特表 2024-508302 組換え免疫細胞療法

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-26

(54)【発明の名称】組換え免疫細胞療法

(51)【国際特許分類】

   C12N 5/10 20060101AFI20240216BHJP

   C12N 5/078 20100101ALI20240216BHJP

   C07K 19/00 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 5/0783 20100101ALI20240216BHJP

   A61K 48/00 20060101ALI20240216BHJP

   A61K 35/17 20150101ALI20240216BHJP

   A61K 35/28 20150101ALI20240216BHJP

   A61K 35/545 20150101ALI20240216BHJP

   A61K 38/19 20060101ALI20240216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240216BHJP

   A61P 35/02 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 15/09 20060101ALN20240216BHJP

   C12N 15/13 20060101ALN20240216BHJP

   C07K 14/74 20060101ALN20240216BHJP

   C12N 15/12 20060101ALN20240216BHJP

   C12N 15/62 20060101ALN20240216BHJP

   C07K 14/705 20060101ALN20240216BHJP

   C07K 16/00 20060101ALN20240216BHJP

   C07K 16/30 20060101ALN20240216BHJP

   C12N 15/55 20060101ALN20240216BHJP

【ＦＩ】

C12N5/10

C12N5/078 ZNA

C07K19/00

C12N5/0783

A61K48/00

A61K35/17

A61K35/28

A61K35/545

A61K38/19

A61P35/00

A61P35/02

C12N15/09 100

C12N15/13

C07K14/74

C12N15/12

C12N15/62 Z

C07K14/705

C07K16/00

C07K16/30

C12N15/55

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553130

(86)(22)【出願日】2022-03-04

(85)【翻訳文提出日】2023-10-27

(86)【国際出願番号】 US2022019020

(87)【国際公開番号】W WO2022187704

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/157,332

(32)【優先日】2021-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】514141673

【氏名又は名称】ファクター バイオサイエンス インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100079108

【弁理士】

【氏名又は名称】稲葉 良幸

(74)【代理人】

【識別番号】100109346

【弁理士】

【氏名又は名称】大貫 敏史

(74)【代理人】

【識別番号】100117189

【弁理士】

【氏名又は名称】江口 昭彦

(74)【代理人】

【識別番号】100134120

【弁理士】

【氏名又は名称】内藤 和彦

(72)【発明者】

【氏名】エンジェル，マシュー

(72)【発明者】

【氏名】ローデ，クリストファー

(72)【発明者】

【氏名】コパチ，ミッチェル

(72)【発明者】

【氏名】ハリス，ジャスミン

(72)【発明者】

【氏名】パン，ジェームス

【テーマコード（参考）】

4B065

4C084

4C087

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA24

4B065CA25

4B065CA44

4C084AA02

4C084AA13

4C084BA44

4C084CA53

4C084NA14

4C084ZB261

4C084ZB271

4C087AA01

4C087AA02

4C087BB43

4C087BB44

4C087CA12

4C087NA14

4C087ZB26

4C087ZB27

4H045BA10

4H045BA41

4H045CA40

4H045DA50

4H045DA76

4H045DA89

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、部分的には、とりわけ、宿主免疫応答を抑制された組換え免疫細胞に関する。
【選択図】図３

【特許請求の範囲】

【請求項1】

ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含む単離免疫細胞を含む組成物であって、前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記組成物。

【請求項2】

前記免疫細胞が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の、実質的に全てのコピー全ての、遺伝子組み換えによる破壊を含む、請求項１に記載の組成物。

【請求項3】

前記免疫細胞が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の機能喪失を有する、請求項１または２に記載の組成物。

【請求項4】

前記免疫細胞が、任意選択で、前記免疫細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで引き起こされる、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方のアレルの機能喪失を有する、請求項１～３に記載の組成物。

【請求項5】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子の前記遺伝子組み換えによる破壊が、ヒトＢ２Ｍのエクソン３に存在する、請求項１～４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項6】

前記Ｂ２Ｍ遺伝子の前記遺伝子組み換えによる破壊が欠失である、請求項１～５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項7】

前記欠失が、約１０～約２０ヌクレオチドである、請求項６に記載の組成物。

【請求項8】

前記欠失が、約１４ヌクレオチドである、請求項７に記載の組成物。

【請求項9】

前記欠失が、前記ヒトＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド５００～５５０付近にある、請求項７または８に記載の組成物。

【請求項10】

前記欠失が、配列ＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号２）、または、その機能的等価物のものである、請求項９に記載の組成物。

【請求項11】

前記免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現及び／または活性が下方制御されている、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項12】

前記免疫細胞が、対象への投与の際に、宿主免疫系により実質的に認識されない、請求項１～１１のいずれか１つに記載の組成物。

【請求項13】

前記免疫細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含まない免疫細胞と比較して、宿主Ｔ細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている、請求項１～１２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項14】

前記免疫細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含む別の免疫細胞と比較して、他の宿主免疫細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている、請求項１～１３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項15】

前記免疫細胞がステルス細胞である、請求項１～１４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項16】

前記免疫細胞は、宿主免疫細胞のフラトリサイド、例えば、ＮＫ細胞のフラトリサイドが低下している、または取り除かれている、請求項１～１５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項17】

前記免疫細胞が自己活性化可能である、請求項１～１６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項18】

前記免疫細胞は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、自己活性化可能である、請求項１７に記載の組成物。

【請求項19】

前記免疫細胞が腫瘍細胞傷害性を誘発可能である、請求項１～１８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項20】

前記免疫細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、腫瘍細胞傷害性を誘発可能である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項21】

前記免疫細胞が、ＭＨＣ ＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊をさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項22】

前記免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ発現及び／または活性が下方制御されている、請求項２１に記載の組成物。

【請求項23】

前記免疫細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項24】

前記免疫細胞が、Ｂ２Ｍポリペプチド、ならびに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、融合タンパク質を発現する、請求項１～２３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項25】

前記融合タンパク質が、修復鋳型を、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の一本鎖または二本鎖切断に挿入することにより発現し；前記修復鋳型が、前記Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ遺伝子用のコード配列を含む、請求項２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記融合タンパク質が、免疫細胞により発現した、内因性Ｂ２Ｍ及びＨＬＡペアを置き換えることにより、前記免疫細胞が宿主免疫細胞により減少する、または取り除かれる可能性を低くする、請求項２４及び２５に記載の組成物。

【請求項27】

前記免疫細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含まない、請求項１～２６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項28】

前記遺伝子組み換えによる変異が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる低下または除去である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項29】

前記遺伝子組み換えによる変異が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる増加である、請求項１～２７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項30】

前記免疫細胞、任意選択でＮＫ細胞を遺伝子組み換えし、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む、組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項31】

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有ドメインを含む、請求項３０に記載の組成物。

【請求項32】

前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のうちの１つに由来する、請求項３０または３１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項33】

前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８またはＣＤ８の１つに由来する、請求項３０～３２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項34】

前記抗原結合領域が、１つの抗原に結合する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項35】

前記抗原結合領域が、２つの抗原に結合する、請求項３０～３３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項36】

抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
を含む、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項37】

抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
のうちの２つを含む、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項38】

抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、及び
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
のそれぞれのうちの１つを含む、請求項３０～３５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項39】

前記抗原結合領域が腫瘍抗原に結合する、請求項３０～３８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項40】

前記抗原結合領域が、
ａ．腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡ－Ｅに結合する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ａ；
ｂ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５に結合するＣＤ９６；
ｃ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＴＩＧＩＴ；
ｄ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＤＮＡＭ－１；
ｅ．腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡクラスＩに結合するＫＩＲ；
ｆ．腫瘍細胞上で任意選択でＮＫＧ２Ｄ－Ｌに結合するＮＫＧ２Ｄ；
ｇ．任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６ａであって、及び／または、前記ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、前記ＣＤ１６ａ；
ｈ．腫瘍細胞上で任意選択でＢ７－Ｈ６に結合するＮＫｐ３０；
ｉ．ＮＫｐ４４；ならびに
ｊ．ＮＫｐ４６
のうちの１つ以上を含む、請求項３０～３９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項41】

前記抗原結合領域が、免疫グロブリンドメイン、任意選択で、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２ ＨＬＡクラスＩ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｌ、またはＢ７－Ｈ６に対して向けられるｓｃＦｖを含む、請求項３０～４０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項42】

前記抗原結合領域が、ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原に結合する、請求項３０～４１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項43】

前記抗原結合領域が２つの抗原に結合し、前記抗原が、
ａ．ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原、ならびに
ｂ．ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原
である、請求項３０～４２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項44】

前記組換えＣＡＲの前記細胞外ドメインが、ＮＫ細胞活性化受容体またはｓｃＦｖの細胞外ドメインを含む、請求項３０～４３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項45】

前記免疫細胞が、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における遺伝子編集を含む、請求項３０～４４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項46】

ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における前記遺伝子編集が、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる、請求項４５に記載の組成物。

【請求項47】

前記遺伝子編集が、ＩＬ－６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及び／またはＨＰＫ１の発現及び／または活性の低下または除去を引き起こす、請求項４６に記載の組成物。

【請求項48】

前記遺伝子編集が、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び／またはＴＲＡＩＬの発現及び／または活性の増加を引き起こす、請求項４６に記載の組成物。

【請求項49】

前記リンパ系細胞がＴ細胞である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項50】

前記Ｔ細胞がガンマ－デルタＴ細胞である、請求項４９に記載の組成物。

【請求項51】

前記リンパ系細胞がＮＫ細胞である、請求項１～４８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項52】

前記ＮＫ細胞がＮＫ－Ｔ細胞である、請求項５１に記載の組成物。

【請求項53】

前記ＮＫ細胞がヒト細胞である、請求項５１に記載の組成物。

【請求項54】

前記ＮＫ細胞が、対象の体細胞に由来する、請求項５１～５３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項55】

前記ＮＫ細胞が、同種異系または自己由来細胞に由来する、請求項５１～５４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項56】

前記ＮＫ細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来する、請求項５１～５５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項57】

前記ｉＰＳが、体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることにより誘導され、前記リプログラムすることが、前記ｉＰＳ細胞を、任意選択で、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４から選択される、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、請求項５６に記載の組成物。

【請求項58】

前記リプログラムすることが、前記ｉＰＳ細胞を、各Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４をコードする１つ以上のＲＮＡと接触させることを含む、請求項５７に記載の組成物。

【請求項59】

前記ｉＰＳ細胞が、同種異系または自己由来細胞に由来する、請求項５６または５７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項60】

前記Ｂ２Ｍの上記遺伝子組み換えによる破壊が遺伝子編集を含み、前記遺伝子編集が、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる、請求項１～５９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項61】

前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６及びＣＤ１６のうちの１つ以上を発現する、請求項１～６０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項62】

前記ＮＫ細胞が、任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６ａであって、及び／または、前記ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、前記ＣＤ１６ａを発現する、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

前記ＮＫ細胞がＣＤ３を発現しない、請求項１～６２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項64】

前記ＮＫ細胞がＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＣＤ１６^{ｄｉｍ／－}である、請求項１～６３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項65】

前記ＮＫ細胞がＣＤ５６^ｄｉｍ ＣＤ１６＋である、請求項１～６４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項66】

前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞、またはＣＤ２７－ ＣＤ１１ｂ－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｔｏｌｅｒａｎｔ}細胞である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項67】

前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞、またはＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２７－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ}細胞である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項68】

前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞、またはＣＤ２７＋ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ}細胞である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項69】

前記ＮＫ細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、請求項１～６５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項70】

前記ＮＫ細胞が、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ－ｂ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、及び、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂ（ＭＩＰ－１ｂ）から選択される１つ以上のサイトカインを分泌する、請求項１～６９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項71】

前記ＮＫ細胞が、自殺遺伝子産物をコード可能な１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、請求項１～７０のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項72】

前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼ及びアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、請求項７１に記載の組成物。

【請求項73】

前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質または天然もしくは組換えバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、これらの断片もしくは融合構築物から選択される、請求項６０～７２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項74】

前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、請求項２～７３のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項75】

前記ＲＮＡが修飾ｍＲＮＡである、請求項７４に記載の組成物。

【請求項76】

前記修飾ｍＲＮＡが、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む、請求項７５に記載の組成物。

【請求項77】

前記非標準ヌクレオチドが、ピリミジンに対して、２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される、または、プリンに対して、６Ｃ位、７Ｎ位、及び８Ｃ位から選択される位置において、１つ以上の置換を有する、請求項７６に記載の組成物。

【請求項78】

前記非標準ヌクレオチドが、任意選択で、前記非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％の量で、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－ホルミルシュードウリジン、及び５－メトキシシュードウリジンのうちの１つ以上を含む、請求項７６または７７のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項79】

前記ＲＮＡが、５’キャップ構造を含む、請求項２～７８のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項80】

前記ＲＮＡ ５’－ＵＴＲが、コザックコンセンサス配列を含む、請求項２～７９のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項81】

前記ＲＮＡ ５’－ＵＴＲが、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、前記５’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビン５’－ＵＴＲを含むことができる、請求項８０に記載の組成物。

【請求項82】

前記ＲＮＡ ３’－ＵＴＲが、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、前記３’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビン３’－ＵＴＲを含むことができる、請求項２～８１のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項83】

前記ＲＮＡが、３’ポリ（Ａ）テールを含む、請求項２～８２のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項84】

前記ＲＮＡ３’ポリ（Ａ）テールが、約２０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である、請求項８３に記載の組成物。

【請求項85】

前記ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である、請求項２～８４のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項86】

前記ＲＮＡが、インビトロ転写により調製される、請求項２～８５のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項87】

前記骨髄細胞がマクロファージである、請求項１～８６のいずれか１項に記載の組成物。

【請求項88】

前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである、請求項８７に記載の組成物。

【請求項89】

先行請求項のいずれかに記載の単離ＮＫ細胞を含む、医薬組成物。

【請求項90】

組換え免疫細胞の作製方法であって、
ａ．体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることであって、前記リプログラムすることは、前記ｉＰＳ細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、前記リプログラムすることと、
ｂ．前記ｉＰＳ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を破壊することであって、前記破壊することは、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、前記細胞を遺伝子編集することを含む、前記破壊することと、
ｃ．前記ｉＰＳ細胞を免疫細胞に分化させることと、を含み、
ｄ．前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記方法。

【請求項91】

前記免疫細胞がＮＫ細胞である、請求項９０に記載の方法。

【請求項92】

前記ＮＫ細胞がＮＫ－Ｔ細胞である、請求項９１に記載の方法。

【請求項93】

前記ＮＫ細胞がヒト細胞である、請求項９１または９２に記載の方法。

【請求項94】

前記リンパ系細胞がＴ細胞である、請求項９０に記載の方法。

【請求項95】

前記Ｔ細胞がガンマ－デルタＴ細胞である、請求項９４に記載の方法。

【請求項96】

前記骨髄細胞がマクロファージである、請求項９０に記載の方法。

【請求項97】

前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである、請求項９６に記載の方法。

【請求項98】

前記体細胞が線維芽細胞またはケラチノサイトである、請求項９０～９７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項99】

前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、ｉＰＳ細胞の増殖速度の増加をもたらす、請求項９０～９８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項100】

前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の増殖速度の増加をもたらす、請求項９０～９９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項101】

前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の拡大の増加をもたらす、請求項９０～１００のいずれか１つに記載の方法。

【請求項102】

前記分化が、胚様体に基づく造血関与を含む、請求項９０～１０１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項103】

前記分化が、ＣＤ３４＋細胞の濃縮を含む、請求項９０～１０２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項104】

前記分化が、ＣＤ５＋／ＣＤ７＋一般リンパ系前駆細胞への分化を含む、請求項９０～１０３のいずれか１項に記載の方法。

【請求項105】

前記方法が、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＣＤ１６＋ＮＫ細胞をもたらす、請求項９０～１０４のいずれか１項に記載の方法。

【請求項106】

前記ＲＮＡが、表Ａ及び／または式Ｉ－ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と会合している、請求項９０～１０５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項107】

前記免疫細胞が、請求項１～８６のいずれか１項に記載の細胞である、請求項９０～１０６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項108】

がんの処置方法であって、
ａ．Ｂ２Ｍ遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手することと、
ｂ．前記単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
ｃ．前記免疫細胞が、リンパ系細胞またはＣＡＲ骨髄細胞である、前記方法。

【請求項109】

前記免疫細胞がＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞、例えばＮＫ－Ｔ細胞；またはマクロファージ、例えばＭ１マクロファージもしくはＭ２マクロファージ、及びＮＫ細胞である、請求項１０８に記載の方法。

【請求項110】

前記がんが血液癌である、請求項１０８または１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項111】

前記がんが充実性腫瘍である、請求項１０８または１０９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項112】

前記がんが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳癌及び中枢神経系癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化器癌を含む）；膠芽腫；肝細胞癌；肝癌；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ ＮＨＬ）；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他のがん腫及び肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーシス、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連するもの）、及びメーグス症候群に関連する異常な血管増殖から選択される、請求項１０８～１１１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項113】

前記免疫細胞が、請求項１～８６のいずれか１項に記載の細胞である、請求項１０８～１１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項114】

ＣＤ１６ａ遺伝子に遺伝子編集を含む単離免疫細胞を含む組成物であって、前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記組成物。

【請求項115】

前記遺伝子編集が、前記ＣＤ１６ａを、ＣＤ１６ａの高親和性バリアントに形質転換させる、請求項１１４に記載の組成物。

【請求項116】

前記遺伝子編集が、１５８位に、フェニルアラニンのバリンへの置換（Ｆ１５８Ｖ）を導入する、請求項１１４または１１５に記載の組成物。

【請求項117】

前記細胞が、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、請求項１１６に記載の組成物。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本開示は、宿主免疫系による認識及び／またはクリアランスを逃れる、組換え免疫細胞に関する。

【0002】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月５日に出願された米国仮特許出願第６３／１５７，３３２号の利益を主張し、上述の特許出願の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれている。

【背景技術】

【0003】

自己由来キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）療法などの、自己由来組換え細胞療法は、血液がんの処置に革命を起こしたが、これらは製造時間及び変動性、リンパ球枯渇の要件、ならびに、サイトカイン放出に関連する副作用によって限界がある。遺伝子編集された人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に由来する、同種異系の細胞療法が、自己由来組換え細胞療法に関連する課題に取り組むために開発されている。これらの「オフザシェルフ」細胞療法は、免疫拒絶を軽減し、向上した治療特性及びより大きな安全性を付与するように設計された、特異的編集物を含有する。しかし、ｉＰＳＣ中の画定される座位を、効率的で形跡を残さず、両アレル標的することは、現在の遺伝子編集アプローチでは技術的に課題が残っている。

【0004】

さらに、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、インビトロ及びインビボの両方で、多種多様の細胞型に速やかに分化するものの、機能性細胞の純粋な集団を確実に入手する、指向された分化手順の開発は、特に、リンパ系または骨髄系列の細胞に分化する際に困難であることが証明されている。ｉＰＳＣ由来の機能性免疫細胞を生成することは、免疫腫瘍学用途のための、オフザシェルフ組換え細胞療法の開発を支える上で特に興味深い。

【0005】

実用的な方法で組み換え及び産生可能な細胞療法を生成するための、改善された組成物及び方法が必要とされている。

【発明の概要】

【0006】

したがって、本開示は、細胞療法用の組成物及び方法、例えば、宿主免疫系による認識及び／またはクリアランスを逃れ、故に、対象の免疫応答により低下しない、または失われない治療効果を有する組換え免疫細胞に関する。

【0007】

一態様では、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊、例えば、任意選択で、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方のアレルにおける機能喪失を含む、単離免疫細胞であって、上記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記免疫細胞を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。実施形態では、免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現及び／または活性が下方制御されている。実施形態では、免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊を含む別の免疫細胞と比較して、Ｔ細胞または他の免疫細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている。実施形態では、免疫細胞は、免疫細胞のフラトリサイド、例えば、ＮＫ細胞のフラトリサイドが低下している、または取り除かれている。実施形態では、免疫細胞はステルス細胞であり、例えば、免疫細胞は、対象への投与の際に、免疫系により実質的に認識されない。

【0008】

場合によっては、免疫細胞は、Ｂ２Ｍポリペプチド、ならびに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、修復鋳型を、Ｂ２Ｍ遺伝子の一本鎖または二本鎖切断に挿入することにより発現することができる；場合によっては、修復鋳型は、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ遺伝子用のコード配列を含む。特に、融合タンパク質は、免疫細胞により発現した、内因性Ｂ２Ｍ及びＨＬＡペアを置き換えることにより、免疫細胞が宿主免疫細胞により減少する、または取り除かれる可能性を低くする。

【0009】

実施形態では免疫細胞、任意選択でＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子組み換えし、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む、組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。実施形態では、免疫細胞、任意選択でＴ細胞またはＮＫ細胞を組み換え、ＲＯＲ１及び／またはＣＤ１９に向けさせる。

【0010】

実施形態では、本細胞、例えば、Ｂ２Ｍノックアウト免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージは、（ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインが存在しない中においても）自己殺傷活性、そしてむしろ自己活性化活性が実質的に低下している、または消失している。さらに、本細胞、例えば、Ｂ２Ｍノックアウト免疫、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージは、（ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインが存在しない中においても）殺腫瘍活性を有し、予想外の拡大及び増殖特性を有する。

【0011】

別の態様では、組換え免疫細胞の作製方法であって、（ａ）体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることであって、上記リプログラムすることは、上記ｉＰＳ細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、上記リプログラムすることと、（ｂ）上記ｉＰＳ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を破壊することであって、上記破壊することは、上記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、上記細胞を遺伝子編集することを含む、上記破壊することと、（ｃ）上記ｉＰＳ細胞を免疫細胞に分化させることと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0012】

別の態様では、がんの処置方法であって、（ａ）Ｂ２Ｍ遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手することと、（ｂ）上記単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。免疫細胞はさらに遺伝子組み換えされ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現することができる。

【0013】

本開示のさらなる態様及び利点は、本開示の例示的な実施形態のみを示し説明する以下の詳細な説明から当業者には容易に明らかになるであろう。理解されるように、本開示は、他の及び異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、全て本開示から逸脱することなく、様々な明らかな点で変更が可能である。図面及び説明は、本質的に例示とみなし、制限とはみなさないものとする。具体的な組成物及び／または方法に関する、本明細書におけるいかなる説明も、本明細書で開示する、任意の他の具体的な組成物及び／または方法に適用され、また、これらに対して使用することができる。さらに、本明細書で開示する任意の組成物は、本明細書で開示する任意の方法に適用することができる。換言すると、本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1A】本開示のｍＲＮＡベースのリプログラミング及び遺伝子編集、その後の分化の非限定的な概略図を示す。

【図1B】がん細胞を殺傷する分化した細胞を示す。

【図2】ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）に対する遺伝子編集スキームの設計を示す；以下の配列を示す：ＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡ（配列番号５０）、ＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号５１）、ＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡ（配列番号５２）。

【図3】Ｂ２Ｍの遺伝子編集を示すＲＮＡゲルを示す。

【図4】遺伝子編集Ｂ２Ｍからの、１４個の塩基対欠失を示す配列決定実験を示す；下から上への以下の配列を示す：ＡＣＡＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号５５）、ＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧ（配列番号５４）、及びＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＧＴ（配列番号５３）。

【図5】ＩＦＮガンマ活性化を伴う、または伴わない、Ｂ２ＭのＲＮＡレベルを示す（「ＩＦＮＹ」；左の２つの棒はＢ２Ｍノックアウトであり、右の２つの棒はナイーブ細胞である）。

【図6】ＣＤ１６ａの（Ｇ１４７Ｄ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ４４３０８２、Ｙ１５８Ｈ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ３９６７１６、及び、Ｆ１７６Ｖ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ３９６９９１における）ヘテロ接合性を示す配列決定実験を示す；上から下への以下の配列を示す：ＧＫＧＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＨＩＰＫＡＴＬＫＤＳ（配列番号５６）、ＧＫＤＲＫＹＦＨＨＮＳＤＦＹＩＰＫＡＴＬＫＤＳ（配列番号５７）、ＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＦＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮ（配列番号５８）、及びＫＤＳＧＳＹＦＣＲＧＬＶＧＳＫＮＶＳＳＥＴＶＮ（配列番号５９）。

【図7】Ａ及びＢは、Ｋ－５６２腫瘍細胞との共培養における、対照（ＰＭＢＣ単離）ＮＫ細胞の画像を示し、腫瘍細胞のＮＫ細胞傷害性を示す（免疫学的血栓形成、または「クランピング」と表す）。

【図8】Ａ及びＢは、Ｋ－５６２腫瘍細胞との共培養における、本開示の遺伝子編集及び分化細胞（例えば、Ｂ２ＭノックアウトＮＫ細胞）の画像を示し、腫瘍細胞のＮＫ細胞傷害性を示す（免疫学的血栓形成、または「クランピング」と表す）。

【図9A】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。インターフェロンガンマを示す。

【図9B】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＩＬ－２を示す。

【図9C】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＩＬ－７を示す。

【図9D】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＩＬ－１３を示す。

【図9E】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＭＩＰ－１ａを示す。

【図9F】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＭＩＰ－１ｂを示す。

【図9G】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＴＮＦａを示す。

【図9H】Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いるサイトカイン放出アッセイの結果を示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、ＰＢＭＣ－ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。ＧＭ－ＣＳＦを示す。

【図10A】実施例で記載する、本開示の遺伝子編集及び分化細胞（例えば、Ｂ２ＭノックアウトＮＫ細胞）に対するフローサイトメトリーデータを示す。

【図10B】実施例で記載する、本開示の遺伝子編集及び分化細胞（例えば、Ｂ２ＭノックアウトＮＫ細胞）に対するフローサイトメトリーデータを示す。

【図10C】実施例で記載する、本開示の遺伝子編集及び分化細胞（例えば、Ｂ２ＭノックアウトＮＫ細胞）に対するフローサイトメトリーデータを示す。

【図10D】実施例で記載する、本開示の遺伝子編集及び分化細胞（例えば、Ｂ２ＭノックアウトＮＫ細胞）に対するフローサイトメトリーデータを示す。

【図11A】Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型の構造を示す。

【図11B】Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ａ修復鋳型に対する理想的な標的部位（配列番号６０：ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱ；及び配列番号６１：ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣｇｔｇａｇｔｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃｔｃｃｃｇｃｔｃ）を示す。

【図11C】追加の標的結合部位を示す（配列番号６０及び配列番号６１を再び示す）。

【図11D】Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型が挿入されている、２つのラインのサイズを有するゲルを示す。

【図11E】図１１Ｄに示すバンドのシグナルの強度及びその比率を示すグラフを含む。

【図11F】Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型が挿入されている、２つのラインのサイズを有するゲルを示す。

【図11G】図１１Ｆに示すバンドのシグナルの強度及びその比率を示すグラフを含む。

【図11H】Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型中の、関連する配列を示す。

【図12】Ａ及びＢは、ＣＤ１６ａの１５８位におけるフェニルアラニン（Ｆ）をバリン（Ｖ）で置き換えるための、標的部位配列及び修復鋳型を示す。関連する配列を、これらの図に示す。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本開示は、部分的には、リンパ系細胞または骨髄系列の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを、ｍＲＮＡベース、及びｉＰＳベースの方法を用いて遺伝子編集し、分化させて、免疫抑制されているが、自己活性、増殖性、及び抗腫瘍である治療用細胞を得ることができるという発見に基づく。

【0016】

Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む細胞傷害性リンパ球は、血液及び充実性腫瘍の処置のための、同種異系「オフザシェルフ」細胞療法として開発されている。しかし、同種異系リンパ球療法は、宿主免疫拒絶に起因する、限定的な拡大能、及び限定的なインビボ持続性を含む課題に直面している。これらの課題に取り組むために、本開示は、部分的には、ｍＲＮＡによりコードされた、クロマチン文脈依存性の遺伝子編集エンドヌクレアーゼを用いる、ＭＨＣクラスＩ分子の主要な成分であるベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子が両アレルノックアウトされた、ｍＲＮＡリプログラミングｉＰＳＣ株の製造方法に関する。本明細書にて開示するとおり、これらのＢ２ＭノックアウトｉＰＳＣを次いで、専用のマイクロパターニングされた培養容器をスフェロイド培養工程で置き換える、新規の完全懸濁プロセスを用いて分化させた。得られたリンパ球の表面マーカーを、フローサイトメトリーによって特性決定し、がん細胞でインキュベートして、腫瘍細胞の関与及び細胞傷害性を評価した。特に、親の野生型ｉＰＳＣ株と比較して、Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳＣ株から、一定して高収率のリンパ球が得られた。２４時間後、野生型及びＢ２Ｍノックアウトリンパ球細胞の両方が、Ｋ５６２細胞の７５～９０％を殺傷した（エフェクター：標的（Ｅ：Ｔ）比は５：１）。興味深いことに、Ｂ２ＭノックアウトｉＰＳＣ由来の細胞傷害性リンパ球は、ＩＬ１５及びＩＬ２を添加すると、より大きなＫ５６２細胞殺傷を示したが、野生型細胞による殺傷は、これらの活性化サイトカインによっては制御されなかった。がん細胞の殺活性は、レベルが低下（活性が１５～４０％低下）したにもかかわらず、凍結保存の間を通して維持された。したがって、本開示のＢ２ＭノックアウトｉＰＳＣは、がんの処置のための、実質的な宿主免疫拒絶を伴わない「オフザシェルフ」同種異系細胞療法を開発するための細胞傷害性リンパ球の理想的な源である。

【0017】

一態様では、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊、例えば、任意選択で、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方のアレルにおける機能喪失を含む、単離免疫細胞であって、上記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記免疫細胞を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。

【0018】

本免疫細胞は、本明細書においては場合によっては、「組換え免疫細胞」と呼ばれる。

【0019】

別の態様では、組換え免疫細胞の作製方法であって、（ａ）体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることであって、上記リプログラムすることは、上記ｉＰＳ細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、上記リプログラムすることと、（ｂ）上記ｉＰＳ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を破壊することであって、上記破壊することは、上記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、上記細胞を遺伝子編集することを含む、上記破壊することと、（ｃ）上記ｉＰＳ細胞を免疫細胞に分化させることと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0020】

別の態様では、がんの処置方法であって、（ａ）Ｂ２Ｍ遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手することと、（ｂ）上記単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0021】

免疫抑制
実施形態では、本免疫細胞を組み換えて、宿主免疫系による認識及び／またはクリアランスを逃れるようにする。実施形態では、本免疫細胞は、ステルス免疫細胞である。実施形態では、本免疫細胞は、対象への投与の際に、免疫系により実質的に認識されない。

【0022】

実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊を含まない免疫細胞と比較して、Ｔ細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている。実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊を含む別の免疫細胞と比較して、他の免疫細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている。

【0023】

実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0024】

実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0025】

実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子（例えば、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０１２９２０）である。様々な実施形態におけるＢ２Ｍ遺伝子の配列を、本明細書の実施例の章で記載する。Ｂ２Ｍは、ＭＨＣクラスＩ分子の軽鎖であり、そのために、主要組織適合性複合体の一体化部分である。ヒトにおいては、Ｂ２Ｍは、第１５染色体に位置するｂ２ｍ遺伝子によりコードされる。ヒトタンパク質は、１１９個のアミノ酸で構成され、１１．８キロダルトンの分子量を有する（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ－Ｐ６１７６９）。ヒトベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）のアミノ酸配列は、以下のとおりである：
ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号１）。

【0026】

実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子の、実質的に全てのコピー全てが、遺伝子組み換えにより破壊されている。実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子の機能喪失を有する。実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ遺伝子の両方のアレルの機能喪失を有する。

【0027】

実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子組み換えによる破壊は、ヒトＢ２Ｍのエクソン３に存在する。実施形態では、Ｂ２Ｍ遺伝子の遺伝子組み換えによる破壊は、欠失である。実施形態では、欠失は、約１０～約２０ヌクレオチドである。実施形態では、欠失は、ヒトＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド５００～５５０付近にある。実施形態では、欠失は、配列ＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号２）、または、その機能的等価物のものである。

【0028】

実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現及び／または活性が下方制御されている。

【0029】

実施形態では、Ｂ２Ｍの遺伝子組み換えによる破壊は、遺伝子編集を含み、遺伝子編集は、細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる。

【0030】

実施形態では、本免疫細胞は組み換えされ、例えば、Ｂ２Ｍ（ＭＨＣクラスＩ）破壊に加えて、さらに免疫抑制される。実施形態では、本免疫細胞は、組み換えにより、ヒトＭＨＣ ＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿００９６２８．１）において破壊されている。

【0031】

実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ発現及び／または活性が下方制御されている。

【0032】

実施形態では、本免疫細胞は、ＣＩＩＴＡの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、ＣＩＩＴＡの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0033】

実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0034】

実施形態では、ＣＩＩＴＡの遺伝子組み換えによる破壊は、遺伝子編集を含み、遺伝子編集は、細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる。

【0035】

実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0036】

実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、本免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩの機能が低下している、または阻害されていることを特徴とする。

【0037】

実施形態では、Ｂ２Ｍ及びＣＩＩＴＡの遺伝子組み換えによる破壊は、遺伝子編集を含み、遺伝子編集は、細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる。

【0038】

実施形態では、本免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含む。

【0039】

実施形態では、免疫細胞は、Ｂ２Ｍポリペプチド、ならびに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、修復鋳型を、Ｂ２Ｍ遺伝子の一本鎖または二本鎖切断に挿入することにより発現することができる；場合によっては、修復鋳型は、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ遺伝子用のコード配列を含む。特に、融合タンパク質は、免疫細胞により発現した、内因性Ｂ２Ｍ及びＨＬＡペアを置き換えることにより、免疫細胞が宿主免疫細胞により減少する、または取り除かれる可能性を低くする。

【0040】

実施形態では、本免疫細胞は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含まない。

【0041】

実施形態では、遺伝子組み換えによる変異は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる低下または除去である。

【0042】

実施形態では、遺伝子組み換えによる変異は、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる増加である。

【0043】

実施形態では、Ｂ２Ｍの遺伝子組み換えによる破壊は、Ｂ２Ｍまたはその断片と、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子及び／またはそれらの断片との、遺伝子組み換えによる融合の発現と組み合わせられる。

【0044】

実施形態では、Ｂ２Ｍまたはその断片、ならびに、１つ以上の遺伝子及び／またはそれらの断片は、リンカー領域によって分離されている。実施形態では、リンカーは（Ｇ_４Ｓ）_３である。

【0045】

実施形態では、遺伝子組み換えによる変異は、ＩＬ－２、ＩＬ－１５、ＩＬ－２１から選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる増加である。実施形態では、ＩＬ－１５は、Ｎ７２Ｄ変異を含有する。実施形態では、ＩＬ－１５は、ＩＬ－１５Ｒαのサイトカイン結合ドメインに融合している。

【0046】

実施形態では、本免疫細胞は、ＩＬ－１５シグナル伝達の陰性制御因子の発現が低下している、または阻害されていることを特徴とする。実施形態では、ＩＬ－１５シグナル伝達の陰性制御因子は、ＣＩＳＨタンパク質である。実施形態では、ＩＬ－１５シグナル伝達の陰性制御因子の減少または阻害は、ＣＩＳＨ遺伝子の、遺伝子組み換えによる破壊により達成される。サイトカイン誘発性のＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨ）遺伝子は、遺伝子ＩＤ：ＮＧ＿０２３１９４．１にて見いだされる。

【0047】

実施形態では、ＣＩＳＨの遺伝子組み換えによる破壊は、遺伝子編集を含み、遺伝子編集は、細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる。

【0048】

免疫細胞
実施形態では、本免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞系列のものである。

【0049】

場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞である。

【0050】

場合によっては、リンパ系細胞はＮＫ細胞、例えば、ＮＫ－Ｔ細胞である。ＮＫ細胞はヒト細胞であってよい。

【0051】

場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0052】

様々な実施形態において、免疫細胞は、幹細胞、例えばｉＰＳＣからリプログラムされ、免疫細胞に分化する。

【0053】

実施形態では、免疫細胞は、そのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に破壊を有する。

【0054】

実施形態では、免疫細胞は、そのベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に破壊を有し、Ｂ２ＭポリペプチドならびにＨＬＡポリペプチド（例えば、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチド）を含む融合タンパク質を発現する。

【0055】

実施形態では、免疫細胞は、遺伝子編集され、ＣＤ１６ａの高親和性バリアントを発現する（図１２Ａ、及び図１２Ｂを参照されたい）。

【0056】

実施形態では、骨髄細胞は、一般的な骨髄前駆細胞に由来する、または由来し得る細胞である。実施形態では、骨髄細胞は、巨核球、赤血球、肥満細胞、または骨髄芽球である。実施形態では、骨髄細胞は、骨髄芽球に由来する、または由来し得る細胞である。実施形態では、骨髄細胞は、好塩基球、好中球、好酸球、または単核細胞である。実施形態では、骨髄細胞は、単核細胞に由来する、または由来し得る細胞である。実施形態では、骨髄細胞はマクロファージである。実施形態では、骨髄細胞は樹状細胞である。

【0057】

実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。実施形態では、ＮＫ細胞はヒト細胞である。実施形態では、ＮＫ細胞は、対象の体細胞に由来する。実施形態では、ＮＫ細胞は、同種異系または自己由来細胞に由来する。実施形態では、ＮＫ細胞は、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来する。実施形態では、ｉＰＳは、体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることにより誘導され、リプログラムすることは、ｉＰＳ細胞を、任意選択で、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４から選択される、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む。実施形態では、ｉＰＳ細胞は、同種異系または自己由来細胞に由来する。実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６及びＣＤ１６のうちの１つ以上を発現する。

【0058】

実施形態では、ＮＫ細胞はＣＤ１６ａを発現し、これは任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合し、及び／または、ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である（図１２Ａ及び図１２Ｂを参照されたい）。

【0059】

実施形態では、ＮＫ細胞はＣＤ３を発現しない。

【0060】

実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＣＤ１６^{ｄｉｍ／－}である。実施形態では、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＣＤ１６＋である。実施形態では、ＮＫ細胞は、任意選択で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞、またはＣＤ２７－ ＣＤ１１ｂ－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｔｏｌｅｒａｎｔ}細胞である。実施形態では、ＮＫ細胞は、任意選択で、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＮＫ細胞、またはＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２７－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ}である。実施形態では、ＮＫ細胞は、任意選択で、ＣＤ５６^{ｂｒｉｇｈｔ} ＮＫ細胞、またはＣＤ２７＋ ＮＫ細胞を含む、ＮＫ^{ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ}である。実施形態では、ＮＫ細胞は、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である。

【0061】

実施形態では、ＮＫ細胞は、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ－ｂ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、及び、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂ（ＭＩＰ－１ｂ）から選択される１つ以上のサイトカインを分泌する。

【0062】

実施形態では、本免疫細胞は、免疫細胞のフラトリサイド、例えば、ＮＫ細胞のフラトリサイドが低下している、または取り除かれている。例えば、実施形態では、本組換えＮＫ細胞は驚くべきことに、ＮＫ細胞傷害性に関与せず、それ故、例えば、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）中での破壊にもかかわらず、生き残ることができる。

【0063】

実施形態では、本免疫細胞は、自己活性化可能である。実施形態では、本免疫細胞は、外因的に提供され得るシグナルを含む、細胞外シグナル（例えば、サイトカイン）を必要とすることなく、活性化可能である。実施形態では、本免疫細胞は、活性のためのエキソビボ刺激を必要としない。実施形態では、本免疫細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、自己活性化可能である。

【0064】

実施形態では、本免疫細胞は、腫瘍細胞傷害性を誘発可能である。実施形態では、本免疫細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、腫瘍細胞傷害性を誘発可能である。腫瘍細胞傷害性を評価するためのアッセイとしては、インビボ抗がん応答評価、及び微視的評価、例えば、カルセインアセトキシメチル（ＡＭ）染色ベースの微視的方法が挙げられる（実施例、及び、その内容全体が参照により組み込まれている、Ｃｈａｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０２０ Ｆｅｂ ２２；（１５６）：１０．３７９１／６０７１４を参照されたい）。さらに、比色分析乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）測定をベースにする、ＮＫ細胞媒介細胞傷害性アッセイを用いることができる（その内容全体が参照により組み込まれている、Ｃｈａｖａ ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０２０ Ｆｅｂ ２２；（１５６）：１０．３７９１／６０７１４を参照されたい）。

【0065】

キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を有する免疫細胞
実施形態では、本免疫細胞（例えば、遺伝子編集され、免疫細胞にリプログラムされた細胞）を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を用いて組み換える、例えば、本免疫細胞は、ＣＡＲ－ＮＫ細胞またはＣＡＲ－Ｔである。

【0066】

実施形態では、免疫細胞、任意選択でＮＫ細胞またはＴ細胞を遺伝子組み換えし、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む、組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有ドメインを含む。

【0067】

実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のうちの１つに由来する。

【0068】

実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８の１つに由来する。

【0069】

実施形態では、抗原結合領域は、１つの抗原に結合する。実施形態では、結合領域は、２つの抗原に結合する。

【0070】

実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは、（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは、（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２つを含む。実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドまたは受容体、またはその断片、及び、（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のそれぞれの１つを含む。

【0071】

実施形態では、抗原結合領域は腫瘍抗原に結合する。

【0072】

実施形態では、抗原結合領域は、（ｉ）腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡ－Ｅに結合する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ａ；（ｉｉ）腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５に結合するＣＤ９６；（ｉｉｉ）腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＴＩＧＩＴ；（ｉｖ）腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＤＮＡＭ－１；（ｖ）腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡクラスＩに結合するＫＩＲ；（ｖｉ）腫瘍細胞上で任意選択でＮＫＧ２Ｄ－Ｌに結合するＮＫＧ２Ｄ；（ｖｉｉ）任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６（例えば、ＣＤ１６ａもしくはＣＤ１６ｂ）であって、及び／または、ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、上記ＣＤ１６；（ｖｉｉｉ）腫瘍細胞上で任意選択でＢ７－Ｈ６に結合するＮＫｐ３０；（ｉｘ）ＮＫｐ４４；ならびに、（ｘ）ＮＫｐ４６のうちの１つ以上を含む。

【0073】

実施形態では、抗原結合領域は、免疫グロブリンドメイン、任意選択で、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２ ＨＬＡクラスＩ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｌ、またはＢ７－Ｈ６に対して向けられるｓｃＦｖ、及び、これらの任意のバリアントを含む。

【0074】

実施形態では、抗原結合領域は、ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１から選択される抗原、加えて、これらの任意のバリアントに結合する。実施形態では、ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１から選択される抗原、及び、これらの任意のバリアントを、単一標的ＣＡＲ、二重標的ＣＡＲ、ｍＡｂ、または、これらのいずれかの任意の組み合わせとして用いることができる。

【0075】

実施形態では、抗原結合領域は２つの抗原に結合し、当該抗原は、（ａ）ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原、及びこれらの任意のバリアント、ならびに、（ｂ）ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原、及びこれらの任意のバリアントである。

【0076】

実施形態では、抗原結合領域は２つの抗原に結合し、当該抗原は、（ａ）ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、及びＣＤ１３８、腫瘍関連表面抗原（ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）など）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ１１１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｈｓｐ－７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生残及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ１）－１、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲｌ、Ｎｋｐ３０、Ｎ ＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、ならびにテネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ Ａｌ）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）；系列特異的または組織特異的抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ）、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ １７）、多発性骨髄腫またはリンパ性白血病抗原（例えば、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＳＬＡＭＦ７、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＦＫＢＰ１１、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８、及びＦＣＲＬ５から選択されるもの）、ウイルス特異的表面抗原（例えば、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ ｇｐｌ２０など））；ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス（Ｌａｓｓｅ ｖｉｒｕｓ）特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原から選択される抗原、及びこれらの任意のバリアント、ならびに、（ｂ）ＣＤ１６、ＣＤ６４、ＣＤ７８、ＣＤ９６、ＣＬＬ１、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ７１、ＣＤ４５、ＣＤ７１、ＣＤ１２３、及びＣＤ１３８、腫瘍関連表面抗原（ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）など）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲバリアントＩＩＩ（ＥＧＦＲｖ１１１）、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ジシアロガングリオシドＧＤ２、管上皮ムチン、ｇｐ３６、ＴＡＧ－７２、グリコスフィンゴリピド、膠腫関連抗原、β－ヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、サイログロブリン、ＲＡＧＥ－１、ＭＮ－ＣＡ ＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｈｓｐ－７０－２、Ｍ－ＣＳＦ、プロスターゼ、プロスターゼ特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ－ＥＳＯ－１、ＬＡＧＡ－１ａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、生残及びテロメラーゼ、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ－１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦＩ）－Ｉ、ＩＧＦ－ＩＩ、ＩＧＦＩ受容体、メソセリン、腫瘍特異的ペプチドエピトープを提示する主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、５Ｔ４、ＲＯＲｌ、Ｎｋｐ３０、Ｎ ＫＧ２Ｄ、腫瘍間質抗原、フィブロネクチンのエクストラドメインＡ（ＥＤＡ）及びエクストラドメインＢ（ＥＤＢ）、ならびにテネイシンＣのＡｌドメイン（ＴｎＣ Ａｌ）及び線維芽細胞関連タンパク質（ＦＡＰ）；系列特異的または組織特異的抗原（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＴＬＡ－４、Ｂ７－１（ＣＤ８０）、Ｂ７－２（ＣＤ８６）、ＧＭ－ＣＳＦ）、サイトカイン受容体、エンドグリン、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）分子、ＢＣＭＡ（ＣＤ２６９、ＴＮＦＲＳＦ １７）、多発性骨髄腫またはリンパ性白血病抗原（例えば、ＴＮＦＲＳＦ１７、ＳＬＡＭＦ７、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＦＫＢＰ１１、ＫＡＭＰ３、ＩＴＧＡ８、及びＦＣＲＬ５から選択されるもの）、ウイルス特異的表面抗原（例えば、ＨＩＶ特異的抗原（ＨＩＶ ｇｐｌ２０など））；ＥＢＶ特異的抗原、ＣＭＶ特異的抗原、ＨＰＶ特異的抗原、ラッサウイルス（Ｌａｓｓｅ ｖｉｒｕｓ）特異的抗原、インフルエンザウイルス特異的抗原から選択される抗原、ならびにこれらの任意のバリアントである。

【0077】

実施形態では、組換えＣＡＲの細胞外ドメインは、ＮＫ細胞活性化受容体またはｓｃＦｖの細胞外ドメインを含む。

【0078】

実施形態では、ＮＫ細胞は、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における遺伝子編集を含む。

【0079】

実施形態では、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における遺伝子編集は、細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる。実施形態では、遺伝子編集は、ＩＬ－６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及び／またはＨＰＫ１の発現及び／または活性の低下または除去を引き起こす。実施形態では、遺伝子編集は、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び／またはＴＲＡＩＬの発現及び／または活性の増加を引き起こす。

【0080】

実施形態では、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはマクロファージは、自殺遺伝子産物をコード可能な１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む。実施形態では、自殺遺伝子産物は、チミジンキナーゼ及びアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む。

【0081】

本明細書で開示する（即ち、遺伝子編集を（例えば、Ｂ２Ｍに）含む、高親和性ＣＤ１６ａ受容体を発現する、及び／または、Ｂ２Ｍポリペプチド及びＨＬＡポリペプチドを含む融合タンパク質を発現する）任意の免疫細胞を、さらに遺伝子組み換えして、ＣＡＲを発現させることができる。

【0082】

ＲＮＡ修飾
実施形態では、本開示は、ＲＮＡベースの修飾、例えば、リプログラミング及び／または遺伝子編集に関する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、遺伝子編集タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、リプログラミング因子をコードする。

【0083】

実施形態では、ＲＮＡはｍＲＮＡである。実施形態では、ＲＮＡは修飾ｍＲＮＡである。実施形態では、修飾ｍＲＮＡは、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。

【0084】

いくつかの実施形態では、非標準ヌクレオチドをＲＮＡに組み込み、ＲＮＡをタンパク質に翻訳することが可能な効率を増加させ、また、ＲＮＡの毒性を低下させることができる。実施形態では、ＲＮＡ分子は、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、５－メチルシチジン脱メチル化経路の、１つ以上の非標準ヌクレオチドメンバーを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、及び５－カルボキシシチジン、またはこれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、核酸は、シュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、またはこれらの誘導体のうちの少なくとも１つを含む。

【0085】

実施形態では、非標準ヌクレオチドは、ピリミジンに対して、２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される、または、プリンに対して、６Ｃ位、７Ｎ位、及び８Ｃ位から選択される位置において、１つ以上の置換を有する。

【0086】

実施形態では、非標準ヌクレオチドは、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－ホルミルシュードウリジン、及び、５－メトキシシュードウリジンのうちの１つ以上を、任意選択で、非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％の量で含む。

【0087】

いくつかの実施形態では、１つ以上の非標準ヌクレオチドは、５－メチルウリジン及び５－メチルシチジン、５－メチルウリジン及び７－デアザグアノシン、５－メチルシチジン及び７－デアザグアノシン、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、及び５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシンから選択される。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、または、これらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも２つを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、５－メチルウリジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、及び７－デアザグアノシン、または、これらの１つ以上の誘導体のうちの少なくとも３つを含む。実施形態では、ｍＲＮＡは、２－チオウリジン、５－アザウリジン、シュードウリジン、４－チオウリジン、５－メチルウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－アミノウリジン、５－アミノシュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メトキシウリジン、５－メトキシシュードウリジン、５－エトキシウリジン、５－エトキシシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－ホルミルウリジン、５－ホルミルシュードウリジン、５－メチル－５－アザウリジン、５－アミノ－５－アザウリジン、５－ヒドロキシ－５－アザウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－アミノシュードウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、４－チオ－５－アザウリジン、４－チオシュードウリジン、４－チオ－５－メチルウリジン、４－チオ－５－アミノウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシウリジン、４－チオ－５－メチル－５－アザウリジン、４－チオ－５－アミノ－５－アザウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシ－５－アザウリジン、４－チオ－５－メチルシュードウリジン、４－チオ－５－アミノシュードウリジン、４－チオ－５－ヒドロキシシュードウリジン、２－チオシチジン、５－アザシチジン、シュードイソシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アミノシチジン、Ｎ４－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－アミノシチジン、５－ヒドロキシシチジン、５－メトキシシチジン、５－エトキシシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メチル－５－アザシチジン、５－アミノ－５－アザシチジン、５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、５－メチルシュードイソシチジン、５－アミノシュードイソシチジン、５－ヒドロキシシュードイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－メチルシュードイソシチジン、２－チオ－５－アザシチジン、２－チオシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシシチジン、２－チオ－５－メチルシチジン、２－チオ－５－アミノシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－５－メチルシュードイソシチジン、２－チオ－５－アミノシュードイソシチジン、２－チオ－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチルシュードイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチルシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－メチル－５－メチルシュードイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－アミノシュードイソシチジン、Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノシュードイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチルシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－アミノ－５－メチルシュードイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－アミノシュードイソシチジン、Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシシュードイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチル－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシュードイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシュードイソシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－メチルシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－アミノシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－メチル－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチルシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－メチルシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－アミノシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－アミノ－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシチジン、Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチル－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシ－５－アザシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－メチルシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－アミノシュードイソシチジン、２－チオ－Ｎ４－ヒドロキシ－５－ヒドロキシシュードイソシチジン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－アミノアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシアデノシン、７－デアザアデノシン、８－アザアデノシン、Ｎ６－メチル－７－デアザアデノシン、Ｎ６－メチル－８－アザアデノシン、７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－メチル－７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－アミノ－７－デアザアデノシン、Ｎ６－アミノ－８－アザアデノシン、Ｎ６－アミノ－７－デアザ－８－アザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－７－デアザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－８－アザアデノシン、Ｎ６－ヒドロキシ－７－デアザ－８－アザアデノシン、６－チオグアノシン、７－デアザグアノシン、８－アザグアノシン、６－チオ－７－デアザグアノシン、６－チオ－８－アザグアノシン、７－デアザ－８－アザグアノシン、及び６－チオ－７－デアザ－８－アザグアノシンから選択される１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。

【0088】

実施形態では、非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％が、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－ホルミルシュードウリジン、及び、５－メトキシシュードウリジンのうちの１つ以上を含む。

【0089】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、１つ以上のウリジン残基、１つ以上のシチジン残基、及び、１つ以上のグアノシン残基のうちの少なくとも１つを含み、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む。一実施形態では、ウリジン残基の約２０％～約８０％が、５－メチルウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約３０％～約５０％が、５－メチルウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約４０％が、５－メチルウリジン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約６０％～約８０％が、５－メチルシチジン残基である。別の実施形態では、シチジン残基の約８０％～約１００が、５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が、５－メチルシチジン残基である。またさらなる実施形態では、シチジン残基の約２０％～約１００％が、５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、グアノシン残基の約２０％～約８０％が、７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、グアノシン残基の約４０％～約６０％が、７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、グアノシン残基の約５０％が、７－デアザグアノシン残基である。一実施形態では、シチジン残基の約２０％～約８０％、または、約３０％～約６０％、または約４０％が、Ｎ４－メチルシチジン及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基である。別の実施形態では、各シチジン残基は、５－メチルシチジン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が、５－メチルシチジン残基、及び／または５－ヒドロキシメチルシチジン残基、及び／またはＮ４－メチルシチジン残基、及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基、及び／またはこれらの１つ以上の誘導体である。またさらなる実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％が、Ｎ４－メチルシチジン及び／またはＮ４－アセチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。さらなる実施形態では、シチジン残基の約１００％が、５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。一実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約４０％が５－メチルウリジン残基であり、シチジン残基の約２０％～約１００％が５－ヒドロキシメチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。いくつかの実施形態では、シチジン残基の１００％未満が５－メチルシチジン残基である。他の実施形態では、シチジン残基の１００％未満が５－ヒドロキシメチルシチジン残基である。一実施形態では、ＲＮＡ分子中の各ウリジン残基は、シュードウリジン残基または５－メチルシュードウリジン残基である。別の実施形態では、ウリジン残基の約１００％が、シュードウリジン残基及び／または５－メチルシュードウリジン残基である。さらなる実施形態では、ウリジン残基の約１００％が、シュードウリジン残基及び／または５－メチルシュードウリジン残基であり、シチジン残基の約１００％が５－メチルシチジン残基であり、グアノシン残基の約５０％が７－デアザグアノシン残基である。

【0090】

５－メチルウリジンの代わりに、または、これと組み合わせて使用可能な他の非標準ヌクレオチドとしては、シュードウリジン及び５－メチルシュードウリジン（別名「１－メチルシュードウリジン」、別名「Ｎ１－メチルシュードウリジン」）、または、これらの１つ以上の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。５－メチルシチジン及び／または５－ヒドロキシメチルシチジンの代わりに、または、これらと組み合わせて使用可能な他の非標準ヌクレオチドとしては、シュードイソシチジン、５－メチルシュードイソシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－ホルミルシチジン、５－カルボキシシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、または、これらの１つ以上の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、例えば、１回のトランスフェクションのみを行うとき、または、細胞がトランスフェクトされているときは、トランスフェクション関連毒性、または、先天性免疫シグナル伝達に対して特に感度が高いわけではなく、非標準ヌクレオチドの画分を減らすことができる。非標準ヌクレオチドの画分を減らすことは、部分的には、非標準ヌクレオチドの画分を減らすことで核酸のコストを低下させることができるため、有益である可能性がある。特定の状況では、例えば、最小免疫原性の核酸が所望される場合、非標準ヌクレオチドの画分を増やすことができる。

【0091】

実施形態では、ＲＮＡ分子は、５’キャップ構造を含む。実施形態では、ＲＮＡ分子は、コザックコンセンサス配列を含む５’－ＵＴＲを含む。実施形態では、ＲＮＡ分子は、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含む５’－ＵＴＲを含む。実施形態では、ＲＮＡ分子は、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含む３’－ＵＴＲを含む。実施形態では、５’－ＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲ配列を含む。実施形態では、３’－ＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲ配列を含む。実施形態では、ＲＮＡ分子は、３’ポリ（Ａ）テールを含む。

【0092】

特定の実施形態は、キャップ０、キャップ１、キャップ２、及びキャップ３から選択される５’キャップ構造を含む核酸、またはこれらの誘導体に関する。一実施形態では、核酸は、１つ以上のＵＴＲを含む。別の実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、核酸の安定性を増加させる。さらなる実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲを含む。またさらなる実施形態では、１つ以上のＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲを含む。またさらなる実施形態では、ＲＮＡ分子は、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲ、及び、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲを含む。一実施形態では、５’－ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列に実質的に類似するコザック配列を含む。別の実施形態では、核酸は、３’ポリ（Ａ）テールを含む。さらなる実施形態では、３’ポリ（Ａ）テールは、約２０ｎｔ～約２５０ｎｔ、または約１２０ｎｔ～約１５０ｎｔ長である。さらなる実施形態では、３’ポリ（Ａ）テールは、約２０ｎｔ、または約３０ｎｔ、または約４０ｎｔ、または約５０ｎｔ、または約６０ｎｔ、または約７０ｎｔ、または約８０ｎｔ、または約９０ｎｔ、または約１００ｎｔ、または約１１０ｎｔ、または約１２０ｎｔ、または約１３０ｎｔ、または約１４０ｎｔ、または約１５０ｎｔ、または約１６０ｎｔ、または約１７０ｎｔ、または約１８０ｎｔ、または約１９０ｎｔ、または約２００ｎｔ、または約２１０ｎｔ、または約２２０ｎｔ、または約２３０ｎｔ、または約２４０ｎｔ、または約２５０ｎｔ長である。

【0093】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡは、１つ以上のグアニンを含む複数のアデニンで構成されるテールを含む。

【0094】

実施形態では、ＲＮＡは、（ａ）タンパク質をコードする配列、及び、（ｂ）デオキシアデノシンヌクレオチドと、１つ以上の他のヌクレオチドとを含むテール領域を含む。

【0095】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、デオキシグアノシン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のデオキシグアノシン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるデオキシグアノシン残基を含む。

【0096】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、デオキシシチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のデオキシシチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるデオキシシチジン残基を含む。

【0097】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、デオキシチミジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のデオキシチミジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるデオキシチミジン残基を含む。

【0098】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、デオキシグアノシン残基及びデオキシシチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、または約５０％のデオキシアデノシン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％未満のデオキシアデノシン残基を含む。

【0099】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、グアノシン残基を含む。

【0100】

実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のグアノシン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるグアノシン残基を含む。

【0101】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、シチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のシチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるシチジン残基を含む。

【0102】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、ウリジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約１％、約２％、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、または約５０％のウリジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、５０％を超えるウリジン残基を含む。

【0103】

実施形態では、１つ以上の他のヌクレオチドは、グアノシン残基及びシチジン残基を含む。実施形態では、テール領域は、約９９％、約９８％、約９５％、約９０％、約８５％、約８０％、約７５％、約７０％、約６５％、約６０％、約５５％、または約５０％のアデノシン残基を含む。

【0104】

実施形態では、テール領域は、５０％未満のアデノシン残基を含む。

【0105】

実施形態では、テールは（Ａ）_１５０である。実施形態では、テールは（Ａ_３９Ｇ）_３（Ａ）_３０である。実施形態では、テールは（Ａ_１９Ｇ）_７（Ａ）_１０である。実施形態では、テールは（Ａ_９Ｇ）_１５である。

【0106】

実施形態では、テール領域の長さは、約８０％ヌクレオチド～約１２０ヌクレオチド、約１２０ヌクレオチド～約１６０ヌクレオチド、約１６０ヌクレオチド～約２００ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド～約２４０ヌクレオチド、約２４０ヌクレオチド～約２８０ヌクレオチド、または、約２８０ヌクレオチド～約３２０ヌクレオチドである。

【0107】

実施形態では、テール領域の長さは、３２０ヌクレオチドより大きい。

【0108】

実施形態では、ＲＮＡは、５’キャップ構造を含む。実施形態では、ＲＮＡ ５’－ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列を含む。実施形態では、ＲＮＡ ５’－ＵＴＲは、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、５’－ＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの５’－ＵＴＲを含むことができる。

【0109】

実施形態では、ＲＮＡ ３’－ＵＴＲは、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、３’－ＵＴＲは、アルファグロビンまたはベータグロビンの３’－ＵＴＲを含むことができる。実施形態では、ＲＮＡは、３’ポリ（Ａ）テールを含む。実施形態では、ＲＮＡ３’ポリ（Ａ）テールは、約２０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である。

【0110】

実施形態では、ＲＮＡは、約２００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である。

【0111】

実施形態では、ＲＮＡは、インビトロ転写により調製される。実施形態では、ＲＮＡは合成である。

【0112】

遺伝子編集タンパク質
実施形態では、本開示は、遺伝子、例えば、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）において、遺伝子組み換えによる破壊をもたらすための遺伝子編集に関する。実施形態では、遺伝子編集は、遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡ分子を用いて実施される。

【0113】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質または天然もしくは組換えバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、これらの断片または融合構築物から選択される。

【0114】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、（ｉ）複数の反復配列を含むＤＮＡ結合ドメイン、及び、（ｉｉ）ヌクレアーゼの触媒ドメインを含むヌクレアーゼドメインを含む。実施形態では、反復配列のうちの少なくとも１つは、アミノ酸配列ＬＴＰｖＱＶＶＡＩＡｗｘｙｚα（配列番号３）を含み、任意選択で、３６～３９アミノ酸長であり、式中、
ｖはＱ、Ｄ、またはＥであり、
ｗはＳまたはＮであり、
ｘはＩ、Ｈ、Ｎ、またはＩであり、
ｙはＤ、Ａ、Ｉ、Ｎ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｇであるか、または存在せず、
ｚはＧＧＲＰＡＬＥ（配列番号４）、ＧＧＫＱＡＬＥ（配列番号５）、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（配列番号６）、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（配列番号７）、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤＨＧ（配列番号８）、ＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＨＧ（配列番号９）、ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＤ（配列番号１０）、またはＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡ（配列番号１１）であり、
αは、連続する４つのアミノ酸である。

【0115】

実施形態では、αは、少なくとも１つのグリシン（Ｇ）残基を含む。実施形態では、αは、少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）残基を含む。実施形態では、αは、３３、３４、または３５位のいずれか１つにおいて、少なくとも１つのヒスチジン（Ｈ）残基を含む。実施形態では、αは、少なくとも１つのアスパラギン酸（Ｄ）残基を含む。実施形態では、αは、グリシン（Ｇ）残基、ヒスチジン（Ｈ）残基、及び、アスパラギン酸（Ｄ）残基のうちの少なくとも１つ、または２つ、または３つを含む。

【0116】

実施形態では、αは、任意選択で、アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）から選択される、極性で正の電荷を有する親水性アミノ酸；任意選択で、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される、極性で中性の電荷を有する親水性アミノ酸；任意選択で、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択される、極性で負の電荷を有する親水性アミノ酸、ならびに、任意選択で、ヒスチジン（Ｈ）から選択される、芳香族の、極性で正の電荷を有する親水性アミノ酸から任意選択で選択される、１つ以上の親水性残基を含む。

【0117】

いくつかの実施形態では、αは、アルギニン（Ｒ）及びリシン（Ｋ）から選択される、１つ以上の極性で正の電荷を有する親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される、１つ以上の極性で中性の電荷を有する親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、アスパラギン酸（Ｄ）及びグルタミン酸（Ｅ）から選択される、１つ以上の極性で負の電荷を有する親水性アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、ヒスチジン（Ｈ）から選択される、１つ以上の芳香族の、極性で正の電荷を有する親水性アミノ酸を含む。

【0118】

実施形態では、αは、任意選択で、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される疎水性の脂肪族アミノ酸、ならびに、任意選択で、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）から選択される疎水性の芳香族アミノ酸から任意選択で選択される、１つ以上の疎水性残基を含む。いくつかの実施形態では、αは、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、及びバリン（Ｖ）から選択される１つ以上の疎水性の脂肪族アミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、αは、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、及びチロシン（Ｙ）から選択される１つ以上の芳香族アミノ酸を含む。実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、約１５、または約１６、または約１７、または約１８、または約１８．５個の反復配列を含む。

【0119】

実施形態では、αは、ＧＨＧＧ（配列番号１２）、ＨＧＳＧ（配列番号１３）、ＨＧＧＧ（配列番号１４）、ＧＧＨＤ（配列番号１５）、ＧＡＨＤ（配列番号１６）、ＡＨＤＧ（配列番号１７）、ＰＨＤＧ（配列番号１８）、ＧＰＨＤ（配列番号１９）、ＧＨＧＰ（配列番号２０）、ＰＨＧＧ（配列番号２１）、ＰＨＧＰ（配列番号２２）、ＡＨＧＡ（配列番号２３）、ＬＨＧＡ（配列番号２４）、ＶＨＧＡ（配列番号２５）、ＩＶＨＧ（配列番号２６）、ＩＨＧＭ（配列番号２７）、ＲＨＧＤ（配列番号２８）、ＲＤＨＧ（配列番号２９）、ＲＨＧＥ（配列番号３０）、ＨＲＧＥ（配列番号３１）、ＲＨＧＤ（配列番号３２）、ＨＲＧＤ（配列番号３３）、ＧＰＹＥ（配列番号３４）、ＮＨＧＧ（配列番号３５）、ＴＨＧＧ（配列番号３６）、ＧＴＨＧ（配列番号３７）、ＧＳＧＳ（配列番号３８）、ＧＳＧＧ（配列番号３９）、ＧＧＧＧ（Ｓ配列番号４０）、ＧＲＧＧ（配列番号４１）、及びＧＫＧＧ（配列番号４２）から選択される。

【0120】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、残基１２または１３において、ＤＮＡ結合ドメインを標的ＤＮＡ分子に向けさせる、反復可変二残基（ＲＶＤ）を含む。

【0121】

実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子中で１つの塩基対を認識する。実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子中でＣ残基を認識し、ＨＤ、Ｎ（ヌル）、ＨＡ、ＮＤ、及びＨＩから選択される。実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子中でＧ残基を認識し、ＮＮ、ＮＨ、ＮＫ、ＨＮ、及びＮＡから選択される。実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子中でＡ残基を認識し、ＮＩ及びＮＳから選択される。実施形態では、ＲＶＤは、核酸分子中でＴ残基を認識し、ＮＧ、ＨＧ、Ｈ（ヌル）、及びＩＧから選択される。

【0122】

実施形態では、核酸分子中でＣ残基を認識するＲＶＤは、ＨＤである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＣ残基を認識するＲＶＤは、Ｎ（ヌル）である。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＣ残基を認識するＲＶＤは、ＨＡである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＣ残基を認識するＲＶＤは、ＮＤである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＣ残基を認識するＲＶＤは、ＨＩである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＧ残基を認識するＲＶＤは、ＮＮである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＧ残基を認識するＲＶＤは、ＮＨである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＧ残基を認識するＲＶＤは、ＮＫである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＧ残基を認識するＲＶＤは、ＨＮである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＧ残基を認識するＲＶＤは、ＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＡ残基を認識するＲＶＤは、ＮＩである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＡ残基を認識するＲＶＤは、ＮＳである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＴ残基を認識するＲＶＤは、ＮＧである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＴ残基を認識するＲＶＤは、ＨＧである。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＴ残基を認識するＲＶＤは、Ｈ（ヌル）である。いくつかの実施形態では、核酸分子中でＴ残基を認識するＲＶＤは、ＩＧである。

【0123】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳ＊ＲＶＤ＊ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＧＨＧＧ（配列番号４３、「＊ＲＶＤ＊」は、配列番号３のジヌクレオチド「ｘｙ」に対応する。）の少なくとも１つの反復を有するＤＮＡ結合ドメインを有する。

【0124】

いくつかの実施形態では、反復配列は３３または３４アミノ酸長である。実施形態では、反復配列は３６～３９アミノ酸長である。実施形態では、反復配列は３６アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、反復配列は３７アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、反復配列は３８アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、反復配列は３９アミノ酸長である。

【0125】

実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼの触媒ドメインを含む。実施形態では、ヌクレアーゼドメインは、別のヌクレアーゼドメインと二量体を形成することが可能である。実施形態では、ヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩ、またはそのハイブリッド、反復配列から選択される。実施形態では、触媒ドメインは、Ｆｏｋ１のα１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、β４、β５、及びβ６ドメインを含むＦｏｋＩ及びＳｔｓＩの触媒ドメインと、全体または一部が、ＳｔｓＩのα１、α２、α３、α４、α５、α６、β１、β２、β３、β４、β５、及びβ６ドメインで置換されており、任意選択で少なくとも１つの変異を含む、ＦｏｋＩのドメインの少なくとも１つとのハイブリッドである。

【0126】

いくつかの実施形態では、Ｎ末端で切断される断片、Ｃ末端で切断される断片、内部欠失を有する断片、ならびに、Ｎ末端、Ｃ末端、及び／または内部欠失を組み合わせ、完全エンドヌクレアーゼ切断ドメインの触媒活性の一部または全てを維持する断片を含む、エンドヌクレアーゼ切断ドメインの特定の断片を用いる。断片が、完全ドメインの触媒活性の一部または全部を維持することができるか否かを判定することは、例えば、本発明の方法に従い、断片を含有する遺伝子編集タンパク質を合成することと、本発明の方法に従い、細胞が遺伝子編集タンパク質を発現するように誘導することと、遺伝子編集の効率を測定することと、により達成することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子編集効率の測定値を用いて、任意の特定の断片が、完全エンドヌクレアーゼ切断ドメインの触媒活性の一部または全部を維持するか否かを判定する。特定の実施形態はそれ故、エンドヌクレアーゼ切断ドメインの、生物学的に活性な断片に関する。一実施形態では、エンドヌクレアーゼ切断ドメインは、ＦｏｋＩ、ＳｔｓＩ、ＳｔｓＩ－ＨＡ、ＳｔｓＩ－ＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ、ＳｔｓＩ－ＵＨＡ２、ＳｔｓＩ－ＨＦ、及びＳｔｓＩ－ＵＨＦ、あるいは、その天然もしくは組換えバリアントまたはその生物学的に活性な断片、または、そのハイブリッドもしくはキメラから選択される。

【0127】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、リンカーを含む。別の実施形態では、リンカーは、ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに接続する。さらなる実施形態では、リンカーは、約１～約１０アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１、約２、または約３、または約４、または約５、または約６、または約７、または約８、または約９、または約１０アミノ酸長である。一実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、標的ＤＮＡ分子内でニックまたは二本鎖の切断を生成することが可能である。

【0128】

実施形態では、遺伝子編集タンパク質は、それら全体が参照により本明細書に組み込まれている、国際特許公報第ＷＯ２０１４／０７１２１９号、または米国仮出願第６３／０２３，６７８号に記載されているもののいずれかである。

【0129】

製剤／投与
いくつかの実施形態では、本開示は、医薬組成物の形態の、本明細書に記載する組成物に関する。

【0130】

様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載する免疫細胞と、薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む医薬組成物に関する。いくつかの実施形態では、本発明は、本免疫細胞を含む医薬組成物に関する。

【0131】

脂質／細胞接触／トランスフェクション
実施形態では、本発明は、本ＲＮＡ分子の、脂質による送達に関する。実施形態では、遺伝子編集タンパク質及び／またはリプログラミング因子をコードする本ｍＲＮＡは、脂質により送達される。

【0132】

実施形態では、脂質は、式（Ｉ）の化合物である：

【0133】

【化1】

［式中、Ｑ_１、Ｑ_２、Ｑ_３、及びＱ_４は独立して、正電荷を帯びることが可能な原子または基であり、
Ａ_１及びＡ_２は独立して、存在しないか、Ｈ、または、任意に置換されたＣ_１－Ｃ_６アルキルであり、
Ｌ_１、Ｌ_２、及びＬ_３は独立して、存在しないか、結合、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、または、エーテル、エステル、無水物、アミド、カルバメート、二級アミン、三級アミン、四級アンモニウム、チオエーテル、尿素、カルボニル、もしくはイミンのうちの１つ以上により任意に連結されている、上述の任意の組み合わせであり、
Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ_３、Ｒ_４、Ｒ_５、Ｒ_６、Ｒ_７、及びＲ_８は独立して、存在しないか、Ｈ、（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニルであり、Ｒ_１、Ｒ_２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７、及びＲ８のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和結合を含み、ｘ、ｙ、及びｚは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］

【0134】

実施形態では、脂質は、式（ＩＩ）の化合物である：

【0135】

【化2】

［式中、Ｒ９、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｒ１６、Ｒ１７、Ｒ１８、Ｒ１９、Ｒ２０、Ｒ２１、Ｒ２２、Ｒ２３、Ｒ２４、Ｒ２５、Ｒ２６、Ｒ２７、及びＲ２８は独立して、Ｈ、ハロ、ＯＨ、（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ハロ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ１－Ｃ６）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ１－Ｃ_６）アルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはヘテロシクロであり、
ｉ、ｊ、ｋ、ｍ、ｓ、及びｔは独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］

【0136】

実施形態では、脂質は、式（ＩＩＩ）の化合物である：

【0137】

【化3】

［式中、Ｌ_４、Ｌ_５、Ｌ_６、及びＬ_７は独立して、結合、（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（ハロ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（ヒドロキシ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、（アルコキシ）（Ｃ_１－Ｃ_２０）アルカンジイル、アリーレン、ヘテロアリーレン、シクロアルカンジイル、複素環－ジイル、－（ＣＨ_２）_ｖ１－Ｃ（Ｏ）－、－（（ＣＨ_２）_ｖ１－Ｏ）_ｖ２－、または－（（ＣＨ_２）_ｖ１－Ｃ（Ｏ）－Ｏ）_ｖ２－であり、
Ｒ_２９、Ｒ_３０、Ｒ_３１、Ｒ_３２、Ｒ_３３、Ｒ_３４、及びＲ_３５は独立して、Ｈ、（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（ハロ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（ヒドロキシ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（アルコキシ）（Ｃ_１－Ｃ_６０）アルキル、（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（ハロ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（ヒドロキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（アルコキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルケニル、（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（ハロ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（ヒドロキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニル、（アルコキシ）（Ｃ_２－Ｃ_６０）アルキニルであり、Ｒ_２９、Ｒ_３０、Ｒ_３１、Ｒ_３２、Ｒ_３３、Ｒ_３４、及びＲ_３５のうちの少なくとも１つは、少なくとも２つの不飽和結合を含み、
ｖ、ｖ_１、及びｖ_２は独立して、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］

【0138】

実施形態では、脂質は、式（ＩＶ）の化合物である：

【0139】

【化4】

［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］

【0140】

実施形態では、脂質は、式（Ｖ）の化合物である：

【0141】

【化5】

【0142】

実施形態では、脂質は、式（ＶＩ）の化合物である：

【0143】

【化6】

【0144】

実施形態では、脂質は、式（ＶＩＩ）の化合物である：

【0145】

【化7】

【0146】

実施形態では、脂質は、式（ＶＩＩＩ）の化合物である：

【0147】

【化8】

【0148】

実施形態では、脂質は、式（ＩＸ）の化合物である：

【0149】

【化9】

【0150】

実施形態では、脂質は、式（Ｘ）の化合物である：

【0151】

【化10】

【0152】

実施形態では、脂質は、式（ＸＩ）の化合物である：

【0153】

【化11】

【0154】

実施形態では、脂質は、式（ＸＩＩ）の化合物である：

【0155】

【化12】

【0156】

実施形態では、脂質は、式（ＸＩＩＩ）の化合物である：

【0157】

【化13】

【0158】

実施形態では、脂質は、式（ＸＩＶ）の化合物である：

【0159】

【化14】

【0160】

実施形態では、脂質は、式（ＸＶ）の化合物である：

【0161】

【化15】

［式中、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５である。］

【0162】

実施形態では、脂質は、式（ＸＶＩ）の化合物である：

【0163】

【化16】

【0164】

実施形態では、（例えば、式Ｉ－ＸＶＩの）本化合物は、医薬組成物、及び／または脂質集合体、及び／または脂質担体、及び／または脂質核酸複合体、及び／またはリポソーム、及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。

【0165】

実施形態では、（例えば、式Ｉ－ＸＶＩの）本化合物は、追加の脂質、またはヘルパー脂質を必要としない、医薬組成物、及び／または脂質集合体、及び／または脂質担体、及び／または脂質核酸複合体、及び／またはリポソーム、及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。実施形態では、（例えば、式Ｉ－ＸＶＩの）本化合物は、中性脂質（例えば、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２－ジオレオイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、もしくはコレステロール）、及び／または、さらなるカチオン性脂質（例えば、Ｎ－［１－（２，３－ジオレオイルオキシ）プロピル］－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、１，２－ビス（オレオイルオキシ）－３－３－（トリメチルアンモニウム）プロパン（ＤＯＴＡＰ）、もしくは１，２－ジオレオイル－３－ジメチルアンモニウム－プロパン（ＤＯＤＡＰ））をさらに含む、医薬組成物、及び／または脂質集合体、及び／または脂質担体、及び／または脂質核酸複合体、及び／またはリポソーム、及び／または脂質ナノ粒子の構成成分である。

【0166】

実施形態では、脂質は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公報第ＷＯ２０２１／００３４６２号に記載されているもののいずれかである。

【0167】

実施形態では、脂質は、表Ａのもののいずれかである。

【0168】

【表1-1】

【表1-2】

【0169】

作製方法
態様では、本開示は、組換え免疫細胞の作製方法であって、（ａ）体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることであって、上記リプログラムすることは、上記ｉＰＳ細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、上記リプログラムすることと、（ｂ）上記ｉＰＳ細胞内のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を破壊することであって、上記破壊することは、上記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、上記細胞を遺伝子編集することを含む、上記破壊することと、（ｃ）上記ｉＰＳ細胞を免疫細胞に分化させることと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0170】

実施形態では、方法は、ｉＰＳ細胞内のＣＩＩＴＡ遺伝子を破壊することであって、上記破壊することは、上記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、上記細胞を遺伝子編集することを含む、上記破壊することをさらに含む。

【0171】

実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。

【0172】

実施形態では、体細胞は線維芽細胞またはケラチノサイトである。

【0173】

実施形態では、方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、ｉＰＳ細胞の増殖速度の増加をもたらす。

【0174】

実施形態では、方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の増殖速度の増加をもたらす。

【0175】

実施形態では、方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の拡大の増加をもたらす。

【0176】

実施形態では、分化は、胚様体に基づく造血関与を含む。実施形態では、分化は、ＣＤ３４＋細胞の濃縮を含む。実施形態では、分化は、ＣＤ５＋／ＣＤ７＋一般リンパ系前駆細胞への分化を含む。

【0177】

実施形態では、方法は、ＣＤ５６^ｄｉｍ ＣＤ１６＋ＮＫ細胞をもたらす。

【0178】

実施形態では、ＲＮＡは、及び／または式Ｉ－ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と会合している。

【0179】

処置方法
態様では、本開示は、がんの処置方法であって、（ａ）ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手することと、（ｂ）上記単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、上記免疫細胞は、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、上記方法を提供する。

【0180】

場合によっては、リンパ系細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞；またはＮＫ－Ｔ細胞である。

【0181】

場合によっては、骨髄細胞はマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである。

【0182】

実施形態では、免疫細胞はＮＫ細胞である。

【0183】

実施形態では、がんは、血液癌である。実施形態では、がんは、充実性腫瘍である。実施形態では、がんは、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳癌及び中枢神経系癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化器癌を含む）；膠芽腫；肝細胞癌；肝癌；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ ＮＨＬ）；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他のがん腫及び肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーシス、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連するもの）、及びメーグス症候群に関連する異常な血管増殖から選択される。

【0184】

本開示の免疫細胞は、（例えば、静脈もしくは動脈を通して）全身投与することができる、または、腫瘍に、もしくは腫瘍付近に導入することができる。

【0185】

定義
別段に定義されない限り、本明細書で使用する全ての当該技術分野の用語、表記法、ならびに他の技術的及び科学的用語または専門用語は、請求項に記載の主題が属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有することを意図する。場合によっては、一般的に理解される意味を有する用語を、明確性、及び／または、速やかに参照するために本明細書で定義し、そのような定義を本明細書に含めることは、当該技術分野において一般的に理解されるものに対する実質的な差を示すものと必ずしも解釈されるべきではない。本明細書に使用される用語は、特定の事例を説明する目的のみのためのものであり、制限することを意図するものではない。

【0186】

本明細書及び特許請求の範囲で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に明らかに別途の指示がない限り、複数の指示対象を含む。

【0187】

本明細書で使用する場合、「少なくとも１つの」、「１つ以上の」、及び「及び／または」という語句は、操作において連結的及び離接的の両方である、オープンエンドの表現である。例えば、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの少なくとも１つ」、「Ａ、Ｂ、及びＣのうちの１つ以上」、「Ａ、Ｂ、またはＣのうちの１つ以上」、及び「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」という表現はそれぞれ、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢ、ＡとＣ、ＢとＣ、またはＡとＢとＣを意味する。

【0188】

本明細書で使用する場合、「または」とは、「及び」、「または」、または「及び／または」を意味し得、排他的及び包括的の両方で用いることができる。例えば、「ＡまたはＢ」という用語は、「ＡまたはＢ」、「ＡであるがＢではない」、「ＢであるがＡではない」、及び「Ａ及びＢ」を意味し得る。場合によっては、文脈により特定の意味が決定される場合もある。

【0189】

本明細書で使用する場合、「約」ある数という用語は、当該数の±１０％の数、及び／または、当該数から１標準偏差（±）以内の数を意味する。「約」ある範囲という用語は、当該範囲－その最低値の１０％、及び＋その最大値の１０％、ならびに当該範囲－その最低値の一標準偏差、及び＋その最大値の一標準偏差を意味する。

【0190】

本出願を通して、様々な実施形態を範囲形式で提示することができる。範囲形式での記載は単に、便宜上、かつ簡便化のためと理解されるべきであり、本開示の範囲の柔軟性のない限定と解釈してはならない。したがって、範囲の記載は、具体的に開示された起こりうる全ての部分範囲、及びその範囲内の個別の数値を有するものと考えられなければならない。例えば、１～６などの範囲の記載は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などの具体的に開示された部分範囲、ならびにその範囲内の個別の数字、例えば１、２、３、４、５、及び６を有すると考えられなければならない。これは、範囲の広さに関係なく適用される。

【0191】

本開示及び／または特許請求の範囲のいずれかで使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「伴う」という用語、またはこれらの変形は、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語と同様の形で包括的であることが意図される。

【0192】

「予防すること」とは、少なくとも、疾患の発生を回避すること、及び／または当該疾患に罹患する可能性を低減することを意味する。処置することとは、少なくとも、疾患の徴候または症状を軽減することを含む、当該疾患の影響を緩和または回避することを意味する。

【0193】

「実質的に」という用語は、概して著しい程度であることを意味するか、または本質的に、を意味する。換言すれば、この「実質的に」という用語は、所望の特質に対してほぼ正確であるか、または正確な特質とわずかに異なることを意味し得る。「実質的に」は、所望の特質と区別不能である場合がある。「実質的に」は、所望の特質と区別できる場合があるが、その違いは重要ではないかまたは無視できるものである。

【0194】

本明細書で使用する「増加した」、「増加すること」、または「増加する」という用語は一般的に、参照レベルと比較して、統計的に有意な量の増加を意味する。いくつかの態様では、「増加した」、または「増加する」という用語は、参照レベルと比較して少なくとも１０％の増加、例えば、参照レベルと比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％の増加、または１００％以下の増加、または１０～１００％の間の任意の増加を意味する。「増加」の他の例としては、参照レベルと比較して、少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１０００倍以上の増加が挙げられる。

【0195】

「減少した」、「減少すること」、または「減少する」という用語は、本明細書では一般的に、参照レベルと比較しての値の減少を意味するために使用する。いくつかの態様では、「減少した」、または「減少する」とは、参照レベルと比較して少なくとも１０％の減少、例えば、少なくとも約２０％、または少なくとも約３０％、または少なくとも約４０％、または少なくとも約５０％、または少なくとも約６０％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、または最大１００％以下の減少（例えば、参照レベルと比較して、レベルが存在しないこと、または検出不可能なレベル）、あるいは、参照レベルと比較して、１０～１００％の間の任意の減少を意味する。

【0196】

本明細書に記載される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。

【0197】

実施形態
実施形態１．ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含む単離免疫細胞を含む組成物であって、前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記組成物。

【0198】

実施形態２．前記免疫細胞が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の、実質的に全てのコピー全ての、遺伝子組み換えによる破壊を含む、実施形態１に記載の組成物。

【0199】

実施形態３．前記免疫細胞が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の機能喪失を有する、実施形態１または２に記載の組成物。

【0200】

実施形態４．前記免疫細胞が、任意選択で、前記免疫細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで引き起こされる、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の両方のアレルの機能喪失を有する、実施形態１～３に記載の組成物。

【0201】

実施形態５．前記Ｂ２Ｍ遺伝子の前記遺伝子組み換えによる破壊が、ヒトＢ２Ｍのエクソン３に存在する、実施形態１～４のいずれか１つに記載の組成物。

【0202】

実施形態６．前記Ｂ２Ｍ遺伝子の前記遺伝子組み換えによる破壊が、欠失である、実施形態１～５のいずれか１つに記載の組成物。

【0203】

実施形態７．前記欠失が、約１０～約２０ヌクレオチドである、実施形態６に記載の組成物。

【0204】

実施形態８．前記欠失が、約１４ヌクレオチドである、実施形態７に記載の組成物。

【0205】

実施形態９．前記欠失が、前記ヒトＢ２Ｍ遺伝子のヌクレオチド５００～５５０付近にある、実施形態７または実施形態８に記載の組成物。

【0206】

実施形態１０．前記欠失が、配列ＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧ（配列番号２）、または、その機能的等価物のものである、実施形態９に記載の組成物。

【0207】

実施形態１１．前記免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩ発現及び／または活性が下方制御されている、実施形態１～１０のいずれか１つに記載の組成物。

【0208】

実施形態１２．前記免疫細胞が、対象への投与の際に、宿主免疫系により実質的に認識されない、実施形態１～１１のいずれか１つに記載の組成物。

【0209】

実施形態１３．前記免疫細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含まない免疫細胞と比較して、宿主Ｔ細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている、実施形態１～１２のいずれか１つに記載の組成物。

【0210】

実施形態１４．前記免疫細胞は、前記Ｂ２Ｍ遺伝子に遺伝子組み換えによる破壊を含む別の免疫細胞と比較して、他の宿主免疫細胞による細胞殺傷に対する感度が低下している、または取り除かれている、実施形態１～１３のいずれか１つに記載の組成物。

【0211】

実施形態１５．前記免疫細胞がステルス細胞である、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の組成物。

【0212】

実施形態１６．前記免疫細胞は、宿主免疫細胞のフラトリサイド、例えば、ＮＫ細胞のフラトリサイドが低下している、または取り除かれている、実施形態１～１５のいずれか１つに記載の組成物。

【0213】

実施形態１７．前記免疫細胞が、自己活性化可能である、実施形態１～１６のいずれか１つに記載の組成物。

【0214】

実施形態１８．前記免疫細胞は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びインターロイキン－１５（ＩＬ－１５）から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、自己活性化可能である、実施形態１７に記載の組成物。

【0215】

実施形態１９．前記免疫細胞が、腫瘍細胞傷害性を誘発可能である、実施形態１～１８のいずれか１つに記載の組成物。

【0216】

実施形態２０．前記免疫細胞は、ＩＬ－２及びＩＬ－１５から任意に選択されるインターロイキンが存在しない中で、腫瘍細胞傷害性を誘発可能である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の組成物。

【0217】

実施形態２１．前記免疫細胞が、ＭＨＣ ＩＩトランスアクチベーター（ＣＩＩＴＡ）遺伝子に、遺伝子組み換えによる破壊をさらに含む、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の組成物。

【0218】

実施形態２２．前記免疫細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ発現及び／または活性が下方制御されている、実施形態２１に記載の組成物。

【0219】

実施形態２３．前記免疫細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の組成物。

【0220】

実施形態２４．前記免疫細胞が、Ｂ２Ｍポリペプチド、ならびに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、融合タンパク質を発現する、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の組成物。

【0221】

実施形態２５．前記融合タンパク質が、修復鋳型を、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の一本鎖または二本鎖切断に挿入することにより発現し；前記修復鋳型が、前記Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ遺伝子用のコード配列を含む、実施形態２４に記載の組成物。

【0222】

実施形態２６．前記融合タンパク質が、免疫細胞により発現した、内因性Ｂ２Ｍ及びＨＬＡペアを置き換えることにより、前記免疫細胞が宿主免疫細胞により減少する、または取り除かれる可能性を低くする、実施形態２４及び実施形態２５に記載の組成物。

【0223】

実施形態２７．前記免疫細胞が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子における、遺伝子組み換えによる変異を含まない、実施形態１～２６のいずれか１つに記載の組成物。

【0224】

実施形態２８．前記遺伝子組み換えによる変異が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる低下または除去である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の組成物。

【0225】

実施形態２９．前記遺伝子組み換えによる変異が、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇから選択される１つ以上の遺伝子の発現及び／または活性の、遺伝子組み換えによる増加である、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の組成物。

【0226】

実施形態３０．前記免疫細胞、任意選択でＮＫ細胞を遺伝子組み換えし、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む、組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の組成物。

【0227】

実施形態３１．前記細胞内シグナル伝達ドメインが、少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有ドメインを含む、実施形態３０に記載の組成物。

【0228】

実施形態３２．前記細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のうちの１つに由来する、実施形態３０または３１のいずれか１つに記載の組成物。

【0229】

実施形態３３．前記膜貫通ドメインが、ＣＤ２８またはＣＤ８の１つに由来する、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の組成物。

【0230】

実施形態３４．前記抗原結合領域が、１つの抗原に結合する、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の組成物。

【0231】

実施形態３５．前記抗原結合領域が、２つの抗原に結合する、実施形態３０～３３のいずれか１つに記載の組成物。

【0232】

実施形態３６．抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
を含む、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の組成物。

【0233】

実施形態３７．抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
のうちの２つを含む、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の組成物。

【0234】

実施形態３８．抗原結合領域を含む前記細胞外ドメインが、
ａ．天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、及び
ｂ．免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）
のそれぞれのうちの１つを含む、実施形態３０～３５のいずれか１つに記載の組成物。

【0235】

実施形態３９．前記抗原結合領域が腫瘍抗原に結合する、実施形態３０～３８のいずれか１つに記載の組成物。

【0236】

実施形態４０．前記抗原結合領域が、
ａ．腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡ－Ｅに結合する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ａ；
ｂ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５に結合するＣＤ９６；
ｃ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＴＩＧＩＴ；
ｄ．腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＤＮＡＭ－１；
ｅ．腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡクラスＩに結合するＫＩＲ；
ｆ．腫瘍細胞上で任意選択でＮＫＧ２Ｄ－Ｌに結合するＮＫＧ２Ｄ；
ｇ．任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６ａであって、及び／または、ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、前記ＣＤ１６ａ；
ｈ．腫瘍細胞上で任意選択でＢ７－Ｈ６に結合するＮＫｐ３０；
ｉ．ＮＫｐ４４；ならびに
ｊ．ＮＫｐ４６
のうちの１つ以上を含む、実施形態３０～３９のいずれか１つに記載の組成物。

【0237】

実施形態４１．前記抗原結合領域が、免疫グロブリンドメイン、任意選択で、ＨＬＡ－Ｅ、ＣＤ１５５、ＣＤ１１２ ＨＬＡクラスＩ、ＮＫＧ２Ｄ－Ｌ、またはＢ７－Ｈ６に対して向けられるｓｃＦｖを含む、実施形態３０～４０のいずれか１つに記載の組成物。

【0238】

実施形態４２．前記抗原結合領域が、ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原に結合する、実施形態３０～４１のいずれか１つに記載の組成物。

【0239】

実施形態４３．前記抗原結合領域が２つの抗原に結合し、前記抗原が、
ａ．ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原、ならびに
ｂ．ＡＦＰ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ、ＣＤ１２３／ＩＬ３Ｒａ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３５／ＦＬＴ３、ＣＤ１３８、ＣＤ１４７、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３９（ＢＣＡＭ）、ＣＤ２７６（Ｂ７－Ｈ３）、ＣＤ３０、ＣＤ３１４／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ３１９／ＣＳ１／ＳＬＡＭＦ７、ＣＤ３２６／ＥＰＣＡＭ／ＴＲＯＰ１、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ７０、ＣＬＤＮ１８．２、ＣＬＤＮ６、ｃＭＥＴ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＰＨＡ２、ＦＡＰ、ＦＲアルファ、ＧＤ２、ＧＰＣ３、ＩＬ１３Ｒアルファ２、インテグリンＢ７、ルイスＹ（ＬｅＹ）、ＭＥＳＯ、ＭＧ７抗原、ＭＵＣ１、ＮＥＣＴＩＮ４、ＮＫＧ２ＤＬ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ／ＦＯＬ１、ＲＯＢＯ１、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ／ＴＡＣＩ、ＴＲＢＣ１、ＴＲＢＣ２、及びＴＲＯＰ２から選択される抗原
である、実施形態３０～４２のいずれか１つに記載の組成物。

【0240】

実施形態４４．前記組換えＣＡＲの前記細胞外ドメインが、ＮＫ細胞活性化受容体またはｓｃＦｖの細胞外ドメインを含む、実施形態３０～４３のいずれか１つに記載の組成物。

【0241】

実施形態４５．前記免疫細胞が、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における遺伝子編集を含む、実施形態３０～４４のいずれか１つに記載の組成物。

【0242】

実施形態４６．ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及びＨＰＫ１のうちの１つ以上における前記遺伝子編集が、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる、実施形態４５に記載の組成物。

【0243】

実施形態４７．前記遺伝子編集が、ＩＬ－６、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｄ、ＫＩＲ、ＴＲＡＣ、ＰＤ１、及び／またはＨＰＫ１の発現及び／または活性の低下または除去を引き起こす、実施形態４６に記載の組成物。

【0244】

実施形態４８．前記遺伝子編集が、ＩＬ－７、ＣＣＬ１７、ＣＣＲ４、ＩＬ－６Ｒ、ＩＬ－１２、ＩＬ－１５、及び／またはＴＲＡＩＬの発現及び／または活性の増加を引き起こす、実施形態４６に記載の組成物。

【0245】

実施形態４９．前記リンパ系細胞がＴ細胞である、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の組成物。

【0246】

実施形態５０．前記Ｔ細胞がガンマ－デルタＴ細胞である、実施形態４９に記載の組成物。

【0247】

実施形態５１．前記リンパ系細胞がＮＫ細胞である、実施形態１～４８のいずれか１つに記載の組成物。

【0248】

実施形態５２．前記ＮＫ細胞がＮＫ－Ｔ細胞である、実施形態５１に記載の組成物。

【0249】

実施形態５３．前記ＮＫ細胞がヒト細胞である、実施形態５１に記載の組成物。

【0250】

実施形態５４．前記ＮＫ細胞が、対象の体細胞に由来する、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の組成物。

【0251】

実施形態５５．前記ＮＫ細胞が、同種異系または自己由来細胞に由来する、実施形態５１～５４のいずれか１つに記載の組成物。

【0252】

実施形態５６．前記ＮＫ細胞が、人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞に由来する、実施形態５１～５５のいずれか１つに記載の組成物。

【0253】

実施形態５７．前記ｉＰＳが、体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることにより誘導され、前記リプログラムすることが、前記ｉＰＳ細胞を、任意選択で、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４から選択される、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、実施形態５６に記載の組成物。

【0254】

実施形態５８．前記リプログラムすることが、前記ｉＰＳ細胞を、各Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ｃＭｙｃ、及びＫｌｆ４をコードする１つ以上のＲＮＡと接触させることを含む、実施形態５７に記載の組成物。

【0255】

実施形態５９．前記ｉＰＳ細胞が、同種異系または自己由来細胞に由来する、実施形態５６または５７のいずれか１つに記載の組成物。

【0256】

実施形態６０．前記Ｂ２Ｍの前記遺伝子組み換えによる破壊が遺伝子編集を含み、前記遺伝子編集が、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることにより引き起こされる、実施形態１～５９のいずれか１つに記載の組成物。

【0257】

実施形態６１．前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６及びＣＤ１６のうちの１つ以上を発現する、実施形態１～６０のいずれか１つに記載の組成物。

【0258】

実施形態６２．前記ＮＫ細胞が、任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６ａであって、及び／または、前記ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、前記ＣＤ１６ａを発現する、実施形態６１に記載の組成物。

【0259】

実施形態６３．前記ＮＫ細胞がＣＤ３を発現しない、実施形態１～６２のいずれか１つに記載の組成物。

【0260】

実施形態６４．前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ ＣＤ１６ｄｉｍ／－である、実施形態１～６３のいずれか１つに記載の組成物。

【0261】

実施形態６５．前記ＮＫ細胞が、ＣＤ５６ｄｉｍ ＣＤ１６＋である、実施形態１～６４のいずれか１つに記載の組成物。

【0262】

実施形態６６．前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞、またはＣＤ２７－ ＣＤ１１ｂ－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫｔｏｌｅｒａｎｔ細胞である、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の組成物。

【0263】

実施形態６７．前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６ｄｉｍ ＮＫ細胞、またはＣＤ１１ｂ＋ ＣＤ２７－ ＮＫ細胞を含む、ＮＫｃｙｔｏｔｏｘｉｃ細胞である、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の組成物。

【0264】

実施形態６８．前記ＮＫ細胞が、任意選択で、ＣＤ５６ｂｒｉｇｈｔ ＮＫ細胞、またはＣＤ２７＋ ＮＫ細胞を含む、ＮＫｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ細胞である、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の組成物。

【0265】

実施形態６９．前記ＮＫ細胞が、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞である、実施形態１～６５のいずれか１つに記載の組成物。

【0266】

実施形態７０．前記ＮＫ細胞が、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ－ｇ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ－ａ）、腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ－ｂ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、インターロイキン－２（ＩＬ－２）、インターロイキン－７（ＩＬ－７）、インターロイキン－１０（ＩＬ－１０）、インターロイキン－１３（ＩＬ－１３）、マクロファージ炎症性タンパク質１ａ（ＭＩＰ－１ａ）、及び、マクロファージ炎症性タンパク質１ｂ（ＭＩＰ－１ｂ）から選択される１つ以上のサイトカインを分泌する、実施形態１～６９のいずれか１つに記載の組成物。

【0267】

実施形態７１．前記ＮＫ細胞が、自殺遺伝子産物をコード可能な１つ以上の組換え遺伝子をさらに含む、実施形態１～７０のいずれか１つに記載の組成物。

【0268】

実施形態７２．前記自殺遺伝子産物が、チミジンキナーゼ及びアポトーシスシグナル伝達タンパク質からなる群から選択されるタンパク質を含む、実施形態７１に記載の組成物。

【0269】

実施形態７３．前記遺伝子編集タンパク質が、ヌクレアーゼ、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＲｉｂｏＳｌｉｃｅ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、ニッカーゼ、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復（ＣＲＩＳＰＲ）関連タンパク質または天然もしくは組換えバリアント、ファミリーメンバー、オルソログ、これらの断片または融合構築物から選択される、実施形態６０～７２のいずれか１つに記載の組成物。

【0270】

実施形態７４．前記ＲＮＡがｍＲＮＡである、実施形態２～７３のいずれか１つに記載の組成物。

【0271】

実施形態７５．前記ＲＮＡが修飾ｍＲＮＡである、実施形態７４に記載の組成物。

【0272】

実施形態７６．前記修飾ｍＲＮＡが、１つ以上の非標準ヌクレオチドを含む、実施形態７５に記載の組成物。

【0273】

実施形態７７．前記非標準ヌクレオチドが、ピリミジンに対して、２Ｃ位、４Ｃ位、及び５Ｃ位から選択される、または、プリンに対して、６Ｃ位、７Ｎ位、及び８Ｃ位から選択される位置において、１つ以上の置換を有する、実施形態７６に記載の組成物。

【0274】

実施形態７８．前記非標準ヌクレオチドが、任意選択で、前記非標準ヌクレオチドの少なくとも５０％、または少なくとも６０％、または少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または１００％の量で、５－ヒドロキシシチジン、５－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、５－カルボキシシチジン、５－ホルミルシチジン、５－メトキシシチジン、シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、５－メチルウリジン、５－ヒドロキシメチルウリジン、５－カルボキシウリジン、５－ホルミルウリジン、５－メトキシウリジン、５－ヒドロキシシュードウリジン、５－メチルシュードウリジン、５－ヒドロキシメチルシュードウリジン、５－カルボキシシュードウリジン、５－ホルミルシュードウリジン、及び５－メトキシシュードウリジンのうちの１つ以上を含む、実施形態７６または７７のいずれか１つに記載の組成物。

【0275】

実施形態７９．前記ＲＮＡが、５’キャップ構造を含む、実施形態２～７８のいずれか１つに記載の組成物。

【0276】

実施形態８０．前記ＲＮＡ ５’－ＵＴＲが、コザックコンセンサス配列を含む、実施形態２～７９のいずれか１つに記載の組成物。

【0277】

実施形態８１．前記ＲＮＡ ５’－ＵＴＲが、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、前記５’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビン５’－ＵＴＲを含むことができる、実施形態８０に記載の組成物。

【0278】

実施形態８２．前記ＲＮＡ ３’－ＵＴＲが、インビボでＲＮＡ安定性を増加させる配列を含み、前記３’－ＵＴＲが、アルファグロビンまたはベータグロビン３’－ＵＴＲを含むことができる、実施形態２～８１のいずれか１つに記載の組成物。

【0279】

実施形態８３．前記ＲＮＡが、３’ポリ（Ａ）テールを含む、実施形態２～８２のいずれか１つに記載の組成物。

【0280】

実施形態８４．前記ＲＮＡ３’ポリ（Ａ）テールが、約２０ヌクレオチド～約２５０ヌクレオチド長である、実施形態８３に記載の組成物。

【0281】

実施形態８５．前記ＲＮＡが、約２００ヌクレオチド～約５０００ヌクレオチド長である、実施形態２～８４のいずれか１つに記載の組成物。

【0282】

実施形態８６．前記ＲＮＡが、インビトロ転写により調製される、実施形態２～８５のいずれか１つに記載の組成物。

【0283】

実施形態８７．前記骨髄細胞がマクロファージである、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の組成物。

【0284】

実施形態８８．前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである、実施形態８７に記載の組成物。

【0285】

実施形態８９．前記実施形態のいずれかに記載の単離ＮＫ細胞を含む、医薬組成物。

【0286】

実施形態９０．組換え免疫細胞の作製方法であって、
ａ．体細胞をｉＰＳ細胞にリプログラムすることであって、前記リプログラムすることは、前記ｉＰＳ細胞を、１つ以上のリプログラミング因子をコードするリボ核酸（ＲＮＡ）と接触させることを含む、前記リプログラムすることと、
ｂ．前記ｉＰＳ細胞内のＢ２Ｍ遺伝子を破壊することであって、前記破壊することは、前記細胞を、１つ以上の遺伝子編集タンパク質をコードするＲＮＡと接触させることで、前記細胞を遺伝子編集することを含む、前記破壊することと、
ｃ．前記ｉＰＳ細胞を免疫細胞に分化させることと、を含み、
ｄ．前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記方法。

【0287】

実施形態９１．前記免疫細胞がＮＫ細胞である、実施形態９０に記載の方法。

【0288】

実施形態９２．前記ＮＫ細胞がＮＫ－Ｔ細胞である、実施形態９１に記載の方法。

【0289】

実施形態９３．前記ＮＫ細胞がヒト細胞である、実施形態９１または９２に記載の方法。

【0290】

９４．前記リンパ系細胞がＴ細胞である、実施形態９０に記載の方法。

【0291】

実施形態９５．前記Ｔ細胞がガンマ－デルタＴ細胞である、実施形態９４に記載の方法。

【0292】

実施形態９６．前記骨髄細胞がマクロファージである、実施形態９０に記載の方法。

【0293】

実施形態９７．前記マクロファージが、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージである、実施形態９６に記載の方法。

【0294】

実施形態９８．前記体細胞が線維芽細胞またはケラチノサイトである、実施形態９０～９７のいずれか１つに記載の方法。

【0295】

実施形態９９．前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、ｉＰＳ細胞の増殖速度の増加をもたらす、実施形態９０～９８のいずれか１つに記載の方法。

【0296】

実施形態１００．前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の増殖速度の増加をもたらす、実施形態９０～９９のいずれか１つに記載の方法。

【0297】

実施形態１０１．前記方法が、前記Ｂ２Ｍ遺伝子の破壊を伴わないｉＰＳ細胞の速度と比較して、リンパ系列細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ ｌｉｎｅａｇｅ ｃｅｌｌ）に沿った分化細胞の拡大の増加をもたらす、実施形態９０～１００のいずれか１つに記載の方法。

【0298】

実施形態１０２．前記分化が、胚様体に基づく造血関与を含む、実施形態９０～１０１のいずれか１つに記載の方法。

【0299】

実施形態１０３．前記分化が、ＣＤ３４＋細胞の濃縮を含む、実施形態９０～１０２のいずれか１つに記載の方法。

【0300】

実施形態１０４．前記分化が、ＣＤ５＋／ＣＤ７＋一般リンパ系前駆細胞への分化を含む、実施形態９０～１０３のいずれか１つに記載の方法。

【0301】

実施形態１０５．前記方法が、ＣＤ５６ｄｉｍ ＣＤ１６＋ＮＫ細胞をもたらす、実施形態９０～１０４のいずれか１つに記載の方法。

【0302】

実施形態１０６．前記ＲＮＡが、表Ａ及び／または式Ｉ－ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と会合している、実施形態９０～１０５のいずれか１つに記載の方法。

【0303】

実施形態１０７．前記免疫細胞が、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の細胞である、実施形態９０～１０６のいずれか１つに記載の方法。

【0304】

実施形態１０８．がんの処置方法であって、
ａ．Ｂ２Ｍ遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手することと、
ｂ．前記単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与することと、を含み、
ｃ．前記免疫細胞が、リンパ系細胞またはＣＡＲ骨髄細胞である、前記方法。

【0305】

実施形態１０９．前記免疫細胞がＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞、例えばＮＫ－Ｔ細胞；またはマクロファージ、例えばＭ１マクロファージもしくはＭ２マクロファージ、及びＮＫ細胞である、実施形態１０８に記載の方法。

【0306】

実施形態１１０．前記がんが血液癌である、実施形態１０８または１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0307】

実施形態１１１．前記がんが充実性腫瘍である、実施形態１０８または１０９のいずれか１つに記載の方法。

【0308】

実施形態１１２．前記がんが、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳癌及び中枢神経系癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化器癌を含む）；膠芽腫；肝細胞癌；肝癌；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ ＮＨＬ）；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他のがん腫及び肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーシス、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連するもの）、及びメーグス症候群に関連する異常な血管増殖から選択される、実施形態１０８～１１１のいずれか１つに記載の方法。

【0309】

実施形態１１３．前記免疫細胞が、実施形態１～８６のいずれか１つに記載の細胞である、実施形態１０８～１１２のいずれか１つに記載の方法。

【0310】

実施形態１１４．ＣＤ１６ａ遺伝子に遺伝子編集を含む単離免疫細胞を含む組成物であって、前記免疫細胞が、リンパ系細胞または骨髄細胞から選択される、前記組成物。

【0311】

実施形態１１５．前記遺伝子編集が、前記ＣＤ１６ａを、ＣＤ１６ａの高親和性バリアントに形質転換させる、実施形態１１４に記載の組成物。

【0312】

実施形態１１６．前記遺伝子編集が、１５８位に、フェニルアラニンのバリンへの置換（Ｆ１５８Ｖ）を導入する、実施形態１１４または実施形態１１５に記載の組成物。

【0313】

実施形態１１７．前記細胞が、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、実施形態１１６に記載の組成物。

【0314】

本発明は、以下の非限定例によりさらに説明される。

【実施例】

【0315】

以下の実施例は、例証目的のためのみに含まれており、本発明の範囲を限定するようには意図されていない。

【0316】

実施例１：細胞の調製方法及び結果
図１Ａは、本実施例で用いる細胞の製造方法の概略図を示す。ｍＲＮＡベースの細胞リプログラミング（線維芽細胞からｉＰＳ細胞）、及び遺伝子編集（ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）ノックアウト）を用いた。さらに、編集した細胞を、細胞傷害性リンパ系細胞に分化させた。図１Ｂは、がん細胞を殺傷する、分化した細胞傷害性リンパ系細胞を示す。

【0317】

線維芽細胞はヒト対象から入手し、ｍＲＮＡベースのリプログラミングを用いて、ｉＰＳ細胞にリプログラムした。

【0318】

新規のリンカー領域を含有するＤＮＡ結合ドメインを含む、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によりコードされた遺伝子編集エンドヌクレアーゼを用いる、ｉＰＳＣ中で画定される座位の効率的な標的化を行った（例えば、ＬＴＰＥＱＶＶＡＩＡＳ＊ＲＶＤ＊ＧＧＫＱＡＬＥＴＶＱＲＬＬＰＶＬＣＱＡＧＨＧＧ（配列番号４３、「＊ＲＶＤ＊」は、配列番号３のジヌクレオチド「ｘｙ」に対応する。）の少なくとも１つの反復を有するＤＮＡ結合ドメインを含む、遺伝子編集タンパク質）。ＭＨＣクラスＩ分子の主要な成分である、Ｂ２Ｍのエクソン３を標的化し、１２個の株のうち１０個（１２個の株のうち６個は、所望の両アレル欠失を含有する。）の標的化編集を確認した。インターフェロンγへの曝露の後、Ｂ２Ｍ上方制御の観点から、ＲＴ－ＰＣＲ及び免疫蛍光法により、ｉＰＳＣにおける遺伝子ノックアウトを確認した。

【0319】

より具体的には、以下のベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子を標的化した：

【0320】

【表2】

そして、以下のプライマーを用いた：Ｂ２Ｍ＿Ｆｗｄ：
ＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＡＡＡＡＴＧＣＡＧＣＧＣＡＡＴＣＴＣＣＡＧ（配列番号４５）及びＢ２Ｍ＿Ｒｅｖ：ＣＡＣＴＴＡＡＣＴＡＴＣＴＴＧＧＧＣＴＧＴＧＡＣＡＡＡＧＴＣＡＣＡＴＧＧＴＴＣＡＣＡＣ（配列番号４６）及びＢ２Ｍ＿Ｒｅｖ＿ＲＣ：
ＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＴＧ（配列番号４７）。図２を参照されたい。

【0321】

上記配列において、上から下にかけて、配列は以下を特徴とする：
太字：エクソン。
マークなし：イントロン
下線（一本線）：左側遺伝子編集タンパク質結合部位。
下線（二本線）：右側遺伝子編集タンパク質結合部位。
大文字。遺伝子編集タンパク質結合部位と切断領域との間の分離領域。
下線（点線）：増幅プライマー結合部位。

【0322】

図３は、成功した遺伝子編集を示す。１．２×１０^５個のｉＰＳＣをエレクトロポレーションし、ｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングした２４ウェルプレートの馴化培地にプレーティングし、４８時間増殖させた。細胞をｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングした６ウェルプレートに継代した。細胞をさらに４日間培養した。細胞を、ゲノムＤＮＡ抽出の間で分裂させ、２．０×１０^４個の細胞を、ｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングした６ウェルプレートのウェルに播種した。Ｂ２Ｍのアンプリコンの長さは５８７ｂｐであり、編集したバンド１は４１６ｂｐ（「＊」を参照されたい）であり、編集したバンド２は１７１ｂｐ（「＊」を参照されたい）であった。配列決定により、Ｂ２Ｍにおいて１４個の塩基対の欠失が確認された（図４を参照されたい）。

【0323】

図５は、ＩＦＮガンマ活性化を伴う、または伴わない、Ｂ２ＭのＲＮＡレベルを示す（「ＩＦＮＹ」；左の２つの棒はＢ２Ｍノックアウトであり、右の２つの棒はナイーブ細胞である）。１．５×１０^４個のｉＰＳＣを、ｒｈＬａｍｉｎｉｎ－５２１でコーティングした２４ウェルプレートの馴化培地にプレーティングし、２４時間増殖させた。次に、培地を、ＩＦＮガンマにより、またはこれを用いずに、２５ｎｇ／ｍＬの濃度で、馴化培地で置き換えた（ｔ＝０）。ｔ＝７２時間で細胞を回収するまで、毎日培地を交換した。ＲＮＡを抽出し、定量して、ＲＴ－ｑＰＣＲ分析のために正規化した。ハウスキーピング遺伝子はＧＡＰＤＨであり、試験遺伝子はＢ２Ｍであった。

【0324】

ヒトｉＰＳＣを機能性ＮＫ細胞に分化させるように指示するための、拡張性のある３Ｄ培養系を開発した。本プロセスは、マイクロパターニングしたウェル、または、多層培養容器（ＳｔｅｍＤｉｆｆ（商標）Ｔ／ＮＫ Ｃｅｌｌキット→ＳｔｅｍＳｐａｎ Ｔ／ＮＫ分化キット） 中での、本プロセスの調整版のいずれかで実施する、短い胚様体ベースの造血関与工程を伴った。造血関与に続けて、増殖、ＣＤ３４＋細胞の濃縮、及び、ＣＤ５＋／ＣＤ７＋一般リンパ系前駆細胞への分化を行った。次に、本プロセスを、１４日間のＮＫ細胞分化期を経て機能性ＣＤ５６ｄｉｍ／ＣＤ１６＋ ＮＫ細胞を得た、または、２２日間のＴ細胞分化期を経て、ＣＤ８＋ Ｔ細胞を得た。

【0325】

下表は、生成した細胞の概要を示す：

【0326】

【表3】

【0327】

本表は、野生型と比較して、Ｂ２Ｍノックアウト細胞が頑健に増殖したこともまた示す。標的部位において１４個のｂｐ欠失を有する、Ｂ２Ｍ－／－ｉＰＳＣ株（図４に示す）は、ｉＰＳＣとして、及び、野生型ｉＰＳＣ株と比較したときに、リンパ系列に沿っての分化の間の両方において、増殖速度の増加を示した。

【0328】

さらに、例示的な分化細胞型としての、得られたＮＫ細胞を、ＣＤ１６ａ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ Ｐ０８６３７（ＦＣＧ３Ａ＿ＨＵＭＡＮ））に対して特性決定すると、Ｇ１４７Ｄ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ４４３０８２、Ｙ１５８Ｈ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ３９６７１６、及びＦ１７６Ｖ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ３９６９９１においてヘテロ接合であることが測定された。Ｆ１７６Ｖ ｄｂＳＮＰ：ｒｓ３９６９９１は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４の高い結合能力を示す。図６を参照されたい。ｇＤＮＡを、２工程ＰＣＲ：カッパＨｉＦｉ ＨｏｔＳｔａｒｔ（３５×／６４℃伸長）で増幅した：プライマーは、Ｆ：ＣＴＧＡＴＣＴＡＧＡＡＣＴＴＡＣＴＧＴＧＡＡＴＣＣＴＴＧＴＣＡＣＣＴＧＣＣＡＣ（配列番号４８）、及びＲ：ＧＡＴＡＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＡＣＧＡＴＡＧＧＡＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＣ（配列番号４９）であった。

【0329】

本実施例は、とりわけ、例示的な分化細胞型として、野生型及び組換えｉＰＳＣの両方の、機能的ＮＫ細胞への分化のための拡張性のある３Ｄプロセスを示す。本明細書に記載する３Ｄプロセスは、野生型及び組換えｉＰＳＣの両方の、Ｔ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞またはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ－Ｔ細胞；及びマクロファージ、例えば、Ｍ１マクロファージまたはＭ２マクロファージを含むがこれらに限定されない、リンパ系または骨髄系列の他の機能性免疫細胞への分化にもまた有用である。本プロセスは、免疫腫瘍学用途のための、次世代細胞療法の開発を支える。

【0330】

本明細書で開示する方法は、トランスフェクトしたＲＮＡが、表Ａ及び／または式Ｉ～ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と関連する際に強化される。

【0331】

実施例２：細胞の特性決定方法及び結果
表現型及び機能特性決定アッセイを用いて、実施例１の細胞を評価した。

【0332】

表現型特性決定では、表面マーカー、特に（例えば、ＣＤ５６でゲーティングされる）ＣＤ５６／ＣＤ１６のフローサイトメトリー染色を用いた。（例えば、ＣＤ５６でゲーティングされる）ＣＤ５６／ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ５６／ＣＤ４５、ＣＤ５６／ＣＤ３、ＣＤ５６／ＣＤ２４４、ＣＤ５６／ＣＤ９４／ＮＫＧ２Ａ、ＣＤ５６／ＮＫｐ４６、ＣＤ５６／ＮＫｐ４４、ＣＤ５６／ＫＩＲ、ＣＤ５６／ＴＲＡＩＬ、及びＣＤ５６／ＦＡＳＬもまた評価した。図１０Ａ～図１０Ｃ、及び、下表を参照されたい：

【0333】

この最初の表におけるデータは、１ラウンド目の懸濁での、ＰＢＭＣ単離ＮＫ細胞とｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞を特性決定する：

【0334】

【表4】

【0335】

この２番目の表におけるデータは、２ラウンド目の懸濁での、ｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞－ＡｇｇｒｅＷｅｌｌ（商標）とｉＰＳＣ由来のＮＫ細胞を特性決定する

【0336】

【表5】

【0337】

例示したＢ２Ｍ編集、分化細胞型、即ち、ＮＫ細胞は、ＣＤ４５＋、ＣＤ５６＋、ＣＤ１６－、ＮＫＧ２Ｄ－、ＫＩＲ２ＤＬ４－、ＫＩＲ２ＤＬ１－、及びＣＤ８－であった。図１０もまた参照されたい。

【0338】

機能特性決定は、細胞傷害性、活性化の測定、ならびにサイトカイン放出アッセイ、及び例示的な分化細胞型、即ち、ＮＫ細胞に対する増殖アッセイの評価を伴った。

【0339】

カルセインＡＭ（大部分の真核細胞で細胞生存能を測定するために用いる、細胞透過性色素）をロードした標的細胞を用いて、ＮＫ細胞傷害性を測定した。生きた細胞では、非蛍光のカルセインＡＭを、細胞内エステラーゼによるアセトキシメチルエステル加水分解の後に、緑色蛍光カルセインに転換する。様々な、エフェクター（ＮＫ細胞）：標的（Ｋ－５６２細胞）比（Ｅ：Ｔ比）を試験し、腫瘍の殺傷を観察した。Ｋ－５６２細胞は、末期の急性転化（骨髄（ＢＭ）、末梢血における、３０％を超える未成熟細胞、ＢＭ中の芽球への大きな集中、または、芽細胞による延髄外浸潤の存在）における、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）を患う５３歳女性由来のがん細胞株である。これらの細胞は一般に、ＮＫ活性を阻害するために必要なＭＨＣ複合体を欠いているため、細胞傷害性アッセイに用いる。実験は、サイトカインカクテル（ＩＬ－１５及びＩＬ－２）を用いて、またこれを用いずにインキュベートしたエフェクター細胞もまた含む。

【0340】

Ｋ－５６２細胞に、カルセインＡＭを１時間ロードし、１０％ＦＢＳを含む完全ＲＰＭＩ－１６４０で洗浄した後、ＮＫ細胞と共培養した。細胞を、Ｏｐｅｒａｔｔａハイコンテンツイメージャーを用いて、３０分毎に撮像しながら１８時間共培養した。実行が終了すると、細胞懸濁液を遠心分離し、培地を回収した。馴化培地をＬｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸで試験し、ＩＦＮｇ及びＴＮＦａを検出し、これらの濃度を測定した。細胞を再懸濁し、ＣＤ５６／ＣＤ１６、及びＣＤ５６／ＣＤ１０７４ａに対して染色した。

【0341】

本明細書に記載する、及び／または、当該技術分野において周知の方法を用いて、フローサイトメトリーにより活性化マーカーＣＤ１０７ａを測定することにより、活性化を評価した。

【0342】

サイトカイン放出アッセイに関して、細胞傷害性測定の後、培地を回収し、本明細書に記載する、及び／または、当該技術分野において周知の方法を用いて、サイトカイン放出をアッセイした（ＩＦＮｇ及びＴＮＦａ）。

【0343】

増殖に関して、細胞を、活性化サイトカインＩＬ－１５の存在下でインキュベートし、３日毎に培地を交換した。３日毎に、試料をペレット処理して洗浄し、活性化サイトカインを含有する新鮮な培地に再度播種し、計数して、細胞の数及び生存能を経時的に追跡した。細胞を２８日にわたって追跡した。この実験中、培地を、Ｌｕｍｉｎｅｘ免疫パネルにより、サイトカイン評価のために保存した。

【0344】

この取扱いで残った細胞を、既知の細胞数及びイメージで、未処理９６ウェルプレートに播種し、細胞の計数、及び、培地のＩＬ－１５との交換を、３日毎に２８日間行った。

【0345】

ＮＫ－９２細胞は、急速進行性非ホジキンリンパ腫を患う、５０歳のコーカサス男性の末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）に由来する、インターロイキン２（ＩＬ－２）依存性ナチュラルキラー細胞株である。ＮＫ－９２細胞を、ＮＫ細胞傷害性実験用の対照細胞として用い、腫瘍細胞の機能性殺傷を証明する。本明細書では、ＮＫ－９２細胞を、カルセインＡＭを用いる細胞傷害性アッセイで使用する。ＮＫ細胞が関与する際、ＮＫ細胞はサイトカイン及びヒストンを培地に分泌する。ヒストンは、細胞の「クランピング」として観察可能な、「免疫学的血栓形成」の発生として知られている、炎症及び凝固メカニズムに非常に関与している。

【0346】

細胞傷害性アッセイ、活性化、及び、サイトカイン放出プレートレイアウトについて、試料を３通りで実行した；細胞混合物を、サイトカインカクテル（ＩＬ－１５＋ＩＬ－２）を用いて、またこれを用いずに試験した；単一ドナー由来のＰＢＭＣ単離ＮＫ細胞を対照として用いた；ＰＢＭＣ単離ＮＫ細胞、及び３Ｄ Ｂ２Ｍ－／－ＮＫ細胞（本開示の方法により作製）を、２つの異なるＥ：Ｔ比（２万個のＮＫ細胞と２万個のＫ－５６２細胞（１：１のＥ：Ｔ比）、及び、３万個のＮＫ細胞と２万個のＫ－５６２細胞（３：１のＥ：Ｔ比））で試験した；２Ｄ野生型及び２Ｄ Ｂ２Ｍ－／－ＮＫ細胞（本開示の方法により作製）を、１：１のＥ：Ｔ比で試験した；そして、３Ｄ野生型には上記試験を行わず、増殖のためにプレーティングした。

【0347】

ＮＫ細胞傷害性アッセイを、図７Ａ～Ｂ、及び図８Ａ～Ｂに示す（時間経過は、１秒当たり５フレームである）。５フレームは、２．５時間に相当する。配向に関しては、Ｋ－５６２細胞が、ＮＫ細胞よりも本明細書での図では大きいことに注意されたい。図７Ａ～Ｂは、０及び１８時間後の時点で、サイトカインカクテルなしで、Ｋ－５６２（３：１のＥ：Ｔ）で共培養したＰＢＭＣ単離ＮＫ細胞（即ち、対照細胞）を示す。ＮＫ細胞攻撃に起因するＫ－５６２細胞のクランピングが観察された。このことは、アッセイが予想通り実施されていることを示している。図８Ａ～Ｂは、サイトカインカクテルなしで、Ｋ－５６２（３：１のＥ：Ｔ）で共培養した３Ｄ Ｂ２Ｍ－／－ＮＫ細胞を示す。ＮＫ細胞の攻撃が観察されたため、そして、ＰＭＢＣ単離ＮＫ細胞のレベルよりも驚くほどはるかに高いレベルで、Ｋ－５６２細胞のクランピングが観察される（図７Ｂ及び図８Ｂを比較されたい：より多くのクランピング、及びより少ない関与していない（ｌｅｓｓ ｕｎｅｎｇａｇｅｄ）ＮＫ細胞に注意されたい）。

【0348】

Ｌｕｍｉｎｅｘ ＭＡＧＰＩＸを用いたサイトカイン放出アッセイの結果を、図９Ａ～９Ｈに示す。示さない限り（即ち、「＋ＩＬ２、ＩＬ１５」）、条件は、ＩＬ－２またはＩＬ－１５を加えていないものである。さらに、細胞の比を示す（１：１、または３：１）。本明細書の他の箇所におけるように、野生型ＰＢＭＣ由来ＮＫは、対照ＮＫ細胞である。図９Ａは、インターフェロンガンマを示す。図９Ｂは、ＩＬ－２を示す。図９Ｃは、ＩＬ－７を示す。図９Ｄは、ＩＬ－１３を示す。図９Ｅは、ＭＩＰ－１ａを示す。図９Ｆは、ＭＩＰ－１ｂを示す。図９Ｇは、ＴＮＦａを示す。図９Ｈは、ＧＭ－ＣＳＦを示す。

【0349】

要するに、非限定的に、本明細書のデータは、（ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインが存在しない中でも）自己殺傷するのではなく、自己活性化するＢ２Ｍノックアウト免疫細胞の場合の生成を示す。さらに、これらのＢ２Ｍノックアウト細胞は、（ＩＬ－２及びＩＬ－１５などのサイトカインが存在しない中でも）腫瘍細胞を殺傷することができ、予想外の拡大及び増殖特性を有する。

【0350】

実施例３：Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅの挿入
本実施例では、Ｂ２Ｍコード配列及びＨＬＡ－Ｅ（主要組織適合性複合体クラスＩ、Ｅ）コード配列を含む修復鋳型（Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型）を、ベータ－２－ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）編集に挿入した。ここでは、本明細書で開示する、Ｂ２Ｍ遺伝子が編集されたｉＰＳＣを、ＨＬＡ－Ｅ用のコード配列を含む修復鋳型と接触させる。あるいは、未編集のｉＰＳＣを、遺伝子編集構成要素と接触させ、ＨＬＡ－Ｅ用のコード配列を含む修復鋳型と共にＢ２Ｍ遺伝子を編集する。両方の場合において、得られた細胞（ｉＰＳＣにおける、または、リンパ系もしくは骨髄系列の免疫細胞に分化した際のいずれか）は、編集されたＢ２Ｍ遺伝子を有し、変更された箇所でＨＬＡ－Ｅを発現することになる。

【0351】

図１１Ａに示すように、Ｂ２Ｍのエクソン１に完全に含まれる、Ｂ２Ｍシグナルペプチド配列（Ｂ２Ｍ＿ｓｐ）は、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型に含まれる。理論に拘束されることを望むものではないが、Ｂ２Ｍのエクソン１を編集し、Ｂ２Ｍ ＣＤＳ全体を含めることによって、融合物を生成するための最も直接的な経路がもたらされる。

【0352】

Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型の理想的な挿入は、図１１Ｂに示すように、Ｂ２Ｍのエクソン１－イントロン１の境界に位置する。遺伝子編集され、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型をそのゲノムに組み込んだ、実線１／１及び２／２を含む、さらなる結合部位を、図１１Ｃに示す。

【0353】

本明細書で開示する方法を用いて、細胞を遺伝子編集し、修復鋳型をゲノムに挿入した。図１１Ｄは、図１１Ｃの１／１及び２／２位におけるゲノムに修復鋳型を挿入した、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型（約１．５ｋｂ）を有する、２つの株のサイズを有するゲルを示す。本例においては、間葉幹細胞（ＭＳＣ）細胞を遺伝子編集した。図１１Ｅは、図１１Ｄに示すバンド由来のシグナルの強度、及びその比率を示す。

【0354】

本明細書で開示する方法を用いて、細胞を遺伝子編集し、修復鋳型をゲノムに挿入した。図１１Ｆは、図１１Ｃの２／２位におけるゲノムに修復鋳型を挿入した、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型（約１．５ｋｂ）を有する、１つの株のサイズを有するゲルを示す。本例においては、ｉＰＳＣを遺伝子編集した。図１１Ｇは、図１１Ｆに示すバンド由来のシグナルの強度、及びその比率を示す。

【0355】

図１１Ｈは、Ｂ２Ｍ－ＨＬＡ－Ｅ修復鋳型中の、関連する配列を示す。

【0356】

特に、他の細胞、例えば、本明細書に記載する分化細胞は、遺伝子編集され、対象となるコード配列、例えば、ＨＬＡ－Ｅコード配列を含む修復鋳型を挿入されていることができる。

【0357】

本実施例の方法により、修復鋳型は、細胞に、Ｂ２Ｍを、Ｂ２Ｍを機能化するために必要なＨＬＡ－Ｅにより、例えば融合タンパク質として、発現させる。したがって、本方法は、ネイティブの内因性Ｂ２Ｍ遺伝子を破壊して、他のＨＬＡが機能化しないようにすることで、細胞を「ステルス化」させる。

【0358】

本明細書で開示する方法は、トランスフェクトしたＲＮＡが、表Ａ及び／または式Ｉ～ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と関連する際に強化される。

【0359】

実施例４：高親和性ＣＤ１６ａの挿入
本実施例では、Ｃ１６ａを編集し、高親和性ＣＤ１６ａバリアントのコード配列で置き換える。図１２Ａ及び１２Ｂに示すように、ＣＤ１６ａの１５８位におけるフェニルアラニン（Ｆ）は、Ｆをバリン（Ｖ）で置き換えるように遺伝子編集の標的となる。関連する配列を、これらの図に示す。

【0360】

図１２Ｂに示すように、ＮｈｅＩ部位は、ＣＤ１６ａ用のアンプリコンに現れないため、ＮｈｅＩ消化後に、約２１２７／９１２ｂｐにおいてバンドが存在することにより、ＣＤ１６＿ＮｈｅＩ＿ｓｓＯＤＮ＿８１及びＣＤ１６＿ＮｈｅＩ＿ｓｓＯＤＮ＿８１＿ＰＴによる修正の成功が示される。

【0361】

本明細書で開示する方法は、トランスフェクトしたＲＮＡが、表Ａ及び／または式Ｉ～ＸＶＩから選択される１つ以上の脂質と関連する際に強化される。

【0362】

実施例５：遺伝子編集及び分化細胞を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）に遺伝子組み換えする
本実施例では、本開示の方法により（例えば、遺伝子編集によりＢ２Ｍ遺伝子を破壊して、幹細胞から細胞を、リンパ系または骨髄系列の免疫細胞に分化させることにより）生成した、本開示の免疫細胞、例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子組み換えして、組換えキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。ＣＡＲは、細胞内シグナル伝達ドメインと、膜貫通ドメインと、抗原結合領域を含む細胞外ドメインと、を含む。実施形態では、本開示の免疫細胞を組み換えて、ＲＯＲ１及び／またはＣＤ１９に向けさせる。細胞を遺伝子組み換えして、組換えＣＡＲを発現させる方法は当該技術分野において周知であり、任意のこのような周知の方法を、本開示の免疫細胞と共に用いることができる。

【0363】

場合によっては、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）含有ドメインを含む。

【0364】

場合によっては、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３－ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、及びＣＤ１３７（４－１ＢＢ）のうちの１つに由来する。

【0365】

場合によっては、ＣＡＲの膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８の１つに由来する。

【0366】

場合によっては、抗原結合領域は、１つの抗原に結合する。実施形態では、結合領域は、２つの抗原に結合する。

【0367】

場合によっては、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、あるいは（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の２つを含む。実施形態では、抗原結合領域を含む細胞外ドメインは、（ａ）天然リガンドもしくは受容体、またはその断片、及び（ｂ）免疫グロブリンドメイン、任意選択で、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）のそれぞれの１つを含む。

【0368】

場合によっては、抗原結合領域は、腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡ－Ｅに結合する、ＣＤ９４／ＮＫＧ２ａ；腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５に結合するＣＤ９６；腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＴＩＧＩＴ；腫瘍細胞上で任意選択でＣＤ１５５またはＣＤ１１２に結合するＤＮＡＭ－１；腫瘍細胞上で任意選択でＨＬＡクラスＩに結合するＫＩＲ；腫瘍細胞上で任意選択でＮＫＧ２Ｄ－Ｌに結合するＮＫＧ２Ｄ；任意選択で、腫瘍細胞上で抗体／抗原複合体に結合するＣＤ１６ａであって、及び／または、ＣＤ１６ａは、任意選択で高親和性バリアントであり、任意選択で、Ｆ１５８Ｖに対してホモ接合またはヘテロ接合である、上記ＣＤ１６ａ；腫瘍細胞上で任意選択でＢ７－Ｈ６に結合するＮＫｐ３０；ＮＫｐ４４；ならびにＮＫｐ４６のうちの１つ以上を含む。

【0369】

実施例６：がんの処置
本実施例では、本開示の免疫細胞を用いてがんを処置する。

【0370】

がんの処置方法は、Ｂ２Ｍ遺伝子内に、遺伝子組み換えによる破壊を含む、単離免疫細胞を入手する工程と、単離免疫細胞を、それを必要とする対象に投与する工程と、を含む。本方法では、免疫細胞はリンパ系細胞系列または骨髄細胞である。場合によっては、免疫細胞はＴ細胞、例えば、細胞傷害性Ｔ細胞もしくはガンマ－デルタＴ細胞；ＮＫ細胞、例えばＮＫ－Ｔ細胞；またはマクロファージ、例えばＭ１マクロファージもしくはＭ２マクロファージ、及びＮＫ細胞である。

【0371】

場合によっては、加えて、または代替的に、免疫細胞は、高親和性ＣＤ１６ａ受容体を発現する。

【0372】

場合によっては、免疫細胞は、Ｂ２Ｍポリペプチド、ならびに、ＨＬＡ－Ａ、ＨＬＡ－Ｂ、ＨＬＡ－Ｃ、ＨＬＡ－Ｅ、ＨＬＡ－Ｆ、及びＨＬＡ－Ｇポリペプチドを含む、融合タンパク質を発現する。融合タンパク質は、修復鋳型を、Ｂ２Ｍ遺伝子の一本鎖または二本鎖切断に挿入することにより発現することができる；場合によっては、修復鋳型は、Ｂ２Ｍ及びＨＬＡ遺伝子用のコード配列を含む。特に、融合タンパク質は、免疫細胞により発現した、内因性Ｂ２Ｍ及びＨＬＡペアを置き換えることにより、免疫細胞が宿主免疫細胞により減少する、または取り除かれる可能性を低くする。

【0373】

場合によっては、免疫細胞はさらに遺伝子組み換えされ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する。

【0374】

がんは、血液癌であり得る。

【0375】

がんは、充実性腫瘍であり得る。

【0376】

がんは、基底細胞癌、胆道癌；膀胱癌；骨癌；脳癌及び中枢神経系癌；乳癌；腹膜癌；子宮頸癌；絨毛癌；結腸及び直腸癌；結合組織癌；消化器系の癌；子宮内膜癌；食道癌；眼癌；頭頸部癌；胃癌（消化器癌を含む）；膠芽腫；肝細胞癌；肝癌；上皮内腫瘍；腎臓癌または腎癌；喉頭癌；白血病；肝臓癌；肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌）；黒色腫；骨髄腫；神経芽細胞腫；口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）；卵巣癌；膵臓癌；前立腺癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；直腸癌；呼吸器系の癌；唾液腺癌；肉腫（例えば、カポジ肉腫）；皮膚癌；扁平上皮癌；胃癌；精巣癌；甲状腺癌；子宮癌または子宮内膜癌；泌尿器系の癌；外陰癌；ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）；小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ；中等度／濾胞性ＮＨＬ；中等度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み細胞ＮＨＬ（ｈｉｇｈ ｇｒａｄｅ ｓｍａｌｌ ｎｏｎ－ｃｌｅａｖｅｄ ｃｅｌｌ ＮＨＬ）；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；ＡＩＤＳ関連リンパ腫；ならびにワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）；急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）；有毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；ならびに他のがん腫及び肉腫；ならびに移植後リンパ増殖性疾患（ＰＴＬＤ）、ならびにファコマトーシス、浮腫（例えば、脳腫瘍と関連するもの）、及びメーグス症候群に関連する異常な血管増殖から選択され得る。

【0377】

均等物
本発明を、その特定の実施形態に関連して説明してきたが、さらなる修正が可能であり、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変形、使用、または適応を網羅することを意図するものであり、本発明が属する技術分野において公知の範囲内であるかまたは慣行の範囲内であるような本開示からの逸脱、ならびに本明細書に記載の本質的な特徴に適用され得るような、及び添付の特許請求の範囲に従うような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。

【0378】

当業者であれば、単なる通常の実験を使用して、本明細書に具体的に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。このような均等物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。

【0379】

参照による援用
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

【0380】

本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいかなる内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。

【0381】

本明細書で使用される場合、全ての表題は単に組織化のためのものであり、いかなる形でも本開示を制限することを意図するものではない。任意の個々の節の内容は、全ての節に等しく適用され得る。

【図1A】

【図1B】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9A】

【図9B】

【図9C】

【図9D】

【図9E】

【図9F】

【図9G】

【図9H】

【図10A】

【図10B】

【図10C】

【図10D】

【図11A】

【図11B】

【図11C】

【図11D】

【図11E】

【図11F】

【図11G】

【図11H】

【図12A】

【図12B】

【国際調査報告】