ホーム > 特許ランキング > ブレニュス ファーマ
知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
特表2024-508003非自己多重ストレスを受けたがん細胞ならびにがんのワクチン接種および処置ためのそれらの使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-21
(54)【発明の名称】非自己多重ストレスを受けたがん細胞ならびにがんのワクチン接種および処置ためのそれらの使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/09 20100101AFI20240214BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240214BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/385 20060101ALI20240214BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240214BHJP
A61K 35/36 20150101ALI20240214BHJP
A61K 35/37 20150101ALI20240214BHJP
A61K 35/13 20150101ALI20240214BHJP
【ＦＩ】
C12N5/09
A61P35/00
A61P37/04
A61K39/385
A61K39/00 Z
A61K39/00 B
A61K35/36
A61K35/37
A61K35/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023552331
(86)(22)【出願日】2022-02-25
(85)【翻訳文提出日】2023-10-23
(86)【国際出願番号】 EP2022054883
(87)【国際公開番号】W WO2022180251
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】63/154,103
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523326366
【氏名又は名称】ブレニュス ファーマ
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】ピントゥール，ブノワ
(72)【発明者】
【氏名】ブラヴェッティ，ポール
【テーマコード（参考）】
4B065
4C085
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC02
4B065AC20
4B065BA21
4B065BB31
4B065BB40
4B065BD03
4B065BD04
4B065CA45
4C085AA03
4C085AA38
4C085BB01
4C085CC03
4C085DD21
4C085DD86
4C085EE01
4C085EE06
4C085FF24
4C085GG01
4C085GG02
4C085GG03
4C085GG04
4C085GG05
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB64
4C087MA65
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA14
4C087ZB09
4C087ZB26
(57)【要約】
本発明は、細胞療法のための先端医療医薬品（ＡＭＴＰ）の分野に関する。特に、本発明は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む組成物、ならびにインビトロで適用されたストレスに応答してこれらの細胞により産生される免疫原性ストレスタンパク質を含む組成物に関する。組成物は、がん細胞においてその場で観察される複数の細胞耐性機構に同時に対抗することを可能にし、したがって、ヒト患者におけるがんのワクチン接種および処置にとって好適である。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答してこれらの細胞により産生された免疫原性ストレスタンパク質を含む組成物。
【請求項2】
ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞が、ストレスタンパク質の前記産生をもたらす、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスおよび任意のそれらの組み合わせを含む群から選択される、インビトロで適用された１つまたは複数のストレスに応答して耐性機構を発達させている、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞が、非増殖性である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項4】
免疫原性ストレスタンパク質が、好ましくは、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン：（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド、を含む群から選択されるハプテンを用いて、より好ましくは、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）を用いてハプテン化される、請求項１～３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項5】
医薬組成物またはワクチン組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項6】
約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項7】
それを必要とする対象におけるがんの処置に使用するための、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項8】
（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、ならびに（ｉｉ）ストレスタンパク質、を含む中間組成物であって、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの前記１つが、前記ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して耐性機構を発達させている、中間組成物。
【請求項9】
（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、および（ｉｉ）ストレスタンパク質、を含む中間組成物であって、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの前記１つが、前記ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して耐性機構を発達させている、中間組成物。
【請求項10】
請求項８または９に記載の中間組成物の製造方法であって、以下のステップ：ａ）ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を好適な培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）で培養されたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、１つまたは複数のストレスにインビトロで供し、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞が、前記１つまたはいくつかのストレスに応答して耐性機構を発達させ、それによりストレスタンパク質を産生するステップ；
ｃ）前記ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、それらがステップｂ）で産生したストレスタンパク質と共に回収するステップ；
ｄ）ステップｃ）で共に回収した、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞、およびそれらが産生したストレスタンパク質を、前記ストレスタンパク質を免疫原性にすることが可能な分子または方法により処置するステップ、
を含む、方法。
【請求項11】
ステップｃ）が、ステップｂ）の完了の少なくとも数時間後、好ましくは、少なくとも１２時間後またはそれ以降に実施される、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
ステップｄ）が、ストレスタンパク質を、免疫原性を付与することが可能な手段にストレスタンパク質を連結するかまたはそれと複合体形成させるステップを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項13】
免疫原性を付与することが可能な手段がハプテンであり、好ましくは、前記ハプテンが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミド、を含む群から選択され、より好ましくは、前記ハプテンが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
ステップｂ）が、ステップａ）で培養された前記ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、同時にまたは逐次にインビトロで適用された次記のストレス：（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙ、好ましくは約１～約１５Ｇｙの範囲の総線量で、好ましくは約１～約２０分の範囲の時間にわたる；好ましくは約１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約３８℃～約４５℃の範囲の温度で、約１５分間～約４時間の範囲の時間にわたり、細胞に適用されたインビトロ熱ショック；好ましくは約４２℃の温度で約６０分間にわたり細胞に適用されたインビトロ熱ショック、
に供することを含む、請求項８に記載の中間組成物を製造するための、請求項１０から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項15】
ステップｂ）が、ステップａ）で培養された前記ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、同時にまたは逐次にインビトロで適用された次記のストレス：（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでのインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件でのインビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間の範囲の時間にわたるインビトロ曝露、
に供することを含む、請求項９に記載の中間組成物の製造のための、請求項１０～１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項16】
－前記細胞がＨＴ－２９細胞であり、（ｉｉ）での前記インビトロ曝露が約１３μＭのオキサリプラチンに対し約７２時間にわたる曝露であり；または－前記細胞がＨＣＴ－１１６細胞であり、（ｉｉ）でのインビトロ曝露が約４８時間にわたる、約３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）に対する曝露であり；または
－前記細胞がＬｏＶｏ細胞であり、（ｉｉ）でのインビトロ曝露が約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）に対する曝露である、
請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
ａ．請求項８および９に記載の６つの中間組成物を得るステップであって、前記６つの中間組成物が：
1）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項８に記載の中間組成物、
２）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項８に記載の中間組成物、
３）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項８に記載の中間組成物、
４）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項９に記載の中間組成物、
５）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項９に記載の中間組成物、
６）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む、請求項９に記載の中間組成物、を含むステップ；
ｂ．これらの６つの中間組成物を共に混合するステップであって、
好ましくは、これらの６つの中間組成物が、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞と等しい比率で共に混合されるステップ、
を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組成物の製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、細胞療法のための先端医療医薬品（ＡＭＴＰ）の分野に関する。特に、本発明は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む組成物、ならびにインビトロで加えられたストレスに応答してこれらの細胞により産生される免疫原性のストレスタンパク質に関する。この組成物は、がん細胞で観察される複数の細胞耐性機構に同時に対抗することを可能にし、したがって、ヒト患者におけるがんのワクチン接種および処置に好適である。
本発明は、細胞療法のための先端医療医薬品（ＡＭＴＰ）の分野に関する。特に、本発明は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む組成物、ならびにインビトロで加えられたストレスに応答してこれらの細胞により産生される免疫原性のストレスタンパク質に関する。この組成物は、がん細胞で観察される複数の細胞耐性機構に同時に対抗することを可能にし、したがって、ヒト患者におけるがんのワクチン接種および処置に好適である。
【背景技術】
【0002】
免疫系は、２つの防護機構，即ち、急速であるが非特異的である自然免疫、および遅いが特異的であり、記憶を有する獲得免疫に基づく。これらの２つの補完的機構は、細胞媒介免疫応答の際に直接的に、または液性免疫応答の際に活性分子（例えば、免疫グロブリン、サイトカインなど）の分泌を介して細胞を動員することにより、外部および内側からの「攻撃」に対して戦う能力を与える。
【0003】
免疫は、原発性非ウィルス性がんの発生に対し、宿主を保護するのみでなく、腫瘍免疫原性も形成する。がん免疫編集は、３つの段階：排除（すなわち、がんの免疫監視）、平衡、および逃避からなる過程である。第１段階では、免疫系は、腫瘍増殖に対し戦い、これは、腫瘍に関連する組織および環境変化（マクロファージ、ＮＫ細胞、ＤＣ細胞などの非特異的細胞の動員、抗増殖性および／またはアポトーシス性分子の分泌、サイトカインの産生、ならびにＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の動員および活性化）の関与を必然的に伴う。第２段階の間に、感受性のあるがん細胞は排除され、最も耐性である細胞の免疫選択が作動する。作動している耐性機構は、アポトーシスに対する耐性、阻害性サイトカイン（ＴＧＦ－β、ＩＬ－１０、ＰＧＥ２またはＩＤＯ）の分泌、抗原提示の変化（クラスＩ主要組織適合抗原（ＭＨＣ）の発現の部分的または完全な消失）、中和分子の分泌、および細胞性免疫系に反撃するためのＭＩＣＡまたはＭＩＣＢ転写物の発現である。この段階の間に、破壊されるがん細胞の数は、耐性細胞の数と平衡状態にあり、したがって、この段階の名前になっている。第２段階は、特に、がん患者の処置の際に観察される寛解期に対応する。第３段階の間に、免疫系の種々の保護機構に対して耐性のがん細胞が、増殖する。これらのがん細胞はその後、腫瘍塊を発達させ、これが、生理学的逃避現象の臨床発現である。関連する逃避現象は、がんの進行および転移段階でも観察される。
【0004】
抗がんの処置は、手術を含み、その目的は、主に、腫瘍塊を除去または低減させることであるが、発がんの過程に対し何ら実際的阻害効果はなく、したがって、手術は通常、がん細胞を完全に除去するために、種々の処置療法を補充される。
【0005】
放射線療法は、がん細胞の場合のように、急速に増殖している細胞のＤＮＡの変化をもたらすことが意図されている。放射線療法の副作用には２つの要素があり、第１は、がん細胞だけが照射されるのではなく、健全細胞も同様に照射され、これは、健全細胞の「がん化」を引き起こし得る；第２に、がん細胞は、ＨＳＰ、ＧＲＰなどのシャペロンタンパク質を発現することにより、照射誘導アポトーシスに対し耐性を生じ、逃避現象をもたらす。
【0006】
化学療法剤は、がん細胞それ自体に対し作用すること、または特定の代謝経路を阻害することのいずれかにより、がん細胞を排除することが意図されている。化学療法剤は、求電子剤、インターカレート剤、または分解剤などのＤＮＡと直接相互作用する薬剤、ＤＮＡ合成阻害剤（代謝拮抗薬、トポイソメラーゼ阻害剤、紡錘体形成阻害剤、など）、新生血管形成阻害剤、プロテアソーム阻害剤などのＤＮＡと間接的に相互作用する薬剤を含む。ここで再度、耐性機構ががん細胞により発達し、多剤化学療法戦略にも関わらず、大量の腫瘍増殖を伴う再発現象が観察され得る。
【0007】
免疫療法は、受容体を遮断し、細胞溶解を誘導し、細胞傷害性を刺激する、またはアポトーシスの阻害を解除する抗体またはサイトカインの注射に基づく受動免疫療法；および「ワクチン接種による免疫化」とも呼ばれる能動免疫療法を含み、後者の場合、患者は、ＥＵ規則１３９４／２００７により欧州で定義された新規クラスの医薬品である「先端医療医薬品」（ＡＴＭＰ）を用いてがんに対し免疫される。
【0008】
遺伝子療法（ＧＴＭＰと呼ばれる）のための各種ＡＴＭＰが多様ながんの臨床試験で使用されている；若干の例を示すと、アデノウィルスベクターは、頭頸部がんにおいてｐ５３を発現させるために、または膀胱がんにおいてＣＤ４０Ｌを発現させるために使用された；ＧＭ－ＣＳＦをコードする腫瘍溶解性ヘルペスウィルスが黒色腫の患者に使用された；および種々の腫瘍関連抗原に向け直されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）によって操作されたＴ細胞も最近使用されている。
【0009】
臨床的に意味のある免疫応答を誘発する試みで、腫瘍抗原をロードした自家樹状細胞（ＤＣ）を含む細胞療法のためのＡＭＴＰ（ＣＴＭＰと呼ばれる）も使用されている。例えば、ＦＤＡおよびＥＭＡは、２０１０年および２０１３年にそれぞれ、前立腺がんのためのＤＣベースの治療ワクチン（Ｄｅｎｄｒｅｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，ＬＬＣにより開発された、シプロイセル－Ｔ、商品名「プロベンジ」）を承認したが、欧州委員会は、２０１５年に、欧州連合でのシプロイセル－Ｔの製造承認を取り消した。
【0010】
しかし、ＡＭＴＰによっても同様に、免疫系を伴う３段階がん免疫編集で記載された天然の逃避現象と類似の逃避現象が観察される。
したがって、固有の有効性を提供し、および／または複数治療戦略に寄与することができる、がんの処置のための治療戦略がなおも必要である。
したがって、固有の有効性を提供し、および／または複数治療戦略に寄与することができる、がんの処置のための治療戦略がなおも必要である。
【0011】
がんの耐性現象、特に、アポトーシスに対する耐性におけるシャペロンタンパク質の役割をより良好に理解するために、多くの試験が行われている。特に、ヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）、グルコース制御タンパク質（ＧＲＰ）および多剤耐性タンパク質（ＭＲＰ）は、耐性因子であり、保護作用を有することは公知である。これらのタンパク質は、低酸素、低い炭水化物濃度などの代謝攻撃、熱ストレス、放射線照射などの物理的攻撃、または薬物などの化学的攻撃の結果としての耐性の機構として、がん細胞により産生される。
【0012】
結果として、これらのシャペロンタンパク質の阻害に基づく処置戦略を開発するための試験が行われているが、これらは、全体としてまちまちな結果のために、高い毒性レベルを含む副作用がないわけではない。シャペロンタンパク質、特に、ＨＳＰ７０を、マウスのがん細胞に対する免疫化の因子として使用する試験も行われている。しかし、この手法は、特定のシャペロンタンパク質に焦点を絞り、がん細胞により発達した保護機構全体を考慮してはいない。
【0013】
この問題に対処するために、発明者らは、がん細胞耐性機構に対抗することが可能な医薬またはワクチン組成物を得るためのインビトロ法を記載し、この方法は、患者に適用された処置プロトコルの過程で、特定のストレス（複数のストレス）にインビボで供されたがん細胞によりその場で発達した機構と同一の特定の耐性機構を有する自家がん細胞のインビトロ産生にその他の点で適合する（米国特許第１１，０９６，９９５号；欧州特許第３ ０５７ ９８１号）。これらの組成物のマウスへのインビボ投与後に、データは、腫瘍体積および重量に対して好ましい影響を示し、概念の証拠を確証した。
【0014】
ここで、発明者らは、更に進めて、多剤耐性機構に同時に対抗する、ヒト患者のワクチン接種および種々のがんの処置に好適である、非自己の多重ストレスを受けた細胞の選択を含む新規組成物を提供する。
【発明の概要】
【0015】
本発明は以降、特に、添付の特許請求の範囲で開示される通りである。
特に、本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスタンパク質を含む組成物に関する。
特に、本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスタンパク質を含む組成物に関する。
【0016】
一実施形態では、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞は、ストレスタンパク質の産生をもたらす、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスおよび任意のそれらの組み合わせを含む群から選択される、インビトロで適用された１種または複数のストレスに応答して耐性機構を発達させている発現した。
一実施形態では、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏは、非増殖性である。
一実施形態では、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏは、非増殖性である。
【0017】
一実施形態では、免疫原性ストレスタンパク質は、ハプテン化される。一実施形態では、免疫原性ストレスタンパク質は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドを含む群から選択されるハプテンでハプテン化される。一実施形態では、免疫原性ストレスタンパク質は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）でハプテン化される。
【0018】
一実施形態では、組成物は、医薬組成物またはワクチン組成物であり、少なくとも１種の薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む。
一実施形態では、組成物は、約１０５～約１０８個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。
本開示は、それを必要とする対象におけるがんの処置に使用するためのこの組成物に更に関する。本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、この組成物を対象に投与することを含む方法にも関する。
一実施形態では、組成物は、約１０５～約１０８個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。
本開示は、それを必要とする対象におけるがんの処置に使用するためのこの組成物に更に関する。本発明は、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、この組成物を対象に投与することを含む方法にも関する。
【0019】
本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、ならびに（ｉｉ）ストレスタンパク質、を含む中間組成物であって、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つが、ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して耐性機構を発達させている、中間組成物に更に関する。
本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、および（ｉｉ）ストレスタンパク質、を含む中間組成物であって、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つが、ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレスに応答して耐性機構を発達させている。
本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、および（ｉｉ）ストレスタンパク質、を含む中間組成物であって、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つが、ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレスに応答して耐性機構を発達させている。
【0020】
本発明は、更に前記中間組成物の製造方法であって、以下のステップ：
ａ）ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を好適な培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）で培養されたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、１つまたは複数のストレスにインビトロで供するステップであって、これらのＨＴ２９，ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏが、１つまたは複数のストレスに応答して耐性機構を発達させ、それによりストレスタンパク質を産生するステップ；
ｃ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、それらがステップｂ）で産生したストレスタンパク質と一緒に回収するステップ；
ｄ）ステップｃ）で全てが共に回収された、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞、およびそれらが産生したストレスタンパク質を、ストレスタンパク質を免疫原性にすることが可能な分子または方法により処置するステップ
を含む方法に関する。
一実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の完了後少なくとも数時間、好ましくはステップｂ）の完了後少なくとも１２時間以上、実施される。
一実施形態では、ステップｄ）は、ストレスタンパク質を、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するか、またはそれと複合体形成するステップを含む。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、ハプテンである。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドを含む群から選択されるハプテンである。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）である。
ａ）ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を好適な培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）で培養されたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、１つまたは複数のストレスにインビトロで供するステップであって、これらのＨＴ２９，ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏが、１つまたは複数のストレスに応答して耐性機構を発達させ、それによりストレスタンパク質を産生するステップ；
ｃ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、それらがステップｂ）で産生したストレスタンパク質と一緒に回収するステップ；
ｄ）ステップｃ）で全てが共に回収された、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞、およびそれらが産生したストレスタンパク質を、ストレスタンパク質を免疫原性にすることが可能な分子または方法により処置するステップ
を含む方法に関する。
一実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の完了後少なくとも数時間、好ましくはステップｂ）の完了後少なくとも１２時間以上、実施される。
一実施形態では、ステップｄ）は、ストレスタンパク質を、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するか、またはそれと複合体形成するステップを含む。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、ハプテンである。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドを含む群から選択されるハプテンである。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）である。
【0021】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、ならびに（ｉｉ）ストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」を製造するためであり、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つは、ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して耐性機構を発達させており、前記方法のステップｂ）は、ステップａ）で培養したＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、同時にまたは逐次にインビトロで適用された以下のストレスに供することを含む：
（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでのインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙ、好ましくは約１～約１５Ｇｙの範囲の総線量で、好ましくは約１～約２０分の範囲の時間にわたるインビトロ放射線照射；好ましくは約１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、ならびに
（ｉｉｉ）約３８℃～約４５℃の範囲の温度で、約１５分間～約４時間の範囲の時間にわたり適用されたインビトロ熱ショック；好ましくは約４２℃の温度で約６０分間にわたり適用されたインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでのインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙ、好ましくは約１～約１５Ｇｙの範囲の総線量で、好ましくは約１～約２０分の範囲の時間にわたるインビトロ放射線照射；好ましくは約１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、ならびに
（ｉｉｉ）約３８℃～約４５℃の範囲の温度で、約１５分間～約４時間の範囲の時間にわたり適用されたインビトロ熱ショック；好ましくは約４２℃の温度で約６０分間にわたり適用されたインビトロ熱ショック。
【0022】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、ならびに（ｉｉ）ストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」を製造するためであり、ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、またはストレスを受けたＬｏＶｏ細胞のうちの１つは、ストレスタンパク質の産生をもたらす、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して耐性機構を発達させており、前記方法のステップｂ）は、ステップａ）で培養したＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、同時にまたは逐次にインビトロで適用された以下のストレスに供することを含む：
（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでのインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間の範囲の時間にわたるインビトロ曝露。
最新の実施形態では、少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへのインビトロ曝露は、以下の通りであり得る：
－細胞がＨＴ－２９細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンに対するものであり；または
－細胞がＨＣＴ－１１６細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約４８時間にわたる、約３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）に対するものであり；または
－細胞がＬｏＶｏ細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）に対するものである。
（ｉ）枯渇培地中、低酸素下、および／または低いｐＨでのインビトロ培養；好ましくは、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間の範囲の時間にわたるインビトロ曝露。
最新の実施形態では、少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへのインビトロ曝露は、以下の通りであり得る：
－細胞がＨＴ－２９細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンに対するものであり；または
－細胞がＨＣＴ－１１６細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約４８時間にわたる、約３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）に対するものであり；または
－細胞がＬｏＶｏ細胞の場合、（ｉｉ）でのインビトロ曝露は、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）に対するものである。
【0023】
本発明は、更に本発明の組成物の製造方法であって、以下のステップ：
ａ．６つの中間組成物を得るステップであって、６つの中間組成物が：
１）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
２）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
３）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
４）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、
５）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、
６）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、であるステップ、
ｂ．これら６つの中間組成物を共に混合するステップ
を含む方法に関する。
一実施形態では、６つの中間組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞と等しい比率で共に混合される。
ａ．６つの中間組成物を得るステップであって、６つの中間組成物が：
１）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
２）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
３）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ａ」、
４）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、
５）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、
６）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞およびストレスタンパク質を含む中間組成物「ＤＳ－Ｂ」、であるステップ、
ｂ．これら６つの中間組成物を共に混合するステップ
を含む方法に関する。
一実施形態では、６つの中間組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞と等しい比率で共に混合される。
【0024】
定義
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書で使用される場合、「ＨＴ－２９細胞」は、１９６４年に４４才の女性の原発腫瘍から単離されたヒト結腸腺癌細胞株を指す。これは、特に、下記の配列多様性を含む：
－ＡＰＣ ｐ．Ｂｌｕ８５３Ｔｅｒ（ｃ．２５５７Ｇ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ｔｈｒ１５５６Ａｓｎｆｓ＊３（ｃ．４６６６ｄｕｐＡ）に関してヘテロ接合、
－ＢＲＡＦ ｐ．Ｖａｌ６００Ｇｌｕ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＰＩＫ３ＣＡ ｐ．Ｐｒｏ４４９Ｔｈｒ（ｃ．１３４５Ｃ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＳＭＡＤ４ ｐ．Ｇｌｎ３１１Ｔｅｒ（ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ）に関してホモ接合、および
－ＴＰ５３ ｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ（ｃ．８１８Ｇ＞Ａ）に関してホモ接合。
本発明では、以下の用語は以下の意味を有する。
本明細書で使用される場合、「ＨＴ－２９細胞」は、１９６４年に４４才の女性の原発腫瘍から単離されたヒト結腸腺癌細胞株を指す。これは、特に、下記の配列多様性を含む：
－ＡＰＣ ｐ．Ｂｌｕ８５３Ｔｅｒ（ｃ．２５５７Ｇ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ｔｈｒ１５５６Ａｓｎｆｓ＊３（ｃ．４６６６ｄｕｐＡ）に関してヘテロ接合、
－ＢＲＡＦ ｐ．Ｖａｌ６００Ｇｌｕ（ｃ．１７９９Ｔ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＰＩＫ３ＣＡ ｐ．Ｐｒｏ４４９Ｔｈｒ（ｃ．１３４５Ｃ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＳＭＡＤ４ ｐ．Ｇｌｎ３１１Ｔｅｒ（ｃ．９３１Ｃ＞Ｔ）に関してホモ接合、および
－ＴＰ５３ ｐ．Ａｒｇ２７３Ｈｉｓ（ｃ．８１８Ｇ＞Ａ）に関してホモ接合。
【0025】
この細胞株は、Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓデータベースでは受入番号「ＣＶＣＬ＿０３２０」として、およびＡＴＣＣリポジトリコレクションでは「ＨＴＢ－３８（商標）」として参照され、それぞれのリポジトリから販売されている。この細胞株に対する他の受入番号は、Ｂａｎｃｏ Ｃｅｌｕｌａｓ ｄｏ Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ（ＢＣＲＪ）の「０１１１」；Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨの「ＡＣＣ２９９」；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）の「９１０７２２０１」；Ｋｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）の「３００３８」；およびＣｈｉｎａ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＣＣＴＣＣ）の「ＧＤＣ０１４９」を含む。これらのコレクションの内容、特に、この細胞株の遺伝子型、ＨＬＡ型判定、ＳＴＲプロファイルおよび表現型に関する説明は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0026】
本明細書で使用される場合、「ＨＣＴ－１１６細胞」は、１９８１年に４８才の男性の原発腫瘍から単離されたヒト結腸癌腫細胞株を指す。これは、特に、下記の配列多様性を含む：
－ＡＣＶＲ２Ａ ｐ．Ｌｙｓ４３７Ａｒｇｆｓ＊５（ｃ．１３１０ｄｅｌＡ）に関してホモ接合、
－ＢＲＣＡ２ ｐ．Ｉｌｅ２６７５Ａｓｐｆｓ＊６（ｃ．８０２１ｄｕｐＡ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ａｒｇ２４Ｓｅｒｆｓ＊２０（ｃ．６８ｄｕｐＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ａｓｐ７４ｆｓ＊２１（ｃ．２２０ｄｅｌＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ｇｌｕ３３Ａｒｇｆｓ＊２０（ｃ．９７ｄｅｌＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＴＮＮＢ１ ｐ．Ｓｅｒ４５ｄｅｌ（ｃ．１３３＿１３５ｄｅｌＴＣＴ）に関してヘテロ接合、
－ＥＰ３００ ｐ．Ｍｅｔ１４７０Ｃｙｓｆｓ＊２２（ｃ．４４０８ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＥＰ３００ ｐ．Ａｓｎ１７００Ｔｈｒｆｓ＊９（ｃ．５０９９ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ｃ．３８Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＰＩＫ３ＣＡ ｐ．Ｈｉｓ１０４７Ａｒｇ（ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ）に関してヘテロ接合、および
－ＴＧＦＢＲ２ ｐ．Ｌｙｓ１２８Ｓｅｒｆｓ＊３５（ｃ．３８３ｄｅｌＡ）に関してホモ接合。
－ＡＣＶＲ２Ａ ｐ．Ｌｙｓ４３７Ａｒｇｆｓ＊５（ｃ．１３１０ｄｅｌＡ）に関してホモ接合、
－ＢＲＣＡ２ ｐ．Ｉｌｅ２６７５Ａｓｐｆｓ＊６（ｃ．８０２１ｄｕｐＡ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ａｒｇ２４Ｓｅｒｆｓ＊２０（ｃ．６８ｄｕｐＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ａｓｐ７４ｆｓ＊２１（ｃ．２２０ｄｅｌＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＤＫＮ２Ａ ｐ．Ｇｌｕ３３Ａｒｇｆｓ＊２０（ｃ．９７ｄｅｌＧ）に関してヘテロ接合、
－ＣＴＮＮＢ１ ｐ．Ｓｅｒ４５ｄｅｌ（ｃ．１３３＿１３５ｄｅｌＴＣＴ）に関してヘテロ接合、
－ＥＰ３００ ｐ．Ｍｅｔ１４７０Ｃｙｓｆｓ＊２２（ｃ．４４０８ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＥＰ３００ ｐ．Ａｓｎ１７００Ｔｈｒｆｓ＊９（ｃ．５０９９ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ｃ．３８Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＰＩＫ３ＣＡ ｐ．Ｈｉｓ１０４７Ａｒｇ（ｃ．３１４０Ａ＞Ｇ）に関してヘテロ接合、および
－ＴＧＦＢＲ２ ｐ．Ｌｙｓ１２８Ｓｅｒｆｓ＊３５（ｃ．３８３ｄｅｌＡ）に関してホモ接合。
【0027】
この細胞株は、Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓデータベースでは受入番号「ＣＶＣＬ＿０２９１」として、およびＡＴＣＣリポジトリコレクションでは「ＣＣＬ－２４７（商標）」として参照され、それぞれのリポジトリから販売されている。この細胞株に対する他の受入番号は、Ｂａｎｃｏ Ｃｅｌｕｌａｓ ｄｏ Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ（ＢＣＲＪ）の「０２８８」；Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨの「ＡＣＣ５８１」；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）の「９１０９１００５」；およびＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）の「１０２４７」を含む。これらのコレクションの内容、特に、この細胞株の遺伝子型、ＨＬＡ型判定、ＳＴＲプロファイルおよび表現型に関する説明は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0028】
本明細書で使用される場合、「ＬｏＶｏ細胞」は、１９７１年に５６才の男性の左鎖骨上領域の転移腫瘍のフラグメントから単離されたヒト結腸直腸腺癌を指す。これは、特に、下記の配列多様性を含む：
－ＡＣＶＲ２Ａ ｐ．Ｌｙｓ４３７Ａｒｇｆｓ＊５（ｃ．１３１０ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ａｒｇ１１１４Ｔｅｒ（ｃ．３３４０Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ｍｅｔ１４３１ｆｓ＊４２（ｃ．４２８９ｄｅｌＣ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ａｒｇ２８１６Ｇｌｎ（ｃ．８４４７Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－Ｂ２Ｍ ｐ．Ｌｅｕ１５Ｐｈｅｆｓ＊４１（ｃ．４３＿４４ｄｅｌＣＴ）に関してヘテロ接合、
－ＦＢＸＷ７ ｐ．Ａｒｇ５０５Ｃｙｓ（ｃ．１５１３Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ｃ．３８Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＳＭＡＤ２ ｐ．Ａｌａ２９２Ｖａｌ（ｃ．８７５Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、および
－ＴＧＦＢＲ２ ｐ．Ｌｙｓ１２８Ｓｅｒｆｓ＊３５（ｃ．３８３ｄｅｌＡ）に関してホモ接合。
－ＡＣＶＲ２Ａ ｐ．Ｌｙｓ４３７Ａｒｇｆｓ＊５（ｃ．１３１０ｄｅｌＡ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ａｒｇ１１１４Ｔｅｒ（ｃ．３３４０Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ｍｅｔ１４３１ｆｓ＊４２（ｃ．４２８９ｄｅｌＣ）に関してヘテロ接合、
－ＡＰＣ ｐ．Ａｒｇ２８１６Ｇｌｎ（ｃ．８４４７Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－Ｂ２Ｍ ｐ．Ｌｅｕ１５Ｐｈｅｆｓ＊４１（ｃ．４３＿４４ｄｅｌＣＴ）に関してヘテロ接合、
－ＦＢＸＷ７ ｐ．Ａｒｇ５０５Ｃｙｓ（ｃ．１５１３Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、
－ＫＲＡＳ ｐ．Ｇｌｙ１３Ａｓｐ（ｃ．３８Ｇ＞Ａ）に関してヘテロ接合、
－ＳＭＡＤ２ ｐ．Ａｌａ２９２Ｖａｌ（ｃ．８７５Ｃ＞Ｔ）に関してヘテロ接合、および
－ＴＧＦＢＲ２ ｐ．Ｌｙｓ１２８Ｓｅｒｆｓ＊３５（ｃ．３８３ｄｅｌＡ）に関してホモ接合。
【0029】
この細胞株は、Ｃｅｌｌｏｓａｕｒｕｓデータベースでは受入番号「ＣＶＣＬ＿０３９９」として、およびＡＴＣＣリポジトリコレクションでは「ＣＣＬ－２２９（商標）」として参照され、それぞれのリポジトリから販売されている。この細胞株に対する他の受入番号は、Ｂａｎｃｏ Ｃｅｌｕｌａｓ ｄｏ Ｒｉｏ ｄｅ Ｊａｎｅｉｒｏ（ＢＣＲＪ）の「０３３２」；Ｌｅｉｂｎｉｚ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ＤＳＭＺ－Ｇｅｒｍａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ａｎｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ ＧｍｂＨの「ＡＣＣ３５０」；Ｇｅｎｅｒａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ａｕｔｈｅｎｔｉｃａｔｅｄ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＥＣＡＣＣ）の「８７０６０１０１」；およびＫｏｒｅａｎ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｂａｎｋ（ＫＣＬＢ）の「１０２２９」を含む。これらのコレクションの内容、特に、この細胞株の遺伝子型、ＨＬＡ型判定、ＳＴＲプロファイルおよび表現型に関する説明は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0030】
本明細書で使用される場合、「化学療法剤」は、腫瘍成長の阻害に有効な任意の分子を指す。化学療法剤の例には、解剖治療化学（ＡＴＣ）分類システムの亜群Ｌ０１に記載のものが含まれる。化学療法剤のさらなる例としては、限定されないが、下記が挙げられる：
ｉ．アルキル化剤、例えば、：
・クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロフォスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物・塩酸塩、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン、ウラシルマスタードなどを含むナイトロジェンマスタード；
・カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、クロロゾトシンなどを含むニトロソウレア；
・ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファンなどを含むスルホン酸アルキル
・カルボコン、チオテパ、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、ベンゾドーパ、メツレドーパ、ウレドーパ、などを含むアジリジン；プロカルバジンなどを含むヒドラジン；
・ダカルバジン、テモゾロミドなどを含むトリアゼン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｒｎｉｄｅ）、トリメチロールメラミンなどを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；
・およびミトブロニトール、ピポブロマン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ、などを含む）、プリカマイシンなどを含むその他のアルキル化剤；
ｉｉ．アセトゲニン、例えば、ブラタシン、ブラタシノンなど；
ｉｉｉ．ベンゾジアゼピン、例えば、２－オキソクアゼパム、３－ヒドロキシフェナゼパム、ブロマゼパム、カマゼパム、カルブラゼパム、クロルジアゼポキシド、シナゼパム、シノラゼパム、クロナゼパム、クロニプラゼパム、クロラゼプ酸、シプラゼパム、デロラゼパム、デモキセパム、デスメチルフルニトラゼパム、デバゼピド、ジアゼパム、ジクラゼパム、ジフルジアゼパム、ドキセファゼパム、エルファゼパム、カルフルゼプ酸エチル、ジラゼプ酸エチル、ロフラゼプ酸エチル、フルブロマゼパム、フレタゼパム、フルジアゼパム、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルテマゼパム（Ｆｌｕｔｅｍａｚｅｐａｍ）、フルトプラゼパム、ホサゼパム、ギダゼパム、ハラゼパム、イクラゼパム、イラゼピン、ケナゼピン、ケタゾラム、ロラゼパム、ロルメタゼパム、ルフラドム、メクロナゼパム、メダゼパム、メニトラゼパム、メタクラゼパム、モトラゼパム、Ｎ－デスアルキルフルラゼパム、ニホキシパム、ニメタゼパム、ニテマゼパム、ニトラゼパム、ニトラゼパテ、ノルダゼパム、ノルテトラゼパム、オキサゼパム、フェナゼパム、ピナゼパム、ピボキサゼパム、プラゼパム、プロフラゼパム、クアゼパム、ＱＨ－ＩＩ－６６、レクラゼパム、ＲＯ４４９１５３３、Ｒｏ５－４８６４、ＳＨ－Ｉ－０４８Ａ、スラゼパム、テマゼパム、テトラゼパム、チフルアドム、トルファゼパム、トリフルノルダゼパム（ｔｒｉｆｌｕｎｏｒｄａｚｅｐａｍ）、ツクラゼパム、ウルダゼパム、アルフェンダザム、クロバザム、ＣＰ－１４１４Ｓ、ロフェンダザム、トリフルバザム、ギリソパム、ＧＹＫＩ－５２４６６、ＧＹＫＩ－５２８９５、ネリソパム、タランパネル、トフィソパム、アジナゾラム、アルプラゾラム、ブロマゾラム、クロナゾラム、エスタゾラム、ルアルプラゾラム、フルブロマゾラム、フルニトラゾラム、ニトラゾラム、ピラゾラム、トリアゾラム、ブレタゼニル、クリマゾラム、ＥＶＴ－２０１、ＦＧ－８２０５、フルマゼニル、ＧＬ－ＩＩ－７３、イミダゼニル、１２３Ｉ－イオマゼニル、Ｌ－６５５，７０８、ロプラゾラム、ミダゾラム、ＰＷＺ－０２９、レミマゾラム、Ｒｏ１５－４５１３、Ｒｏ４８－６７９１、Ｒｏ４８－８６８４、Ｒｏ４９３８５８１、サルマゼニル、ＳＨ－０５３－Ｒ－ＣＨ３－２’Ｆ、クロキサゾラム、フルタゾラム、ハロキサゾラム、メキサゾラム、オキサゾラム、ベンタゼパム、クロチアゼパム、ブロチゾラム、シクロチゾラム、デスクロロエチゾラム、エチゾラム、フルクロチゾラム、イスラパファント、ＪＱ１、メチゾラム、オランザピン、テレンゼピン、ロピラゼパム、ザピゾラム、ラゾバザム、リパゼパム、ゾラゼパム、ゾメバザム、ゾメタピン、プレマゼパム、クラゾラム、アントラマイシン、アビザホン、リルマザホン、など。
ｉｖ．代謝拮抗薬、例えば、：
・アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、プテロプテリン、ラルチトレキセド、デノプテリン、トリメトレキサート、ペメトレキセドなどを含む葉酸代謝拮抗薬；
・ペントスタチン、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、ネララビン、チオグアニン、メルカプトプリンなどを含むプリン類似体；
・フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、テガフール／ギメラシル／オテラシル、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、デシタビンなどを含むピリミジン類似体；および
・ヒドロキシカルバミドなど。
ｖ．アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；
ｖｉ．抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；
ｖｉｉ．葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）など；
ｖｉｉｉ．メイタンシノイド、例えば、メイタンシン、アンサミトシンなど；
ｉｘ．白金類似体、例えば、白金、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンなど；
ｘ．抗ホルモン剤、例えば、：
・タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾ－ル，４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、トレミフェンなどを含む抗エストロゲン剤；
・フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、ゴセレリンなどを含む抗アンドロゲン剤；
ｘｉ.トリコテセン、例えば、Ｔ２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、アングイディンなど；
ｘｉｉ．トキソイド、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、テセタキセルなど；
ｘｉｉｉ．その他の化学療法剤、例えば、カンプトテシン（その誘導体：ベロテカン、コシテカン、エチリノテカン、ペゴル、エキサテカン、ギマテカン、イリノテカン、ラルトテカン、ルビテカン、シラテカン、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）、およびトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（その アドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８を含む）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（その合成類似体：ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、アクラシノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カンニノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン；ドキソルビシン（モルフォリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン、デオキシドキソルビシンなどを含む）；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン（ｉｄａｎｒｂｉｃｉｎ）；マルセロマイシン；ミコフェノール酸；ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポトフィロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン；ツベルシジン；ウベニメクス；ジノスタチン；ゾルビシン；アセグラトン；アルドホスファルニド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｒｎｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンティナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｎｎａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン（２，２’，２’’－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｅ）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロムトール（ｍｉｔｏｂｒｏｍｔｏｌ）；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；６－チオグアニン；ビンブラスチン；エトポシド；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；トポイソメラーゼＩ阻害剤ＳＮ３８；ヂルルオロメチルオルニチン；レチノイン酸；など。
ｉ．アルキル化剤、例えば、：
・クロルメチン、シクロホスファミド、イホスファミド、トロフォスファミド、クロラムブシル、メルファラン、プレドニムスチン、ベンダムスチン、ウラムスチン、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、メクロレタミン、メクロレタミン酸化物・塩酸塩、ノベムビシン（novembichin）、フェネステリン、ウラシルマスタードなどを含むナイトロジェンマスタード；
・カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシン、クロロゾトシンなどを含むニトロソウレア；
・ブスルファン、マンノスルファン、トレオスルファンなどを含むスルホン酸アルキル
・カルボコン、チオテパ、トリアジクオン、トリエチレンメラミン、ベンゾドーパ、メツレドーパ、ウレドーパ、などを含むアジリジン；プロカルバジンなどを含むヒドラジン；
・ダカルバジン、テモゾロミドなどを含むトリアゼン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｒｎｉｄｅ）、トリメチロールメラミンなどを含むエチレンイミンおよびメチラメラミン；
・およびミトブロニトール、ピポブロマン、アクチノマイシン、ブレオマイシン、マイトマイシン（マイトマイシンＣ、などを含む）、プリカマイシンなどを含むその他のアルキル化剤；
ｉｉ．アセトゲニン、例えば、ブラタシン、ブラタシノンなど；
ｉｉｉ．ベンゾジアゼピン、例えば、２－オキソクアゼパム、３－ヒドロキシフェナゼパム、ブロマゼパム、カマゼパム、カルブラゼパム、クロルジアゼポキシド、シナゼパム、シノラゼパム、クロナゼパム、クロニプラゼパム、クロラゼプ酸、シプラゼパム、デロラゼパム、デモキセパム、デスメチルフルニトラゼパム、デバゼピド、ジアゼパム、ジクラゼパム、ジフルジアゼパム、ドキセファゼパム、エルファゼパム、カルフルゼプ酸エチル、ジラゼプ酸エチル、ロフラゼプ酸エチル、フルブロマゼパム、フレタゼパム、フルジアゼパム、フルニトラゼパム、フルラゼパム、フルテマゼパム（Ｆｌｕｔｅｍａｚｅｐａｍ）、フルトプラゼパム、ホサゼパム、ギダゼパム、ハラゼパム、イクラゼパム、イラゼピン、ケナゼピン、ケタゾラム、ロラゼパム、ロルメタゼパム、ルフラドム、メクロナゼパム、メダゼパム、メニトラゼパム、メタクラゼパム、モトラゼパム、Ｎ－デスアルキルフルラゼパム、ニホキシパム、ニメタゼパム、ニテマゼパム、ニトラゼパム、ニトラゼパテ、ノルダゼパム、ノルテトラゼパム、オキサゼパム、フェナゼパム、ピナゼパム、ピボキサゼパム、プラゼパム、プロフラゼパム、クアゼパム、ＱＨ－ＩＩ－６６、レクラゼパム、ＲＯ４４９１５３３、Ｒｏ５－４８６４、ＳＨ－Ｉ－０４８Ａ、スラゼパム、テマゼパム、テトラゼパム、チフルアドム、トルファゼパム、トリフルノルダゼパム（ｔｒｉｆｌｕｎｏｒｄａｚｅｐａｍ）、ツクラゼパム、ウルダゼパム、アルフェンダザム、クロバザム、ＣＰ－１４１４Ｓ、ロフェンダザム、トリフルバザム、ギリソパム、ＧＹＫＩ－５２４６６、ＧＹＫＩ－５２８９５、ネリソパム、タランパネル、トフィソパム、アジナゾラム、アルプラゾラム、ブロマゾラム、クロナゾラム、エスタゾラム、ルアルプラゾラム、フルブロマゾラム、フルニトラゾラム、ニトラゾラム、ピラゾラム、トリアゾラム、ブレタゼニル、クリマゾラム、ＥＶＴ－２０１、ＦＧ－８２０５、フルマゼニル、ＧＬ－ＩＩ－７３、イミダゼニル、１２３Ｉ－イオマゼニル、Ｌ－６５５，７０８、ロプラゾラム、ミダゾラム、ＰＷＺ－０２９、レミマゾラム、Ｒｏ１５－４５１３、Ｒｏ４８－６７９１、Ｒｏ４８－８６８４、Ｒｏ４９３８５８１、サルマゼニル、ＳＨ－０５３－Ｒ－ＣＨ３－２’Ｆ、クロキサゾラム、フルタゾラム、ハロキサゾラム、メキサゾラム、オキサゾラム、ベンタゼパム、クロチアゼパム、ブロチゾラム、シクロチゾラム、デスクロロエチゾラム、エチゾラム、フルクロチゾラム、イスラパファント、ＪＱ１、メチゾラム、オランザピン、テレンゼピン、ロピラゼパム、ザピゾラム、ラゾバザム、リパゼパム、ゾラゼパム、ゾメバザム、ゾメタピン、プレマゼパム、クラゾラム、アントラマイシン、アビザホン、リルマザホン、など。
ｉｖ．代謝拮抗薬、例えば、：
・アミノプテリン、メトトレキサート、ペメトレキセド、プララトレキサート、プテロプテリン、ラルチトレキセド、デノプテリン、トリメトレキサート、ペメトレキセドなどを含む葉酸代謝拮抗薬；
・ペントスタチン、クラドリビン、クロファラビン、フルダラビン、ネララビン、チオグアニン、メルカプトプリンなどを含むプリン類似体；
・フルオロウラシル（５－ＦＵ）、カペシタビン、ドキシフルリジン、テガフール、テガフール／ギメラシル／オテラシル、カルモフール、フロクスウリジン、シタラビン、ゲムシタビン、アザシチジン、デシタビンなどを含むピリミジン類似体；および
・ヒドロキシカルバミドなど。
ｖ．アンドロゲン、例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなど；
ｖｉ．抗副腎剤、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなど；
ｖｉｉ．葉酸補充剤、例えば、フロリン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ ａｃｉｄ）など；
ｖｉｉｉ．メイタンシノイド、例えば、メイタンシン、アンサミトシンなど；
ｉｘ．白金類似体、例えば、白金、カルボプラチン、シスプラチン、ジシクロプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、サトラプラチンなど；
ｘ．抗ホルモン剤、例えば、：
・タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）－イミダゾ－ル，４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、トレミフェンなどを含む抗エストロゲン剤；
・フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、ゴセレリンなどを含む抗アンドロゲン剤；
ｘｉ.トリコテセン、例えば、Ｔ２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、アングイディンなど；
ｘｉｉ．トキソイド、例えば、カバジタキセル、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセル、テセタキセルなど；
ｘｉｉｉ．その他の化学療法剤、例えば、カンプトテシン（その誘導体：ベロテカン、コシテカン、エチリノテカン、ペゴル、エキサテカン、ギマテカン、イリノテカン、ラルトテカン、ルビテカン、シラテカン、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）、およびトポテカン）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（その アドゼレシン、カルゼルシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８を含む）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（その合成類似体：ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エリュテロビン、パンクラチスタチン、サルコジクチン、スポンギスタチン、アクラシノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カンニノマイシン；カルジノフィリン；クロモマイシン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン；デトルビシン；６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン；ドキソルビシン（モルフォリノドキソルビシン、シアノモルホリノドキソルビシン、２－ピロリノドキソルビシン、デオキシドキソルビシンなどを含む）；エピルビシン；エソルビシン；イダルビシン（ｉｄａｎｒｂｉｃｉｎ）；マルセロマイシン；ミコフェノール酸；ノガラルナイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）；オリボマイシン；ペプロマイシン；ポトフィロマイシン；ピューロマイシン；クエラマイシン；ロドルビシン；ストレプトニグリン（ｓｔｒｅｐｔｏｍｇｒｉｎ）；ストレプトゾシン；ツベルシジン；ウベニメクス；ジノスタチン；ゾルビシン；アセグラトン；アルドホスファルニド（ａｌｄｏｐｈｏｓｐｈａｒｎｉｄｅ）グリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルチン；ジアジクオン；エルフォルニチン；エリプチニウム酢酸；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンティナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲンナニウム（ｓｐｉｒｏｇｅｎｎａｎｉｕｍ）；テヌアゾン酸；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン（２，２’，２’’－ｔｒｉｃｈｌｏｒｏｔｒｉｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｅ）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロムトール（ｍｉｔｏｂｒｏｍｔｏｌ）；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド；６－チオグアニン；ビンブラスチン；エトポシド；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；ゼローダ；イバンドロン酸；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；トポイソメラーゼＩ阻害剤ＳＮ３８；ヂルルオロメチルオルニチン；レチノイン酸；など。
【0031】
本明細書で、タンパク質、ストレスタンパク質の文脈で使用される場合、「検出可能レベル」は、前記タンパク質が、従来からタンパク質の検出のために当業者により使用された手段および方法により検出できる量または濃度で、当該組成物中に存在することを意味する。このような手段および方法は、当該技術分野で周知であり、限定されないが、下記の実施例３～５で詳述した液体クロマトグラフタンデム型質量分析法（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）などの質量分析法が挙げられる。
【0032】
本明細書で使用される場合、「ハプテン」は、タンパク質などの大きな担体に結合した場合にのみ免疫応答を誘発する小分子を指す。患者がハプテン－担体コンジュゲートに対する抗体を生成すると、ハプテンは、抗体に結合することができ得るが、通常、免疫応答を開始しない；この作用を行うことができるのは、ハプテン－担体コンジュゲートのみである。ハプテンの例には、限定されないが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンナムアミド（nitrocinnamide）；２－（３，４－ジメトキシフェニル）キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドが挙げられる。
【0033】
「過剰発現」、およびその逸脱は、本明細書では、参照細胞または参照細胞集団と比較して、対象細胞または対象細胞集団において、１０％高い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれより高い、マーカーまたはタンパク質の相対的または絶対的な発現および／または存在量を指す。或いはまたは更に、過剰発現は、参照細胞または参照細胞集団と比較して、対象細胞または対象細胞集団において、少なくとも１０％高い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％高い、またはそれより高い、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も指し得る。特に、参照細胞は、対象細胞と同じ細胞株由来であるが、本明細書で記載の組成物または中間組成物を製造する方法に供されていない細胞（または参照細胞集団は、それらの細胞を含む、好ましくは、それらの細胞からなる集団である）；特に、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、以下に記載される、インビトロで適用された代謝ストレス、放射線照射、熱および／または化学的ストレスのいずれにも供されていない；或いは、枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中で、低酸素下で、または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）で（すなわち、代謝ストレスに供されて）培養され、以下に記載される、インビトロで適用された放射線照射、熱ストレスおよび／または化学的ストレスのいずれの他のストレスにも供されていない、対象細胞と同じ細胞株由来の細胞（好ましくは、それらの細胞を含むまたは好ましくは、それらの細胞からなる集団）である。
【0034】
「過少発現」、およびその逸脱は、本明細書では、参照細胞または参照細胞集団と比較して、対象細胞または対象細胞集団において、１０％低い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれより低い、マーカーまたはタンパク質の相対的または絶対的な発現および／または存在量を指す。或いはまたは更に、過少発現（overexpression）は、参照細胞または参照細胞集団と比較して、対象細胞または対象細胞集団において、少なくとも１０％低い、好ましくは少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、またはそれより低い、平均蛍光強度（ＭＦＩ）も指し得る。特に、参照細胞は、対象細胞と同じ細胞株由来であるが、本明細書で記載の組成物または中間組成物を製造する方法に供されていない細胞である（または参照細胞集団は、それらの細胞を含む、好ましくは、それらの細胞からなる集団である）；特に、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、以下に記載される、インビトロで適用された代謝ストレス、放射線照射、熱および／または化学的ストレスのいずれにも供されていない；或いは、枯渇培地（例えば、がん細胞の増殖および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中で、低酸素下で、または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）で（すなわち、代謝ストレスに供されて）培養され、以下に記載される、インビトロで適用された放射線照射、熱ストレスおよび／または化学的ストレスのいずれの他のストレスにも供されていない、対象細胞と同じ細胞株由来の細胞（好ましくは、それらの細胞を含むまたは好ましくは、それらの細胞からなる集団）である。
【0035】
本明細書で使用される場合、「ワクチン組成物」は、薬学的に許容可能な賦形剤中に、少なくとも１つの抗原または免疫原（例えば、免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質など）および必要に応じてアジュバントを含み、投与時に患者において免疫応答を誘導するために有用である組成物を指す。
【0036】
本明細書で使用される場合、「アジュバント」は、投与時に対象において、抗原（例えば、免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質など）に対する免疫応答を高める、増大させるおよび／または増強する物質を指す。
【0037】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容可能な賦形剤」は、活性成分ではなく（すなわち、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞でも、免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質でもない）、患者に投与した際に、有害な、アレルギーまたは他の好ましくない反応を生じない、医薬組成物またはワクチン組成物の固体、半固体または液体成分を指す。ほとんどのこれらの薬学的に許容可能な賦形剤は、例えば、Ａｌｌｅｎ（Ｅｄ．），２０１７．Ａｎｓｅｌ’ｓ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｄｏｓａｇｅ ｆｏｒｍｓ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｓｙｓｔｅｍｓ（１１ｔｈ ｅｄ．）．Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ：Ｗｏｌｔｅｒｓ Ｋｌｕｗｅｒ；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ，Ａｌｌｅｎ ＆ Ａｄｅｂｏｙｅ（Ｅｄｓ．），２０１３．Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｙ（２２ｎｄ ｅｄ．）．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ；ａｎｄ Ｓｈｅｓｋｅｙ，Ｃｏｏｋ ＆ Ｃａｂｌｅ（Ｅｄｓ．），２０１７．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ（８ｔｈ ｅｄ．）．Ｌｏｎｄｏｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐｒｅｓｓ、に詳細に記載されている。
【発明を実施するための形態】
【0038】
薬物製剤（ＤＰ／ＳＴＣ－１０１０）
本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６、またはＬｏＶｏ細胞のうちの少なくとも１つ、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物であって、ストレスおよび／または耐性タンパク質が、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞のうちの少なくとも１つにより産生された組成物に関する。
本発明は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６、またはＬｏＶｏ細胞のうちの少なくとも１つ、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物であって、ストレスおよび／または耐性タンパク質が、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞のうちの少なくとも１つにより産生された組成物に関する。
【0039】
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９およびＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９およびＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９およびＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９およびＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
一実施形態では、組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用されたストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。
【0040】
以下では、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む組成物に対するいかなる言及も、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞のうちの１つ、２つまたは３つを含む組成物を包含することが意図される。
本発明では、組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。「ストレスを受けた」とは、これらの細胞がインビトロで適用されたストレスに応答して、耐性機構を発達させていることを意味する。結果として、これらの細胞は、組成物の一部を形成するストレスおよび／または耐性タンパク質を産生している。
本発明では、組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。「ストレスを受けた」とは、これらの細胞がインビトロで適用されたストレスに応答して、耐性機構を発達させていることを意味する。結果として、これらの細胞は、組成物の一部を形成するストレスおよび／または耐性タンパク質を産生している。
【0041】
一実施形態では、ストレスは、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスおよび任意のそれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
一実施形態では、ストレスは組み合わせであり、同時または逐次であるかに関係なく、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、および代謝ストレスのうちの２種、３種またはそれより多くを含む。
一実施形態では、ストレスは組み合わせであり、同時または逐次であるかに関係なく、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、および代謝ストレスのうちの２種、３種またはそれより多くを含む。
【0042】
一実施形態では、本発明の組成物は、下記を含むかまたはそれからなる：
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；および
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；および
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
【0043】
一実施形態では、本発明の組成物は、下記を含むまたは下記からなる：
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
【0044】
一実施形態では、本発明の組成物は、下記を含むかまたはそれからなる：
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
一ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびにインビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
【0045】
一実施形態では、ストレスは放射線照射である。放射線照射は、好ましくは、細胞を死滅または不活性化させないように十分に低いが、ストレスおよび／または耐性タンパク質の産生を誘導するために十分に高い線量である。一実施形態では、放射線照射は、約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量を細胞に照射することを含む、またはそれらの総線量で細胞に照射することからなる。一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分である。一実施形態では、放射線照射は、１０Ｇｙの総線量で約１．５～２分間の時間にわたり、すなわち、約５～約６．６Ｇｙ／分の線量で、細胞に照射することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、放射線照射は、１０Ｇｙの総線量で約５分間の時間にわたり、すなわち、約２Ｇｙ／分の線量で、細胞に照射することを含むかまたはそれからなる。
【0046】
一実施形態では、ストレスは熱ストレスである。熱ストレスは、好ましくは、細胞を死滅または不活性化させないように十分に低いが、ストレスおよび／または耐性タンパク質の産生を誘導するために十分に高い温度である。一実施形態では、熱ストレスは、３７℃より高い温度で、好ましくは、約３８℃～約４５℃の範囲の温度で、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度で、細胞を培養することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、熱ストレスは、約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された。一実施形態では、熱ストレスは、約４２℃の温度で約６０分間の時間にわたり細胞を培養することを含むかまたはそれからなる。
【0047】
一実施形態では、ストレスは化学的ストレスである。化学ストレスは、細胞を少なくとも１つまたは複数の化学薬剤に、好ましくは、細胞を死滅または不活性化させないように十分に低いが、ストレスおよび／または耐性タンパク質の産生を誘導するために十分に高い用量で用量曝露することにより実施される。一実施形態では、化学的ストレスは、細胞を少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールに曝露することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、化学的ストレスは、約６～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたり、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたり細胞に適用された。一実施形態では、化学的ストレスは、細胞、好ましくは、ＨＴ－２９細胞を、オキサリプラチンに、好ましくは、約１μＭ～約２０μＭの範囲の濃度で、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０μＭの濃度で、より好ましくは、約１３μＭの濃度で、約６０時間～約８４時間にわたり、好ましくは、約７２時間にわたり、曝露することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、化学的ストレスは、細胞、好ましくは、ＨＣＴ－１１６細胞を、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）に、好ましくは、約２０ｎＭ～約４００ｎＭの範囲の濃度で、例えば、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２２０、２４０、２６０、２８０、３００、３２０、３４０、３６０、３８０、または４００ｎＭの濃度で、より好ましくは、約３１．５ｎＭ，１００ｎＭまたは３１５ｎＭの濃度で、約３６時間～約６０時間にわたり、好ましくは、約４８時間にわたり、曝露することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、化学的ストレスは、細胞、好ましくは、ＬｏＶｏ細胞を、フルオロウラシル（５－ＦＵ）に、好ましくは、約０．５μＭ～約１５μＭの範囲の濃度で、例えば、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、１０．５、１１．０、１１．５、１２．０、１２．５、１３．０、１３．５、１４．０、１４．５、または１５μＭの濃度で、より好ましくは、約５μＭの濃度で、約３６時間～約６０時間にわたり、好ましくは、約４８時間にわたり、曝露することを含むかまたはそれからなる。
【0048】
一実施形態では、ストレスは代謝ストレスである。代謝ストレスは、細胞を死滅または不活性化させないが、ストレスおよび／または耐性タンパク質の産生を誘導する非生理学的細胞培地中で細胞を培養することにより実施される。一実施形態では、代謝ストレスは、枯渇培地（例えば、がん細胞の増殖および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中で、低酸素下で、低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）で、細胞を培養することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、代謝ストレスは、例えば、２％ＦＢＳ培地（古典的に使用される１０％ＦＢＳ培地ではなく）などの低血清培養条件中で細胞を培養することを含むかまたはそれからなる。
【0049】
一実施形態では、本発明の組成物は、下記を含むかまたはそれからなる：
－ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露、に応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露、に応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；および
－ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約４８時間にわたる約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露、に応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
－ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量による約１～約５分の時間にわたるインビトロ放射線照射、および（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック、に応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露、に応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；
－ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露、に応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質；および
－ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下でのインビトロ培養、および（ｉｉ）約４８時間にわたる約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露、に応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質。
【0050】
一実施形態では、組成物は、非増殖性であるＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。「非増殖性」または「不活性」により、これらの細胞が、細胞増殖、すなわち、細胞が成長および分裂して２個の娘細胞を産生するプロセスを実行することが可能ではないことを意味する。
【0051】
当業者なら、細胞を非増殖性にする手段および方法をよく知っている。例えば、細胞は、細胞を死滅させるまたは不活化するのに十分な線量での放射線照射により、非増殖性にすることができる。一実施形態では、放射線照射は、細胞を非増殖性にするために、細胞を２５Ｇｙ以上の総線量で照射することを含むかまたはそれからなる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、約１０％～約５０％ｖ／ｖのエタノールを用いた、エタノール固定により非増殖性にすることができる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルにより、非増殖性にすることができる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、ハプテン化によるなどの免疫原性を付与することが可能な手段に連結するか、またはそれと複合体形成することにより、非増殖性にすることができる。
【0052】
当業者はまた、細胞が非増殖性かそうでないかを判断する手段および方法、例えば、（増殖の完全な欠如を評価するために）細胞培養による及び／又はヨウ化プロピジウム（生細胞と死細胞を識別する）による生存率試験を実施することにより判断する方法、をよく知っている。
【0053】
一実施形態では、非増殖性細胞は、構造的に損なわれておらず、即ち、それらは、完全な細胞膜を示す。一実施形態では、非増殖性細胞は、構造的に完全ではなく、即ち、それらは、完全な細胞膜を示さない。後者の場合では、細胞は、組成物中に、膜フラグメント、オルガネラおよび他の細胞質成分の形態で存在する。
【0054】
一実施形態では、細胞は、インビトロで適用されたストレスに応答して、それらの耐性機構を発達させた後、したがって、ストレスおよび／または耐性タンパク質を産生した後、非増殖性になっている。一実施形態では、細胞は、ストレスを受けた数時間後に、好ましくは、ストレスを受けた１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間超後に、非増殖性になっている。
【0055】
一実施形態では、組成物は、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）および／またはＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つを過剰発現している、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。
【0056】
一実施形態では、組成物は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して；少なくとも１０％多くの、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多くの、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）および／またはＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つを発現するストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。更にまたは或いは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞集団より；少なくとも１０％多くの、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多くの、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）および／またはＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つが、組成物中で発現されている。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）および／またはＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または４つに関するの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞集団より、組成物中で少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0057】
本発明では、組成物は、ストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
一実施形態では、これらのストレスおよび／または耐性タンパク質は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に会合されており、すなわち、外表面または内表面に関わらず、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の表面に露出しており；および／またはＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞内に含まれ、即ち、それらの細胞質またはそれらのオルガネラのいずれか内に含まれ；および／または例えば、それらがこれらの細胞により分泌されたために、組成物中で遊離状態であり、即ち、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に結合せず、またそれらの細胞内に含まれてもいない。
本発明では、組成物は、免疫原性であるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。「免疫原性」または「免疫コンピテント」とは、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、前記患者に投与される場合、患者において免疫応答（例えば、抗体の産生）を誘発することが可能であることを意味する。
一実施形態では、これらのストレスおよび／または耐性タンパク質は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に会合されており、すなわち、外表面または内表面に関わらず、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の表面に露出しており；および／またはＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞内に含まれ、即ち、それらの細胞質またはそれらのオルガネラのいずれか内に含まれ；および／または例えば、それらがこれらの細胞により分泌されたために、組成物中で遊離状態であり、即ち、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に結合せず、またそれらの細胞内に含まれてもいない。
本発明では、組成物は、免疫原性であるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。「免疫原性」または「免疫コンピテント」とは、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、前記患者に投与される場合、患者において免疫応答（例えば、抗体の産生）を誘発することが可能であることを意味する。
【0058】
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、それらを免疫原性にすることが可能な分子の存在下、またはプロセスによって免疫原性にされている。一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、免疫原性を付与することが可能な手段との連結により、または複合体形成により、免疫原性にされている。
免疫原性を付与することが可能な手段および方法は、当業者に周知である。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞に、またはそれらの環境に天然で存在しない１つまたは複数の分子を含むかまたはからなる。このような手段は一般的に、「抗原」と呼ばれる。いくつかの抗原は、それ自体で液性または細胞性免疫応答を誘発でき、したがって、「免疫原」と見なされる。このような抗原のいくつかの例には、限定されないが、アジュバントが挙げられる。当業者は、がんワクチンでの使用に好適するアジュバントをよく知っており、これは、ストレスおよび／または耐性タンパク質と複合体を形成すると、それらを免疫原性にする。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ＆ Ｒｅｅｄ，２０１０（Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１５５－６１）またはＣｕｚｚｕｂｂｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：６１５２４０）を参照されたい。
免疫原性を付与することが可能な手段および方法は、当業者に周知である。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞に、またはそれらの環境に天然で存在しない１つまたは複数の分子を含むかまたはからなる。このような手段は一般的に、「抗原」と呼ばれる。いくつかの抗原は、それ自体で液性または細胞性免疫応答を誘発でき、したがって、「免疫原」と見なされる。このような抗原のいくつかの例には、限定されないが、アジュバントが挙げられる。当業者は、がんワクチンでの使用に好適するアジュバントをよく知っており、これは、ストレスおよび／または耐性タンパク質と複合体を形成すると、それらを免疫原性にする。例えば、Ｄｕｂｅｎｓｋｙ ＆ Ｒｅｅｄ，２０１０（Ｓｅｍｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２（３）：１５５－６１）またはＣｕｚｚｕｂｂｏ ｅｔ ａｌ．，２０２１（Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：６１５２４０）を参照されたい。
【0059】
しかし、一部の抗原は、それ自体では免疫応答を開始できず、前もって、担体、例えば、ストレスおよび／または耐性タンパク質とコンジュゲート化することが必要である。後者の抗原は、「不完全抗原」と呼ばれることもあり、限定されないが、ハプテンが含まれる。
ハプテンのいくつかの例には、限定されないが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドが挙げられる。
ハプテンのいくつかの例には、限定されないが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドが挙げられる。
【0060】
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、ハプテン化される。一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、２，４－ジニトロフェニル化（ＤＮＰ）される。
当業者なら、ストレスおよび／または耐性タンパク質などのタンパク質をハプテン化する手段および方法をよく知っている。
当業者なら、ストレスおよび／または耐性タンパク質などのタンパク質をハプテン化する手段および方法をよく知っている。
【0061】
免疫原性を付与することが可能な別の手段は、オプソニン化を含み、これは、ストレスおよび／または耐性タンパク質へのオプソニンの結合を伴う周知の方法である。
【0062】
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、化学的ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0063】
一実施形態では、組成物は、具体的に例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６もしくはＬｏＶｏ細胞のいずれかと比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどによる代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して；検出可能なレベルで、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を特に含む：チロシン－タンパク質キナーゼＨＣＫ、ポリピリミジントラクト－結合タンパク質３、Ｅ３ユビキチン－タンパク質リガーゼＲＮＦ２１３、セリン／アルギニンリッチスプライシング因子８、ＥＨドメイン含有タンパク質４、ＬＩＭドメインのみのタンパク質７、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼＲＮＡポリメラーゼＩサブユニットＲＰＡ２、２’－５’－オリゴアデニル酸シンターゼ３、ＷＤリピートおよびＨＭＧボックスＤＮＡ結合タンパク質１、β－２－糖タンパク質１、セリン／トレオニンタンパク質ホスファターゼＰＰ１－γ触媒サブユニット、アニリーン、非定型ミオシン－Ｉｂ、ＡＰ－２複合体サブユニットα－２、サイクリン依存性キナーゼ２、転写１－α／βのシグナル伝達物質および活性化剤、プミリオホモログ１、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー１、Ｒａｃ ＧＴＰアーゼ活性化タンパク質１、シンギュリン、シンタキシン結合タンパク質３、ミトコンドリアカルニチン／アシルカルニチン担体タンパク質、インポーチンサブユニットα－７、リボソームタンパク質Ｓ６キナーゼα－４、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－５Ａ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼ大サブユニット、低分子量フォスフォチロシンタンパク質ホスファターゼ、リボヌクレオシド二リン酸レダクターゼサブユニットＭ２、ＡＤＰリボース化因子様タンパク質１、ダイナミン－２、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１３、ＩＳＴ１ホモログ、フォークヘッドボックスタンパク質Ｋ１、ソルビトールデヒドロゲナーゼ、Ｂｃｌ２様タンパク質１、三要素モチーフ含有タンパク質２９、キネシン様タンパク質ＫＩＦ２２、メチルステロールモノオキシゲナーゼ１、カベオラ関連タンパク質１、ＢＲＣＡ１関連ＡＴＭ活性化剤１、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質Ｏ－マンノシルトランスフェラーゼＴＭＴＣ３、核内転写因子カッパ－Ｂキナーゼ相互作用タンパク質の阻害剤、ジンクフィンガーＣＣＣＨ型抗ウィルスタンパク質１、核小体タンパク質９、ロイシンジッパータンパク質１、ポリホメオティック様タンパク質２、テンシン－４、ＬＥＭドメイン含有タンパク質２、インポーチン－４、Ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１、ＰＤＺおよびＬＩＭドメインタンパク質５、ＵＡＰ５６相互作用因子、ＭＭＳ１９ヌクレオチド除去修復タンパク質ホモログ、キネシン様タンパク質ＫＩＦ２Ｃ、ＡＤＰリボースグリコヒドラーゼＭＡＣＲＯＤ１、キネシン様タンパク質ＫＩＦＣ１、ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＤＨＸ３３、棘皮動物微小管関連タンパク質様４、ファンコーニ貧血グループＩタンパク質、ＥＨドメイン含有タンパク質３、オピオイド成長因子受容体、γ－アデュシン、ＤＮＡ ｄＣ－ｄＵ編集酵素ＡＰＯＢＥＣ－３Ｂ、ニューロプラスチン、亜鉛トランスポーター１、グルタレドキシン－３、サイトゾルチミジンキナーゼ、ミリストイル化アラニンリッチＣ－キナーゼ基質、ＵＭＰ－ＣＭＰキナーゼ、マクロファージキャッピングタンパク質、高移動度グループタンパク質ＨＭＧＩ－Ｃ、スムーセリン、血小板活性化因子アセチルヒドロラーゼＩＢサブユニットγ、転写開始因子ＴＦＩＩＤサブユニット９、不活性水酸化ステロイドデヒドロゲナーゼ様タンパク質１、ボレアリン、ｌａ関連タンパク質４、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体アセンブリ因子２、オーロラキナーゼＢ、ゴルジ結合植物病因関連タンパク質１、ＡＴＰ－結合カセットサブファミリーＦメンバー２、アルマジロリピート含有Ｘ連鎖タンパク質３、ラギュレーター複合体タンパク質ＬＡＭＴＯＲ３、推定ＡＴＰ依存性ＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ２０、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼサブユニットＨ、およびカルシウム結合タンパク質３９。
【0064】
一実施形態では、組成物は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６もしくはＬｏＶｏ細胞のいずれかと比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどによる代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して、以下のタンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｂアルファ鎖、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ａアルファ鎖、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｃアルファ鎖、ＣＤ９抗原、核自己抗原Ｓｐ－１００、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー３、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＥメンバー１、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー１、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー２、Ｂｃｌ２様タンパク質１、Ｂｃｌ２結合転写因子１、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット２、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニット４アイソフォーム１、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニット５Ａ、ペルオキシソームアシルコエンザイムＡオキシダーゼ１、ヒートショックタンパク質β１、ヒートショックタンパク質ＨＳＰ９０β、ヒートショック同族７１ｋＤａタンパク質、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質６、ヒートショック７０ｋＤａタンパク質４、リボヌクレアーゼ阻害剤、核内転写因子κ－Ｂキナーゼ相互作用タンパク質の阻害剤、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－５Ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－６Ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－５Ｃ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－７ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１３、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－２５、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１５、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－８Ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１０、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１ｂ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１Ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｐ－１Ａ、Ｒａｓ関連Ｃ３ボツリヌス毒素基質１、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－８Ｂ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１８、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－２ｃ、Ｘ線修復交差補完タンパク質６、ＤＮＡミスマッチ修復タンパク質Ｍｓｈ６、ＭＭＳ１９ヌクレオチド除去修復タンパク質ホモログ、タンパク質輸送タンパク質ＳＥｃ１６Ａ、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼサブユニットα１、促進性グルコーストランスポーターメンバー１溶質輸送体ファミリー２、ミトコンドリアトリカルボン酸輸送タンパク質、モノカルボン酸トランスポーターメンバー１、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットβ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットαアイソフォーム１、輸送およびゴルジ組織タンパク質１ホモログ、アデノシン３’－ホスホ５’－ホスホ硫酸トランスポーター１、トランスポーチン－１、および亜鉛トランスポーター１。
【0065】
一実施形態では、組成物は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６もしくはＬｏＶｏ細胞のいずれかと比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどによる代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して、以下の膜タンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｂアルファ鎖、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ａアルファ鎖、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｃアルファ鎖、ＣＤ９抗原、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＤメンバー３、Ｂｃｌ２様タンパク質１、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット２、ミトコンドリアシトクロムｃオキシダーゼサブユニット４アイソフォーム１、核内転写因子カッパＢキナーゼ相互作用タンパク質の阻害剤、ナトリウム／カリウム輸送ＡＴＰアーゼサブユニットα１、促進性グルコーストランスポーターメンバー１溶質輸送体ファミリー２、ミトコンドリアトリカルボン酸輸送タンパク質、モノカルボン酸トランスポーターメンバー１、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットβ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットαアイソフォーム１、輸送およびゴルジ組織タンパク質1ホモログ、アデノシン３’－ホスホ５’－ホスホ硫酸トランスポーター１、および亜鉛トランスポーター１。
【0066】
一実施形態では、組成物は特に、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６もしくはＬｏＶｏ細胞のいずれかと比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して以下のタンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を検出可能なレベルで含む：ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー１、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＦメンバー２、Ｂｃｌ２様タンパク質１、核内転写因子カッパＢキナーゼ相互作用タンパク質の阻害剤、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－５Ａ、Ｒａｓ関連タンパク質Ｒａｂ－１３、ＭＭＳ１９ヌクレオチド除去修復タンパク質ホモログ、および亜鉛トランスポーター１。
【0067】
一実施形態では、組成物は特に、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、（ｉｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｖ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６もしくはＬｏＶｏ細胞のいずれかと比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、（ｉｉ）熱ストレスおよび（ｉｉｉ）化学的ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６および／もしくはＬｏＶｏ細胞と比較して、以下の膜タンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を、検出可能なレベルで含む：Ｂｃｌ２様タンパク質１、核内転写因子カッパＢキナーゼ相互作用タンパク質の阻害剤、および亜鉛トランスポーター１。
【0068】
一実施形態では、組成物は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を更に含み得る。
「腫瘍抗原」は、がん細胞により産生された抗原性物質または分子を意味する。腫瘍抗原は、２つのカテゴリー：がん細胞上にのみ存在し、非がん細胞上には存在しない「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」；ならびにがん細胞および非がん細胞上に存在する「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」に分類される。
「腫瘍抗原」は、がん細胞により産生された抗原性物質または分子を意味する。腫瘍抗原は、２つのカテゴリー：がん細胞上にのみ存在し、非がん細胞上には存在しない「腫瘍特異的抗原」または「ＴＳＡ」；ならびにがん細胞および非がん細胞上に存在する「腫瘍関連抗原」または「ＴＡＡ」に分類される。
【0069】
共通のＴＳＡ、特に、ネオ抗原である。本明細書で使用される場合、「ネオ抗原」は、例えば、発がん時に遺伝子不安定性により生じた１つまたは複数の変異を含む遺伝子によりがん細胞でコードされる異常な腫瘍特異的抗原を指す。結果として、この変異遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、正常な細胞には見出されない異常なタンパク質の産生をもたらす変異をそれ自体に含み得る。これらの変異タンパク質は、非自己タンパク質または異種タンパク質と見なされ、したがって、ネオ抗原特異的Ｔ細胞受容体により認識され、免疫系を活性化し、がん細胞に対する免疫系の攻撃を引き起こし得る。ネオ抗原はまた、ウィルス感染症、選択的スプライシングおよび／または遺伝子再構成によっても産生され得る。例えば、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０２１．Ｆｒｏｎｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：６７２３５６）またはＪｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．（２０１９．Ｊ Ｈｅｍａｔｏｌ Ｏｎｃｏｌ．１２（１）：９３）を参照されたい。
【0070】
一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏに特異的である。
一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは本来免疫原性である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、それらを免疫原性にすることが可能な分子または方法により、免疫原性にされ得る、またはそれらの免疫原性が高められ得る。
免疫原性を付与することが可能な手段は、当業者に周知であり、上記で記載されている。これらには、限定されないが、特に、ハプテンが挙げられる。
一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは本来免疫原性である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、それらを免疫原性にすることが可能な分子または方法により、免疫原性にされ得る、またはそれらの免疫原性が高められ得る。
免疫原性を付与することが可能な手段は、当業者に周知であり、上記で記載されている。これらには、限定されないが、特に、ハプテンが挙げられる。
【0071】
一実施形態では、これらのＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に会合しており、すなわち、外表面または内表面に関わらず、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の表面に露出しており；および／またはＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞内に含まれ、即ち、それらの細胞質またはそれらのオルガネラのいずれか内に含まれ；および／または例えば、それらがこれらの細胞により分泌されたために、組成物中で遊離状態であり、即ち、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の膜に会合せず、またそれらの細胞内に含まれてもいない。
【0072】
一実施形態では、組成物は、医薬組成物またはワクチン組成物であり、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を更に含む。
薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩および酢酸塩の溶液、ゼラチン、コラーゲン、カーボポール（登録商標）、植物油などが挙げられる。また、好適な防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどを更に含んでもよい。
本発明の組成物中に使されし得る薬学的に許容可能な賦形剤の他の例としては、限定されないが、イオン交換体、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどのミョウバン、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒトの血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
更に、いくつかの薬学的に許容可能な賦形剤には、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、担体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する、例えば溶媒および分散媒、好適なそれらの混合物および例えば落花生油および胡麻油などの植物油など）、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウムなど）、被覆剤（例えば、レシチンなど）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなど）、抗酸化剤および安定化剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素など）、非イオン性浸潤剤または清澄剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールなど）、粘度調整剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど）が含まれ得る。
薬学的に許容可能な賦形剤としては、限定されないが、水、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース溶液およびエタノール、グルコース、スクロース、デキストラン、マンノース、マンニトール、ソルビトール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、リン酸塩および酢酸塩の溶液、ゼラチン、コラーゲン、カーボポール（登録商標）、植物油などが挙げられる。また、好適な防腐剤、安定化剤、抗酸化剤、抗菌剤および緩衝剤、例えば、ＢＨＡ、ＢＨＴ、クエン酸、アスコルビン酸、テトラサイクリンなどを更に含んでもよい。
本発明の組成物中に使されし得る薬学的に許容可能な賦形剤の他の例としては、限定されないが、イオン交換体、リン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムなどのミョウバン、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、ヒトの血清アルブミンなどの血清タンパク質、リン酸塩などの緩衝物質、グリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、植物性飽和脂肪酸の部分グリセリド混合物、水、塩または電解質（例えば、硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、亜鉛塩）、コロイド状シリカ、三ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、セルロース系物質、ポリエチレングリコール、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリアクリル酸塩、ワックス、ポリエチレン－ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコールおよび羊毛脂が挙げられる。
更に、いくつかの薬学的に許容可能な賦形剤には、界面活性剤（例えば、ヒドロキシプロピルセルロース）、担体（例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセリン、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）を含有する、例えば溶媒および分散媒、好適なそれらの混合物および例えば落花生油および胡麻油などの植物油など）、等張剤（例えば、糖類または塩化ナトリウムなど）、被覆剤（例えば、レシチンなど）、吸収遅延剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなど）、防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、チメロサールなど）、緩衝液（例えば、ホウ酸、重炭酸ナトリウムおよび重炭酸カリウム、ホウ酸ナトリウムおよびホウ酸カリウム、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、酢酸ナトリウム、リン酸二水素ナトリウムなど）、等張化剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、デキストロース、グリセリン、塩化カリウム、プロピレングリコール、塩化ナトリウムなど）、抗酸化剤および安定化剤（例えば、重亜硫酸ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、チオ尿素など）、非イオン性浸潤剤または清澄剤（例えば、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポロキサマー２８２およびチロキサポールなど）、粘度調整剤（例えば、デキストラン４０、デキストラン７０、ゼラチン、グリセリン、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシメチルプロピルセルロース、ラノリン、メチルセルロース、ワセリン、ポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなど）が含まれ得る。
【0073】
アジュバントの例としては、限定されないが、ヘルパーペプチド、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム（ミョウバンとも呼ばれる）、リン酸アルミニウム、など）、フロイント不完全アジュバント、フロイント完全アジュバント、サポニン、Ｍｅｒｃｋアジュバント６５、スミスクライン・ビーチャムアジュバントＡＳ－２、ＡｑｕｉｌｌａアジュバントＱＳ－２１、ＭＰＬ（商標）免疫賦活薬、３ｄ－ＭＰＬ、ＬＥＩＦ、カルシウム塩、鉄塩、亜鉛塩、アシル化チロシン、アシル化糖、カチオン誘導体化ポリサッカライド、アニオン誘導体化ポリサッカライド、ポリホスファゼン、生分解性マイクロスフェア、モノホスホリルリピドＡ、ムラミルトリペプチドホスファチジルエタノールアミン、サイトカイン（例えば、インターロイキン－２、インターロイキン－１２、インターロイキン－４、インターロイキン－７、など）、ＣｐＧ含有オリゴヌクレオチド、およびこれらの組み合わせ、が挙げられる。
【0074】
一実施形態では、組成物は、約１０５～約１０８個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、好ましくは、約１０６～約１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。一実施形態では、約３ｘ１０6個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。
【0075】
一実施形態では、組成物は、組成物１ｍＬ当り、約１０６～約１０9個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、好ましくは、組成物１ｍＬ当り、約１０６～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、例えば、組成物１ｍＬ当り、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、または１ｘ１０８個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。一実施形態では、組成物１ｍＬ当り、約３ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含む。
【0076】
一実施形態では、組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞（即ち１：１：１）の等しい比率を含む。一実施形態では、組成物は、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多くのストレスを受けたＨＴ－２９を含む。一実施形態では、組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９またはＬｏＶｏ細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多くのストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞を含む。一実施形態では、組成物は、ストレスを受けたＨＴ－２９またはＨＣＴ－１１６細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多くのストレスを受けたＬｏＶｏ細胞を含む。
【0077】
一実施形態では、組成物は、下記を含む：
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞。
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞。
【0078】
中間生成物
本発明は、上述の組成物の調製に有用な中間組成物にも関する。
一実施形態では、中間組成物は、上記で定義される少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、免疫原性である。ストレスおよび／または耐性タンパク質を免疫原性にするための手段および方法は、前に記載されている。
本発明は、上述の組成物の調製に有用な中間組成物にも関する。
一実施形態では、中間組成物は、上記で定義される少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤を含む。
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、免疫原性である。ストレスおよび／または耐性タンパク質を免疫原性にするための手段および方法は、前に記載されている。
【0079】
一実施形態では、中間組成物は、上述の、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を更に含み得る。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞に特異的である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは本来免疫原性である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するか、またはそれと複合体形成することにより、免疫原性にされ得る、またはそれらの免疫原性が高められ得る。免疫原性を付与することが可能な手段は、当業者に周知であり、上記で記載されている。これらには、限定されないが、特に、ハプテンが挙げられる。
【0080】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、ならびに
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、ならびに
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
【0081】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
【0082】
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを過剰発現している：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）。
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して；少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多くの、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現される。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを過剰発現している：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）。
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して；少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多くの、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現される。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0083】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、タンパク質ＥＣＴ２、プレクチン、エピプラキン、増殖マーカータンパク質Ｋｉ－６７、小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、およびリソソーム膜糖タンパク質１のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0084】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、およびタンパク質ＥＣＴ２のうちの少なくとも１つまたは複数を、検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0085】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質：小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、リソソーム膜糖タンパク質１、リボソーム結合タンパク質１、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤２、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ５、エメリン、タンパク質ＬＹＲＩＣ、極長鎖脂肪酸伸長酵素タンパク質１、およびタンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットγの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0086】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ細胞は、以下の細胞表面タンパク質：ヒートショック関連７０ｋＤａタンパク質、アネキシン、アノクタミン－６、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、セロトランスフェリン、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ、クラスタリン、フューリン、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原γ鎖、ＣＤ１０９抗原、塩化物細胞内チャネルタンパク質４、プロトカドヘリン脂肪１、天然耐性関連マクロファージタンパク質２、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ、カルパイン－５、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、高移動度グループタンパク質Ｂ１、テトラスパニン－１５、ＵＬ１６結合タンパク質２、インテグリンβ－７、ソニックヘッジホッグタンパク質、トール様受容体３、β－２－糖タンパク質１、組織因子、プロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシンタイプ６、内皮タンパク質Ｃ受容体、容積感受性アニオンチャネルサブユニットＬＲＲＣ８Ａ、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体３、亜鉛トランスポーターＺＩＰ６、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原ＤＭアルファ鎖、シスチン／グルタミン酸トランスポーター、リゾホスファチジン酸受容体２、シンデカン－１、ヒアルロニダーゼ－２、インテグリンα４、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、形質転換増殖因子β－１プロタンパク質、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤２のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0087】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
【0088】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
【0089】
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つまたは２つを過剰発現している：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）および／またはＣＤ２２７（ＭＵＣ１）。
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つまたは２つを過剰発現している：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）および／またはＣＤ２２７（ＭＵＣ１）。
【0090】
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して；少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多い、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、および／またはＣＤ２２７（ＭＵＣ１）のうちの少なくとも１つまたは２つを発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）およびＣＤ２２７（ＭＵＣ１）のうちの少なくとも１つまたは２つは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より；ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現される。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）およびＣＤ２２７（ＭＵＣ１）のうちの少なくとも１つまたは２つの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より；ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0091】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、タンパク質ＥＣＴ２、プレクチン、エピプラキン、増殖マーカータンパク質Ｋｉ－６７、小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、およびリソソーム膜糖タンパク質１のうちのの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0092】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子１、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、およびタンパク質ＥＣＴ２のうちの少なくとも１つまたは複数を、検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0093】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質の少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：インテグリンα６、リソソーム膜糖タンパク質リソソーム膜糖タンパク質１、リボソーム結合結合タンパク質１、デルタ（１４）ステロールレダクターゼＬＢＲ、ミトコンドリアプロトン／カルシウム交換輸送体タンパク質、ＲＲＰ１２様タンパク質、拡張シナプトタグミン（ｅｘｔｅｎｄｅｄ ｓｙｎａｐｔｏｔａｇｍｉｎ）－１、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットαアイソフォーム１、溶質輸送体ファミリー２、促進性グルコーストランスポーターメンバー１、デスモグレイン－２、キネクチン、タンパク質ＬＹＲＩＣ、スフィンゴシン－１－リン酸リアーゼ１、小胞関連膜タンパク質関連タンパク質Ａ、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ７、シグナル認識粒子受容体サブユニットβ、トーシン－１Ａ－相互作用タンパク質１、ＥＲ膜タンパク質複合体サブユニット１、ステロール－４α－カルボン酸－３－デヒドロゲナーゼ（脱炭酸）、膜関連プロゲステロン受容体成分１、ＣＤ４４抗原ＭＩＣＯＳ複合体サブユニットＭＩＣ２６、膜貫通型ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質４、ＯＲＭ１－様タンパク質２、ドリコールリン酸、マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３、細胞骨格関連タンパク質４、膜貫通型タンパク質４３、レチノールデヒドロゲナーゼ（ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）１１、シグナルペプチダーゼ複合体サブユニット２、セリンパルミトイルトランスフェラーゼ２、コイルドコイルドメイン含有タンパク質４７、超長鎖エノイルＣｏＡレダクターゼ、プロトカドヘリンＦａｔ １、膜貫通型ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質７、カベオリン－１、ＮＦ－Ｘ１タイプジンクフィンガータンパク質ＮＦＸＬ１、受容体発現強化タンパク質６、受容体発現促進タンパク質６、ミトコンドリアＨＩＧ１ドメインファミリーメンバー２Ａ、小型内在性膜タンパク質２０、ＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット１３、ＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット３、ミトコンドリアチアミンピロリン酸担体、ミトコンドリア分裂１タンパク質、アミンオキシダーゼ［フラビン含有］Ｂ、ミトコンドリア内膜タンパク質膜タンパク質ＯＸＡ１Ｌ、２－ヒドロキシアシル－ＣｏＡリアーゼ２、ニカリン、細胞膜カルシウム輸送ＡＴＰアーゼ１、ミオフェリン、およびカチオン非依存性マンノース６リン酸受容体。
【0094】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、ならびに
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、ならびに
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
【0095】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
この中間組成物は、本明細書では、「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と呼ばれる。
【0096】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
【0097】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを過剰発現している：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）。
【0098】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多い、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つを発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つ、または３つは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より；ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現される。更にまたは或いは、以下のマーカー：Ｃｍｈｓｐ７０．１（ＨＳＰ７０）、ＣＤ２２７（ＭＵＣ１）およびＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射、および（ｉｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より；ならびに／またはインビトロで適用された、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射、および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞の集団において、少なくとも２倍高い、好ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0099】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子1、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、タンパク質ＥＣＴ２、プレクチン、エピプラキン、増殖マーカータンパク質Ｋｉ－６７、小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、およびリソソーム膜糖タンパク質１のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0100】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞は、以下のタンパク質：ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、ｒｈｏグアニンヌクレオチド交換因子1、ゴルジンサブファミリーＢメンバー１、β－２－糖タンパク質１、プラコフィリン－３、タンパク質ＦＡＭ８３Ｈ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ１６Ａ、逆フォルミン－２、アニリーン、およびタンパク質ＥＣＴ２のうちの少なくとも１つまたは複数を、検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0101】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された（ｉ）放射線照射および（ｉｉ）熱ストレスのいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質の少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、核小体複合体タンパク質４ホモログ、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニットＳＥＣ１１Ａ、シグナル認識粒子受容体サブユニットβ、マイクロソームグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ１、ＤＰＨ－シトクロムＰ４５０レダクターゼ、超長鎖（３Ｒ）－３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドラターゼ３、マンノシルオリゴ糖グルコシダーゼ、オキシステロール結合タンパク質関連タンパク質８、受容体発現促進タンパク質５、ＭＩＣＯＳ複合体サブユニットＭＩＣ２６、β－１，３－ガラクトシル－Ｏ－グリコシル糖タンパク質 β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニル転移酵素３、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ膜サブユニットＤＡＰＩＴ、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｆ、ＣＤＧＳＨ鉄硫黄ドメイン含有タンパク質２、ビタミンＫエポキシドレダクターゼ複合体サブユニット１様タンパク質１、タンパク質ＦＡＭ１６２Ａ、エルリン－１、長鎖脂肪酸－ＣｏＡリガーゼ１、ＣＹＢ５Ｂ＿ヒトシトクロムｂ５タイプＢ、レチノールデヒドロゲナーゼ１１、膜貫通型ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質２、超長鎖エノイル－ＣｏＡレダクターゼ、３－β－ヒドロキシステロイド－デルタ（８），デルタ（７）－イソメラーゼ、モノカルボン酸トランスポーター１，ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｂアルファ鎖、エルリン－２、ＣＤ９抗原、ＡＴＰシンターゼタンパク質８、ミトコンドリア分裂プロセスタンパク質１、シトクロムcオキシダーゼサブユニットＮＤＵＦＡ４、ＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット１３、ＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット４、ＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット３、ミトコンドリア分裂１タンパク質、およびＢＲＩ３結合タンパク質。
【0102】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞により産生された。化学的ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、免疫原性である。ストレスおよび／または耐性タンパク質を免疫原性にするための手段および方法は、前に記載した。
一実施形態では、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、免疫原性である。ストレスおよび／または耐性タンパク質を免疫原性にするための手段および方法は、前に記載した。
【0103】
一実施形態では、中間組成物は、上述の、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を更に含み得る。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞に特異的である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは本来免疫原性である。一実施形態では、ＴＡＡおよび／またはＴＳＡは、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するか、またはそれと複合体形成することにより、免疫原性にされ得る、またはそれらの免疫原性が高められ得る。免疫原性を付与することが可能な手段は、当業者に周知であり、前に記載されている。これらには、限定されないが、特に、ハプテンが挙げられる。
【0104】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたり、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたり、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0105】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＴ－２９細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
【0106】
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
【0107】
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のマーカーのうちの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つを過剰発現している：ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）。
【0108】
一実施形態では、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞と比較して；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）に供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多い、以下のマーカー：ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つを発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つは、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）に供されていないＨＴ－２９細胞の集団より、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞の集団において、少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現される。更にまたは或いは、以下のマーカー：ＣＤ５４（ＩＣＡＭ－１）、ＣＤ９５（ＦＡＳ受容体）、および／またはＣＤ１０７（ＬＡＭＰ－１）のうちの少なくとも１つ、少なくとも２つまたは３つの平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＴ－２９細胞の集団より；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約７２時間にわたる約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露）に供されていないＨＴ－２９細胞の集団より、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞の集団において、少なくとも２倍高い、好ましくは、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0109】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、キネクチン、プレクチン、およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット７のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0110】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、およびポリ（ｒＣ）結合タンパク質２のうちの少なくとも１つまたは複数を検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0111】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質：リボソーム結合タンパク質１、およびＮＡＤＰＨ--シトクロムＰ４５０レダクターゼのうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0112】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＴ－２９細胞と比較して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下の細胞表面タンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：ＣＤ１０９抗原、ＨＬＡクラスＩＩ組織適合抗原γ鎖、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原アルファ鎖Ｆ、ヒアルロナン媒介運動受容体、インテグリンβ８、インテグリンβ３、プロタンパク質コンバターゼスブチリシン／ケキシンタイプ６、クラスタリン、セロトランスフェリン、天然耐性関連マクロファージタンパク質２、ＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ｂ、内皮タンパク質Ｃ受容体、カドヘリンＥＧＦ ＬＡＧ７回膜貫通Ｇ型受容体３、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０Ａ、シスチン／グルタミン酸トランスポーター、組織因子、形質転換増殖因子β－１プロタンパク質、免疫グロブリンスーパーファミリーメンバー３、アノクタミン－６、メタロプロテイナーゼ阻害剤２、トール様受容体３、容量調節性アニオンチャネルサブユニットＬＲＲＣ８Ａ、テトラスパニン－１５、亜鉛トランスポーターＺＩＰ６、フューリン、プロトカドヘリンｆａｔ １、ヒアルロニダーゼ－２、リゾホスファチジン酸受容体２、高移動度グループタンパク質Ｂ１、塩化物細胞内チャネルタンパク質４、ＵＬ１６結合タンパク質２、カルパイン－５、アネキシンＡ９、ヒスチジンリッチ糖タンパク質、インテグリンα４、およびヒートショック関連７０ｋＤａタンパク質２。
【0113】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0114】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＨＣＴ－１１６細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
【0115】
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
【0116】
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のマーカー：ＣＤ６６（ＣＥＡ）を過剰発現している。
【0117】
一実施形態では、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）に供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多い、マーカーＣＤ６６（ＣＥＡ）を発現している。更にまたは或いは、マーカーＣＤ６６（ＣＥＡ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より；および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）へのインビトロ曝露）に供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞の集団中で、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現されている。更にまたは或いは、マーカーＣＤ６６（ＣＥＡ）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より、および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露）に供されていないＨＣＴ－１１６細胞の集団より、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞の集団において、少なくとも２倍高く、好ましくは、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0118】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、キネクチン、プレクチン、およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット７のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0119】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、およびポリ（ｒＣ）結合タンパク質２のうちの少なくとも１つまたは複数を検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0120】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＨＣＴ－１１６細胞と比較して、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している：ミトコンドリアリン酸担体タンパク質、インテグリンβ４、リソソーム膜糖タンパク質１、ＣＤ４４抗原、リボソーム結合タンパク質１、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットαアイソフォーム１、キネクチン、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ａアルファ鎖、リゾリン脂質アシルトランスフェラーゼ７、膜関連プロゲステロン受容体成分１、マイクロソームグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ１、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット４、デスモグレイン－２、インテグリンα３、トーシン－１Ａ－相互作用タンパク質１、細胞膜カルシウム輸送ＡＴＰアーゼ１、スフィンゴシン－１－リン酸リアーゼ１、Ｖ型プロトンＡＴＰアーゼ１１６ｋＤａサブユニットａ１、ミトコンドリア内膜タンパク質ＯＸＡ１Ｌ、ミトコンドリアＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット５、膜貫通型タンパク質４３、アミンオキシダーゼ［フラビン含有］Ｂ、タンパク質輸送タンパク質Ｓｅｃ６１サブユニットβ、分泌担体関連膜タンパク質３、タンパク質ＦＡＭ１６２Ａ、レチノールデヒドロゲナーゼ１１、ＡＤＰリボース化因子様タンパク質８Ｂ、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１βサブ複合体サブユニット３、ドリコールリン酸マンノシルトランスフェラーゼサブユニット３、ミトコンドリアチアミンピロリン酸担体、およびＯＲＭ１様タンパク質２。
【0121】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）下記に応答してこれらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0122】
一実施形態では、中間組成物は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）下記に応答してこれらのＬｏＶｏ細胞により産生されたストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、および
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露。
この中間組成物は、本明細書では、「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と呼ばれる。
【0123】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂは、放射線照射耐性タンパク質、熱ストレス耐性タンパク質、代謝ストレス耐性タンパク質、およびこれらの組み合わせを含むかまたはそれらからなる群から選択されるストレスおよび／または耐性タンパク質を含む。
【0124】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のマーカー：ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）およびＣＤ６６（ＣＥＡ）のうちの少なくとも１つまたは２つを過剰発現している；好ましくは、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）を過剰発現している。
【0125】
一実施形態では、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して；ならびに／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどにより代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）に供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、少なくとも１０％多くの、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多くの、マーカー：ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）およびＣＤ６６（ＣＥＡ）のうちの少なくとも１つまたは２つ、好ましくは、マーカー：（ＭＤＲ－１）を発現している。更にまたは或いは、以下のマーカー：ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）およびＣＤ６６（ＣＥＡ）のうちの少なくとも１つまたは２つ、好ましくは、ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より、および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）に供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞の集団において、少なくとも１０％多く、好ましくは、少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％またはそれより多く発現されている。更にまたは或いは、以下のマーカー：ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）およびＣＤ６６（ＣＥＡ）のうちの少なくとも１つまたは２つ、好ましくは、ＣＤ２４３（ＭＤＲ－１）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）は、例えば、１０％ＦＢＳ中などの古典的な条件で培養され、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）のいずれにも供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より、および／または例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレス（例えば、約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露）に供されていないＬｏＶｏ細胞の集団より；ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞の集団において、少なくとも１０％多い、好ましくは、少なくとも２倍高い、好ましくは、少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍またはそれより高い。
【0126】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、ポリ（ｒＣ）結合タンパク質２、キネクチン、プレクチン、およびＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ［ユビキノン］１αサブ複合体サブユニット７のうちの少なくとも１つまたは複数を過剰発現している。
【0127】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下のタンパク質：β－２－糖タンパク質１、ヒストンＨ２Ａタイプ１、およびポリ（ｒＣ）結合タンパク質２のうちの少なくとも１つまたは複数を検出可能なレベルで、特異的に発現している。
【0128】
一実施形態では、例えば、２％ＦＢＳ中で培養されるなどの代謝ストレスに供されているが、インビトロで適用された化学的ストレスに供されていないＬｏＶｏ細胞と比較して、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ細胞は、以下の膜および／または細胞表面タンパク質のうちの少なくとも１つまたは複数の次を過剰発現している：核孔膜糖タンパク質２１０、レチクロン－４、ＮＡＤＰＨ--シトクロムＰ４５０レダクターゼ、長鎖脂肪酸－ＣｏＡリガーゼ３、長鎖脂肪酸－ＣｏＡリガーゼ４、小胞関連膜タンパク質関連タンパク質Ａ、ミトコンドリアトリカルボン酸輸送タンパク質、キネクチン、小胞関連膜タンパク質関連タンパク質Ｂ／Ｃ、超長鎖（３Ｒ）－３－ヒドロキシアシル－ＣｏＡデヒドラターゼ３、小胞体膜内在性タンパク質ＶＩＰ３６、超長鎖エノイルＣｏＡレダクターゼ、マイクロソームグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ１、シトクロムｂ５タイプＢ、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼ膜サブユニットＤＡＰＩＴ、ミトコンドリアＡＴＰシンターゼサブユニットｆ、シトクロムｃオキシダーゼサブユニット２、ミトコンドリアヘムタンパク質シトクロムｃ１、ＨＬＡクラスＩ組織適合抗原Ｂアルファ鎖、タンパク質ＬＹＲＩＣ、モノカルボン酸トランスポーター１、シトクロムｃオキシダーゼサブユニットＮＤＵＦＡ４、マンノシルオリゴ糖グルコシダーゼ、シグナルペプチダーゼ複合体触媒サブユニットＳＥＣ１１Ａ、タンパク質ＦＡＭ１６２Ａ、膜貫通型ｅｍｐ２４ドメイン含有タンパク質２、レチノールデヒドロゲナーゼ１１、エルリン－１、ＢＲＩ３結合タンパク質、３－β－ヒドロキシステロイド－デルタ（８），デルタ（７）－イソメラーゼ、受容体発現促進タンパク質５、ＣＤＧＳＨ鉄硫黄ドメイン含有タンパク質２、ＣＤ９抗原、拡張シナプトタグミン－２、超長鎖アシルＣｏＡシンテターゼ、クニッツ型プロテアーゼ阻害剤２、ＣＤ１６６抗原、長鎖脂肪酸－ＣｏＡリガーゼ１、白血球表面抗原表面抗原ＣＤ４７、タパシン、およびβ－１，３－ガラクトシル－Ｏ－グリコシル糖タンパク質 β－１，６－Ｎ－アセチルグルコサミニル転移酵素３。
【0129】
製造方法
本発明はまた、上記中間組成物を製造する方法にも関する。
一実施形態では、上記の中間組成物の製造方法は、以下のステップ：
ａ）ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を好適な培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）で培養されたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、１つまたは複数のストレスにインビトロで供し、１つまたは複数のストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞が耐性機構を発達させ、それによりストレスおよび／または耐性タンパク質を産生するステップ；ならびに
ｃ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、それらがステップｂ）で産生したストレスおよび／または耐性タンパク質と共に回収するステップ
を含む。
本発明はまた、上記中間組成物を製造する方法にも関する。
一実施形態では、上記の中間組成物の製造方法は、以下のステップ：
ａ）ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を好適な培地中で培養するステップ；
ｂ）ステップａ）で培養されたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、１つまたは複数のストレスにインビトロで供し、１つまたは複数のストレスに応答して、これらのＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞が耐性機構を発達させ、それによりストレスおよび／または耐性タンパク質を産生するステップ；ならびに
ｃ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を、それらがステップｂ）で産生したストレスおよび／または耐性タンパク質と共に回収するステップ
を含む。
【0130】
一実施形態では、ステップａ）は、枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中で、低酸素下で、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）で、実施される。一実施形態では、ステップａ）は、２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件下で実施される。一実施形態では、枯渇培地中のこの培養は、ステップｂ）の間維持される。
ステップｂ）で適用されたストレスは、前に記載されている。
ステップｂ）で適用されたストレスは、前に記載されている。
【0131】
一実施形態では、ステップｃ）は、ステップｂ）の完了の少なくとも数時間後、好ましくは、ステップｂ）の完了の１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間後またはそれより後に実施される。これにより、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞は、１つまたは複数のストレスに応答して、それらの耐性機構を発達させるのに十分な時間、その結果、ストレスおよび／または耐性タンパク質を産生するのに十分な時間を確実に有している。
【0132】
一実施形態では、方法は、ステップｃ）で全て共に回収された、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞、およびそれらが産生したストレスおよび／または耐性タンパク質を、該ストレスおよび／または耐性タンパク質を免疫原性にすることが可能な分子または手段により、処置するステップｄ）を更に含む。
【0133】
一実施形態では、ステップｄ）は、ストレスおよび／または耐性タンパク質を、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するかまたはそれと複合体形成することを含むかまたはそれからなる。
【0134】
免疫原性を付与することが可能な手段は、当業者に周知である。一実施形態では、免疫原性を付与することが可能な手段は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞中に、またはそれらの環境中に天然で存在しない１個または複数の分子を含むかまたはそれからなる。このような手段は上記で詳述されており、限定されないが、ハプテンが挙げられる。
【0135】
ハプテンの例には、限定されないが、２，４－ジニトロフェニル（ＤＮＰ）；２，４－ジニトロフルオロベンゼン；スルファニル酸；Ｎ－ヨードアセチル－Ｎ’－（５－スルホン酸－ナフチル）エチレンジアミン；アニリン；ｐ－アミノ安息香酸；ビオチン；フルオレセインおよびこれらの誘導体（ＦＩＴＣ、ＴＡＭＲＡ、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄ）；ジゴキシゲニン；５－ニトロ－３－ピラゾールカルバミド；４，５－ジメトキシ－２－ニトロシンアミド；２－（３，４－ジメトキシフェニル）－キノリン－４－カルバミド；２，１，３－ベンゾオキサジアゾール－５－カルバミド；３－ヒドロキシ－２－キノキサリンカルバミド；４－（ジメチルアミノ）アゾベンゼン－４’－スルホンアミド（ＤＡＢＳＹＬ）；ロテノンイソキサゾリン；（Ｅ）－２－（２－（２－オキソ－２，３－ジヒドロ－１Ｈ－ベンゾ［ｂ］［１，４］ジアゼピン－４－イル）フェノジ）アセトアミド；７－（ジエチルアミノ）－２－オキソ－２Ｈ－クロメン－３－カルボン酸；２－アセトアミド－４－メチル－５－チアゾールスルホンアミド；およびｐ－メトキシフェニルピラゾポドフィルアミドが挙げられる。
【0136】
一実施形態では、ステップｄ）は、ストレスおよび／または耐性タンパク質を、ハプテン化することを含むかまたはそれからなる。一実施形態では、ステップｄ）は、ストレスおよび／または耐性タンパク質を、２，４－ジニトロフェニル化すること（すなわち、ストレスおよび／または耐性タンパク質を２，４－ジニトロフェニルでハプテン化すること）を含むかまたはそれからなる。
当業者なら、ストレスおよび／または耐性タンパク質などのタンパク質をハプテン化する手段および方法をよく知っている。
当業者なら、ストレスおよび／または耐性タンパク質などのタンパク質をハプテン化する手段および方法をよく知っている。
【0137】
中間組成物が、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞に特異的な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）および／または腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）を更に含む一実施形態では、ステップｄ）はまた、ストレスおよび／または耐性タンパク質に対する上述と同じ条件で、これらのＴＡＡおよび／またはＴＳＡを、免疫原性を付与することが可能な手段に連結するかまたはそれと複合体形成することも含む。
【0138】
一実施形態では、方法は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を不活化して、それらを非増殖性にするステップを更に含む。適用可能な場合は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞がインビトロで適用されたストレスに応答して、それらの耐性機構を発達させた後、したがって、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞がストレスおよび／または耐性タンパク質を産生した後はいつでも、このステップを行える。一実施形態では、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を不活化するステップは、ステップｂ）の完了後、少なくとも数時間で、好ましくは、ステップｂ）の完了の１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間後またはそれより後に実施される。一実施形態では、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を不活化するステップは、ステップｃ）の完了後に実施される。一実施形態では、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞を不活化するステップは、適用可能な場合は、ステップｄ）の完了後に実施される。
【0139】
当業者なら、細胞を非増殖性にする手段および方法をよく知っている。例えば、細胞は、細胞を死滅させるまたは不活化するのに十分な線量での放射線照射により、非増殖性にすることができる。一実施形態では、放射線照射は、細胞を非増殖性にするために、細胞に２５Ｇｙ以上の総線量を照射することを含むかまたはそれからなる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、約１０％～約５０％ｖ／ｖのエタノールを使用するエタノール固定により非増殖性にすることができる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、少なくとも１回の凍結－解凍サイクルにより、非増殖性にすることができる。或いはまたは更に、細胞は、例えば、ハプテン化によるなどの免疫原性を付与することが可能な手段に連結するかまたはそれと複合体形成することにより、非増殖性にすることができる。
【0140】
当業者はまた、細胞が非増殖性かそうでないかを判断する手段および方法、例えば、細胞培養（増殖の完全な欠如を評価するために）により、および／またはヨウ化プロピジウム（生細胞と死細胞を識別する）により、生存率試験を実施することにより判断する方法、をよく知っている。
【0141】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、ならびに（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生された。
【0142】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のストレス：代謝ストレス、放射線照射および熱ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
【0143】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
【0144】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
【0145】
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉｉ）によるストレスは、（ｉｉ）によるストレスのすぐ後または直後、例えば、（ｉ）によるストレスを維持している間で、（ｉｉ）によるストレスの終了の、１０分未満、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、または３時間後に適用される。
【0146】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のストレス：代謝ストレス、放射線照射および熱ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のストレス：代謝ストレス、放射線照射および熱ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
【0147】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
【0148】
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉｉ）によるストレスは、（ｉｉ）によるストレスの直後またはすぐ後、例えば、（ｉ）によるストレスを維持している間で、（ｉｉ）によるストレスの終了の１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、または３時間後などに適用される。
【0149】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、（ｉｉ）放射線照射および（ｉｉｉ）熱ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生された。
【0150】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のストレス：代謝ストレス、放射線照射および熱ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。放射線照射、熱ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
【0151】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）約０．２５～約２５Ｇｙの範囲の総線量、好ましくは約１～約１５Ｇｙ、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５Ｇｙの総線量での放射線照射（一実施形態では、照射時間は、約１～約２０分の範囲、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０分であり、好ましくは、約１～約５分の範囲である）、および
（ｉｉｉ）約１５～約４時間、好ましくは、約３０分～約２時間の範囲にわたり、例えば、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、または１２０分の時間にわたり細胞に適用された、約３８℃～約４５℃の範囲の温度、例えば、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、または４５℃の温度でのインビトロ熱ショック。
【0152】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）１０Ｇｙの総線量で約１～約５分間にわたるインビトロ放射線照射、および
（ｉｉｉ）約４２℃の温度で約６０分間にわたるインビトロ熱ショック。
【0153】
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉｉ）によるストレスは、（ｉｉ）によるストレスの直後またはすぐ後、例えば、（ｉ）によるストレスを維持している間で、（ｉｉ）によるストレスの終了の１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、または３時間後などに適用される。
【0154】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＴ－２９細胞により産生された。
【0155】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のストレス：代謝ストレス、および化学的ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。化学的ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
【0156】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0157】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＴ－２９細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約７２時間にわたる、約１３μＭのオキサリプラチンへのインビトロ曝露。
【0158】
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉ）によるストレスは、（ｉ）によるストレスを維持している間に適用される。
【0159】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＨＣＴ－１１６細胞により産生された。
【0160】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のストレス：代謝ストレス、および化学的ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。化学的ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載されている。
【0161】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0162】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＨＣＴ－１１６細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露。
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉ）によるストレスは、（ｉ）によるストレスを維持している間に適用される。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約３１．５ｎＭ、１００ｎＭまたは３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）へのインビトロ曝露。
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉ）によるストレスは、（ｉ）によるストレスを維持している間に適用される。
【0163】
一実施形態では、方法は、（ｉ）ストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、および（ｉｉ）ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる中間組成物「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」の製造のためであり、ストレスおよび／または耐性タンパク質は、インビトロで適用された（ｉ）代謝ストレス、および（ｉｉ）化学的ストレスに応答して、これらのＬｏＶｏ細胞により産生された。
【0164】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のストレス：代謝ストレス、および化学的ストレスにインビトロで供することを含むかまたはそれからなる。化学的ストレスおよび代謝ストレスは、前に記載した。
【0165】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
（ｉ）枯渇培地（例えば、がん細胞の成長および／または生存に有用な、または不可欠でさえある１つまたは複数の物質を部分的にまたは完全に欠く培地）中での、低酸素下での、および／または低いｐＨ（例えば、ｐＨ６．５未満）での、インビトロ培養、
（ｉｉ）少なくとも１つまたは複数の化学療法剤および／またはアルコールへの約６時間～約１２０時間、好ましくは、約２４～約９６時間の範囲にわたる、例えば、２４、３０、３６、４２、４８、５４、６０、６６、７２、７８、８４、９０、または９６時間にわたるインビトロ曝露。
【0166】
この実施形態では、方法のステップｂ）は、方法のステップａ）で培養されたＬｏＶｏ細胞を以下のインビトロストレスに供することを含むかまたはそれからなる：
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露。
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉ）によるストレスは、（ｉ）によるストレスを維持している間に適用される。
（ｉ）２％ＦＢＳ培地中の低血清培養条件中でのインビトロ培養、
（ｉｉ）約４８時間にわたる、約５μＭのフルオロウラシル（５－ＦＵ）へのインビトロ曝露。
一実施形態では、（ｉ）によるストレスは、ステップｂ）の全期間にわたり適用される。一実施形態では、（ｉｉ）によるストレスは、（ｉ）によるストレスを維持している間に適用される。
【0167】
本発明はまた、上述の（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物の製造方法にも関する。この最終組成物は、本明細書では、「ＤＰ」と呼ばれる。
【0168】
一実施形態では、上述の（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物の製造方法は、以下のステップ：
ａ）上記の中間組成物の製造方法を使用して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＢおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ中間組成物を得るステップ；ならびに
ｂ）ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＢおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ中間組成物を共に混合するステップ
を含む。
ａ）上記の中間組成物の製造方法を使用して、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＢおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ中間組成物を得るステップ；ならびに
ｂ）ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＢおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ中間組成物を共に混合するステップ
を含む。
【0169】
一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、組成物１ｍＬ当り、約１０６～約１０9個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、好ましくは、組成物１ｍＬ当り、約１０６～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、例えば、組成物１ｍＬ当り、約１ｘ１０７、２ｘ１０７、３ｘ１０７、４ｘ１０７、５ｘ１０７、６ｘ１０７、７ｘ１０７、８ｘ１０７、９ｘ１０７、または１ｘ１０８個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の最終濃度と混合することを含む。一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、組成物１ｍＬ当り、約３ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の最終濃度と混合することを含む。
【0170】
一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞（すなわち、約１：１：１：１：１：１）と等しい比率で混合することを含む。一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、ストレスを受けたＨＣＴ－１１６またはＬｏＶｏ細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多いストレスを受けたＨＴ－２９を含むかまたはそれからなる比率で混合することを含む。一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、ストレスを受けたＨＴ－２９またはＬｏＶｏ細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多いストレスを受けたＨＣＴ－１１６を含む、またはそれからなる比率で混合することを含む。一実施形態では、ステップｂ）は、６つの中間組成物を、ストレスを受けたＨＴ－２９またはＨＣＴ－１１６細胞よりも、少なくとも１．５、２または２．５倍多いストレスを受けたＬｏＶｏ細胞を含む、またはそれからなる比率で混合することを含む。
【0171】
一実施形態では、ステップｂ）は、下記を共に混合することを含む：
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞（ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ由来）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞（ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＡおよびＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ由来）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞（ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞。
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞（ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ由来）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９細胞、
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞（ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＡおよびＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ由来）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＣＴ－１１６細胞、および
－約１０５～約１０8個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞（ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ）、好ましくは、約１０６～約１０7個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＬｏＶｏ細胞。
【0172】
治療的使用および方法
本発明はまた、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書の上記で定義される、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物を、前記対象に投与することを含む方法にも関する。
本発明はまた、それを必要とする対象におけるがんを処置する方法であって、本明細書の上記で定義される、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる組成物を、前記対象に投与することを含む方法にも関する。
【0173】
本発明はまた、それを必要とする対象におけるがんの処置に使用するための、本明細書の上記で定義される、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質、を含むかまたはそれらからなる組成物にも関する。
【0174】
本発明はまた、それを必要とする対象におけるがんの処置のための、本明細書の上記で定義される、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質、を含むかまたはそれらからなる組成物の使用にも関する。
【0175】
本発明はまた、それを必要とする対象におけるがんの処置のための医薬の製造のための、本明細書の上記で定義される、（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）インビトロで適用されたストレスに応答して、これらの細胞により産生された免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質、を含むかまたはそれらからなる組成物の使用に関する。
一実施形態では、がんを処置することは、前記がん由来のがん細胞に対する免疫応答を誘発することを含む。
一実施形態では、がんを処置することは、前記がん由来のがん細胞に対する免疫応答を誘発することを含む。
【0176】
がんの例には、疾病及び関連保健問題の国際統計分類（ＩＣＤ）、の第１０版、ＩＩ章、ブロックＣ００～Ｄ４８に列挙されているものが挙げられる。
がんのさらなる例としては、限定されないが、再発、転移または多剤耐性がんが挙げられる。
がんのさらなる例には、限定されないが、腺線維腫、腺腫、原発性骨髄線維症、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、エナメル上皮腫、肛門がん、血管嚢胞性縦隔リンパ節過形成、被角血管腫、好酸球性血管リンパ球増殖症、血管腫症、無汗性外胚葉形成異常症、前後異形成、アポクリン化生、アプドーマ、窒息性胸郭異形成症、星状細胞腫（例えば、小脳星細胞腫および大脳星細胞腫を含む）、心房指形成異常、非定型メラニン細胞過形成、非定型異形成、自己実質化生、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖症、胆管がん（例えば、肝外胆管がんを含む）、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍（例えば、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫神経膠腫、悪性神経膠腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路および視床下部膠腫、上衣腫、髄芽腫、妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫および傍神経節腫を含む）、鰓腫、女性乳がん、男性乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、気管支肺異形成症、上皮細胞のがん成長、上皮細胞の前がん様成長、上皮細胞の転移成長、カルチノイド心臓疾患、カルチノイド腫瘍（例えば、消化管カルチノイド腫瘍を含む）、癌腫（例えば、原発不明癌、副腎皮質癌、膵島細胞癌、腺癌、副腎皮質癌、基底細胞癌、基底扁平細胞癌、細気管支癌、ブラウン・ピアース癌、嚢胞腺癌、腺管癌、肝細胞癌、クレブス癌、乳頭癌、燕麦細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平細胞癌、移行上皮癌、ウォーカー癌、メルケル細胞癌、および皮膚癌を含む）、セメント質腫、セメント質過形成、大脳の形成異常症、子宮頸がん、子宮頸部異形成、胆管癌、真珠腫、軟骨芽細胞腫、軟骨外胚葉異形成、脊索腫、分離腫、軟骨腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）、鎖骨頭蓋異形成症、結腸腺癌、結腸がん、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、局所転移結腸直腸がん、先天性副腎過形成、先天性の外胚葉異形成症、先天性脂腺過形成、結合組織異形成、頭蓋手根足根骨形成不全、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨幹端異形成、頭蓋咽頭腫、円柱腫、嚢胞腺腫、嚢胞性過形成（例えば、乳房の嚢胞性過形成を含む）、葉上嚢肉腫（ｃｙｓｔｏｓａｒｃｏｎｉａ ｐｈｙｌｌｏｄｅｓ）、象牙質異形成症、義歯性線維症、骨幹異形成、乳管過形成、未分化胚細胞腫、片肢性骨端異形成症、多発性骨端異形成、骨端線離開異形成、点状骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ ｐｕｎｃｔａｔａ）、外胚葉異形成症、エールリッヒ腫瘍、エナメル異形成症、脳眼形成不全症、子宮内膜がん（例えば、上衣腫および子宮内膜過形成を含む）、上衣腫、上皮がん、上皮異形成、上皮化生、食道がん、ユーイング腫瘍ファミリー（例えば、ユーイング肉腫を含む）、肝外胆管がん、眼がん（例えば、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫を含む）、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維腫、線維筋性異形成、線維筋過形成、線維性骨異形成症、開花性骨異形成、局所性上皮肥厚、膀胱がん、神経節腫、胃がん（例えば、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）を含む）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管がん、消化管腫瘍、ゴーシェ病、生殖細胞腫瘍（例えば、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、および卵巣胚細胞腫瘍を含む）、巨細胞腫、歯肉過形成、神経膠芽腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、過誤腫、頭頸部がん、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、肝細胞がん、肝細胞腫、遺伝性腎－網膜形成異常、発汗性外胚葉形成異常症、組織球腫（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｎｉａ）、組織球症、高ガンマグロブリン血症、発汗減少症性外胚葉性異形成、下咽頭がん、炎症性線維性歯肉増殖、炎症性乳頭状歯肉増殖、腸がん、腸上皮化生、腸ポリープ、眼内黒色腫、血管内乳頭状内皮過形成、腎臓がん、咽喉がん、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性ヘアリー細胞白血病、急性Ｂ細胞白血病、急性Ｔ細胞白血病、ＨＴＬＶ白血病、慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性ヘアリー細胞白血病、慢性Ｂ細胞白血病、慢性Ｔ細胞白血病、および慢性ＨＴＬＶ白血病を含む）、ライディッヒ細胞腫、口唇がんおよび口腔がん、脂肪腫、肝臓がん、肺がん（例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、管筋腫、リンパ管腫、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、マスト細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、腺リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、および小細胞リンパ腫を含む）、リンパ球減少性胸腺異形成、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、悪性カルチノイド症候群、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、乳腺異形成症、下顎顔面異形成、髄芽腫、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫（例えば、悪性中皮腫を含む）、骨幹端異形成、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、 転移性頸部扁平上皮がん（例えば、原発不明転移性頸部扁平上皮がんを含む）、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成症、粘膜上皮異形成、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨端形成異常、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄化生、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、筋芽細胞腫、筋腫、粘液腫、鼻副鼻腔がん、上咽頭がん、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、腹部腫瘍、骨腫瘍、乳房腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、膵臓腫瘍、腹膜腫瘍、内分泌腺腫瘍（例えば、副腎腫瘍、上皮小体腫瘍、下垂体腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、胸腺腫瘍、および甲状腺腫瘍を含む）、眼腫瘍、頭頸部腫瘍、神経系腫瘍（例えば、中枢神経系腫瘍および末梢神経系腫瘍を含む）、リンパ系腫瘍、骨盤腫瘍、皮膚腫瘍、軟組織腫瘍、脾臓腫瘍、胸部腫瘍、尿生殖路腫瘍、神経鞘腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経腫、結節性前立腺過形成、結節性再生性過形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指形成異常、眼脊椎異形成、歯牙異形成、歯牙腫、眼下顎異形成、中咽頭がん、骨腫、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がんおよび卵巣低悪性度腫瘍を含む）、膵臓がん（例えば、島細胞膵がんおよび外分泌膵臓がんを含む）、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、異常蛋白血症、副甲状腺がん、根尖性セメント質異形成症、褐色細胞腫（例えば、陰茎がんを含む）、松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、松果体腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、多骨性線維性骨異形成症、ポリープ、妊娠がん、新生物発生前障害（例えば、良性増殖異常傷害、例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、食道異形成症、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光角化症を含む）、原発性肝細胞がん、原発性肝臓がん、原発性骨髄化生、前立腺がん、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、偽上皮腫性増殖、紫斑病、直腸がん、腎がん（例えば、腎臓がん、腎盂、尿管がん、腎盂および尿管の移行細胞がん、を含む）、細網内皮症、網膜異形成、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、子宮肉腫、軟部肉腫、癌肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、横紋筋肉腫、サルコイドーシス肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、および腱鞘の明細胞肉腫を含む）、硬化性血管腫、二次性骨髄様化生、老人性脂腺増生症、中隔視神経形成異常症、セルトリ細胞腫、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、黒色腫皮膚がんおよび非黒色腫皮膚がんを含む）、小腸がん、脊椎骨端異形成、扁平上皮化生（例えば、羊膜の扁平上皮化生を含む）、胃がん、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、症候性骨髄様化生、奇形腫、精巣がん、莢膜細胞腫、胸腺腫（例えば、悪性胸腺腫を含む）、甲状腺がん、栄養膜腫瘍（例えば、妊娠性栄養膜腫瘍を含む）、尿管がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、心室橈骨異形成、ゆうぜい性肥厚、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウイルムス腫瘍、が挙げられる。
一実施形態では、がんは、腎がん、肝臓がん、膵臓がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、子宮頸がん、黒色腫および神経膠腫を含むかまたはそれらからなる群より選択される。
一実施形態では、がんは、限定されないが、結腸腺癌、結腸がん、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、および結腸直腸癌を含む結腸がんおよび結腸直腸がんを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
がんのさらなる例としては、限定されないが、再発、転移または多剤耐性がんが挙げられる。
がんのさらなる例には、限定されないが、腺線維腫、腺腫、原発性骨髄線維症、ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍、エナメル上皮腫、肛門がん、血管嚢胞性縦隔リンパ節過形成、被角血管腫、好酸球性血管リンパ球増殖症、血管腫症、無汗性外胚葉形成異常症、前後異形成、アポクリン化生、アプドーマ、窒息性胸郭異形成症、星状細胞腫（例えば、小脳星細胞腫および大脳星細胞腫を含む）、心房指形成異常、非定型メラニン細胞過形成、非定型異形成、自己実質化生、基底細胞過形成、良性巨大リンパ節増殖症、胆管がん（例えば、肝外胆管がんを含む）、膀胱がん、骨がん、脳腫瘍（例えば、脳幹神経膠腫、小脳星細胞腫神経膠腫、悪性神経膠腫、テント上原始神経外胚葉腫瘍、視経路および視床下部膠腫、上衣腫、髄芽腫、妊娠性絨毛性腫瘍神経膠腫および傍神経節腫を含む）、鰓腫、女性乳がん、男性乳がん、気管支腺腫／カルチノイド、気管支肺異形成症、上皮細胞のがん成長、上皮細胞の前がん様成長、上皮細胞の転移成長、カルチノイド心臓疾患、カルチノイド腫瘍（例えば、消化管カルチノイド腫瘍を含む）、癌腫（例えば、原発不明癌、副腎皮質癌、膵島細胞癌、腺癌、副腎皮質癌、基底細胞癌、基底扁平細胞癌、細気管支癌、ブラウン・ピアース癌、嚢胞腺癌、腺管癌、肝細胞癌、クレブス癌、乳頭癌、燕麦細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、扁平細胞癌、移行上皮癌、ウォーカー癌、メルケル細胞癌、および皮膚癌を含む）、セメント質腫、セメント質過形成、大脳の形成異常症、子宮頸がん、子宮頸部異形成、胆管癌、真珠腫、軟骨芽細胞腫、軟骨外胚葉異形成、脊索腫、分離腫、軟骨腫（ｃｈｒｏｎｄｒｏｍａ）、鎖骨頭蓋異形成症、結腸腺癌、結腸がん、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、結腸直腸癌、局所転移結腸直腸がん、先天性副腎過形成、先天性の外胚葉異形成症、先天性脂腺過形成、結合組織異形成、頭蓋手根足根骨形成不全、頭蓋骨幹異形成、頭蓋骨幹端異形成、頭蓋咽頭腫、円柱腫、嚢胞腺腫、嚢胞性過形成（例えば、乳房の嚢胞性過形成を含む）、葉上嚢肉腫（ｃｙｓｔｏｓａｒｃｏｎｉａ ｐｈｙｌｌｏｄｅｓ）、象牙質異形成症、義歯性線維症、骨幹異形成、乳管過形成、未分化胚細胞腫、片肢性骨端異形成症、多発性骨端異形成、骨端線離開異形成、点状骨端異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ ｅｐｉｐｈｙｓｉａｌｉｓ ｐｕｎｃｔａｔａ）、外胚葉異形成症、エールリッヒ腫瘍、エナメル異形成症、脳眼形成不全症、子宮内膜がん（例えば、上衣腫および子宮内膜過形成を含む）、上衣腫、上皮がん、上皮異形成、上皮化生、食道がん、ユーイング腫瘍ファミリー（例えば、ユーイング肉腫を含む）、肝外胆管がん、眼がん（例えば、眼内黒色腫および網膜芽細胞腫を含む）、顔面指趾生殖器異形成、家族性線維性顎異形成、家族性白色襞性異形成、線維腫、線維筋性異形成、線維筋過形成、線維性骨異形成症、開花性骨異形成、局所性上皮肥厚、膀胱がん、神経節腫、胃がん（例えば、胃がん（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）を含む）、消化管カルチノイド腫瘍、消化管がん、消化管腫瘍、ゴーシェ病、生殖細胞腫瘍（例えば、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、および卵巣胚細胞腫瘍を含む）、巨細胞腫、歯肉過形成、神経膠芽腫、グロムス血管腫、顆粒膜細胞腫、半陰陽性卵巣腫瘍、過誤腫、頭頸部がん、血管内皮腫、血管腫、血管外皮細胞腫、肝細胞がん、肝細胞腫、遺伝性腎－網膜形成異常、発汗性外胚葉形成異常症、組織球腫（ｈｉｓｔｉｏｃｙｔｏｎｉａ）、組織球症、高ガンマグロブリン血症、発汗減少症性外胚葉性異形成、下咽頭がん、炎症性線維性歯肉増殖、炎症性乳頭状歯肉増殖、腸がん、腸上皮化生、腸ポリープ、眼内黒色腫、血管内乳頭状内皮過形成、腎臓がん、咽喉がん、平滑筋肉腫、白血病（例えば、急性リンパ芽球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、急性ヘアリー細胞白血病、急性Ｂ細胞白血病、急性Ｔ細胞白血病、ＨＴＬＶ白血病、慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性ヘアリー細胞白血病、慢性Ｂ細胞白血病、慢性Ｔ細胞白血病、および慢性ＨＴＬＶ白血病を含む）、ライディッヒ細胞腫、口唇がんおよび口腔がん、脂肪腫、肝臓がん、肺がん（例えば、小細胞肺がんおよび非小細胞肺がんを含む）、管筋腫、リンパ管腫、リンパ腫（例えば、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、中枢神経系リンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、妊娠中の非ホジキンリンパ腫、マスト細胞リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、腺リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、大細胞型リンパ腫、および小細胞リンパ腫を含む）、リンパ球減少性胸腺異形成、リンパ増殖性障害、マクログロブリン血症（例えば、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、悪性カルチノイド症候群、悪性中皮腫、悪性胸腺腫、乳腺異形成症、下顎顔面異形成、髄芽腫、髄膜腫、間葉腫、中腎腫、中皮腫（例えば、悪性中皮腫を含む）、骨幹端異形成、化生性貧血、変形骨化、化生性ポリープ、 転移性頸部扁平上皮がん（例えば、原発不明転移性頸部扁平上皮がんを含む）、モンディーニ異形成、単骨性線維性骨異形成症、粘膜上皮異形成、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨端形成異常、多発性骨髄腫／形質細胞腫瘍、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄化生、骨髄増殖性疾患、慢性骨髄増殖性疾患、筋芽細胞腫、筋腫、粘液腫、鼻副鼻腔がん、上咽頭がん、前立腺腫瘍、結腸腫瘍、腹部腫瘍、骨腫瘍、乳房腫瘍、消化管腫瘍、肝腫瘍、膵臓腫瘍、腹膜腫瘍、内分泌腺腫瘍（例えば、副腎腫瘍、上皮小体腫瘍、下垂体腫瘍、精巣腫瘍、卵巣腫瘍、胸腺腫瘍、および甲状腺腫瘍を含む）、眼腫瘍、頭頸部腫瘍、神経系腫瘍（例えば、中枢神経系腫瘍および末梢神経系腫瘍を含む）、リンパ系腫瘍、骨盤腫瘍、皮膚腫瘍、軟組織腫瘍、脾臓腫瘍、胸部腫瘍、尿生殖路腫瘍、神経鞘腫、神経芽腫、神経上皮腫、神経線維腫、神経線維腫症、神経腫、結節性前立腺過形成、結節性再生性過形成、眼耳脊椎異形成、眼歯指形成異常、眼脊椎異形成、歯牙異形成、歯牙腫、眼下顎異形成、中咽頭がん、骨腫、卵巣がん（例えば、卵巣上皮がんおよび卵巣低悪性度腫瘍を含む）、膵臓がん（例えば、島細胞膵がんおよび外分泌膵臓がんを含む）、乳頭腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、副鼻腔および鼻腔がん、異常蛋白血症、副甲状腺がん、根尖性セメント質異形成症、褐色細胞腫（例えば、陰茎がんを含む）、松果体およびテント上原始神経外胚葉腫瘍、松果体腫、下垂体腫瘍、形質細胞腫瘍／多発性骨髄腫、形質細胞腫、胸膜肺芽腫、多骨性線維性骨異形成症、ポリープ、妊娠がん、新生物発生前障害（例えば、良性増殖異常傷害、例えば、良性腫瘍、線維嚢胞性状態、組織肥大、腸ポリープ、結腸ポリープ、食道異形成症、白斑症、角化症、ボーエン病、農夫皮膚、日光口唇炎、および日光角化症を含む）、原発性肝細胞がん、原発性肝臓がん、原発性骨髄化生、前立腺がん、偽軟骨発育不全脊椎骨端異形成、偽上皮腫性増殖、紫斑病、直腸がん、腎がん（例えば、腎臓がん、腎盂、尿管がん、腎盂および尿管の移行細胞がん、を含む）、細網内皮症、網膜異形成、網膜芽細胞腫、唾液腺がん、肉腫（例えば、子宮肉腫、軟部肉腫、癌肉腫、軟骨肉腫、線維肉腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、筋肉腫、粘液肉腫、横紋筋肉腫、サルコイドーシス肉腫、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨の悪性線維性組織球腫、および腱鞘の明細胞肉腫を含む）、硬化性血管腫、二次性骨髄様化生、老人性脂腺増生症、中隔視神経形成異常症、セルトリ細胞腫、セザリー症候群、皮膚がん（例えば、黒色腫皮膚がんおよび非黒色腫皮膚がんを含む）、小腸がん、脊椎骨端異形成、扁平上皮化生（例えば、羊膜の扁平上皮化生を含む）、胃がん、テント上原始神経外胚葉および松果体腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍、症候性骨髄様化生、奇形腫、精巣がん、莢膜細胞腫、胸腺腫（例えば、悪性胸腺腫を含む）、甲状腺がん、栄養膜腫瘍（例えば、妊娠性栄養膜腫瘍を含む）、尿管がん、尿道がん、子宮がん、膣がん、心室橈骨異形成、ゆうぜい性肥厚、外陰がん、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、およびウイルムス腫瘍、が挙げられる。
一実施形態では、がんは、腎がん、肝臓がん、膵臓がん、子宮内膜がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、肺がん、頭頸部がん、子宮頸がん、黒色腫および神経膠腫を含むかまたはそれらからなる群より選択される。
一実施形態では、がんは、限定されないが、結腸腺癌、結腸がん、結腸癌、結腸直腸腺癌、結腸直腸がん、および結腸直腸癌を含む結腸がんおよび結腸直腸がんを含むかまたはそれらからなる群から選択される。
【0177】
一実施形態では、組成物は、１回投与されるか、または１回投与される予定である。一実施形態では、組成物は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５回またはそれより多くなどの数回投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、毎週、２週毎、３週毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、毎年投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、導入レジメンまたはボーラスレジメンとして、好ましくは、最初の数週間にわたり、例えば、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間またはそれより長い期間にわたり、好ましくは、最初の６～８週間にわたり、毎週、２週毎、３週毎、毎月、好ましくは毎週投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、導入レジメンまたはボーラスレジメン後、追加のレジメンとして、毎月、２ヶ月毎、３か月毎、６ヶ月毎、毎年投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、最初の６～８週間は毎週；その後、約１か月後；その後、約３か月後；その後、がんが処置されるまで６ヶ月毎に投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約１０５～約１０8個の範囲のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個の範囲のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、単回用量として投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、少なくとも２回用量、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの回数の用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約３ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、組成物は、約６ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、組成物は、６ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の単回用量、または約３ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の２回用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約１０μＬ～約１ｍＬの範囲の体積、例えば、約１０μＬ、約５０μＬ、約１００μＬ、約２００μＬ、約３００μＬ、約４００μＬ、約５００μＬ、約６００μＬ、約７００μＬ、約８００μＬ、約９００μＬ、または１ｍＬ、好ましくは約１００μＬの体積で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、全身投与されるか、または全身投与される予定である。一実施形態では、組成物は、注射により、好ましくは、全身注射により投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、毎週、２週毎、３週毎、毎月、２ヶ月毎、３ヶ月毎、６ヶ月毎、毎年投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、導入レジメンまたはボーラスレジメンとして、好ましくは、最初の数週間にわたり、例えば、最初の２、３、４、５、６、７、８、９、１０週間またはそれより長い期間にわたり、好ましくは、最初の６～８週間にわたり、毎週、２週毎、３週毎、毎月、好ましくは毎週投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、導入レジメンまたはボーラスレジメン後、追加のレジメンとして、毎月、２ヶ月毎、３か月毎、６ヶ月毎、毎年投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、最初の６～８週間は毎週；その後、約１か月後；その後、約３か月後；その後、がんが処置されるまで６ヶ月毎に投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約１０５～約１０8個の範囲のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、好ましくは、約１０６～約１０7個の範囲のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、例えば、約１ｘ１０６、２ｘ１０６、３ｘ１０６、４ｘ１０６、５ｘ１０６、６ｘ１０６、７ｘ１０６、８ｘ１０６、９ｘ１０６、または１ｘ１０７個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、単回用量として投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、少なくとも２回用量、例えば、２、３、４、５またはそれより多くの回数の用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約３ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、組成物は、約６ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の総用量で投与されるか、または投与される予定である。一実施形態では、組成物は、６ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の単回用量、または約３ｘ１０６個のストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞の２回用量で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、約１０μＬ～約１ｍＬの範囲の体積、例えば、約１０μＬ、約５０μＬ、約１００μＬ、約２００μＬ、約３００μＬ、約４００μＬ、約５００μＬ、約６００μＬ、約７００μＬ、約８００μＬ、約９００μＬ、または１ｍＬ、好ましくは約１００μＬの体積で投与されるか、または投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、全身投与されるか、または全身投与される予定である。一実施形態では、組成物は、注射により、好ましくは、全身注射により投与されるか、または投与される予定である。
【0178】
全身注射の例には、限定されないが、静脈内（ｉｖ）、皮下（ｓｑ）、皮内（ｉｄ）、筋肉内（ｉｍ）、動脈内、非経口、結節内、腹腔内（ｉｐ）、心臓内、病巣内、前立腺内、膣内、直腸内、髄腔内、鼻腔内、腫瘍内（ｉｔ）、小胞内、および灌流が挙げられる。
一実施形態では、組成物は、皮内、皮下、腫瘍内または静脈内に投与されるか、投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、皮内投与されるか、または皮内投与される予定である。
他の好適な投与経路も同様に、本発明で同様に意図され、投与方法は最終的に、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定される。
一実施形態では、組成物は、皮内、皮下、腫瘍内または静脈内に投与されるか、投与される予定である。
一実施形態では、組成物は、皮内投与されるか、または皮内投与される予定である。
他の好適な投与経路も同様に、本発明で同様に意図され、投与方法は最終的に、健全な医学的判断の範囲内で主治医により決定される。
【0179】
一実施形態では、組成物は、少なくとも１つの追加の療法の投与の前に、それと同時に、またはその後に対象に投与されるか、または投与される予定である。
【0180】
好適な追加の療法の例には、上記で定義の化学療法剤、放射線療法および免疫刺激剤が挙げられる。
放射線療法の好適な例には、限定されないが、体外照射療法（例えば、表在性Ｘ線療法、常用電圧Ｘ線療法、メガボルトＸ線療法、放射線外科、定位放射線治療、コバルト療法、電子療法、高速中性子治療、中性子捕獲治療、陽子線治療、など）；密封小線源治療；非密封線源放射線治療；トモセラピー、などが挙げられる。
放射線療法の好適な例には、限定されないが、体外照射療法（例えば、表在性Ｘ線療法、常用電圧Ｘ線療法、メガボルトＸ線療法、放射線外科、定位放射線治療、コバルト療法、電子療法、高速中性子治療、中性子捕獲治療、陽子線治療、など）；密封小線源治療；非密封線源放射線治療；トモセラピー、などが挙げられる。
【0181】
化学療法剤の好適例には、解剖治療化学分類法の亜群Ｌ０３に記載のものが含まれる。免疫刺激剤のさらなる例には、限定されないが、サイトカイン（例えば、フィルグラスチム、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、モルグラモスチム、サルグラモスチム、アンセスチム、アルブインターフェロン、インターフェロンアルファ天然、インターフェロンアルファインターフェロンアルファ２ａ、ペグインターフェロンアルファ２ａ、インターフェロンアルファ２ｂ、インターフェロンアルファｎ１、インターフェロンアルファコン－１、インターフェロンα－ｎ３、インターフェロンベータ天然、インターフェロンベータ１ｂ、インターフェロンガンマ、アルデスロイキン、オプレルベキン、など ）；免疫チェックポイント阻害剤（例えば、ＣＴＬＡ４、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、ＬＡＧ－３、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、Ａ２ＡＲ、および／またはＩＤＯの阻害剤で、ニボルマブ、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＡＭＰ－２２４、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＤＸ－１１０５、ＭＥＤＩ－４７３６、アレルマブ、イピリムマブ、トレメリムマブ、ピディリズマブ、ＩＭＰ３２１、ＭＧＡ２７１、ＢＭＳ－９８６０１６、リリルマブ、ウレルマブ、ＰＦ－０５０８２５６６、ＩＰＨ２１０１、ＭＥＤＩ－６４６９、ＣＰ－８７０，８９３、モガムリズマブ、バルリルマブ、アベルマブ、ガリキシマブ、ＡＭＰ－５１４、ＡＵＮＰ １２、インドキシモド、ＮＬＧ－９１９、ＩＮＣＢ０２４３６０、などを含む）；ｔｏｌｌ様受容体アゴニストス（例えば、ブプレノルフィン、カルバマゼピン、エタノール、フェンタニル、ＧＳ－９６２０、イミキモド、レフィトリモド、レボルファノール、メタドン、モルヒネ、（＋）－モルヒネ、モルヒネ－３－グルクロニド、オクスカルバゼピン、オキシコドン、ペチジン、レシキモド、ＳＤ－１０１、タペンタドール、チルソトリモド、ＶＴＸ－２３３７、クリプトコッカス由来グルクロノキシロマンナン、マイコプラズマ由来ＭＡＬＰ－２、マイコプラズマ由来ＭＡＬＰ－４０４、ボレリア由来ＯｓｐＡ、ナイセリアまたはヘモフィルス由来ポリン、ｈｓｐ６０、ヘマグルチニン、エルシニア由来ＬｃｒＶ、細菌性フラゲリン、リポ多糖類、リポテイコ酸、マイコバクテリウム由来リポマンナン、グリコシルホスファチジルイノシトール、リゾホスファチジルセリン、リーシュマニア由来リポホスホグリカン、サッカロマイセス由来ザイモサン、Ｐａｍ２ＣＧＤＰＫＨＰＫＳＦ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド、ポリ（Ｉ：Ｃ）核酸配列、ポリ（Ａ：Ｕ）核酸配列、ＳＴＩＮＧ受容体作動薬（例えば、国際公開第２０１７１００３０５号の§０２４０に記載のもの、バジメザン、ＣＬ６５６、ＡＤＵ－Ｓ１００、３’３’－ｃＧＡＭＰ、２’３’－ｃＧＡＭＰ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ＣＤＧ、ＭＬ ＲＲ－Ｓ２ ｃＧＡＭＰ、環状ジ－ＧＭＰ、ＤＭＸＡＡ、ＤｉＡＢＺＩ、など）；ＣＤ１リガンド；成長ホルモン；顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）；イムノシアニン；ペガデマーゼ；プロラクチン；タソネルミン；女性の性ステロイドホルモン；ヒスタミン二塩酸塩；ポリＩＣＬＣ；ビタミンＤ；レンティナン；プレリキサホル；ロキニメックス；ミファムルチド、酢酸グラチラマー；チモペンチン；チモシンα１；チムリン；ポリイノシン（酸）ポリシチジル酸；ピドチモド；カルメットゲラン桿菌；メラノーマワクチン；シプロイセル－Ｔ；などが挙げられる。
【0182】
一実施形態では、組成物は、例えば、シクロホスファミドなどの化学療法剤の投与後に対象に投与され得る。
更にまたは或いは、組成物は、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの免疫刺激剤の投与と同時に対象に投与され得る。
更にまたは或いは、組成物は、例えば、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）などの免疫刺激剤の投与と同時に対象に投与され得る。
【0183】
キットオブパーツ（部品キット）
本発明は、キットオブパーツにも関する。
用語「キットオブパーツ」は、「パッケージ」、「商業用パッケージ」、または「医薬品パッケージ」とも呼ばれ、個別に貯蔵および／または使用されるが、相互に機能的に関連することが意図される、物理的に分離された成分の実体を包含する。特に、用語「キットオブパーツ」は、任意の順に、必須ではないが典型的には、数時間～数日、数週間もしくはそれより長いの範囲の所与の時間間隔で、別々に；または即時製剤として同時に、または個別に任意の順で、数秒～数分または数時間の範囲の時間間隔内に、使用または投与できる物理的に分離された成分物質を包含する。
本発明は、キットオブパーツにも関する。
用語「キットオブパーツ」は、「パッケージ」、「商業用パッケージ」、または「医薬品パッケージ」とも呼ばれ、個別に貯蔵および／または使用されるが、相互に機能的に関連することが意図される、物理的に分離された成分の実体を包含する。特に、用語「キットオブパーツ」は、任意の順に、必須ではないが典型的には、数時間～数日、数週間もしくはそれより長いの範囲の所与の時間間隔で、別々に；または即時製剤として同時に、または個別に任意の順で、数秒～数分または数時間の範囲の時間間隔内に、使用または投与できる物理的に分離された成分物質を包含する。
【0184】
一実施形態では、キットオブパーツは、下記を含む：
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物。
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物。
【0185】
一実施形態では、キットオブパーツは、下記を含む：
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物。
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物。
【0186】
一実施形態では、キットオブパーツは、下記を含む：
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物。
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ａ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；
－「ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物；および
－「ＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂ」と命名された上記で定義の中間組成物。
【0187】
一実施形態では、キットオブパーツは、上述の（ｉ）ストレスを受けたＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞、ならびに（ｉｉ）免疫原性ストレスおよび／または耐性タンパク質を含むかまたはそれらからなる上述の組成物（「ＤＰと命名された」）の製造方法にしたがって、中間組成物を混合するための説明書を更に含む。
一実施形態では、キットオブパーツは、例えば、上記で定義の、少なくとも１つの化学療法剤および／または免疫刺激剤などの少なくとも１つの追加の治療薬を更に含む。
一実施形態では、キットオブパーツは、例えば、上記で定義の、少なくとも１つの化学療法剤および／または免疫刺激剤などの少なくとも１つの追加の治療薬を更に含む。
【0188】
一実施形態では、キットオブパーツは、下記を含む：
－「ＤＰ」と命名された上記で定義の組成物；
－例えば、上記で定義の、少なくとも１つの化学療法剤および／または免疫刺激剤などの少なくとも１つの追加の治療薬。
－「ＤＰ」と命名された上記で定義の組成物；
－例えば、上記で定義の、少なくとも１つの化学療法剤および／または免疫刺激剤などの少なくとも１つの追加の治療薬。
【図面の簡単な説明】
【0189】
【図1A】無処置試料に関する、３つのヒト細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ）のそれぞれで特定されたタンパク質の数を比較した２つのベン図である。 図１Ａ：ＲＣＢ試料。 図１Ｂ：ＭＣＢ試料。
【図1B】無処置試料に関する、３つのヒト細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ）のそれぞれで特定されたタンパク質の数を比較した２つのベン図である。 図１Ａ：ＲＣＢ試料。 図１Ｂ：ＭＣＢ試料。
【図2】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示すグラフである。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
【図3】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおいて過剰発現および過少発現したタンパク質の数を示すグラフである。
【図4】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示すグラフである。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
【図5】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰発現および過少発現したタンパク質の数を示すグラフである。
【図6】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示すグラフである。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
【図7】古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰発現および過少発現したタンパク質の数を示すグラフである。
【図8】ＨＴ－２９細胞：ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、およびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂのいくつかの組成物における、ならびにＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂの混合物を含む薬物製剤（ＤＰ）における、膜および／または細胞表面タンパク質またはその他（すなわち、用語「膜」または「細胞表面」が、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒ ｄａｔａｂａｓｅの「細胞成分」領域においてアノーテーションとして報告されなかったいずれか他のタンパク質）に関わらず、同定されたタンパク質の数を示す（ｙ軸上に）グラフである。実験は、３連で実施し、「＃１」、「＃２」および「＃３」として示した。
【図9A】ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ａ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｂ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ（図９Ｃ）、およびＤＰ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｄ）の間のｐ値および倍率変化によるタンパク質分布を示すパイチャートである。
【図9B】ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ａ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｂ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ（図９Ｃ）、およびＤＰ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｄ）の間のｐ値および倍率変化によるタンパク質分布を示すパイチャートである。
【図9C】ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ａ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｂ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ（図９Ｃ）、およびＤＰ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｄ）の間のｐ値および倍率変化によるタンパク質分布を示すパイチャートである。
【図9D】ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ａ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｂ）、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ（図９Ｃ）、およびＤＰ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ（図９Ｄ）の間のｐ値および倍率変化によるタンパク質分布を示すパイチャートである。
【図10】ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ対ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ対ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、およびＤＰ対ＨＴ－２９ ＭＣＢの間で、統計学的に有意に過少発現（すなわち、ｐ値≦０．０５および存在量比率≦０．５）または過剰発現（すなわち、ｐ値≦０．０５および存在量比≧２）された、膜および／または細胞表面タンパク質の数（ｙ軸上に）を示すグラフである。過少発現したタンパク質の数は、負の数として示される。
【図11A】樹状細胞からのＩＬ－８またはＩＬ－１２の分泌を示す、ｐｇ／ｍＬで表す３つのグラフである。図１１Ａ：ＣＤ４０Ｌの非存在下のＩＬ－８の分泌；図１１Ｂ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－８の分泌；図１１Ｃ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－１２の分泌。
【図11B】樹状細胞からのＩＬ－８またはＩＬ－１２の分泌を示す、ｐｇ／ｍＬで表す３つのグラフである。図１１Ａ：ＣＤ４０Ｌの非存在下のＩＬ－８の分泌；図１１Ｂ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－８の分泌；図１１Ｃ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－１２の分泌。
【図11C】樹状細胞からのＩＬ－８またはＩＬ－１２の分泌を示す、ｐｇ／ｍＬで表す３つのグラフである。図１１Ａ：ＣＤ４０Ｌの非存在下のＩＬ－８の分泌；図１１Ｂ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－８の分泌；図１１Ｃ：０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在下でのＩＬ－１２の分泌。
【図12】種々の比率のＳＴＣ－１０１０で処置されたｍＤＣおよび自家ＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養から収集した上清中のＩＦＮγ放出を示すグラフである。ハッシュのラインは、ＩＦＮγの検出限界を示す。
【図13A】種々の用量のＳＴＣ－１０１０での処置時にＲＴ－ｑＰＣＲにより評価された、ＤＣ活性化マーカーＣＤ４０、ＣＤ８３およびＣＤ８６の発現を示す３つのグラフである。データは、ニワトリＧＡＰＤＨの発現に対して正規化した相対量として表される。図１３Ａ：ＣＤ４０の発現；図１３Ｂ：ＣＤ８３の発現；図１３Ｃ：ＣＤ８６の発現。
【0190】
実施例
本発明は、以下の実施例により更に説明される。
実施例１
ヒト結腸直腸がんワクチンのための細胞株の選択
本発明者らは、がん細胞株においてインビトロ耐性機構を人為的に発達させ、それらを免疫原性にすることにより、それら自体に対するがん細胞耐性機構を調整する抗がん処置の開発を目的とした。
いくつかの結腸直腸ヒト細胞株をヒト結腸直腸がんワクチンの開発のための好適な候補として選択した。
本発明は、以下の実施例により更に説明される。
実施例１
ヒト結腸直腸がんワクチンのための細胞株の選択
本発明者らは、がん細胞株においてインビトロ耐性機構を人為的に発達させ、それらを免疫原性にすることにより、それら自体に対するがん細胞耐性機構を調整する抗がん処置の開発を目的とした。
いくつかの結腸直腸ヒト細胞株をヒト結腸直腸がんワクチンの開発のための好適な候補として選択した。
【0191】
最初の細胞株の選択は、最大の臨床類型学パネル：マイクロサテライト安定性（ＭＳＳ対ＭＳＩ状態）；変異対野性型ＢＲＡＦ、ＫＲＡＳ、ＰＩＫ３ＣＡ、ＰｔｅｎおよびＴＰ５３遺伝子；共通の抗がん治療に対する既知の耐性（フルオロウラシル「５－ＦＵ」、オキサリプラチン、ＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）、抗ＶＥＧＦ抗体）を範囲に含むように、それらの生物学的および遺伝的特徴に基づいて行った。
文献およびデータベース（ＳｅｌＴＡＲｂａｓｅ，ＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓおよびＧＤＳＣデータベース）に基づいて、以下の細胞株を選択した：
－ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＬ－１８８（商標））、
－ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２７（商標））、
－ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２８（商標））、
－ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２９（商標））、
－ＳＷ４８（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２３１（商標））、
－ＨＣＴ－１１６（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２４７（商標））、および
－ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＨＴＢ－３８（商標））。
文献およびデータベース（ＳｅｌＴＡＲｂａｓｅ，ＣｅｌｌｏｓａｕｒｕｓおよびＧＤＳＣデータベース）に基づいて、以下の細胞株を選択した：
－ＬＳ１７４Ｔ（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＬ－１８８（商標））、
－ＳＷ６２０（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２７（商標））、
－ＳＷ４８０（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２８（商標））、
－ＬｏＶｏ（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２２９（商標））、
－ＳＷ４８（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２３１（商標））、
－ＨＣＴ－１１６（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＣＣＬ－２４７（商標））、および
－ＨＴ－２９（ＡＴＣＣ（登録商標）参照番号：ＨＴＢ－３８（商標））。
【0192】
予備研究用細胞バンク（ＲＣＢ）：これらの細胞株を、ＡＴＣＣから取得し、１０％ＦＢＳ中で培養し、７つのＲＣＢを得たが、これらの７つから６つのみが予想される成長プロファイルを有し、凍結－解凍サイクル後、生存可能であった：ＳＷ６２０をこの段階で廃棄した（表１）。
【表1】
【0193】
プレＲＣＢ２％：予想される成長プロファイルを有するこれらの６つのＲＣＢは、抗ＶＥＧＦ抗体で観察された栄養源枯渇作用を模倣するために、低血清培養条件（１０％ＦＢＳ→５％ＦＢＳ→２％ＦＢＳ）に適応させた。
４つの細胞株のみga、低血清培養条件中で成長することが可能であり、凍結－解凍サイクル後に生存可能であった（ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ、およびＳＷ４８０）（表２）。
これらの４つの細胞株をその後、２つの更なるタイプのストレスに曝露して、「ＤＳ－Ａ」および「ＤＳ－Ｂ」を得た。
４つの細胞株のみga、低血清培養条件中で成長することが可能であり、凍結－解凍サイクル後に生存可能であった（ＨＣＴ－１１６、ＨＴ－２９、ＬｏＶｏ、およびＳＷ４８０）（表２）。
【表2】
【0194】
ＤＳ－Ａ：ヒートショックタンパク質ＨＳＰ７０の発現を誘導するために、細胞を（１）低線量電離放射線（１０Ｇｙ）に５分間、および（２）熱ストレス（４２℃で１時間）の組み合わせを含む物理的ストレスに曝露した。
【0195】
ＤＳ－Ｂ：細胞を、結腸直腸がんに対し一般的に使用される化学療法剤：５－ＦＵ（Ｓｉｇｍａ、Ｆ６６２７）、オキサリプラチン（Ｓｉｇｍａ、Ｙ００００２７１）またはＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）（Ｓｉｇｍａ、Ｈ０１６５）による化学的刺激を含む化学的ストレスに曝露した。特に、化学療法剤と各細胞株との会合は、文献の前提（表３）、および更に各化学療法剤に対する細胞株の耐性の程度に基づいた。各細胞株に関して、各化学療法剤に対するこの耐性レベルを、細胞傷害性アッセイにおいて５０％阻害濃度（ＩＣ５０）を測定することにより評価した。ＩＣ５０を表４に示す。
【表3】
【表4】
【0196】
ストレスに曝露後、物理的または化学的曝露に関係なく、細胞はハプテン化され、すなわち、ストレスに応答して耐性機構として発現されたストレスタンパク質に対する免疫原性を付与することが可能な担体分子の結合を通して、これらのストレスタンパク質が遊離であるか、がん細胞の表面に結合しているか、またはその内部に存在するかどうかにかかわらず、免疫原性となった。担体分子は、ジニトロフェニルである。
最終的に、ストレス曝露後に低減された血清（２％ＦＢＳ）を有する培地中で最良の増殖能を有する３つの細胞株：ＬｏＶｏ、ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９が選択された。
最終的に、ストレス曝露後に低減された血清（２％ＦＢＳ）を有する培地中で最良の増殖能を有する３つの細胞株：ＬｏＶｏ、ＨＣＴ－１１６およびＨＴ－２９が選択された。
【0197】
マスターセルバンク（ＭＣＢ）：これらの選択された３つの細胞株を、代謝ストレス（抗ＶＥＧＦ抗体による処置療法で観察される栄養源枯渇）を模倣する低血清培養条件（２％ＦＢＳ）中で培養し、マスターセルバンク（ＭＣＢ）を得た。
【0198】
実施例２
ヒト結腸直腸がんワクチン製造工程
実施例１で得られた予備的結果に基づいて、本発明者らは、多重ストレスを受け、ハプテン化された、非増殖性のＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含むワクチン組成物を製造した。
各細胞株に対し、ＭＣＢから出発して、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを製造した。
ＤＳ－Ａの場合、各細胞株のＭＣＢを解凍し（凍結されている場合）、インビトロで培養した。それらの成長相またはそれらの定常相の間に、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）を含む物理的ストレスを適用した。このストレスに反応して発現されたストレスタンパク質を次に、ジニトロフェニルでハプテン化した。３千万個の細胞／ｍＬで製剤化して貯蔵目的のための凍結後に、これらの細胞（ハプテン化されたストレス分子を含む）を高電離放射線（２５Ｇｙ）で不活化、即ち、非増殖性にし、細胞構造を損なわれないまま維持しながら、細胞増殖を阻害した。
ＤＳ－Ｂの場合、各細胞株のＭＣＢを解凍し（凍結されている場合）、インビトロで培養した。それらの成長相またはそれらの定常相の間に、化学療法剤による化学刺激を含む化学的ストレスを適用した：ＨＴ－２９細胞の場合、１３μＭのオキサリプラチンを７２時間適用した；ＨＣＴ－１１６細胞の場合、３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）（または直近の実験で類似の最終結果であった１００ｎＭのＳＮ－３８）を４８時間適用した；およびＬｏＶｏ細胞の場合、５μＭの５－ＦＵを４８時間適用した。このストレスに反応して発現されたストレスタンパク質を次に、ジニトロフェニルでハプテン化した。３千万個の細胞／ｍＬで製剤化して貯蔵目的のための凍結後に、これらの細胞（ハプテン化されたストレス分子を含む）を高電離放射線（２５Ｇｙ）で不活化、即ち、非増殖性にし、、細胞構造を損なわれないまま維持しながら、細胞増殖を阻害した。
ヒト結腸直腸がんワクチン製造工程
実施例１で得られた予備的結果に基づいて、本発明者らは、多重ストレスを受け、ハプテン化された、非増殖性のＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞を含むワクチン組成物を製造した。
各細胞株に対し、ＭＣＢから出発して、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを製造した。
ＤＳ－Ａの場合、各細胞株のＭＣＢを解凍し（凍結されている場合）、インビトロで培養した。それらの成長相またはそれらの定常相の間に、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）を含む物理的ストレスを適用した。このストレスに反応して発現されたストレスタンパク質を次に、ジニトロフェニルでハプテン化した。３千万個の細胞／ｍＬで製剤化して貯蔵目的のための凍結後に、これらの細胞（ハプテン化されたストレス分子を含む）を高電離放射線（２５Ｇｙ）で不活化、即ち、非増殖性にし、細胞構造を損なわれないまま維持しながら、細胞増殖を阻害した。
ＤＳ－Ｂの場合、各細胞株のＭＣＢを解凍し（凍結されている場合）、インビトロで培養した。それらの成長相またはそれらの定常相の間に、化学療法剤による化学刺激を含む化学的ストレスを適用した：ＨＴ－２９細胞の場合、１３μＭのオキサリプラチンを７２時間適用した；ＨＣＴ－１１６細胞の場合、３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）（または直近の実験で類似の最終結果であった１００ｎＭのＳＮ－３８）を４８時間適用した；およびＬｏＶｏ細胞の場合、５μＭの５－ＦＵを４８時間適用した。このストレスに反応して発現されたストレスタンパク質を次に、ジニトロフェニルでハプテン化した。３千万個の細胞／ｍＬで製剤化して貯蔵目的のための凍結後に、これらの細胞（ハプテン化されたストレス分子を含む）を高電離放射線（２５Ｇｙ）で不活化、即ち、非増殖性にし、、細胞構造を損なわれないまま維持しながら、細胞増殖を阻害した。
【0199】
マーカー発現の比較を実施し、各ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを検証した。
３つのＤＳ－Ａに関して、３つの細胞株に適用された放射線照射および熱ストレスは、３つ全てのＤＳ－Ａにおいて同じ表現型変化を誘導し、非ストレス細胞と比較して、ＨＳＰ７０およびＣＤ２２７を過剰発現した（表５）。これらのデータは、同様に処置されたいくつかの他の細胞バッチで実施された実験で確認され、全て、放射線照射および熱ストレス後に、ＨＳＰ７０およびＣＤ２２７の過剰発現を確証した。
３つのＤＳ－Ａに関して、３つの細胞株に適用された放射線照射および熱ストレスは、３つ全てのＤＳ－Ａにおいて同じ表現型変化を誘導し、非ストレス細胞と比較して、ＨＳＰ７０およびＣＤ２２７を過剰発現した（表５）。これらのデータは、同様に処置されたいくつかの他の細胞バッチで実施された実験で確認され、全て、放射線照射および熱ストレス後に、ＨＳＰ７０およびＣＤ２２７の過剰発現を確証した。
【表5】
【0200】
ＤＳ－Ｂの場合、オキサリプラチンによるＨＴ－２９細胞の処置は、非ストレス細胞と比較して、ＣＤ９５、ＣＤ１０７およびＣＤ５４マーカーの過剰発現をもたらした；およびＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）によるＨＣＴ－１１６細胞の処置または５－ＦＵによるＬｏＶｏ細胞の処置は、非ストレス細胞と比較して、ＣＤ６６マーカーの過剰発現をもたらし、および５－ＦＵによるＬｏＶｏ細胞の処置はＣＤ２４３の過剰発現をもたらした（表６）。これらのデータは、同様に処置されたいくつかの他の細胞バッチで実施された実験で確認され、これら全ては、下記を確証した：
－予備的細胞培養条件に関係なく（Ｔ２５またはＴ２２５ ＣｅｌｌＳｔａｃｋに関わらず）、ＳＮ－３８による処置後、ＨＣＴ－１１６細胞におけるＣＤ６６の過剰発現；
－オキサリプラチンで処置後のＨＴ－２９細胞におけるＣＤ５４、ＣＤ９５およびＣＤ１０７の過剰発現；および
－５－ＦＵで処置後のＬｏＶｏ細胞におけるＣＤ２４３（および、より少ない程度で、ＣＤ６６）の過剰発現。
－予備的細胞培養条件に関係なく（Ｔ２５またはＴ２２５ ＣｅｌｌＳｔａｃｋに関わらず）、ＳＮ－３８による処置後、ＨＣＴ－１１６細胞におけるＣＤ６６の過剰発現；
－オキサリプラチンで処置後のＨＴ－２９細胞におけるＣＤ５４、ＣＤ９５およびＣＤ１０７の過剰発現；および
－５－ＦＵで処置後のＬｏＶｏ細胞におけるＣＤ２４３（および、より少ない程度で、ＣＤ６６）の過剰発現。
【0201】
最終的に、ワクチン組成物（ＤＰまたは「ＳＴＣ－１０１０」）は、６つ全てのＤＳ（３つのＤＳ－Ａ：各細胞株に対し１つ；および３つのＤＳ－Ｂ：各細胞株に対し１つ）を１００μＬ用量（それぞれ３百万個の細胞を含む）にプールすることによって製剤化され得る。ＦＡＣＳ解析により、この最終産物中のＨＳＰ７０、ＣＤ２２７、ＣＤ９５およびＣＤ２４３の高発現が明らかとなった（総細胞数中のマーカー発現細胞のパーセンテージとして、および平均蛍光強度として評価）（表７）。
【表6】
【表7】
【0202】
実施例３
６つの中間組成物中のタンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ特定および相対的定量化
この調査中、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせにインビトロで供された、および供されていない、種々の分類法による種々の細胞株を分析した。
発現タンパク質を特異的データベースで特定した。適合させた試料調製を実施して、タンパク質検出を改善した。
検出されたタンパク質の個々の量を評価した。
各タンパク質に対し得られた正規化シグナルを他のものと比較した。
６つの中間組成物中のタンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ特定および相対的定量化
この調査中、放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせにインビトロで供された、および供されていない、種々の分類法による種々の細胞株を分析した。
発現タンパク質を特異的データベースで特定した。適合させた試料調製を実施して、タンパク質検出を改善した。
検出されたタンパク質の個々の量を評価した。
各タンパク質に対し得られた正規化シグナルを他のものと比較した。
【0203】
材料および方法
産生中、異なるストレス（放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせ）に曝露後、細胞株を、遺伝子発現に応じて収集する必要がある。これらの異なるストレスは、抗原の過剰発現を誘導した。免疫原性もまた、ハプテンによって表面タンパク質を化学的に標識することにより高められている。タンパク質発現を、異なるストレスに曝露後、異なる細胞試料間で比較した。この試験で分析した種々の組成物の要約を表８に示す。
産生中、異なるストレス（放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせ）に曝露後、細胞株を、遺伝子発現に応じて収集する必要がある。これらの異なるストレスは、抗原の過剰発現を誘導した。免疫原性もまた、ハプテンによって表面タンパク質を化学的に標識することにより高められている。タンパク質発現を、異なるストレスに曝露後、異なる細胞試料間で比較した。この試験で分析した種々の組成物の要約を表８に示す。
【表8】
【0204】
試料調製方法
タンパク質を検出するための細胞ペレットに適用した試料調製方法は、細胞の化学的溶解とそれに続くタンパク質消化を含んだ。それぞれ生成されたペプチドを、物理化学的特性に従って、高分解能質量分析計と組み合わせたナノフロークロマトグラフシステム（ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分離した。この技術を使用する主要な利点は、装置の感度を改善し、特定されるタンパク質の数を増大させることである。
タンパク質を検出するための細胞ペレットに適用した試料調製方法は、細胞の化学的溶解とそれに続くタンパク質消化を含んだ。それぞれ生成されたペプチドを、物理化学的特性に従って、高分解能質量分析計と組み合わせたナノフロークロマトグラフシステム（ナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）を使用して分離した。この技術を使用する主要な利点は、装置の感度を改善し、特定されるタンパク質の数を増大させることである。
【0205】
分析法
ショットガンプロテオミクスまたはペプチドマッピングとも呼ばれる、データ依存型分析（ＤＤＡ）モードでナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。この分析ツールは、全クロマトグラフ分離を通して数千ペプチドのＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの獲得を可能にする。
ショットガンプロテオミクスまたはペプチドマッピングとも呼ばれる、データ依存型分析（ＤＤＡ）モードでナノＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析を実施した。この分析ツールは、全クロマトグラフ分離を通して数千ペプチドのＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルの獲得を可能にする。
【0206】
タンパク質特定
実験によりＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルが獲得されると、質量分析データを使用してプロテオームデータベースからタンパク質を特定するソフトウェア探索エンジン使用して、データ処理を実施した。この場合、実験データを、タンパク質特定のために、完全ヒトプロテオーム（スイスプロットデータベース）と相関させた。
実験によりＭＳおよびＭＳ／ＭＳスペクトルが獲得されると、質量分析データを使用してプロテオームデータベースからタンパク質を特定するソフトウェア探索エンジン使用して、データ処理を実施した。この場合、実験データを、タンパク質特定のために、完全ヒトプロテオーム（スイスプロットデータベース）と相関させた。
【0207】
特定されたタンパク質を検証するために、いくつかの特定パラメーターを実装して、特異性を確保し、擬陽性を排除した。タンパク質特定を、特定されるタンパク質に関し極めて厳密となるように、少なくとも１つのタンパク質特異的ペプチドと共に２つのペプチドで実施した。特定されたタンパク質は、より多い量で存在するものであった。更に、特定方法に関して、いくつかの高頻度で観察されるメチオニン酸化またはグルタミンからのピログルタミン酸形成などのペプチド修飾を、探索エンジンに追加した。
タンパク質の量の正規化も行った。
タンパク質の量の正規化も行った。
【0208】
個別の定量化評価
この戦略は、Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｎａｑｕａｎｔ，Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により正確に較正された合成ペプチドのユニバーサル検量線を加えることを含んだ。この検量線は、全ての特定されたタンパク質の量のペプチドシグナルの変換を可能にした。検量線で使用したペプチドは、特異性により選択されている；それらの配列は、バイオプロセスで使用された細胞株のプロテオームのいずれにも対応しない。
これらの標準は、任意のタンパク質の量を定量化するように適合させた正確な検量線を表す。この検量線の再現性および安定性は、Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより保証される。全ての特定されたペプチドおよびタンパク質は、この検量線を用いて正規化することができる。正規化シグナルは、バッチ間比較を可能にした。
この戦略は、Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ａｎａｑｕａｎｔ，Ｖｉｌｌｅｕｒｂａｎｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）により正確に較正された合成ペプチドのユニバーサル検量線を加えることを含んだ。この検量線は、全ての特定されたタンパク質の量のペプチドシグナルの変換を可能にした。検量線で使用したペプチドは、特異性により選択されている；それらの配列は、バイオプロセスで使用された細胞株のプロテオームのいずれにも対応しない。
これらの標準は、任意のタンパク質の量を定量化するように適合させた正確な検量線を表す。この検量線の再現性および安定性は、Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙにより保証される。全ての特定されたペプチドおよびタンパク質は、この検量線を用いて正規化することができる。正規化シグナルは、バッチ間比較を可能にした。
【0209】
結果
１３個の試料を同時に処置および分析した。いくつかのペレット試料は溶解が困難であり、同じ注入タンパク質量を比較するために、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、消化の前にタンパク質の定量を実施した。この定量ステップにも関わらず、試料分析後、注入タンパク質の量は、試料間で大きく異なるように思われた。
この差異は、注入したタンパク質の量の差異に由来するか、または試料中のタンパク質の動的範囲の差異に由来し得る。
それらの仮説を評価するために、試料に添加されたＡＱＴＢｅａｄｓを品質管理として使用した。Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）品質管理は、勾配およびｒ２＞０．９を有する良好な直線性ならびに１～５００ ｆｍｏｌの範囲の注入タンパク質量の定量を示した。ペプチド消化物もまた、ＬＣ－ＭＳ注入後に定量化された。結果を表９に示す。
１３個の試料を同時に処置および分析した。いくつかのペレット試料は溶解が困難であり、同じ注入タンパク質量を比較するために、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡタンパク質アッセイキットを用いて、消化の前にタンパク質の定量を実施した。この定量ステップにも関わらず、試料分析後、注入タンパク質の量は、試料間で大きく異なるように思われた。
この差異は、注入したタンパク質の量の差異に由来するか、または試料中のタンパク質の動的範囲の差異に由来し得る。
それらの仮説を評価するために、試料に添加されたＡＱＴＢｅａｄｓを品質管理として使用した。Ｒｅａｄｙｂｅａｄｓ（商標）品質管理は、勾配およびｒ２＞０．９を有する良好な直線性ならびに１～５００ ｆｍｏｌの範囲の注入タンパク質量の定量を示した。ペプチド消化物もまた、ＬＣ－ＭＳ注入後に定量化された。結果を表９に示す。
【表9】
【0210】
全体タンパク質比較
無処置細胞
ＲＣＢ（研究用セルバンク）試料は、１０％ＦＢＳ培地中の無処置試料であった。
ＭＣＢ（マスターセルバンク）は、培地適応（２％ＦＢＳ）させたＲＣＢに由来する。
３つのヒト細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ）において特定されたタンパク質を比較した（図１Ａおよび１Ｂ）。
特定されたタンパク質のほぼ５０％は、通常、３つ全ての無処置ヒト細胞株中で特定された。これら３つの細胞株は、結腸または結腸直腸癌由来であるので、この結果は予測された。
無処置細胞
ＲＣＢ（研究用セルバンク）試料は、１０％ＦＢＳ培地中の無処置試料であった。
ＭＣＢ（マスターセルバンク）は、培地適応（２％ＦＢＳ）させたＲＣＢに由来する。
３つのヒト細胞株（ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ）において特定されたタンパク質を比較した（図１Ａおよび１Ｂ）。
特定されたタンパク質のほぼ５０％は、通常、３つ全ての無処置ヒト細胞株中で特定された。これら３つの細胞株は、結腸または結腸直腸癌由来であるので、この結果は予測された。
【0211】
ＤＳ－Ａ処置
ＤＳ－Ａ処置は、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）に細胞を曝露することを含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
このＤＳ－Ａ処置後、いくつかのタンパク質は、３つ全ての細胞株において過剰発現されるように見えた（全タンパク質量に対して、ＤＳ－Ａ試料中およびＭＣＢ試料の間のタンパク質比率＞２．５）。これらの結果を表１０に示す。
ＤＳ－Ａ試料中でのみ特定され、ＭＣＢ試料中では特定されなかったこれらの１０個のタンパク質は、ＤＳ－Ａ処置が細胞に耐性機構を発達させ、それによってストレスタンパク質を産生することを反映している。
ＤＳ－Ａ処置は、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）に細胞を曝露することを含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
このＤＳ－Ａ処置後、いくつかのタンパク質は、３つ全ての細胞株において過剰発現されるように見えた（全タンパク質量に対して、ＤＳ－Ａ試料中およびＭＣＢ試料の間のタンパク質比率＞２．５）。これらの結果を表１０に示す。
【表10】
【0212】
ＤＳ－Ｂ処置
ＤＳ－Ｂ処置は、細胞を化学療法剤への曝露、即ち、ＨＴ－２９細胞に対しては７２時間の１３μＭのオキサリプラチンの適用；ＨＣＴ－１１６細胞に対しては４８時間の３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）の適用；およびＬｏＶｏ細胞に対しては４８時間の５μＭの５－ＦＵの適用を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
このＤＳ－Ｂ処置後、いくつかのタンパク質は、過剰発現されるように見えた（全タンパク質量に対して、ＤＳ－Ｂ試料とＭＣＢ試料の間のタンパク質比率＞２．５）。これらのタンパク質を表１１に報告する。
過剰発現されたタンパク質は、主に、ＤＮＡ修復に関連しているように見えた。結果の分析をより深く行うために、膜タンパク質に注力することにした。
ＤＳ－Ｂ処置は、細胞を化学療法剤への曝露、即ち、ＨＴ－２９細胞に対しては７２時間の１３μＭのオキサリプラチンの適用；ＨＣＴ－１１６細胞に対しては４８時間の３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）の適用；およびＬｏＶｏ細胞に対しては４８時間の５μＭの５－ＦＵの適用を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
このＤＳ－Ｂ処置後、いくつかのタンパク質は、過剰発現されるように見えた（全タンパク質量に対して、ＤＳ－Ｂ試料とＭＣＢ試料の間のタンパク質比率＞２．５）。これらのタンパク質を表１１に報告する。
【表11】
【0213】
膜タンパク質に対する注力
無処置細胞
表１２～１４は、１つのヒト細胞株（無処置ＲＣＢおよびＭＣＢ）における、他の２つの細胞株と比較した、過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質の割合比率＞２．５）である。
無処置細胞
表１２～１４は、１つのヒト細胞株（無処置ＲＣＢおよびＭＣＢ）における、他の２つの細胞株と比較した、過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質の割合比率＞２．５）である。
【表12】
【表13】
【表14】
【0214】
ＤＳ－Ａ処置
ＤＳ－Ａ処置は、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）に対する細胞曝露を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
膜タンパク質は、過少発現ではなく、主に過剰発現されるように見えた。
表１５～１７は、その対応するＭＣＢ試料と比較して、各ヒト細胞株（ＤＳ－Ａ試料）において過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質の割合比率＞２．５）を記載する。
ＤＳ－Ａ処置は、熱ストレス（４２℃で１時間）と共に、５分間の低線量の電離放射線（１０Ｇｙ）に対する細胞曝露を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
膜タンパク質は、過少発現ではなく、主に過剰発現されるように見えた。
表１５～１７は、その対応するＭＣＢ試料と比較して、各ヒト細胞株（ＤＳ－Ａ試料）において過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質の割合比率＞２．５）を記載する。
【表15】
【表16】
【表17】
【0215】
ＤＳ－Ｂ処置
ＤＳ－Ｂ処置は、細胞の化学療法剤への曝露、即ち、ＨＴ－２９細胞に対しては７２時間の１３μＭのオキサリプラチンの適用；ＨＣＴ－１１６細胞に対しては４８時間の３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）の適用；およびＬｏＶｏ細胞に対しては４８時間の５μＭの５－ＦＵの適用を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
膜タンパク質は、過少発現ではなく、主に過剰発現されるように見えた。
表１８～２０は、その対応するＭＣＢ試料と比較して、各ヒト細胞株（ＤＳ－Ｂ試料）において過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質比率＞２．５）を記載する。
ＤＳ－Ｂ処置は、細胞の化学療法剤への曝露、即ち、ＨＴ－２９細胞に対しては７２時間の１３μＭのオキサリプラチンの適用；ＨＣＴ－１１６細胞に対しては４８時間の３１５ｎＭのＳＮ－３８（７－エチル－１０－ヒドロキシカンプトテシン）の適用；およびＬｏＶｏ細胞に対しては４８時間の５μＭの５－ＦＵの適用を含む。これらの細胞はまた、代謝ストレス（すなわち、ＲＣＢおよびＭＣＢの間の１０％～２％のＦＢＳへの培地適応）にも供された。
膜タンパク質は、過少発現ではなく、主に過剰発現されるように見えた。
表１８～２０は、その対応するＭＣＢ試料と比較して、各ヒト細胞株（ＤＳ－Ｂ試料）において過剰発現された膜タンパク質（全タンパク質量に対して、タンパク質比率＞２．５）を記載する。
【表18】
【表19】
【表20】
【0216】
実施例４
最終組成物中のタンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ特定および相対的定量化
本研究は、最終ワクチン組成物（ＤＰ、上記の６つ全て（３つのＤＳ－Ａ：各細胞株を１つ；および３つのＤＳ－Ｂ：各細胞株を１つ）を共にプールしたＤＳを含む）中の差次的発現タンパク質を特定することを目的とした。
図２は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したさせたタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図３は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
図４は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図５は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
図６は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示す。
「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図７は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおいて過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
最終組成物中のタンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳ特定および相対的定量化
本研究は、最終ワクチン組成物（ＤＰ、上記の６つ全て（３つのＤＳ－Ａ：各細胞株を１つ；および３つのＤＳ－Ｂ：各細胞株を１つ）を共にプールしたＤＳを含む）中の差次的発現タンパク質を特定することを目的とした。
図２は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したさせたタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図３は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＣＴ－１１６ ＲＣＢと比較した、ＨＣＴ－１１６ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
図４は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示し、「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図５は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＨＴ－２９ ＲＣＢと比較した、ＨＴ－２９ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおける過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
図６は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養したＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－Ａ、ＤＳ－Ｂ、および上記の６つ全てのＤＳを含む最終産物（ＤＰ）（したがって、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂを含む）において発現したタンパク質の数の差異を示す。「＋」は、新しく発現したタンパク質を示す。
「－」は、もはや全く発現しないタンパク質の数を示す。
図７は、古典的条件（１０％ＦＢＳを含む）で培養した初期ＬｏＶｏ ＲＣＢと比較した、ＬｏＶｏ ＭＣＢ、ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂにおいて過剰および過少発現したタンパク質の数を示す。
【0217】
これらのＬＣ／ＭＳデータに比較を表２１に示し、この表では、最終組成物（ＤＰ）中にのみ存在する（すなわち、ＲＣＢ段階の３つの細胞株のいずれにおいても特定されない）、最終組成物（ＤＰ）において過剰発現されている（ＲＣＢ段階の３つの細胞株と比較して）、および最終組成物（ＤＰ）において類似かまたはより少なく発現されている、タンパク質の数およびパーセンテージを示している。
表２２は、最終組成物（ＤＰ）中にのみ見出され、ＲＣＢのいずれにも見出されなかったタンパク質のリストを示す。これらのタンパク質のいずれかの存在は、したがって、上記の全ての異なる処置を受けた最終組成物の特徴である。
最終組成物（ＤＰ）において特定された１５５６個のタンパク質のさらなる分析は、それらの９７個が特に重要であり、生物学的、臨床的、およびがん予後値に基づいて、１２個のスーパーファミリーに分類できることを示した。最終組成物（ＤＰ）中の９７個のタンパク質のうち、５２個は、ＲＣＢ段階の３つの細胞株と比較して、過剰発現され、８個は最終組成物（ＤＰ）においてのみ見出されたが、いずれのＲＣＢ中にも見出されなかった。表２３は、これらの１２個のスーパーファミリー中のタンパク質の数を要約する。
「接着」は、ＩｇＣＡＭ（例えば、ＩＣＡＭ１）、カドヘリン、インテグリン、およびセレクチンを含むＣＡＭタンパク質（細胞接着分子）に対応する。
「ＡＴＰ結合カセット」は、薬剤耐性現象に関連する、輸送システムスーパーファミリーの膜貫通型タンパク質に対応する。
「ＢＣＬ」は、アポトーシス促進性（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ１／Ｂｃｌ－２同族アンタゴニストキラー、およびＢｃｌ－２関連デスプロモーター）であるか、または抗アポトーシス性（例えば、Ｂｃｌ－２、およびＢｃｌ－ｘＬ）である、細胞死を調節するタンパク質に対応する。
「ＣＯＸ」は、ミトコンドリア呼吸鎖の末端成分由来のタンパク質である、シトクロムＣオキシダーゼタンパク質（「複合体ＩＶ」とも呼ばれる）に対応する。シトクロムＣオキシダーゼ中の変異は、がんに関与する（特に、シトクロムＣオキシダーゼサブユニット４中の変異）。
「ＥＧＦＲ」は、種々のがん腫タイプの病因および進行に関与する上皮増殖因子に対応する。
「ＨＳＰ」は、広範囲のヒトがんにおいて過剰発現されタンパク質のクラスであり、腫瘍細胞増殖、分化、浸潤、転移、死亡、および免疫系による認識に関連する、ヒートショックタンパク質に対応する。
「阻害剤」は、促進性または抗がん増殖に関連するタンパク質に対応する。
「ＭＵＣ」は、高度にグリコシル化されたタンパク質である、ムチンタンパク質に対応する。ＭＵＣ１３は特に、胃、結腸直腸、および卵巣がんを含む種々の上皮がんにおいて高頻度かつ異常に発現される。
「ＲＡＳ関連」は、低分子量ＧＴＰアーゼの１タイプである、Ｒａｐ ＧＴＰ結合たんぱく質に対応する。９５％の膵臓がんおよび４５％の結腸直腸がんを含む、全てのヒトがんの３０％超が、ＲＡＳ遺伝子ファミリーの変異により促進される。
「修復」は、腫瘍進行に関連するタンパク質に対応する。
「トランスポーター」は、薬剤耐性において機能を有する膜貫通型タンパク質に対応する。
表２４は、過剰発現されているこれらの５２個のタンパク質を特定し、このうちの８個は、ＲＣＢと比較して最終組成物（ＤＰ）においてのみ発現される。
表２５：種々のタイプのがんにおけるこれらの９７個のタンパク質の生物学的、臨床的、およびがん予後値の関係を示す。認められるように、最終組成物（ＤＰ）は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞が結腸直腸の細胞株であることを考慮すれば予測されるように、結腸直腸がんに関連するのみでなく、他のタイプのがんにも関連するマーカーを発現する。このことは、本明細書で記載される組成物が、結腸直腸がんのみでなく、広く多様な他のがんの処置にとっても有用であり得ることを示唆する。
【表21】
【表22】
【表23】
「ＡＴＰ結合カセット」は、薬剤耐性現象に関連する、輸送システムスーパーファミリーの膜貫通型タンパク質に対応する。
「ＢＣＬ」は、アポトーシス促進性（例えば、ＢＡＸ、ＢＡＫ１／Ｂｃｌ－２同族アンタゴニストキラー、およびＢｃｌ－２関連デスプロモーター）であるか、または抗アポトーシス性（例えば、Ｂｃｌ－２、およびＢｃｌ－ｘＬ）である、細胞死を調節するタンパク質に対応する。
「ＣＯＸ」は、ミトコンドリア呼吸鎖の末端成分由来のタンパク質である、シトクロムＣオキシダーゼタンパク質（「複合体ＩＶ」とも呼ばれる）に対応する。シトクロムＣオキシダーゼ中の変異は、がんに関与する（特に、シトクロムＣオキシダーゼサブユニット４中の変異）。
「ＥＧＦＲ」は、種々のがん腫タイプの病因および進行に関与する上皮増殖因子に対応する。
「ＨＳＰ」は、広範囲のヒトがんにおいて過剰発現されタンパク質のクラスであり、腫瘍細胞増殖、分化、浸潤、転移、死亡、および免疫系による認識に関連する、ヒートショックタンパク質に対応する。
「阻害剤」は、促進性または抗がん増殖に関連するタンパク質に対応する。
「ＭＵＣ」は、高度にグリコシル化されたタンパク質である、ムチンタンパク質に対応する。ＭＵＣ１３は特に、胃、結腸直腸、および卵巣がんを含む種々の上皮がんにおいて高頻度かつ異常に発現される。
「ＲＡＳ関連」は、低分子量ＧＴＰアーゼの１タイプである、Ｒａｐ ＧＴＰ結合たんぱく質に対応する。９５％の膵臓がんおよび４５％の結腸直腸がんを含む、全てのヒトがんの３０％超が、ＲＡＳ遺伝子ファミリーの変異により促進される。
「修復」は、腫瘍進行に関連するタンパク質に対応する。
「トランスポーター」は、薬剤耐性において機能を有する膜貫通型タンパク質に対応する。
表２４は、過剰発現されているこれらの５２個のタンパク質を特定し、このうちの８個は、ＲＣＢと比較して最終組成物（ＤＰ）においてのみ発現される。
【表24】
表２５：種々のタイプのがんにおけるこれらの９７個のタンパク質の生物学的、臨床的、およびがん予後値の関係を示す。認められるように、最終組成物（ＤＰ）は、ＨＴ－２９、ＨＣＴ－１１６およびＬｏＶｏ細胞が結腸直腸の細胞株であることを考慮すれば予測されるように、結腸直腸がんに関連するのみでなく、他のタイプのがんにも関連するマーカーを発現する。このことは、本明細書で記載される組成物が、結腸直腸がんのみでなく、広く多様な他のがんの処置にとっても有用であり得ることを示唆する。
【表25】
【0218】
実施例５
２つの中間組成物および最終産物中の表面タンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる特定および相対的定量化
本研究は、１つの出発物質（ＨＴ－２９ ＭＣＢ）、２つの対応する中間組成物（ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ）および上記６つ全てを含む（したがって、ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂを含む）最終産物（ＤＰ）における、異なる産生ステップでの腫瘍性細胞の表面プロテオームを特徴付けること、および最終的に差次的発現表面タンパク質を特定することを目的とした。
２つの中間組成物および最終産物中の表面タンパク質のＬＣ－ＭＳ／ＭＳによる特定および相対的定量化
本研究は、１つの出発物質（ＨＴ－２９ ＭＣＢ）、２つの対応する中間組成物（ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ）および上記６つ全てを含む（したがって、ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂを含む）最終産物（ＤＰ）における、異なる産生ステップでの腫瘍性細胞の表面プロテオームを特徴付けること、および最終的に差次的発現表面タンパク質を特定することを目的とした。
【0219】
材料および方法
前の実施例３および４で記載の産物と類似のタイプの産物（ＤＳ／ＤＰ）を分析した。同じステップ、特に、異なるストレス（放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせ）への曝露が適用されている。これらの異なるストレスは、抗原の過剰発現を誘導した。免疫原性もまた、表面タンパク質をハプテンによって化学標識することにより高められている。タンパク質発現を、異なるストレスに曝露後の異なる細胞試料間で比較した。本研究で分析した種々の組成物の要約を表２６に示す。
前の実施例３および４で記載の産物と類似のタイプの産物（ＤＳ／ＤＰ）を分析した。同じステップ、特に、異なるストレス（放射線照射、熱ストレス、化学的ストレス、代謝ストレスまたはそれらの組み合わせ）への曝露が適用されている。これらの異なるストレスは、抗原の過剰発現を誘導した。免疫原性もまた、表面タンパク質をハプテンによって化学標識することにより高められている。タンパク質発現を、異なるストレスに曝露後の異なる細胞試料間で比較した。本研究で分析した種々の組成物の要約を表２６に示す。
【表26】
【0220】
試料処置
可能な場合には、６ｘ１０６個の細胞の量（それが可能でない場合は、全試料を使用）をＰＢＳで穏やかに洗浄した後、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎを用いてビオチン化した。その後、細胞を溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）細胞表面タンパク質ビオチン化および単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ４４３９０）を用いて、タンパク質を単離した。いずれの調製ステップも、製造業者の説明書に従って実施した。
その後、タンパク質をメタノール－クロロホルムを用いて沈殿させ、沈殿物をメタノールで洗浄し、乾燥およびｉＳＴ ＬＹＳＥ（ＰｒｅＯｍｉｃｓ Ｇｍｂｈ）緩衝液でマイクロキャビテーション（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ，Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）により可溶化した。
ＬｙｓＣおよびトリプシンを用いてタンパク質を消化した。ペプチドを、混合モード逆相カチオン交換輸送体ＳＰＥカラム（ＰｒｅＯｍｉｃｓ Ｇｍｂｈ）を用いて精製し、乾燥後、１００μＬの３％アセトニトリル、０．１％ギ酸含有水溶液中に可溶化した。
ＢＣＡ方法を用いてペプチド濃度を測定した（表２７）。測定したペプチド濃度が低かったにも関わらず、それらの量は、この実現可能性研究にとって十分であった。
可能な場合には、６ｘ１０６個の細胞の量（それが可能でない場合は、全試料を使用）をＰＢＳで穏やかに洗浄した後、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）Ｃｅｌｌ Ｓｕｒｆａｃｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎを用いてビオチン化した。その後、細胞を溶解し、Ｐｉｅｒｃｅ（商標）細胞表面タンパク質ビオチン化および単離キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ａ４４３９０）を用いて、タンパク質を単離した。いずれの調製ステップも、製造業者の説明書に従って実施した。
その後、タンパク質をメタノール－クロロホルムを用いて沈殿させ、沈殿物をメタノールで洗浄し、乾燥およびｉＳＴ ＬＹＳＥ（ＰｒｅＯｍｉｃｓ Ｇｍｂｈ）緩衝液でマイクロキャビテーション（Ｂｉｏｒｕｐｔｏｒ Ｐｉｃｏ，Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）により可溶化した。
ＬｙｓＣおよびトリプシンを用いてタンパク質を消化した。ペプチドを、混合モード逆相カチオン交換輸送体ＳＰＥカラム（ＰｒｅＯｍｉｃｓ Ｇｍｂｈ）を用いて精製し、乾燥後、１００μＬの３％アセトニトリル、０．１％ギ酸含有水溶液中に可溶化した。
ＢＣＡ方法を用いてペプチド濃度を測定した（表２７）。測定したペプチド濃度が低かったにも関わらず、それらの量は、この実現可能性研究にとって十分であった。
【表27】
【0221】
分析法
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
２５０ｎｇのペプチドを各試料に関して３連で注入した。
クロマトグラフィーは、ＲｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８（７５μｍｘ５０ｃｍ、２μｍの材料）カラムを備えたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）装置を用い、プレカラム上の３分間のトラッピングステップ後に、２．５％～３５％アセトニトリルの１２０分勾配を３００ｎＬ／分の流速で適用して実施した。
表２８に記載の実験設定を用いて、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）質量分析計を使用してデータを取得した。各サイクルの最も強い１０個のイオンについて、ＭＳ／ＭＳスキャンを実施し、６５４５サイクル、したがって、クロマトグラフピーク当り平均で１７サイクルを行った。
ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ
２５０ｎｇのペプチドを各試料に関して３連で注入した。
クロマトグラフィーは、ＲｅｐＭａｐ１００ Ｃ１８（７５μｍｘ５０ｃｍ、２μｍの材料）カラムを備えたＵｌｔｉｍａｔｅ ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）装置を用い、プレカラム上の３分間のトラッピングステップ後に、２．５％～３５％アセトニトリルの１２０分勾配を３００ｎＬ／分の流速で適用して実施した。
表２８に記載の実験設定を用いて、Ｑ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ）質量分析計を使用してデータを取得した。各サイクルの最も強い１０個のイオンについて、ＭＳ／ＭＳスキャンを実施し、６５４５サイクル、したがって、クロマトグラフピーク当り平均で１７サイクルを行った。
【表28】
【0222】
タンパク質特定
データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４で処理した。
ＮｅＸｔＰｒｏｔから取得したヒト参照プロテオームを収集するデータベースおよびヒトタンパク質を除くｃＲＡＰ混入物データベースに対して、ＳＥＱＵＥＳＴ－ＨＴアルゴリズムを用いてタンパク質を特定した。
パラメーターは以下の通りであった：
－酵素＝トリプシン（完全）；
－許容される誤切断＝２；
－前駆体エラー許容範囲＝１０ｐｐｍ；
－フラグメントエラー許容範囲＝０．０２Ｄａ；
－動的修飾＝酸化（Ｍ）、脱アミド化（Ｎ／Ｑ）、ＣＡＭチオプロパノイル（Ｋ）；
－タンパク質末端修飾＝アセチル化、ＣＡＭチオプロパノイル；
－静的修飾＝カルバミドメチル（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈＩ）（Ｃ）。
偽発見率（ＦＤＲ）測定は、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを用いて実施した。
ＳＥＱＵＥＳＴ－ＨＴより劣る信頼性で報告された、すなわち、特定されていないと考えられる全てのスペクトルを、上記と同じデータベースに対し、以下の変更した設定を用いて、同じアルゴリズムにより二度目に処理した：
－酵素＝トリプシン＿Ｒ（半分）；
－許容される誤切断＝２；
－前駆体エラー許容範囲＝１０ｐｐｍ；
－フラグメントエラー許容範囲＝０．０２Ｄａ；
－動的修飾＝酸化（Ｍ）、脱アミド化（Ｎ／Ｑ）、ＣＡＭチオプロパノイル（Ｋ）；
－タンパク質末端修飾＝アセチル化、ＣＡＭチオプロパノイル；
－静的修飾＝カルバミドメチル（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈＩ）（Ｃ）。
偽発見率（ＦＤＲ）測定は、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを用いて実施した。
タンパク質は、「膜」または「細胞表面」のキーワードが、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒデータベースの「細胞成分」の領域中にアノーテーションとして報告されている場合には、「膜」または「細胞表面」の一部と見なされた。同じタンパク質に関していくつかの細胞成分が報告され得ることに留意しなければならない。更に、用語「膜」は、細胞膜（例えば、核膜、オルガネラ膜、小胞膜、など）以外の膜を指し得る。
データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４で処理した。
ＮｅＸｔＰｒｏｔから取得したヒト参照プロテオームを収集するデータベースおよびヒトタンパク質を除くｃＲＡＰ混入物データベースに対して、ＳＥＱＵＥＳＴ－ＨＴアルゴリズムを用いてタンパク質を特定した。
パラメーターは以下の通りであった：
－酵素＝トリプシン（完全）；
－許容される誤切断＝２；
－前駆体エラー許容範囲＝１０ｐｐｍ；
－フラグメントエラー許容範囲＝０．０２Ｄａ；
－動的修飾＝酸化（Ｍ）、脱アミド化（Ｎ／Ｑ）、ＣＡＭチオプロパノイル（Ｋ）；
－タンパク質末端修飾＝アセチル化、ＣＡＭチオプロパノイル；
－静的修飾＝カルバミドメチル（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈＩ）（Ｃ）。
偽発見率（ＦＤＲ）測定は、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを用いて実施した。
ＳＥＱＵＥＳＴ－ＨＴより劣る信頼性で報告された、すなわち、特定されていないと考えられる全てのスペクトルを、上記と同じデータベースに対し、以下の変更した設定を用いて、同じアルゴリズムにより二度目に処理した：
－酵素＝トリプシン＿Ｒ（半分）；
－許容される誤切断＝２；
－前駆体エラー許容範囲＝１０ｐｐｍ；
－フラグメントエラー許容範囲＝０．０２Ｄａ；
－動的修飾＝酸化（Ｍ）、脱アミド化（Ｎ／Ｑ）、ＣＡＭチオプロパノイル（Ｋ）；
－タンパク質末端修飾＝アセチル化、ＣＡＭチオプロパノイル；
－静的修飾＝カルバミドメチル（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈＩ）（Ｃ）。
偽発見率（ＦＤＲ）測定は、Ｐｅｒｃｏｌａｔｏｒアルゴリズムを用いて実施した。
タンパク質は、「膜」または「細胞表面」のキーワードが、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒデータベースの「細胞成分」の領域中にアノーテーションとして報告されている場合には、「膜」または「細胞表面」の一部と見なされた。同じタンパク質に関していくつかの細胞成分が報告され得ることに留意しなければならない。更に、用語「膜」は、細胞膜（例えば、核膜、オルガネラ膜、小胞膜、など）以外の膜を指し得る。
【0223】
タンパク質定量化
データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４ソフトウェア用のＭｉｎｏｒａ ａｎｄ ｆｅａｔｕｒｅ ｍａｐｐｅｒを用いて処置した。
ピーク積分パラメーターは以下の通りであった：
－取得後再較正＝有り（精密パラメーター）；
－最小トレース長＝５；
－同位体の最大デルタＲＴ＝０．２分；
－積分のＰＳＭ信頼水準＝高。
クロマトグラフ整列パラメーターは以下の通りであった：
－ＲＴ整列＝有り：
－パラメーター調整＝精密；
－最大ＲＴシフト＝５分；
－質量許容誤差＝１０ｐｐｍ。
特徴マッピングパラメーターは以下の通りであった：
－ＲＴ許容範囲＝自動；
－質量許容誤差＝自動；
－Ｓ／Ｎ閾値＝２．
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４ソフトウェア用の前駆体イオンクオンティファイアーノードを使用することにより、統計解析を実施した。
一般的定量化設定は以下の通りであった：
－使用ペプチド＝ユニーク＋ＲＡＺＯＲ（ユニークは、異なるタンパク質またはタンパク質群により共有されないペプチドを意味する；ＲＡＺＯＲは、複数タンパク質群により共有されるが、最大数のユニークペプチドを有し、最大長のアミノ酸配列を有するタンパク質を定量するためにのみ使用されるペプチドを意味する）；
－ペプチドのユニークさに対するタンパク質群を考慮する＝有り；
－欠測チャネルを有する定量分析結果を拒絶する＝無し；
前駆体定量化設定は以下の通りであった：
－前駆体存在量は＝面積に基づく；
－特徴を再現する最小数＝５０％（定量化に使用するために試料の１群の少なくとも５０％でペプチドが検出されなければならない）。
正規化設定は以下の通りであった：
－正規化モード＝総ペプチド量（特定された全てのペプチドに対する各注入の存在量値の総計を計算し、最高の総存在量を有する注入を、全ての他の注入の存在量値を、注入当りの定数係数により補正するための基準として使用し、それにより最終的に総存在量は、全ての注入に対し同じである）。
定量解析ロールアップ仮説試験設定は以下の通りであった：
－比率計算＝ペアワイズ比率ベース（ペプチド比率は、選択された試験因子に関する全ての反復実験からの全ての組み合わせ比率の幾何学的中央値として計算される。タンパク質比率は、その後、ペプチド群比率の幾何学的中央値として計算される）。
－補完モード＝反復試料ベースの再サンプリング（欠測値を、（技術的、生物学的）反復試料の検出された値の中央値周辺を中心とする分布からサンプリングしたランダム値と置き換える）；
－仮説検定＝ｔ－検定（バックグラウンドベース）。
ｐ値を与える仮説検定は、ｔ－バックグラウンド検定（またはＡＮＯＶＡバックグラウンド）である。この検定は、ほとんどのタンパク質存在量が、プロテオミクスにおいて刺激に応答して変化しないという仮設に基づいている。この方法は、この一定集団の中央値および分散に対して各タンパク質の存在量比を試験する前の条件間で主に一定であると考えられるタンパク質比のランクを決定する。この検定は、欠測値を有する試験に有用であり、数百個のタンパク質が特定される場合にのみ使用できる。それは、技術的反復を要しない。
データは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４ソフトウェア用のＭｉｎｏｒａ ａｎｄ ｆｅａｔｕｒｅ ｍａｐｐｅｒを用いて処置した。
ピーク積分パラメーターは以下の通りであった：
－取得後再較正＝有り（精密パラメーター）；
－最小トレース長＝５；
－同位体の最大デルタＲＴ＝０．２分；
－積分のＰＳＭ信頼水準＝高。
クロマトグラフ整列パラメーターは以下の通りであった：
－ＲＴ整列＝有り：
－パラメーター調整＝精密；
－最大ＲＴシフト＝５分；
－質量許容誤差＝１０ｐｐｍ。
特徴マッピングパラメーターは以下の通りであった：
－ＲＴ許容範囲＝自動；
－質量許容誤差＝自動；
－Ｓ／Ｎ閾値＝２．
Ｐｒｏｔｅｏｍｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ ２．４ソフトウェア用の前駆体イオンクオンティファイアーノードを使用することにより、統計解析を実施した。
一般的定量化設定は以下の通りであった：
－使用ペプチド＝ユニーク＋ＲＡＺＯＲ（ユニークは、異なるタンパク質またはタンパク質群により共有されないペプチドを意味する；ＲＡＺＯＲは、複数タンパク質群により共有されるが、最大数のユニークペプチドを有し、最大長のアミノ酸配列を有するタンパク質を定量するためにのみ使用されるペプチドを意味する）；
－ペプチドのユニークさに対するタンパク質群を考慮する＝有り；
－欠測チャネルを有する定量分析結果を拒絶する＝無し；
前駆体定量化設定は以下の通りであった：
－前駆体存在量は＝面積に基づく；
－特徴を再現する最小数＝５０％（定量化に使用するために試料の１群の少なくとも５０％でペプチドが検出されなければならない）。
正規化設定は以下の通りであった：
－正規化モード＝総ペプチド量（特定された全てのペプチドに対する各注入の存在量値の総計を計算し、最高の総存在量を有する注入を、全ての他の注入の存在量値を、注入当りの定数係数により補正するための基準として使用し、それにより最終的に総存在量は、全ての注入に対し同じである）。
定量解析ロールアップ仮説試験設定は以下の通りであった：
－比率計算＝ペアワイズ比率ベース（ペプチド比率は、選択された試験因子に関する全ての反復実験からの全ての組み合わせ比率の幾何学的中央値として計算される。タンパク質比率は、その後、ペプチド群比率の幾何学的中央値として計算される）。
－補完モード＝反復試料ベースの再サンプリング（欠測値を、（技術的、生物学的）反復試料の検出された値の中央値周辺を中心とする分布からサンプリングしたランダム値と置き換える）；
－仮説検定＝ｔ－検定（バックグラウンドベース）。
ｐ値を与える仮説検定は、ｔ－バックグラウンド検定（またはＡＮＯＶＡバックグラウンド）である。この検定は、ほとんどのタンパク質存在量が、プロテオミクスにおいて刺激に応答して変化しないという仮設に基づいている。この方法は、この一定集団の中央値および分散に対して各タンパク質の存在量比を試験する前の条件間で主に一定であると考えられるタンパク質比のランクを決定する。この検定は、欠測値を有する試験に有用であり、数百個のタンパク質が特定される場合にのみ使用できる。それは、技術的反復を要しない。
【0224】
【0225】
タンパク質の相対的定量化
以下を比較する４つの比較を実施した：
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡとＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡとＨＴ－２９ ＭＣＢ、
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＢとＨＴ－２９ ＭＣＢ、および
－ＨＴ－２９ ＭＣＢとＤＰ。
注記１：トレースデータの質量分析による取得の生物学的もしくは技術的変動および／または確率論的性質のために、いくつかのタンパク質存在量値が失われる可能性がある。したがって、我々は、いずれの群においても、その定量可能なペプチドが注入物の少なくとも５０％に存在するタンパク質を定量可能と見なしている。
注記２：いくつかのタンパク質またはペプチドの場合、存在量比は、１０００または０．００１に等しい。これらの値は、任意である。最初の例では、それらは、このタンパク質またはペプチドが分子条件でのみ定量化され、第２の例では、分母条件でのみ定量化されていることを意味する。
注記３：それらのペプチドのＭＳ／ＭＳフラグメント化スペクトルに基づいて特定されないタンパク質は、それでも、「実行間の一致（ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｕｎ）」により定量化できる。この定量化は、それらのペプチドのＸＩＣ（ＭＳ１）クロマトグラフィー特性（正確な質量、保持時間）と、同じ実験の少なくとも１回の取得で特定されたペプチドの特性との類似性に基づいている。
注記４：タンパク質存在量は、関連するｐ値が０．０５以下であり、０．５以下または２以上の存在量比を有する場合に、統計学的におよび有意に異なると見なされる。
図９Ａ～Ｄは、４つの比較のそれぞれにおける、ｐ値および倍率変化に従ったタンパク質分布を示す。
図１０は、４つの比較のそれぞれにおける、統計学的および有意な差を有する膜および／または細胞表面由来のタンパク質の数を示す。
全ての注入に対して、特定されたタンパク質の６５％が、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒデータベースの「細胞成分」の領域中の用語「膜」または「細胞表面」に関連した（図８）。比較として、非ビオチン化ＨｅＬａ細胞中では、より低い比率の特定されたタンパク質（５１％、すなわち、３５６２個中の８１６個）が同じデータベース中で用語「膜」または「細胞表面」に関連する。これは、４つ全ての試料において表面プロテオームの濃縮の成功を示す傾向がある。
相対的定量化および試料間の比較は、ストレスを受け／ハプテン化された細胞（ＤＳ－ＡまたはＤＳ－Ｂ）または薬物製剤（ＤＰ）を、無処置細胞（ＭＣＢ）と比較する場合、タンパク質の約２９％～３４％が有意に変化したことを示した（それぞれ、図９Ａ～Ｃ）。ストレスを受け／ハプテン化された細胞試料（ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂ）の両方を相互に比較する場合、より低い割合（１５％）が観察される（図９Ｄ）。
有意に過剰発現または過少発現されたタンパク質の半分より多くが、膜および細胞表面タンパク質としてアノーテーションされている（図１０）。
以下を比較する４つの比較を実施した：
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡとＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡとＨＴ－２９ ＭＣＢ、
－ＨＴ－２９ ＤＳ－ＢとＨＴ－２９ ＭＣＢ、および
－ＨＴ－２９ ＭＣＢとＤＰ。
注記１：トレースデータの質量分析による取得の生物学的もしくは技術的変動および／または確率論的性質のために、いくつかのタンパク質存在量値が失われる可能性がある。したがって、我々は、いずれの群においても、その定量可能なペプチドが注入物の少なくとも５０％に存在するタンパク質を定量可能と見なしている。
注記２：いくつかのタンパク質またはペプチドの場合、存在量比は、１０００または０．００１に等しい。これらの値は、任意である。最初の例では、それらは、このタンパク質またはペプチドが分子条件でのみ定量化され、第２の例では、分母条件でのみ定量化されていることを意味する。
注記３：それらのペプチドのＭＳ／ＭＳフラグメント化スペクトルに基づいて特定されないタンパク質は、それでも、「実行間の一致（ｍａｔｃｈ ｂｅｔｗｅｅｎ ｒｕｎ）」により定量化できる。この定量化は、それらのペプチドのＸＩＣ（ＭＳ１）クロマトグラフィー特性（正確な質量、保持時間）と、同じ実験の少なくとも１回の取得で特定されたペプチドの特性との類似性に基づいている。
注記４：タンパク質存在量は、関連するｐ値が０．０５以下であり、０．５以下または２以上の存在量比を有する場合に、統計学的におよび有意に異なると見なされる。
図９Ａ～Ｄは、４つの比較のそれぞれにおける、ｐ値および倍率変化に従ったタンパク質分布を示す。
図１０は、４つの比較のそれぞれにおける、統計学的および有意な差を有する膜および／または細胞表面由来のタンパク質の数を示す。
全ての注入に対して、特定されたタンパク質の６５％が、Ｔｈｅｒｍｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｅｎｔｅｒデータベースの「細胞成分」の領域中の用語「膜」または「細胞表面」に関連した（図８）。比較として、非ビオチン化ＨｅＬａ細胞中では、より低い比率の特定されたタンパク質（５１％、すなわち、３５６２個中の８１６個）が同じデータベース中で用語「膜」または「細胞表面」に関連する。これは、４つ全ての試料において表面プロテオームの濃縮の成功を示す傾向がある。
相対的定量化および試料間の比較は、ストレスを受け／ハプテン化された細胞（ＤＳ－ＡまたはＤＳ－Ｂ）または薬物製剤（ＤＰ）を、無処置細胞（ＭＣＢ）と比較する場合、タンパク質の約２９％～３４％が有意に変化したことを示した（それぞれ、図９Ａ～Ｃ）。ストレスを受け／ハプテン化された細胞試料（ＤＳ－ＡおよびＤＳ－Ｂ）の両方を相互に比較する場合、より低い割合（１５％）が観察される（図９Ｄ）。
有意に過剰発現または過少発現されたタンパク質の半分より多くが、膜および細胞表面タンパク質としてアノーテーションされている（図１０）。
【0226】
比較結果
ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ／ＨＴ－２９ ＭＣＢ
生データに基づいて、放射線照射および熱ショックによるストレスに続けてハプテン化後に過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＳ－Ａ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する４５５個のタンパク質が、ＤＳ－Ａにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１２７個のタンパク質が、ＤＳ－Ａにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３８個が１０００の存在量比を有した（表３０）。
HT-29 DS-A/HT-29 MCB
生データに基づいて、熱ショックに続けてハプテン化後に過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＳ－Ａ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する４３０個のタンパク質が、ＤＳ－Ｂにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１２７個のタンパク質が、ＤＳ－Ｂにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３７個が、１０００の存在量比を有した（表３１）。
DP/HT-29 MCB
注記：ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂのみならず、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂを収集するＤＰの組成により、この比較は、実際のタンパク質過剰発現を代表するものではない；したがって、ＭＣＢ比較のためには、希釈因子を考慮に入れることが必要となるであろう。
生データに基づいて、過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＰ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する３４３個のタンパク質が、ＤＰにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１１２個のタンパク質が、ＤＰにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３４個が、１０００の存在量比を有した（表３２）。
ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ／ＨＴ－２９ ＭＣＢ
生データに基づいて、放射線照射および熱ショックによるストレスに続けてハプテン化後に過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＳ－Ａ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する４５５個のタンパク質が、ＤＳ－Ａにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１２７個のタンパク質が、ＤＳ－Ａにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３８個が１０００の存在量比を有した（表３０）。
【表30】
生データに基づいて、熱ショックに続けてハプテン化後に過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＳ－Ａ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する４３０個のタンパク質が、ＤＳ－Ｂにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１２７個のタンパク質が、ＤＳ－Ｂにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３７個が、１０００の存在量比を有した（表３１）。
【表31】
注記：ＨＴ－２９ ＤＳ－ＡおよびＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂのみならず、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂを収集するＤＰの組成により、この比較は、実際のタンパク質過剰発現を代表するものではない；したがって、ＭＣＢ比較のためには、希釈因子を考慮に入れることが必要となるであろう。
生データに基づいて、過剰発現された膜または細胞表面タンパク質を選別するために、存在量比ＤＰ／ＭＣＢ≧１０００が選択されている。
細胞膜タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量≧１０００を有する３４３個のタンパク質が、ＤＰにおいて過剰発現されたと特定された。
特異的細胞表面タンパク質を考慮する場合、ＭＣＢと比較して、存在量比≧２を有する１１２個のタンパク質が、ＤＰにおいて過剰発現されたと特定され、それらのうち３４個が、１０００の存在量比を有した（表３２）。
【表32】
【0227】
薬物製剤（ＤＰ）中のプロテオーム特定
表３３は、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂの混合物を含むＤＰの３回の反復実験で特定された１３２個の細胞表面タンパク質である。
表３３は、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ａ、ＨＴ－２９ ＤＳ－Ｂ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ａ、ＨＣＴ－１１６ ＤＳ－Ｂ、ＬｏＶｏ ＤＳ－ＡおよびＬｏＶｏ ＤＳ－Ｂの混合物を含むＤＰの３回の反復実験で特定された１３２個の細胞表面タンパク質である。
【表33】
【0228】
実施例６
混合リンパ球反応アッセイによるＳＴＣ－１０１０の機能活性のインビトロ評価
目的は、最終産物（ＤＰまたは「ＳＴＣ－１０１０」）を、単独でまたはＣＤ４０Ｌ（天然にインビボで存在する）と組み合わせて適用した場合の、ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）の免疫原性プロファイルの誘導能に関してインビトロで評価すること、および樹状細胞により媒介されるＴ細胞活性化を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで評価することであった。本試験を、ＨＬＡ適合単球由来ｍＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養に関して実施し、この系では、ｉ）ＤＣのサイトカインプロファイルを、培養上清（ＩＬ－１２およびＩＬ－８を含む）中に放出されたサイトカインの定量化により測定し、ｉｉ）ＤＣ媒介Ｔ細胞活性化を、特定のホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）ベースの検出キットを用いて、放出されたＩＦＮγの定量化によるＭＬＲ応答の評価により測定した。
混合リンパ球反応アッセイによるＳＴＣ－１０１０の機能活性のインビトロ評価
目的は、最終産物（ＤＰまたは「ＳＴＣ－１０１０」）を、単独でまたはＣＤ４０Ｌ（天然にインビボで存在する）と組み合わせて適用した場合の、ヒト単球由来樹状細胞（ＤＣ）の免疫原性プロファイルの誘導能に関してインビトロで評価すること、および樹状細胞により媒介されるＴ細胞活性化を混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイで評価することであった。本試験を、ＨＬＡ適合単球由来ｍＤＣおよびＣＤ８＋Ｔ細胞の共培養に関して実施し、この系では、ｉ）ＤＣのサイトカインプロファイルを、培養上清（ＩＬ－１２およびＩＬ－８を含む）中に放出されたサイトカインの定量化により測定し、ｉｉ）ＤＣ媒介Ｔ細胞活性化を、特定のホモジニアス時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）ベースの検出キットを用いて、放出されたＩＦＮγの定量化によるＭＬＲ応答の評価により測定した。
【0229】
材料および方法
ｉ）分化／成熟プロトコルを通して成熟ＤＣを得るために使用される単球、ならびにｉｉ）ＣＤ８＋リンパ球、を新しく単離するために、健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣをこの試験に使用した。
手短に説明すると、ヒト単球をＰＢＭＣから新しく単離し、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で培養し、ＤＣに分化させた。分化過程の最後に、３つの異なる比率（１：１、３：１および１０：１の比率の条件と、これに加えて、陰性対照として、ＳＴＣ－１０１０を含まない条件）でＳＴＣ－１０１０を含むＬＰＳおよびＩＦＮγの存在下、０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在および非存在下で、特異的カクテル中でＤＣを成熟させた
成熟すると、ｍＤＣは、ＣＤ２０９＋ＣＤ１ａ＋ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋ＣＤ８６＋として検証され、細胞培養上清を、ＨＴＲＦによるＩＬ－１２およびＩＬ－８の定量化のために回収した。
その後、ＤＣを適切な１：４の刺激剤：応答体比率で、同じドナーから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞と共に、共培養した。対照条件（無処置）、ならびにＴ細胞単独およびｍＤＣ単独を実験に含めた。共培養の７２時間後、上清を収集し、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果を、Ｔ細胞活性化の重要な代表的代替物として使用される、放出されたＩＦＮγレベルの定量化により評価した。サイトカインレベル定量化は、ＨＴＲＦにより実施した。
ｉ）分化／成熟プロトコルを通して成熟ＤＣを得るために使用される単球、ならびにｉｉ）ＣＤ８＋リンパ球、を新しく単離するために、健康なドナー由来のヒトＰＢＭＣをこの試験に使用した。
手短に説明すると、ヒト単球をＰＢＭＣから新しく単離し、ＧＭ－ＣＳＦおよびＩＬ－４の存在下で培養し、ＤＣに分化させた。分化過程の最後に、３つの異なる比率（１：１、３：１および１０：１の比率の条件と、これに加えて、陰性対照として、ＳＴＣ－１０１０を含まない条件）でＳＴＣ－１０１０を含むＬＰＳおよびＩＦＮγの存在下、０．６μｇ／ｍＬのＣＤ４０Ｌの存在および非存在下で、特異的カクテル中でＤＣを成熟させた
成熟すると、ｍＤＣは、ＣＤ２０９＋ＣＤ１ａ＋ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋ＣＤ８６＋として検証され、細胞培養上清を、ＨＴＲＦによるＩＬ－１２およびＩＬ－８の定量化のために回収した。
その後、ＤＣを適切な１：４の刺激剤：応答体比率で、同じドナーから単離したＣＤ８＋Ｔ細胞と共に、共培養した。対照条件（無処置）、ならびにＴ細胞単独およびｍＤＣ単独を実験に含めた。共培養の７２時間後、上清を収集し、ＣＤ８＋Ｔ細胞活性化に及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果を、Ｔ細胞活性化の重要な代表的代替物として使用される、放出されたＩＦＮγレベルの定量化により評価した。サイトカインレベル定量化は、ＨＴＲＦにより実施した。
【0230】
結果
ｍＤＣサイトカインに及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果
ＳＴＣ－１０１０は、ＣＤ４０Ｌの存在下、非存在下の両方の条件で、ｍＤＣによるＩＬ－８の分泌を比率依存的に制限することができた（それぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＳＴＣ－１０１０はまた、ＣＤ４０Ｌの存在下で、ｍＤＣによるＩＬ－１２の分泌を比率依存的に高めることができる（図１１Ｃ）。この比率依存的応答は、ＤＣの成熟に及ぼすＳＴＣ－１０１０の作用を確証する。
ｍＤＣサイトカインに及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果
ＳＴＣ－１０１０は、ＣＤ４０Ｌの存在下、非存在下の両方の条件で、ｍＤＣによるＩＬ－８の分泌を比率依存的に制限することができた（それぞれ、図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＳＴＣ－１０１０はまた、ＣＤ４０Ｌの存在下で、ｍＤＣによるＩＬ－１２の分泌を比率依存的に高めることができる（図１１Ｃ）。この比率依存的応答は、ＤＣの成熟に及ぼすＳＴＣ－１０１０の作用を確証する。
【0231】
２つの他のサイトカイン（ＩＬ－１０およびＴＮＦα）もこの試験の過程で評価した：ＳＴＣ－１０１０は、ＣＤ４０Ｌの存在下でＩＬ－１０分泌を制限する傾向を実証した；一方、ＴＮＦα分泌は、ＣＤ４０Ｌの非存在または存在の両方で、ＳＴＣ－１０１０曝露によりわずかに減少し、効果は最高比率で最高に達した。
ＩＦＮγ定量化によるＭＬＲ応答に及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果
自家ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したｍＤＣは、以前に成熟期間中にＣＤ４０Ｌに曝露した場合、効果的なＭＬＲ応答を示した。この効果は、対照およびビークルと比較して、共培養から収集された上清中のＩＦＮγ放出が有意な上方調節を示したという評価により立証された（図１２）。
ＩＦＮγ定量化によるＭＬＲ応答に及ぼすＳＴＣ－１０１０の効果
自家ＣＤ８＋Ｔ細胞と共培養したｍＤＣは、以前に成熟期間中にＣＤ４０Ｌに曝露した場合、効果的なＭＬＲ応答を示した。この効果は、対照およびビークルと比較して、共培養から収集された上清中のＩＦＮγ放出が有意な上方調節を示したという評価により立証された（図１２）。
【0232】
結論
これらのデータを考慮すると、ＳＴＣ－１０１０は、サイトカインプロファイルを通して立証されたように、ＳＴＣ－１０１０の免疫原性および比率依存性活性と共に、ＤＣ成熟を調節するその能力を実証した。
この免疫原性プロファイルは、ＭＬＲにより確認され、ＳＴＣ－１０１０プライミングＤＣと共培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、改善された機能的活性を有した。
これらのデータを考慮すると、ＳＴＣ－１０１０は、サイトカインプロファイルを通して立証されたように、ＳＴＣ－１０１０の免疫原性および比率依存性活性と共に、ＤＣ成熟を調節するその能力を実証した。
この免疫原性プロファイルは、ＭＬＲにより確認され、ＳＴＣ－１０１０プライミングＤＣと共培養されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、改善された機能的活性を有した。
【0233】
実施例７
漿尿膜アッセイによるＳＴＣ－１０１０の機能活性のインオボ評価
この目的は、最終産物（ＤＰまたは「ＳＴＣ－１０１０）」を、漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおける免疫応答の誘導能に関してインオボで評価することであった。
漿尿膜アッセイによるＳＴＣ－１０１０の機能活性のインオボ評価
この目的は、最終産物（ＤＰまたは「ＳＴＣ－１０１０）」を、漿尿膜（ＣＡＭ）アッセイにおける免疫応答の誘導能に関してインオボで評価することであった。
【0234】
材料および方法
ニワトリ胚の調製
白色レグホンの受精卵を３７．５℃、５０％の相対湿度下で９日間インキュベートした。その時点（Ｅ９）で、卵殻に小さい穴を開けることにより、ＣＡＭを気嚢中に落下させ、ＣＡＭの上部の卵殻中で１ｃｍ２のウィンドウを切り取った。各試験群に関して少なくとも２０個の卵を開口した（しかし、卵殻開口は、侵襲的外科行為であるので、開口後の最初の数時間中に数例の死亡が起こり得るため、データは、群あたり１５～２０個の卵で収集されていてもよい）。
ニワトリ胚の調製
白色レグホンの受精卵を３７．５℃、５０％の相対湿度下で９日間インキュベートした。その時点（Ｅ９）で、卵殻に小さい穴を開けることにより、ＣＡＭを気嚢中に落下させ、ＣＡＭの上部の卵殻中で１ｃｍ２のウィンドウを切り取った。各試験群に関して少なくとも２０個の卵を開口した（しかし、卵殻開口は、侵襲的外科行為であるので、開口後の最初の数時間中に数例の死亡が起こり得るため、データは、群あたり１５～２０個の卵で収集されていてもよい）。
【0235】
処置
処置の前に、各卵の生存率をチェックし、生存卵をいくつかの群に無作為化した。全ての群の卵を、１００μＬの体積のＳＴＣ－１０１０によって、以下の３つの試験条件で処置した：
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［１］」；１０５細胞／ｍＬ、すなわち、１０４細胞／胚；
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［２］」；５ｘ１０５細胞／ｍＬ、すなわち、５ｘ１０４細胞／胚；および
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［３］」；１０６細胞／ｍＬ、すなわち、１０５細胞／胚。
ＳＴＣ－１０１０を含まない陰性対照（「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」）を同時に実施した。
ニワトリ免疫細胞の定量的評価
Ｅ１８日目に、末梢血を採取し、血液凝固を防止するためにヘパリンで処置した。
樹状細胞（ＤＣ）評価に関しては、１００μＬの個々の試料（ｎ＝８／群）を回収し、そこからＲＮＡを抽出し、逆転写、前増幅し、ニワトリＣＤ４０、ＣＤ８３およびＣＤ８６配列に特定的なプライマーを用いて、ｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲで実施した全てのポイントに対し、参照遺伝子発現として、ニワトリＧＡＰＤＨの発現も分析し、これを使用して試料間の免疫バイオマーカー発現を正規化した。各試料のＣｑの計算、平均Ｃｑおよび各群の免疫細胞の相対量をＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアにより直接管理した。
Ｔリンパ球評価のために、残りの血液試料を群内でプールした。次に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）単離のために、血液試料をＨｙｐａｑｕｅ－Ｆｉｃｏｌｌ（ＨＦ）分離によって処理した。その後、フローサイトメトリー分析によるＴリンパ球評価のために、精製ＰＢＭＣを抗ニワトリＣＤ４５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６７９）、抗ニワトリＣＤ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、参照番号：８２００－２６）、抗ニワトリＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６８６）および抗ニワトリＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６８６）で標識した。
免疫サイトカインの定量的評価
Ｅ１８日目に、末梢血を個々に採取し（ｎ＝５／群）、血液凝固を防止するためにヘパリンで処置した。その後、血液試料を血漿収集のために遠心分離し、続いて、ＩＬ－１２およびＩＦＮγ発現に関するＥＬＩＳＡ分析を実施し、各血漿試料を３つの希釈で評価した。全てのＥＬＩＳＡキットを、Ｃｕｓａｂｉｏに注文した（ニワトリＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡキット、参照番号：ＣＳＢ－Ｅ１２８３６Ｃ；ニワトリＩＦＮ ＥＬＩＳＡキット、参照番号：ＣＳＢ－Ｅ０８５５０Ｃｈ）。
処置の前に、各卵の生存率をチェックし、生存卵をいくつかの群に無作為化した。全ての群の卵を、１００μＬの体積のＳＴＣ－１０１０によって、以下の３つの試験条件で処置した：
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［１］」；１０５細胞／ｍＬ、すなわち、１０４細胞／胚；
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［２］」；５ｘ１０５細胞／ｍＬ、すなわち、５ｘ１０４細胞／胚；および
－試験条件「ＳＴＣ１０１０［３］」；１０６細胞／ｍＬ、すなわち、１０５細胞／胚。
ＳＴＣ－１０１０を含まない陰性対照（「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」）を同時に実施した。
ニワトリ免疫細胞の定量的評価
Ｅ１８日目に、末梢血を採取し、血液凝固を防止するためにヘパリンで処置した。
樹状細胞（ＤＣ）評価に関しては、１００μＬの個々の試料（ｎ＝８／群）を回収し、そこからＲＮＡを抽出し、逆転写、前増幅し、ニワトリＣＤ４０、ＣＤ８３およびＣＤ８６配列に特定的なプライマーを用いて、ｑＰＣＲにより分析した。ｑＰＣＲで実施した全てのポイントに対し、参照遺伝子発現として、ニワトリＧＡＰＤＨの発現も分析し、これを使用して試料間の免疫バイオマーカー発現を正規化した。各試料のＣｑの計算、平均Ｃｑおよび各群の免疫細胞の相対量をＢｉｏ－Ｒａｄ（登録商標）ＣＦＸ Ｍａｅｓｔｒｏソフトウェアにより直接管理した。
Ｔリンパ球評価のために、残りの血液試料を群内でプールした。次に、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）単離のために、血液試料をＨｙｐａｑｕｅ－Ｆｉｃｏｌｌ（ＨＦ）分離によって処理した。その後、フローサイトメトリー分析によるＴリンパ球評価のために、精製ＰＢＭＣを抗ニワトリＣＤ４５（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６７９）、抗ニワトリＣＤ３（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、参照番号：８２００－２６）、抗ニワトリＣＤ４（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６８６）および抗ニワトリＣＤ８（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、参照番号：ＭＡ５－２８６８６）で標識した。
免疫サイトカインの定量的評価
Ｅ１８日目に、末梢血を個々に採取し（ｎ＝５／群）、血液凝固を防止するためにヘパリンで処置した。その後、血液試料を血漿収集のために遠心分離し、続いて、ＩＬ－１２およびＩＦＮγ発現に関するＥＬＩＳＡ分析を実施し、各血漿試料を３つの希釈で評価した。全てのＥＬＩＳＡキットを、Ｃｕｓａｂｉｏに注文した（ニワトリＩＬ－１２ ＥＬＩＳＡキット、参照番号：ＣＳＢ－Ｅ１２８３６Ｃ；ニワトリＩＦＮ ＥＬＩＳＡキット、参照番号：ＣＳＢ－Ｅ０８５５０Ｃｈ）。
【0236】
統計解析および有意性
全ての定量データに対し、外れ値特定および一元配置分散分析（各２組の群間で事後検定）を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。
全ての定量データに対し、外れ値特定および一元配置分散分析（各２組の群間で事後検定）を、Ｐｒｉｓｍ（登録商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて実施した。
【0237】
結果
ＦＡＣＳによるニワトリ免疫細胞の定量的評価
Ｅ１８で精製したＰＢＭＣ中のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳ定量化により、群「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」および「ＳＴＣ－１０１０［３］」における白血球活性化を評価した。表３４は、末梢白血球中に含まれるこれらの異なる細胞サブセットのＦＡＣＳ分析データを示す（末梢ＣＤ４５＋白血球中の％として）。
これらのデータは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋白血球の増加、特にＣＤ３－／ＣＤ４＋白血球の高い増加を示す。
ＦＡＣＳによるニワトリ免疫細胞の定量的評価
Ｅ１８で精製したＰＢＭＣ中のＣＤ４５＋、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、およびＣＤ８＋細胞のＦＡＣＳ定量化により、群「Ｎｅｇ Ｃｔｒｌ」および「ＳＴＣ－１０１０［３］」における白血球活性化を評価した。表３４は、末梢白血球中に含まれるこれらの異なる細胞サブセットのＦＡＣＳ分析データを示す（末梢ＣＤ４５＋白血球中の％として）。
【表34】
【0238】
免疫サイトカインの定量的評価
Ｅ１８の全ての群中の末梢血液中のＩＬ－１２およびＩＦＮγの発現レベルを推定した。サイトカイン分泌を適切に評価するために、各血漿試料を３つの希釈１／２、１／１０および１／５０で評価した。
これらの結果からわかるように、陰性対照と比較して、３つ全ての試料希釈で、ＳＴＣ－１０１０により誘導されたＩＬ－１２分泌の真の増加が観察された。しかし、ＳＴＣ－１０１０処置後にＩＦＮγの有意な増加は観察されなかった（データは示さず）。
Ｅ１８の全ての群中の末梢血液中のＩＬ－１２およびＩＦＮγの発現レベルを推定した。サイトカイン分泌を適切に評価するために、各血漿試料を３つの希釈１／２、１／１０および１／５０で評価した。
【表35】
【0239】
ＲＴ－ｑＰＣＲによるニワトリ免疫細胞の定量的評価
３つのＤＣ活性化マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＳＴＣ－１０１０により誘導されたこれらのマーカー、特に、最高用量時のＣＤ４０およびＣＤ８６の上方調節、ならびにＣＤ８３の全用量での上方調節、および、最低用量でのより有意な上方調節を示す（図１３Ａ～Ｃ）。
３つのＤＣ活性化マーカー（ＣＤ４０、ＣＤ８３、ＣＤ８６）の発現をＲＴ－ｑＰＣＲにより評価した。結果は、ＳＴＣ－１０１０により誘導されたこれらのマーカー、特に、最高用量時のＣＤ４０およびＣＤ８６の上方調節、ならびにＣＤ８３の全用量での上方調節、および、最低用量でのより有意な上方調節を示す（図１３Ａ～Ｃ）。
【0240】
結論
この試験全体を通して、胚の大多数が生存したことから、ＳＴＣ－１０１０の毒性がないことが確証された：
－陰性対照：ｎ＝５０、３個の胚が死亡した（６％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［１］」：ｎ＝４８、２個の胚が死亡した（４．１７％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［２］」：ｎ＝３３、０個の胚が死亡した（０％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［３］」：ｎ＝２９、１個の胚が死亡した（３．４５％の死亡率）。
ＳＴＣ－１０１０は、このＣＡＭアッセイを用いて、免疫系を増強し、自然および／または適応免疫応答を活性化できることが示された。
これらの有望な結果に基づいて、ヒト結腸直腸腺癌をグラフトしたニワトリ胚に対するＳＴＣ－１０１０のインオボ有効性を評価する新規研究が実施されるであろう。
この試験全体を通して、胚の大多数が生存したことから、ＳＴＣ－１０１０の毒性がないことが確証された：
－陰性対照：ｎ＝５０、３個の胚が死亡した（６％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［１］」：ｎ＝４８、２個の胚が死亡した（４．１７％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［２］」：ｎ＝３３、０個の胚が死亡した（０％の死亡率）；
－群「ＳＴＣ１０１０［３］」：ｎ＝２９、１個の胚が死亡した（３．４５％の死亡率）。
ＳＴＣ－１０１０は、このＣＡＭアッセイを用いて、免疫系を増強し、自然および／または適応免疫応答を活性化できることが示された。
これらの有望な結果に基づいて、ヒト結腸直腸腺癌をグラフトしたニワトリ胚に対するＳＴＣ－１０１０のインオボ有効性を評価する新規研究が実施されるであろう。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図9D】
【図10】
【図11A】
【図11B】
【図11C】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図13C】
【国際調査報告】