0099】
本出願において、前記炭素源としては、グルコース、サッカロース、ラクトース、フルクトース、スクロース、マルトースなどのような炭水化物；マンニトール、ソルビトールなどのような糖アルコール、ピルビン酸、乳酸、クエン酸などのような有機酸；グルタミン酸、メチオニン、リシンなどのようなアミノ酸などを含むことができる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、ブラックストラップ糖蜜、米ぬか、キャッサバ、バカス及びトウモロコシ浸漬液のような天然の有機栄養源を用いることができ、具体的には、グルコース及び殺菌された前処理糖蜜（すなわち、還元糖に転換された糖蜜）などのような炭水化物を使用することができ、その他の適量の炭素源を制限なく多様に利用することができる。これらの炭素源は、単独で使用しても、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0100】
前記窒素源としては、アンモニア、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、硝酸アンモニウムなどのような無機窒素源；グルタミン酸、メチオニン、グルタミンなどのようなアミノ酸、ペプトン、ＮＺ－アミン、肉類抽出物、酵母抽出物、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、カゼイン加水分解物、魚類またはその分解生成物、脱脂大豆ケーキまたはその分解生成物などのような有機窒素源が使用されてもよい。これらの窒素源は、単独で使用し、２種以上を組み合わせて使用してもよく、これに限定されるものではない。
【0101】
前記リン源としては、リン酸第１カリウム、リン酸第２カリウム、またはそれに対応するナトリウム－含有塩などが含まれてもよい。無機化合物としては、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸マグネシウム、硫酸鉄、硫酸マンガン、炭酸カルシウムなどが使用されてもよく、それ以外にアミノ酸、ビタミン及び／または適切な前駆体などが含まれてもよい。これらの構成成分または前駆体は、培地に回分式または連続式で添加されてもよい。しかし、これに限定されるものではない。
【0102】
また、本出願のコリネバクテリウム・グルタミカム菌株の培養中に水酸化アンモニウム、水酸化カリウム、アンモニア、リン酸、硫酸などのような化合物を培地に適切な方法で添加し、培地のｐＨを調整することができる。また、培養中は脂肪酸ポリグリコールエステルなどのような消泡剤を用いて気泡生成を抑制することができる。また、培地の好気状態を維持するために、培地内に酸素または酸素含有気体を注入したり、嫌気及び微好気状態を維持するために、気体の注入なしに、あるいは窒素、水素または二酸化炭素ガスを注入することができ、これに限定されるものではない。
【0103】
本出願の培養において、培養温度は２０～４５℃、具体的には２５～４０℃を維持することができ、約１０～１６０時間培養することができるが、これに限定されるものではない。
【0104】
本出願の培養により生産されたＬ－アミノ酸は、培地中に分泌されるか、または細胞内に残留する。
【0105】
本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、本出願のコリネバクテリウム属微生物を準備する段階、上記微生物を培養するための培地を準備する段階、またはこれらの組合わせ（順は無関係、ｉｎ ａｎｙ ｏｒｄｅｒ）を、例えば、前記培養段階の前に、さらに含むことができる。
【0106】
本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、上記培養による培地（培養済み培地）または本出願のコリネバクテリウム属微生物からＬ－アミノ酸を回収する段階をさらに含んでもよい。上記回収する段階は、上記培養する段階の後にさらに含むことができる。
【0107】
前記回収は、本出願の微生物の培養方法、例えば、回分式、連続式または流加式培養方法などにより当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて所望のＬ－アミノ酸を収集（ｃｏｌｌｅｃｔ）することであってもよい。例えば、遠心分離、濾過、結晶化タンパク質沈殿剤による処理（塩析法）、抽出、超音波破砕、限外濾過、透析法、分子篩クロマトグラフィー（ゲルろ過）、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなどの各種クロマトグラフィー、ＨＰＬＣまたはそれらの方法を組み合わせて使用することができ、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて培地または微生物から所望のＬ－アミノ酸を回収することができる。
【0108】
また、本出願のＬ－アミノ酸生産方法は、さらに精製段階を含んでもよい。前記精製は、当該技術分野において公知となった適切な方法を用いて行うことができる。一例として、本出願のＬ－アミノ酸生産方法が回収段階と精製段階の両方を含む場合、回収段階及び精製段階は、順序に関係なく連続的または非連続的に行われるか、または同時にまたは一つの段階に統合されて行うことができるが、これに限定されるものではない。
【0109】
併せて、本出願のＬ－メチオニン生産方法は、上記Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンをＬ－メチオニンに転換する段階をさらに含んでもよい。本出願のＬ－メチオニン生産方法において、上記転換する段階は、上記培養する段階または上記回収する段階の後にさらに含むことができる。上記転換する段階は、当該技術分野において公知となった適した方法を用いて行うことができる（米国特許第８４２６１７１号明細書）。一具現例として、本出願のＬ－メチオニン生産方法は、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン、メチルメルカプタン及びＯ－アセチルホモセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏａｃｅｔｙｌｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ）またはシスタチオニン－γ－シンターゼ（ｃｙｓｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ ｇａｍｍａ－ｓｙｎｔｈａｓｅ）またはＯ－スクシニルホモセリンスルフヒドリラーゼ（Ｏ－ｓｕｃｃｉｎｙｌ ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌａｓｅ）を接触させてＬ－メチオニンを生産する段階を含んでもよい。
【0110】
本出願の方法において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター及び微生物などは、上記他の様態で記載した通りである。
【0111】
本出願の他の一つの様態は、本出願の変異体、本出願の変異体をコードするポリヌクレオチドまたは本出願のポリヌクレオチドを含むベクターを含むコリネバクテリウム属微生物；それを培養した培地；あるいは、それらの組み合わせを含むＬ－アミノ酸生産用組成物を提供することである。
【0112】
本出願の組成物は、Ｌ－アミノ酸生産用組成物に通常使用される任意の適切な賦形剤をさらに含むことができ、そのような賦形剤は、例えば、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁化剤、緩衝剤、安定化剤または等張化剤等であってもよいが、これに限定されるものではない。
【0113】
本出願のＬ－アミノ酸生産用組成物において、上記Ｌ－アミノ酸は、Ｌ－バリン、Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリンまたはＬ－メチオニンであってもよい。
【0114】
本出願の組成物において、変異体、ポリヌクレオチド、ベクター、菌株及び培地などは、前記他の態様で記載した通りである。
【発明を実施するための形態】
【0115】
以下、本出願を実験例を通じてより詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、本出願を例示するための好ましい実施様態に過ぎず、従って、本出願の権利範囲をこれに限定することと意図されない。一方、本明細書に記載されていない技術的な事項は、本出願の技術分野または類似技術分野において熟練した通常の技術者であれば、十分に理解して容易に実施することができる。
【0116】
実施例１：クエン酸シンターゼ（ＧｌｔＡ）変異体ベクター製作
本発明者らは、ＧｌｔＡの４１５番目のアミノ酸残基をアセチルｃｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ｃｏＡ）結合位置に見出し、これを他のアミノ酸で置換した時にアセチルｃｏＡのＫｍ値が高くなりながらクエン酸シンターゼ活性が弱化されると予測した。
これについて、上記ＧｌｔＡの４１５番目のアミノ酸であるリシンを他のアミノ酸で置換するベクターを製作した。具体的には、４１５番目のアミノ酸であるリシンをヒスチジン（Ｋ４１５Ｈ）、トリプトファン（Ｋ４１５Ｗ）、そしてグリシン（Ｋ４１５Ｇ）で置換するために変異が含まれたベクターを製作した。
本発明者らは、ＧｌｔＡの４１５番目のアミノ酸残基をアセチルｃｏＡ（ａｃｅｔｙｌ－ｃｏＡ）結合位置に見出し、これを他のアミノ酸で置換した時にアセチルｃｏＡのＫｍ値が高くなりながらクエン酸シンターゼ活性が弱化されると予測した。
これについて、上記ＧｌｔＡの４１５番目のアミノ酸であるリシンを他のアミノ酸で置換するベクターを製作した。具体的には、４１５番目のアミノ酸であるリシンをヒスチジン（Ｋ４１５Ｈ）、トリプトファン（Ｋ４１５Ｗ）、そしてグリシン（Ｋ４１５Ｇ）で置換するために変異が含まれたベクターを製作した。
【0117】
野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７のｇＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型とし、配列番号１５及び１７のプライマー対と配列番号１６及び１８のプライマー対を、配列番号１５及び２０のプライマー対と配列番号１８及び１９のプライマー対を、配列番号１５及び２２のプライマー対と配列番号１８及び２１のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った。上記で得られた６つの断片中、両断片の混合物を鋳型とし、配列番号１５及び配列番号１８のプライマー対を用いて再度オーバーラッピング（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行って３つの断片をそれぞれ得た。ＰＣＲは、９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間行った。ｐＤＣＭ２ベクター（配列番号１４、韓国公開特許第１０－２０２０－０１３６８１３号公報）はｓｍａＩを処理し、上記で得られた３つのＰＣＲ産物をそれぞれフュージョンクローニングした。フュージョンクローニングは、Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ（登録商標）ＨＤクローニングキット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を用いた。クローニング結果として得られたプラスミドをそれぞれｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｗ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｇ）と命名した。本実施例で用いたプライマーの配列は、下記表１に記載した。
【0118】
【表1】
【0119】
実施例２：Ｌ－バリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体導入及び評価
２－１．Ｌ－バリン生産基盤菌株の製作及び評価
野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９のアセトラクテートシンターゼアイソザイム１サブユニット（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ １ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＩｌｖＮ）にそれぞれ１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７］（配列番号２７）を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した（韓国登録特許第１０－１９４７９４５号公報）。
２－１．Ｌ－バリン生産基盤菌株の製作及び評価
野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９のアセトラクテートシンターゼアイソザイム１サブユニット（Ａｃｅｔｏｌａｃｔａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ ｉｓｏｚｙｍｅ １ ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ，ＩｌｖＮ）にそれぞれ１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｊｕｎｅ ２０１４，Ｖｏｌｕｍｅ １９，Ｉｓｓｕｅ ３，ｐｐ ４５６－４６７］（配列番号２７）を導入してＬ－バリン生産能が向上した菌株を製作した（韓国登録特許第１０－１９４７９４５号公報）。
【0120】
具体的には、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７のＤＮＡ（ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ）を鋳型とし、配列番号２９及び３１のプライマー対と配列番号３０及び３２のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った。上記で得られた両断片の混合物を鋳型とし、配列番号２９及び配列番号３２のプライマー対を用いて再度オーバーラッピング（ｏｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ）ＰＣＲを行って３つの断片をそれぞれ得た。ＰＣＲは９４℃で５分間変性後、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、７２℃で１分３０秒を３０回繰り返した後、７２℃で５分間行った。ｐＤＣＭ２ベクターはｓｍａＩを処理し、上記で得られた３つのＰＣＲ産物をそれぞれフュージョンクローニングした。クローニング結果として得られたプラスミドをそれぞれｐＤＣＭ２－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。上記ｐＤＣＭ２－ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９菌株にそれぞれ形質転換させ、染色体上で相同性組換えを誘導した（ｖａｎ ｄｅｒ Ｒｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ５２：５４１－５４５，１９９９）。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。選別されたコリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号３３及び３４のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異が正確に導入されていることを確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖとそれぞれ命名した。本実施例で用いたプライマーの配列は、下記表２に記載した。
【0121】
【表2】
【0122】
その後、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７とＡＴＣＣ１３８６９菌株、上記で製作したＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖ菌株を対象に発酵力価実験を実施した。栄養培地で継代培養された各菌株を生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに接種し、３０℃で７２時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ－バリンの濃度を分析して下記表３に示した。
【0123】
＜栄養培地（ｐＨ７．２）＞
ブドウ糖１０ｇ、肉汁５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブドウ糖１０ｇ、肉汁５ｇ、ポリペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム２．５ｇ、酵母エキス５ｇ、寒天２０ｇ、ウレア２ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0124】
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブドウ糖１００ｇ、硫酸アンモニウム４０ｇ、大豆タンパク質２．５ｇ、トウモロコシ浸漬固形分（Ｃｏｒｎ Ｓｔｅｅｐ Ｓｏｌｉｄｓ）５ｇ、尿素３ｇ、第２リン酸カリウム１ｇ、硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ、ビオチン１００μｇ、チアミンＨＣｌ １ｍｇ、パントテン酸カルシウム２ｍｇ、ニコチンアミド３ｍｇ、炭酸カルシウム３０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0125】
【表3】
【0126】
前記結果から見られるように、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７及び１３８６９菌株と対比してｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）遺伝子変異が導入されたＣＪ７Ｖ及びＣＪ８Ｖ菌株でＬ－バリン生産能が増加したことを確認した。
【0127】
２－２．Ｌ－バリン生産菌株にＧｌｔＡ弱化変異体（Ｋ４１５Ｈ、Ｋ４１５Ｗ、Ｋ４１５Ｇ）の導入及び評価
Ｌ－バリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体を導入してＬ－バリン生産能を評価した。実施例１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｗ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｇ）ベクターを染色体上における相同組換えによりＬ－バリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ、ＣＪ８Ｖ及びＣＡ０８－００７２（ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、米国特許第８４６５９６２号明細書）にそれぞれ形質転換させた。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。
Ｌ－バリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体を導入してＬ－バリン生産能を評価した。実施例１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｗ）、ｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｇ）ベクターを染色体上における相同組換えによりＬ－バリン生産菌株であるＣＪ７Ｖ、ＣＪ８Ｖ及びＣＡ０８－００７２（ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ、米国特許第８４６５９６２号明細書）にそれぞれ形質転換させた。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。
【0128】
その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号２３及び２４のプライマー対（表４）を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じて変異挿入菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム下記のように命名し、実施例２－１と同様の方法で力価評価して下記表５に示した。
【0129】
【表4】
【0130】
【表5】
【0131】
前記結果から見られるように、Ｋ４１５Ｈ変異体の場合、生育の低下なしにＬ－バリン生産能が増加することを確認した。
【0132】
上記ＣＡ０８－００７２：ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）はＣＡ０８－１６８８と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２０年９月２８日付で寄託し、受託番号ＫＣＣＭ１２７９５Ｐの付与を受けた。
【0133】
実施例３：Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産強化菌株の製作及びＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能の評価
３－１ 外来膜タンパク質変異型ＹｊｅＨ導入菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入される、外来膜タンパク質であるとともにＯ－アセチルホモセリン排出タンパク質であるＹｊｅＨ変異体の有効性を判断するために、ＹｊｅＨ変異体（配列番号４７）をコードする遺伝子（配列番号４８）を含む染色体導入ベクターを製作した。
３－１ 外来膜タンパク質変異型ＹｊｅＨ導入菌株の製作
コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２に導入される、外来膜タンパク質であるとともにＯ－アセチルホモセリン排出タンパク質であるＹｊｅＨ変異体の有効性を判断するために、ＹｊｅＨ変異体（配列番号４７）をコードする遺伝子（配列番号４８）を含む染色体導入ベクターを製作した。
【0134】
具体的には、トランスポザーゼ（ｔｒａｎｓｐｏｓａｓｅ）欠損ベクターを製作するために、トランスポザーゼをコードする遺伝子（配列番号３８、遺伝子番号ＮＣｇｌ２３３５）位置を中心に５’上端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号３９及び４０）と３’下端部位を増幅するためのプライマー対（配列番号４１及び４２）を考案した。配列番号３９及び４２のプライマー対は各末端にＸｂａＩ制限酵素部位を挿入し、配列番号４０及び４１のプライマー対は互いに交差するように考案し、この部位に制限酵素ＳｍａＩ配列が位置するようにした。プライマー配列は、下記表６に記載した。
【0135】
【表6】
【0136】
ＡＴＣＣ１３０３２野生型（ＷＴ）の染色体を鋳型として配列番号３９及び４０のプライマー対と配列番号４１及び４２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で３０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ＮＣｇｌ２３３５遺伝子の欠損部位を中心に５’上端部位の８５１ｂｐ ＤＮＡ断片と３’下端部位の８４７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【0137】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号３９及び４２のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒変性、５５℃で３０秒アニーリング、７２℃で９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、トランスポザーゼをコードする遺伝子（配列番号３８、遺伝子番号ＮＣｇｌ２３３５）を欠損可能な部位を含む１６４８ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【0138】
得られたＰＣＲ産物をＳｍａＩ制限酵素処理したｐＤＣＭ２ベクターとインフュージョンＨＤクローニングキットを用いてフュージョンクローニングした。クローニングされたベクターを大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、形質転換された大腸菌をカナマイシン２５ｍｇ／Ｌが含まれたＬＢ固体培地に塗抹した。ＰＣＲを通じて上記目的とした遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選別した後、プラスミド抽出法を用いてプラスミドを獲得し、最終的にＮＣｇｌ２３３５欠損カセットがクローニングされたｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５組換えベクターを製作した。
【0139】
Ｏ－アセチルホモセリン排出タンパク質の有効性を判断するために、大腸菌由来のＹｊｅＨ変異体をコードする遺伝子（配列番号４８）を含む染色体導入ベクターを製作した。このために、ＣＪ７プロモーター（米国特許第７６６２９４３号明細書）を用いてｙｊｅＨ遺伝子を発現するベクターを製作した。ＣＪ７プロモーター部位を増幅するためのプライマー対（配列番号４３及び４４）と大腸菌のｙｊｅＨ部位を増幅するためのプライマー対（配列番号４５及び４６）を考案した。プライマー配列は、下記表７に記載した。
【0140】
【表7】
【0141】
ｐＥＣＣＧ１１７－ＰＣＪ７－ｇｆｐ（米国特許第７６６２９４３号明細書、ｐ１１７－Ｐｃｊ７－ｇｆｐ）を鋳型とし、配列番号４３及び配列番号４４、野生型大腸菌の染色体を鋳型として配列番号４５及び４６のプライマー対を用いてそれぞれＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ＣＪ７プロモーター部位の３６０ｂｐ ＤＮＡ断片と大腸菌のｙｊｅＨ遺伝子部位の１２９７ｂｐのＤＮＡ断片を得た。
【0142】
増幅された２種類のＤＮＡ切片を鋳型とし、配列番号４３及び配列番号４６プライマーでＰＣＲを行った。ＰＣＲ条件は、９５℃で５分間変性後、９５℃で３０秒の変性、５５℃で３０秒のアニーリング、７２℃で９０秒の重合を３０回繰り返した後、７２℃で７分間重合反応を行った。その結果、ＣＪ７プロモーターとｙｊｅＨ遺伝子が導入された部位を含む１６１４ｂｐのＤＮＡ断片が増幅された。
【0143】
上記ＰＣＲを通じて獲得した遺伝子欠損ＤＮＡ断片に制限酵素ＳｍａＩ処理されたｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５ベクターにインフュージョンＨＤクローニングキットを用いてクローニングし、 ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）組換えベクターを製作した。
【0144】
また、変異型ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）遺伝子を導入するための組換えベクターを製作した。
【0145】
具体的には、ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，ＷＴ）プラスミドを鋳型とし、配列番号４９及び配列番号５０のプライマーを用いて、ＹｊｅＨアミノ酸配列の３５１番目のアミノ酸であるフェニルアラニンをロイシンで置換した（Ｆ３５１Ｌ）。製作された変異ＹｊｅＨ（Ｆ３５１Ｌ）をコードする遺伝子を含むプラスミドをｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と命名した。プライマー配列は、下記表８に記載した。
【0146】
【表8】
【0147】
製作されたｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５、ｐＤＣＭ２－△ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）をＡＴＣＣ１３０３２菌株に電気パルス法で形質転換し、２次交差過程を経て染色体上でＮＣｇｌ２３３５遺伝子が欠損したＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）を得た。ＮＣｇｌ２３３５遺伝子欠損及びＹｊｅＨ変異体をコードする遺伝子の挿入有無は、配列番号３９及び４２のプライマー対を用いたＰＣＲ後にＡＴＣＣ１３０３２と比較して最終確認した。
【0148】
３－２．Ｏ－アセチルホモセリン生産能の評価
実施例３－１で製作されたＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２のＯ－アセチルホモセリン（Ｏ－ＡＨ； Ｏ－Ａｃｅｔｙｌ Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）生産能を比較するために、下記のような方法で培養して培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
下記のＯ－アセチルホモセリン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を一白金耳接種し、３３℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析し、分析された濃度は、表９の通りであった。
実施例３－１で製作されたＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５、ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）と野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２のＯ－アセチルホモセリン（Ｏ－ＡＨ； Ｏ－Ａｃｅｔｙｌ Ｈｏｍｏｓｅｒｉｎｅ）生産能を比較するために、下記のような方法で培養して培養液中のＯ－アセチルホモセリンを分析した。
下記のＯ－アセチルホモセリン生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに菌株を一白金耳接種し、３３℃で２０時間、２００ｒｐｍで振盪培養した。ＨＰＬＣを用いてＯ－アセチルホモセリン濃度を分析し、分析された濃度は、表９の通りであった。
【0149】
Ｏ－アセチルホモセリン生産培地（ｐＨ７．２）
ブドウ糖３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、尿素（Ｕｒｅａ）３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ）２．５ｇ、ＣＳＬ（Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ，Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
ブドウ糖３０ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ２ｇ、尿素（Ｕｒｅａ）３ｇ、（ＮＨ４）２ＳＯ４ ４０ｇ、ペプトン（Ｐｅｐｔｏｎｅ）２．５ｇ、ＣＳＬ（Ｃｏｒｎ ｓｔｅｅｐ ｌｉｑｕｏｒ，Ｓｉｇｍａ）５ｇ（１０ｍｌ）、ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ ０．５ｇ、ＣａＣＯ３ ２０ｇ（蒸溜水１リットル基準）
【0150】
【表9】
【0151】
その結果、上記表９のように対照群菌株であるＡＴＣＣ１３０３２を培養時にＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリンが０．３ｇ／Ｌで蓄積され、トランスポザーゼであるＮＣｇｌ２３３５遺伝子を欠損してもＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産には影響がないことを確認した。特に、変異型ｙｊｅＨ遺伝子を発現させた場合、１．０ｇ／Ｌ水準に蓄積されたことを確認した。
【0152】
３－３．Ｏ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体（Ｋ４１５Ｈ）の導入及び評価
実施例３－２のＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体を導入してＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能を評価した。実施例１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）ベクターを染色体上における相同組換えにより野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５とＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産菌株であるＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）にそれぞれ形質転換させた。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。
実施例３－２のＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産菌株にＧｌｔＡ変異体を導入してＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能を評価した。実施例１で製作したｐＤＣＭ２－ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）ベクターを染色体上における相同組換えにより野生型菌株であるＡＴＣＣ１３０３２、ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５とＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産菌株であるＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）にそれぞれ形質転換させた。相同性配列の組換えにより染色体上にベクターが挿入された菌株は、カナマイシン２５ｍｇ／Ｌを含有した培地で選別した。
【0153】
その後、２次組換えが完了した上記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に配列番号２３及び２４のプライマー対を用いたＰＣＲを通じて遺伝子断片を増幅した後、遺伝子配列の分析を通じてｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）変異挿入菌株を確認した。上記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカム下記のように命名し、実施例３－２と同様の方法で力価評価し、下記表１０に示した。
【0154】
【表10】
【0155】
上記結果で見られるように、ＧｌｔＡ Ｋ４１５Ｈ変異体を導入した菌株はいずれもこれを導入していない親株よりＯ－アセチル－Ｌ－ホモセリン生産能が増加することを確認した。
【0156】
上記ＡＴＣＣ１３０３２ △ＮＣｇｌ２３３５：：ＰＣＪ７－ｙｊｅＨ（ｅｃｏ，Ｆ３５１Ｌ）ｇｌｔＡ（Ｋ４１５Ｈ）はＣＭ０４－１００６と命名し、ブダペスト条約下の受託機関である韓国微生物保存センターに２０２０年１０月２１日付で寄託して受託番号ＫＣＣＭ１２８０９Ｐの付与を受けた。
【0157】
以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者であれば、本出願がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施されうることが理解できるだろう。これに関連し、以上で記述した実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本出願の範囲は上記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれるあらゆる変更または変形された形態が本出願の範囲に含まれるものと解釈すべきである。
【0158】
【表11】
【0159】
【表12】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-08-24
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【0028】
本出願において、用語「クエン酸シンターゼ（Ｃｉｔｒａｔｅ ｓｙｎｔｈａｓｅ）」は、微生物の解糖過程で生成されるアセチルＣｏＡとオキサロ酢酸を重合してクエン酸を生成する酵素である。また、上記酵素はアセチルＣｏＡと４－炭素オキサロ酢酸の分子からの２－炭素アセテート残基の縮合反応を触媒して６－炭素クエン酸を形成することができる。本出願の用語「クエン酸シンターゼ」は、クエン酸合成酵素、ＣＳ、ＧｌｔＡタンパク質またはＧｌｔＡで混用され得る。本出願において上記ＧｌｔＡは公知のデータベースであるＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋからその配列を得ることができる。併せて、上記ＧｌｔＡはｇｌｔＡ遺伝子によりコードされるクエン酸シンターゼ活性を有するポリペプチドであってもよいが、これに制限されない。
【国際調査報告】