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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-27
(54)【発明の名称】リポソームおよび酵素送達のためのその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 9/127 20060101AFI20240219BHJP
A61K 47/60 20170101ALI20240219BHJP
A61K 47/24 20060101ALI20240219BHJP
A61K 38/06 20060101ALI20240219BHJP
A61K 38/47 20060101ALI20240219BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240219BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240219BHJP
A61K 47/18 20170101ALI20240219BHJP
A61K 47/28 20060101ALI20240219BHJP
A61K 47/26 20060101ALI20240219BHJP
C12N 15/56 20060101ALN20240219BHJP
【ＦＩ】
A61K9/127 ZNA
A61K47/60
A61K47/24
A61K38/06
A61K38/47
A61P3/00
A61P43/00 105
A61P43/00 121
A61K47/18
A61K47/28
A61K47/26
C12N15/56
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546036
(86)(22)【出願日】2022-01-26
(85)【翻訳文提出日】2023-09-21
(86)【国際出願番号】 EP2022051727
(87)【国際公開番号】W WO2022161990
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】21382062.4
(32)【優先日】2021-01-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ＴＲＩＴＯＮ
(71)【出願人】
【識別番号】511000083
【氏名又は名称】コンセホ スペリオール デ インベスティガシオネス シエンティフィカス（セエセイセ）
【氏名又は名称原語表記】ＣＯＮＳＥＪＯ ＳＵＰＥＲＩＯＲ ＤＥ ＩＮＶＥＳＴＩＧＡＣＩＯＮＥＳ ＣＩＥＮＴＩＦＩＣＡＳ（ＣＳＩＣ）
【住所又は居所原語表記】Ｃ／Ｓｅｒｒａｎｏ，１１７，Ｅ－２８００６ Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ
(71)【出願人】
【識別番号】523285731
【氏名又は名称】ナノモル テクノロジーズ，エセ．エレ．
(71)【出願人】
【識別番号】523285742
【氏名又は名称】リーンバイオ
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】ヴェントサ ラル，レオノール
(72)【発明者】
【氏名】ヴェシアナ ミロ，ジャウメ
(72)【発明者】
【氏名】ロヨ エスポシト，ミリアム
(72)【発明者】
【氏名】トムセン メレロ，ジュディット
(72)【発明者】
【氏名】アバソロ オラオルチュア，イバネ
(72)【発明者】
【氏名】シュワルツ ナヴァッロ，シモン
(72)【発明者】
【氏名】コルケロ ニエト，ホセ ルイス
(72)【発明者】
【氏名】プリド マルティネス，ダニエル
(72)【発明者】
【氏名】クリストバル レシナ，エドガー
(72)【発明者】
【氏名】ゴンザレス ミラ，エリザベット
(72)【発明者】
【氏名】サラ ヴェルゲス，サンティアゴ
(72)【発明者】
【氏名】コルドバ インセンス，アルバ
(72)【発明者】
【氏名】メルロ マス，ジョゼップ
(72)【発明者】
【氏名】スルダヴィラ ファブラガ，アンドリュー
(72)【発明者】
【氏名】フォント イングレス，アルベルト
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
【Ｆターム（参考）】
4C076AA19
4C076AA95
4C076BB11
4C076CC21
4C076CC41
4C076DD19
4C076DD63H
4C076DD67
4C076DD70H
4C076EE59
4C076FF63
4C076FF70
4C076GG31
4C084AA02
4C084AA03
4C084BA01
4C084BA08
4C084BA15
4C084BA22
4C084BA23
4C084BA36
4C084BA37
4C084BA44
4C084CA56
4C084CA62
4C084DC22
4C084MA02
4C084MA05
4C084MA24
4C084MA66
4C084NA13
4C084NA14
4C084ZC191
4C084ZC192
4C084ZC541
4C084ZC542
4C084ZC751
4C084ZC752
(57)【要約】
本発明は、ａ） リン脂質と；ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と；ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されているコンジュゲートと；ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と；ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）酵素と、を含むリポソームに関する。それはまた、それを含む医薬組成物、および特にファブリー病の治療に使用するための医薬として使用するためのリポソームまたは医薬組成物に関する。それはまた、リポソームの製造方法にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
リポソームであって、ａ） ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）であるリン脂質と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、前記ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介して前記コレステロール部分に共有結合され、他端が前記ＲＧＤ配列を含む前記ペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含むことを特徴とする、リポソーム。
【請求項2】
前記α－ガラクトシダーゼ酵素において、その単量体の各々が、配列番号１の配列であるか、または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列であることを特徴とする、請求項１に記載のリポソーム。
【請求項3】
前記α－ガラクトシダーゼ酵素が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物から得られることを特徴とする、請求項１または２に記載のリポソーム。
【請求項4】
前記非脂質カチオン性界面活性剤が、第四級アンモニウム型であることを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項5】
非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤が、塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）、塩化メネゼトニウム（ＢＺＴ）、塩化ステアラルコニウム、セトリミド、塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、およびそれらの任意の組み合わせからなるリストから選択されることを特徴とする、請求項４に記載のリポソーム。
【請求項6】
前記非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤がＭＫＣであり、リポソームａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の成分の総モルに対して５モル％以下の割合で存在することを特徴とする、請求項５に記載のリポソーム。
【請求項7】
前記ＰＥＧが、ＰＥＧ５０～ＰＥＧ６００、好ましくはＰＥＧ２００～ＰＥＧ４００の分子量を有するＰＥＧであることを特徴とする、請求項１～６のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項8】
前記ＰＥＧがＰＥＧ４００であり、前記ＲＧＤ配列が配列番号２であり、前記非脂質性カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤がリポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して５モル％以下の割合で存在するＭＫＣであり、請求項１に記載されるＧＬＡの比率が２０～３０であり、前記ＧＬＡにおいて、その単量体の各々が、配列番号１の配列であるか、または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有する配列であり、モル比率ＤＰＰＣ：ｃｈｏｌ：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤが１０：６．５：０．５であることを特徴とする、請求項１～７のいずれか一項に記載のリポソーム。
【請求項9】
薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に、請求項１～８のいずれか一項に記載されるリポソームの治療有効量を含むことを特徴とする、医薬組成物。
【請求項10】
薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に、組成物の総体積に対して２～１０重量％の量の、グルコース、スクロースまたはトレアロースを含むことを特徴とする、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項11】
前記医薬組成物１ｍＬ当たり少なくとも０．２ｍｇの量の前記α－ガラクトシダーゼ酵素を含むことを特徴とする、請求項９または１０に記載の医薬組成物。
【請求項12】
医薬として使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のリポソームまたは請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項13】
ファブリー病の治療に使用するための、請求項１～８のいずれか一項に記載のリポソームまたは請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項14】
請求項１～８のいずれか一項に記載のリポソームまたは請求項９～１１のいずれか一項に記載の医薬組成物が、ファブリー病に罹患している対象に、単回投与として、または、少なくとも２週間に１回反復して、投与される、請求項１３に記載の使用のためのリポソーム。
【請求項15】
請求項１～８のいずれか一項に記載のリポソームを製造する方法であって、工程ａ） 請求項１～８のいずれか一項に記載のＧＬＡ酵素を含む水溶液を調製する工程と、
工程ｂ） 有機溶媒に溶解した、請求項１～８のいずれか一項に記載のコンジュゲートと、コレステロールと、リン脂質とを含む溶液を調製し、前記有機溶液を圧縮流体で膨張させる工程と、
工程ｃ） 非脂質カチオン性界面活性剤を、工程ａ）の溶液または膨張させる前の工程ｂ）の溶液のいずれかに添加する工程と、
工程ｄ） 工程ｂ）から得られた溶液を工程ａ）の得られた溶液上にて減圧する工程と、
工程ｅ） 任意の順序で、工程ｄ）で得られた溶液の透析濾過および濃縮を行う工程と、
を含むことを特徴とする、リポソームの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本出願は、２０２１年１月２７日に出願された欧州特許出願ＥＰ２１３８２０６２の利益を主張する。
【0002】
本発明は一般に、酵素、特にα－ガラクトシダーゼ酵素の送達に有用なリポソームの分野に関する。本発明は、とりわけ、リポソーム、ならびにこれらのリポソームの調製方法、およびファブリー病などの疾患の治療におけるその使用を提供する。
【背景技術】
【0003】
特定の疾患はファブリー病などのリソソーム疾患の場合のように、特定のタンパク質の活性の欠如または特定の酵素の活性の欠如によって、不完全または欠損によって、引き起こされ得る。
【0004】
ファブリー病（ＦＤ）は、リソソーム加水分解酵素であるα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）の欠乏または欠損を特徴とする稀なリソソーム蓄積症である。ＧＬＡ活性の欠損は、血管内皮細胞、有足細胞、心筋細胞、および神経細胞を含む多種多様な細胞型のリソソーム内で、その中性スフィンゴ糖脂質基板、主にグロボトリアオシルセラミド（Ｇｂ３）の蓄積をもたらす。ファブリー患者では、腎臓におけるＧｂ３蓄積が妊娠１７週という早い時期に始まり、徐々に増加し、初期の腎臓損傷およびアルブミン尿と直接相関する（Ｎａｊａｆｉａｎ、Ｂ．ら、２０１１）。腎細胞におけるＧｂ３の蓄積、したがって有足細胞の尿中の喪失は臨床症状（例えば、タンパク尿）の前に起こり、これは、組織損傷が臨床的に明らかになる前に細胞損傷が起こることを意味する（Ｓｃｈｉｆｆｍａｎｎら、２０１７年）。他の器官におけるＧｂ３の蓄積および臨床症状の後の開発は、心臓を含む他の器官においても同じ傾向に従うようである（Ｈｓｕ Ｍ．Ｊら、２０１９）。前臨床および臨床試料において、Ｇｂ３蓄積は、免疫組織化学、薄層クロマトグラフィー、電子顕微鏡および質量分析（ＭＳ）を用いて可視化または定量化することができる。
【0005】
ファブリー患者の主要な治療は酵素補充療法（ＥＲＴ）であり、これは、１週間おきに外因性の組換えＧＬＡの静脈内注入に依存する。現在、１ｋｇあたり１ｍｇおよび１ｋｇあたり０．２ｍｇをそれぞれ投与されるアガルシダーゼベータ（Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）、Ｓａｎｏｆｉ－Ｇｅｎｚｙｍｅ）およびアガルシダーゼアルファ（リプレガル（登録商標）、Ｓｈｉｒｅ－Ｔａｋｅｄａ）の２つのＧＬＡ酵素がＦＤにおいてＥＲＴのために承認されている。Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）（遺伝子操作されたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において産生される）およびリプレガル（登録商標）（ヒト細胞株において産生される）は同等の生化学的特性を示し、比活性に有意差はない（Ｌｅｅら、２００３）。両方の化合物は組織におけるＧｂ３蓄積を減少させるが、いずれの処置も、特に進行期において、疾患を完全には逆転させないようである（Ｆｅｒｖｅｎｚａ、ＦＣ．ら、２００８）。
【0006】
裸のＧＬＡを投与する酵素補充療法は、不十分な生体内分布、短い血漿半減期、限られた有効性、およびファブリー患者における比較的高い免疫原性を含むいくつかの欠点を示す。これらの問題を克服するための魅力的な戦略は、酵素をカプセル化するためのナノ担体の使用である。ガイドリガンドで官能化されたナノリポソームはＧＬＡを保護し、内皮細胞に送達するためにすでに出現しているが（例えば、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）、低いコロイド安定性および制限された酵素捕捉効率は、これらのナノ製剤の医薬開発および臨床変換のための問題を提示する。
【0007】
当該分野で知られていることから、酵素を効率的に捕捉し、酵素活性を改善する、ファブリー病などの治療薬として酵素を使用する疾患のための特定の酵素送達方法を見出す必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【0008】
本発明者らはα－ガラクトシダーゼＡ（ＧＬＡ）酵素送達のための強固なツールを開発し、輸送された酵素がその活性をｉｎ ｖｉｖｏで高い有効性で実施することを可能にし、これはファブリー病の治療に有用である。このツールは、各リポソーム（本明細書では「ハイブリッドリポソーム」（ＨＬＰ）または「ナノ－ＧＬＡ」または「ナノＧＬＡ」とも呼ばれる）が：
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0009】
本実施例はＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６（実施例１参照）に開示された既知のリポソーム系、および遊離酵素リプレガル（登録商標）（ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験については実施例２、ｉｎ ｖｉｖｏ実験については実施例３参照）との比較結果を提供し、驚くべき結果を提供する。本発明において、ＧＬＡは、単量体がタグおよびタグフリーの両方を含有する配列番号１の配列であるヒトＧＬＡで例示された。
【0010】
Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に開示されている既知のリポソーム系との比較はＧＬＡ送達のためにリポソーム系（本明細書では実施例１において「ＬＰ」または「ＬＰ－ＧＬＡ」と命名される）が以前に開発されたようにして実施され、それはリン脂質ＤＰＰＣ、コレステロール、および内皮細胞において発現されるαｖβ３－インテグリンの認識に有利に働くコレステロール部分（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ）に連結されたＲＧＤ単位（トリペプチドＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐを含む）から構成されていた。それにもかかわらず、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６のＧＬＡ負荷リポソーム系では、酵素捕捉効率は約４０％であり、ｉｎ ｖｉｖｏ治療用量を達成するのに不十分な薬物濃度をもたらした（図２参照）。
【0011】
驚くべきことに、（リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）での総モルに対して）３０モル％未満の濃度のカチオン性塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）界面活性剤の本発明のリポソームへの組み込みは、ＧＬＡ捕捉（図２参照）、および／またはｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＡ酵素活性（図４Ａおよび図４Ｂ参照）に関して、以前から知られているリポソームよりも優れていた。さらに、本発明のリポソームは安全であった。低濃度（リポソームの構成成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して３０％以下）のＭＫＣがｉｎ ｖｉｔｒｏでのＧＬＡの有効性を驚くほど改善したと言う事実は、より高濃度のＭＫＣ、例えば他のナノベシクル中のＭＫＣの５０％モル以上の濃度が、ＧＬＡの捕捉を可能にしたが（図２参照）ＧＬＡ酵素活性を消失させた（図４Ａ参照）ことを考慮すると、意外であった。
【0012】
本発明のリポソームを用いて得られた結果は、実施例２に見られるような相乗効果によるものであった。ＧＬＡとリポソーム成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）との重量比率は、本発明のリポソームの物理化学的性質および安定性に重大な影響を及ぼした（実施例２．１）。リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率（ＧＬＡのμｇ／成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）のｍｇ）が３０でα－ガラクトシダーゼ酵素が存在するリポソームはｉｎ ｖｉｔｒｏでリプレガル（登録商標）のものの１５０％の活性で実施され、一方、その比率が少なくとも３６であるリポソームは安定ではなく、それらの物理化学的性質が変化した（図５Ａおよび図５Ｂ参照）。
【0013】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、驚くべきことに、本発明のリポソームを含む組成物がグルコース、スクロースまたはトレアロースを含む場合、ＧＬＡ酵素活性は、他の等浸透圧溶液（実施例３および図６Ａおよび図６Ｂを参照されたい）、特に５％ｗ／ｖのグルコースと比較して改善された。さらに、遊離酵素（リプレガル（登録商標）または組換えヒトＧＬＡ）よりも血漿中のＧＬＡ酵素活性を上昇させた（図７）。
【0014】
ｉｎ ｖｉｖｏで、ＦＤのマウスモデルにおいて、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ここで、ＭＫＣはリポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して５％モルであった）は、単回投与（図８Ａおよび図８Ｂ参照）および反復投与（８回まで１週間あたり２回）（図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃ参照）として、いくつかの器官におけるＧｂ３の減少におけるリプレガル（登録商標）および遊離組換えＧＬＡよりも良好な成績を示した。本発明のリポソームは、有意に、単回投与および反復投与の両方で、脳内のＧｂ３の減少を示したが、これは遊離酵素（リプレガル（登録商標）を含む）では観察されなかった（図１０参照）。
【0015】
以下に提供するデータから、本発明のリポソームは、ファブリー病の治療のための酵素補充療法システムとして使用することができることは注目に値する。
【0016】
したがって、本発明の第１の態様は、以下を含むリポソームを指す：
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）、すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0017】
本発明の第２の態様は、治療有効量の本発明の第１の態様のリポソームを、薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に含む医薬組成物に関する。
【0018】
本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物は本発明の第１の態様で定義される酵素を治療剤として使用する疾患の治療、例えば、ファブリー病としてのヒト疾患の治療に使用することができる。
【0019】
本発明の第３の態様は、医薬として使用するための本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。
【0020】
本発明の第４の態様は、ファブリー病の治療に使用するための本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。
【0021】
本発明の第５の態様は、バイオイメージングツールとしての本発明の第１の態様のリポソームの使用に関する。
【0022】
本発明の第６の態様は、ＧＬＡ酵素置換のための送達システムとしての本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。
【0023】
リポソームの調製はＷＯ２０１４００１５０９およびＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３に開示されたＣＯ２ベースのＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ方法論によって行うことができ、これは、前臨床試験および臨床試験の両方に充分な量のナノ医薬の調製を可能にするリポソームの堅牢性および再現性のあるスケールアップを保証し、続いて、本明細書に説明されるように濃縮および透析濾過（透析濾過）を（任意の順序で）行う。
【0024】
本発明の第７の態様は、
工程ａ） 本発明の第１の態様に記載のＧＬＡ酵素を含む水溶液を調製する工程と、
工程ｂ） 有機溶媒に溶解した、本発明の第１の態様に記載のコンジュゲートと、コレステロールと、リン脂質とを含む溶液を調製し、有機溶液を圧縮流体で膨張させる工程と、
工程ｃ） 本発明の第一の態様に記載の非脂質カチオン性界面活性剤を、工程ａ）の溶液または膨張させる前の工程ｂ）の溶液のいずれかに添加する工程と、
工程ｄ） 工程ｂ）から得られた溶液を工程ａ）の得られた溶液上にて減圧する工程と、
工程ｅ） 任意の順序で、工程ｄ）で得られた溶液の透析濾過および濃縮を行う工程と、
を含む、本発明の第１の態様のリポソームの製造方法に関する。
工程ａ） 本発明の第１の態様に記載のＧＬＡ酵素を含む水溶液を調製する工程と、
工程ｂ） 有機溶媒に溶解した、本発明の第１の態様に記載のコンジュゲートと、コレステロールと、リン脂質とを含む溶液を調製し、有機溶液を圧縮流体で膨張させる工程と、
工程ｃ） 本発明の第一の態様に記載の非脂質カチオン性界面活性剤を、工程ａ）の溶液または膨張させる前の工程ｂ）の溶液のいずれかに添加する工程と、
工程ｄ） 工程ｂ）から得られた溶液を工程ａ）の得られた溶液上にて減圧する工程と、
工程ｅ） 任意の順序で、工程ｄ）で得られた溶液の透析濾過および濃縮を行う工程と、
を含む、本発明の第１の態様のリポソームの製造方法に関する。
【0025】
本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物を含む装置に関する。
【図面の簡単な説明】
【0026】
【図1】ＨＬＰ－ＧＬＡナノベシクルの、直径サイズ、ＰＤＩおよびζ電位に関する安定性を、時間の関数として測定した結果を示す。アッセイは、３つの独立した測定で、反復された、単一の代表的な実験に対応する。
【図2】試験したすべての系のＧＬＡ捕捉効率。非含有ＭＫＣリポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ）、クアトソーム（ＭＱ－ＧＬＡ）およびハイブリッドリポソーム（ＨＬＰ－ＧＬＡ）。結果は、３つの独立したアッセイの平均に対応する。
【図3】３つの異なるナノ製剤のＣｒｙｏ－ＴＥＭ画像： Ａ）非含有ＭＫＣリポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ２０）、Ｂ）クアトソーム（ＭＱ－ＧＬＡ２０）およびＣ）ハイブリッドリポソーム（ＨＬＰ－ＧＬＡ８．５）。
【図4A】異なるＧＬＡ－ナノベシクル複合体の酵素活性とｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性：リポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ）、クアトソーム（ＭＱ－ＧＬＡ）、およびＭＫＣ（ＨＬＰ－ＧＬＡ）を含むハイブリッドリポソーム（ＨＬＰ－ＧＬＡ）における酵素活性。全ての値は、参照として遊離ＧＬＡを用いた酵素活性を指す。結果は、３つの独立したアッセイの平均に対応する。
【図4B】異なるＧＬＡ－ナノベシクル複合体の酵素活性とｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性：遊離ＭＫＣの存在下での酵素活性はＨＬＰ－ＧＬＡ系と同じ濃度を再現する（アッセイは、３つの独立したアッセイで再現された、単一の代表的な実験に対応する。）；
【図4C】異なるＧＬＡ－ナノベシクル複合体の酵素活性とｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞活性：Ｆａｂｒｙ ＫＯマウス由来の一次内皮細胞におけるＧｂ３の喪失（ＧＬＡによるその加水分解による）として測定されるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイ。アッセイは、３つの独立したアッセイで再現された、単一の代表的な実験に対応する。
【図5A】ナノ－ＧＬＡ「ＮＦ－６３０」（リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）のＭＡＥＣにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイは遊離タンパク質（ＬｅａｎＢｉｏ（ｒｈ－ＧＬＡ）およびリプレガル（登録商標）からのＧＬＡ最終版）と比較して約３６の比率でｒｈ－ＧＬＡを含む；「ＮＦ－６３１＿ｗ／ｏ ＲＧＤ」および「ＮＦ－６２９＿ｗ／ｏ ＧＬＡ」を対照として使用した（これらは「ＮＦ－６３０」（ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌおよびＭＫＣを含む）と同じ構造だが、「ＮＦ－６３１」はｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを含まず、ＧＬＡを含まず、「ＮＦ－６２９」はｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを含み、ＧＬＡを含まない）。
【図5B】３０の比率のｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（「ナノ－ＧＬＡ」）（遊離ｒｈ－ＧＬＡ、および遊離リプレガル（登録商標）と比較して、ＧＬＡは、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総質量に対して３０の比率で存在した（２７１ｕｇ／ｍｌでのＧＬＡ）。）の細胞培養におけるＧｂ３の減少：「ＮＦ－ｅｍｐｔｙ」は、ＧＬＡを含まないリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣによって構成されるナノ製剤である。
【図6A】異なる培地で透析濾過したナノ－ＧＬＡの捕捉効率。
【図6B】ナノ－ＧＬＡ試料の比酵素活性（ＥＡ）は、対照（リプレガル（登録商標）酵素活性を１に正規化した）に関連している。
【図6C】グルコース５％およびスクロース１０％の水溶液中で透析濾過したナノ－ＧＬＡ試料、およびグルコース５％およびスクロース１０％の水溶液中で７倍濃縮および透析濾過したナノ－ＧＬＡ試料のＭＡＥＣにおけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイ。
【図7】ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ、遊離ｒｈ－ＧＬＡ、および遊離リプレガル（登録商標）の血漿活性。血漿において、投与後３０分での酵素活性（ＥＡ）は注射用量（ＩＤ）のパーセンテージを計算するために、１分での活性を参照した。
【図8A】ファブリーＫＯマウスモデルの肝臓および脾臓における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣの単回投与でのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。
【図8B】ファブリーＫＯマウスモデルの腎臓および心臓における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣの単回投与でのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。
【図9A】ファブリーＫＯマウスモデルの肝臓、脾臓および肺臓における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣの反復単回投与でのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。
【図9B】ファブリーＫＯマウスモデルの血漿、腎臓および心臓における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣの反復単回投与でのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。
【図9C】ファブリーＫＯマウスモデルの皮膚における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣの反復単回投与でのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。「（Ｉ）」、Ｇｂ３レベルｐｍｏｌ ｅｑ．／ｍｇ ｐｒｏｔ；および「（ＩＩ）」、Ｇｂ３損失値（ＷＴに言及）。
【図10】単回および反復での静脈内投与後のファブリーＫＯマウスモデルの脳における、遊離ｒｈ－ＧＬＡおよび遊離リプレガル（登録商標）と比較した、ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣのｉｎ ｖｉｖｏでの有効性。
【発明を実施するための形態】
【0027】
本出願において本明細書で使用されるすべての用語は特に明記しない限り、当技術分野で知られているそれらの通常の意味で理解されるものとする。本出願において使用される特定の用語についての他のより具体的な定義は以下に記載される通りであり、他に明示的に記載される定義がより広い定義を提供しない限り、本明細書および特許請求の範囲を通して均一に適用することが意図される。
【0028】
本発明の目的のために、与えられた任意の範囲は、範囲の下端点および上端点の両方を含む。記載されている範囲は特に明記されていない限り、おおよそのものとみなされるべきである。
【0029】
本発明の第一の態様は、リポソームに関し、リポソームは、
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の総モルに対して３０モル％（３０モル％）未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の総モルに対して３０モル％（３０モル％）未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0030】
用語「リポソーム」は脂質二重層によって構成される１つ以上の膜を含む自己組織化構造として理解されるべきであり、その各々は、反対に配向された両親媒性脂質分子を含有する２つの単層を含む。リポソームは、単一の二重層膜（小単層ベシクル「ＳＵＶ」および大単層ベシクル「ＬＵＶ」）、または複数の二重層膜（多層大ベシクル「ＭＬＶ」）を有することができる。
【0031】
リポソーム膜はジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルイノシトール（ＰＩ）およびホスファチジン酸（ＰＡ）などのリン脂質を含むことができるが、これらに限定されない。
【0032】
本発明の第１の態様の一実施形態において、任意選択で以下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、リン脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）である。
【0033】
コレステロール（Ｃｈｏｌ）、ＣＡＳ番号： ５７－８８－５は、コレステン－３β－オールとしても知られている。
【0034】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、コンジュゲートｃ）は式コレステロール－（ポリエチレングリコール）－（ＲＧＤ配列を含むペプチド）（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）のコンジュゲートであり、ＰＥＧは、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロールに共有結合され、他端がカルバメート結合を介してＲＧＤ配列を含むペプチドに共有結合されている。
【0035】
ＷＯ２０１４００１５０９、またはＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３、またはＣｒｉｓｔｏｂａｌ－Ｌｅｃｉｎａ、Ｅ．ｅｔ ａｌ．２０２０の教示に続いて、濃縮および透析濾過工程により、本発明のコンジュゲートを得ることができる。
【0036】
本発明のリポソームはまた、本明細書において、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）：非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）と命名され；特定の実施形態において、ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣである。
【0037】
ＲＧＤペプチド（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐモチーフを含む）は細胞の膜中に存在するインテグリンと相互作用することができるペプチドとして当技術分野で一般的に記載されているペプチドであり、細胞間および細胞と異なる組織または基底膜との間の両方での細胞接着の研究のために特に興味深い。
【0038】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ＲＧＤペプチドは配列番号２（ＲＧＤｆＫ）の配列を含む（例えばそれからなる）。
【0039】
ＲＧＤｆＫ配列（配列番号２）を有するペプチドにおいて、フェニルアラニンは唯一のＤ－アミノ酸であり（これが、小文字で配列において区別されている理由である）、ポリエチレングリコールとの共有結合はＷＯ２０１４００１５０９に記載されているように、リジン側鎖を官能化することによって行われている。
【0040】
本発明の第１の態様の別の実施形態では必要に応じて、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ＲＧＤ配列はＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３およびＷＯ２０１４００１５０９に記載されているようなｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ循環配列番号２（「ｃＲＧＤｆＫ」）である。
【0041】
上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組合せた、第１の態様の別の実施形態において、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）分子量はＰＥＧ５０およびＰＥＧ６００（下付き文字は分子量を指す）の間であり、例えば、ＰＥＧ５０、ＰＥＧ１００、ＰＥＧ２００、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ５００、またはＰＥＧ６００である。
【0042】
本発明の第１の態様の実施形態において、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、非脂質カチオン性界面活性剤は、リポソームの構成要素ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％；７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％；１３％、１４％、１５％；１６％；１７％、１８％、１９％；２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％モル、または、リポソームの構成要素ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して、０．１％～３０％、０．１％～２０％、０．１％～１５％、０．４％～６％、４％～６％、または４．５～５．５％モル未満の割合で存在する。
【0043】
非脂質カチオン性界面活性剤としては非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【0044】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、非脂質カチオン性界面活性剤は非脂質カチオン性第四級アンモニウム界面活性剤である。
【0045】
本発明において、非脂質第四級アンモニウム界面活性剤は、１個の窒素置換基が長鎖アルキル基である第四級アンモニウム塩を指す。非脂質第四級アンモニウム界面活性剤は水溶性であり、臨界ミセル濃度（ｃｍｃ）を超えるミセルを形成するように自己組織化する。逆に、脂質第四級アンモニウム界面活性剤は、自己組織化して、ベシクル、平面二重層、または逆ミセルなどの他の構造を形成する。本発明の第四級アンモニウム界面活性剤は脂質ではない。
【0046】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、非脂質カチオン性第４級アンモニウム界面活性剤は塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、塩化セチルピリジニウム（ＣＰＣ）、塩化ベンザルコニウム（ＢＡＣ）、塩化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＣ）、塩化ベンゼトニウム（ＢＺＴ）、塩化ステアラルコニウム、塩化セトリミド、塩化ベンジルジメチルドデシルアンモニウム、およびそれらの組み合わせからなるリストから選択される。
【0047】
本発明の第１の態様の実施形態において、任意選択で上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、非脂質カチオン性第４級アンモニウム界面活性剤はリポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の総モルに対して３０％未満の割合で存在する塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）であり、例えば、ＭＫＣは、リポソームの構成要素ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して、少なくとも０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．１％、４．２％、４．３％、４．４％、４．５％、４．６％、４．７％、４．８％、４．９％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、５．６％、５．７％、５．８％、５．９％、６％；７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％；１３％、１４％、１５％；１６％；１７％、１８％、１９％；２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、または３０％モル、または、リポソームの構成要素ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総モルに対して、０．１％～３０％、０．１％～２０％、０．１％～１５％、０．４％～６％、４％～６％、または４．５～５．５％モル未満の割合で存在する。
【0048】
塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）、ＣＡＳ番号１３９－０８－２は、ベンジルジメチルテトラデシルアンモニウムクロリドまたはミリスチルジメチルベンジルアンモニウムクロリドまたはＮ－ベンジル－Ｎ－テトラデシルジメチルアンモニウムクロリドまたはＮ、Ｎ－ジメチル－Ｎ－テトラデシルベンゼンメタンアミニウムクロリドまたはテトラデシルベンジルジメチルアンモニウムクロリドとしても知られる。
【0049】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤのモル比は１０：６．５：０．５であり、例えば、ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤであり、ＲＧＤは環状配列番号２である（例えば、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３およびＷＯ２０１４００１５０９に記載されるようなＲＧＤペプチドである（したがって、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤは構成要素に関して３％モルを表す））。
【0050】
用語「α－ガラクトシダーゼ」（α－ガラクトシダーゼＡまたはガラクトシダーゼα（略してＧＬＡ）とも呼ばれる）は、本明細書で使用される場合、糖脂質および糖タンパク質から末端α－ガラクトシル部分を加水分解するグリコシド加水分解酵素を指す。これは、ＧＬＡ遺伝子によってコードされる（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）Ｇｅｎｅ ＩＤ： ２７１７、２０２０年１２月１３日、ＤＮＡ ＞ＮＣ＿００００２３．１１：ｃ１０１４０７９２５－１０１３９７８０３ ヒト染色体Ｘ、ＧＲＣｈ３８．ｐ１３一次アセンブリ； ＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０６２８０）。これは主にセラミドトリヘキソシドを加水分解し、メリビオースのガラクトースおよびグルコースへの加水分解を触媒することができる。本明細書において理解されるように、ＧＬＡは、プロカリオテスおよびユーカリオテの両方においてクローニングされ、発現されるα－ガラクトシダーゼを意味し得る。
【0051】
本発明の第１の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明のＧＬＡ（本明細書では「酵素」とも呼ばれる）は４８．８ｋＤａの単量体質量を有するホモ二量体酵素であるヒトＧＬＡ（ＥＣ ３．２．１．２２）であり、したがって、ＧＬＡ全体は１００ＫＤａの近似分子量を示す；または代わりに、配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性を有し、その酵素活性を保持する酵素である。一例では、本発明のＧＬＡは、例えば、ヒスタグまたはｃｍｙｃｔａｇなどのタグを含まない。さらに別の例では、本発明のＧＬＡは、少なくとも１つのタグ、例えば、ヒスタグまたはｃｍｙｃｔａｇを含む酵素ＧＬＡである。
【0052】
本発明の第１の態様の一実施形態では上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、酵素は配列番号１の配列の２つのモノマーを含む（例えばそれからなる）二量体である。
【0053】
本発明の第１の態様の一実施形態において、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、酵素はＧＬＡｃｍｙｃＨｉｓであり、このアミノ酸配列は、Ｃｏｒｃｈｅｒｏ Ｊｌ ｅｔ ａｌ、２０１１に開示されている。
【0054】
本発明の第１の態様の一実施形態では必要に応じて、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、アルファ－ガラクトシダーゼ酵素はリポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５、２～３４、２～３３、２～３２、２～３１、２～３０、１０～３５、１４～３５、１４～３３、１４～３０、１５～３５、１５～３４、１５～３３、１５～３２、１５～３１、１５～３０、２０～３５、２０～３４、２０～３３、２０～３２、２０～３１、２０～３０となるように存在し、または別の実施形態では２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５となるように存在する。
【0055】
本発明の第一の態様の実施形態において、場合により以下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、リポソームは、
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）（例えば、ＲＧＤ配列は、ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ循環配列番号２（「ｃＲＧＤｆＫ」）である）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、６％；または、０．１％－３０％、０．１％－２０％、０．１％－１５％、０．４％－６％、または４．５－５．５％より小さい割合で存在する）と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５となるように存在し、ここで、その単量体の各々は配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、配列番号１の配列と８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性）である、α－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） リン脂質（例えば、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ））と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されている、コンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）（例えば、ＲＧＤ配列は、ｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ循環配列番号２（「ｃＲＧＤｆＫ」）である）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の総モルに対して３０モル％未満の割合で存在する非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、６％；または、０．１％－３０％、０．１％－２０％、０．１％－１５％、０．４％－６％、または４．５－５．５％より小さい割合で存在する）と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４または３５となるように存在し、ここで、その単量体の各々は配列番号１の配列または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、配列番号１の配列と８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性）である、α－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0056】
本発明において、用語「同一性」は、配列が最適にアラインメントされる場合、２つの配列において同一である残基の割合を指す。最適なアラインメントにおいて、第１の配列中の位置が第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基によって占められる場合、配列は、その位置に関して同一性を示す。２つの配列間の同一性のレベル（または「配列同一性パーセント」）は配列のサイズに対する、配列によって共有される同一の位置の数の比率として測定される（すなわち、配列同一性パーセント＝［同一の位置の数／位置の総数］×１００）。
【0057】
最適なアラインメントを迅速に取得し、２つ以上の配列間の同一性を計算するための多数の数学的アルゴリズムが知られており、多数の利用可能なソフトウェアプログラムに組み込まれている。そのようなプログラムの実施例としては、とりわけ、アミノ酸配列分析のためのＭＡＴＣＨ－ＢＯＸ、ＭＵＬＴＡＩＮ、ＧＣＧ、ＦＡＳＴＡ、およびＲＯＢＵＳＴプログラムが挙げられる。好ましいソフトウェア分析プログラムには、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗ、およびＢＬＡＳＴプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ ２．１、ＢＬ２ＳＥＱ、およびその後のバージョン）が含まれる。
【0058】
アミノ酸配列分析のために、重量マトリックス、例えばＢＬＯＳＵＭマトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ６２、およびＢＬＯＳＵＭ８０マトリックス）、ゴネットマトリックス、またはＰＡＭマトリックス（例えば、ＰＡＭ３０、ＰＡＭ７０、ＰＡＭ１２０、ＰＡＭ１６０、ＰＡＭ２５０、およびＰＡＭ３５０マトリックス）が、同一性を決定するのに使用される。
【0059】
ＢＬＡＳＴプログラムはデータベース中の複数の配列（例えば、ＧｅｎＳｅｑ）に対して選択された配列をアラインメントすることによって、または２つの選択された配列の間でＢＬ２ＳＥＱを用いて、少なくとも２つのアミノ酸配列の分析を提供する。ＢＬＡＳＴプログラムは、好ましくはＢＬＡＳＴプログラム動作に統合されるＤＵＳＴまたはＳＥＧプログラムなどの低複雑度フィルタリングプログラムによって修正されることが好ましい。ギャップ存在コスト（またはギャップスコア）が使用される場合、ギャップ存在コストは、好ましくは約－５～－１５に設定される。同様のギャップパラメータは、必要に応じて、他のプログラムと共に使用することができる。ＢＬＡＳＴプログラムおよびそれらの基礎をなす原理は例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ、”Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”、１９９０、ＪＭｏｌ．Ｂｉｏｌ、ｖ．２１５、ｐａｇｅｓ ４０３－４１０．に記載されている。
【0060】
多重配列解析には、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムを使用できる。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムは、望ましくは「動的」（対「高速」）設定を使用して実行される。アミノ酸配列は、配列間の同一性のレベルに応じて、ＢＬＯＳＵＭマトリックスの可変セットを用いて評価される。ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗプログラムおよび動作の基本原理は例えば、Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｔ ａｌ、”ＣＬＵＳＴＡＬ Ｖ： ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｓｏｆｔｗａｒｅ ｆｏｒ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ”、１９９２、ＣＡＢＩＯＳ、８（２）、ｐａｇｅｓ １８９－１９１にさらに記載されている。
【0061】
本発明の第１の態様の実施形態において、必要に応じて、上記または以下に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、酵素（本発明のＧＬＡ）は例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｃｈａｐｔｅｒ １６， １６．１－１６－５４に記載されているような、標準的な細胞培養技術（例えば、安定した発現に基づく製造方法）に続いて、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物から組換えにより得られる。
【0062】
上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組合せた、第１の態様の一実施形態では、ＧＬＡ酵素がＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）；またはＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）からのバイオシミラー；またはリプレガル（登録商標）もしくはそのバイオシミラーである。
【0063】
本発明の第１の態様の実施形態において、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、リポソームは：
ａ） ＤＰＰＣであるリン脂質と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、ＰＥＧ４００であり、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がカルバメート結合を介してＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合され、ＲＧＤペプチドが配列番号２の配列（例えば、環状、例えば、ｃＲＧＤｆＫである、）コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよびＭＫＣ）の総モルに対して３０モル％（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、６％）未満の割合で存在する、ＭＫＣである非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、本発明の第１の態様で定義され、その単量体の各々が配列番号１の配列であるα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） ＤＰＰＣであるリン脂質と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲートであって、ＰＥＧ部分が、ＰＥＧ４００であり、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がカルバメート結合を介してＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合され、ＲＧＤペプチドが配列番号２の配列（例えば、環状、例えば、ｃＲＧＤｆＫである、）コンジュゲートと、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよびＭＫＣ）の総モルに対して３０モル％（例えば、少なくとも０．１％、０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、５．１％、５．２％、５．３％、５．４％、５．５％、６％）未満の割合で存在する、ＭＫＣである非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、本発明の第１の態様で定義され、その単量体の各々が配列番号１の配列であるα－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0064】
本発明の第１の態様の実施形態において、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、リポソームは：
ａ） ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲート、例えば、配列番号２（例えば、ｃＲＧＤｆＫ）であって、ＰＥＧ４００部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されたコンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよびＭＫＣ）の総モルに対して約５％モル（例えば、４．５～５．５％）の割合で存在する、ＭＫＣである非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素であって、１つの実施形態において、比率は３０であり、その単量体の各々は配列番号１の配列であるか、または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性）を有する配列であり、例えば、ＧＬＡは、ＣＨＯ細胞において得られ、ここで、ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤのモル比は、１０：６．５：０．５である、α－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
ａ） ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）と、
ｂ） コレステロール（ｃｈｏｌ）と、
ｃ） コレステロール部分、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ４００）部分、およびＲＧＤ配列を含むペプチド部分を含むコンジュゲート、例えば、配列番号２（例えば、ｃＲＧＤｆＫ）であって、ＰＥＧ４００部分が、一端がアルキルエーテルタイプの結合を介してコレステロール部分に共有結合され、他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合されたコンジュゲート（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）と、
ｄ） 非脂質カチオン性界面活性剤であって、リポソームの成分（すなわち、リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよびＭＫＣ）の総モルに対して約５％モル（例えば、４．５～５．５％）の割合で存在する、ＭＫＣである非脂質カチオン性界面活性剤と、
ｅ） α－ガラクトシダーゼ酵素であって、リポソームの成分ａ）、ｂ）、ｃ）およびｄ）の総量（ｍｇ）に対するＧＬＡの量（μｇ）の比率が２～３５となるように存在するα－ガラクトシダーゼ酵素であって、１つの実施形態において、比率は３０であり、その単量体の各々は配列番号１の配列であるか、または配列番号１と少なくとも８５％の配列同一性（例えば、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％の配列同一性）を有する配列であり、例えば、ＧＬＡは、ＣＨＯ細胞において得られ、ここで、ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤのモル比は、１０：６．５：０．５である、α－ガラクトシダーゼ酵素と、
を含む。
【0065】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、本発明の酵素は非共有結合的にリポソームに組み込まれる。
【0066】
本発明の第１の態様の一実施形態では上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、酵素（本発明のＧＬＡ）はリポソームの内側にあるか、または代替として、リポソームの外側にあるか、または代替として、酵素はリポソームを横断する。
【0067】
本発明の第１の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、リポソームは球状、単層、サイズが均質、および安定である。
【0068】
本発明のリポソームを、例えば、ζ電位によって特徴付けるための、当技術分野において周知の方法が存在する。ナノビヒクルのサイズは当業者に公知の任意の方法、例えば、動的光散乱（ＤＬＳ）、質量分析、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）または高分解能透過型電子顕微鏡（ＨＲ－ＴＥＭ）によって測定することができる。本発明のリポソームの安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定することができる。
【0069】
本発明の第１の態様の一実施形態において、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、リポソームは３００ｎｍ未満、例えば２０～３００ｎｍ、例えば８０～２００ｎｍ、または例えば１００～１６０ｎｍ、例えば１２０～１５５ｎｍの平均直径を有し、例えば動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定される。
【0070】
「均質なサイズ」という用語は、０．０５～０．４０、例えば０．０５～０．３０、または例えば０．０５～０．２の多分散指数（ＰＤＩ）を有するリポソームを指す。
【0071】
本発明の第１の態様の一実施形態では上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、リポソームは２０～６５ｍＶ、例えば３０～５０ｍＶ、または例えば３５～５０ｍＶのζ電位を有する。
【0072】
本発明の第１の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、リポソームは平均直径１００～１６０ｎｍの球状であり、単層であり、ＰＤＩは０．０５～０．３であり、ζ電位は２０～６５ｍＶであり、分散液中で少なくとも２ヶ月間安定であり；例えば、リポソームは平均直径１２０～１５５ｎｍの球状であり、単層であり、ＰＤＩは０．０５～０．２であり、ζ電位は３５～５０ｍＶであり、分散液中で少なくとも２ヶ月間安定である。
【0073】
本発明の第１の態様の一実施形態では上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、リポソームはフルオロフォア、放射性医薬品、ペプチド、ポリマー、無機分子、脂質、単糖、オリゴ糖、抗体または抗体の断片、抗原、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される要素にさらに結合する。
【0074】
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様のリポソームの治療有効量を、薬学的に許容される賦形剤または担体、またはビヒクルと共に含む医薬組成物に関する。
【0075】
「治療有効量」という表現は本明細書で使用される場合、投与された場合、対処される疾患の症状の１つまたは複数の発症を予防するか、またはある程度軽減するのに十分な化合物（すなわち、本発明のリポソーム）の量を指す。本発明に従って投与される化合物の特定の用量は、もちろん、投与される化合物、投与経路、治療される特定の状態、および同様の考慮事項を含む、症例を取り巻く特定の状況によって決定される。
【0076】
「薬学的に許容される賦形剤または担体、またはビヒクル」という表現は、薬学的に許容される材料、組成物、またはビヒクルを指す。各成分は、医薬組成物の他の成分と適合性であるという意味で薬学的に許容されなければならない。また、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、免疫原性、または合理的なベネフィット／リスク比に相応する他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織または器官と接触して使用するのに適していなければならない。
【0077】
本発明の第２の態様の一実施形態では、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、本発明の第１の態様のリポソームの治療有効量を含む医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に、組成物の総体積（％ｗ／ｖ）に対して２～１５％（２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％；例えば、２％～１０％、２％～８％、または２～５％、例えば、５％）の量でグルコース、スクロースまたはトレアロースを含む。
【0078】
本発明の第２の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に、組成物の総体積に対して２～１５重量％（２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％；例えば、２％～１０％、２％～８％、または２～５％、例えば、５％）の量でグルコースを含む。
【0079】
本発明の第２の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、医薬組成物は薬学的に許容される賦形剤またはビヒクルと共に、組成物の総体積に対して５重量％の量のグルコースを含む。
【0080】
本発明の第２の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、医薬組成物はＧＬＡ酵素を、少なくとも０．１ｍｇ／ｍＬ（医薬組成物１ｍＬ当たりｍｇ）、例えば、少なくとも０．２ｍｇ／ｍＬ、別の例では少なくとも０．２２５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．２７１ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも０．３５ｍｇ／ｍＬの量で含む。
【0081】
本発明の第３の態様は、医薬として使用するための本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。
【0082】
本発明の第３の態様は、医薬の製造のための本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物の使用として再配合することができる。
【0083】
本発明の第４の態様は、ファブリー病の治療に使用するための本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に関する。
【0084】
本発明の第４の態様は、ファブリー病の治療のための薬物の製造のための、本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物の使用として再配合することができる。それはまた、治療有効量の本発明のリポソームの第１の態様を、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤と共に、それを必要とする対象（ヒトを含む）に投与することを含む、ファブリー病の治療または予防のための方法として再配合され得る。
【0085】
薬剤は、非経口、皮膚、経口、硬膜外、舌下、経鼻、髄腔内、気管支、リンパ管、直腸、経皮、または吸入投与に適合した形態で提供することができる。非経口投与に適合した形態はその注射用投与を可能にすることができる物理的状態、すなわち、好ましくは液体状態を指す。非経口投与は筋肉内、動脈内、静脈内、皮内、皮下または骨内投与によって行うことができるが、これらのタイプの非経口投与経路に限定されない。経口投与に適合させた形態は滴下、シロップ剤、チザン剤、エリキシル剤、懸濁剤、即時懸濁剤、飲用バイアル剤、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、スタンプ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ剤、トローチ剤または凍結乾燥剤を含むが、これらに限定されないリストから選択される。直腸投与に適合させた形態は坐剤、直腸被膜、直腸分散液または直腸軟膏を含むが、これらに限定されないリストから選択される。経皮投与に適合した形態は経皮パッチまたはイオン導入を含むが、これらに限定されないリストから選択される。
【0086】
本発明の第３および第４の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、医薬品は静脈内投与に適合した形態で提供される。
【0087】
本発明の第３および第４の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、医薬は例えば、少なくとも週１回、さらに別の例では少なくとも２週間に１回、例えば、症状が逆転するまで、または代替的に、患者の全生涯（生涯）の間、繰り返し投与される。
【0088】
本発明の第３および第４の態様の一実施形態では、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと任意に組み合わせて、ＧＬＡの少なくとも０．２０ｍｇ、０．２５ｍｇ、０．５ｍｇ、０．７５ｍｇ、１ｍｇ、１．５ｍｇ、２ｍｇ、２．５ｍｇがファブリー病に罹患している対象の１Ｋｇあたり１週間おきに該対象に投与される。
【0089】
本発明のリポソームは例えば色素で標識し、部位特異的標識のための標的化リガンドで官能化し、最終的に酵素を送達することができる。
【0090】
したがって、本発明の第５の態様は、バイオイメージングツールとしての本発明の第１の態様のリポソームの使用に関する。
【0091】
本発明の第５の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、酵素の内部移行および送達を追跡するためのバイオイメージングツールとして使用される。
【0092】
「バイオイメージングツール」は本明細書によれば、細胞または特定の組織のいくつかの区画を追跡するために生物学において使用されるイメージング技術において使用される試薬であると理解されるべきである。バイオイメージングツールの例としては、化学発光化合物、蛍光およびリン光化合物、Ｘ線またはα、β、またはγ線放出化合物などが挙げられる。
【0093】
本発明の第６の態様は、本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物を、ＧＬＡ酵素置換のための送達システムと呼ぶ。
【0094】
第１の態様のリポソームは、超音波処理（ＵＳ）、薄膜水和（ＴＨＦ）、および（例えば、ＷＯ２０１４００１５０９；または濃縮および透析濾過後のＥＰ１８４３８３６に開示されているような）膨張液体有機溶液体懸濁液体の減圧（ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ）と呼ばれるＣＯ２膨張溶媒を使用する１工程スケーラブル法などの様々な技術によって形成することができる。
【0095】
本発明の第７の態様は、以下の工程を含む、本発明の第１の態様のリポソームの製造方法に関する：
工程ａ） 本発明の第１の態様で定義されるＧＬＡ酵素を含む水溶液を調製する工程と、
工程ｂ） 有機溶媒に溶解した、本発明の第１の態様で定義されるコンジュゲート、コレステロール、およびリン脂質を含む溶液を調製する工程であって、有機溶液が圧縮流体で膨張される、工程と、
工程ｃ） 本発明の第一の態様において定義される非脂質カチオン性界面活性剤を、工程ａ）の溶液または膨張させる前の工程ｂ）の溶液のいずれかに添加する工程と、
工程ｄ） 工程ｂ）で得られた溶液を工程ａ）で得られた溶液上で減圧する工程と、
工程ｅ） 任意の順序で、工程ｄ）で得られた溶液を透析濾過および濃縮する工程。
工程ａ） 本発明の第１の態様で定義されるＧＬＡ酵素を含む水溶液を調製する工程と、
工程ｂ） 有機溶媒に溶解した、本発明の第１の態様で定義されるコンジュゲート、コレステロール、およびリン脂質を含む溶液を調製する工程であって、有機溶液が圧縮流体で膨張される、工程と、
工程ｃ） 本発明の第一の態様において定義される非脂質カチオン性界面活性剤を、工程ａ）の溶液または膨張させる前の工程ｂ）の溶液のいずれかに添加する工程と、
工程ｄ） 工程ｂ）で得られた溶液を工程ａ）で得られた溶液上で減圧する工程と、
工程ｅ） 任意の順序で、工程ｄ）で得られた溶液を透析濾過および濃縮する工程。
【0096】
本発明の第７の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、工程ａ）の水溶液は、緩衝液、塩、糖および／または他の賦形剤も含有することができる。
【0097】
透析濾過工程は、例えば、ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉ ＴＦＦ透析濾過システム（ＫＲ２ｉ）によって、例えば、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に既に記載されている手順に従い、例えば、透析濾過サイクルを４または５に低下させるなどの特定の改変を伴って実施することができ；濃縮工程は例えば、以下の改変を伴う同じ装置によって実施することができる：
ａ）透析濾過および濃縮プロセスの順序は交換可能である：透析濾過および濃縮、または濃縮および透析濾過；
ｂ）操作流量（ポンプによって提供される）は、２０～２００ｍＬ／分であり得る；
ｃ）操作ＴＭＰ（膜貫通圧力）は、２．５～１０ｐｓｉであり得る；
ｄ）中空繊維フィルターカラムは、作業体積重量計に応じて、１３～２３５ｃｍ２の変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）および３００ｋＤａであってよく；および／または；
ｅ）商業的提供者からのリザーバーがプロセス体積に応じて、ガラスフラスコに置き換えられ得る。
ａ）透析濾過および濃縮プロセスの順序は交換可能である：透析濾過および濃縮、または濃縮および透析濾過；
ｂ）操作流量（ポンプによって提供される）は、２０～２００ｍＬ／分であり得る；
ｃ）操作ＴＭＰ（膜貫通圧力）は、２．５～１０ｐｓｉであり得る；
ｄ）中空繊維フィルターカラムは、作業体積重量計に応じて、１３～２３５ｃｍ２の変性ポリエーテルスルホン（ｍＰＥＳ）および３００ｋＤａであってよく；および／または；
ｅ）商業的提供者からのリザーバーがプロセス体積に応じて、ガラスフラスコに置き換えられ得る。
【0098】
例えば、濃縮を実施するために、１０～５０００ｍＬの容量を、カラムのみに接続された試料容器に加えることができる。この場合、試料は、体積が除去されるにつれてより濃縮される。濃縮の程度（濃縮係数、ＣＦ）は最終体積（Ｖｆ）に分割された初期体積（Ｖｉ）に対応し、ＣＦ＝Ｖｉ／Ｖｆである。例えば、初期容量が５０ｍＬであり、所望のＣＦが５である場合、試料容器内の試料容量が１０ｍＬであるとき、プロセスは停止する。プロセスの完了のための時間は処理される総体積および操作パラメータに依存し、現場の専門家は、それをどのように調整するかを知っている。
【0099】
本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、透析濾過および濃縮ステップは、分散液から非組み込みＧＬＡおよび有機溶媒を除去するために、水溶液、例えば、水または等浸透圧溶液中で実施される。
【0100】
本発明の第７の態様の一実施形態では、任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、透析濾過および濃縮ステップは、２～１５％ｗ／ｖのスクロース、グルコースまたはトレハロース、例えば、スクロース１０％、グルコース５％またはトレハロース１０％ｗ／ｖ、例えば、グルコース５％ｗ／ｖを含む水溶液中で実施される。
【0101】
本発明の第７の態様の一実施形態では任意選択で、上記または下記に提供される実施形態のいずれかと組み合わせて、透析濾過は、少なくとも３回、例えば３回、４回、５回、６回または７回行われ、別の例では少なくとも４回、例えば４回、５回、６回、７回、８回、９回、１０回、１１回または１２回行われる。
【0102】
本発明の別の態様は、本発明の第７の態様の方法によって得ることができるリポソームでもある。
【0103】
また、本発明の一部は、リン脂質、コレステロール、本発明の第１の態様のコンジュゲート、および本発明の第１の態様の非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、ＤＰＰＣ、Ｃｈｏｌ、コンジュゲートＣｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤおよびＭＫＣ）の自己組織化と、その後の、例えばリポソームの表面におけるＧＬＡの吸着によるＧＬＡ捕捉（本発明の第１の態様のＧＬＡ）とによる、本発明の第１の態様のリポソームの製造方法である。また、本発明の一部は、この製造方法によって得られるリポソームである。
【0104】
本発明の第８の態様は、本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物を含むキット（パーツのキット）に関し、これは、場合により、本発明の第１の態様のリポソームまたは本発明の第２の態様の医薬組成物に含まれる酵素の送達のための説明書を含むことができる（これ以降、「本発明のキット」）。必要に応じて、キットは、本発明のリポソームを可視化するためのさらなる手段をさらに含んでもよい。
【0105】
また、本発明の一部は、本発明の態様のいずれかに記載の使用のための本発明のキットの使用でもある。
【0106】
また、本発明の一部は、本発明の第１の態様のリポソームまたはそれらを含む本発明の第２の態様の医薬組成物の放出のための装置である。
【0107】
本明細書および特許請求の範囲全体を通して、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および単語の変動は、他の技術的特徴、添加剤、構成要素、または工程を排除することを意図しない。さらに、「含む」という用語は、「からなる」の場合を包含する。本発明のさらなる物体、利点、および特徴は、説明を検討することによって当業者に明らかになるか、または本発明を実施することによって知ることができる。以下の実施例および図面は、例示のために提供され、本発明を限定することを意図するものではない。図面に関連し、請求項の括弧内に配置された参照符号は単に請求項の明瞭性を高めることを試みるためのものであり、請求項の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。さらに、本発明は、本明細書に記載の特定の好ましい実施形態の全ての可能な組み合わせを包含する。
【実施例】
【0108】
〔実施例１． ＧＬＡ酵素の細胞内送達におけるナノベシクルおよびその性能：〕
異なるＲＧＤ標的化ナノベシクルを得て、それらのＧＬＡの細胞内送達（ナノベシクルに含まれるＧＬＡとしてＲｅｐａｌｇａｌ（登録商標）を使用）における性能を比較した：（ｉ）リポソーム系であって、リン脂質ＤＰＰＣ、コレステロール、および、ＲＧＤペプチドが環状ｃＲＧＤｆｋであるＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されたコレステロール部分（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ）に連結されたＲＧＤ単位（トリペプチドＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）から構成される、組換えＧＬＡを含有するリポソーム系（本明細書において「ＬＰ」と命名される）；（ｉｉ）ナノベシクルであって、第四級アンモニウム界面活性剤である塩化ミリストニウム（ＭＫＣ）を高量（全膜成分の５０ｍｏｌ％を超える量、「ｈ－ＭＫＣ」）を含有し、「クアトソーム」（Ｆｅｒｒｅｒ－Ｔａｓｉｅｓ、Ｌ．ｅｔ ａｌ．２０１３）として知られるナノベシクル（本明細書において「ＭＱ」と命名される）、および、（ｉｉｉ）リポソームであって、それらの膜中に様々な濃度のカチオン性界面活性剤（例えばＭＫＣ）を有し、低ＭＫＣ量（全膜成分の５ｍｏｌ％未満、「ｌ－ＭＫＣ」）を含有するリポソーム（本明細書において「ハイブリッドリポソーム」（「ＨＬＰ」）と命名される）。全ては、他のナノベシクルプロセシング技術（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）と比べて、高いバッチ間の一貫性および容易なスケーラビリティを有するナノベシクルの調製を可能にする、ＷＯ２００６／０７９８８９に記載されているような圧縮ＣＯ２の使用に基づいて、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して得られた。
異なるＲＧＤ標的化ナノベシクルを得て、それらのＧＬＡの細胞内送達（ナノベシクルに含まれるＧＬＡとしてＲｅｐａｌｇａｌ（登録商標）を使用）における性能を比較した：（ｉ）リポソーム系であって、リン脂質ＤＰＰＣ、コレステロール、および、ＲＧＤペプチドが環状ｃＲＧＤｆｋであるＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されたコレステロール部分（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ）に連結されたＲＧＤ単位（トリペプチドＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）から構成される、組換えＧＬＡを含有するリポソーム系（本明細書において「ＬＰ」と命名される）；（ｉｉ）ナノベシクルであって、第四級アンモニウム界面活性剤である塩化ミリストニウム（ＭＫＣ）を高量（全膜成分の５０ｍｏｌ％を超える量、「ｈ－ＭＫＣ」）を含有し、「クアトソーム」（Ｆｅｒｒｅｒ－Ｔａｓｉｅｓ、Ｌ．ｅｔ ａｌ．２０１３）として知られるナノベシクル（本明細書において「ＭＱ」と命名される）、および、（ｉｉｉ）リポソームであって、それらの膜中に様々な濃度のカチオン性界面活性剤（例えばＭＫＣ）を有し、低ＭＫＣ量（全膜成分の５ｍｏｌ％未満、「ｌ－ＭＫＣ」）を含有するリポソーム（本明細書において「ハイブリッドリポソーム」（「ＨＬＰ」）と命名される）。全ては、他のナノベシクルプロセシング技術（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）と比べて、高いバッチ間の一貫性および容易なスケーラビリティを有するナノベシクルの調製を可能にする、ＷＯ２００６／０７９８８９に記載されているような圧縮ＣＯ２の使用に基づいて、ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を使用して得られた。
【0109】
〔材料および方法〕
〔材料：〕
コレスト－５－エン－３β－オール（コレステロール；純度９５％）は、Ｐａｎｒｅａｃ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から購入した。１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）は、ＣｏｒｄｅｎＰｈａｒｍａ（Ｐｌａｎｋｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手した。塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓａｌｅｍ、米国）から購入した。コレステロール－ＰＥＧ２００－ＲＧＤは、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３またはＣｒｉｓｔｏｂａｌ－Ｌｅｃｉｎａ、Ｅ．、ｅｔ ａｌ．２０２０に以前に記載されているように調製した（ＰＥＧ部分は、アルキルエーテルタイプの結合を介して一端がコレステロール部分に共有結合し、カルバメートタイプの結合を介して他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合した）。ＧＬＡ酵素は、Ｓｈｉｒｅ－Ｔａｋｅｄａ（タグフリー酵素である）から購入したアガルシダーゼアルファ（ＧＬＡ、１ｍｇ ｍＬ－１、リプレガル（登録商標））によって例示された。エタノールＨＰＬＣグレード（Ｔｅｋｎｏｃｒｏｍａ Ｓａｎｔ Ｃｕｇａｔ ｄｅｌ Ｖａｌｌｅｓ、スペイン）は、高純度で購入し、さらなる精製なしで使用した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＡＣＳ試薬、純度９９．９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（マドリード、スペイン）から入手した。二酸化炭素（純度９９．９％）は、Ｃａｒｂｕｒｏｓ Ｍｅｔａｌｉｃｏｓ Ｓ．Ａ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から供給された。使用した水は、ＭｉｌｌｉＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｂｅｒｉｃａ、マドリード、スペイン）で前処理した。
〔材料：〕
コレスト－５－エン－３β－オール（コレステロール；純度９５％）は、Ｐａｎｒｅａｃ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から購入した。１，２－ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ホスホコリン（ＤＰＰＣ）は、ＣｏｒｄｅｎＰｈａｒｍａ（Ｐｌａｎｋｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手した。塩化ミリスタルコニウム（ＭＫＣ）は、ＵＳ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（Ｓａｌｅｍ、米国）から購入した。コレステロール－ＰＥＧ２００－ＲＧＤは、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３またはＣｒｉｓｔｏｂａｌ－Ｌｅｃｉｎａ、Ｅ．、ｅｔ ａｌ．２０２０に以前に記載されているように調製した（ＰＥＧ部分は、アルキルエーテルタイプの結合を介して一端がコレステロール部分に共有結合し、カルバメートタイプの結合を介して他端がＲＧＤ配列を含むペプチド部分に共有結合した）。ＧＬＡ酵素は、Ｓｈｉｒｅ－Ｔａｋｅｄａ（タグフリー酵素である）から購入したアガルシダーゼアルファ（ＧＬＡ、１ｍｇ ｍＬ－１、リプレガル（登録商標））によって例示された。エタノールＨＰＬＣグレード（Ｔｅｋｎｏｃｒｏｍａ Ｓａｎｔ Ｃｕｇａｔ ｄｅｌ Ｖａｌｌｅｓ、スペイン）は、高純度で購入し、さらなる精製なしで使用した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ、ＡＣＳ試薬、純度９９．９％）は、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ（マドリード、スペイン）から入手した。二酸化炭素（純度９９．９％）は、Ｃａｒｂｕｒｏｓ Ｍｅｔａｌｉｃｏｓ Ｓ．Ａ（Ｂａｒｃｅｌｏｎａ、スペイン）から供給された。使用した水は、ＭｉｌｌｉＱ Ａｄｖａｎｔａｇｅ Ａ１０浄水システム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｉｂｅｒｉｃａ、マドリード、スペイン）で前処理した。
【0110】
〔ナノベシクルの調製：〕
すべての製剤はＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３、Ｖｅｎｔｏｓａ、Ｎ．、ｅｔ ａｌ．２００５およびＷＯ２００６／０７９８８９に記載されているＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ方法論を用いて同じ調製経路を用いて調製し、その後濃縮工程を行った。
すべての製剤はＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３、Ｖｅｎｔｏｓａ、Ｎ．、ｅｔ ａｌ．２００５およびＷＯ２００６／０７９８８９に記載されているＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ方法論を用いて同じ調製経路を用いて調製し、その後濃縮工程を行った。
【0111】
すべての場合（ＬＰ、ＭＱおよびＨＬＰ）において、ＲＧＤペプチドはＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３および２０１６に開示されているｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ循環配列番号２（「ｃＲＧＤｆＫ」）であり、コンジュゲートは、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１３に記載されているのと同じ文書に記載されているように得られた。
【0112】
〔クアトソーム（ＭＱおよびＭＱ－ＧＬＡ）調製：〕
ＧＬＡ非負荷クアトソーム（ＭＱ）について、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤをＤＭＳＯに溶解した後、コレステロールおよびＭＫＣのエタノール溶液を滴下し、２：５体積比のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨを含む溶液を得た。２５ｍＬの高圧容器に充填し、圧縮ＣＯ２で体積膨張させ、１０ＭＰａの作動圧（Ｐｗ）を得た。完全な均質化および熱平衡を達成するために、系を約１５分間３０８Ｋおよび１０ＭＰａに保った。ＧＬＡ負荷クアトソーム（ＭＱ－ＧＬＡ）については、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）に添加して、所望の最終酵素濃度（２０μｇ ｍＬ－１）に到達させた。ナノベシクルを形成するために、膨張した有機相を冷水溶液上で減圧した。この工程では、ＣＯ２膨張液を容器から押し下げ、減圧中に容器内の１１ＭＰａの一定圧力を維持するためのプランジャーとして、作動圧力のＮ２の流れを用いた。３．６ｍｇ ｍＬ－１の総濃度（それぞれの成分の詳細な最終モル濃度は、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＭＫＣについてそれぞれ０．３５、２．５９、および５．８７μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のナノベシクルの、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ（それぞれ３％および７％ ｖ／ｖ）を含む水系培地中での分散を得て、特性評価まで４℃で保存した。
ＧＬＡ非負荷クアトソーム（ＭＱ）について、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤをＤＭＳＯに溶解した後、コレステロールおよびＭＫＣのエタノール溶液を滴下し、２：５体積比のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨを含む溶液を得た。２５ｍＬの高圧容器に充填し、圧縮ＣＯ２で体積膨張させ、１０ＭＰａの作動圧（Ｐｗ）を得た。完全な均質化および熱平衡を達成するために、系を約１５分間３０８Ｋおよび１０ＭＰａに保った。ＧＬＡ負荷クアトソーム（ＭＱ－ＧＬＡ）については、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）に添加して、所望の最終酵素濃度（２０μｇ ｍＬ－１）に到達させた。ナノベシクルを形成するために、膨張した有機相を冷水溶液上で減圧した。この工程では、ＣＯ２膨張液を容器から押し下げ、減圧中に容器内の１１ＭＰａの一定圧力を維持するためのプランジャーとして、作動圧力のＮ２の流れを用いた。３．６ｍｇ ｍＬ－１の総濃度（それぞれの成分の詳細な最終モル濃度は、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＭＫＣについてそれぞれ０．３５、２．５９、および５．８７μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のナノベシクルの、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ（それぞれ３％および７％ ｖ／ｖ）を含む水系培地中での分散を得て、特性評価まで４℃で保存した。
【0113】
〔リポソーム（ＬＰおよびＬＰ－ＧＬＡ）調製：〕
リポソーム（ＬＰ）を、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載された手順に従って、わずかな改変を加えて調製した。簡単に説明すると、コレステロールおよびＤＰＰＣのエタノール溶液を滴加する前に、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤをＤＭＳＯに溶解し、１：５の体積比のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨを含む溶液を得た。混合物を２５ｍＬの高圧容器に充填し、圧縮ＣＯ２で体積膨張させて１０ＭＰａの作動圧にした。完全な均質化および熱平衡を達成するために、系を約１５分間３０８Ｋおよび１０ＭＰａに保った。ＧＬＡ負荷リポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ２０）については、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）で希釈し、所望の最終酵素濃度（２０μｇ ｍＬ－１）に到達させた。ナノベシクルを形成するために、膨張した有機相を水溶液上にて室温で減圧した。次の工程は、クアトソーム調製の場合と同じ順序に従った。１．５ｍｇ ｍＬ－１の総濃度（それぞれの成分の詳細な最終モル濃度は、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＤＰＰＣについて、それぞれ０．１０、０．９１、および１．４５μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のナノベシクルの、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ（それぞれ０．８％および４％ ｖ／ｖ）を含む水系培地中での分散液を得、特性決定まで４℃で保存した。
リポソーム（ＬＰ）を、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載された手順に従って、わずかな改変を加えて調製した。簡単に説明すると、コレステロールおよびＤＰＰＣのエタノール溶液を滴加する前に、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤをＤＭＳＯに溶解し、１：５の体積比のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨを含む溶液を得た。混合物を２５ｍＬの高圧容器に充填し、圧縮ＣＯ２で体積膨張させて１０ＭＰａの作動圧にした。完全な均質化および熱平衡を達成するために、系を約１５分間３０８Ｋおよび１０ＭＰａに保った。ＧＬＡ負荷リポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ２０）については、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）で希釈し、所望の最終酵素濃度（２０μｇ ｍＬ－１）に到達させた。ナノベシクルを形成するために、膨張した有機相を水溶液上にて室温で減圧した。次の工程は、クアトソーム調製の場合と同じ順序に従った。１．５ｍｇ ｍＬ－１の総濃度（それぞれの成分の詳細な最終モル濃度は、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＤＰＰＣについて、それぞれ０．１０、０．９１、および１．４５μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のナノベシクルの、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ（それぞれ０．８％および４％ ｖ／ｖ）を含む水系培地中での分散液を得、特性決定まで４℃で保存した。
【0114】
〔ハイブリッドリポソーム（ＨＬＰおよびＨＬＰ－ＧＬＡ）調製：〕
ハイブリッドリポソームの調製のために、リポソームのためのものと同様の調製経路を使用した。ＭＫＣ（膜成分の総モルの０．４、２．２、または４．３モル％）を、反応器に装填する前にエタノール溶液に組み込んだ。次の工程はリポソーム調製と同じ順序に従い、（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、および（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰ系を得た。ＧＬＡ負荷ハイブリッドリポソームについては、以前に記載されたように、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）で希釈して最終酵素濃度に到達させた：（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０については２０μｇ ｍＬ－１、および、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ８．５については８．５μｇ ｍＬ－１であった。総脂質濃度１．５ｍｇ ｍＬ－１（各成分の詳細な最終モル濃度はｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＤＰＰＣについてそれぞれ０．１０、０．９１、および１．４５μｍｏｌ ｍＬ－１であり、（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、または（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰについてそれぞれ０．０１、０．０６、または０．１１μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のハイブリッドリポソームを、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ、０．８％および４％ ｖ／ｖを含有する水性培地中で得て、特性評価まで４℃で保存した。
ハイブリッドリポソームの調製のために、リポソームのためのものと同様の調製経路を使用した。ＭＫＣ（膜成分の総モルの０．４、２．２、または４．３モル％）を、反応器に装填する前にエタノール溶液に組み込んだ。次の工程はリポソーム調製と同じ順序に従い、（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、および（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰ系を得た。ＧＬＡ負荷ハイブリッドリポソームについては、以前に記載されたように、ＧＬＡを注射用水（Ｉタイプ）で希釈して最終酵素濃度に到達させた：（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０については２０μｇ ｍＬ－１、および、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ８．５については８．５μｇ ｍＬ－１であった。総脂質濃度１．５ｍｇ ｍＬ－１（各成分の詳細な最終モル濃度はｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、コレステロール、およびＤＰＰＣについてそれぞれ０．１０、０．９１、および１．４５μｍｏｌ ｍＬ－１であり、（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ、または（４．３％ＭＫＣ）－ＨＬＰについてそれぞれ０．０１、０．０６、または０．１１μｍｏｌ ｍＬ－１であった）のハイブリッドリポソームを、低量のＤＭＳＯおよびＥｔＯＨ、０．８％および４％ ｖ／ｖを含有する水性培地中で得て、特性評価まで４℃で保存した。
【0115】
〔透析濾過および濃縮：〕
ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉ ＴＦＦ透析濾過系（ＫＲ２ｉ）を用いて、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に既に記載されている手順に従って、本明細書に説明されている濃縮工程などの改変を用いて、非コンジュゲートＧＬＡ酵素をＧＬＡ負荷リポソームから分離した。
ＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉ ＴＦＦ透析濾過系（ＫＲ２ｉ）を用いて、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に既に記載されている手順に従って、本明細書に説明されている濃縮工程などの改変を用いて、非コンジュゲートＧＬＡ酵素をＧＬＡ負荷リポソームから分離した。
【0116】
簡潔には、遊離ＧＬＡ（≒１００ｋＤａ）を分離するために、３００ｋＤａカットオフｍＰＥＳ中空繊維カラムを使用した。各ＧＬＡ含有製剤について、１０ｍＬのナノベシクル分散液を、注射用の冷水純水（Ｉタイプ）（６０ｍＬ）を用いた６サイクルの透析濾過に供し、取り込まれていないＧＬＡおよび分散液からの有機溶媒の排除をもたらした。
【0117】
ｉｎ ｖｉｖｏ試験のための用量に達するために、（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰハイブリッドリポソーム系を、３００ｋＤａカットオフｍＰＥＳフィルターカラムを有するＫｒｏｓＦｌｏ（登録商標）Ｒｅｓｅａｒｃｈ ＩＩｉ ＴＦＦ透析濾過システム（ＫＲ２ｉ）を使用して濃縮した。７４ｍＬの初期体積を×１２の濃縮係数にかけ、最終ナノ製剤６ｍＬを得た。ｉｎ ｖｉｖｏ試験を通して新鮮な製剤の投与を確実にするために、同じ手順に従って３つの独立したバッチを作製したが、物理化学的特性に有意差はなかった（以下を参照されたい）。
【0118】
試料（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰハイブリッドリポソームをｉｎ ｖｉｖｏ試験のために濃縮するために、透析濾過に指定されたものと同じプロセスを使用したが、この場合、緩衝液リザーバーは系に接続されなかった。これは、体積が除去されるにつれて、試料がより濃縮されることを可能にした。濃縮の程度（濃縮係数、ＣＦ）は最終体積（Ｖｆ）に分割された初期体積（Ｖｉ）に対応し、ＣＦ＝Ｖｉ／Ｖｆであり、ｉｎ ｖｉｖｏ毒性学のために、試料は１２のＣＦで濃縮された。
【0119】
手順自体が関連する影響を有さないことを確実にするために、濃縮工程後にＤＬＳによってリポソーム系の物理化学的特性（サイズ、ＰＤＩおよびζ電位）を決定した。リポソームはナノスケールサイズ（２５０ｎｍ以下）および低多分散性（ＰＤＩ＜０．３５）を維持したため、サイズ（ｐ＝０．１６９）、ＰＤＩ（ｐ＝０．９０３）およびζ電位（ｐ＝０．１１６）に関して濃縮後に有意な変化は観察されなかった。統計は、Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）１７統計ソフトウェア（２０１３）を使用して、２試料ｔ検定によって行った。形態もまた、ｃｒｙｏＴＥＭ画像によって検査した。画像は、ナノメートル範囲のサイズを有する、球状で、大部分が単層のベシクルを示した。
【0120】
〔サイズ、多分散性指数およびζ電位の特性評価：〕
作製された全てのベシクルのサイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）およびζ電位を、非侵襲的後方散乱技術（ＮＩＢＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）と組み合わせた動的光散乱（ＤＬＳ）および電気泳動光散乱（ＥＬＳ）分析器を用いて測定した。試料（１ｍＬ）を、前もって変更または希釈することなく分析した。報告されたすべての値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、作製後翌日、同じ試料について２０℃で３回連続して測定した平均結果であった。サイズデータは強度サイズ分布に基づいており、３つの測定値間のｚ平均値±標準偏差に対応していた。
作製された全てのベシクルのサイズ、多分散性指数（ＰＤＩ）およびζ電位を、非侵襲的後方散乱技術（ＮＩＢＳ）（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＵＫ）と組み合わせた動的光散乱（ＤＬＳ）および電気泳動光散乱（ＥＬＳ）分析器を用いて測定した。試料（１ｍＬ）を、前もって変更または希釈することなく分析した。報告されたすべての値は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｓｏｆｔｗａｒｅを用いて、作製後翌日、同じ試料について２０℃で３回連続して測定した平均結果であった。サイズデータは強度サイズ分布に基づいており、３つの測定値間のｚ平均値±標準偏差に対応していた。
【0121】
〔Ｃｒｙｏ－ＴＥＭによる形態学的特性評価：〕
ナノ製剤をｃｒｙｏ－ＴＥＭにより調べ、ベシクル形態を直接分析し、構造の均一性（不均一性）と共存について学習した。サイズ、形状、二重層の数および二重層分布に関する情報を収集した。短期安定性を知るために、数日のナノ製剤製造後にガラス化試料を調製し、翌月に２～３回調製した。ナノ製剤は、ｃｒｙｏ－ＴＥＭ分析まで４℃で保存した。そのために、それらを２５℃で３０分間平衡化し、次いで、十分に確立された手順（Ｄａｎｉｎｏ、Ｄ．２０１２）に従って、制御された試料調製チャンバー中でこの温度からガラス化し、極低温でＴ１２ Ｇ２ Ｔｅｃｎａｉ（ＦＥＩ）およびＴａｌｏｓ Ｆ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）顕微鏡で試験した。穿孔されたＴｅｄ Ｐｅｌｌａグリッドを使用し、ガラス化試料の温度は常に－１７０℃未満に保った。画像は、以前に記載されたように（Ｄａｎｉｎｏ、Ｄ．２０１２）、低用量操作でＧａｔａｎ ＵｌｔｒａＳｃａｎ ２ｋｘ２ｋ ＣＣＤカメラまたはＣｅｔａカメラを用いて記録した。画像を様々な倍率（８．８Ｋ～５３Ｋ）で記録して、全ての構造、すなわち、数ｎｍ～数百の範囲の異なる長さスケールで適切に捕捉した。バックグラウンド減算を除き、画像処理は適用されなかった。全ての測定は、ＣｒｙｏＥＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ａｔ Ｔｅｃｈｎｉｏｎ（イスラエル工科大学、イスラエル）で行った。
ナノ製剤をｃｒｙｏ－ＴＥＭにより調べ、ベシクル形態を直接分析し、構造の均一性（不均一性）と共存について学習した。サイズ、形状、二重層の数および二重層分布に関する情報を収集した。短期安定性を知るために、数日のナノ製剤製造後にガラス化試料を調製し、翌月に２～３回調製した。ナノ製剤は、ｃｒｙｏ－ＴＥＭ分析まで４℃で保存した。そのために、それらを２５℃で３０分間平衡化し、次いで、十分に確立された手順（Ｄａｎｉｎｏ、Ｄ．２０１２）に従って、制御された試料調製チャンバー中でこの温度からガラス化し、極低温でＴ１２ Ｇ２ Ｔｅｃｎａｉ（ＦＥＩ）およびＴａｌｏｓ Ｆ２００Ｃ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ）顕微鏡で試験した。穿孔されたＴｅｄ Ｐｅｌｌａグリッドを使用し、ガラス化試料の温度は常に－１７０℃未満に保った。画像は、以前に記載されたように（Ｄａｎｉｎｏ、Ｄ．２０１２）、低用量操作でＧａｔａｎ ＵｌｔｒａＳｃａｎ ２ｋｘ２ｋ ＣＣＤカメラまたはＣｅｔａカメラを用いて記録した。画像を様々な倍率（８．８Ｋ～５３Ｋ）で記録して、全ての構造、すなわち、数ｎｍ～数百の範囲の異なる長さスケールで適切に捕捉した。バックグラウンド減算を除き、画像処理は適用されなかった。全ての測定は、ＣｒｙｏＥＭ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｓｏｆｔ Ｍａｔｔｅｒ ａｔ Ｔｅｃｈｎｉｏｎ（イスラエル工科大学、イスラエル）で行った。
【0122】
〔小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を用いたリポソームの形態特性評価：〕
リポソームの二重層の厚さおよびプロファイル、ラメラ構造の程度、ならびに取り込まれたＧＬＡの量についての定量的情報を、Ａａｒｈｕｓ大学に設置され、液体Ｇａ金属ジェットＸ線源（Ｅｘｃｉｌｌｕｍ）（Ｓｃｈｗａｍｂｅｒｇｅｒ、Ａ．ｅｔ ａｌ．２０１５）および散乱なしスリット（Ｌｉ、Ｙ．、ｅｔ ａｌ．２００８）を備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳからの最適化ＮａｎｏＳＴＡＲ ＳＡＸＳ器具（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｓ．、２００４）上で小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を用いて調査した。水中のＧＬＡ（１ｍｇ ｍＬ－１）およびそれらの分散媒質中のリポソームまたはハイブリッドリポソーム（１．５ｍｇ ｍＬ－１）（水または４％ ＥｔＯＨおよび０．８％ ＤＭＳＯ ｖ／ｖを含む水）を測定し、一致するバックグラウンドを差し引いて、水を絶対スケール校正に使用した。測定の前に、ＡＬＶ－６０１０／ＥＰＰマルチタウデジタル相関器を備えたＡＬＶ／ＣＧＳ－８Ｆゴニオメーターを備えたＡＬＶ器具（ＡＬＶ、Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ）上でＡａｒｈｕｓ中のＤＬＳを実施することによって、出荷中の試料の変化をチェックしたことに留意されたい。
リポソームの二重層の厚さおよびプロファイル、ラメラ構造の程度、ならびに取り込まれたＧＬＡの量についての定量的情報を、Ａａｒｈｕｓ大学に設置され、液体Ｇａ金属ジェットＸ線源（Ｅｘｃｉｌｌｕｍ）（Ｓｃｈｗａｍｂｅｒｇｅｒ、Ａ．ｅｔ ａｌ．２０１５）および散乱なしスリット（Ｌｉ、Ｙ．、ｅｔ ａｌ．２００８）を備えたＢｒｕｋｅｒ ＡＸＳからの最適化ＮａｎｏＳＴＡＲ ＳＡＸＳ器具（Ｐｅｄｅｒｓｅｎ、Ｊ．Ｓ．、２００４）上で小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）を用いて調査した。水中のＧＬＡ（１ｍｇ ｍＬ－１）およびそれらの分散媒質中のリポソームまたはハイブリッドリポソーム（１．５ｍｇ ｍＬ－１）（水または４％ ＥｔＯＨおよび０．８％ ＤＭＳＯ ｖ／ｖを含む水）を測定し、一致するバックグラウンドを差し引いて、水を絶対スケール校正に使用した。測定の前に、ＡＬＶ－６０１０／ＥＰＰマルチタウデジタル相関器を備えたＡＬＶ／ＣＧＳ－８Ｆゴニオメーターを備えたＡＬＶ器具（ＡＬＶ、Ｌａｎｇｅｎ、ドイツ）上でＡａｒｈｕｓ中のＤＬＳを実施することによって、出荷中の試料の変化をチェックしたことに留意されたい。
【0123】
〔ナノベシクルの安定性：〕
リポソーム系の４℃での安定性に続いて、前述のようにＤＬＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ； Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、異なる時点（作製の１、７、１４、および３１日後）でのナノベシクルのサイズ、多分散指数（ＰＤＩ）およびζ電位を測定した。
リポソーム系の４℃での安定性に続いて、前述のようにＤＬＳ装置（Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ； Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、異なる時点（作製の１、７、１４、および３１日後）でのナノベシクルのサイズ、多分散指数（ＰＤＩ）およびζ電位を測定した。
【0124】
〔酵素の定量および捕捉効率：〕
捕捉効率（ＥＥ％）は、透析濾過によって遊離ＧＬＡを除去した後のナノベシクル中に封入された酵素の量（プロトタイプＬｏａｄｅｄ、Ｌと称する）を、それらの作製直後に得られた原料バッチ中に存在する初期ＧＬＡの量（プロトタイプＴｏｔａｌ、Ｔと称する）と比較することによって決定した（式（１）を参照されたい）。遊離ＧＬＡの除去後のリポソームに負荷されたＧＬＡの量を、ベシクルの膜成分の総量と比較することによって、ＧＬＡ負荷量を計算した（式（２）参照）。
ＥＥ％＝（質量ＧＬＡ Ｌｏａｄｅｄ ／質量ＧＬＡ Ｔｏｔａｌ）×１００ （式１）
ＧＬＡ負荷＝質量ＧＬＡ Ｌｏａｄｅｄ ／質量膜成分 （式２）
統計は、Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）１７統計ソフトウェア（２０１３）を使用して、２試料ｔ検定によって行った。
捕捉効率（ＥＥ％）は、透析濾過によって遊離ＧＬＡを除去した後のナノベシクル中に封入された酵素の量（プロトタイプＬｏａｄｅｄ、Ｌと称する）を、それらの作製直後に得られた原料バッチ中に存在する初期ＧＬＡの量（プロトタイプＴｏｔａｌ、Ｔと称する）と比較することによって決定した（式（１）を参照されたい）。遊離ＧＬＡの除去後のリポソームに負荷されたＧＬＡの量を、ベシクルの膜成分の総量と比較することによって、ＧＬＡ負荷量を計算した（式（２）参照）。
ＥＥ％＝（質量ＧＬＡ Ｌｏａｄｅｄ ／質量ＧＬＡ Ｔｏｔａｌ）×１００ （式１）
ＧＬＡ負荷＝質量ＧＬＡ Ｌｏａｄｅｄ ／質量膜成分 （式２）
統計は、Ｍｉｎｉｔａｂ（登録商標）１７統計ソフトウェア（２０１３）を使用して、２試料ｔ検定によって行った。
【0125】
これらの試料のそれぞれにおける組換え酵素濃度を検出および定量するために、ＳＤＳ－ＰＡＧＥを、ＴＧＸ Ｓｔａｉｎ－Ｆｒｅｅ（商標）ＦａｓｔＣａｓｔ（商標）アクリルアミド１２％ゲル（Ｂｉｏ－Ｒａｄ、参照番号１６１－１８５）を使用することによって行った。蛍光バンドを可視化するために、ＣｈｅｍｉＤｏｃ（商標）Ｔｏｕｃｈ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用した。ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよび光活性化後のデンシトメトリーによってＧＬＡタンパク質量を推定し、既知量の制御Ｈｉｓタグ付きＧＬＡを生成し、精製し、社内で定量した。定量的に比較される試料および標準を、同じゲル中で流し、データセットとして処理した。バンドの密度測定分析は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂ（商標）ソフトウェア（バージョン５．２．１．、Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を用いて行った。
【0126】
〔ｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素活性：〕
ＧＬＡ酵素活性は、以前に記載されたように（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）、Ｄｅｓｎｉｃｋ ．ｅｔ ａｌ．１９７３によって最初に記載された蛍光測定法を用いて、Ｍａｙｅｓ ．ｅｔ ａｌ．１９８１の改変を用いてアッセイした。プロトコールは、アッセイ緩衝液（０．０１Ｍ酢酸、０．０１Ｍ酢酸塩、ｐＨ ４．５）中の基質（２．４６×１０－３Ｍ）として４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－ガラクトピラノシド（４－ＭＵＧ、Ｍ－７６３３ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用を含んでいた。グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ １０．４）で反応を停止させ、放出された生成物（４－メチルウンベリフェロンまたは４－ＭＵ）を蛍光測定（λｅｘｃ＝３６５ｎｍ、λｅｍ＝４５０ｎｍ）で測定し、回帰プロットを用いて蛍光測定値を４－ＭＵ μｍｏｌに変換し、時間およびタンパク質量ごとに調整した。
ＧＬＡ酵素活性は、以前に記載されたように（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）、Ｄｅｓｎｉｃｋ ．ｅｔ ａｌ．１９７３によって最初に記載された蛍光測定法を用いて、Ｍａｙｅｓ ．ｅｔ ａｌ．１９８１の改変を用いてアッセイした。プロトコールは、アッセイ緩衝液（０．０１Ｍ酢酸、０．０１Ｍ酢酸塩、ｐＨ ４．５）中の基質（２．４６×１０－３Ｍ）として４－メチルウンベリフェリルα－Ｄ－ガラクトピラノシド（４－ＭＵＧ、Ｍ－７６３３ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の使用を含んでいた。グリシン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ １０．４）で反応を停止させ、放出された生成物（４－メチルウンベリフェロンまたは４－ＭＵ）を蛍光測定（λｅｘｃ＝３６５ｎｍ、λｅｍ＝４５０ｎｍ）で測定し、回帰プロットを用いて蛍光測定値を４－ＭＵ μｍｏｌに変換し、時間およびタンパク質量ごとに調整した。
【0127】
〔ｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性アッセイ：〕
リソソームに到達し、Ｇｂ３を加水分解するＧＬＡ負荷ナノベシクルの能力を、ＧＬＡ欠損マウス（ＧｌａｔｍＫｕｌ１）由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）の初代培養物において試験した（Ｏｓｈｉｍａ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９９７）。これらの細胞を、ＩＣＴＳ ＮＡＮＢＩＯＳＩＳのｉｎ ｖｉｖｏ実験プラットフォーム／Ｕ２０で単離し、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ヘパリン（０．１ｍｇ ｍＬ－１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）（０．０５ｍｇ ｍＬ－１、ＢＤ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ ｍＬ－１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびウシ胎仔血清（１０～２０％、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、以前に記載されたように増殖させ（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）、内皮細胞の増殖を可能にした。継代２～５の細胞を、コンフルエンスの６０～８０％まで２４ウェルプレートに播種し、Ｇｂ３－ＮＢＤ（０．８×１０－６Ｍ、Ｍａｔｒｅｙａ）と共に、指定された濃度の試験化合物と共にインキュベートした。４８時間後、Ｇｂ３－ＮＢＤ蛍光シグナルを、生細胞（７－アミノアクチノマイシンＤ染色陰性）中のフローサイトメトリー（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。対照細胞（処理なし）における蛍光シグナルを１００％として確立し、Ｇｂ３損失値の割合（％Ｇｂ３損失値＝１００－％Ｇｂ３－ＮＢＤシグナル）を用いて結果をプロットした。
リソソームに到達し、Ｇｂ３を加水分解するＧＬＡ負荷ナノベシクルの能力を、ＧＬＡ欠損マウス（ＧｌａｔｍＫｕｌ１）由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）の初代培養物において試験した（Ｏｓｈｉｍａ、Ｔ．ｅｔ ａｌ．１９９７）。これらの細胞を、ＩＣＴＳ ＮＡＮＢＩＯＳＩＳのｉｎ ｖｉｖｏ実験プラットフォーム／Ｕ２０で単離し、非必須アミノ酸（Ｇｉｂｃｏ）、ヘパリン（０．１ｍｇ ｍＬ－１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、内皮細胞増殖サプリメント（ＥＣＧＳ）（０．０５ｍｇ ｍＬ－１、ＢＤ）、ヒドロコルチゾン（１μｇ ｍＬ－１、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）およびウシ胎仔血清（１０～２０％、Ｇｉｂｃｏ）を補充したＲＰＭＩ培地中で、以前に記載されたように増殖させ（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）、内皮細胞の増殖を可能にした。継代２～５の細胞を、コンフルエンスの６０～８０％まで２４ウェルプレートに播種し、Ｇｂ３－ＮＢＤ（０．８×１０－６Ｍ、Ｍａｔｒｅｙａ）と共に、指定された濃度の試験化合物と共にインキュベートした。４８時間後、Ｇｂ３－ＮＢＤ蛍光シグナルを、生細胞（７－アミノアクチノマイシンＤ染色陰性）中のフローサイトメトリー（ＦａｃｓＣａｌｉｂｕｒ、Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）によって分析した。対照細胞（処理なし）における蛍光シグナルを１００％として確立し、Ｇｂ３損失値の割合（％Ｇｂ３損失値＝１００－％Ｇｂ３－ＮＢＤシグナル）を用いて結果をプロットした。
【0128】
〔ｉｎ ｖｉｔｒｏ毒性：〕
ＨｅＬａ細胞に対する３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いて、細胞の細胞傷害性を試験した（Ｂｏｔｅｌｌａ Ｐ ．ｅｔ ａｌ．２０１１）。簡潔に述べると、２，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、接着させ、次いで異なる投与のナノベシクルに７２時間曝露した。次いで、ＰＢＳ中のＭＴＴ溶液（５ｍｇ ｍＬ－１）をウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。活性ミトコンドリアによるＭＴＴ減少から生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、５９０ｎｍで分光光度的に測定した（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８００ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｉｚａｓａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。データは、未処理対照群の細胞生存率と比較した生存細胞の割合として表した。
ＨｅＬａ細胞に対する３－（４，５－ジメチルチアゾール－２－イル］－２，５－ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）を用いて、細胞の細胞傷害性を試験した（Ｂｏｔｅｌｌａ Ｐ ．ｅｔ ａｌ．２０１１）。簡潔に述べると、２，０００個の細胞を９６ウェルプレートに播種し、接着させ、次いで異なる投与のナノベシクルに７２時間曝露した。次いで、ＰＢＳ中のＭＴＴ溶液（５ｍｇ ｍＬ－１）をウェルに添加し、さらに４時間インキュベートした。活性ミトコンドリアによるＭＴＴ減少から生じたホルマザン結晶をＤＭＳＯで溶解し、５９０ｎｍで分光光度的に測定した（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８００ Ａｂｓｏｒｂａｎｃｅ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ、Ｉｚａｓａ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。データは、未処理対照群の細胞生存率と比較した生存細胞の割合として表した。
【0129】
〔Ｉｎ ｖｉｔｒｏ血液適合性：〕
ナノ系の血液適合性を試験するために、２つのタイプのアッセイを実施した。一方では、赤血球の完全性に対するそれらの効果を、溶血試験を用いて測定した（Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ、Ｍ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．２０１６）。一方、血漿凝固時間を分析することにより、血液凝固に対するそれらの潜在的干渉を研究した。詳細には、溶血試験のために、マウス赤血球（ＲＢＣ）を３つの野性タイプＣ５７ＢＬ６マウスから隔離し、ＰＢＳの２％（ｖ／ｖ）に再懸濁し、重複中、３７℃で１ｈの間に異なる濃度の試験化合物に曝露した。放出されたヘモグロビンの量を、遠心分離（１０００ｇ、１０分）後、分光光度計において４０５ｎｍ（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８００）で測定した。吸収値は、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘと共にＲＢＣをインキュベートした後に得られた１００％溶血の陽性対照とした。５％未満の試料は、非溶血性であるとみなされた。
ナノ系の血液適合性を試験するために、２つのタイプのアッセイを実施した。一方では、赤血球の完全性に対するそれらの効果を、溶血試験を用いて測定した（Ｇｉａｎｎｏｔｔｉ、Ｍ．Ｉ．ｅｔ ａｌ．２０１６）。一方、血漿凝固時間を分析することにより、血液凝固に対するそれらの潜在的干渉を研究した。詳細には、溶血試験のために、マウス赤血球（ＲＢＣ）を３つの野性タイプＣ５７ＢＬ６マウスから隔離し、ＰＢＳの２％（ｖ／ｖ）に再懸濁し、重複中、３７℃で１ｈの間に異なる濃度の試験化合物に曝露した。放出されたヘモグロビンの量を、遠心分離（１０００ｇ、１０分）後、分光光度計において４０５ｎｍ（Ｂｉｏｔｅｋ ＥＬｘ８００）で測定した。吸収値は、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘと共にＲＢＣをインキュベートした後に得られた１００％溶血の陽性対照とした。５％未満の試料は、非溶血性であるとみなされた。
【0130】
血漿凝固におけるナノベシクルの効果を、以前に報告されたように（Ｒａｆａｅｌ、Ｄ．、ｅｔ ａｌ．２０１８）、Ｓｔａｒｔ４装置（Ｓｔａｇｏ、Ｆｒａｎｃｅ）を使用し、製造業者のプロトコールに従って、活性化部分トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、およびトロンビン時間（ＴＴ）を決定するために試験した。値を、正常な基準時間範囲と比較した。ＡＰＴＴアッセイを用いて内因性経路を評価したが、プロトロンビン時間（ＰＴ）アッセイは外因性経路の尺度であった。外因性および内因性経路は共通経路に収束した。トロンビン時間（ＴＴ）は、最終共通経路の機能性のインジケータであった。
【0131】
〔ｉｎ ｖｉｖｏ毒性：〕
ＭＫＣ含有ナノベシクルの反復投与の実現可能性を試験するために、３つの異なる用量（１回の投与あたり０．３７、１．２２および３．６７ｍｇ脂質）でのハイブリッドリポソームの８回の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の効果を、ヘテロ接合性（ＧｌａｔｍＫｕｌ１）（Ｏｓｈｉｍａ、Ｔ．、ｅｔ ａｌ．１９９７）で維持された我々のＧＬＡトランスジェニックコロニーから得られた野生型Ｃ５７ＢＬ６雌マウス（２２～３８ｇ）において試験した。動物医療はＶａｌｌ ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙの実験動物の医療および使用のためのガイドに従って取り扱い、動物実験のためにＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵに従った。正確な実験手順は、施設および地域政府の動物実験倫理委員会によって承認された（参照番号９５７２）。
ＭＫＣ含有ナノベシクルの反復投与の実現可能性を試験するために、３つの異なる用量（１回の投与あたり０．３７、１．２２および３．６７ｍｇ脂質）でのハイブリッドリポソームの８回の静脈内（ｉ．ｖ．）投与の効果を、ヘテロ接合性（ＧｌａｔｍＫｕｌ１）（Ｏｓｈｉｍａ、Ｔ．、ｅｔ ａｌ．１９９７）で維持された我々のＧＬＡトランスジェニックコロニーから得られた野生型Ｃ５７ＢＬ６雌マウス（２２～３８ｇ）において試験した。動物医療はＶａｌｌ ｄ’Ｈｅｂｒｏｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ａｎｉｍａｌ Ｆａｃｉｌｉｔｙの実験動物の医療および使用のためのガイドに従って取り扱い、動物実験のためにＥＵ指令２０１０／６３／ＥＵに従った。正確な実験手順は、施設および地域政府の動物実験倫理委員会によって承認された（参照番号９５７２）。
【0132】
ＭＡＥＣ取得および血液適合性アッセイを含む、動物または動物に由来する試料を用いた全ての研究は、ＣＩＢＥＲ－ＢＢＮのｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ ｏｆ ｔｈｅ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ＆ Ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ （ＦＶＰＲ） ａｒｅａ （Ｕ２０ Ｉｎ ｖｉｖｏ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｐｌａｔｆｏｒｍ， Ｎａｎｂｉｏｓｉｓ， Ｂａｒｃｅｌｏｎａ， スペイン）にて、ＩＣＴＳ ＮＡＮＢＩＯＳＩＳによって行われた。
【0133】
〔アッセイ状態におけるナノ構造化製剤の安定性：〕
４－ＭＵＧ基質（２．４６×１０－３Ｍ）、３７℃、６０分を含む、酢酸緩衝液（０．０１Ｍ酢酸、０．０１Ｍ酢酸塩、ｐＨ ４．５）中で１：１６００に希釈したアッセイ状態におけるナノ構造化製剤の安定性もチェックした。アッセイ条件においてナノ構造化されたナノ粒子の完全性を、ＤＬＳおよびナノ粒子追跡分析－ナノサイト（ＮＴＡ）によって評価した。ＮＴＡ （Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ、英国、ｓＣＭＯＳカメラおよび４８８ｎｍレーザを装備）は粒子を個々に追跡し、それらの流体力学的直径ならびに粒子濃度を計算するためにストークス・アインシュタイン方程式を使用する。１００μｍ×８０μｍ×１０μｍの視野内でブラウン運動下にて移動する粒子のビデオを記録し、ＮＴＡソフトウェアによって分析した。ナノベシクルの平均サイズ、ＰＤＩ、および粒子濃度をアッセイした。
４－ＭＵＧ基質（２．４６×１０－３Ｍ）、３７℃、６０分を含む、酢酸緩衝液（０．０１Ｍ酢酸、０．０１Ｍ酢酸塩、ｐＨ ４．５）中で１：１６００に希釈したアッセイ状態におけるナノ構造化製剤の安定性もチェックした。アッセイ条件においてナノ構造化されたナノ粒子の完全性を、ＤＬＳおよびナノ粒子追跡分析－ナノサイト（ＮＴＡ）によって評価した。ＮＴＡ （Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ ＮＳ３００、Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｕｍｅｎｔｓ、英国、ｓＣＭＯＳカメラおよび４８８ｎｍレーザを装備）は粒子を個々に追跡し、それらの流体力学的直径ならびに粒子濃度を計算するためにストークス・アインシュタイン方程式を使用する。１００μｍ×８０μｍ×１０μｍの視野内でブラウン運動下にて移動する粒子のビデオを記録し、ＮＴＡソフトウェアによって分析した。ナノベシクルの平均サイズ、ＰＤＩ、および粒子濃度をアッセイした。
【0134】
〔ヒト血清中の（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰの安定性〕
ヒト血清中の１２倍濃縮（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰの安定性を、濁度測定によって測定し、これにより、経時的な系の変化のモニタリングが可能になった。濁度測定法により、透過率、したがって光の減衰を測定することが可能であった。経時的な透過率の変化は例えば、沈降またはナノ粒子サイズの増加が生じた場合、懸濁液の変化のインジケータとして作用し得る。次いで、吸光度が透過率に対して対数関係を有するので、濁度を吸光度によって評価することができる。
ヒト血清中の１２倍濃縮（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰの安定性を、濁度測定によって測定し、これにより、経時的な系の変化のモニタリングが可能になった。濁度測定法により、透過率、したがって光の減衰を測定することが可能であった。経時的な透過率の変化は例えば、沈降またはナノ粒子サイズの増加が生じた場合、懸濁液の変化のインジケータとして作用し得る。次いで、吸光度が透過率に対して対数関係を有するので、濁度を吸光度によって評価することができる。
【0135】
１２倍濃縮（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ系を、２つの異なる濃度のヒト血清（Ｈ４５２２、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ）、７５％および９０％（ｖｏｌ ％）と共に、４８ウェルプレート中で３回インキュベートした。次いで、試料をオービタルシェーカー撹拌中、３７℃でインキュベートし、０分、１５分、３０分、６０分、９０分、および１２０分で分析した。各時点で、試料の吸光度をλ＝３００ｎｍ（Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ ｒｅａｄｅｒ Ｉｎｆｉｎｉｔｅ ２００ Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）で読み取り、対応する量の血清のみを参照として用いた。相対濁度を、試料濁度を時間ゼロでの濁度で割って決定した（式Ｓ１）。有意な変化は観察されなかった。
【0136】
さらに、濃縮（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰを５０％（体積％）のヒト血清（１時間、３７℃、オービタルシェーカーによる撹拌）と共にインキュベートした。肉眼的外観は観察されなかった。次いで、リポソームの完全性もｃｒｙｏＴＥＭ画像によって評価し、血清の存在下でのリポソームベシクル構造の安定性を実証した。
【0137】
〔ベシクル当たりのＧＬＡの理論数：〕
ヒトＧＬＡは４８．８ｋＤａの単量体重量を有するホモ二量体酵素であるため、ＧＬＡ全体は１００ＫＤａの近似分子量を示した。取り込まれていないＧＬＡが除去されたので、透析濾過（Ｌｏａｄｅｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）による精製後に、以下の理論的（表１）および実験的（表２）な系データを用いて、ナノベシクル当たりのホモ二量体ＧＬＡ単位の理論的数を、近似されたアプローチで計算した。ＬＰ－ＧＬＡ不安定性の問題およびＭＱ－ＧＬＡクアトソームのためのＳＡＸＳ技術の不適切さのために、ＨＬＰ－ＧＬＡハイブリッドリポソームについてこれらの計算を行うことしかできなかった。
ヒトＧＬＡは４８．８ｋＤａの単量体重量を有するホモ二量体酵素であるため、ＧＬＡ全体は１００ＫＤａの近似分子量を示した。取り込まれていないＧＬＡが除去されたので、透析濾過（Ｌｏａｄｅｄ ｐｒｏｔｏｔｙｐｅ）による精製後に、以下の理論的（表１）および実験的（表２）な系データを用いて、ナノベシクル当たりのホモ二量体ＧＬＡ単位の理論的数を、近似されたアプローチで計算した。ＬＰ－ＧＬＡ不安定性の問題およびＭＱ－ＧＬＡクアトソームのためのＳＡＸＳ技術の不適切さのために、ＨＬＰ－ＧＬＡハイブリッドリポソームについてこれらの計算を行うことしかできなかった。
【0138】
【表1】
【0139】
【表2】
【0140】
【数1】
【0141】
〔統計学的分析：〕
特に明記しない限り、すべての結果を、いくつかの実験反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。ＡＮＯＶＡ試験、スチューデントｔ検定または同等のノンパラメトリック検定を使用して、Ｐｒｉｓｍ ６．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、異なる製剤間の差異を調査した。統計的差異は、得られたｐ値に従って、有意（ｐ＜０．０５、＊）、非常に有意（ｐ＜０．０１，＊＊）または極めて有意（ｐ＜０．００１，＊＊＊）であると認められた。
特に明記しない限り、すべての結果を、いくつかの実験反復の平均値±標準偏差（ＳＤ）として表した。ＡＮＯＶＡ試験、スチューデントｔ検定または同等のノンパラメトリック検定を使用して、Ｐｒｉｓｍ ６．０２ソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｉｎｃ．、ＣＡ、ＵＳＡ）を使用して、異なる製剤間の差異を調査した。統計的差異は、得られたｐ値に従って、有意（ｐ＜０．０５、＊）、非常に有意（ｐ＜０．０１，＊＊）または極めて有意（ｐ＜０．００１，＊＊＊）であると認められた。
【0142】
〔結果：〕
〔１．１ ナノベシクルのキャラクタリゼーション：〕
３つの異なる膜組成物を使用してＧＬＡ－ナノベシクル系を得、すべてｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤで官能化して、内皮細胞において過剰発現されたαｖβ３－インテグリンの認識を可能にした（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に説明されているように）。第１の製剤は、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤから構成され、リポソーム（ＬＰ）を生じた。第２の製剤は、コレステロール、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、およびｈ－ＭＫＣ（材料および方法の節で説明したように５０％を超えるＭＫＣ）から構成され、クアトソーム（ＭＱ）を形成した。第３の系については、少量のＭＫＣを、３つの異なるｌ－ＭＫＣ濃度：０．４、２．２、および４．３ｍｏｌ％でリポソーム製剤に添加し、正に荷電した膜を有するハイブリッドリポソーム（ＨＬＰ）の生成を可能にした。すべてのＧＬＡ負荷系（それぞれＬＰ－ＧＬＡ２０、ＭＱ－ＧＬＡ２０、およびＨＬＰ－ＧＬＡ２０と名付けた）を、同じ初期理論ＧＬＡ濃度、すなわち２０μｇ／ｍｌを用いて調製した。８．５μｇ／ｍｌの低ＧＬＡ濃度で追加のＨＬＰ－ＧＬＡ８．５系を調製して、ＭＱ－ＧＬＡ２０と同じ３．４μｇ μｍｏｌ－１の酵素および膜成分比率を得た（表３参照）。全てのナノベシクルは、実験の節に記載されたＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ製造経路を用いて調製した。
〔１．１ ナノベシクルのキャラクタリゼーション：〕
３つの異なる膜組成物を使用してＧＬＡ－ナノベシクル系を得、すべてｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤで官能化して、内皮細胞において過剰発現されたαｖβ３－インテグリンの認識を可能にした（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に説明されているように）。第１の製剤は、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤから構成され、リポソーム（ＬＰ）を生じた。第２の製剤は、コレステロール、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤ、およびｈ－ＭＫＣ（材料および方法の節で説明したように５０％を超えるＭＫＣ）から構成され、クアトソーム（ＭＱ）を形成した。第３の系については、少量のＭＫＣを、３つの異なるｌ－ＭＫＣ濃度：０．４、２．２、および４．３ｍｏｌ％でリポソーム製剤に添加し、正に荷電した膜を有するハイブリッドリポソーム（ＨＬＰ）の生成を可能にした。すべてのＧＬＡ負荷系（それぞれＬＰ－ＧＬＡ２０、ＭＱ－ＧＬＡ２０、およびＨＬＰ－ＧＬＡ２０と名付けた）を、同じ初期理論ＧＬＡ濃度、すなわち２０μｇ／ｍｌを用いて調製した。８．５μｇ／ｍｌの低ＧＬＡ濃度で追加のＨＬＰ－ＧＬＡ８．５系を調製して、ＭＱ－ＧＬＡ２０と同じ３．４μｇ μｍｏｌ－１の酵素および膜成分比率を得た（表３参照）。全てのナノベシクルは、実験の節に記載されたＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ製造経路を用いて調製した。
【0143】
得られたナノベシクルの組成を以下の表３に記載し、それらの物理化学的特性を以下の表４に記載する。
【0144】
【表3】
【0145】
【表4】
【0146】
〔１．２ ＭＫＣは、ナノベシクルのコロイド安定性およびＧＬＡ捕捉効率を改善した〕
Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されているものと同様のＧＬＡ負荷リポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ２０）を調製したが、市販のアガルシダーゼアルファ（リプレガル（登録商標））を高品質、タグフリーのモデル酵素として使用し、また、社内で製造されたＨｉｓタグＧＬＡの代わりに、すでに承認され商品化されているＧＬＡを使用し、同様の低酵素捕捉効率を得るが、以前に報告された系（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）よりも不安定であった。市販のＧＬＡを捕捉すると、ＬＰ－ＧＬＡ２０は、ＬＰおよび以前に評価された系（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）と比較して、より高い平均粒径およびより広い粒径分布を示し、また、有意に高い多分散性指数によって反映された。加えて、ＬＰ－ＧＬＡ２０は、低い負のζ電位値、すなわち、それらの安定性に直接的な負の影響を有する事実を示した。具体的には、これらのＬＰ－ＧＬＡ２０リポソームは、製造後数日で沈降した。
Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されているものと同様のＧＬＡ負荷リポソーム（ＬＰ－ＧＬＡ２０）を調製したが、市販のアガルシダーゼアルファ（リプレガル（登録商標））を高品質、タグフリーのモデル酵素として使用し、また、社内で製造されたＨｉｓタグＧＬＡの代わりに、すでに承認され商品化されているＧＬＡを使用し、同様の低酵素捕捉効率を得るが、以前に報告された系（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）よりも不安定であった。市販のＧＬＡを捕捉すると、ＬＰ－ＧＬＡ２０は、ＬＰおよび以前に評価された系（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）と比較して、より高い平均粒径およびより広い粒径分布を示し、また、有意に高い多分散性指数によって反映された。加えて、ＬＰ－ＧＬＡ２０は、低い負のζ電位値、すなわち、それらの安定性に直接的な負の影響を有する事実を示した。具体的には、これらのＬＰ－ＧＬＡ２０リポソームは、製造後数日で沈降した。
【0147】
比較して、ＭＱ製剤は、約７０ｎｍの狭いサイズ分布および有意に小さい平均サイズを示した。特に、それらの物理化学的性質は、ＧＬＡが系（ＭＱ－ＧＬＡ２０）に組み込まれたときにも維持された。
【0148】
すべての３つのＨＬＰ系（表４参照）は直径が約１１０ｎｍの小さなベシクルを形成し、ＭＱベシクルよりもわずかに大きいが、依然として狭いサイズ分布を有していた。ζ電位値はＭＫＣ濃度と直接相関し、より多くのＭＫＣを構造に添加すると増加した。ＭＫＣの添加は、ＧＬＡが捕捉された場合（ＨＬＰ－ＧＬＡ２０系）でも高い陽性のζ電位値を維持したが、ＧＬＡ（ＨＬＰ）の非存在下で得られた値よりわずかに低い値であった。ナノ製剤の安定性は、カチオン性ＭＫＣ界面活性剤を含有するＭＱ－ＧＬＡ２０およびＨＬＰ－ＧＬＡ２０を、非含有ＭＫＣ ＬＰ－ＧＬＡ２０系と比較した場合に明瞭に観察されたが、これは第１の系の製造後１ヶ月までベシクル沈降が観察されなかったためである。ＭＫＣ含有系の著しい安定性は、それらのサイズ、ＰＤＩ、およびζ電位の経時的変化をモニターすることによっても観察された（図１）。
【0149】
次に、ナノベシクル中のＧＬＡの濃度をＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびデンシトメトリー分析（表４に示される各ナノベシクル系についてのＧＬＡ濃度）によって定量し、それに基づいて、捕捉効率（ＥＥ％）およびＧＬＡ負荷を決定した（実験の節を参照されたい）。図２に見られるように、ＭＫＣは、ナノ製剤へのＧＬＡの組み込み能力において重要な役割を果たした。遊離ＭＫＣ ＬＰ－ＧＬＡ２０（ＥＥ～３０％）と比較して、ＭＱ－ＧＬＡ２０（ＥＥ＞８０％）において有意に高い捕捉効率が達成された。前述のように、第四級アンモニウム界面活性剤ＭＫＣはＭＱ－ＧＬＡ２０製剤の主な膜成分であり、その結果、膜中のより高いカチオン性表面電荷をもたらし、静電相互作用によるＧＬＡのより高い捕捉を誘導した。図２に示されるように、ハイブリッドリポソーム系において同様の効果が見出され、ＨＬＰ－ＧＬＡ２０系において、ＥＥおよびＧＬＡ負荷は、存在するＭＫＣの量と直接相関した。（０．４％ＭＫＣ）‐ＨＬＰ－ＧＬＡ２０（最低ＭＫＣ濃度）について、２３±５％の捕捉効率が得られ、ＬＰ－ＧＬＡ２０に匹敵し、これは、ＭＫＣ添加によって与えられる物理化学的特性（サイズ、ＰＤＩ、および安定性）の改善にもかかわらず、ＥＥの改善を達成するためにより多くの静電相互作用が必要であることを示唆する。より高いＭＫＣレベル、（２．２％ＭＫＣ）‐ＨＬＰ－ＧＬＡ２０および（４．３％ＭＫＣ）‐ＨＬＰ－ＧＬＡ２０を有する製剤では、それぞれ６０±２０％および１００±２０％までの著しく改善されたＥＥが検出された。しかし、（４．３％ＭＫＣ）‐ＨＬＰ－ＧＬＡ２０とＭＱ－ＧＬＡ２０のＥＥ％間の差は２０μｇ／ｍｌのこの特異的ＧＬＡ濃度で統計的に有意ではなく、ＭＫＣ濃度≧４．３ｍｏｌ％によって提供される静電相互作用はこの量のＧＬＡを捕捉するのに十分以上であることを示した。
【0150】
ＳＡＸＳを使用して、リポソーム形態の変化のさらなる理解を得た。最初に、ＧＬＡが負荷リポソーム試料中の全散乱信号に有意に寄与したので、遊離ＧＬＡからの散乱を調べた。ＧＬＡの既知の二量体結晶構造（ＰＤＢ： １ｒ４６２６、χ２＝１．８）に基づいて、純粋な酵素のＳＡＸＳデータにｒｉｇｉｄ－ｂｏｄｙ ｒｅｆｉｎｅされた二量体構造（Ｓｔｅｉｎｅｒ、Ｅ．Ｍ．、ｅｔ ａｌ．２０１８）をフィッティングすることができた。フィッティングは絶対スケールで行い、１．１０ｍｇ ｍＬ－１の濃度推定値を得た（全てのＧＬＡが二量体形態であると仮定する）これは、市販のＧＬＡ試料の１ｍｇ ｍＬ－１の濃度よりもわずかに高かった。低散乱ベクトル係数ｑにおける強度のわずかな増加は、試料中のわずかな凝集を示唆し得、いくぶん高い濃度推定値をもたらす。ナノ製剤では、ＳＡＸＳデータは、二重層膜の断面プロファイルにわたる電子密度の変動から生じる、リポソームに典型的な中間体ｑにおける特性最小値を示した。データは、Ｐａｂｓｔ ．ｅｔ ａｌ．２０００および２００３に基づくパラクリスタルモデル（Ｈｏｓｅｍａｎｎ、Ｒ．ｅｔ ａｌ．１９６３）に適合させ、層の平均数（Ｎ層）および二層の厚さ（Ｔ）を決定することができる。データをフィッティングするとき、良好なフィッティングを得るために、ポリマー散乱からのさらなる寄与を含めなければならないことが観察された（表５）。ＧＬＡ（ＬＰおよびＨＬＰ）を含まない試料では、この散乱寄与は一定であり、おそらく膜表面上の可撓性ｃｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤから生じる。したがって、ＧＬＡを含有する試料については、ポリマー散乱は、ＧＬＡフリーフィットから得られた平均値に固定された。ＬＰ－ＧＬＡ２０およびＨＬＰ－ＧＬＡ２０ではＧＬＡは散乱パターンにも寄与し、したがって、遊離ＧＬＡからの理論的信号はそれ自体の個々のスケール因子との線形結合を通してリポソーム散乱に加えられた。ポリマーおよびＧＬＡからの散乱寄与は小さく、ある程度相関していたが、ＳＡＸＳを用いてＧＬＡ濃度を決定することはこのアプローチによってなお可能であり、これは理論的に計算されたＧＬＡ濃度とかなりよく一致した（表５）。
【0151】
【表5】
【0152】
ＭＫＣ濃度の増加は、ＧＬＡ含有（５１．０Åから４９．３Å）およびＧＬＡ非含有（５１．５Åから４８．５Å）リポソームの両方で二重層厚さ（Ｔ）をわずかに減少させた。さらに、ＭＫＣを有する試料では、ＧＬＡが添加されたときにＴはわずかに高く、このことは、タンパク質が、正に荷電したリポソーム表面に結合し、それによって見かけの二重層の厚さを増加させる可能性があることを示唆している。ＬＰとＬＰ－ＧＬＡ２０の両方は、ＭＫＣがリポソームに導入されるにつれて減少する多層を示し、おそらく、ＨＬＰとＨＬＰ－ＧＬＡ２０と比較して、ＬＰとＬＰ－ＧＬＡ２０で観察された一般的なより低い安定性と初期沈降の効果である。
【0153】
ｃｒｙｏ－ＴＥＭによるナノベシクルの直接分析は、ＳＡＸＳ分析と完全に一致した（図３）。ナノ製剤は予想されたように大部分が単層であり、サイズがかなり均一であった。ＬＰ－ＧＬＡおよびＨＬＰ－ＧＬＡ８．５ナノベシクルは直径が約１２０ｎｍであり、ＭＱ－ＧＬＡ２０ナノベシクルはより小さく、平均して直径が６０～７０ｎｍであり、全て表３に示されるＤＬＳデータと優れた一致を示した。ｃｒｙｏ－ＴＥＭは個々のナノベシクルを示したので、いくつかの二重層構造を有する特定の多分散性が認められたが、全体的かつＳＡＸＳ分析と一致して、ベシクルは高度の単層性を示した。
【0154】
全体として、物理化学的性質は、クアトソームおよびハイブリッドリポソームの両方がＧＬＡ酵素の潜在的担体としてのさらなる探索のための有望な系であることを示した。カチオン性界面活性剤の存在による膜の正電荷の増加はより狭くより単分散のサイズ分布をもたらし、コロイド安定性の著しい改善を伴った。これは、ＭＫＣフリー系（ＬＰ－ＧＬＡ２０）で見られる初期の不安定化現象を修正し、ＭＱ－ＧＬＡ２０およびＨＬＰ－ＧＬＡ系をさらなる審査に適したものにした。特に重要なのは、ＬＰ－ＧＬＡ２０と比較して、ＧＬＡ捕捉効率の２倍の増加であった。これは、酵素ナノ製剤における大きな進歩であり、ナノベシクルへの大きな生体高分子の高いまたは完全な組み込みを得ることはしばしば非常に困難であった。
【0155】
〔１．３． ＧＬＡの比酵素活性は、ＭＫＣを３０％モル未満で使用した場合に増加した〕
ナノベシクルに結合したＧＬＡ酵素の特異的酵素活性を、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に従う蛍光アッセイを用いて測定した。ＧＬＡはリソソーム酵素であったので、酵素活性アッセイは低ｐＨで起こる必要があった。変化していないカプセル化パターンにわたって酵素活性が測定されたことを確実にするために、ナノ構造化製剤の安定性を、アッセイ条件の酸性培地中で、方法の節で説明した酵素アッセイを実施する前に確認し、ナノベシクルの平均サイズ、ＰＤＩ、および粒子濃度を、有意な変化なしに、酵素アッセイ状態中で維持した。
ナノベシクルに結合したＧＬＡ酵素の特異的酵素活性を、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に従う蛍光アッセイを用いて測定した。ＧＬＡはリソソーム酵素であったので、酵素活性アッセイは低ｐＨで起こる必要があった。変化していないカプセル化パターンにわたって酵素活性が測定されたことを確実にするために、ナノ構造化製剤の安定性を、アッセイ条件の酸性培地中で、方法の節で説明した酵素アッセイを実施する前に確認し、ナノベシクルの平均サイズ、ＰＤＩ、および粒子濃度を、有意な変化なしに、酵素アッセイ状態中で維持した。
【0156】
驚くべきことに、図４Ａに見られるように、結果は、ナノベシクル中のＭＫＣの存在がタンパク質酵素活性に劇的な影響を及ぼすことを示した。ＭＱ－ＧＬＡ２０におけるｈ－ＭＫＣの使用は、最大８０％の酵素活性のかなりの減少を引き起こした。一方、ＭＫＣを使用しない場合（ＬＰ－ＧＬＡ２０系）、酵素活性は市販のＧＬＡの約半分であった（市販されているリプレガル（登録商標）は、一連の賦形剤（ポリソルベート－２０、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウムおよびリン酸一塩基ナトリウム）を最終医薬形態で含む溶液として製剤化された）。市販のＧＬＡ製剤の非含有ＭＫＣリポソームへの封入は酵素をおそらく不安定化し、最初は０．２μｇ／ｍｌの非イオン性ポリソルベート－２０界面活性剤でその元の製剤中で安定化した。
【0157】
興味深いことに、ＨＬＰ－ＧＬＡの場合、リポソーム膜中のｌ－ＭＫＣの存在は、全てのハイブリッドリポソームの酵素活性が、膜中にＭＫＣを含まない市販の遊離酵素およびＬＰ－ＧＬＡ２０の酵素活性を上回るので、ナノ製剤中の酵素活性を実質的に増加させるのに役立った。
【0158】
ＬＰ－ＧＬＡおよびＨＬＰ－ＧＬＡまたはＬＰ－ＧＬＡおよびＭＱ－ＧＬＡ間の統計的比較はそれぞれ極めて有意（ｐ＝０．０００１、＊＊＊）であり、非常に有意（ｐ＝０．００４、＊＊）であった（明確にするために、図４Ａの図中には示されていない）。（０．４％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０を、より高いＭＫＣ含有量を含む他のＨＬＰ－ＧＬＡと比較した場合にのみ有意であるＨＬＰ－ＧＬＡの間の酵素活性に関する統計的比較（ｐ＝０．００４、＊＊）である。
【0159】
純粋なＭＫＣの存在下で、ＨＬＰ－ＧＬＡ製剤中のものと同等の界面活性剤濃度で測定したＧＬＡの酵素活性は、対応する製剤について測定したものよりも低かった（図４Ｂを参照されたい）。この結果は、酵素活性増強が、ｌ－ＭＫＣをその膜中に含有するＨＬＰ－ＧＬＡリポソーム中のＧＬＡの捕捉に関連しており、製剤中のこの界面活性剤の存在のみによるものではないことを指摘した。
【0160】
ハイブリッドリポソーム系は、使用される他のナノベシクル系と比較して、改善されたＧＬＡ負荷、物理化学的安定性、ならびにコンジュゲートＧＬＡのより高い酵素活性に関して驚くべき結果をもたらした。
【0161】
〔１．４． 本発明のリポソームは、安全なｉｎ ｖｉｖｏ毒物学的プロファイルを維持しながら、ＧＬＡ酵素のｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性を増加させた〕
ＨＬＰ－ＧＬＡが細胞に入り、リソソーム内のＧｂ３堆積を減少させる能力を、蛍光標識Ｇｂ３（ＮＢＤ－Ｇｂ３）を添加することによって測定した（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）。このアッセイでは、内因性ＧＬＡ活性を有さないＦａｂｒｙ ＫＯマウス由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）を、異なる濃度のＨＬＰ－ＧＬＡで刺激した。結果として、総Ｇｂ３損失値は、低ｐＨが酵素活性を可能にした、細胞内在化およびリソソーム局在化後のナノベシクルによって担持された酵素の作用のみに起因した。結果は、内因性酵素活性の以前に記載された増加に従って（図４Ｃ）、ならびに以前に公開されたＧＬＡ負荷リポソーム系Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６と一致して、遊離ＧＬＡを用いた実験と比較して、ナノ製剤化酵素のより良好な効力を示した。しかし、以前の系とは異なり、これらの新しいＨＬＰ－ＧＬＡ系はコロイド安定性の増強およびより高いＧＬＡ捕捉効率（ＥＥ≧９０％）を示し、したがって、それらは、前臨床開発の進行段階へのそれらの進行を保証するために、全体的に物理化学的および生物学的要件を満たす、より良好な品質のものであった。
ＨＬＰ－ＧＬＡが細胞に入り、リソソーム内のＧｂ３堆積を減少させる能力を、蛍光標識Ｇｂ３（ＮＢＤ－Ｇｂ３）を添加することによって測定した（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）。このアッセイでは、内因性ＧＬＡ活性を有さないＦａｂｒｙ ＫＯマウス由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）を、異なる濃度のＨＬＰ－ＧＬＡで刺激した。結果として、総Ｇｂ３損失値は、低ｐＨが酵素活性を可能にした、細胞内在化およびリソソーム局在化後のナノベシクルによって担持された酵素の作用のみに起因した。結果は、内因性酵素活性の以前に記載された増加に従って（図４Ｃ）、ならびに以前に公開されたＧＬＡ負荷リポソーム系Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６と一致して、遊離ＧＬＡを用いた実験と比較して、ナノ製剤化酵素のより良好な効力を示した。しかし、以前の系とは異なり、これらの新しいＨＬＰ－ＧＬＡ系はコロイド安定性の増強およびより高いＧＬＡ捕捉効率（ＥＥ≧９０％）を示し、したがって、それらは、前臨床開発の進行段階へのそれらの進行を保証するために、全体的に物理化学的および生物学的要件を満たす、より良好な品質のものであった。
【0162】
ＨＬＰ－ＧＬＡ系の安全性および毒性プロファイルを特徴付けるために、いくつかのｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。最初に、ＨｅＬａ細胞を異なる濃度のＨＬＰ－ＧＬＡに曝露し、ＭＴＴアッセイにより７２時間インキュベーション後に細胞生存率を測定した。細胞生存率は全ての場合において７５％を超えて維持され、ハイブリッドリポソームへのＭＫＣの組み込みはいかなる用量依存性細胞毒性も誘導しなかったことを示した。
【0163】
さらに、十分に確立された血液適合性試験を用いて、ＨＬＰ－ＧＬＡを安全に静脈内投与できるかどうかも試験した。最初に、赤血球脆弱性における異なるナノ製剤の影響を、マウス血液試料における溶血試験を用いて研究した。試験したＨＬＰ－ＧＬＡ系のいずれも有意な溶血を誘導せず、測定値は全溶血の５％を決して超えないことが見出された。
【0164】
同様に、ヒト血漿を０．１５４ｍｇ ｍＬ－１の（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰ－ＧＬＡ２０と共にインキュベートした後、血漿凝固時間の有意な変動は検出されず、結果は正常な予想範囲内であった（表６参照）。
【0165】
【表6】
【0166】
ＨＬＰ－ＧＬＡがｉｎ ｖｉｔｒｏで安全であることが証明されたら、ビヒクル（ＧＬＡを含まない）のみを用いてｉｎ ｖｉｖｏ反復投与毒性アッセイを実施した。この予備的なｉｎ ｖｉｖｏ研究の背後にある理論的根拠は、ＭＫＣ含有リポソームを使用することの妥当性を評価し、したがって、ｉｎ ｖｉｖｏでビヒクルによって引き起こされる潜在的な毒性を同定することであった。したがって、Ｃ５７ＢＬ６野生型マウスを、３つの異なった用量（０．３７、１．２２および３．６７ｍｇの脂質／注射、これは、約１２、４１および１０５ｍｇ ｋｇ－１の脂質に相当する）の非ＧＬＡ（２．２％ＭＫＣ）－ＨＬＰハイブリッドリポソームで、４週間に、１週間に２回処置した。投与前に、リポソーム系の濃縮は所望の用量に達するために必要であり、治療用量をｉｎ ｖｉｖｏで達成するためにナノ製剤中の十分なＧＬＡ濃度に達するために必要であった濃縮因子を模倣する。この工程は、系の物理化学的特性のいかなる有意な変化も誘発せず、１２倍濃縮試料を得た（材料および方法の節に示されるように濃縮した）。また、（材料および試験法の節に示されるような）濁度測定によってヒト血清（３７℃）中のこの系の安定性を評価した。濁度の有意な変化は観察されず、ベシクルの完全性もｃｒｙｏＴＥＭによって確認された。
【0167】
治療計画はファブリーマウスにおけるＧＬＡを用いた有効性アッセイのそれを模倣することを目的とし、この場合、持続的な効果を確実にするために、（リプレガル（登録商標）またはＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）を用いた）酵素の反復投与が必要とされた。動物の全体的な福祉（一般的な外観、飲食行動および刺激に対する応答）ならびに重量を、５週間（４週間の処置＋追加のサーベイランスの週）の間にモニターし、モニターしたパラメータのいずれにも有意な変化はなく、反復投与時のＨＬＰ系の良好な耐容性を実証した。
【0168】
〔結論：〕
異なるＭＫＣ含量を有する、ＧＬＡ酵素捕捉のための２つの異なるＲＧＤ標的化脂質ベースのナノベシクル、例えば、高いＭＫＣ濃度（総膜成分の＞５０モル％）を含有するクアトソームとして知られる非リポソームナノベシクル、および、低いＭＫＣ濃度（総膜成分の＜５モル％）を含有するハイブリッドリポソームの使用を探求した。ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を用いて両系の調製に成功し、高レベルの均一性を有する多機能ナノベシクルの調製に対するこの技術の適合性を確認した。これらのベシクルの膜組成は、ナノ製剤の物理化学的および生物学的特性の両方に強く影響した。ＭＫＣを組み込むことによる膜への正電荷の添加は、ナノ製剤のコロイド安定性を改善した。
異なるＭＫＣ含量を有する、ＧＬＡ酵素捕捉のための２つの異なるＲＧＤ標的化脂質ベースのナノベシクル、例えば、高いＭＫＣ濃度（総膜成分の＞５０モル％）を含有するクアトソームとして知られる非リポソームナノベシクル、および、低いＭＫＣ濃度（総膜成分の＜５モル％）を含有するハイブリッドリポソームの使用を探求した。ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ法を用いて両系の調製に成功し、高レベルの均一性を有する多機能ナノベシクルの調製に対するこの技術の適合性を確認した。これらのベシクルの膜組成は、ナノ製剤の物理化学的および生物学的特性の両方に強く影響した。ＭＫＣを組み込むことによる膜への正電荷の添加は、ナノ製剤のコロイド安定性を改善した。
【0169】
さらに、系に添加された正電荷の量は、酵素を捕捉する能力に直接影響を及ぼした。その結果、クアトソームは、高い捕捉効率を示したが、驚くべきことに、低レベルのＭＫＣを有するハイブリッドリポソームはクアトソームと同様の酵素捕捉効率を達成した。しかし、高い捕捉効率および良好なコロイド安定性にもかかわらず、クアトソームは、ＧＬＡ酵素の活性を完全に消失させた。Ｉｎ ｖｉｔｒｏで、ｌ－ＭＫＣハイブリッドリポソーム（全膜成分の０．４～４．３ｍｏｌ％）は、非細胞毒性で非溶血性であることを示した。さらに、これらのハイブリッドリポソームへのＧＬＡの捕捉は、酵素の有効性を増強し、遊離投与ＧＬＡよりも、リソソームＧｂ３のより大きな減少を示した。ＭＫＣ含有リポソームの反復投与後、マウスにおいて良好な忍容性が観察され、有害な副作用は観察されなかった。全体として、本明細書に記載されるＧＬＡのコロイド安定性、捕捉効率、および生物学的活性の改善は、ファブリー患者における電流酵素的補充療法に対するこれらの系の有意な利益を実証するために必要なステップである、ｉｎ ｖｉｖｏで投与されるＧＬＡコンジュゲートリポソームの用量および体積の低減を可能にした。この結果は、ファブリー病治療のためのｌ－ＭＫＣハイブリッドリポソームの使用を可能にする。
【0170】
〔実施例２． 膜賦形剤に対するＧＬＡの比率の影響〕
ＧＬＡ濃度と、ナノリポソーム系（すなわち、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤおよび非脂質カチオン性界面活性剤）を形成する膜賦形剤の濃度との間の関係を分析した。
ＧＬＡ濃度と、ナノリポソーム系（すなわち、ＤＰＰＣ、コレステロール、およびコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤおよび非脂質カチオン性界面活性剤）を形成する膜賦形剤の濃度との間の関係を分析した。
【0171】
ＭＫＣ界面活性剤を含まないＧＬＡ－ＨＩＳ（ＨＥＫ細胞において得られる）およびＣｈｏｌ－ＰＥＧ２００－ＲＧＤを使用する非ＧＬＡ製剤に関する以前に公表された研究は、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されているように、１４μｇを超えるＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤（膜賦形剤１ｍｇに対して１４μｇを超えるＧＬＡ）の比が不安定な中間体製剤をもたらし、高い多分散性値および不十分な経時安定性を示すことを示した。さらに、これらの以前の製剤は、低いカプセル化効率を有していた。一方、膜に対するＧＬＡの比が６．１より低いことは、安定な製剤を可能にしたが、達成されたＧＬＡ濃度は８．５μｇ／ｍＬのみであった（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６）。
【0172】
ＭＫＣの添加が実施例１に示されるようにナノリポソームの物理化学的および封入特性の改善を明らかにしたら、範囲設定試験を実施して、（Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に開示された）約３０μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤の以前に記載された比を有する最適化された製剤が安定な様式で得られたかどうかを評価した。
【0173】
〔材料および方法〕
この実施例で使用された全ての材料および方法は、別段の指示がない限り、実施例１に示されたものと同じであった。
この実施例で使用された全ての材料および方法は、別段の指示がない限り、実施例１に示されたものと同じであった。
【0174】
ＧＬＡ負荷ナノリポソーム（ナノ－ＧＬＡ）製剤は、ＤＰＰＣ、コレステロールおよびコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを含有する水溶液リポソーム系におけるＧＬＡタンパク質（この場合、タグを含まない（タグフリー）αガラクトシダーゼ（「組換えヒトＧＬＡ」、「ｒｈ－ＧＬＡ」と命名される）と、少量の界面活性剤ミリスタルコニウムクロリド（ＭＫＣ）（他の膜賦形剤に関しては５％モル）との捕捉からなる。ナノ－ＧＬＡは２つの工程、工程（１）で、ＤＥＬＯＳ－ｓｕｓｐにより中間分散液を得て、工程（２）で、この中間体を濃縮し、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）により透析濾過した。
【0175】
ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験のために、実施例１のＨＬＰと同様の低ＭＫＣ（全膜成分の５モル％）を含む「ハイブリッドリポソーム」（ＨＬＰ）を得たが（実施例１の材料および方法に記載されるように）、この場合、ＰＥＧは、本明細書で「リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ」または「ＨＬＰＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ」または「ナノ－ＧＬＡ」と命名されたＰＥＧ４００であった。したがって、このリポソームは、Ｃａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に記載されているように、示されたＭＫＣ含有量、ならびにリン脂質ＤＰＰＣ、コレステロール、およびコレステロール部分（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）に連結されたＲＧＤユニット（トリペプチドＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）も含有し、ここで、ＰＥＧ４００（下付き文字はＰＥＧ分子量に対応する）は、アルキルエーテルタイプの結合を介して一端がコレステロールに共有結合され、カルバメート結合を介して他端がＲＧＤ配列を含むペプチドに共有結合され、ＲＧＤペプチドはｈｅａｄ ｔｏ ｔａｉｌ環状ｃＲＧＤｆｋ（配列番号２）であった。このリポソームは、実施例１に示されるＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ方法を使用して得られ、透析濾過および濃縮工程にわずかな差異があった。ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰによって製造されたリポソームを７．０～７．５倍に濃縮し、４～５回の透析濾過サイクルを適用して、水で、または５％ｗ／ｖのグルコースを含む水で透析濾過した。
【0176】
ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤのモル比は１０：６．５：０．５であった。したがって、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤは、成分に関して３％モルを表した。
【0177】
リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣはまた、タグフリーアルファガラクトシダーゼ（「ｒｈ－ＧＬＡ」）を有し、ｒｈ－ＧＬＡは、その単量体が、配列番号１の配列（非修飾遺伝子を有する約１００ＫＤａのタグフリータンパク質であり、ヒトＧＬＡと同じ配列であるが、２０２１年１月２５日の日付においてＵｎｉＰｒｏｔ番号Ｐ０６２８０に含まれるシグナルペプチドを有さない（遺伝子番号：２７１７））を有し、また、ｒｈ－ＧＬＡは、スタンダード細胞培養技術（安定発現ベースの製造方法）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｔｈｉｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ． Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ． Ｃｈａｐｔｅｒ １６， １６．１－１６－５４）に従い、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養（ＣＨＯＫ１細胞）を用いてＧＬＡ遺伝子を用いて組み替えて得られた。
【0178】
ｒｈ－ＧＬＡを、実施例１に示されるように負荷し、それを、非共有結合を通してナノリポソーム（リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）に捕捉した；例えば、質量比率３０のために、０．２７ｍｇ／ｍｌのＧＬＡを負荷し、これは、（ＤＰＰＣ、Ｃｈｏｌ、Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤおよびＭＫＣに関して）約３０μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤のＧＬＡ／膜成分比率を表す。
【0179】
例えば、ナノ－ＧＬＡ製剤比率ＧＬＡ／膜成分の物理化学的性質および安定性に対する影響に関連して、ナノ－ＧＬＡ試料は、５ｍｏｌ％のＭＫＣおよび３ｍｏｌ％のコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを含有するタグフリーＧＬＡバージョン（「ｒｈ－ＧＬＡ」）を用いて調製された。試料は、第１のＤＥＬＯＳ工程中に、１．２ｍｇ／ｍＬの膜賦形剤と共に０、３０および４５μｇ／ｍＬのＧＬＡを製剤化して得た。次いで、第２の製造工程（ＴＦＦ）中に、試料を７．０～７．５倍に濃縮し、最大３４３μｇ／ｍＬのＧＬＡおよび８．４または９．０ｍｇ／ｍＬの脂質膜成分を含有し、膜に対するＧＬＡの比が０～４１μｇ／ｍｇであるナノ－ＧＬＡの異なる製剤を得た。
【0180】
ナノ－ＧＬＡ製剤の細胞培養におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素有効性のために、この実験において、細胞に入り、リソソーム内のＧｂ３堆積を減少（加水分解）させるＨＬＰ－ＧＬＡの能力を、Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスに由来するマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）に蛍光標識Ｇｂ３（ニトロベンゾオキサジアゾールＧｂ３、ＮＢＤ－Ｇｂ３）基質を添加することによって測定した（実施例１およびＣａｂｒｅｒａ、Ｉ．ら、２０１６に開示）、このアッセイにおいて、内因性ＧＬＡ活性を有さないＦａｂｒｙ ＫＯマウス由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）を、異なる濃度のＨＬＰ－ＧＬＡで刺激した。結果として、総Ｇｂ３損失値は、低ｐＨが酵素活性を可能にした、細胞内在化およびリソソーム局在化後のナノベシクルによって担持された酵素の作用のみに起因した。
【0181】
〔結果：〕
〔２．１． ナノ－ＧＬＡ製剤の物理化学的性質および安定性、またはＧＬＡ／膜成分比率への影響〕
結果は、質量比率ＧＬＡ／膜成分が、その巨視的および微視的外観、平均粒径および多分散性に関してナノ－ＧＬＡの物理化学的安定性に重大な影響を及ぼすことを示した。非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、ＭＫＣ）の低濃度（リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび界面活性剤に関して３０モル％未満）での存在に加えて、別のパラメータ、すなわち、ＧＬＡ重量とナノリポソーム系を形成する膜賦形剤（すなわち、ＤＰＰＣ、コレステロール、コレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤおよびＭＫＣ）の重量との間の関係も重要であった。
〔２．１． ナノ－ＧＬＡ製剤の物理化学的性質および安定性、またはＧＬＡ／膜成分比率への影響〕
結果は、質量比率ＧＬＡ／膜成分が、その巨視的および微視的外観、平均粒径および多分散性に関してナノ－ＧＬＡの物理化学的安定性に重大な影響を及ぼすことを示した。非脂質カチオン性界面活性剤（例えば、ＭＫＣ）の低濃度（リン脂質、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび界面活性剤に関して３０モル％未満）での存在に加えて、別のパラメータ、すなわち、ＧＬＡ重量とナノリポソーム系を形成する膜賦形剤（すなわち、ＤＰＰＣ、コレステロール、コレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤおよびＭＫＣ）の重量との間の関係も重要であった。
【0182】
【表7】
【0183】
表７に見られるように、一方で、０、２０および３０μｇ／ｍＬの、膜に対するＧＬＡの比は、均質な乳白色および経時的に安定な外観を示し、平均粒径は約１２０～１５０ｎｍであり、多分散指数（ＰｄＩ）は、すべての場合において０．２０未満であった。最大２７１μｇ／ｍｌのＧＬＡを含有する濃縮ナノ－ＧＬＡバージョンは２ヶ月以上安定であり、中間製剤は１ヶ月以上安定であった。
【0184】
一方、３６および４１μｇ／ｍｇのより高いＧＬＡ／膜比で調製されたバッチは、調製後、より乳状であり、いくつかの沈殿物は、調製後わずか数時間で中間製剤中に現れ、約２００ｎｍのサイズおよび０．４０を超えるＰｄＩをもたらした。これらの高い比率で調製した最終ナノ－ＧＬＡ濃縮バージョンでは有意なサイズ差は観察されなかったが、ＰｄＩは全ての場合で０．２５を超えた。その安定性も損なわれており、凝集体の形成によって引き起こされるそれらの生成後７日未満で沈降を呈していた。
【0185】
〔２．２． ＧＬＡ：膜成分の比率が約３０マイクログラムＧＬＡ／ｍｇ膜成分であるような本発明のリポソームを使用するナノ－ＧＬＡ製剤比率ＧＬＡ／膜成分の細胞培養物におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ酵素効力に対する影響：〕
マウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性に対するこれらのより高いＧＬＡ対膜比の影響も見出され、実施例２．１に開示された高比率のナノ製剤（少なくとも３６の比率）ではＧｂ３レベルをより効果的に減少させることができなかった（図５Ａを参照されたい、ここで、ｒｈ－ＧＬＡを約３６の比率で含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（「ＮＦ－６３０」と呼ばれる）は、遊離タンパク質（リプレガル（登録商標）およびｒｈ－ＧＬＡ）よりも優れた有効性を示さなかった）。一方、約３０（μｇ ＧＬＡ／ｍｇ脂質膜成分）の比率でｒｈ－ＧＬＡを含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（図５Ｂにおいて「ナノ－ＧＬＡ」と命名される）は、遊離ＧＬＡを用いた実験と比較して、ナノ製剤化酵素のより良好な効力を示し、それはリプレガル（登録商標）の１５０％の活性を有した（図５Ｂを参照されたい）。図５Ｂに見られるように、ｒｈ－ＧＬＡを含まないＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣは、活性を示さなかった（前記図において「ＮＦ－ｅｍｐｔｙ」と命名された）。ｒｈ－ＧＬＡ効果を含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣは、別個のアイテム（空のリポソームにｒｈ－ＧＬＡを加えたもの）の効果の加算によるものではなく、図５Ｂに見られるように、驚くべき相乗効果によるものであった。
マウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）におけるｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性に対するこれらのより高いＧＬＡ対膜比の影響も見出され、実施例２．１に開示された高比率のナノ製剤（少なくとも３６の比率）ではＧｂ３レベルをより効果的に減少させることができなかった（図５Ａを参照されたい、ここで、ｒｈ－ＧＬＡを約３６の比率で含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（「ＮＦ－６３０」と呼ばれる）は、遊離タンパク質（リプレガル（登録商標）およびｒｈ－ＧＬＡ）よりも優れた有効性を示さなかった）。一方、約３０（μｇ ＧＬＡ／ｍｇ脂質膜成分）の比率でｒｈ－ＧＬＡを含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（図５Ｂにおいて「ナノ－ＧＬＡ」と命名される）は、遊離ＧＬＡを用いた実験と比較して、ナノ製剤化酵素のより良好な効力を示し、それはリプレガル（登録商標）の１５０％の活性を有した（図５Ｂを参照されたい）。図５Ｂに見られるように、ｒｈ－ＧＬＡを含まないＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣは、活性を示さなかった（前記図において「ＮＦ－ｅｍｐｔｙ」と命名された）。ｒｈ－ＧＬＡ効果を含むリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣは、別個のアイテム（空のリポソームにｒｈ－ＧＬＡを加えたもの）の効果の加算によるものではなく、図５Ｂに見られるように、驚くべき相乗効果によるものであった。
【0186】
〔結論：〕
したがって、ＧＬＡと膜賦形剤との間の質量比率は、遊離タグＧＬＡ、５ｍｏｌ％のＭＫＣおよび３ｍｏｌ％のコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを用いて調製されたナノ－ＧＬＡ製剤の物理化学的性質および安定性に重大な影響を及ぼした。実験的に見られるように、３６μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤の比率は、リポソーム分散体の沈降を引き起こす凝集体の形成、および粒度分布におけるより高い多分散性値の取得を導いた。ナノ製剤の物理化学的性質におけるこの障害は、ナノ製剤の有効性に直接的な影響を及ぼした。一方、約３０μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤の比率は、物理化学的性質、安定性、ひいては有効性の点で高品質のナノ－ＧＬＡ製剤を生成した。したがって、ＧＬＡと膜賦形剤との間の最大比率は、安定なナノ－ＧＬＡ製剤について、３６μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤未満である必要があった。
したがって、ＧＬＡと膜賦形剤との間の質量比率は、遊離タグＧＬＡ、５ｍｏｌ％のＭＫＣおよび３ｍｏｌ％のコレステロール－ＰＥＧ４００－ＲＧＤを用いて調製されたナノ－ＧＬＡ製剤の物理化学的性質および安定性に重大な影響を及ぼした。実験的に見られるように、３６μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤の比率は、リポソーム分散体の沈降を引き起こす凝集体の形成、および粒度分布におけるより高い多分散性値の取得を導いた。ナノ製剤の物理化学的性質におけるこの障害は、ナノ製剤の有効性に直接的な影響を及ぼした。一方、約３０μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤の比率は、物理化学的性質、安定性、ひいては有効性の点で高品質のナノ－ＧＬＡ製剤を生成した。したがって、ＧＬＡと膜賦形剤との間の最大比率は、安定なナノ－ＧＬＡ製剤について、３６μｇ ＧＬＡ／ｍｇ膜賦形剤未満である必要があった。
【0187】
〔実施例３．リポソームまたは本発明を用いたファブリー病のｉｎ ｖｉｖｏ処置：〕
〔材料および方法〕
この実施例で使用された全ての材料および方法は、特に指示がない限り、実施例１および実施例２（２．２で得られた結果について）で示されたものと同じであった。
〔材料および方法〕
この実施例で使用された全ての材料および方法は、特に指示がない限り、実施例１および実施例２（２．２で得られた結果について）で示されたものと同じであった。
【0188】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、実施例１および２のＨＬＰと同様の低ＭＫＣ（全膜成分（ＤＰＰＣ、ｃｈｏｌ、コンジュゲートおよび非脂質カチオン性界面活性剤）の５モル％）を含む「ハイブリッドリポソーム」（ＨＬＰ）が得られたが（実施例１の材料および方法に記載されるように）、この場合、ＰＥＧは、本明細書で「リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ」または「ＨＬＰＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ」（「ナノ－ＧＬＡ」）と命名されたＰＥＧ４００であった。したがって、このリポソームは、示されたＭＫＣ含有量、ならびにリン脂質ＤＰＰＣ、コレステロール、およびコレステロール部分（ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）に連結されたＲＧＤユニット（トリペプチドＡｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ）を含有し、ここで、ＰＥＧ４００は、アルキルエーテルタイプの結合を介して一端がコレステロールに共有結合され、カルバメート結合を介して他端がＲＧＤ配列を含むペプチドに共有結合され、ＲＧＤペプチドは環状ｃＲＧＤｆｋ（配列番号２）であった（実施例１および２に記載の通り）。このリポソームは、実施例１および２に示すＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰ方法を用いて得た。
【0189】
ＤＰＰＣ：コレステロール：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤのモル比は１０：６．５：０．５であった。したがって、ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤは、成分に関して３％モルを表した。
【0190】
ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣまた、実施例２に示すように、タグフリーαガラクトシダーゼ（ＧＬＡ）またはｒｈ－ＧＬＡも含んでいた。ＣＨＯ細胞中で産生されるように、ｒｈ－ＧＬＡのグリコシル化プロファイルは、Ｆａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）と同等であった。この実験で使用することができた他の可能なＧＬＡ酵素は、Ｓａｎｏｆｉ ＧｅｎｚｙｍｅからのＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）、またはＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）からのＢｉｏｓｉｍｉｌａｒｓなどの他の供給源であった。ｉｎ ｖｉｖｏ実験のために、ｒｈ－ＧＬＡを、実施例１および２に示されるように負荷し、それを、非共有結合（０．２７ｍｇ／ｍＬ ＧＬＡ、比率３０）を通してナノリポソーム（リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）に捕捉した。いかなる理論にも拘束されるものではないが、本発明者らは、ｒｈ－ＧＬＡ酵素がおそらく、活性部位が（二重層とは反対の）水相に曝露され、二重層の表面に吸着された組み込まれたｒｈ－ＧＬＡの一部であり、別の画分がナノリポソームの内部に封入された、末梢タンパク質として膜に組み込まれたと考えた。本発明のリポソームにおいて、リポソームの成分の総ミリグラムに対するＧＬＡのマイクログラムの比率は３０であった（実施例２．２に記載の通り）。
【0191】
〔非経口投与のための医薬組成物の緩衝液製剤：〕
本発明のリポソームの非経口投与のための適切な緩衝液を選択するために、いくつかの培地を、表８（結果の節の以下を参照されたい）に示されるように透析濾過に使用した。材料緩衝液：実施例１に記載されたミリＱ水；スクロース： Ｄ－（＋）－スクロース、フロッカバイオケミカ、ＣＡＳ ５７－５０－１；グルコース： Ｄ－（＋）－グルコース、デキストロース、シグマ－アルドリッチ；トレハロース： Ｄ（＋）－トレハロース２水和物、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＡＳ ６１３８－２３－４；ヒスチジン： Ｌ－ヒスチジン純粋、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ；グリシン：グリシンバイオウルトラ、シグマ－アルドリッチ、ＣＡＳ ５６－４０－６；ＮａＣｌ：分析用塩化ナトリウム、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＩＴＷ試薬；二塩基性リン酸ナトリウム：シグマアルドリッチ、ＣＡＳ ７５５８－７９－４；一塩基性リン酸ナトリウム一水和物：フルカバイオケミカ、ＣＡＳ １３４７２－３５－０．塩化ナトリウム（５．４９４ｍｇ／ｍＬ）、二塩基性リン酸ナトリウム（０．４４ｍｇ／ｍＬ）、および一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（０．１４ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製したＰＢＳ １００ｍＭ。緩衝液製剤（以下の結果節３．１に関連する）に関する実験のために、モデルとして使用したＧＬＡは、Ｃｏｒｃｈｅｒｏ ＪＬ．ｅｔ ａｌ．２０１１に記載されたＧＬＡｃｍｙｃＨｉｓであった。
本発明のリポソームの非経口投与のための適切な緩衝液を選択するために、いくつかの培地を、表８（結果の節の以下を参照されたい）に示されるように透析濾過に使用した。材料緩衝液：実施例１に記載されたミリＱ水；スクロース： Ｄ－（＋）－スクロース、フロッカバイオケミカ、ＣＡＳ ５７－５０－１；グルコース： Ｄ－（＋）－グルコース、デキストロース、シグマ－アルドリッチ；トレハロース： Ｄ（＋）－トレハロース２水和物、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＣＡＳ ６１３８－２３－４；ヒスチジン： Ｌ－ヒスチジン純粋、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ；グリシン：グリシンバイオウルトラ、シグマ－アルドリッチ、ＣＡＳ ５６－４０－６；ＮａＣｌ：分析用塩化ナトリウム、パンリアックＡｐｐｌｉＣｈｅｍ、ＩＴＷ試薬；二塩基性リン酸ナトリウム：シグマアルドリッチ、ＣＡＳ ７５５８－７９－４；一塩基性リン酸ナトリウム一水和物：フルカバイオケミカ、ＣＡＳ １３４７２－３５－０．塩化ナトリウム（５．４９４ｍｇ／ｍＬ）、二塩基性リン酸ナトリウム（０．４４ｍｇ／ｍＬ）、および一塩基性リン酸ナトリウム二水和物（０．１４ｍｇ／ｍＬ）を用いて調製したＰＢＳ １００ｍＭ。緩衝液製剤（以下の結果節３．１に関連する）に関する実験のために、モデルとして使用したＧＬＡは、Ｃｏｒｃｈｅｒｏ ＪＬ．ｅｔ ａｌ．２０１１に記載されたＧＬＡｃｍｙｃＨｉｓであった。
【0192】
〔ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性（ＥＡ）：〕
リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（実施例１および２に説明されるように透析濾過および濃縮）、リプレガル（登録商標）、またはリポソームを含まないｒｈ－ＧＬＡをファブリーマウスモデルに投与した後の血漿中のＥＡを分析して、ＧＬＡのＧＬＡ血漿含有量を決定した（Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９７）。Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスに、各グループにおいて１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡを投与し、１または３０分後に安楽死させた（グループおよび時点あたり４匹の動物）。
リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（実施例１および２に説明されるように透析濾過および濃縮）、リプレガル（登録商標）、またはリポソームを含まないｒｈ－ＧＬＡをファブリーマウスモデルに投与した後の血漿中のＥＡを分析して、ＧＬＡのＧＬＡ血漿含有量を決定した（Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９７）。Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスに、各グループにおいて１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡを投与し、１または３０分後に安楽死させた（グループおよび時点あたり４匹の動物）。
【0193】
〔単回投与有効性試験：〕
リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ、遊離ｒｈ－ＧＬＡまたは遊離リプレガル（登録商標）の１ｍｇ／ｋｇ（酵素の投与量）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与をファブリーＫＯマウス（１グループあたり８匹）に行った。１週間後、マウスを安楽死させて臓器試料（肝臓、脾臓、腎臓および心臓）を採取した。器官をホモジナイズし、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）によってＧｂ３レベルを決定した。遊離ｒｈ－ＧＬＡおよびリプレガル（登録商標）を、１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ（同量のタンパク質）の同じ投与量で投与し、酵素（リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）のナノカプセル化が、遊離ＧＬＡ（ｒｈ－ＧＬＡおよびリプレガル（登録商標））の投与を上回る任意の優位性を与えたかどうかをよりよく調べた。このアッセイで使用される方法論および実験設計は、現在臨床実践中または前臨床開発中のタンパク質の効力を試験するために以前に使用された手順に従った（Ｉｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ、２００１、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１６）。相対的Ｇｂ３損失値の計算のために、非処置ＫＯマウスとＷＴ対応物との間のＧｂ３レベルの差は、ＷＴにおけるＧｂ３損失値の１００％に相当すると仮定された。次いで、異なる治療群におけるＧｂ３レベルは、ＷＴにおけるこの総Ｇｂ３損失値に差し向けられ、より高いパーセンテージのＧｂ３損失値を有する処置がより高い有効性を有する処置であったことを意味する。結果を比較するために、多重比較によるＡＮＯＶＡ検定およびｔ検定を実施した。
リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ、遊離ｒｈ－ＧＬＡまたは遊離リプレガル（登録商標）の１ｍｇ／ｋｇ（酵素の投与量）の単回静脈内（ｉ．ｖ．）投与をファブリーＫＯマウス（１グループあたり８匹）に行った。１週間後、マウスを安楽死させて臓器試料（肝臓、脾臓、腎臓および心臓）を採取した。器官をホモジナイズし、液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）によってＧｂ３レベルを決定した。遊離ｒｈ－ＧＬＡおよびリプレガル（登録商標）を、１ｍｇ／ｋｇのＧＬＡ（同量のタンパク質）の同じ投与量で投与し、酵素（リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ）のナノカプセル化が、遊離ＧＬＡ（ｒｈ－ＧＬＡおよびリプレガル（登録商標））の投与を上回る任意の優位性を与えたかどうかをよりよく調べた。このアッセイで使用される方法論および実験設計は、現在臨床実践中または前臨床開発中のタンパク質の効力を試験するために以前に使用された手順に従った（Ｉｏａｎｎｏｕ ｅｔ ａｌ、２００１、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ、２０１６）。相対的Ｇｂ３損失値の計算のために、非処置ＫＯマウスとＷＴ対応物との間のＧｂ３レベルの差は、ＷＴにおけるＧｂ３損失値の１００％に相当すると仮定された。次いで、異なる治療群におけるＧｂ３レベルは、ＷＴにおけるこの総Ｇｂ３損失値に差し向けられ、より高いパーセンテージのＧｂ３損失値を有する処置がより高い有効性を有する処置であったことを意味する。結果を比較するために、多重比較によるＡＮＯＶＡ検定およびｔ検定を実施した。
【0194】
〔Ｇｂ３の測定：〕
Ｇｂ３レベルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｔａｌｏｎｉａ（ＩＱＡＣ－ＣＳＩＣ）で液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）を用いて測定した。詳細には、内部標準（Ｎ－ドデカノイルスフィンゴシン、Ｎ－ドデカノイルグルコシルスフィンゴシン、Ｎ－ドデカノイルスフィンゴシルホスホリルコリン、およびＮ－ヘプタデカノイルセラミドトリヘキソシド、それぞれ０．２ｎｍｏｌ）を含有するメタノール－クロロホルム（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液７５０μＬを、血漿（０．１ｍＬ）または腎臓ホモジネート（０．１ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬタンパク質）に添加した。試料を４８℃で一晩抽出し、冷却し、メタノール中の１Ｍ ＫＯＨ ７５μｌを加え、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。７５μＬの１Ｍ酢酸の添加後、試料を蒸発乾固させ、スフィンゴ脂質の分析まで－２０℃で保存した。分析前に、１５０μＬのメタノールを試料に添加し、１３０００ｇで５分間遠心分離し、１３０μＬの上清を新しいバイアルに移し、注入した。スフィンゴ脂質を、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアで制御される飛行時間型（ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ）検出器に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムで測定した。試料をＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム（粒径１．７μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ）に注入し、流速０．３ｍｌ／分およびカラム温度３０℃を使用した。移動相は１ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸（溶液Ａ）を含むメタノール、２ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸（溶液Ｂ）を含む水であった。勾配溶出は８０％溶液Ａで開始し、３分間かけて９０％溶液Ａに増やし、３分間かけて保持し、９分間かけて９９％溶液Ａに増やし、３分間保持した後に行った。初期条件を２分間達成し、系を３分間安定化した。ＴＯＦ検出器の取得範囲はｍ／ｚ５０～１５００、キャピラリー電圧は３．０ ｋＶ、脱溶媒温度は３５０℃、脱溶媒ガス流量は６００リットル／ｈであった。定量は、５０ ｍＤａの窓を用いて、各化合物について得られたイオンクロマトグラムを用いて行った。線形ダイナミックレンジは、標準混合物の注入によって決定した。化合物の陽性の同定は、標準（＜２％）のものと比較して、＜５ｐｐｍのエラーおよびＬＣ保持時間を有する正確な質量測定に基づいた。内部標準（Ｎ－ヘプタデカノイルセラミドトリヘキソシド）に対して定量を行った。
Ｇｂ３レベルは、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｃａｔａｌｏｎｉａ（ＩＱＡＣ－ＣＳＩＣ）で液体クロマトグラフィー－高分解能質量分析（ＬＣ－ＨＲＭＳ）を用いて測定した。詳細には、内部標準（Ｎ－ドデカノイルスフィンゴシン、Ｎ－ドデカノイルグルコシルスフィンゴシン、Ｎ－ドデカノイルスフィンゴシルホスホリルコリン、およびＮ－ヘプタデカノイルセラミドトリヘキソシド、それぞれ０．２ｎｍｏｌ）を含有するメタノール－クロロホルム（２：１、ｖｏｌ／ｖｏｌ）溶液７５０μＬを、血漿（０．１ｍＬ）または腎臓ホモジネート（０．１ｍＬ、約０．３ｍｇ／ｍＬタンパク質）に添加した。試料を４８℃で一晩抽出し、冷却し、メタノール中の１Ｍ ＫＯＨ ７５μｌを加え、混合物を３７℃で２時間インキュベートした。７５μＬの１Ｍ酢酸の添加後、試料を蒸発乾固させ、スフィンゴ脂質の分析まで－２０℃で保存した。分析前に、１５０μＬのメタノールを試料に添加し、１３０００ｇで５分間遠心分離し、１３０μＬの上清を新しいバイアルに移し、注入した。スフィンゴ脂質を、Ｗａｔｅｒｓ／Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ ＭａｓｓＬｙｎｘソフトウェアで制御される飛行時間型（ＬＣＴ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＸＥ）検出器に接続されたＡｃｑｕｉｔｙ超高性能液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）システムで測定した。試料をＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ８カラム（粒径１．７μｍ、１００ｍｍ×２．１ｍｍ）に注入し、流速０．３ｍｌ／分およびカラム温度３０℃を使用した。移動相は１ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸（溶液Ａ）を含むメタノール、２ｍＭギ酸アンモニウムおよび０．２％ギ酸（溶液Ｂ）を含む水であった。勾配溶出は８０％溶液Ａで開始し、３分間かけて９０％溶液Ａに増やし、３分間かけて保持し、９分間かけて９９％溶液Ａに増やし、３分間保持した後に行った。初期条件を２分間達成し、系を３分間安定化した。ＴＯＦ検出器の取得範囲はｍ／ｚ５０～１５００、キャピラリー電圧は３．０ ｋＶ、脱溶媒温度は３５０℃、脱溶媒ガス流量は６００リットル／ｈであった。定量は、５０ ｍＤａの窓を用いて、各化合物について得られたイオンクロマトグラムを用いて行った。線形ダイナミックレンジは、標準混合物の注入によって決定した。化合物の陽性の同定は、標準（＜２％）のものと比較して、＜５ｐｐｍのエラーおよびＬＣ保持時間を有する正確な質量測定に基づいた。内部標準（Ｎ－ヘプタデカノイルセラミドトリヘキソシド）に対して定量を行った。
【0195】
〔反復投与効力アッセイ：〕
反復投与効力アッセイを実施し、成分比率１０：６．５：０．５（ＤＰＰＣ：コレステロール：Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）のｒｈ－ＧＬＡ（「ナノ－ＧＬＡ」と命名）と５．３％ｍｏｌ ＭＫＣとを含有するＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣを、遊離酵素ｒｈ－ＧＬＡ（本明細書において「ＧＬＡｖｆ」と命名）およびリプレガル（登録商標）と比較した。動物（上記で説明した単回投与実験で使用したのと同じ種類の動物、対照としてＦａｂｒｙ ＫＯマウス、Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴマウス、および非処置Ｆａｂｒｙ ＫＯマウス）を、比較製剤のそれぞれについて、各化合物１ｍｇ／ｋｇ（各群についてｎ＝６）で、８回までの用量（投与用量から１日目、３日目、５日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目、および１７日目に１回）で投与した。ＷＴマウスを対照として使用し、それらには何も与えず、それらは、ＷＴが有するＧｂ３のレベルを知るための対照としての役割を果たした（未処理のＫＯが有するＧｂ３のレベルから健常なＷＴが有するそれを差し引いたＧｂ３のレベルの差は、１００％の有効な治療が減らさなければならないＧｂ３のレベルであり、したがって、図８Ａおよび図８Ｂおよび図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃに含まれるグラフの１００％のＧｂ３損失値であった）。次いでマウスを安楽死させ、最後の投与の２４時間後に試料（血液、腎臓、肝臓、脾臓、肺、皮膚、心臓および脳）を採取した。Ｇｂ３を、先に説明したようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。結果を比較するために、多重比較によるＡＮＯＶＡ検定およびｔ検定を実施した。差は、ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であるとみなした。
反復投与効力アッセイを実施し、成分比率１０：６．５：０．５（ＤＰＰＣ：コレステロール：Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）のｒｈ－ＧＬＡ（「ナノ－ＧＬＡ」と命名）と５．３％ｍｏｌ ＭＫＣとを含有するＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣを、遊離酵素ｒｈ－ＧＬＡ（本明細書において「ＧＬＡｖｆ」と命名）およびリプレガル（登録商標）と比較した。動物（上記で説明した単回投与実験で使用したのと同じ種類の動物、対照としてＦａｂｒｙ ＫＯマウス、Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴマウス、および非処置Ｆａｂｒｙ ＫＯマウス）を、比較製剤のそれぞれについて、各化合物１ｍｇ／ｋｇ（各群についてｎ＝６）で、８回までの用量（投与用量から１日目、３日目、５日目、８日目、１０日目、１２日目、１５日目、および１７日目に１回）で投与した。ＷＴマウスを対照として使用し、それらには何も与えず、それらは、ＷＴが有するＧｂ３のレベルを知るための対照としての役割を果たした（未処理のＫＯが有するＧｂ３のレベルから健常なＷＴが有するそれを差し引いたＧｂ３のレベルの差は、１００％の有効な治療が減らさなければならないＧｂ３のレベルであり、したがって、図８Ａおよび図８Ｂおよび図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃに含まれるグラフの１００％のＧｂ３損失値であった）。次いでマウスを安楽死させ、最後の投与の２４時間後に試料（血液、腎臓、肝臓、脾臓、肺、皮膚、心臓および脳）を採取した。Ｇｂ３を、先に説明したようにＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって分析した。結果を比較するために、多重比較によるＡＮＯＶＡ検定およびｔ検定を実施した。差は、ｐ＜０．０５の場合、統計学的に有意であるとみなした。
【0196】
〔結果：〕
〔３．１． リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）：ＭＫＣおよびｒｈ－ＧＬＡを含む非経口製剤〕
非経口製剤はリポソーム構造の破裂または収縮を防ぐためにならびに組織への損傷を避けるために血液と等浸透圧（約２７５～３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧）である必要があるので、糖（トレハロース、グルコース、スクロース）、アミノ酸（ヒスチジンおよびグリシン）、リン酸塩および他の化合物ならびに標準ＮａＣｌ溶液を含有する異なる培地を評価した。
〔３．１． リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ－ＲＧＤ）：ＭＫＣおよびｒｈ－ＧＬＡを含む非経口製剤〕
非経口製剤はリポソーム構造の破裂または収縮を防ぐためにならびに組織への損傷を避けるために血液と等浸透圧（約２７５～３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧）である必要があるので、糖（トレハロース、グルコース、スクロース）、アミノ酸（ヒスチジンおよびグリシン）、リン酸塩および他の化合物ならびに標準ＮａＣｌ溶液を含有する異なる培地を評価した。
【0197】
まず、ＰＢＳ １００ｍＭを用いた第１の試験を評価した。ＧＬＡタンパク質モデルとしてこの場合にはＧＬＡｃｍｙｃＨｉｓを含むリポソームを、実施例１で先に示したようにＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰによって調製し、通常は水中で減圧した。次いで、透析濾過工程において、試料を、水の代わりにＰＢＳ １００ｍＭを使用する５サイクルの透析濾過に供した。
【0198】
透析濾過後の差異が試料について観察された。第一に、透析濾過直後の肉眼的外観はわずかに白色であり、２日後にいくらかの沈降が観察された。ＰＤＩの増加も観察された（０．３１）。さらに、ＧＬＡ定量化は、透析濾過中にＧＬＡが失われたことを示した。使用される培地が、リポソームの物理化学的性質（サイズ、ＰＤＩ、形態）に影響を及ぼし得るだけでなく、ＧＬＡとリポソームとの相互作用にも影響を及ぼし得、リポソームからの酵素の剥離を誘発し得ることを示す。
【0199】
結論として、水中での生成およびＰＢＳリポソーム中での後の透析濾過は、同様の物理化学的特性を維持した。しかしながら、透析濾過緩衝液交換中にＧＬＡが失われる可能性がある。
【0200】
これらの結果を考慮すると、透析濾過による緩衝液交換は、浸透圧調整剤を組み込むための良好な戦略であると思われた。
【0201】
第２の研究では、異なる浸透圧調整剤のスクリーニングが検討され、リポソーム特性ならびにＧＬＡの捕捉効率に及ぼし得る影響が研究された。
【0202】
最初に、異なる化合物の濃度を、以下の表８に示すように、血液に対して等浸透性（約２７０～３００ｍＯｓｍ／Ｋｇ）であるように調整した。次いで、これらの培地中の透析濾過を、２つの異なる実験（スクリーニング１および２）において、表８に示す培地中で行った。
【0203】
【表8】
【0204】
第１の試みにおいて、ＧＬＡ負荷リポソーム（ＭＫＣ＝０．０４ｍｇ／ｍＬおよびＧＬＡ ３５μｇ／ｍＬを有するモル比１０：６．５：０．５のＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ、「ＮＦ－４１１」と命名されたプロトタイプ）の１つのバッチを、理論濃度３５μｇ／ｍＬのＧＬＡを有するＤＥＬＯＳ－ｓｕｓｐによって製造した。次いで、ＭｉｌｌｉＱ水の代わりに異なる緩衝液／培地に対して全試料を透析濾過した（表１０／スクリーニング１に要約し、ＮＦ－４１１と同じリポソーム組成を有するが、表９に説明されるように異なる培地を有するＮＦ－４１２～ＮＦ－４１７を得た）。
【0205】
試料をＤＬＳによって分析（サイズ、ＰＤＩおよびζ電位）し、ＧＬＡ濃度をＴＧＸによって評価した。捕捉効率を、全試料中のＧＬＡの質量当たりの負荷試料中の質量ＧＬＡとして計算し、透析濾過が、以前にＰＢＳについて見られたようなＧＬＡの損失を引き起こしたかどうかを調べた。結果を表９にまとめる。
【0206】
【表9】
【0207】
選択された培地中の透析濾過された（「透析濾過」）試料について、試験された濃度（スクロース１０％、グルコース５％、およびトレハロース１０％ｗ／ｖ）の全ての糖は、２８０～３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの浸透圧値を有する等張性試料になった。これらの製剤はまた、ＰＤＩ＜０．２５および元の試料と同様のサイズ（約１１０～１３０ｎｍ）を有する良好な物理化学的特性を維持した。カプセル化効率は３つの系について高（＞７０％）であり、トレハロース（９０％および１００％に対して７３％）についての捕捉効率（ＥＥ）％はわずかに低かったが、この差は関連しなかった。
【0208】
沈降および乳状の外観が観察され、より高いＰＤＩ（ＮＦ－４１６およびＮＦ－４１７）と相関しているので、ヒスチジン１０ｍＭを含有する培地中で透析濾過したものを除いて、全ての試料の肉眼的外観は良好であった。
【0209】
結論として、この最初のスクリーニング後、リポソームに提供された３つの可能な培地、すなわちスクロース１０％、グルコース５％、およびトレハロース１０％が正しい浸透圧および物理化学的性質を有する。
【0210】
第２の試みにおいて、別のバッチのＧＬＡ負荷リポソーム（ＭＫＣ＝０．０４ｍｇ／ｍＬおよびＧＬＡ＝２５μｇ／ｍＬを有するモル比１０：６．５：０．５のＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ、ＮＦ－４３１と命名された（または「ＮＦ－４３１（オリジナル）」と命名された）プロトタイプをＤＥＬＯＳ－ｓｕｓｐによって生成した。次いで、前の実施例で行ったように、ＭｉｌｌｉＱ水の代わりに異なる緩衝液／培地に対して全試料を透析濾過し、ＮＦ－４３１～ＮＦ－４４１（ＮＦ－４３１と同じリポソーム組成物を用いたが、表１０で説明されるように異なる培地中）を得た。
【0211】
試料をＤＬＳによって分析（サイズ、ＰＤＩおよびζ電位）し、ＧＬＡ濃度および捕捉効率も計算した（表１０参照）。
【0212】
【表10】
【0213】
この一連の透析濾過試料において、追加の培地も試験した：ＬｅａｎＢｉｏからの緩衝液（マンニトールおよびリン酸ナトリウムを含有するＦａｂｒａｚｙｍｅ（登録商標）の組成に類似）、グリシン２．５％、スクロース８．５％およびグリシン０．４％の混合物、および最後に、塩化ナトリウム０．９％。
【0214】
試験された濃度の全ての培地は、２５０～３００ｍＯｓｍ／Ｋｇの間の浸透圧値を有する等張性試料になることが分かった。指摘すると、トレハロース（ＮＦ－４３７）を含有する試料は、予想よりも高い浸透圧を示した（第１のアッセイで得られた３０１ ｍＯｓｍ／Ｋｇ（ＮＦ－４１５）に対して３４７ ｍＯｓｍ／Ｋｇ、およびトレハロース１０％ストックに対して２９５ ｍＯｓｍ／Ｋｇ）。
【0215】
これらの製剤はまた、ＰＤＩ＜０．３０および元のものと比較して同様のサイズ（約１１０～１７０ｎｍ）を有する良好な物理化学的特性を維持した。スクロースを含有する試料の場合、それらは１週間後に少し乳白色になり、グリシン（ＮＦ－４４０）も含有する試料の場合に特にわずかにサイズが増加したが、ＰＤＩは影響を受けなかった。
【0216】
捕捉効率に関して、２つの傾向が観察された（図６Ａ参照）：一方で、ＧＬＡは、透析濾過後に維持されたので、糖またはアミノ酸が浸透剤として使用された場合、十分に取り込まれた。この場合、グルコース、スクロース、トレハロース、グリシンおよびスクロース／グリシンで透析濾過された試料に見られるように、高い捕捉効率（＜８５％）が得られた。一方、塩（例えば、塩化ナトリウムまたはリン酸塩）が使用された場合、それらはリポソームからのＧＬＡの分離を引き起こし、透析濾過中にその損失をもたらした。この効果は、ナトリウムおよびリン酸塩、ＮａＣｌを含有する緩衝液中で透析濾過された試料、ならびにＰＢＳを用いて行われた第１の実験において見られた。
【0217】
次に、培地のこの第２のスクリーニングのために、ＧＬＡ酵素活性も評価した（図６Ｂ）。（ＤＥＬＯＳ－ＳＵＳＰによる減圧の直前の）水中の希釈ＧＬＡは、リプレガル（登録商標）（１に正規化）の約半分で、酵素活性の急激な低下を示した。一方、ナノリポソーム中に捕捉されたＧＬＡは、グリシン中のＧＬＡが他の試料よりもわずかに少ないＥＡを示すように見えるにもかかわらず、全ての試験培地においてその良好な酵素活性（リプレガル（登録商標）よりも高い）を維持した。
【0218】
結論として、グルコース５％、スクロース１０％、およびトレハロース１０％は、良好な物理化学的特性、ＧＬＡ濃度および酵素活性を維持することができる等浸透性ナノ製剤を得るための最良の結果を示した。
【0219】
ｉｎ ｖｉｔｒｏでの有効性（Ｇｂ３減少）に関する最後の実験では、等浸透圧培地としてのグルコース５％：およびスクロース１０％（グルコース５％もしくはスクロース１０％で透析濾過、または、濃縮ｘ７およびグルコース５％もしくはスクロース１０％で透析濾過）におけるリポソーム（ＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ、モル比１０：６．５：０．５、ＭＫＣ＝０．０４ｍｇ／ｍＬ（５％ｍｏｌ ＭＫＣ）およびＧＬＡ＝２５μｇ／ｍＬ）の比較を行い、ＧＬＡ負荷リポソームがリソソームに到達し、Ｇｂ３を加水分解する能力を検討した。これを、ＧＬＡ欠損マウス由来のマウス大動脈内皮細胞（ＭＡＥＣ）の初代培養物において試験した（実施例１で説明したのと同じ材料および方法）。結果は、グルコース５％で製剤化されたリポソームが、スクロース１０％で製剤化されたリポソームよりも高いｉｎ ｖｉｔｒｏ有効性（Ｇｂ３減少）を示したことを示した（図６Ｃ）。
【0220】
したがって、ｉｎ ｖｉｖｏ実験（「ナノ－ＧＬＡ」）における使用のために決定された最終的な医薬形態は、水溶液ナノリポソーム分散液であった。ナノ－ＧＬＡ中の成分および各成分の役割を以下の表１１に記載する（ここで、ＭＫＣは５％モルであり、前に説明したＧＬＡ／リポソーム膜賦形剤の質量比率は３０であり、グルコースは５％ｗ／ｖであった）。表１１に開示されるナノ－ＧＬＡ組成物は、等浸透性培地の選択のための実験におけるＧＬＡｃｍｙｃＨｉｓの代わりに、前の実施例で説明したタグフリー「ｒｈ－ＧＬＡ」を含んでいた。
【0221】
【表11】
【0222】
〔３．２． Ｉｎ ｖｉｖｏ酵素活性（ＥＡ）〕
ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（表１１に開示される製剤中）は、遊離酵素（リプレガル（登録商標）またはｒｈ－ＧＬＡ）よりも血漿中のＥＡ濃度を増加させた（図７）。投与３０分後、血漿は、ＧＬＡが前の節３．１に記載されるように本発明のリポソーム中にナノ製剤化された場合、注射用量（ＩＤ）の１８．９±０．７％（１分と称される）を保持し、遊離酵素の場合、わずか２．９±０．２％のＩＤを保持した（ｐ＝０．０２４）。したがって、リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ここで、ＭＫＣは５％モルであり、前に説明したＧＬＡ／リポソーム膜賦形剤の質量比率は３０であった）は、活性成分（ＧＬＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ循環寿命を延長した。
ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（表１１に開示される製剤中）は、遊離酵素（リプレガル（登録商標）またはｒｈ－ＧＬＡ）よりも血漿中のＥＡ濃度を増加させた（図７）。投与３０分後、血漿は、ＧＬＡが前の節３．１に記載されるように本発明のリポソーム中にナノ製剤化された場合、注射用量（ＩＤ）の１８．９±０．７％（１分と称される）を保持し、遊離酵素の場合、わずか２．９±０．２％のＩＤを保持した（ｐ＝０．０２４）。したがって、リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ここで、ＭＫＣは５％モルであり、前に説明したＧＬＡ／リポソーム膜賦形剤の質量比率は３０であった）は、活性成分（ＧＬＡ）のｉｎ ｖｉｖｏ循環寿命を延長した。
【0223】
〔３．３． Ｉｎ ｖｉｖｏ単回投与有効性試験〕
ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（表１１に開示される製剤中）（前の節３．１および３．２に記載されたリポソームの成分）、遊離（非封入）ｒｈ－ＧＬＡ、または、臨床的に利用可能なリプレガル（登録商標）（同様に遊離酵素）の、単回投与で処置した動物におけるＧｂ３濃度を比較することによって、ファブリーＫＯマウスにおいてナノ－ＧＬＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を試験した。Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスモデル（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドにおけるＧｌａｔｍＫｕｌ）であることは、ＦＤのための最も広範な動物モデルであり、ＧＬＡ遺伝子が完全に欠如していた（Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９７）。これらのマウスは、ヒトファブリー患者と同じパターンに従って、リソソームにおけるラメラ構造を有する典型的な脂質封入体、および心臓および腎臓を含む標的組織におけるＧｂ３の進行性蓄積を示した。Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴマウスおよび非処置Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスも対照として含めた。
ｒｈ－ＧＬＡを有するリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（表１１に開示される製剤中）（前の節３．１および３．２に記載されたリポソームの成分）、遊離（非封入）ｒｈ－ＧＬＡ、または、臨床的に利用可能なリプレガル（登録商標）（同様に遊離酵素）の、単回投与で処置した動物におけるＧｂ３濃度を比較することによって、ファブリーＫＯマウスにおいてナノ－ＧＬＡのｉｎ ｖｉｖｏ有効性を試験した。Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスモデル（Ｃ５７ＢＬ６バックグラウンドにおけるＧｌａｔｍＫｕｌ）であることは、ＦＤのための最も広範な動物モデルであり、ＧＬＡ遺伝子が完全に欠如していた（Ｏｈｓｈｉｍａら、１９９７）。これらのマウスは、ヒトファブリー患者と同じパターンに従って、リソソームにおけるラメラ構造を有する典型的な脂質封入体、および心臓および腎臓を含む標的組織におけるＧｂ３の進行性蓄積を示した。Ｃ５７ＢＬ６ ＷＴマウスおよび非処置Ｆａｂｒｙ ＫＯマウスも対照として含めた。
【0224】
明確にするために、図８Ａおよび図８Ｂでは、絶対Ｇｂ３レベル（タンパク質のｐｍｏｌ ｅｑ／ｍｇ単位）および相対Ｇｂ３損失値（％）の両方を表した。Ｇｂ３レベルはＧＬＡ ＫＯマウスの組織間で有意に変動し、ここで、組織は、腎臓、脾臓、心臓、および脳であり、組織は、Ｇｂ３蓄積によって主に影響を受ける（図８Ａおよび図８Ｂに見られるように）。比較して、脾臓は、より低いレベルのＧｂ３を示した。非処置ＫＯマウスにおけるＧｂ３レベル（図８Ａおよび図８ＢにおけるＫＯ）は、腎臓（２２，６８６±１０２４ｐｍｏｌ／ｍｇ）および脾臓（６，８２８±５００．４ｐｍｏｌ／ｍｇ）、続いて心臓（６９４±１６１ｐｍｏｌ／ｍｇ）および肝臓（２，３７５±７１２．１ｐｍｏｌ／ｍｇ）において高かった。さらに、マウスをナノ－ＧＬＡの単回投与で処置した場合、脳においても約２１％のＧｂ３レベルの低下が観察された（図１０）。
【0225】
相対的Ｇｂ３損失値の計算のために、非処置ＫＯマウスとＷＴ対応物との間のＧｂ３レベルの差は、ＷＴにおけるＧｂ３損失値の１００％に相当すると仮定された。次いで、異なる治療群におけるＧｂ３レベルは、ＷＴにおけるこの総Ｇｂ３損失値に差し向けられ、より高いパーセンテージのＧｂ３損失値を有する処置がより高い有効性を有する処置であったことを意味する。脾臓、肝臓および心臓において、Ｇｂ３の濃度は、リプレガル（登録商標）処理によるよりもリポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ナノ－ＧＬＡ）によって有意に良好に減少し、これは、本発明のリポソームにおけるタンパク質の封入がその有効性を改善したことを意味する。
【0226】
〔３．４． Ｉｎ ｖｉｖｏ反復投与有効性試験〕
得られた結果は、１ｍｇ／ｋｇ当量をＦａｂｒｙ ＫＯマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔に８回静脈内投与した後、リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ナノ－ＧＬＡ）（表１１に開示される製剤中）中のナノ製剤化ｒｈ－ＧＬＡが全ての試験組織においてＧｂ３損失値を誘導したことを示した（図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃを参照されたい）。また、ナノ－ＧＬＡは、達成されたＧｂ３損失値において、血漿、肝臓、脾臓、肺、腎臓および皮膚において遊離ｒｈ－ＧＬＡ（ＧＬＡｖｆ）よりも優れていることが見出された。また、反復投与におけるナノ－ＧＬＡは、脳内のＧｂ３堆積を約２９％減少させることができることも見出された。脳におけるこの有効性はナノ－ＧＬＡの単回投与で観察されたものよりも高かったが、これらの差は有意ではなかった（図１０参照）。
得られた結果は、１ｍｇ／ｋｇ当量をＦａｂｒｙ ＫＯマウスおよびそれらのＷＴ同腹仔に８回静脈内投与した後、リポソームＤＰＰＣ：Ｃｈｏｌ：（Ｃｈｏｌ－ＰＥＧ４００－ＲＧＤ）：ＭＫＣ（ナノ－ＧＬＡ）（表１１に開示される製剤中）中のナノ製剤化ｒｈ－ＧＬＡが全ての試験組織においてＧｂ３損失値を誘導したことを示した（図９Ａ、図９Ｂおよび図９Ｃを参照されたい）。また、ナノ－ＧＬＡは、達成されたＧｂ３損失値において、血漿、肝臓、脾臓、肺、腎臓および皮膚において遊離ｒｈ－ＧＬＡ（ＧＬＡｖｆ）よりも優れていることが見出された。また、反復投与におけるナノ－ＧＬＡは、脳内のＧｂ３堆積を約２９％減少させることができることも見出された。脳におけるこの有効性はナノ－ＧＬＡの単回投与で観察されたものよりも高かったが、これらの差は有意ではなかった（図１０参照）。
【0227】
〔先行技術文献〕
〔特許文献〕
ＷＯ２０１４００１５０９
ＷＯ２００６／０７９８８９
〔非特許文献〕
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〔特許文献〕
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【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図3C】
【図4A】
【図4B】
【図4C】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【配列表】
【国際調査報告】