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▶ セントロ デ インベスティガシオン イ デサロージョ デ メディカメントス（シデム）の特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-26
(54)【発明の名称】多剤耐性病原体に対する抗菌活性を有するペプチド実体
(51)【国際特許分類】
C07K 14/00 20060101AFI20240216BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240216BHJP
A61K 38/16 20060101ALI20240216BHJP
A61P 31/00 20060101ALI20240216BHJP
A61P 31/04 20060101ALI20240216BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240216BHJP
A61K 31/407 20060101ALI20240216BHJP
【ＦＩ】
C07K14/00 ZNA
A61K45/00
A61K38/16
A61P31/00
A61P31/04
A61P43/00 121
A61K31/407
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023523524
(86)(22)【出願日】2021-11-18
(85)【翻訳文提出日】2023-04-17
(86)【国際出願番号】 CU2021050011
(87)【国際公開番号】W WO2022105948
(87)【国際公開日】2022-05-27
(31)【優先権主張番号】2020-0086
(32)【優先日】2020-11-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CU
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】518390701
【氏名又は名称】セントロ デ インベスティガシオン イ デサロージョ デ メディカメントス．セイデエエメ
(74)【代理人】
【識別番号】110000855
【氏名又は名称】弁理士法人浅村特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】モンテロ － アレホ、ヴィヴィアン
(72)【発明者】
【氏名】ペルドモ － モラレス、ローランド
(72)【発明者】
【氏名】バスケス － ゴンザレス、アマンダ
(72)【発明者】
【氏名】ガレイ － ペレス、イルダ エリサ
【テーマコード（参考）】
4C084
4C086
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA07
4C084AA19
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA19
4C084BA23
4C084CA59
4C084MA02
4C084NA05
4C084NA14
4C084ZB321
4C084ZB322
4C084ZB352
4C084ZC751
4C086AA01
4C086AA02
4C086CC08
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086NA05
4C086ZB32
4C086ZB35
4C086ZC75
4H045AA10
4H045AA30
4H045BA18
4H045EA20
4H045FA33
(57)【要約】
本発明は、細菌性であり、かつ既存の抗生物質に対して多剤耐性である微生物として存在する病原性微生物に対して活性である合成ペプチド系化合物を記載する。本発明はまた、前記ペプチドを含有する併用療法を記載する。ペプチド系化合物及びその組合せを含む医薬組成物が、その使用及びそれを使用することができる治療方法と共に記載される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号１、配列番号２、及び配列番号３の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列を含むことを特徴とする、抗菌活性を有するペプチド。
【請求項2】
各配列に存在するシステイン（Ｃｙｓ、Ｃ）がジスルフィド結合を形成しており、末端のカルボキシル末端の残基はアミド化されていることをさらに特徴とする、請求項１に記載のペプチド。
【請求項3】
Ｘａａが、Ｄ型又はＬ型のアルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びリジン（Ｌｙｓ、Ｋ）からなる群から独立して選択され、ただし、Ｘａａ残基の少なくとも４つがアルギニンであることを条件とすることをさらに特徴とする、請求項２に記載のペプチド。
【請求項4】
細菌感染症を有する患者への、多剤耐性現象の発生を制御するための併用療法であって、請求項１～３に記載される群から選択される少なくとも２つの配列を前記患者に投与することを含む、併用療法。
【請求項5】
細菌感染症を有する患者への、多剤耐性現象の発生を制御するための併用療法であって、請求項１から３に定義される群から選択される配列をベータラクタム系抗生物質と共に前記患者に投与することを含む、併用療法。
【請求項6】
ベータラクタム系抗生物質がカルバペネムである、請求項５に記載の併用療法。
【請求項7】
微生物感染症を治療及び／又は予防するための医薬組成物であって、ａ）有効成分としての治療有効量の請求項１～３に記載される群から選択されるペプチドと、
ｂ）１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と
を含む、医薬組成物。
【請求項8】
請求項１～３に記載される群から選択される第２のペプチドを有効成分としてさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項9】
ベータラクタム系抗生物質を有効成分としてさらに含む、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項10】
ベータラクタム系抗生物質がメロペネムである、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
請求項１～３に記載の群から選択されるペプチド、請求項４～６に記載の併用療法から選択される併用療法、又は請求項７～１０に記載の医薬組成物から選択される医薬組成物の使用であって、前記使用が、微生物感染症の予防及び／又は治療のための医薬品を製造するための使用であることから特徴付けられる、使用。
【請求項12】
感染症がＥＳＫＡＰＥ群に属するグラム陰性菌又はグラム陽性菌の病原性株によって引き起こされる、請求項１１に記載の使用。
【請求項13】
グラム陰性菌が、既存の抗生物質に対して多剤耐性を示し、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomona aeruginosa）、及び大腸菌（Escherichia ｃｏｌｉ）を含む群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項14】
グラム陽性菌が、既存の抗生物質に対して多剤耐性を示し、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を含む群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項15】
微生物感染症を治療又は予防する方法であって、請求項１～３に記載の群から選択されるペプチド、請求項４～６に記載の併用療法から選択される併用療法、又は請求項７～１０に記載の医薬組成物から選択される医薬組成物を、治療有効量で微生物感染症を有する対象に投与することを含む、方法。
【請求項16】
感染症がＥＳＫＡＰＥ群に属するグラム陰性菌又はグラム陽性菌の病原性株によって引き起こされる、請求項１５に記載の治療方法。
【請求項17】
グラム陰性菌が、既存の抗生物質に対して多剤耐性を示し、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomona aeruginosa）、及び大腸菌（Escherichia coli）を含む群から選択される、請求項１６に記載の治療方法。
【請求項18】
グラム陽性菌が、既存の抗生物質に対して多剤耐性を示し、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）を含む群から選択される、請求項１６に記載の治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、新規ペプチド実体、組合せ、及びそれらを含む医薬組成物、並びに医薬品の製造及び細菌感染症を治療する方法におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
抗生物質耐性は、細菌及び真菌のような病原菌が、それらを死滅させるように設計された薬物を無効にする又は回避する能力を発達させる場合に生じる。これは、病原菌が死滅せず、増殖し続けることを意味する。抗生物質に耐性のある病原菌によって引き起こされる感染症は、治療が困難であり、時には不可能である。ほとんどの場合において、抗生物質耐性感染症は、長い入院、追加の医療フォローアップ訪問、及び高価で毒性のある治療代替法を必要とすることをこれに付け加えると、問題の複雑さはさらに大きくなる。抗生物質耐性は、他の疾患における耐性現象で生じるように、身体が抗生物質に対して耐性になりつつあることを意味するものではなく、むしろ、細菌は、それらを死滅させるように設計された抗生物質に対して耐性になっている。この問題は、投与される抗生物質の用量を増加させることによって解決されず、これは毒性の追加のリスクも表す。抗生物質耐性は、生活のあらゆる段階の人々、並びに健康、獣医学及び農業産業に影響を及ぼす可能性があり、世界で最も深刻かつ緊急の健康問題の１つになっている。耐性感染症のリスクを完全に回避することはできないが、一部の人々、例えば慢性疾患を有する人々は他の人々よりもリスクが高い。抗生物質の有効性が失われると、感染症を治療し、公衆衛生に対する脅威を制御する能力が失われる（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｃｄｃ．ｇｏｖ／ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ／ｉｎｔｌ－ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ／ａｍｒ－ｃｈａｌｌｅｎｇｅ．ｈｔｍｌ）。さらに、様々な非感染性疾患シナリオのほとんどにおいて、臨床医はまた、例えば、関節置換、臓器移植、抗炎症療法、がん、並びに糖尿病、喘息、及び関節リウマチなどの慢性疾患の治療において、抗生物質の使用を介した感染症を予防する能力に依存している。
【0003】
既存の抗生物質に対する耐性に寄与する重要な代謝経路及び機構を標的とするアジュバントと組み合わせて抗生物質を使用するために多大な努力がなされてきた（透過剤、ラクタマーゼ阻害剤、流出ポンプ阻害剤、クオラムセンシング阻害剤、毒素の阻害剤など）。抗生物質とアジュバントとのこのような組合せによる成果はこれまで不十分であるため、これらの薬物に対する耐性に対処するためのさらなる代替手段が求められている。
【0004】
２０１７年の初め以来、世界保健機関（ＷＨＯ）は、新しい抗生物質が緊急に必要とされている１２種類の薬物耐性細菌を含む優先病原体のリストを世界中で公表している。この報告は、多剤耐性グラム陰性菌に対する新しい抗生物質を開発することの重要性及び差し迫った必要性を強調している。（https://www.who.int/news-room/detail/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-which-new-antibiotics-are-urgently-needed参照）。抗生物質耐性の発生率が最も高いと報告されている微生物の中には、カルバペネムに耐性であるアシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）種、カルバペネムに耐性である緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、及びカルバペネムに耐性でありＥＳＢＬを産生する腸内細菌（Enterobacteriaceae）種がある。さらに、バンコマイシンに耐性であるエンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）種及びメチシリンに耐性である黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種などの中程度の発生率を有する他の微生物が挙げられる。
【0005】
抗菌ペプチド（ＡＭＰ）が細菌膜と相互作用して細胞溶解を引き起こす能力により、抗菌ペプチドは、既存の抗生物質に対する病原体の耐性の現象に対抗するための有望な代替物となっている［Mulani,MS,et al.,Emerging Strategies to Combat ESKAPE Pathogens in the Era of Antimicrobial Resistance:A Review.Frontiers in microbiology,2019.10:p.539-539］。天然ＡＭＰの膜溶解機構は、耐性機構が特異的な薬物標的に急速に出現するため、潜在的に有望な治療代替法である［Mourtado,R.,et al.,Design of stapled antimicrobial peptides that are stable,non-toxic and kill antibiotic-resistant bacteria in mice.Nature Biotechnology,2019.37(10):p.1186-1197］。この意味で、今日、新たな外用抗感染剤の必要性は、感染性疾患、具体的には未解決の及び／又は多剤耐性微生物によって引き起こされる感染性疾患に対抗するためにより緊急である。
【0006】
一般的に、ＡＭＰは、細菌などの負に帯電した細菌膜に対して選択的であり、それらの細胞傷害性は、それらの表面に中性電荷を提示する真核生物に対して中程度である。ＡＭＰの抗菌機構における特徴的な要素は、細胞質膜との相互作用であり、したがって、電荷及び疎水性は、抗菌活性の発現にとって重要な特性である。一旦ペプチド－膜結合が起こると、作用機構は一般に、溶解孔の形成又はペプチド凝集体の形成による膜の不安定化を伴う。他の非溶解機構には、細胞の脱分極、及び細胞質ゾルへの移行、及び細胞内標的（核酸、酵素など）への結合が含まれる［Hale,J.D.and R.E.Hancock,Alternative mechanisms of action of cationic antimicrobial peptides on bacteria.Expert Rev Anti Infect Ther,2007.5(6):p.951-9.］。
【0007】
イセエビ（Panulirus ssp）属の甲殻類の血リンパからの天然鋳型からの治療候補の証拠はない。β型抗菌ペプチドデフェンシンの新しいファミリーの存在が、近年、イセエビのパヌリラスアーガス（Panulirus argus）の血球において記載された［Montero-Alejo,V.,et al.,Defensin-like peptide from Panulirus argus relates structurally with beta-defensin from vertebrates.Fish Shellfish Immunol,2012.33(4):p.872-9.][Montero-Alejo,V.,et al.,Panusin represents a new family of beta-defensin-like peptides in invertebrates.Dev Comp Immunol,2017.67:p.310-321］。プロフェノールオキシダーゼ活性化系を調節するトリプシン型プロテアーゼ阻害剤の新しいファミリーも、この甲殻類において同定された［Perdomo-Morales,R.,et al.,The trypsin inhibitor panulirin regulates the prophenoloxidase-activating system in the spiny lobster Panulirus argus.J Biol Chem,2013.288(44):p.31867-79][WO/2013/113296.PERDOMO,M.R.,et al.,Composition from lobster hemocyte extract for detection of lipopolysaccharides,peptidoglycans,and 1,3-beta-d-glucans.2014.］。上記のように、多剤耐性（ＭＤＲ）病原体の現象及びこの問題に対処することを可能にする新しい治療代替法の欠如により、抗菌活性及び新規な作用機序を有する新しい分子を探索することが必要となっている。
【発明の概要】
【0008】
本発明は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３の配列を含む群からの合成ペプチド配列であって、多剤耐性細菌によって引き起こされる微生物感染症の予防及び治療における潜在的な治療用途を有する合成ペプチド配列を提供する。
【0009】
本発明はさらに、細菌感染症を有する患者への、多剤耐性現象の発生を制御するための併用療法であって、配列番号１～３を含む群から選択される少なくとも２つの配列を患者に投与することを含む、併用療法を提供する。また、配列番号１～３を含む群から選択される配列をベータラクタム系抗生物質と共に患者に投与することを含む併用療法も提供する。より具体的には、ベータラクタム系抗生物質クラスがカルバペネムであるこの併用療法を提供する。
【0010】
本発明の別の目的は、有効成分としての配列番号１～３からなる群から選択されるペプチドと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物である。本発明の別の目的は、配列番号１～３からなる群から選択される第２のペプチドを有効成分としてさらに含む医薬組成物である。本発明の別の目的は、配列番号１～３からなる群から選択されるペプチド及びベータラクタム系抗生物質も含む医薬組成物である。この目的の特定の実施形態は、抗生物質がメロペネムである場合である。
【0011】
本発明に記載のペプチドは、細菌感染症を治療するための薬物の製造に使用することができる。本発明の特徴的な態様は、特にグラム陰性菌によって引き起こされる感染症の治療におけるその使用である。本発明を実施する特定の形態は、ＥＳＫＡＰＥ群に属する病原性株、例えばクレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）種、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）種、緑膿菌（Pseudomona aeruginosa）種、及び大腸菌（Escherichia coli）種によって引き起こされる感染症の治療における、より具体的には、既存の抗生物質に対して多剤耐性である前記種の臨床分離株におけるその治療的使用である。
【0012】
本発明の別の特定の態様は、グラム陽性菌によって引き起こされる感染症の治療におけるその使用である。本発明を実施する特定の形態は、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）種又は黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種の群から選択される病原性株によって引き起こされる感染症の治療における、より具体的には、既存の抗生物質に対して多剤耐性である前記種の臨床分離株におけるその使用であろう。
【0013】
本発明の別の目的は、微生物感染症を治療又は予防する方法であって、組合せ又は医薬組成物のいずれかの配列番号１～３からなる群から選択されるペプチドを投与することを含む、方法である。特定の実施形態は、ＥＳＫＡＰＥ群に属する病原性株によって感染症が引き起こされる場合である。
【図面の簡単な説明】
【0014】
【図1】ＲＰ－ＨＰＬＣによる精製及びＥＳＩ－ＭＳ／ＭＳによる配列チェックを示す図である。ａ）配列番号１、ｂ）配列番号２、ｃ）配列番号３。
【図2】異なる細胞型に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３のペプチドの毒性効果の評価を示す図である。Ａ）ウィスターラットの赤血球に対する異なるペプチド濃度でインビトロで決定された溶血率。Ｂ）Ｈｅｐ２細胞株に対する異なるペプチド濃度でインビトロで決定された細胞生存率。ペプチド濃度は、細菌増殖の９０％致死濃度（ＬＤ９０）値よりも最大１０倍高い値をカバーするために使用した。
【図3】細菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及び緑膿菌（Pseudomona aeruginosa）の死滅時間の評価を示す図である。Ａ）配列番号１、Ｂ）配列番号２、Ｃ）配列番号３。各場合において、抗生物質メロペネムを使用して、クレブシエラニューモニエ（K.pneumoniae）の死滅時間及び緑膿菌（P.aeruginosa）細菌に対する抗生物質シプロフロキサシンを比較した。評価した時間におけるコロニー数の３ｌｏｇの減少は、選択した細菌に対する致死効果を実証している。
【図4】ペプチド配列：Ａ）配列番号１、Ｂ）配列番号２、Ｃ）配列番号３の存在下でのヒト全血培養物からのＬＰＳ誘導性ＩＬ－６放出の阻害、及び参照としてのポリミキシンＢ（ＰＭＢ）のＬＰＳ中和活性との比較を示す図である。
【図5】カブトガニ血球抽出液（ＬＡＬ）法によって決定されたペプチドのＬＰＳ中和活性を示す図である。異なる濃度のペプチドをＬＰＳ（０．５ＥＵ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ＬＡＬ法は、ペプチドの存在下で活性ＬＰＳの存在（回収率）を決定することを可能にする。ＬＡＬアッセイの応答の用量依存的阻害を、各ペプチド変異体について２ｎＭ～２０μＭの濃度範囲でＬＰＳチャレンジに対して得る。
【発明を実施するための形態】
【0015】
本発明は、細菌性であり、かつ既存の抗生物質に対する多剤耐性微生物として現れる病原性微生物に対抗する新しい合成ペプチド化合物に基づく代替物を提供する。驚くべきことに、ロブスターのパヌリラスアーガス（P.argus）の血球中で同定された天然ペプチドの異なるファミリーから設計されたキメラハイブリッド構造は、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）種、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種及び大腸菌（Eccherichia coli）種を含む多剤耐性抗生物質株に対して抗菌活性を示す。
【0016】
本発明の好ましい実施形態では、配列番号１、配列番号２、及び／若しくは配列番号３、又は配列番号１～３と少なくとも８０％の同一性を有するペプチド構造の配列からなる群から選択されるアミノ酸配列のリストが示される。
【0017】
好ましい実施形態では、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３の群に含まれる選択された配列は、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）法を用いた化学合成によって得られる。とはいえ、これらの配列の一次構造には、Ｌ型又はＤ型で生じ得るアルギニン又はリジンに対応する少なくとも６個の塩基性アミノ酸が存在し、好ましい実施形態では、得られる配列は少なくとも４残基のアルギニンを含有しなければならない。
【0018】
本発明は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３の群に含まれる選択された配列の少なくとも１つを含む併用療法を記載する。前記併用療法では、ペプチドは、同時又は連続的に投与することができる同じ製剤又は異なる製剤中に見出すことができる。
【0019】
別の実施形態では、本発明は、有効成分としての配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３からなる群から選択される少なくとも１つの合成ペプチドと、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【0020】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３の配列の、対象における微生物感染症の予防及び／又は治療における使用を提供する。本発明のペプチド配列は、ヒト及び／又は動物において感染症を引き起こすグラム陰性及びグラム陽性菌株に対する溶菌効果を有するので、広域スペクトル抗菌性である。
【0021】
好ましい実施形態では、本発明は、細菌増殖の阻害剤であり、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）種、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種及び大腸菌（Eccherichia coli）種の群からの選択された病原性微生物に対して殺菌活性を有する、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３の前記ペプチド配列の使用を提供する。
【0022】
好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３のペプチド配列の、エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）種、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）種、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）種、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）種、及び大腸菌（Eccherichia coli）種などの多剤耐性病原性微生物の増殖阻害剤としての使用を提供する。その結果、全ての抗生物質多剤耐性微生物はペプチド化合物に感受性であり、動力学的微量希釈法で１．０～８．０μＭの間のＣＬ９０値を示した。
【0023】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３のペプチド配列の、３０分未満の時間での初期細菌量の３ｌｏｇの減少を得るための使用を提供する。これらは、選択された細菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）（ＡＴＣＣ１００３）及び緑膿菌（Pseudomona aeruginosa）（ＡＴＣＣ９０２７）に対する抗生物質メロペネム及びシプロフロキサシンと比較して細菌量の減少を達成するための迅速性を提供するというのは事実である。
【0024】
好ましい実施形態では、配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３のペプチド配列が、グラム陰性菌の外膜の主要かつ毒性成分であるリポ多糖又はＬＰＳの中和活性を示すことが例示される。好ましくは、ペプチド配列は、全血培養物中のＬＰＳ誘導性炎症促進性サイトカイン放出を阻害し、ＬＡＬ（カブトガニ血球抽出液）試薬に対するＬＰＳ応答を阻害する。
【0025】
本発明はさらに、臨床分離株由来のクレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）種及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種の多抗生物質耐性株のインビトロ培養物における配列番号１－配列番号２、配列番号１－配列番号３及び配列番号２－配列番号３の組合せから得られる相乗的抗菌効果を例示する実施形態を提供する。
【0026】
本発明はさらに、微生物感染症と診断された対象を治療する方法であって、治療有効量の配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３によって形成される群から選択されるペプチドの１つを投与することを含む、方法を提供する。好ましい実施形態では、前記感染症は、既存の抗生物質に対して多剤耐性であるグラム陰性及びグラム陽性菌によって引き起こされる感染症である。本発明はさらに、前記治療方法が、配列番号の配列の選択されたペプチドが組み合わされる場合に、より速い抗菌応答を保証することを提供する。配列番号１、配列番号２、及び／又は配列番号３、診療所からのクレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）種及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）種株のインビトロ培養物におけるカルバペネム系抗生物質と共に組み合わされる。
【0027】
例
例１．
ペプチド実体の合成。
ペプチド合成のために、Ｆｍｏｃ－Ａｍ－ＯＨスペーサーで官能化されたＣｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇの置換）を使用した。以下をアミノ酸の側鎖の保護基として使用した。Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、及びＧｌｎに対してトリチル（Ｔｒｔ）；Ａｒｇに対して２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）；Ｌｙｓに対してＢｏｃ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、及びＧｌｕに対してｔＢｕ。Ｎα－アミノ基を保護するＦｍｏｃ基を、ピペリジンのＤＭＦ中２０％溶液での処理（２×１０分）によって除去した。各脱保護工程後、ＤＭＦで５分間４回洗浄した。各アミノ酸とスペーサーのカップリングは、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（エチル－２－シアノ－２－（ヒドロキシミノ）アセタート）による活性化法により行った。４当量の試薬及びＤＭＦを溶媒として使用した。カップリング反応の完了を、遊離アミノ基の存在に感受性であるニンヒドリン法によって検証した［Kaiser,E.,et al.,Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.Anal Biochem,1970.34(2):p.595-8］。全ての洗浄及び反応を機械的撹拌を用いて行い、溶媒又は試薬を真空濾過によって除去した。アミノ酸側鎖の脱保護及び樹脂からのペプチドの分離は、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）溶液（Ｃｙｓ又はＭｅｔを含有するペプチドの場合）で２５℃にて２時間処理することによって行った。ＴＦＡに溶解した固定されていないペプチドを－２０℃に冷却したエーテル中で沈殿させ、水中の４０％アセトニトリル溶液に再溶解し、凍結乾燥した。続いて、Ｇｏｎｚａｌｅｚらによって記載された処理によって配列を検証した［Gonzalez,J.,et al.,Effect of the position of a basic amino acid on C-terminal rearrangement of protonated peptides upon collision-induced dissociation.J Mass Spectrom,1996.31(2):p.150-8.］。ナノスプレーイオン化源を備えたＱ－Ｔｏｆ１又はＱ－Ｔｏｆ２直交ハイブリッド構成分光計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）でＥＳＩ－ＭＳスペクトルを得た。ヨウ化ナトリウム及びヨウ化セシウム溶液を、分光計の較正のための基準として使用した。マススペクトルの処理には、Ｍａｓｓｌｙｎｘバージョン３．５プログラム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）を用いた。最後に、設計された配列に対応するペプチドの分取精製を行った。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ精製をＬａｂＣｈｒｏｍ装置（Merck Hitachi、ドイツ）で行った。ＲＰ－Ｃ１８（Ｖｙｄａｃ、２５×２５０ｍｍ、２５μｍ）のカラムを使用し、５ｍＬ／分の流量で５０分間、移動相Ｂの１５～４５％の直線勾配から分離を行った。移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）の組成を用いた。５０ｍｇの各粗ペプチドを注入した。クロマトグラムは波長２２６ｎｍで取得した。
例１．
ペプチド実体の合成。
ペプチド合成のために、Ｆｍｏｃ－Ａｍ－ＯＨスペーサーで官能化されたＣｈｅｍｍａｔｒｉｘ樹脂（０．７ｍｍｏｌ／ｇの置換）を使用した。以下をアミノ酸の側鎖の保護基として使用した。Ｃｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、及びＧｌｎに対してトリチル（Ｔｒｔ）；Ａｒｇに対して２，２，４，６，７－ペンタメチル－ジヒドロベンゾフラン－５－スルホニル（Ｐｂｆ）；Ｌｙｓに対してＢｏｃ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｔｙｒ、及びＧｌｕに対してｔＢｕ。Ｎα－アミノ基を保護するＦｍｏｃ基を、ピペリジンのＤＭＦ中２０％溶液での処理（２×１０分）によって除去した。各脱保護工程後、ＤＭＦで５分間４回洗浄した。各アミノ酸とスペーサーのカップリングは、ＤＩＣ／Ｏｘｙｍａ（エチル－２－シアノ－２－（ヒドロキシミノ）アセタート）による活性化法により行った。４当量の試薬及びＤＭＦを溶媒として使用した。カップリング反応の完了を、遊離アミノ基の存在に感受性であるニンヒドリン法によって検証した［Kaiser,E.,et al.,Color test for detection of free terminal amino groups in the solid-phase synthesis of peptides.Anal Biochem,1970.34(2):p.595-8］。全ての洗浄及び反応を機械的撹拌を用いて行い、溶媒又は試薬を真空濾過によって除去した。アミノ酸側鎖の脱保護及び樹脂からのペプチドの分離は、ＴＦＡ／Ｈ２Ｏ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９４／２．５／２．５／１）溶液（Ｃｙｓ又はＭｅｔを含有するペプチドの場合）で２５℃にて２時間処理することによって行った。ＴＦＡに溶解した固定されていないペプチドを－２０℃に冷却したエーテル中で沈殿させ、水中の４０％アセトニトリル溶液に再溶解し、凍結乾燥した。続いて、Ｇｏｎｚａｌｅｚらによって記載された処理によって配列を検証した［Gonzalez,J.,et al.,Effect of the position of a basic amino acid on C-terminal rearrangement of protonated peptides upon collision-induced dissociation.J Mass Spectrom,1996.31(2):p.150-8.］。ナノスプレーイオン化源を備えたＱ－Ｔｏｆ１又はＱ－Ｔｏｆ２直交ハイブリッド構成分光計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）でＥＳＩ－ＭＳスペクトルを得た。ヨウ化ナトリウム及びヨウ化セシウム溶液を、分光計の較正のための基準として使用した。マススペクトルの処理には、Ｍａｓｓｌｙｎｘバージョン３．５プログラム（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、英国）を用いた。最後に、設計された配列に対応するペプチドの分取精製を行った。分取ＲＰ－ＨＰＬＣ精製をＬａｂＣｈｒｏｍ装置（Merck Hitachi、ドイツ）で行った。ＲＰ－Ｃ１８（Ｖｙｄａｃ、２５×２５０ｍｍ、２５μｍ）のカラムを使用し、５ｍＬ／分の流量で５０分間、移動相Ｂの１５～４５％の直線勾配から分離を行った。移動相Ａ：水中０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）、移動相Ｂ：アセトニトリル中０．０５％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）の組成を用いた。５０ｍｇの各粗ペプチドを注入した。クロマトグラムは波長２２６ｎｍで取得した。
【0028】
例２．
ＭＤＲに対するインビトロでの抗菌効果の評価
エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及び大腸菌（Escherichia coli）の臨床細菌分離株から、ＬＢ寒天ウェッジ上で、ミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨ）にｈｏｅを播種し、１８０ｒｐｍで一晩軌道振盪しながら３７℃で増殖させた。その後、５ｍＬのＭＨに１００μＬの増殖物を接種することによってワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）を調製し、３７℃で２時間又は３時間インキュベートした。培養物が０．４５～０．５５の間の６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）に達したとき、増殖は停止した。このＯＤ範囲では、培養物は１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度であると考えられる［Ericksen,B.,et al.,Antibacterial activity and specificity of the six human {alpha}-defensins.Antimicrob Agents Chemother,2005.49(1):p.269-75］。細菌懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、これをワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）として使用した。ペプチドを滅菌ＰＢに所望の濃度に溶解し、５０μＬを滅菌９６ウェルポリプロピレンプレート（Eppendorf、ドイツ）に適用した。ペプチドの２倍連続希釈物（二重反復）をＰＢ中で作製し、５０μＬのワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）を各ウェルに適用した。プレートを３７℃で２時間インキュベートして、ペプチドと細菌膜との相互作用を可能にした。続いて、１００μＬの二重濃縮ＭＨ培地を全てのウェルに添加し、マイクロプレートリーダ（BioTek Instruments、米国）を使用して３７℃で１５時間、５分ごとに６５０ｎｍでＯＤを記録することによって、微生物増殖を速度論的に追跡した。最後に、増殖曲線を分析し、データの数学的処理により、ＣＦＵに関してペプチド濃度と生存率との間の関係を得ることができた。データをＬｏｇ［ペプチド］型対ＯＤの応答の式に当てはめることによって、微生物増殖の９０％の致死濃度（ＬＣ９０）を決定することが可能である（表１）。このようにして、臨床分離株由来の多剤耐性グラム陰性及びグラム陽性微生物の株に対する各配列についての細菌培養物のＣＬ９０の３回の個々の実験の平均を報告する。
表１．臨床分離株由来の多剤耐性株（ＥＳＫＡＰＥ群由来）に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３の細菌培養物の９０％の致死濃度（ＬＣ９０）で表した値。値は、独立した実験から得られた濃度の範囲を表す。
例３．
細胞傷害性評価
ＭＤＲに対するインビトロでの抗菌効果の評価
エンテロコッカスフェシウム（Enterococcus faecium）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）、アシネトバクターバウマンニ（Acinetobacter baumannii）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、及び大腸菌（Escherichia coli）の臨床細菌分離株から、ＬＢ寒天ウェッジ上で、ミューラー・ヒントン液体培地（ＭＨ）にｈｏｅを播種し、１８０ｒｐｍで一晩軌道振盪しながら３７℃で増殖させた。その後、５ｍＬのＭＨに１００μＬの増殖物を接種することによってワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）を調製し、３７℃で２時間又は３時間インキュベートした。培養物が０．４５～０．５５の間の６５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ）に達したとき、増殖は停止した。このＯＤ範囲では、培養物は１０８ＣＦＵ／ｍＬの濃度であると考えられる［Ericksen,B.,et al.,Antibacterial activity and specificity of the six human {alpha}-defensins.Antimicrob Agents Chemother,2005.49(1):p.269-75］。細菌懸濁液をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈し、これをワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）として使用した。ペプチドを滅菌ＰＢに所望の濃度に溶解し、５０μＬを滅菌９６ウェルポリプロピレンプレート（Eppendorf、ドイツ）に適用した。ペプチドの２倍連続希釈物（二重反復）をＰＢ中で作製し、５０μＬのワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）を各ウェルに適用した。プレートを３７℃で２時間インキュベートして、ペプチドと細菌膜との相互作用を可能にした。続いて、１００μＬの二重濃縮ＭＨ培地を全てのウェルに添加し、マイクロプレートリーダ（BioTek Instruments、米国）を使用して３７℃で１５時間、５分ごとに６５０ｎｍでＯＤを記録することによって、微生物増殖を速度論的に追跡した。最後に、増殖曲線を分析し、データの数学的処理により、ＣＦＵに関してペプチド濃度と生存率との間の関係を得ることができた。データをＬｏｇ［ペプチド］型対ＯＤの応答の式に当てはめることによって、微生物増殖の９０％の致死濃度（ＬＣ９０）を決定することが可能である（表１）。このようにして、臨床分離株由来の多剤耐性グラム陰性及びグラム陽性微生物の株に対する各配列についての細菌培養物のＣＬ９０の３回の個々の実験の平均を報告する。
表１．臨床分離株由来の多剤耐性株（ＥＳＫＡＰＥ群由来）に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３の細菌培養物の９０％の致死濃度（ＬＣ９０）で表した値。値は、独立した実験から得られた濃度の範囲を表す。
【表1】
例３．
細胞傷害性評価
【0029】
ペプチドの溶血活性をウィスターラット赤血球で評価した。採取した血液に、採取装置（Monovette、Sarstedt、ドイツ）内でヘパリンを補充した。血液を１０００×ｇで１０分間２５℃で遠心分離し（Ｈｅｔｔｉｃｈ、ドイツ）、赤血球ペレットを滅菌生理食塩水で連続して３回洗浄した。血漿を含まない赤血球を生理食塩水で希釈して、４％（ｖ／ｖ）の最終濃度にした。各ペプチドの２倍連続希釈物を等量の赤血球と混合し、Ｕ底マイクロプレート（Sero-Wel、Bibby Sterilin、英国）中３７℃で１時間インキュベートした。０．１％（ｖ／ｖ）のＰＢＳ及びＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００を、それぞれ０％及び１００％溶血の対照として使用した。インキュベーションが終了したら、プレートを１０００ｇで５分間遠心分離し、上清を平底ポリスチレンマイクロプレートに移し、赤血球によるヘモグロビンの放出を示す５４０ｎｍでの吸光度を測定した。溶血率（％Ｈ）を、２回の独立した反復から式１に従って計算し、式中、Ｈ０％及びＨ１００％は、それぞれＰＢＳ及びＴｒｉｔｏｎＸ－１００を用いた対照のＡｂｓ５４０ｎｍに対応し、各ペプチド濃度について得られたＡｂｓ５４０ｎｍの値のＨペプチドに対応する。
【数1】
【0030】
同様に、Ｈｅｐ２細胞における配列番号１～３によって表されるペプチドの細胞傷害効果を決定した。完全にコンフルエントな細胞単層（１×１０５細胞／ウェル）を４８時間後に播種した９６ウェルプレートを使用した。増殖培地をプレートから除去し、ＳＦＢＩを含まない培養培地に溶解した１００μＬのペプチドを６．２５μＭ～１００μＭの異なる濃度でウェルあたり添加した。評価するペプチドの濃度ごとに６つのウェルを使用し、残りのウェル（６）には、ＳＦＢＩを含まない培養培地１００μＬを添加し、後者は細胞対照を構成した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で７２時間インキュベートし、毎日観察して、細胞傷害性を示す細胞単層の可能性のある形態学的変化を決定した。この後、生細胞中の活性ミトコンドリア酵素によるＭＴＴ化合物の減少に基づく比色アッセイを使用して、全てのウェルにおいて細胞生存率を決定した［Mosmann,T.,Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxicity assays.J Immunol Methods,1983.65(1-2):p.55-63］。ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍＬの濃度の１０μＬのＭＴＴ溶液を各ウェルに添加した。細胞を再び、遮光して、５％ＣＯ２雰囲気中、３７℃で４時間インキュベートした。その後、培地の全内容物をプレートから除去し、上清を濾紙上に慎重にデカントした。形成された沈殿物を、１００μＬの無水ＤＭＳＯを各ウェルに添加し、プレートを５分間慎重に振盪することによって再懸濁した。プレートの吸光度を、統合プログラムＧｅｎ５バージョン２．００．１８を備えたＥＬＸ８０８マルチウェルプレート分光光度計（BIOTEK、米国）において、６３０ｎｍの参照フィルターを用いて５４０ｎｍで読み取った。ペプチドの各濃度に関連する細胞生存率を以下のように計算した。
ＡｂｓＣＴ：ペプチドで処理した細胞培養物の平均吸光度値。ＡｂｓＣＣ：１００％細胞生存率とみなされる細胞対照の平均吸光度値。各ペプチド濃度について二重反復でアッセイを実施した。図は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドのインビトロ細胞傷害性アッセイの２つの変異体を示す。
【数2】
ＡｂｓＣＴ：ペプチドで処理した細胞培養物の平均吸光度値。ＡｂｓＣＣ：１００％細胞生存率とみなされる細胞対照の平均吸光度値。各ペプチド濃度について二重反復でアッセイを実施した。図は、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドのインビトロ細胞傷害性アッセイの２つの変異体を示す。
【0031】
例４．
時間死滅の評価。
この方法は、初期細菌濃度ＣＦＵの少なくとも３ｌｏｇ（１０００倍）の減少を達成するために、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチド、並びに抗生物質メロペネム及びシプロフロキサシンによって必要とされる時間の決定に基づく。時間依存性死を、文献［１２］に記載されているように、わずかな修正を加えて、緑膿菌（P.aeruginosa）（ＡＴＣＣ９０２７）及びクレブシエラニューモニエ（K.pneumoniae）（ＡＴＣＣ１００３）菌株に対して評価した。細菌のワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）（１×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を、最終容量１ｍｌ（ｖ／ｖ）で、試験する株について示されるＭＩＣの２倍の濃度の全ての抗菌剤に曝露した。抗菌剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の接種材料を対照とみなした。接種後、全ての懸濁液を３７℃でインキュベートした。培養物の１００μｌアリコートを異なる所定時間（５、１０、１５、２０、３０、６０、９０、及び１２０分）で取り出し、これを滅菌ＰＢＳで１００倍希釈し、ミューラー・ヒントン寒天プレート上に広げた。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、総コロニー数を数えることによって細胞生存を決定した。ＣＦＵ対時間曲線を各ペプチド化合物について構築し、参照抗生物質と比較した。細菌死時間は、グラム陰性株の感受性対照として使用される既存の抗生物質よりも設計された配列では短い。
時間死滅の評価。
この方法は、初期細菌濃度ＣＦＵの少なくとも３ｌｏｇ（１０００倍）の減少を達成するために、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチド、並びに抗生物質メロペネム及びシプロフロキサシンによって必要とされる時間の決定に基づく。時間依存性死を、文献［１２］に記載されているように、わずかな修正を加えて、緑膿菌（P.aeruginosa）（ＡＴＣＣ９０２７）及びクレブシエラニューモニエ（K.pneumoniae）（ＡＴＣＣ１００３）菌株に対して評価した。細菌のワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）（１×１０５ＣＦＵ／ｍＬ）を、最終容量１ｍｌ（ｖ／ｖ）で、試験する株について示されるＭＩＣの２倍の濃度の全ての抗菌剤に曝露した。抗菌剤を含まないＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の接種材料を対照とみなした。接種後、全ての懸濁液を３７℃でインキュベートした。培養物の１００μｌアリコートを異なる所定時間（５、１０、１５、２０、３０、６０、９０、及び１２０分）で取り出し、これを滅菌ＰＢＳで１００倍希釈し、ミューラー・ヒントン寒天プレート上に広げた。プレートを３７℃で２４時間インキュベートし、総コロニー数を数えることによって細胞生存を決定した。ＣＦＵ対時間曲線を各ペプチド化合物について構築し、参照抗生物質と比較した。細菌死時間は、グラム陰性株の感受性対照として使用される既存の抗生物質よりも設計された配列では短い。
【0032】
例５．
単球活性化試験（ＭＡＴ）によるＬＰＳの中和活性の評価。
この方法は、炎症促進性応答を生じる剤によって誘導された全血培養物中に放出された炎症促進性サイトカインの決定に基づく。ＬＰＳを炎症促進性応答の主な誘導物質として使用した。配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドの影響を決定するために、ＬＰＳの存在下及び／又は非存在下でのエクスビボシステムにおいて、ＩＬ－６サイトカインの放出をＥＬＩＳＡによって決定した。このために、全血培養物を、０．２５ＥＵ．／ｍＬの固定濃度のＬＰＳ（スパイク）の存在下及び非存在下で、０．０５～５０ｎＭをカバーするペプチドの一連の希釈物と共にＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、米国）中でインキュベートした。培養物をＵｌｔｉｍａＩＩインキュベータ（Revco Products、米国）中、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。続いて、５０μＬのサンプルを抽出し、サイトカイン濃度を、各サイトカインについての標準及び各サイトカインに対する捕捉抗体及びビオチン化モノクローナル抗体を使用して決定した。０．０５ＥＵ／ｍＬ～２０００ＥＵ／ｍＬの範囲の国際ＬＰＳ標準の曲線とＲＰＭＩ中の全血との共インキュベーションを同じプレートで行った。試験を三重反復で行い、得られた値の平均値及び標準偏差を、GraphPad Prism vプログラム．５．０（GraphPad Software,Inc.、米国）を用いて計算した。各試験条件（配列番号１～３に対応するペプチドを含む及び含まないＬＰＳ）で得られたサイトカイン放出値を比較するために、多重スチューデント検定を使用した。ＬＰＳと共インキュベートした異なる濃度のペプチドとＬＰＳ対照との間の効果を比較するために、単純分類ＡＮＯＶＡを使用し、続いてダネットの多重比較検定を使用した。
単球活性化試験（ＭＡＴ）によるＬＰＳの中和活性の評価。
この方法は、炎症促進性応答を生じる剤によって誘導された全血培養物中に放出された炎症促進性サイトカインの決定に基づく。ＬＰＳを炎症促進性応答の主な誘導物質として使用した。配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドの影響を決定するために、ＬＰＳの存在下及び／又は非存在下でのエクスビボシステムにおいて、ＩＬ－６サイトカインの放出をＥＬＩＳＡによって決定した。このために、全血培養物を、０．２５ＥＵ．／ｍＬの固定濃度のＬＰＳ（スパイク）の存在下及び非存在下で、０．０５～５０ｎＭをカバーするペプチドの一連の希釈物と共にＲＰＭＩ－１６４０培地（Ｓｉｇｍａ、米国）中でインキュベートした。培養物をＵｌｔｉｍａＩＩインキュベータ（Revco Products、米国）中、３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。続いて、５０μＬのサンプルを抽出し、サイトカイン濃度を、各サイトカインについての標準及び各サイトカインに対する捕捉抗体及びビオチン化モノクローナル抗体を使用して決定した。０．０５ＥＵ／ｍＬ～２０００ＥＵ／ｍＬの範囲の国際ＬＰＳ標準の曲線とＲＰＭＩ中の全血との共インキュベーションを同じプレートで行った。試験を三重反復で行い、得られた値の平均値及び標準偏差を、GraphPad Prism vプログラム．５．０（GraphPad Software,Inc.、米国）を用いて計算した。各試験条件（配列番号１～３に対応するペプチドを含む及び含まないＬＰＳ）で得られたサイトカイン放出値を比較するために、多重スチューデント検定を使用した。ＬＰＳと共インキュベートした異なる濃度のペプチドとＬＰＳ対照との間の効果を比較するために、単純分類ＡＮＯＶＡを使用し、続いてダネットの多重比較検定を使用した。
【0033】
設計された配列は、全血培養物中のＬＰＳによって媒介される炎症促進性サイトカイン（ＩＬ－６）の発現の阻害活性を示す。
【0034】
例６．
ＬＡＬ ＰＹＲＯＣＨＲＯＭＥ発色アッセイによるＬＰＳの中和活性の評価。
ペプチドの中和活性は、ＬＡＬ速度論的発色アッセイ（ＰＹＲＯＣＨＲＯＭＥ（登録商標）、ＡＣＣ、米国）を使用して、細菌エンドトキシン（ＬＰＳ）に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表される。ＡＣＣ、米国から供給された全てのパイロジェンフリー材料を使用して試験を実施した。試験条件は、製造業者の指示に従った。評価すべきペプチドを、０．５ＥＵ／ｍｌの一定のエンドトキシンチャレンジ（ＬＰＳ）を用いて、２０μＭの初期濃度から一連の１：１０希釈（ｖ／ｖ）で試験した。異なるペプチド濃度及びＬＰＳチャレンジを、非発熱性マイクロプレート（ＡＣＣ、米国）中、３７℃で５分間インキュベートした。続いて、ＬＡＬ試薬を添加し、反応速度を、マイクロプレート分光光度計において３７℃で１５秒間隔で１時間、４５０ｎｍで測定した。黄色の発色の出現は、ＬＡＬに含まれる発色基質からのｐ－ニトロアニリンの放出によるものであり、これはサンプル中の遊離ＬＰＳの存在によってのみ加水分解され、基質の加水分解をもたらす酵素カスケードを活性化する。ＫＣ４ソフトウェアを使用して、評価したペプチドによって中和又は隔離されていない遊離又は活性ＬＰＳの量に変換されるＬＰＳ回収率を得た。
ＬＡＬ ＰＹＲＯＣＨＲＯＭＥ発色アッセイによるＬＰＳの中和活性の評価。
ペプチドの中和活性は、ＬＡＬ速度論的発色アッセイ（ＰＹＲＯＣＨＲＯＭＥ（登録商標）、ＡＣＣ、米国）を使用して、細菌エンドトキシン（ＬＰＳ）に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表される。ＡＣＣ、米国から供給された全てのパイロジェンフリー材料を使用して試験を実施した。試験条件は、製造業者の指示に従った。評価すべきペプチドを、０．５ＥＵ／ｍｌの一定のエンドトキシンチャレンジ（ＬＰＳ）を用いて、２０μＭの初期濃度から一連の１：１０希釈（ｖ／ｖ）で試験した。異なるペプチド濃度及びＬＰＳチャレンジを、非発熱性マイクロプレート（ＡＣＣ、米国）中、３７℃で５分間インキュベートした。続いて、ＬＡＬ試薬を添加し、反応速度を、マイクロプレート分光光度計において３７℃で１５秒間隔で１時間、４５０ｎｍで測定した。黄色の発色の出現は、ＬＡＬに含まれる発色基質からのｐ－ニトロアニリンの放出によるものであり、これはサンプル中の遊離ＬＰＳの存在によってのみ加水分解され、基質の加水分解をもたらす酵素カスケードを活性化する。ＫＣ４ソフトウェアを使用して、評価したペプチドによって中和又は隔離されていない遊離又は活性ＬＰＳの量に変換されるＬＰＳ回収率を得た。
【0035】
例７．
細菌生存に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表される異なるペプチド変異体間の組合せから得られる抗菌効果の評価。
抗生物質に多剤耐性であるグラム陰性菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びグラム陽性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の臨床分離株由来の株のみを選択して、ペプチド間の組合せ試験を行った。実験は、「チェッカーボード」として記載された試験又はチェッカーボードの方法に従って実施された［Huang,R.-y.,et al.,Isobologram Analysis:A Comprehensive Review of Methodology and Current Research.Frontiers in Pharmacology,2019.10:p.1222］この試験は、相乗作用（ＦＩＣＩ≦０．５）、相加作用（０．５＜ＦＩＣＩ≦１）、不関作用（１＜ＦＩＣＩ≦２）及び拮抗作用（ＦＩＣＩ＞２）のように得られる効果の分類を確立する式３に従った分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）の決定を可能にする。
式中、ＭＩＣＡ：化合物Ａの最小発育阻止濃度；ＭＩＣＢ：化合物Ｂの最小発育阻止濃度；ＭＩＣＡＢ：Ｂと組み合わさって増殖を阻害するＡの最小濃度；ＭＩＣＢＡ：Ａと組み合わさって増殖を阻害するＢの最小濃度。チェッカーボード実験は、滅菌９６ウェルポリプロピレンプレート（Eppendorf、ドイツ）で行った。各細菌の単離コロニーを使用して、ＰＢＳ中で１×１０５ＣＦＵ細菌培養物を作成し、これをワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）と呼んだ。さらに、ペプチドの６４μＭストック溶液をＰＢＳ中で調製した。各ペプチドのＰＢＳでの２倍希釈を５０μＬの最終容量で行った。ペプチドＡを列（２～１１）に配置し、ペプチドＢをプレートの行（Ｂ～Ｆ）に配置した。このようにして、ペプチドＡ（０．２５～１６μＭ）とペプチドＢ（０．０７５～１６μＭ）との間のペプチド濃度の組合せのために、プレートの６０個の内部ウェルを使用した。最初の列及び最後の行は、それぞれ組み合わされていないＡペプチド及びＢペプチドの濃度に対応していた。細菌増殖の対照として、５０μＬのＰＢＳをプレートの列及び外側の行の全てのウェルに添加した。その後、５０μＬのワーキング細菌培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）を全てのウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。最後に、１００μＬの二重濃縮ＭＨブロス（ＭＨＢ）を全てのウェルに分注し、プレート分光光度計（BioTek Instruments、米国）で、３７℃で１５時間、６５０ｎｍでＯＤを測定し、５分間隔でＯＤ値を記録することによって、微生物増殖を速度論的に追跡した。細菌増殖阻害（ＭＩＣ）値は、プレートの最も外側のウェルでインキュベートしたＭＨＢ培地のブランク（対照）と同様の値とした。以下の表は、３つの独立した実験で得られた結果の平均を示す。
表２．配列番号１、配列番号２及び配列番号３に含まれるペプチド配列間の組合せで証明される相乗作用をチェックするチェッカーボード試験。
細菌生存に対する配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表される異なるペプチド変異体間の組合せから得られる抗菌効果の評価。
抗生物質に多剤耐性であるグラム陰性菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びグラム陽性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の臨床分離株由来の株のみを選択して、ペプチド間の組合せ試験を行った。実験は、「チェッカーボード」として記載された試験又はチェッカーボードの方法に従って実施された［Huang,R.-y.,et al.,Isobologram Analysis:A Comprehensive Review of Methodology and Current Research.Frontiers in Pharmacology,2019.10:p.1222］この試験は、相乗作用（ＦＩＣＩ≦０．５）、相加作用（０．５＜ＦＩＣＩ≦１）、不関作用（１＜ＦＩＣＩ≦２）及び拮抗作用（ＦＩＣＩ＞２）のように得られる効果の分類を確立する式３に従った分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）の決定を可能にする。
【数3】
式中、ＭＩＣＡ：化合物Ａの最小発育阻止濃度；ＭＩＣＢ：化合物Ｂの最小発育阻止濃度；ＭＩＣＡＢ：Ｂと組み合わさって増殖を阻害するＡの最小濃度；ＭＩＣＢＡ：Ａと組み合わさって増殖を阻害するＢの最小濃度。チェッカーボード実験は、滅菌９６ウェルポリプロピレンプレート（Eppendorf、ドイツ）で行った。各細菌の単離コロニーを使用して、ＰＢＳ中で１×１０５ＣＦＵ細菌培養物を作成し、これをワーキング培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｃｕｌｔｕｒｅ）と呼んだ。さらに、ペプチドの６４μＭストック溶液をＰＢＳ中で調製した。各ペプチドのＰＢＳでの２倍希釈を５０μＬの最終容量で行った。ペプチドＡを列（２～１１）に配置し、ペプチドＢをプレートの行（Ｂ～Ｆ）に配置した。このようにして、ペプチドＡ（０．２５～１６μＭ）とペプチドＢ（０．０７５～１６μＭ）との間のペプチド濃度の組合せのために、プレートの６０個の内部ウェルを使用した。最初の列及び最後の行は、それぞれ組み合わされていないＡペプチド及びＢペプチドの濃度に対応していた。細菌増殖の対照として、５０μＬのＰＢＳをプレートの列及び外側の行の全てのウェルに添加した。その後、５０μＬのワーキング細菌培養物（ｗｏｒｋｉｎｇ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）を全てのウェルに添加し、プレートを３７℃で２時間インキュベートした。最後に、１００μＬの二重濃縮ＭＨブロス（ＭＨＢ）を全てのウェルに分注し、プレート分光光度計（BioTek Instruments、米国）で、３７℃で１５時間、６５０ｎｍでＯＤを測定し、５分間隔でＯＤ値を記録することによって、微生物増殖を速度論的に追跡した。細菌増殖阻害（ＭＩＣ）値は、プレートの最も外側のウェルでインキュベートしたＭＨＢ培地のブランク（対照）と同様の値とした。以下の表は、３つの独立した実験で得られた結果の平均を示す。
表２．配列番号１、配列番号２及び配列番号３に含まれるペプチド配列間の組合せで証明される相乗作用をチェックするチェッカーボード試験。
【表2】
【0036】
例８
分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）を表すことによる、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドと抗生物質メロペネムとの組合せにおける相乗作用の評価。
チェッカーボード法を使用して、臨床分離株由来の多剤耐性細菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対するメロペネムと配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドとの間の相乗作用を評価した。使用したチェッカーボード法の手順は、例７に記載したものと同様である。この場合、メロペネムを化合物Ａとして、ペプチドを化合物Ｂとして試験した。表３に示す結果は、特定された分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）（fractional inhibitory concentration index）に基づき、以下の分類に従っている：相乗作用（ＦＩＣＩ≦０．５）、相加作用（０．５＜ＦＩＣＩ≦１）、不関作用（１＜ＦＩＣＩ≦２）及び拮抗作用（ＦＩＣＩ＞２）。全てのハイブリッド変異体は、抗生物質に対するグラム陰性菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びグラム陽性多剤耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の臨床分離株に対してメロペネムと組み合わせた場合に相乗的抗菌効果を生じる（表３）。
表３．配列番号１、配列番号２及び配列番号３とメロペネム（カルバペネム）との組合せで証明される相乗作用を検証するチェッカーボード試験。
分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）を表すことによる、配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドと抗生物質メロペネムとの組合せにおける相乗作用の評価。
チェッカーボード法を使用して、臨床分離株由来の多剤耐性細菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoneae）及び黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対するメロペネムと配列番号１、配列番号２及び配列番号３によって表されるペプチドとの間の相乗作用を評価した。使用したチェッカーボード法の手順は、例７に記載したものと同様である。この場合、メロペネムを化合物Ａとして、ペプチドを化合物Ｂとして試験した。表３に示す結果は、特定された分画阻害濃度指数（ＦＩＣＩ）（fractional inhibitory concentration index）に基づき、以下の分類に従っている：相乗作用（ＦＩＣＩ≦０．５）、相加作用（０．５＜ＦＩＣＩ≦１）、不関作用（１＜ＦＩＣＩ≦２）及び拮抗作用（ＦＩＣＩ＞２）。全てのハイブリッド変異体は、抗生物質に対するグラム陰性菌クレブシエラニューモニエ（Klebsiella pneumoniae）及びグラム陽性多剤耐性黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）の臨床分離株に対してメロペネムと組み合わせた場合に相乗的抗菌効果を生じる（表３）。
表３．配列番号１、配列番号２及び配列番号３とメロペネム（カルバペネム）との組合せで証明される相乗作用を検証するチェッカーボード試験。
【表3】
【配列表フリーテキスト】
【0037】
配列表１ ＜２２３＞合成構築物
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
配列表２ ＜２２３＞合成構築物
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
配列表３ ＜２２３＞ハイブリッドペプチドに対する合成変異体
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
配列表２ ＜２２３＞合成構築物
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
配列表３ ＜２２３＞ハイブリッドペプチドに対する合成変異体
＜２２３＞Ｘａａ＝少なくとも４つのＡｒｇ残基を有する、Ｌ又はＤコンフォメーションにおけるＡｒｇ又はＬｙｓ
＜２２３＞アミド化
【図1-1】
【図1-2】
【図1-3】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】