特表 2024-507984 磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための装置

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-21

(54)【発明の名称】磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための装置

(51)【国際特許分類】

   C12M 1/42 20060101AFI20240214BHJP

   C12M 1/26 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 1/02 20060101ALI20240214BHJP

   C12N 5/09 20100101ALI20240214BHJP

【ＦＩ】

C12M1/42

C12M1/26

C12N1/02

C12N5/09

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023552178

(86)(22)【出願日】2022-02-25

(85)【翻訳文提出日】2023-10-24

(86)【国際出願番号】 CA2022050274

(87)【国際公開番号】W WO2022178643

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/153,456

(32)【優先日】2021-02-25

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/183,350

(32)【優先日】2021-05-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514221779

【氏名又は名称】ザ ガバニング カウンシル オブ ザ ユニバーシティ オブ トロント

(74)【代理人】

【識別番号】110003797

【氏名又は名称】弁理士法人清原国際特許事務所

(72)【発明者】

【氏名】ケリー，シャナ オルウィン

(72)【発明者】

【氏名】ワン，ゾンジェ

(72)【発明者】

【氏名】アーメド，シャリフ

【テーマコード（参考）】

4B029

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B029AA09

4B029BB11

4B029HA02

4B029HA05

4B029HA10

4B065AA93X

4B065BD14

4B065BD50

4B065CA44

4B065CA46

(57)【要約】

細胞収集物流体から磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための、装置、システム、および方法が提供される。装置は、マイクロ磁石のアレイを有する磁石プレート、および磁石プレートに解除自在に結合されたモジュール式チップを含む。モジュール式チップは、フローチャンバおよび複数の流量低減構造を有する。マイクロ磁石のアレイによって生成される磁界が、前記流量低減構造と協働して、それぞれの構造の近傍において捕捉ゾーンを画定する。磁界は、標的細胞に対する抗力を克服して捕捉ゾーンにおいて標的細胞を捕捉することを促進するように十分である。磁石プレートからのモジュール式チップの分離は、捕捉された標的細胞のモジュール式チップからの回収を可能にする。
【選択図】図１

【特許請求の範囲】

【請求項1】

磁気的にタグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から回収するための装置であって、
マイクロ磁石のアレイが中に配置された磁石プレートであって、前記マイクロ磁石のアレイが前記磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレートと、
前記磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合されるモジュール式チップであって、前記モジュール式チップが、
入口および出口を有するフローチャンバ、ならびに
前記フローチャンバ内の複数の流量低減構造であって、各構造が捕捉表面の近傍の流量を低減するように成形された捕捉表面を備え、前記マイクロ磁石のアレイによって生成される磁界が、前記流量低減構造と協働して、前記流量低減構造のそれぞれの近傍において対応の捕捉ゾーンを画定する、流量低減構造を有し、
前記磁界が、前記捕捉ゾーンにおいて、前記標的細胞に対する抗力を克服して、前記捕捉ゾーンにおいて前記細胞収集物から標的細胞を捕捉するのを促進するほど十分に高く、および
前記磁石プレートからの前記モジュール式チップの分離が、捕捉された前記標的細胞の前記モジュール式チップからの分離および回収を可能にする、モジュール式チップと
を備える、装置。

【請求項2】

前記モジュール式チップは、ガラス基部とチャンバ壁を備え、前記チャンバ壁とガラス基部は前記フローチャンバを形成し、前記チャンバ壁と前記複数の流量低減構造は、前記ガラス基部から延在する、請求項１に記載の装置。

【請求項3】

前記チャンバ壁と前記複数の流量低減構造は、ＰＤＭＳ製である、請求項２に記載の装置。

【請求項4】

前記ガラス基部は０．０５～０．５ｍｍの間の厚さである、請求項２または３に記載の装置。

【請求項5】

前記ガラス基部は０．１ｍｍ未満の厚さである、請求項４に記載の装置。

【請求項6】

前記ガラス基部はＰＤＭＳでコーティングされる、請求項２から５のいずれか一項に記載の装置。

【請求項7】

前記ガラス基部は長さ７５ｍｍおよび幅５０ｍｍである、請求項２から６のいずれか一項に記載の装置。

【請求項8】

前記複数の流量低減構造のそれぞれの高さは、５０ミクロン～８００ミクロンの間である、請求項１から７のいずれか一項に記載の装置。

【請求項9】

層流が維持される場合、前記複数の流量低減構造のそれぞれの高さは８００ミクロンである、請求項８に記載の装置。

【請求項10】

磁気的にタグ付けされた標的細胞を細胞収集物から回収するためのシステムであって、
マイクロ磁石のアレイが中に配置された磁石プレートであって、前記マイクロ磁石のアレイが前記磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレートと、
前記磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合される１つ以上のモジュール式チップであって、それぞれが、
入口および出口を有するフローチャンバ、ならびに
前記フローチャンバ内の複数の流量低減構造であって、各構造が、捕捉表面の近傍の流量を低減するように成形された捕捉表面を備え、前記マイクロ磁石のアレイによって生成される磁界が、前記流量低減構造と協働して、前記流量低減構造のそれぞれの近傍において対応の捕捉ゾーンを画定する、流量低減構造を有し、
ここで前記磁界が、前記捕捉ゾーンにおいて、前記標的細胞に対する抗力を克服して、前記捕捉ゾーンにおいて前記細胞収集物から標的細胞を捕捉するのを促進するほど十分に高く、および
前記磁石プレートからの前記モジュール式チップの分離が、捕捉された前記標的細胞の前記モジュール式チップからの分離および回収を可能にする、１つ以上のモジュール式チップと、
前記磁石プレートを保持するように構成されたスキャフォールドと
を備える、システム。

【請求項11】

前記磁石プレートは、前記スキャフォールドの中へ組み込まれる、請求項１０に記載のシステム。

【請求項12】

前記磁石プレートは、前記スキャフォールドに解除自在に固定可能である、請求項１０に記載のシステム。

【請求項13】

前記１つ以上のモジュール式チップが、第１のモジュール式チップと第２のモジュール式チップを備える、請求項１０から１２のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項14】

前記第１のモジュール式チップは、前記磁石プレートの第１の部分に対して覆うように解除自在に結合され、前記第２のモジュール式チップは、前記磁石プレートの第２の部分に対して覆うように解除自在に結合される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項15】

前記磁石プレートは、第１の磁石プレートと第２の磁石プレートを備え、前記第１のモジュール式チップが、前記第１の磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合され、前記第２のモジュール式チップが、前記第２の磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合される、請求項１３に記載のシステム。

【請求項16】

前記第１の磁石プレートと前記第２の磁石プレートは、前記スキャフォールド内で平行に配置される、請求項１５に記載のシステム。

【請求項17】

前記スキャフォールドは、前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップのそれぞれの一端の近傍に配置された第１のコネクタ、ならびに、前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップのそれぞれの他端の近傍に配置された第２のコネクタをさらに備え、前記第１のコネクタおよび前記第２のコネクタが、それぞれの対応する前記第１のモジュール式チップまたは前記第２のモジュール式チップの、対応する前記入口および前記出口に流体接続可能である、請求項１３から１６のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項18】

前記第１のモジュール式チップと前記第２のモジュール式チップは、前記細胞収集物の供給源に対して平行に流体接続される、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項19】

前記第１のモジュール式チップと前記第２のモジュール式チップが直列に流体接続され、前記第１のモジュール式チップの前記出口が前記第２のモジュール式チップの前記入口と直接流体連通している、請求項１３から１７のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項20】

前記第１のモジュール式チップと前記第２のモジュール式チップのそれぞれにおける、前記複数の流量低減構造の高さが、同じである、請求項１３から１９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項21】

前記第１のモジュール式チップと前記第２のモジュール式チップのそれぞれにおける複数の流量低減構造の高さが、１００ミクロンである、請求項２０に記載のシステム。

【請求項22】

前記第１のモジュール式チップ内の前記複数の流量低減構造の高さが、前記第２のモジュール式チップ内の前記複数の流量低減構造の高さとは異なる、請求項１３から１９のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項23】

前記第１のモジュール式チップ内の前記複数の流量低減構造の高さが、第２のモジュール式チップ内の複数の流量低減構造の高さより低い、請求項２２に記載のシステム。

【請求項24】

前記１つ以上のモジュール式チップが第３のモジュール式チップをさらに含み、前記第３のモジュール式チップは、前記磁石プレートの第３の部分に対して覆うように解除自在に結合される、請求項１３から２３のいずれか一項に記載のシステム。

【請求項25】

磁気的にタグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から回収するための方法であって、
磁気的にタグ付けされた細胞収集物流体を装置の中へ導入する工程であって、該装置が、マイクロ磁石のアレイが中に配置された磁石プレートであって、前記マイクロ磁石のアレイが前記磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレート、ならびに、前記磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合されるモジュール式チップであって、複数の流量低減構造を有するフローチャンバを有し、前記磁気的にタグ付けされた標的細胞が、磁気引力に対する感度が高く、前記フローチャンバを通って移動する際に前記流量低減構造によって捕捉される、モジュール式チップを備える、工程と、
前記装置から非標的細胞を洗い流す工程と、
前記磁石プレートから前記モジュール式チップを分離する工程と、
前記モジュール式チップから前記磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程と
を含む方法。

【請求項26】

患者からの腫瘍試料を前記細胞収集物流体中の単一細胞に溶解する工程と、前記導入する工程の前に、前記単一細胞を磁性粒子で標識する工程とをさらに含む、請求項２５に記載の方法。

【請求項27】

前記細胞収集物流体は、末梢血、血管新生腫瘍、悪性胸水、リンパ液、骨髄の流体部分、または別の細胞運搬流体に由来する、請求項２５に記載の方法。

【請求項28】

前記細胞収集物流体は、６～３２ｍＬ／時間の流量で前記装置の前記フローチャンバに導入される、請求項２５から２７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項29】

前記流量は１６ｍＬ／時間である、請求項２８に記載の方法。

【請求項30】

前記流量は３２ｍＬ／時間である、請求項２８に記載の方法。

【請求項31】

前記洗い流す工程は、シリンジを用いてフラッシング流体を前記装置の中に導入することを含む、請求項２５から３０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項32】

磁気的にタグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から回収するための方法であって、
前記磁気的にタグ付けされた標的細胞を含有する前記細胞収集物流体を請求項１９のシステムの中に、第１のモジュール式チップの入口を通して導入し、前記第１のモジュール式チップの出口から第２のモジュール式チップの入口の中に流体試料を導く工程と、
前記システムから非標的細胞を洗い流す工程と、
磁石プレートから前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップを分離する工程と、
前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップから、前記磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程と
を含む方法。

【請求項33】

磁気的にタグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から回収するための方法であって、
前記磁気的にタグ付けされた標的細胞を含有する前記細胞収集物流体を請求項１８のシステムの中に、第１のモジュール式チップの入口および第２のモジュール式チップの入口を通して導入する工程と、
前記システムから非標的細胞を洗い流す工程と、
磁石プレートから前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップを分離する工程と、
前記第１のモジュール式チップおよび前記第２のモジュール式チップから、前記磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程と
を含む方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、概して、細胞の集合から細胞を回収するための装置に関する。特に、本開示は、フローチャンバ内で磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するために磁気を使用する装置に関する。

【背景技術】

【0002】

腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、循環系を出て腫瘍組織に遊走した白血球のサブセットである^１。ＴＩＬは、腫瘍死滅プロセスに関与し、腫瘍中のＴＩＬの存在は、治療後のより良好な臨床転帰と関連することが多い^２。腫瘍の死滅におけるそれらの効力のために、ＴＩＬは、癌を治療するための養子細胞療法（ＡＣＴ）に首尾よく使用されており、高度に免疫原性の腫瘍、特に黒色腫の管理において顕著な成功を達成した。

【0003】

臨床における成功にもかかわらず、長引くターンアラウンド時間は、ＴＩＬベースのＡＣＴの適用を有意に制限する。これまでのところ、ＴＩＬベースのＡＣＴの典型的なリードタイムは、６～１４週で変動し^３、ＴＩＬの成長および増殖は、リードタイムの８０％を占める^４～６。治療用量のＴＩＬを生成するためのこのアプローチは、ＴＩＬベースのＡＣＴの総費用を患者あたり＞８５，０００ドルに劇的に増加させる^７。より効果的なＴＩＬ単離／増殖が、その実用性および臨床的採用に大いに利益をもたらし得ることは、よく受け入れられている。さらに、約２０％の患者が、ＴＩＬ製造の完了前に臨床的に悪化する^９。より速いＴＩＬ製造プロセスは、潜在的に、これらの患者に対してより良好な結果を提供し得る。さらに、いくつかの研究は、長引く増殖がＴＩＬの表現型および効力を変更し得ることを示唆している^{１０，１１}。インビトロで最小限の培養および選択を受けたＴＩＬは、インビボで使用した場合、より高いレベルの抗原反応性および活性化を示した^１２。まとめると、元の供給源から多数の非常に強力なＴＩＬを効率的に生成し、単離後の処理を最小限に抑える方法を確立することが非常に望ましい。

【0004】

増殖後のＴＩＬの量は、２つの主要な因子、増殖速度および細胞の初期量に依存する。ＴＩＬの増殖状態を最適化することについてはかなりの努力がなされてきたが^{１３，１４}、腫瘍から単離されたＴＩＬの初期量を増加させることについては、非常に限られた研究しか行われてこなかった。ＣＤ８^＋ＴＩＬは患者における腫瘍拒絶の主要な駆動因子であるため、ＣＤ８^＋などのＴＩＬ亜集団の濃縮は、ＴＩＬの反応性^１５および特異性^１６を改善することができる^１７。研究において、消化した腫瘍組織からのＴＩＬの濃縮は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）^{１８～２０}または磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いて達成されてきたが、これらのアプローチのいずれも、臨床応用でＴＩＬを単離するために使用されていない^{２１，２２}。ＦＡＣＳは、しばしば、不良な液滴形成または走査誤差のために、細胞の５０～７０％を失う^{２３，２４}。この低レベルの回収は、ＴＩＬの著しい損失をもたらし、および下流の増殖プロセスの障害となる可能性がある。さらに、ＭＡＣＳはＦＡＣＳよりも良好な回収率を有するが^２４、このカラムベースのアプローチは死細胞およびデブリを捕捉し^２５、白血球を含む小細胞の不十分な濃縮につながる^{２６，２７}。

【0005】

マイクロ流体ベースのアプローチは、高い特異性および感度を有する細胞選別に使用されている^{２８，２９}。循環腫瘍細胞^{３０，３１}、抗原特異的Ｔ細胞^{３２，３３}、および混入腫瘍原性細胞^３４などの様々な哺乳動物細胞の単離、回収、および分析に広く適用されている。しかしながら、既存のプラットフォームは、妥当なコストで容積的な、高回収率の、高純度の細胞選別を必要とするＴＩＬ単離に適していない。

【発明の概要】

【0006】

いくつかの例において、本開示は、タグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から磁気的に回収するための装置を記載し、該装置は、マイクロ磁石のアレイが中に配置された磁石プレートであって、マイクロ磁石のアレイが磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレートと、磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合されるモジュール式チップであって、該モジュール式チップが、入口および出口を有するフローチャンバ、ならびに、フローチャンバ内の複数の流量低減構造であって、各構造が捕捉表面の近傍の流量を低減するように成形された捕捉表面を備え、マイクロ磁石のアレイによって生成される磁界が、流量低減構造と協働して流量低減構造のそれぞれの近傍において対応の捕捉ゾーンを画定し、ここで磁界が、捕捉ゾーンにおいて、標的細胞に対する抗力を克服して細胞収集物からの標的細胞の捕捉を促進するのに十分に高く、および、ここで磁石プレートからのモジュール式チップの分離が、捕捉された標的細胞のモジュール式チップからの分離および回収を可能にする、モジュール式チップとを備える。

【0007】

いくつかの例において、本開示は、細胞収集物から磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するためのシステムを記載し、該システムは、マイクロ磁石のアレイが中に配置された磁石プレートであって、マイクロ磁石のアレイが磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレートと、磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合される１つ以上のモジュール式チップであって、１つ以上のモジュール式チップのそれぞれが、入口および出口を有するフローチャンバ、ならびにフローチャンバ内の複数の流量低減構造であって、各構造が捕捉表面の近傍において流量を低減するように成形された捕捉表面を備えた、流量低減構造を有し、マイクロ磁石のアレイによって生成される磁界が、流量低減構造と協働して流量低減構造のそれぞれの近傍において対応の捕捉ゾーンを画定する、モジュール式チップとを備え、ここで磁界が、捕捉ゾーンにおいて、標的細胞に対する抗力を克服して細胞収集物からの標的細胞の捕捉を促進するのに十分に高く、および、ここで磁石プレートからのモジュール式チップの分離が、捕捉された標的細胞のモジュール式チップからの分離および回収を可能にする、モジュール式チップと、磁石プレートを保持するように構成されたスキャフォールドとを備える。

【0008】

いくつかの例において、本開示は、タグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から磁気的に回収するための方法を記載し、該方法は、磁気的にタグ付けされた細胞収集物流体を装置の中へ導入する工程であって、該装置が、マイクロ磁石のアレイが中に配置された、磁石プレートあって、マイクロ磁石のアレイが磁石プレートに沿って磁界を生成する、磁石プレート、ならびに、モジュール式チップが磁石プレートに対して覆うように解除自在に結合されるモジュール式チップであって、複数の流量低減構造を有するフローチャンバを有し、磁気的にタグ付けされた標的細胞が、磁気引力に対する感度が高く、フローチャンバを通って移動する際に流量低減構造によって捕捉される、モジュール式チップを備える、工程と、装置から非標的細胞を洗い流す工程と、磁石プレートからモジュール式チップを分離する工程と、モジュール式チップから磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程とを含む。

【0009】

いくつかの例において、本開示は、タグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から磁気的に回収するための方法を記載し、該方法は、磁気的にタグ付けされた標的細胞を含有する細胞収集物流体を、本明細書に記載されるとおりのシステムの中に、第１のモジュール式チップの入口を通して導入し、第１のモジュール式チップの出口から第２のモジュール式チップの入口の中へと流体試料を導く工程と、システムから非標的細胞を洗い流す工程と、磁石プレートから第１のモジュール式チップおよび第２のモジュール式チップを分離する工程と、第１のモジュール式チップおよび第２のモジュール式チップから磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程とを含む。

【0010】

いくつかの例において、本開示は、タグ付けされた標的細胞を細胞収集物流体から磁気的に回収するための方法を記載し、該方法は、磁気的にタグ付けされた標的細胞を含有する細胞収集物流体を、本明細書に記載されるとおりのシステムの中に、第１のモジュール式チップの入口および第２のモジュール式チップの入口を通して導入する工程と、システムから非標的細胞を洗い流す工程と、磁石プレートから第１のモジュール式チップおよび第２のモジュール式チップを分離する工程と、第１のモジュール式チップおよび第２のモジュール式チップから磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収する工程とを含む。

【0011】

磁石プレートから分離するモジュール式チップの能力は、開示される装置、システム、および方法におけるスループットを改善するのに役立ち、選別後にモジュール式チップから細胞を除去する際の容易さを増加させる。解除自在な結合はまた、システムがフィールドプログラマブルであることを可能にし、すなわち、異なる選別用途のために構成を変更し、それを目的に適合させる際の柔軟性を可能にする。例えば、磁石プレートへのモジュール式チップの解除自在な結合は、エンドユーザによってシステムが直列構成と並列構成との間で交換可能であることを可能にする。モジュール式チップおよび磁石プレートが別個の構成要素であるという事実はまた、従来のリソグラフィを使用する代わりに、３Ｄ印刷および／または射出成形を使用して、モジュール式チップがより迅速かつ安価に製作されることを可能にする。このことはまた、衛生的な使い捨てシステムを可能にするのに有益であり得、低コストの大量３Ｄ印刷プロセスが使い捨てモジュール式チップを製作するために使用され得、それはヘルスケア環境において特に望ましい場合がある。

【図面の簡単な説明】

【0012】

ここで、例として、本出願の例示的な実施形態を示す添付の図面を参照する。

【0013】

【図1】細胞収集物から標的細胞を磁気回収するための、異なるチャネル厚さを有する、分解された例示的装置の説明図である。

【図2】図２ａは、本開示の一実施形態による、細胞収集物から標的細胞を磁気回収するためのシステムにおいて平行に接続された、組み立てられた図１の装置の例示的な図である。図２ｂは、本開示の別の実施形態によるシステムにおいて直列に接続された、組み立てられた図１の装置の例示的な図である。

【図3】分解された図１の例示的装置の写真である。

【図4】組み立てられた図２ａのシステムの写真である。

【図5】図５ａは、本開示の他の実施形態による、組み立てられた図３の装置の写真である。図５ｂは、図５ａの部分Ａの拡大図である。

【図6】図５ａの装置のそれぞれにおけるＸの部分の拡大斜視図である。

【図7】養子細胞療法において使用するための腫瘍試料からの磁気的にタグ付けされた標的細胞の回収のための例示的な方法の概略図である。

【図8】図２ａまたは２ｂの装置を用いて細胞収集物から標的細胞を回収するための例示的な方法の工程を示すフローチャートである。

【図9】図５ａおよび図６から、異なる高さを有する装置内の、シミュレートされた流速分布（カラーバーの単位（ｍｍ・ｓ－１））を示す。

【図10】図９のシミュレートされた流速の定量化を示す。

【図11】磁気的にタグ付けされた標的細胞がどのように非標的細胞から分離され得るかの図解である。

【図12】図２ａまたは２ｂのシステムを用いて細胞収集物から標的細胞を回収するための例示的な方法の工程を示すフローチャートである。

【図13】図１３ａは、磁気的にタグ付けされた標的ＴＩＬを回収するために使用される図２ａのシステムの図解である。図１３ｂは、図１３ａからの、回収されたＴＩＬのサブセットＣＤ８^＋ＴＩＬを回収するために使用される図２ｂのシステムの図解である。

【図14】図１４ａ、１４ｂ、および１４ｃは、バイナリーマイクロ流体細胞選別と市販のカラムベースの磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）との間の比較を示す。（１４ａ）陽性および陰性濃縮に用いたＫ５６２およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞の典型的なＣＤ４５プロファイルである。（１４ｂ）陽性濃縮中の捕捉性能の定量化である。凡例は、各ランに使用した細胞数を示す。（１４ｃ）陰性濃縮中の捕捉性能の定量化である。凡例は、各ランに使用した細胞数を示す。

【図15】図１５ａ、１５ｂ、および１５ｃは、定量的マイクロ流体細胞選別と市販のカラムベースの磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）との間の比較を示す。（１５ａ）ＰＣ－３Ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＵ９３７細胞の典型的なＣＤ３２６プロファイルである。（１５ｂ）定量的マイクロ流体細胞選別および推定捕捉カットオフの捕捉プロファイルの定量化である。（１５ｃ）バイナリＭＡＣＳ選別およびその推定捕捉カットオフの捕捉プロファイルの定量化である。

【図16】図１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、および１７は、ＣＤ４またはＣＤ８に基づいてＴＩＬを選別するための流量の最適化を示し、（１６ａ）は、純粋なヒトＣＤ４Ｔ細胞、純粋なＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞にスパイクされた１％ＣＤ４Ｔ細胞の典型的なフローサイトメトリープロファイルである。ＣＤ４はＭＮＰによって占有されたため、ＡＰＣとコンジュゲートしたＣＤ４５を使用して純度を確認した。（１６ｂ）は、異なる流量下での精製されたスパイクイン試料の典型的なフローサイトメトリープロファイルである。ヒトＣＤ４の最適な流量は３２ｍＬ／時間である。（１６ｃ）は、異なる流量下での精製されたスパイクイン試料の典型的なフローサイトメトリープロファイルである。マウスＣＤ８の最適な流量は１６ｍＬ／時間である。

【図17】図１６ａ、１６ｂ、１６ｃ、および１７は、ＣＤ４またはＣＤ８に基づいてＴＩＬを選別するための流量の最適化を示し、（１７）は、０．１％および１％スパイクイン試料（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるヒトＣＤ４およびＢ１６Ｆ１０におけるマウスＣＤ８）を単離するためのＦＡＣＳ／ＭＡＣＳ／ＭＡＧＩＣの純度の間の定量的比較である。

【図18】図１８および図１９は、０．１％および１％スパイクイン試料（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるヒトＣＤ４およびＢ１６Ｆ１０におけるマウスＣＤ８）から精製したＴ細胞集団の典型的なサイトメトリーヒストグラムおよび回収効率の定量化である。

【図19】図１８および図１９は、０．１％および１％スパイクイン試料（ＭＤＡ－ＭＢ－２３１におけるヒトＣＤ４およびＢ１６Ｆ１０におけるマウスＣＤ８）から精製したＴ細胞集団の典型的なサイトメトリーヒストグラムおよび回収効率の定量化である。

【図20】異なる選別技術によって誘導された細胞ストレスを比較する円グラフである。

【図21】ＴＩＬ単離のためのマウス黒色腫モデルのワークフローを示す。

【図22】図２２および図２３は、単離後のＤ４における典型的なサイトメトリープロットと、ＴＩＬの純度および回収率の定量である。ＴＩＬをＣＤ８＋／ＣＤ４５＋集団と定義した。純粋なＢ１６細胞およびＣＤ８＋脾細胞を陰性および陽性対照として使用した。分析を４日目に行って、ＣＤ８－ＭＮＰを分解させ、蛍光標識のためにＣＤ８エピトープを再発現させた。

【図23】図２２および図２３は、単離後のＤ４における典型的なサイトメトリープロットと、ＴＩＬの純度および回収率の定量である。ＴＩＬをＣＤ８＋／ＣＤ４５＋集団と定義した。純粋なＢ１６細胞およびＣＤ８＋脾細胞を陰性および陽性対照として使用した。分析を４日目に行って、ＣＤ８－ＭＮＰを分解させ、蛍光標識のためにＣＤ８エピトープを再発現させた。

【図24】バルクＴＣＲ配列決定を用いたＣＤＲ３発現に基づくＴＩＬ集団内の固有のクローン型の決定およびシャノン多様性指数を示すグラフである。

【図25】ヒトＮＳＣＬＣ患者からＴＩＬを単離するためのＦＡＣＳ／ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳの回収の定量化を示すグラフである。

【図26】血球計算器を用いた標準計数からの、異なる方法によって単離されたＴＩＬの増殖曲線を示すグラフである。

【図27】１４日間の増殖後のＭＡＧＩＣ－ＴＩＬの典型的なＣＤ４５ＲＡ／ＣＣＲ７プロファイルを示す。

【図28】ＴａｑＭａｎマイクロアレイを用いた、血液中のＣＤ８ Ｔ細胞と比較したＴＩＬの相対的ｍＲＮＡ発現の定量化を示す。増殖、活性化、細胞傷害性および免疫応答関連経路における上方制御が観察された（ＮＦｋＢおよびＪＡＫ－ＳＴＡＴ）。ＭＡＧＩＣ ＴＩＬは、ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ ＴＩＬと比較して、ＩＦＮＧ、ＧＺＭＢ、ＮＦＫＢファミリーおよびＳＴＡＴファミリーなどの免疫応答のコア遺伝子のより顕著な上方制御を有する。

【図29】ｌｏｇ２（ＦＣ）＞１．５の遺伝子セットを用いた経路濃縮を示すグラフである。Ｔ細胞増殖、活性化、細胞傷害性、ならびにＮＦｋＢ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、およびＴＮＦ経路において正のレギュレーションが起こった可能性が非常に高い。より高い（－ｌｏｇ１０（Ｐ）スコアは、対応する経路が関与する可能性がより高いことを意味する。

【図30】インビトロでのＢ１６Ｆ１０^{ＯＶＡ－ＧＦＰ}細胞に対するＴＩＬの細胞毒性を示すグラフである。ＭＡＧＩＣ ＴＩＬは、インビトロでより高い殺傷効力を有する。

【図31】インビトロ死滅アッセイから収集した上清のサイトカインプロファイルである。非ＴＩＬ対照と比較して、ＴＩＬの存在は、抗原提示、単球動員および抗血管新生に関与するいくつかのサイトカイン／ケモカインの分泌を促進する。ＲＮＡレベルと同様に、ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ ＴＩＬと比較してＭＡＧＩＣ ＴＩＬにおいてＩＦＮのより有意な分泌が観察された。

【図32】１４日間増殖させたＴＩＬの治療有効性を比較するシナリオ１試験のワークフローを示す。マウスあたりのＭＡＧＩＣ、ＭＡＣＳ、およびＦＡＣＳについて、Ｄ１４上の利用可能なＴＩＬの数は、２×１０^６、５×１０^５、および５×１０^４である。

【図33】１８日目の各群の典型的な腫瘍サイズを示す。

【図34】ＭＡＧＩＣ、ＭＡＣＳ、およびＦＡＣＳによって単離されたＴＩＬによって処置された腫瘍サイズおよび生存曲線の定量化を示すグラフである（ｎ＝５）。（最大数の利用可能なＴＩＬを各群に注射した）。ログランク検定を使用して統計的有意性を決定した。

【図35】異なる用量（ｎ＝５）下でＭＡＧＩＣ－ＴＩＬにより処置された腫瘍サイズおよび生存曲線の定量化を示すグラフである。ログランク検定を使用して統計的有意性を決定した。

【図36】同じ用量（５×１０^５、ｎ＝５）下でのＭＡＧＩＣおよびＭＡＣＳ ＴＩＬの治療有効性と、同じ用量（５×１０^４、ｎ＝５）下でのＭＡＧＩＣおよびＦＡＣＳ ＴＩＬの治療有効性の比較を示すグラフである。

【図37】シナリオ２の研究のワークフローを示し、最適投与量約５×１０^５で、異なる方法によって単離されたＴＩＬの治療有効性を最も早い時点で比較する（ＭＡＧＩＣについてはＤ５、ＭＡＣＳについてはＤＩＯ、ＦＡＣＳについてはＤ１５、ＦＡＣＳについては、マウスのマウスが大きな腫瘍を発症する前に所望の濃度に達しないので、より少数（５×１０^４）のＴＩＬを注射した）。

【図38】１８日目の各群の典型的な腫瘍サイズを示す。

【図39】ＭＡＧＩＣ、ＭＡＣＳ、およびＦＡＣＳによって単離されたＴＩＬによって処置された腫瘍サイズおよび生存曲線の定量化を示すグラフである（ｎ＝５、^＊＊ｐ＜０．０１）。ログランク検定を使用して統計的有意性を決定した。

【図40】固形腫瘍における浸潤Ｔ細胞の典型的な画像（青色：核、赤色：ＣＤ８ａ、褐色：メラニン）、ならびにＭＡＧＩＣ、ＭＡＣＳ、およびＦＡＣＳ ＴＩＬによって処置された腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬの数／面積被覆率の定量化である（ｎ＝３、腫瘍あたり５スライス）。

【図41】ＣＤ８ ＴＩＬにおけるＣＤ３９に基づく定量的選別のためのマウス結腸癌モデルＭＣ－３８のワークフローを示す。

【図42】バルクＣＤ８ ＴＩＬ集団におけるＣＤ３９発現の典型的なサイトメトリープロファイルおよびＣＤ３９媒介定量的選別からの選別細胞の特徴付けを示す。

【図43】バルクＣＤ８ ＴＩＬと比較した異なるＣＤ３９集団の相対的ｍＲＮＡ発現の定量化を示す。

【図44】Ｋｉ６７発現に基づく細胞増殖の典型的なサイトメトリープロファイルおよび定量である。

【図45】インビトロでのＭＣ－３８細胞に対するＴＩＬの細胞毒性を示すグラフである。

【図46】ＣＤ３９発現に基づく定量的ＭＡＧＩＣによって単離されたＴＩＬの異なる集団の治療有効性を比較する動物研究のワークフローを示す。

【図47】２１日目の各群の典型的な腫瘍サイズを示す。

【図48】異なるＣＤ３９発現を有するＴＩＬによって処置された腫瘍サイズの定量化を示すグラフである（ｎ＝５～１０）。ログランク検定を使用して統計的有意性を決定した。

【図49】異なる精製度を有するＴＩＬによって処置された腫瘍サイズの定量化を示すグラフである（未選別、ＣＤ８で選別、ＣＤ８およびＣＤ３９で選別、ｎ＝５～１０）。ログランク検定を使用して統計的有意性を決定した。

【図50】図５０ａは、構成可能なマイクロ流体細胞選別の提案された作動原理の実験的検証を示し、実験は、抗ＣＤ４５ ＭＮＰによって標識され、かつカルセインＡＭによって染色されたＫ５６２細胞を使用して実施された。画像は、異なる捕捉設定を有する装置の典型的な顕微鏡画像である。磁気標識細胞と適切な外部磁石との組み合わせのみが、所望の捕捉ポケットでの効率的な細胞捕捉をもたらした。図５０ｂは、異なる動作段階における装置の典型的な顕微鏡画像である。磁石を除去した後、捕捉された細胞のほぼ１００％をチップから回収することができ、これは細胞選別中に優れた回収効率を与えた。

【図51】図５１、５２、５３、および５４は、Ｂ１６Ｆ１０の黒色腫モデルにおけるＣＤ８＋ＴＩＬの単離およびクローン型化を例示し、ここで図５１は、ＣＤ８＋ＴＩＬのＦＡＣＳ単離のために使用された代表的なゲーティング戦略を例示する。

【図52】図５１、５２、５３、および５４は、Ｂ１６Ｆ１０の黒色腫モデルにおけるＣＤ８＋ＴＩＬの単離およびクローン型化を例示し、ここで図５２は、異なるアプローチによる分離されたＣＤ８＋ＴＩＬからのＶおよびＪ遺伝子の使用を例示する。すべてのアプローチにおいて遺伝子の同様の濃縮が見られ、分離されたＴＩＬの同様の起原および表現型を示した。

【図53】図５１、５２、５３、および５４は、Ｂ１６Ｆ１０の黒色腫モデルにおけるＣＤ８＋ＴＩＬの単離およびクローン型化を例示し、ここで図５３は、異なるアプローチによって分離されたＣＤ８＋ＴＩＬのＶＪ対合状態を例示する。

【図54】図５１、５２、５３、および５４は、Ｂ１６Ｆ１０の黒色腫モデルにおけるＣＤ８＋ＴＩＬの単離およびクローン型化を例示し、図５４はＶＪ対合状態の定量化を例示する。高回収率のアプローチは、ＴＩＬのまれなクローンを分離することができ、それらの複雑さと多様性をよりよく維持した。

【図55】図５５および５６は、ヒトＮＳＣＬＣ試料についての異なる選別技術の比較を示し、図５５は選別前後の典型的なサイトメトリープロファイルを示し、図５６は、ＦＡＣＳ／ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳの純度の定量化を示す。

【図56】図５５および５６は、ヒトＮＳＣＬＣ試料についての異なる選別技術の比較を示し、図５５は選別前後の典型的なサイトメトリープロファイルを示し、図５６は、ＦＡＣＳ／ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳの純度の定量化を示す。

【図57】図５７は、相対的な発現を示し、上の図は経路の濃縮を示し、下の図は特定の経路による免疫関連遺伝子を示す。脾臓由来の活性化ＣＤ８^＋Ｔ細胞を内部参照として使用した。

【図58】図５８ａ、５８ｂ、５９ａ、および５９ｂは、養子細胞療法を受けた腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬの定量化を示し、図５８ａは、ランダムフォレストベースの腫瘍分類子がユーザ定義の腫瘍／ストローマ／ガラス領域によって訓練されたことを示す。次いで、訓練された分類子を適用して、全スライドセグメント化を実施して、腫瘍を同定した。間質およびガラス領域を下流分析において除外した。図５８ｂは、重ね合わされた明視野画像をＣｙｔｏＮｕｃｌｅａｒアルゴリズムによって分解して、ヘマトキシリン（青色）、ワープレッドおよび褐色のチャネルを再構築したことを示す。分解画像を使用して、閾値処理によって各チャネルの陽性面積を計算した。

【図59】図５８ａ、５８ｂ、図５９ａ、および５９ｂは、養子細胞療法を受けた腫瘍におけるＣＤ８^＋ＴＩＬの定量化を示し、図５９ａは、ＣＤ８^＋ＴＩＬの細胞数を示し、分解された画像を使用して自動細胞計数アルゴリズムによって定量化した。ＴＩＬはヘマトキシリン^＋／ｗａｒｐ ｒｅｄ^＋として画定され、および図５９ｂは、養子細胞療法を受けた腫瘍からの典型的な分解画像を示す。

【図60】図６０ａ、６０ｂ、および図６１は、ＭＣ－３８マウスモデルにおける異なるＣＤ３９集団からのＴＩＬのフローサイトメトリー分析を示し、図６０ａはＣＤ８／ＣＤ４５ゲーティングによる腫瘍内に約１％のＣＤ８＋ＴＩＬを有するＭＣ－３８モデルであり、図６０ｂは、消耗マーカー（ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＴＩＧＩＴ）の典型的なサイトメトリープロファイルと計量である。

【図61】図６０ａ、６０ｂ、および図６１は、ＭＣ－３８マウスモデルにおける異なるＣＤ３９集団からのＴＩＬのフローサイトメトリー分析を示し、図６１は、細胞内のサイトカイン（ＩＦＮ、ＴＮＦ、ＩＬ－２）の典型的なサイトメトリープロファイルおよび計量である。

【図62a】図６２ａは、異なる癌細胞株を横断するＣＤ３２６のベンチマークを示す。これらの細胞株の混合物は、インプットとしてＣＤ３２６発現のかなり均一で広いスペクトルを有するように生成された。図６２ｂは、１６ｍＬ／時間の流量で稼働する各モジュールから回収された集団の典型的なフローサイトメトリープロファイルおよび中央値蛍光強度（ＭＦＩ）である。図６２ｃは、８ｍＬ／時間の流量で運転する各モジュールから回収された集団のＭＦＩを示す。

【図62b】図６２ａは、異なる癌細胞株を横断するＣＤ３２６のベンチマークを示す。これらの細胞株の混合物は、インプットとしてＣＤ３２６発現のかなり均一で広いスペクトルを有するように生成された。図６２ｂは、１６ｍＬ／時間の流量で稼働する各モジュールから回収された集団の典型的なフローサイトメトリープロファイルおよび中央値蛍光強度（ＭＦＩ）である。図６２ｃは、８ｍＬ／時間の流量で運転する各モジュールから回収された集団のＭＦＩを示す。

【図62c】図６２ａは、異なる癌細胞株を横断するＣＤ３２６のベンチマークを示す。これらの細胞株の混合物は、インプットとしてＣＤ３２６発現のかなり均一で広いスペクトルを有するように生成された。図６２ｂは、１６ｍＬ／時間の流量で稼働する各モジュールから回収された集団の典型的なフローサイトメトリープロファイルおよび中央値蛍光強度（ＭＦＩ）である。図６２ｃは、８ｍＬ／時間の流量で運転する各モジュールから回収された集団のＭＦＩを示す。

【図63】開示されるモジュール式チップの一例を製作するためのモールドを印刷するための３Ｄプリンタの能力の特性評価を示す。３Ｄプリンタは、ネガティブ構造（すなわちマイクロウェル）よりもポジティブ構造（すなわちマイクロポスト）の形状形成をより良く支持することが示されている。プリンタは、２００μｍ未満の幅を有する微細な特徴をポジティブ状に印刷することができる。

【図64】３Ｄ印刷を使用した高アスペクト比および複合高さ構造の直接生成を図示する。

【図65】開示されるモジュール式チップの一例を製作する際のダブルレプリカ手順のワークフローである。１つの３Ｄ印刷されたポジ型から、高分解能ネガパターンを担持する複数のＰＤＭＳモデルを生成することができる。非接着処理の後、これらのネガティブモールドを使用してポジティブチャネルを生成し、最終装置を作製することができる。

【図66】開示されるシステムの一例を用いて、末梢血細胞からＨＡ反応性Ｔ細胞を単離するために抗体媒介ネガティブ選択および多量体媒介ポジティブ選択を行う場合の選別性能の定量化を示す。

【0014】

同様の参照番号は、同様の構成要素を示すために異なる図で使用されている場合がある。

【発明を実施するための形態】

【0015】

様々な例において、本開示は、細胞収集物から標的細胞、特に磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための装置および方法を記載する。開示される装置、システム、および方法はまた、末梢血、血管新生腫瘍、悪性胸水、リンパ液、骨髄の流体部分、および他の細胞運搬流体等の流体供給源（細胞の集合を運搬する）から標的細胞を回収するために使用されてもよい。一例において、方法は、固形腫瘍からのＴＩＬの迅速かつ効率的な回収を可能にするために使用され得る調整可能な免疫磁気細胞選別アプローチである。

【0016】

浸潤細胞のマイクロ流体標的化（またはＭＡＧＩＣ）と称されるものは、免疫磁気選別に基づく腫瘍組織からのＴＩＬの回収および拡大のために使用され得る。本開示は、細胞回収が腫瘍試料からのＴＩＬに対して行われる例を提供するが、開示される方法および装置は、必要に応じて修飾を伴って、種々の培地中の他の細胞の磁気プロファイリングに好適であり得る。別の例では、開示される装置、システム、および方法は、末梢血から腫瘍反応性免疫細胞を収集するために使用され得る。

【0017】

ＭＡＧＩＣは、構成可能、定量的、および容積測定的な、細胞分離のために設計された一連のモジュール式マイクロ流体チップを使用する。図１～６を参照すると、例示的な実施形態による、細胞収集物流体から磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための装置（１０）およびシステム（１００）が示されている。

【0018】

装置（１０）は、概して、磁石プレート（１２）と、磁石プレート（１２）に解除自在に結合され、その上に重なるモジュール式チップ（１４）とを備える。

【0019】

図３に最もよく見られるように、各磁石プレート（１２）は、その中に配置および配列されたマイクロ磁石（１６）のアレイを有し、マイクロ磁石（１６）のアレイは、磁石プレート（１２）に沿ってほぼ一定の磁界を生成する。示された実施形態では、全てのマイクロ磁石（１６）はＮ５２ ＮｄＦｅＢ磁石である。他の応用では、異なる磁気強度を有する磁石が使用されてもよい。さらなる応用では、異なる磁気強度を有する磁石を同じ磁石プレート（１２）に固定して、磁石プレート（１２）に沿って変化する磁界を生成することができる。

【0020】

モジュール式チップ（１４）は、基部とチャンバ壁２０とで構成される。本実施形態において、モジュール式チップ（１４）は、第１の端部（２２）と、反対側の第２の端部（２４）とを有する。基部は、流れ面（２６）と、磁石プレート（１２）と結合するための、反対側の結合面とを有するガラス基部（１８）であってもよい。流れ面（２６）および反対側の結合面は、概して、第１の端部（２２）と第２の端部（２４）との間に延在する。ガラス基部（１８）の少なくとも流れ面（２６）はまた、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、または表面を平滑化することによって非特異的捕捉を防止するための別の好適なコーティング、例えば別のシリコーン系潤滑剤でコーティングされてもよい。このコーティングは、ガラス基部（１８）の流れ面（２６）を滑らかにするのに役立ち、したがって回収中に滑り落ち得る細胞を捕捉する。コーティングはまた、チャンバ壁２０とガラス基部（１８）との間に結合を形成して漏れを防止するのに役立つ。

【0021】

ガラス基部（１８）は、０．０５ｍｍ～０．５ｍｍの間の厚さを有し得る。好ましくは、ガラス基部（１８）は、０．１ｍｍ以下の厚さを有し、それにより、磁石プレート（１２）およびモジュール式チップ（１４）が共に結合されるときに、マイクロ磁石（１６）によって及ぼされる磁界がガラス基部（１８）を越えてより良好に延在することが可能になる。ガラス基部（１８）の寸法は、長さ３０ｍｍ～３００ｍｍ、および／または幅１２．５ｍｍ～１２５ｍｍであってもよい。本実施形態では、ガラス基部（１８）は、長さ７５ｍｍ、幅５０ｍｍである。

【0022】

チャンバ壁２０は、ガラス基部（１８）の流れ面（２６）から延在し、接着剤を使用することなどによってそこに固定され得る。チャンバ壁２０およびガラス基部（１８）は、集合的に、それらの間にフローチャンバ（２８）を形成する。フローチャンバ（２８）は、モジュール式チップ（１４）の第１の端部（２２）の近傍などの、フローチャンバ（２４）の一端に配置された入口（３０）を有する。フローチャンバ（２８）はまた、第２の端部（２４）の近接などの、フローチャンバ（２４）の反対側の端部に配置された出口（３２）を有する。示される実施形態では、各装置（１０）は、１つの入口（３０）と、１つの出口（３２）と、１つのフローチャンバ（２４）とを有する。しかしながら、代替的な応用では、装置（１０）は、複数の入口（３０）、および／または複数の出口（３２）、および／または複数のフローチャンバ（２８）を有し得る。

【0023】

入口（３０）は、流体をフローチャンバ（２４）内に受容するように構成され、出口（３２）は、流体をフローチャンバ（２４）から排出するように構成されるが、入口（３０）および出口（３２）は、逆に使用されてもよい。この場合、入口（３０）は出口（３２）となり、出口（３２）は入口（３０）となる。

【0024】

モジュール式チップ（１４）は、フローチャンバ（２８）内に配置された複数の流量低減構造（３４）をさらに含む。流量低減構造（３４）もまた、ガラス基部（１８）の流れ面（２６）から延在し、そこに固定され得る。いくつかの実施例では、チャンバ壁２０および流量低減構造（３４）は、３Ｄ印刷および射出成形等によって単一ユニットとして形成され、次いで、ガラス基部（１８）に固定されてもよい。代替的な応用では、チャンバ壁２０および流量低減構造（３４）、または全体としての装置（１０）は、射出成形を通して形成されてもよい。各構造（３４）は、捕捉表面（３６）の近傍で流量を減少させるように成形された捕捉表面（３６）を含む。本実施形態では、各流量低減構造（３４）は、Ｘ字形であるが、Ｖ字形またはＣ字形の幾何学形状等の他の形状が使用されてもよい。

【0025】

マイクロ磁石（１６）のアレイによって生成される磁界は、ガラス基部（１８）を通って延在し、流量低減構造（３４）と協働して、流量低減構造（３４）のそれぞれの近傍にそれぞれの捕捉ゾーンを画定する。

【0026】

所望の濾過速度／タイプに応じて、各流量低減構造（３４）の高さは、５０ミクロン～８００ミクロンであってもよい。高さが８００ミクロンを超えると、細胞捕捉のメカニズムが変化し、捕捉の特異性が失われることが見出された。流量低減構造（３４）の高さが５０ミクロンより低い場合、細胞サイズが約２０ミクロンであるため、詰まりが生じることが見出された。

【0027】

図１に示す実施形態では、例えば、左上のモジュール式チップ（１４）内の全ての流量低減構造の高さは１００μｍ（３４ａ）であり、左中段のモジュール式チップ（１４）内の全ての流量低減構造の高さは４００μｍ（３４ｃ）であり、および、左下のモジュール式チップ（１４）の全ての流量低減構造の高さは８００μｍ（３４ｄ）である。図５ａ、５ｂ、および図６に描写される実施形態では、それぞれ、１００μｍ、２００μｍ、４００μｍ、および８００μｍの高さを有する、流量低減構造（３４ａ）、（３４ｂ）、（３４ｃ）、および（３４ｄ）が、さらに詳細に示される。

【0028】

さらなる用途では、モジュール式チップ（１４）は、同じガラスベース１８上に、互いに異なる高さを有する流量低減構造（３４）を有し得る。例えば、図９に示すモジュラーチップ（１４）は、ガラスベース１８上に高さの順に配置された流量低減構造（３４ａ）、（３４ｂ）、（３４ｃ）、および（３４ｄ）を含む。

【0029】

所与のモジュール式チップのフローのための流量低減構造の適切な高さを決定または選択するのを助けるために、サイトメトリープロファイルが使用されて、特定の標的集団を捕捉するように選別設定を設計するのを助ける場合がある。

【0030】

ある応用では、図６２ａに示すように、ＭＣＦ－７、ＰＣ－３Ｍ、２２Ｒｖ１、ＰＣ－３、ＭＤＡ－ＭＢ２３１、およびＨｅＬａを含む、ＣＤ３２６を発現する一連のヒト癌細胞株をフローサイトメトリーによってベンチマークした。これらの細胞は、中央蛍光強度（ＭＦＩ）によって判断すると、８０～２０，０００の範囲にわたって、ＣＤ３２６発現の有意な差を有する。４つのモジュール１００、２００、４００、および８００μｍを直列に接続した定量的選別装置を構成し、細胞混合物を１６ｍＬ／時間の流量で選別した。図６２ｂは、各モジュールで捕捉されている集団のＭＦＩを示す。曲線フィッティングは、ｌｏｇ_２厚さとｌｏｇ_２ＭＦＩとの間の直線関係（Ｒ^２＞０．９９８）を示唆し、約－１．５の傾きであった。したがって、上記の観察から、ＭＦＩは、捕捉モジュールの高さを２倍にすると、１／３（２～１．５＝０．３５）に低下した。

【0031】

次いで、図６２ｂに示されるＣＤ３９のフローサイトメトリーデータに基づいて、ＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団とＣＤ３９^ｌｏｗ集団との間のＭＦＩの差は、約２７倍であることが見出された（１８６１５対６８８）。したがって、母集団は、１００μｍおよび８００μｍのモジュールによって良好に分離されると判明した。その間のＣＤ３９^ｍｅｄ集団は５７６８のＭＦＩを有することが見出され、ＣＤ３９^ｌｏｗと比較して８．３８の倍数変化をもたらした。このことは、捕捉のために２００μｍモジュールを使用する理論的根拠を提供する。まとめると、１００、２００、および８００μｍモジュールを連続的に接続するセットアップは、ＣＤ３９の定量的選別のために選択されてよい。

【0032】

もちろん、代替的な応用では、モジュール式チップ（１４）は、本明細書に図示および論じられるものと異なる高さを伴う流量低減構造（３４）を有してもよい。

【0033】

さらなる可能な変形形態として、図９に示す装置（１０）の実施形態は、モジュール式チップ（１４）を間に挟んだ２つの磁石プレート（１２）を含む。この実施形態における磁石は、流量低減構造（３４ａ、３４ｂ、３４ｃ、および３４ｄ）のすべてに沿って一定の磁化を有する磁界を生成する。

【0034】

例示的実施形態によると、装置（１０）を使用して細胞収集物流体から磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための方法（８００）が、図７から図１１に示される。

【0035】

（８０２）において、方法（８００）は、任意選択で、細胞収集物流体を取得する工程を含んでもよい。この取得は、患者からの腫瘍試料を単一細胞に溶解し、細胞収集物流体を形成することを含み得る。溶解は、腫瘍試料を単細胞懸濁液へと酵素的に解離することをさらに含み得る。

【0036】

代替的に、または加えて、腫瘍試料を溶解して細胞収集物流体を形成するのではなく、細胞収集物流体は、末梢血、血管新生腫瘍、悪性胸水、リンパ液、骨髄の流体部分、または懸濁液中に単一細胞を保持する他の細胞運搬流体に由来し得る。

【0037】

次いで、（８０４）において、単細胞が、免疫磁気標識などによって磁性粒子で標識され得る。例えば、単細胞混合物は、目的の免疫細胞上に発現されるが、腫瘍細胞上には発現されない表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤ８、またはＣＤ４５）に特異的である磁性ナノ粒子（ＭＮＰ）とコンジュゲートされる抗体によって標識され得る。その表面上のＭＮＰの付着により、目的の免疫細胞（すなわち、ＴＩＬ）は、マイクロ流体装置内で強い磁化を得ることになる。磁気的にタグ付けされた標的細胞は、そのように、磁気引力を受けやすいように作製される。

【0038】

磁気的にタグ付けまたは標識された標的細胞を含有する細胞収集物流体は、次いで、（８０６）において、装置（１０）に導入される。特に、細胞収集物流体は、シリンジ（図示せず）を使用して、入口（３０）を通して装置（１０）のフローチャンバ（２８）に導入されてもよい。

【0039】

装置（１０）に導入されると、細胞収集物流体は、ＭＮＰ間の相互作用によって生成される磁力と、マイクロ磁石（１６）によって生成される磁界との２つの主要な力と、特定の領域における流体速度によって決定される流体抗力とを経験する。磁力が流体抗力に打ち勝つと、細胞は特定の領域に留まるのに充分な力を獲得する。ＴＩＬは、より多数のＭＮＰで標識されるため、腫瘍細胞および他の非標的細胞と比較してより高い磁力を経験する。

【0040】

したがって、捕捉ゾーンにおけるマイクロ磁石（１６）からの磁界は、流量低減構造（３４）と協働して、標的細胞に対する抗力に打ち勝って、捕捉ゾーンにおいて細胞収集物から磁化された標的細胞を捕捉することを促進するように十分に高い。そのようにして、より高い磁化を有する細胞が、流量低減構造（３４）によって捕捉される。

【0041】

上述のように、流量低減構造（３４）は、異なる目的のために選択された、異なる高さ／厚さを有してもよい。適切な／所望の構成の選択後、流量はまた、より良好な選別性能のために調整され得る。モジュール式チップ（１４）の厚さ／高さの違いは、それ自体、異なる流量に寄与し得る。より低い流量低減構造（３４）を有する装置（１０）は、フローチャンバ（２８）内で、それらのより低体積を有し、したがって、チャンバを通るより高い流量を有する傾向があってもよい。逆に、より高い流量低減構造（３４）を有する装置（１０）は、それらのフローチャンバ（２８）内で、より高い体積を有し、したがって、それを通るより低い流速を有する傾向があってもよい。

【0042】

流量自体はまた、細胞収集物流体が回収装置（１０）に注入されるときに調整されてもよい。上記の癌細胞株セットアップに戻ると、８ｍＬ／時間の流量で選別された各モジュールからのＭＦＩ（図６２ｃ）を１６ｍＬ／時間（図６２ｂ）と比較した。全体として、ＭＦＩは流量にほぼ直線的に比例し、ｋ≒１であった。このこは、既存の流量を調整することによって所望のＭＦＩを達成するための直接変換をもたらした。

【0043】

ＣＤ３９の定量的選別のための上記のセットアップ（直列に接続された１００、２００、および８００μｍのモジュールを有する）については、弱いマーカー（すなわち、ＣＤ３９／ＰＤ－１）については８ｍｂ／時間または強いマーカー（すなわち、ＣＤ４５）については３２ｍＬ／時間の流量下で予備選別を行うことが推奨される。選別後、各モジュールからの集団を収集して、フローサイトメトリーによってＭＦＩを決定することができる。既存のＭＦＩを所望のＭＦＩと比較することによって、ユーザは最適な流量を推定することができる。あるいは、フローサイトメトリーによるＭＦＩは、各モジュール中の細胞のパーセンテージを計数し、続いて、対応するＭＦＩを推測するために、これらのパーセンテージを上記で得られたフローサイトメトリーデータにマッピングすることによって推定することができる。

【0044】

例えば、ＣＤ３９を８ｍＬ／時間の流量で選別し、２００μｍモジュールからのＭＦＩは７６２０であることが分かった。理想的なＭＦＩは５７６８である（上記の癌細胞株設定を参照）。したがって、その場合の最適な流量は、８×５７６８÷７６２０＝６．０５ｍＬ／時間であり得る。

【0045】

流量の差は、タンパク質マーカーの異なる発現を有する細胞（すなわち、異なる程度の磁化を有する細胞）の捕捉を可能にする。特定の量のＭＮＰは、ＣＤ３９を標的とする抗体にコンジュゲートされる。ＣＤ３９抗体はＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。したがって、細胞表面上のＣＤ３９の高い発現は、結合したＣＤ３９抗体のより高い数値をもたらし、これはＭＮＰの量に比例する。このように、ＣＤ３９の発現レベルは、磁気標識のレベルと相関する。したがって、より低い厚さ（したがって、より高い流量）を有するモジュール式チップ（１４）は、より高い発現を有する細胞を捕捉する。より高い厚さ（したがって、より低い流量）を有するモジュール式チップ（１４）は、より低い発現を有する細胞を捕捉する。

【0046】

図９は、異なる高さの流量低減構造（３４）を有する装置（１０）内のシミュレートされた流速分布を示し、カラーバーの単位（ｍｍ・ｓ^－１）によって表示される。図１０は、シミュレートされた流速の定量化を示す。「Ｘ」形構造（３４）のポケット付近の流量は低く、細胞捕捉に有利な低速ゾーン、すなわち捕捉ゾーンを形成した。

【0047】

図１１は、示された装置（１０）の実施形態が、磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するためにどのように捕捉し得るかの図解である。免疫磁気標識された細胞がこの装置（１０）に導入されると、１００～８００μｍの間で高さが異なる領域は、流体速度の低下および流体抗力の低下をもたらす。特定の細胞は、それが得られた磁力が流体抗力を克服すると、「Ｘ」構造の捕捉ポケットに捕捉される。

【0048】

（８０８）において、方法（８００）は、装置（１０）から非標的細胞を洗い流す工程をさらに含む。洗い流す工程は、非標的細胞、または捕捉ゾーン内に捕捉されなかった細胞を洗い流すために、フラッシング流体を装置（１０）に導入することによって行われ得る。フラッシング流体は、シリンジを使用して入口（３０）を通ってフローチャンバ（２８）に注入され得る。

【0049】

（８１０）において、モジュール式チップ（１４）が磁石プレート（１２）から分離される。磁石プレート（１２）から分離するモジュール式チップ（１４）の能力は、スループットを改善するのに役立ち、選別後にモジュール式チップ（１４）から細胞を除去する際の容易さを高める。磁石プレート（１２）からモジュール式チップ（１４）を分離することにより、磁気的に標識された標的細胞からマイクロ磁石（１６）によって生成された磁力が除去される。このことは、８１２において、捕捉された磁気的にタグ付けされた標的細胞のモジュール式チップ（１４）からの分離および回収を可能にする。

【0050】

細胞収集物が腫瘍試料に由来する場合、回収される標的細胞はＣＤ８^＋ＴＩＬであり得る。これらの回収されたＴＩＬは、抗原非依存的な様式でＣＤ３／ＣＤ２８マイクロ粒子の刺激を用いるインビトロ増殖プロトコルを経る場合がある。増殖したＴＩＬが所望のレベルに達すると、それらを養子細胞療法のためにインビボ環境（すなわち患者）に移植して戻すことができる。

【0051】

図１～６はまた、例示的な実施形態による、細胞収集物流体から磁気的にタグ付けされた標的細胞を選別および回収するためのシステム（１００）を示す。システム（１００）は、概して、上記で説明されるような第１の装置（１０ａ）と、上記で説明されるような第２の装置（１０ｂ）と、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）の磁石プレート（１２）を保持するように構成される、スキャフォールド（１０２）とを備える。

【0052】

描写されるように、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）のそれぞれの磁石プレート（１２）は、相互に平行に位置付けられる、スキャフォールド（１０２）に組み込まれる。代替的に、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）のそれぞれの磁石プレート（１２）は、スキャフォールドに解除自在に固着可能であり得る。その点に関して、磁石プレート（１２）は、摺動またはスナップ嵌め結合機構を介するなど、当該技術分野で知られている任意の方法でスキャフォールド（１０２）に結合され得る。異なる磁気強度または構成の磁石を有する磁石プレート（１２）は、したがって、スキャフォールド（１０２）に交換可能に組み込まれ得る。他の代替実施例では、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）は、スキャフォールド（１０２）上で直列に、または互いに対して非垂直角度で配列されてもよい。

【0053】

システム（１００）が複数の装置（１０）を含む場合、各装置の流量低減構造は、同じであっても互いに異なっていてもよい。

【0054】

システム（１００）はさらに、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）のそれぞれの端部に近接して位置付けられる第１のコネクタ（１０４）と、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）のそれぞれの他端に近接して位置付けられる第２のコネクタ（１０６）とを含むように示される。例えば、図２ａおよび図４に示されるように、第１のコネクタ（１０４）は、モジュール式チップ（１４）の第１の端部（２２）に近接して位置付けられてもよく、第２のコネクタ（１０６）は、モジュール式チップ（１４）の第２の端部（２４）に近接して位置付けられてもよい。したがって、第１のコネクタ（１０４）は、それぞれの第１の装置（１０ａ）または第２の装置（１０ｂ）のそれぞれの対応する入口（３０）に流体連結可能であってもよく、第２のコネクタ（１０６）は、それぞれの第１の装置（１０ａ）または第２の装置（１０ｂ）のそれぞれの対応する出口（３２）に流体連結可能であってもよい。

【0055】

本実施形態は、可撓性の管（１０８）を使用して、第１のコネクタ（１０４）を対応する入口（３０）と流体連結し、第２のコネクタ（１０６）を対応する出口（３２）と流体連結し、および／または１つの装置の入口（３０）を別の装置の出口（３２）と流体連結する。管（１０８）の可撓性は、第１のコネクタ（１０４）と、第２のコネクタ（１０６）の、入口（３０）と、出口（３２）との間で再構成可能または再接続可能であることを可能にする。第１のコネクタ（１０４）を対応する入口（３０）と流体連結し、第２のコネクタ（１０６）を対応する出口（３２）と流体連結するために、管（１０８）の代わりに代替の連結機構が使用されてもよい。

【0056】

各第１のコネクタ（１０４）はまた、細胞収集物の供給源（図示せず）と流体接続してもよく、各第２のコネクタ（１０６）はまた、残留物容器（図示せず）と流体接続してもよい。図１～図４はさらに、スキャフォールド（１０２）が、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）に加えて、追加の装置（第３の装置（１０ｃ）等）が、所望に応じて、システム（１００）に追加され得るように、２つより多い装置（１０）を保持するように構成され得ることを図示する。

【0057】

システム（１００）の構成要素の再構成可能性は、システム（１００）が複数のモードまたは構成に適合されることを可能にする。２つの例示的な構成は、図２ａおよび図４にその例が示される並列構成／システム（１００ａ）と、図２ｂにその例が示される直列構成／システム（１００ｂ）とを含む。

【0058】

図２ａの実施形態では、平行システム（１００ａ）の一例が示されており、可撓性チューブ１０８は、各第１のコネクタ（１０４）をその対応する装置（１０）の入口（３０）と流体連結し、別の可撓性チューブは、各第２のコネクタ（１０６）をその対応する装置（１０）の出口（３２）と流体連結する。このような場合、各第１のコネクタ（１０４）は細胞の収集源とも流体接続し、各第２のコネクタ（１０６）は残留物容器（図示せず）とも流体接続する。

【0059】

同様に、図２ａの第１、第２および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）のそれぞれにおける流量低減構造（３４）の高さは同じである。特に、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）は、１００ミクロンの高さを有する流量低減構造（３４ａ）を含む。このようにして、図２ａの第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）は、構造的に同じである。代替的な応用では、図２ａの装置は、代わりに、５０ミクロン～８００ミクロンの高さを有する流量低減構造を含んでもよい。

【0060】

図４の実施形態では、平行システム（１００ａ）の別の例が示されており、可撓性チューブ１０８は、図２ａに示されているのと同じ方法で並列に配置されている。しかしながら、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）のそれぞれにおける流量低減構造（３４）の高さは異なる。特に、図４の第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）は、それぞれ１００、４００、および８００ミクロンの高さを有する流量低減構造（３４ａ）、（３４ｃ）、および（３４ｄ）を含む。

【0061】

図２ｂは、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）が、第３の装置（１０ｃ）とともに、直列に配置され、流体的に直列に接続される、直列システム（１００ｂ）の実施例を図示する。

【0062】

直列システム（１００ｂ）では、平行システム（１００ａ）と同様に、第１の装置（１０ａ）に近接するコネクタ（１０４）は、可撓性の管（１０８）を用いて、第１の装置（１０ａ）の入口（３０）に流体的に連結される。しかしながら、上述のように、各モジュール式チップ（１４）では、入口（３０）および出口（３２）の機能は逆にされ得る。したがって、平行システム（１００ａ）とは異なり、第１の装置（１０ａ）の出口（３２）は、第２のコネクタ（１０６）ではなく、第２の装置（１０ｂ）の入口（３０）に流体連結される。さらに、第２の装置（１０ｂ）の出口（３２）は、第１のコネクタ（１０４）ではなく、第３の装置（１０ｃ）の入口（３０）に流体連結される。次いで、第３の装置（１０ｃ）の出口（３２）は、装置（１０ｃ）に近接する第２のコネクタ（１０６）に流体連結される。

【0063】

直列システム（１００ｂ）の第１の装置（１０ａ）における複数の流量低減構造（３４）の高さもまた、第２の装置（１０ｂ）および第３の装置（１０ｃ）における流量低減構造（３４）の高さとは異なる（より低いまたはより高い）。図２ｂに示される特定の実施形態では、第１の装置（１０ａ）は流量低減構造（３４ａ）（１００μｍ）を有し、第２の装置（１０ｂ）は流量低減構造（３４ｃ）（４００μｍ）を有し、第３の装置（１０ｃ）は流量低減構造（３４ｄ）（８００μｍ）を有する。

【0064】

システム（１００）のモジュール性および構成可能性は、システム（１００）がフィールドプログラマブルであることを可能にし、すなわち、異なる選別用途のために構成を変更する際の柔軟性を可能にして、システム（１００）を目的に適合させる。例えば、エンドユーザの必要性に応じて、システム（１００）は、平行システム（１００ａ）に構成されてもよく、次に、直列システム（１００ｂ）、または並列および直列構成要素の両方を有するシステム、および／または構成要素の異なる組み合わせを伴うシステムに再構成することができる。

【0065】

いくつかの例では、それぞれがそれ自体の磁石プレート（１２）を有する第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）を含むシステム（１００）の代わりに、システム（１００）は、第１および第２のモジュール式チップ（１４）とともに使用することができる単一の大きな磁石プレートを含む場合がある。第１のモジュール式チップ（１４）は、第１のモジュール式チップ（１４）が磁石プレート（１２）の第１の部分を覆うようにスキャフォールドに結合されてもよく、第２のモジュール式チップ（１４）も、第２のモジュール式チップ（１４）が磁石プレート（１２）の第２の部分を覆うようにスキャフォールドに結合されてもよい。そして、平行システム（１００ａ）または直列システム（１００ｂ）は、上述のように、第１のモジュール式チップと第２のモジュール式チップ（１４）の入口（３０）および出口（３２）を接続することによって同様に達成され得る。すなわち、システム（１００）のモジュール性および構成可能性は、単一の大きい磁石プレート（１２）（これは、スキャフォールド（１０２）に組み込まれてもよく、またはスキャフォールド（１０２）に解除自在に連結されてもよい）上に自由に配置され得るモジュール式チップ（１４）を使用して達成され得るか、またはそれ自体の磁石プレート（１２）を備えたモジュール式チップ（１４）をそれぞれ含む装置（１００）を使用して達成され得る。

【0066】

例示的実施形態による、システム（１００）を使用して細胞収集物流体から磁気的にタグ付けされた標的細胞を回収するための方法（１２００）が、図１２、１３ａ、および１３ｂに示される。任意選択で、方法（１２００）は、上述のように、腫瘍試料の溶解（８０２）および標的細胞の磁気標識（８０４）を含み得る。

【0067】

次いで、１２０２において、方法（１２００）は、磁気的にタグ付けされた標的細胞を含有する細胞収集物流体をシステム（１００）の中へ、具体的には、第１の装置（１０ａ）の入口（３０）を通して第１の装置（１０ａ）の中へ導入する工程を含む。次いで、１２０４において、流体試料は、第２の装置（１０ｂ）の中へ、すなわち、第１の装置（１０ａ）の出口（３２）から第２の装置（１０ｂ）の入口（３０）の中へ導かれる。方法（１２００）はまた、任意選択で、（１２０６）において、流体試料を第３の装置（１０ｃ）の中へ、すなわち、第２の装置（１０ｂ）の出口（３２）から第３の装置（１０ｃ）の入口（３０）の中へ導く工程を含んでもよい。

【0068】

次いで、（１２０８）において、非標的細胞をシステム（１００）から洗い流す。洗い流す工程は、非標的細胞、または捕捉ゾーンにおいて捕捉されなかった細胞を洗い流すために、システム（１００）にフラッシング流体を導入することによって行われ得る。フラッシング流体は、シリンジを使用して入口（３０）を通って第１の装置（１０ａ）のフローチャンバ（２８）に注入され得る。次いで、フラッシング流体は、上述のように、第２の装置（１０ｂ）および第３の装置（１０ｃ）を通過することになる。

【0069】

（１２１０）において、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）のモジュール式チップ（１４）が、それらの対応する磁石プレート（１２）から分離される。次いで、１２１２において、第１および第２の装置（１０ａ）、（１０ｂ）のモジュール式チップ（１４）からの磁気的にタグ付けされた標的細胞が回収される。

【0070】

図１３ａおよび図１３ｂは、システム（１００）を並列および直列に使用するときにどの方法（１２００）が実行され得るかを示す。

【0071】

図１３ａは、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、および（１０ｃ）が平行に接続され、それぞれが１００ミクロンの流量低減構造（３４ａ）を有する、平行システム（１００ａ）を含む。それらの構造的同一性を考慮して、方法（１２００）は、ＣＤ８＋ＴＩＬへの腫瘍細胞の超高スループットバイナリー選別およびその回収のために実施され得る。本明細書において「バイナリＭＡＧＩＣ」とも呼ばれるこのバイナリ選別は、バルクＴＩＬを生成するためのＴ細胞集団の単離を可能にする。

【0072】

しかしながら、ＴＩＬは、それらの活性化の程度に基づいて亜集団にさらに分類され得る。特に、より強力な表現型を有する細胞の亜集団は、ＴＩＬにおける特定のタンパク質へのホーニングによって標的化され得る。

【0073】

そのために、図１３ｂは、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、および（１０ｃ）が異なる流量低減構造（３４ａ）、（３４ｃ）、および（３４ｄ）（それぞれ、１００、４００、および８００ミクロン）と直列に接続される、直列システム（１００ｂ）を示す。それらの構造的相違を考慮すると、方法（１２００）は、ハイスループットの定量的選別および腫瘍細胞（または一般的なＣＤ８^＋ＴＩＬ）の、バイスタンダーＴＩＬ（Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ＴＩＬ）、反応性ＴＩＬ（Ｒｅａｃｔｉｖｅ ＴＩＬ）、および疲弊ＴＩＬ（Ｅｘｈａｕｓｔｅｄ ＴＩＬ）などの、ＣＤ３９発現に基づく亜集団への回収のために実施され得る。このタイプの選別は、本明細書では「定量的ＭＡＧＩＣ」とも呼ばれる。

【0074】

上述のように、異なる高さを有する流量低減構造（３４）は、フローチャンバ（２８）を通る異なる流量をもたらすことができる。標識された細胞収集物流体はまた、異なる流量で注入されてもよい。この流量の差は、ＣＤ３９タンパク質マーカーの異なる発現を有する細胞の捕捉を可能にする。したがって、１００ミクロンの流量低減構造（３４ａ）を有する第１の装置（１０ａ）は、疲弊ＴＩＬなどのより高い発現を有する細胞を捕捉することができる。４００ミクロンの流量低減構造（３４ｃ）を有する第２の装置（１０ｂ）は、反応性ＴＩＬなどの培地発現を有する細胞を捕捉することができる。８００ミクロンの流量低減構造（３４ｄ）を有する第３の装置（１０ｃ）は、バイスタンダーＴＩＬなどのより低い発現を有する細胞を捕捉することができる。

【0075】

したがって、第１、第２、および第３の装置（１０ａ）、（１０ｂ）、（１０ｃ）のモジュール式チップ（１４）が、それらの対応する磁石プレート（１２）から分離されるとき、第１のモジュラープレートから回収される標的細胞は、大部分が疲弊ＴＩＬであり、第２のモジュラープレートから回収される標的細胞は、大部分が反応性ＴＩＬであり、第３のモジュラープレートから回収される標的細胞は、大部分がバイスタンダーＴＩＬである。

【0076】

方法（１２００）は、方法（８００）の実行に続いて実行されてもよく、方法（８００）から回収された磁気的にタグ付けされた標的細胞は、直列システム（１００ｂ）に導入される。方法（１２００）は、代替的に、方法（８００）とは独立して行われてもよく、この場合、磁気的にタグ付けされた標的細胞を伴う細胞収集物流体（溶解した腫瘍試料など）が、直列システム（１００ｂ）に直接導入される。

【0077】

装置（１０）内の磁石プレート（１２）からのモジュール式チップ（１４）の分離可能性、およびシステム（１００）のモジュール式構成は、モジュール式チップから細胞を除去する際の容易さを増すように役立ち、かつ、調整可能な分解能を可能にする。目的の細胞を含む任意の１つの区画を他のモジュールから単純に別々に取り出すことができるため、特定の亜集団の細胞を容易に回収することができる。このモジュール設計はまた、エンドユーザが、分解能（選別される集団の数）、スループット、およびシステムの複雑性の観点から、要求を満たす選別システムを組み立てることを可能にする。

【0078】

システム（１００ａ）を直列に使用する別の利点は、純度を犠牲にすることなく、市販の選別技術と比較して最大３０倍高い回収効率、および１００倍良好なスループットを達成し得ることである。達成される高い回収率および純度は、ＴＩＬのクローン型の初期量および多様性を改善し、増殖プロセスを加速し得る。このアプローチを用いて単離されたＴＩＬは最小限の増殖しか必要とせず、このことはそのインビボの細胞毒性表現型を最大化する。マウス腫瘍モデルにおけるインビボ養子細胞療法を用いて、ＭＡＧＩＣプラットフォームを通して単離および増殖させたＴＩＬは非常に強力であり、異種移植された動物の生存期間の中央値を５０％延長できることが実証された。

【0079】

加えて、ハイスループットのために設定された定量的選別（直列のシステム（１００ａ）、およびＣＤ３９に基づくＴＩＬ亜集団の精細なプロファイリング（並列のシステム（１００ｂ）を得ることができる。以下の実施例において、ＣＤ３９の中程度のレベルの発現が、抗原特異的であり、自己再生可能であり、高度に細胞傷害性の表現型に迅速に分化することができるＴＩＬの前駆細胞集団を画定することが実証される。ＣＤ３９^ｍｅｄ集団の特徴は、ＣＤ３９^ｈｉｇｈ、ＣＤ３９^ｌｏｗまたはバルクＴＩＬと比較してインビボで優れた抗腫瘍効果をもたらす。まとめると、本明細書に記載される実施例は、開示される装置、システム、および方法が、迅速なターンアラウンドを伴う、費用効果的かつ効率的な養子細胞療法を可能にすることを実証する。

【実施例】

【0080】

例示的な製造方法
ここで、開示される装置の一例の、例示的な製造方法を説明する。別個の構成要素としてのモジュール式チップおよび磁石プレートの分離可能性は、少なくともモジュール式チップが、従来のリソグラフィを使用するよりもむしろ、３Ｄ印刷および／または射出モデリングを使用して、より迅速かつ安価に製作されることを可能にする。さらに、モジュール式チップのための低コストで大量の製造プロセスを可能にすることによって（例えば、３Ｄ印刷を使用）、モジュール式チップは、システムの使い捨て部品であり得る。モジュール式チップは、細胞収集物流体（これは、血液、リンパ液などの生体液であり得る）と最も直接接触する構成要素であるため、モジュール式チップの使い捨て性は、衛生上の理由および／またはヘルスケア環境での使用に有益であり得る。

【0081】

この例では、ＭＡＧＩＣ／モジュール式チップ（１４）を製造するための型は、２５μｍの層厚を有する「ＰＤＭＳ用ＣＣＷマスターモールド」樹脂（Ｒｅｓｉｎｗｏｒｋｓ ３Ｄ、トロント、カナダ）を使用して、ステレオリソグラフィー３Ｄプリンタ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ ３Ｄ Ｐｒｉｎｔｅｒ，Ｃｒｅａｔｉｖｅ ＣＡＤｗｏｒｋｓ、トロント、カナダ）によって３Ｄ印刷された。他の既知の３Ｄ印刷樹脂が、任意選択でＵＶまたは熱処理とともに、このプロセスにおいて使用されてもよい^４９。ＭＡＧＩＣチップは、ＰＤＭＳ（Ｓｙｌｇａｒｄ １８４， １８２ ｏｒ １８６ Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ， Ｍｉｄｌａｎｄ， ＭＩ）を印刷金型上にキャスティングし、続いて５０～１００°Ｃで３０分間～４時間インキュベートすることによって作製した。硬化したＰＤＭＳレプリカを剥がし、打ち抜き、厚さ番号１のガラスカバースリップ（２６０４６２、Ｔｅｄ Ｐｅｌｌａ、Ｒｅｄｄｉｎｇ、ＣＡ）にプラズマ接合してチップを仕上げた。使用前に、ＭＡＧＩＣチップをリン酸緩衝生理食塩水（Ｗｉｓｅｎｔ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、モントリオール、カナダ）中の０．０１～１％のＰｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ６８（２４０４００３２，サーモフィッシャーサイエンティフィック，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）で３０分～２４時間処理して、細胞とチップとの間の非特異的結合を低減した。実験中、各装置をアレイにされたＮ５２ ＮｄＦｅＢ磁石（Ｄ１４－Ｎ５２， Ｋ＆Ｊ Ｍａｇｎｅｔｉｃｓ， Ｐｉｐｅｒｓｖｉｌｌｅ， ＰＡ）で挟み、流体処理のためにデジタルシリンジポンプ（Ｆｕｓｉｏｎ １００、Ｃｈｅｍｙｘ、Ｓｔａｆｆｏｒｄ、ＴＸ）に接続した。

【0082】

５ｋＶ加速電圧および高真空モードを使用する電界放出走査電子顕微鏡（ＳＵ５０００、Ｈｉｔａｃｈｉ、東京、日本）下での画像化のために、作製されたチップを１５ｎｍのＡｕ（Ｄｅｎｔｏｎ Ｄｅｓｋ ＩＩ，Ｌｅｉｃａ）でスパッタコーティングした。他の応用では、加工されたチップは、上記で説明されるように使用されるとき、スパッタコーティングされない場合がある。

【0083】

３Ｄ印刷に関して、ポジティブ（例えば、マイクロポスト）およびネガティブ（例えば、マイクロウェル）構造を印刷する３Ｄプリンタの能力（図６３参照）を最初に定量化した。この例における３Ｄプリンタ（すなわち、上で参照したＭｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ Ｅｄｉｔｉｏｎ ３Ｄ Ｐｒｉｎｔｅｒ）は、ネガティブ構造と比較してポジティブ構造の印刷においてより良好な解像度を有することが見出された。ネガティブ構造のより低い分解能は、表面張力または樹脂の高い粘度に起因して、その中に留まる樹脂の残留物に起因し得る。その点で、３Ｄプリンタは、「Ｘ」形の細胞捕捉ポケットなどの高解像度パターンをポジティブ構造上に印刷することができる。３Ｄプリンタは、少なくとも１ｍｍまでの高さを有する微細構造をサポートすることが分かっており、これは、標準的なリソグラフィではほとんどサポートされない（図６４参照）。加えて、３Ｄプリンタは、１回のショットで複数の深さの構造を生成することができることが見出されたが、標準的なリソグラフィ方法は、リソグラフィが１回のラウンドにつき１つの厚さしか生成できないため、複数のラウンドを必要とする。

【0084】

ネガティブ構造の３Ｄ印刷における制限された解像度の課題は、ＰＤＭＳを鋳造する特別に設計された二重レプリカ手順の使用によって対処され得る（図６５参照）。この二重レプリカ手順は、まず、ネガティブ構造を担持するＰＤＭＳ型を生成する。次いで、ネガティブモールドを７０％エタノール溶液中の飽和洗剤で２０分間～７２時間処理した。この洗剤処理は、新たに硬化されたＰＤＭＳが、処理されたＰＤＭＳから分離されることを可能にし、装置製造中にネガティブＰＤＭＳ構造のポジティブチャネルを生成するための鋳型としての使用を可能にする。

【0085】

このプロトコルの使用は、少なくとも３つの主要な利点を有する。第１に、それは、任意の構造を充分に高い分解能で製作することを可能にする。３Ｄプリンタがポジティブ構造を印刷するより高い解像度を有することが見出されたため、チャネル製造のためのポジティブ構造とネガティブ構造の両方を作製する能力を有するためにこのプロトコルを使用することが重要である。第２に、このプロトコルは、１つの３Ｄ印刷片から複数のネガ型を生成することができ、製造をスケールアップすることができる。同時に、全てのモールドが全く同じピースから形成されるため、３Ｄ印刷／標準リソグラフィ中のバッチ間の変動も最小限に抑えられる。第３に、これは、他の種類の樹脂の使用を伴わず、処理プロセスが単純であるため、比較的費用効果的かつ直接的である。

【0086】

研究例
上述のように作製された例示的な装置を、いくつかの例示的な研究において使用した。

【0087】

装置の全体的な設計は、バイナリ選別設定を使用して、ＭＮＰおよび外部磁石を用いて／用いずに細胞を選別することによって検証した（図５０ａ）。予想通り、ＭＮＰおよび外部磁石の両方が存在する場合にのみ細胞が捕捉された。細胞の大部分が「Ｘ」形構造付近の低速ポケットに捕捉されたことは注目に値する。この結果は、我々の選別原理の忠実性を証明し、我々のモジュラーチップの特異性を示した。さらに、外部磁石なしでチップを洗い流すことによって、チップから捕捉された細胞を回収する実現可能性を、調べた（図５０ｂ）。捕捉された細胞のほぼ１００％がチップから首尾よく除去され、効率的な細胞回収を促進した。

【0088】

ＭＡＧＩＣ／装置（１０）およびシステム（１００）の選別性能を、市販の磁気選別プラットフォーム－磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）と比較した。直列システム（１００ａ）を用いたバイナリ選別では、Ｋ５６２およびＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を用いたＣＤ４５に基づくポジティブおよびネガティブ選別を行った（図１４参照）。ポジティブ選別中、バイナリＭＡＧＩＣはチップあたり５０００万までの細胞の一貫した捕捉を提供するが、ＭＡＣＳカラムは１０００万細胞で飽和し、５０００万でポジティブ細胞の大部分を捕捉することができなかったことが見出された。これは、ＭＡＧＩＣが、腫瘍細胞の過剰なバックグラウンドからＴＩＬを精製することなど、陽性細胞の体積測定的捕捉を伴う用途により適していることを実証する。

【0089】

平行システム（１００ｂ）を用いた定量的選別のために、ＣＤ３２６を、それぞれＣＤ３２６の高い、中程度の、および低い発現を有するＰＣ－３Ｍ、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１、およびＵ９３７細胞を使用して試験した（図１５を参照）。定量的ＭＡＧＩＣは全ての細胞株を適切に濃縮することができたが、ＭＡＣＳはその陽性画分においてＣＤ３２６^ｍｅｄ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞を捕捉することができなかったことが観察された。これは、ＭＡＣＳが中程度および低発現細胞を識別する能力が限られていることを示す。定量的ＭＡＧＩＣ選別は、高スループット下でより精細な選別分解能を提供し、これは、ＭＡＣＳによってアクセス可能ではない生物学的情報をより良好に分解し得る。

【0090】

バイナリＭＡＧＩＣを用いた細胞傷害性ＣＤ８^＋ＴＩＬの単離

【0091】

ＣＤ４およびＣＤ８は、腫瘍内の異なる抗腫瘍Ｔ細胞集団の決定的マーカーであり、ＴＩＬ単離に広く受け入れられている。バイナリＭＡＧＩＣ設定（平行システム（１００ａ））は、ＣＤ４またはＣＤ８を介してＴＩＬを分離するように構成した。Ｔ細胞を腫瘍細胞の試料中にスパイクして、ＴＩＬの分離に有利な流量を最適化した。純粋なヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞および純粋なマウスＣＤ８^＋ＯＴ－１ Ｔ細胞を使用した。ヒトＣＤ４^＋およびマウスＣＤ８^＋Ｔ細胞を捕捉するための最適な流量は、それぞれ３２ｍＬ／時間および１６ｍＬ／時間であることが見出された（図１６ａ～１７を参照）。これは、３．２億ヒト細胞および１．６億マウス細胞のスループット／時間／装置に対応する。ＣＤ４^＋およびＣＤ８^＋ＴＩＬは、典型的には、全ＴＩＬの１０％未満を表すため^３７、のそのような能力は、チップあたり５億解離腫瘍細胞を取り扱うのに十分と見られる。ＭＡＧＩＣ、ＦＡＣＳ、およびＭＡＣＳの性能を、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ヒト乳癌細胞にスパイクされたヒトＣＤ４^＋Ｔ細胞のＣＤ４媒介捕捉、およびＢ１６Ｆ１０マウス黒色腫細胞にスパイクされたマウスＣＤ８^＋ＯＴ－１ Ｔ細胞のＣＤ８－媒介捕捉の２つの別個の設定からの少量のスパイクイン試料（～１０００万／ラン）を使用して比較した（図１８および図１９を参照）。ＭＡＧＩＣは、その液滴がない作用原理および超高スループットのおかげで、ＦＡＣＳ／ＭＡＣＳと比較して、選別された細胞に対するストレスにわたるＦＡＣＳ／ＭＡＣＳにわたる最良の回復で、Ｔ細胞の一貫した濃縮を達成したことが見出された（図２０参照）。

【0092】

ＭＡＧＩＣ、ＦＡＣＳ、およびＭＡＣＳを、Ｂ１６Ｆ１０マウス黒色腫モデル由来のＴＩＬでチャレンジした（図２１参照）。１４日目にマウスを屠殺し、ＣＤ８発現に基づく異なる単離技術を用いて消化腫瘍からＴＩＬを単離した。興味深いことに、ＣＤ８^＋ＴＩＬのパーセンテージは、固形腫瘍内の全細胞集団の０．２％にすぎず（図５１）、したがって、これらの稀な集団の量を最大にするためには、すべての消化された腫瘍を処理する必要があることが分かった。単一グラムの腫瘍組織は、典型的には１億～１０億細胞を含む^３８。そのような高い細胞数は、実際の腫瘍試料からの希少および生きたＴＩＬの選別を非常に困難にする。ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳで希釈されていない試料を処理することは、目詰まりの問題のために困難であり、ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳについて、それぞれ５×１０^６細胞／ｍＬおよび２×１０^６細胞／ｍＬの濃度まで試料を希釈することを必要とした。これは、その処理時間を４時間および２０時間に劇的に増加させた。しかしながら、ＭＡＧＩＣは、チップ当たりの高い流量で目詰まりすることなく、２０×１０^６細胞／ｍＬまでの細胞数を有する濃縮試料を処理することができた。実際のＢ１６Ｆ１０腫瘍からＴＩＬを選別するためのＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ／ＭＡＧＩＣの性能を表１に要約する。

【0093】

【表1】

【0094】

単離されたＣＤ８^＋ＴＩＬの純度および量は、Ｔ細胞増殖のために調製された培地下での４日間の培養後にＣＤ８／ＣＤ４５共染色によって決定し（図２２を参照）、その時点で、９７％を超えるＭＮＰが表面から脱離して^３４、標識のためにＣＤ８ａエピトープを再発現した。ＭＡＧＩＣは４日目に最良の純度（９８．０％）を達成し、ＦＡＣＳ（８８．３％）よりも効率的であった。この傾向は、ＦＡＣＳに基づく選別に必要とされる時間ならびに有意な細胞アポトーシス／死を引き起こした高レベルの細胞ストレスによって説明され得る。図２３に示すように、ＭＡＧＩＣは、それぞれＭＡＣＳおよびＦＡＣＳよりも５倍および３０倍高い回収率を有する。この傾向は、スパイクイン特性評価とよく一致している。非常に限られた数およびパーセンテージのＴＩＬ（２．６５％）が、選別されていない消化腫瘍試料から回収された。このことは、効率的で穏やかなマイクロ流体選別プロセスがＴＩＬのより良好な増殖曲線をもたらすことを示唆する。ＴＩＬ回復も非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）患者由来の腫瘍標本を用いて試験し（図２４、５５、および５６参照）、同様の傾向が観察された － ＭＡＧＩＣは最高の細胞回復を保持し、ＭＡＣＳおよびＦＡＣＳよりも５～２０倍良好である。

【0095】

単離されたＴＩＬのクローン型を、バルクＴＣＲ配列決定を使用して分析した。観察されたユニークなクローンの数（ＣＤＲ３に基づく）は、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳおよびＭＡＧＩＣによって単離されたＴＩＬについてそれぞれ６８４、２０４６８、および６４１６５であった（図２５）。この傾向は、ＭＡＧＩＣの高い回収率は、元のＴＩＬ集団の不均質性および多様性を最大限に保存するのにも役立つことを示唆する。興味深いことに、異なる単離技術は、ＶおよびＪ遺伝子の使用を有意に変化させず（図５０）、単離されたＴＩＬの同様の抗原特異性を示した。しかしながら、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えのマッピング（図５１）は、ＭＡＧＩＣによって単離されたＴＩＬ（ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬと呼ぶ）が、Ｖ－Ｊ対形成の有意により高い複雑性およびより高いシャノン多様性指数（図５２）を有することを明らかにし、これは、ＭＡＧＩＣによって単離されたＴＩＬのより良好な多様性を強調する。

【0096】

ＭＡＧＩＣ単離プロセスで量、純度、および多様性の有意な改善が観察されたため、増殖速度および固有の細胞毒性の増強も観察され得るかどうかを調査した。１×１０^６／ｍＬの密度で細胞を継代培養する共通のＣＤ３／ＣＤ２８ベースの増殖プロトコルを用いて、単離したＴＩＬをウェルプレート中で１４日間、異なる方法を用いて培養した。細胞数をウェルあたり週に２回記録し、各方法から単離されたＴＩＬの総数を計算した（図２６）。ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬの増殖速度は、ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ－ＴＩＬよりも速いことが見出された。ＭＡＧＩＣおよびＭＡＣＳ ＴＩＬが各反復について１×１０^６の量に達するのに７日および１４日を要する。ＦＡＣＳ－ＴＩＬは、おそらく細胞密度がＴ細胞活性化および増殖の重要な調節因子であるため、その極めて低い初期量のために、１４日以内に１×１０^６の量を供給することができなかった^３９。ＭＡＧＩＣによって提供される高収率は、増殖に有利なより濃縮された初期ＴＩＬ集団をもたらす。増殖の終わりに、ＣＣＲ７／ＣＤ４５ＲＡによるＴＩＬの表現型を染色によって特徴付けた（図２７）。ＴＩＬの約９５％はＣＣＲ７^－／ＣＤ４５ＲＡ^－であり、ＴＩＬの適切なエフェクター数が迅速なインビトロ増殖に有利であることを示す。

【0097】

その後、ＲＮＡおよび表現型レベルで、増殖したＴＩＬの細胞毒性および反応性を特徴付けた。第１に、ｑＰＣＲによる重要な免疫経路の相対的発現を、対照として活性化ＣＤ８^＋脾細胞を使用して、評価した（図２８および５７）。ＮＦｋＢ、ＪＡＫ－ＳＴＡＴ、増殖マーカー、および細胞毒性サイトカインを含め、免疫応答経路および遺伝子の大部分は上方制御される（図５７）。ＧＯおよびＫＥＧＧデータベースにおいてｌｏｇ_２（ＦＣ）＞１．５の遺伝子セットを使用して、経路濃縮をさらに行った（図２９）。ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬは、ほとんどの経路において最も高い－ｌｏｇ_１０（Ｐ）を有し、ＲＮＡレベルでのＭＡＧＩＣ－ＴＩＬの免疫反応性の改善を示唆している。ＴＩＬをＢ１６Ｆ１０－ＯＶＡ細胞の単層と共培養することによって、インビトロ死滅アッセイを構築した（図３０）。ＲＮＡのレベルで収集されたデータと一致して、ＭＡＧＩＣ選別ＴＩＬは、２４時間および４８時間での細胞死のパーセンテージによって測定されたより高い免疫反応性を示した。共培養中の上清のＥＬＩＳＡ分析は、全てのタイプのＴＩＬが機能的であることを明らかにした。すべてのタイプのＴＩＬは、抗原提示、細胞毒性、Ｔ細胞増殖、単球動員、および抗血管新生を促進するサイトカインのカクテルを生成することができた。特に、ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬは、有意に高いレベルのＩＦＮγを分泌し、これは、他のＴＩＬよりも改善された細胞傷害性を説明し得る。

【0098】

異なるアプローチによって単離されたＴＩＬの効力をさらに調査するために、動物試験の２つのシナリオを設計して、それらの治療効力を系統的に試験した（図３２～図４０を参照）。シナリオ１は、ＴＩＬの異なる増殖曲線の結果として、細胞数が変動する注入の固定時点（腫瘍導入後７日目）を有する（図３２）。全てのＴＩＬが未処置対照と比較して腫瘍増殖を抑制することが観察された（図３３および図３４）。マイクロ流体選別されたＴＩＬは、おそらく迅速な拡大によって可能になる高い投与回数、ならびに高い多様性の結果としてのより良好な細胞毒性表現型に起因して、最良の治療有効性を達成した。投与量の影響もＭＡＧＩＣ－ＴＩＬについて調査した。興味深いことに、５×１０^５の投与量は、２×１０^６の投与量よりも統計的に良好な生存中央値を提供する（３２対２８日、ｐ＝０．０４９）。１ショットにおけるＴＩＬの高い投与量は、治療にいくつかの悪影響をもたらし得ることが予想される^４０。したがって、５×１０^５細胞に近い用量が、Ｂ１６Ｆ１０モデルにおける最適な用量である。さらに、ＭＡＧＩＣ／ＭＡＣＳ－ＴＩＬの治療転帰を５×１０^５細胞の用量で比較し（図３６）、ＭＡＧＩＣ／ＦＡＣＳ－ＴＩＬの治療転帰を５×１０^４細胞の用量で比較した（図３６）。結果は、ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬが同じ用量下でＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ－ＴＩＬよりも本質的により強力であることを強調した。

【0099】

次に、ＴＩＬの単離と新規腫瘍の導入を同日に実施した場合のＴＩＬの治療転帰を評価した（図３７）。これは、患者が急速に増殖する転移性腫瘍を有し、急速に悪化するという状況を模倣するためであり、これは臨床における患者の２０％に相当する^９。ＴＩＬを、それらの量が最適用量に達したら注射した（５×１０^５細胞）。ＭＡＧＩＣ／ＭＡＣＳ／ＦＡＣＳ－ＴＩＬを用いて、５日目、１０日目、および１５日目に最適用量でＴＩＬを単離した（標的濃度に到達しなかったＦＡＣＳを除く）。この状況下では、ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬは、おそらくインビトロでの高い初期回復および急速な拡大に起因して、高い効力および早期注射の結果として依然として最良の治療転帰を提供する（図３８および図３９）。生存期間の中央値は、未処置、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬについてそれぞれ１８、２０、２１、および３２日である。興味深いことに、ＭＡＧＩＣ－ＴＩＬ群の５匹のマウスのうち２匹は、目に見える腫瘍組織が皮下に見られないように、４０日目に完全寛解であった。このような知見は、最小限のインビトロ増殖（５日間）を受けたＭＡＧＩＣ－ＴＩＬがより良好なインビボ治療効果を有し得ることを示す。この結果は、「若いＴＩＬ」－最小限に培養されたＴＩＬ（若いＴＩＬと称される）が、延長された増殖を受けた標準的なＴＩＬと比較して高いレベルの抗原反応性を有し^１２、転移性黒色腫の退縮を効果的に媒介し得るという考えとよく一致する^１０。最近の研究は、オリゴクローナルＴＩＬが、より大きな増殖能を有する低頻度クローン型によってしばしば増殖することを強調している^４１。結果として、ＴＩＬのクローン組成および腫瘍反応性は、インビトロ増殖中に変化する可能性がある^４２。このことは、「正しい」クローン型の濃縮は、バルクＴＩＬの増殖よりも望ましいという、ＴＩＬ増殖の洗練された性質を明らかにする^４１。最後に、シナリオ２からの腫瘍における浸潤したＣＤ８^＋Ｔ細胞の数を比較して、浸潤能力を直接ベンチマークした（図４０ａ、５８～５９ｂ）。浸潤ＣＤ８＋Ｔ細胞の数および面積（図４０ｂ）は、ＭＡＧＩＣ群において５～１０倍高く上方制御され、これはその陽性の治療結果とよく一致している。総合すると、これらの発見は、ＴＩＬのインビトロ培養を最小限に抑えることの重要性を究明し、効率的な細胞選別を通じて、より多くの初期ＴＩＬを有して開始することの重要性を直接証明する。

【0100】

定量的ＭＡＧＩＣを用いた高力価ＴＩＬの単離

【0101】

ＡＣＴの大きな成功にもかかわらず、その客観的応答率は４０～７０％で変動する^８。現在、ＴＩＬのどの表現型がインビボで最良の治療効力を有するかは不明である。ＴＩＬの高度に腫瘍反応性の集団の同定は、ＡＣＴのより良好な臨床的成功につながり得る。最近の研究は、ＣＤ３９の発現が高度に強力なＴＩＬを定義し得ることを強調している。一方、ＣＤ３９^ｐｏｓ集団は、単独で^{４３，４４}、または他のマーカーと組み合わせて^４５、ＴＩＬの腫瘍反応性集団を正確に決定し、臨床転帰の改善をもたらすことが報告された。一方、ＣＤ３９の発現はＴ細胞疲弊と高度に関連していた^４６。代わりに、ＣＤ３９^ｎｅｇ集団が長期腫瘍管理を促したことが示唆される^４７。したがって、治療効果におけるＣＤ３９発現の役割に関するコンセンサスの欠如がある。興味深いことに、ＣＤ３９の中程度の発現を有するＴＩＬ（ＣＤ３９^ｍｅｄ）がインビトロで無尽蔵の表現型を保持することを示唆するいくつかの証拠がある^４６。ＣＤ３９^ｎｅｇがバイスタンダー集団を定義し^４３、ＣＤ３９^ｐｏｓが疲弊集団を定義するというコンテキストで^４７、バイナリ選別によって無視され、しばしば主観的に陽性^４７または陰性^４３画分に割り当てられる集団であるＣＤ３９^ｍｅｄが、改善された治療転帰を有し得ると仮定される。

【0102】

実験は、ＭＣ－３８を有するマウスモデルからのＣＤ８＋Ｔ細胞の単離によって開始した。ＣＤ３９に基づく二次定量的（直列システム１００ｂ）選別を、ＣＤ８単離後５日目～７日目に実施し、続いてインビトロ特性評価を行った（図４１）。ＣＤ８ Ｔ細胞内のＣＤ３９の発現はバイモーダルではなく、細胞の約２５％がＣＤ３９^ｍｅｄであり（図４２）、これは既存の文献と同様のプロファイルを共有することが最初に確認された^４６。定量的ＭＡＧＩＣ（ｑＭＡＧＩＣ）の流量を６ｍＬ／時間に微調整し、３つのＣＤ３９集団の間の明確な分離を達成した（図４２）。次に、ｑＰＣＲを実施して、細胞毒性、幹細胞性、および疲弊の共通マーカーを含め、様々なＣＤ３９集団の表現型を分析した（図４３）。ＣＤ３９^ｌｏｗ集団は、ＰＲＦ１、ＧＺＭＢ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、２Ｂ４などの細胞毒性および疲弊マーカーの低い発現、ならびにＣＤ２７、ＴＣＦ７、およびＩＬ７Ｒを含む幹細胞性マーカーの高い発現を保持し、非分化幹様表現型を定義し、これは従来の報告とよく一致している^４７。対照的に、ＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団は、既存の論文とよく相関する、非常に疲弊しているが細胞毒性がある表現型を定義した^{４３，４４}。興味深いことに、ＣＤ３９^ｍｅｄ集団は、細胞毒性、幹細胞性、および疲弊マーカーのバランスのとれた発現を有した。ＣＤ３９^ｍｅｄがメモリー幹様Ｔ細胞マーカーであるＴＣＦ７の最も高い発現を有することは注目に値する。

【0103】

タンパク質レベルでの表現型を検証するために、細胞内フローサイトメトリーを実施した（図４４および図６０ａ～図６１）。各集団について同様の傾向が、消耗マーカー（ＰＤ－１、ＴＩＭ３、およびＴＩＧＩＴ）および幹細胞性マーカー（ＣＤ２７およびＴＣＦ７）のパネル内で観察された。特に、ＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団は、ＴＮＦおよびＩＬ－２の有意に低い細胞内発現を有し、これはそれらの疲弊した機能不全表現型の徴候であることが見出された。ＩＬ－２の劇的な減少はまた、このようなＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団が増殖能力を低下させたことを示した。この仮説は、Ｋｉ６７染色によって確認される（図５Ｆ）。メモリー幹様Ｔ細胞のパーセンテージを、ＣＣＲ７／ＣＤ４５の染色を通して各集団で検証し（図４５）、幹様Ｔ細胞の大部分がＣＤ３９^ｌｏｗおよびＣＤ３９^ｍｅｄ集団において提示されることを見出した。また、ＣＤ３９^ｍｅｄ集団が最も高い割合のＰＤ－１^＋／ＴＣＦ７^＋細胞を有することが観察された。このような集団が、定義された腫瘍特異性を有する幹様Ｔ細胞前駆細胞として報告されているため^４８、ＣＤ３９^ｍｅｄ集団は、幹様Ｔ細胞前駆細胞集団を大部分含有する異なる集団であると結論付けられた。

【0104】

次に、機能レベルでの細胞毒性の直接測定として、インビトロ共培養死滅アッセイを実施した（図４６）。ＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団が播種後２４時間で最も高い腫瘍死滅活性を示したことが認められた。ＣＤ３９^ｍｅｄ集団は最初の２４時間でわずかに低い有効性を有したが、４８時間でその死滅活性をＣＤ３９^ｈｉｇｈ集団と同じレベルまで上昇させることができた。したがって、ＰＤ－ｌ^＋／ＴＣＦ７^＋／ＣＤ３９^ｍｅｄ集団は、有効な腫瘍死滅のための高度に細胞毒性の集団を迅速に生成することができた。しかし、ＣＤ３９^ｌｏｗ集団は、２４時間および４８時間で有意に低い死滅活性を保持し、これは、ＣＤ３９^ｌｏｗ細胞が腫瘍反応性を欠くか、または細胞傷害性集団を生成する能力が限られている可能性があることを意味する。この知見は、このような集団がＰＤ－１発現を欠き^４６、非特異的バイスタンダー細胞を含むことが報告された以前の研究とよく一致している^４３。

【0105】

インビボでの異なるＣＤ３９集団の抗腫瘍効力を、ＭＣ－３８を抱えるマウスに選別したＴＩＬを再導入することによって調べた（図４６および図４７）。ＣＤ３９^ｍｅｄ ＴＩＬは、全てのＣＤ３９集団の中で最良の長期抗腫瘍活性を示し、未処置群と比較して生存期間中央値を６０％延長した（図４８）。興味深いことに、ＣＤ３９^ｈｉｇｈ ＴＩＬは、初めに非常に有効であったが、注射の１週間後に腫瘍増殖を制御できなかったことが見出された。これはおそらくその再生不可能な終結表現型によるものである。ＣＤ３９^ｍｅｄ ＴＩＬの並列比較を、最小限のインビトロ培養を受けたバルクＣＤ８ ＴＩＬ（「若いＴＩＬ」）、およびより長いインビトロ培養を受けたバルクＣＤ８ ＴＩＬ（「老いたＴＩＬ」）、ならびにセグメント化された腫瘍画分から浸潤した選別されていないＴＩＬを含む、他のＴＩＬタイプの間で行った。腫瘍体積および生存中央値から判断すると、ＣＤ３９^ｍｅｄ ＴＩＬは、すべてのＴＩＬタイプの中で最良の治療有効性を提供した（図４９）。

【0106】

循環ＴＩＬの選別

【0107】

開示されるシステムおよび方法は、末梢血中の稀な腫瘍反応性Ｔ細胞など、異なる体液中の他の細胞型に適用可能である。加えて、開示されるシステムおよび方法はまた、特定のタンパク質の発現レベルだけでなく、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の反応性に基づいて、細胞を選別することもできる。

【0108】

開示されるシステムおよび方法はまた、陽性、陰性、または定量的選別等の種々の種類の選別用途にも適用可能である。以下に記載する実施例では、２工程の手順によって末梢血から循環腫瘍反応性Ｔ細胞を選別するためのプロトコルを開発した。第１に、ＲＢＣ溶解血液からのＣＤ８細胞のネガティブ選択を行い、続いて多量体ベースのポジティブを用いて、末梢血から特異的抗原（腫瘍／抗原特異的Ｔ細胞とも呼ばれる）に対する反応性を有する高純度Ｔ細胞を単離した。

【0109】

動物モデルを、２つの定義された高度に免疫原性のエピトープ、Ｃ５７ＢＬ６モデルにおけるニワトリオボアルブミン（ＯＶＡ２５７－２６４、ＳＩＩＮＦＥＫＬ）およびＢａｌｂ／ｃモデルにおけるインフルエンザＡ型血球凝集素（ＨＡ５３３－５４１、ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ）を用いて最初に確立した。エピトープの発現を有する腫瘍細胞を皮下注射した。これらのエピトープの免疫原性は、血液中のＯＶＡ／ＨＡ－反応性Ｔ細胞の生成をもたらした。これらの稀な反応性Ｔ細胞は、ＭＨＣ（主要組織適合複合体）またはＨＬＡ（ヒト白血球抗原）－特異的多量体を介して認識することができる。多量体をＭＮＰでさらに磁気的に標識して、腫瘍／エピトープ－反応性Ｔ細胞の捕捉を可能にすることができる。

【0110】

単離前に、ＨＡ反応性Ｔ細胞の存在量は、単核細胞集団の０．０６３％にすぎないことは注目に値する（図６６、選別前パネルを参照）。単離中、マウス全血を腫瘍発達の中間期に採取した。赤血球（ＲＢＣ）をＲＢＣ溶解緩衝液によって溶解した。Ｂ細胞にはＣＤ１９、単球にはＣＤ１１ｂなどを含め、血液細胞の他の部分を標的とするカクテルによって、溶解した細胞を標識した。このようなカクテルは、インハウスで調製することができ、または市販のリソース（例えば、ｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｍｏｕｓｅ ＣＤ８細胞キット、カタログ番号１１４１７Ｄ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）から直接購入することができる。続いてカクテル標識細胞をＭＮＰで標識し、提案されたシステムにより８～３２ｍＬ／時間の流量で（特に、上記のｕｎｔｏｕｃｈｅｄ ｍｏｕｓｅ ＣＤ８細胞キットについて、１６ｍＬ／時間を使用）選別した。ＣＤ８の陰性選択後、ＣＤ８＋細胞の純度は３．７％から９０．８％に改善され（図６６、ＣＤ８後パネル）、ＨＡ反応性Ｔ細胞の希少性は０．０６３％から０．４４％に促進された（図６６、ＣＤ８後パネル）。

【0111】

次に、多量体に基づいて陽性選択を実施して、バルクＣＤ８＋集団からＨＡ反応性Ｔ細胞を精製した。バルクＣＤ８^＋Ｔ細胞を、対応するＰＥコンジュゲート多量体（この特定の場合ではペンタマー）およびそれに応じた抗ＰＥ ＭＮＰによって標識した。多量体上のフルオロフォアのコンジュゲーションは柔軟であり、ＦＩＴＣ （フルオレセインイソチオシアネート）、ＰＥ（フィコエリトリン）、ＡＰＣ（アロフィコシアニン）、シアニンファミリー、およびビオチンはすべて、標識化のために対応するＭＮＰ（例えば、抗ビオチンＭＮＰ）を使用して、機能することになる。多量体標識細胞を、提案されたシステムを用いて、２～８ｍＬ／時間（この特定の場合では４ｍＬ／時間）の流量で選別した。陽性選択後、ＨＡ反応性Ｔ細胞の純度は０．４４％から８３．６％に改善された（図６６、多量体後パネル）。

【0112】

本開示は、ＴＩＬ選別および回収のための開示された方法および装置を説明するが、開示された方法および装置は、他の細胞治療目的のために、他の細胞を含む他の粒子の磁気プロファイリングのために使用され得る。例えば、開示される装置、システム、および方法はまた、末梢血、血管新生腫瘍、悪性胸水、リンパ液、骨髄の流体部分、および他の細胞運搬流体等の他の流体供給源から標的細胞を回収するために使用されてもよい。

【0113】

上述した本開示の実施形態は、単なる例であることを意図している。本開示は、他の特定の形態で具現化され得る。本開示に対する変更、修正、および変形は、本開示の意図される範囲から逸脱することなく行われ得る。本明細書に開示および図示されるシステム、装置、およびプロセスは、特定の数の要素／構成要素を備えてもよいが、システム、装置、およびアセンブリは、付加的またはより少ないそのような要素／構成要素を含むように修正されることができる。例えば、開示される要素／構成要素のいずれも単数として参照され得るが、本明細書に開示される実施形態は、複数のそのような要素／構成要素を含むように修正され得る。上記の実施形態のうちの１つ以上から選択された特徴は、明示的に説明されていない代替実施形態を作成するように組み合わせられてもよい。開示された範囲内の全ての値および部分範囲も開示される。本明細書で説明される主題は、技術における全ての好適な変更を包含および包含することを意図する。言及される全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0114】

参考文献
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【0115】

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３．Ｒｏｈａａｎ， Ｍ． Ｗ．， Ｖａｎ Ｄｅｎ Ｂｅｒｇ， Ｊ． Ｈ．， Ｋｖｉｓｔｂｏｒｇ， Ｐ． ＆ Ｈａａｎｅｎ， Ｊ． Ｂ． Ａ． Ｇ． Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｍｅｌａｎｏｍａ： Ａ ｖｉａｂｌｅ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｏｐｔｉｏｎ １１ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１０７ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １１ Ｍｅｄｉｃａｌ ａｎｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ １１１２ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ６， １-１６ （２０１８）．

【0117】

４．Ｓｅｌｉｋｔａｒ－Ｏｆｉｒ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｈａｒｅｄ ａｎｄ ｎｅｏａｎｔｉｇｅｎ－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｂａｓｅｄ ｏｎ ＣＤ１３７ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８， １-１４ （２０１７）．

【0118】

５．Ｌｅｅ， Ｈ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ８， １１３３４５-１１３３５９ （２０１７）．

【0119】

６．Ｈｕｒｔａｄｏ， Ｍ． Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｅｘｐａｎｄｅｄ ｆｒｏｍ ｐｅｄｉａｔｒｉｃ ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ ｄｉｓｐｌａｙ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １４， １-１８ （２０１９）．

【0120】

７．Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｗｉｔｈ Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｉｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅａｒｌｙ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ４１， ４１３-４２５ （２０１８）．

【0121】

８．Ｌｉｎｄｅｎｂｅｒｇ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｅｖａｌｕａｔｉｎｇ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ａｄｏｐｔｉｏｎ ｓｃｅｎａｒｉｏｓ ｆｏｒ ＴＩＬ－ｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ ｔｈｅ ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ ｏｎ ｉｔｓ （ｅａｒｌｙ） ｃｏｓｔ－ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ． ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０， １-１４ （２０２０）．

【0122】

９．Ｂｏｒｃｈ， Ｔ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｆｕｔｕｒｅ ｒｏｌｅ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ８， １-７ （２０２０）．

【0123】

１０．Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． ＣＤ８＋ ｅｎｒｉｃｈｅｄ ‘Ｙｏｕｎｇ’ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｃａｎ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． １６， ６１２２-６１３１ （２０１０）．

【0124】

１１．Ｄｏｎｉａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ‘ｓｔａｎｄａｒｄ’ ａｎｄ ‘ｙｏｕｎｇ’ ｔｕｍｏｕｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ａｔ ａ ｄａｎｉｓｈ ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ． Ｓｃａｎｄ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ７５， １５７-１６７ （２０１２）．

【0125】

１２．Ｔｒａｎ， Ｋ． Ｑ． ｅｔ ａｌ． Ｍｉｎｉｍａｌｌｙ Ｃｕｌｔｕｒｅｄ Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ Ｄｉｓｐｌａｙ Ｏｐｔｉｍａｌ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｆｏｒ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３１， ７４２-７５１ （２００８）．

【0126】

１３．Ｆｏｒｇｅｔ， Ｍ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｇｅｎｅｒａｔｅ ａｎｄ ｅｘｐａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ－ｇｒａｄｅ， ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ， ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ． Ｆｒｏｎｔ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ８， １-８ （２０１７）．

【0127】

１４．Ｗｉｃｋｓｔｒｏｍ， Ｓ． ＆ Ｌｏｖｇｒｅｎ， Ｔ． Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｍｅｌａｎｏｍａ ｔｕｍｏｒｓ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｖｏｌ． １９１３ １０５-１１８ （２０１９）．

【0128】

１５．Ｐｒｉｅｔｏ， Ｐ． Ａ．， Ｄｕｒｆｌｉｎｇｅｒ， Ｋ． Ｈ．， Ｗｕｎｄｅｒｌｉｃｈ， Ｊ． Ｒ．， Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ， Ｓ． Ａ． ＆ Ｄｕｄｌｅｙ， Ｍ． Ｅ． Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｏｆ ＣＤ８＋ Ｃｅｌｌｓ Ｆｒｏｍ Ｍｅｌａｎｏｍａ Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ Ｒｅｖｅａｌｓ Ｔｕｍｏｒ Ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｆｏｒ Ｕｓｅ ｉｎ Ａｄｏｐｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． ３３， ５４７-５５６ （２０１０）．

【0129】

１６．Ｓｃｈｏｂｅｒ， Ｋ． ＆ Ｂｕｓｃｈ， Ｄ． Ｈ． ＴＩＬ ２．０： Ｍｏｒｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ Ｔ－ｃｅｌｌ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｂｙ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ ｆｏｒ ｄｅｆｉｎｅｄ ａｎｔｉｇｅｎ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ． Ｅｕｒ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４６， １３３５-１３３９ （２０１６）．

【0130】

１７．Ａｎｄｅｒｓｅｎ， Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｌｏｎｇ－Ｌａｓｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｅｌａｎｏｍａ ａｆｔｅｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ａｎｄ ａｎ ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ ｉｌ２ ｒｅｇｉｍｅｎ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２２， ３７３４-３７４５ （２０１６）．

【0131】

１８．Ｄｏｎｇ， Ｍ． Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｔａｒｇｅｔ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ Ｕｓｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅ－Ｓｃａｌｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ＣＤ８ Ｔ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ １７８， １１８９－１２０４．ｅ２３ （２０１９）．

【0132】

１９．Ｈａｌｌ， Ｍ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ （ＴＩＬ） ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ． Ｃａｎｃｅｒ ４， １-１２ （２０１６）．

【0133】

２０．Ｇａｒａｕｄ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｂ ｃｅｌｌｓ ｓｉｇｎａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｈｕｍｏｒａｌ ｉｍｍｕｎｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ． ＪＣＩ Ｉｎｓｉｇｈｔ ４， １-２０ （２０１９）．

【0134】

２１．Ｗａｇｎｅｒ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ Ｔ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ （ＴＩＬ） ｉｎ ｌｉｖｅｒ ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ． Ａｎｎ． Ｓｕｒｇ． Ｏｎｃｏｌ． １５， ２３１０-２３１７ （２００８）．

【0135】

２２．Ｓａｌｏｔ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｌａｒｇｅ ｓｃａｌｅ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｖγ９Ｖδ２ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ ｂｌｏｏｄ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ ｃｅｌｌｓ ａｆｔｅｒ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ＭＡＣＳ ‘ＴＣＲ γ／δ ＋ Ｔ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔ’． Ｊ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｍｅｔｈｏｄｓ ３４７， １２-１８ （２００９）．

【0136】

２３．Ｆａｒａｇｈａｔ， Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ， ｌｏｗ－ｌｏｓｓ， ｌｏｗ－ｃｏｓｔ， ａｎｄ ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ ｃｅｌｌ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｕｓｉｎｇ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ－Ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ． Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ． Ｓ． Ａ． １１４， ４５９１-４５９６ （２０１７）．

【0137】

２４．Ｓｕｔｅｒｍａｓｔｅｒ， Ｂ． Ａ． ＆ Ｄａｒｌｉｎｇ， Ｅ． Ｍ． Ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ－ｙｉｅｌｄ， ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｃｅｌｌ ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ： ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｖｅｒｓｕｓ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｓｃｉ． Ｒｅｐ． ９， １-９ （２０１９）．

【0138】

２５．Ｍａｉｒ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｖｉａ ｉｍｍｕｎｏｍａｇｎｅｔｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． ３， ７９６-８０５ （２０１９）．

【0139】

２６．Ｍｏｏｒｅ， Ｄ． Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｂ－ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ Ｍｉｌｔｅｎｙｉ ＭＡＣＳ ｂｅａｄ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｋｉｔｓ． ＰＬｏＳ Ｏｎｅ １４， １-１５ （２０１９）．

【0140】

２７．Ｇｅｅｎｓ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｍａｇｎｅｔｉｃ－ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ａｎｄ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ－ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｅｓｔｉｃｕｌａｒ ｃｅｌｌ ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎｓ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｈｕｍ． Ｒｅｐｒｏｄ． ２２， ７３３-７４２ （２００７）．

【0141】

２８．Ｗｙａｔｔ Ｓｈｉｅｌｄｓ Ｉｖ， Ｃ．， Ｒｅｙｅｓ， Ｃ． Ｄ． ＆ Ｌｏｐｅｚ， Ｇ． Ｐ． Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ： Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｅｌｌｓ ｆｒｏｍ ｄｅｂｕｌｋｉｎｇ ｔｏ ｒａｒｅ ｃｅｌｌ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １５， １２３０-１２４９ （２０１５）．

【0142】

２９．Ｌｅｅ， Ｗ．， Ｔｓｅｎｇ， Ｐ． ＆ Ｃａｒｌｏ， Ｄ． Ｄｉ． Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｍｉｃｒｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ （２０１７）． ｄｏｉ：１０．１００７／９７８－３－３１９－４４１３９－９．

【0143】

３０．Ｌｉｎ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ－Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ Ｌａｂｙｒｉｎｔｈ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｌａｂｅｌ－ｆｒｅｅ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｔｕｍｏｒ Ｃｅｌｌｓ． Ｃｅｌｌ Ｓｙｓｔ． ５， ２９５－３０４．ｅ４ （２０１７）．

【0144】

３１．Ｃｈｅｎ， Ｋ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｌａｔｅｒａｌ Ｆｉｌｔｅｒ Ａｒｒａｙｓ ｗｉｔｈ Ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ ｆｏｒ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ－Ｔｕｍｏｒ－Ｃｅｌｌ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ５８， ７６０６-７６１０ （２０１９）．

【0145】

３２．Ｍｕｒｒａｙ， Ｃ．， Ｐａｏ， Ｅ．， Ｊａｎｎ， Ａ．， Ｐａｒｋ， Ｄ． Ｅ． ＆ Ｄｉ Ｃａｒｌｏ， Ｄ． Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｓｕｂｓｅｔｓ ｆｏｒ Ｃｅｌｌ Ｔｈｅｒａｐｙ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｕｓｉｎｇ Ｍａｇｎｅｔｉｃ Ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ． ＳＬＡＳ Ｔｅｃｈｎｏｌ． ２３， ３２６-３３７ （２０１８）．

【0146】

３３．Ｍｕｒｒａｙ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｕｎｓｕｐｅｒｖｉｓｅｄ ｃａｐｔｕｒｅ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｒａｒｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｍｕｌｔｉ－ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｒａｔｃｈｅｔｉｎｇ． Ｌａｂ Ｃｈｉｐ １８， ２３９６-２４０９ （２０１８）．

【0147】

３４．Ｗａｎｇ， Ｚ． ｅｔ ａｌ． Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｒａｒｅ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈＰＳＣ－ｄｅｒｉｖｅｄ ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ｓｃｉ． Ａｄｖ． ６， １-１２ （２０２０）．

【0148】

３５．Ｍｏｈａｍａｄｉ， Ｒ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｂｉｎｎｉｎｇ ａｎｄ ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｏｆ ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ ｔｕｍｏｒ ｃｅｌｌ ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ． Ａｎｇｅｗ． Ｃｈｅｍ．， Ｉｎｔ． Ｅｄ． ５４， １３９-１４３ （２０１５）．

【0149】

３６．Ｌａｂｉｂ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｔｒａｃｋｉｎｇ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎ ｔａｒｇｅｔｓ ｉｎ ｒａｒｅ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅ ｌａｂｅｌｌｉｎｇ ａｎｄ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｓｏｒｔｉｎｇ． Ｎａｔ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． （２０２０） ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓ４１５５１－０２０－０５９０－１．

【0150】

３７．Ａｌｌｅｎ， Ｂ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｍａｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ ｉｎ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｓ． Ｎａｔ． Ｍｅｄ． ２６， １１２５-１１３４ （２０２０）．

【0151】

３８．Ｄｅｌ Ｍｏｎｔｅ， Ｕ． Ｄｏｅｓ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｎｕｍｂｅｒ １０９ ｓｔｉｌｌ ｒｅａｌｌｙ ｆｉｔ ｏｎｅ ｇｒａｍ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｔｉｓｓｕｅ？ Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ ８， ５０５-５０６ （２００９）．

【0152】

３９．Ｍａ， Ｑ．， Ｗａｎｇ， Ｙ．， Ｌｏ， Ａ． Ｓ． Ｙ．， Ｇｏｍｅｓ， Ｅ． Ｍ． ＆ Ｊｕｎｇｈａｎｓ， Ｒ． Ｐ． Ｃｅｌｌ ｄｅｎｓｉｔｙ ｐｌａｙｓ ａ ｃｒｉｔｉｃａｌ ｒｏｌｅ ｉｎ ｅｘ ｖｉｖｏ ｅｘｐａｎｓｉｏｎ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｆｏｒ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｊ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ２０１０， （２０１０）．

【0153】

４０．Ｓｃｈｍｉｄｔｓ， Ａ．， Ｗｅｈｒｌｉ， Ｍ． ＆ Ｍａｕｓ， Ｍ． Ｖ． Ｔｏｗａｒｄ Ｂｅｔｔｅｒ Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ｏｆ ＣＡＲ－Ｔ Ｃｅｌｌ-Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ． Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｅｄ． ７２， １-１８ （２０２１）．

【0154】

４１．Ｐｏｓｃｈｋｅ， Ｉ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ｔｈｅ Ｏｕｔｃｏｍｅ ｏｆ Ｅｘ Ｖｉｖｏ ＴＩＬ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｉｓ Ｈｉｇｈｌｙ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｄ ｂｙ Ｓｐａｔｉａｌ Ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｔｕｍｏｒ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ ａｎｄ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｇｒｏｗｔｈ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｔ－Ｃｅｌｌ Ｃｌｏｎｅｓ． Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２６， ４２８９-４３０１ （２０２０）．

【0155】

４２．Ｌｏｚａｎｏ－Ｒａｂｅｌｌａ， Ｍ． ＆ Ｇｒｏｓ， Ａ． ＴＣＲ Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ Ｃｈａｎｇｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ＴＩＬ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ： Ｃｌｏｎａｌ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｒ Ｄｒｉｆｔｉｎｇ？ Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２６， ４１７７-４１７９ （２０２０）．

【0156】

４３．Ｓｉｍｏｎｉ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｂｙｓｔａｎｄｅｒ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ ａｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ ａｎｄ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃａｌｌｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｕｒ ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５７， ５７５-５７９ （２０１８）．

【0157】

４４．Ｋｏｒｔｅｋａａｓ， Ｋ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． ＣＤ３９ Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｈｅ ＣＤ４ ＋ Ｔｕｍｏｒ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｔ－ｃｅｌｌ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒ ． Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｒｅｓ． ８， １３１１-１３２１ （２０２０）．

【0158】

４５．Ｄｕｈｅｎ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏ－ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＤ３９ ａｎｄ ＣＤ１０３ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ ｔｕｍｏｒ－ｒｅａｃｔｉｖｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒｓ． Ｎａｔ． Ｃｏｍｍｕｎ． ９， （２０１８）．

【0159】

４６．Ｃａｎａｌｅ， Ｆ． Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＣＤ３９ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｄｅｆｉｎｅｓ ｃｅｌｌ ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ ｉｎ ｔｕｍｏｒ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ ＣＤ８＋ Ｔ ｃｅｌｌｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ７８， １１５-１２８ （２０１８）．

【0160】

４７．Ｋｒｉｓｈｎａ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ ＣＤ８ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｍｅｄｉａｔｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｏｆ ａｄｏｐｔｉｖｅ ｃｅｌｌ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ａｇａｉｎｓｔ ｈｕｍａｎ ｃａｎｃｅｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３７０， １３２８-１３３４ （２０２０）．

【0161】

４８．Ｓｉｄｄｉｑｕｉ， Ｉ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ Ｔｃｆ１ ＋ ＰＤ－１ ＋ ＣＤ８ ＋ Ｔ Ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈ Ｓｔｅｍ－ｌｉｋｅ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｐｒｏｍｏｔｅ Ｔｕｍｏｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ Ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｈｅｃｋｐｏｉｎｔ Ｂｌｏｃｋａｄｅ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ． Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ５０， １９５－２１１．ｅ１０ （２０１９）．

【0162】

４９．Ｖｅｎｚａｃ， Ｂ． ｅｔ ａｌ． ＰＤＭＳ Ｃｕｒｉｎｇ Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｎ ３Ｄ－Ｐｒｉｎｔｅｄ Ｍｏｌｄｓ： Ｗｈｙ？ Ａｌｓｏ， Ｈｏｗ ｔｏ Ａｖｏｉｄ Ｉｔ？． Ａｎａｌ． Ｃｈｅｍ． ９３， １９， ７１８０-７１８７ （２０２１）．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17】

【図18】

【図19】

【図20】

【図21】

【図22】

【図23】

【図24】

【図25】

【図26】

【図27】

【図28】

【図29】

【図30】

【図31】

【図32】

【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【図44】

【図45】

【図46】

【図47】

【図48】

【図49】

【図50】

【図51】

【図52】

【図53】

【図54】

【図55】

【図56】

【図57】

【図58】

【図59】

【図60】

【図61】

【図62a】

【図62b】

【図62c】

【図63】

【図64】

【図65】

【図66】

【国際調査報告】