▶ アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-26
(54)【発明の名称】免疫細胞を形質導入する方法
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240216BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240216BHJP
A61K 35/15 20150101ALI20240216BHJP
C12N 15/867 20060101ALN20240216BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240216BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240216BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240216BHJP
C12N 7/01 20060101ALN20240216BHJP
C07K 14/725 20060101ALN20240216BHJP
C07K 16/28 20060101ALN20240216BHJP
C07K 19/00 20060101ALN20240216BHJP
C07K 14/78 20060101ALN20240216BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10
A61K35/17
A61K35/15
C12N15/867 Z
C12N15/13
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N7/01
C07K14/725
C07K16/28
C07K19/00
C07K14/78
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023544092
(86)(22)【出願日】2022-01-28
(85)【翻訳文提出日】2023-07-20
(86)【国際出願番号】 US2022014247
(87)【国際公開番号】W WO2022165133
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】63/142,730
(32)【優先日】2021-01-28
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/302,225
(32)【優先日】2022-01-24
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519089657
【氏名又は名称】アロジーン セラピューティクス，インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(72)【発明者】
【氏名】ルーマン トッド
(72)【発明者】
【氏名】サラゴサ ホセルヒオ
(72)【発明者】
【氏名】ジャーマンズデルファー アブラハム
(72)【発明者】
【氏名】ラオ スマ
(72)【発明者】
【氏名】ニ ヤジン
(72)【発明者】
【氏名】チャン チュペイ
(72)【発明者】
【氏名】フアン トム タオ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA97X
4B065AA97Y
4B065AB01
4B065AC04
4B065BA02
4B065BB19
4B065BB38
4B065BC02
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA03
4C087BB65
4C087NA20
4H045AA50
4H045DA76
4H045EA20
4H045FA74
(57)【要約】
本明細書において、キメラ抗原受容体(CAR)などの外因性遺伝子産物を発現するレトロウイルスベクターを用いて、T細胞などの免疫細胞を形質導入するための改善された方法が提供される。本明細書において、形質導入効率を増加させ、それによって外因性遺伝子産物を発現する集団における免疫細胞の割合を増加させる方法が提供される。関連する細胞、細胞集団、組成物、および使用方法も提供される。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
レトロウイルスベクターを用いて細胞集団を形質導入する方法であって、前記ベクターが前記細胞に対して外因性である核酸を含み、前記方法が、ａ）前記細胞集団を選択することであって、選択された細胞集団が、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、腫瘍細胞、メモリーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、末梢血リンパ球、末梢血単核細胞、樹状細胞、またはナチュラルキラー細胞もしくはそれらの混合物を含む、選択すること、および、
ｂ）前記選択された細胞集団を前記レトロウイルスベクターと共に、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨで細胞培養培地中で培養することと、前記開始ｐＨ範囲内の前記開始ｐＨを、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間維持して、前記外因性核酸によってコードされる遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入細胞集団をもたらすことと、を含む、方法。
【請求項2】
前記開始ｐＨが、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、前記開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記開始ｐＨが、前記形質導入培養工程の終わりまでずっと、約７．０を超えて維持される、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記形質導入培養工程が、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間実施される、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記細胞培養培地が、共局在化剤を含まない、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記細胞培養培地が、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導体を含まない、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記選択された細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記外因性核酸が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記選択された細胞集団が、容器中で培養され、前記容器が、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記形質導入培養工程が、前記選択された細胞集団および前記レトロウイルスベクターを、約０．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
前記形質導入細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から約３～約１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記形質導入細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から約７～約１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記開始ｐＨ範囲が受動的に維持される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記開始ｐＨ範囲が能動的に維持される、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
前記選択された細胞集団が、同種細胞集団である、請求項１～１５のいずれかに記載の方法。
【請求項17】
前記選択された細胞集団が、自己細胞集団である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
第一および第二の細胞集団を形質導入する方法であって、前記第一および第二の細胞集団が、請求項１～１７のいずれか一項に記載の同じ方法によって形質導入され、それにより、前記第一および第二の形質導入細胞集団において前記外因性核酸遺伝子産物を発現する前記形質導入細胞集団の割合が、約２％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、または約２０％～約３０％を超えて異ならない、方法。
【請求項19】
ポリカチオンが前記細胞培養培地に添加されない、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランが、前記培養培地に添加されない、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
レトロウイルスベクターを用いて細胞傷害性Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、前記ベクターが、前記細胞障害性Ｔ細胞に外因性である核酸を含み、前記方法が、前記細胞傷害性Ｔ細胞集団を前記レトロウイルスベクターと共に、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨで細胞培養培地で培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、前記開始ｐＨ範囲内の前記開始ｐＨを維持して、前記外因性核酸によってコードされる前記遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで前記細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法。
【請求項22】
前記開始ｐＨが、少なくとも約１、約２、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記開始ｐＨが、前記形質導入培養工程の終わりまでずっと、前記開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項２１に記載の方法。
【請求項24】
前記形質導入培養工程が、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間実施される、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記共局在化剤がフィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導体である、請求項２１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記細胞傷害性Ｔ細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する、請求項２１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
前記外因性核酸が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項２１～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
前記細胞傷害性Ｔ細胞集団が、容器中で培養され、前記容器が、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである、請求項２１～２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項29】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項２１～２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項30】
前記形質導入培養工程が、前記細胞傷害性Ｔ細胞集団および前記レトロウイルスベクターを、約０．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む、請求項２１～２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項31】
前記形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から３～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項２１～３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項32】
前記形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から７～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項２１～３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項33】
前記開始ｐＨ範囲が受動的に維持される、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項34】
前記開始ｐＨ範囲が能動的に維持される、請求項２１～３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項35】
前記細胞傷害性Ｔ細胞集団が、同種細胞傷害性Ｔ細胞集団である、請求項２１～３４のいずれかに記載の方法。
【請求項36】
前記細胞傷害性Ｔ細胞集団が、自己細胞傷害性Ｔ細胞集団である、請求項２１～３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項37】
第一および第二の細胞傷害性Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、前記第一および第二の細胞傷害性Ｔ細胞集団が、請求項２１～３６のいずれか一項に記載の方法によって形質導入され、それにより、前記第一および第二の形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団において前記外因性核酸遺伝子産物を発現する前記形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の割合が、約２％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、または約２０％～約３０％を超えて異ならない、方法。
【請求項38】
ポリカチオンが前記細胞培養培地に添加されない、請求項２１～３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項39】
ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランが、前記培養培地に添加されない、請求項２１～３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項40】
レトロウイルスベクターを用いて、末梢血単核細胞の集団を形質導入する方法であって、前記ベクターが、前記末梢血単核細胞に外因性である核酸を含み、前記方法が、前記末梢血単核細胞集団を前記レトロウイルスベクターと共に、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨで細胞培養培地で培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、前記開始ｐＨ範囲内に前記開始ｐＨを維持して、前記外因性核酸によってコードされる前記遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入末梢血単核細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで前記細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法。
【請求項41】
前記開始ｐＨが、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項４０に記載の方法。
【請求項42】
前記開始ｐＨが、前記形質導入培養工程の終わりまでずっと、前記開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項４０に記載の方法。
【請求項43】
前記形質導入培養工程が、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項44】
前記共局在化剤がフィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導体である、請求項４０～４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項45】
前記末梢血単核細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する、請求項４０～４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項46】
前記外因性核酸が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項４０～４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項47】
前記末梢血単核細胞集団が、容器中で培養され、前記容器が、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである、請求項４０～４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項48】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項４０～４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項49】
前記形質導入培養工程が、前記末梢血単核細胞集団および前記レトロウイルスベクターを、約０．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む、請求項４０～４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項50】
前記形質導入末梢血単核細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から３～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項４０～４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項51】
前記形質導入末梢血単核細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から７～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項４０～５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項52】
前記開始ｐＨ範囲が受動的に維持される、請求項４０～５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項53】
前記開始ｐＨ範囲が能動的に維持される、請求項４０～５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項54】
前記末梢血単核細胞集団が同種末梢血単核細胞集団である、請求項４０～５３のいずれかに記載の方法。
【請求項55】
前記末梢血単核細胞集団が自己末梢血単核細胞集団である、請求項４０～５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項56】
第一および第二の末梢血単核細胞集団を形質導入する方法であって、前記第一および第二の末梢血単核細胞集団が、請求項４０～５５のいずれか一項に記載の同じ方法によって形質導入され、それにより、前記第一および第二の形質導入末梢血単核細胞集団において前記外因性核酸遺伝子産物を発現する前記形質導入末梢血単核細胞集団の割合が、約２％～約５％、約５％～約１０％、約１０％～約２０％、または約２０％～約３０％を超えて異ならない、方法。
【請求項57】
ポリカチオンが前記細胞培養培地に添加されない、請求項４０～５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項58】
ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランが、前記培養培地に添加されない、請求項４０～５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項59】
レトロウイルスベクターを用いて、人工多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞の集団を形質導入する方法であって、前記ベクターが、誘導Ｔ細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）に外因性である核酸を含み、前記方法が、前記誘導Ｔ細胞集団を前記レトロウイルスベクターと共に、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨで細胞培養培地で培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、前記開始ｐＨ範囲に前記開始ｐＨを維持して、前記外因性核酸によってコードされる前記遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入された誘導Ｔ細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで前記細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法。
【請求項60】
前記開始ｐＨが、少なくとも約１、約２、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項５９に記載の方法。
【請求項61】
前記開始ｐＨが、前記形質導入培養工程の終わりまでずっと、前記開始ｐＨ範囲内に維持される、請求項５９に記載の方法。
【請求項62】
前記形質導入培養工程が、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間実施される、請求項６１に記載の方法。
【請求項63】
前記共局在化剤がフィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導体である、請求項５９～６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項64】
前記誘導Ｔ細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する、請求項５９～６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項65】
前記外因性核酸が、キメラ抗原受容体をコードする、請求項５９～６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項66】
前記誘導Ｔ細胞集団が、容器中で培養され、前記容器が、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである、請求項５９～６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項67】
前記レトロウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、請求項５９～６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項68】
前記形質導入培養工程が、前記誘導Ｔ細胞集団および前記レトロウイルスベクターを、約０．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む、請求項５９～６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項69】
前記形質導入された誘導Ｔ細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から３～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項５９～６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項70】
前記形質導入された誘導Ｔ細胞集団の少なくとも約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、約７０％～約９５％が、前記形質導入培養工程の開始から７～１８日後に前記外因性核酸遺伝子産物を発現する、請求項５９～６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項71】
前記開始ｐＨ範囲が受動的に維持される、請求項５９～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項72】
前記開始ｐＨ範囲が能動的に維持される、請求項５９～７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項73】
前記誘導Ｔ細胞集団が、同種誘導Ｔ細胞集団である、請求項５９～７２のいずれかに記載の方法。
【請求項74】
前記誘導Ｔ細胞集団が、自己誘導Ｔ細胞集団である、請求項５９～７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項75】
第一および第二の誘導Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、前記第一および第二の誘導Ｔ細胞集団が、請求項５９～７４のいずれか一項に記載の同じ方法によって形質導入され、それにより、前記第一および第二の形質導入された誘導Ｔ細胞集団において前記外因性核酸遺伝子産物を発現する前記形質導入された誘導Ｔ細胞集団の割合が、２％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、または２０％～３０％を超えて異ならない、方法。
【請求項76】
ポリカチオンが前記細胞培養培地に添加されない、請求項５９～７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項77】
ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランが、前記培養培地に添加されない、請求項５９～７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項78】
請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法によって産生された遺伝子改変細胞。
【請求項79】
請求項１～７８のいずれか一項に記載の方法によって産生された遺伝子改変細胞の集団。
【請求項80】
請求項７８または７９に記載の細胞または細胞集団を含む治療用組成物。
【請求項81】
対象において疾患を治療する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項１～７７のいずれか一項に記載の方法によって産生される細胞の治療有効量を投与することを含む、方法。
【請求項82】
対象において疾患を治療する方法であって、それを必要とする前記対象に、請求項８０に記載の治療用組成物の治療有効量を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１４２，７３０号および２０２２年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０２，２２５号の優先の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年１月２８日に出願された米国仮特許出願第６３／１４２，７３０号および２０２２年１月２４日に出願された米国仮特許出願第６３／３０２，２２５号の優先の利益を主張するものであり、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）遺伝子産物などの遺伝子産物を発現するレトロウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞を形質導入する方法に関する。
【背景技術】
【0003】
養子細胞療法では、自己および同種免疫細胞を遺伝子改変して、細胞が新しい治療機能を実行できるようにする合成タンパク質を発現させることができる。免疫細胞は、抗原認識部分およびＴ細胞活性化ドメインから構成される融合タンパク質であるキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を、発現するように遺伝子操作され得る。ＣＡＲ、例えば、ＣＡＲ－Ｔ細胞（「ＣＡＲ－Ｔ」）を含有する操作された免疫細胞は、抗原特異性を有し、癌細胞などの標的細胞を認識および殺傷する能力が保持または強化される。免疫細胞は、ＣＡＲをコードする核酸がウイルスベクターを介して免疫細胞に導入される形質導入によって操作され得る。ＣＡＲ Ｔ免疫療法のための免疫細胞を形質導入する以前の方法、特に製造スケールで同種免疫細胞を形質導入する方法は、非効率であり、一貫性のない結果を生じ、一般的に処理コストおよび複雑さを増大させる試薬を使用することがある。
【0004】
したがって、免疫細胞形質導入効率が堅牢かつ一貫しており、かつ現在の方法よりも簡単で安価である、ＣＡＲ－Ｔ細胞を生成する方法に対するニーズが依然としてある。
【発明の概要】
【0005】
本明細書には、外因性遺伝子産物を発現する細胞の割合が高い免疫細胞の遺伝子改変された集団、外因性遺伝子産物陽性細胞の割合が高い細胞集団を提供する、ウイルスベクターを用いて免疫細胞を形質導入するための改善された方法、および本開示の方法を使用して調製された細胞集団を用いる治療方法が記載されている。さらに、記載される方法は、生産のランツーランで、外因性遺伝子産物を発現する細胞をより一貫した割合で有する遺伝子改変細胞集団、および／またはより安価でより単純な形質導入方法を提供する。例えば、本明細書において、キメラ抗原受容体を使用する同種細胞療法（例えば、同種ＣＡＲ－Ｔ細胞療法）に有用な細胞の製造に使用され得る、Ｔ細胞レトロウイルスベクター形質導入に特に好適な方法が記載される。
【0006】
一態様では、ベクターが細胞にとって外因性である核酸を含むレトロウイルスベクターを用いて、細胞集団を形質導入する方法であって、ａ）細胞集団を選択することであって、ここで選択された細胞集団が、Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、腫瘍細胞、メモリーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、末梢血リンパ球、末梢血単核細胞、樹状細胞、またはナチュラルキラー細胞、またはその混合物を含む、選択すること、およびｂ）選択された細胞集団を、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨの細胞培養培地でレトロウイルスベクターと共に培養し、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、開始ｐＨ範囲内に開始ｐＨを維持して、外因性核酸によってコードされる遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入細胞集団をもたらすこと、を含む、方法が提供される。
【0007】
一実施形態では、形質導入方法の開始ｐＨは、少なくとも１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、または２４時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲で維持される。一部の実施形態では、開始ｐＨは、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、開始ｐＨ範囲に維持される。
【0008】
一部の実施形態では、開始ｐＨは、形質導入培養工程の終わりまでずっと開始ｐＨ範囲に維持される。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、少なくとも１、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、７２、または９６時間の間、実施される。一部の実施形態では、ｐＨは受動的に制御される。一部の実施形態では、ｐＨは、バイオリアクターで能動的に制御される。
【0009】
一部の実施形態では、本開示の形質導入方法は、選択された細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養することを含む。一部の実施形態では、ＭＯＩは、形質導入手順における標的細胞の総数に対する機能性ウイルス粒子の比率である。一部の実施形態では、形質導入手順に加えられる機能性ウイルス粒子の力価は、ｑＰＣＲによって決定される。
【0010】
本開示の一部の実施形態では、外因性核酸は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。一部の実施形態では、外因性核酸は、モノクローナル抗体、自殺ポリペプチド、誘導性「オン」もしくは「促進剤」スイッチ、または制御スイッチ、例えば、二量体形成ドメインに特異的なエピトープをコードする。
【0011】
一部の実施形態では、選択された細胞集団は、容器中で培養され、容器は、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、選択された細胞集団およびレトロウイルスベクターを、約．７５リットルの体積～約２５０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、選択された細胞集団およびレトロウイルスベクターを、約．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む。
【0012】
一部の実施形態では、本開示の方法で使用されるレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0013】
一部の実施形態では、形質導入細胞集団の少なくとも３５％～９５％、４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から３～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、形質導入細胞集団の少なくとも３５％～９５％、４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から７～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。
【0014】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、任意選択的に、形質導入培養工程中に、フィブロネクチン、フィブロネクチン誘導体、ポリブレンまたはＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬などの、形質導入培養工程中の共局在化剤を含む。
【0015】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、形質導入培養工程中に、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン誘導体、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬などの、共局在化剤を含まない。
【0016】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、形質導入培養工程中に共局在化剤を含まない。
【0017】
一部の実施形態では、ポリブレン、硫酸プロタミン、またはＤＥＡＥ－デキストランなどのポリカチオンは、形質導入前または形質導入中に細胞培養培地に添加されない。
【0018】
一部の実施形態では、選択された細胞集団は、同種細胞集団である。一部の実施形態では、選択された細胞集団は、自己細胞集団である。
【0019】
一態様では、第一および第二の細胞集団を形質導入する方法であって、第一および第二の細胞集団が、本開示の同じ方法によって形質導入され、それにより、第一および第二の形質導入細胞集団において外因性核酸遺伝子産物を発現する形質導入細胞集団の割合が、２％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、または２０％～３０％を超えて異ならない方法、が提供される。
【0020】
一部の実施形態では、本開示の方法は、形質導入細胞集団を提供するものであり、ここで形質導入細胞集団の細胞は、本開示の同じ方法によって形質導入される細胞と比較して減少しているベクターコピー数を含み、ここで同方法の形質導入培養工程の開始ｐＨは７．０未満である。
【0021】
本開示の態様では、レトロウイルスベクターを用いて細胞傷害性Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、ベクターが細胞障害性Ｔ細胞に外因性である核酸を含み、方法が、細胞傷害性Ｔ細胞集団を、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨの細胞培養培地でレトロウイルスベクターと共に培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、開始ｐＨ範囲内に開始ｐＨを維持して、外因性核酸によってコードされる遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法が提供される。
【0022】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、開始ｐＨは、少なくとも１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または２４時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲で維持される。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞培養培地の開始ｐＨは、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、開始ｐＨ範囲に維持される。
【0023】
この態様の一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞培養培地の開始ｐＨは、形質導入培養工程の終わりまでずっと開始ｐＨ範囲に維持される。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、少なくとも１、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、７２、または９６時間の間、実施される。
【0024】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ｐＨは受動的に制御される。一部の実施形態では、ｐＨは能動的に制御される。
【0025】
一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞培養培地は、形質導入培養工程中に、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン誘導体、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）などの、共局在化剤を含まない。
【0026】
一部の実施形態では、ポリブレン、硫酸プロタミン、またはＤＥＡＥ－デキストランなどのポリカチオンは、形質導入前または形質導入中に細胞傷害性Ｔ細胞培養培地に添加されない。
【0027】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する。一部の実施形態では、ＭＯＩは、形質導入手順における細胞傷害性Ｔ細胞の総数に対する機能性ウイルス粒子の比率である。
【0028】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、外因性核酸は、キメラ抗原受容体をコードする。一部の実施形態では、外因性核酸は、モノクローナル抗体、自殺ポリペプチド、誘導性「オン」もしくは「促進剤」スイッチ、または制御スイッチ、例えば、二量体形成ドメインに特異的なエピトープをコードする。
【0029】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔ細胞集団は、容器中で培養され、容器は、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、細胞傷害性Ｔ細胞集団およびレトロウイルスベクターを、約．７５リットルの体積～約２５０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む。
【0030】
一部の実施形態では、本開示の方法における使用のためのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0031】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の少なくとも４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から３～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の少なくとも４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から７～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。
【0032】
一部の実施形態では、形質導入される細胞傷害性Ｔ細胞集団は、同種細胞傷害性Ｔ細胞集団である。一部の実施形態では、形質導入される細胞傷害性Ｔ細胞集団は、自己細胞傷害性Ｔ細胞集団である。
【0033】
本開示の態様では、第一および第二の細胞傷害性Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、第一および第二の細胞傷害性Ｔ細胞集団が、本開示の同じ方法によって形質導入され、それにより、第一および第二の形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団において外因性核酸遺伝子産物を発現する形質導入細胞傷害性Ｔ細胞集団の割合が、２％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、または２０％～３０％を超えて異ならない方法、が提供される。
【0034】
本開示の態様では、レトロウイルスベクターを用いて、末梢血単核細胞の集団を形質導入する方法であって、ベクターが末梢血単核細胞に外因性である核酸を含み、方法が、末梢血単核細胞集団を、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨの細胞培養培地でレトロウイルスベクターと共に培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、開始ｐＨ範囲内に開始ｐＨを維持して、外因性核酸によってコードされる遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入末梢血単核細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法が提供される。
【0035】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、開始ｐＨは、少なくとも１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、または２４時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲で維持される。一部の実施形態では、開始ｐＨは、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、開始ｐＨ範囲に維持される。
【0036】
この態様の一部の実施形態では、開始ｐＨは、形質導入培養工程の終わりまでずっと開始ｐＨ範囲に維持される。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、少なくとも１、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、７２、または９６時間の間、実施される。
【0037】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、ｐＨは受動的に制御される。一部の実施形態では、ｐＨは能動的に制御される。
【0038】
一部の実施形態では、末梢血単核細胞培養培地は、形質導入培養工程中に、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン誘導体、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）などの、共局在化剤を含まない。
【0039】
一部の実施形態では、ポリブレン、硫酸プロタミン、またはＤＥＡＥ－デキストランなどのポリカチオンは、形質導入前または形質導入中に末梢血単核細胞培養培地に添加されない。
【0040】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、末梢血単核細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する。一部の実施形態では、ＭＯＩは、形質導入手順における末梢血単核細胞の総数に対する機能性ウイルス粒子の比率である。
【0041】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、外因性核酸は、キメラ抗原受容体をコードする。一部の実施形態では、外因性核酸は、モノクローナル抗体、自殺ポリペプチド、誘導性「オン」もしくは「促進剤」スイッチ、または制御スイッチ、例えば、二量体形成ドメインに特異的なエピトープをコードする。
【0042】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、末梢血単核細胞集団は、容器中で培養され、容器は、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、末梢血単核細胞集団およびレトロウイルスベクターを、約．７５リットルの体積～約２５０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む。
【0043】
一部の実施形態では、本開示のこの態様の方法における使用のためのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0044】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、形質導入末梢血単核細胞集団の少なくとも４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から３～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、形質導入末梢血単核細胞集団の少なくとも４０％～９５％、５０％～９５％、６０％～９５％、７０％～９５％は、形質導入培養工程の開始から７～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。
【0045】
一部の実施形態では、形質導入される末梢血単核細胞集団は、同種末梢血単核細胞集団である。一部の実施形態では、形質導入される末梢血単核細胞集団は、自己末梢血単核細胞集団である。
【0046】
本開示の態様では、第一および第二の末梢血単核細胞集団を形質導入する方法であって、第一および第二の末梢血単核細胞集団が、本開示の同じ方法によって形質導入され、それにより、第一および第二の形質導入末梢血単核細胞集団において外因性核酸遺伝子産物を発現する形質導入末梢血単核細胞集団の割合が、２％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、または２０％～３０％を超えて異ならない方法、が提供される。
【0047】
本開示の態様では、レトロウイルスベクターを用いて、人工多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞の集団を形質導入する方法であって、ベクターが誘導Ｔ細胞（ｄｅｒｉｖｅｄ Ｔ ｃｅｌｌ）に外因性である核酸を含み、方法が、誘導Ｔ細胞集団を、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲内の開始ｐＨの細胞培養培地でレトロウイルスベクターと共に培養することと、形質導入培養工程の少なくとも最初の一時間、開始ｐＨ範囲内に開始ｐＨを維持して、外因性核酸によってコードされる遺伝子産物を発現する細胞を含む形質導入された誘導Ｔ細胞集団をもたらすことと、を含み、ここで細胞培養培地が共局在化剤を含まない、方法が提供される。
【0048】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、開始ｐＨは、少なくとも１、２、４、６、８、１０、１２、１６、１８、２０、２２、または２４時間の間、７．０～７．９の開始ｐＨ範囲で維持される。一部の実施形態では、人工多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞集団のための培養培地の開始ｐＨは、少なくとも約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１２、約１４、約１６、約１８、約２０、約２２、約２４、約３６、約４８、約７２、または約９６時間～約１６８時間を超えない時間の間、開始ｐＨ範囲に維持される。
【0049】
この態様の一部の実施形態では、誘導Ｔ細胞培養培地の開始ｐＨは、形質導入培養工程の終わりまでずっと開始ｐＨ範囲に維持される。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、少なくとも１、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、７２、または９６時間の間、実施される。
【0050】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、誘導Ｔ細胞培養培地のｐＨは、受動的に制御される。一部の実施形態では、ｐＨは能動的に制御される。
【0051】
本発明のこの態様の一部の実施形態では、誘導Ｔ細胞培養培地は、形質導入培養工程中に、フィブロネクチン、またはフィブロネクチン誘導体、例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）などの、共局在化剤を含まない。
【0052】
一部の実施形態では、ポリブレン、硫酸プロタミン、またはＤＥＡＥ－デキストランなどのポリカチオンは、形質導入前または形質導入中に誘導Ｔ細胞培養培地に添加されない。
【0053】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、誘導Ｔ細胞集団を、約．２５、約．５、約１、約５、約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、または約５０～約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、約９０、約９５、約１００、約１２５、約１５０、約１７５、約２００、約２２５、または約２５０のＭＯＩで培養する。一部の実施形態では、ＭＯＩは、形質導入手順における、人工多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞の総数に対する機能性ウイルス粒子の比率である。
【0054】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、外因性核酸は、キメラ抗原受容体をコードする。一部の実施形態では、外因性核酸は、モノクローナル抗体、自殺ポリペプチド、誘導性「オン」もしくは「促進剤」スイッチ、または制御スイッチ、例えば、二量体形成ドメインに特異的なエピトープをコードする。
【0055】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、誘導Ｔ細胞集団は、容器中で培養され、容器は、細胞培養プレート、細胞培養ディープウェルプレート、細胞スタック、制御されたバイオリアクター、振とうフラスコ、またはガス透過性バッグである。一部の実施形態では、形質導入培養工程は、誘導Ｔ細胞集団およびレトロウイルスベクターを、約０．５リットルの体積～約１０リットルの体積の細胞培養培地で培養することを含む。
【0056】
一部の実施形態では、本開示の方法における使用のためのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。
【0057】
本開示のこの態様の一部の実施形態では、形質導入された誘導Ｔ細胞集団の３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％は、形質導入培養工程の開始から３～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。一部の実施形態では、形質導入された誘導Ｔ細胞集団の約３５％～約９５％、約４０％～約９５％、約５０％～約９５％、約６０％～約９５％、または約７０％～約９５％は、形質導入培養工程の開始から７～１８日後に外因性核酸遺伝子産物を発現する。
【0058】
一部の実施形態では、形質導入される誘導Ｔ細胞集団は、同種誘導Ｔ細胞集団である。一部の実施形態では、形質導入される誘導Ｔ細胞集団は、自己誘導Ｔ細胞集団である。
【0059】
本開示の態様では、第一および第二の誘導Ｔ細胞集団を形質導入する方法であって、第一および第二の誘導Ｔ細胞集団が、本開示の同じ方法によって形質導入され、それにより、第一および第二の形質導入された誘導Ｔ細胞集団において外因性核酸遺伝子産物を発現する形質導入された誘導Ｔ細胞集団の割合が、２％～５％、５％～１０％、１０％～２０％、または２０％～３０％を超えて異ならない方法、が提供される。
【0060】
本発明の一部の実施形態では、本開示の方法によって産生される遺伝子改変細胞が提供される。本発明の別の実施形態では、本開示の方法によって産生される遺伝子改変細胞の集団が提供される。別の実施形態では、本発明の方法によって産生される細胞または細胞集団を含む治療用組成物が提供される。別の実施形態では、治療有効量の細胞、細胞集団、または本発明の方法によって産生される治療用組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、治療方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【0061】
【0062】
【0063】
図２Ｃは、生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合に対する、ｐＨ、％レンチウイルスベクター（ｖ／ｖ）（ＬＶＶとして示される）、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬濃度（μｇ／ｍＬ）（ＲＮとして示される）、および容器タイプの主効果および２方向相互作用のｐ値を示す。
【0064】
【発明を実施するための形態】
【0065】
本明細書において、免疫細胞、特にＴ細胞を形質導入するための改善された方法が提供され、これは形質導入効率を増加させ、および／または生産稼働間の外因性核酸発現レベルの一貫性を改善する一方で、処理コストおよび複雑さを低減する。
【0066】
本明細書に提供される例示的方法は、典型的にはエクスビボ法であり、レトロウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターで活性化Ｔ細胞を形質導入して、遺伝子改変Ｔ細胞を産生することを含む。例示的な実施形態では、形質導入工程は、共局在化剤なしで実施することができる。さらなる例示的な実施形態では、形質導入工程は、６．９～７．８のｐＨ、または７．０～７．９のｐＨで実施することができる。典型的には、こうした方法は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を濃縮して、活性化工程で使用され得るＴ細胞を含むＰＢＭＣを単離することを含み得る。さらに、例示的な実施形態では、こうした方法は、遺伝子改変Ｔ細胞を増殖させることを含み得る。さらなる例示的な実施形態では、本明細書に提供される方法は、Ｔ細胞の内因性遺伝子を破壊することをさらに含み得る。本明細書に提供される方法の例示的な実施形態では、Ｔ細胞を活性化、形質導入、かつ典型的には増殖させることができる。例示的な実施形態におけるこうしたＴ細胞は、ＣＡＲを発現するように遺伝子改変され得る。
定義
定義
【0067】
本開示で使用される専門用語は当技術分野では標準であるが、特許請求の範囲の意味に対する明快さと明確さを確実にするために、特定の用語の定義が本明細書に提供される。単位、接頭辞、および記号は、ＳＩで許容される形式で表示することができる。本明細書に記載されるように、別段の示唆がない限り、任意の濃度範囲、割合範囲、比の範囲、または整数範囲は、列挙された範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、その分数（整数の１０分の１および１００分の１など）を含むと理解されるべきである。本明細書で使用される節の見出しは、組織化のみを目的としており、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。
【0068】
本開示で使用される場合、本明細書に別途明示的に定められている場合を除き、以下の各用語は、以下に記載する意味を有するものとする。追加的な定義は、本開示全体を通して記載される。
【0069】
別段の記載がない限り、用語「ａ」または「ａｎ」は、「少なくとも一つ以上」の意味として解釈されるべきである。
【0070】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して数値に関連して使用される用語「約」は、当業者によく知られており、かつ許容可能な精度の間隔を示す。一般に、こうした精度の間隔は、±．１５％である。
【0071】
用語「活性化」または「活性化された」は、検出可能な細胞増殖を誘導するために十分に刺激された免疫細胞、例えば、Ｔ細胞の状態を指す。活性化はまた、誘導されたサイトカイン産生および検出可能なエフェクター機能と関連し得る。「活性化されたＴ細胞」という用語は、とりわけ、細胞分裂をしているＴ細胞を指す。Ｔ細胞活性化は、限定されるものではないが、ＣＤ５７、ＰＤ１、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ２５、ＣＤ１３７、ＣＤ６９、および／またはＣＤ７１を含む、一つ以上のバイオマーカーのＴ細胞発現の増加によって特徴付けられ得る。
【0072】
用語「投与する」とは、当業者に公知の様々な方法および送達システムのいずれかを使用して、対象に薬剤を物理的に導入することを指す。本明細書に開示される方法によって調製されるＴ細胞についての例示的な投与経路は、例えば注射もしくは点滴による、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊椎、または、その他の非経口投与経路を含む。本明細書で使用される場合、「非経口投与」という語句は、通常は注射による、腸内および局所投与以外の投与様式を意味し、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、リンパ管内、病巣内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、クモ膜下、脊髄内、硬膜外、および胸骨内注射および注入、ならびにインビボエレクトロポレーションを含む。投与はまた、例えば、一回、複数回、および／または一つ以上の長期間にわたって実施することができる。
【0073】
用語「同種」は、後に同じ種の別の個体に導入される、ある個体に由来する任意の材料を指す、例えば同種Ｔ細胞移植または療法。
【0074】
「抗体」（Ａｂ）という用語は、限定されないが、抗原に特異的に結合する免疫グロブリンを含む。概して、抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも二つの重（Ｈ）鎖および二つの軽（Ｌ）鎖を含み得る。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、三つまたは四つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、および／またはＣＨ４を含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、一つの定常ドメイン、ＣＬを含み得る。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が散在する相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、超可変性の領域にさらに細分され得る。各ＶＨおよびＶＬは、三つのＣＤＲおよび四つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端へ以下の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。用語「抗体」は、例として、天然および非天然両方のＡｂ、モノクローナルおよびポリクローナルのＡｂ、二重特異性抗体、ミニボディ、ドメイン抗体、キメラおよびヒト化Ａｂ、ヒトまたは非ヒトＡｂ、完全合成Ａｂ（時には「抗体模倣体」とも呼ぶ）、ラクダ科動物抗体、抗体融合物（時には「抗体コンジュゲート」とも呼ぶ）、および単鎖Ａｂを含む。非ヒトＡｂは、ヒトにおけるその免疫原性を減少させるための組換え方法によってヒト化することができる。
【0075】
本明細書で使用される「免疫グロブリン」は、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、およびＩｇＭを含むがこれに限定されない、一般的に知られているアイソタイプのいずれかに由来することができる。ＩｇＧサブクラスもまた、当該技術分野で公知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むがこれに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によってコードされるＡｂクラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。
【0076】
用語「自己」は、後で再導入されるのと同じ個体に由来する任意の材料を指す。例えば、操作された自己細胞療法（ｅＡＣＴ（商標））は、ドナー、例えば患者からのリンパ球の収集を伴い、次いで、それらは、例えばＣＡＲ構築物を発現するように操作され、その後、同じドナー、例えば患者へ再び投与される。
【0077】
本明細書で使用される場合、用語「共局在化剤」は、ウイルスベクターまたは粒子、例えばレトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の、標的細胞、例えばＴ細胞などの免疫細胞との共局在を促進する試薬を指し、例えば、フィブロネクチンまたはフィブロネクチン誘導体、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬など、を含み得る。
【0078】
本明細書で使用される場合、「製造スケール形質導入量」という用語は、５００ｍＬ～最大５リットルまでの体積を指す。
【0079】
用語「感染多重度」（以下、「ＭＯＩ」）は、例えば形質導入手順などの手順の媒体における、ウイルス粒子などの感染因子と、例えば細胞などの感染標的との比を指す。一部の実施形態では、ＭＯＩは、形質導入手順の間に標的細胞の総数に加えられる機能性ウイルス粒子の数に等しくてもよい。一部の実施形態では、形質導入手順に加えられる機能性ウイルス粒子の数は、機能性ウイルス粒子の力価を確認することによって決定される。一部の実施形態では、機能性ウイルス粒子の力価は、ｑＰＣＲを使用して、当技術分野で公知の技術を使用して、安定的に形質導入された標準細胞株として細胞当たりに統合された核酸ウイルスコピーの数を決定することによって決定される。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰａｕｇｈ，Ｂ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ１１，３８９（２０２１）を参照のこと。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、レトロウイルス粒子である。一部の実施形態では、ウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。
【0080】
本明細書で使用される場合、ｐＨ制御は、例えば、細胞培養ｐＨが、ｐＨフィードバック制御または受動を有するバイオリアクターで連続的に制御される場合、例えば、細胞培養ｐＨが、組織培養インキュベーター内の緩衝細胞培養培地および％ＣＯ2を調整して所定のｐＨを達成することにより培養開始時に制御され、さらに制御されない場合、活性であり得る。
【0081】
用語「選択的」または「特異的」および関連する派生語は、本明細書では互換的に使用される。抗原結合ドメインなどの分子は、第二の標的に結合するよりも、一つの標的により強く結合する場合に、選択的、または特異的であると言われる。
【0082】
本明細書において使用される場合、ベクターコピー数（「ＶＣＮ」）という用語は、細胞当たりのベクターコピー数、例えばウイルスベクターコピーの数を指す。
【0083】
本明細書において互換的に使用される場合、用語「ウイルスベクター」および「レトロウイルスベクター」は、レトロウイルスに由来し、形質導入を介して遺伝物質を細胞へと移すために使用される任意の形態の核酸を示す。この用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡなどのウイルスベクター核酸、これらの核酸のカプセル化形態、およびウイルスベクター核酸がパッケージングされてあるウイルス粒子を包含する。
【0084】
免疫細胞
本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞は対象から取得することができる。免疫細胞は、同種または自己起源の対象から（すなわち、健康なドナーまたは患者から）取得することができる。
本明細書に記載される免疫細胞のインビトロ操作または遺伝子改変の前に、細胞は対象から取得することができる。免疫細胞は、同種または自己起源の対象から（すなわち、健康なドナーまたは患者から）取得することができる。
【0085】
免疫細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の非限定的な供給源から得られ得る。一部の実施形態では、当分野の当業者に利用可能かつ公知の任意の数のＴ細胞株を使用することができる。一部の実施形態では、細胞は、健康なドナー、癌と診断された患者、または感染症と診断された患者に由来することができる。一部の実施形態では、細胞は、異なる表現型特徴を示す細胞の混合集団の一部であってもよい。
【0086】
一部の実施形態では、免疫細胞は、Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位からの組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を含む、多数の供給源から取得することができる。ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離などの当業者に公知の任意の数の技術を使用して、対象から採取された血液から取得することができる。
【0087】
一部の実施形態では、免疫細胞は、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、ｉＰＳＣ、造血幹細胞、および間葉系幹細胞などの幹細胞に由来し得る。ｉＰＳ細胞およびその他の種類の幹細胞は、不死細胞株を培養するか、または患者から直接単離することができる。一部の実施形態では、免疫細胞は、人工多能性幹細胞から誘導されたＴ細胞である。幹細胞を単離、発現、および／または培養するための様々な方法が当技術分野で公知であり、本開示の実践に使用することができる。
【0088】
一部の実施形態では、免疫細胞は、再プログラムされたＴ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。一部の実施形態では、原料物質は、Ｔ細胞または非Ｔ細胞に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であってもよい。原料物質は、あるいは、Ｂ細胞であってもよく、または末梢血単核細胞単離物、造血前駆細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、脂肪幹細胞、もしくは任意の他の体細胞型からの任意の他の細胞であってもよい。
【0089】
採血
一部の実施形態では、操作されるＴ細胞は、ＰＢＭＣから取得される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって、対象から収集または取得することができる。例えば、一部の実施形態では、血液は、静脈穿刺、または血液および／もしくはＰＢＭＣの試料を収集する任意の他の採血方法によって収集され得る。
一部の実施形態では、操作されるＴ細胞は、ＰＢＭＣから取得される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、当技術分野で公知の任意の好適な方法によって、対象から収集または取得することができる。例えば、一部の実施形態では、血液は、静脈穿刺、または血液および／もしくはＰＢＭＣの試料を収集する任意の他の採血方法によって収集され得る。
【0090】
一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、アフェレーシスによって個体の循環血液から取得することができる。アフェレーシス産物は、典型的には、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。ある特定の実施形態では、アフェレーシス、特に白血球除去療法（ｌｅｕｋｏｐｈｅｒｅｓｉｓ）によって収集される細胞は、血漿分画を除去するために洗浄されてもよく、その後の処理のために適切な緩衝液または培地中に置かれてもよい。
【0091】
Ｔ細胞濃縮
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離を使用して、ＰＢＭＣから単離される。Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ６２－、ＣＤ９５－、ＣＤ９５＋、ＩＬ２Ｒ＋、ＩＬ２Ｒ－、ＣＣＲ７＋、ＣＣＲ７－、ＣＤＬ－、ＣＤ６２Ｌ＋、およびその組み合わせ）の特定の亜集団は、当技術分野で公知のポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５－、ＩＬ－２Ｒ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。本明細書で使用するための一つの方法は、ネガティブに選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤＩ ｌｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、本開示の方法および実施形態で使用するための対象となる細胞集団を単離することもできる。
ある特定の実施形態では、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を通した遠心分離を使用して、ＰＢＭＣから単離される。Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ４５ＲＡ－、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤＳ＋、ＣＤ６２－、ＣＤ９５－、ＣＤ９５＋、ＩＬ２Ｒ＋、ＩＬ２Ｒ－、ＣＣＲ７＋、ＣＣＲ７－、ＣＤＬ－、ＣＤ６２Ｌ＋、およびその組み合わせ）の特定の亜集団は、当技術分野で公知のポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離され得る。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５－、ＩＬ－２Ｒ－、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。一例では、Ｔ細胞の亜集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ９５＋、ＩＬ－２Ｒ＋、ＣＣＲ７－、ＣＤ６２Ｌ－である。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、ネガティブ選択細胞に特有の表面マーカーに向けられた抗体の組み合わせを用いて達成することができる。本明細書で使用するための一つの方法は、ネガティブに選択された細胞に存在する細胞表面マーカーに向けられたモノクローナル抗体のカクテルを使用する、負磁気免疫付着（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリーを介した細胞ソーティングおよび／または選択である。例えば、ネガティブ選択によってＣＤ４＋細胞について濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤＩ ｌｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、本開示の方法および実施形態で使用するための対象となる細胞集団を単離することもできる。
【0092】
ＰＢＭＣは、本明細書に記載される方法を使用して、遺伝子改変、例えば、ＣＡＲの導入に直接使用することができる。ＰＢＭＣは、ＮＫ細胞またはＮＫＴ細胞などの他の細胞傷害性リンパ球をさらに含み得ることが理解されよう。本明細書に開示されるキメラ抗原受容体のコード配列を担持する発現ベクターは、ヒトドナーＴ細胞、ＮＫ細胞、またはＮＫＴ細胞の集団に導入され得る。発現ベクターを担持する形質導入に成功したＴ細胞は、フローサイトメトリーを使用してソートされてＣＤ３陽性Ｔ細胞を単離し、次いでさらに増殖されて、抗ＣＤ３抗体およびＩＬ－２または本明細書の別に記載される当技術分野で既知の他の方法を使用した細胞活性化に加えて、これらのＣＡＲ発現Ｔ細胞の数を増加させることができる。
【0093】
ある特定の実施形態では、ＰＢＭＣを単離した後、Ｔリンパ球をさらに単離することができ、細胞傷害性およびヘルパーＴリンパ球の両方を、遺伝子改変および／または増殖の前または後のいずれかで、ナイーブ、メモリー、およびエフェクターＴ細胞亜集団にソートすることができる。
【0094】
一部の実施形態では、ＣＤ８＋細胞は、これらのタイプのＣＤ８＋細胞のそれぞれに関連する特徴的な細胞表面抗原を特定することによって、ナイーブ、幹細胞メモリー、中央メモリー、およびエフェクター細胞へとさらにソートされる。一部の実施形態では、中央メモリーＴ細胞の表現型マーカーの発現は、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、ＣＤ３、およびＣＤ１２７を含み、グランザイムＢに対して陰性である。一部の実施形態では、幹細胞メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ－、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、中央メモリーＴ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、エフェクターＴ細胞は、ＣＤ６２Ｌ、ＣＣＲ７、ＣＤ２８、およびＣＤ１２７に対して陰性であり、グランザイムＢおよびパーフォリンに対して陽性である。
【0095】
ある特定の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、さらに亜集団へとソートされる。例えば、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞は、特徴的な細胞表面抗原を有する細胞集団を特定することによって、ナイーブ、中央メモリー、およびエフェクター細胞にソートすることができる。
【0096】
細胞活性化および増殖
本開示の免疫細胞は、免疫細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかで、活性化および増殖することができる。図１は、本開示の免疫細胞の活性化、形質導入、トランスフェクト、および増殖に使用され得る例示的なプロトコルを示す。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、トランスフェクト、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。
本開示の免疫細胞は、免疫細胞の遺伝子改変の前または後のいずれかで、活性化および増殖することができる。図１は、本開示の免疫細胞の活性化、形質導入、トランスフェクト、および増殖に使用され得る例示的なプロトコルを示す。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、トランスフェクト、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。
【0097】
概して、本開示の操作された免疫細胞は、例えば、Ｔ細胞の表面でＣＤ３ＴＣＲ複合体および共刺激分子を刺激する剤と接触させて、Ｔ細胞について活性化シグナルを作製させることによって、増殖させることができる。例えば、カルシウムイオノフォアＡ２３１８７、ホルボル１２－ミリスチン酸１３－酢酸塩（ＰＭＡ）、またはフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）などの有糸分裂性レクチンなどの化学物質を使用して、Ｔ細胞の活性化シグナルを作製することができる。
【0098】
一部の実施形態では、Ｔ細胞集団は、例えば、ＯＫＴ３抗体などの抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片、または表面に固定化された抗ＣＤ２抗体と接触することによって、またはカルシウムイオンフォアと組み合わせたタンパク質キナーゼＣ活性化因子（例えば、ブリオスタチン）と接触することによって、インビトロで刺激され得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、アクセサリー分子に結合するリガンドが使用される。例えば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体（例えばＯＫＴ３抗体）、および抗ＣＤ２８抗体と接触させることができる。抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、プラスチックもしくは磁気ビーズなどのビーズ、またはプレート、または他の基材上に配置され得る。Ｔ細胞培養に適切な条件には、増殖および生存率に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５、（Ｌｏｎｚａ））が含まれ、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦｂ、およびＴＮＦまたは当業者に周知の細胞増殖のための任意のその他の添加物が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加物としては、限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地は、追加のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを有するＲＰＭＩ １６４０、ＡｌＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、およびＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含むことができ、血清を含まないか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは定義されたホルモンのセット、および／またはＴ細胞（例えば、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５）の増殖に十分な量のサイトカインが補充される。例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）などの増殖を支持するために必要な条件下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈することができる。一部の実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖することができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中で増殖され得る。
【0099】
Ｔ細胞培養に適切な条件には、増殖および生存率に必要な因子を含有し得る適切な培地（例えば、最小必須培地またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ－ｖｉｖｏ １５、（Ｌｏｎｚａ））が含まれ、血清（例えば、ウシ胎児またはヒト血清）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インスリン、ＩＦＮ－ｙ、ＩＬ－４、ＩＬ－７、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＴＧＦｂ、およびＴＮＦまたは当業者に周知の細胞増殖のための任意のその他の添加物が挙げられる。細胞の増殖のための他の添加物としては、限定されるものではないが、界面活性剤、プラスマネート、およびＮ－アセチル－システインおよび２－メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられる。培地は、追加のアミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミンを有するＲＰＭＩ １６４０、ＡＩＭ－Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、ａ－ＭＥＭ、Ｆ－１２、Ｘ－Ｖｉｖｏ１５、およびＸ－Ｖｉｖｏ２０、Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒを含むことができ、血清を含まないか、または適切な量の血清（または血漿）もしくは定義されたホルモンのセット、および／またはＴ細胞（例えば、ＩＬ－７および／またはＩＬ－１５）の増殖に十分な量のサイトカインが補充される。例えばペニシリンおよびストレプトマイシンなどの抗生物質は、実験培養物にのみ含まれ、対象に注入される細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、例えば、適切な温度（例えば、３７℃）および雰囲気（例えば、空気＋５％のＣＯ２）などの増殖を支持するために必要な条件下で維持される。様々な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特徴を呈することができる。一部の実施形態では、本開示の細胞は、組織または細胞と共培養することによって増殖することができる。細胞はまた、インビボで、例えば、対象に細胞を投与した後の対象の血液中で増殖され得る。
【0100】
Ｔ細胞を活性化および増殖させる方法は当該技術分野で公知であり、例えば、米国特許第６，９０５，８７４号、米国特許第６，８６７，０４１号、米国特許第６，７９７，５１４号、およびＷＯ２０１２／０７９０００に記載され、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。概して、このような方法は、ＩＬ－２などの適切なサイトカインを有する培養培地において、プラスチックもしくは磁気ビーズまたは他の表面に一般的に付着した抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体などの刺激分子および共刺激性分子と、ＰＢＭＣまたは単離されたＴ細胞を接触させることを含む。このビーズに結合された抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体は、「サロゲート」抗原提示細胞（ＡＰＣ）としての役目を果たす。一例はＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）システムであり、これは、ヒトＴ細胞の生理学的活性化のためのＣＤ３／ＣＤ２８アクチベーター／刺激因子システムである。他の実施形態では、米国特許第６，０４０，１７７号、米国特許第５，８２７，６４２号、およびＷＯ２０１２１２９５１４（その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される方法を使用して、Ｔ細胞は活性化および刺激されて、フィーダー細胞および適切な抗体およびサイトカインと増殖することができる。別の実施形態では、細胞は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社（カリフォルニア州オーバーン）からＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）Ｔ細胞試薬として提供される、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合する抗体および／またはその断片を含む抗ＣＤ３／２８ナノメートルスケールマトリックスで活性化され、増殖される。（例えば、カタログ番号２００－０７６－２０２ ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ－ＣＲＲ、カタログ番号１３０－０１９－０１１ ＭＡＣＳ ＧＭＰ Ｔ Ｃｅｌｌ Ｔｒａｎｓａｃｔ ｆｏｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｕｓｅを参照）。
【0101】
形質導入
本開示の方法によって産生されるＰＢＭＣおよびＴ細胞を含む、免疫細胞を遺伝子改変するための方法が本明細書に提供される。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、Ｔ細胞を、複製不能レトロウイルスベクターとエクスビボで接触させ、Ｔ細胞を遺伝子改変して外因性遺伝子産物を発現させる。一部の実施形態では、外因性遺伝子産物はＣＡＲである。
本開示の方法によって産生されるＰＢＭＣおよびＴ細胞を含む、免疫細胞を遺伝子改変するための方法が本明細書に提供される。本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、Ｔ細胞を、複製不能レトロウイルスベクターとエクスビボで接触させ、Ｔ細胞を遺伝子改変して外因性遺伝子産物を発現させる。一部の実施形態では、外因性遺伝子産物はＣＡＲである。
【0102】
一部の実施形態では、外因性遺伝子産物は、モノクローナル抗体、自殺ポリペプチド、誘導性カスパーゼ－９（米国特許出願第２０１１／０２８６９８０号）もしくはチミジンキナーゼなどの誘導性「オン」もしくは「促進剤」スイッチ、または「オフ」スイッチに特異的な（すなわち、これらによって特異的に認識される）エピトープである。例示的なｍＡｂ特異的エピトープは、国際特許公開第ＷＯ２０１６／１２０２１６号に開示されており、その全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、外因性遺伝子産物は、ＲＱＲ８などのＲエピトープである。例えば、ＷＯ２０１３１５３３９１Ａを参照されたく、それは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。リツキシマブは、ＣＡＲ免疫細胞の表面上に発現されると、Ｒエピトープに結合し、ＣＡＲ免疫細胞を溶解させることができる。一部の実施形態では、外因性遺伝子産物は、二量体形成ドメインなどの制御スイッチである。
【0103】
一部の実施形態では、形質導入は、媒体のいずれも除去することなく、活性化工程を実施するのと同じ容器で実施することができる。例えば、収集した血液試料から濃縮され単離されたＰＢＭＣなどの血球は、ガス透過性バッグ中で活性化され、その後、同じガス透過性バッグ中でレトロウイルス粒子と接触させることができる。例示的な実施形態では、血球は、レトロウイルスベクターと接触する前に、好中球を含む顆粒球から離れて分離、単離、および／または精製される。さらなる例示的な実施形態では、複製不能組換えレンチウイルス粒子であり得るレトロウイルスベクターを、活性化ＰＢＭＣを含有する同じガス透過性バッグに導入して、形質導入反応混合物を形成することができる。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、活性化工程中に形質導入反応混合物に添加される。一部の実施形態では、レトロウイルスベクターは、活性化工程の後に形質導入反応混合物に添加される。一部の実施形態では、形質導入工程の前または同時のいずれの場合でも、活性化工程は、１２、２４、３６、４８、６０、７２、８４、９６、１０８、１２０、１３２、１４４、または１５６時間以内にわたって実施される。図１は、例示的なＣＡＲ Ｔ細胞産生プロトコルにおける、可能性のある形質導入時点を示す。培地は、ｅｘ ｖｉｖｏでのＴ細胞の培養のための当該技術分野で公知のものなど、典型的には形質導入の間に存在し、塩基培地、および例えば、本明細書にさらに詳細に開示されているサイトカインを含むサプリメントを含む。例えば、上記の活性化および増殖の説明を参照されたい。
【0104】
一部の実施形態においてレトロウイルスベクターがＴ細胞に添加されたときに開始する形質導入反応は、２３～３９℃でインキュベートされてもよく、一部の例示的な実施形態では、３７℃でインキュベートされてもよい。一部の実施形態では、形質導入反応は、３７～３９℃で実行され得る。一部の実施形態では、形質導入反応は、０．５、１．０、２．０、３．０、４．０、５．０、６．０、７．０、８．０、９．０、および１０．０％ＣＯ2でインキュベートされる。形質導入反応は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２４、２５、２４、３６、４８～最長で１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、７２、または９６時間インキュベートされ得る。例示的な実施形態では、形質導入反応を、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６、１～７、１～８、１～９、１～１０、４～１２、４～１４、４～１６、４～１８、４～２０、４～２４、４～２６、４～２８、４～３０、４～３２、４～３６、４～３８、４～４０、４～４２、４～４４、４～４６、４～４８、または４～７２時間、開始ｐＨ範囲のｐＨで、インキュベートされ得る。一部の実施形態では、形質導入反応ｐＨは、例えば、培地緩衝剤（例えば、重炭酸ナトリウムおよび／またはＨＥＰＥＳ）およびインキュベーターｐＣＯ２を調整して、培養開始時に所望のｐＨ（例えば、ｐＨ７．０超）を可能にし、例えば、７．０以上などの標的ｐＨを達成することによって、受動的に制御される。一部の実施形態では、形質導入反応ｐＨは、例えば、オンラインｐＨ測定を有するバイオリアクターを使用して、かつＣＯ2ガス添加を介して培養ｐＨを連続的に（能動的に）調節することによってｐＨを維持するｐＨフィードバック制御ループを用いて、能動的に制御される。
【0105】
一部の実施形態では、Ｔ細胞は、感染多重度（ＭＯＩ）と呼ばれる、細胞に対するレトロウイルスまたはレンチウイルス粒子の異なる比率で形質導入され得る。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、０．２５、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０～５００のＭＯＩ（プラーク形成単位／細胞）を使用して形質導入される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、０．２５、０．５０、１．０、５、１０、１５、２０、２５、または３０～５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、または２００の間のＭＯＩで形質導入される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、約１～１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０のＭＯＩで形質導入される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、１～２０のＭＯＩで形質導入される。
【0106】
本明細書に開示される方法および組成物の一部の実施形態では、Ｔ細胞の２５％～９０％が外因性遺伝子産物を発現し、一部の実施形態では、形質導入Ｔ細胞の２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％～９０％が外因性遺伝子産物を発現する。
【0107】
一部の実施形態では、外因性遺伝子産物を発現する形質導入Ｔ細胞の割合は、少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％、より具体的には少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％、より具体的には少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、または８０％であり得る。一部の実施形態では、示された外因性遺伝子産物の発現レベルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０日目に、特に形質導入反応中にレトロウイルスベクターが最初に細胞と接触してから３～１０日後に達成される。
【0108】
一部の実施形態では、形質導入反応は、０．２５～２５０、０．２５～７．５、０．３７５～７．５、０．５～５、または０．７～４．０リットルの体積の形質導入培養培地で発生する。一部の実施形態では、形質導入反応は、少なくとも０．２５、０．５０、０．７５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０、５０、１００、１５０、２００、または２５０リットルの体積の形質導入培養培地で発生する。一部の実施形態では、形質導入反応は、約０．２５、約０．５０、約０．６０、または約０．７５～約０．８、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約７．５、約８．０、または約１０．０リットルの体積の形質導入培養培地で発生する。
【0109】
一部の実施形態では、細胞は、細胞にとって外因性である核酸を含むウイルスベクターによって形質導入される。一部の実施形態では、外因性核酸はＣＡＲをコードする。一部の実施形態では、ウイルスベクターは、レトロウイルス、レンチウイルス、またはＡＡＶベクターである。
【0110】
ＣＡＲを発現するために形質導入される細胞は、同種または自己起源に由来し得る。一実施形態では、Ｔ細胞のインビトロ形質導入、培養、および／または増殖は、胎児仔ウシ血清および胎児ウシ血清などの非ヒト動物由来産物の非存在下で実施される。
【0111】
一部の実施形態では、形質導入反応細胞集団が、少なくとも５、１０、２０、３０、５０、１００、１５０、または２００のＭＯＩで、開始ｐＨ範囲内のｐＨで、および７．８以下で、または７．９以下で、ＣＡＲをコードするレトロウイルスベクターとともに、１時間から２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、２４、または４８時間でインキュベートされ、およびここで、Ｔ細胞の少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、または８５％が、レトロウイルスベクターが形質導入反応中に最初に細胞と接触してから少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０日後までにＣＡＲを発現する。
【0112】
遺伝子破壊
同種ＣＡＲ Ｔ療法、またはＡｌｌｏＣＡＲｓ（商標）を製造するためのプロセスは、健康なドナーから健康な、選択された、スクリーニングされた、および試験されたＴ細胞を採取することを含む。同種Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを減少させ、同種拒絶反応を予防するための遺伝子編集である。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＣＲａまたはＴＣＲｂ）は、ＧｖＨＤを避けるためにノックアウトされる。ＣＤ５２遺伝子をノックアウトして、抗ＣＤ５２抗体治療に対してＣＡＲＴ産物を抵抗性にすることもできる。したがって抗ＣＤ５２抗体治療は、宿主免疫系をリンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）し、ＣＡＲＴ細胞が生着したままで完全な治療的効果を達成できるように使用することができる。一例では、抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブを含むことができる（ＣＨＥＭＢＬ １２０１５８７，ＣｈｅｍＩＤｐｌｕｓ：２１６５０３－５７－０；ＤＢ０００８７；またＵＳ５，８４６，５３４も参照されたい、その両方ともその全体で全ての目的に対して本明細書に組み込まれる）。次に、Ｔ細胞は、血液学的腫瘍または固形腫瘍に発現される特定の細胞表面タンパク質を認識するＣＡＲを発現するように操作される。次いで、操作されたＴ細胞は精製工程を受け、最終的にバイアル中で凍結保存される。
同種ＣＡＲ Ｔ療法、またはＡｌｌｏＣＡＲｓ（商標）を製造するためのプロセスは、健康なドナーから健康な、選択された、スクリーニングされた、および試験されたＴ細胞を採取することを含む。同種Ｔ細胞は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクを減少させ、同種拒絶反応を予防するための遺伝子編集である。一部の実施形態では、選択されたＴ細胞受容体遺伝子（例えば、ＴＣＲａまたはＴＣＲｂ）は、ＧｖＨＤを避けるためにノックアウトされる。ＣＤ５２遺伝子をノックアウトして、抗ＣＤ５２抗体治療に対してＣＡＲＴ産物を抵抗性にすることもできる。したがって抗ＣＤ５２抗体治療は、宿主免疫系をリンパ枯渇（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｅ）し、ＣＡＲＴ細胞が生着したままで完全な治療的効果を達成できるように使用することができる。一例では、抗ＣＤ５２抗体は、アレムツズマブを含むことができる（ＣＨＥＭＢＬ １２０１５８７，ＣｈｅｍＩＤｐｌｕｓ：２１６５０３－５７－０；ＤＢ０００８７；またＵＳ５，８４６，５３４も参照されたい、その両方ともその全体で全ての目的に対して本明細書に組み込まれる）。次に、Ｔ細胞は、血液学的腫瘍または固形腫瘍に発現される特定の細胞表面タンパク質を認識するＣＡＲを発現するように操作される。次いで、操作されたＴ細胞は精製工程を受け、最終的にバイアル中で凍結保存される。
【0113】
自己キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法を製造するためのプロセスは、患者自身の細胞（例えば、Ｔ細胞を含む白血球）を収集し、Ｔ細胞を遺伝子操作して、例えば癌細胞抗原などの、細胞表面に発現された標的抗原を認識するＣＡＲを発現させることを含む。次いで、操作された細胞を凍結保存し、その後、細胞が操作のために除去されたその患者に投与する。
【0114】
一部の実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性ＴＣＲａおよび／またはＣＤ５２の発現を低減または除去するように遺伝子改変される。一部の実施形態では、細胞は、遺伝子編集技術（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ１２、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ＴＡＬＥＮ（登録商標）、ＭｅｇａＴＡＬ、メガヌクレアーゼ）を使用して遺伝子改変され、内因性タンパク質（例えば、ＴＣＲａおよび／またはＣＤ５２）の発現を低減または排除する。一部の実施形態では、方法は、エンドヌクレアーゼを細胞内に導入して、ＤＮＡ切断による標的遺伝子の不活化を可能にすることにより、一つ以上の遺伝子を破壊または不活化することを含む。一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、例えば、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ｍｅｇａＴＡＬヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥヌクレアーゼ／ＴＡＬＥＮ）、またはＣＲＩＳＰＲ（例えば、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２、またはＣＡＳ１４）エンドヌクレアーゼであってもよい。
【0115】
一部の実施形態では、免疫細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ））、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスを使用して、核酸ベクターによってトランスフェクトされる。一部の実施形態では、単離された免疫細胞は、内因性ＴＣＲａおよび／またはＣＤ５２の発現を低減または除去するように遺伝子改変される。
【0116】
増殖と枯渇
本明細書に開示される方法の例示的な実施形態では、形質導入Ｔ細胞は、上述の活性化および増殖の記述に一般的に記載されるように、採取前に増殖させることができる。一部の実施形態では、形質導入細胞は、標的内因性遺伝子をノックアウトするためにさらにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、形質導入細胞は、例えば、ＴＣＲαβを発現する細胞など、望ましくない細胞型の枯渇されたものである。図１に示されるように、一部の実施形態では、形質導入細胞は、枯渇前または枯渇後に増殖させることができる。
本明細書に開示される方法の例示的な実施形態では、形質導入Ｔ細胞は、上述の活性化および増殖の記述に一般的に記載されるように、採取前に増殖させることができる。一部の実施形態では、形質導入細胞は、標的内因性遺伝子をノックアウトするためにさらにトランスフェクトされる。一部の実施形態では、形質導入細胞は、例えば、ＴＣＲαβを発現する細胞など、望ましくない細胞型の枯渇されたものである。図１に示されるように、一部の実施形態では、形質導入細胞は、枯渇前または枯渇後に増殖させることができる。
【0117】
フローサイトメトリーを使用して、細胞集団内のＴ細胞受容体陽性細胞などの特定の細胞型を枯渇させることができる。概して、フローサイトメトリーは、主に光学的手段によって細胞の構成要素または構造特徴を定量化するための方法である。構造特徴を定量化することによって異なる細胞型を区別することができるため、フローサイトメトリーおよび細胞ソーティングを使用して、混合物中の異なる表現型の細胞をカウントおよびソートすることができる。
【0118】
フローサイトメトリー解析には、二つの主要な工程、１）一つ以上の標識マーカーで選択された細胞型を標識すること、および２）集団内の細胞の総数に対して標識細胞の数を決定すること、を伴う。一部の実施形態では、細胞型を標識する方法は、特定の細胞型、例えばＴ細胞受容体、によって発現されるマーカーに標識された抗体を結合することを含む。抗体は、蛍光化合物で直接標識されるか、または例えば、第一の抗体を認識する蛍光標識された第二の抗体で間接的に標識され得る。
【0119】
一部の実施形態では、ＣＡＲを発現するＴ細胞をソートするために使用される方法は、磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）である。磁気活性化細胞ソーティング（ＭＡＣＳ）は、超常磁性ナノ粒子およびカラムを使用して、その表面抗原（ＣＤ分子）に応じて様々な細胞集団を分離するための方法である。ＭＡＣＳを使用して、純細胞集団を取得することができる。
【0120】
単一細胞懸濁液中の細胞は、マイクロビーズで磁気標識され得る。試料は、強磁性球体からなるカラムに適用され、細胞にやさしいコーティングで覆われ、細胞の迅速かつ穏やかな分離を可能にする。標識されていない細胞は通過し、一方で磁気標識された細胞はカラム内に保持される。フロースルーは、非標識細胞画分として収集され得る。洗浄工程の後、カラムは分離器から除去され、磁気標識された細胞はカラムから溶出される。
【0121】
Ｔ細胞などの特定の細胞集団の精製のための詳細なプロトコルは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｂａｓｕ Ｓ ｅｔ ａｌ．（２０１０）（Ｂａｓｕ Ｓ，Ｃａｍｐｂｅｌｌ ＨＭ，Ｄｉｔｔｅｌ ＢＮ，Ｒａｙ Ａ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｅｌｌ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｃｅｌｌ ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．（４１）：１５４６）に見出すことができる。
【0122】
製剤および凍結保存
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、まずその培養培地から細胞を採取し、次いで治療有効量での投与に適した培地および容器システム（「医薬的に許容可能な」担体）で細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。適切な注入培地は、任意の等張性培地製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ社）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ社）であるが、水中の５％デキストロースまたはリンゲル乳酸も利用することができる。注入培地は、ヒト血清アルブミンで補充され得る。
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、まずその培養培地から細胞を採取し、次いで治療有効量での投与に適した培地および容器システム（「医薬的に許容可能な」担体）で細胞を洗浄および濃縮することによって製剤化される。適切な注入培地は、任意の等張性培地製剤、典型的には生理食塩水、Ｎｏｒｍｏｓｏｌ（商標）Ｒ（Ａｂｂｏｔｔ社）またはＰｌａｓｍａ－Ｌｙｔｅ（商標）Ａ（Ｂａｘｔｅｒ社）であるが、水中の５％デキストロースまたはリンゲル乳酸も利用することができる。注入培地は、ヒト血清アルブミンで補充され得る。
【0123】
別の実施形態では、操作された免疫細胞、例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、採取、洗浄、および濃縮され、次いで、適切な凍結保存媒体、例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳｌ０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）中で所定の細胞濃度で凍結保存される。標準的な手順が、ヒト対象における使用のための保管および／または調製のために、操作された免疫細胞、例えばＣＡＲを発現するＴ細胞、の凍結保存に使用される。必要な場合、凍結保存された操作された免疫細胞を解凍し、成長および増殖させて、より多くのそのような細胞を産生することができる。
【0124】
キメラ抗原受容体
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原（例えば、癌細胞上の標的抗原）を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合すると、ＣＡＲは免疫細胞を活性化して、その抗原を有する細胞（例えば、癌細胞）を攻撃および破壊することができる。ＣＡＲはまた、共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み、それらの効力を増加させることができる。例えば、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７，Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３ （２０１６）；米国特許第７，７４１，４６５号、および第６，３１９，４９４号を参照されたい。
本明細書で使用される場合、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、標的抗原（例えば、癌細胞上の標的抗原）を特異的に認識するタンパク質である。標的抗原に結合すると、ＣＡＲは免疫細胞を活性化して、その抗原を有する細胞（例えば、癌細胞）を攻撃および破壊することができる。ＣＡＲはまた、共刺激ドメインまたはシグナル伝達ドメインを組み込み、それらの効力を増加させることができる。例えば、Ｆｉｎｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１６１：２７９１－２７９７，Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ １１９：６９６－７０６（２０１２）；Ｋａｌａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．３：９５（２０１１）；Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６５：７２５－３３（２０１１）、およびＧｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．５６：５９－８３ （２０１６）；米国特許第７，７４１，４６５号、および第６，３１９，４９４号を参照されたい。
【0125】
本明細書に記載されるキメラ抗原受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含み、細胞外ドメインは、抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原特異的ＣＡＲは、５’から３’の以下の要素を含む：シグナル配列、抗原結合ドメイン、ヒンジおよび膜貫通領域、ならびに一つ以上の連続シグナル伝達ドメイン。
【0126】
一部の実施形態では、ＣＡＲは、安全スイッチおよび／またはモノクローナル抗体特異的エピトープをさらに含む。例えば、ＷＯ２０１６／１２０２１６を参照されたい。
【0127】
抗原結合ドメイン
上述のように、本明細書に記載のＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、特定の標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインのポリペプチド構造は、抗体に基づく。抗原結合ドメインは、免疫学的に機能的な断片である抗体結合領域を含むが、これに限定されない。抗原結合ドメインの「免疫学的に機能的な断片」（または「断片」）という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、標的抗原に特異的に結合することが可能な抗体の部分（その部分がどのように取得または合成されるかによらない）を含む抗原結合ドメインの種である。こうした断片は、標的抗原に結合し、所与のエピトープに結合するために、無傷の抗体を含む他の抗原結合ドメインと競合しうるという点で、生物学的に活性である。免疫学的に機能的な断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）、一つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、二重特異性抗体（同じ鎖上の二つのドメイン間での対形成を可能にするにはあまりに短い、短いペプチドリンカーを介して結合された、軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、ドメイン抗体、二価抗原結合ドメイン（二つの抗原結合部位を含む）、多特異性抗原結合ドメイン、および単鎖抗体を含むが、これらに限定されない。これらの断片は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類、またはウサギを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類に由来し得る。
上述のように、本明細書に記載のＣＡＲは、抗原結合ドメインを含む。本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」は、特定の標的抗原に結合する任意のポリペプチドを意味する。ある特定の実施形態では、抗原結合ドメインのポリペプチド構造は、抗体に基づく。抗原結合ドメインは、免疫学的に機能的な断片である抗体結合領域を含むが、これに限定されない。抗原結合ドメインの「免疫学的に機能的な断片」（または「断片」）という用語は、全長鎖に存在するアミノ酸の少なくとも一部を欠くが、標的抗原に特異的に結合することが可能な抗体の部分（その部分がどのように取得または合成されるかによらない）を含む抗原結合ドメインの種である。こうした断片は、標的抗原に結合し、所与のエピトープに結合するために、無傷の抗体を含む他の抗原結合ドメインと競合しうるという点で、生物学的に活性である。免疫学的に機能的な断片は、ｓｃＦｖ断片、Ｆａｂ断片（Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２など）、一つ以上の相補性決定領域（「ＣＤＲ」）、二重特異性抗体（同じ鎖上の二つのドメイン間での対形成を可能にするにはあまりに短い、短いペプチドリンカーを介して結合された、軽鎖可変ドメインと同じポリペプチド上の重鎖可変ドメイン）、ドメイン抗体、二価抗原結合ドメイン（二つの抗原結合部位を含む）、多特異性抗原結合ドメイン、および単鎖抗体を含むが、これらに限定されない。これらの断片は、ヒト、マウス、ラット、ラクダ類、またはウサギを含むがこれらに限定されない、任意の哺乳類に由来し得る。
【0128】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、抗体の全長の軽鎖または重鎖中に存在する一つ以上の相補性結合領域（ＣＤＲ）を含み、一部の実施形態では、単一の重鎖および／または軽鎖またはその一部分を含む。これらの断片は、組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよく、または無傷の抗体を含む抗原結合ドメインの酵素的切断または化学的切断によって産生されてもよい。
【0129】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、その断片の抗体であり、その相補性決定領域（ＣＤＲ）のうちの一つ以上を含む。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、軽鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３、ならびに重鎖ＣＤＲであるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。
【0130】
フレームワーク、ＣＤＲ、および可変ドメインのそれぞれへのアミノ酸の割り当ては、典型的には、Ｋａｂａｔナンバリング（例えば、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．ｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．，ＮＩＨ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ ９１－３２４２，Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｍｄ．１９９１を参照）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリング（例えば、Ｃｈｏｔｈｉａ ＆ Ｌｅｓｋ，（１９８７），Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ １９６：９０１－９１７；Ａｌ－Ｌａｚｉｋａｎｉ ｅｔ ａｌ．，（１９９７）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７３：９２７－９４８；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，（１９９２） Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２２７：７９９－８１７；Ｔｒａｍｏｎｔａｎｏ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２１５（１）：１７５－８２；および米国特許第７，７０９，２２６号を参照）、接触ナンバリング、またはＡｂＭスキーム（Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ ｐｒｏｇｒａｍ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ）のナンバリングスキームに従う。
【0131】
抗原結合ドメインのバリアント（例えば、ＣＤＲ、ＶＨおよび／またはＶＬのバリアント）も、本開示の範囲内であり、例えば、可変軽鎖および／または可変重鎖であって、各々が抗原結合ドメイン配列のアミノ酸配列と少なくとも７０～８０％、８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、９７～９９％、または９９％を超える同一性を有することも、本開示の範囲内である。一部の例では、こうした分子は、少なくとも一つの重鎖および一つの軽鎖を含むが、他の例では、バリアント形態は、二つの可変軽鎖および二つの可変重鎖（またはそれらのサブ部分）を含む。当業者は、周知の技術を使用して、本明細書に記載する抗原結合ドメインの好適なバリアントを決定することができる。ある特定のいくつかの実施形態において、当業者は、活性に重要とは考えられない領域を標的化することによって、活性を破壊することなく変化させることができる、分子の好適な領域を特定することができる。
【0132】
一部の実施形態では、抗原結合ドメインはｓｃＦｖである。一部の実施形態では、抗原選択性ＣＡＲは、リーダーまたはシグナルペプチドを含む。当業者によって理解されるように、抗原結合ドメインは、非タンパク質成分を含み得る。
【0133】
本開示の方法および組成物におけるＣＡＲでの使用に適した抗原結合ドメインは、様々な抗原結合特異性を有し得る。一部の実施形態では、抗原結合ドメインは、標的細胞によって発現される（合成される）抗原上に存在するエピトープに特異的である。一例では、標的細胞は、癌細胞関連抗原である。癌細胞関連抗原は、例えば、乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ－ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば、小細胞肺癌細胞）、黒色腫細胞、慢性リンパ性白血病細胞、急性リンパ性白血病細胞、神経芽腫細胞、神経膠腫、神経膠芽腫、髄芽腫、結腸直腸癌細胞など、に関連する抗原であり得る。癌細胞関連抗原はまた、非癌細胞によっても発現され得る。
【0134】
キメラ結合抗原が結合することができる抗原の非限定的な例としては、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ－１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソテリン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮増殖因子受容体２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量黒色腫関連抗原（ＨＭＷ－ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ－Ａ１、ＩＬ－１３Ｒ－ａ２、ＧＤ２、Ａｘ１、Ｒｏｒ２、ＢＣＭＡが挙げられる。Ｃｌａｕｄｉｎおよびそのアイソタイプなど。
【0135】
ヒンジドメイン
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン（またはヒンジ領域）を含み得る。用語は、ＣＡＲ中の膜貫通ドメインを、ＣＡＲ中の細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドを含む。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインに対してより柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。
本開示のＣＡＲの細胞外ドメインは、「ヒンジ」ドメイン（またはヒンジ領域）を含み得る。用語は、ＣＡＲ中の膜貫通ドメインを、ＣＡＲ中の細胞外抗原結合ドメインに連結するように機能する任意のポリペプチドを含む。特に、ヒンジドメインを使用して、細胞外抗原結合ドメインに対してより柔軟性およびアクセス可能性を提供することができる。
【0136】
ヒンジドメインは、最大３００個のアミノ酸を含むことができ、一部の実施形態では、１０～１００個のアミノ酸、または一部の実施形態では、２５～５０個のアミノ酸を含むことができる。ヒンジドメインは、天然起源分子の全てまたは一部に、例えば、ＣＤ８、ＣＤ４、ＣＤ２８、４－ｌＢＢ、またはＩｇＧの細胞外領域の全てまたは一部に（特に、ＩｇＧのヒンジ領域；ヒンジ領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭなどの免疫グロブリンファミリーのメンバーのいくつかもしくは全て、またはその断片を含有し得ることを理解されたい）、または抗体重鎖定常領域の全てまたは一部に、由来し得る。
【0137】
あるいは、ヒンジドメインは、天然起源の配列に対応する合成配列であってもよく、または完全合成配列であってもよい。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８ａ鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）の一部である。別の特定の実施形態では、前述のヒンジドメインおよび膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８ａ鎖の一部を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＡＲのヒンジドメインは、ＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃｙＲＩＩＩａ分子のサブ配列、特にＣＤ８ａ、ＣＤ２８、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ４、ＰＤ－１、またはＦｃｙＲＩＩＩａ分子のいずれかのヒンジ領域を含む。一部の実施形態では、ヒンジドメインは、ヒトＣＤ８ａヒンジ、ヒトＩｇＧｌヒンジ、ヒトＩｇＧ４ヒンジ、ヒトＰＤ－１ヒンジ、またはヒトＦｃｙＲＩＩＩａヒンジを含む。一部の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲは、ｓｃＦｖ、ＣＤ８ａヒトヒンジおよび膜貫通ドメインを含む。
【0138】
膜貫通ドメイン
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを用いて設計される。これは同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合され得る。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または改変されて、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化することができる。一部の実施形態では、短いリンカーは、ＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインのいずれかまたは一部の間に結合を形成することができる。本明細書に開示されるＣＡＲの好適な膜貫通ドメインは、（ａ）表面に、例えば限定されないが、リンパ球細胞、例えばＴヘルパー（Ｔｈ）細胞などのＣＤ４＋細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞などのＣＤ８＋細胞、Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、などの免疫細胞を発現する能力、および／または（ｂ）標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を向けるために、細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。
本開示のＣＡＲは、ＣＡＲの細胞外ドメインに融合された膜貫通ドメインを用いて設計される。これは同様に、ＣＡＲの細胞内ドメインに融合され得る。いくつかの例では、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または改変されて、かかるドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避し、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化することができる。一部の実施形態では、短いリンカーは、ＣＡＲの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインのいずれかまたは一部の間に結合を形成することができる。本明細書に開示されるＣＡＲの好適な膜貫通ドメインは、（ａ）表面に、例えば限定されないが、リンパ球細胞、例えばＴヘルパー（Ｔｈ）細胞などのＣＤ４＋細胞、細胞傷害性Ｔ（Ｔｃ）細胞などのＣＤ８＋細胞、Ｔ調節性（Ｔｒｅｇ）細胞、またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、などの免疫細胞を発現する能力、および／または（ｂ）標的細胞に対して免疫細胞の細胞応答を向けるために、細胞外抗原結合ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインと相互作用する能力を有する。
【0139】
膜貫通ドメインは、天然源または合成源のいずれかに由来し得る。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。本開示における特定の使用の膜貫通領域は、ＣＤ２８、ＣＤ８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－Ｉ（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激体（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－Ｉ（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、ｌｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｅガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤＩ ｌｅ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭｌ、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤｌ００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来し得る（含み得るまたは対応し得る）。
【0140】
非限定的な例として、膜貫通領域は、Ｔ細胞受容体、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ－２受容体、ｐ５５（ａ鎖）、ｐ７５（Ｐ鎖）、またはｙ鎖、Ｆｅ受容体のサブユニット鎖、特にＦｅｙ受容体ＩＩＩ、またはＣＤタンパク質に由来してもよく、またはその一部分であってもよい。あるいは、膜貫通ドメインは合成であってもよく、主にロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含んでもよい。一部の実施形態では、前述の膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８ａ鎖（例えば、ＮＰ＿００１１３９３４５．１）に由来する。
【0141】
細胞内ドメイン
本開示のＣＡＲの細胞内（細胞質）ドメインは、ＣＡＲ、例えばシグナルＩ／活性化、および／またはシグナル２／共刺激、を含む免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも一つの活性化を提供することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性を指すことができる。一部の実施形態では、ＣＡＲで使用するための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定されないが、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するように協働して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列であってもよい。
本開示のＣＡＲの細胞内（細胞質）ドメインは、ＣＡＲ、例えばシグナルＩ／活性化、および／またはシグナル２／共刺激、を含む免疫細胞の正常なエフェクター機能の少なくとも一つの活性化を提供することができる。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、サイトカインの分泌を含む細胞溶解活性またはヘルパー活性を指すことができる。一部の実施形態では、ＣＡＲで使用するための活性化細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、限定されないが、抗原受容体の係合後にシグナル伝達を開始するように協働して作用するＴ細胞受容体および共受容体の細胞質配列、ならびにこれらの配列の任意の誘導体またはバリアント、ならびに同じ機能を有する任意の合成配列であってもよい。
【0142】
適切な（例えば活性化）細胞内ドメインは、限定されないが、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＯＸ－４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死－Ｉ（ＰＤ－１）、誘導性Ｔ細胞共刺激体（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原－Ｉ（ＬＦＡ－１、ＣＤ１－ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、ｌｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｅガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０ （ＫＬＲＦｌ）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤＩ ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤＩ ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤＩ ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤＩ ｌｅ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭｌ、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤｌ００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ （ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、またはそれらの任意の組み合わせに由来する（または対応する）シグナル伝達ドメインを含むことを理解されたい。
【0143】
細胞内ドメインは、上述の活性化ドメインに加えて、共刺激シグナル伝達ドメイン（本明細書では、共刺激分子として交換可能に示される）を組み込み、それらの効力を増加させることができる。共刺激ドメインは、本明細書に記載される活性化分子によって提供される一次シグナルに加えてシグナルを提供することができる。
【0144】
本開示の範囲内の適切な共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ３（アルファ、ベータ、デルタ、イプシロン、ガンマ、ゼータ）、ＣＤ４、ＣＤＳ、ＣＤ７、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ ４５、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＰＤ－１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原－Ｉ（ＬＦＡ－１ （ＣＤＩ ｌａ／ＣＤ１８）、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ（腫瘍壊死因子スーパーファミリーメンバー１４；ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、ｌｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ－１０、Ｆｅガンマ受容体、ＭＨＣクラスＩ分子、ＴＮＦＲ、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ－１、Ｂ７－Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ－２Ｒベータ、ＩＬ－２Ｒガンマ、ＩＬ－７Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡｌ、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ－６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤｌ－ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤｌ－ｌａ、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤｌ－ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤｌ－ｌｃ、ＩＴＧＢｌ、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ－１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭｌ（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭｌ、ＣＲＴ ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬｌ、ＣＤｌ００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ－Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦｌ、ＣＤ１５０、ＩＰＯ－３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ－７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３リガンド、またはその断片もしくは組み合わせに由来し得る（または対応し得る）ことを理解されたい。上記に列挙されていない追加の共刺激性分子またはその断片は、本開示の範囲内にあることが理解される。
【0145】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、４－１ＢＢ／ＣＤ１３７ドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、またはＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。４－１ＢＢ／ＣＤ１３７の完全な天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００１５５２．２に記載される。完全な天然４－１ＢＢ／ＣＤ１３７核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ ００１５６１．５に記載される。
【0146】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、ＣＤ２８ドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、またはＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。ＣＤ２８の完全な天然アミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００６１３０．１に記載される。完全な天然ＣＤ２８核酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００６１３９．ｌに記載される。
【0147】
一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内／細胞質ドメインは、ＣＤ３ゼータドメインをそれ自体で含むように設計されてもよく、またはＣＡＲの文脈で有用な任意の他の所望の細胞内ドメインと組み合わせられてもよい。一部の実施形態では、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３１シグナル伝達ドメインを含有してもよい。例えば、ＣＡＲの細胞内ドメインは、ＣＤ３ゼータ鎖部分および共刺激シグナル伝達分子の一部分を含み得る。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分内の細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結することができる。
【0148】
核酸および発現ベクターの調製
本明細書では、ＣＡＲをコードする核酸、およびＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを作製する方法が提供される。
本明細書では、ＣＡＲをコードする核酸、およびＣＡＲをコードする核酸を含むベクターを作製する方法が提供される。
【0149】
本開示によるポリヌクレオチド、およびベクターの作製には、様々な公知の技術を利用することができる。例えば、本開示の構築物および操作された免疫細胞を作製するための特定の方法は、ＷＯ２０１５／１２００９６の開示に記載されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【0150】
ＣＡＲをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクター中に存在し得る。ＣＡＲが二つの別個のポリペプチドを含む場合、二つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じベクターまたは別個のベクターでクローニングすることができる。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製開始点、およびベクターの複製および／または維持を提供する他の特徴を含み得る。適切な発現ベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクターなどが含まれる。
【0151】
ポリヌクレオチドのクローニングのために、発現ベクターを宿主細胞（単離された宿主細胞）に導入して、ベクター自体の複製を可能にし、それによってその中に含有されるポリヌクレオチドのコピーを増幅することができる。クローニングベクターは、配列構成要素を含有することができ、限定されるものではないが、概して複製開始点、プロモーター配列、転写開始配列、エンハンサー配列、および選択可能なマーカーを含む。これらの要素は、当業者によって適宜選択され得る。例えば、複製開始点は、宿主細胞中のベクターの自律的複製を促進するために選択され得る。
【0152】
他の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗原結合ドメインのいずれか一つをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。一部の実施形態では、本開示は、ＣＡＲをコードする単離ポリヌクレオチドに関する。また、ポリヌクレオチドを含むベクター、およびポリヌクレオチドを作製する方法も本明細書において提供される。
【0153】
ある特定の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される発現ベクターを含有する単離された宿主細胞を提供する。ベクターを含有する宿主細胞は、ベクター中に含有されるポリヌクレオチドの発現またはクローニングに有用であり得る。適切な宿主細胞には、限定されるものではないが、原核細胞、真菌細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞、さらに具体的にはヒト細胞などのより高次の真核細胞が含まれ得る。
【0154】
ベクターは、限定されるものではないが、ＤＥＡＥ－デキストラン媒介送達、リン酸カルシウム沈殿法、カチオン性脂質媒介送達、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃、受容体媒介遺伝子送達、ポリリジン（ｐｏｌｙｙｓｉｎｅ）、ヒストン、キトサン、およびペプチドによって媒介される送達を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して宿主細胞に導入され得る。対象となるベクターの発現のための細胞のウイルストランスフェクションおよび形質転換のための標準的な方法は、当該技術分野で周知である。さらなる実施形態では、異なる発現ベクターの混合物は、免疫エフェクター細胞のドナー集団を遺伝子改変する際に使用することができ、各ベクターは、本明細書に開示される異なるＣＡＲをコードする。結果として生じる形質導入免疫エフェクター細胞は、操作された細胞の混合集団を形成し、操作された細胞の割合は、複数の異なるＣＡＲを発現する。
【0155】
レトロウイルス粒子の調製
本明細書に開示される例示的な実施形態では、形質導入方法は、一つ以上の核酸を含む複製不能組換えレトロウイルス粒子を用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞を形質導入して、操作されたＴ細胞などの、形質導入された操作された免疫細胞を生成する工程を含み得る。一部の実施形態では、一つ以上の核酸は、後に形質導入されたＴ細胞、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で発現される、一つ以上のタンパク質をコードし得る。本明細書に提供される方法においてＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入するために使用されるレトロウイルス粒子は、当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。本明細書に開示されるように、レトロウイルス粒子は、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：４５５－４６０）。一部の実施形態では、複製不能組換えレトロウイルス粒子は、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、レンチウイルス属、またはスプマウイルス属に由来し得る。本明細書に開示される方法での使用に適した多くのレトロウイルスがある。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ （“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出すことができる。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は、当技術分野で見出すことができる。例として、ＨＩＶに関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（すなわち、ゲノム登録番号ＡＦ０３３８１９）から見出すことができる。
本明細書に開示される例示的な実施形態では、形質導入方法は、一つ以上の核酸を含む複製不能組換えレトロウイルス粒子を用いて、Ｔ細胞などの免疫細胞を形質導入して、操作されたＴ細胞などの、形質導入された操作された免疫細胞を生成する工程を含み得る。一部の実施形態では、一つ以上の核酸は、後に形質導入されたＴ細胞、例えばキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）で発現される、一つ以上のタンパク質をコードし得る。本明細書に提供される方法においてＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入するために使用されるレトロウイルス粒子は、当技術分野で公知の方法に従って作製することができる。本明細書に開示されるように、レトロウイルス粒子は、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：４５５－４６０）。一部の実施形態では、複製不能組換えレトロウイルス粒子は、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、レンチウイルス属、またはスプマウイルス属に由来し得る。本明細書に開示される方法での使用に適した多くのレトロウイルスがある。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎ ｅｔ ａｌ （“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”１９９７ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ Ｅｄｓ：Ｊ Ｍ Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ Ｍ Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ Ｅ Ｖａｒｍｕｓ ｐｐ ７５８－７６３）に見出すことができる。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造についての詳細は、当技術分野で見出すことができる。例として、ＨＩＶに関する詳細は、ＮＣＢＩ Ｇｅｎｂａｎｋ（すなわち、ゲノム登録番号ＡＦ０３３８１９）から見出すことができる。
【0156】
例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子は、レンチウイルス属からの組換えレトロウイルスに由来し得、複製不能組換えレンチウイルス粒子であり得る。一部の実施形態では、組換えレトロウイルスは、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに由来し得る。さらなる例示的な実施形態では、組換えレトロウイルスは、レンチウイルス属のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来し得る。
【0157】
一部の実施形態では、複製不能組換えレトロウイルス粒子は、複製不能組換えレトロウイルス粒子製造に特異的な培地中の培養物中で増殖させることができる。複製不能組換えレトロウイルス粒子を増殖させるための任意の適切な増殖培地および／またはサプリメントを、本明細書に記載の方法に従って、複製不能組換えレトロウイルス粒子接種材料に使用することができる。一部の態様によれば、レトロウイルス粒子は、その後、形質導入工程（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｓｔｅｅｐ）の間に培地に添加され得る。
【0158】
複製不能組換えレトロウイルス粒子は、当技術分野で公知の方法に従って哺乳類細胞株を使用して産生することができる。適切な哺乳類細胞には、初代細胞および不死化細胞株が含まれる。適切な哺乳類細胞株は、ヒト細胞株を含み得る。適切な哺乳類細胞株には、限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）番号ＣＣＬ－２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ－１６５８）、Ｈｕｈ－７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ１Ｏ）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ－７細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５１）、ヒト胎児性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ－７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ－６０、ＮＫ細胞株（例えば、ＮＫＬ、ＮＫ９２、およびＹＴＳ）などが含まれる。一部の例では、細胞は不死化細胞株ではなく、代わりに、個体またはエクスビボ細胞から得られた細胞（例えば、初代細胞）である。例えば、一部の実施形態では、細胞は、個体から得られた免疫細胞である。別の例として、細胞は、個体から得られた幹細胞または前駆細胞である。
【0159】
操作された免疫細胞
本開示の操作された免疫細胞は、同種または自己であり得る。
本開示の操作された免疫細胞は、同種または自己であり得る。
【0160】
一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、Ｔ細胞（例えば、炎症性Ｔリンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球、調節性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）、ヘルパーＴリンパ球、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ））、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、ＴＣＲ発現細胞、樹状細胞、キラー樹状細胞、マスト細胞、ナチュラルキラー細胞、またはＢ細胞である。一部の実施形態では、細胞は、ＣＤ４＋Ｔ－リンパ球およびＣＤ８＋Ｔ－リンパ球のうちの一つまたは両方からなる群に由来し得る。一部の例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はＴ細胞である。一部の例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はガンマデルタＴ細胞である。一部の例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はマクロファージである。一部の例示的な実施形態では、操作された免疫細胞はナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。
【0161】
上述のように、一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、例えば限定されないが幹細胞に由来し得る。幹細胞は、成体幹細胞、非ヒト胚性幹細胞、より詳細には、非ヒト幹細胞、臍帯血幹細胞、前駆細胞、骨髄幹細胞、人工多能性幹細胞、全能性幹細胞、または造血幹細胞であり得る。一部の実施形態では、細胞は、末梢血から取得または調製される。一部の実施形態では、細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から取得または調製される。一部の実施形態では、細胞は、骨髄から取得または調製される。一部の実施形態では、細胞は、臍帯血から取得または調製される。一部の実施形態では、細胞はヒト細胞である。
【0162】
一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載される方法により産生されるＣＡＲを発現するＴリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載される方法により産生されるＣＡＲを発現する細胞傷害性Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載される方法により産生されるＣＡＲを発現する調節性Ｔリンパ球である。一部の実施形態では、免疫細胞は、本明細書に記載される方法により産生されるＣＡＲを発現するヘルパーＴリンパ球である。一部の実施形態では、本開示の操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは異なる細胞外抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは同じ細胞外抗原結合ドメインを含む。
【0163】
また、上述の方法のいずれかに従って、形質転換された免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）から得られた細胞株も本明細書に提供される。また、本明細書では、免疫抑制治療に耐性の改変細胞も提供される。一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは細胞外抗原結合ドメインを含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、ＣＡＲの集団を含み、各ＣＡＲは同じ細胞外抗原結合ドメインを含む。
【0164】
一部の実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、一つ以上の破壊された遺伝子または不活化された遺伝子を含み得る。一部の実施形態では、本開示による操作された免疫細胞は、ＣＤ５２、ＤＬＬ３、ＧＲ、ＰＤ－１、ＣＴＬＡ－４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＢＴＬＡ、ＢＹ５５、ＴＩＧＩＴ、Ｂ７Ｈ５、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣｌ０、２Ｂ４、ＨＬＡ、ＴＣＲａ、およびＴＣＲｂからなる群から選択される一つの破壊された遺伝子または不活化された遺伝子を含み、ならびに／またはＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴａ導入遺伝子を発現する。一部の実施形態では、単離細胞は、多鎖ＣＡＲを含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、本開示による単離細胞は、以下からなる群から選択される二つの破壊された遺伝子または不活化された遺伝子を含む：ＣＤ５２およびＧＲ、ＣＤ５２およびＴＣＲａ、ＣＤＲ５２およびＴＣＲｂ、ＧＲおよびＴＣＲａ、ＧＲおよびＴＣＲｂ、ＴＣＲａおよびＴＣＲｂ、ＰＤ－１およびＴＣＲａ、ＰＤ－１およびＴＣＲｂ、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲａ、ＣＴＬＡ－４およびＴＣＲｂ、ＬＡＧ３およびＴＣＲａ、ＬＡＧ３およびＴＣＲｂ、ＴＩＭ３およびＴＣＲａ、Ｔｉｍ３およびＴＣＲｂ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲａ、ＢＴＬＡおよびＴＣＲｂ、ＢＹ５５およびＴＣＲａ、ＢＹ５５およびＴＣＲｂ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲａ、ＴＩＧＩＴおよびＴＣＲｂ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲａ、Ｂ７Ｈ５およびＴＣＲｂ、およびＴＣＲｂ、ＳＩＧＬＥＣ ｌ０およびＴＣＲａ、ＳＩＧＬＥＣ ｌ０およびＴＣＲｂ、２Ｂ４およびＴＣＲａ、２Ｂ４およびＴＣＲｂ、ならびに／または本開示による単離細胞は、ＣＡＲ、多鎖ＣＡＲ、および／もしくはｐＴａ導入遺伝子を発現する。
【0165】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、ＴＣＲａ遺伝子および／またはＴＣＲＰ遺伝子を破壊または不活化することによって、本開示による細胞内で機能的ではない状態になる。一部の実施形態では、個体に由来する改変細胞を取得する方法が提供され、ここにおいて、細胞は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）シグナル伝達経路とは独立して増殖することができる。本方法によって取得可能である改変細胞は、ＭＨＣシグナル伝達経路から独立して増殖することができ、本開示の範囲に包含される。
【0166】
一部の実施形態では、免疫細胞は、一つ以上の化学療法剤に耐性であるように操作される。化学療法剤は、例えば、プリンヌクレオチド類似体（ＰＮＡ）であってもよく、したがって、養子免疫療法と化学療法とを組み合わせた癌治療に適した免疫細胞を作る。例示的なＰＮＡとしては、例えば、クロファラビン、フルダラビン、シクロホスファミド、およびシタラビンが単独でまたは組み合わせて含まれる。ＰＮＡは、デオキシシチジンキナーゼ（ｄＣＫ）によってモノリン酸ＰＮＡ、ジリン酸ＰＮＡ、およびトリリン酸ＰＮＡに代謝される。それらのトリリン酸形態は、ＤＮＡ合成のためにＡＴＰと競合し、アポトーシス促進剤として作用し、トリヌクレオチド生成に関与するリボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＮＲ）の強力な阻害剤である。
【0167】
一部の実施形態では、本開示の単離細胞または細胞株は、ｐＴａまたはその機能的バリアントを含み得る。一部の実施形態では、単離細胞または細胞株は、ＴＣＲａ遺伝子を破壊または不活化することによってさらに遺伝子改変され得る。
【0168】
上述のように、本開示はまた、ＣＡＲポリヌクレオチドを含む操作された免疫細胞も提供する。一部の実施形態では、ＣＡＲは、プラスミドベクターを介して導入遺伝子として免疫細胞内に導入され得る。一部の実施形態では、プラスミドベクターはまた、例えば、ベクターを受容した細胞の識別および／または選択を提供する選択マーカーを含有してもよい。
【0169】
一部の実施形態では、細胞は、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃（ｂｉｏｌｉｓｔｉｃｓ）（例えば、遺伝子銃（Ｇｅｎｅ Ｇｕｎ））、脂質トランスフェクション、ポリマートランスフェクション、ナノ粒子、またはポリプレックスからなる群から選択される方法を使用して、本開示の核酸ベクターによってトランスフェクトされる。一部の実施形態では、細胞は、本開示のウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクター、特にレンチウイルスベクターで形質導入される。
【0170】
治療方法
癌を含む疾患または障害を治療するための方法が提供される。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＴ細胞介在性免疫反応の生成に関し、本開示の操作された免疫細胞の有効量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞介在性免疫反応は、標的細胞に対して向けられる。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の少なくとも一つの単離された抗原結合ドメインの有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、少なくとも一つの免疫細胞の有効量を投与することを含み、免疫細胞は、本明細書に記載の少なくとも一つのキメラ抗原受容体、および／または単離された抗原結合ドメインを含む。
癌を含む疾患または障害を治療するための方法が提供される。一部の実施形態では、本開示は、対象におけるＴ細胞介在性免疫反応の生成に関し、本開示の操作された免疫細胞の有効量を対象に投与することを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞介在性免疫反応は、標的細胞に対して向けられる。一部の実施形態では、操作された免疫細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む。一部の実施形態では、標的細胞は腫瘍細胞である。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、本明細書に記載の少なくとも一つの単離された抗原結合ドメインの有効量を投与することを含む。いくつかの態様では、本開示は、悪性腫瘍を治療または予防するための方法を含み、前述の方法は、それを必要とする対象に、少なくとも一つの免疫細胞の有効量を投与することを含み、免疫細胞は、本明細書に記載の少なくとも一つのキメラ抗原受容体、および／または単離された抗原結合ドメインを含む。
【0171】
一部の実施形態では、対象は、固形腫瘍、またはリンパ腫もしくは白血病などの血液悪性腫瘍を有する。一部の実施形態では、癌は、対象の骨髄中に存在する。一部の実施形態では、操作された細胞は、自己免疫細胞、例えば、自己Ｔ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、同種免疫細胞、例えば、同種Ｔ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、異種免疫細胞、例えば、異種Ｔ細胞である。一部の実施形態では、操作された細胞は、エクスビボでトランスフェクトおよび／または形質導入される。本明細書で使用される場合、用語「インビトロ細胞」は、エクスビボで培養される任意の細胞を指す。治療剤、例えば、操作されたＣＡＲＴ細胞の「治療有効量」、「有効用量」、「有効量」または「治療有効用量」は、単独で、または別の治療剤と組み合わせて使用された場合、疾患の発症に対して対象を保護する、または疾患の症状の重症度の減少、疾患無症状期間の頻度および持続期間の増加、または疾患（ｄｉｓｅａｓｅ ａｆｆｌｉｃｔｉｏｎ）による機能障害もしくは障害の予防によって証明される疾患退縮を促進する、任意の量である。疾患退縮を促進する治療剤の能力は、例えば、臨床試験中のヒト対象において、ヒトにおける有効性を予測する動物モデル系において、またはインビトロアッセイにおける薬剤の活性をアッセイすることによって、熟練した施術者（例えば、医師または臨床医）に公知の様々な方法を用いて評価することができる。
【0172】
用語「患者」および「対象」は互換的に使用され、ヒト対象、ならびに正式に診断された障害を有するもの、正式に認識された障害を有していないもの、医学的な注意を引くもの、障害を発症するリスクを有するものなどを含む。
【0173】
用語「治療する」および「治療」は、治療的治療、予防的治療、および対象が障害または他のリスク因子を発症するリスクを減少させる開示を含む。治療は、障害の完全な治癒を必要とせず、症状または根底にあるリスク因子を減少させる実施形態を包含する。用語「予防する」は、事象の可能性のＩ ００％除去を必要としない。むしろ、化合物または方法の存在下で事象の発生の可能性が低減されたことを示す。
【0174】
組成物中の細胞の所望の治療総量は、少なくとも２個の細胞（例えば、少なくとも一個のＣＤ８＋Ｔ細胞および少なくとも一個のＣＤ４＋Ｔ細胞、または二個のＣＤ８＋Ｔ細胞、または二個のＣＤ４＋Ｔ細胞）であるか、またはより典型的には１０2個を超える細胞であり、および最大１０6個、その個数を含んで最大１０8個または１０9個の細胞であり、および１０10または１０12個以上の細胞であり得る。細胞数は、組成物が意図される望ましい使用、およびその中に含まれる細胞のタイプに依存する。所望の細胞の密度は、典型的には、１０6細胞／ｍｌ超であり、概して、１０7細胞／ｍｌ超、概して、１０8細胞／ｍｌ超である。臨床的に意義のある数の免疫細胞を、１０5、１０6、１０7、１０8、１０9、１０10、１０11、または１０12細胞に累積的に等しいか、またはそれを超える複数の注入に分配することができる。本開示のいくつかの態様では、特に、注入された全ての細胞は特定の標的抗原に再び向けられるため、１０6／キログラム（患者あたり１０6～１０11）の範囲のより少ない細胞数を投与することができる。ＣＡＲ治療は、これらの範囲内の用量で複数回投与することができる。
【0175】
細胞は、療法を受けている患者に対し、自己、同種、または異種であり得る。
【0176】
一部の実施形態では、ＣＡＲ Ｔ細胞の治療有効量は約１×１０５細胞／ｋｇ、約２×１０5細胞／ｋｇ、約３×１０5細胞／ｋｇ、約４×１０５細胞／ｋｇ、約５ Ｘ１０５細胞／ｋｇ、約６×１０５細胞／ｋｇ、約７×１０５細胞／ｋｇ、約８×１０５細胞／ｋｇ、約９×１０５細胞／ｋｇ、２×１０６細胞／ｋｇ、約３×１０６細胞／ｋｇ、約４×１０６細胞／ｋｇ、約５×１０６細胞／ｋｇ、約６×１０６細胞／ｋｇ、約７×１０６細胞／ｋｇ、約８×１０６細胞／ｋｇ、約９×１０６細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約２×１０７細胞／ｋｇ、約３×１０７細胞／ｋｇ、約４×１０７細胞／ｋｇ、約５×１０７細胞／ｋｇ、約６×１０７細胞／ｋｇ、約７×１０７細胞／ｋｇ、約８×１０７細胞／ｋｇ、または約９×１０７細胞／ｋｇである。
【0177】
一部の実施形態では、ＣＡＲ＋／ＣＡＲ－Ｔ＋細胞についての標的用量は、約１×１０6～約１×１０10細胞／ｋｇ、例えば、約１×１０6細胞／ｋｇ、約１×１０７細胞／ｋｇ、約１×１０８細胞／ｋｇ、約１×１０9細胞／ｋｇ、または約１×１０10細胞／ｋｇの範囲である。この範囲を超える用量および下回る用量は、特定の対象に適切であり得、必要に応じて、適切な用量レベルを医療従事者によって決定することができる。さらに、本開示に従って細胞の複数回用量を提供することができる。
【0178】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載の少なくとも一つの抗原結合ドメインと、薬学的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、追加の活性薬剤をさらに含む。
【0179】
本開示のＣＡＲ発現細胞集団は、単独で、または希釈剤と組み合わせた、および／またはＩＬ－２もしくは他のサイトカインもしくは細胞集団などの他の構成要素と組み合わせた医薬組成物として、のいずれかで投与することができる。本開示の医薬組成物は、本明細書に記載のＴ細胞などのＣＡＲ発現細胞集団を、一つ以上の薬学的または生理学的に許容可能な担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含むことができる。こうした組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水などの緩衝剤、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストランなどの炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含み得る。本開示の組成物は、静脈内投与のために製剤化されることが好ましい。
【0180】
医薬組成物（溶液、懸濁液など）は、以下のうちの一つ以上を含み得る：注射用水などの滅菌希釈剤、生理食塩水、好ましくは、生理食塩水、リンゲル液、等張性塩化ナトリウム、溶媒または懸濁媒として役立ち得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなどの固定油、 ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の溶媒、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤と、アスコルビン酸または亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート剤と、酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤、塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張性の調整のための薬剤。非経口調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラス製もしくはプラスチック製の複数回用量バイアルに封入され得る。治療的開示のため、注射用医薬組成物は、滅菌であることが好ましい。
【0181】
方法は、本明細書に提供される操作された細胞を投与する前に、一つ以上の化学療法剤を患者に投与することをさらに含んでもよい。ある特定の実施形態では、化学療法剤は、リンパ球枯渇（前処理）化学療法である。例えばシクロホスファミドの特定の有益な用量（２００ｍｇ／ｍ２／日～２０００ｍｇ／ｍ２／日、約１００ｍｇ／ｍ２／日～約２０００ｍｇ／ｍ２／日；例えば、約１００ｍｇ／ｍ２／日、約２００ｍｇ／ｍ２／日、約３００ｍｇ／ｍ２／日、約４００ｍｇ／ｍ２／日、約５００ｍｇ／ｍ２／日、約６００ｍｇ／ｍ２／日、約７００ｍｇ／ｍ２／日、約８００ｍｇ／ｍ２／日、約９００ｍｇ／ｍ２／日、約１０００ｍｇ／ｍ２／日、約１５００ｍｇ／ｍ２／日または約２０００ｍｇ／ｍ２／日）および特定用量のフルダラビン（２０ｍｇ／ｍ２／日～９００ｍｇ／ｍ２／日、約１０ｍｇ／ｍ２／日～約９００ｍｇ／ｍ２／日；例えば、約１０ｍｇ／ｍ２／日、約２０ｍｇ／ｍ２／日、約３０ｍｇ／ｍ２／日、約４０ｍｇ／ｍ２／日、約４０ｍｇ／ｍ２／日、約５０ｍｇ／ｍ２／日、約６０ｍｇ／ｍ２／日、約７０ｍｇ／ｍ２／日、約８０ｍｇ／ｍ２／日、約９０２０ｍｇ／ｍ２／日、約１００ｍｇ／ｍ２／日、約５００ｍｇ／ｍ２／日または約９００ｍｇ／ｍ２／日）を患者に投与することを含むＴ細胞療法を必要とする患者を条件づける方法である。例示的な投与レジメンは、患者への治療有効量の操作されたＴ細胞の投与前に、三日間、約３０ｍｇ／ｍ２／日のフルダラビンの投与と組み合わせて、またその前または後に、約３００ｍｇ／ｍ２／日のシクロホスファミドを患者に毎日投与することを含む、患者を治療することを伴う。
【0182】
一部の実施形態では、特に、本明細書に提供される操作された細胞が、ＣＤ５２の表面発現を排除または最小化するように遺伝子編集されていた場合には、リンパ球枯渇は、例えばアレムツズマブなどの抗ＣＤ５２抗体の投与をさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ５２抗体は、約１～２０ｍｇ／日ＩＶ、例えば、約１３ｍｇ／日ＩＶの用量で、１、２、３、４、５、６、７日間、またはそれ以上投与される。
【0183】
抗体は、リンパ球枯渇レジメンの他の要素（例えば、シクロホスファミドおよび／またはフルダラビン）の投与と組み合わせて、その投与の前、または後に投与され得る。
【0184】
他の実施形態では、抗原結合ドメイン、形質導入（または他の方法で操作された）細胞、および化学療法剤は、それぞれ、対象の疾患または病態を治療するために有効な量で投与される。
【0185】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＣＡＲ発現免疫エフェクター細胞を含む組成物は、任意の数の化学療法剤と併せて投与することができる。化学療法剤の例としては、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（商標））などのアルキル化剤；アルキルスルホン酸塩、例えばブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファン；アジリジン、例えばベンゾドパ、カルボコン、メツレドーパ、およびウレドパ；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスファミド、トリエチレンチオホスホラミド（ｔｒｉｅｔｈｙｌｅｎｅｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｏｒａｍｉｄｅ）およびトリメチルオロメラミンレジュメ（ｔｒｉｍｅｔｈｙｌｏｌｏｍｅｌａｍｉｎｅ ｒｅｓｕｍｅ）を含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；窒素マスタード、例えばクロラムブシル、クロマファジン、コロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロルエタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、ホテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；抗生物質、例えば、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリチアマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、チュベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；代謝拮抗薬、例えばメトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）；葉酸類似体、例えばデノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキセート；例えばフルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；ピリミジン類似体、例えばアンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン、５－ＦＵ；アンドロゲン、例えばカルステロン、ドロモスタノロンプロピオン酸塩、エピチオスタンオール、メピチオスタン、テストステロン；抗副腎剤（ａｎｔｉ－ａｄｒｅｎａｌ）、例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジコン；エルホルミチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン、ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸、２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”－トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナ類似体、例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ－１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦ Ｓ２０００；ジフルオロメチルオミチン（ＤＭＦＯ）；Ｔａｒｇｒｅｔｉｎ（商標）（ベキサロテン）、Ｐａｎｒｅｔｉｎ（商標）、（アリトレチノイン）などのレチノイン酸誘導体；ＯＮＴ ＡＫ（商標）（デニロイキンジフチトックス）；エスペラマイシン；カペシタビン；ならびに前述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体が挙げられる。この定義には、例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹｌ １７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（フェアストン）などの抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびに前述のいずれかの薬学的に許容可能な塩、酸または誘導体も含まれる。化学療法剤の組み合わせはまた、適切な場合に投与され、ＣＨＯＰ、すなわちシクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、ドキソルビシン（ヒドロキシドキソルビシン）、ビンクリスチン（オンコビン（登録商標））、およびプレドニゾンを含むが、これらに限定されない。
【0186】
一部の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後、同時に、または一週間以内に投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、操作された細胞、ポリペプチド、または核酸の投与後、約１～７日、約１～約４週間、または約１週間～約１か月、約１週間～約２か月、約１週間～約３か月、約１週間～約６か月、約１週間～約９か月、または約１週間～約１２か月で投与される。他の実施形態では、化学療法剤は、細胞、ポリペプチド、または核酸を投与する少なくとも１か月前に投与される。一部の実施形態では、方法は、二つ以上の化学療法剤を投与することをさらに含む。
【0187】
様々な追加の治療剤を、本明細書に記載される組成物と併せて使用することができる。例えば、潜在的に有用な追加の治療剤としては、ニボルマブ（オプジーボ（登録商標））、ペムブロリズマブ（キイトルーダ（登録商標））、ペムブロリズマブ、ピジリズマブ、およびアテゾリズマブなどのＰＤ－１阻害剤が挙げられる。本開示と組み合わせた使用に適した追加の治療剤には、限定されるものではないが、イブルチニブ（イムブルビカ（登録商標））、オファツムマブ（アーゼラ（登録商標）、リツキシマブ（リツキサン（登録商標））、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（登録商標））、トラスツズマブエムタンシン（カドサイラ（登録商標）、イマチニブ（グリベック（登録商標））、セツキシマブ（アービタックス（登録商標）、パニツムマブ）（ベクティビックス（登録商標））、カツマキソマブ、イブリツモマブ、オファツムマブ、トシツモマブ、ブレンツキシマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、エルロチニブ、ゲフィチニブ、バンデタニブ、アファチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、アキシチニブ、マシチニブ、パゾパニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、トセラニブ、レスタウルチニブ、アキシチニブ、セジラニブ、レンバチニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、レゴラフェニブ、セマキサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、トセラニブ、バンデタニブ、エントレクチニブ、カボザンチニブ、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ポナチニブ、ラドチニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、ルキソリチニブ、パクリチニブ、コビメチニブ、セルメチニブ、トラメチニブ、ビニメチニブ、アレクチニブ、セリチニブ、クリゾチニブ、アフリベルセプト、アジポチド、デニロイキンジフチトックス、エベロリムスおよびテムシロリムスなどのｍＴＯＲ阻害剤、ソニデギブおよびビスモデギブなどのヘッジホッグ阻害剤、ＣＤＫ阻害剤（パルボシクリブ）などのＣＤＫ阻害剤が挙げられる。
【0188】
一部の実施形態では、ＣＡＲ発現免疫細胞を含む組成物は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防、または低減するための治療レジメンで投与することができる。サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）または神経毒性を予防するための治療レジメンには、レンジルマブ、トシリズマブ、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、アナキンラ、ｉＮＯＳ阻害剤（例えば、Ｌ－ＮＩＬまたは１４００Ｗ）が含まれ得る。追加の実施形態では、ＣＡＲ含有免疫細胞を含む組成物は、抗炎症剤で投与することができる。抗炎症剤または薬剤には、以下に限定されないが、ステロイドおよびグルココルチコイド（ベタメタゾン、ブデソニド、デキサメタゾン、酢酸ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、ヒドロコルチゾン、エチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、プレドニゾン、トリアムシノロン）、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、メトトレキサート、スルファサラジン、レフルノミド、抗ＴＮＦ薬、シクロホスファミドおよびミコフェノール酸を含む非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤＳ）が挙げられる。例示的なＮＳＡＩＤとしては、イブプロフェン、ナプロキセン、ナプロキセンナトリウム、Ｃｏｘ－２阻害剤、およびシアル酸が挙げられる。例示的な鎮痛剤としては、アセトアミノフェン、オキシコドン、プロポルキシフェン塩酸塩のトラマドールが挙げられる。例示的なグルココルチコイドとしては、コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、またはプレドニゾンが挙げられる。例示的な生物学的応答調節剤としては、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ４、ＣＤＳなど）に対する分子、サイトカイン阻害剤、例えばＴＮＦ拮抗薬（例えば、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標））、アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標））、およびインフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）））、ケモカイン阻害剤、および接着分子阻害剤が挙げられる。生物学的応答調節剤は、モノクローナル抗体ならびに分子の組換え型を含む。例示的なＤＭＡＲＤには、アザチオプリン、シクロホスファミド、シクロスポリン、メトトレキサート、ペニシラミン、レフルノミド、スルファサラジン、ヒドロキシクロロキン、金（経口（オーラノフィン）および筋肉内）およびミノサイクリンが挙げられる。
【0189】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、サイトカインと併せて投与される。サイトカインの例としては、リンホカイン、モノカイン、および従来のポリペプチドホルモンが挙げられる。サイトカインには、ヒト成長ホルモンなどの成長ホルモンが含まれ、Ｎ－メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）などの糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）；肝増殖因子（ＨＧＦ）；線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；ミューラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ－ベータなどの神経成長因子（ＮＧＦ）；血小板成長因子；ＴＧＦ－アルファおよびＴＧＦ－ベータなどの形質転換成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子－Ｉおよび－ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン－アルファ、ベータ、および－ガンマなどのインターフェロン；マクロファージ－ＣＳＦ（Ｍ－ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球－マクロファージ－ＣＳＦ（ＧＭ－ＣＳＦ）；および顆粒球－ＣＳＦ（Ｇ－ＣＳＦ）；インターロイキン（ＩＬ）、例えばＩＬ－１、ＩＬ－ｌアルファ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－８、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１１、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１；ＴＮＦ－アルファまたはＴＮＦ－ベータなどの腫瘍壊死因子；ならびにＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子を含む。本明細書で使用される場合、サイトカインという用語は、天然源または組換え細胞培養由来のタンパク質、ならびに天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物を含む。
【0190】
キットおよび製造物品
本開示は、本明細書に提供される方法を使用してＣＡＲを発現する免疫細胞のいずれか一つを含むキット、およびその医薬組成物を提供する。キットの実施形態では、操作されたＣＡＲ細胞は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）などの適切な培地で凍結される。
本開示は、本明細書に提供される方法を使用してＣＡＲを発現する免疫細胞のいずれか一つを含むキット、およびその医薬組成物を提供する。キットの実施形態では、操作されたＣＡＲ細胞は、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ１０、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ２、またはＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）ＣＳ５（ＢｉｏＬｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）などの適切な培地で凍結される。
【0191】
一部の例示的な実施形態では、本開示のキットは、リンパ枯渇レジメント（ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ ｒｅｇｉｍｅｎｔ）およびＣＡＲ－Ｔレジメンの構成要素として対象に投与するための、同種ＣＡＲ発現Ｔ細胞およびＣＤ５２抗体を含む。本開示はまた、本明細書に記載される治療用組成物またはキットのうちのいずれか一つを含む製造物品を提供する。製造物品の例としては、バイアル（例えば、ＣＡＲを発現する免疫細胞を含む密封バイアル）が挙げられる。
【実施例】
【0192】
実施例１：免疫細胞形質導入効率に対するプロセス因子の効果
Ａ．生存ＣＡＲ １＋免疫細胞の割合に対するＭＯＩ、増殖培地ｐＨ、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度および培養容器の効果
Ａ．生存ＣＡＲ １＋免疫細胞の割合に対するＭＯＩ、増殖培地ｐＨ、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度および培養容器の効果
【0193】
ＰＢＭＣ収集
ドナー血液を収集し、アフェレーシスによりその成分部分に分離した。次いで、ＰＢＭＣを、ＧＥ Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－ｐｌａｑｕｅ（密度１．０７７ｇ／ｍＬ）工程勾配で濃縮し、５％のＤＭＳＯを含む緩衝液中で凍結保存した。
ドナー血液を収集し、アフェレーシスによりその成分部分に分離した。次いで、ＰＢＭＣを、ＧＥ Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）－ｐｌａｑｕｅ（密度１．０７７ｇ／ｍＬ）工程勾配で濃縮し、５％のＤＭＳＯを含む緩衝液中で凍結保存した。
【0194】
活性化
０日目に、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）で単離され凍結されたヒトＰＢＭＣを解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と１０％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）とを含む洗浄培地で一回洗浄した。次いで、細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）を用いてＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含む培養培地（本明細書では増殖培地とも呼ぶ）中で培養し、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で一晩インキュベートした。１日目に、細胞を洗浄培地で洗浄し、計数し、１ｍＬ当たり１．５×１０6の細胞密度で培養培地に再懸濁し、１：１０の体積希釈でＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ポリマーナノマトリックス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）と混合した。組換えヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を、最終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるまで加えた。次いで、Ｔ細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で４日目までインキュベートした。
０日目に、Ｆｉｃｏｌｌ（登録商標）で単離され凍結されたヒトＰＢＭＣを解凍し、Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）と１０％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）とを含む洗浄培地で一回洗浄した。次いで、細胞を、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）を用いてＸ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を含む培養培地（本明細書では増殖培地とも呼ぶ）中で培養し、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で一晩インキュベートした。１日目に、細胞を洗浄培地で洗浄し、計数し、１ｍＬ当たり１．５×１０6の細胞密度で培養培地に再懸濁し、１：１０の体積希釈でＴ Ｃｅｌｌ ＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ポリマーナノマトリックス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）と混合した。組換えヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を、最終濃度１００Ｕ／ｍＬとなるまで加えた。次いで、Ｔ細胞を、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で４日目までインキュベートした。
【0195】
形質導入と増殖
４日目に、細胞を洗浄し、１ｍＬ当たり１×１０6の細胞密度で、組換えヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を含有する培養培地に再懸濁した。細胞を、ＣＡＲ１（１５６０ヌクレオチド）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶＶ ＃１８３１Ｐ、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて、以下の表１に記載される試験条件下で形質導入し、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で６日目までインキュベートした。６日目に、形質導入細胞を培養し、細胞集団を増殖させた。
*培養バッグはMACS細胞分化バッグ-100(MiltenyiBiotec社)である
**プレートは6ウェル培養プレート(Corning，Inc.)である
***第二列%LVV(v/v)から計算
４日目に、細胞を洗浄し、１ｍＬ当たり１×１０6の細胞密度で、組換えヒトＩＬ－２（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を含有する培養培地に再懸濁した。細胞を、ＣＡＲ１（１５６０ヌクレオチド）をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶＶ ＃１８３１Ｐ、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）を用いて、以下の表１に記載される試験条件下で形質導入し、標準的な加湿組織培養インキュベーター中で、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で６日目までインキュベートした。６日目に、形質導入細胞を培養し、細胞集団を増殖させた。
【表1】
*培養バッグはMACS細胞分化バッグ-100(MiltenyiBiotec社)である
**プレートは6ウェル培養プレート(Corning，Inc.)である
***第二列%LVV(v/v)から計算
【0196】
形質導入効率評価
８日目および１１日目に、形質導入効率および細胞生存率を、フローサイトメトリーによって確認した。形質導入前、形質導入中、または形質導入後に、ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランを添加しなかった。各試験群について、細胞試料を洗浄し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「ＤＰＢＳ」）中に再懸濁した。各々が異なる抗体パネルを含む二つの抗体／染色カクテルを、市販の抗体／染色の組み合わせを使用して調製した。
８日目および１１日目に、形質導入効率および細胞生存率を、フローサイトメトリーによって確認した。形質導入前、形質導入中、または形質導入後に、ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランを添加しなかった。各試験群について、細胞試料を洗浄し、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「ＤＰＢＳ」）中に再懸濁した。各々が異なる抗体パネルを含む二つの抗体／染色カクテルを、市販の抗体／染色の組み合わせを使用して調製した。
【0197】
各試験群試料から約１×１０6の細胞を、抗体／染色カクテルのうちの一つのアリコートと共にＦＡＣＳチューブに添加した。次いで、ＦＡＣＳチューブを、２５℃で暗所で２５＋５分間インキュベートした。試料を二回洗浄し、１％パラホルムアルデヒド（「ＰＦＡ」）中に再懸濁し、次いでＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ニュージャージー州フランクリンレイクス）により処理し、得られたデータをＦｌｏｗＪｏソフトウェアバージョン１０（ＦｌｏｗＪｏ社、オレゴン州アシュランド）を用いて分析した。
【0198】
以下の表２は、試験の８日目および１１日目の各試験群について、生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合を示す。
【表2】
【0199】
製造プロセス因子、％レンチウイルスベクター（ｖ／ｖ）、増殖培地ｐＨ、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬濃度、および培養容器の形質導入効率への影響を図２に示す。主効果および相互作用の有意性は、ＪＭＰ（登録商標）１４ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ケーリー）を使用して、確率値（ｐ値）閾値が＜０．０５に設定された分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定された。細胞を７．０以上のｐＨで形質導入すると、より低いｐＨで細胞を形質導入（これは結果として、より低いパーセンテージの生存ＣＡＲ＋細胞をもたらした（図２Ｂを参照））するよりも、より大きなパーセンテージの生存ＣＡＲ＋細胞がもたらされた（図２Ａを参照）。主効果および２方向相互作用のＰ値を、図２Ｃに示す。
【0200】
図２が示すように、驚くべきことに、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬（タカラバイオ、米国）濃度は、ＣＡＲ形質導入効率に有意な効果を持たない。むしろ、ｐＨが、ＭＯＩで試験した全ての因子の形質導入効率に最も有意な効果を有し、形質導入容器もまた、形質導入効率に寄与する。
Ｂ．生存ＣＡＲ－２＋免疫細胞のパーセンテージに対する増殖培地ｐＨおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の影響
ＰＢＭＣを収集し、活性化し、ＣＡＲ－２（約１５００ヌクレオチド）を、一部要因実験（ｐａｒｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＪＭＰＯ １４ソフトウェア、Ｄ－最適設計を使用）において上記の実施例１Ａに記載される方法によって形質導入して、生存ＣＡＲ－２＋Ｔ細胞の割合に対するｐＨおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の影響を評価した。
Ｂ．生存ＣＡＲ－２＋免疫細胞のパーセンテージに対する増殖培地ｐＨおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の影響
ＰＢＭＣを収集し、活性化し、ＣＡＲ－２（約１５００ヌクレオチド）を、一部要因実験（ｐａｒｔｉａｌ ｆａｃｔｏｒｉａｌ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ）（ＪＭＰＯ １４ソフトウェア、Ｄ－最適設計を使用）において上記の実施例１Ａに記載される方法によって形質導入して、生存ＣＡＲ－２＋Ｔ細胞の割合に対するｐＨおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度の影響を評価した。
【0201】
形質導入効率評価
１５日目に、上述の実施例１Ａに記載されるように、フローサイトメトリーによって形質導入効率および細胞生存率を確認した。主効果および相互作用の有意性は、ＪＭＰ（登録商標）１４ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ケーリー）を使用して、確率値（ｐ値）閾値が＜０．０５に設定された分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定され、モデル化された。生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合の結果を、ＪＭＰ（登録商標）１４ ＡＮＯＶＡソフトウェアを使用して４８のＭＯＩでシミュレーションし、表３に示されるＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度および培地ｐＨレベルで、生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合に対するＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）および培地ｐＨの主効果を評価した。結果は、表３の右端の列に示されている。
１５日目に、上述の実施例１Ａに記載されるように、フローサイトメトリーによって形質導入効率および細胞生存率を確認した。主効果および相互作用の有意性は、ＪＭＰ（登録商標）１４ソフトウェア（ＳＡＳ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．、ノースカロライナ州ケーリー）を使用して、確率値（ｐ値）閾値が＜０．０５に設定された分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって決定され、モデル化された。生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合の結果を、ＪＭＰ（登録商標）１４ ＡＮＯＶＡソフトウェアを使用して４８のＭＯＩでシミュレーションし、表３に示されるＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）濃度および培地ｐＨレベルで、生存ＣＡＲ＋Ｔ細胞の割合に対するＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）および培地ｐＨの主効果を評価した。結果は、表３の右端の列に示されている。
【表3】
【0202】
表３は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を含む場合と含まない場合の両方において、Ｔ細胞を７．３のｐＨで形質導入すると、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬を含む場合と含まない場合の両方において、より低いｐＨ６．７で細胞を形質導入するよりも、生存ＣＡＲ＋細胞のパーセンテージが大きかったことを示す。驚くべきことに、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）試薬濃度は、ＣＡＲ形質導入効率に最も大きな効果を持たない。形質導入中の培地ｐＨが、形質導入効率に最も大きな影響を与える。
【0203】
実施例２：ベクター組込み形質導入の経時変化
０日目に、ＰＢＭＣ（上記実施例１に記載されるように収集）を、２Ｌガス透過性バッグ（Ｘｕｒｉ（商標） Ｃｅｌｌ ｂａｇ （商標）、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）中で解凍した。Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中の１．５×１０6細胞／ｍＬの濃度で、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）、ＩＬ－２、およびグルタミンをさらに含む細胞は、１：１０の体積希釈でＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ポリマーナノマトリックス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を添加することによって活性化された。細胞を、３７°Ｃでインウェーブアクションバイオリアクター中で培養した。
０日目に、ＰＢＭＣ（上記実施例１に記載されるように収集）を、２Ｌガス透過性バッグ（Ｘｕｒｉ（商標） Ｃｅｌｌ ｂａｇ （商標）、ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）中で解凍した。Ｘ－ＶＩＶＯ（商標）１５培養培地（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中の１．５×１０6細胞／ｍＬの濃度で、５％ヒト血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社、カリフォルニア州サクラメント）、ＩＬ－２、およびグルタミンをさらに含む細胞は、１：１０の体積希釈でＴｒａｎｓＡｃｔ（商標）ポリマーナノマトリックス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ社）を添加することによって活性化された。細胞を、３７°Ｃでインウェーブアクションバイオリアクター中で培養した。
【0204】
２日目に、ＣＡＲ－２（１５００ヌクレオチド）をコードする１％（ｖ／ｖ）レンチウイルスベクター（ＬＶＶ ＃１８３１Ｐ、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）を、７．２ ＋０．１のｐＨで細胞培養物に添加した。得られた形質導入反応混合物を、３７°Ｃで８時間培養した。形質導入中にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）は使用されなかった。また、形質導入前、形質導入中、または形質導入後に、ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランを添加しなかった。
【0205】
細胞へのレンチウイルスベクターの導入から１、２、４、６、および８時間後に、培養培地から細胞試料を採取した。各細胞試料を、１×１０6細胞／ｍＬの細胞密度で培養培地中において、遠心分離し、洗浄し、再懸濁し、Ｇ－Ｒｅｘ（登録商標）細胞培養系（Ｗｉｌｓｏｎ Ｗｏｌｆ社、ミネソタ州セントポール）中で、製造業者の指示に従って、４０ｍＬの体積で１４日間培養した。
【0206】
ＣＡＲ＋細胞の割合を、上記実施例１に記載されるように、フローサイトメトリーによって７日目および１４日目に決定した。
【0207】
結果を図３に示す。図に示すように、ＣＡＲ＋細胞の割合は、７日目と比較すると、１４日目の各形質導入時点でより高い。さらに、１４日目に、ＣＡＲ＋細胞の割合の増加は、４時間の形質導入後に減速し始め、６～８時間の形質導入で横ばいになり始める。
【0208】
実施例３：製造スケール免疫細胞形質導入
ＣＡＲ－１を発現するＴ細胞について、１４の製造スケールの稼働を実施した。稼働７～１４を、以下に記載されるように実施した。形質導入工程を７．２未満のｐＨで実施したという一つを例外として、稼働１～６を以下に示すように実施した。
ＣＡＲ－１を発現するＴ細胞について、１４の製造スケールの稼働を実施した。稼働７～１４を、以下に記載されるように実施した。形質導入工程を７．２未満のｐＨで実施したという一つを例外として、稼働１～６を以下に示すように実施した。
【0209】
ＰＢＭＣ収集、活性化および形質導入
ＰＢＭＣ（上記実施例１に記載されるように収集）を、ヒト血清を含む培地中で、ガス透過性バッグ中で解凍し、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で一晩インキュベートした。
ＰＢＭＣ（上記実施例１に記載されるように収集）を、ヒト血清を含む培地中で、ガス透過性バッグ中で解凍し、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で一晩インキュベートした。
【0210】
次いで、ＰＢＭＣを洗浄し、５％ヒト血清、ＩＬ－２、グルタミン、ＣＤ３およびＣＤ２８刺激試薬を含む培地中に再懸濁し、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2でインキュベートした。
【0211】
活性化細胞を培地で洗浄して、活性化試薬を除去し、培養培地に再懸濁した。培養培地は、５％ヒト血清、ＩＬ－２、およびグルタミンから成った。細胞を培養培地中に導入する前に、ＣＯ2を培養培地から除去し、ｐＨ７．２以上を達成した。細胞を、１ｍＬ当たり１×１０6細胞の細胞密度で、ガス透過性バッグ内の製造スケールボリューム（製造スケール形質導入量）の培養培地に再懸濁した。ＣＡＲ－１をコードするレンチウイルスベクター（ＬＶＶ ＃１８３１Ｐ、Ｌｅｎｔｉｇｅｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、メリーランド州ゲイザースバーグ）を、１０％ＬＶＶ（Ｖ／Ｖ）で細胞懸濁液に添加した。得られた形質導入反応混合物を、３７°Ｃおよび５％のＣＯ2で４８時間培養した。形質導入中にＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）は使用されなかった。また、形質導入に、ポリブレン、硫酸プロタミン、ＤＥＡＥ－デキストランを添加しなかった。
【0212】
増殖
細胞をさらにエレクトロポレーションして標的遺伝子を破壊し、その後、１リットルの総体積の培養培地中で灌流ウェーブバイオリアクター内で増殖させた。Ｔ細胞の濃縮を１８日目に実施し、破壊された遺伝子発現を有するＴ細胞について選択した。
細胞をさらにエレクトロポレーションして標的遺伝子を破壊し、その後、１リットルの総体積の培養培地中で灌流ウェーブバイオリアクター内で増殖させた。Ｔ細胞の濃縮を１８日目に実施し、破壊された遺伝子発現を有するＴ細胞について選択した。
【0213】
ＣＡＲ発現および細胞生存率
１９日目に、上記の実施例１Ａに記載されるように、フローサイトメトリーによってＣＡＲ発現および細胞生存率を評価し、以下の表４に記載される。
*標準偏差
１９日目に、上記の実施例１Ａに記載されるように、フローサイトメトリーによってＣＡＲ発現および細胞生存率を評価し、以下の表４に記載される。
【表4】
*標準偏差
【0214】
表４は、７．１超のｐＨで形質導入された細胞が、７．１未満のｐＨで形質導入された細胞と比較して、より高いパーセンテージの生存ＣＡＲ発現細胞を有することを示す。さらに表は、７．１超のｐＨで細胞を形質導入すると、７．１未満のｐＨで形質導入された細胞と比較して、ランツーランで生存ＣＡＲ発現細胞のより一貫したパーセンテージがもたらされたことを示す。
【図1-1】
【図1-2】
【図2】
【図3】
【国際調査報告】