特表 2024-508304 Ｃｌａｕｄｉｎ－６に対する抗体およびそれの使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-26

(54)【発明の名称】Ｃｌａｕｄｉｎ－６に対する抗体およびそれの使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/13 20060101AFI20240216BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240216BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240216BHJP

   C12P 21/08 20060101ALI20240216BHJP

   C07K 16/28 20060101ALI20240216BHJP

   A61K 39/395 20060101ALI20240216BHJP

   A61K 47/68 20170101ALI20240216BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240216BHJP

【ＦＩ】

C12N15/13 ZNA

C12N15/63 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

C12P21/08

C07K16/28

A61K39/395 T

A61K47/68

A61K39/395 L

A61P35/00

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553178

(86)(22)【出願日】2022-03-01

(85)【翻訳文提出日】2023-10-23

(86)【国際出願番号】 US2022018383

(87)【国際公開番号】W WO2022187275

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/155,304

(32)【優先日】2021-03-02

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/240,399

(32)【優先日】2021-09-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】521339223

【氏名又は名称】ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(74)【代理人】

【識別番号】100103182

【弁理士】

【氏名又は名称】日野 真美

(74)【代理人】

【識別番号】100217663

【弁理士】

【氏名又は名称】末広 尚也

(72)【発明者】

【氏名】ファン，ハイチュン

(72)【発明者】

【氏名】レイ，ミン

(72)【発明者】

【氏名】ペイ，イ

(72)【発明者】

【氏名】リ，ハン

(72)【発明者】

【氏名】ル，フアルイ

【テーマコード（参考）】

4B064

4B065

4C076

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG27

4B064CA19

4B064CC24

4B064DA01

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AB01

4B065AC14

4B065BA02

4B065CA25

4B065CA44

4C076AA95

4C076CC27

4C076CC41

4C076EE41

4C076EE59

4C076FF70

4C085AA14

4C085AA26

4C085BB01

4C085BB11

4C085BB31

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045FA74

(57)【要約】

本開示は、ヒトＣＬＤＮ６に結合する抗体およびそれの抗体断片を提供する。本開示の抗体を、抗体ベースの免疫療法で使用して、抗体薬物コンジュゲートによる破壊のため、ＣＬＤＮ６発現がんに対して細胞傷害応答を方向付ける、またはＣＬＤＮ６発現がんを標的化することができる。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

（ａ）（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、ＣＤＲ３：配列番号１０；
（ｂ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、ＣＤＲ３：配列番号１３、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、ＣＤＲ３：配列番号１６；
（ｃ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、ＣＤＲ３：配列番号３４、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、ＣＤＲ３：配列番号３７；
（ｄ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、ＣＤＲ３：配列番号４０、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、ＣＤＲ３：配列番号４３；
（ｅ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、ＣＤＲ３：配列番号４０、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、ＣＤＲ３：配列番号４３；および
（ｆ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、ＣＤＲ３：配列番号４８、ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、ＣＤＲ３：配列番号５１
を含む、抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項2】

（ａ）配列番号１に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｂ）配列番号３に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号４に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｃ）配列番号２３に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｄ）配列番号２４に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２５に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｅ）配列番号２６に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２７に記載の配列を有する軽鎖可変領域；
（ｆ）配列番号２８に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号２９に記載の配列を有する軽鎖可変領域；または
（ｇ）配列番号３０に記載の配列を有する重鎖可変領域および配列番号３１に記載の配列を有する軽鎖可変領域
を含む、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項3】

ヒト抗体である、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項4】

キメラ抗体である、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項5】

細胞傷害剤にコンジュゲートされている、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項6】

完全長抗体である、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項7】

抗体断片である、請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項8】

前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、単鎖抗体、ミニボディ、ならびにダイアボディからなる群から選択される、請求項７に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体。

【請求項9】

活性成分として、請求項１から４のいずれか一項に記載の抗体の少なくとも１つのおよび医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項10】

活性成分として請求項５のいずれか一項に記載の抗体および薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。

【請求項11】

がんを処置するのに使用するための、請求項９または１０に記載の医薬組成物。

【請求項12】

がんを処置する方法であって、請求項９または１０に記載の医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、方法。

【請求項13】

対象においてがんを診断する方法であって、生物学的試料を請求項１から２のいずれか一項に記載の抗体または抗体断片と接触させるステップを含む、方法。

【請求項14】

請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体をコードする配列を含む、単離されたポリヌクレオチド。

【請求項15】

配列番号１～４のいずれか１つに記載の配列をコードする、請求項１４に記載の単離されたポリヌクレオチド。

【請求項16】

請求項１５に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。

【請求項17】

請求項１５に記載のポリヌクレオチド、および／または請求項１６に記載のベクターを含む、宿主細胞。

【請求項18】

請求項１に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体の作製方法であって、請求項１７に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、作製方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、それの全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０２１年９月３日出願の、「Ｃｌａｕｄｉｎ－６に対する抗体およびそれの使用」という表題の米国特許第６３／２４０，３９９号明細書、および２０２１年３月２日出願の、「Ｃｌａｕｄｉｎ－６に対する抗体およびそれの使用」という表題の米国特許第６３／１５５，３０４号明細書の優先権を主張する。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０２２年２月２８日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、「１２２８６３－５００６－ＷＯ＿ＳＴ２５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ．ＴＸＴ」と命名され、３４キロバイトのサイズである。

【0003】

分野
本開示は、免疫療法の分野におけるものであり、ヒトＣｌａｕｄｉｎ－６（ＣＬＤＮ６）に結合する抗体およびそれの断片、これらの抗体をコードするポリヌクレオチド配列、およびそれらを産生する細胞に関する。本開示は、これらの抗体を含む治療用組成物、ならびにがん検出、予後診断および抗体ベースの免疫療法のためのそれらの使用方法にさらに関する。

【背景技術】

【0004】

Ｃｌａｕｄｉｎ（ＣＬＤＮ）ファミリーは、２７のメンバーから構成され、細胞および組織型選択的な方法で異なる発現パターンを示す。Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮および内皮のタイトジャンクション（ＴＪ）内に位置する膜内在性タンパク質である。ＣＬＤＮは、同じ細胞において（シス相互作用）と隣接細胞上において（トランス相互作用）の両方で互いに相互作用し、組織特異的バリア機能を有するＴＪの構成をもたらす。個々の細胞型は、１つより多くのｃｌａｕｄｉｎファミリーメンバーを発現する。正常な生理学的状況では、ｃｌａｕｄｉｎは複数のタンパク質と相互作用し、タイトジャンクションへのシグナル伝達およびタイトジャンクションからのシグナル伝達に密接に関与する（Lal-Nag, M and Morin, P.J., Genome Biol 10: 235, 2009）。

【0005】

ＣＬＤＮタンパク質は、４つの膜貫通（ＴＭ）ヘリックス（ＴＭ１、ＴＭ２、ＴＭ３、およびＴＭ４）ならびに２つの細胞外ループ（ＥＬ１およびＥＬ２）を含む。隣接細胞からのｃｌａｕｄｉｎの細胞外ループは、互いに相互作用し、細胞シートをシールし、内腔と基底外空間の間の傍細胞輸送を制御する。ｃｌａｕｄｉｎタンパク質構造は、異なるファミリーメンバー間で高度に保存され、ＣＬＤＮ６は２２０アミノ酸を含み、サイズが２３ｋＤａであり、ｃｌａｕｄｉｎに典型的なタンパク質構造を示す。

【0006】

広く発現される多くのＣｌａｕｄｉｎタンパク質とは違い、ＣＬＤＮ６は、選択的発現によって特徴付けられる（Hewitt, et al., BMC Cancer, 6:186, 2006）。ＣＬＤＮ６は、いくつかの型の胚性上皮細胞で発現されるがん胎児性のタイトジャンクション分子である。タイトジャンクションの妨害およびタイトジャンクション分子の制御不全は、がん細胞の顕著な特徴であり、悪性形質転換と関連することが多い。ＣＬＤＮ６発現は、胃腺癌、肺腺癌、および卵巣腺癌、子宮内膜および胚性癌腫、脳の小児腫瘍（例えば、非定型奇形腫様／横紋筋肉腫様腫瘍）および胚細胞性腫瘍を含む、様々ながん種で異常に活性化される（Hassimoto et al., J Pharmacol Exp Ther 368:179-186, 2019；Kojima et al., Cancers 2020, 12, 2748）。したがって、ＣＬＤＮ６は、腫瘍関連抗原として同定された。ＣＬＤＮ６は、腫瘍関連抗原として、それが上皮分化およびバリア機能に重要である上皮形態形成の初期の間に発現されるため分化抗原として分類され得る。成人の正常組織ではなく、がんにおけるＣＬＤＮ６の異なる発現パターンから、抗体へのその細胞表面到達可能性と合わせて、診断ならびに様々ながん種における免疫療法アプローチのための有望な標的としてＣＬＤＮ６は適切である。

【0007】

ＣＬＤＮ６と他のｃｌａｕｄｉｎタンパク質の間には高度な配列保存がある。他のｃｌａｕｄｉｎタンパク質（例えば、ＣＬＤＮ９、ＣＬＤＮ４およびＣＬＤＮ３）とのＣＬＤＮ６の高い相同性は、治療的用途に好適な特性、例えば、特異性、親和性および安全性を有するＣＬＤＮ６抗体を提供することを困難にする。

【0008】

抗体ベースの免疫療法抗体のためにＣｌａｕｄｉｎ６を標的化することは、ＣＬＤＮ６の活性をモジュレート、および／またはＣＬＤＮ６を発現するがんに対する細胞傷害応答を方向付けることができる。したがって、抗ＣＬＤＮ６抗体の必要性がある。

【発明の概要】

【0009】

本開示は、がん細胞に存在するＣｌａｕｄｉｎ－６に結合することができる抗ＣＬＤＮ６抗体および断片を提供することにより、上記のニーズを解決する。これらの抗体およびそれの断片は、ＣＲＤ配列の独自のセット、ＣＬＤＮ６に対する特異性によって特徴付けられ、がん検出、予後診断および免疫療法に有用である。より具体的には、本開示は、ヒトＣＬＤＮ６に結合する抗体に、およびＣＬＤＮ－６を発現する腫瘍細胞および／または腫瘍幹細胞の存在を検出するため、腫瘍微小環境に局在する細胞のＣＬＤＮ６介在性活性をモジュレートするため、またはＣＬＤＮ６を発現するがんに対する細胞傷害応答を方向付けるためのそれらの使用に関する。

【0010】

一部の実施形態によれば、抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８および３０から選択される重鎖（ＨＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、ならびに、配列番号２、４、２５、２７、２９および３１から選択される軽鎖（ＬＣ）可変領域の３つのＣＤＲ、または、同定された抗体または断片配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するそれのアナログもしくは誘導体からなる群から選択される一連の６つの相補性決定領域（ＣＤＲ）配列を含む。

【0011】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、およびＣＤＲ３：配列番号７を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、およびＣＤＲ３：配列番号１０を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0012】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、およびＣＤＲ３：配列番号１３を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、およびＣＤＲ３：配列番号１６を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0013】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、およびＣＤＲ３：配列番号３４を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、およびＣＤＲ３：配列番号３７を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0014】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、およびＣＤＲ３：配列番号４０を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、およびＣＤＲ３：配列番号４３を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0015】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、およびＣＤＲ３：配列番号４０を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、およびＣＤＲ３：配列番号４３を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0016】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、およびＣＤＲ３：配列番号４８を含む重鎖可変領域；ならびに／またはＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、およびＣＤＲ３：配列番号５１を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0017】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８および３０からなる群から選択される可変重鎖配列を含む。

【0018】

他の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、２５、２７、２９および３１からなる群から選択される可変軽鎖配列を含む。

【0019】

他の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８および３０からなる群から選択される可変重鎖配列、ならびに、配列番号２、４、２５、２７、２９および３１からなる群から選択される可変軽鎖配列、を含む。

【0020】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、以下の組合せ：
（ａ）配列番号１を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３を含む可変重鎖配列および配列番号４を含む可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２３を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号２４を含む可変重鎖配列および配列番号２５を含む可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号２６を含む可変重鎖配列および配列番号２７を含む可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号２８を含む可変重鎖配列および配列番号２９を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｇ）配列番号３０を含む可変重鎖配列および配列番号３１を含む可変軽鎖配列
から選択される可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む。

【0021】

一部の実施形態では、細胞傷害剤に共有結合したＣＬＤＮ６に結合する抗体を含むイムノコンジュゲートが提供され、この場合、抗体は、以下の組合せ：
（ａ）配列番号１を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｂ）配列番号３を含む可変重鎖配列および配列番号４を含む可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２３を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号２４を含む可変重鎖配列および配列番号２５を含む可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号２６を含む可変重鎖配列および配列番号２７を含む可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号２８を含む可変重鎖配列および配列番号２９を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｇ）配列番号３０を含む可変重鎖配列および配列番号３１を含む可変軽鎖配列
から選択される可変重鎖配列および可変軽鎖配列を含む。

【0022】

一部の実施形態では、細胞傷害剤に共有結合したＣｌａｕｄｉｎ－６に結合する抗体を含むイムノコンジュゲートが提供され、この場合、抗体は、（ａ）ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、およびＣＤＲ３：配列番号７を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、およびＣＤＲ３：配列番号１０を含む軽鎖可変領域；（ｂ）ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、およびＣＤＲ３：配列番号１３を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、およびＣＤＲ３：配列番号１６を含む軽鎖可変領域；（ｃ）ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、およびＣＤＲ３：配列番号３４を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、およびＣＤＲ３：配列番号３７を含む軽鎖可変領域；（ｄ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、およびＣＤＲ３：配列番号４０を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、およびＣＤＲ３：配列番号４３を含む軽鎖可変領域；（ｅ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、およびＣＤＲ３：配列番号４０を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、およびＣＤＲ３：配列番号４３を含む軽鎖可変領域；ならびに（ｆ）ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、およびＣＤＲ３：配列番号４８を含む重鎖可変領域；ならびに／もしくはＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、およびＣＤＲ３：配列番号５１を含む軽鎖可変領域、を含む。

【0023】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体およびそれの抗体断片は、表１に開示の１つもしくは複数の重鎖可変領域ＣＤＲおよび／または表２に開示の１つもしくは複数の軽鎖可変領域ＣＤＲを含む。

【0024】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、以下の構造的および機能的特徴の１つまたは複数を、単独でまたは組合せで呈する：（ａ）それらの細胞表面にヒトＣＬＤＮ６を発現する細胞に結合する；（ｂ）Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に発現されたＣＬＤＮ６へのアイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２０～２５倍高いか、またはＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞に発現されたＣＬＤＮ６へのアイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２０～３０倍高いシグナル（例えば、ＭＦＩ）でＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に、およびアイソタイプ対照抗体の結合活性よりも１６倍だけ高いシグナルでＣｌａｕｄｉｎ－９ ＨＥＫ２９３細胞に選択的に結合する；（ｃ）アイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２５～６０倍高いシグナルで等しく、Ｃｌａｕｄｉｎ－６（Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＣＨＯ－Ｋ１細胞）およびＣｌａｕｄｉｎ－９（ＨＥＫ２９３細胞）を発現する細胞に結合する；（ｄ）ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４を発現する細胞に弱く結合するかまたはまったく結合しない；（ｅ）Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞に結合するが、Ｃｌａｕｄｉｎ６遺伝子をノックアウトしたＮＥＣ８細胞には結合しない；（ｆ）場合により、マウスＣＬＤＮ６と交差反応する；（ｇ）Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞における結合およびエンドサイトーシス介在細胞傷害性の誘導後、Ｃｌａｕｄｉｎ－６陽性細胞の表面から効率的に内部移行される；ならびに（ｈ）その天然構造でＣＬＤＮ６を持つ細胞に対する１つまたは複数の免疫エフェクター機能を呈し、この場合、１つまたは複数の免疫エフェクター機能が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）から選択される。

【0025】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、内因性レベルのＣｌａｕｄｉｎ－６を発現するヒト細胞におよびＣｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するように改変された宿主細胞に特異的に結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ－３およびＣｌａｕｄｉｎ－４への結合を示さない。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、ヒト精巣胎芽性癌（ＮＥＣ８細胞）の内因性発現されたＣＬＤＮ６に結合する。一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、ヒト卵巣癌（ＯＶ９０細胞）の内因性発現されたＣＬＤＮ６に結合する。一部の実施形態では、ＣＬＤＮ６特異的抗体または抗体断片は、１００ｎＭより低い親和性でヒトＣｌａｕｄｉｎ－６に結合する。他の実施形態では、ＣＬＤＮ６／９特異的抗体または抗体断片は、ヒトＣＬＤＮ６およびヒトＣＬＤＮ９に選択的に結合する。

【0026】

一部の実施形態では、抗体は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞の表面と会合したＣＬＤＮ６に結合することができる。好ましくは、ＣＬＤＮ６発現細胞は、無傷細胞、特に非透過性細胞であり、抗体によって結合されたＣＬＤＮ６タンパク質は細胞の表面と会合され、天然、例えば非変性構造を有する。特定の実施形態では、抗体は、実質的に、ＣＬＤＮ９を発現する細胞の表面と会合したＣＬＤＮ９に結合することができず；またはＣＬＤＮ４を発現する細胞の表面と会合したＣＬＤＮ４に結合することができず、および／またはＣＬＤＮ３を発現する細胞の表面と会合したＣＬＤＮ３に結合することができない。

【0027】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、ＣＬＤＮ９と比較してＣＬＤＮ６に選択的に結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ－３（ＣＬＤＮ３）、Ｃｌａｕｄｉｎ－４（ＣＬＤＮ４）に結合しない。別の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９の両方に等しく結合する（例えば、いずれかのＣＬＤＮへの優先はない）。一部の実施形態では、抗体は、ＣＬＤＮ６を過剰発現するように改変された宿主細胞のいずれか（例えば、２９３Ｔ－ＣＬＤＮ６またはＣＨＯ－ＣＬＤＮ６）を使用するＦＡＣＳベースのアッセイで、約５０ｎＭより小さいＥＣ_５０（例えば、約７５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満）を呈する。

【0028】

一部の実施形態では、抗体またはその断片は、その天然構造でＣＬＤＮ６を持つ細胞に対する１つまたは複数の免疫エフェクター機能を呈し、この場合、１つまたは複数の免疫エフェクター機能は、好ましくは、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、アポトーシスの誘導、および増殖の阻害からなる群から選択され、好ましくは、エフェクター機能はＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣである。

【0029】

一部の実施形態では、抗体またはその断片は、標的化した細胞傷害性、例えば、腫瘍細胞の死滅を提供するように、１つまたは複数の治療エフェクター部分、例えば、放射線標識、細胞毒、治療用酵素、アポトーシスを誘導する薬剤等に接着され得る。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、腫瘍細胞の表面上に生じる際に、ヒトＣＬＤＮ６に特異的に結合し、ＣＬＤＮ６の内部移行を効率的に誘導するかまたは腫瘍細胞の細胞介在性死滅を方向付ける。

【0030】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、１つまたは複数の細胞傷害剤、例えば化学療法剤または薬物、増殖阻害剤、毒素（例えば、タンパク質毒、細菌、真菌、植物、または動物起源の酵素的に活性な毒素、またはその断片）、または放射性同位体（例えば、放射性コンジュゲート）にコンジュゲートした抗ＣＬＤＮ６抗体を含むイムノコンジュゲートに組み込まれる。

【0031】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、限定はされないが、１つまたは複数の増強されたＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、ＴＤＣＣ抗体介在性エフェクター機能を有する化合物を生じる、アミノ酸残基置換、突然変異および／または改変を含む、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または改変を含み得る。

【0032】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、本明細書に開示の単一の抗ＣＬＤＮ６抗体のＶＨまたはＶＬドメイン由来の、６個のＣＤＲまたはそのバリアントを含む。例えば、結合剤は、「ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１」と指定される抗ＣＬＤＮ６抗体の６個すべてのＣＤＲ領域を含み得る。代表的な例では、抗体またはその抗体断片は、本明細書において、「ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１」と呼ばれる抗ヒトＣＬＤＮ６抗体の可変重鎖領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３ならびに可変軽鎖領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を表す、配列番号５～７および配列番号８～１０のアミノ酸配列を含み得る。

【0033】

本明細書に開示の任意の抗ＣＬＤＮ６抗体は、完全ヒト、キメラ、ＣＤＲ移植、ヒト化、もしくは組換え抗体、またはその断片であり得る。代替の実施形態では、開示した抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、二重特異性または多特異性フォーマットを含む、様々な代替のフォーマットでの使用のために開発され得る。

【0034】

一部の実施形態では、ＣＬＤＮ６抗体は、完全長抗体である。一部の実施形態では、抗体は、抗体断片である。さらなる実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆｄ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよびｓｃＦｖ－Ｆｃ断片、単鎖抗体、ミニボディ、およびダイアボディからなる群から選択される。

【0035】

本開示は、本明細書に開示の任意の抗ＣＬＤＮ６抗体をコードする核酸も提供する。関連する実施形態では、本開示は、本明細書に開示の抗ＣＬＤＮ６抗体をコードする１つまたは複数の核酸を含むベクターまたは前記ベクターを含む宿主細胞を提供する。

【0036】

ＣＬＤＮ６抗体およびその抗体断片は、がんの処置のために使用され得る。ＣＬＤＮ６を発現するがん細胞は、ＣＬＤＮ６に対する抗体による治療など、ＣＬＤＮ６を標的化する治療の好適な標的である。がんの治療のためのそのような方法は、ＣＬＤＮ６抗体またはその抗体断片を含む組成物または製剤を、それを必要とする対象に投与するステップを含み得る。

【0037】

例えば、ＣＬＤＮ６抗体またはその抗体断片は、単独で（例えば、単独療法として）、または他の免疫療法剤および／もしくは化学療法との組合せで、投与され得る。一実施形態では、ＣＬＤＮ６抗体または断片を使用して、ＣＬＤＮ６を発現するがん細胞の死滅を媒介するのに好適なＡＤＣを調製する。代替の実施形態では、ＣＬＤＮ６抗体を使用して、増強されたＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、ＴＤＣＣ、またはＣＤＤによって腫瘍細胞を死滅させるように設計された組換え抗体を操作により作製する。

【0038】

本開示は、ＡＤＣを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む、がんを処置する方法も提供し、この場合、ＡＤＣは、ペイロードにコンジュゲートした、本明細書に開示の抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片を含む。一部の実施形態では、方法は、抗ＣＬＤＮ ＡＤＣを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含み、この場合、がんは、子宮、精巣、卵巣および肺がんから選択される。

【図面の簡単な説明】

【0039】

本開示の前述の概要、および以下の詳細な説明は、添付の図と併せて読むことで、よりよく理解されよう。本開示を例示する目的で、目下好ましい実施形態を図に示している。しかし、示されたまさにその通りの構成、例および手段に、本開示が限定されないことを理解されたい。

【0040】

【図1-1】ヒト抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-2】ヒト抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-3】ヒト抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図1-4】ヒト抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインのアミノ酸配列ならびにそれらのそれぞれのＣＤＲ配列（カバットナンバリング）を提供する図である。配列識別子が提供されており、ＣＤＲについては可変ドメイン配列に下線が引かれている。

【図2】図２Ａおよび２Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞および非トランスフェクト親ＣＨＯ－Ｋ１細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図3】図３Ａおよび３Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図4】図４Ａおよび４Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞への抗Ｃｌａｕｄｉｎ抗体の結合を示す図である。

【図5】図５Ａおよび５Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞への抗Ｃｌａｕｄｉｎ抗体の結合を示す図である。

【図6】図６Ａおよび６Ｂは、ＦＡＣＳによる、ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＮＥＣ８腫瘍細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体の結合を示す図である。

【図7】図７Ａおよび７Ｂは、ＦＡＣＳによる、ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＯＶ９０腫瘍細胞への抗ＣＮＤＬ６抗体の結合を示す図である。

【図8】図８Ａおよび８Ｂは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－３（ＣＬＤＮ３）およびＣｌａｕｄｉｎ－４（ＣＬＤＮ４）を内因性発現するＭＣＦ７細胞への抗ＣＬＤＮ抗体の結合を示す図である。

【図9】図９は、ＦＡＣＳによる、ヒト腫瘍細胞株、ＮＥＣ８、ＯＶ９０およびＭＣＦ７ならびにＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞へのウサギポリクローナル抗ＣＬＤＮ９抗体の結合を示す図である。

【図10-1】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株に結合する本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２の用量応答曲線を示す図である。Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（１０Ａ）；Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（１０Ｂ）；およびＣｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ細胞（１０Ｃ）。

【図10-2】図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株に結合する本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２の用量応答曲線を示す図である。Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（１０Ａ）；Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞（１０Ｂ）；およびＣｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ細胞（１０Ｃ）。

【図11】図１１Ａおよび１１Ｂは、ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＮＥＣ８細胞（図１１Ａ）およびＯＶ９０細胞（図１１Ｂ）におけるＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２介在抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す図である。

【図12-1】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、ＮＥＣ８腫瘍細胞（図１２Ａ）；ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＯＶ９０腫瘍細胞（図１２Ｂ）およびＣｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株ＨＥＫ２９３細胞（図１２Ｃ）において、抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２によって誘導される抗体介在性エンドサイトーシスを示す図である。

【図12-2】図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、ＮＥＣ８腫瘍細胞（図１２Ａ）；ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＯＶ９０腫瘍細胞（図１２Ｂ）およびＣｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株ＨＥＫ２９３細胞（図１２Ｃ）において、抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２によって誘導される抗体介在性エンドサイトーシスを示す図である。

【図13-1】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図13-2】図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図14-1】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄおよび１４Ｅは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウト細胞（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）への、抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．４．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ＮＲ．ＮＲ６．Ａｂ１およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図14-2】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄおよび１４Ｅは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウト細胞（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）への、抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．４．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ＮＲ．ＮＲ６．Ａｂ１およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図14-3】図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄおよび１４Ｅは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウト細胞（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）への、抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．４．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ＮＲ．ＮＲ６．Ａｂ１およびアイソタイプ対照抗体の結合を示す図である。

【図15-1】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅおよび１５Ｆは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－３を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ならびに２つの陽性対照ＭＡＢ４６２０およびＭＡＢ４２１９の結合を示す図である。

【図15-2】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅおよび１５Ｆは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－３を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ならびに２つの陽性対照ＭＡＢ４６２０およびＭＡＢ４２１９の結合を示す図である。

【図15-3】図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃ、１５Ｄ、１５Ｅおよび１５Ｆは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－３を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－４を過剰発現するＣＨＯ－Ｋ１細胞への抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ならびに２つの陽性対照ＭＡＢ４６２０およびＭＡＢ４２１９の結合を示す図である。

【図16-1】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６の用量応答曲線を示す図である。

【図16-2】図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃおよび１６Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６の用量応答曲線を示す図である。

【図17-1】図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウト（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６の用量応答曲線を示す図である。

【図17-2】図１７Ａ、１７Ｂおよび１７Ｃは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウト（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６の用量応答曲線を示す図である。

【図18-1】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１Ｎ７３Ｄのバリアントおよびアイソタイプ対照の用量応答曲線を示す図である。

【図18-2】図１８Ａ、１８Ｂ、１８Ｃおよび１８Ｄは、ＦＡＣＳによる、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ細胞への本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１Ｎ７３Ｄのバリアントおよびアイソタイプ対照の用量応答曲線を示す図である。

【図19】図１９Ａおよび１９Ｂは、ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＮＥＣ８細胞（図１９Ａ）およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞（図１９Ｂ）におけるＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５介在抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を示す図である。

【図20】図２０Ａおよび２０Ｂは、ＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞におけるＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５の内部移行活性を示す図である。

【図21】図２１Ａおよび２１Ｂは、ヒトＣＬＤＮ６を内因性発現するＮＥＣ８腫瘍細胞（図２１Ａ）およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞（図２１Ｂ）における抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５によって誘導された抗体介在性エンドサイトーシスを示す図である。

【発明を実施するための形態】

【0041】

本開示がより容易に理解することができるように、ある特定の技術的および科学的用語について下に具体的に定義する。本文書の他の場所で特に定義されていない限り、本明細書で使用される他のすべての技術的および科学的用語は、本開示が属する技術分野の当業者であれば一般に理解される意味を有する。

【0042】

本開示全体をとおして、以下の略語が使用される：
ｍＡｂまたはＭａｂまたはＭＡｂ － モノクローナル抗体。
ＣＤＲ － 免疫グロブリン可変領域の相補性決定領域。
ＶＨまたはＶＨ － 免疫グロブリン重鎖可変領域。
ＶＬまたはＶＬ － 免疫グロブリン軽鎖可変領域。
ＦＲ － 抗体フレームワーク領域、ＣＤＲ領域を除外する免疫グロブリン可変領域。

【0043】

「Ｃｌａｕｄｉｎ－６」または「ＣＬＤＮ６」（本明細書では交換可能に使用される）という用語は、好ましくは、ヒトＣＬＤＮ６、特に、配列表の配列番号１に記載のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列のバリアントを含むタンパク質に関する。「ＣＬＤＮ６」という用語は、任意のＣＬＤＮ６バリアント、例えば翻訳後修飾バリアントおよび構造バリアントを含む。ヒト、カニクイザル、およびマウスＣＬＤＮ６のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿０６７０１８．２（ヒト）（配列番号１７）、ＸＰ＿００５５９１０８０．１（カニクイザル）（配列番号１８）、およびＮＰ＿０６１２４７．１（マウス）（配列番号１９）に提供されている。カニクイザルとマウスのＣＬＤＮ６のオルソログは、それぞれヒトタンパク質と＞９９％および～８８％の同一性を共有する。

【0044】

「ＣＬＤＮ９」という用語は、ヒトＣＬＤＮ９、特に、配列番号２０（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿０６６１９２．１）に記載のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列のバリアントを含むタンパク質に関する。ヒトＣＬＤＮ６およびヒトＣＬＤＮ９タンパク質は、７１．８％の同一性を共有する。

【0045】

「ＣＬＤＮ４」という用語は、ヒトＣＬＤＮ４、特に、配列番号２１（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２９６．１）に記載のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列のバリアントを含むタンパク質に関する。ヒトＣＬＤＮ６およびヒトＣＬＤＮ４タンパク質は、５９．１％の同一性を共有する。

【0046】

「ＣＬＤＮ３」という用語は、ヒトＣＬＤＮ３、特に、配列番号２２（ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ＿００１２９７．１）に記載のアミノ酸配列または前記アミノ酸配列のバリアントを含むタンパク質に関する。ヒトＣＬＤＮ６およびヒトＣＬＤＮ３タンパク質は、５６．７％の同一性を共有する。

【0047】

「パーセンテージ同一性」という用語は、ベストなアライメント後に得られた、比較される２つの配列間で同一のアミノ酸残基のパーセンテージを示すことを意図し、このパーセンテージは統計的に純粋であり、２つの配列間の違いは無作為にそれらの全長にわたり分配されている。２つのアミノ酸配列間の配列比較は、従来どおり、それらを最適にアラインした後にこれらの配列を比較することによって実施され、配列類似性の局所領域を同定および比較するため、前記比較はセグメントによりまたは「比較のウインドウ」によって実施された。比較のための配列の最適なアライメントは、手動の他に、Smith and Waterman, :1981, Ads App. Math. 2, 482の局所相同アルゴリズムにより、Neddiernan and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48, 443の局所相同アルゴリズムにより、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl Acad. Sci. USA 85, 2444の類似性探索方法により、またはこれらのアルゴリズム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ Ｐ、ＢＬＡＳＴ ＮおよびＴＦＡＳＴＡ）を使用するコンピュータープログラムにより、産生され得る。

【0048】

本明細書における「抗体」という用語は、最も広義に使用され、それらに限定されないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）を含めて、種々の抗体構造を包含する。

【0049】

本明細書で使用される「交差反応する」という用語は、本明細書に記載の抗ヒトＣＬＤＮ６抗体が、異なる種由来のＣＬＤＮ６に結合する能力を指す。例えば、本明細書に記載の抗体は、別の種由来のＣＬＤＮ６（例えば、またはラット、またはマウスのＣＬＤＮ６）にも結合することができる。

【0050】

ＩｇＧなどの例示的な抗体は、２つの重鎖および２つの軽鎖を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略される）および重鎖定常領域で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略される）および軽鎖定常領域で構成される。ＶＨ領域およびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と称されるより保存された領域が散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。それぞれのＶＨおよびＶＬは、以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４でアミノ末端からカルボキシ末端へと配置された、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。

【0051】

超可変領域は一般に、軽鎖可変領域における、アミノ酸残基約２４～３４（ＬＣＤＲ１；「Ｌ」は軽鎖を示す）、５０～５６（ＬＣＤＲ２）および８９～９７（ＬＣＤＲ３）からのアミノ酸残基、ならびに、重鎖可変領域における、約３１～３５Ｂ（ＨＣＤＲ１；「Ｈ」は重鎖を示す）、５０～６５（ＨＣＤＲ２）、および９５～１０２（ＨＣＤＲ３）周辺のアミノ酸残基を包含し；Kabat et al., SEQUENCES OF PROTEINS OF IMMUNOLOGICAL INTEREST, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)、ならびに／または、超可変ループを形成するそれら残基を包含する（例えば、軽鎖可変領域における、２６～３２残基（ＬＣＤＲ１）、５０～５２残基（ＬＣＤＲ２）および９１～９６残基（ＬＣＤＲ３）、ならびに、重鎖可変領域における、２６～３２残基（ＨＣＤＲ１）、５３～５５残基（ＨＣＤＲ２）および９６～１０１残基（ＨＣＤＲ３）；Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917。

【0052】

本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、例えば、当該集団を構成する個々の抗体は、可能性のあるバリアント抗体を除いて、同一でありかつ／または同じエピトープに結合する。例えば、バリアント抗体は、天然に存在する突然変異を含有するかまたはモノクローナル抗体調製物の製造過程で発生するが、こういったバリアントは一般にマイナーな量で存在するものである。様々な決定基（エピトープ）に対して向けられた様々な抗体を通常では含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物のそれぞれのモノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して向けられたものである。したがって、修飾語「モノクローナル」とは、実質的に均一な集団の抗体から得られている抗体の性状を指示するものであり、任意の方法による抗体の産生を必要とするものとして解釈されるべきではない。例えば、本開示に従って使用されるモノクローナル抗体は、それらに限定されないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法、およびヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部または一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含めて、様々な技法によって作製することができ、モノクローナル抗体を作製するためのかかる方法およびその他の例示的な方法が、本明細書に記載されている。

【0053】

「キメラ」抗体という用語は、組換え抗体であって、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する抗体または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同であるが、一方で、その鎖（複数可）の残部は、別の種に由来する抗体または別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同一または相同である、組換え抗体、同様に、それらが所望の生物学的活性を呈する限り、かかる抗体の断片を指す。加えて、相補性決定領域（ＣＤＲ）移植を実施して、親和性または特異性を始めとする抗体分子のある特定の特性を変えることができる。通常では、可変ドメインはげっ歯類動物などの実験動物（「親抗体」）由来の抗体から得られ、そして定常ドメイン配列はヒト抗体から得られるので、生成するキメラ抗体は、ヒト対象においてエフェクター機能を方向付けることができ、それが由来する親（例えば、マウス）抗体よりも、有害な免疫応答を誘発する可能性が低くなる。

【0054】

「ヒト化抗体」という用語は、重鎖および／または軽鎖の非ヒト（例えば、マウス、ラット、またはハムスター）相補性決定領域（ＣＤＲ）と一緒に、可変領域において１つまたは複数のヒトフレームワーク領域を含むように改変された抗体を指す。ある特定の実施形態では、ヒト化抗体は、ＣＤＲ領域を除いて完全にヒト型である配列を含む。ヒト化抗体は通常では、非ヒト化抗体と比べてヒトに対する免疫原性が低く、したがってある特定の状況において治療効果を提供する。当業者であれば、ヒト化抗体について知っており、それらを生成するのに適した技法についても知っている。例えば、それらのそれぞれは全内容が参照により本明細書に組み込まれる、Hwang, W. Y. K., et al., Methods 36:35, 2005；Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033, 1989；Jones et al., Nature, 321:522-25, 1986；Riechmann et al., Nature, 332:323-27, 1988；Verhoeyen et al., Science, 239:1534-36, 1988；Orlandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:3833-37, 1989；米国特許第５，２２５，５３９号明細書；同第５，５３０，１０１号明細書；同第５，５８５，０８９号明細書；同第５，６９３，７６１号明細書；同第５，６９３，７６２号明細書；同第６，１８０，３７０号明細書；およびSelick et al.、国際公開第９０／０７８６１号パンフレットを参照されたい。

【0055】

「ヒト抗体」とは、ヒトによって生成される抗体のアミノ酸配列に相当するアミノ酸配列を有する、および／または当業者にとっては既知のヒト抗体を作製するための技法のいずれかを使用して作製されている、抗体である。ヒト抗体に関する本定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に排除する。ヒト抗体は、Cole et al, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al, J. Immunol, 147(I):86-95 (1991)に記載の方法を含めて、当技術分野で既知の種々の技法を使用して生成することができる。van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol, 5: 368-74 (2001)もまた参照されたい。ヒト抗体は、トランスジェニック動物に抗原を投与することによって調製することができるが、当該トランスジェニック動物は抗原負荷に応答してかかる抗体を産生するように改変されており、その動物の内因性の遺伝子座は無効とされている、例えば、免疫ＨｕＭａｂマウス（例えば、ＨｕＭａｂマウスに関しては、Nils Lonberg et al., 1994, Nature 368:856-859、国際公開第９８／２４８８４号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９３／１２２７号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／０３９１８号パンフレットおよび国際公開第０１／０９１８７号パンフレットを参照されたい）、ゼノマウス（例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）技術に関しては、米国特許第６，０７５，１８１号明細書および同第６，１５０，５８４号明細書を参照されたい）またはＴｒｉａｎｎｉマウス（例えば、国際公開第２０１３／０６３３９１号パンフレット、国際公開第２０１７／０３５２５２号パンフレットおよび国際公開第２０１７／１３６７３４号パンフレットを参照されたい）である。

【0056】

抗体の「クラス」とは、その重鎖が有する定常ドメインまたは定常領域のタイプを指す。抗体に関し主たる５つのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）に、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｌ、およびＩｇＡ２にさらに分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。

【0057】

抗体の「抗原結合ドメイン」という用語（または単に「結合ドメイン」）または同様の用語は、抗原複合体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、以下が含まれる：（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨの各ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341: 544-546）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ。

【0058】

抗体の「可変ドメイン」（Ｖドメイン）は、結合を媒介し、特定の抗体の抗原に特異性を付与する。しかし、可変性は、可変ドメインの１１０個のアミノ酸全長にわたって均等には分布していない。代わりに、Ｖ領域は、それぞれが９～１２個のアミノ酸長である「超可変領域」またはＣＤＲと本明細書では呼ばれる極度の可変性のより短い領域によって分離された１５～３０個のアミノ酸からなるフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる比較的不変である区間から、構成される。当業者であれば理解されるように、ＣＤＲの正確なナンバリングおよび配置は、様々なナンバリングシステムのうちで異なってもよい。しかし、可変重配列および／または可変軽配列の開示には関連するＣＤＲの開示が含まれることを理解されたい。したがって、各可変重領域の開示は、ｖｈＣＤＲ（例えば、ｖｈＣＤＲ１、ｖｈＣＤＲ２、およびｖｈＣＤＲ３）の開示であり、各可変軽領域の開示は、ｖｌＣＤＲ（例えば、ｖｌＣＤＲ１、ｖｌＣＤＲ２、およびｖｌＣＤＲ３）の開示である。

【0059】

本明細書で使用される用語として「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とは、特異的抗原認識の媒介を主に担う、重鎖と軽鎖の両ポリペプチドの可変領域内の短いポリペプチド配列を指す。各ＶＬおよび各ＶＨの内には、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と称される）が存在する。本明細書で特に明記されない限り、ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域は、カバットナンバリングスキームに従ってアノテーションが付けられている（Kabat E. A., et al., 1991, Sequences of proteins of Immunological interest, In: NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services, Bethesda, Md）。

【0060】

他の実施形態では、抗体のＣＤＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、MacCallum RM et al, (1996) J Mol Biol 262: 732-745に従って、または、それらのそれぞれは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132- 136およびLefranc M-P et al, (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212に記載のＩＭＧＴナンバリングシステムに従って、決定することができる。また、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Martin A. "Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains," in Antibody Engineering, Kontermann and Diibel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001)も、参照されたい。他の実施形態では、抗体のＣＤＲはＡｂＭナンバリングスキームに従って決定することができ、このスキームはＡｂＭ超可変領域を参照とするものであるが、この領域とは、ＫａｂａｔのＣＤＲとＣｈｏｔｈｉａの構造ループとの間の妥協を表し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ’ｓ ＡｂＭ抗体モデリングソフトウェア（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．）により使用されている。

【0061】

「フレームワーク」または「フレームワーク領域」または「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般には、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４から構成される。

【0062】

「ヒトコンセンサスフレームワーク」とは、ヒト免疫グロブリンのＶＬフレームワーク配列またはＶＨフレームワーク配列の選択において最も普通に存在するアミノ酸残基を表すフレームワークである。一般に、ヒト免疫グロブリンのＶＬ配列またはＶＨ配列の選択は、可変ドメイン配列のサブグループ由来である。一般に、配列のサブグループは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda Md. (1991), Vols. 1-3にあるような、サブグループである。一実施形態では、ＶＬの場合、サブグループは、Kabat et al.、上掲にあるような、サブグループカッパＩである。一実施形態では、ＶＨの場合、サブグループは、Kabat et al.、上掲にあるような、サブグループＩｌｌである。

【0063】

「ヒンジ領域」は一般に、ヒトＩｇＧ１の２１６～２３８（ＥＵナンバリング）または２２６～２５１（カバットナンバリング）からのストレッチングとして定義される。ヒンジは、個別の３つの領域、上部、中間（例えばコア）、および下部の各ヒンジにさらに分けることができる。

【0064】

本明細書で使用される「Ｆｃ領域」という用語は、定常領域の少なくとも一部を含有する免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義する。本用語には、天然配列のＦｃ領域およびバリアントＦｃ領域が含まれる。一実施形態では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端にまで及ぶ。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても存在しなくてもよい。本明細書で別段の指定がない限り、Ｆｃ領域または定常領域のアミノ酸残基のナンバリングは、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)に記載のＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵナンバリングシステムに従う。

【0065】

「抗体断片」という用語は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合する、当該インタクトな抗体の部分を含む、当該インタクトな抗体とは異なる分子を指す。抗体断片の例としては、それらに限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）_２；ダイアボディ；線状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）が挙げられる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる同一の２つの抗原結合断片と、容易に結晶化する能力を反映する表記である、残りの「Ｆｃ」断片とが生成される。Ｆａｂ断片は、重（Ｈ）鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）とともに軽（Ｌ）鎖全体、および１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）から構成される。抗体のペプシン処理により、単一の大きいＦ（ａｂ）_２断片が得られ、これは、およそ、二価の抗原結合活性を有する２つのジスルフィド連結のＦａｂ断片に相当しており、依然として抗原を架橋することができる。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域からの１つまたは複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にさらなる数個の残基を有する点でＦａｂ’断片とは異なる。Ｆａｂ’－ＳＨは、Ｆａｂ’に関する本明細書における表記であるが、この場合、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を持つ。Ｆ（ａｂ’）_２抗体断片は当初、Ｆａｂ’断片の間にヒンジシステインを有する、Ｆａｂ’断片の対として生成されたものであった。抗体断片の他の化学的カップリングも知られている。

【0066】

「Ｆｖ」は、緊密な、非共有結合の会合にある１つの重鎖可変領域ドメインと１つの軽鎖可変領域ドメインとの二量体から構成される。これらの２つのドメインの折り畳みから、抗原結合のためのアミノ酸残基を与えるとともに抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（Ｈ鎖およびＬ鎖にそれぞれ由来の３ループ）が生じる。

【0067】

「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される「単鎖Ｆｖ」は、単一のポリペプチド鎖に接続されたＶＨ抗体ドメインおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ｓＦｖが抗原結合にとって所望の構造を形成することを可能にする、ポリペプチドリンカーをＶＨドメインとＶＬドメインとの間にさらに含む。ｓＦｖの概説については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照されたい。

【0068】

抗体の「抗原結合ドメイン」という用語（または、単に「結合ドメイン」）または同様の用語は、抗原複合体に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の「抗原結合部分」という用語内に包含される結合断片の例には、以下が含まれる、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨの各ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）_２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片、（ｉｉｉ）ＶＨドメインおよびＣＨドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989）、（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーによって必要に応じて連結することができる２つ以上の単離されたＣＤＲの組合せ。

【0069】

「多重特異性抗体」という用語は、最も広義に使用され、特に、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗体をカバーするが、この場合、ＶＨ－ＶＬ単位が多重エピトープ特異性を有する（例えば、１つの生体分子上の異なる２つのエピトープまたは異なる生体分子上の各エピトープに結合することができる）。かかる多重特異性抗体としては、それらに限定されないが、完全長抗体、２つ以上のＶＬドメインおよびＶＨドメインを有する抗体、二重特異性ダイアボディおよびトリアボディが挙げられる。「多重エピトープ特異性」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の２つ以上の異なるエピトープに特異的に結合する能力を指す。

【0070】

「デュアル特異性（Dual specificity）」または「二重特異性（bispecificity）」とは、同じまたは異なる標的（複数可）上の異なる２つのエピトープに特異的に結合する能力を指す。しかし、二重特異性抗体とは対照的に、デュアル特異性抗体はアミノ酸配列が同一である２つの抗原結合アームを有し、各Ｆａｂアームは２つの抗原を認識することができる。デュアル特異性によって、抗体は、単一のＦａｂまたはＩｇＧ分子として異なる２つの抗原と高親和性を持って相互作用することが可能となる。一実施形態によれば、ＩｇＧ１形態にある多重特異性抗体は、各エピトープに、５μＭ～０．００１ｐＭ、３μＭ～０．００１ｐＭ、１μＭ～０．００１ｐＭ、０．５μＭ～０．００１ｐＭ、または０．１μＭ～０．００１ｐＭの親和性で結合する。「単一特異性」とは、１つのエピトープのみに結合する能力を指す。多重特異性抗体は、完全な免疫グロブリン分子と類似の構造を有することができ、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ Ｆｃ領域を含む。かかる構造には、それらに限定されないが、ＩｇＧ－Ｆｖ、ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２、ＤＶＤ－Ｉｇ、（ｓｃＦｖ）_２－（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃおよび（ｓｃＦｖ）_２－Ｆｃ－（ｓｃＦｖ）_２が含まれ得る。ＩｇＧ－（ｓｃＦｖ）_２の場合、ｓｃＦｖは、重鎖もしくは軽鎖のいずれかのＮ末端もしくはＣ末端のいずれかに付着させることができる。

【0071】

本明細書で使用される場合、「二重特異性抗体」という用語は、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体、多くはヒトまたはヒト化抗体を指す。本開示では、結合特異性の一方は、ＣＬＤＮ６の方に向けることができ、もう一方は、任意の他の抗原、例えば、細胞表面タンパク質、受容体、受容体サブユニット、組織特異的抗原、ウイルス由来タンパク質、ウイルスによってコードされたエンベロープタンパク質、細菌に由来するタンパク質、または細菌性表面タンパク質等に向けることができる。

【0072】

本明細書で使用される場合、「ダイアボディ」という用語は、２つのポリペプチド鎖を含む二価の抗体を指し、この場合、各ポリペプチド鎖は、同じペプチド鎖上のＶＨドメインとＶＬドメインとの分子内会合を可能とするには短すぎるリンカー（例えば、アミノ酸５個で構成されるリンカー）によって連結されたＶＨドメインとＶＬドメインを含む。この配置により、各ドメインが別のポリペプチド鎖上の相補ドメインと強制的に対になってホモ二量体構造を形成する。したがって、「トリアボディ」という用語は、３つのペプチド鎖を含む三価の抗体を指し、ペプチド鎖のそれぞれが、同じペプチド鎖内におけるＶＨドメインとＶＬドメインとの分子内会合を可能とするには極端に短いリンカー（例えば、アミノ酸１～２個から構成されるリンカー）によって連結された１つのＶＨドメインと１つのＶＬドメインを含有する。

【0073】

「単離された抗体」という用語は、本明細書に開示の種々の抗体を説明して使用される場合、抗体が発現された細胞からまたは細胞培養物から特定されかつ分離および／または回収された抗体を意味する。単離された抗体または抗体断片には、抗体または抗体断片のバリアントが含まれ得るが、これは、抗体または抗体断片の作製、精製、および／または保存過程で発生する１つまたは複数の翻訳後修飾（例えば、Ｃ末端リジンクリッピング）を有する。その天然環境の混入成分とは、ポリペプチドの診断的または治療的用途を通常では妨害すると思われる物質であり、混入成分には酵素、ホルモン、およびその他のタンパク質性または非タンパク質性溶質が含まれ得る。一部の実施形態では、単離された抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）またはクロマトグラフ（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）の各アプローチによって決定して、９５％または９９％を超える純度まで精製される。抗体の純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照されたい。好ましい実施形態では、抗体は、（１）スピニングカップ配列決定装置の使用によりＮ末端もしくは内部のアミノ酸配列の少なくとも１５個の残基を得るのに十分な程度まで、または（２）クマシーブルーもしくは好ましくは銀染色を使用して非還元条件下または還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥによって均一になるまで、精製される。

【0074】

抗体の標的分子への結合に関して、「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピト－プ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」であるという用語は、非特異的相互作用とは測定可能な程度に異なる結合を意味する。特異的結合は、例えば、対照分子の結合と比較した分子の結合を決定することによって測定することができる。例えば、特異的結合は、標的に類似する対照分子、例えば過剰な非標識標的との競合によって決定することができる。この場合、特異的結合は、プロ－ブへの標識標的の結合が、過剰な非標識標的によって競合的に阻害される場合に、指摘される。本明細書で使用される「特異的結合」、あるいは特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピト－プ「に特異的に結合する」またはそれ「に特異的」であるという用語は、例えば、１０－４Ｍ以下、代替的に１０－５Ｍ以下、代替的に１０－６Ｍ以下、代替的に１０－７Ｍ以下、代替的に１０－８Ｍ以下、代替的に１０－９Ｍ以下、代替的に１０－１０Ｍ以下、代替的に１０－１１Ｍ以下、代替的に１０－１２Ｍ以下の標的に対するＫｄを有する分子、または、１０－４Ｍ～１０－６Ｍもしくは１０－６Ｍ～１０－１０Ｍもしくは１０－７Ｍ～１０－９Ｍの範囲のＫｄを有する分子によって示され得る。当業者であれば理解するように、親和性およびＫＤの値は反比例している。抗原に対する高親和性は、低いＫＤ値によって測定される。一実施形態では、「特異的結合」という用語は、ある分子が、実質的に他のいずれのポリペプチドまたはポリペプチドエピト－プにも結合することなく、ＣＬＤＮ６にまたはＣＬＤＮ６エピト－プに結合する、結合を指す。

【0075】

本明細書で使用される場合、「ＣＬＤＮ６に結合する」という用語は、抗体または抗原結合断片が、内因性ヒトＣＬＤＮ６が正常細胞または悪性細胞の表面上に、またはＣＬＤＮ６を過剰発現するように改変された組換え宿主細胞の表面上に存在する場合に、内因性ヒトＣＬＤＮ６を認識しかつこれに結合する能力を指す。

【0076】

本明細書で使用される「親和性」という用語は、抗体のエピトープへの結合強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］×［Ａｇ］／［Ａｂ－Ａｇ］（式中、［Ａｂ－Ａｇ］は抗体－抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定義される解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定する方法は、Harlow, et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988)、Coligan et al., eds., Current Protocols in Immunology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993)、およびMuller, Meth. Enzymol. 92:589-601 (1983)に見出すことができ、これらの参照文献は参照により全体が本明細書に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定する当分野においてよく知られている一標準法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析によるもの）の使用である。

【0077】

「エピトープ」は、抗体とその抗原（複数可）との間の相互作用の部位（単数または複数）を指示する、技術用語である。（Janeway, C, Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3- 8. New York, Garland Publishing, Inc.）：によって：「抗体は一般に、タンパク質などの大分子の表面上の小領域のみを一般に認識する…」と記載されているように：［ある特定のエピトープ］が、タンパク質の折り畳みによって一緒にされた、［抗原］ポリペプチド鎖の異なる部分からのアミノ酸で構成される可能性が高い。この種の抗原決定基は、認識される構造が、抗原のアミノ酸配列中では不連続であるが３次元構造では一緒になっているタンパク質のセグメントから構成されるので、立体配座エピトープまたは不連続エピトープとして知られている。対照的に、ポリペプチド鎖の単一セグメントから構成されるエピトープは、連続エピトープまたは線状エピトープと称される（Janeway, C. Jr., P. Travers, et al. (2001). Immunobiology: the immune system in health and disease. Part II, Section 3-8. New York, Garland Publishing, Inc.）。

【0078】

「ＫＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、ｋｄのｋａに対する比（例えば、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される、平衡解離定数を指す。抗体のＫＤ値は、当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法には、好ましくはＦｏｒｔｅｂｉｏ Ｏｃｔｅｔ ＲＥＤデバイスを使用するバイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）解析、好ましくはＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）表面プラズモン共鳴システムなどのバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴、またはフローサイトメトリーおよびスキャッチャード解析が含まれる。

【0079】

薬剤および特定の活性（例えば、細胞への結合、酵素活性の阻害、免疫細胞の活性化または阻害）に関する「ＥＣ_５０」とは、かかる活性に関して薬剤の最大の応答または効果の５０％を生じる当該薬剤の効果的濃度を指す。薬剤および特定の活性に関する「ＥＣ_１００」とは、かかる活性に関して薬剤の実質的に最大の応答を生じる当該薬剤の効果的濃度を指す。

【0080】

本明細書で使用される場合、「抗体薬物コンジュゲート」（ＡＤＣ）という用語は、合成リンカーを介して細胞傷害剤（ペイロードとして知られる）に共有結合で連結された組換えモノクローナル抗体からなるイムノコンジュゲートを指す。イムノコンジュゲート（抗体薬物コンジュゲート、ＡＤＣ）は、高度に強力な抗体ベースのがん療法のクラスである。ＡＤＣは、合成リンカーを介して細胞傷害剤（ペイロードとして知られる）に共有結合で連結された組換えモノクローナル抗体からなる。ＡＤＣは、モノクローナル抗体の特異性および小分子化学療法薬物の効力を兼ね備えるとともに、高度に細胞傷害性の小分子薬物部分の腫瘍細胞への直接的な標的化送達を容易にする。

【0081】

本明細書で使用される場合、「エンドサイトーシス」という用語は、真核細胞が原形質膜のセグメント、細胞表面受容体、および細胞外液からの成分を内部移行するプロセスを指す。エンドサイトーシスのメカニズムには、受容体介在性エンドサイトーシスが含まれる。「受容体介在性エンドサイトーシス」という用語は、リガンドがその標的に結合すると、膜陥入および挟持を引き起こし、内部移行され、サイトゾルに送達されるか、適当な細胞内区画に移される、生物学的メカニズムを指す。

【0082】

「バイスタンダー効果」という用語は、抗体薬物コンジュゲートによって標的とされた腫瘍細胞に隣接した健康な細胞の標的細胞介在性死滅を指す。バイスタンダー効果とは一般に、抗原陽性標的細胞から隣接した抗原陰性の健康細胞へと拡散することができる疎水性の細胞傷害薬の細胞流出によって引き起こされる。バイスタンダー効果の有無は、イムノコンジュゲートを作製するのに使用されるリンカーと共役化学の態様に起因する可能性がある。

【0083】

抗体Ｆｃ領域とある特定のＦｃ受容体との相互作用に由来する「エフェクター機能」という用語には、それらに必ずしも限定されないが、Ｃｌｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、ＡＤＣＣ、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＣＤＤ）などのＦｃｙＲ介在性エフェクター機能、および細胞表面受容体の下方調節が含まれる。かかるエフェクター機能には、一般に、Ｆｃ領域が抗原結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と組み合わされることが必要である。

【0084】

本明細書で使用される場合、「抗体ベースの免疫療法」および「免疫療法」という用語は広義には、抗ＣＬＤＮ６抗体、二重特異性分子、抗原結合ドメイン、または抗ＣＬＤＮ６抗体もしくはそれの抗体断片もしくはＣＤＲを含む融合タンパク質のターゲティング特異性に依存して、ＣＬＤＮ６発現細胞に及ぼす直接的または間接的な影響を媒介する、任意の形態の療法を指して、使用される。本用語は、ネイキッド抗体、二重特異性抗体（Ｔ細胞結合、ＮＫ細胞結合、およびその他の免疫細胞／エフェクター細胞結合の各方式を含めて）、抗体薬物コンジュゲートを使用する処置の方法、抗ＣＬＤＮ６キメラ抗原受容体を含むように改変されたＴ細胞（ＣＡＲ－Ｔ）またはＮＫ細胞（ＣＡＲ－ＮＫ）、およびＣＬＤＮ６特異的結合剤を含む腫瘍溶解性ウイルスを使用する細胞療法、ならびに抗ＣＬＤＮ６抗体の抗原結合配列を送達することによる遺伝子療法を包含することを意図するものであり、かつ、ｉｎ ｖｉｖｏで相当する抗体断片を発現させることを意図するものである。

【0085】

Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質ファミリー
Ｃｌａｕｄｉｎは、上皮または内皮細胞シートに見出されるものなど、分極細胞型の最突端細胞－細胞接着ジャンクションである、タイトジャンクションの主要な構造タンパク質を含む膜内在性タンパク質である。

【0086】

ヒトのタンパク質のｃｌａｕｄｉｎファミリーは、サイズが２２～３４ｋＤａの範囲である、少なくとも２４のメンバーから構成される。すべてのｃｌａｕｄｉｎは、両方のタンパク質末端が膜の細胞内面に局在し、２つの細胞外（ＥＣ）ループ、ＥＣ１およびＥＣ２の形成をもたらすテトラスパニン形態を持つ。典型的には、ＥＣ１は、サイズが約５０～６０アミノ酸であり、ＥＣ２はＥＣ１より小さく、通常およそ２５アミノ酸を含む。ＥＣループは、タイトジャンクションの形成をもたらす、直接の同種親和性相互作用、およびｃｌａｕｄｉｎのある特定の組合せでは、異種親和性相互作用を媒介する。

【0087】

Ｃｌａｕｄｉｎ－６
Ｃｌａｕｄｉｎ６（ＣＬＤＮ６）は、通常、２２０アミノ酸の前駆体タンパク質としてヒトで発現され；その最初の２１アミノ酸は、シグナルペプチドを構成する。ＣＬＤＮ６前駆体タンパク質のアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＰ０６７０１８．２として、アメリカ国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトで公に利用可能であり、本明細書では配列番号１７として提供される。

【0088】

発現ＣＬＤＮ６は、セミノーマ、胚性癌腫および卵黄嚢腫瘍を含む胚細胞腫瘍、ならびに胃腺癌、肺腺癌、卵巣腺癌、および子宮内膜癌の一部の症例で高く発現される（Ushiku T, et al., Histopathology 61(6):1043-1056, 2012、Hewitt KJ, Agarwal R, Morin PJ. The claudin gene family: expression in normal and neoplastic tissues. BMC Cancer 2006; 6; 186；Micke, P. et al. (2014) Aberrantly activated Claudin-6 and 18.2 as potential therapy targets in non-small-cell lung cancer. Int. J. Cancer 135, 2206-2214；Lal-Nag, M. et al. (2012) Claudin-6: a novel receptor for CPE-mediated cytotoxicity in ovarian cancer. Oncogenesis 1, e33; Ben-David, U. et al. (2013) Immunologic and chemical targeting of the tight junction protein Claudin-6 eliminates tumorigenic human pluripotent stem cells. Nat. Commun. 4, 1992）。

【0089】

ヒトＣＬＤＮ６タンパク質は、細胞外ドメイン（ＥＣＤ）がヒトＣＬＤＮ９タンパク質配列と非常に近く、ＥＣＤ１では＞９８％の同一性およびＥＣＤ２では＞９１％の同一性を有する。ヒトＣＬＤＮ４もまた、ＥＣＤ配列がヒトＣＬＤＮ６と近く、ＥＣＤ１では＞８４％の同一性およびＥＣＤ２では＞７８％の同一性を有する。ＣＬＤＮ６に対するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の発見は、それらの細胞外ドメインで３つのアミノ酸のみ（ＥＣＤ１に２つおよびＥＣＤ２に１つ）がＣＬＤＮ６と異なる内因性発現されたＣｌａｕｄｉｎ－９（ＣＬＤＮ９）の高い相同性によって妨げられてきた。ＣＬＤＮ４、ＣＬＤＮ６、およびＣＬＤＮ９タンパク質の推定されるカニクイザルタンパク質ＥＣＤ配列は、それぞれのヒトＥＣＤ配列と１００％同一である。したがって、開示された抗ヒトＣＬＤＮ６抗体および断片は、カニクイザルＣＬＤＮ６と交差反応すると予想される（データは示さない）。さらに、Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子は、異なる種間で高度に保存され、例えばヒトおよびマウス遺伝子は、ＤＮＡおよびタンパク質レベルで８８％の相同性を示す。

【0090】

がん処置のためのＣＬＤＮ６標的化
ここ数年、タイトジャンクションはがん細胞の増殖、形質転換および転移に役割を果たすことが、より確証的になっている。ｃｌａｕｄｉｎの制御不全は、上皮細胞のタイトジャンクションの破壊をもたらし、次いで、細胞極性の欠損および上皮完全性の障害を生じる。腫瘍細胞によるＣＬＤＮ６の過剰発現は、腫瘍細胞の脱分化の結果としてｃｌａｕｄｉｎの局在の制御不全、または異常な血管新生を有する腫瘍塊内で効率的に養分を吸収するように急速に増殖するがん組織の必要性と関連し得る(Morin PJ., Cancer Res. 1;65(21):9603-6, 2005)。細胞間接着の減少およびがん細胞の移動性の増加は、上皮の間葉転移（ＥＭＴ）の主なイベント、がん進行および転移の重要なステップであると示唆される。

【0091】

抗ＣＬＤＮ６抗体
本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６）は、ヒトＣＬＤＮ６またはヒトＣＬＤＮ６／９に選択的に結合する。本開示の抗体およびそれの断片は、ＣＬＤＮ６に対するＣＤＲ配列の独自のセットによって特徴付けられ、単剤療法として、または他の抗がん剤との組合せでがん免疫療法に有用である。

【0092】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはその抗体断片は、以下の構造的および機能的特徴の１つまたは複数を、単独でまたは組合せで呈する：（ａ）それらの細胞表面にヒトＣＬＤＮ６を発現する細胞に結合する；（ｂ）アイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２０～２５倍高いか、またはＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞に発現されたＣＬＤＮ６へのアイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２０～３０倍高いシグナル（例えば、ＭＦＩ）でＣｌａｕｄｉｎ－６ ＣＨＯ－Ｋ１細胞に選択的に結合する；（ｃ）アイソタイプ対照抗体の結合活性よりおよそ２５～６０倍高いシグナルで等しく、Ｃｌａｕｄｉｎ－６（Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＣＨＯ－Ｋ１細胞）およびＣｌａｕｄｉｎ－９（ＨＥＫ２９３細胞）を発現する細胞に結合する；（ｄ）ＣＬＤＮ３、ＣＬＤＮ４を発現する細胞に弱く結合するかまたはまったく結合しない；（ｅ）Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞に結合するが、Ｃｌａｕｄｉｎ６遺伝子をノックアウトしたＮＥＣ８細胞には結合しない；（ｆ）場合により、マウスＣＬＤＮ６と交差反応する；（ｇ）Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞における結合およびエンドサイトーシス介在細胞傷害性の誘導後、Ｃｌａｕｄｉｎ－６陽性細胞の表面から効率的に内部移行される；ならびに（ｈ）その天然構造でＣＬＤＮ６を持つ細胞に対する１つまたは複数の免疫エフェクター機能を呈し、この場合、１つまたは複数の免疫エフェクター機能が、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、または抗体依存性細胞性食作用（ＡＤＣＰ）から選択される。

【0093】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の一連のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。例えば、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の抗ＣＬＤＮ６抗体の１つにおいてそういったＣＤＲに相当する一連のＣＤＲ（例えば、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１のＣＤＲ）を含むことができる。

【0094】

別の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体は、表２に開示の一連のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。例えば、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、表２に開示の抗ＣＬＤＮ６抗体の１つまたは複数においてそういったＣＤＲに相当する一連のＣＤＲ（例えば、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２のＣＤＲ）を含むことができる。

【0095】

代替の実施形態では、抗ＣＮＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、表１に開示の一連のＣＤＲ（ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、およびＨＣＤＲ３）を有するＶＨ、ならびに表２に開示の一連のＣＤＲ（ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、およびＬＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。

【0096】

一実施形態では、抗体は、ヒトＣＬＤＮ６に特異的に結合する、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体もしくはヒト抗体、またはそれの抗原結合部分とすることができる。一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、キメラ抗体またはヒト化抗体としてフォーマットされた、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１またはＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２抗体のＣＤＲ領域の６つすべてを含む。

【0097】

【表1】

【0098】

【表2】

【0099】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、ＣＤＲ３：配列番号１３；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、ＣＤＲ３：配列番号３４；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、ＣＤＲ３：配列番号４０；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、ＣＤＲ３：配列番号４０；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、ＣＤＲ３：配列番号４８
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＨを含む。

【0100】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、ＣＤＲ３：配列番号１０；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、ＣＤＲ３：配列番号１６；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、ＣＤＲ３：配列番号３７；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、ＣＤＲ３：配列番号４３；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、ＣＤＲ３：配列番号４３；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、ＣＤＲ３：配列番号５１、
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＬを含む。

【0101】

別の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、
（ａ）
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、ＣＤＲ３：配列番号１３；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、ＣＤＲ３：配列番号３４；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、ＣＤＲ３：配列番号４０；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、ＣＤＲ３：配列番号４０；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、ＣＤＲ３：配列番号４８；
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＨと、
（ｂ）
（ｉ）ＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、ＣＤＲ３：配列番号１０；
（ｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、ＣＤＲ３：配列番号１６；
（ｉｉｉ）ＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、ＣＤＲ３：配列番号３７；
（ｉｖ）ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、ＣＤＲ３：配列番号４３；
（ｖ）ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、ＣＤＲ３：配列番号４３；および
（ｖｉ）ＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、ＣＤＲ３：配列番号５１、
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を有するＶＬと、
を含む。

【0102】

一実施形態では、抗体は、
（ｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号５、ＣＤＲ２：配列番号６、ＣＤＲ３：配列番号７、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号８、ＣＤＲ２：配列番号９、ＣＤＲ３：配列番号１０；
（ｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号１１、ＣＤＲ２：配列番号１２、ＣＤＲ３：配列番号１３、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号１４、ＣＤＲ２：配列番号１５、ＣＤＲ３：配列番号１６；
（ｉｉｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３２、ＣＤＲ２：配列番号３３、ＣＤＲ３：配列番号３４、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号３５、ＣＤＲ２：配列番号３６、ＣＤＲ３：配列番号３７；
（ｉｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号３９、ＣＤＲ３：配列番号４０、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４２、ＣＤＲ３：配列番号４３；
（ｖ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号３８、ＣＤＲ２：配列番号４４、ＣＤＲ３：配列番号４０、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４１、ＣＤＲ２：配列番号４５、ＣＤＲ３：配列番号４３；および
（ｖｉ）ＶＨ：ＣＤＲ１：配列番号４６、ＣＤＲ２：配列番号４７、ＣＤＲ３：配列番号４８、
ＶＬ：ＣＤＲ１：配列番号４９、ＣＤＲ２：配列番号５０、ＣＤＲ３：配列番号５１
からなる群から選択される一連の相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を有する、ＶＨおよびＶＬの組合せを含む。

【0103】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８および３０群から選択される可変重鎖配列、ならびに／または配列番号２、４、２５、２７、２９および３１から選択される可変軽鎖配列を含む。

【0104】

一実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、一対の可変重鎖配列と可変軽鎖配列を含み、これは以下の組合せから選択される：配列番号１を含む可変重鎖配列と配列番号２を含む可変軽鎖配列；配列番号３を含む可変重鎖配列と配列番号４を含む可変軽鎖配列；配列番号２３を含む可変重鎖配列と配列番号２を含む可変軽鎖配列；配列番号２４含む可変重鎖配列と配列番号２５を含む可変軽鎖配列；配列番号２６を含む可変重鎖配列と配列番号２７を含む可変軽鎖配列；配列番号２８を含む可変重鎖配列と配列番号２９を含む可変軽鎖配列および；配列番号３０を含む可変重鎖配列と配列番号３１を含む可変軽鎖配列。当業者であれば、可変軽鎖および可変重鎖を独立して選択して、または混合およびマッチさせて、上で特定されたペアリングとはまったく別である、可変重鎖と可変軽鎖の組合せを含む抗ＣＬＤＮ６抗体を調製することができることを、さらに理解するであろう。

【0105】

代替の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、一対の可変重鎖配列と可変軽鎖配列を含み、これは以下の組合せから選択される：配列番号１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号２３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号２４と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２５と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号２６と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２７と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；配列番号２８と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号２９と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；および配列番号３０と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列と配列番号３１と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列。当業者であれば、可変軽鎖および可変重鎖を独立して選択して、または混合およびマッチさせて、上で特定されたペアリングとはまったく別である、可変重鎖と可変軽鎖の組合せを含む抗ＣＬＤＮ６抗体を調製することができることを、さらに理解するであろう。

【0106】

一部の実施形態では、抗体は完全長抗体である。他の実施形態では、抗体は、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ）_２、Ｆｖ、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、キメラ抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、ミニ抗体、およびＣＬＤＮ６選択的結合をそのポリペプチドに付与するのに十分である免疫グロブリンの少なくとも一部を含有するポリペプチドからなる群から選択される抗体断片を始めとする抗体断片である。

【0107】

一部の実施形態では、本明細書に開示の抗ＣＬＤＮ６抗体の可変領域ドメインは、Ｃ末端アミノ酸で、少なくとも１つの他の抗体ドメインまたはそれの断片に共有結合で付着させることができる。したがって、例えば、可変領域ドメインに存在するＶＨドメインは、免疫グロブリンＣＨ１ドメインまたはそれの断片に連結することができる。同様に、ＶＬドメインはＣＫドメインまたはそれの断片に連結することができる。このように、例えば、抗体はＦａｂ断片とすることができるが、この場合、抗原結合ドメインは、会合したＶＨドメインおよびＶＬドメインを含有し、これらドメインは、そのＣ末端で、それぞれＣＨ１ドメインおよびＣＫドメインに共有結合で連結されている。ＣＨ１ドメインをさらなるアミノ酸で伸長させて、例えば、Ｆａｂ断片に見られるようなヒンジ領域またはヒンジ領域ドメインの一部を供給すること、または、抗体のＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインなどのさらなるドメインを供給することができる。

【0108】

したがって、一実施形態では、抗体断片は、本明細書に記載の少なくとも１つのＣＤＲを含む。抗体断片は、本明細書に記載の、少なくとも２、３、４、５、または６つのＣＤＲを含むことができる。抗体断片は、本明細書に記載の抗体の少なくとも１つの可変領域ドメインをさらに含むことができる。可変領域ドメインは、任意のサイズであってもアミノ酸組成であってもよいが、全体として、ヒトＣＬＤＮ６への結合を担う少なくとも１つのＣＤＲ配列を、例えば、本明細書に記載のＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３、ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、および／またはＣＤＲ－Ｌ３を含むことになるが、これは、１つまたは複数のフレームワーク配列に隣接しているかまたはそれとインフレームである。

【0109】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体はモノクローナル抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体はヒト抗体である。代替の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体はマウス抗体である。一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体はキメラ抗体、二重特異性抗体、またはヒト化抗体である。

【0110】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換を含む。当業者であれば、保存的アミノ酸置換とは、１つのアミノ酸と、類似した構造的または化学的特性、例えば類似した側鎖などを有する別のアミノ酸との置換であると理解するであろう。例示的な保存的置換は、当技術分野において、例えば、Watson et al., Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Publication Company, 4th Ed. (1987)に記載されている。

【0111】

「保存的改変」とは、アミノ酸配列を含有する抗体の結合特性に有意に影響することがないまたはこれを変えることがないアミノ酸改変を指す。保存的改変には、アミノ酸の置換、付加、および欠失が含まれる。保存的置換とは、アミノ酸が類似の側鎖を有するアミノ酸残基に置き換えられている置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーについては十分に定義されており、それとしては、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、トリプトファン）、芳香族側鎖（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン、チロシン）、脂肪族側鎖（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン）、アミド（例えば、アスパラギン、グルタミン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および含硫側鎖（システイン、メチオニン）を有するアミノ酸が挙げられる。さらに、アラニンスキャニング突然変異誘発について既に記載されているように（MacLennan et al. (1998), Acta Physiol Scan Suppl 643: 55-67、Sasaki et al. (1998), Adv Biophys 35: 1-24）、ポリペプチド中の任意の天然残基をアラニンで置換することもできる。本開示の抗体に対するアミノ酸置換は、既知の方法によって、例えばＰＣＲ突然変異誘発によって行うことができる（米国特許第４，６８３，１９５号明細書）。

【0112】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、可変重鎖配列を含む。他の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０の可変重鎖配列を含む抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。さらに他の実施形態では、抗ＴＮＦＲ２抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０の可変重鎖配列を含み、かつ、重鎖可変配列に、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５の保存的アミノ酸置換を有する。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０の１つまたは複数のフレームワーク領域に包含される（カバットのナンバリングシステムに基づく）。

【0113】

特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０に記載の抗ＣＬＤＮ６重鎖可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変重鎖配列を含む、可変重鎖配列を含み、フレームワーク領域に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換（カバットのナンバリングシステムに基づく）を含み、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０に記載の可変重鎖配列と配列番号２、４、２５、２７、２９または３１に記載の可変軽鎖配列とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。

【0114】

一部の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、２５、２７、２９または３１に記載のアミノ酸配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、可変軽鎖配列を含む。他の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、２５、２７、２９または３１の可変軽鎖配列を含む抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。さらに他の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、２５、２７、２９または３１の可変軽鎖配列を含み、かつ、軽鎖可変配列に、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換、例えば、１、２、３、４、５、１～２、１～３、１～４または１～５の保存的アミノ酸置換を有する。さらに別の実施形態では、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換は、配列番号２、４、２５、２７、２９または３１の１つまたは複数のフレームワーク領域に包含される（カバットのナンバリングシステムに基づく）。

【0115】

特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、配列番号２、４、２５、２７、２９または３１に記載の抗ＣＬＤＮ６軽鎖可変領域配列と少なくとも約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の配列同一性を有する可変軽鎖配列を含み、フレームワーク領域に１つまたは複数の保存的アミノ酸置換（カバットのナンバリングシステムに基づく）を含み、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８または３０に記載の可変重鎖配列と配列番号２、４、２５、２７、２９または３１に記載の可変軽鎖配列とを含む抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片の結合活性および／または機能活性を保持する。

【0116】

本開示の抗体の治療効果は、その有効性および効力を改善する細胞傷害薬または細胞傷害剤へのコンジュゲーションによって増強され得る。一部の実施形態では、抗体は、細胞傷害性エフェクター剤、例えば放射性同位体、薬物、または細胞毒に結合したＣＬＤＮ－６特異的抗体を含む抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）である。

【0117】

本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体は、二重特異性Ｔ細胞結合抗体、またはＮＫ細胞を再指令する二重特異性分子、または細胞療法、例えばＣＡＲ－Ｔ療法を含む、腫瘍へと患者のエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を方向付ける、ＣＬＤＮ６またはＣＬＤＮ６／９選択的結合による、抗体ベースの免疫療法を開発するためにも使用され得る。

【0118】

例示的な態様では、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの断片は、２つの異なるおよび別個の抗原に結合することができる二重特異性抗体の形態の抗原結合タンパク質へと組み込まれ得る。５０を超えるフォーマットの二重特異性抗原結合タンパク質が当技術分野で公知であり、その一部は、Kontermann and Brinkmann, Drug Discovery Today 20(7): 838-847 (2015)；Zhang et al., Exp Hematol Oncol 6: 12 (2017)；Spiess et al.,, Mol Immunol.; 67(2 Pt A):95-106 (2015)に記載される。例示的な一態様では、二重特異性抗体の抗ＣＤＬＮ６抗原結合タンパク質成分は、完全長抗体である。代替の実施形態では、二重特異性抗原結合タンパク質は、任意の本開示の抗体のＬＣおよびＨＣ可変領域を含む抗ＣＬＤＮ６ ｓｃＦｖを含む。

【0119】

様々な態様では、抗原結合断片は重鎖可変領域に基づき、他の態様では、抗原結合断片は軽鎖可変領域に基づく。例示的な態様では、抗原結合断片は、ＨＣ可変領域とＬＣ可変領域の両方の少なくとも一部を含む。例示的な態様では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ６抗体のＬＣまたはＨＣ可変領域の両方でなければ少なくとも１つおよび第２の抗原に特異的な第２の抗体のＬＣおよびＨＣ可変領域の両方でなければ少なくとも１つを含む。例示的な例では、二重特異性抗原結合タンパク質は、本開示のＣＬＤＮ６抗体のＬＣおよびＨＣ可変領域ならびに第２の抗原に特異的な第２の抗体のＬＣおよびＨＣ可変領域を含むｓｃＦｖを含む。

【0120】

例示的な実施形態では、抗原結合タンパク質は二重特異性であり、ＣＬＤＮ６および第２の抗原に結合する。例示的な例では、第２の抗原は、Ｔ細胞によって発現される細胞表面タンパク質である。例示的な態様では、細胞表面タンパク質は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、例えば、ＣＤ３である。例示的な例では、第２の抗原はＴ細胞活性化をアシストする共刺激分子、例えばＣＤ４０または４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）である。代替の例示的な例では、第２の抗原は、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＢＴＬＡ、ＣＴＬＡ４、ＩＤＯ、ＫＩＲ、ＬＡＧ３、ＮＯＸ２、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＶＩＳＴＡ、またはＳＩＧＬＥＣ７から選択される免疫チェックポイント分子（例えば、免疫チェックポイント経路に含まれるタンパク質）である。場合により、免疫チェックポイント分子は、ＰＤ－１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、またはＣＴＬＡ４である。

【0121】

本明細書に記載の抗ＣＬＤＮ６抗体、または抗原結合部分、二重特異性抗体、またはＣＬＤＮ６結合剤を含む融合タンパク質は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞と関連する疾患の抗体ベースの治療のために使用され得る。例えば、抗体は、ＣＬＤＮ６を発現する細胞と関連する固形腫瘍がん疾患、例えば、乳がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、膵臓がん、胃がん、胆嚢がんおよび尿路上皮がんを処置するために使用され得る。

【0122】

様々な実施形態では、本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ６抗体は、限定はされないが、薬物動態の変更、血清半減期の増加、結合親和性の増加、免疫原性の減少、産生の増加、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）へのＦｃリガンド結合の変更、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、ＡＤＣＰ、ＴＤＣＣの増強または減少、グリコシル化および／またはジスルフィド結合の変更ならびに結合特異性の改変を含む、好ましい特徴を有する化合物を生じるアミノ酸残基置換、突然変異および／または改変を含むが、これに限定されない、定常領域（すなわち、Ｆｃ領域）の置換または改変を含み得る。Ｆｃエフェクター機能が改善した抗体または抗体断片は、例えば、ＦｃドメインとＦｃ受容体（例えば、ＦｃｙＲＩ、ＦｃｙＲＩＩＡおよびＢ、ＦＣＹＲＩＩＩおよびＦｃＲｎ）の間の相互作用に含まれるアミノ酸残基の変化によって生成され、細胞傷害性の増加をもたらし得る。

【0123】

細胞傷害性細胞の活性化の重要なステップは、免疫エフェクター細胞のＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６Ａ）へのｍＡｂの結合であり、この相互作用の強さは、抗体アイソタイプ、抗体Ｆｃ領域のグリコシル化パターンおよびＦｃγＲＩＩＩａ多形によって決定される。多くの論文が、臨床試験に由来する抗体ベースのがん治療におけるＦｃγＲ介在性エフェクター機能の役割を示す発見を報告している。研究結果は、臨床応答（例えば、抗体有効性）とヒトＦｃγＲを活性化する特定のａｌｌｏｆｏｒｍの間の関係を示す。１５８Ｆ対立遺伝子を持つ患者は、トラスツズマブ、リツキシマブ、セツキシマブ、インフリキシマブおよびイピリムマブを含むある特定の治療抗体ならびに作用の主要なメカニズムとしてＡＤＣＣを利用する他の治療抗体への臨床応答の減少を示すことが報告された。改善されたＦｃｇＲ結合プロファイルを有するように改変された抗体は、優れた抗腫瘍応答を駆動し、大きな臨床的有用性を付与することが報告された。

【0124】

活性化および阻害ＦｃγＲの発見は、免疫エフェクター細胞を活性化して特定の機能を実施するように設計された活性化／阻害（Ａ：Ｉ）比によって特徴付けられるＦｃγＲ結合活性を有することに基づいて「目的に合った」治療抗体の設計に注目した探索研究努力をもたらした。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）によるがんの免疫療法は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ活性を含む様々なメカニズムにより腫瘍細胞の除去を促進する。実際には、いくつかの認可されたｍＡｂの治療活性は、エフェクター細胞に発現された低親和性Ｆｃγ受容体へのＦｃγ領域の結合に依存する。

【0125】

いくつかの論文は、最適化されたＦｃｇＲ結合プロファイルおよび細胞介在性エフェクター機能を最適化するのに好適な活性化／阻害（Ａ：Ｉ）比を有するバリアントヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメイン（ＣＨ領域）を設計するタンパク質工学戦略の使用の成功を報告する。特定の努力は、低親和性受容体ＦｃγＩＩＩａのＦｃドメインの親和性の増加に注目した。Ｆｃドメイン内の多くの突然変異は、Ｆｃ受容体の結合を直接または間接的に増強し、結果として細胞の細胞傷害性を著しく増強することが同定された（Lazar, G.A. PNAS 103:4005-4010 (2006)、Shields, R.L. et al, J. Biol. Chem. 276:6591-6604 (2001) Stewart, R. et al., Protein Engineering Design and Selection 24: 671-678 (2011) (Richards, J.O. et al, Mol. Cancer Ther. 7:2517-2575 (2008)。

【0126】

ＣＬＤＮ６結合
本明細書で提供される抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、非共有結合および可逆的な方法でＣＬＤＮ６に結合する。様々な実施形態では、抗原結合タンパク質のＣＬＤＮ６への結合強度は、その親和性、抗原結合タンパク質の結合部位とエピトープの間の相互作用の強度の測定で記載され得る。様々な態様では、抗原結合タンパク質の親和性は、フローサイトメトリーまたは蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）ベースのアッセイを使用して測定またはランク付けされる。フローサイトメトリーベースの結合アッセイは、当技術分野で公知である。例えば、Cedeno-Arias et. al., Sci Pharm 79(3): 569-581 (2011)；Rathanaswami et. al., Analytical Biochem 373: 52- 60 (2008)；およびGeuijen et. al., J Immunol Methods 302(1-2): 68-77 (2005)を参照。選択性は、ＣＬＤＮ６、またはＣＬＤＮファミリーメンバーの抗原結合タンパク質によって示されるＫＤに基づき、ＫＤは、当技術分野で公知の技術、例えば、表面プラズモン共鳴、ＦＡＣＳベースの親和性アッセイによって決定され得る。

【0127】

様々な態様では、ＣＬＤＮ６抗体の相対親和性は、異なる濃度のＣＬＤＮ６抗体がＣＬＤＮ６を発現する細胞とインキュベートされ、放射された蛍光（抗体－抗原結合の直接測定である）が決定される、ＦＡＣＳベースのアッセイによって決定される。各用量または濃度の蛍光をプロットする曲線が作成される。最大値は、蛍光が定常に達するかまたは最大に達する最低濃度であり、結合飽和が起こる場合である。最大値の半分は、ＥＣ_５０またはＩＣ_５０が考えられ、最低ＥＣ_５０／ＩＣ_５０を有する抗体は、同じ方法で試験した他の抗体と比較して最高の親和性を有すると考えられる。

【0128】

一態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を過剰発現するように遺伝子改変される。例えば、細胞は、ＣＬＤＮ６を発現するように改変されたＨＥＫ２９３ＴまたはＣＨＯ細胞である。代替の態様では、細胞は、ＣＬＤＮ６を内因性発現する確立された体液腫瘍細胞株である。様々な態様では、細胞は、ヒト細胞株（例えば、卵巣細胞株、子宮内膜細胞株、生殖細胞腫瘍細胞株、肺細胞株、消化管（ＧＩ）細胞株、肝細胞株、肺細胞株等）由来の細胞である。

【0129】

一実施形態では、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、ＣＬＤＮ９と比較してＣＬＤＮ６に選択的に結合し、ｃｌａｕｄｉｎ－３（ＣＬＤＮ３）またはｃｌａｕｄｉｎ－４（ＣＬＤＮ４）に結合しない。代替の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、ＣＬＤＮ６とＣＬＤＮ９の両方に等しく結合し（例えば、いずれかのＣＬＤＮの優先はない）およびｃｌａｕｄｉｎ－３（ＣＬＤＮ３）またはｃｌａｕｄｉｎ－４（ＣＬＤＮ４）に結合しない。

【0130】

ＣＬＤＮ６内部移行および用量依存性細胞傷害性
抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体－薬物抗体ＩＭＡｂ０２７を含むＡＤＣである、ＩＭＡＢ０２７－ｖｃＭＭＡＥの安全性および抗腫瘍活性の前臨床特徴付けは、以下を評価する研究を含む：様々なＣＬＤＮ６＋ヒト卵巣がん（ＯＣ）および精巣がん（ＴＣ）細胞株におけるＩＭＡＢ０２７の内部移行；ＸＴＴ代謝アッセイによる細胞培養で評価した結合特徴（ＦＡＣＳによる）および細胞生存およびＩＭＡＢ０２７－ｖｃＭＭＡＥ介在細胞傷害性作用（直接および間接バイスタンダー）（Tureci, et al,AACR; Cancer Res 2018;78 (13Suppl): Abstract # 1778）。

【0131】

Tureci, et al.は、ＩＭＡＢ０２７ ＡＣＤがＣＬＤＮ６を発現する細胞株に強く結合し、ＣＬＤＮ６を発現する細胞株によって内部移行され、ｎｇ／ｍＬオーダーのＥＣ５０値で１００％までＣＬＤＮ６＋ＯＣ細胞およびＴＣ細胞の生存を低減し得ることを報告した。さらに、コンジュゲーション後、ＩＭＡＢ０２７－ｖｃＭＭＡＥは、抗体依存性細胞の細胞傷害性および補体依存性細胞傷害性によるＣＬＤＮ６＋細胞死を誘導するＩＭＡＢ０２７の能力を保持した。ＣＬＤＮ６を発現しない細胞株は、単一培養のＩＭＡＢ０２７－ｖｃＭＭＡＥによって影響されないが、ＣＬＤＮ６＋およびＣＬＤＮ６陰性細胞の共培養では、ＩＭＡＢ０２７－ｖｃＭＭＡＥはバイスタンダー効果を発揮し、標的担持ＣＬＤＮ６＋細胞に加えて、共培養したＣＬＤＮ６陰性細胞の死を生じる。したがって、ＣＬＤＮ６に特異的なモノクローナル抗体は、ＣＬＤＮ６の誘導性および効果的な内部移行を媒介することができ、ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞に細胞傷害剤を送達するのに有用であることが公知である。

【0132】

最大結合能、ＥＣ_５０、細胞表面内部移行および細胞傷害性のｉｎ ｖｉｔｒｏ評価に基づき、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体は、がんの処置のためのＡＤＣベースの標的化抗体としての使用の好適性を評価され得る。したがって、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体は、がんの処置のための抗体ベースの免疫療法の方法での使用のための内部移行する部位特異的ＡＤＣの開発のためのＡＤＣベースの標的化抗体としての使用に好適である。

【0133】

ＣＬＤＮ６に特異的な本開示の抗体は、ＣＬＤＮ６の誘導性内部移行および効率的な内部移行を媒介することができ、それは、ＡＤＣコンジュゲート二次抗体が存在する場合に、用量依存性細胞傷害性にいたる。ＣＬＤＮ６を過剰発現するＨＥＫ２９３細胞株では、細胞死滅の観察されたＥＣ_５０は、１．７３ｎＭ～２．１９ｎＭの範囲である。がん細胞株ＮＥＣ８では、細胞死滅のＥＣ_５０は、０．１ｎＭ～０．２ｎＭの範囲である。がん細胞株ＯＶ９０では、細胞死滅のＥＣ_５０は、１．０８ｎＭ～２．３２ｎＭの範囲である。

【0134】

ＣＬＤＮ６ ＡＤＣＣ
標的細胞の表面上に発現されるＣＬＤＮ６の結合の結果として、本開示の抗体は作用の１つまたは複数のメカニズム、例えば細胞傷害剤の送達により、またはＡＤＣＣ－、ＣＤＣ－、またはＴＤＣＣ－介在性溶解を方向付けることにより標的細胞死を媒介することができる。一実施形態では、標的細胞は、原発性または転移性がん細胞である。

【0135】

一部の態様では、本開示の抗ＣＬＤＮ６産生抗体は、死滅を媒介するそれらの能力（例えば、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｔ細胞依存性細胞傷害性（ＴＤＣＣ）、および／または細胞増殖の阻害）および／またはＣＬＤＮ６を発現する細胞の食作用について評価され得る。
本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体は、内因性に、またはヒトＣＬＤＮ６を過剰発現するように改変された宿主細胞によって、ＣＬＤＮ６を発現する標的細胞に対してＡＤＣＣを方向付けることもできる。がん細胞株ＮＥＣ８では、ＡＤＣＣ活性のＥＣ_５０は、０．４０ｎＭ～９．８３ｎＭの範囲である。がん細胞株ＯＶ９０では、ＡＤＣＣ活性のＥＣ_５０は、０．３ｎＭ～０．７５ｎＭの範囲である。

【0136】

抗体ベースの免疫療法
腫瘍抗原を標的とする抗体を使用する抗体ベースの免疫療法の目標は、正常な組織を害することなくがん細胞を排除することである。したがって、腫瘍学における抗体ベースの免疫療法の有効性および安全性は、意図された作用メカニズム、免疫系の関連エフェクター機能および腫瘍特異的または腫瘍関連標的抗原の性質よって大いに異なる。

【0137】

本開示の抗体は、直接腫瘍細胞を死滅させるようにペイロード（例えば、放射性同位体、薬物または毒素）の標的化にも使用することができ、または免疫エフェクター細胞への化学療法の細胞傷害性副作用のために障害され得る抗腫瘍免疫応答を含み得る作用の補足的なメカニズムにより腫瘍を攻撃する従来の化学療法剤と相乗的に使用することができる。

【0138】

抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）とは、高度に強力な抗体ベースのがん療法のクラスである。ＡＤＣは、合成リンカーを介して細胞傷害剤（ペイロードとして知られる）に共有結合で連結された組換えモノクローナル抗体からなる。ＡＤＣは、モノクローナル抗体の特異性と小分子化学療法薬の効力を兼ね備えるとともに、高度に細胞傷害性の小分子薬物部分の腫瘍細胞への直接的な標的化送達を容易にする。ＡＤＣの標的化性質により、全身曝露が限定されることと相まって薬物効力の向上が可能となる。合わせて、これらの特性により、副作用はより少なくかつ治療ウインドウがより広いという望ましい特徴がＡＤＣに付与される（Peters et al., Biosci Rep, 35(4):e00225, 2015）。

【0139】

ＡＤＣ標的としての使用に適した細胞表面抗原は、２つの重要な特性によって特徴付けられる：（ｉ）標的細胞による高発現レベルおよび正常組織では発現が限定的またはまったくないこと、ならびに、（ｉｉ）抗体結合に応答した効率的な内部移行。ＣＬＤＮ６は、子宮内膜がん、卵巣がんおよび精巣がんおよび肺がん（ＮＳＣＬＣ）を含む複数のがんで過剰発現する。発現されたＣＬＤＮタンパク質の実質的な部分は、腫瘍形成細胞表面と会合したままであり、それにより本開示の抗体またはＡＤＣの局在および内部移行を可能にする証拠がある。

【0140】

本明細書で使用される場合、「内部移行する」抗体は、会合した抗原または受容体への結合時に細胞によって取り込まれる（任意の細胞毒とともに）ものである。治療適用のため、内部移行は、好ましくはそれを必要とする対象においてｉｎ ｖｉｖｏで起こるであろう。内部移行されたＡＤＣの数は、抗原発現細胞、特に抗原発現がん幹細胞を死滅させるのに十分であり得る。全体として、細胞毒またはＡＤＣの効力により、一部の例では、細胞への単一抗体分子の取込みは、抗体が結合する標的細胞を死滅させるのに十分である。例えば、ある特定の薬物は、高い効力があり、抗体にコンジュゲートした毒素のわずかな分子の内部移行が腫瘍細胞を死滅させるのに十分である。哺乳動物細胞への結合時に抗体が内部移行するかどうかは、以下の実施例に記載されるものを含む様々な当技術分野で認識されるアッセイによって決定され得る。

【0141】

抗体薬物コンジュゲートの生成は、適切な任意のペイロード薬、合成リンカーおよび共役化学を使用して、当業者に知られている任意の技法によって行うことができる。当業者であれば、ＡＤＣについて知っており、以下のことついても知っている：ＡＤＣの開発には、いくつかの要因に関する評価が必要であり、この要因には、標的抗原の生物学、抗体の特異性、ペイロード薬の細胞傷害性および作用のメカニズム、リンカーの安定性および切断、リンカー付着の部位、および共役化学によって作製されるＡＤＣの不均一性のレベルが含まれる。不均一性であると、抗体ごとに付着した細胞傷害性分子の数に関して、効能がない種（薬物ペイロードではない）と、抗体１分子当たり４つを超える薬物部分（高負荷）を有する種（この種はより迅速にクリアされるとともに毒性の一因となる可能性がある）とを含有する薬物製品の作製がもたらされるおそれがある。さらに、効力のない種（細胞傷害性ペイロードのまったくない抗体）が存在すると、ＡＤＣ標的抗原への結合にあたり競合することによって、効力が低下する可能性がある。したがって、一定した薬物：抗体比（ＤＡＲ）によって特徴付けられる抗体の均一な混合物を含むＡＤＣ薬物製品を作製することが望まれる。

【0142】

目下臨床評価にあるＡＤＣ候補の大部分は、細胞傷害性ペイロードとして薬物の主要な３つのクラスのうちの１つ、すなわちメイタンシノイド、アウリスタチンおよびＰＢＤ二量体を用いる；しかし、他のクラスのペイロード、例えば、カリケアマイシン（ゲムツズマブオゾガマイシンおよびイノツズマブオゾガマイシン向け）、デュオカルマイシン、エキサテカン、またはＳＮ－３８も使用される（Shim et al., Biomolecules, 10(3):360, 2020）。一般的に言えば、細胞傷害性薬物は、チューブリン阻害剤（アウリスタチンおよびメイタンシノイド）として、またはＤＮＡ構造のかく乱物質として、いずれかで作用するが、このかく乱物質には、デュオカルマイシン（ＤＮＡアルキル化）、カリケアマイシン（ＤＮＡ二本鎖切断）、ＳＮ－３８およびエキサテカンなどのカンプトテシンアナログ（トポイソメラーゼ阻害剤）、またはピロロベンゾジアゼピン（ＰＢＤ）二量体（ＤＮＡ鎖架橋）（Shim et al.）が含まれる。

【0143】

リンカーの重要な機能の１つは、血液循環においてＡＤＣの安定性を維持することであり、一方で、標的細胞による内部移行の際に毒素放出を可能とすることである。適切なリンカーを特定するための過程で考慮すべき重要なパラメータには、リンカーの切断性および共役化学の詳細（すなわち、連鎖の位置および性質）が含まれる。広義では、リンカーは、切断性および非切断性という広い２つのカテゴリーに分類される。切断性リンカーは、血流中の正常な生理的状態とがん細胞の細胞質に存在する細胞内状態との間の差異を利用する（Peters et al., Biosci Rep, 35(4):e00225, 2015）。ＡＤＣ－抗原複合体が内部移行された後の微小環境の変化によって、リンカーの切断が引き起こされ、細胞傷害性ペイロードが放出され、標的抗原を発現する標的がん細胞へと毒性が効果的に送り込まれる。広義では、３つのタイプの切断性リンカーがある：ヒドラゾン、ジスルフィドおよびペプチドの各リンカー。対照的に、非切断性リンカーは単に、ＡＤＣ抗原の内部移行に続くリソソーム分解のプロセスのみに依存する。ＡＤＣ－抗原複合体の内部移行の後、リソソーム内のプロテアーゼ酵素が抗体のタンパク質構造を分解し、リンカーに付着した単一のアミノ酸（通常はシステインまたはリジン）と、実薬として細胞質に放出される細胞傷害剤とが得られる。リンカー化学が、ＡＤＣの特異性、効力、活性および安全性の重要な決定要因であることはよく知られている。

【0144】

当業者であれば、ＴＳＡ－またはＴＡＡ特異的抗体へのリンカー－ペイロードのコンジュゲーションに使用するのに適したタンパク質の化学修飾のための多くの技法があることを、認識するであろう。当業者であれば、共役化学の様々な方法によって、薬物付着の数と部位にわたる様々なレベルの制御が提供され、作製される抗ＣＬＤＮ６ ＡＤＣの薬物動態、毒性および治療ウインドウが影響を受ける可能性があることを認識するであろう。抗体薬物コンジュゲートは、従来の技法に従って抗体に薬物を結合させることによって調製することができる。治療的部分を抗体にコンジュゲートするための技法は、当業者によく知られている、例えば、以下を参照されたい、Arnon et al., “Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom et al., “Antibodies For Drug Delivery”, in Controlled Drug Delivery (2nd Ed.), Robinson et al. (eds.), pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe, “Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review”, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al. (eds.), pp. 475-506 (1985)；“Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy”, in Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy, Baldwin et al. (eds.), pp. 303-16 (Academic Press 1985)、およびThorpe et al., “The Preparation And Cytotoxic Properties Of Antibody-Toxin Conjugates”, Immunol. Rev., 62: 119-58 (1982)。

【0145】

当業者であれば、従来のコンジュゲーション技法（天然アミノ酸配列組成の結果として、抗体に存在する表面に露出したリジン残基またはシステイン残基のいずれかへのコンジュゲーションを含む）に加えて、抗ＣＬＤＮ６特異的イムノコンジュゲートを調製するのに使用することができる部位特異的薬物コンジュゲーションに関する、他の多数の方法があることを理解するであろう。部位特異的共役化学法は、抗体の結合親和性を変化させることなく、比較的均一なＡＤＣ生成物を作製することを意図する。一般的に言えば、抗体の部位特異的コンジュゲーションには以下の３つの戦略が主として使用される：改変されたシステインの使用、非天然アミノ酸の組込みおよび、酵素的コンジュゲーションであって、部位特異的様式でタンパク質の翻訳後修飾を生成する細菌酵素（例えば、トランスグルタミナーゼ、グリコトランスフェラーゼ、ソルターゼ、またはホルミルグリシン生成酵素）に特異的に反応するように設計された抗体の反応部位を使用した、酵素的コンジュゲーション。治療的部分を抗体に部位特異的にコンジュゲートするための技法は、当業者によく知られており、これには、それらに限定されないが、米国特許第７，７２３，４８５号明細書；同第８，９３７，１６１号明細書；同第９，０００，１３０号明細書；同第９，８８４，１２７号明細書；同第９，７１７，８０３号明細書；同第１０，６３９，２９１号明細書；同第１０，３５７，４７２；米国特許出願公開第２０１５／０２８３２５９号明細書；同第２０１７／０３６２３３４号明細書；同第２０１８／０１４０７１４号明細書；および国際公開第２０１３／０９２９８３号パンフレット；同第２０１３／０９２９９８号パンフレット；同第２０１４／０７２４８２号パンフレット；同第２０１４／２０２７７３号パンフレット；同第２０１４／２０２７７５号パンフレット；同第２０１５／１５５７５３号パンフレット；同第２０１５／１９１８８３号パンフレット；同第２０１６／１０２６３２号パンフレット；同第２０１７／０５９１５８号パンフレット；同第２０１８／１４０５９０号パンフレットおよび同第２０１８／１８５５２６号パンフレットに、開示の方法が含まれる。

【0146】

代替の実施形態では、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片は、免疫系のエフェクター細胞と、好ましくは、ＡＤＣＣ、ＴＤＣＣ、ＣＤＣ、またはＡＤＣＰによって、相互作用し得る（Kubota, T. et al. (2009) Cancer Sci. 100 (9), 1566-1572；Nazarian et al., J. Bio. Scre., 2015, 20(4) 519-527）。

【0147】

本開示の文脈の「免疫エフェクター機能」という用語は、免疫系の成分によって媒介される任意の機能を含み、腫瘍播種および転移の阻害を含む、腫瘍増殖の阻害および／または腫瘍発生の阻害をもたらす。好ましくは、免疫エフェクター機能は、がん細胞の死滅をもたらす。好ましくは、本開示の文脈の免疫エフェクター機能は、抗体介在性エフェクター機能である。そのような機能は、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞介在性食作用（ＡＤＣＰ）、腫瘍関連抗原を持つ細胞におけるアポトーシスの誘導を含む。

【0148】

抗体依存性細胞介在性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）は、エフェクター細胞の細胞死滅能を記載し、好ましくは、抗体によってマークされている標的細胞を必要とする。エフェクター細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞、キラー細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、マスト細胞、および／または好塩基球を含み得；より具体的には、エフェクター細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞である。ある特定の態様では、ＡＤＣＣは、抗体が腫瘍細胞上の抗原に結合すると生じ、抗体Ｆｃドメインは免疫エフェクター細胞の表面上のＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合する。Ｆｃ受容体のいくつかのファミリーが同定され、特定の細胞集団は、既定したＦｃ受容体を特徴的に発現する。ＡＤＣＣは、様々な程度の急速な腫瘍崩壊を直接誘導するメカニズムとみなすことができ、抗原提示および腫瘍に対するＴ細胞応答の誘導をもたらす。好ましくは、ＡＤＣＣのｉｎ ｖｉｖｏ誘導は、腫瘍に対するＴ細胞応答および宿主由来の抗体応答をもたらすであろう。

【0149】

補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）は、抗体によって方向付けられ得る別の細胞死滅方法である。ＩｇＭは、補体活性化の最も有効なアイソタイプであるが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ３は両方とも、古典的な補体活性化経路によるＣＤＣの方向付けにも非常に有効である。

【0150】

あるいは、本明細書で提供される本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体は、腫瘍を処置する養子免疫遺伝子治療で利用され得る。一実施形態では、本開示の抗体（例えば、ｓｃＦｖ断片）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を生成するために使用され得る。「ＣＡＲ」は、本開示の抗ＣＬＤＮ抗体またはそれの免疫反応性断片（例えば、ＳｃＦｖ断片）、膜貫通ドメインおよび少なくとも１つの細胞内ドメインを含むＥＣＤから構成される融合タンパク質である。一実施形態では、ＣＡＲを発現するように遺伝的に改変されたＴ細胞、ナチュラルキラー細胞または樹状細胞は、ＣＬＤＮ６を発現する腫瘍細胞を特異的に標的化する対象の免疫系を刺激するように、がんを患う対象へと導入され得る。

【0151】

抗体を産生する方法
抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片は、当技術分野で知られている任意の方法によって作製することができる。例えば、レシピエントは、可溶性組換えＣｌａｕｄｉｎ－６（ＣＬＤＮ６）タンパク質またはその担体タンパク質とコンジュゲートされたＣＬＤＮ６ペプチドの断片で免疫することができる。適切な任意の免疫方法を使用することができる。かかる方法としては、アジュバント、他の免疫刺激剤、反復ブースター免疫、および１つまたは複数の免疫経路の使用を挙げることができる。

【0152】

ヒトＣＬＤＮ６の任意の好適な供給源は、本明細書に開示の組成物および方法の非ヒトまたはヒト抗ＣＬＤＮ６抗体の生成のための免疫原として使用することができる。

【0153】

様々な形態のＣＬＤＮ６抗原を使用して、生物学的に活性な抗ＣＬＤＮ６抗体の特定のための免疫応答を誘発させることができる。したがって、誘発ＣＬＤＮ６抗原は、単独でまたは１つもしくは複数の免疫原性増強剤との組合せの、単一のエピトープであっても、多重のエピトープであっても、タンパク質全体であってもよい。一部の態様では、誘発抗原は、単離された可溶性完全長タンパク質、または完全長配列未満を含む可溶性タンパク質である（例えば、ＣＬＤＮ６、ＥＣＤ１および／またはＥＣＤ２の細胞外ドメイン／ループを単独でまたは組み合わせて含むペプチドで免疫する）。本明細書で使用される場合、「部分」という用語は、必要に応じて、目的の抗原の免疫原性エピトープを構成する、最小数のアミノ酸または核酸を指す。目的の細胞の形質転換に適したあらゆる遺伝的ベクターを用いることができ、それには、アデノウイルスベクター、プラスミド、およびカチオン性脂質などの非ウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。

【0154】

マウス、げっ歯類、霊長類、ヒト等などの種々の哺乳動物宿主から、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）を調製することが望ましい。かかるモノクローナル抗体を調製する技法に関する記載が、例えば、Sties et al. (eds.) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (4th ed.) Lance Medical Publication, Los Altos, CAに、およびそこで引用される参考文献；Harlow and Lane (1988) ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL CSH Press; Goding (1986) MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (2nd ed.) Academic Press, New York, NYに見出すことができる。通常では、所望の抗原で免疫した動物由来の脾臓細胞が、普通には骨髄腫細胞との融合によって、不死化される。Kohler and Milstein, (196) Eur. J. Immunol. 6:511-519を参照されたい。不死化についての代替の方法としては、エプスタイン・バーウイルス、癌遺伝子、もしくはレトロウイルスを用いる形質転換、または当該分野において知られている他の方法が挙げられる。例えば、Doyle et al. (eds. 1994 and periodic supplements) CELL AND TISSUE CULTURE: LABORATORY PROEDURES, John Wiley and Sons, New York, NYを参照されたい。抗原に対する所望の特異性および所望の親和性の抗体の産生のために、単一の不死化細胞から生じるコロニーをスクリーニングする。かかる細胞により産生されるモノクローナル抗体の収量は、脊椎動物宿主の腹膜腔への注入を含めて、種々の技法によって増大することができる。あるいは、例えば、Huse et al. (1989) Science 246: 1275-1281に概説された一般的プロトコルに従って、ヒトＢ細胞由来のＤＮＡライブラリをスクリーニングすることによって、モノクローナル抗体またはそれの抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を単離することができる。したがって、抗体は、当技術分野で熟練した研究者によく知られている様々な技法によって得ることができる。

【0155】

他の適切な技法には、ファージ、酵母、ウイルスまたは類似のベクターにおける抗体のライブラリの選択が関与する。例えば、Huse et al.上掲；およびWard et al. (1989) Nature 341:544-546を参照されたい。本明細書で開示のポリペプチドおよび抗体は、キメラ抗体またはヒト化抗体を含めて、改変の有無にかかわらず使用することができる。しばしば、ポリペプチドおよび抗体は、検出可能なシグナルを供給する物質を、共有結合または非共有結合のいずれかで連結することによって、標識されることもある。科学文献と特許文献どちらにおいても、幅広い様々の標識およびコンジュゲーションの技法が、知られており、広く報告されている。適切な標識としては、放射性核種、酵素、基質、補因子、阻害因子、蛍光性の部分、化学発光性の部分、および磁性粒子等が挙げられる。かかる標識の使用を教示する特許としては、米国特許第３，８１７，８３７号明細書；同第３，８５０，７５２号明細書；同第３，９３９６，３４５号明細書；同第４，２７７，４３７号明細書；同第４，２７５，１４９号明細書；および同第４，３６６，２４１号明細書が挙げられる。また、組換え免疫グロブリンも産生させることができる、Cabilly米国特許第４，８１６，５６７号明細書；およびQueen et al. (1989) Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 86: 10029-10023を参照されたい；または、トランスジェニックマウスにおいて作製することができる、Nils Lonberg et al., (1994), Nature 368:856-859；およびMendez et al. (1997) Nature Genetics 15: 146-156；TRANSGENIC ANIMALS AND METHODS OF USE （国際公開第２０１２／６２１１８号パンフレット）、Ｍｅｄａｒｅｘ、Ｔｒｉａｎｎｉ、Ａｂｇｅｎｉｘ、Ａｂｌｅｘｉｓ、ＯｍｉｎｉＡｂ、Ｈａｒｂｏｕｒおよびそのほかの技法を参照されたい。

【0156】

一部の実施形態では、ＣＬＤＮ６および／またはＣｌａｕｄｉｎファミリーの他の関連するメンバーに結合する産生された抗体の能力は、標準的な結合アッセイを使用して、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）、ＦｏｔｅＢｉｏ（ＢＬＩ）、Ｇａｔｏｒ（ＢＬＩ）、ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロット、免疫蛍光、フローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）、または内部移行アッセイを使用して、評価することができる。

【0157】

ハイブリドーマまたは宿主細胞から調製した抗体組成物は、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、およびアフィニティークロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが通常の精製技法である。プロテインＡのアフィニティーリガンドとしての適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種およびアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用して、ヒトガンマ１、ガンマ２、またはガンマ４の各重鎖をベースとする抗体を精製することができる（例えば、Lindmark et al., 1983 J. Immunol. Meth. 62:1-13を参照されたい）。プロテインＧが、すべてのマウスアイソタイプにおよびヒトガンマ３に推奨される（例えば、Guss et al., 1986 EMBO J. 5:1567-1575を参照されたい）。アフィニティーリガンドが付着されるマトリクスはほとんどの場合アガロースであるが、その他のマトリクスも利用可能である。多孔性ガラス（controlled pore glass）またはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンなどの機械的に安定なマトリクスによって、アガロースで得ることができるよりも早い流速および短い処理時間が可能となる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ ＡＢＸ（商標）レジン（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、Ｎ．Ｊ．）が精製に有用である。イオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラム）でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、および硫酸アンモニウム沈殿などのタンパク質精製向けの他の技法も、回収される抗体に応じて利用可能である。

【0158】

任意の予備的精製ステップに続いて、目的の抗体と混入物を含む混合物を、通常では低塩濃度（例えば、約０～０．２５Ｍ塩から）で行うが、ｐＨ約２．５～４．５の間にての溶出緩衝剤を使用する低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することができる。

【0159】

また、本開示の抗体または抗体断片をコードする単離されたポリヌクレオチド配列により表わされるヌクレオチド配列の全部または一部（例えば、可変領域をコードする部分）に、本明細書で定義の、低、中および高のストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする、核酸も含まれる。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は典型的には、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０または５０）ヌクレオチド長である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、抗ＣＬＤＮ６ポリペプチド（例えば、重鎖可変領域または軽鎖可変領域）をコードする核酸またはその相補鎖の一部または全部の配列と少なくとも８０％、例えば、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９８％同一である。本明細書に記載のタイプのハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー、例えば、ＰＣＲプライマーまたは診断プローブとして使用することができる。

【0160】

ポリヌクレオチド、ベクターおよび宿主細胞
他の実施形態は、抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド、上記ポリヌクレオチドを含むベクター、および宿主細胞、ならびに上記抗体を作製するための組換え技法を包含する。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、完全長モノクローナル抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、およびＦｖ断片、ダイアボディ、線状抗体、単鎖抗体分子、および抗体断片から形成された多重特異性抗体を含めて、所望の任意の形態の抗ＣＬＤＮ６抗体をコードすることができる。

【0161】

一部の実施形態には、配列番号１、３、２３、２４、２６、２８および３０のアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片の重鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。一部の実施形態には、配列番号２、４、２５、２７、２９および３１のいずれかのアミノ酸配列を有する抗体または抗体断片の軽鎖可変領域をコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチドが含まれる。

【0162】

一実施形態では、単離されたポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３を含む可変重鎖配列および配列番号４を含む可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２３を含む可変重鎖配列および配列番号２を含む可変軽鎖配列；
（ｄ）配列番号２４を含む可変重鎖配列および配列番号２５を含む可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号２６を含む可変重鎖配列および配列番号２７を含む可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号２８を含む可変重鎖配列および配列番号２９を含む可変軽鎖配列；ならびに
（ｇ）配列番号３０を含む可変重鎖配列および配列番号３１を含む可変軽鎖配列
のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体または抗体断片をコードする。

【0163】

別の実施形態では、単離されたポリヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号１と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｂ）配列番号３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号４と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｃ）配列番号２３と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；または、
（ｄ）配列番号２４と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２５と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｅ）配列番号２６と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２７と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；
（ｆ）配列番号２８と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号２９と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列；ならびに
（ｇ）配列番号３０と９０％、９５％、または９９％同一である可変重鎖配列および配列番号３１と９０％、９５％、または９９％同一である可変軽鎖配列
のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域および重鎖可変領域を有する抗体または抗体断片をコードする。

【0164】

抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片をコードする配列を含むポリヌクレオチドを、当技法分野で知られている、１つまたは複数の調節配列または制御配列に融合することができ、かつ、それを当技術分野において知られている適切な発現ベクターまたは宿主細胞に含有せしめることができる。重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインをコードするポリヌクレオチド分子それぞれを、独立して、ヒト定常ドメインなどの定常ドメインをコードするポリヌクレオチド配列に融合することができ、その結果、インタクトな抗体の作製が可能となる。あるいは、ポリヌクレオチドまたはその一部を互いに融合することができ、その結果、単鎖抗体の作製用の鋳型がもたらされる。

【0165】

組換え産生の場合、抗体をコードするポリヌクレオチドを、クローニング用（ＤＮＡの増幅）または発現用の複製可能なベクターに挿入する。組換え抗体を発現させるための適切な多くのベクターが利用可能である。ベクター成分としては一般に、それらに限定されないが、以下の１つまたは複数が挙げられる：シグナル配列、複製起点、１つまたは複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、および転写終結配列。

【0166】

抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片はまた、融合ポリペプチドとして産生されてもよく、この場合、抗体または断片は、シグナル配列などの異種ポリペプチド、または成熟タンパク質もしくはポリペプチドのアミノ末端に特異的な切断部位を有する他のポリペプチドと融合されている。選択された異種シグナル配列は典型的には、宿主細胞によって認識されプロセシングされる（すなわちシグナルペプチダーゼによって切断される）ものである。抗ＣＬＤＮ６抗体シグナル配列を認識かつプロセシングしない原核宿主細胞の場合、シグナル配列を、原核生物のシグナル配列によって置換することができる。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、リポタンパク質、熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダー等とすることができる。酵母での分泌の場合、天然シグナル配列を、例えば、酵母インベルターゼアルファ因子（サッカロマイセス（Saccharomyces）およびクルイベロマイセス（Kluyveromyces）のアルファ因子リーダーを含めて）、酸性ホスファターゼ、Ｃ．アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼ、または国際公開第９０／１３６４６号パンフレットに記載のシグナルから得られるリーダー配列で置換することができる。哺乳動物細胞では、哺乳動物シグナル配列、ならびにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルを使用することができる。かかる前駆体領域のＤＮＡを、抗ＣＬＤＮ６抗体をコードするＤＮＡにリーディングフレーム内でライゲートする。

【0167】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、１つまたは複数の選択された宿主細胞においてベクターが複製することを可能とする核酸配列を含有する。一般には、クローニングベクター内でのその配列は、ベクターが宿主染色体ＤＮＡとは独立して複製することを可能とするものであり、これは複製起点または自律複製配列を含む。様々な細菌、酵母、およびウイルスについて、かかる配列はよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２由来の複製起点は大半のグラム陰性細菌にとって適切であり、２－υ．プラスミド起点は酵母に適切であり、種々のウイルス性起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ、およびＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、複製成分の起点は、哺乳動物発現ベクターには必要とされない（ＳＶ４０起点は、初期プロモーターを含有するという理由だけで、通常では使用することができる）。

【0168】

発現ベクターおよびクローニングベクターは、発現の特定を容易にする選択マーカーをコードする遺伝子を含有することができる。通常の選択マーカー遺伝子は、抗生物質もしくはその他の毒素、例えばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、もしくはテトラサイクリンに対する耐性を付与するタンパク質をコードする、または代替的には補完性の栄養要求性欠損症である、あるいは他の選択肢では、選択マーカー遺伝子は複合培地に存在しない特定の栄養分を供給する、例えば、上記遺伝子はバシラス綱（Bacilli）のためのＤ－アラニンラセミ化酵素をコードする。

【0169】

組成物および処置方法
本開示はまた、上皮細胞由来の原発性または転移性がんを有する患者の処置のための治療薬として使用するための抗ＣＬＤＮ６抗体またはそれの抗体断片を含む、例えば、医薬組成物を始めとする組成物を提供する。特定の実施形態では、本明細書に記載の組成物は、腫瘍細胞を死滅させるためにがん患者に投与される。例えば、本明細書に記載の組成物を使用して、ＣＬＤＮ６を発現または過剰発現するがん細胞の存在によって特徴付けられる固形腫瘍の患者を処置することができる。一部の態様では、本開示の組成物を使用して、乳がん、肺がん、卵巣がん、精巣がん、膵臓がん、胃がん、胆嚢がんまたは尿路上皮がんを処置することができる。

【0170】

一部の態様では、がんの処置は、組合せ戦略が特に望ましい分野である、なぜなら、２つ、３つ、４つ、またはさらに多い制がん薬／療法の組合せ作用によって、しばしば、単剤療法アプローチの影響よりもかなり強い相乗効果が生みだされるからである。本明細書で提供される薬剤および組成物（例えば、医薬組成物）は、単独で、または手術、放射線照射、化学療法および／または骨髄移植（自家、同系、同種または非血縁）などの従来の治療レジメンとの組合せで使用することができる。薬剤および組成物はまた、抗腫瘍剤、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞傷害剤、免疫チェックポイント阻害剤、共刺激分子、キナーゼ阻害剤、血管新生阻害剤、小分子標的治療薬およびマルチエピトープ戦略のうちの１つまたは複数との組合せで使用してもよい。したがって、別の実施形態では、がん処置は、種々の他の薬物と効果的に組み合わせることができる。

【0171】

一処置方法では、抗ＣＬＤＮ６抗体を含む医薬組成物は、抗ＣＬＤＮ６抗体または抗体断片にコンジュゲートしているかまたはコンジュゲートしていないかいずれかで、治療剤または毒剤をさらに含んでもよい。特定の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体を使用して、ＣＬＤＮ６を発現および／または過剰発現する標的腫瘍に、細胞傷害性ペイロードを含むＡＤＣを送り込む。代替の実施形態では、抗ＣＬＤＮ６抗体を使用して、ＣＬＤＮ６およびＣＬＤＮ９を発現および／または過剰発現する標的腫瘍に、細胞傷害性ペイロードを含むＡＤＣを送り込む。

【0172】

本開示のＣＬＤＮ６抗体は、単独で、またはがんを処置するのに有用である他の組成物との組合せでのいずれかで投与することができる。一実施形態では、本開示の抗体は、単独で、またはがんを処置するのに有用な他の抗体を始めとする他の免疫療法との組合せでのいずれかで投与することができる。例えば、一実施形態では、他の免疫療法とは、ヒトプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ－１）、ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－Ｌ２、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、ＮＫＧ２Ａ、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＣＴＬＡ－４、ＧＩＴＲ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ１３７、ＴＩＧＩＴならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される免疫チェックポイント分子に対する抗体である。代替の実施形態では、第２の免疫療法は、腫瘍特異抗原（ＴＳＡ）または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対する抗体である。各組合せは、本開示の別々の実施形態を表す。

【0173】

本明細書で論議の治療剤の組合せは、二重特異性もしくは多重特異性結合剤もしくは融合タンパク質の成分として、または医薬的に許容される担体に含まれる単一組成物として同時に投与することができる。あるいは、療法薬の組合せは、医薬的に許容される担体に含まれる各薬剤を有する別々の組成物として同時に投与してもよい。別の実施形態では、治療剤の組合せを順次に投与する場合もある。

【0174】

医薬組成物は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th Edition, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1995に開示のものなどの従来の技法に従って、医薬的に許容される担体または希釈剤、ならびにその他の任意の既知のアジュバントおよび賦形剤とともに製剤化することができる。一部の態様では、医薬組成物は、がんを処置するのに対象に投与される。

【0175】

本明細書で使用される場合、「医薬的に許容される担体」には、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等が含まれる。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮の各投与（例えば、注射または注入による）に適している。投与経路に応じて、活性化合物、すなわち抗体、二重特異性分子および多重特異性分子を、物質でコーティングして、化合物を不活性化するおそれのある酸およびその他の自然条件の作用から当該化合物を保護することができる。

【0176】

通常では、注射による投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝剤の溶液である。必要であれば、医薬はまた、可溶化剤、および注射部位の疼痛を緩和するためのリグノカインなどの局所麻酔薬を含んでいてもよい。一般に、成分は、別々に供給されるか、または単位剤形で一緒に混合されて、例えば、活性薬剤の量を表示するアンプルまたはサシェットなどの密封容器内の、凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給される。医薬は、輸注によって投与する場合、無菌の医薬品等級の水または生理食塩水を含有する点滴瓶を用いて投薬することができる。医薬は、注射によって投与する場合、成分を投与前に混合することができるように、無菌注射用水または生理食塩水のアンプルを供給することができる。

【0177】

本開示の組成物は、当技術分野で知られている様々な方法によって投与することができる。当業者であれば理解されるように、投与の経路および／または様式は、所望の結果に応じて異なる。活性化合物は、インプラント、経皮パッチおよびマイクロカプセル化による送達系を含めて、制御放出製剤などの、急速な放出に対して化合物を保護することになる担体とともに調製することができる。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーを使用することができる。かかる製剤を調製する方法は一般に当業者に知られている。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978を参照されたい。

【0178】

代替の実施形態では、従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、本明細書に記載の抗体またはそれの断片をコードする核酸を哺乳動物細胞または標的組織中に導入することができる。かかる方法を使用して、抗体をコードする核酸をｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞に投与することができる。一部の実施形態では、抗体またはそれの断片をコードする核酸を、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子治療用途のために投与する。他の実施形態では、遺伝子送達技法を使用して、細胞ベースのモデルまたは動物モデルにおいて抗体の活性について研究する。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソーム性のゲノムまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡウイルスおよびＲＮＡウイルスが含まれる。かかる方法は当技術分野でよく知られている。

【0179】

本開示の改変されたポリペプチドをコードする核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、ネイキッドＤＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤強化取込みが含まれる。リポフェクション法およびリポフェクション試薬は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質には、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際公開第９１／１７４２４号パンフレット、国際公開第９１／１６０２４号パンフレットのものが含まれる。細胞（ｅｘ ｖｉｖｏ投与）または標的組織（ｉｎ ｖｉｖｏ投与）に送達することができる。免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含めて、脂質：核酸複合体の調製は、当業者によく知られている。

【0180】

本明細書に記載の抗体をコードする核酸の送達用のＲＮＡウイルスベースまたはＤＮＡウイルスベースのシステムを使用すると、ウイルスを体内の特定の細胞に標的化するとともにウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に発展した方法の利点が生かされる。ウイルスベクターを患者に直接投与することができる（ｉｎ ｖｉｖｏ）、またはそれらを使用してｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を処理することができ、そして改変細胞を患者に投与する（ｅｘ ｖｉｖｏ）。本開示のポリペプチドの送達向けの従来のウイルスベースのシステムとして、遺伝子導入用のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスの各ベクターを挙げることができる。ウイルスベクターは現在、標的細胞および組織における遺伝子導入の最も効率的かつ汎用的な方法である。宿主ゲノムにおける統合が、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法を用いて可能であり、多くの場合、挿入された導入遺伝子の長期的発現をもたらす。加えて、高度の形質導入効率が、様々な多くの細胞型および標的組織において観察されている。

【0181】

医薬組成物中の有効成分の投薬量レベルは、対象にとって毒性がなく、特定の対象、組成物および投与様式に関して所望の治療反応を達成するのに効果的である、有効成分の量が得られるように、変えることができる。選択される投薬量レベルは、採用する本開示の特定の組成物の活性、投与の経路、投与の時間、採用する特定の化合物の排泄速度、処置の期間、採用する特定の組成物との組合せで使用される他の薬物、化合物および／または物質、処置される患者の年齢、性別、体重、状態、全体的健康、および以前の病歴等の医学分野でよく知られている要因を含めて様々な薬物動態の要因に左右されるであろう。

【0182】

本明細書に記載の医薬組成物は、有効量で投与することができる。「有効量」とは、単独で、もしくはさらなる用量とともに所望の反応または所望の効果を達成する量を指す。特定の疾患のまたは特定の状態の処置の場合、所望の反応は好ましくは、疾患の経過の阻害に関連する。このことは、疾患の進行を遅延させること、および特に、疾患の進行を中断または好転させることを含む。

【0183】

本開示の広範な範囲は、以下の例を参照して最もよく理解されるが、本例は本開示を特定の実施形態に限定することを意図するものではない。本明細書に記載される特定の実施形態は、例としてのみ提供されるものであり、本開示は、添付の特許請求の範囲の条件によって、かかる特許請求の範囲が権利を有する均等物の全範囲を含めて、制限されるものである。

【実施例】

【0184】

一般方法
免疫沈降、クロマトグラフィー、および電気泳動を始めとするタンパク質精製の方法が記載されている。例えば、Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York.を参照されたい。化学分析、化学修飾、翻訳後修飾、融合タンパク質の生成、およびタンパク質のグリコシル化が記載されている。例えば、Coligan et al. (2000) Current Protocols in Protein Science, Vol. 2, John Wiley and Sons, Inc., New York；Ausubel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 3, John Wiley and Sons, Inc., NY, N.Y., pp. 16.0.5-16.22.17；Sigma-Aldrich, Co. (2001) Products for Life Science Research, St. Louis, Mo.; pp. 45-89；Amersham Pharmacia Biotech (2001) BioDirectory, Piscataway, N.J., pp. 384-391を参照されたい。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の産生、精製、および断片化が記載されている。Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 1, John Wiley and Sons, Inc., New York；Harlow and Lane (1999) Using Antibodies, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Harlow and Lane、上掲。

【0185】

抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体を含有するハイブリドーマまたは細胞培養物の上清を、ＨｉＴｒａｐプロテインＧカラム（ＧＥ、カタログ番号１７０４０４０１）によって、製造業者の手順に従って精製した。簡単に説明すると、上清を５ＣＶのＤＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号１４１９０－１３６）によって平衡化し、シリンジ／注入ポンプ（Ｌｅｇａｔｏ ２００、ＫＤＳ）を介して、周囲温度および３分間の滞留時間でロードした。カラムを５ＣＶのＤＰＢＳで洗浄し、４ＣＶのｐＨ２．８溶出緩衝剤（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号ＰＩ２１００４）によって溶出を行った。溶出を分画し、画分を１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ、ｐＨ８．５（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号５０－８４３－２７０）で中和し、Ａ２８０（ＤｒｏｐＳｅｎｓｅ９６、Ｔｒｉｎｅａｎ）によってアッセイした。ピーク画分をプールし、緩衝剤をＤＰＢＳに交換した。遠心フィルター（ＥＭＤ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＵＦＣ８０３０２４）を、４，０００×ｇで２分間、ＤＰＢＳ中で平衡化した。精製した試料をロードし、ＤＰＢＳを添加し、試料を４，０００×ｇ、５～１０分間回転で、総ＤＰＢＳ体積が≧６ＤＶになるまで回転させた。最終プールをＡ２８０によって分析した。

【0186】

分子生物学の標準方法が記載されている。例えば、Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Sambrook and Russell (2001) Molecular Cloning, 3rd ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.；Wu (1993) Recombinant DNA, Vol. 217, Academic Press, San Diego, Calif.を参照されたい。標準方法は、Ausbel et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Vols. 1-4, John Wiley and Sons, Inc. New York, N.Y.にもみられ、これには、細菌細胞におけるクローニングおよびＤＮＡ突然変異誘発（Ｖｏｌ．１）、哺乳動物細胞および酵母におけるクローニング（Ｖｏｌ．２）、複合糖質およびタンパク質発現（Ｖｏｌ．３）、ならびにバイオインフォマティクス（Ｖｏｌ．４）が記載されている。

【0187】

エレクトロポレーションまたは脂質ベースのトランスフェクションを使用してヒト（Homo sapiens）Ｃｌａｕｄｉｎタンパク質（表３の参照タンパク質配列）を発現するｐｃＤＮＡ３．１ベースのプラスミドを、選択された宿主細胞（すなわち、ＣＨＯ－Ｋ１またはＨＥＫ２９３）にトランスフェクトすることによって、ヒトＣｌａｕｄｉｎ－６、Ｃｌａｕｄｉｎ－９、Ｃｌａｕｄｉｎ－３、またはＣｌａｕｄｉｎ－４を発現する安定な細胞株を生成した。ジェネティシンまたはピューロマイシンを使用して、統合された細胞を選択した。抗生物質選択の７～１０日後、標識抗体を使用したＦＡＣＳまたは段階希釈によって、安定したクローンを単離した。増殖後、フローサイトメトリーにより安定したクローンをＣｌａｕｄｉｎタンパク質発現についてさらに確認した。マウスおよびカニクイザルＣｌａｕｄｉｎ－６（表３の参照配列）は、それぞれ脂質ベースのトランスフェクションを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性に発現させた。

【0188】

ＮＥＣ８／ＣＬＤＮ６ノックアウト細胞株は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムを使用して作成した。簡単に説明すると、ＣＬＤＮ６ Ｅｘｏｎ２を標的化するｓｇＲＮＡをリボヌクレオタンパク質複合体として使用して、エレクトロポレーションによってＮＥＣ８細胞に
トランスフェクトした。ノックアウト細胞プールをソーターによって得て、ＮＧＳによって確かめた。ＫＯ細胞プールは、フローサイトメトリーによってさらに確かめた。

【0189】

【表3】

【0190】

ハイブリドーマクローンについて重鎖および軽鎖の可変領域の配列を下記のように決定した。全ＲＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ、ＭＤ、ＵＳＡ）製のＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔを使用して、１～２×１０^６個のハイブリドーマ細胞から抽出した。ＣＤＮＡは、Ｔａｋａｒａ（Ｍｏｕｎｔａｉｎｖｉｅｗ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＳＭＡＲＴｅｒ ＲＡＣＥ ５’／３’Ｋｉｔを使用して５’ＲＡＣＥ反応を実行することによって生成した。ＰＣＲを、ＮＥＢ（Ｉｐｓｗｉｔｃｈ、ＭＡ、ＵＳＡ）製のＱ５ Ｈｉｇｈ－Ｆｉｄｅｌｉｔｙ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅを使用して実行して、適当な免疫グロブリンの３’マウス定常領域に対する遺伝子特異的プライマーとの組合せで、Ｔａｋａｒａ Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ Ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘを使用して重鎖および軽鎖からの可変領域を増幅した。重鎖および軽鎖について増幅可変領域を２％アガロースゲル上でランし、適当なバンドを切り取り、次いでＱｉａｇｅｎ製のＭｉｎｉ Ｅｌｕｔｅ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔを使用してゲル精製した。精製ＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）製のＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ ＰＣＲ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｋｉｔを使用してクローニングし、Ｔａｋａｒａ製のＳｔｅｌｌａｒ Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．Ｃｏｌｉ細胞に形質転換し、ＬＢ寒天培地＋５０μｇ／ｍＬカナマイシンプレートに播種した。直接コロニーサンガー配列決定をＧｅｎｅＷｉｚ（Ｓｏｕｔｈ Ｐｌａｉｎｆｉｅｌｄ、ＮＪ、ＵＳＡ）によって実行した。生成するヌクレオチド配列を、ＩＭＧＴ Ｖ－ＱＵＥＳＴを使用して分析して、生産的再編成を特定し、翻訳されたタンパク質配列を分析した。ＣＤＲ決定は、Ｋａｂａｔナンバリングに基づいた。

【0191】

選択されたＶＨ鎖またはＶＬ鎖をＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ１（Ｕｎｉｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）またはヒトカッパ軽鎖（ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１８３４）由来の定常領域を内部に有するｐｃＤＮＡ３．４ベースの発現ベクターにクローニングした。プロバイダーのＥｘｐｉ２９３発現システムプロトコルに従って、対になった重鎖－および軽鎖－発現プラスミドをＥｘｐｉ２９３細胞（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にトランスフェクトした。トランスフェクションの５日後に、遠心分離により培養上清を回収した。組換え抗体を、プロテインＡカラムおよびＰＢＳ ｐＨ７．２に交換した緩衝剤を使用する１ステップの親和性精製によって精製した。

【0192】

蛍光活性化細胞ソーティング検出システム（ＦＡＣＳ（登録商標））を含めて、フローサイトメトリーの方法が利用可能である。例えば、Owens et al. (1994) Flow Cytometry Principles for Clinical Laboratory Practice, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.；Givan (2001) Flow Cytometry, 2nd ed.; Wiley-Liss, Hoboken, N.J.；Shapiro (2003) Practical Flow Cytometry, John Wiley and Sons, Hoboken, N.J.を参照されたい。例えば、診断試薬として使用するための、核酸プライマーおよびプローブ、ポリペプチド、ならびに抗体を含めて、核酸を修飾するのに適切な蛍光試薬が、利用可能である。Molecular Probes (2003) Catalogue, Molecular Probes, Inc., Eugene, Oreg.；Sigma-Aldrich (2003) Catalogue, St. Louis, Mo.。
リガンド／受容体相互作用を特徴付けるための標準技法が利用可能である。例えば、Coligan et al. (2001) Current Protocols in Immunology, Vol. 4, John Wiley, Inc., New Yorkを参照されたい。特定の作用機構を備える抗体の特性評価に適当な抗体機能特性評価の標準方法も、当業者にはよく知られている。

【0193】

抗ＣＬＤＮ６抗体（６４Ａ）をベースとする社内製抗ＣＬＤＮ６抗体を、本明細書では「ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１」（ＰＣ１）と呼ばれるが、国際公開第２０１２／１５６０１８号パンフレットで公開された公共で利用可能な情報に基づいて調製した（ＶＨ、配列番号３６；およびＶＬ、配列番号３５）。ＰＣ１抗体を使用して、実施例で使用されるトランスフェクト細胞および腫瘍細胞株によるＣｌａｕｄｉｎ－６発現を確認し、本明細書で開示の抗ＣＬＤＮ６特異的抗体を評価しかつ特徴付けるために使用される結合アッセイおよび機能アッセイを確立した。第２の社内製ＣＬＤＮ６／９反応性抗体（ｈｓＣ２７．２２）を、本明細書で「ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２」（ＰＣ２）と呼ばれるが、国際公開第２０１５／０６９７９４号パンフレットで公開された公共で利用可能な情報に基づいて調製した（ＶＨ、配列番号６７；およびＶＬ、配列番号６５）。

【0194】

例えば、抗原性断片、リーダー配列、タンパク質折り畳み、機能的ドメイン、ＣＤＲアノテーション、グリコシル化部位、および配列アラインメントを決定するためのソフトウェアパッケージおよびデータベースが利用可能である。

【0195】

[実施例１]
抗ＣＬＤＮ－６抗体の生成
ヒト抗体ＶＨおよびＶＬ遺伝子を発現する、ヒトＩｇＧ トランスジェニックマウス、Ｔｒｉａｎｎｉマウスを免疫することによって、完全ヒト抗ヒトＣＬＤＮ６抗体を生成した（例えば、国際公開第２０１３／０６３３９１号パンフレット、ＴＲＩＡＮＮＩ（登録商標）マウス）。

【0196】

免疫：上記のＴＲＩＡＮＮＩマウスを、ヒトＣｌａｕｄｉｎ－６遺伝子を含有するＤＮＡおよびヒトＣｌａｕｄｉｎ－６遺伝子を安定にトランスフェクトしたＣＨＯ細胞を含む免疫原の注射によって免疫した。ＴＲＩＡＮＮＩマウスは、尾静脈注射によってＤＮＡで免疫した。ヒトＣｌａｕｄｉｎ－６をトランスフェクトしたＣＨＯ細胞は、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下（ＳＣ）注射、尾根部注射またはＦｏｏｔｐａｄ注射した。

【0197】

免疫応答を、後眼窩採血によってモニタリングした。血漿をフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）またはイメージング（下記のように）によってスクリーニングした。十分な抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６力価を備えるマウスを融合に使用した。マウスを腹腔内、尾根部または静脈内に免疫原で追加免疫し、その後、屠殺し、脾臓およびリンパ節を取り出した。

【0198】

抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体を産生するマウスの選択：Ｃｌａｕｄｉｎ－６に結合する抗体を産生するマウスを選択するために、免疫マウスからの血清を、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を発現しない対照細胞（ＣＨＯ細胞）ではなく、Ｃｌａｕｄｉｎ－６タンパク質を発現する細胞（Ｃｌａｕｄｉｎ－６遺伝子をトランスフェクトしたＣＨＯ）への結合について、ＦＡＣＳまたはイメージングによってスクリーニングした。

【0199】

ＦＡＣＳの場合、簡単に説明すると、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ細胞または親ＣＨＯ細胞を、免疫マウスからの血清の希釈液とともに４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。Ａｌｅｘａ ６４７標識ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ－２１２３５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0200】

加えて、マウス血清をイメージングによって試験した。簡単に説明すると、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ細胞を、免疫マウスからの血清の希釈液とともにインキュベートした。細胞を洗浄し、パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、二次Ａｌｅｘａ４８８ヤギ抗マウス抗体およびＨｏｅｃｈｓｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、特異的抗体結合を検出した。プレートをスキャンし、イメージングマシン（Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５、Ｂｉｏｔｅｋ）で解析した。

【0201】

ＣＬＤＮ６に対する抗体を産生するハイブリドーマの生成：本開示のヒト抗体を産生するハイブリドーマを生成するために、脾細胞およびリンパ節細胞を、免疫マウスから単離し、マウス骨髄腫細胞株などの適当な不死化細胞株に融合した。生成するハイブリドーマを、抗原特異的抗体の産生についてスクリーニングした。例えば、免疫マウスからの脾細胞、リンパ節細胞の単細胞懸濁液を、電気融合によって等数のＳｐ２／０マウスＩｇＧ非分泌性骨髄腫細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５８１）に融合した。細胞を平底９６ウェル組織培養プレートに播種し、これに続いて選択培地（ＨＡＴ培地）で約１週間インキュベーションし、次いでハイブリドーマ培養培地に切り替えた。細胞播種の概１０～１４日後に、個々のウェルからの上清を、上記のようにイメージングまたはＦＡＣＳによってスクリーニングした。抗体分泌性ハイブリドーマを２４ウェルプレートに移し、再びスクリーニングし、抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６がなおも陽性である場合、陽性ハイブリドーマを、単一細胞ソーターを使用するソーティングによって、サブクローニングした。サブクローンを、上記のようにイメージングまたはＦＡＣＳによって再びスクリーニングした。次いで、安定したサブクローンをｉｎ ｖｉｔｒｏで培養して、精製および特性評価のための少量の抗体を生成した。

【0202】

［実施例２］
抗ＣＬＤＮ６抗体の結合特異性
本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２の結合特異性を、Ｃｌａｕｄｉｎ－６トランスフェクト細胞株、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、商品番号Ｕ３２８８ＤＬ１８０＿３）および親ＣＨＯ細胞（ＣＨＯ－Ｋ１、ＡＴＣＣ、ＣＣＬ－６１）を使用して、ＦＡＣＳによって評価した。簡単に説明すると、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、対（ｖｅｒｓｅ）、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞を、抗ＣＬＤＮ－６抗体と、４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。Ａｌｅｘａ ６４７標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ－２１４４５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0203】

図２Ａおよび図２Ｂに、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２が、５μｇ／ｍｌで染色するアイソタイプ対照抗体と比較して、それぞれ２８倍および２４倍のＭＦＩで、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、商品番号Ｕ３２８８ＤＬ１８０＿３）に結合したことを示す。対照抗体ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、アイソタイプ対照抗体と比較して、２５倍のＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１に結合した。すべての抗体は、親ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しなかった（図２Ａおよび２Ｂ）。

【0204】

本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体の結合特異性は、ＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－９への結合についてさらに評価した。簡単に説明すると、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、商品番号Ｕ３２８８ＤＬ１８０＿４）を、組換えＣｌａｕｄｉｎ－６抗体と４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ－２１４４５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0205】

図３Ａおよび３Ｂに、ＦＡＣＳ（５μｇ／ｍｌの濃度の抗体）による、陽性対照ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２とともに、本開示のＣｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２の、ＨＥＫ２９３親細胞と比較したＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞への結合活性を示した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１は、アイソタイプ対照と比較して１６倍のＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に結合し；ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、アイソタイプ対照と比較して５３倍のＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に結合した。対照抗体ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、それぞれアイソタイプ対照抗体よりも１５倍および３２倍高いＭＦＩでヒトＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に結合した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１の結合パターンはＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１と類似し、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２の結合パターンはＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２と類似した。すべての試験抗体は、親ＨＥＫ２９３細胞に結合しなかった（図３Ａおよび３Ｂ）。先行研究では、Ｃｌａｕｄｉｎ－６のアミノ酸配列が、細胞外（ＥＣＬ）ループ１（ＥＣＬ－１）およびループ２（ＥＣＬ－２）でＣｌａｕｄｉｎ－９、３、および４と非常に相同であることが示された（ヒトＣＬＤＮ６、９、３および４のＥＣＬ１およびＥＣ２ループのアミノ酸配列間の％同一性をまとめた表４および５を参照）（Biochemical et Biophysica Acta 1778 (2008) 631-645）。したがって、これらのＣｌａｕｄｉｎファミリーメンバーを発現する細胞に結合する抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体の能力を評価することが重要である。

【0206】

【表4】

【0207】

【表5】

【0208】

本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体の結合特性をさらに評価するため、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２（ハイブリドーマの上清から精製）ならびに２つの社内製陽性対照、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２を、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１およびＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合について試験した。結合は、Ｃｌａｕｄｉｎ－３および４陽性対照抗体として天然のエピトープを認識する抗Ｃｌａｕｄｉｎ３抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ４６２０）および抗Ｃｌａｕｄｉｎ－４抗体（Ｒ＆Ｄ、カタログ番号ＭＡＢ４２１９）を使用して、上記のようにＦＡＣＳによって評価した。

【0209】

図４Ａおよび４Ｂに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１が、アイソタイプ対照よりも１２倍高いＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞に結合したことを示す。比較して、抗ｃｌａｕｄｉｎ３対照抗体ＭＡＢ４６２０は、５μｇ／ｍｌの濃度でアイソタイプ対照よりも６１倍高いＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合した。この観察は、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１がＣＬＤＮ３に選択的であると特徴付けられ得ることを示すが、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１結合は、ヒトＣＬＤＮ３を内因性発現するＭＣＦ７細胞を使用する追跡ＦＡＣＳ解析で観察されなかった。この相違は、ヒト細胞による内因性発現と比較して、ＣＨＯ－Ｋ１トランスフェクト細胞によるＣＬＤＮ６発現における構造的な違いにより得る。他の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、Ｃｌａｕｄｉｎ－３トランスフェクトＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しなかった。２つの陽性対照抗体、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２もまた、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しなかった。

【0210】

図５Ａおよび５Ｂに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２がＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しないことを示す。陽性対照抗Ｃｌａｕｄｉｎ－４抗体ＭＡＢ４２１９は、アイソタイプ対照よりも３３倍高いＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１に結合した。ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１は、Ｃｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しなかったが、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、アイソタイプ対照よりも４．５倍高いＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合した。

【0211】

先行研究では、ＮＥＣ８（精巣胚細胞腫瘍細胞株）が内因性ヒトＣｌａｕｄｉｎ－６を高発現し、ＯＶ９０（卵巣がん細胞株）が低レベルのＣｌａｕｄｉｎ－６を発現することが確立された。本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２が、ＮＥＣ８細胞およびＯＶ９０細胞上に発現されたＣＬＤＮ６に結合できるかどうか決定するため、これら２つの抗体を、２つの陽性対照抗体、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２とともに、ＦＡＣＳによって評価した。簡単に説明すると、ＮＥＣ８細胞およびＯＶ９０細胞を、Ｃｌａｕｄｉｎ－６組換え抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２と、４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ２１４４５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0212】

図６Ａおよび６Ｂからの結果は、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２が、それぞれアイソタイプ対照と比較して２７倍および２５倍高いＭＦＩでＮＥＣ８細胞に結合できることを示した。陽性対照抗体ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、アイソタイプ対照と比較して、それぞれ１９倍および２０倍の結合活性でＮＥＣ８細胞に結合した。

【0213】

図７Ａおよび７Ｂに、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２が、それぞれアイソタイプ対照抗体よりも１９倍および１７倍高いＭＦＩでＯＶ９０に結合することを示した。陽性対照抗体、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、それぞれアイソタイプ対照よりも２０倍および１５倍高いＭＦＩでＯＶ９０細胞に結合した。

【0214】

本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２（ハイブリドーマから精製）、２つの陽性対照抗体、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２は、陽性対照抗体として抗Ｃｌａｕｄｉｎ－３抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４６２０）および抗Ｃｌａｕｄｉｎ－４抗体（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４２１９）を使用するＦＡＣＳによって、ＭＣＦ７細胞株（Ｃｌａｕｄｉｎ－３および４を発現することが知られている内因性細胞株、国際公開第２０１９／０５６０２３号パンフレット）への結合についても評価した。

【0215】

図８Ａおよび８Ｂに、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２はＭＣＦ７細胞に結合しないが、抗Ｃｌａｕｄｉｎ－３抗体（ＭＡＢ４６２０）および抗Ｃｌａｕｄｉｎ－４抗体（ＭＡＢ４２１９）は、それぞれアイソタイプ対照よりも２０倍および１５倍高いＭＦＩでＣｌａｕｄｉｎ－３およびＣｌａｕｄｉｎ－４に結合したことを示した。対照抗体ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２もＭＣＦ７細胞に結合しなかった。

【0216】

３つの腫瘍細胞株、ＮＥＣ８、ＯＶ９０およびＭＣＦ７を、それらのＣｌａｕｄｉｎ－９の発現レベルについて評価するため、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞株とともに、これら３つの細胞株を、上記したＦＡＣＳプロトコルにより、陽性対照として細胞内Ｃ末端エピトープ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＰＡ５－６７４３１）に特異的な抗Ｃｌａｕｄｉｎ－９ポリクローナル抗体を使用するＦＡＣＳによって試験した。

【0217】

図９に、抗Ｃｌａｕｄｉｎ－９陽性対照抗体はＮＥＣ８およびＯＶ９０細胞株に結合せず、アイソタイプ対照抗体と比較してＭＣＦ７細胞株において非常に低い結合シグナルを有したが、抗Ｃｌａｕｄｉｎ－９抗体は、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に強く結合した（アイソタイプ対照と比較して１３倍高いＭＦＩ）ことを示した。これらの結果は、ヒト細胞株、ＮＥＣ８、ＯＶ９０およびＭＣＦ７がＣｌａｕｄｉｎ－９を発現しないことを示す。

【0218】

全体として、上記のＦＡＣＳ結合実験の結果は、本開示の抗体ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１が、アイソタイプ対照と比較してＣＬＤＮ６に強く結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ－９に弱く結合することを示す。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１は、検出可能だが弱い結合シグナル（陽性対照の２０％）でＣＬＤＮ３に結合するが、ＣＬＤＮ３陽性対照抗体は、アイソタイプ対照と比較してずっと高い結合シグナル（６１倍）を有した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１は、ＣＬＤＮ４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞およびＭＣＦ７細胞（ＣＬＤＮ３およびＣＬＤＮ４を発現する）に結合しない。これらの結果は、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１がＣｌａｕｄｉｎ－６に選択的に結合することを示す。

【0219】

データは、抗ＣＬＤＮ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２がＣｌａｕｄｉｎ－６および９に強く結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ－３またはＣｌａｕｄｉｎ－４に結合しないことをさらに示す。

【0220】

抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２ならびに関連陽性対照（ＰＣ）抗体のＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－６内因性発現細胞株ＮＥＣ８およびＯＶ９０、ならびにＣｌａｕｄｉｎ－３および４内因性発現細胞株ＭＣＦ７への結合特異性は、以下の表６に要約する。結合選択性は、抗ＣＬＤＮ抗体のＭＦＩとアイソタイプ対照抗体のＭＦＩを比較することによって決定した。注：［－］は、アイソタイプ対照と比較して結合が観察されないことを示す；ｎ／ｄはデータがないことを示す；およびアスタリスク（^＊）によってマークした挿入は、図面内に示していないデータを提供する。

【0221】

【表6】

【0222】

ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２を、ＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株へのそれらの結合親和性について評価した。簡単に説明すると、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２を、ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２とともに、連続希釈し、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３、およびＣｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯへの結合について、上記のようにＦＡＣＳにより試験した。

【0223】

図１０Ａ、１０Ｂおよび１０Ｃに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２が、用量依存性の様式でこれらの試験細胞株に結合したことを示す。ＥＣ_５０値は、以下の表７に要約した。

【0224】

ＦＡＣＳ実験からの結果は、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１が高親和性でＣｌａｕｄｉｎ－６に結合することを示す（ＥＣ_５０は、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞では０．５５ｎＭ、およびＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ細胞では０．９７ｎＭ）。それは、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞への結合と比較して、低親和性（６．７２ｎＭ）でＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に結合した。これらの試験細胞株におけるＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１結合パターンは、陽性対照ＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１と類似している。
抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、類似の親和性、それぞれＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞では、１．００ｎＭのＥＣ_５０で、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞では１．４９ｎＭで、Ｃｌａｕｄｉｎ－６およびＣｌａｕｄｉｎ－９に結合した。それは、低ｎＭのＥＣ５０（６．８８ｎＭ）でＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ細胞に結合した。これらの細胞株における結合パターンおよび親和性は、陽性対照ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２と類似している。

【0225】

【表7】

【0226】

［実施例３］
Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現する腫瘍細胞における抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
様々なヒトＣｌａｕｄｉｎ－６陽性細胞に結合した抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２のＡＤＣＣ活性を、生物発光アッセイによって測定した。簡単に説明すると、抗ＣＬＤＮ６抗体をＲＰＭＩ＋４％低ＩｇＧ ＦＢＳを含有するアッセイ緩衝剤で連続希釈し、個々の標的細胞株とＡＤＣＣエフェクター細胞の混合物に添加した。ＡＤＣＣエフェクター細胞は、結合したＣｌａｕｄｉｎ－６抗体のＦｃ部分を認識すると活性化されるＣＤ１６Ａを発現するＪｕｒｋａｔ細胞である。エフェクター細胞の活性化は、製造元の取扱説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ生物発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）を使用して検出した。

【0227】

ＡＤＣＣ活性を、内因性レベルのＣｌａｕｄｉｎ－６発現、および他のＣｌａｕｄｉｎファミリーメンバー、例えばＣｌａｕｄｉｎ３、４および９を欠損する、ＮＥＣ８細胞株で測定した。

【0228】

図１１Ａおよび表８に示すように、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は両方ともＮＥＣ８細胞のＡＤＣＣ活性を増強した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、それぞれ０．６４ｎＭおよび２．７７ｎＭのＥＣ_５０値を呈した。

【0229】

【表8】

【0230】

上の例に記載したように、Ｃｌａｕｄｉｎ－６は、ＯＶ９０細胞において低発現である。図１１Ｂおよび表９に示すように、ＡＤＣＣ活性は、ＯＶ９０細胞におけるＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２についても観察した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、それぞれ０．３ｎＭおよび０．７５ｎＭのＥＣ_５０レベルを呈し、それはＮＲ．Ｎ６．ＰＣ１およびＮＲ．Ｎ６．ＰＣ２のＥＣ_５０値、０．２８ｎＭおよび０．５２ｎＭに匹敵する。

【0231】

【表9】

【0232】

［実施例４］
抗体介在性エンドサイトーシス（ＡＤＣ）
Ｃｌａｕｄｉｎ－６陽性細胞に結合した本開示のＣｌａｕｄｉｎ－６特異的抗体のエンドサイトーシスを、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＭＭＡＦ抗体と一緒の標的結合抗体の共内部移行を使用する細胞傷害性ベースのエンドサイトーシスアッセイによって測定した。

【0233】

ＮＥＣ８、ＯＶ９０、およびＨＥＫ－Ｃｌａｕｄｉｎ－６細胞を増殖培地（それぞれ、Ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ ０．５μｇ／ｍＬを含む、ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ、Ｍｅｄｉａ１９９（１：１）を有するＭＣＤＢ＋１５％ＦＢＳ、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞を回収し、それぞれの増殖培地に再懸濁し、アッセイプレートに播種した。細胞を３７℃で一晩インキュベートした。抗ＣＮＤＬ６抗体を、ＭＭＡＦコンジュゲートＦａｂ抗ｈＦｃ断片（Ｍｏｒａｄｅｃ、カタログ番号ＡＨ－２０２ＡＦ－５０）とともにプレインキュベートし、次いで、細胞プレートに添加し、さらなる９６時間インキュベートした。細胞力価Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を添加して、各ウェルの細胞生存率を評価した。Ｎｅｏ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してシグナルを定量化した。

【0234】

表１０および図１２Ａで示されるように、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２ならびに社内製陽性対照抗体は、０．１～０．２ｎＭの範囲のＥＣ_５０値で、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞においてエンドサイトーシス介在細胞傷害性が誘発された。

【0235】

【表10】

【0236】

ＯＶ９０は、ＮＥＣ８細胞より低発現レベルでも、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現する細胞株である。表１１および図１２Ｂに示すように、エンドサイトーシス介在細胞傷害性はすべての試験抗体にわたり類似している。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２は、それぞれ１．０８および２．３２ｎＭのＥＣ_５０値を呈する。

【0237】

【表11】

【0238】

組換えによりＣｌａｕｄｉｎ－６を発現するように作成されたＨＥＫ２９３細胞株は、エンドサイトーシス介在細胞傷害性を試験するためにも使用した。図１２Ｃおよび表１２に示すように、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ２ならびに社内製陽性対照抗体はすべて、エンドサイトーシス介在細胞傷害性を方向付ける。ＥＣ_５０値は、それぞれ１．７３～２．１９ｎＭの範囲である。

【0239】

【表12】

【0240】

［実施例５］
抗ＣＬＤＮ６抗体の結合特異性
抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６を、ＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、商品番号Ｕ３２８８ＤＬ１８０＿３）およびＣｌａｕｄｉｎ９－ＨＥＫ２９３細胞（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、商品番号Ｕ３２８８ＤＬ１８０＿４）ならびに陰性ＨＥＫ２９３細胞（ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５７３）への結合について評価した。簡単に説明すると、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３およびＨＥＫ２９３細胞を、Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５組換え抗体、ならびにＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６（ハイブリドーマの上清から精製）と、４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。本明細書で使用する場合、「組換え抗体」という用語は、ヒトＩｇＧ１定常領域を含むように改変された抗体を意味する。組換え抗体（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３～Ａｂ５）は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ２１４４５）を用いて、精製抗体ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をコンジュゲートしたヤギ抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ２１２３５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0241】

図１３Ａ、１３Ｂ、１３Ｃおよび１３Ｄに、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６が、５μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３～５）および１０μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６）で染色するアイソタイプ対照抗体と比較して、それぞれ３１倍、２３倍、２４倍および６０倍のＭＦＩで、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞に結合したことを示す。これらの抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６は、５μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３～５）および１０μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６）で染色するアイソタイプ対照抗体と比較して、それぞれ５倍、２倍、２倍および４７倍のＭＦＩで、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３トランスフェクト細胞に結合した。

【0242】

この結果は、抗ＣＬＤＮ６抗体が、Ｃｌａｕｄｉｎ－９よりもＣｌａｕｄｉｎ－６に優先的に結合することを示す。

【0243】

抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６ならびにＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１が、ＣＬＤＮ６を内因的に発現するＮＥＣ８細胞およびＣＬＤＮ６遺伝子ノックアウトＮＥＣ８（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ）細胞上に結合できるかどうか決定するため、これらの抗体を、アイソタイプ対照抗体とともに、ＦＡＣＳによって評価した。簡単に説明すると、ＮＥＣ８細胞およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ細胞を、Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５（組換え）、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６（ハイブリドーマの上清から精製）およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１（組換え）と、４℃で２時間インキュベートした。細胞を２％ＰＦＡ（Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ、カタログ番号：Ｊ６１８９９）によって４℃で１５分間固定し、次いで洗浄した。組換え抗体（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３～Ａｂ５）には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ６４７をコンジュゲートしたヤギ抗ヒトＩｇＧ二次抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ２１４４５）を用いて、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６（ハイブリドーマの上清から精製）には、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ６４７をコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号：Ａ２１２３５）を用いて、４℃で１時間インキュベーション後、特異的抗体結合を検出した。フローサイトメトリー解析を、フローサイトメトリー機器（Ｉｎｔｅｌｌｉｃｙｔｅ、ＩＱｕｅ ｐｌｕｓ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で実行した。

【0244】

図１４Ａ、１４Ｂ、１４Ｃ、１４Ｄおよび１４Ｅに、本開示の抗ＣＬＤＮ６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１が、それぞれ２０倍、１９倍、２１倍、２３倍および３２倍のＭＦＩで、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞に結合したことを示す。これらは、５μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３～５）または１０μｇ／ｍｌ（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６）で染色するアイソタイプ対照抗体と比較して、ＮＥＣ８ ＣＬＤＮ６遺伝子ノックアウト細胞に結合しなかった。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１は、実施例２で先に報告したのと類似の結合パターンを示した（１４Ｅ）。

【0245】

ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５（組換え抗体）、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６（ハイブリドーマの上清から精製）の結合特性をさらに評価するため、実施例２に記載のように、ＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１およびＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞への結合について試験した。抗Ｃｌａｕｄｉｎ抗体は、天然エピトープ（マウス抗Ｃｌａｕｄｉｎ３ ＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４６２０）、マウス抗Ｃｌａｕｄｉｎ４ ＩｇＧ２ａ（Ｒ＆Ｄ、ＭＡＢ４２１９））を認識した。米国特許出願公開第２０１６／０２２２１２５号明細書の抗体をＣｌａｕｄｉｎ３およびＣｌａｕｄｉｎ４陽性対照として使用して、ＣＨＯ－Ｋ１細胞におけるＣｌａｕｄｉｎ３およびＣｌａｕｄｉｎ４の発現レベルを確かめた。

【0246】

図１５Ａ、１５Ｂ、１５Ｃおよび１５Ｄは、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６が、用量依存性の様式でＣｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合するが、それらはＣｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１およびＣｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞に結合しないことを確立した。図１５Ｅおよび１５Ｆに、陽性対照抗体、ＭＢＡ４６２０（抗Ｃｌａｕｄｉｎ３）およびＭＢＡ４２１９（抗Ｃｌａｕｄｉｎ４）が、それぞれ用量依存性の様式で、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１およびＣｌａｕｄｉｎ４－ＣＨＯ－Ｋ１に結合することを示す。

【0247】

データは、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６が、Ｃｌａｕｄｉｎ－６に強く結合し、Ｃｌａｕｄｉｎ－３もしくはＣｌａｕｄｉｎ－４に結合しないかまたはＣｌａｕｄｉｎ－４への限定された結合活性によって特徴付けられるか（ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６）のいずれかをさらに実証した。

【0248】

表１３は、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６、ならびに関連陽性対照抗体のＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－３－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、Ｃｌａｕｄｉｎ－４－ＣＨＯ－Ｋ１細胞、ＮＥＣ８のＣｌａｕｄｉｎ－６内因性発現細胞株およびＣｌａｕｄｉｎ－６遺伝子ノックアウトのＮＥＣ８細胞への結合プロファイルを要約する。結合選択性は、抗ＣＬＤＮ６抗体のＭＦＩとアイソタイプ対照抗体のＭＦＩを比較することによって決定した。注：［－］は、アイソタイプ対照と比較して結合が観察されないことを示し、^＊はＣＬＤＮ６遺伝子ノックアウト細胞を示す。

【0249】

【表13】

【0250】

抗ＣＬＤＮ６抗体を、ＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－６過剰発現細胞株へのそれらの結合親和性についても評価した。簡単に説明すると、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５（組換え抗体）、ならびにＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６（ハイブリドーマの上清から精製）を、連続希釈し、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－９を過剰発現するＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を過剰発現するＣＨＯ、およびＣｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８への結合について、上記のようにＦＡＣＳにより試験した。

【0251】

図１６Ａおよび１６Ｃに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６は、用量依存性の様式でＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞に結合するが、それらはＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に最小限にのみ結合する（図１６Ｂ）かまたは弱く結合する（１６Ｃ）ことを示す。図１６Ａおよび１６Ｂは、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１の結合活性を要約する。

【0252】

親ＨＥＫ２９３細胞では顕著な結合は検出されなかった（図１６Ｄ）。マウスＩｇＧアイソタイプ対照は、いずれの細胞株にも結合しないＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６を含む（データは示さない）。

【0253】

図１７Ａに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５の、用量依存性の様式での、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞への結合およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞への結合の完全な欠損を確立した（図１７Ｂ）。図１７Ｃに、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６が、ＮＥＣ８細胞に結合し、ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞に結合しないことを示した。

【0254】

これらの結果は、本開示の抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、４、５および６が、Ｃｌａｕｄｉｎ－６に特異的におよび優先的に結合することを示した。

【0255】

これらの抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体のＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ－Ｋ１およびＮＥＣ８に結合するＥＣ_５０値（２回の実験から抽出した）を以下の表１４に示す。注：＃は、ＣＬＤＮ６を内因性発現するヒト細胞株を示す。

【0256】

【表14】

【0257】

データは、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ６が、Ｃｌａｕｄｉｎ－６発現細胞株に、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３では４．１１ｎＭ～１５．６７ｎＭ；Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＣＨＯ細胞では３．０６ｎＭ～４．７９ｎＭ；およびＮＥＣ８細胞では３．２７ｎＭ～８．３４ｎＭの範囲のＥＣ_５０値で結合することを確立した。

【0258】

シークエンスしたＶＨおよびＶＬは、通常、Ｎ結合型グリコシル化部位およびシステイン残基の付加／欠損を含む明らかな責任について調べた。例として、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１（配列番号１）のＶＨは、ＦＲ３（Ｎ末端から数えてＮ７３）にＮ結合型グリコシル化部位を含有する。Ｎ結合型グリコシル化は、相同生殖系列配列によって導かれるＡｓｎからＡｓｐへの突然変異によって除去され、配列番号２３を生じる。

【0259】

ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびアイソタイプ対照抗体とともにＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１バリアントＮ７３Ｄを、上記のようにＦＡＣＳにより、Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３、Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞へのそれらの結合特異性および親和性について評価した。

【0260】

Ｃｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞およびＣｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現するＮＥＣ８細胞に結合する抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１ Ｎ７３ＤおよびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１のＥＣ_５０値は、２回の実験から抽出され、表１５に要約する。

【0261】

【表15】

【0262】

図１８Ａ、１８Ｂおよび１８Ｃに、用量依存性の様式で、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１バリアントＮ７３ＤがＣｌａｕｄｉｎ－６－ＨＥＫ２９３細胞（１８Ａ）およびＮＥＣ８細胞（１８Ｃ）に結合し、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１バリアントＮ７３Ｄが親ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１への類似の結合プロファイルを呈することを示す。それらは、ずっと低い活性でＣｌａｕｄｉｎ－９－ＨＥＫ２９３細胞に結合し（１８Ｂ）、ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞には結合しなかった（１８Ｄ）。

【0263】

［実施例６］
Ｃｌａｕｄｉｎ－６を内因性発現する腫瘍細胞における抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）
ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５ならびにＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１のＡＤＣＣ活性を、生物発光アッセイによって測定した。簡単に説明すると、抗ＣＬＤＮ６抗体をＲＰＭＩ＋４％低ＩｇＧ ＦＢＳを含有するアッセイ緩衝剤で連続希釈し、個々の標的細胞株とＡＤＣＣエフェクター細胞の混合物に添加した。ＡＤＣＣエフェクター細胞は、結合したＣｌａｕｄｉｎ－６抗体のＦｃ部分を認識すると活性化されるＣＤ１６Ａを発現するＪｕｒｋａｔ細胞である。エフェクター細胞の活性化は、製造元の取扱説明書に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ生物発光アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｅ６１３０）を使用して検出した。

【0264】

ＡＤＣＣ活性を、内因性レベルのＣｌａｕｄｉｎ－６発現を有し、および他のＣｌａｕｄｉｎファミリーメンバー、例えばＣｌａｕｄｉｎ３、４および９を欠損する、ＮＥＣ８、ならびにＮＥＣ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ（ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞株）で測定した。

【0265】

図１９Ａおよび表１６に示すように、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５は、それぞれ６．４３ｎＭ、９．８３ｎＭおよび３．７８ｎＭのＥＣ_５０値でＮＥＣ８細胞のＡＤＣＣ活性を誘導した。ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１（陽性対照として含まれる）は、０．６４ｎＭの先のＥＣ５０値と比較して、０．４０ｎＭのＥＣ５０値でＡＤＣＣ活性を一貫して呈した（実施例３、表８）。すべてのＥＣ_５０値は、２回の実験から抽出した。ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ細胞ではＡＤＣＣ活性が検出されなかった（１９Ｂ）。

【0266】

【表16】

【0267】

［実施例７］
抗ＣＬＤＮ６抗体の内部移行
ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５の内部移行は、ＮＥＣ８、またはＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞を使用する免疫蛍光イメージングアッセイによって測定した。細胞を、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０を含有する完全培地中に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。抗体を、まず、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８抗体標識キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ２０１８１）を使用して、蛍光色素と化学的にコンジュゲートさせた。過剰量のコンジュゲートしていない色素は、Ｚｅｂａ（商標）スピン脱塩カラム、４０Ｋ ＭＷＣＯ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、８７７６６）を使用して除去した。次いで細胞を、４℃で４時間、１０μｇ／ｍｌの蛍光標識した抗体とインキュベートした。抗体のプレ結合後、相当するプレートを３７℃で０、４および２４時間インキュベートした後、室温で１５分間、パラホルムアルデヒドで細胞を固定した。固定した細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、室温で１時間、抗Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ４８８抗体（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ａ１１０９４）とインキュベートし、細胞外細胞表面シグナルをクエンチした。内部移行した抗体の蛍光シグナルは、Ｃｙｔａｔｉｏｎ Ｉｍａｇｅｒ（Ｂｉｏｔｅｋ、ＶＴ）を使用して、細胞のイメージングおよび蛍光強度の定量により評価した。

【0268】

図２０Ａおよび２０Ｂに、ＮＥＣ８細胞に内部移行したが、ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ細胞には内部移行しない本開示の抗体を示す。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を、ＮＥＣ８細胞またはＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ ＫＯ細胞のいずれかとインキュベートすると、内部移行シグナルは検出されなかった。この観察は、本開示の抗体の内部移行は、特異的な細胞表面上のＣｌａｕｄｉｎ－６タンパク質への結合によることを示す。

【0269】

［実施例８］
抗ＣＬＤＮ６抗体による抗体介在性エンドサイトーシス
Ｃｌａｕｄｉｎ－６陽性細胞に結合したＮＲ．Ｎ６．Ａｂ１、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ３、ＮＲ．Ｎ６．Ａｂ４およびＮＲ．Ｎ６．Ａｂ５抗体のエンドサイトーシスは、抗ヒトＩｇＧ Ｆｃ－ＭＭＡＦ抗体と一緒に標的結合抗体の共内部移行に基づき、細胞傷害性ベースのエンドサイトーシスアッセイによって測定した。

【0270】

ＮＥＣ８およびＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ－６ノックアウト細胞を、増殖培地（ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ）中で培養した。細胞を回収して増殖培地中に再懸濁し、アッセイプレートに播種した。細胞を、３７℃で一晩インキュベートした。抗Ｃｌａｕｄｉｎ－６抗体を、ＭＭＡＦコンジュゲートＦａｂ抗ｈＦｃ断片（Ｍｏｒａｄｅｃ、カタログ番号ＡＨ－２０２ＡＦ－５０）とともにプレインキュベートし、次いで、細胞プレートに添加し、さらなる７２時間インキュベートした。細胞力価Ｇｌｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）を添加して、各ウェルの細胞生存率を評価した。Ｎｅｏ２プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してシグナルを定量した。

【0271】

図２１Ａおよび表１７に示すように、本開示の抗Ｃｌａｕｄｉｎ６抗体は、０．１４～０．５１ｎＭの範囲のＥＣ_５０値でＮＥＣ８細胞株において抗体介在性エンドサイトーシスを誘導した。ＮＥＣ８ Ｃｌａｕｄｉｎ６ ＫＯ細胞株では、エンドサイトーシス由来細胞傷害性は検出されなかった（図２１Ｂ）。

【0272】

【表17】

【0273】

特に指示のない限り、明細書および特許請求の範囲において使用される成分の量、分子量などの特性、反応条件等を表現するすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されていると理解すべきである。したがって、そうではないと指示のない限り、本明細書および添付の特許請求の範囲において記載する数値パラメータは、本開示によって得ようとする所望の特性に応じて異なってもよい近似値である。少なくとも、均等論の原則を特許請求の範囲に適用することを限定しようとする試みではなく、各数値パラメータは、報告された有効桁の数値を考慮してかつ通常の四捨五入技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。

【0274】

本開示の幅広い範囲を示す数値範囲およびパラメータは近似値であるが、特定の例において記載される数値はできるだけ正確に報告されている。いずれの数値も、しかし、それらのそれぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じるある特定の誤差を本質的に含有する。

【0275】

本開示を説明する文脈で（特に以下の特許請求の範囲の文脈で）使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」という用語、および類似の指示対象は、本明細書に特に指示のない限り、または文脈と明らかに矛盾しない限り、単数形と複数形の両方をカバーすると解釈される。本明細書における値の範囲の列挙は、単に、範囲に入る各個別の値に個々に言及することの省略方法としての役割を果たすことが意図されている。本明細書に特に指示のない限り、個々の値はそれぞれ、本明細書に個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書に記載のすべての方法は、本明細書に特に指示のない限り、またはさもなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、適切な任意の順序で行うことができる。本明細書で提供されるあらゆる例、または例示的な言い回し（例えば「などの（ｓｕｃｈ ａｓ）」）の使用は、単に、本開示をより良く例示することを意図するものであり、特に主張しない限り開示の範囲に限定を課すものではない。本明細書中のいかなる言い回しも、特許請求されていない要素が本発明の実施にとって必須であることを示すものと解釈すべきではない。

【0276】

本明細書に開示された開示の代替要素または実施形態の群分けは、限定であると解釈すべきではない。各群の構成要素は、個々に、または群の他の構成要素もしくは本明細書に見出される他の構成要素との任意の組合せで、言及することができかつ特許請求することができる。ある群の１つまたは複数の構成要素が、便宜上および／または特許性の理由から、群に包含され、または群から削除され得る。なんらかのかかる包含または削除が生じる場合、本明細書は、改変された群を含み、したがって、添付の特許請求の範囲で使用される全マーカッシュ群の書面による明細を満足するものである。

【0277】

本開示のある特定の実施形態が、発明者らが知っている本開示を実施するためのベストモードを含めて、本明細書に記載されている。もちろん、それら記載の実施形態の変形例は、前述の説明を読み解くことで当業者であれば明らかとなるであろう。本発明者らは、当業者であれば必要に応じてかかる変形を採用すると考えており、本開示が本明細書に具体的に記載のもの以外の方法で実行されることを意図している。したがって、本開示は、適用法が許すなら、本明細書に添付の特許請求の範囲に列挙された主題の改変形態および均等物すべてを包含する。さらに、それらの可能なすべての変形における上記の要素の任意の組合せも、本明細書に特に指示のない限り、またはさもなければ文脈と明らかに矛盾しない限り、本開示によって包含される。

【0278】

本明細書に開示の具体的な実施形態は、「からなる」または「から本質的になる」という言い回しを使用して、特許請求の範囲においてさらに限定することができる。出願されたか、補正によって追加されたかにかかわらず、特許請求の範囲において使用される場合、「からなる」という移行句は、特許請求の範囲に規定されてないいかなる要素をも、ステップをもまたは成分をも、排除する。「から本質的になる」という移行句は、請求項の範囲を、特定された材料またはステップ、ならびに基本的かつ新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。そのように特許請求される本開示の実施形態が、本明細書に本質的にまたは明示的に説明されており、本明細書において有効である。

【0279】

本明細書に開示された本開示の実施形態は、本開示の原理の例示であることが理解されよう。採用することができる他の改変は、本開示の範囲内である。したがって、一例であって限定されないが、本開示の代替の構成が本明細書の教示に従って利用することができる。したがって、本開示は、示されかつ記載されたように厳密にそのものに限定されるものではない。

【0280】

本開示を、種々の具体的な材料、手順および例を参照することによって、本明細書で説明し、例示してきたが、本開示は、その目的のために選択された材料および手順の特定の組合せに限定されるものではないと理解される。かかる詳細の多数の変形が、当業者であれば理解されるように、暗に含まれ得る。本明細書および例は、例示的なものに過ぎないと考えられ、本開示の真の範囲および趣旨は、以下の特許請求の範囲によって指示されることが意図される。本願で参照されたすべての参考文献、特許、および特許出願は、これらの全体が参照によって本明細書に組み込まれる。

【図1-1】

【図1-2】

【図1-3】

【図1-4】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10-1】

【図10-2】

【図11】

【図12-1】

【図12-2】

【図13-1】

【図13-2】

【図14-1】

【図14-2】

【図14-3】

【図15-1】

【図15-2】

【図15-3】

【図16-1】

【図16-2】

【図17-1】

【図17-2】

【図18-1】

【図18-2】

【図19】

【図20】

【図21】

【配列表】

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【国際調査報告】