特表 2024-508227 定量的質量分析による臨床抗体応答のためのＥＬＩＳＡの較正

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-26

(54)【発明の名称】定量的質量分析による臨床抗体応答のためのＥＬＩＳＡの較正

(51)【国際特許分類】

   G01N 33/53 20060101AFI20240216BHJP

   G01N 30/72 20060101ALI20240216BHJP

   G01N 27/62 20210101ALI20240216BHJP

   C07K 16/08 20060101ALN20240216BHJP

【ＦＩ】

G01N33/53 N

G01N30/72 C

G01N27/62 V

G01N27/62 D

C07K16/08 ZNA

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023545982

(86)(22)【出願日】2022-02-25

(85)【翻訳文提出日】2023-07-28

(86)【国際出願番号】 EP2022054795

(87)【国際公開番号】W WO2022180212

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】63/154,128

(32)【優先日】2021-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】21167342.1

(32)【優先日】2021-04-08

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】516257833

【氏名又は名称】ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェー

【氏名又は名称原語表記】ＪＡＮＳＳＥＮ ＶＡＣＣＩＮＥＳ ＆ ＰＲＥＶＥＮＴＩＯＮ Ｂ．Ｖ．

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100095360

【弁理士】

【氏名又は名称】片山 英二

(74)【代理人】

【識別番号】100093676

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 純子

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100149010

【弁理士】

【氏名又は名称】星川 亮

(72)【発明者】

【氏名】サドフ，ジェラルド，シー．

(72)【発明者】

【氏名】ヴェルウィリゲン，アンネ－ミエケ，イヴォンヌ，ヴィルヘルミナ

(72)【発明者】

【氏名】スティー，ダニエル，ジョン

(72)【発明者】

【氏名】スニークス－ヴリース，エブリン

(72)【発明者】

【氏名】ファン デン ケルクホフ，トーマス，ルドウィック，ゲルトルーディス，マチルダ

【テーマコード（参考）】

2G041

4H045

【Ｆターム（参考）】

2G041CA01

2G041EA04

2G041EA12

2G041FA12

2G041GA09

2G041HA01

2G041JA02

2G041LA08

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA40

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA50

4H045EA53

(57)【要約】

臨床抗体応答についてＥＬＩＳＡ読み出しを較正する方法が記載される。特に、本発明は、定量的質量分析によるワクチンに対する臨床抗体応答についてＥＬＩＳＡ読み出しを較正するための方法に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

試料中の抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、前記方法は、
ｉ．前記抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記抗体を含有する較正物質を前記抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって、前記較正物質中の前記抗体の相対量を判定する工程と、
ｉｉｉ．前記抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記較正物質を前記抗原と接触させることによって、工程ｉを繰り返す工程と、
ｉｖ．前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｖ．前記抗体のプロテオタイピックペプチドを含む混合物を生成するために、前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程であって、前記プロテオタイピックペプチドは、前記抗体のＦｃ領域において生じる、消化する工程と、
ｖｉ．前記プロテオタイピックペプチドの質量応答を測定するために、前記混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉｉ．前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、前記較正物質中の前記抗体の前記絶対量を判定する工程であって、前記参照曲線は、前記プロテオタイピックペプチドの質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、
ｖｉｉｉ．工程ｉｉにおいて前記ＥＬＩＳＡによって判定された、前記較正物質中の前記抗体の前記相対量を、工程ｖｉｉにおいて判定された、前記較正物質中の前記抗体の前記絶対量に相関させるための変換係数を確立する工程と、
ｉｘ．前記抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記試料を前記抗原と接触させる工程と、
ｘ．前記ＥＬＩＳＡ検出法によって、前記試料中の前記抗体の前記相対量を判定する工程と、
ｘｉ．前記試料中の前記抗体の前記絶対量を判定するために、前記変換係数を適用する工程と、を含む、方法。

【請求項2】

工程ｉの前に前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線を得ることを更に含む、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

工程ｖｉｉにおいて、前記プロテオタイピックペプチドの絶対量が、まず、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記較正物質中の前記抗体の前記絶対量が、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項１又は２に記載の方法。

【請求項4】

前記試料は、前記抗原若しくは同じウイルス由来の関連抗原を含むワクチンを投与された対象から、又は前記抗原を含むウイルスと接触した対象から得られた試料である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】

前記ワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであり、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するワクチン、インフルエンザウイルスに対するワクチン、エボラウイルスに対するワクチン、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルスに対するワクチン、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対するワクチンである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記抗原は、ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】

前記試料中の前記抗体は、前記抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項8】

前記抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】

前記試料は、血清、血漿又は別の生物学的流体試料である、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項10】

前記較正物質は、血清、血漿又は別の生物学的流体試料である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項11】

前記工程ｖは、前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項12】

前記抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４のうちの１つ又は２つ以上を含む、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】

前記プロテオタイピックペプチドは、配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項14】

工程ｖｉの前に前記混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に供することを更に含み、好ましくは前記ＬＣは、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項15】

前記定量的質量分析は、タンデム質量分析である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項16】

前記定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）含む、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項17】

前記定量的質量分析は、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。

【請求項18】

前記プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の前記質量応答を測定することを更に含む、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。

【請求項19】

前記プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することを更に含む、請求項１８に記載の方法。

【請求項20】

ＲＳＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中の前記ＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、前記方法は、
ｉ．前記ＲＳＶ抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記試料を前記ＲＳＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドを含む第１の混合物を生成するために、前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、前記第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．前記プロテオタイピックペプチドの質量スペクトルを生成するために、前記第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．前記質量スペクトルから前記プロテオタイピックペプチドの質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、前記試料において前記ＲＳＶ抗原に特異的な前記抗体の前記絶対量を判定する工程であって、前記参照曲線は、前記プロテオタイピックペプチドの質量分析応答を前記プロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法。

【請求項21】

工程ｉの前に前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線を得ることを更に含む、請求項２０に記載の方法。

【請求項22】

工程ｖｉｉにおいて、前記プロテオタイピックペプチドの絶対量が、まず、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記ＲＳＶ抗原に特異的な前記抗体の前記絶対量が、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項２０又は２１に記載の方法。

【請求項23】

前記定量的質量分析は、タンデム質量分析である、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項24】

前記定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、請求項２１～２３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項25】

前記プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の前記質量応答を測定することを更に含む、請求項２０～２４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項26】

前記プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することを更に含む、請求項２０～２５のいずれか一項に記載の方法。

【請求項27】

ＨＩＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中の前記ＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、前記方法は、
ｉ．前記ＨＩＶ抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記試料を前記ＨＩＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、前記第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．前記プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、前記第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．前記質量スペクトルから前記プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．前記プロテオタイピックペプチドの各々の前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、前記試料において前記ＨＩＶ抗原に特異的な前記抗体の前記絶対量を判定する工程であって、前記参照曲線は、前記プロテオタイピックペプチドの質量分析応答を前記プロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法。

【請求項28】

工程ｉの前に前記プロテオタイピックペプチドの各々の前記参照曲線を得ることを更に含む、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記プロテオタイピックペプチドの絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項２７又は２８に記載の方法。

【請求項30】

工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記プロテオタイピックペプチドの絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項２７～２９のいずれか一項に記載の方法。

【請求項31】

前記試料中の前記抗体の前記絶対量は、前記抗体ＩｇＧ１、３、及び４の前記絶対量と前記抗体ＩｇＧ２の前記絶対量との合計である、請求項３０に記載の方法。

【請求項32】

前記定量的質量分析は、タンデム質量分析である、請求項２７～３１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項33】

前記定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、請求項２７～３２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項34】

前記プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の前記質量応答を測定することを更に含む、請求項２７～３３のいずれか一項に記載の方法。

【請求項35】

前記プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の前記質量応答を対応する前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することを更に含む、請求項２７～３４のいずれか一項に記載の方法。

【請求項36】

ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中の前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、前記方法は、
ｉ．前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と前記抗原に結合した前記抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、前記試料を前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、前記１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、前記第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．前記プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、前記第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．前記質量スペクトルから前記プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．前記プロテオタイピックペプチドの各々の前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、前記試料において前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な前記抗体の前記絶対量を判定する工程であって、前記参照曲線は、前記プロテオタイピックペプチドの質量分析応答を前記プロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法。

【請求項37】

工程ｉの前に前記プロテオタイピックペプチドの各々の前記参照曲線を得ることを更に含む、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有する前記プロテオタイピックペプチドの絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項３６又は３７に記載の方法。

【請求項39】

工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有する前記プロテオタイピックペプチドの絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記質量応答を前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することによって判定され、次いで、前記ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量は、前記プロテオタイピックペプチドの前記絶対量に基づいて判定される、請求項３６～３８のいずれか一項に記載の方法。

【請求項40】

前記試料中の前記抗体の前記絶対量は、前記抗体ＩｇＧ１、３、及び４の前記絶対量と前記抗体ＩｇＧ２の前記絶対量との合計である、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記定量的質量分析は、タンデム質量分析である、請求項３６～４０のいずれか一項に記載の方法。

【請求項42】

前記定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、請求項３６～４１のいずれか一項に記載の方法。

【請求項43】

前記プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の前記質量応答を測定することを更に含む、請求項３６～４２のいずれか一項に記載の方法。

【請求項44】

前記プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の前記質量応答を対応する前記プロテオタイピックペプチドの前記参照曲線と比較することを更に含む、請求項３６～４３のいずれか一項に記載の方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

技術分野
本発明は、臨床抗体応答についてＥＬＩＳＡ読み出しを較正する方法に関する。特に、本発明は、定量的質量分析によるワクチンに対する臨床抗体応答についてＥＬＩＳＡ読み出しを較正するための方法に関する。

【0002】

発明の背景
現在、臨床試験におけるワクチン製品に対する一次免疫応答は、免疫アッセイによって使用されるウイルス反応性血清の参照材料との比較に基づいて、任意の単位で読み出されるＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイによって分析されている（Ａｙｄｉｎ２０１５）。このタイプの読み出しは、異なる参加者の免疫応答を同じ臨床研究内の群間で比較するのに十分な情報を与えるが、免疫応答の大きさに関する情報を与えない。このため、異なる標的抗原にわたって様々なワクチン製品間の免疫応答を正確に比較すること、又は正確に同じアッセイ及び参照材料が使用されないときに、臨床日を前臨床データと比較することは、不可能である。

【0003】

このタイプのＥＬＩＳＡに関しては、定量的質量分析はヒト血清における他の抗体から抗原特異的抗体を区別することができないので、免疫アッセイから離れて、代わりにヒト血清における抗原特異的抗体の読み出しとして定量的質量分析を使用する実用的な可能性はない。

【0004】

活性医薬品が循環において直接測定され得る治療とは対照的に、ワクチンの薬力学的応答は、免疫原に対する免疫系の応答に基づく。多くの独特な方法で標的抗原に結合することができるポリクローナル血清試料におけるワクチン特異的抗体の濃度は、均一な結合化学量論及び親和性を有するモノクローナル抗体に基づいて、参照標準に対して確実に評価されることができない。自然に感染した、又はワクチン接種によってヒトのコホートに由来するポリクローナル血清に基づく参照標準は、様々な濃度でのある範囲の抗体特異性を含有し、ワクチン応答を評価するための適切な参照となる。

【0005】

臨床免疫アッセイを較正するために定量的質量分析を使用することが可能であり（Ｐａｎ，Ａｅｂｅｒｓｏｌｄら２００９）、それによって、アッセイの読み出しを血清１ｍｌ当たりのＩｇＧ／ＩｇＡの単位での絶対量にする。これは、ワクチンに対する臨床応答の実際の大きさを与え、更に、それを同じウイルスに対する他のワクチン製品に対する応答と比較する可能性を可能にする。更に、それは、臨床データを前臨床データと比較する可能性を可能にする。

【0006】

しかしながら、ワクチン誘発免疫応答の絶対較正を可能にする質量分析の使用は、報告されていない。免疫応答の絶対読み出しの確立に関してかなりの量の先行技術文献が存在するが、それは、研究室にわたって広く実施され得る許容された標準の確立、参照標準としての既知の濃度を有する精製抗体の使用、又は抗体の免疫精製に続く直接定量に依存している。

【0007】

ＥＬＩＳＡは、その極めて高い特異性、高スループット、単純さ、規制上の許容性のために、臨床試料における免疫応答を測定するための最も好ましい検出方法であり、抗原特異的抗体を測定する目的のための唯一の実用的な解決策である。したがって、上述の２つの技術、ＥＬＩＳＡ及び定量的質量分析（quantitative mass spectrometry、ｑＭＳ）の新しい組み合わせの開発が必要とされている。

【0008】

発明の概要
本発明は、ＥＬＩＳＡの任意の読み出しを抗原特異的抗体の絶対量に変換することを可能にする、定量的質量分析によって臨床抗体応答のＥＬＩＳＡ読み出しを較正することによってこの必要性に対処する。本発明は、臨床分析の主力であるＥＬＩＳＡが、ｑＭＳの全ての利点、すなわち、絶対免疫グロブリン読み出し（Ｃａｌｄｅｒｏｎ－Ｃｅｌｉｓ、Ｅｎｃｉｎａｒら２０１８）とともに使用され得るように、２つの周知の技術、ＥＬＩＳＡ及び定量的質量分析（ｑＭＳ）を組み合わせる。したがって、ＥＬＩＳＡ参照材料の応答を定量するためにｑＭＳを使用することによって、ＥＬＩＳＡの任意の読み出しは、免疫グロブリンの絶対量に変換され得る。

【0009】

一般的な態様では、本出願は、試料中の抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法に関する。

【0010】

いくつかの実施形態では、本方法は、
ｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、抗体を含有する較正物質を抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって、較正物質中の抗体の相対量を判定する工程と、
ｉｉｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、較正物質を抗原と接触させることによって、工程ｉを繰り返す工程と、
ｉｖ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｖ．抗体のプロテオタイピックペプチドを含む混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｖｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答を測定するために、混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、較正物質中の抗体の絶対量を判定する工程と、
ｖｉｉｉ．工程ｉｉにおいてＥＬＩＳＡによって判定された、較正物質中の抗体の相対量を、工程ｖｉｉにおいて判定された、較正物質中の抗体の絶対量に相関させるための変換係数を確立する工程と、
ｉｘ．試料中の抗体の絶対量を判定するために、変換係数を適用する工程と、を含む。

【0011】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける。

【0012】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって第１に判定され、次いで、較正物質中の抗体の絶対量は、プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0013】

いくつかの実施形態では、本方法は、
ｘ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料を抗原と接触させる工程と、
ｘｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって試料において抗体の相対量を判定する工程と、
ｘｉｉ．工程ｖｉｉｉにおいて確立された変換係数を適用することによって、試料において抗体の絶対量を判定する工程と、を更に含む。

【0014】

いくつかの実施形態では、試料は、抗原若しくは同じウイルス由来の関連抗原を含むワクチンを投与された対象から、又は抗原を含むウイルス若しくは抗原的に関連するウイルスと接触した対象から得られた試料である。

【0015】

いくつかの実施形態では、ワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであり、好ましくは呼吸器合胞体ウイルス（respiratory syncytial virus、ＲＳＶ）に対するワクチン、ヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）に対するワクチン、インフルエンザウイルスに対するワクチン、エボラウイルスに対するワクチン、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルスに対するワクチン、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２に対するワクチンである。

【0016】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＲＳＶ－Ｂ抗原、好ましくはＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である。

【0017】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ抗原、好ましくはモザイク（Mosaic）ｇｐ１４０である。

【0018】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原、好ましくはスパイク抗原（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓ）である。

【0019】

いくつかの実施形態では、試料中の抗体は、抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0020】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４などの、免疫グロブリンＧ（immunoglobulin G、ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、試料は、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくはヒト血清である。

【0022】

いくつかの実施形態では、較正物質は、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくはヒト血清である。

【0023】

いくつかの実施形態では、試料中の抗体は、較正物質として使用された抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0024】

いくつかの実施形態では、工程ｖは、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドは、抗原に特異的な抗体において、好ましくは抗体のＦｃ領域において生じ、より好ましくは配列番号１又は配列番号２のアミノ酸配列を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｖｉの前に混合物を液体クロマトグラフィー（liquid chromatography、ＬＣ）に供することを更に含み、好ましくはＬＣは、高速液体クロマトグラム（high performance liquid chromatogram、ＨＰＬＣ）である。

【0027】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析は、タンデム質量分析であり、好ましくは多重反応モニタリング（multiple reaction monitoring、ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（selected reaction monitoring、ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（parallel reaction monitoring、ＰＲＭ）を含む。

【0028】

ある特定の実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量（intact mass）の質量応答を測定することを含む。更なる実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0029】

別の態様では、本出願は、ＲＳＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＲＳＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＲＳＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、試料においてＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0030】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける。

【0031】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析は、タンデム質量分析であり、好ましくは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0032】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答を測定することを含む。

【0033】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0034】

別の態様では、本出願は、ＨＩＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＨＩＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＨＩＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0035】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む。

【0036】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析は、タンデム質量分析であり、好ましくは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0037】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0038】

別の態様では、本出願は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0039】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む。

【0040】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析は、タンデム質量分析であり、好ましくは多重反応モニタリング（ＭＲＭ）、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）、又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0041】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0042】

本発明の他の態様、特徴、及び利点は、発明の詳細な説明、並びにその好ましい実施形態及び添付の特許請求の範囲を含む以下の開示より明らかとなろう。

【図面の簡単な説明】

【0043】

上記の概要、及び本出願の好ましい実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでより良く理解されるであろう。しかしながら、本出願は、図面に示される実施形態そのものに限定されないことを理解するべきである。

【図1】実施例１に記載のペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）の質量応答を示す。ピーク面積は、相対存在量で表される。

【図2】分光光度読み出しによって得られた、ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原に結合した抗ＲＳＶ－Ｂ抗原抗体陽性ヒト血清についてのＥＬＩＳＡ参照標準曲線を示す。発光は、相対発光量（Relative light unit、ＲＬＵ）で表される。

【図3】ＥＬＩＳＡ参照材料であるＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原陽性ヒト血清のｑＭＳ分析の実験設定を開示する。

【図4】抗ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原抗体陽性ヒト血清に対する質量分析によって読み出された抗原結合ＩｇＧの量で生成されたＥＬＩＳＡ参照標準曲線の直線部分を開示する。

【図5】実施例２に記載されるペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）及びＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２）の質量応答を示す。ピーク面積は、相対存在量で表される。

【図6】分光光度読み出しによって得られた、ＨＩＶ抗原に結合した抗ＨＩＶ抗原（モザイクｇｐ１４０）抗体陽性ヒト血清についてのＥＬＩＳＡ参照標準曲線を示す。読み出しは、４５０ｎｍ波長での光学密度（Optical Density、ＯＤ４５０）で表される。

【図7】抗ＨＩＶ抗原抗体陽性ヒト血清に対する質量分析によって読み出された抗原結合ＩｇＧの量で生成されたＥＬＩＳＡ参照標準曲線の直線部分を開示する。

【図8】実施例３に記載されるペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）及びＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２）の質量応答を示す。ピーク面積は、相対存在量で表される。

【図9】分光光度読み出しによって得られた、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に結合した抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原抗体陽性ヒト血清についてのＥＬＩＳＡ参照標準曲線を示す。発光は、相対発光量（ＲＬＵ）で表される。

【図7】抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原抗体陽性ヒト血清に対する質量分析によって読み出された抗原結合ＩｇＧの量で生成されたＥＬＩＳＡ参照標準曲線の直線部分を開示する。

【0044】

詳細な記述
「背景技術」において、また、本明細書全体を通じて各種刊行物、論文及び特許を引用又は記載し、これら参照文献の各々はその全容が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書に含まれる文書、操作、材料、デバイス、物品などの考察は、本発明のコンテキストを与えるためのものである。かかる考察は、これらの事物のいずれか又は全てが、開示又は特許請求されるいずれかの発明に対する先行技術の一部を構成することを容認するものではない。

【0045】

特に規定のない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されるのと同じ意味を有する。そうでない場合、本明細書で使用される特定の用語は、本明細書に記載される意味を有するものである。本明細書に引用する全ての特許、公開された特許出願及び刊行物は、参照によってあたかもその全体が本明細書に記載されているように組み込まれる。

【0046】

本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、特に文脈上明らかでない限り、複数の指示対象物を含むことに留意する必要がある。

【0047】

別途記載のない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」という用語は、一連の全ての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、単なる通常の実験手順を使用するだけで、本明細書に記載した本発明の特定の実施形態に対して多くの均等物を認識するか、又は確認することができよう。かかる均等物は、本発明によって包含されることが意図される。

【0048】

本明細書及び以下の特許請求の範囲を通して、文脈上必要としない限り、「含む（comprise）」という用語並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」などの変形は、指定の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むが、任意のその他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外するものではないことを意味すると、理解されよう。本明細書に使用される場合、「含む（comprising）」という用語は、「含有する（containing）」又は「含む（including）」という用語に置き換えることができ、又は場合によって本明細書に使用される場合、「有する（having）」という用語に置き換えることもできる。

【0049】

本明細書に使用される場合、「からなる（consisting of）」は、特許請求の範囲の要素において指定されていない任意の要素、工程、又は成分を除外する。本明細書に使用される場合、「から本質的になる（consisting essentially of）」は、特許請求の範囲の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程は除外しない。本出願の態様又は実施形態に関連して本明細書で使用するとき、本開示の範囲を変化させるために、「含む（comprising）」、「含有する（containing）」、「含む（including）」、及び「有する」という上記用語のいずれかを、「からなる」又は「から本質的になる」という用語に置き換えることができる。

【0050】

本明細書に使用される場合、複数の列挙された要素間の「及び／又は」という接続的な用語は、個々の及び組み合わされた選択肢の両方を包含するものとして理解される。例えば、２つの要素が「及び／又は」によって接続される場合、第１の選択肢は、第２の要素なしに第１の要素が適用可能であることを指す。第２の選択肢は、第１の要素なしに第２の要素が適用可能であることを指す。第３の選択肢は、第１及び第２の要素が一緒に適用可能であることを指す。これらの選択肢のうちのいずれか１つは、意味に含まれ、したがって、本明細書に使用される場合、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。選択肢のうちの２つ以上の同時適用性もまた、意味に含まれ、したがって、「及び／又は」という用語の要件を満たすことが理解される。

【0051】

特に断らない限り、本明細書に記載される濃度又は濃度範囲などのあらゆる数値は、全ての場合において、「約」という用語によって修飾されているものとして理解されるべきである。したがって、数値は、通常、記載される値の±１０％を含む。例えば、１ｍｇ／ｍＬの濃度は０．９ｍｇ／ｍＬ～１．１ｍｇ／ｍＬを含む。同様に、１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの濃度範囲は、０．９ｍｇ／ｍＬ～１１ｍｇ／ｍＬを含む。本明細書で使用するとき、数値範囲の使用は、文脈上そうでない旨が明確に示されない限り、その範囲内の整数及び値の分数を含む、全ての可能な部分範囲、その範囲内の全ての個々の数値を明示的に含む。

【0052】

本明細書で使用するとき、「対象」とは、本出願の実施形態による方法によって治療される、又は治療された任意の動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを意味する。本明細書に使用される場合、「哺乳動物」という用語は、あらゆる哺乳動物を包含する。哺乳動物の例としては、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ネコ、イヌ、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サル又は類人猿などの非ヒト霊長類（non-human primate、ＮＨＰ）、ヒトなど、より好ましくはヒトが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0053】

本出願の読者を助けるため、明細書の記載は、様々な段落若しくはセクションにおいて、及び／又は本出願の様々な実施形態において分けられている。これらの分離は、段落又はセクション又は実施形態の実体を別の段落又はセクション又は実施形態の実体から切り離すものとみなされるべきではない。反対に、当業者であれば、本明細書の記載が広範な用途を有し、想到され得る様々な段落、パラグラフ、及び文章の全ての組み合わせを包含することを理解するであろう。いかなる実施形態の考察も、単なる例示であることを意味するものであり、特許請求の範囲を含む本開示の範囲がこれらの実施例に限定されることを示唆することを意図するものではない。

【0054】

本明細書で互換的に使用される「生物学的試料」という用語は、生物から得られた様々な試料タイプを包含し、診断又は監視アッセイで使用され得る。この用語は、血液及び生物学的起源の他の液体試料、生検標本又は組織培養物又はそれに由来する細胞、及びその子孫などの固体組織試料を包含する。この用語は、特定の成分に対する試薬での処理、可溶化、又は濃縮などによって、それらの調達後に任意の方法で操作された試料を包含する。この用語は、臨床試料を包含し、細胞培養物、細胞上清、細胞可溶化物、血清、血漿、生物学的流体、及び組織試料中の細胞も含む。

【0055】

本明細書で使用するとき、「抗体」という用語は、広義で使用され、かつヒト、ヒト化、複合、及びキメラ抗体を含む、免疫グロブリン又は抗体分子、並びにモノクローナル又はポリクローナルである抗体フラグメントを含む。一般に、抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示すタンパク質又はペプチド鎖である。抗体は、単量体又は多量体であることができ、任意の種に由来することができ、例えば、ＩｇＭ、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、若しくはＩｇＧ４）、ＩｇＤ、ＩｇＡ、又はＩｇＥであることができる。

【0056】

本明細書で使用するとき、「抗原結合フラグメント」という用語は、例えば、ダイアボディ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖフラグメント、ジスルフィド安定化Ｆｖフラグメント（ｄｓＦｖ）、（ｄｓＦｖ）_２、二重特異性ｄｓＦｖ（ｄｓＦｖ－ｄｓＦｖ’）、ジスルフィド安定化ダイアボディ（ｄｓダイアボディ）、単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｄａｂ）ｓｃＦｖ二量体（二価ダイアボディ）、１つ又は２つ以上のＣＤＲを含む抗体の一部分から形成される多重特異性抗体、ラクダ化単一ドメイン抗体、ナノボディ、ドメイン抗体、二価ドメイン抗体、又は抗原に結合するが完全な抗体構造を含まない任意の他の抗体フラグメントなどの抗体フラグメントを指す。

【0057】

本明細書で使用するとき、「モノクローナル抗体（monoclonal antibody、ｍＡｂ）」という用語は、単一分子組成物の抗体の調製物を指す。

【0058】

本明細書で使用される場合、「ポリクローナル抗体」という用語は、同じ抗原又は異なる抗原上のいくつかの異なる特異的抗原決定基に、結合するか又はそれと反応することができる、異なる抗体分子の組成物を指す。ポリクローナル抗体の抗原特異性の可変性は、ポリクローナル抗体を構成する個々の抗体の可変領域、特に相補性決定領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３に位置づけられる。

【0059】

「抗原特異的抗体」という用語は、抗原と抗体と間の結合を指し、抗原が、多くの他の多様な抗体の存在下であっても、すなわち、抗体の不均一な混合物中で、優先的に結合することを示すために、抗体と会合する能力を特徴とする。例えば、抗原特異的抗体は、ＫＤが１×１０^－７Ｍ以下、好ましくは１×１０^－８Ｍ以下、より好ましくは５×１０^－９Ｍ以下、１×１０^－９Ｍ以下、５×１０^－１０Ｍ以下、又は１×１０^－１０Ｍ以下で抗原に結合する抗体又はその抗原結合フラグメントを指す。「ＫＤ」という用語は、Ｋｄ対Ｋａ（すなわち、Ｋｄ／Ｋａ）の比から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を指す。結合剤のＫＤ値は、本開示を考慮して当該技術分野における方法を用いて判定することができる。例えば、ある抗体のＫＤは、表面プラズモン共鳴法を使用することによって、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用することなどによって、又は例えば、Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤ９６システムなどのバイオレイヤーインターフェロメトリー技術を使用することによって、求めることができる。抗体のＫＤの値が小さいほど、抗体が標的抗原に結合する親和性が高い。

【0060】

抗体の「絶対量」という用語は、重量、モル、重量濃度、又はモル濃度、好ましくは重量濃度又はモル濃度の単位での量を指す。

【0061】

「ワクチン」という用語は、特定の感染症に対する能動的獲得免疫を提供する生物学的製剤を指す。ワクチンは、典型的には、ウイルスを含む疾患を引き起こす微生物に似た薬剤を含有する。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンは、ＨＩＶウイルスの１つ又は２つ以上の部分／フラグメントを含有又はコードし、ＨＩＶウイルスの部分／フラグメントはＨＩＶ抗原とも呼ばれる。ワクチンは、予防的（天然又は「野生」病原体による将来の感染の影響を予防又は改善するため）又は治療的（例えば、研究されているがんに対するワクチン）であることができる。

【0062】

免疫応答を測定するためのＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡは、その極めて高い特異性、高スループット及び単純さ、並びに抗原特異的抗体を測定するその能力のために、ヒト血清試料における免疫応答を測定するための最も好ましい検出方法である。種特異的二次抗体の助けを借りて血清抗体を検出する間接ＥＬＩＳＡは、この目的のために一般的に使用される。間接ＥＬＩＳＡにおける第１の工程は、マイクロタイタープレートのウェルにおける標的抗原の固定化である。抗原は、マイクロタイタープレートのウェルに非特異的に（吸着）又は特異的に（例えば、ストレプトアビジンを介して）吸着され得る。抗原特異的抗体の検出は、２段階プロセスであり、第一に、血清若しくは血漿抗体又は精製及び未標識一次抗体が、特異的抗原に結合し、第二に、一次抗体の宿主種に対して指向性のある二次検出抗体が適用される。所望の読み出し方法に応じて、二次検出抗体は、例えば、フルオロフォア又は特定の基質を検出可能な生成物（比色、化学発光、又は蛍光など）に変換することができる酵素で特異的に標識される。例えば、酵素は、以下の酵素、
・タンパク質とのコンジュゲーションにしばしば使用される西洋ワサビペルオキシド（ＨＲＰ）であって、ｏ－フェニレンジアミン二塩酸塩（o-phenylenediamine dihydrochloride、ＯＰＤ）を、琥珀色生成物に変換するもの、
・ＨＲＰは、３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（tetramethylbenzidine、ＴＭＢ）を青色生成物に変換し、硫酸又はリン酸の存在下で黄色になり、
・ＨＲＰは、増強化学発光（enhanced chemiluminescence、ＥＣＬ）基質を発光しながら生成物に変える、
・ＨＲＰは、２，２’－アジノビス［３－エチルベンゾチアゾリン－６－スルホン酸］－ジアンモニウム塩（ＡＢＴＳ）を、緑色生成物に変換するもの、及び
・アルカリホスファターゼは、ｐ－ニトロフェニルホスフェート（ＰＮＰＰ）を、黄色の生成物に変換するもののうちの１つであることができる。

【0063】

ウイルス抗原でのワクチン接種後のヒト血清において抗原特異的免疫グロブリンの量を判定するための間接的ＥＬＩＳＡの設定のために、多くのプロトコールが確立されている。例えば、マルチウェルプレートは、ウイルス標的抗原でコーティングされ、十分なインキュベーション時間の後、洗浄されてブロックされる。次いで、連続希釈されたヒト血清及び対照は、添加され、十分に長くインキュベートされて、血清抗体を抗原に結合することを可能にする。次いで、プレートは、再度洗浄され、標識二次抗体は、添加され、プレートは、十分に長くインキュベートされる。最終洗浄工程の後、基質は、添加され、得られた比色又は発光結果は、読み出される。最後に、得られた結果は、定量的質量分析（ｑＭＳ）によって絶対量に変換される必要がある、任意の値をもたらす参照材料のシグナルと比較される。

【0064】

定量的質量分析（ｑＭＳ）によるＥＬＩＳＡ結果の較正
本出願は、概して、定量的質量分析（ｑＭＳ）によるヒト血清において免疫応答についてのＥＬＩＳＡ結果の較正に関し、これは、ＥＬＩＳＡの任意の読み出しを抗原特異的抗体の絶対量に変換することを可能にする。

【0065】

１つの一般的な態様では、本出願は、試料中の抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、抗体を含有する較正物質を抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって、較正物質中の抗体の相対量を判定する工程と、
ｉｉｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、較正物質を抗原と接触させることによって、工程ｉを繰り返す工程と、
ｉｖ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｖ．抗体のプロテオタイピックペプチドを含む混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｖｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答を測定するために、混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、較正物質中の抗体の絶対量を判定する工程と、
ｖｉｉｉ．工程ｉｉにおけるＥＬＩＳＡによって判定された、較正物質中の抗体の相対量を、工程ｖｉｉにおいて判定された、較正物質中の抗体の絶対量に相関させるための変換係数を確立する工程と、
ｉｘ．試料中の抗体の絶対量を判定するために、変換係数を適用する工程と、を含む、方法に関する。

【0066】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける。

【0067】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって第１に判定され、次いで、較正物質中の抗体の絶対量は、プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0068】

いくつかの実施形態では、本方法は、
ｘ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料を抗原と接触させる工程と、
ｘｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって試料において抗体の相対量を判定する工程と、
ｘｉｉ．変換係数を適用することによって、試料において抗体の絶対量を判定する工程と、を更に含む。

【0069】

本明細書で使用される場合、「試料」という用語は、抗原を含むワクチンを投与された対象から、又はワクチン接種されていないが抗原を含むウイルスに感染した対象から採取された試料を指す。例えば、対象は、ワクチンを投与された健康な参加者若しくは患者、又はウイルスと接触した健康な参加者若しくは患者であり得る。好ましくは、患者は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、又はＡ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルスなどのウイルスに感染したことがあるか、又は感染している。ワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンであることができる。ワクチンの例としては、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）に対するワクチン、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に対するワクチン、インフルエンザウイルスに対するワクチン、エボラウイルスに対するワクチン、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルスに対するワクチン、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスに対するワクチンが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0070】

試料は、対象から直接得られた生物学的試料であることができる。それはまた、例えば、生物学的試料が遠心分離され、凍結され、解凍された後などの、生物学的試料の処理済み試料であることができる。

【0071】

ある特定の実施形態では、試料は、血清、血漿、又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である。

【0072】

好ましくは、試料は、較正物質に対するそのＥＬＩＳＡ応答に基づいて、未試験試料又は未知試料である。

【0073】

本出願の実施形態によれば、較正物質は、ＥＬＩＳＡ検出法における参照材料である。ＥＬＩＳＡの例は、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合／阻害ＥＬＩＳＡであることができる。

【0074】

ある特定の実施形態では、較正物質は、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である。

【0075】

本出願の実施形態によれば、ＥＬＩＳＡにおける参照材料の応答は、抗体の絶対量を得るために、定量的質量分析（ｑＭＳ）によって較正され得る。本出願におけるｑＭＳは、１つ又は２つ以上のプロテオタイピックペプチドの使用を必要とする、任意の質量分析（mass spectrometry、ＭＳ）ベースの標的タンパク質定量であることができる。

【0076】

プロテオタイピックペプチドは、ＭＳベースの標的化プロテオミクス法によって確実に観察される可能性が最も高いタンパク質配列においてペプチドである。それらは、タンデム質量分析計によって調べられる試料混合物において目的のタンパク質の定性的及び定量的同定に非常に有用である。ＭＳベースの標的タンパク質定量のための最適なプロテオタイピックペプチドの選択は、経験的アプローチ又はインシリコ分析によって行うことができる。

【0077】

伝統的に、本出願におけるプロテオタイピックペプチドは、そのアミノ酸配列が、（１）抗体のポリクローナル混合物に特有であり、典型的にはタンパクの定常領域の一部であり、（２）血漿／血清において存在し得る他のタンパクには見出されない、特徴的なトリプシンペプチドである（Ｈａｌｑｕｉｓｔ及びＴｈｏｍａｓ Ｋａｒｎｅｓ、２０１１）。

【0078】

血漿／血清におけるｍＡｂ定量についてのＬＣ－ＭＳ／ＭＳベースのアッセイは、伝統的に、ｍＡｂ試料のトリプシン消化と、それに続く特徴的なトリプシンペプチドの定量に依存してきた。特徴的なトリプシンペプチドアプローチは、ｍＡｂの干渉のない定量を確実にするが、この様式で開発されたアッセイは、１つの分析物にのみ適用されることができ、したがって、各新薬候補は、前臨床動物研究におけるその定量を容易にするために、完全に新規なアッセイの開発を必要とする。

【0079】

本出願の実施形態によれば、プロテオタイピックペプチドは、免疫複合体が単離されたときに、標的抗体、例えば、抗原特異的抗体においてのみ生じる、特異的プロテオタイピックペプチドである。このタイプのプロテオタイピックペプチドは、抗体及びＦｃ融合タンパク質候補のポリクローナル混合物の大部分のＦｃ領域において見出される普遍的代替ペプチドである。単一の普遍的代替ペプチドに基づく、このアプローチは、血漿試料において抗体及びＦｃ融合タンパク質候補の種々のポリクローナル混合物を定量することが可能である。

【0080】

ある特定の実施形態では、特異的プロテオタイピックペプチドは、ヒトＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４）のＦｃ領域において生じる。このようなペプチド配列は、４つの一般的な特徴を有する。
（１）本配列は、抗体及びＦｃ融合タンパク質候補のヒトポリクローナル混合物において存在しなければならず、したがって、種々のこのようなタンパク質候補を含む開発プログラムにわたるその一般的な適用可能性を可能にする。
（２）本配列は、ヒトｍＡｂ及びＦｃ融合タンパク質分析物のトリプシン消化から確実に産生される。
（３）本配列は、良好なクロマトグラフィーピーク形状、適切なクロマトグラフィー保持及び効率的なイオン化などの有利なＬＣ－ＭＳ／ＭＳ特性を有する。
（４）本配列は、前臨床薬物開発研究において典型的に使用される任意の動物種に存在する任意の血漿／血清タンパク質のタンパク質配列において見出されず、したがって、血漿タンパク質由来の干渉がない定量を確実にする（Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｏｕｙａｎｇら２０１２）。

【0081】

ある特定の実施形態では、好ましい特定のプロテオタイピックペプチドは、表１に列挙される。

【0082】

【表1】

【0083】

いくつかの実施形態では、抗原は、ＲＳＶ抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザウイルス抗原、エボラウイルス抗原、又はＡ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルス抗原であることができる。

【0084】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＲＳＶ－Ｂ抗原、好ましくはＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である。

【0085】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＨＩＶ抗原、好ましくはモザイクｇｐ１４０である。

【0086】

ある特定の実施形態では、抗原は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原、好ましくはスパイク抗原（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓ）である。

【0087】

いくつかの実施形態では、試料中の抗体は、抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0088】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む。好ましくは、これらの抗体は、表１に列挙されるプロテオタイピックペプチドのうちの１つを含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、工程ｉｖは、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。

【0090】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｖｉの前に混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に供することを更に含み、好ましくはＬＣは、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である。

【0091】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析は、タンデム質量分析である。好ましくは、定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0092】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答を測定することを含む。

【0093】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答を測定することを含む。

【0094】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0095】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0096】

本出願の実施形態によれば、抗原に特異的な抗体の絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定される。

【0097】

プロテオタイプペプチドの参照曲線は、当該技術分野において公知の任意の方法によって得られることができる。例えば、このような参照曲線を確立するために、異なる量のプロテオタイピックペプチドを含有する較正物質は、同じ較正物質の希釈によって、又は較正物質中の異なる量のプロテオタイピックペプチドをスパイクすることによってのいずれかで得られる。較正物質の各量／濃度について、プロテオタイピックペプチドの質量応答は、本出願の方法に従って判定される。次いで、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの参照曲線を得るために、質量応答に対してプロットされる。したがって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答を、抗原に特異的なプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける。

【0098】

本出願の実施形態によれば、抗原に特異的な抗体の絶対量を判定するときに、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって第１に判定される。次いで、抗原に特異的な抗体の絶対量は、１）プロテオタイピックペプチドの絶対量、２）抗体と対応するプロテオタイピックペプチドとの間のモル比又は重量比、及び３）ＥＬＩＳＡにおいて使用される血清の希釈係数に基づいて判定される。

【0099】

いくつかの実施形態では、較正物質中の抗体の絶対量は、モル濃度又は重量濃度で表され得る。

【0100】

本出願の実施形態によれば、較正物質中の抗体の相対量は、工程ｉｉにおいてＥＬＩＳＡによって判定される。ＥＬＩＳＡの例としては、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合／阻害ＥＬＩＳＡが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

【0101】

いくつかの実施形態では、変換係数は、工程ｉｉにおけるＥＬＩＳＡによって判定された抗体の相対量を、工程ｖｉｉにおいて判定された抗体の絶対量に相関させるために確立される。いくつかの実施形態では、変換係数は、抗体の絶対量に対する抗体の相対量に関連付ける式又はプロット又は曲線として表され得る。

【0102】

変換係数の確立後、抗体の相対量は、変換係数を相対量に適用することによって絶対量に変換される。試料における抗体の絶対量は、参照材料において抗体の絶対量の発現に依存して、モル濃度又は重量濃度で表され得る。例えば、判定された参照材料における抗体の絶対量がモル濃度で表される場合、試料における抗体の絶対量はまた、モル濃度で表され、参照材料における抗体の絶対量が重量濃度で表される場合、試料における抗体の絶対量はまた、重量濃度で表される。

【0103】

いくつかの実施形態では、試料における抗体の絶対量は、抗体の絶対量をｑＭＳによって判定されたプロテオタイピックペプチドの質量応答に間接的に関連付ける、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と直接比較することによって判定される。

【0104】

いくつかの実施形態では、参照曲線は、シグモイド曲線である。ある特定の実施形態では、抗体の絶対量は、参照曲線との直接比較によって、又はシグモイド曲線フィッティングによって判定される。

【0105】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、抗体の絶対量は、１）プロテオタイピックペプチドの絶対量、２）抗体と対応するプロテオタイピックペプチドとの間のモル比又は重量比、及び３）ＥＬＩＳＡにおいて使用される血清の希釈係数に基づいて判定される。

【0106】

いくつかの実施形態では、２つ以上のプロテオタイピックペプチドは、本方法において使用され得る。更なる実施形態では、試料において抗原に特異的な抗体の絶対量は、抗体ＩｇＧ１、２、３、及び４の絶対量の合計である。

【0107】

例えば、方法は、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチド、及び配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドを使用することができる。次に、抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量は、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの参照曲線に基づいて判定され、抗体ＩｇＧ２の絶対量は、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの参照曲線に基づいて判定される。次いで、抗原に特異的な抗体の絶対量は、抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量と抗体ＩｇＧ２の絶対量との合計である。

【0108】

別の一般的な態様では、本出願はまた、ＲＳＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＲＳＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＲＳＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、試料においてＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0109】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける。

【0110】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、プロテオタイピックペプチドの絶対量は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって第１に判定され、次いで、ＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量は、プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0111】

いくつかの実施形態では、試料は、血清、血漿、又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である。

【0112】

ある特定の実施形態では、試料は、例えば、生物学的試料が遠心分離され、凍結され、解凍された後などの、生物学的試料の処理済み試料である。

【0113】

いくつかの実施形態では、ＲＳＶワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンである。

【0114】

本出願の実施形態によれば、較正物質は、ＥＬＩＳＡ検出法における参照材料である。ＥＬＩＳＡの例は、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合／阻害ＥＬＩＳＡであることができる。

【0115】

いくつかの実施形態では、試料において抗体は、ＲＳＶ抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0116】

ある特定の実施形態では、ＲＳＶ抗原は、ＲＳＶ－Ｂ抗原、好ましくはＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である。

【0117】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む。

【0118】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドは、抗体のＦｃ領域で生じる。

【0119】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。

【0120】

いくつかの実施形態では、工程ｉｉは、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。

【0121】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析（ｑＭＳ）は、タンデム質量分析である。好ましくは、定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0122】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0123】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0124】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0125】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0126】

別の一般的な態様では、本出願はまた、ＨＩＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＨＩＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＨＩＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0127】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む。

【0128】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0129】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0130】

更なる実施形態では、試料中の抗体の絶対量は、抗体ＩｇＧ１、３、及び４の絶対量と抗体ＩｇＧ２の絶対量との合計である。

【0131】

いくつかの実施形態では、試料は、血清、血漿、又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である。

【0132】

ある特定の実施形態では、試料は、例えば、生物学的試料が遠心分離され、凍結され、解凍された後などの、生物学的試料の処理済み試料である。

【0133】

いくつかの実施形態では、ＨＩＶワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンである。

【0134】

本出願の実施形態によれば、較正物質は、ＥＬＩＳＡ検出法における参照材料である。ＥＬＩＳＡの例は、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合／阻害ＥＬＩＳＡであることができる。

【0135】

いくつかの実施形態では、試料において抗体は、ＨＩＶ抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0136】

ある特定の実施形態では、ＨＩＶ抗原は、モザイクｇｐ１４０である。

【0137】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む。

【0138】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドは、抗体のＦｃ領域で生じる。

【0139】

いくつかの実施形態では、工程ｉｉは、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。

【0140】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析（ｑＭＳ）は、タンデム質量分析である。好ましくは、定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0141】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0142】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0143】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の各々の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0144】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0145】

別の一般的な態様では、本出願はまた、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法は、
ｉ．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法に関する。

【0146】

いくつかの実施形態では、本方法は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む。

【0147】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0148】

いくつかの実施形態では、工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量は、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される。

【0149】

更なる実施形態では、試料中の抗体の絶対量は、抗体ＩｇＧ１、３、及び４の絶対量と抗体ＩｇＧ２の絶対量との合計である。

【0150】

いくつかの実施形態では、試料は、血清、血漿、又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である。

【0151】

ある特定の実施形態では、試料は、例えば、生物学的試料が遠心分離され、凍結され、解凍された後などの、生物学的試料の処理済み試料である。

【0152】

いくつかの実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ワクチンは、予防ワクチン又は治療ワクチンである。

【0153】

本出願の実施形態によれば、較正物質は、ＥＬＩＳＡ検出法における参照材料である。ＥＬＩＳＡの例は、直接ＥＬＩＳＡ、間接ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、逆ＥＬＩＳＡ、又は競合／阻害ＥＬＩＳＡであることができる。

【0154】

いくつかの実施形態では、試料において抗体は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する。

【0155】

ある特定の実施形態では、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓである。

【0156】

いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４などの、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む。

【0157】

いくつかの実施形態では、プロテオタイピックペプチドは、抗体のＦｃ領域で生じる。

【0158】

いくつかの実施形態では、工程ｉｉは、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む。

【0159】

いくつかの実施形態では、定量的質量分析（ｑＭＳ）は、タンデム質量分析である。好ましくは、定量的質量分析は、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）又は選択反応モニタリング（ＳＲＭ）又は並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む。

【0160】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0161】

いくつかの実施形態では、本方法の工程ｖｉは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を測定することを更に含む。

【0162】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の各々の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0163】

いくつかの実施形態では、本方法は、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む。

【0164】

実施形態
本発明は以下の非限定的な実施形態も提供する。

【0165】

実施形態１は、試料中の抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法が、
ｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、抗体を含有する較正物質を抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって、較正物質中の抗体の相対量を判定する工程と、
ｉｉｉ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、較正物質を抗原と接触させることによって、工程ｉを繰り返す工程と、
ｉｖ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｖ．抗体のプロテオタイピックペプチドを含む混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｖｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答を測定するために、混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、較正物質中の抗体の絶対量を判定する工程と、
ｖｉｉｉ．工程ｉｉにおいてＥＬＩＳＡによって判定された、較正物質中の抗体の相対量を、工程ｖｉｉにおいて判定された、較正物質中の抗体の絶対量に相関させるための変換係数を確立する工程と、
ｉｘ．試料中の抗体の絶対量を判定するために、変換係数を適用する工程と、を含む、方法である。

【0166】

実施形態１ａは、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、実施形態１に記載の方法である。

【0167】

実施形態１ｂは、工程ｖｉｉにおいて、プロテオタイピックペプチドの絶対量が、まず、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、較正物質中の抗体の絶対量が、プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態１又は１ａに記載の方法である。

【0168】

実施形態１ｃは、
ｘ．抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料を抗原と接触させる工程と、
ｘｉ．ＥＬＩＳＡ検出法によって試料において抗体の相対量を判定する工程と、
ｘｉｉ．変換係数を適用することによって、試料において抗体の絶対量を判定する工程と、を更に含む、実施形態１又は１ａ又は１ｂに記載の方法である。

【0169】

実施形態２は、試料が、抗原を含むワクチンを投与された対象から、又は抗原を含むウイルスと接触した対象から得られる、実施形態１～１ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0170】

実施形態２ａは、対象が、健康な参加者又は患者である、実施形態２に記載の方法である。

【0171】

実施形態２ｂは、患者が、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型又はＤ型肝炎ウイルス、及びＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスからなる群から選択されるウイルスに感染している、実施形態２ａに記載の方法である。

【0172】

実施形態３は、ワクチンが、予防ワクチン又は治療ワクチンである、実施形態２～２ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0173】

実施形態３ａは、ワクチンが、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、エボラウイルスに対するもの、Ａ型、Ｂ型、Ｃ型若しくはＤ型肝炎ウイルスに対するもの、又はＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ウイルスに対するものである、実施形態３に記載の方法である。

【0174】

実施形態４は、抗原が、ＲＳＶ抗原、ＨＩＶ抗原、インフルエンザウイルス抗原、エボラウイルス抗原、Ａ型肝炎抗原、Ｂ型肝炎抗原、Ｃ型肝炎抗原、Ｄ型肝炎抗原、及びＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原からなる群から選択される、実施形態１～３ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0175】

実施形態４ａは、抗原が、ＲＳＶ－Ｂ抗原、好ましくはＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である、実施形態４に記載の方法である。

【0176】

実施形態４ｂは、抗原が、ＨＩＶ抗原、好ましくはｇｐ１４０又はｇｐ１２０、より好ましくはｇｐ１４０クレードＣである、実施形態４に記載の方法である。

【0177】

実施形態４ｃは、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原、好ましくはスパイク抗原（ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓ）である、実施形態４の方法である。

【0178】

実施形態５は、抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態１～４ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0179】

実施形態５ａは、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、実施形態５に記載の方法である。

【0180】

実施形態５ｂは、試料中の抗体が、抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する、実施形態５に記載の方法である。

【0181】

実施形態６は、プロテオタイピックペプチドが、抗原に特異的な抗体において生じる、実施形態１～５ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0182】

実施形態６ａは、プロテオタイピックペプチドが、抗原に特異的な抗体のＦｃ領域において生じる、実施形態１～６のいずれか１つに記載の方法である。

【0183】

実施形態６ｂは、プロテオタイピックペプチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、実施形態１～６ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0184】

実施形態７は、試料が、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である、実施形態１～６ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0185】

実施形態７ａは、試料が、生物学的試料の処理済み試料である、実施形態７に記載の方法である。

【0186】

実施形態７ｂは、生物学的試料が、遠心分離され、凍結され及び／又は解凍される、実施形態７ａに記載の方法である。

【0187】

実施形態８は、較正物質が、血清、血漿又は別の生物学的流体試料である、実施形態１～７ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0188】

実施形態９は、工程ｉｖが、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施形態１～８のいずれか１つに記載の方法である。

【0189】

実施形態９ａは、工程ｉｖの前に混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）に供することを更に含み、好ましくはＬＣは、高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）である、実施形態１～９のいずれか１つに記載の方法である。

【0190】

実施形態１０は、定量的質量分析が、タンデム質量分析である、実施形態１～９ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0191】

実施形態１０ａは、定量的質量分析が、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。

【0192】

実施形態１０ｂは、定量的質量分析が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。

【0193】

実施形態１０ｃは、定量的質量分析が、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の方法である。

【0194】

実施形態１０ｄは、ＰＲＭが、ＥＳＩ－Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続されたＣ１８ナノＬＣを含む、実施形態１０ｃに記載の方法である。

【0195】

実施形態１１は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態１～１０ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0196】

実施形態１１ａは、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態１１に記載の方法である。

【0197】

実施形態１１ｃは、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態１～１０ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0198】

実施形態１１ｄは、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態１１ｃに記載の方法である。

【0199】

実施形態１２は、較正物質中の抗体の絶対量が、重量濃度又はモル濃度で表される、実施形態１～１１ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0200】

実施形態１２ａは、試料における抗体の絶対量が、重量濃度又はモル濃度で表される、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の方法である。

【0201】

実施形態１３は、ＲＳＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法が、
ｉ．ＲＳＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＲＳＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって、試料においてＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程と、を含む、方法である。

【0202】

実施形態１４は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの参照曲線を得ることを更に含み、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、実施形態１３に記載の方法である。

【0203】

実施形態１４ａは、対象が、健康な参加者又は患者である、実施形態１４又は１４ａに記載の方法である。

【0204】

実施形態１４ｂは、患者が、ＲＳＶ感染患者である、実施形態１４ａに記載の方法である。

【0205】

実施形態１４ｃは、プロテオタイピックペプチドの絶対量が、まず、プロテオタイピックペプチドの質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＲＳＶ抗原に特異的な抗体の絶対量が、プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態１３～１４ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0206】

実施形態１５は、ワクチンが、予防ワクチン又は治療ワクチンである、実施形態１３～１４ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0207】

実施形態１６は、抗原が、ＲＳＶ－Ｂ抗原、好ましくはＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原である、実施形態１３～１５のいずれか１つに記載の方法である。

【0208】

実施形態１７は、抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態１３～１６のいずれか１つに記載の方法である。

【0209】

実施形態１７ａは、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、実施形態１７に記載の方法である。

【0210】

実施形態１７ｂは、試料において抗体が、ＲＳＶ抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する、実施形態１７に記載の方法である。

【0211】

実施形態１８は、プロテオタイピックペプチドが、ＲＳＶ抗原に特異的な抗体において生じる、実施形態１３～１７ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0212】

実施形態１８ａは、プロテオタイピックペプチドが、ＲＳＶ抗原に特異的な抗体のＦｃ領域において生じる、実施形態１３～１８のいずれか１つに記載の方法である。

【0213】

実施形態１９は、試料が、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である、実施形態１３～１８ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0214】

実施形態１９ａは、試料が、生物学的試料の処理済み試料である、実施形態１９に記載の方法である。

【0215】

実施形態１９ｂは、生物学的試料が、遠心分離され、凍結され及び／又は解凍される、実施形態１９ａに記載の方法である。

【0216】

実施形態２０は、工程ｉｉが、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施形態１３～１９ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0217】

実施形態２１は、定量的質量分析が、タンデム質量分析である、実施形態１３～２０のいずれか１つに記載の方法である。

【0218】

実施形態２１ａは、定量的質量分析が、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含む、実施形態１３～２１のいずれか１つに記載の方法である。

【0219】

実施形態２１ｂは、定量的質量分析が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、実施形態１３～２１のいずれか１つに記載の方法である。

【0220】

実施形態２１ｃは、定量的質量分析が、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、実施形態１３～２１のいずれか１つに記載の方法である。

【0221】

実施形態２１ｄは、ＰＲＭが、ＥＳＩ－Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続されたＣ１８ナノＬＣを含む、実施形態２１ｃに記載の方法である。

【0222】

実施形態２２は、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態１３～２１ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0223】

実施形態２２ａは、プロテオタイピックペプチドのインタクト質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態２２に記載の方法である。

【0224】

実施形態２２ｂは、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態１３～２１ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0225】

実施形態２２ｃは、プロテオタイピックペプチドのフラグメント質量の質量応答をプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態２２ｂに記載の方法である。

【0226】

実施形態２３は、試料における抗体の絶対量が、重量濃度又はモル濃度で表される、実施形態１３～２２ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0227】

実施形態２４は、ＨＩＶ抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法が、
ｉ．ＨＩＶ抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＨＩＶ抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＨＩＶ抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法である。

【0228】

実施形態２４は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む、実施形態２３に記載の方法である。

【0229】

実施形態２５は、工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態２３又は２４に記載の方法である。

【0230】

実施形態２５ａは、工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態２３～２５のいずれか１つに記載の方法である。

【0231】

実施形態２５ｂは、試料中の抗体の絶対量が、抗体ＩｇＧ１、３、及び４の絶対量と抗体ＩｇＧ２の絶対量との合計である、実施形態２３～２５ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0232】

実施形態２６は、対象が、健康な参加者又は患者である、実施形態２３～２５ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0233】

実施形態２６ａは、患者が、ＨＩＶ感染患者である、実施形態２６に記載の方法である。

【0234】

実施形態２７は、ワクチンが、予防ワクチン又は治療ワクチンである、実施形態２３～２６ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0235】

実施形態２８は、抗原が、モザイクｇｐ１４０である、実施形態２３～２７のいずれか１つに記載の方法である。

【0236】

実施形態２９は、抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態２３～２８のいずれか１つに記載の方法である。

【0237】

実施形態２９ａは、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、実施形態２９に記載の方法である。

【0238】

実施形態２９ｂは、試料において抗体が、ＨＩＶ抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する、実施形態２９に記載の方法である。

【0239】

実施形態３０は、プロテオタイピックペプチドが、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体において生じる、実施形態２３～２９ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0240】

実施形態３０ａは、プロテオタイピックペプチドが、ＨＩＶ抗原に特異的な抗体のＦｃ領域において生じる、実施形態２３～３０のいずれか１つに記載の方法である。

【0241】

実施形態３１は、試料が、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である、実施形態２３～３０ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0242】

実施形態３１ａは、試料が、生物学的試料の処理済み試料である、実施形態３０に記載の方法である。

【0243】

実施形態３１ｂは、生物学的試料が、遠心分離され、凍結され及び／又は解凍される、実施形態３１ａに記載の方法である。

【0244】

実施形態３２は、工程ｉｉが、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施形態２３～３１ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0245】

実施形態３３は、定量的質量分析が、タンデム質量分析である、実施形態２３～３２のいずれか１つに記載の方法である。

【0246】

実施形態３３ａは、定量的質量分析が、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含む、実施形態２３～３３のいずれか１つに記載の方法である。

【0247】

実施形態３３ｂは、定量的質量分析が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、実施形態２３～３３のいずれか１つに記載の方法である。

【0248】

実施形態３３ｃは、定量的質量分析が、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、実施形態２３～３３のいずれか１つに記載の方法である。

【0249】

実施形態３３ｄは、ＰＲＭが、ＥＳＩ－Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続されたＣ１８ナノＬＣを含む、実施形態３３ｃに記載の方法である。

【0250】

実施形態３４は、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態２３～３３ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0251】

実施形態３４ａは、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態３４に記載の方法である。

【0252】

実施形態３４ｂは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態２３～３３ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0253】

実施形態３４ｃは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態３４ｂに記載の方法である。

【0254】

実施形態３５は、試料における抗体の絶対量が、重量濃度又はモル濃度で表される、実施形態２３～３４ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【0255】

実施形態３６は、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原を含むワクチンを投与された対象由来の試料中のＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する方法であって、方法が、
ｉ．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と抗原に結合した抗体とを含む１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を形成するために、試料をＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原と接触させる工程と、
ｉｉ．１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を単離する工程と、
ｉｉｉ．配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドと配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドとを含む第１の混合物を生成するために、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を消化する工程と、
ｉｖ．第２の混合物を生成するために、第１の混合物を液体クロマトグラフィー（ＬＣ）、好ましくは高速液体クロマトグラム（ＨＰＬＣ）に供する工程と、
ｖ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量スペクトルを生成するために、第２の混合物を定量的質量分析に供する工程と、
ｖｉ．質量スペクトルからプロテオタイピックペプチドの各々の質量応答を測定する工程と、
ｖｉｉ．プロテオタイピックペプチドの各々の質量応答をプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線と比較することによって、試料においてＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体の絶対量を判定する工程であって、参照曲線は、プロテオタイピックペプチドの質量分析応答をプロテオタイピックペプチドの絶対量に関連付ける、判定する工程と、を含む、方法である。

【0256】

実施形態３７は、工程ｉの前にプロテオタイピックペプチドの各々の参照曲線を得ることを更に含む、実施形態３６に記載の方法である。

【0257】

実施形態３８は、工程ｖｉｉにおいて、配列番号１のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ１、３及び４の絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態３６又は３７に記載の方法である。

【0258】

実施形態３８ａは、工程ｖｉｉにおいて、配列番号２のアミノ酸配列を有するプロテオタイピックペプチドの絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの質量応答を当該プロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することによって判定され、次いで、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体ＩｇＧ２の絶対量が、当該プロテオタイピックペプチドの絶対量に基づいて判定される、実施形態３６～３８のいずれか１つに記載の方法である。

【0259】

実施形態３８ｂは、試料中の抗体の絶対量が、抗体ＩｇＧ１、３、及び４の絶対量と抗体ＩｇＧ２の絶対量との合計である、実施形態３６～３８ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0260】

実施形態３９は、対象が、健康な参加者又は患者である、実施形態３６～３８ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0261】

実施形態３９ａは、患者が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２感染患者である、実施形態３９に記載の方法である。

【0262】

実施形態３９ｂは、抗原が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ Ｓである、実施形態３６～３９ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0263】

実施形態４０は、ワクチンが、予防ワクチン又は治療ワクチンである、実施形態３６～３９ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0264】

実施形態４１は、抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）のうちの１つ又は２つ以上を含む、実施形態３６～４０のいずれか１つに記載の方法である。

【0265】

実施形態４１ａは、ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４である、実施形態４１に記載の方法である。

【0266】

実施形態４１ｂは、試料において抗体が、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原の同じ又は異なるエピトープに結合する、実施形態４１に記載の方法である。

【0267】

実施形態４２は、プロテオタイピックペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体において生じる、実施形態３６～４１ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0268】

実施形態４２ａは、プロテオタイピックペプチドが、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原に特異的な抗体のＦｃ領域において生じる、実施形態３６～４２のいずれか１つに記載の方法である。

【0269】

実施形態４３は、試料が、血清、血漿又は別の生物学的流体試料、好ましくは血清である、実施形態３６～４２ａのいずれか１つに記載の方法である。

【0270】

実施形態４３ａは、試料が、生物学的試料の処理済み試料である、実施形態４３に記載の方法である。

【0271】

実施形態４３ｂは、生物学的試料が、遠心分離され、凍結され及び／又は解凍される、実施形態４３ａに記載の方法である。

【0272】

実施形態４４は、工程ｉｉが、１つ又は２つ以上のタンパク質複合体を変性させる工程、還元する工程、アルキル化する工程及び／又は希釈する工程のうちの１つ又は２つ以上を更に含む、実施形態３６～４３ｂのいずれか１つに記載の方法である。

【0273】

実施形態４５は、定量的質量分析が、タンデム質量分析である、実施形態３６～４４のいずれか１つに記載の方法である。

【0274】

実施形態４５ａは、定量的質量分析が、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）を含む、実施形態３６～４５のいずれか１つに記載の方法である。

【0275】

実施形態４５ｂは、定量的質量分析が、選択反応モニタリング（ＳＲＭ）を含む、実施形態３６～４５のいずれか１つに記載の方法である。

【0276】

実施形態４５ｃは、定量的質量分析が、並列反応モニタリング（ＰＲＭ）を含む、実施形態３６～４５のいずれか１つに記載の方法である。

【0277】

実施形態４５ｄは、ＰＲＭが、ＥＳＩ－Ｑ－Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計に接続されたＣ１８ナノＬＣを含む、実施形態４５ｃに記載の方法である。

【0278】

実施形態４６は、プロテオタイピックペプチドの各々のインタクト質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態３６～４５ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0279】

実施形態４６ａは、プロテオタイピックペプチドのそれぞれのインタクト質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態４６に記載の方法である。

【0280】

実施形態４６ｂは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を測定することを更に含む、実施形態３６～４５ｄのいずれか１つに記載の方法である。

【0281】

実施形態４６ｃは、プロテオタイピックペプチドの各々のフラグメント質量の質量応答を対応するプロテオタイピックペプチドの参照曲線と比較することを更に含む、実施形態４６ｂに記載の方法である。

【0282】

実施形態４７は、試料における抗体の絶対量が、重量濃度又はモル濃度で表される、実施形態３６～４６ｃのいずれか１つに記載の方法である。

【実施例】

【0283】

当業者は、広い発明概念から逸脱することなく、上で説明される実施形態に変更を行うことができることを理解するであろう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、本説明によって定義されるように本出願の趣旨及び範囲内の修正を包含することを意図するものと理解される。

【0284】

実施例１．ＲＳＶ抗原特異的ＩｇＧの絶対量の判定のためのプロテオタイピックペプチドの使用
本実施例は、定量的質量分析（ｑＭＳ）分析とＥＬＩＳＡとを組み合わせることによる、抗ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原（ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原についての配列番号１１）ＩｇＧ陽性ヒト血清における抗原特異的ＩｇＧ抗体の絶対量の判定のための、任意のヒトＩｇＧ１、３及び４について特異的なプロテオタイピックペプチドの使用を記載する。

【0285】

ＥＬＩＳＡ参照材料（ウイルス感染個体から単離されたプールされたＩｇＧ含有血清）のｑＭＳ分析における第１の工程は、プロテオタイピックペプチド、目的の特定のタンパク質（すなわち、ヒトＩｇＧ１、３及び４抗体）においてのみ生じるペプチドを選択することである。本発明の原理を証明するために、ヒトＩｇＧ１、３及び４のＦｃ領域について特異的なペプチド、すなわちＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１、Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｏｕｙａｎｇら２０１２；Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｚｈａｏら２０１３）を選択した。この特異的ペプチドの合成バージョンを得て、０．４～１０００ｐｇ／試料の範囲において既知濃度のプロテオタイピックペプチドを添加（「スパイク」）することにより、プロテオタイピックペプチドの較正曲線を作成することによって、その適合性を試験するために使用した。較正試料は、多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）においてＥＳＩ－ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄ質量分析計に接続された逆相液体クロマトグラフィーによって分析した。図１では、線形性は、ペプチドの質量分析ＭＳ２応答（Ｌｏｇ１０変換ピーク面積で報告されるペプチドのフラグメント質量）と添加ペプチドの既知濃度（Ｌｏｇ１０変換ｐｇ／試料で報告される）との間に観察されることができ、それによって、混合物におけるペプチドの量、その後のＩｇＧの量を定量的に判定するために使用するのに適切であるものにすることができる。したがって、この線形用量応答は、ｑＭＳ分析が試料混合物においてヒト抗ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質抗体の量を定量的に判定するために適切であることを確立する。

【0286】

通常の方法においてＲＳＶ－Ｂ Ｆ ＥＬＩＳＡを実行するときに（上記のように）、ＲＳＶ－Ｂ Ｆ特異的ヒト血清抗体（結果）の検出のための発光読み出しが使用される。この発光読み出しは、任意であり、相対発光量（ＲＬＵ）で測定される。結果を半定量的にするために、試料の結果は、ＥＵ／ｍｌで表される抗ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質ＩｇＧ陽性ヒト血清参照の比として表される。ＥＬＩＳＡにおけるＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質陽性ヒト血清参照の抗体結合を測定する、発光読み出しから得られた希釈曲線は、図２に示される。この曲線の直線部分（±１３５０～３２８０５０ＥＵ／ｍｌ）は、未知のヒト血清試料における免疫応答を定量するために、使用される。しかしながら、量は、任意の値である、１ｍｌ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍｌ）で表される。この値を絶対にするために、曲線は、質量分析によって測定される必要がある。

【0287】

ＥＵ／ｍＬにおける任意の値をｐｇ ＩｇＧ／ｍｌにおける絶対値に変換するために、ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の参照標準曲線試料を、質量分析によって測定した。これは、通常のＥＬＩＳＡの最初の２つの工程を実行することによって達成した：（１）ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質（配列番号１１）をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、かつ（２）抗ＲＳＶ－Ｂ Ｆタンパク質抗体陽性ヒト血清で生成された参照標準曲線試料を、ＥＬＩＳＡプレートに添加して異なる濃度を得た（図３参照）。その後、全ての非結合抗体を洗い流した。プレートに結合した残りの抗体及びタンパク質を除去し、８Ｍ尿素の添加によって変性させた。複数のウェルからの変性抗体及びタンパク質を、分析中の感度を増加させるために、ＲＳＶ－Ｂ Ｆ抗原陽性血清の濃度に基づいて、プールした（９６ウェルプレートのｎ＝１６ウェル）。抗体及びタンパク質の還元及びアルキル化後、抗体及びタンパク質を、２Ｍ尿素で希釈し、トリプシンを、３７℃で３時間消化のために添加した。最後に、試料を、固相抽出によって脱塩し、ＭＲＭモードにおいてＬＣ ＥＳＩ ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄ分析によって分析した。

【0288】

ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の線形部分からの異なる試料について得られたＭＳ２ピーク面積を、図１に示される曲線からの線形回帰の式を使用して、Ｌｏｇ１０変換ｐｇ ＩｇＧ／ｍｌに変換し、ＥＬＩＳＡにおける血清希釈係数によって乗算し、その後、ＥＵ／ｍＬにおける参照材料のＬｏｇ１０変換希釈に対してプロットした（表２及び図４を参照）。結果は、質量分析結果がまた、希釈曲線のこの部分において線形であることを示す。しかしながら、プロットのＹ軸上の任意の相対発光量（ＲＬＵ）で表される分光光度読み出しを得る代わりに、ここで、ｐｇ ＩｇＧ／ｍｌで表される抗原結合ＩｇＧの絶対量を示す。

【0289】

【表2】

【0290】

この時点から、図４で得られた式（１０Ｌｏｇ ｐｇ ＩｇＧ／ｍｌ＝（０．９３６７^＊１０Ｌｏｇ ＥＵ／ｍｌ）－１．６２０７）は、通常のＥＬＩＳＡからのＥＬＩＳＡ読み出し（ＥＵ／ｍｌで表される）をｐｇ ＩｇＧ／ｍｌで表されるＩｇＧの絶対量に変換するために、適用され得る。これは、ｐｇ ＩｇＧ／ｍｌで表される絶対量において、将来の発光ＥＬＩＳＡ希釈曲線において得られたＩｇＧ抗体の量を表すことを可能にする。ＥＬＩＳＡ読み出し値は実験依存的であり得るが、絶対ＩｇＧ量は、同一の設定及び材料又はブリッジングを通して分析的に等価であることが示されている材料を用いて実行された全ての実験について有効である。その後、全ての未知の血清試料は、標準ＥＬＩＳＡによって分析されることができ、読み出し（例えば、発光値）は、通常行われるように参照材料と比較して表されことができるが、ＩｇＧ濃度の単位は、ｐｇ ＩｇＧ／ｍｌで表される絶対値である。

【0291】

実施例２．ＨＩＶ抗原特異的ＩｇＧの絶対量の判定のためのプロテオタイピックペプチドの使用
本実施例は、定量的質量分析（ｑＭＳ）分析とＥＬＩＳＡとを組み合わせることによって、抗ＨＩＶ抗原（モザイクｇｐ１４０）ＩｇＧ陽性ヒト血清における抗原特異的ＩｇＧ抗体の絶対量の判定のための、任意のヒトＩｇＧ１、３及び４又はＩｇＧ２について特異的なプロテオタイピックペプチドの使用を記載する。

【0292】

この実施例では、２つのプロテオタイピックペプチド：第一に、ヒトＩｇＧ１、３及び４抗体について特異的である、実施例１にも記載されたペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）、第二に、ヒトＩｇＧ２に特異的なＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２、Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｏｕｙａｎｇら２０１２；Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｚｈａｏら２０１３）を選択した。これらの特異的ペプチドの合成バージョンを得て、１～１０００ｐｇ／分析試料の範囲において既知濃度のプロテオタイピックペプチドを添加（「スパイク」）することにより、プロテオタイピックペプチドの各々の較正曲線を作成することによって、それらの適合性を試験するために使用した。較正試料は、多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）においてＥＳＩ－ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄ質量分析計に接続された逆相液体クロマトグラフィーによって分析した。図５では、線形性は、両方のペプチドの質量分析ＭＳ２応答（Ｌｏｇ１０変換ピーク面積で報告されるペプチドのフラグメント質量）と添加ペプチドの既知濃度（Ｌｏｇ１０変換ｐｇ／試料で報告されるペプチド）との間に観察されることができ、それによって、混合物におけるペプチドの量、その後のＩｇＧの量を定量的に判定するために使用するのに適切であるものにすることができる。したがって、この線形用量応答は、ｑＭＳ分析が試料混合物においてヒト抗ＨＩＶ ＩｇＧ抗体の量を定量的に判定するために適切であることを確立する。

【0293】

通常の方法においてこのＨＩＶ ＥＬＩＳＡを実行するときに（上記のように）、ＨＩＶ特異的ヒト血清抗体（結果）の検出のために読み出された４５０ｎｍでの光学密度（ＯＤ４５０）は、使用される。このＯＤ４５０読み出しは、任意であり、吸収単位（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ｕｎｉｔ、ＡＵ）で測定される。結果を半定量的にするために、試料の結果は、ＥＵ／ｍｌで表される抗ＨＩＶタンパク質ＩｇＧ陽性ヒト血清参照の比として表される。ＥＬＩＳＡにおけるＨＩＶタンパク質陽性ヒト血清参照の抗体結合を測定する、ＯＤ４５０読み出しから得られた希釈曲線は、図６に示される。この曲線の直線部分（±１５０～３７０００ＥＵ／ｍＬ）は、未知のヒト血清試料における免疫応答を定量するために、使用される。しかしながら、量は、任意の値である、１ｍＬ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍＬ）で表される。この値を絶対にするために、曲線は、質量分析によって測定される必要がある。

【0294】

ＥＵ／ｍＬ単位の任意の値をμｇ ＩｇＧ／ｍＬにおける絶対値に変換するために、ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の参照標準曲線試料を、質量分析によって測定した。これは、通常のＥＬＩＳＡの最初の２つの工程実行することによって達成した：（１）モザイクｇｐ１４０抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、かつ（２）抗ＨＩＶタンパク質／抗原抗体陽性ヒト血清で生成された参照標準曲線試料を、ＥＬＩＳＡプレートに添加して異なる濃度を得た（図３参照）。その後、全ての非結合抗体を洗い流した。プレートに結合した残りの抗体及びタンパク質を除去し、８Ｍ尿素の添加によって変性させた。複数のウェルからの変性抗体及びタンパク質を、分析中の感度を増加させるために、ＨＩＶ抗原陽性血清の濃度に基づいて、プールした（９６ウェルプレートのｎ＝１６ウェル）。抗体及びタンパク質の還元及びアルキル化後、抗体及びタンパク質を、２Ｍ尿素で希釈し、トリプシンを、３７℃で３時間消化のために添加した。最後に、試料を、固相抽出によって脱塩し、ＭＲＭモードにおいてＬＣ ＥＳＩ ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄ分析によって分析した。

【0295】

ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の直線部分からの異なる試料について得られたＭＳ２ピーク面積を、図５に示されるＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２の曲線からの線形回帰の式を使用して、両方の選択されたペプチドについてそれぞれμｇ ＩｇＧ／ｍＬのＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２の絶対量に変換した。その後、ＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２値を、各ＥＬＩＳＡ参照標準曲線点についての総ＩｇＧ濃度を得るために、合計した。最後に、得られた総ＩｇＧ値を、Ｌｏｇ１０変換し、ＥＬＩＳＡにおける血清希釈係数によって乗算し、ＥＵ／ｍＬ単位における参照材料のＬｏｇ１０変換希釈に対してプロットした（表３及び図７を参照）。結果は、質量分析結果がまた、希釈曲線のこの部分において線形であることを示す。しかしながら、プロットのＹ軸上の任意の相対ＯＤ４５０単位（ＡＵ）で表される分光光度読み出しを得る代わりに、ここで、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される抗原結合ＩｇＧの絶対量を示す。

【0296】

【表3】

【0297】

この時点から、図７で得られた式（１０Ｌｏｇμｇ ＩｇＧ／ｍＬ＝（０．４２０^＊１０Ｌｏｇ ＥＵ／ｍＬ）＋０．４０６）は、通常のＥＬＩＳＡからのＥＬＩＳＡ読み出し（ＥＵ／ｍＬで表される）をμｇ ＩｇＧ／ｍＬで表されるＩｇＧの絶対量に変換するために、適用され得る。これは、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される絶対量において、将来の光学密度ＥＬＩＳＡ希釈曲線において得られたＩｇＧ抗体の量を表すことを可能にする。ＥＬＩＳＡ読み出し値は実験依存的であり得るが、絶対ＩｇＧ量は、同一の設定及び材料又はブリッジングを通して分析的に等価であることが示されている材料を用いて実行された全ての実験について有効である。その後、全ての未知の血清試料は、標準ＥＬＩＳＡによって分析されることができ、読み出し（例えば、発光値）は、通常行われるように参照材料と比較して表され得るが、ＩｇＧ濃度の単位は、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される絶対値である。

【0298】

実施例３．ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原特異的ＩｇＧの絶対量の判定のためのプロテオタイピックペプチドの使用
本実施例は、定量的質量分析（ｑＭＳ）分析とＥＬＩＳＡとを組み合わせることによって、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２陽性ヒト血清における抗原特異的ＩｇＧ抗体の絶対量の判定のための、任意のヒトＩｇＧ１、３及び４又はＩｇＧ２について特異的なプロテオタイピックペプチドの使用を記載する。

【0299】

この実施例では、２つのプロテオタイピックペプチド：第一に、ヒトＩｇＧ１、３及び４抗体について特異的である、実施例１にも記載されたペプチドＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号１）、第二に、ヒトＩｇＧ２に特異的なＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫ（配列番号２、Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｏｕｙａｎｇら２０１２；Ｆｕｒｌｏｎｇ、Ｚｈａｏら２０１３）を選択した。これらの特異的ペプチドの合成バージョンを得て、１～１０００ｐｇ／分析試料の範囲において既知濃度のプロテオタイピックペプチドを添加（「スパイク」）することにより、プロテオタイピックペプチドの各々の較正曲線を作成することによって、それらの適合性を試験するために使用した。較正試料は、多重反応モニタリングモード（ＭＲＭ）においてＥＳＩ－ｔｒｉｐｌｅ ｑｕａｄ質量分析計に接続された逆相液体クロマトグラフィーによって分析した。図８では、線形性は、両方のペプチドの質量分析ＭＳ２応答（Ｌｏｇ１０変換ピーク面積で報告されるペプチドのフラグメント質量）と添加ペプチドの既知濃度（Ｌｏｇ１０変換ｐｇ／試料で報告されるペプチド）との間に観察されることができ、それによって、混合物におけるペプチドの量、その後のＩｇＧの量を定量的に判定するために使用するのに適切であるものにすることができる。したがって、この線形用量応答は、ｑＭＳ分析が試料混合物においてヒト抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＩｇＧ抗体の量を定量的に判定するために適切であることを確立する。

【0300】

通常の方法においてこのＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２ ＥＬＩＳＡを実行するときに（上記のように）、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２特異的ヒト血清抗体（結果）の検出のための発光読み出しは、使用される。この発光読み出しは、任意であり、相対発光量（ＲＬＵ）で測定される。結果を半定量的にするために、試料の結果は、ＥＵ／ｍｌで表される抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質ＩｇＧ陽性ヒト血清参照の比として表される。ＥＬＩＳＡにおけるＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質陽性ヒト血清参照の抗体結合を測定する、発光読み出しから得られた希釈曲線は、図９に示される。この曲線の直線部分（±４５０～３３０００ＥＵ／ｍＬ）は、未知のヒト血清試料における免疫応答を定量するために、使用される。しかしながら、量は、任意の値である、１ｍＬ当たりのＥＬＩＳＡ単位（ＥＵ／ｍＬ）で表される。この値を絶対にするために、曲線は、質量分析によって測定される必要がある。

【0301】

ＥＵ／ｍＬ単位の任意の値をμｇ ＩｇＧ／ｍＬにおける絶対値に変換するために、ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の参照標準曲線試料を、質量分析によって測定した。これは、通常のＥＬＩＳＡの最初の２つの工程を実行することによって達成した：（１）ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原をＥＬＩＳＡプレートにコーティングし、かつ（２）抗ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２タンパク質／抗原抗体陽性ヒト血清で生成された参照標準曲線試料を、ＥＬＩＳＡプレートに添加して異なる濃度を得た（図３参照）。その後、全ての非結合抗体を洗い流した。プレートに結合した残りの抗体及びタンパク質を除去し、８Ｍ尿素の添加によって変性させた。複数のウェルからの変性抗体及びタンパク質を、分析中の感度を増加させるために、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２抗原陽性血清の濃度に基づいて、プールした（９６ウェルプレートのｎ＝１６ウェル）。抗体及びタンパク質の還元及びアルキル化後、抗体及びタンパク質を、２Ｍ尿素で希釈し、トリプシンを、３７℃で３時間消化のために添加した。最後に、試料を、固相抽出によって脱塩し、ＭＲＭモードにおいてＬＣ ＥＳＩ ｔｒｉｐｌｅｑｕａｄ分析によって分析した。

【0302】

ＥＬＩＳＡ参照標準曲線の直線部分からの異なる試料について得られたＭＳ２ピーク面積を、図８に示される曲線からのＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２についての線形回帰の式を使用して、両方の選択されたペプチドについてそれぞれμｇ ＩｇＧ／ｍＬのＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２の絶対量に変換した。その後、ＩｇＧ１、３、及び４並びにＩｇＧ２値を、各ＥＬＩＳＡ参照標準曲線点についての総ＩｇＧ濃度を得るために、合計した。最後に、得られた総ＩｇＧ値を、Ｌｏｇ１０変換し、ＥＬＩＳＡにおける血清希釈係数によって乗算し、ＥＵ／ｍＬ単位における参照材料のＬｏｇ１０変換希釈に対してプロットした（表４及び図１０を参照）。結果は、質量分析結果がまた、希釈曲線のこの部分において線形であることを示す。しかしながら、プロットのＹ軸上の任意の相対発光で表される分光光度読み出しを得る代わりに、ここで、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される抗原結合ＩｇＧの絶対量を示す。

【0303】

【表4】

【0304】

この時点から、図１０で得られた式（１０Ｌｏｇμｇ ＩｇＧ／ｍＬ＝（０．８５７^＊１０Ｌｏｇ ＥＵ／ｍＬ）－２．００）は、通常のＥＬＩＳＡからのＥＬＩＳＡ読み出し（ＥＵ／ｍＬで表される）をμｇ ＩｇＧ／ｍＬで表されるＩｇＧの絶対量に変換するために、適用され得る。これは、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される絶対量において、将来の光学密度ＥＬＩＳＡ希釈曲線において得られたＩｇＧ抗体の量を表すことを可能にする。ＥＬＩＳＡ読み出し値は実験依存的であり得るが、絶対ＩｇＧ量は、同一の設定及び材料又はブリッジングを通して分析的に等価であることが示されている材料を用いて実行された全ての実験について有効である。その後、全ての未知の血清試料は、標準ＥＬＩＳＡによって分析されることができ、読み出し（例えば、発光値）は、通常行われるように参照材料と比較して表され得るが、ＩｇＧ濃度の単位は、μｇ ＩｇＧ／ｍＬで表される絶対値である。

【0305】

本明細書に記載された実施例及び実施形態は、例示のみを目的としたものであり、上述の実施形態に対する変更は、その広範な発明概念から逸脱することなくなされ得ることが理解される。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に制限されず、添付の特許請求の範囲によって定義されるような本発明の趣旨及び範囲内の修正をも包含することを意図するものと理解される。

【0306】

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【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【配列表】

2024508227000001.app

【国際調査報告】