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特表2024-508207がんに対する組み合わせ治療におけるＬＴＢＲアゴニスト
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-26
(54)【発明の名称】がんに対する組み合わせ治療におけるＬＴＢＲアゴニスト
(51)【国際特許分類】
A61K 45/06 20060101AFI20240216BHJP
C07K 16/28 20060101ALI20240216BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240216BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240216BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240216BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240216BHJP
【ＦＩ】
A61K45/06
C07K16/28
C07K16/46
A61P35/00
A61P43/00 121
A61K39/395 D
A61K39/395 N
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533647
(86)(22)【出願日】2021-11-30
(85)【翻訳文提出日】2023-07-31
(86)【国際出願番号】 EP2021083595
(87)【国際公開番号】W WO2022117572
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】20211335.3
(32)【優先日】2020-12-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(31)【優先権主張番号】21166846.2
(32)【優先日】2021-04-02
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＷＥＥＮ
(71)【出願人】
【識別番号】514185600
【氏名又は名称】ブイアイビー ブイゼットダブリュ
【氏名又は名称原語表記】ＶＩＢ ＶＺＷ
【住所又は居所原語表記】Ｓｕｚａｎｎｅ Ｔａｓｓｉｅｒｓｔｒａａｔ １，９０５２ Ｇｅｎｔ，Ｂｅｌｇｉｕｍ
(71)【出願人】
【識別番号】512320560
【氏名又は名称】カトリック ユニヴェルシテット ルーヴェン
(71)【出願人】
【識別番号】596099561
【氏名又は名称】ブレイエ・ユニバージテイト・ブリュッセル
【氏名又は名称原語表記】ＶＲＩＪＥ ＵＮＩＶＥＲＳＩＴＥＩＴ ＢＲＵＳＳＥＬ
(74)【代理人】
【識別番号】110003971
【氏名又は名称】弁理士法人葛和国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ベルガース，ガブリエレ
(72)【発明者】
【氏名】アレン，エリザベス
(72)【発明者】
【氏名】ドムブレヒト，ブルノ
(72)【発明者】
【氏名】メールシース，パスカル
(72)【発明者】
【氏名】ヴァン ギンデラーヒター，ジョー
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4C084AA02
4C084AA03
4C084AA20
4C084MA02
4C084NA14
4C084ZB261
4C084ZB262
4C084ZC751
4C085AA13
4C085BB31
4C085CC22
4C085DD61
4C085EE03
4C085GG01
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本発明は、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせに関する。かかる組み合わせは、がんの処置における使用のために特に有用である。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下：－ リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）アゴニスト；および
－ 調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）枯渇剤
を含む、組み合わせ。
【請求項2】
Ｔｒｅｇ枯渇剤が、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有する、請求項１に記載の組み合わせ。
【請求項3】
Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーが、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３からなる群より選択される、請求項２に記載の組み合わせ。
【請求項4】
Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーが、ＣＣＲ８またはＣＴＬＡ４である、請求項２または３に記載の組み合わせ。
【請求項5】
Ｔｒｅｇ枯渇剤の細胞傷害活性が、－ 抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか、
－ 補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、
－ 抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、
－ 細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞に結合してこれを活性化するか、または
－ 細胞傷害性ペイロードを含む、
細胞傷害性部分の存在により引き起こされる、請求項２～４のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項6】
細胞傷害性部分が、例えば、脱フコシル化を通して、またはＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増大させる変異を含むことにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分、特にＦｃ領域部分を含む、請求項５に記載の組み合わせ。
【請求項7】
Ｔｒｅｇ枯渇剤が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性を有するＣＣＲ８に結合する抗体である、請求項１～６のいずれか一項に記載の組み合わせ。
【請求項8】
請求項１～７のいずれか一項に記載の組み合わせを含む、組成物。
【請求項9】
ＬＴＢＲアゴニスト性部分およびＴｒｅｇを枯渇させる部分を含む、二重特異性分子であって、細胞傷害活性を有する、前記二重特異性分子。
【請求項10】
医薬としての使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の組み合わせ、請求項８に記載の組成物、または請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項11】
がんの処置における使用のための、請求項１～７のいずれか一項に記載の組み合わせ、請求項８に記載の組成物、または請求項９に記載の二重特異性分子。
【請求項12】
がんが、乳癌、子宮体癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、結腸直腸癌、および腎臓癌からなる群より選択される、請求項１１に記載の使用のための組み合わせ、組成物、または二重特異性分子。
【請求項13】
がんの処置における使用のためのＬＴＢＲアゴニストであって、処置が、Ｔｒｅｇ枯渇治療をさらに含む、前記ＬＴＢＲアゴニスト。
【請求項14】
請求項１３に記載の使用のためのＬＴＢＲアゴニストであって、ここで、ＬＴＢＲアゴニストが、ＬＴＢＲアゴニスト性抗体であり；かつ
ここで、Ｔｒｅｇ枯渇治療が、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するＣＣＲ８に結合する抗体の投与を含む、
前記ＬＴＢＲアゴニスト。
【請求項15】
がんの処置における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤であって、処置が、ＬＴＢＲアゴニストの投与をさらに含む、前記Ｔｒｅｇ枯渇剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
発明の分野
本発明は、リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）アゴニストおよび調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）枯渇剤を含む組み合わせ、ならびにかかる組み合わせを含む組成物に関する。本発明は、がんの処置における組み合わせ治療において、特に有用である。
本発明は、リンフォトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）アゴニストおよび調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）枯渇剤を含む組み合わせ、ならびにかかる組み合わせを含む組成物に関する。本発明は、がんの処置における組み合わせ治療において、特に有用である。
【背景技術】
【0002】
発明の背景
Ｔｒｅｇ細胞は、適応免疫系の不可欠な構成成分の１つであり、それにより、それらは、自己抗原に対する寛容性を維持すること、および自己免疫疾患を予防することに寄与する。しかし、Ｔｒｅｇ細胞はまた、多くの異なるがんの腫瘍微小環境において高度に濃縮されていることが見出される。腫瘍微小環境において、Ｔｒｅｇ細胞は、主要関連抗原（ＴＡＡ）特異的Ｔ細胞免疫を低下させ、それにより効果的な抗腫瘍活性を妨げることにより、免疫回避に寄与する。Ｔｒｅｇ細胞による高い腫瘍浸潤は、したがって、しばしば、がん患者における浸潤性の表現型および予後不良と関連する。
Ｔｒｅｇ細胞は、適応免疫系の不可欠な構成成分の１つであり、それにより、それらは、自己抗原に対する寛容性を維持すること、および自己免疫疾患を予防することに寄与する。しかし、Ｔｒｅｇ細胞はまた、多くの異なるがんの腫瘍微小環境において高度に濃縮されていることが見出される。腫瘍微小環境において、Ｔｒｅｇ細胞は、主要関連抗原（ＴＡＡ）特異的Ｔ細胞免疫を低下させ、それにより効果的な抗腫瘍活性を妨げることにより、免疫回避に寄与する。Ｔｒｅｇ細胞による高い腫瘍浸潤は、したがって、しばしば、がん患者における浸潤性の表現型および予後不良と関連する。
【0003】
腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の重要性、および抗腫瘍免疫を阻害することにおけるそれらの潜在的な役割を認めることにより、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇ細胞を調節するための複数の戦略が提案されてきた。いくつかの研究は、Ｔｒｅｇを枯渇させることは、腫瘍免疫を増強し、重要な治療上の利益を提供することを示してきた（例えば、Tanaka and Sakaguchi 2019, Eur J Immuno 49:1140-1146を参照）。
【0004】
抗体により媒介される腫瘍Ｔｒｅｇ細胞の殺傷のために、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞上で発現される表面分子は、それらが他のＴ細胞と比較して、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞上で特異的に、またははるかに高いレベルで発現される場合は特に、良好な標的である。例えば、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）は、抑制性Ｔｒｅｇ細胞上で高度に発現される。モガムリズマブ（ＫＷ－０７６１）は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を増大させるために脱フコシル化されたＦｃ領域を有する、抗ＣＣＲ４抗体である。Ｔｒｅｇ上のＣＣＲ４への結合およびそのＡＤＣＣ活性を通して、モガムリズマブは、ＦｏｘＰ３＋ＣＤ４ Ｔｒｅｇを枯渇させることができる（Kurose et al. 2015, J Thorac Oncol 10:74-83およびSugiyama et al. 2013, PNAS 110:17945-17650）。モガムリズマブは、日本および米国において承認されており、単剤治療において、または抗ＰＤ－１もしくは抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせにおいて、モガムリズマブによるいくつかの臨床治験が進行中である。
【0005】
ＣＤ２５は、Ｔｒｅｇ細胞機能の重要な表面の特徴であり、その発現は、Ｆｏｘｐ３により制御される。マウスおよびヒトにおける腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞は、ＣＤ２５を高度に発現する。ＡＤＣＣ活性が増強された抗ＣＤ２５抗体は、腫瘍内Ｔｒｅｇ細胞を効果的に枯渇させ、Ｔｒｅｇ細胞の割当に対するエフェクターを増加させ、確立した腫瘍に対する制御を改善することが示されている（Vargas et al. 2017, Immunity 46:577-586）。同じ著者はまた、抗ＣＤ２５抗体によるＴｒｅｇ枯渇が、ＰＤ－１の遮断と相乗効果を生じることを観察した。
【0006】
別の例として、Ｇタンパク質共役型ＣＣケモカイン受容体タンパク質ＣＣＲ８（ＣＫＲＬ１／ＣＭＫＢＲ８／ＣＭＫＢＲＬ２）およびその天然のリガンドであるＣＣＬ１は、がんと、特に腫瘍環境におけるＴ細胞の調節と関連づけられることが知られている。Eruslanovら（Clin Cancer Res 2013, 17:1670-80）は、ヒトがん組織におけるＣＣＲ８発現の上方調節を示し、原発性のヒト腫瘍が相当な量の天然のＣＣＲ８リガンドであるＣＣＬ１を産生することを示した。このことは、ＣＣＬ１／ＣＣＲ８系が免疫回避に寄与することを示し、ＣＣＲ８シグナルの遮断ががんの処置のための魅力的な戦略であることを示唆する。Hoelzingerら（J Immunol 2010, 184:8633-42）は、同様に、ＣＣＬ１の遮断がＴｒｅｇの抑制性機能を阻害し、Ｔｒｅｇの応答に影響を及ぼすことなく腫瘍免疫を増強することを示す。Wangら（PloSONE 2012, e30793）は、腫瘍浸潤性ＦｏｘＰ３＋Ｔ細胞上でのＣＣＲ８の発現の増大を報告し、ＣＣＲ８を遮断することは、Ｔｒｅｇの腫瘍中への遊走の阻害をもたらし得ることを示唆する。腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ上でのＣＣＲ８の高い、かつ比較的特異的な発現に起因して、がんの処置におけるこのＴｒｅｇ集団の調節および枯渇のために、ＣＣＲ８に対するモノクローナル抗体が用いられてきた（例えば、ＷＯ２０１８１１２０３２ Ａ１およびＷＯ２０１９／１５７０９８ Ａ１）。ＷＯ２０１８／１８１４２５ Ａ１は、抗ＣＣＲ８ｍＡｂによるＴｒｅｇの枯渇は、腫瘍免疫を増強することができることを示した。この効果は、抗ＣＣＲ８抗体によるＴｒｅｇ枯渇を抗ＰＤ－１抗体治療と組み合わせることにより増大し、これはさらに、同じ腫瘍型による再負荷からもマウスを保護したＷＯ２０１８／１８１４２５ Ａ１）。それらの中和活性を通して、これらの抗体は、腫瘍中へのＴｒｅｇの遊走を阻害し、Ｔｒｅｇの抑制性機能を逆転させ、および腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる（ＷＯ２０１９／１５７０９８ Ａ１）。最近、Wangら（Cancer Immunol Immonother 2020、https://doi.org/10.1007/s00262-020-02583-y）は、ＣＣＲ８の遮断は、腫瘍内Ｔｒｅｇを脆弱な表現型へと不安定化させ、同時に抗腫瘍免疫を再活性化し、抗ＰＤ－１の治療上の利益を増大させることができることを示した。
【0007】
ＣＴＬＡ－４は、免疫チェックポイントとして機能するタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ－４の重要な機能は、抗原提示細胞におけるＣＤ８０／８６発現の下方調節により、通常型のＴ細胞の活性化を阻害することである。ＣＴＬＡ－４は、ナイーブなＴｒｅｇ上で構成的に発現されるが、一方で、その発現は、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞において上方調節される。エフェクターおよびＴｒｅｇ細胞の両方の上でのＣＴＬＡ－４の阻害性活性の遮断は、腫瘍退縮を誘導することができる抗腫瘍エフェクターＴ細胞活性の増強をもたらす。Ｔｒｅｇ細胞コンパートメント上での抗ＣＬＴＡ－４抗体の活性は、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の選択的な枯渇を介して媒介され、これは、Ｆｃガンマ受容体を発現するマクロファージを必要とし（Simpson et al. 2013, J Exp Med 210:1695-1710）、増強されたＡＤＣＣ活性は、抗腫瘍応答を増強する（Selby et al. 2013, Cancer Immunol Res 1:32-42）ことが示唆されている。
【0008】
ＣＤ３８は、ＣＤ３８陰性のＴｒｅｇよりも免疫抑制性が高いＴｒｅｇの集団により発現される。ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰ活性を有する抗ＣＤ３８抗体による患者の処置は、ＣＤ３８陽性の免疫抑制性Ｔｒｅｇ細胞を枯渇させた（Krejcik et al. 2016, Bood 128:384-394）。
【0009】
ＴＩＧＩＴは、Ｔｒｅｇのサプレッサー機能を促進するＴｒｅｇ上の共阻害性受容体（coinhibitory receptor）である。ＡＤＣＣ活性を有する抗ＴＩＧＩＴ抗体は、単剤治療において、および抗ＰＤ－１との組み合わせにおいて、Ｔｒｅｇを優先的に枯渇させ、抗腫瘍効力を誘導することが示されている（Leroy et al. 2018, Cancer Res 78(13 Suppl) Abstract LB-114）。
【0010】
Ｔｒｅｇ上のＩＣＯＳ発現は、血液または脾臓におけるものよりも腫瘍微小環境において高く、このことは、優先的な腫瘍内Ｔｒｅｇの枯渇のためのその有用性を示し、これは、マウス腫瘍において確認された（Sainson et al. 2019, https://doi.org/10.1101/771493）。ＭＥＤＩ－５７０およびＫＹ１０４４などのＡＤＣＣ活性を有する抗ＩＣＯＳ抗体は、現在、臨床治験において、単剤治療または抗ＰＤ－Ｌ１抗体との組み合わせ治療において試験されている。
【0011】
ＯＸ－４０、４－１ＢＢおよびＧＩＴＲは、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバーであり、Ｔｒｅｇ細胞構成的に発現され、Ｔ細胞受容体刺激により上方調節されるが、一方、それらは、通常型Ｔ細胞においては、Ｔ細胞受容体刺激の後でのみ、誘導される。抗ＯＸ－４０抗体によるＦｃガンマ受容体を活性化することを介するＴｒｅｇ枯渇は、例えば、Bulliardら（2014, Immunol Cell Biol 92:475-80）により示されている。
【0012】
がん治療における腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞の枯渇は、前臨床および臨床研究において抗腫瘍効力を示したが、一方、治療の効力および期間に関して、さらなる改善がなお必要とされる。
【発明の概要】
【0013】
発明の要旨
本発明者らは、今や、驚くべきことに、請求の範囲において詳述されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせが、上述の必要性を満たすことを見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストが用いられる場合に、相乗効果が観察されることを見出した。本発明の組み合わせは、したがって、改善された腫瘍治療を提供する。
したがって、本発明の目的は、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせを提供することである。
本発明者らは、今や、驚くべきことに、請求の範囲において詳述されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせが、上述の必要性を満たすことを見出した。特に、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストが用いられる場合に、相乗効果が観察されることを見出した。本発明の組み合わせは、したがって、改善された腫瘍治療を提供する。
したがって、本発明の目的は、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせを提供することである。
【0014】
好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有する。
好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１およびＬＡＧ－３からなる群より選択される。
特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＬＴＡ４、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＬＴＡ４、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４；最も好ましくはＣＣＲ８またはＣＴＬＡ４から選択される。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４；最も好ましくはＣＣＲ８から選択される。
好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１およびＬＡＧ－３からなる群より選択される。
特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＬＴＡ４、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＬＴＡ４、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４；最も好ましくはＣＣＲ８またはＣＴＬＡ４から選択される。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４；最も好ましくはＣＣＲ８から選択される。
【0015】
別の好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤の細胞傷害活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、Ｔ細胞に結合してこれを活性化するか、または細胞傷害性ペイロードを含む、細胞傷害性部分の存在により引き起こされる。
本発明の特定の態様において、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含み、特にＦｃ領域部分は、例えば、脱フコシル化を通して、またはＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増大させる変異を含むことにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
本発明の特定の態様において、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含み、特にＦｃ領域部分は、例えば、脱フコシル化を通して、またはＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増大させる変異を含むことにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
【0016】
さらにさらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合し、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性を有する抗体である。さらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性を有するＣＣＲ８に結合する抗体である。
本発明の別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、（ａ）ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するＦｃ領域部分、ならびに（ｂ）Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合する少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。
本発明の別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、（ａ）ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するＦｃ領域部分、ならびに（ｂ）Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合する少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。
【0017】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーの非遮断性結合剤である。
本発明の別の目的は、本発明の組み合わせを含む組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、本発明の組み合わせを含む組成物を提供することである。
【0018】
本発明のさらに別の目的は、ＬＴＢＲアゴニスト性部分およびＴｒｅｇを枯渇させる部分を含む二重特異性分子提供することであって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性、ならびにこれをコードする核酸を有する。
本発明のさらなる目的は、医薬としての使用のための、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、ならびにＬＴＢＲアゴニスト性部分およびＴｒｅｇを枯渇させる部分を含む二重特異性分子提供することであって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性を有する。
本発明のさらなる目的は、医薬としての使用のための、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、ならびにＬＴＢＲアゴニスト性部分およびＴｒｅｇを枯渇させる部分を含む二重特異性分子提供することであって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性を有する。
【0019】
本発明の別の目的は、がんの処置における使用のための、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、ならびにＴｒｅｇを枯渇させる部分およびＬＴＢＲアゴニスト性部分を含む二重特異性分子を提供することであって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性を有する。好ましくは、がんは、乳癌、子宮体癌（uterine corpus cancer）、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、結腸直腸癌、および腎臓癌からなる群より選択される。
本発明のさらに別の目的は、がんの処置における使用のためのＬＴＢＲアゴニスト提供することであって、ここで、処置は、Ｔｒｅｇ細胞枯渇治療をさらに含む。
本発明のさらに別の目的は、がんの処置における使用のためのＬＴＢＲアゴニスト提供することであって、ここで、処置は、Ｔｒｅｇ細胞枯渇治療をさらに含む。
【0020】
特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲアゴニスト性抗体であり；かつ、Ｔｒｅｇ細胞枯渇治療は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するＣＣＲ８に結合する抗体の投与を含む。
本発明のさらなる目的は、がんの処置における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤であって、ここで、処置は、ＬＴＢＲアゴニストの投与をさらに含む。
本発明のさらなる目的は、がんの処置における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤であって、ここで、処置は、ＬＴＢＲアゴニストの投与をさらに含む。
【0021】
Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストに加えて、治療は、さらなる活性成分を含んでもよい。さらなる態様において、さらなる活性成分は、チェックポイント阻害剤である。チェックポイント阻害剤は、チェックポイントタンパク質がそれらのパートナータンパク質に結合して、それにより免疫系の機能を活性化することを遮断する化合物である。好ましくは、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－１およびＢ７－２からなる群より選択されるタンパク質を遮断する。より好ましくは、チェックポイント阻害剤は、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１を遮断する。好ましい例として、抗ＰＤ－１および抗ＰＤ－Ｌ１抗体が挙げられる。本発明における使用のための好ましい免疫チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ＪＴＸ－４０１４、スパルタリズマブ（spartalizumab）、カムレリズマブ（camrelizumab）、シンチリマブ（sintilimab）、チスレリズマブ（tislelizumab）、トリパリマブ（toripalimab）、ドスタルリマブ（dostarlimab）、ＩＮＣＭＧＡ０００１２、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＫＮ０３５、ＡＵＮＰ１２、ＣＫ－３０１、ＣＡ－１７０およびＢＭＳ－９８６１８９から選択される。
【0022】
好適には、本発明における使用によるＴｒｅｇ枯渇剤とチェックポイント阻害剤とは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーおよび免疫チェックポイントに結合する抗体などの、単一の分子中に含まれていてもよい。したがって、特定の態様において、本明細書において記載されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーならびにＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、Ｂ７－１およびＢ７－２からなる群より選択されるタンパク質に結合する二重特異性抗体である。好適には、本明細書において記載されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、セミプリマブ、ＪＴＸ－４０１４、スパルタリズマブ、カムレリズマブ、シンチリマブ、チスレリズマブ、トリパリマブ、ドスタルリマブ、ＩＮＣＭＧＡ０００１２、ＡＭＰ－２２４、ＡＭＰ－５１４、ＫＮ０３５、ＡＵＮＰ１２、ＣＫ－３０１、ＣＡ－１７０およびＢＭＳ－９８６１８９の、ＰＤ－１またはＰＤ－Ｌ１に結合する部分を含んでもよい。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【0024】
【0025】
【0026】
【発明を実施するための形態】
【0027】
発明の詳細な説明
本発明は、以下において、特定の態様に関して、および特定の図面を参照して記載されるであろうが、本発明は、それに限定されない。
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連付けられて用いられる科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するべきである。さらに、文脈により別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。一般に、本明細書において記載される分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学に関連付けられて用いられる命名法、およびこれらの技術は、当該分野において周知であり、一般的に用いられるものである。
本発明は、以下において、特定の態様に関して、および特定の図面を参照して記載されるであろうが、本発明は、それに限定されない。
本明細書において別段に定義されない限り、本発明に関連付けられて用いられる科学的および技術的用語は、当業者により一般的に理解される意味を有するべきである。さらに、文脈により別段に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むべきであり、複数形の用語は、単数形を含むべきである。一般に、本明細書において記載される分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質および核酸の化学に関連付けられて用いられる命名法、およびこれらの技術は、当該分野において周知であり、一般的に用いられるものである。
【0028】
本明細書において前に記載されるとおり、本発明は、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせを提供する。かかる組み合わせは、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストが組み合わせたがん治療として投与される場合に観察される相乗効果に起因して、特に有用である。
【0029】
Ｔｒｅｇ枯渇剤
本明細書において用いられる場合、用語「Ｔｒｅｇ枯渇剤」とは、対象のＴｒｅｇの著しい部分を枯渇させる（deplete）（除去する（ablate））ことができる分子を表す。いくつかの態様において、対象において、Ｔｒｅｇ細胞の大部分が除去される。いくつかの態様において、対象において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％より多くのＴｒｅｇが除去される。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞に結合し、これを枯渇させる。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面の表面マーカーに結合して、その細胞傷害活性を通してその枯渇を誘導することができる分子である。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、組織浸潤性Ｔｒｅｇおよび循環血Ｔｒｅｇなどの他のＴｒｅｇよりも高い程度まで、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、他のＴ細胞より高い程度まで、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる。さらに別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させ、腫瘍微小環境における、好ましくは腫瘍における、Ｔｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の比を増大させる。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇は、単離されたヒトＴｒｅｇまたは腫瘍浸潤性リンパ球を、化合物により、および必要とされる場合にはＮＫ細胞またはＰＢＭＣなどのエフェクター細胞の存在下において、処置すること、ならびに、処置後に生存するＴｒｅｇ細胞の数を分析することにより測定され、これは、本質的には、Pablosら（BMC Immunology 2005, 6:6 doi:10.1186/1471-2172-6-6）により記載されるとおりである。あるいは、および一態様においては補足的に、Ｔｒｅｇ枯渇は、ＰＢＭＣに化合物を添加し、４時間後に生存するＴｒｅｇのレベルを測定することにより、検証してもよい。あるいは、Ｔｒｅｇ枯渇は、ＰＢＭＣを化合物と共にインキュベートし、磁気ビーズを用いて化合物に結合した細胞をキャプチャーし、その後、キャプチャーされない細胞をＦＡＣＳ分析することを通して、検証され、これは、本質的には、Sugiyamaら（Proc Natl Acad Sci U S A 2013 Oct 29;110(44):17945-50. doi: 10.1073/pnas.1316796110）において記載されるとおりとおりである。Ｔｒｅｇ枯渇を決定するための好適なin vivoアッセイは、Ｔｒｅｇを枯渇させる化合物のマウスへの投与の後での、腫瘍浸潤性の免疫細胞の腫瘍ＦＡＣＳ分析を含む。
本明細書において用いられる場合、用語「Ｔｒｅｇ枯渇剤」とは、対象のＴｒｅｇの著しい部分を枯渇させる（deplete）（除去する（ablate））ことができる分子を表す。いくつかの態様において、対象において、Ｔｒｅｇ細胞の大部分が除去される。いくつかの態様において、対象において、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％より多くのＴｒｅｇが除去される。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞に結合し、これを枯渇させる。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面の表面マーカーに結合して、その細胞傷害活性を通してその枯渇を誘導することができる分子である。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、組織浸潤性Ｔｒｅｇおよび循環血Ｔｒｅｇなどの他のＴｒｅｇよりも高い程度まで、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、他のＴ細胞より高い程度まで、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させる。さらに別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、腫瘍内Ｔｒｅｇを枯渇させ、腫瘍微小環境における、好ましくは腫瘍における、Ｔｒｅｇに対するエフェクターＴ細胞の比を増大させる。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇は、単離されたヒトＴｒｅｇまたは腫瘍浸潤性リンパ球を、化合物により、および必要とされる場合にはＮＫ細胞またはＰＢＭＣなどのエフェクター細胞の存在下において、処置すること、ならびに、処置後に生存するＴｒｅｇ細胞の数を分析することにより測定され、これは、本質的には、Pablosら（BMC Immunology 2005, 6:6 doi:10.1186/1471-2172-6-6）により記載されるとおりである。あるいは、および一態様においては補足的に、Ｔｒｅｇ枯渇は、ＰＢＭＣに化合物を添加し、４時間後に生存するＴｒｅｇのレベルを測定することにより、検証してもよい。あるいは、Ｔｒｅｇ枯渇は、ＰＢＭＣを化合物と共にインキュベートし、磁気ビーズを用いて化合物に結合した細胞をキャプチャーし、その後、キャプチャーされない細胞をＦＡＣＳ分析することを通して、検証され、これは、本質的には、Sugiyamaら（Proc Natl Acad Sci U S A 2013 Oct 29;110(44):17945-50. doi: 10.1073/pnas.1316796110）において記載されるとおりとおりである。Ｔｒｅｇ枯渇を決定するための好適なin vivoアッセイは、Ｔｒｅｇを枯渇させる化合物のマウスへの投与の後での、腫瘍浸潤性の免疫細胞の腫瘍ＦＡＣＳ分析を含む。
【0030】
さらに別の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、Ｔｒｅｇの細胞表面において、別のＴ細胞の細胞表面上のマーカーの発現と比較して、過剰発現されるマーカーである。より特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇの細胞表面上で、末梢Ｔｒｅｇ細胞上でのその発現と比較して、過剰発現されるマーカーである。
【0031】
好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３からなる群より選択される。特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４から選択される。
【0032】
したがって、特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣケモカイン受容体４（ＣＣＲ４）である。ＣＣＲ４に結合する抗体であって細胞傷害活性を有するものは、例えば、ＷＯ２０１３１６６５００ Ａ１、ＷＯ２０１６０５７４８８ Ａ１およびＷＯ２０１６１７８７７９ Ａ１において開示されている。特定の態様において、本発明における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤は、モガムリズマブである。
【0033】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＴＬＡ４、別名、ＣＴＬＡ－４または細胞傷害性Ｔ－リンパ球関連タンパク質４である。ＣＴＬＡ４に結合する抗体は、例えば、ＷＯ２０１３００３７６１ Ａ１およびＷＯ２０１７１０６３７２ Ａ１において開示されている。特定の態様において、本発明における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤（depletory）は、イピリムマブまたはトレメリムマブである。
【0034】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＤ２５である。インターロイキン－２受容体アルファ鎖（別名、ＣＤ２５）は、ヒトにおいてＩＬ２ＲＡ遺伝子によりコードされるタンパク質である。インターロイキン２（ＩＬ２）受容体アルファ（ＩＬ２ＲＡ）およびベータ（ＩＬ２ＲＢ）鎖は、共通のガンマ鎖（ＩＬ２ＲＧ）と一緒に、高アフィニティーＩＬ２受容体を構成する。好適なＣＤ２５結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１７１７４３３１ Ａ１、ＷＯ２０１８１６７１０４ Ａ１およびＷＯ２０１９１７５２２０ Ａ１において開示され、これらの全ては、本明細書において参考として援用される。特定の態様において、本発明における使用のためのＣＤ２５に結合する抗体は、ＲＧ６２９２、別名、ＲＯ７２９６６８２である。
【0035】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＴＩＧＩＴである。ＴＩＧＩＴ（別名、ＩｇとＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains））は、一部のＴ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）上に存在する免疫受容体である。それはまた、ＷＵＣＡＭおよびＶｓｔｍ３としても同定される。本発明における使用のための好適なＴＩＧＩＴ結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１５００９８５６ Ａ２、ＷＯ２０１６０２８６５６ Ａ１、ＷＯ２０１６１０６３０２ Ａ１、ＷＯ２０１７０５３７４８ Ａ２、ＷＯ２０１７１５２０８８ Ａ１、およびＷＯ２０１９０２３５０４ Ａ１において開示されている。さらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、チラゴルマブ（tiragolumab）；ＷＯ２０１９０２３５０４ Ａ１の配列番号２２１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２２２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体；またはＷＯ２０１９０２３５０４ Ａ１の配列番号２１９のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインを含む、抗体である。
【0036】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＯＸ４０である。ＯＸ４０（別名、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー４（ＴＮＦＲＳＦ４）またはＣＤ１３４）は、二次的な共刺激性分子である。本発明における使用のための好適なＯＸ４０結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１８０３１４００ Ａ１、ＷＯ２００７０６２２４５ Ａ２、ＷＯ２０１８２０２６４９ Ａ１、ＷＯ２０１６１７９５１７ Ａ１、およびＷＯ２０１８１１２３４６ Ａ１において開示されている。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＫＨＫ４０８３、ＡＴＯＲ－１０１５、ＩＮＣＡＧＮ０１９４９、およびＡＢＢＶ－３６８から選択される。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、以下から選択される抗体である：
・ＷＯ２００７０６２２４５ Ａ２の配列番号９の位置２０～１４１におけるアミノ酸からのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２００７０６２２４５ Ａ２の配列番号１０の位置２１～１２９におけるアミノ酸からのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１８２０２６４９ Ａ１の配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１８２０２６４９ Ａ１の配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１６１７９５１７ Ａ１の配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１６１７９５１７ Ａ１の配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；ならびに
・ＷＯ２０１８１１２３４６ Ａ１の抗体Ｈｕ３７３８。
・ＷＯ２００７０６２２４５ Ａ２の配列番号９の位置２０～１４１におけるアミノ酸からのアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２００７０６２２４５ Ａ２の配列番号１０の位置２１～１２９におけるアミノ酸からのアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１８２０２６４９ Ａ１の配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１８２０２６４９ Ａ１の配列番号８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１６１７９５１７ Ａ１の配列番号１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１６１７９５１７ Ａ１の配列番号１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；ならびに
・ＷＯ２０１８１１２３４６ Ａ１の抗体Ｈｕ３７３８。
【0037】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＩＣＯＳである。ＩＣＯＳ（別名、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（Inducible T-cell COStimulator）またはＣＤ２７８）は、ＩＣＯＳ遺伝子によりコードされる免疫チェックポイントタンパク質である。それは、活性化Ｔ細胞上で発現されるＣＤ２８スーパーファミリー共刺激性分子である。本発明における使用のための好適なＩＣＯＳ結合抗体は、例えば、ＷＯ２００８１３７９１５ Ａ２、ＷＯ２０１６１５４１７７ Ａ２、ＷＯ２０１２１３１００４ Ａ２、ＷＯ２０１８０２９４７４ Ａ２、およびＷＯ２０１８１８７６１３ Ａ２において開示されている。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＫＹ－１１０４４、ＫＹ－１０５５、ＸｍＡｂ２３１０４、ボプラテリマブ（vopratelimab）、およびＭＥＤＩ－５７０から選択される。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、以下から選択される抗体である：
・ボプラテリマブ；
・ＷＯ２０１８０２９４７４ Ａ２の配列番号４０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１８０２９４７４ Ａ２の配列番号４１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；ならびに
・ＷＯ２００８１３７９１５Ａ２の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２００８１３７９１５Ａ２の配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
・ボプラテリマブ；
・ＷＯ２０１８０２９４７４ Ａ２の配列番号４０８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１８０２９４７４ Ａ２の配列番号４１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；ならびに
・ＷＯ２００８１３７９１５Ａ２の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２００８１３７９１５Ａ２の配列番号２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
【0038】
さらに別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＤ３８である。ＣＤ３８（表面抗原分類３８、別名、サイクリックＡＤＰリボースヒドロラーゼ）は、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、Ｂリンパ球およびナチュラルキラー細胞を含む多くの免疫細胞の表面上で見出される糖タンパク質である。ＣＤ３８はまた、鎖相棒接着、シグナル伝達およびカルシウムシグナル伝達においても機能する。本発明における使用のための好適なＣＤ３８結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１６２１０２２３ Ａ１、ＷＯ２０１２０９２６１６ Ａ１、ＷＯ２００８０４７２４２ Ａ２、およびＷＯ２０１５０６６４５０ Ａ１において開示されている。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、以下から選択される抗体である：
・ダラツムマブ；
・イサツキシマブ；ならびに
・ＷＯ２０１２０９２６１６ Ａ１の配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１２０９２６１６ Ａ１の配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
・ダラツムマブ；
・イサツキシマブ；ならびに
・ＷＯ２０１２０９２６１６ Ａ１の配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１２０９２６１６ Ａ１の配列番号１０のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
【0039】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＧＩＴＲである。ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連タンパク質、別名、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１８（ＴＮＦＲＳＦ１８）または活性化誘導性（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ－ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ）ＴＮＦＲファミリー受容体（ＡＩＴＲ））もまた、共刺激性免疫チェックポイント分子であって、ＣＤ２５＋／ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞により維持される優性な免疫学的自己寛容において、重要な役割を果たすものである。本発明における使用のための好適なＧＩＴＲ結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１５１８７８３５ Ａ２、ＷＯ２０１６０５４６３８ Ａ１、ＷＯ２０１６０８１７４６ Ａ２、ＷＯ２０１５１８４０９９ Ａ１、およびＷＯ２０１６０５７８４６ Ａ１において開示されている。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、以下から選択される抗体である：
・ＷＯ２０１５１８７８３５ Ａ２の抗体２８Ｆ３．ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖可変領域を有する、抗体；
・ＷＯ２０１５１８４０９９ Ａ１の配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１５１８４０９９ Ａ１の配列番号２０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１６０５７８４６ Ａ１の配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１６０５７８４６ ９９ Ａ１の配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
・ＷＯ２０１５１８７８３５ Ａ２の抗体２８Ｆ３．ＩｇＧ１の重鎖および軽鎖可変領域を有する、抗体；
・ＷＯ２０１５１８４０９９ Ａ１の配列番号２０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１５１８４０９９ Ａ１の配列番号２０８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体；
・ＷＯ２０１６０５７８４６ Ａ１の配列番号９９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１６０５７８４６ ９９ Ａ１の配列番号７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
【0040】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、４－１ＢＢである。４－１ＢＢ（別名、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー９（ＴＮＦＲＳＦ９）、ＣＤ１３７、およびリンパ球活性化誘導型（induced by lymphocyte activation：ＩＬＡ））もまた、共刺激性免疫チェックポイント分子である。好適な分子として、ウレルマブおよびウトミルマブ（utomilumab）、ならびに細胞傷害活性、特にＡＤＣＣ活性が増大したこれらの誘導体が挙げられる。
【0041】
別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＮＲＰ１である。ＮＲＰ１（別名、ニューロピリン－１）は、ＶＥＧＦおよびセマフォリンファミリーメンバーの両方についての、チロシンキナーゼ受容体に対する膜結合型共受容体である。ＮＲＰ１は、血管新生、軸索ガイダンス、細胞の生存、遊走および浸潤において多目的な役割を果たし、Ｔｒｅｇ上で高度に発現される。本発明における使用のための好適な分子として、ＷＯ２００７０５６４７０、ＷＯ２０１２００６５０３ Ａ１、ＷＯ２０１４０５８９１５ Ａ２、およびＷＯ２０１８１１９１７１ Ａ１において開示される抗体、ならびに細胞傷害活性、特にＡＤＣＣ活性が増大したそれらの誘導体が挙げられる。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ベセンクマブ（vesencumab）である。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＷＯ２０１８１１９１７１ Ａ１のＭＡＢ１２の重鎖および軽鎖可変領域を含む。
【0042】
さらに別の特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＬＡＧ３である。ＬＡＧ３（リンパ球活性化遺伝子３、別名、ＣＤ２２３）は、免疫チェックポイント受容体である。本発明における使用のための好適なＬＡＧ３結合抗体は、例えば、ＷＯ２０１４１４０１８０ Ａ１；ＷＯ２０１４００８２１８ Ａ１； ＵＳ２０１６０１７６９６５ Ａ１；ＷＯ２０１６０２８６７２ Ａ１；およびＷＯ２０１００１９５７０ Ａ２において開示されている。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＷＯ２０１４１４０１８０ Ａ１の配列番号９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、およびＷＯ２０１４１４０１８０ Ａ１の配列番号４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、抗体である。
【0043】
より好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８である。ＣＣＲ８は、ベータ－ケモカイン受容体ファミリーのメンバーであって、これは、Ｇ共役型受容体に類似する７回膜貫通型タンパク質であると予測される。同定されたＣＣＲ８のリガンドとして、その天然のコグネートなリガンドであるＣＣＬ１（Ｉ－３０９が挙げられる。本発明者らは、ＣＣＲ８を標的とすることを通したＴｒｅｇの修飾により、腫瘍反応性のエフェクターＴ細胞および末梢Ｔｒｅｇ細胞（例えば、循環血Ｔｒｅｇ細胞）を保存しつつ、腫瘍浸潤性Ｔｒｅｇ細胞を特異的に枯渇させることが可能となることを見出した。
【0044】
「特異的結合」、「特異的に結合する（bind specifically）」、および「特異的に結合する（specifically bind）」とは、特に、Ｔｒｅｇ枯渇剤が、約１０-６Ｍ、１０-７Ｍ、１０-８Ｍ、１０-９Ｍ、１０-１０Ｍ、１０-１１Ｍ、１０-１２Ｍまたは１０-１３Ｍ未満の目的のマーカー／抗原について、解離定数（Ｋｄ）を有することを意味するものと理解される。好ましい態様において、解離定数は、１０-８Ｍ未満、例えば、１０-９Ｍ、１０-１０Ｍ、１０-１１Ｍ、１０-１２Ｍまたは１０-１３Ｍの範囲である。Ｔｒｅｇ枯渇剤の膜標的に対するアフィニティーは、例えば、ウイルス様粒子を用いる表面プラズモン共鳴に基づくアッセイ（ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９において記載されるとおりのBIAcoreアッセイなど）；細胞酵素結合免疫吸着（ＥＬＩＳＡ）；および蛍光励起セルソーティング（ＦＡＣＳ）の読み出し値により、決定してもよい。見かけのＫｄまたはＥＣ５０値を決定するための好ましい方法は、２１℃において、マーカーを過剰発現する、特にｈｕＣＣＲ８を過剰発現する細胞により、ＦＡＣＳを用いることによるものである
【0045】
当業者により理解されるであろうとおり、原則的に、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合するＴｒｅｇ枯渇剤のうちの任意の型を、本発明において用いることができ、Ｔｒｅｇ枯渇剤の異なる型は、当業者にとって容易に利用可能であるか、または当該分野において典型的な知識を用いて作製することができる。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤の結合部分は、タンパク質性であり、ことさらには、Ｔｒｅｇ枯渇性ポリペプチドである。さらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤の結合部分は、抗体ベースのもの、または非抗体ベースのものであり、好ましくは抗体ベースのものである。非抗体ベースのＴｒｅｇ枯渇剤として、これらに限定されないが、アフィボディー（affibody）（登録商標）、Kunitzドメインペプチド、モノボディー（アドネクチン（adnectin）、アンティカリン（anticalin）（登録商標）、設計されたアンキリンリピートドメイン（DARPin）、センティリン（centyrin）、フィノマー（fynomer）、アビマー（avimer）；アフィリン（affilin）；アフィチン（affitin）、ペプチドなどが挙げられる。
【0046】
本明細書において記載される場合、用語「抗体」、「抗体フラグメント」および「活性な抗体フラグメント」とは、抗原、特にＣＣＲ８タンパク質に特異的に結合することができる免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメインまたは抗原結合ドメインを含むタンパク質を指す。「抗体」は、さらに、天然のソースまたは組み換えソースから誘導される完全な免疫グロブリンであってもよく、完全な免疫グロブリンの免疫反応性部分であってもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の多量体、例えば四量体であってもよい。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分が、抗体または活性な抗体フラグメントであるものを含む。本発明のさらなる側面において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、抗体である。本発明のさらなる側面において、抗体は、モノクローナルである。抗体は、付加的に、または代替的に、ヒト化されているか、またはヒトのものであってもよい。さらなる側面において、抗体は、ヒトのものであるか、または任意の場合において、ヒト対象におけるその使用および投与を可能にする形式および特徴を有する抗体である。抗体は、これらに限定されないが、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、ウシ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒトコブラクダ（dromedary）、ラクダ（camel）、ラマ、アルパカおよびサメを含む任意の種に由来してよい。
【0047】
用語「抗原決定フラグメント」は、前記の完全なポリクローナルまたはモノクローナル抗体の抗原結合部分であって、標的抗原またはその単一の鎖に特異的に結合する能力を保持するもの、抗体を含む融合タンパク質、または抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾された立体構造を指すことを意図される。抗原決定フラグメントは、Ｆａｂ；Ｆａｂ’；Ｆ（ａｂ’）２；Ｆｃフラグメント；シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはｄＡｂ）フラグメントを含むが、これらに限定されない。これらのフラグメントは、当該分野における通常の方法を用いることにより、例えば、パパイン（Ｆａｂフラグメントを生成するため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２フラグメントを生成するため）などの酵素によるタンパク質分解的切断により、完全な抗体から誘導される。本明細書において用いられる場合、抗原決定フラグメントはまた、単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）などの重鎖および／または軽鎖可変領域を含む融合タンパク質を指す。
【0048】
本明細書において用いられる場合、用語「モノクローナル抗体」とは、均一な抗体集団を有する抗体組成物を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対して向けられている。さらに、典型的には様々な決定因子（エピトープ）に対して向けられた様々な抗体を含む、通常の抗体（ポリクローナル）調製物とは対照的に、各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定因子に対して向けられている。本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８またはＣＴＬＡ４に、ことさらにはＣＣＲ８に結合するモノクローナル抗体部分を含む。
【0049】
本明細書において用いられる場合、用語「ヒト化された抗体」とは、ヒトおよび非ヒト（マウスまたはウサギなど）の抗体配列の最適な組み合わせ、すなわち、抗体のヒト内容物は最大化されているが、非ヒト抗体の可変領域に起因し得る結合アフィニティーの喪失をほとんどまたは全く引き起こさない組み合わせを同定するための分子モデリング技術により生成された抗体を指す。例えば、ヒト化された抗体、別名キメラ抗体は、非ヒト抗体からの相補性決定領域（ＣＤＲ）を「ヒト化する」か、またはこれを非免疫原性にするために、ヒト抗体からの、ヒトフレームワーク領域の、および定常領域のアミノ酸配列を含む。
【0050】
本明細書において用いられる場合、用語「ヒト抗体」とは、ヒトにより産生され得るか、および／または当業者に公知であるかまたは本明細書において開示されるヒト抗体を作製するための技術のうちのいずれかを用いて作製された抗体のものに対応するアミノ酸配列を有する、抗体を意味する。また、用語「ヒト抗体」は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体を包含することが、理解される。１つのかかる例は、マウス軽鎖およびヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体である。
【0051】
本発明の一側面において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、活性な抗体フラグメントを含む。用語「活性な抗体フラグメント」とは、任意の抗体または抗体様構造の部分であって、それ自体が抗原決定基またはエピトープに対して高いアフィニティーを有し、かかる特異性の理由となる１つ以上の抗原結合部位、例えば相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むものを指す。非限定的な例として、免疫グロブリンドメイン、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、ｓｃＦｖ、重鎖－軽鎖二量体、免疫グロブリン単一可変ドメイン、シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂまたはｄＡｂ）、ナノボディー（Nanobodies）（登録商標）、および完全軽鎖または完全重鎖などの単鎖構造、ならびに抗原に結合するように操作されている抗体定常ドメインが挙げられる。本発明を鑑みた前記フラグメントの「活性」についてのさらなる要件は、前記フラグメントがＴｒｅｇの細胞表面マーカー、特にＣＣＲ８に結合することができることである。用語「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」またはより具体的には「免疫グロブリン可変ドメイン」（「ＩＶＤ」と略される）は、相補性決定領域により中断されたフレームワーク領域から本質的になる免疫グロブリンドメインを意味する。典型的には、免疫グロブリンドメインは、４つの「フレームワーク領域」から本質的になり、これらは、当該分野において、および下で、それぞれ、「フレームワーク領域１」または「ＦＲ１」として；「フレームワーク領域２」または「ＦＲ２」として；「フレームワーク領域３」または「ＦＲ３」として；および「フレームワーク領域４」または「ＦＲ４」として言及される；これらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」で中断され、これらは、当該分野において、および下で、それぞれ、「相補性決定領域１」または「ＣＤＲ１」として；「相補性決定領域２」または「ＣＤＲ２」として；および「相補性決定領域３」または「ＣＤＲ３」として言及される。したがって、免疫グロブリン可変ドメインの一般的な構造または配列は、以下のとおり示すことができる：ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４。それは、抗原結合部位を担持することにより抗体に抗原に対する特異性を与える、免疫グロブリン可変ドメイン（ＩＶＤ）である。典型的には、通常の免疫グロブリンにおいて、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）とは相互作用して、抗原結合部位を形成する。この場合、ＶＨおよびＶＬのいずれの相補性決定領域（ＣＤＲ）も、抗原結合部位に寄与するであろう。すなわち、６つのＣＤＲの合計が、抗原結合部位形成に関与するであろう。上の定義を考慮すると、従来の４鎖抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ分子など；当該分野において公知）の、またはかかる通常の４鎖抗体から誘導される、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、例えばジスルフィド連結されたＦｖおよびｓｃＦｖフラグメント、またはダイアボディー（全て当該分野において公知）の、抗原結合ドメインは、軽鎖および重鎖可変ドメインなどの（会合した）免疫グロブリンドメインのペアにより、すなわち、それぞれの抗原のエピトープに一緒に結合する免疫グロブリンドメインのＶＨ－ＶＬペアにより、抗原のそれぞれのエピトープに結合する。シングルドメイン抗体（ｓｄＡｂ）とは、本明細書において用いられる場合、形式ＦＲ１－ＣＤＲ１－ＦＲ２－ＣＤＲ２－ＦＲ３－ＣＤＲ３－ＦＲ４による、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。本発明のシングルドメイン抗体は、「免疫グロブリン単一可変ドメイン」（「ＩＳＶＤ」と略される）と等価であり、抗原結合部位が、単一の免疫グロブリンドメイン上に存在し、これにより形成される分子を指す。このことが、シングルドメイン抗体を、２つの免疫グロブリンドメイン、特に２つの可変ドメインが相互作用して抗原結合部位を形成する、「通常の」抗体またはそれらのフラグメントと区別する。シングルドメイン抗体の結合部位は、単一のＶＨ／ＶＨＨまたはＶＬドメインにより形成される。したがって、シングルドメイン抗体の抗原結合部位は、３つ以下のＣＤＲにより形成される。かかるシングルドメインは、それが単一の抗原結合単位（すなわち、単一の抗原結合ドメインが、機能的な抗原結合単位を形成するために、別の可変ドメインと相互作用する必要がないような、単一可変ドメインから本質的になる機能的な抗原結合単位）を形成することができる限りにおいて、軽鎖可変ドメインの配列（例えば、ＶＬ配列）もしくはその好適なフラグメント；または重鎖可変ドメインの配列（例えば、ＶＨ配列もしくはＶＨＨ配列）もしくはその好適なフラグメントであってよい。
【0052】
したがって、一態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有するＴｒｅｇ枯渇剤は、上で詳述されるとおり、少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有するＴｒｅｇ枯渇剤は、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。
【0053】
本発明のさらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、上で詳述されるとおり、少なくとも１つのＦｃ領域部分、および、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ペプチドリンカーにより一緒に連結された、少なくとも１つのＦｃ領域部分、および、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む、遺伝子操作されたポリペプチドである。Ｆｃ領域部分および／またはシングルドメイン抗体部分領域のアミノ酸配列は、ヒトについての免疫原性を低下させるためにヒト化されていてもよい。
【0054】
特に、シングルドメイン抗体は、ナノボディー（Nanobody）（登録商標）（本明細書において定義されるとおり）またはその好適なフラグメントであってよい（注意：Nanobody（登録商標）、Nanobodies（登録商標）およびNanoclone（登録商標）は、Sanofiの会社であるAblynx N.V.の登録商標である）。ナノボディー（Nanobodies）（登録商標）の一般的な説明については、以下のさらなる記載への参照が行われ、および例えばＷＯ２００８／０２００７９などの先行技術において記載される。「ＶＨＨドメイン」、別名ＶＨＨ、ＶＨＨ抗体フラグメントおよびＶＨＨ抗体は、もともとは、「重鎖抗体」の（すなわち、「軽鎖を除いた抗体」の）抗原結合免疫グロブリン（Ｉｇ）（可変）ドメインとして記載されてきた（例えば、Hamers-Casterman et al., Nature 363:446-8 (1993)を参照）。用語「ＶＨＨドメイン」は、これらの可変ドメインを、従来の４鎖抗体において存在する重鎖可変ドメイン（これは、本明細書において「ＶＨドメイン」として言及される）と、および従来の４鎖抗体において存在する軽鎖可変ドメイン（これは、本明細書において「ＶＬドメイン」として言及される）と区別するために選択された。ＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）についてのさらなる説明については、一般的な背景技術として言及されるMuyldermansによる総説論文（Reviews in Molecular Biotechnology 74: 277-302, 2001）ならびに以下の特許出願への参照が行われる：Vrije Universiteit BrusselのＷＯ９４／０４６７８、ＷＯ９５／０４０７９およびＷＯ９６／３４１０３；UnileverのＷＯ９４／２５５９１、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ００／４０９６８、ＷＯ００／４３５０７、ＷＯ００／６５０５７、ＷＯ０１／４０３１０、ＷＯ０１／４４３０１、ＥＰ １１３４２３１およびＷＯ０２／４８１９３；Vlaams Instituut voor Biotechnologie（ＶＩＢ）のＷＯ９７／４９８０５、ＷＯ０１／２１８１７、ＷＯ０３／０３５６９４、ＷＯ０３／０５４０１６およびＷＯ０３／０５５５２７；Algonomics N.V.およびAblynx N.V.のＷＯ０３／０５０５３１；National Research Council of CanadaによるＷＯ０１／９０１９０；Institute of AntibodiesによるＷＯ０３／０２５０２０（＝ＥＰ １４３３７９３）；ならびにAblynx N.V.によるＷＯ０４／０４１８６７、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ０４／０４１８６５、ＷＯ０４／０４１８６３、ＷＯ０４／０６２５５１、ＷＯ０５／０４４８５８、ＷＯ０６／４０１５３、ＷＯ０６／０７９３７２、ＷＯ０６／１２２７８６、ＷＯ０６／１２２７８７およびＷＯ０６／１２２８２５、およびさらなる公開されたAblynx N.V.による特許出願。これらの参考文献において記載されるとおり、ナノボディー（Nanobody）（登録商標）（特にＶＨＨ配列および部分的にヒト化されたナノボディー（Nanobody）（登録商標））は、特に、フレームワーク配列のうちの１つ以上における１つ以上の「ホールマーク（Hallmark）残基」の存在により特徴づけることができる。ナノボディー（Nanobody）（登録商標）のヒト化および／またはラクダ化、ならびに他の修飾、部分またはフラグメント、誘導体または「ナノボディー（Nanobody）（登録商標）融合」、多価または多重特異性コンストラクト（リンカー配列のいくつかの非限定的な例を含む）、ならびにナノボディー（Nanobody）（登録商標）およびそれらの調製物の半減期を延長するための様々な修飾を含む、ナノボディー（Nanobody）（登録商標）のさらなる説明は、例えば、ＷＯ０８／１０１９８５およびＷＯ０８／１４２１６４において見出すことができる。ＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）は、全長抗体の結合のアフィニティーおよび特異性を完全に保持する、最小の抗原結合フラグメントの１つである（例えば、Greenberg et al., Nature 374:168-73 (1995)；Hassanzadeh-Ghassabeh et al., Nanomedicine (Lond), 8:1013-26 (2013)を参照）。
【0055】
さらに、フルサイズの抗体については、ＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）などの単一可変ドメインを、ヒト化に供する、すなわち、最も近いヒト生殖系列配列との配列同一性の程度を増大させることができる。特に、ヒト化された免疫グロブリン単一可変ドメイン、例えばＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）は、ヒト化置換（本明細書においてさらに定義されるとおりの）であるか、および／またはこれに対応する少なくとも１つの単一のアミノ酸残基（および特に、少なくとも１つのフレームワーク残基）が存在する、シングルドメイン抗体であってもよい。潜在的に有用なヒト化置換は、天然に存在するＶＨＨ配列のフレームワーク領域の配列を、１つ以上の近接して関連するヒトＶＨ配列の対応するフレームワーク配列と比較することにより、確認することができ、その後、そのように決定された潜在的に有用なヒト化置換のうちの１つ以上（またはそれらの組み合わせ）を、前記ＶＨＨ配列中に導入することができ、結果として生じるヒト化されたＶＨＨ配列を、標的に対するアフィニティーについて、安定性について、発現の容易性およびレベルについて、および／または他の所望される特性について、試験することができる。この方法において、限定された程度の試行錯誤により、当業者は、他の好適なヒト化置換（またはその好適な組み合わせ）を決定することができる。
【0056】
ヒト化されたシングルドメイン抗体、特にＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）は、対応する天然に存在するＶＨＨドメインと比較して低下した免疫原性などの、いくつかの利点を有し得る。ヒト化される、により、ヒト患者における投与の際の免疫原性が軽微であるか存在しないように変異していることが意味される。ヒト化置換は、結果として生じるヒト化されたアミノ酸配列および／またはＶＨＨが、抗原結合能力などのＶＨＨの有利な特性をなお保持するように選択されるべきである。本明細書において提供される説明に基づいて、当業者は、一方でのヒト化置換により提供される有利な特性と他方での天然に存在するＶＨＨドメインの有利な特性との間の、所望される、または好適なバランスを、最適化するかまたはこれを達成することができる、ヒト化置換またはヒト化置換の好適な組み合わせを選択することができるであろう。かかる方法は、技術を有する受信者により公知である。ヒトのコンセンサス配列を、ヒト化のための標的配列として用いることができるが、また、他の手段も当該分野において公知である。１つの代替物は、当業者がヒト生殖系列アレルの数をアラインメント（例えば、これに限定されないが、ＩＧＨＶ３アレルのアラインメントなど）して、前記アラインメントを標的配列中のヒト化のために好適な残基の同定のために用いる方法を含む。また、ヒト生殖系列アレルの標的配列に対して最も相同なサブセットを出発点としてアラインメントして、好適なヒト化残基を同定してもよい。あるいは、ＶＨＨを分析して、ヒトアレルにおけるその最も近接した相同体を同定し、ヒト化コンストラクトの設計のために用いる。ラクダ科のＶＨＨに適用されるヒト化技術もまた、特定のアミノ酸（単独で、または組み合わせにおいて）の置き換えを含む方法により行うことができる。前記置き換えは、文献から知られるものに基づいて選択してもよく、公知のヒト化の研究から、ならびに、天然のＶＨＨ配列と比較したヒトコンセンサス配列、または目的のＶＨＨ配列と最も類似するヒトアレルからのものである。ＷＯ０８／０２００７９の表Ａ－５～Ａ－８において示されるＶＨＨのエントロピーおよびＶＨＨの可変性についてのデータから観察することができるとおり、フレームワーク領域中のいくつかのアミノ酸残基は、ヒトとラクダ科との間で、他のものよりもよく保存されている。一般に、本発明は、その最も広義において、これに限定されないが、任意の置換、欠失または挿入は、好ましくは、あまり保存されていない位置において行われる。また、一般に、アミノ酸置換は、アミノ酸の欠失または挿入よりも好ましい。例えば、ヒト様のクラスのラクダ科シングルドメイン抗体は、ヒトまたは他の種に由来する通常の抗体において典型的に見出される疎水性ＦＲ２残基を含むが、その親水性の喪失を、位置１０３における、二本鎖抗体からのＶＨにおいて存在する保存されたトリプトファン残基を置換する、他の置換により代償している。かくして、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ペプチドは、それからの望ましくない免疫応答を予想することなく、かつさらなるヒト化の負担を伴うことなく、ヒトに直接的に投与してもよい。実際に、いくつかのラクダ科ＶＨＨ配列は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高い配列相同性を示し、したがって、前記ＶＨＨは、それからの免疫応答を予想することなく、かつさらなるヒト化の負担を伴うことなく、患者に直接的に投与してもよい。
【0057】
ヒト化の間に、既存の抗体（例えばＷＯ２０１２／１７５７４１およびＷＯ２０１５／１７３３２５への参照が行われる）に、例えば、位置：１１、１３、１４、１５、４０、４１、４２、８２、８２ａ、８２ｂ、８３、８４、８５、８７、８８、８９、１０３または１０８のうちの少なくとも１つにおいて、好適な変異、特に置換を導入して、結合が低下したポリペプチドを作製することができる。本発明のアミノ酸配列および／またはＶＨＨは、任意のフレームワーク残基において、例えば１つ以上のホールマーク残基（下で定義されるとおり）において、または１つ以上の他のフレームワーク残基（すなわち、非ホールマーク残基）、またはその任意の好適な組み合わせにおいて、好適にヒト化されていてもよい。本発明のアミノ酸配列、ＶＨＨまたはポリペプチドを発現するために用いられる宿主生物に依存して、かかる欠失および／または置換はまた、翻訳後修飾のための１つ以上の部位（１つ以上のグリコシル化部位など）が取り除かれるような方法において設計されてもよく、これは、当業者の能力の範囲内であろう。あるいは、例えば部位特異的ペグ化を可能にするための、官能基（本明細書において記載されるとおり）の付着のための１つ以上の部位を導入するために、置換または挿入が設計されてもよい。
【0058】
いくつかの場合において、典型的なラクダ科のホールマーク残基のうちの少なくとも１つであって、位置３７、４４、４５および／または４７において親水性の特徴を有するものが、置き換えられる（ＷＯ２００８／０２００７９の表Ａ－０３を参照）。ヒト化の別の例として、ＦＲ１における、位置１、５、１１、１４、１６および／または２８などの位置；ＦＲ３における、７３、７４、７５、７６、７８、７９、８２ｂ、８３、８４、９３および／または９４などの位置；ならびにＦＲ４における、１０、１０３、１０４、１０８および／または１１１などの位置の残基の置換が挙げられる（ＷＯ２００８／０２００７９の表Ａ－０５～Ａ０８を参照；全ての番号付けは、Kabatに従う）
【0059】
本発明の一側面において、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤は、単一特異性である。下でさらに議論されるとおり、代替的な側面において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、二重特異性である。
【0060】
本明細書において用いられる場合、「二重特異性」とは、単一の抗原もしくはポリペプチド上で、または２つの異なる抗原もしくはポリペプチド上で、２つの区別し得るエピトープに結合する能力を有するＴｒｅｇ枯渇剤を指す。
本明細書において議論されるとおりの本発明の二重特異性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、体細胞雑種などの生物学的方法；または細胞株における、もしくは生体内での、所望される構造をコードする非ネイティブなＤＮＡ配列の発現などの遺伝学的方法；化学的方法（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的もしくは他の方法による１つ以上の分子的実体への会合、例えばそのフラグメントの別の結合剤により）；またはそれらの組み合わせを介して、生成することができる。
本明細書において議論されるとおりの本発明の二重特異性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、体細胞雑種などの生物学的方法；または細胞株における、もしくは生体内での、所望される構造をコードする非ネイティブなＤＮＡ配列の発現などの遺伝学的方法；化学的方法（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的もしくは他の方法による１つ以上の分子的実体への会合、例えばそのフラグメントの別の結合剤により）；またはそれらの組み合わせを介して、生成することができる。
【0061】
単一特異性または二重特異性のＴｒｅｇ枯渇剤を生成することを可能にする技術および製品は、当該分野において公知であり、代替的な形式、Ｔｒｅｇ枯渇剤－薬物抱合体、Ｔｒｅｇ枯渇剤設計方法、in vitroスクリーニング方法、定常領域、翻訳後および化学的な修飾、Ｆｃドメイン工学などのがん細胞の死を引き起こすための改善された特徴に関してもまた、文献において広範に総説されているとおりである（Tiller K and Tessier P, Annu Rev Biomed Eng. 17:191-216 (2015)；Speiss C et al., Molecular Immunology 67:95-106 (2015)；Weiner G, Nat Rev Cancer, 15:361-370 (2015)；Fan G et al., J Hematol Oncol 8:130 (2015)）。
【0062】
本明細書において用いられる場合、「エピトープ」または「抗原決定基」とは、抗体などのＴｒｅｇ枯渇剤が結合する抗原上の部位を指す。当該分野において周知であるとおり、エピトープは、近接したアミノ酸（直鎖状エピトープ）、またはタンパク質の三次フォールディングにより並置された非近接のアミノ酸（立体構造的エピトープ）のいずれからのものであってよい。近接したアミノ酸から形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒への暴露によっても保持されるが、一方、三次フォールディングにより形成されるエピトープは、典型的には、変性溶媒による処置によって失われる。エピトープは、典型的には、ユニークな空間的立体配置中に、少なくとも３個、およびより通常では少なくとも５個または８～１０個のアミノ酸を含む。エピトープの空間的立体配置を決定する方法は、当該分野において周知であり、例えば、Ｘ線結晶学および２－Ｄ核磁気共鳴が挙げられる。例えば、Methods in Molecular Biology、第６６巻中のEpitope Mapping Protocols、Glenn E. Morris編（１９９６年）を参照。
【0063】
さらに本発明により、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有する。「細胞傷害性」または「細胞傷害活性」とは、本明細書において用いられる場合、Ｔｒｅｇ枯渇剤が、それが結合する細胞に対して毒性となる能力を指す。本発明の記載から当業者には明らかであるとおり、本発明に関して、任意の型の細胞傷害性を用いることができる。重要であるのは、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤が、ＣＣＲ８などのＴｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーに結合し、それが結合する細胞に対して毒性を引き起こす能力である。細胞傷害性は、直接的な細胞傷害性であってよく、ここで、Ｔｒｅｇ枯渇剤自体が、細胞に直接損傷を与える（例えば、それが化学療法的なペイロードを含むことから）、または、それは間接的であってもよく、ここで、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、細胞に損傷を引き起こす細胞外の機構を含む（例えば、抗体依存性細胞活性を誘導する抗体）。とりわけ、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、免疫系に、それが結合する細胞を破壊または取り除くようにシグナルを与えることができてもよく、または、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、それが結合する細胞を破壊するための細胞傷害性ペイロードを担持してもよい。特に、細胞傷害活性は、細胞傷害性部分の存在により引き起こされる。かかる細胞傷害性部分の例として、抗体依存性細胞活性（ＡＤＣＣ）を誘導するか、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、Ｔ細胞に結合してこれを活性化するか、または細胞傷害性ペイロードを含む、部分を含む。最も好ましくは、前記細胞傷害性部分は、抗体依存性細胞活性（ＡＤＣＣ）を誘導する。
【0064】
抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）とは、Ｆｃ受容体を発現する非特異的細胞傷害性細胞において、細胞により媒介される反応であって、標的細胞上のＴｒｅｇ枯渇剤を認識し、その後、標的細胞の溶解を引き起こすものを指す。Ｆｃ受容体を発現非特異的細胞傷害性細胞の例として、ナチュラルキラー細胞、好中球およびマクロファージが挙げられる。
【0065】
補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）とは、補体の存在下における標的の溶解を指す。補体活性化経路は、補体系の第１の補体（Ｃ１ｑ）の、コグネートな抗原と複合体化したＴｒｅｇ枯渇剤への結合により開始される。
【0066】
抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）とは、Ｆｃ受容体を発現する貪食細胞（マクロファージなど）が、標的細胞上のＴｒｅｇ枯渇剤を認識し、それにより標的細胞の貪食がもたらされる、細胞により媒介される反応を指す。
ＣＤＣ、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰは、当該分野において公知のアッセイを用いて測定することができる（Vafa et al. Methods 2014 Jan 1; 65(1):114-26 (2013)）。
ＣＤＣ、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰは、当該分野において公知のアッセイを用いて測定することができる（Vafa et al. Methods 2014 Jan 1; 65(1):114-26 (2013)）。
【0067】
細胞傷害活性はまた、例えば、細胞傷害性部分が、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーとは区別し得る、好ましくはＣＣＲ８とは区別し得る、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞のマーカーに結合し、その結合が、前記細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞の活性化をもたらすことにより、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞に結合してこれを活性化する細胞傷害性部分により引き起こされ得る。細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞の活性化は、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤が結合する細胞に対する、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞の細胞傷害活性を誘導する。したがって、特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、好ましくはＣＣＲ８に結合し、かつ、細胞傷害性Ｔ細胞またはＴヘルパー細胞に結合してこれを活性化する。例えば、細胞傷害性部分は、ＣＤ３に結合してもよい。さらなる態様において、細胞傷害性部分は、ＣＤ３に結合する抗体またはその抗原決定フラグメントを含む。したがって、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、好ましくはＣＣＲ８に、およびＣＤ３に結合してもよい。かかるＴｒｅｇ枯渇剤は、腫瘍内Ｔｒｅｇに結合し、Ｔ細胞の細胞傷害活性をこれらのＴｒｅｇに向け、それにより、腫瘍環境からそれらを枯渇させる。特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する部分、およびＣＤ３に結合する部分を含み、ここで、少なくとも１つの部分は、抗体ベースであり、特にここで、両方の部分が、抗体ベースである。したがって、特定の態様において、本発明は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、好ましくはＣＣＲ８に特異的に結合する抗体またはその抗原決定フラグメント、およびＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原決定フラグメントを含む、二重特異性コンストラクトを提供する。
【0068】
細胞傷害性ペイロードとは、細胞傷害性ペイロードと接触する細胞に対して直接的な損傷効果を引き起こす任意の分子的実体を指す。細胞傷害性ペイロードは、当業者に公知である。特定の態様において、細胞傷害性ペイロードは、化学的実体である。かかる細胞傷害性ペイロードの特定の例として、トキシン、化学療法剤および放射性同位元素または放射性核種が挙げられる。さらなる態様において、細胞傷害性ペイロードは、アルキル化剤、アントラサイクリン、細胞骨格破壊剤、エポチロン、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、トポイソメラーゼＩの阻害剤、トポイソメラーゼＩＩの阻害剤、キナーゼ阻害剤、ヌクレオチドアナログおよび前駆体アナログ、ペプチド抗菌剤、白金ベースの剤、レチノイド、ビンカアルカロイドおよび誘導体、ペプチドまたは小分子トキシン、ならびに放射性同位元素からなる群より選択される剤を含む。化学的実体は、当該分野において公知の技術を用いて、タンパク質性の阻害剤、例えば、抗体または抗原決定フラグメントにカップリングすることができる。かかるカップリングは、共有結合によるものであっても非共有結合によるものだってもよく、カップリングは、易動性または可逆性であってもよい。
【0069】
当該分野において周知であるとおり、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域は、いくつかの細胞Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ）と相互作用して、下流のエフェクター機構を刺激してこれを調節する。５つの活性化受容体、すなわち、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲｌｌａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲｌｌｃ（ＣＤ３２ｃ）、ＦｃγＲｌｌｌａ（ＣＤ１６ａ）およびＦｃｙＲｌｌｌｂ（ＣＤ１６ｂ）、ならびに１つの阻害性受容体ＦｃγＲｌｌｂ（ＣＤ３２ｂ）が存在する。ＩｇＧ抗体と免疫系とのコミュニケーションは、ＦｃγＲにより制御され、かつ媒介され、これは、抗体により感知され、収集された情報を、免疫系に中継し、バイオ医薬品（biotherapeutics）に関しては特に、自然免疫系と適応免疫系との間のリンクを提供する（Hayes J et al., 2016. J Inflamm Res 9: 209-219）。
【0070】
ＩｇＧのサブクラスは、ＦｃγＲに結合するそれらの能力において異なり、その差次的な結合が、ある範囲の機能的応答を誘発するそれらの能力を決定する。例えば、ヒトにおいて、ＦｃγＲｌｌｌａは、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）の活性化に関与する主要な受容体であり、ｌｇＧ３と、すぐ後に続くｌｇＧ１は、この受容体に対して最も高いアフィニティーを示し、このことは、ＡＤＣＣを強力に誘導するそれらの能力を反映している。ｌｇＧ２は、この受容体に対してより弱い結合を示している一方で、ヒトｌｇＧ２アイソタイプを有するＴｒｅｇ枯渇剤もまた、Ｔｒｅｇを効果的に枯渇させることが見出されている。
【0071】
本発明の好ましい態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、抗体エフェクター機能、特にヒトにおける抗体エフェクター機能を含む。特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、ＦｃγＲに高アフィニティーで、好ましくは活性化受容体に高アフィニティーで結合する。好ましくは、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲｌｌａおよび／またはＦｃγＲｌｌｌａに、高アフィニティーで結合する。特に好ましくは、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＦｃγＲｌｌｌａに結合する。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、少なくとも１つの活性化Ｆｃγ受容体に、約１０-６Ｍ、１０-７Ｍ、１０-８Ｍ、１０-９Ｍ、１０-１０Ｍ、１０-１１Ｍ、１０-１２Ｍ、または１０-１３Ｍ未満の解離定数により、結合する。ＦｃγＲの結合は、いくつかの手段を通して得ることができる。例えば、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含んでもよく、またはそれは、ＦｃγＲに特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分などの結合部分を含んでもよい。
【0072】
したがって、一態様において、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含む。本発明に関して、用語「フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分」とは、重鎖の定常領域を含んでなり、抗体Ｆｃ受容体および補体系のいくつかの他のタンパク質への結合の原因であり、それによりＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を誘導する、免疫グロブリン分子の結晶化可能フラグメントを指す。
一態様において、Ｆｃ領域部分は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
一態様において、Ｆｃ領域部分は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
【0073】
ＡＤＣＣは、Ｆｃ部分グリカンからフコース部分を減少させるかまたはこれを取り除く方法により、および／またはＩｇＧ１などの免疫グロブリンのＦｃ領域に対する特異的変異（例えば、Ｓ２９８Ａ／Ｅ３３３／Ｋ３３４Ａ、Ｓ２３９Ｄ／Ｉ３３２Ｅ／Ａ３３０ＬまたはＧ２３６Ａ／Ｓ２３９Ｄ／Ａ３３０Ｌ／Ｉ３３２Ｅ）の導入を通して、増大させてもよい（Lazar et al. Proc Natl Acad Sci USA 103:2005-2010 (2006)；Smith et al. Proc Natl Acad Sci USA 209:6181-6 (2012)）。ＡＤＣＰもまた、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に対する特異的変異の導入により増大させてもよい（Richards et al. Mol Cancer Ther 7:2517-27 (2008)）。増大したＡＤＣＣ、ＣＤＣおよびＡＤＣＰ活性のための結合剤を操作するための方法は、Saunders（Frontiers in Immunology 2019, 1296）およびWangら（Protein Cell 2019, 9:63-73）において記載されている。
【0074】
本発明の特定の態様において、Ｆｃ領域部分を含むＴｒｅｇ枯渇剤は、ＡＤＣＣ応答を誘発するために最適化され、言い換えれば、ＡＤＣＣ応答は、Ｆｃ領域部分を含む他のもの（リガンドの、特にＣＣＬ１の、その受容体への、特にＣＣＲ８への結合を阻害しないもの、および例えば未修飾抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体を含む）と比較して増強されるか、増大するか、または改善される。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、増強されたＡＤＣＣ応答を誘発するように操作されている。
【0075】
本発明の好ましい態様において、Ｆｃ領域部分を含むＴｒｅｇ枯渇剤は、ＡＤＣＰ応答を誘発するように最適化され、言い換えれば、ＡＤＣＰ応答は、Ｆｃ領域部分を含む他のもの（リガンドの、特にＣＣＬ１の、その受容体への、特にＣＣＲ８への結合を阻害しないもの、および例えば未修飾抗ＣＣＲ８モノクローナル抗体を含む）と比較して、増強されるか、増大するか、または改善される。
【0076】
別の態様において、細胞傷害性部分は、Ｆｃガンマ受容体に結合する、ことさらには、ＦｃγＲ、特にＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲｌｌａおよび／またはＦｃγＲｌｌｌａ、特にＦｃγＲｌｌｌａなどの活性化受容体に結合してこれを活性化する部分を含む。ＦｃγＲに結合する部分は、本明細書において前に記載されるとおり、抗体ベースであっても非抗体ベースであってもよい。抗体ベースである場合、部分は、その可変領域を通してＦｃγＲに結合してもよい。
【0077】
特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８結合剤である。本明細書において記載される場合、特異的抗原の「結合剤」という用語は、前記抗原に特異的に結合することができる分子を表す。ＣＣＲ８結合剤は、本明細書において用いられる場合、ＣＣＲ８に特異的に結合することができる分子を指す。かかる結合剤はまた、本明細書において、「ＣＣＲ８結合剤」としても言及される。
【0078】
したがって、特定の態様において、ＣＣＲ８結合剤は、ＡＤＣＣ活性を有するモノクローナル抗体である。かかる抗体は、当該分野において、例えばＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１から公知であり、これは、参照により本明細書において含まれる。特定の態様において、本発明のためのＣＣＲ８結合剤は、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１において開示される抗体、特に、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１の請求の範囲において提示されるとおりの抗体から選択される。さらなる態様において、本発明のためのＣＣＲ８結合剤は、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１において開示されるヒト化抗体、特に、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１の請求の範囲において提示されるとおりのヒト化抗体から選択される。別の特定の態様において、本発明のためのＣＣＲ８結合剤は、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１からの抗体１０Ａ１１、２Ｃ７もしくは１９Ｄ７またはそのヒト化されたバリアント；特に、１０Ａ１１またはそのヒト化されたバリアント；ことさらには、ヒト化１０Ａ１１抗体である。別の特定の態様において、それは、１９Ｄ７、より好ましくはヒト化１９Ｄ７抗体である。
【0079】
１つの好ましい態様において、本発明のためのＣＣＲ８結合剤は、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１の配列番号５９を含む軽鎖可変領域および配列番号４１を含む重鎖可変領域を含む抗ＣＣＲ８抗体である。さらなる態様において、軽鎖定常領域は、ＷＯ２０２０１３８４８９ Ａ１の配列番号５２を含み、重鎖定常領域は、配列番号５３を含む。
特定の態様において、ＣＣＲ８結合剤は、抗ＣＣＲ８抗体であり、これは、特にＩｇＧ抗体、ことさらにはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
特定の態様において、ＣＣＲ８結合剤は、抗ＣＣＲ８抗体であり、これは、特にＩｇＧ抗体、ことさらにはＩｇＧ１またはＩｇＧ４である。
【0080】
本発明の特定の側面において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、非遮断性結合剤である。利点として、腸および／または皮膚のＴｒｅｇ集団に対する副作用の軽減、および樹状細胞遊走のリンパ節への阻害の不在またはその低下が挙げられる。さらに、特にＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１阻害剤などのチェックポイント阻害との組み合わせにおいて、非遮断性ＣＣＲ８結合剤などの遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤を用いるＴｒｅｇ枯渇は、腫瘍微小環境における好中球を増大することが観察されている。本発明のこの側面において、非遮断性ＣＣＲ８結合剤などの非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、好中球の増大に対して、より低い効果を有し得、それにより、より高い抗腫瘍効力を提供する。
【0081】
「非遮断性」結合剤とは、それが、リガンドの細胞表面マーカーへの結合を遮断しないか、または実質的に遮断しないことを意味する。例えば、非遮断性ＣＣＲ８結合剤は、ＣＣＲ８リガンドの、ＣＣＲ８タンパク質への結合を遮断しない。さらなる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、それが結合する細胞表面マーカーの活性化を調節しない結合剤である。かかる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、作用性（agonising）または拮抗性の結合剤ではない。したがって、かかる態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、作用性または拮抗性の抗体ではない。
【0082】
好ましくは、非遮断性ＣＣＲ８結合剤は、ＣＣＬ１、ＣＣＬ８、ＣＣＬ１６、およびＣＣＬ１８から選択される少なくとも１つのリガンドの、ＣＣＲ８への結合を遮断せず、特に、それは、ＣＣＬ１またはＣＣＬ１８のＣＣＲ８への結合を遮断せず、好ましくは、ＣＣＬ１のＣＣＲ８への結合を遮断しない。
【0083】
リガンドのマーカーへの、特にＣＣＲ８への結合の遮断は、当該分野において公知方法により決定してもよい。その例として、これらに限定されないが、ＣＣＬ１などのリガンドのＣＣＲ８への結合、ＣＣＲ８発現細胞のＣＣＬ１などのリガンドへの遊走、ＣＣＬ１などのＣＣＲ８リガンドによる細胞内Ｃａ２＋レベルの増大、ＣＣＬ１などのリガンドによるデキサメタゾン誘導性アポトーシスからのレスキュー、およびＣＣＬ１刺激などのＣＣＲ８リガンド刺激に対して感受性の遺伝子の発現におけるバリエーションの測定が挙げられる。
【0084】
「非遮断性」、「非リガンド遮断性」、「遮断しない」または「遮断することなく」などへの言及は、本発明の非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤が、Ｔｒｅｇ細胞表面マーカーを介するリガンドのシグナル伝達を遮断しないか、または実質的に遮断しない態様を含む。すなわち、非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ枯渇剤の不在下におけるリガンドシグナル伝達と比較して、リガンドシグナル伝達のうちの５０％未満を阻害する。本明細書において記載されるとおりの本発明の特定の態様において、非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ枯渇剤の不在下におけるリガンドシグナル伝達と比較して、リガンドシグナル伝達のうちの４０％、３５％、３０％未満、好ましくは約２５％未満を阻害する。特定の態様において、リガンドシグナル伝達のパーセンテージは、Ｔｒｅｇ枯渇剤の細胞表面マーカーへの結合ＥＣ５０の、少なくとも１０倍、特に少なくとも５０倍、ことさらには、少なくとも１００倍であるＴｒｅｇ枯渇剤モル濃度において測定される。別の態様において、リガンドシグナル伝達のパーセンテージは、リガンドのモル濃度の少なくとも１０倍、特に少なくとも５０倍、ことさらには、少なくとも１００倍である、Ｔｒｅｇ枯渇剤、例えばＣＣＲ８結合剤の、モル濃度において測定される。
【0085】
非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤、特に非遮断性ＣＣＲ８結合剤は、少なくとも１つのリガンドの、細胞表面マーカーへの、特にＣＣＲ８への結合を妨害することなく、または少なくとも１つのリガンドの、マーカー、特にＣＣＲ８への結合を実質的に妨害することなく、細胞表面マーカーの、特にＣＣＲ８の結合を可能にする。マーカー、例えばＣＣＲ８を介する、リガンドシグナル伝達、例えばＣＣＬ１シグナル伝達は、例において議論されるとおり、および当該分野において公知であるとおりの方法により、測定してもよい。Ｔｒｅｇ枯渇剤の、特にＣＣＲ８結合剤の、存在または不在下におけるリガンドシグナル伝達の比較は、同じ、または実質的に同じ条件下において行うことができる。
【0086】
いくつかの態様において、ＣＣＲ８シグナル伝達は、ｃＡＭＰの放出を測定することにより、決定することができる。具体的には、組み換え（ヒト）ＣＣＲ８受容体を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞（EuroscreenFASTから入手可能なＦＡＳＴ－０６５Ｃなど）を、ＫＲＨのアッセイバッファー中で懸濁する：５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＭｇＳＯ４、１２４ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３．３ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｇ／ｌのＢＳＡに、１ｍＭのＩＢＭＸを補充したもの。ＣＣＲ８結合剤は、１００ｎＭの濃度において添加し、３０分間にわたり２１℃でインキュベートする。アッセイバッファー中の５μＭのフォルスコリンおよび（ヒト）ＣＣＬ１の混合物を、５ｎＭのＣＣＬ１の最終アッセイ濃度に達するまで添加する。アッセイ混合物を、次いで、３０分間にわたり２１℃でインキュベートする。溶解バッファーの添加および１時間のインキュベーションの後で、ｃＡＭＰの濃度を測定する。ｃＡＭＰは、例えば、Cisbio製のＨＴＲＦキットなどにより、製造者のアッセイ条件（カタログ＃６２ＡＭ９ＰＥ）を用いて、蛍光レベルを決定することにより、測定することができる。非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、結合剤を欠く対照と比較して、ｃＡＭＰの量の５０％未満、特に４０％未満、ことさらには３０％未満、例えば２０％未満などの変化をもたらす。好ましくは、非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤は、対照と比較して、ｃＡＭＰのうちの１０％未満、より好ましくは５％未満の変化をもたらす。
【0087】
非遮断性ＣＣＲ８結合剤を含むがこれに限定されない非遮断性Ｔｒｅｇ枯渇剤を作製するための技術は、当業者に利用可能である。非限定的な例として、抗体は、全長表面マーカーマーカーまたは表面マーカーフラグメントを含む細胞表面マーカー抗原を用いる免疫化を通して作製することができ、作製された抗体を、表面マーカー遮断活性の不在についてスクリーニングすることができる。特定の態様において、抗体は、リガンド結合に関与しない表面マーカーフラグメントを用いる免疫化を通して作成される。非遮断性抗体は、Ｎ末端領域、特に膜貫通ドメインの間には位置しないＮ末端細胞外領域から誘導されるマーカーフラグメント、特にＣＣＲ８フラグメントによる免疫化を通して得てもよい。したがって、特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、マーカーのＮ末端領域においてＣＣＲ８に結合する。１つの特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８のＮ末端領域、およびＣＣＲ８の膜貫通ドメインの間に位置する１つ以上の細胞外ループに結合する。別の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８のＮ末端領域に結合し、ＣＣＲ８の膜貫通ドメインの間に位置する細胞外ループには結合しない。さらに別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８の膜貫通ドメインの間に位置する１つ以上の細胞外ループに結合する。別の特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤のエピトープは、前記Ｎ末端領域において位置する。さらに別の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤のエピトープは、膜貫通ドメインの間の細胞外ループにおいては位置しない。
【0088】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤をコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様において、かかる提供された核酸分子は、コドン最適化された核酸配列を含んでもよい。別の態様において、核酸は、例えば細菌、酵母、昆虫、魚、マウス、サルまたはヒトの細胞などの宿主細胞における発現のために適切な核酸ベクター中の発現カセット中に含まれる。いくつかの態様において、本発明は、所望される結合剤を発現する異種性核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。
【0089】
いくつかの態様において、本発明は、上で定義されるとおりの単離されたＴｒｅｇ枯渇剤を調製する方法を提供する。いくつかの態様において、かかる方法は、核酸（例えば、ベクターを含むか、および／またはベクターを介して宿主細胞に送達され得る、異種性核酸）を含む、宿主細胞を培養することを含んでもよい。好ましくは、宿主細胞（および／または異種性核酸配列）は、Ｔｒｅｇ枯渇剤が宿主細胞から分泌され、細胞培養上清から単離されるように、配置され、構築される。
【0090】
ＬＴＢＲアゴニスト
本明細書において記載される場合、用語「ＬＴＢＲアゴニスト」とは、受容体ＬＴＢＲに対して特異的なリガンドを指し、これは、受容体への結合の作用を有し、したがって、リガンド依存的な受容体活性を特異的に刺激する化合物である（任意のリガンドの不在下において決定された基線レベルとは区別し得るものとして）。この作用はまた、単に、受容体刺激作用または受容体活性化作用としても言及される。さらに、「アゴニスト」に対する同義語としては、「アクチベーター」、「刺激因子」、「受容体活性化リガンド」がある。アゴニストは、天然の化合物、天然の化合物から誘導された半合成の化合物、および合成の化合物を含む。ＬＴＢＲアゴニストは、当該分野において公知であり、それらは、高内皮小胞（high endothelial vesicles：ＨＥＶｓ）および三次リンパ球構造（ＴＬＳ）の誘導に関与する。
本明細書において記載される場合、用語「ＬＴＢＲアゴニスト」とは、受容体ＬＴＢＲに対して特異的なリガンドを指し、これは、受容体への結合の作用を有し、したがって、リガンド依存的な受容体活性を特異的に刺激する化合物である（任意のリガンドの不在下において決定された基線レベルとは区別し得るものとして）。この作用はまた、単に、受容体刺激作用または受容体活性化作用としても言及される。さらに、「アゴニスト」に対する同義語としては、「アクチベーター」、「刺激因子」、「受容体活性化リガンド」がある。アゴニストは、天然の化合物、天然の化合物から誘導された半合成の化合物、および合成の化合物を含む。ＬＴＢＲアゴニストは、当該分野において公知であり、それらは、高内皮小胞（high endothelial vesicles：ＨＥＶｓ）および三次リンパ球構造（ＴＬＳ）の誘導に関与する。
【0091】
ＬＴＢＲ、別名、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー３（ＴＮＦＲＳＦ３）は、アポトーシスおよびサイトカイン放出に関与するリンホトキシンに対する細胞表面受容体である。それは、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである。それは、上皮および骨髄系の系列の細胞を含むほとんどの細胞型の表面上で発現されるが、ＴおよびＢリンパ球においては発現されない。当該タンパク質は、リンホトキシン膜形態（リンホトキシン－アルファとリンホトキシン－ベータとの複合体）に特異的に結合する。コードされるタンパク質およびそのリガンドは、リンパ系組織の発生および組織化において役割を果たす。
【0092】
リンホトキシン－アルファ／ベータ／ベータ（リンホトキシン－αββ）は、リンホトキシン－アルファの１つのサブユニットまたはコピーおよびリンホトキシン－ベータの２つのサブユニットまたはコピーを含んでなる、ヘテロ三量体の種である。リンホトキシン－αββは、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）に結合する。ＬＴＢＲの活性化は、シグナル伝達イベントを開始させ、ＣＸＣＬ１２、ＣＸＣＬ１３、ＣＣＬ１９、およびＣＣＬ２１を含むがこれらに限定されないケモカインの発現をもたらす。これらのケモカインは、樹状細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞の遊走を誘導して、胚中心を確立するように働く。リンホトキシン－αββは、したがって、本発明における適用のために好適なＬＴＢＲアゴニストおよびＨＥＶ誘導因子である。
【0093】
ＬＩＧＨＴ、別名、腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＳＦ１４）は、ＴＮＦスーパーファミリーのメンバーであり、その受容体は、リンホトキシンベータ受容体（ＬＴＢＲ）、ヘルペスウイルス侵入メディエーター（herpes virus entry mediator：ＨＶＥＭ）、およびデコイ受容体３（ＤｃＲ３）として同定されている。ＬＩＧＨＴは、「homologous to lymphotoxin, exhibits inducible expression and competes with HSV glycoprotein D for binding to herpesvirus entry mediator, a receptor expressed on T lymphocytes」の略語である。表面抗原分類の用語において、それは、ＣＤ２５８として分類される。このタンパク質は、リンパ様細胞の活性化のための共刺激因子として機能し得る。それは、既知のＬＴＢＲアゴニストおよびＨＥＶ誘導因子である。
【0094】
当業者により理解されるであろうとおり、原則的に、ＬＴＢＲのアゴニストの任意の型を、本発明において用いることができ、アゴニストの異なる型は、当業者にとって容易に入手可能であるか、小分子および生物製剤（biologics）または生物製剤から誘導される分子を含む、当該分野における典型的な知識を用いて作製することができる。特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストの結合部分は、タンパク質性であり、ことさらにはＬＴＢＲアゴニスト性ポリペプチドである。さらなる態様において、ＬＴＢＲアゴニストの結合部分は、抗体ベースであるかまたは非抗体ベースであり、好ましくは抗体ベースである。非抗体ベースのアゴニストとして、これらに限定されないが、アフィボディー（登録商標）、Kunitzドメインペプチド、モノボディー（アドネクチン）、アンティカリン（登録商標）、設計されたアンキリンリピートドメイン（ＤＡＲＰｉｎｓ）、センティリン、フィノマー、アビマー；アフィリン；アフィチン、ペプチドなどが挙げられる。
【0095】
特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、リンホトキシン－αββ、ＬＩＧＨＴまたはＬＴＢＲに結合するフラグメントまたはその模倣物から選択される。別の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、リンホトキシンアルファまたはリンホトキシンベータを含む。さらなる態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、リンホトキシンアルファおよびリンホトキシンベータ、特に１つのリンホトキシンアルファ部分および２つのリンホトキシンベータ部分を含む、融合ペプチドである。かかるＬＴＢＲアゴニストは、例えば、ＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１およびＷＯ９６２２７８８ Ａ１において開示され、これらは、本明細書において参考として援用される。特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１の配列番号１６、配列番号１７、または配列番号１８を含む。
【0096】
ＬＩＧＨＴおよびＬＩＧＨＴ模倣ペプチドもまた、当該分野において、例えばＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１から、公知である。ある態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＩＧＨＴ（例えば、ヒトＬＩＧＨＴ）またはそのフラグメントを含む。非限定的な例として、ＬＴＢＲ－結合部分は、ＬＩＧＨＴまたはそのフラグメントの細胞外ドメインを含む。ある態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＩＧＨＴホモ三量体を含む（例えば、単鎖ＬＩＧＨＴホモ三量体）。例えば、ＬＴＢＲアゴニストは、ヒトＬＩＧＨＴの細胞外ドメイン、ヒトＬＩＧＨＴの細胞外ドメインに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するそのバリアント、またはそのフラグメントを含んでもよい。ある態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１の配列番号８５に対して、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチド（例えば、ＬＩＧＨＴホモ三量体）を含んでもよい。いくつかの態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、単鎖ポリペプチドである。ある態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１の配列番号８６に対して、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。例えば、ＬＴＢＲアゴニストは、ＷＯ２０１８１１９１１８ Ａ１の配列番号８６を含んでもよい。いくつかの態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＨＶＥＭに結合するかまたはこれを活性化する能力を有する、変異体ＬＩＧＨＴホモ三量体を含む。
【0097】
特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、細胞傷害活性を有しない。さらなる態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、ＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはＡＤＣＰ活性を有しない。別の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、それが結合する細胞の溶解を引き起こさない。別の特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、それが結合する細胞を枯渇させない。
【0098】
好ましい態様において、アゴニストは、抗体または活性な抗体フラグメントであるＬＴＢＲアゴニスト性部分を含む。本発明のさらなる側面において、アゴニストは、抗体（「アゴニスト性抗体」）である。ＬＴＢＲに特異的に結合するアゴニスト性抗体は、当該分野において公知である。例えば、ＷＯ２００６／１１４２８４ Ａ２、ＷＯ２００４／０５８１９１ Ａ２、およびＷＯ０２／３０９８６ Ａ２を参照；これらの各々は、本明細書により本明細書において参考として援用される。本発明のさらなる側面において、抗体は、モノクローナルである。抗体は、付加的に、または代替的に、ヒト化されていても、ヒトのものであってもよい。さらなる側面において、抗体は、ヒトのものであるか、または任意の場合において、ヒト対象におけるその使用および投与を可能にする形式および特徴を有する抗体である。抗体は、これらに限定されないが、マウス、ラット、ニワトリ、ウサギ、ヤギ、ウシ、非ヒト霊長類、ヒト、ヒトコブラクダ（dromedary）、ラクダ（camel）、ラマ、アルパカおよびサメを含む任意の種から誘導してよい。
【0099】
本発明の一側面において、ＬＴＢＲアゴニストは、活性な抗体フラグメントを含む。
別の態様において、上で詳述されるとおりのＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、ＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。
本発明のさらなる態様において、上で詳述されるとおりのＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのＦｃ領域部分、およびＬＴＢＲに結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、ＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのＦｃ領域部分と、ＬＴＢＲに結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分とが、ペプチドリンカーにより一緒に連結されたものを含む、遺伝子操作されたポリペプチドである。Ｆｃ領域部分および／またはシングルドメイン抗体部分領域のアミノ酸配列は、ヒトのために免疫原性を低下させるためにヒト化されていてもよい。
別の態様において、上で詳述されるとおりのＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、ＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。
本発明のさらなる態様において、上で詳述されるとおりのＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのＦｃ領域部分、およびＬＴＢＲに結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、ＬＴＢＲアゴニストは、少なくとも１つのＦｃ領域部分と、ＬＴＢＲに結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分とが、ペプチドリンカーにより一緒に連結されたものを含む、遺伝子操作されたポリペプチドである。Ｆｃ領域部分および／またはシングルドメイン抗体部分領域のアミノ酸配列は、ヒトのために免疫原性を低下させるためにヒト化されていてもよい。
【0100】
特に、シングルドメイン抗体は、ナノボディー（Nanobody）（登録商標）（本明細書において定義されるとおりの）またはその好適なフラグメントであってよい（注意；ナノボディー（Nanobody）（登録商標）、ナノボディー（Nanobodies）（登録商標）およびナノクローン（Nanoclone）（登録商標）は、Sanofiの会社であるAblynx N.V.の登録商標である）。さらに、完全サイズの抗体については、ＶＨＨおよびナノボディー（Nanobodies）（登録商標）などの単一可変ドメインを、ヒト化に供して、ヒト化されたシングルドメイン抗体を得ることができる。別の特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、Ｆｃドメインを含まない。さらなる特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、１つ以上のシングルドメイン抗体部分を含み、Ｆｃドメインを含まない。Techniques for generating ＬＴＢＲアゴニストを作製するための技術は、当業者に利用可能である。
【0101】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義されるとおりのＬＴＢＲアゴニストをコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様において、かかる提供された核酸分子は、コドン最適化された核酸配列を含んでもよい。別の態様において、核酸は、例えば、細菌、酵母、昆虫、魚、マウス、サルまたはヒトの細胞などの宿主細胞における発現のために適切な核酸ベクター中の発現カセット中に含まれる。いくつかの態様において、本発明 所望される結合剤を発現する異種性核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。
【0102】
いくつかの態様において、本発明は、上で定義されるとおりの単離されたＬＴＢＲアゴニストを調製する方法を提供する。いくつかの態様において、かかる方法は、核酸（例えば、ベクターを含むか、および／またはこれを介して宿主細胞に送達され得る、異種性核酸）を含む、宿主細胞を培養することを含んでもよい。好ましくは、宿主細胞（および／または異種性核酸配列）は、ＬＴＢＲアゴニストが宿主細胞から分泌され、細胞培養上清から単離されるように、配置され、構築される。
【0103】
組み合わせ
上述のとおり、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストが用いられた場合に、相乗効果を観察した。本発明の１つの目的は、したがって、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせである。本明細書においてなされた開示から理解されるであろうが、本明細書において記載される特定のＴｒｅｇ枯渇剤と特定のＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせは、本発明の目的である。それに対してさらに、好ましい態様であるものとして言及されるＴｒｅｇ枯渇剤と、好ましい態様であるものとして言及されるＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせは、組み合わせ、組み合わせを含む組成物、およびかかる組み合わせに関する治療に関して、好ましい態様を構成する。
上述のとおり、本発明者らは、驚くべきことに、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストが用いられた場合に、相乗効果を観察した。本発明の１つの目的は、したがって、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストを含む組み合わせである。本明細書においてなされた開示から理解されるであろうが、本明細書において記載される特定のＴｒｅｇ枯渇剤と特定のＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせは、本発明の目的である。それに対してさらに、好ましい態様であるものとして言及されるＴｒｅｇ枯渇剤と、好ましい態様であるものとして言及されるＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせは、組み合わせ、組み合わせを含む組成物、およびかかる組み合わせに関する治療に関して、好ましい態様を構成する。
【0104】
好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーに結合し、細胞傷害活性を有する。
別の好ましい態様において、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３からなる群より選択される。特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４から選択される。
別の好ましい態様において、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３からなる群より選択される。特定の態様において、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、およびＩＣＯＳ；好ましくはＣＣＲ８、ＣＤ２５、およびＣＣＲ４から選択される。
【0105】
より好ましい態様において、Ｔｒｅｇ細胞の細胞表面マーカーは、ＣＣＲ８である。したがって、かかる好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８結合剤である。
さらに好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤の、特にＣＣＲ８結合剤の細胞傷害活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、Ｔ細胞に結合してこれを活性化するか、または細胞傷害性ペイロードを含む、細胞傷害性部分の存在により引き起こされる。
さらに好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤の、特にＣＣＲ８結合剤の細胞傷害活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、Ｔ細胞に結合してこれを活性化するか、または細胞傷害性ペイロードを含む、細胞傷害性部分の存在により引き起こされる。
【0106】
好ましくは、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含む。
有利には、Ｆｃ領域部分は、例えば、脱フコシル化を通して、またはＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増大させる変異を含むことにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
有利には、Ｆｃ領域部分は、例えば、脱フコシル化を通して、またはＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／もしくはＡＤＣＰを増大させる変異を含むことにより、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
【0107】
さらに好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する、少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。
特定の態様において、本発明の組み合わせは、本明細書において「Ｔｒｅｇを枯渇させる抗体」としてもまた言及される、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するマーカー結合抗体、特にＣＣＲ８に結合する抗体、ならびにＬＴＢＲアゴニスト性抗体を含む。したがって、特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストの両方は、抗体、特に、区別し得る抗体である。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３に結合する抗体であり、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲに結合するアゴニスト性抗体である。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８に結合する抗体であり、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲに結合するアゴニスト性抗体である。
特定の態様において、本発明の組み合わせは、本明細書において「Ｔｒｅｇを枯渇させる抗体」としてもまた言及される、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有するマーカー結合抗体、特にＣＣＲ８に結合する抗体、ならびにＬＴＢＲアゴニスト性抗体を含む。したがって、特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストの両方は、抗体、特に、区別し得る抗体である。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８、ＣＣＲ４、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２５、ＴＩＧＩＴ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３８、ＧＩＴＲ、４－１ＢＢ、ＮＲＰ１、およびＬＡＧ－３に結合する抗体であり、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲに結合するアゴニスト性抗体である。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、ＣＣＲ８に結合する抗体であり、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲに結合するアゴニスト性抗体である。
【0108】
別の態様において、本発明の組み合わせは、１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤をさらに含む。一態様において、前記の１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤は、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、および／またはＬＴＢＲアゴニストと共に存在することができる。したがって、本発明の組み合わせは、前記１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤、およびＬＴＢＲアゴニストと共に、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤を含む、第１の組成物を含んでもよく；または、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤と、ＬＴＢＲアゴニストを前記の１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤と共に含む、第２の組成物とを含む；または、前記第１および第２の組成物、すなわち、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤を、前記１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤と共に、およびＬＴＢＲアゴニストを、前記１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはその賦形剤と共に含む。
【0109】
本明細書において用いられるとおりの組み合わせは、２つの特徴（Ｔｒｅｇ枯渇およびＬＴＢＲ作用）の組み合わせを指す。これらの特徴は、単一の分子、例えばＴｒｅｇ結合部分およびＬＴＢＲ作用部分を含む分子において、存在してもよい。二重特異性抗体は、本発明を実施するための可能性であるが、本明細書において下に記載されるであろうとおり、特定の、および好ましい態様において、本発明における使用のためのＴｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストは、区別し得る分子である。より特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、本明細書において記載されるとおりの細胞傷害性ＣＣＲ８に結合する抗体などの抗体であり、ＬＴＢＲアゴニストは、区別し得る分子であり、好ましくはＬＴＢＲアゴニスト性抗体であり。さらなる好ましい態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、本明細書において定義されるとおりの細胞傷害性部分を含まない。
【0110】
組成物
本発明の別の目的は、本発明の組み合わせを含む組成物である。したがって、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合し、細胞傷害活性を有する、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、およびＬＴＢＲアゴニストを含む。
本発明の別の目的は、本発明の組み合わせを含む組成物である。したがって、本発明の組成物は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合し、細胞傷害活性を有する、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、およびＬＴＢＲアゴニストを含む。
【0111】
好ましい態様において、本発明の組成物は、本明細書においてまた「Ｔｒｅｇ枯渇性抗体」、特に、ＣＣＲ８結合抗体として言及される、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有する、マーカー結合抗体、およびＬＴＢＲアゴニスト性抗体を含む。
さらに好ましい態様において、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤をさらに含む。
さらに好ましい態様において、本発明の組成物は、１つ以上の薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤をさらに含む。
【0112】
二重特異性分子
本発明のさらに別の側面は、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分、およびＬＴＢＲアゴニスト性部分を含む、二重特異性分子であって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性を有する。
本明細書において用いられる場合、「二重特異性」とは、２つの区別し得るエピトープ、または２つの異なる抗原もしくはポリペプチド（このうち一方はＬＴＢＲ抗原またはポリペプチドである）に結合する能力を有する分子を指す。
本発明のさらに別の側面は、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分、およびＬＴＢＲアゴニスト性部分を含む、二重特異性分子であって、ここで、二重特異性分子は、細胞傷害活性を有する。
本明細書において用いられる場合、「二重特異性」とは、２つの区別し得るエピトープ、または２つの異なる抗原もしくはポリペプチド（このうち一方はＬＴＢＲ抗原またはポリペプチドである）に結合する能力を有する分子を指す。
【0113】
好ましい態様において、二重特異性分子の細胞傷害活性は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導するか、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を誘導するか、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）を誘導するか、Ｔ細胞に結合してこれを活性化するか、または細胞傷害性ペイロードを含む、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分により、特にＣＣＲ８結合部分により、引き起こされる。
【0114】
特定の態様において、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、タンパク質性、ことさらには、Ｔｒｅｇ枯渇性ポリペプチド（すなわち、マーカーに結合するポリペプチド）、特にＣＣＲ８結合ポリペプチドである。さらなる態様において、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、抗体ベースであるかまたは非抗体ベースであり、好ましくは抗体ベースである。好ましい態様において、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、抗体または活性な抗体フラグメントである。
【0115】
別の態様において、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、少なくとも１つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。
【0116】
さらなる態様において、細胞傷害性部分は、ＣＤ３に結合する抗体またはその抗原決定フラグメントを含む。したがって、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８およびＣＤ３に、結合してもよい。かかるＴｒｅｇ枯渇剤は、腫瘍内Ｔｒｅｇに結合して、これらのＴｒｅｇに対するＴ細胞の細胞傷害活性を指揮し、それにより、腫瘍環境からそれらを枯渇させる。特定の態様において、本発明のＴｒｅｇ枯渇剤は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する部分、および、ＣＤ３に結合する部分を含み、ここで、少なくとも１つの部分は、抗体ベースであり、特にここで、両方の部分が抗体ベースである。したがって、特定の態様において、本発明は、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に特異的に結合する抗体またはその抗原決定フラグメント、およびＣＤ３に特異的に結合する抗体またはその抗原決定フラグメントを含む、二重特異性コンストラクトを提供する。
【0117】
一態様において、細胞傷害性部分は、フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分を含む。本発明の文脈内において、用語「フラグメント結晶化可能（Ｆｃ）領域部分」とは、重鎖の定常領域を含んでなり、抗体Ｆｃ受容体および補体系のいくつかの他のタンパク質への結合の原因となり、それによりＡＤＣＣ、ＣＤＣ、および／またはＡＤＣＰ活性を誘導する、免疫グロブリン分子の結晶化可能フラグメントを指す。
【0118】
本発明のさらなる態様において、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、少なくとも１つのＦｃ領域部分、およびＴｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分を含む。好ましくは、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、少なくとも１つのＦｃ領域部分と、Ｔｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する少なくとも２つのシングルドメイン抗体部分とが、ペプチドリンカーにより一緒に連結されたものを含む、遺伝子操作されたポリペプチドである。Ｆｃ領域部分および／またはシングルドメイン抗体部分領域のアミノ酸配列は、ヒトのために免疫原性を低下させるためにヒト化されていてもよい。
【0119】
一態様において、Ｆｃ領域部分は、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を増大させるように操作されている。
本発明の特定の態様において、Ｆｃ領域部分を含む、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、ＡＤＣＣ応答を誘発するように最適化され、すなわち、Ｆｃ領域部分を含む他のもの、特に他のＣＣＲ８結合剤（リガンドの、特にＣＣＬ１の、そのＴｒｅｇの細胞表面マーカーへの、特にＣＣＲ８への結合を阻害しないものを含む）と比較して、ＡＤＣＣ応答が増強されるか、増大するか、または改善される。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、増強されたＡＤＣＣ応答を誘発するように操作されている。
本発明の特定の態様において、Ｆｃ領域部分を含む、Ｔｒｅｇを枯渇させる部分、特にＣＣＲ８結合部分は、ＡＤＣＣ応答を誘発するように最適化され、すなわち、Ｆｃ領域部分を含む他のもの、特に他のＣＣＲ８結合剤（リガンドの、特にＣＣＬ１の、そのＴｒｅｇの細胞表面マーカーへの、特にＣＣＲ８への結合を阻害しないものを含む）と比較して、ＡＤＣＣ応答が増強されるか、増大するか、または改善される。好ましい態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、増強されたＡＤＣＣ応答を誘発するように操作されている。
【0120】
本発明の好ましい態様において、Ｆｃ領域部分を含む、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、ＡＤＣＰ応答を誘発するように最適化され、すなわち、他のもの、特にＦｃ領域部分を含む他のもの、特に他のＣＣＲ８結合剤（リガンドの、特にＣＣＬ１の、その受容体（細胞表面マーカー）への、特にＣＣＲ８への結合を阻害しないものを含む）と比較して、ＡＤＣＰ応答が増強されるか、増大するか、または改善される。
【0121】
別の態様において、細胞傷害性部分は、Ｆｃガンマ受容体に結合する部分、ことさらには、ＦｃγＲ、特に、ＦｃγＲＩおよび／またはＦｃγＲｌｌａおよび／またはＦｃγＲｌｌｌａなどの活性化受容体、特にＦｃγＲｌｌｌａに結合してこれを活性化する部分を含む。ＦｃγＲに結合する部分は、本明細書において前に記載されるとおり、抗体ベースであっても、非抗体ベースであってもよい。抗体ベースである場合、部分は、その可変領域を通してＦｃγＲに結合してもよい。
【0122】
本明細書において議論されるとおりの本発明の二重特異性分子は、体細胞雑種などの生物学的方法；または細胞株における、もしくは生体内での、所望される結合剤の構造をコードする非ネイティブなＤＮＡ配列の発現などの遺伝学的方法；化学的方法（例えば、化学的カップリング、遺伝子融合、非共有結合的もしくは他の方法による１つ以上の分子的実体への会合、例えばそのフラグメントの別の結合剤により）；またはそれらの組み合わせを介して、生成することができる。
【0123】
二重特異性分子を生成することを可能にする技術および製品は、当該分野において公知であり、これは、文献において、代替的な形式、Ｔｒｅｇ枯渇剤－薬物抱合体、Ｔｒｅｇ枯渇剤設計方法、in vitroスクリーニング方法、定常領域、翻訳後および化学的な修飾、Ｆｃドメイン工学などのがん細胞の死を引き起こすための改善された特徴に関してもまた、広範に総説されているとおりである（Tiller K and Tessier P, Annu Rev Biomed Eng. 17:191-216 (2015)；Speiss C et al., Molecular Immunology 67:95-106 (2015)；Weiner G, Nat Rev Cancer, 15:361-370 (2015)；Fan G et al., J Hematol Oncol 8:130 (2015)）。
【0124】
さらなる態様において、本発明は、本明細書において定義されるとおりの二重特異性分子をコードする核酸分子を提供する。いくつかの態様において、かかる提供された核酸分子は、コドン最適化された核酸配列を含んでもよい。別の態様において、核酸は、例えば細菌、酵母、昆虫、魚、マウス、サルまたはヒトの細胞などの宿主細胞における発現のために適切な核酸ベクター中の発現カセット中に含まれる。いくつかの態様において、本発明は、所望される結合剤を発現する異種性核酸分子（例えば、ＤＮＡベクター）を含む宿主細胞を提供する。
【0125】
特定の態様において、本発明の二重特異性分子は、治療核酸として投与される。本明細書において用いられる用語「治療核酸」とは、任意の核酸分子であって、真核生物（例えば、ヒトなどの哺乳類）中に導入された場合に治療効果を有し、本発明の結合剤をコードするＤＮＡおよびＲＮＡ分子を含むものを指す。
【0126】
処置
本発明のさらなる目的は、医薬としての使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸である。
本発明の別の目的は、がんの処置における使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸である。
本発明のさらなる目的は、医薬としての使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸である。
本発明の別の目的は、がんの処置における使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示する二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸である。
【0127】
本発明のさらに別の目的は、がんの処置における使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示するＴｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤であって、ここで、処置は、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示するＬＴＢＲアゴニストの投与をさらに含む。
好ましくは、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、Ｔｒｅｇを枯渇させる抗体、特にＴｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する、ＣＣＲ８に結合する抗体であり、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有し；かつ、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲアゴニスト性抗体である。
好ましくは、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤は、Ｔｒｅｇを枯渇させる抗体、特にＴｒｅｇの細胞表面マーカーに、特にＣＣＲ８に結合する、ＣＣＲ８に結合する抗体であり、ＡＤＣＣ、ＣＤＣおよび／またはＡＤＣＰ活性を有し；かつ、ＬＴＢＲアゴニストは、ＬＴＢＲアゴニスト性抗体である。
【0128】
本発明のなお別の目的は、がんの処置における使用のための、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示するＬＴＢＲアゴニストであって、ここで、処置は、本明細書において記載されるとおりの特徴を提示するＴｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤の投与をさらに含む。
さらなる態様において、本発明は、本発明の組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本発明の二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸を投与することを含む、対象における疾患を処置するための方法を提供する。好ましくは、疾患はがんであり、特に固形腫瘍の処置である。
さらなる態様において、本発明は、本発明の組み合わせ、かかる組み合わせを含む組成物、本発明の二重特異性分子、ならびにかかる二重特異性分子をコードする核酸を投与することを含む、対象における疾患を処置するための方法を提供する。好ましくは、疾患はがんであり、特に固形腫瘍の処置である。
【0129】
さらなる態様において、本発明は、対象において疾患を処置するための方法を提供し、該方法は、以下：
－ 本明細書において定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤を投与すること；および
－ 本明細書において定義されるとおりのＬＴＢＲアゴニストを投与すること、
のステップを含み、
ここで、両方の投与は、別々に、同時に、または連続的に行われる。
－ 本明細書において定義されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤を投与すること；および
－ 本明細書において定義されるとおりのＬＴＢＲアゴニストを投与すること、
のステップを含み、
ここで、両方の投与は、別々に、同時に、または連続的に行われる。
【0130】
別の特定の態様において、本発明は、Ｔｒｅｇ枯渇治療を経験している対象において疾患を処置するための方法を提供し、当該方法は、ＬＴＲＢアゴニストを前記対象に投与することを含む。
好ましくは、疾患は、がん、特に固形腫瘍の処置である。
好ましくは、疾患は、がん、特に固形腫瘍の処置である。
【0131】
本発明の好ましい態様において、本明細書において記載されるとおりの本発明の側面の対象は、哺乳動物、好ましくはネコ、イヌ、ウシ、ロバ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ハムスター、マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットであるが、最も好ましくは対象は、ヒトである。したがって、本明細書において記載されるとおりの全ての側面において、対象は、好ましくはヒトである。
【0132】
本明細書において用いられる場合、用語「がん」、「がん性」または「悪性の」とは、典型的には調節されない細胞増殖により特徴づけられる、哺乳動物における生理学的状態を指すか、またはこれを説明する。
本明細書において用いられる場合、用語「腫瘍」とは、それが、がんを診断されているか、がんを有することが疑われる対象に適用される場合、任意のサイズの、悪性であるか、または潜在的に悪性である新生物または組織塊を指し、原発腫瘍および続発性の新生物を含む。用語「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」および「細胞腫」はまた、本明細書において、細胞増殖の制御の著しい喪失により特徴づけられる異常な増殖表現型を示す腫瘍および腫瘍細胞を指すために、互換的に用いることができる。一般に、処置のための目的の細胞として、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性および非転移性の細胞が挙げられる。本開示の教示は、任意のおよび全ての腫瘍に関連し得る。
本明細書において用いられる場合、用語「腫瘍」とは、それが、がんを診断されているか、がんを有することが疑われる対象に適用される場合、任意のサイズの、悪性であるか、または潜在的に悪性である新生物または組織塊を指し、原発腫瘍および続発性の新生物を含む。用語「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」および「細胞腫」はまた、本明細書において、細胞増殖の制御の著しい喪失により特徴づけられる異常な増殖表現型を示す腫瘍および腫瘍細胞を指すために、互換的に用いることができる。一般に、処置のための目的の細胞として、前癌性（例えば、良性）、悪性、前転移性、転移性および非転移性の細胞が挙げられる。本開示の教示は、任意のおよび全ての腫瘍に関連し得る。
【0133】
腫瘍の例として、これらに限定されないが、細胞腫、リンパ腫、白血病、芽細胞腫および肉腫が挙げられる。かかるがんのより特定の例として、扁平細胞癌、骨髄腫、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、神経膠腫、肝細胞癌（ＨＣＣ）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫、胃腸（管）癌、腎癌、卵巣癌、肝臓癌、リンパ芽球性白血病、リンパ球性白血病、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、メラノーマ、軟骨肉腫、神経芽細胞腫、膵臓癌、多形神経膠芽腫、子宮頚癌、脳癌、胃癌、膀胱癌、ヘパトーマ、乳癌、結腸癌、および頭頸部癌が挙げられる。
【0134】
一側面において、腫瘍は、固形腫瘍を含む。固形腫瘍の例は、肉腫（組織、例えば海綿骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管性、造血性または線維性結合組織中の、間葉系由来の形質転換した細胞から生じるがんを含む）、細胞腫（上皮細胞から生じる腫瘍を含む）、中皮腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫などである。固形腫瘍を含む腫瘍として、限定することなく、脳癌、肺癌、胃癌、十二指腸癌、食道の癌、乳癌、結腸および直腸の癌、腎癌、膀胱癌、腎臓癌、膵臓癌、前立腺癌、卵巣癌、メラノーマ、口腔癌、肉腫、眼の癌、甲状腺癌、尿道癌、膣癌、頚部癌、リンパ腫などが挙げられる。
【0135】
別の特定の態様において、腫瘍は、浸潤性乳癌、結腸腺癌、頭頸部扁平上皮癌、胃腺癌、肺腺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平細胞癌（ＮＳＣＬＣ）、腎淡明細胞癌（kidney renal clear cell carcinoma）、皮膚性メラノーマ、食道癌、子宮頚癌、肝細胞癌、メルケル細胞癌、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、古典的ホジキンリンパ腫（ｃＨＬ）、尿路上皮癌、高マイクロサテライト不安定性（Microsatellite Instability-High：ＭＳＩ－Ｈ）癌およびミスマッチ修復欠損（ｄＭＭＲ）癌からなる群より選択される。
【0136】
さらなる態様において、腫瘍は、乳癌、子宮体癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、結腸直腸癌、および腎臓癌からなる群より選択される。なおさらなる態様において、腫瘍は、浸潤性乳癌、結腸腺癌、頭頸部扁平上皮癌、胃腺癌、肺腺癌（ＮＳＣＬＣ）、肺扁平細胞癌（ＮＳＣＬＣ）、腎淡明細胞癌、および皮膚性メラノーマからなる群より選択される。一側面において、がんは、ＣＣＲ８を発現する腫瘍を含み、これは、これらに限定されないが、乳癌、子宮体癌、肺癌、胃癌、頭頸部扁平上皮癌、皮膚癌、結腸直腸癌、および腎臓癌を含む。１つの特定の態様において、腫瘍は、乳癌、結腸腺癌、および肺癌からなる群より選択される。
【0137】
本明細書において用いられる場合、用語「投与」とは、薬物、プロドラッグ、抗体または他の剤、または治療的処置を、生理学的な系（例えば、対象、またはin vivo、in vitroもしくはex vivoの細胞、組織、および臓器）に与える行為を指す。ヒトの身体への投与の例示的な経路は、口（経口）、皮膚（経皮）、口腔粘膜（頬側）、耳を通したもの、注射によるもの（例えば、静脈内で、皮下で、腫瘍内で、腹腔内で、など）その他であってよい。本発明のＴｒｅｇ枯渇剤の、またはＬＴＢＲアゴニストの投与という用語は、Ｔｒｅｇ枯渇剤の、またはＬＴＢＲアゴニストの、直接的投与、ならびに、対象において当該核酸からＴｒｅｇ枯渇剤またはＬＴＢＲアゴニストが生成されるように、Ｔｒｅｇ枯渇剤またはＬＴＢＲアゴニストをコードする核酸を投与することによる、間接的投与を含む。Ｔｒｅｇ枯渇剤の、またはＬＴＢＲアゴニストの投与は、したがって、in vivoでのＴｒｅｇ枯渇剤またはＬＴＢＲアゴニストの生成をもたらすＤＮＡおよびＲＮＡ治療方法を含む。
【0138】
腫瘍を「処置する」または「処置すること」への言及は、本明細書において用いられる場合、例えば、腫瘍細胞の数の減少、腫瘍サイズの減少、周辺の臓器中へのがん細胞の浸潤の速度の低下、または腫瘍転移もしくは腫瘍増殖の速度の低下などの、少なくとも１つの治療効果の達成を定義する。本明細書において用いられる場合、用語「調節する」とは、化合物の、細胞の機能（細胞の増殖、浸潤、血管新生、アポトーシスなどを含むがこれらに限定されない）のある側面に影響を及ぼす（例えば、これを促進するか処置される）活性を指す。
【0139】
がんにおける正の治療効果は、多数の方法（例えば、Weber (2009) J Nucl Med 50, 1S-10S）において測定することができる。例として、腫瘍増殖阻害に関して、国立癌研究所（National Cancer Institute：ＮＣＩ）の基準によれば、Ｔ／Ｃ≦４２％は、抗腫瘍活性の最小レベルである。Ｔ／Ｃ（％）＝処置された腫瘍容積の中央値／対照の腫瘍容積の中央値×１００により、Ｔ／Ｃ＜１０％は、高い抗腫瘍活性レベルであるとみなされる。いくつかの態様において、治療有効量により達成される処置は、無増悪生存（ＰＦＳ）、無病生存（ＤＦＳ）または全生存（ＯＳ）のうちのいずれかである。ＰＦＳは、「腫瘍進行までの時間」としても言及され、処置の間および後の、がんが増殖しない時間の長さを示し、患者が完全な応答または部分的な応答を経験した時間の量、ならびに患者が安定した疾患を経験した時間の量を含む。ＤＦＳは、処置の間および後の、患者が疾患を有しないでい続ける時間の長さを指す。ＯＳは、ナイーブまたは未処置の個体または患者と比較した、平均余命の延長を指す。
【0140】
「予防（prevention）」（または予防（prophylaxis））への言及は、本明細書において用いられる場合、がんの症状の発症を遅延させるかまたはこれを予防することを指す。予防（prevention）は、絶対的（疾患が全く生じないようなもの）であっても、一部の個体において、または限定された量の時間の間のみ、効果的であってもよい。
【0141】
本発明の好ましい側面において、対象は、確立された腫瘍を有し、すなわち、対象は、例えば固形腫瘍として分類される腫瘍を既に有する。したがって、本発明は、本明細書において記載されるとおり、対象が固形腫瘍などの腫瘍を既に有する場合に用いることができる。したがって、本発明は、既存の腫瘍を処置するために用いることができる治療選択肢を提供する。本発明の一側面において、対象は、既存の固形腫瘍を有する。本発明は、予防（prevention）として、または好ましくは処置として、固形腫瘍を既に有する対象において用いてもよい。一側面において、本発明は、予防剤（preventative）または予防剤（prophylaxis）である。
【0142】
一側面において、本明細書において記載されるとおりの本発明を用いて、例えば他のがんの処置（例えば所与のがんのための標準治療処置）と比較して、腫瘍退縮が増強されてもよく、腫瘍増殖が損なわれるかまたは減少してもよく、および／または生存時間が延長されてもよい。
本発明の一側面において、本明細書において記載されるとおりの、腫瘍の処置または予防（prevention）の方法は、腫瘍を有する対象を同定する、好ましくは固形腫瘍を有する対象を同定するステップをさらに含む。
本発明の一側面において、本明細書において記載されるとおりの、腫瘍の処置または予防（prevention）の方法は、腫瘍を有する対象を同定する、好ましくは固形腫瘍を有する対象を同定するステップをさらに含む。
【0143】
本明細書において記載される治療の投与レジメンであって、腫瘍を有する患者を処置するために効果的であるものは、患者の疾患の状態、年齢および体重、ならびに治療が対象において抗がん応答を誘発する能力などの要因に依存して変化し得る。適切な投与量の選択は、当業者の能力の範囲内であろう。例えば、０．０１、０．１、０．３、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０または５０ｍｇ／ｋｇ。いくつかの態様において、かかる量は、投与レジメンによる投与のために適切な単位投与量（またはその分子と分母が同じ数の分数（a whole fraction））であって、関連がある集団に投与された（すなわち、治療的投与レジメンにより）場合に、所望されるかまたは有益な治療成績と相関すると決定されているものである。
【0144】
本明細書において記載されるとおりの本発明の任意の側面による組み合わせ、組成物および二重特異性分子は、医薬組成物の形態におけるものであってもよく、これは、付加的に、薬学的に受入可能な担体、希釈剤または賦形剤を含む。本明細書において用いられる場合、用語「薬学的に受入可能な担体」または「薬学的に受入可能な賦形剤」は、活性成分と組み合わされた場合に、当該成分が生物学的活性を保持することを可能にする、任意の材料を含む。薬学的に受入可能な担体は、組成物を増強または安定化するか、組成物の調製を容易にするために用いることができる。薬学的に受入可能な担体として、当業者には公知であるとおり、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などであって、生理学的に適合可能であるものが挙げられる（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences、第１８版、Mack Printing Company、１９９０年、ｐｐ．１２８９－１３２９；Remington: The Science and Practice of Pharmacy、第２１版、Pharmaceutical Press、２０１１年；およびこれらのその後のバージョンを参照）。前記薬学的に受入可能な担体の非限定的な例は、標準的な薬学的担体のうちのいずれか、例えば、リン酸緩衝化食塩水溶液、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、および多様な型の湿潤化剤を含む。
【0145】
これらの組成物として、例えば、液体、半固体および固体の投与処方物、例えば液体の溶液（例えば、注射可能および注入可能な溶液）、分散または懸濁液、錠剤、丸剤、またはリポソームが挙げられる。いくつかの態様において、好ましい形態は、意図される投与の様式および／または治療的適用に依存して変化し得る。組み合わせ、組成物または二重特異性分子を含む医薬組成物は、限定することなく、経口、粘膜、吸入による、局所、頬側、鼻、直腸または非経口（例えば、静脈内、注入、腫瘍内、節内、皮下、腹腔内、筋肉内、皮内、経皮、または対象の組織の物理的侵害を伴う他の種類の投与、および組織の侵害を通しての医薬組成物の投与）を含む、当該分野において公知の任意の適切な方法により投与することができる。かかる処方物は、例えば、皮内、腫瘍内もしくは皮下投与のために、または静脈内注入のために好適である、注射可能または注入可能な溶液の形態であってもよい。特定の態様において、結合剤または核酸は、静脈内投与される。投与は、間欠投与を含んでもよい。あるいは、投与は、少なくとも選択された期間にわたる、他の化合物の投与と同時に、またはその間の、持続投与（例えば、灌流）を含んでもよい。
【0146】
本発明の処方物は、一般にの、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりの、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、およびＬＴＢＲアゴニストの、治療有効量を含む。「治療的レベル」、「治療有効量」または「治療的量」とは、投与された活性剤の量または濃度であって、状態の症状を軽減または予防するために、状態を安全に処置するために適切であるものを意味する。
【0147】
いくつかの態様において、本発明の組み合わせにおいて定義されるとおりの、Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、およびＬＴＢＲアゴニストは、徐放性処方物、例えばインプラント、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化された送達系などの、迅速な放出および／または分解に対してそれを保護する担体と共に調製することができる。生分解性の、生体適合性のポリマーを用いることができる。
【0148】
当業者は、例えば、送達の経路（例えば、経口、対、静脈内、対、皮下、対、腫瘍内など）は、投与量に影響を及ぼし得、および／または、必要とされる投与量は、送達の経路に影響を及ぼし得ることを、理解するであろう。例えば、特定の部位または位置内（例えば、腫瘍内）での特に高い濃度の剤が目的となる場合、集中的な送達（例えば、この例においては、腫瘍内送達）が望ましいおよび／または有用である場合がある。所与の治療レジメンについて経路および／または投与スケジュールを最適化する場合に考慮されるべき他の要因として、例えば、処置されている特定のがん（例えば、型、ステージ、位置など）、対象の臨床的状態（例えば、年齢、全体的な健康など）、組み合わせ治療の存在または不在、および医師に公知の他の要因が挙げられ得る。特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤は、静脈内投与される。別の特定の態様において、ＬＴＢＲアゴニストは、静脈内投与される。さらなる特定の態様において、Ｔｒｅｇ枯渇剤およびＬＴＢＲアゴニストは、静脈内投与される。
【0149】
医薬組成物は、典型的には、製造および貯蔵の条件下において、無菌かつ安定であるべきである。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、懸濁液、リポソーム、または高い薬物濃度に好適な他のオーダーされた構造として処方することができる。無菌の注射可能溶液は、結合剤を、必要とされる量において、必要に応じて上で列挙された材料のうちの１つまたは組み合わせと共に、好適な溶媒中に組み込み、その後、ろ過滅菌することにより、調製することができる。非経口投与のための処方物として、これらに限定されないが、本明細書において議論されるとおり、懸濁液、溶液、油性または水性のビヒクル中のエマルジョン、ペースト、および移植可能な持続放出または生分解性の処方物が挙げられる。無菌の注射可能な処方物は、非毒性の非経口的に受入可能な希釈剤または溶媒を用いて調製してもよい。本発明による使用のための各々の医薬組成物は、使用される投与量および濃度において対象にとって非毒性である、薬学的に受入可能な分散剤、湿潤化剤、懸濁剤、等張化剤、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、担体、賦形剤、塩、または安定化剤を含んでもよい。好ましくは、かかる組成物は、所与の方法および／または投与の部位と適合可能な、例えば非経口（例えば、皮下、皮内、または静脈内注射）、腫瘍内、または腫瘍周囲投与のための、がんの処置における使用のための薬学的に受入可能な担体または賦形剤を、さらに含んでもよい。
【0150】
本発明による使用のための処置方法または組成物の態様は、全ての対象において正の治療効果を達成することにおいては効果的ではない場合があるが、一方で、良好な医療行為、ならびに、スチューデントｔ検定、Ｘ２検定、マン・ホイットニーによるＵ検定、クラスカル・ウォリス検定（Ｈ検定）、ヨンクヒール・タプストラ検定およびウィルコクソン検定などの当該分野に置いて公知の任意の統計学的試験により決定された場合に統計学的に有意な数の対象と一致する、医薬組成物および投与レジメンを用いることにおいては、それは効果的であるはずである。
【0151】
本明細書において、前におよび後に、腫瘍、腫瘍疾患、細胞腫またはがんが言及される場合、元の臓器または組織における、および／または任意の他の位置における転移もまた、腫瘍および／または転移の位置がどこであろうと、代替的に、または付加的に、関連付けられる。
【0152】
いくつかの態様において、がんに対する異なる剤が、本発明の組み合わせ、組成物または二重特異性分子と組み合わせて、同じまたは異なる送達の経路を介して、および／または異なるスケジュールにより、投与されてもよい。代替的に、または付加的に、いくつかの態様において、第１の活性剤の１つ以上の用量は、１つ以上の他の活性剤と、実質的に同時に、および、いくつかの態様においては、一般的な経路を介して、および／または単一の組成物の部分として、投与される。当業者は、さらに、本発明により提供される組み合わせ治療のいくつかの態様は、相乗効果を達成することを理解するであろう；いくつかのかかる態様において、組み合わせにおいて利用される１つ以上の剤の用量は、実質的に異なっても（例えば、低くとも）よく、および／または、剤が異なる治療レジメンにおいて（例えば、単剤治療として、および／または異なる組み合わせ治療の部分として）利用される場合に、標準的であるか、好ましいか、または必要とされるものに対して、代替的な経路により送達されてもよい。
【0153】
いくつかの態様において、２つ以上の活性剤が本発明により利用される場合、かかる剤は、同時に、または連続的に投与することができる。いくつかの態様において、１つの剤の投与は、別の剤の投与に対して、特に時間を合わせる。例えば、いくつかの態様において、第１の剤は、特定の効果が観察されるように（または観察されることが予想される、例えば、所与の投与レジメンと特定の目的の効果との間の相関を示す集団研究に基づいて）投与される。いくつかの態様において、組み合わせにおいて投与される剤についての所望される相対的な投与レジメンは、例えばex vivo、in vivoおよびin vitroモデルを用いて、評価されるかまたは経験的に決定され得る；いくつかの態様において、かかる評価または経験的決定は、in vivoで、患者の集団において（例えば、相関が確立されるように）、または代替的に、目的の特定の患者において、行われる。
【0154】
「組み合わせにおける」またはさらなる治療の投与を含む処置は、本発明による任意の側面の投与の前か、これと同時化、またはこれの後の、付加的な治療の投与を指し得る。組み合わせ処置は、したがって、同時、別々、または連続的に、投与することができる。
【0155】
別の態様において、本発明は、上記の組み合わせ、組成物および／または二重特異性分子を含む、キットを提供する。いくつかの態様において、キットは、薬学的に受入可能な担体またはそれの賦形剤をさらに含む。他の関連する態様において、キット中の上の組み合わせの構成成分のうちのいずれかは、単位用量、特に本明細書において記載される投与量において存在する。さらなる態様において、キットは、上の組み合わせの構成成分のうちのいずれかを対象に投与することにおける使用のための説明書を含む。１つの特定の態様において、キットは、本明細書において記載されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤、およびＬＴＢＲアゴニストを含む。Ｔｒｅｇ枯渇剤、特にＣＣＲ８結合剤およびＬＴＢＲアゴニストは、同じ組成物中に、または異なる組成物中に存在する。
【0156】
１つの特定の態様において、本発明は、本明細書において記載されるとおりの組み合わせ、組成物および／または二重特異性分子を含む、パッケージを提供し、ここで、パッケージは、免疫チェックポイント阻害剤による処置も受ける腫瘍患者に結合剤を投与するための説明書を伴うリーフレットを、さらに含む。
【0157】
さらに別の特定の態様において、本発明は、本明細書において記載されるとおりの疾患の処置のための医薬の製造のための、ＬＴＢＲアゴニストの使用を提供し、ここで、処置は、本明細書において記載されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤の投与をさらに含む。別の特定の態様において、本発明は、本明細書において記載されるとおりの疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書において記載されるとおりのＴｒｅｇ枯渇剤の使用を提供し、ここで、処置は、ＬＴＢＲアゴニストの投与をさらに含む。別のさらなる態様において、本発明は、本明細書において記載されるとおりの疾患の処置のための医薬の製造のための、本明細書において記載されるとおりのＬＴＲＢアゴニストおよびＴｒｅｇ枯渇剤の使用を提供する。本発明は、本明細書において記載されるとおりの疾患、特にがんの処置のための、本明細書において記載されるとおりの医薬組成物をさらに提供する。
【0158】
本発明は、ここで、以下の例によりさらに説明されるであろう。例は、図面を参照して、本発明を実施することにおいて当業者を補佐するために役立つことを意図され、決して、本発明の範囲を限定することは意図されない。
【0159】
例
以下の例は、本発明のある好ましい態様および側面を示し、さらに図示するために提供され、それらの範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
以下の例は、本発明のある好ましい態様および側面を示し、さらに図示するために提供され、それらの範囲を限定するものとして解釈されるものではない。
【0160】
例１：ＬＴＢＲレポーターアッセイ
安定なＬＴＢＲレポーター細胞株の作製
ヒト細胞株背景における機能的シグナル伝達を保証するために、マウスオルトログの細胞内部分がヒトのカウンターパートにより置き換えられた、マウス－ヒトキメラＬＴＢＲコード配列を担持する、トランスジェニックコンストラクトを作製した。ヒトＮＦβＢルシフェラーゼレポーターＨＥＫ２９３安定細胞株（Signosis、ｃａｔ．＃ＳＬ－００１２）を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco）中で、培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、６ウェルのプレート（Greiner）の１ウェルあたり７．５×１０５細胞の密度で播種し、一晩培養した。４０％のおおよそのコンフルエンスに達した後、FUGENE HDトランスフェクション試薬（Promega）を用いて、マウス－ヒトキメラＬＴＢＲ導入遺伝子を担持する直鎖化したｐｃＤＮＡ３．１で、細胞をトランスフェクトした。６時間後、細胞上清を注意深く取り除き、フレッシュな完全ＤＭＥＭで置き換えた。４８時間後、発現カセットを保有するジェネテシン耐性の遺伝子導入体を選択するために、培養培地を、５００μｇ／ｍＬのＧ－４１８（Thermofisher Scientific）を含むように置き換えた。培地を、２～３日毎に交換し、３週間後に、モノクローナル系統を得るために、１ウェルあたり１０３細胞から開始して、１：２の限界希釈を行った。ＬＴＢＲを発現するモノクローナル系統の同定は、フィコエリトリン標識マウス抗マウスＬＴＢＲ ｍＡｂ ５Ｇ１１（Abcam、ｃａｔ．＃ａｂ６５０８９）を用いて、フローサイトメトリーにおいて１０４細胞を得ることに基づいた（Attune NxT、Thermofisher Scientific）。
安定なＬＴＢＲレポーター細胞株の作製
ヒト細胞株背景における機能的シグナル伝達を保証するために、マウスオルトログの細胞内部分がヒトのカウンターパートにより置き換えられた、マウス－ヒトキメラＬＴＢＲコード配列を担持する、トランスジェニックコンストラクトを作製した。ヒトＮＦβＢルシフェラーゼレポーターＨＥＫ２９３安定細胞株（Signosis、ｃａｔ．＃ＳＬ－００１２）を、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco）中で、培養した。トランスフェクションの前に、細胞を、６ウェルのプレート（Greiner）の１ウェルあたり７．５×１０５細胞の密度で播種し、一晩培養した。４０％のおおよそのコンフルエンスに達した後、FUGENE HDトランスフェクション試薬（Promega）を用いて、マウス－ヒトキメラＬＴＢＲ導入遺伝子を担持する直鎖化したｐｃＤＮＡ３．１で、細胞をトランスフェクトした。６時間後、細胞上清を注意深く取り除き、フレッシュな完全ＤＭＥＭで置き換えた。４８時間後、発現カセットを保有するジェネテシン耐性の遺伝子導入体を選択するために、培養培地を、５００μｇ／ｍＬのＧ－４１８（Thermofisher Scientific）を含むように置き換えた。培地を、２～３日毎に交換し、３週間後に、モノクローナル系統を得るために、１ウェルあたり１０３細胞から開始して、１：２の限界希釈を行った。ＬＴＢＲを発現するモノクローナル系統の同定は、フィコエリトリン標識マウス抗マウスＬＴＢＲ ｍＡｂ ５Ｇ１１（Abcam、ｃａｔ．＃ａｂ６５０８９）を用いて、フローサイトメトリーにおいて１０４細胞を得ることに基づいた（Attune NxT、Thermofisher Scientific）。
【0161】
レポーターアッセイ
細胞を、ポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）コートされた９６ウェルのプレート（Greiner）において、６．０×１０４細胞／ウェルの密度において播種し、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco）中で、一晩培養した。化合物（ＶＨＨおよびｍＡｂ）を、様々な濃度において６時間にわたりインキュベートし、ＬＴＢＲに対してＮＦκＢ転写を誘導するそれらのアゴニスト性活性について評価した。Steadylite plusレポーター遺伝子アッセイ系（PerkinElmer、ｃａｔ．＃６０６６７５６）を製造者の説明書に従って用いて、EnSight（商標）マルチモードプレートリーダー（PerkinElmer）上でルシフェラーゼ活性を測定した。用量依存的様式においてレポーターを活性化するアゴニスト性抗マウスＬＴＢＲ ｍＡｂ ５Ｇ１１（Abcam、ｃａｔ．＃ａｂ６５０８９）の滴定により、安定レポーター細胞株の最終ＱＣを行った。
細胞を、ポリ－Ｄ－リジン（ＰＤＬ）コートされた９６ウェルのプレート（Greiner）において、６．０×１０４細胞／ウェルの密度において播種し、３７℃および５％ＣＯ２で、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ならびに１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよびストレプトマイシン（Gibco）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Gibco）中で、一晩培養した。化合物（ＶＨＨおよびｍＡｂ）を、様々な濃度において６時間にわたりインキュベートし、ＬＴＢＲに対してＮＦκＢ転写を誘導するそれらのアゴニスト性活性について評価した。Steadylite plusレポーター遺伝子アッセイ系（PerkinElmer、ｃａｔ．＃６０６６７５６）を製造者の説明書に従って用いて、EnSight（商標）マルチモードプレートリーダー（PerkinElmer）上でルシフェラーゼ活性を測定した。用量依存的様式においてレポーターを活性化するアゴニスト性抗マウスＬＴＢＲ ｍＡｂ ５Ｇ１１（Abcam、ｃａｔ．＃ａｂ６５０８９）の滴定により、安定レポーター細胞株の最終ＱＣを行った。
【0162】
例２：マウスＣＣＲ８ ＶＨＨの作製
ＣＣＲ８ ＤＮＡの免疫
ラマおよびアルパカのＣＣＲ８のＤＮＡによる免疫化を、本質的にはPardon E.ら著（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）ならびにHenry K.A.およびMacKenzie C.R.編（Single-Domain Antibodies: Biology, Engineering and Emerging Applications. Lausanne: Frontiers Media）において開示されるとおり行った。簡単に述べると、動物を、４回、２週間の間隔で、２ｍｇの、発現ベクターｐＶＡＸ１（ThermoFisher Scientific Inc.、Ｖ２６０２０）中に挿入されたマウスＣＣＲ８をコードするＤＮＡで免疫化し、その後、血液試料を採取した。３か月後、全ての動物に、２ｍｇの同じＤＮＡの単一の投与を行い、その後、血液試料を採取した。
ＣＣＲ８ ＤＮＡの免疫
ラマおよびアルパカのＣＣＲ８のＤＮＡによる免疫化を、本質的にはPardon E.ら著（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）ならびにHenry K.A.およびMacKenzie C.R.編（Single-Domain Antibodies: Biology, Engineering and Emerging Applications. Lausanne: Frontiers Media）において開示されるとおり行った。簡単に述べると、動物を、４回、２週間の間隔で、２ｍｇの、発現ベクターｐＶＡＸ１（ThermoFisher Scientific Inc.、Ｖ２６０２０）中に挿入されたマウスＣＣＲ８をコードするＤＮＡで免疫化し、その後、血液試料を採取した。３か月後、全ての動物に、２ｍｇの同じＤＮＡの単一の投与を行い、その後、血液試料を採取した。
【0163】
ファージディスプレイライブラリー調製
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から誘導されたファージディスプレイライブラリーを、Pardon E.ら著（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）ならびにHenry K.A.およびMacKenzie C.R.編（Single-Domain Antibodies: Biology, Engineering and Emerging Applications. Lausanne: Frontiers Media）において記載されるとおりに、調製して用いた。ＶＨＨフラグメントを、ＭＹＣおよびＨｉｓ６タグを含むＭ１３ファージミドベクター中に挿入した。指数関数的に増殖しているEscherichia coli TG1［(F’traD36 proAB laclqZ ΔM15）supE thi-1 Δ(lac-proAB）Δ(mcrB-hsdSM)5(rK- mK-)］細胞を感染させ、その後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで二次感染（surinfection）させることにより、ライブラリーをレスキューした。
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から誘導されたファージディスプレイライブラリーを、Pardon E.ら著（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）ならびにHenry K.A.およびMacKenzie C.R.編（Single-Domain Antibodies: Biology, Engineering and Emerging Applications. Lausanne: Frontiers Media）において記載されるとおりに、調製して用いた。ＶＨＨフラグメントを、ＭＹＣおよびＨｉｓ６タグを含むＭ１３ファージミドベクター中に挿入した。指数関数的に増殖しているEscherichia coli TG1［(F’traD36 proAB laclqZ ΔM15）supE thi-1 Δ(lac-proAB）Δ(mcrB-hsdSM)5(rK- mK-)］細胞を感染させ、その後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで二次感染（surinfection）させることにより、ライブラリーをレスキューした。
【0164】
ファージディスプレイライブラリーを、ｐＶＡＸ１中に挿入されたマウスＣＣＲ８を一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞と、その後のｐＶＡＸ１中に挿入されたマウスＣＣＲ８で一過性にトランスフェクトされたＣＨＯ－Ｋ１細胞とにおける、２回の連続的な選択ラウンドに供した。第２の選択ラウンドから溶離したファージを感染させたE. coli TG1細胞から、ポリクローナルファージミドＤＮＡを調製した。これらの試料からのＰＣＲによりＶＨＨフラグメントを増幅し、Ｎ末端ＰｅｌＢシグナルペプチドおよびＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨｉｓ６タグを有するフレームにおいて、E. coli発現ベクター中にサブクローニングした。エレクトロコンピテントE. coli TG1細胞を、結果として生じるＶＨＨ－発現プラスミドライゲーション混合物により形質転換させ、個々のコピーを、９６ディープウェルプレート中で増殖させた。本質的にはPardon E.ら（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）において記載されるとおり、モノクローナルＶＨＨを発現させた。細菌ペレットを一晩冷凍し、その後、ＰＢＳ中で再懸濁して細胞デブリを取り除くことにより、ＶＨＨを含む粗周辺質抽出物を調製した。
【0165】
ＣＣＲ８選択のアウトプットについてのスクリーニング
ＣＣＲ８を発現する組み換え細胞を、細胞を解離させた非酵素的溶液（Sigma Aldrich、Ｃ５９１４－１００ｍＬ）を用いて回収し、ＦＡＣＳバッファー中で１．０×１０６細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁した。ＶＨＨを含む粗周辺質抽出物の希釈物（ＦＡＣＳバッファー中、１：５）を、ＦＡＣＳバッファー中で５μｇ／ｍｌにおいて、マウス抗ＦＬＡＧビオチン化抗体（Sigma Aldrich、Ｆ９２９１－１ＭＧ）と共に、３０分間にわたり振盪しながら室温においてインキュベートした。細胞懸濁液を、９６ウェルのｖ底プレート中に分注し、ＶＨＨ／抗体混合物と共に１時間、氷上で振盪しながらインキュベートした。ＶＨＨの細胞への結合は、ＦＡＣＳバッファー中１：４００希釈（０．１８μｇ／ｍｌ）におけるストレプトアビジンＲ－ＰＥ（Invitrogen、ＳＡ１００４４）と共に、３０分にわたり暗室において氷上で振盪しながらインキュベートすることにより検出した。一過性にトランスフェクトされた細胞株上でのｍＣＣＲ８の表面発現は、２μｇ／ｍｌにおけるＰＥ抗マウスＣＣＲ８（Biolegend、１５０３１１）抗体により確認した。
ＣＣＲ８を発現する組み換え細胞を、細胞を解離させた非酵素的溶液（Sigma Aldrich、Ｃ５９１４－１００ｍＬ）を用いて回収し、ＦＡＣＳバッファー中で１．０×１０６細胞／ｍｌの最終濃度まで再懸濁した。ＶＨＨを含む粗周辺質抽出物の希釈物（ＦＡＣＳバッファー中、１：５）を、ＦＡＣＳバッファー中で５μｇ／ｍｌにおいて、マウス抗ＦＬＡＧビオチン化抗体（Sigma Aldrich、Ｆ９２９１－１ＭＧ）と共に、３０分間にわたり振盪しながら室温においてインキュベートした。細胞懸濁液を、９６ウェルのｖ底プレート中に分注し、ＶＨＨ／抗体混合物と共に１時間、氷上で振盪しながらインキュベートした。ＶＨＨの細胞への結合は、ＦＡＣＳバッファー中１：４００希釈（０．１８μｇ／ｍｌ）におけるストレプトアビジンＲ－ＰＥ（Invitrogen、ＳＡ１００４４）と共に、３０分にわたり暗室において氷上で振盪しながらインキュベートすることにより検出した。一過性にトランスフェクトされた細胞株上でのｍＣＣＲ８の表面発現は、２μｇ／ｍｌにおけるＰＥ抗マウスＣＣＲ８（Biolegend、１５０３１１）抗体により確認した。
【0166】
マウスのＣＣＲ８免疫化および選択キャンペーンから生じたＶＨＨクローンを、フローサイトメトリーにより、ｍＣＣＲ８により、またはＮ末端欠失マウスＣＣＲ８（デルタ１６－３ＸＨＡ）プラスミドＤＮＡにより先にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞への結合について、模擬（mock）トランスフェクトされた対照細胞と比較して、スクリーニングした。３つの細胞株の間の所与のＶＨＨクローンの結合（蛍光強度中央値）シグナルの比較により、Ｎ末端マウスＣＣＲ８結合剤（すなわち、ｍＣＣＲ８細胞に対して結合するが、マウスＣＣＲ８（デルタ１６－３ＸＨＡ）もしくは対照細胞に対しては結合しない）としての、または細胞外ループｍＣＣＲ８結合剤（すなわち、ｍＣＣＲ８細胞に対して、およびマウスＣＣＲ８（デルタ１６－３ＸＨＡ）に対して結合するが、対照細胞に対しては結合しない）としての、前記クローンの分類が可能となった。
【0167】
一価ＣＣＲ８ ＶＨＨの精製および評価
ＣＣＲ８に結合するＶＨＨをコードする合成ＤＮＡフラグメントを、E. coli 発現ベクター中に、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下において、Ｎ末端ＰｅｌＢシグナルペプチドとインフレームで、周辺質のカウンターパートのターゲティング、ならびにＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨｉｓ６タグのために、サブクローニングした。エレクトロコンピテントE. coli TG1細胞を形質転換し、生じたクローンの配列を決定した。ＶＨＨタンパク質を、これらのクローンから、本質的にはPardon E.ら（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）において記載されるとおり、ＩＭＡＣクロマトグラフィーとその後の脱塩により精製した。
ＣＣＲ８に結合するＶＨＨをコードする合成ＤＮＡフラグメントを、E. coli 発現ベクター中に、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下において、Ｎ末端ＰｅｌＢシグナルペプチドとインフレームで、周辺質のカウンターパートのターゲティング、ならびにＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨｉｓ６タグのために、サブクローニングした。エレクトロコンピテントE. coli TG1細胞を形質転換し、生じたクローンの配列を決定した。ＶＨＨタンパク質を、これらのクローンから、本質的にはPardon E.ら（A general protocol for the generation of Nanobodies for structural biology, Nature Protocols, 2014, 9(3), 674-693）において記載されるとおり、ＩＭＡＣクロマトグラフィーとその後の脱塩により精製した。
【0168】
マウスのＣＣＲ８免疫化キャンペーンから得られた２つの精製されたＶＨＨ（本明細書において以後、ＶＨＨ－０１およびＶＨＨ－０６）を、フローサイトメトリーにより、ｍＣＣＲ８に対するそれらの結合について、Ｎ末端欠失ｍＣＣＲ８と比較して、選択および評価した。この判定の結果を、図１においてまとめる。ＶＨＨ－０１は、全長およびＮ末端欠失マウスＣＣＲ８の両方に結合し、一方、ＶＨＨ－０６は、全長マウスＣＣＲ８のみに結合する。
【0169】
一価ＣＣＲ８ ＶＨＨについての結合および機能の特徴づけ
ｃＡＭＰの均一系時間分解蛍光（Homogenous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）アッセイ
ｃＡＭＰ蓄積実験において、２つの選択された一価のＶＨＨ（ＶＨＨ－０１およびＶＨＨ－０６）を、それらが、マウスＣＣＲ８を提示するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対して、マウスＣＣＬ１シグナル伝達を機能的に阻害する潜在能力について評価した。
ｃＡＭＰの均一系時間分解蛍光（Homogenous Time Resolved Fluorescence：ＨＴＲＦ）アッセイ
ｃＡＭＰ蓄積実験において、２つの選択された一価のＶＨＨ（ＶＨＨ－０１およびＶＨＨ－０６）を、それらが、マウスＣＣＲ８を提示するＣＨＯ－Ｋ１細胞に対して、マウスＣＣＬ１シグナル伝達を機能的に阻害する潜在能力について評価した。
【0170】
組み換えマウスＣＣＲ８を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞は、試験の前に、抗生物質を含まない培地中で増殖させ、ＰＢＳ－ＥＤＴＡ（５ｍＭのＥＤＴＡ）でフラッシュすることにより脱離させ、遠心分離により回収し、ＫＨＲバッファー（５ｍＭのＫＣｌ、１．２５ｍＭのＭｇＳＯ４、１２４ｍＭのＮａＣｌ、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ、１３．３ｍＭのグルコース、１．２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１．４５ｍＭのＣａＣｌ２、０．５ｇ／ｌのＢＳＡに、１ｍＭのＩＢＭＸを補充したもの）中で再懸濁した。１２マイクロリットルの細胞を、三つ組みにおいて、６マイクロリットルのＶＨＨ（最終濃度：１μＭ）と混合し、３０分間にわたりインキュベートした。その後、フォルスコリンとマウスＣＣＬ１（R&D Systems、８４５－ＴＣ）との混合物６マイクロリットルを、そのＥＣ８０値に対応する最終濃度において添加した。プレートを、次いで、３０分間にわたり室温でインキュベートした。溶解バッファーの添加および１時間のインキュベーションの後で、ＨＴＲＦキット（Cisbio、６２ＡＭ９ＰＥ）により、製造者の仕様書に従って、蛍光比を測定した。
【0171】
１μＭにおいて、ＶＨＨ－０１は、ｃＡＭＰレベルに対するＣＣＬ１の作用を阻害したが、一方、ＶＨＨ－０６は、ｃＡＭＰレベルを対象（ＰＢＳ）と比較して変更しなかった。これらのデータは、ＶＨＨ－０１は、ＣＣＲ８の遮断性結合剤であるが、一方、ＶＨＨ－０６は非遮断性結合剤であることを示す。
【0172】
Ｃａ
２＋
放出アッセイ
ＶＨＨ－０１が、ｍＣＣＲ８を提示するＣＨＯ－Ｋ１細胞上でのマウスＣＣＬ１シグナル伝達を機能的に阻害する潜在能力を、Ｃａ２＋放出実験においてさらに評価した。
組み換え細胞（マウスＣＣＲ８を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１ ｍｔ－エクオリン）を、１８時間にわたり、抗生物質を含まない培地中で増殖させ、ＰＢＳＥＤＴＡ（５ｍＭのＥＤＴＡ）でフラッシュすることにより温和に脱離させ、遠心分離により回収し、アッセイバッファー（ＨＥＰＥＳ＋０．１％ ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２、プロテアーゼフリー）中で再懸濁した。細胞を、次いで、室温で、少なくとも４時間にわたり、セレンテラジンｈ（Molecular Probes）と共にインキュベートした。細胞とＶＨＨ（最終濃度：１μＭ）との混合物１００μｌの第１の注射の３０分後に、１００μｌのマウスＣＣＬ１（R&D Systems、８４５－ＴＣ）を、ＥＣ８０値に対応する最終濃度において添加し、混合物中に注入した。結果として生じたスペクトル発光を、Functional Drug Screening System 6000（FDSS 6000、Hamamatsu）を用いて記録した。
ＶＨＨ－０１は、実際、９４％による強力なＣａ２＋放出の阻害をもたらし、ＶＨＨ－０１がＣＣＲ８の遮断性結合剤であることを確認した。
ＶＨＨ－０１が、ｍＣＣＲ８を提示するＣＨＯ－Ｋ１細胞上でのマウスＣＣＬ１シグナル伝達を機能的に阻害する潜在能力を、Ｃａ２＋放出実験においてさらに評価した。
組み換え細胞（マウスＣＣＲ８を安定的に発現するＣＨＯ－Ｋ１ ｍｔ－エクオリン）を、１８時間にわたり、抗生物質を含まない培地中で増殖させ、ＰＢＳＥＤＴＡ（５ｍＭのＥＤＴＡ）でフラッシュすることにより温和に脱離させ、遠心分離により回収し、アッセイバッファー（ＨＥＰＥＳ＋０．１％ ＢＳＡを添加したＤＭＥＭ／ハムＦ１２、プロテアーゼフリー）中で再懸濁した。細胞を、次いで、室温で、少なくとも４時間にわたり、セレンテラジンｈ（Molecular Probes）と共にインキュベートした。細胞とＶＨＨ（最終濃度：１μＭ）との混合物１００μｌの第１の注射の３０分後に、１００μｌのマウスＣＣＬ１（R&D Systems、８４５－ＴＣ）を、ＥＣ８０値に対応する最終濃度において添加し、混合物中に注入した。結果として生じたスペクトル発光を、Functional Drug Screening System 6000（FDSS 6000、Hamamatsu）を用いて記録した。
ＶＨＨ－０１は、実際、９４％による強力なＣａ２＋放出の阻害をもたらし、ＶＨＨ－０１がＣＣＲ８の遮断性結合剤であることを確認した。
【0173】
例３．ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物の作製
ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物の合成および精製
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、抗ＣＣＲ８ ＶＨＨを、フレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカー（１０ＧＳ）により分離したマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインと組み合わせることにより作製した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、２つのＶＨＨ－０６結合剤に加えて、２つのＶＨＨ－０１結合剤を含む。コンストラクトを、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター中に、発現された組み換えタンパク質を細胞外環境に指向させるために、マウスＩｇ重鎖Ｖ領域１０２シグナルペプチドとインフレームで、クローニングした。ＤＮＡの合成およびクローニング、細胞トランスフェクション、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるタンパク質生成、ならびにタンパク質Ａ精製は、Genscript（GenScript Biotech B.V., Leiden, Netherlands）により行われた。
ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物の合成および精製
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、抗ＣＣＲ８ ＶＨＨを、フレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカー（１０ＧＳ）により分離したマウスＩｇＧ２ａＦｃドメインと組み合わせることにより作製した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、２つのＶＨＨ－０６結合剤に加えて、２つのＶＨＨ－０１結合剤を含む。コンストラクトを、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター中に、発現された組み換えタンパク質を細胞外環境に指向させるために、マウスＩｇ重鎖Ｖ領域１０２シグナルペプチドとインフレームで、クローニングした。ＤＮＡの合成およびクローニング、細胞トランスフェクション、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞におけるタンパク質生成、ならびにタンパク質Ａ精製は、Genscript（GenScript Biotech B.V., Leiden, Netherlands）により行われた。
【0174】
ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物によるＣＣＲ８の結合の確認
多価ＶＨＨ－Ｆｃ融合物ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、ＢＷ５１４７細胞上で内因的に発現したマウスＣＣＲ８に結合するその能力について、フローサイトメトリー実験により評価した。細胞を、様々な濃度の多価ＶＨＨ－Ｆｃ融合物と共に、３０分間にわたり４℃でインキュベートし、その後、３０分間にわたり４℃で、ＡＦ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Life Technologies、Ａ１１０２９）またはＡＦ４８８ラバ抗ラットＩｇＧ（Life Technologies、Ａ２１２０８）と共にインキュベートし、その後、２回の洗浄ステップを行った。TOPRO3（Thermo Fisher Scientific、Ｔ３６０５）を用いて死細胞を染色した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４の結合は、９．１４±０．３９ＭのｐＥＣ５０値を有する（ｎ＝６）（平均±標準偏差）。
多価ＶＨＨ－Ｆｃ融合物ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、ＢＷ５１４７細胞上で内因的に発現したマウスＣＣＲ８に結合するその能力について、フローサイトメトリー実験により評価した。細胞を、様々な濃度の多価ＶＨＨ－Ｆｃ融合物と共に、３０分間にわたり４℃でインキュベートし、その後、３０分間にわたり４℃で、ＡＦ４８８ヤギ抗マウスＩｇＧ（Life Technologies、Ａ１１０２９）またはＡＦ４８８ラバ抗ラットＩｇＧ（Life Technologies、Ａ２１２０８）と共にインキュベートし、その後、２回の洗浄ステップを行った。TOPRO3（Thermo Fisher Scientific、Ｔ３６０５）を用いて死細胞を染色した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４の結合は、９．１４±０．３９ＭのｐＥＣ５０値を有する（ｎ＝６）（平均±標準偏差）。
【0175】
ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物による機能的阻害
アポトーシスアッセイ
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、アポトーシスアッセイにおいて、アゴニスト性リガンドＣＣＬ１の作用を機能的に阻害するその能力について試験した。
デキサメタゾンは、ＣＣＲ８を内因的に発現するマウスリンパ腫ＢＷ５１４７細胞において細胞死を誘導する。デキサメタゾン誘導性細胞死は、アンタゴニストリガンドＣＣＬ１の添加により逆転させることができる（Van Snick et al., 1996, Journal of immunology, 157, 2570-2576；Louahed et al., 2003, European Journal of Immunology, 33, 494-501；Spinetti et al., 2003, Journal of Leukocyte Biology, 73, 201-207；Denis et al., 2012, PLOS One, 7, e34199）。５０μｌの細胞（イスコフ－ダルベッコ培地＋１０％ＦＢＳ、５０μＭの２－ＭＥ、１．２５ｍＭのｌ－グルタミン中で、２．７５×１０４細胞／ｍｌにおいて播種される）を、３０μｌのＶＨＨ－Ｆｃ融合物の連続希釈物と共に３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。次いで、デキサメタゾン（Sigma-Aldrich、Ｄ４９０２）とヒトＣＣＬ１（Biolegend、５８２７０６）との混合物２０μｌを、各々１０ｎＭの最終濃度まで添加した。４８時間の３７℃でのインキュベーションの後で、ATPlite 1-step litを製造者の説明書に従って用いて（Perkin Elmer, 6016736）、細胞の生存率を定量した。この判定のこれらの結果を、図２において表す。
ＶＨＨ－Ｆｃ融合物ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、アッセイにおいて、９．２９±０．２２ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝９）（平均±標準偏差）により、強力な機能的阻害を提供する。
アポトーシスアッセイ
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、アポトーシスアッセイにおいて、アゴニスト性リガンドＣＣＬ１の作用を機能的に阻害するその能力について試験した。
デキサメタゾンは、ＣＣＲ８を内因的に発現するマウスリンパ腫ＢＷ５１４７細胞において細胞死を誘導する。デキサメタゾン誘導性細胞死は、アンタゴニストリガンドＣＣＬ１の添加により逆転させることができる（Van Snick et al., 1996, Journal of immunology, 157, 2570-2576；Louahed et al., 2003, European Journal of Immunology, 33, 494-501；Spinetti et al., 2003, Journal of Leukocyte Biology, 73, 201-207；Denis et al., 2012, PLOS One, 7, e34199）。５０μｌの細胞（イスコフ－ダルベッコ培地＋１０％ＦＢＳ、５０μＭの２－ＭＥ、１．２５ｍＭのｌ－グルタミン中で、２．７５×１０４細胞／ｍｌにおいて播種される）を、３０μｌのＶＨＨ－Ｆｃ融合物の連続希釈物と共に３０分間にわたり３７℃でインキュベートした。次いで、デキサメタゾン（Sigma-Aldrich、Ｄ４９０２）とヒトＣＣＬ１（Biolegend、５８２７０６）との混合物２０μｌを、各々１０ｎＭの最終濃度まで添加した。４８時間の３７℃でのインキュベーションの後で、ATPlite 1-step litを製造者の説明書に従って用いて（Perkin Elmer, 6016736）、細胞の生存率を定量した。この判定のこれらの結果を、図２において表す。
ＶＨＨ－Ｆｃ融合物ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、アッセイにおいて、９．２９±０．２２ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝９）（平均±標準偏差）により、強力な機能的阻害を提供する。
【0176】
ｃＡＭＰアッセイ
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、例２において記載されるとおり、ｃＡＭＰアッセイにおいて試験した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、５０ｎＭ以上の濃度において、８．５４ＭのｐＩＣ５０値により、ｃＡＭＰシグナルの１００％の阻害を提供し、このことは、やはり、それが遮断性ＣＣＲ８結合剤であることを確認する。
ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、例２において記載されるとおり、ｃＡＭＰアッセイにおいて試験した。ＶＨＨ－Ｆｃ－１４は、５０ｎＭ以上の濃度において、８．５４ＭのｐＩＣ５０値により、ｃＡＭＰシグナルの１００％の阻害を提供し、このことは、やはり、それが遮断性ＣＣＲ８結合剤であることを確認する。
【0177】
例４．ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物は腸Ｔｒｅｇレベルに影響を及ぼす
腫瘍内および他のＴｒｅｇレベルに対する細胞傷害性ＣＣＲ８結合剤の効果を研究するために、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、ＡＤＣＣ活性が増大した、およびこれが消失したＶＨＨ－Ｆｃ融合物を得るために修飾した。増大したＡＤＣＣ活性は、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４の脱フコシル化（a-fucosylation）（ＶＨＨ－Ｆｃ－４３）を通して得られた。あるいは、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４において、ＬＡＬＡＰＧ Ｆｃ変異の挿入を通してＡＤＣＣ活性を消失させた（ＶＨＨ－Ｆｃ－４１）（Lo et al., 2017, Journal of Biological Chemistry, 292, 3900-3908）。コンストラクトを、哺乳動物発現ベクターであるpQMCFベクター中に、分泌シグナルペプチドとインフレームでクローニングし、CHOEBNALT85 1E9細胞にトランスフェクトし、その後、発現させ、タンパク質Ａおよびゲルろ過クロマトグラフィー（Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonia）を行った。Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインにおいて脱フコシル化Ｎ－グリカンを有するバージョンは、GlymaxX技術を担持するCHOEBNALT85細胞株における発現から得られた（ProBioGen AG, Berlin, Germany）（Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonia）。タンパク質を、０．２２ｍｍで無菌ろ過した。２８０ｎｍにおける吸光度の測定によりタンパク質濃度を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分子ふるいクロマトグラフィーにより純度を決定した。ＬＡＬ試験（Charles-River Endochrome）により、エンドトキシンレベルを判定した。対照であるｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、BioXCellから購入した。ＶＨＨ－Ｆｃ－４１（９．３３ＭのｐＥＣ５０値（ｎ＝１））およびＶＨＨ－Ｆｃ－４３（９．２３±０．１７ＭのｐＥＣ５０値（ｎ＝２））は、ＢＷ５１４７細胞上のＣＣＲ８に同等に結合する。加えて、ＶＨＨ－Ｆｃ－４１（９．５１±０．０２ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝２））およびＶＨＨ－Ｆｃ－４３（９．３９±０．１１ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝４））（平均±標準偏差）はいずれも、ＢＷ１４７アポトーシスアッセイにおいて、ＣＣＬ１の作用を強力に阻害する。全ての値は、平均±標準偏差として示す。
腫瘍内および他のＴｒｅｇレベルに対する細胞傷害性ＣＣＲ８結合剤の効果を研究するために、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４を、ＡＤＣＣ活性が増大した、およびこれが消失したＶＨＨ－Ｆｃ融合物を得るために修飾した。増大したＡＤＣＣ活性は、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４の脱フコシル化（a-fucosylation）（ＶＨＨ－Ｆｃ－４３）を通して得られた。あるいは、ＶＨＨ－Ｆｃ－１４において、ＬＡＬＡＰＧ Ｆｃ変異の挿入を通してＡＤＣＣ活性を消失させた（ＶＨＨ－Ｆｃ－４１）（Lo et al., 2017, Journal of Biological Chemistry, 292, 3900-3908）。コンストラクトを、哺乳動物発現ベクターであるpQMCFベクター中に、分泌シグナルペプチドとインフレームでクローニングし、CHOEBNALT85 1E9細胞にトランスフェクトし、その後、発現させ、タンパク質Ａおよびゲルろ過クロマトグラフィー（Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonia）を行った。Ｆｃ部分のＣＨ２ドメインにおいて脱フコシル化Ｎ－グリカンを有するバージョンは、GlymaxX技術を担持するCHOEBNALT85細胞株における発現から得られた（ProBioGen AG, Berlin, Germany）（Icosagen Cell Factory, Tartu, Estonia）。タンパク質を、０．２２ｍｍで無菌ろ過した。２８０ｎｍにおける吸光度の測定によりタンパク質濃度を決定し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび分子ふるいクロマトグラフィーにより純度を決定した。ＬＡＬ試験（Charles-River Endochrome）により、エンドトキシンレベルを判定した。対照であるｍＩｇＧ２ａアイソタイプは、BioXCellから購入した。ＶＨＨ－Ｆｃ－４１（９．３３ＭのｐＥＣ５０値（ｎ＝１））およびＶＨＨ－Ｆｃ－４３（９．２３±０．１７ＭのｐＥＣ５０値（ｎ＝２））は、ＢＷ５１４７細胞上のＣＣＲ８に同等に結合する。加えて、ＶＨＨ－Ｆｃ－４１（９．５１±０．０２ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝２））およびＶＨＨ－Ｆｃ－４３（９．３９±０．１１ＭのｐＩＣ５０値（ｎ＝４））（平均±標準偏差）はいずれも、ＢＷ１４７アポトーシスアッセイにおいて、ＣＣＬ１の作用を強力に阻害する。全ての値は、平均±標準偏差として示す。
【0178】
ＡＤＣＣ活性を伴う、およびこれを伴わない、これらの遮断性ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ融合物の効果を試験するために、３×１０６細胞のＬＬＣ－ＯＶＡ細胞（２００μｌ）を、メスＣ５７ＢＬ／６マウス（６～１２週）において皮下注射した。第４日において、マウスを、２００μｇの抗ＣＣＲ８ ＶＨＨ－Ｆｃ（ＶＨＨ－Ｆｃ－４１もしくはＶＨＨ－Ｆｃ－４３）またはマウスＩｇＧ２ａ（対照）で、週１回（すなわち、第４、１１日）処置した（ｎマウス／群＝５）。
第１６日において、マウスを安楽死させ、各々のマウスから腫瘍、血液および腸を採取した。
第１６日において、マウスを安楽死させ、各々のマウスから腫瘍、血液および腸を採取した。
【0179】
組織を小片に切断し、その後、１０Ｕ・ｍｌ－１のコラゲナーゼＩ、４００Ｕ・ｍｌ－１のコラゲナーゼＩＶおよび３０Ｕ・ｍｌ－１のDNaseI（Worthington）で、２５分間にわたり３７℃で処置することにより、腫瘍シングルセル懸濁液を得た。組織を、その後、押し潰し、ろ過した（７０μｍ）。得られた細胞懸濁液から、赤血球溶解バッファー（１５５ｍＭのＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭのＫＨＣＯ３、５００ｍＭのＥＤＴＡ）を用いて赤血球細胞を取り除き、その後、ＲＰＭＩで中和した。白血球のみが残されるまで繰り返される５分間にわたる赤血球溶解バッファー中でのインキュベーションのラウンドを通して、血液の赤血球細胞を枯渇させた。
【0180】
先に記載されるとおり（C. C. Bain, A. McI. Mowat, CD200 receptor and macrophage function in the intestine, Immunobiology 217, 643-651 (2012)）、腸のシングルセル懸濁液を調製した。赤血球の溶解の後で、得られたシングルセル懸濁液を、ＦＡＣＳバッファー（２％のＦＣＳおよび２ｍＭのＥＤＴＡにより濃縮されたＰＢＳ）中で再懸濁し、計数した。全てのシングルセル懸濁液を、染色の前に１５分間にわたり、ラット抗マウスＣＤ１６／ＣＤ３２（２．４Ｇ２；BD Biosciences）または抗ヒトＦｃブロック試薬（Miltenyi）と共に、プレインキュベートした。洗浄の後で、フレキシブルな生存率色素ｅＦｌｕｏｒ５０６（eBioscience）（１：２００）で、３０分間にわたり、４℃で、および暗室において試料を染色した。その後、３０分間にわたり、４℃で、および暗室において試料を、洗浄し、染色した。サイトカイン／ケモカインおよび転写因子の細胞内染色を、、製造者のプロトコルに従って行った：それぞれ（カタログＮ°５５４７１５；BD Biosciences）および（カタログＮ°００－５５２３；Invitrogen）。BD FACSCantoII（BD Biosciences）を用いてＦＡＣＳデータを得、FlowJo（TreeStar, Inc.）を用いて分析した。
【0181】
図３において示すとおり、ＡＤＣＣ活性を有するＣＣＲ８遮断性Ｆｃ融合物であるＶＨＨ－Ｆｃ－４３により、腫瘍においてＴｒｅｇを枯渇させるが、一方、ＡＤＣＣ活性を欠くＶＨＨ－Ｆｃ－４１については、腫瘍内Ｔｒｅｇ枯渇は観察されない。いずれのコンストラクトについても、循環中のＴｒｅｇの枯渇は観察さなかった（図４）。
【0182】
例５：ＬＴＢＲアゴニスト性シングルドメイン抗体部分の作製
免疫化
組み換えタンパク質によるラマおよびアルパカの免疫化を通して、本質的には他の場所で記載されるとおり（Pardon et al., 2014）（Henry and MacKenzie, 2018）、ＶＨＨを作製した。簡単に述べると、動物を、６回、１週間の間隔において、５０μｇの組み換えマウスＬＴＢＲ－マウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃキメラタンパク質（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）で免疫化し、その後、血液試料を採取した。
免疫化
組み換えタンパク質によるラマおよびアルパカの免疫化を通して、本質的には他の場所で記載されるとおり（Pardon et al., 2014）（Henry and MacKenzie, 2018）、ＶＨＨを作製した。簡単に述べると、動物を、６回、１週間の間隔において、５０μｇの組み換えマウスＬＴＢＲ－マウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃキメラタンパク質（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）で免疫化し、その後、血液試料を採取した。
【0183】
ファージディスプレイライブラリー調製
末梢血単核細胞（ＰＢＬＣ）から誘導されたファージディスプレイライブラリーを、他の場所で記載されるとおり（Pardon et al., 2014；Henry and MacKenzie, 2018）、調製して用いた。ＶＨＨフラグメントを、ＭＹＣおよびＨｉｓ６タグを含むＭ１３ファージミドベクター中に挿入した。指数関数的に増殖するEscherichia coli TG1［(F’traD36 proAB laclqZ ΔM15) supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5(rK- mK-)］細胞を感染させて、その後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで二次感染させることにより、ライブラリーをレスキューした。マウスＬＴＢＲ免疫化ファージライブラリーを、マウスＬＴＢＲ－マウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃキメラタンパク質（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）上で、Ｆｃに結合するＶＨＨを除去するために５０倍過剰量の総マウスＩｇＧの存在下において、２回の連続した選択のラウンドに供した。個々のコロニーを、９６－ディープウェルのプレート中で、異なる選択のラウンドから溶離したファージに感染したE. coli TG1細胞から増殖させた。モノクローナルＶＨＨを、本質的には前に記載されるように発現させた（Pardon et al., 2014）。細菌のペレットを一晩凍結して、その後、ＰＢＳ中で再懸濁し、遠心分離して細胞デブリを取り除くことにより、ＶＨＨを含む粗周辺質抽出物を調製した。
末梢血単核細胞（ＰＢＬＣ）から誘導されたファージディスプレイライブラリーを、他の場所で記載されるとおり（Pardon et al., 2014；Henry and MacKenzie, 2018）、調製して用いた。ＶＨＨフラグメントを、ＭＹＣおよびＨｉｓ６タグを含むＭ１３ファージミドベクター中に挿入した。指数関数的に増殖するEscherichia coli TG1［(F’traD36 proAB laclqZ ΔM15) supE thi-1 Δ(lac-proAB) Δ(mcrB-hsdSM)5(rK- mK-)］細胞を感染させて、その後、ＶＣＳＭ１３ヘルパーファージで二次感染させることにより、ライブラリーをレスキューした。マウスＬＴＢＲ免疫化ファージライブラリーを、マウスＬＴＢＲ－マウスＩｇＧ２Ａ Ｆｃキメラタンパク質（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）上で、Ｆｃに結合するＶＨＨを除去するために５０倍過剰量の総マウスＩｇＧの存在下において、２回の連続した選択のラウンドに供した。個々のコロニーを、９６－ディープウェルのプレート中で、異なる選択のラウンドから溶離したファージに感染したE. coli TG1細胞から増殖させた。モノクローナルＶＨＨを、本質的には前に記載されるように発現させた（Pardon et al., 2014）。細菌のペレットを一晩凍結して、その後、ＰＢＳ中で再懸濁し、遠心分離して細胞デブリを取り除くことにより、ＶＨＨを含む粗周辺質抽出物を調製した。
【0184】
ＬＴＢＲ選択アウトプットのスクリーニング
ＥＬＩＳＡをマウスＬＴＢＲに結合させることにより、免疫化および選択のキャンペーンからのＶＨＨのクローンを、粗周辺質抽出物として、コーティングされていない対照と比較して、スクリーニングした。バイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry）により、結合を確認した。
ＥＬＩＳＡをマウスＬＴＢＲに結合させることにより、免疫化および選択のキャンペーンからのＶＨＨのクローンを、粗周辺質抽出物として、コーティングされていない対照と比較して、スクリーニングした。バイオレイヤー干渉法（biolayer interferometry）により、結合を確認した。
【0185】
ＥＬＩＳＡ
ＰＢＳ中、ｐＨ７．４で希釈された１μｇ／ｍｌのｍＬＴＢＲ－ｍＦｃ（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート上にコーティングし、その後、ＰＢＳ（Marvel）中の４％の乾燥スキムミルクでブロッキングした。次いで、モノクローナルＶＨＨクローンからの１：５希釈の粗周辺質抽出物を添加し、その後、いずれもＰＢＳ中１％の乾燥スキムミルク中の、１：１０００の抗ｃ－ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Merck、ｃａｔ．♯１１６６７２０３００１）および１：５０００希釈における抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Jackson Immuno Research、ｃａｔ．♯７１５－０３５－１５０）により検出した。適用の間に、プレートを０．０５％のTweenを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。反応の発生は、１００μｌのＨＲＰ基質ＴＭＢ（Thermo Fisher、ｃａｔ．♯００－４２０１－５６）を用いて行われた。１００μｌの０．５ＭのＨ２ＳＯ４（Fisher Scientific、ｃａｔ．♯Ｊ／８４３０／１５）の添加により反応を停止させ、プレートリーダー上でＯＤ４５０において読み出した。クローンP002MP07G04は、ｍＬＴＢＲ－ｍＦｃに対して４．４５８の、これに対してコーティングしていない対照に対しては０．０４２の、ＯＤ４５０での結合シグナルを有した。
ＰＢＳ中、ｐＨ７．４で希釈された１μｇ／ｍｌのｍＬＴＢＲ－ｍＦｃ（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート上にコーティングし、その後、ＰＢＳ（Marvel）中の４％の乾燥スキムミルクでブロッキングした。次いで、モノクローナルＶＨＨクローンからの１：５希釈の粗周辺質抽出物を添加し、その後、いずれもＰＢＳ中１％の乾燥スキムミルク中の、１：１０００の抗ｃ－ｍｙｃ抗体９Ｅ１０（Merck、ｃａｔ．♯１１６６７２０３００１）および１：５０００希釈における抗マウスＩｇＧ－ＨＲＰ（Jackson Immuno Research、ｃａｔ．♯７１５－０３５－１５０）により検出した。適用の間に、プレートを０．０５％のTweenを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４で洗浄した。反応の発生は、１００μｌのＨＲＰ基質ＴＭＢ（Thermo Fisher、ｃａｔ．♯００－４２０１－５６）を用いて行われた。１００μｌの０．５ＭのＨ２ＳＯ４（Fisher Scientific、ｃａｔ．♯Ｊ／８４３０／１５）の添加により反応を停止させ、プレートリーダー上でＯＤ４５０において読み出した。クローンP002MP07G04は、ｍＬＴＢＲ－ｍＦｃに対して４．４５８の、これに対してコーティングしていない対照に対しては０．０４２の、ＯＤ４５０での結合シグナルを有した。
【0186】
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）は、生体分子の相互作用を測定するための、標識フリーの技術であって、バイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層および内部参照層の２つの表面から反射される白色光の干渉のパターンを分析するものである。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化が、干渉パターンのシフトを引き起こし、それをリアルタイムで測定することができる。バイオセンサーチップ表面上に固定されたリガンドと溶液中の分析物との間の結合が、バイオセンサーチップにおいて光学的厚みの増大を生じ、これが波長のシフトをもたらし、これが、生物学的な層の厚みの変化の直接的な尺度となる。動力学的結合パラメーターであるオフ速度（off-rate）（ｋｏｆｆ）および解離定数（ＫＤ）を、Octet RED96eマシン（ForteBio）において製造者の手順に従って決定し、Data Analysis 9.0ソフトウェア（ForteBio）を用いて分析した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ForteBio、ｃａｔ．＃１８－５０８８）チップ上で捕捉されたマウスＬＴＢＲ－Ｆｃ（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）を、クローンP002MP07G04の１／５希釈された周辺質抽出物中に浸漬し、これは、１．８×１０－０２Ｓ－１のｋｏｆｆ値をもたらした。
バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）は、生体分子の相互作用を測定するための、標識フリーの技術であって、バイオセンサーチップ上の固定されたタンパク質の層および内部参照層の２つの表面から反射される白色光の干渉のパターンを分析するものである。バイオセンサーチップに結合した分子の数の任意の変化が、干渉パターンのシフトを引き起こし、それをリアルタイムで測定することができる。バイオセンサーチップ表面上に固定されたリガンドと溶液中の分析物との間の結合が、バイオセンサーチップにおいて光学的厚みの増大を生じ、これが波長のシフトをもたらし、これが、生物学的な層の厚みの変化の直接的な尺度となる。動力学的結合パラメーターであるオフ速度（off-rate）（ｋｏｆｆ）および解離定数（ＫＤ）を、Octet RED96eマシン（ForteBio）において製造者の手順に従って決定し、Data Analysis 9.0ソフトウェア（ForteBio）を用いて分析した。抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ForteBio、ｃａｔ．＃１８－５０８８）チップ上で捕捉されたマウスＬＴＢＲ－Ｆｃ（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）を、クローンP002MP07G04の１／５希釈された周辺質抽出物中に浸漬し、これは、１．８×１０－０２Ｓ－１のｋｏｆｆ値をもたらした。
【0187】
レポーターアッセイ
クローンP002MP07G04を、モノクローナルファージ粒子の上に、多量体の様式においてディスプレイし、レポーターアッセイにおいてスクリーニングして、そのアゴニスト性の潜在能力を無関係な対照と比較して評価した。したがって、２つの異なる形式のモノクローナルファージを評価した：（ｉ）ＶＣＳＭ１３によりレスキューされたファージであって、ファージ１粒子あたりある範囲（１～５つ）のＶＨＨフラグメントをディスプレイするもの、および（ｉｉ）ヘルパーファージによりレスキューされたファージ（Progen、ｃａｔ．♯ＰＲＨＹＰＥ－ＸＳ）であって、ファージ１粒子あたり５つのＶＨＨフラグメントをディスプレイするもの。したがって、クローンP002MP07G04は、無関係な対照と比較して、それぞれ４．７および３．２のレポーターアッセイシグナル比を生じ、このことは、P002MP07G04の多価ディスプレイが、マウスＬＴＢＲを活性化することができることを示唆している。
クローンP002MP07G04を、モノクローナルファージ粒子の上に、多量体の様式においてディスプレイし、レポーターアッセイにおいてスクリーニングして、そのアゴニスト性の潜在能力を無関係な対照と比較して評価した。したがって、２つの異なる形式のモノクローナルファージを評価した：（ｉ）ＶＣＳＭ１３によりレスキューされたファージであって、ファージ１粒子あたりある範囲（１～５つ）のＶＨＨフラグメントをディスプレイするもの、および（ｉｉ）ヘルパーファージによりレスキューされたファージ（Progen、ｃａｔ．♯ＰＲＨＹＰＥ－ＸＳ）であって、ファージ１粒子あたり５つのＶＨＨフラグメントをディスプレイするもの。したがって、クローンP002MP07G04は、無関係な対照と比較して、それぞれ４．７および３．２のレポーターアッセイシグナル比を生じ、このことは、P002MP07G04の多価ディスプレイが、マウスＬＴＢＲを活性化することができることを示唆している。
【0188】
一価ＬＴＢＲ ＶＨＨの生成、精製およびin vitroでの特徴づけ
ＶＨＨをコードする合成ＤＮＡフラグメントを注文し、E. coli発現ベクター中に、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下において、Ｎ末端ＰｅｌＢシグナルペプチド（これは、組み換えタンパク質を周辺質コンパートメントへと志向させる）ならびにＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨＩＳ６タグとインフレームで、サブクローニングした。エレクトロコンピテントE. coli TG1細胞を形質転換し、結果として生じたクローンの配列を検証した。よく確立された手順に従って（Pardon et al., 2014）、ＩＭＡＣクロマトグラフィーとその後の脱塩により、これらのクローンからＶＨＨタンパク質を精製した。
ＶＨＨをコードする合成ＤＮＡフラグメントを注文し、E. coli発現ベクター中に、ＩＰＴＧ誘導性ｌａｃプロモーターの制御下において、Ｎ末端ＰｅｌＢシグナルペプチド（これは、組み換えタンパク質を周辺質コンパートメントへと志向させる）ならびにＣ末端ＦＬＡＧ３およびＨＩＳ６タグとインフレームで、サブクローニングした。エレクトロコンピテントE. coli TG1細胞を形質転換し、結果として生じたクローンの配列を検証した。よく確立された手順に従って（Pardon et al., 2014）、ＩＭＡＣクロマトグラフィーとその後の脱塩により、これらのクローンからＶＨＨタンパク質を精製した。
【0189】
精製された一価P002MP07G04について、抗マウスＩｇＧ Ｆｃキャプチャー（ForteBio, cat. #18-5088）チップ上で捕捉されたマウスＬＴＢＲ－Ｆｃ（R&D Systems、ｃａｔ．♯１００８－ＬＲ）に対して、５５ｎＭの結合ＫＤがＢＬＩにより決定された。
【0190】
１００ｎＭの精製された一価P002MP07G04を、そのＣ末端ＨＩＳ６タグを通して、抗ＨｉｓタグｍＡｂ（Genscript、ｃａｔ．♯Ａ００１８６－１００）により、２：１のモル比において、架橋した。この二量体のP002MP07G04のディスプレイは、レポーターアッセイにおいて、ＬＴＢＲ受容体活性化作用を与え、ＮＦκＢシグナル対バックグラウンド比は６．８であった。対照的に、架橋されていない一価P002MP07G04は、レポーターアッセイにおいて、１００ｎＭにおいては活性ではなかった。
【0191】
多価ＬＴＢＲ ＶＨＨの生成、精製およびin vitroでの特徴づけ
２０ＧＳフレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカーにより分離された３つのP002MP07G04構成要素と１つの抗血清アルブミン構成要素ＳＡ２６ｈ５（WO/2019/016237）とを組み合わせた四価ＶＨＨであるＶＨＨ－１６を、本質的には前に記載されるとおり作製した（Maussang et al., 2013；De Tavernier et al., 2016）。多価コンストラクトを、Pichia pastoris発現ベクター中に、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下において、発現された組み換えタンパク質を細胞外環境へ指向させるＮ末端Saccharomyces cerevisiaeアルファ接合因子シグナルペプチドとインフレームで、クローニングし、配列を検証した。Pichia pastorisにおける形質転換および発現、ならびにタンパク質Ａ精製による精製は、本質的には前に記載されるとおり行われた（Lin-Cereghino et al., 2005; Schotte et al., 2016）。When tested in the レポーターアッセイにおいて試験される場合、ＶＨＨ－１６は、９．３５±０．０３の平均（±標準偏差）ｐＥＣ５０値（ｎ＝３）で、マウスＬＴＢＲを活性化した。
２０ＧＳフレキシブルＧｌｙＳｅｒリンカーにより分離された３つのP002MP07G04構成要素と１つの抗血清アルブミン構成要素ＳＡ２６ｈ５（WO/2019/016237）とを組み合わせた四価ＶＨＨであるＶＨＨ－１６を、本質的には前に記載されるとおり作製した（Maussang et al., 2013；De Tavernier et al., 2016）。多価コンストラクトを、Pichia pastoris発現ベクター中に、ＡＯＸ１メタノール誘導性プロモーターの制御下において、発現された組み換えタンパク質を細胞外環境へ指向させるＮ末端Saccharomyces cerevisiaeアルファ接合因子シグナルペプチドとインフレームで、クローニングし、配列を検証した。Pichia pastorisにおける形質転換および発現、ならびにタンパク質Ａ精製による精製は、本質的には前に記載されるとおり行われた（Lin-Cereghino et al., 2005; Schotte et al., 2016）。When tested in the レポーターアッセイにおいて試験される場合、ＶＨＨ－１６は、９．３５±０．０３の平均（±標準偏差）ｐＥＣ５０値（ｎ＝３）で、マウスＬＴＢＲを活性化した。
【0192】
例６：ＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせにおける、およびＭＣ３８同系マウスモデルにおける腫瘍増殖に対する、Ｔｒｅｇ枯渇剤の効果
マウスＭＣ３８腫瘍モデルを用いて、ＶＨＨ－Ｆｃ－４３を用いて、およびＬＴＢＲアゴニスト、ＶＨＨ－１６を用いて、抗ＣＣＲ８の単剤治療および組み合わせ治療の有効性を試験した。
第０日において、５×１０５のＭＣ３８細胞（０．１ｍｌの細胞懸濁液）を、８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部中に皮下注射した。第７日において、動物は、約１２５ｍｍ３の平均腫瘍サイズに達し、各１０個体の４群に分けられた。マウスに、隔週で、３週間にわたり、２００μｇのマウスＩｇＧ２ａ、２００μｇのP00500043、４０μｇのＶＨＨ－１６、または２００μｇのＶＨＨ－ＦＣ－４３＋４０μｇのＶＨＨ－１６の組み合わせを注射した。体重および腫瘍負荷を、隔週で、３週間の試験の期間にわたり測定した。ノギスで二次元において腫瘍を測定して増殖をモニタリングし、マウスの腫瘍が２０００ｍｍ３の倫理的エンドポイントを超えた場合、そのマウスを安楽死させた。
マウスＭＣ３８腫瘍モデルを用いて、ＶＨＨ－Ｆｃ－４３を用いて、およびＬＴＢＲアゴニスト、ＶＨＨ－１６を用いて、抗ＣＣＲ８の単剤治療および組み合わせ治療の有効性を試験した。
第０日において、５×１０５のＭＣ３８細胞（０．１ｍｌの細胞懸濁液）を、８週齢のメスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウスの右側腹部中に皮下注射した。第７日において、動物は、約１２５ｍｍ３の平均腫瘍サイズに達し、各１０個体の４群に分けられた。マウスに、隔週で、３週間にわたり、２００μｇのマウスＩｇＧ２ａ、２００μｇのP00500043、４０μｇのＶＨＨ－１６、または２００μｇのＶＨＨ－ＦＣ－４３＋４０μｇのＶＨＨ－１６の組み合わせを注射した。体重および腫瘍負荷を、隔週で、３週間の試験の期間にわたり測定した。ノギスで二次元において腫瘍を測定して増殖をモニタリングし、マウスの腫瘍が２０００ｍｍ３の倫理的エンドポイントを超えた場合、そのマウスを安楽死させた。
【0193】
ｍｍ３における腫瘍サイズは、以下から計算した：
腫瘍容積＝（ｗ２×ｌ）×０．５２
ここで、ｗ＝ｍｍにおける腫瘍の幅であり、ｌ＝ｍｍにおける腫瘍の長さである。
腫瘍容積＝（ｗ２×ｌ）×０．５２
ここで、ｗ＝ｍｍにおける腫瘍の幅であり、ｌ＝ｍｍにおける腫瘍の長さである。
【0194】
４つのコホートについての平均腫瘍サイズを、第０日から開始して第２５日まで、図５において表す。単剤治療はいずれも、第１４日～第２５日に、アイソタイプ対照に対して、腫瘍増殖を制御することにおいて効果的であり、一方、組み合わせの抗ＣＣＲ８およびＬＴＢＲアゴニスト処置は、加えて、両方の単剤治療に対して、第１４日に開始して、第２５日においてステージを終了し始める腫瘍負荷を減少させることにおいて相乗効果をもたらす。これはまた、全てのアイソタイプ処置された動物（１０／１０）は、第２５日までに２０００ｍｍ３の倫理的エンドポイントに達したが、一方、３／１０のＶＨＨ－ＦＣ－４３単剤治療処置された動物、および４／１０のＶＨＨ－１６単剤治療処置された動物のみが、エンドポイントに達したという、カプラン・マイヤー生存曲線において反映される。さらに、組み合わせＶＨＨ－ＦＣ－４３＋ＶＨＨ－１６治療の組み合わせで処置されたマウス（０／１０）はいずれも、エンドステージに達しなかった（図６）。多様な処置群を比較する混合効果モデルによる二方向ＡＮＯＶＡは、単剤治療および組み合わせ治療の両方と、アイソタイプ対照との間に、第１４～２１日（高い腫瘍負荷に起因して９／１０のマウスを安楽死させたとき）に、統計学的有意差が存在すること、ならびに、組み合わせ治療は、第１４～２５日においてＶＨＨ－１６よりも、および第１４日においてＶＨＨ－ＦＣ－４３よりも、統計学的に優れていることを示す。ログランク検定は、生存率データを用いて行われ、全ての処置群とアイソタイプ対照との間で、およびＶＨＨ－１６単剤治療について組み合わせ治療に対して（ｐ値＝０．０２９７）、生存率が増大したことを示した。組み合わせ治療について、ＶＨＨ－ＦＣ－４３に対して、生存率の増大に向かう傾向が存在する（ｐ値＝０．０６７６）。図７は、全てのコホートについて、アイソタイプおよび処置された腫瘍において見出される高内皮細静脈（ＨＥＶ）の数の定量を、ＨＥＶの数／腫瘍面積と共に示す。末梢節（peripheral node）アドレシン抗体、ＡＦ４８８抗ＭＥＣＡ７９（Ｍ７９）で染色された腫瘍に対して、免疫蛍光染色を行った。推定ＨＥＶが同定された場合、ＡＦ５６８抗ＣＤ３１を用いて血管染色を評価した。ＨＥＶが存在する場合、連続的に染色されるＣＤ３１陽性血管の管腔側において、非連続的なＭＥＣＡ７９シグナルが存在する。各々の腫瘍からの２つの切片を手作業でカウントして、各々の条件について３～４個体の処置マウスから平均を求め、Zen Blueソフトウェアプログラムを用いてＤＡＰＩ陽性の核の面積から腫瘍面積を計算した。結果は、組み合わせ処置された腫瘍において、各々の単剤治療に対して、ＨＥＶの誘導の増大を示し、ＨＥＶの局在は、ＶＨＨ－１６単剤治療処置されたマウスにおける腫瘍周囲から、組み合わせ処置された動物における腫瘍中の深部へとシフトする（データは示さず）。加えて、大量のＢ２２０陽性Ｂ細胞からなる組織化された構造を取り囲む、多数のＭＥＣＡ－７９陽性ＨＥＶ（矢印）からなる、「成熟した」外見の三次リンパ組織様構造（ＴＬＳ）が、４／６の組み合わせ処置された腫瘍において見出される（図８）。加えて、組み合わせ処置された腫瘍内の深部におけるいくつかのＨＥＶは、多数の個々のＢ細胞により取り囲まれていた。まとめると、腫瘍負荷の減少、生存率増大に向かう傾向、ならびに組み合わせ処置された動物における、増大したＨＥＶおよびＴＬＳ誘導は、ＬＴＢＲ受容体活性化作用とＴｒｅｇ枯渇治療との相乗的活性を示す。
【0195】
例７：ＭＣ３８同系マウスモデルにおける腫瘍増殖に対する、ＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせにおけるＴｒｅｇ枯渇性抗ＣＴＬＡ４の効果
マウスＭＣ３８腫瘍モデルを用いて、Ｔｒｅｇ枯渇活性を有する抗ＣＴＬＡ４の単剤治療、およびＶＨＨ－１６を用いるＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせ治療の有効性を試験した。これらの実験において用いられた抗ＣＴＬＡ４抗体は、以前に記載されている抗ｍＣＴＬＡ４ ９Ｄ９抗体に基づくが、ここで、マウスＩｇＧ２ｂが、マウスＩｇＧ２ａ定常領域により置き換えられている。マウスＩｇＧ２ａは、それが、マウスにおいてより強力なＡＤＣＣ活性を提供することから選択される（Selby MJ. et al., 2013. Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer Immunol Res. 1(1):32-42）。
マウスＭＣ３８腫瘍モデルを用いて、Ｔｒｅｇ枯渇活性を有する抗ＣＴＬＡ４の単剤治療、およびＶＨＨ－１６を用いるＬＴＢＲアゴニストとの組み合わせ治療の有効性を試験した。これらの実験において用いられた抗ＣＴＬＡ４抗体は、以前に記載されている抗ｍＣＴＬＡ４ ９Ｄ９抗体に基づくが、ここで、マウスＩｇＧ２ｂが、マウスＩｇＧ２ａ定常領域により置き換えられている。マウスＩｇＧ２ａは、それが、マウスにおいてより強力なＡＤＣＣ活性を提供することから選択される（Selby MJ. et al., 2013. Anti-CTLA-4 antibodies of IgG2a isotype enhance antitumor activity through reduction of intratumoral regulatory T cells. Cancer Immunol Res. 1(1):32-42）。
【0196】
第０日において、５×１０５のＭＣ３８細胞（１００μＬ）を、メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（７～９週）において皮下注射した。第７日において、動物は、約１１６ｍｍ３の平均腫瘍サイズに達し、各々１０個体の４群、すなわち、マウスＩｇＧ２ａ（対照）、抗ＣＴＬＡ４単剤治療、ＣＨＨ－１６単剤治療、および抗ＣＴＬＡ４＋ＶＨＨ－１６の組み合わせに分けられた。マウスに、第７日から開始して、隔週で３週間にわたり、２００μｇのマウスＩｇＧ２ａ（対照）および４０μｇのＶＨＨ－１６を腹腔内注射した。２００μｇの抗ＣＴＬＡ４による処置は、第１０日に開始し、マウスは、３週間にわたり、週１回投与された。体重および腫瘍負荷は、隔週で、３週間の試験の期間にわたり測定した。ノギスで二次元において腫瘍を測定して、増殖をモニタリングした。
ｍｍ３における腫瘍サイズは、以下から計算した：
腫瘍容積＝（ｗ２×ｌ）×０．５２
ここで、ｗ＝ｍｍにおける腫瘍の幅であり、ｌ＝ｍｍにおける腫瘍の長さである。
ｍｍ３における腫瘍サイズは、以下から計算した：
腫瘍容積＝（ｗ２×ｌ）×０．５２
ここで、ｗ＝ｍｍにおける腫瘍の幅であり、ｌ＝ｍｍにおける腫瘍の長さである。
【0197】
４つのコホートについての腫瘍サイズ中央値（ｍｍ３における）を、第０日に開始して、第２５日まで、図９において表す。抗ＣＴＬＡ４およびＶＨＨ－１６により単剤治療として処置されたコホートは、第１８日から、アイソタイプ対照と比較して、より小さな腫瘍サイズを示した。さらに、抗ＣＴＬＡ４によるＴｒｅｇ枯渇とＬＴＢＲアゴニスト処置との組み合わせは、腫瘍負荷を減少させることにおいて相乗効果をもたらし、この処置群におけるマウスの大多数において、腫瘍の停滞または退縮すらもたらした。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】