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特表2024-508475植物発現システムを用いたアルファルファモザイクウイルス様粒子の製造方法およびその活用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-27
(54)【発明の名称】植物発現システムを用いたアルファルファモザイクウイルス様粒子の製造方法およびその活用
(51)【国際特許分類】
C12N 15/82 20060101AFI20240219BHJP
C12N 15/40 20060101ALI20240219BHJP
C12N 15/29 20060101ALI20240219BHJP
A01H 5/00 20180101ALI20240219BHJP
C07K 1/14 20060101ALI20240219BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20240219BHJP
C07K 14/08 20060101ALI20240219BHJP
C12N 15/84 20060101ALI20240219BHJP
A01H 6/82 20180101ALI20240219BHJP
A01H 6/54 20180101ALI20240219BHJP
A01H 6/46 20180101ALI20240219BHJP
A01H 6/04 20180101ALI20240219BHJP
A01H 6/20 20180101ALI20240219BHJP
A01H 6/14 20180101ALI20240219BHJP
C07K 1/20 20060101ALI20240219BHJP
A61K 39/00 20060101ALI20240219BHJP
A61P 37/04 20060101ALI20240219BHJP
【ＦＩ】
C12N15/82 100Z
C12N15/40 ZNA
C12N15/29
A01H5/00 A
C07K1/14
C07K1/22
C07K14/08
C12N15/84 Z
A01H6/82
A01H6/54
A01H6/46
A01H6/04
A01H6/20
A01H6/14
C07K1/20
A61K39/00 G
A61P37/04
【審査請求】有
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023552114
(86)(22)【出願日】2022-02-11
(85)【翻訳文提出日】2023-08-25
(86)【国際出願番号】 KR2022002106
(87)【国際公開番号】W WO2022182033
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0025902
(32)【優先日】2021-02-25
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】519142114
【氏名又は名称】バイオアプリケーションズ インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＢＩＯＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】110002860
【氏名又は名称】弁理士法人秀和特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】パク，ヨンミン
(72)【発明者】
【氏名】ソン，スジ
(72)【発明者】
【氏名】ミン，キョンミン
【テーマコード（参考）】
2B030
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
2B030AB03
2B030AD08
2B030CA17
2B030CB03
4C085AA03
4C085BA01
4C085CC21
4C085EE06
4C085FF24
4H045AA10
4H045AA11
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045CA01
4H045CA30
4H045DA86
4H045EA31
4H045FA74
4H045GA01
4H045GA25
4H045GA26
(57)【要約】
本発明は、葉緑体に標的化される植物体発現用組み換えベクターを用いて形質転換させた植物体から分離したＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）をＶＬＰ（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）形態で製作および生産する技術に関し、葉緑体標的化タンパク質とＡＭＶカプシドタンパク質が融合した組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクターが提供される。また、前記組み換えベクターにより形質転換された形質転換植物体、前記形質転換植物体から目的タンパク質を分離精製方法、これを用いてウイルス様粒子を製造する方法などが提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチドと、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドと、を含む、植物体発現用組み換えベクター。
【請求項2】
前記ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を含み、前記ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３または１０で表される塩基配列を含む、請求項１に記載の植物体発現用組み換えベクター。
【請求項3】
前記組み換えベクターは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１に記載の植物体発現用組み換えベクター。
【請求項4】
前記ポリヒスチジンタグは、前記ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＣ末端またはＮ末端に連結される、請求項３に記載の植物体発現用組み換えベクター。
【請求項5】
前記組み換えベクターは、プロモーターとターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間に、（１）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されているか；または
（２）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、およびＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されている、請求項３に記載の植物体発現用組み換えベクター。
【請求項6】
請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体。
【請求項7】
下記段階を含む、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製方法：（Ｓｔｅｐ １）請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；および
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
【請求項8】
前記タンパク質抽出緩衝溶液は、下記特徴のうち１つ以上を満たす、請求項７に記載の分離精製方法：（１）１０～１００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）、１００～１５００ｍＭ 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０１～１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））Ｘ－１００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐ－（１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ）、および５～３００ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含む；または
（２）ｐＨが７～９である。
【請求項9】
前記アガロースは、Ｎｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースである、請求項７に記載の分離精製方法。
【請求項10】
前記（Ｓｔｅｐ １）段階は、前記組み換えベクターが導入されたバクテリアを用いて植物体を形質転換させる、請求項７に記載の分離精製方法。
【請求項11】
前記バクテリアは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）である、請求項１０に記載の分離精製方法。
【請求項12】
前記植物体は、シロイヌナズナ、大豆、タバコ、ナス、唐辛子、ジャガイモ、トマト、白菜、キャベツ、およびレタスからなる群から選ばれる双子葉植物；または稲、麦、小麦、ライ麦、とうもろこし、サトウキビ、エンバク、およびタマネギからなる群から選ばれる単子葉植物である、請求項７に記載の分離精製方法。
【請求項13】
請求項７に記載の分離精製方法によって溶出された、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質。
【請求項14】
下記段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＶＬＰ）の製造方法：（Ｓｔｅｐ １）請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階；および
（Ｓｔｅｐ ７）前記（Ｓｔｅｐ ６）で溶出されたタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階。
【請求項15】
前記（Ｓｔｅｐ ７）段階は、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれたタンパク質抽出緩衝溶液をウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液に交替することによって、ウイルス様粒子を製造する、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項16】
前記ウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液は、下記特徴のうち１つ以上を満たす、請求項１５に記載の製造方法：（１）２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む；または
（２）ｐＨが６．９～７．５である。
【請求項17】
自己集合した組み換えＡＭＶウイルス様粒子を精製するために、サイズ排除クロマトグラフィーを行う段階をさらに含む、請求項１４に記載の製造方法。
【請求項18】
請求項１４に記載の製造方法によって製造された組み換えＡＭＶウイルス様粒子であって、下記特徴のうち１つ以上を満たす、組み換えＡＭＶウイルス様粒子：（１）サイズ排除クロマトグラフィーで分子量が約２，０００ｋＤａ以上で現れる；
（２）陰性染色法で染色後、透過電子顕微鏡で観察したとき、直径が１０ｎｍ以上４０ｎｍ以下である；または
（３）超低温透過電子顕微鏡で観察し、３Ｄ構造（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）したとき、３個の複合体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）が規則的な配列を通じて全２０個が組み立てられた球形のＶＬＰ（３ｘ２０）である。
【請求項19】
下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法：（Ｓｔｅｐ １）請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得したウイルス様粒子を極超低温電子顕微鏡を用いて３Ｄ構造を糾明する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記ウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
【請求項20】
前記ワクチン組成物の製造方法は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を添加する段階をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載の製造方法。
【請求項21】
下記特徴のうち１つを満たすことを特徴とする請求項１９に記載の製造方法：（１）前記（Ｓｔｅｐ １）段階の組み換えベクターは、抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結される；または
（２）前記（Ｓｔｅｐ ５）は、ウイルス様粒子の表面に抗原タンパク質を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させる段階を含む。
【請求項22】
請求項１９に記載の製造方法によって製造された、ワクチン組成物。
【請求項23】
下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含む薬物伝達体の製造方法：（Ｓｔｅｐ １）請求項１～５のいずれか一項に記載の組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質溶液を第１緩衝溶液に交替し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）の溶液に薬物を添加する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記（Ｓｔｅｐ ４）の第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替し、ウイルス様粒子を製造する段階。
【請求項24】
前記（Ｓｔｅｐ ５）の第１緩衝溶液および第２緩衝溶液は、下記特徴を満たす、請求項２３に記載の製造方法：
（１）第１緩衝溶液は、１０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、および１００～５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である；および
（２）第２緩衝溶液は、２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、植物体を用いてウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ；ＶＬＰｓ）を生産する方法およびその応用に関し、より具体的には、植物体で高効率の発現ベクター（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ）を用いて組み換えＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）カプシド（ｃａｐｓｉｄ）タンパク質を生産する方法およびこれをＶＬＰで製造する方法に関する。
【0002】
本出願は、２０２１年２月２５日に出願された韓国特許出願第１０－２０２１－００２５９０２号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書および図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
【背景技術】
【0003】
ウイルス様粒子（Ｖｉｒｕｓ ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ）は、ウイルス構造タンパク質の結合を通じて実際ウイルスと類似の形態で組み立てられる粒子を意味する。ＶＬＰは、組み立て時にウイルスの遺伝子を含まず、体内注入時に増殖が不可能な安全な抗原という長所がある。また、高い免疫原性を示す特徴を基に様々な病原体にＶＬＰを適用したワクチンの研究開発が非常に活発に行われている。
【0004】
ウイルスと同様に、ＶＬＰは、エンベロープ（ｅｎｖｅｌｏｐｅ）の有無によってｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ＶＬＰ（以下、「ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰ」という）とｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ＶＬＰ（以下、「ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰ」という）とに分けられる。Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰの場合、宿主の細胞膜をｅｎｖｅｌｏｐｅとして使用しつつ、外部表面にウイルスのタンパク質を抗原として発現させた形態で、宿主細胞膜との融合過程を通じて細胞の外側にｂｕｄｄｉｎｇされる過程で生産される。Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰは、ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰに比べて相対的に当該粒子のサイズが大きいという特徴があり、様々な病原体の抗原を細胞膜に発現させる場合、様々な抗原を同時に発現するＶＬＰを生産できるという特徴がある。代表的なＥｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰとしては、インフルエンザウイルス、レトロウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスＶＬＰなどがある。
【0005】
Ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰの場合、宿主細胞の細胞膜を必要とせず、ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄウイルスのｃａｐｓｉｄタンパク質のうち１つまたは複数個のタンパク質で構成される。Ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰは、Ｅｎｖｅｌｏｐｅ ＶＬＰと同様に、様々な抗原を同時発現できるという特徴があるが、他の病原体の抗原を同時に発現する柔軟性が相対的に劣ると言える。代表的なｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰとしては、Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ロタウイルスＶＬＰなどがある。
【0006】
現在ＶＬＰ生産のための発現システムとしては、細菌、酵母、昆虫細胞、植物細胞、高等動物（哺乳類、鳥類など）細胞などの発現システムが使用されている。細菌発現システムは、組み換えタンパク質を生産するために最も広く使用されているが、哺乳類と類似のタンパク質翻訳後修飾（ｐｏｓｔ－ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ＰＴＭ）ができないので、ＶＬＰの生産に不利な短所があるが、生産コストが安いので、ｃａｐｓｉｄタンパク質の組み合わせだけで生産可能なｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰを中心に使用されている。酵母も、ＶＬＰの生産に広く使用されているが、ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰの開発にも使用されている。Ｂ型肝炎ウイルス、ヒト乳頭腫ウ
イルスなどのＶＬＰの開発が酵母を用いて行われてきた。
イルスなどのＶＬＰの開発が酵母を用いて行われてきた。
【0007】
昆虫細胞の場合、一部のｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ ｐａｔｔｅｒｎを除いて、哺乳動物細胞と非常に類似のＰＴＭ過程が行われ、ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰおよびｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰの生産の両方ともに使用可能であり、一般的に高等細胞に比べてタンパク質の生産量が多いという長所がある。インフルエンザウイルス、ヒト乳頭腫ウイルスなど様々なウイルスに対するＶＬＰの開発に使用されている。
【0008】
植物細胞の場合、 研究が始まったばかりの発現システムであるが、ＶＬＰの開発の観
点から多くの可能性を有している。ＶＬＰタンパク質の生産で発生しうるウイルス、がん遺伝子、腸毒素のような様々な汚染源を確実に排除することができ、有用物質の需要が急増する場合、大量生産に必要な設備技術やコスト面において、従来の動物細胞システムと比較して、絶対的に有利なので、最短期間に低コストで大量生産が可能であるという長所がある。また、哺乳類細胞と類似のＰＴＭを有していて、ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰおよびｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰの両方に対して生産可能であるという特徴がある。
点から多くの可能性を有している。ＶＬＰタンパク質の生産で発生しうるウイルス、がん遺伝子、腸毒素のような様々な汚染源を確実に排除することができ、有用物質の需要が急増する場合、大量生産に必要な設備技術やコスト面において、従来の動物細胞システムと比較して、絶対的に有利なので、最短期間に低コストで大量生産が可能であるという長所がある。また、哺乳類細胞と類似のＰＴＭを有していて、ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰおよびｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐ ＶＬＰの両方に対して生産可能であるという特徴がある。
【0009】
しかしながら、上記提示した長所にもかかわらず、植物細胞からタンパク質を生産することは、動物細胞および微生物を含む他の宿主に比べて相対的に最適化されていない分離精製方法が最も大きな障害物となっている。これより、多くの研究が進行されており、様々な方法で植物細胞からタンパク質の生産性を高めるための試みが行われている。例えば、特許文献１によれば、セルロース結合ドメイン３を含む組み換えベクターおよび前記組み換えベクターを用いて形質転換された植物体で合成されたタンパク質をセルロースに結合し、目的タンパク質を含む融合タンパク質を分離することが可能であり、融合タンパク質にエンテロキナーゼを処理し、目的タンパク質とセルロース結合ドメインを効率的に分離することができると提示されたことがある。
【0010】
また、目的タンパク質を生産することができるタンパク質分離精製技術のさらに他の例として、特許文献２によれば、生理活性タンパク質またはペプチドを免疫グロブリンＦｃ断片と結合させる場合、免疫グロブリンＦｃ断片が結合されていない生理活性タンパク質またはペプチドより生理活性タンパク質またはペプチドの溶解度を改善する効果があることが提示されたことがある。
【0011】
したがって、前述のような従来技術に基づいて植物体から有用生理活性物質を生産する場合、従来使用されている方法である動物細胞や微生物を用いた生産方法を代替できる効果がある。第一に、有用生理活性物質の生産に必要な期間を短縮することができ、生産コストをも画期的に減らすことができる。第二に、動物細胞や微生物で合成されたタンパク質を分離精製する過程で生じうる細胞毒性のような汚染源を確実に排除することができ、第三に、商品化された場合、種子の形態で長期間保管が可能で、保存および保管費用を節減することができる。第四に、安全な種子の形態で運送することができ、緊急を要求する問題が発生するときに必要な地域および国に迅速に供給することができる。第五に、生理活性物質に対する需要が急増する場合、大量生産に必要な生産設備およびシステム構築に多くの技術が要求されないため、容易に大量化することができ、動物細胞システムを用いた生産システムと比較して、設置コストと製品生産コストを画期的に低減することできる長所があり、最短時間に大量生産を可能にして、需要による十分な供給が可能である。
【0012】
前述したように、医学的に適用可能なＶＬＰタンパク質と産業的に有用な価値がある酵素を含む有用生理活性物質を植物体から効果的に合成および分離精製する様々な技術が提供されているにも関わらず、タンパク質ごとに持っている固有な特性が互いに異なっていて、特定の方法を一括的に適用することが好ましくないので、個別的な研究が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0013】
【特許文献1】韓国登録特許第１０－１８４８０８２号公報
【特許文献2】韓国公開特許第１０－２０１５－０１１３９３４号公報
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0014】
本発明は、前述したような従来技術の問題点を解決するためになされたものであって、形質転換植物体で目的タンパク質であるウイルス様粒子を形成する組み換えＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ Ｍｏｓａｉｃ Ｖｉｒｕｓ）を生産するに際して、翻訳段階でタンパク質の発現レベルを高めるために、葉緑体に標的化されるようにルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）を目的タンパク質に融合し、分離精製のためにポリヒスチジンを付着した場合、タンパク質の発現レベルと分離精製効率が高まることを確認し、これを用いて形質転換植物体で目的タンパク質の生産効率を画期的に高めることができることを確認した。
【0015】
また、上記のように分離精製されたＡＭＶを含む溶液の組成、ｐＨおよびＮａＣｌの濃度を適切に調節する場合、ウイルス様粒子が形成されることを様々な実験的な方法で確認した。このようなウイルス様粒子の高分解能３次構造の糾明を通じてワクチンおよび治療剤の開発に活用可能なＶＬＰプラットフォーム（ｐｌａｔｆｏｒｍ）技術を確立することによって、本発明を完成した。
【0016】
これより、本発明の目的は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、植物体発現用組み換えベクターを提供することにある。
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、植物体発現用組み換えベクターを提供することにある。
【0017】
本発明の他の目的は、本発明の組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体を提供することにある。
【0018】
本発明のさらに他の目的は、前記組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製方法およびこれによって製造された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を提供することにある。
【0019】
本発明のさらに他の目的は、前記組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＶＬＰ）の製造方法およびこれによって製造された組み換えＡＭＶウイルス様粒子を提供することにある。
【0020】
本発明のさらに他の目的は、本発明による組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法を提供することにある。
【0021】
本発明のさらに他の目的は、本発明による組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含む薬物伝達体を提供することにある。
【0022】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていないさらに他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【0023】
前述のような本発明の目的を達成するために、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＡＭＶ（Ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）カプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、植物体発現用組み換えベクターを提供する。
【0024】
本発明の一具体例において、前記ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号１で表される塩基配列を含み、前記ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号３または１０で表される塩基配列を含んでもよいが、これに限定されない。
【0025】
本発明の他の具体例において、前記組み換えベクターは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグ（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含んでもよいが、これに限定されない。
【0026】
本発明のさらに他の具体例において、前記ポリヒスチジンタグは、前記ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＣ末端またはＮ末端に連結されたものであってもよいが、これに限定されない。
【0027】
本発明のさらに他の具体例において、前記組み換えベクターは、プロモーターとターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間に、（１）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されているか；または（２）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、およびＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されていてもよいが、連結順序が制限されるものではない。
【0028】
また、本発明は、本発明による組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体を提供する。
【0029】
また、本発明は、下記段階を含む、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；および
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；および
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
【0030】
本発明の一具体例において、前記タンパク質抽出緩衝溶液は、下記特徴のうち１つ以上を満たせるが、これに限定されるものではない：（１）１０～１００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）、１００～１５００ｍＭ 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０１～１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））Ｘ－１００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐ－（１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）－ｐｈｅｎｙｌｅｔ
ｈｅｒ）、および５～３００ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含む；または（２）ｐＨが７～９である。
ｈｅｒ）、および５～３００ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含む；または（２）ｐＨが７～９である。
【0031】
本発明の他の具体例において、前記アガロースは、Ｎｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースであってもよいが、これに限定されない。
【0032】
本発明のさらに他の具体例において、前記（Ｓｔｅｐ １）段階は、前記組み換えベクターが導入されたバクテリアを用いて植物体を形質転換させるものであってもよいが、これに限定されない。
【0033】
本発明のさらに他の具体例において、前記バクテリアは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であってもよいが、これに限定されない。
【0034】
本発明のさらに他の具体例において、前記植物体は、シロイヌナズナ、大豆、タバコ、ナス、唐辛子、ジャガイモ、トマト、白菜、キャベツ、およびレタスからなる群から選ばれる双子葉植物；または稲、麦、小麦、ライ麦、とうもろこし、サトウキビ、エンバク、およびタマネギからなる群から選ばれる単子葉植物であってもよいが、これに限定されない。
【0035】
また、本発明は、本発明による分離精製方法によって溶出された、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を提供する。
【0036】
本発明の一具体例において、前記組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、下記特徴のうち１つ以上を満たすことができるが、これに限定されない：（１）三量体（ｔｒｉｍｅｒ）構造で存在する；または（２）サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で三量体の分子量が約１００ｋＤａで現れる。
【0037】
また、本発明は、下記段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＶＬＰ）の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階；および
（Ｓｔｅｐ ７）前記（Ｓｔｅｐ ６）で溶出されたタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階；および
（Ｓｔｅｐ ７）前記（Ｓｔｅｐ ６）で溶出されたタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階。
【0038】
本発明の一具体例において、前記（Ｓｔｅｐ ７）段階は、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれたタンパク質抽出緩衝溶液をウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液に交替することによって、ウイルス様粒子を製造することができるが、これに限定されない。
【0039】
本発明の他の具体例において、前記ウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液は、下記特徴のうち１つ以上を満たすことができるが、これに限定されるものではない：（１）２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含む；または（２）ｐＨが６．９～７．５である。
【0040】
本発明のさらに他の具体例において、前記製造方法は、自己集合された組み換えＡＭＶウイルス様粒子を精製するためにサイズ排除クロマトグラフィーを行う段階をさらに含んでもよいが、これに限定されない。
【0041】
また、本発明は、本発明によるウイルス様粒子製造方法によって製造された、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を提供する。
【0042】
本発明の一具体例において、前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子は、下記特徴のうち１つ以上を満たすことができるが、これに限定されるものではない：（１）サイズ排除クロマトグラフィーで分子量が約２，０００ｋＤａ以上で現れる；（２）陰性染色法で染色後、透過電子顕微鏡で観察したとき、直径が１０ｎｍ以上４０ｎｍ以下である；または（３）超低温透過電子顕微鏡で観察し、３Ｄ構造（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）したとき、３個の複合体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）が規則的な配列を通じて全２０個が組み立てられた球形のＶＬＰ（３ｘ２０）である。
【0043】
また、本発明は、下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得したウイルス様粒子を極超低温電子顕微鏡を用いて３Ｄ構造を糾明する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記ウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得したウイルス様粒子を極超低温電子顕微鏡を用いて３Ｄ構造を糾明する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記ウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
【0044】
本発明の一具体例において、前記ワクチン組成物の製造方法は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を添加する段階をさらに含んでもよいが、これに限定されない。
【0045】
本発明の他の具体例において、前記ワクチン組成物の製造方法は、下記特徴のうち１つを満たすことができるが、これに限定されない：（１）前記（Ｓｔｅｐ １）段階の組み換えベクターは、抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結される；または（２）前記（Ｓｔｅｐ ５）は、ウイルス様粒子の表面に抗原タンパク質を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させる段階を含む。
【0046】
また、本発明は、前記ワクチン組成物の製造方法によって製造された、ワクチン組成物を提供する。
【0047】
すなわち、本発明は、前記ＡＭＶウイルス様粒子および抗原を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。
【0048】
また、本発明は、ワクチン製造のための前記ＡＭＶウイルス様粒子の用途を提供する。
【0049】
また、本発明は、前記ＡＭＶウイルス様粒子の抗原提示および伝達用途を提供する。
【0050】
また、本発明は、前記ＡＭＶウイルス様粒子および抗原を有効成分として含むワクチン組成物をこれを必要とする個体に投与する段階を含む、疾患の予防または治療用途を提供する。
【0051】
また、本発明は、下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含む薬物伝達体の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質溶液を第１緩衝溶液に交替して組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）の溶液に薬物を添加する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記（Ｓｔｅｐ ４）の第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替し、ウイルス様粒子を製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質溶液を第１緩衝溶液に交替して組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）の溶液に薬物を添加する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記（Ｓｔｅｐ ４）の第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替し、ウイルス様粒子を製造する段階。
【0052】
本発明の一具体例において、前記（Ｓｔｅｐ ５）の第１緩衝溶液および第２緩衝溶液は、下記特徴を満たすことができるが、これに限定されない：（１）第１緩衝溶液は、１０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、および１００～５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である；および（２）第２緩衝溶液は、２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である。
【0053】
また、本発明は、前記薬物伝達体の製造方法によって製造された、薬物伝達体を提供する。
【0054】
また、本発明は、本発明による組み換えＡＭＶウイルス様粒子の薬物伝達用途を提供する。
【0055】
また、本発明は、薬物伝達体の製造のための前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子の用途を提供する。
【0056】
また、本発明は、薬物が担持された前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子をこれを必要とする個体に投与する段階を含む薬物伝達方法を提供する。
【発明の効果】
【0057】
本発明は、葉緑体に標的化される植物発現ベクターを用いて植物から組み換えＡＭＶを高効率で生産する方法およびこれを用いた組み換えＡＭＶ ＶＬＰの製造方法に関する。高分解能で糾明された３次構造の特性上、本発明による組み換えＡＭＶ ＶＬＰは、ワクチン、治療剤、および薬物伝達体などの開発のためのプラットフォーム（Ｐｌａｔｆｏｒｍ）として活用可能である。また、本発明は、植物発現システムを用いるので、生産費用を格別に低減することができ、従来広く知られた方法（動物細胞や微生物からタンパク質を生産した後に分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、がん遺伝子、腸毒素など）を確実に遮断することができる。また、本発明は、動物細胞が必須的に含む翻訳後修飾過程が起こる真核生物タンパク質の合成経路を含んでいて、生理活性を維持し
ているタンパク質の生産が可能で、商品化段階でも動物細胞やバクテリアとは異なって、種子（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）として管理が可能であるという点から有利である。さらには、当該物質の需要が急増する場合、大量生産に必要な設備技術やコスト面において、従来の動物細胞またはバクテリアを用いた生産システムと比較して、さらに効率的かつ経済的であるから、需要の発生に合わせて短期間に大量生産および供給が可能であるという長所もある。
ているタンパク質の生産が可能で、商品化段階でも動物細胞やバクテリアとは異なって、種子（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）として管理が可能であるという点から有利である。さらには、当該物質の需要が急増する場合、大量生産に必要な設備技術やコスト面において、従来の動物細胞またはバクテリアを用いた生産システムと比較して、さらに効率的かつ経済的であるから、需要の発生に合わせて短期間に大量生産および供給が可能であるという長所もある。
【図面の簡単な説明】
【0058】
【図1】図１は、本発明の一実施例による植物体で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現のための６種の組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現カセット（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃａｓｓｅｔｔｅ）を示す図である。図１のＮ末端（上段）は、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端に６ｘＨｉｓ（ポリヒスチジンタグ）を付着した形態で細胞質（ｃｙｔｏｓｏｌ）、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ）、または葉緑体（ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ）でＡＭＶカプシドタンパク質が発現できるようにデザインされた植物発現ベクターのカセットである。図１のＣ末端（下段）は、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＣ末端に６ｘＨｉｓを付着した形態で細胞質、小胞体、または葉緑体でＡＭＶカプシドタンパク質が発現できるようにデザインされた植物発現ベクターのカセットである（Ｈ、ポリヒスチジンタグ；ＨＳＰ－Ｔ、Ｈｓｐターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）；ＮＲ、ルビスコトランジットペプチド；ＮＢ、Ｎｅｗ ＢｉＰ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ；ＨＤＥＬ、ＥＲ ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）。
【図2】図２は、本発明の一実施例による植物体で互いに異なる６種の植物発現ベクターによる組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現をウェスタンブロッティング（ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）で確認した結果を示す図である。
【図4A】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）形態からＶＬＰ形態で製作する条件を確認する結果を示す図である。図４Ａは、実施例４の第１緩衝溶液で平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す。
【図4B】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をサイズ排除クロマトグラフィーを用いて三量体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ）形態からＶＬＰ形態で製作する条件を確認する結果を示す図である。図４Ｂは、実施例４の第２緩衝溶液で平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィー結果を示す。
【図6A】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶ ＶＬＰを極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて撮影したイメージを示す図である。図６Ａは、ＡＭＶ ＶＬＰの２Ｄ（ｔｗｏ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ）ｃｌａｓｓ ａｖｅｒａｇｅを示す。
【図6B】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶ ＶＬＰを極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて撮影したイメージを示す図である。図６Ｂは、２Ｄ ｃｌａｓｓ ａｖｅｒａｇｅを基に構成した、ＡＭＶ ＶＬＰの２０面体の３Ｄ構造を示す。
【図6C】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶ ＶＬＰを極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて撮影したイメージを示す図である。図６Ｃは、ＡＭＶ ＶＬＰの３次構造を基に分解能を測定した結果を示す。
【図6D】本発明において分離精製された組み換えＡＭＶ ＶＬＰを極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いて撮影したイメージを示す図である。図６Ｄは、ＡＭＶ ＶＬＰのイメージプロセッシングとモデルビルディングの進行手続きを示すフローチャットである。
【図7A】本発明において極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および構造分析ソフトウェアを用いて組み換えＡＭＶ ＶＬＰの全体的な構造、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の構造およびアミノ酸の位置を分析した図である。図７Ａは、Ｃｒｙｏ－ＥＭ ｍａｐのＬｏｃａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎを示す。
【図7B】本発明において極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および構造分析ソフトウェアを用いて組み換えＡＭＶ ＶＬＰの全体的な構造、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の構造およびアミノ酸の位置を分析した図である。図７Ｂは、ａｔｏｍｉｃ ｍｏｄｅｌのＢ－ｆａｃｔｏｒを示す。
【発明を実施するための形態】
【0059】
本発明者らは、形質転換植物体で目的タンパク質であるウイルス様粒子を形成する組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を生産するに際して、翻訳段階でタンパク質の発現レベルを高めるために、葉緑体に標的化されるようにルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）を目的タンパク質に融合し、分離精製のためにポリヒスチジンタグを付着した場合、タンパク質の発現レベルと分離精製効率が高まることを確認し、これを用いて形質転換植物体で目的タンパク質の生産効率を画期的に高めることができることを確認し、また、緩衝溶液の組成の調節を通じてＡＭＶカプシドタンパク質がＶＬＰを良好に形成することができることを確認することによって、本発明を完成した。
【0060】
これより、本発明の一実施例では、Ｎ末端とＣ末端にポリヒスチジンタグがそれぞれ融合したＡＭＶカプシドタンパク質が細胞質で発現できるようにｐＣＡＭＢＩＡ１３００植物発現ベクター（１）を製作し、同じ形態のタンパク質を葉緑体で発現できるように、（１）にＲｂｃ－ＴＰ（ルビスコトランジットペプチド）を融合したり、小胞体で発現できるように（１）にＮＢ（Ｎｅｗ ＢｉＰ）シグナルペプチドを融合した。また、それぞれの細胞小器官でＡＭＶカプシドタンパク質コーディングポリヌクレオチドのＮ末端またはＣ末端でＡＭＶカプシドタンパク質が発現するようにデザインし、全６種の植物発現ベクターを製作した（実施例１参照）。
【0061】
本発明の他の実施例では、前記植物発現ベクターをアグロバクテリアに形質転換させた後、これをニコチアナベンサミアナ葉の裏面に注入し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を植物体で発現させた（実施例２参照）。
【0062】
本発明のさらに他の実施例では、前記組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が発現するニコチアナベンサミアナ葉からＮｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースレジンで充填されたカラムを用いて組み換えタンパク質を分離精製し、これをウイルス様粒子を作るための緩衝溶液の組成を調節して、ＡＭＶカプシドタンパク質の自己集合を誘導した。具体的には、第１緩衝溶液中では、ＡＭＶカプシドタンパク質が三量体
を形成し、第２緩衝溶液中では、ＡＭＶカプシドタンパク質がウイルス様粒子を組み立てることを確認した（実施例３～４参照）。
を形成し、第２緩衝溶液中では、ＡＭＶカプシドタンパク質がウイルス様粒子を組み立てることを確認した（実施例３～４参照）。
【0063】
本発明のさらに他の実施例では、上記で得たＡＭＶウイルス様粒子を含む組成物を透過電子顕微鏡を用いてｐＨ変化によるＶＬＰの安定性を確認し、ｐＨ５とｐＨ７の間でＶＬＰ形態を安定的に維持していることを確認した（実施例５参照）。
【0064】
本発明のさらに他の実施例では、極超低温電子顕微鏡を用いて前記ＡＭＶ ＶＬＰの高分解能３次構造を確認した（実施例６および７参照）。
【0065】
これより、本発明は、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含むルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ－ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチド、および配列番号４で表されるアミノ酸配列を含むＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、植物体発現用組み換えベクターを提供することができる。
【0066】
本明細書において使用される用語「ルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、ルビスコ（Ｒｉｂｕｌｏｓｅ－１，５－Ｂｉｓｐｈｏｓｐｈａｔｅ Ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ／Ｏｘｙｇｅｎａｓｅ）小サブユニット（ｓｍａｌｌ ｓｕｂｕｎｉｔ）のＮ末端トランジットペプチド（Ｎ－ｔｅｒｍｉｎａｌ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）を称し、好ましくは、配列番号１の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号１で表されるポリヌクレオチドによってコードされるが、配列番号１の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列によってコードされてもよい。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、２つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域におけるポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適配列に対する参考配列（追加または削除を含まない）に比べて追加または削除（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。前記ルビスコトランジットペプチドは、形質転換植物体で発現した組み換えタンパク質を葉緑体内に移動させるために使用されるものであり、発現するときに配列の一部が切られ、一部のアミノ酸のみが残っていてもよい。より具体的には、本発明によるルビスコトランジットペプチドが融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を植物体で発現させる場合、前記ルビスコトランジットペプチドの前方５４個のアミノ酸が切られて除去され、配列番号２で表されるアミノ酸配列のみが残っていてもよい。また、このような場合、ＤＮＡ ｆｒａｍｅを整列するために、ルビスコトランジットペプチド配列とＡＭＶカプシドタンパク質配列との間にさらなるアミノ酸が挿入されてもよく、好ましくは、グリシン（Ｇｌｙｃｉｎｅ）、またはイソロイシン（Ｉｓｏｌｅｕｃｉｎｅ）がさらに挿入されてもよい。
【0067】
本明細書において使用される用語「ＮＢ（Ｎｅｗ ＢｉＰ）」は、発現した組み換えタンパク質を小胞体に移動させるために使用されるものであり、好ましくは、配列番号９の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは、配列番号９で表される遺伝子であるが、配列番号９の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含んでもよい。前記ＮＢ遺伝子は、発現するとき、配列の全部が切られていて、ＢｉＰに対するどんなアミノ酸も残っていない。
【0068】
本明細書において使用される用語「トランジットペプチド（ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）」または「シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、特定の細胞小器官、細胞区画、細胞外へのタンパク質の輸送または局在化を誘導できるアミノ酸配列を指す。この用語は、トランジットペプチドおよびトランジットペプチドをコード化する塩基配列の全てを含む。
【0069】
本明細書において使用される用語「ＡＭＶ」は、アルファルファモザイクウイルス（Ａｌｆａｌｆａ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）を指すものであり、２０面体の非エンベロープ（ｎｏｎ－ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ）ＤＮＡウイルスである。ＡＭＶは、植物にモザイク形状の病変を起こすウイルスであるが、ヒトや動物にはいかなる感染および病変を起こさないと知られている。本発明において「ＡＭＶ」は、配列番号３または１０の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、より好ましくは、配列番号３または１０で表されるポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号３で表されるポリヌクレオチドによってコードされるが、配列番号３または１０の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列によってコードされてもよい。
【0070】
本明細書において使用される用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、一般的に、リン酸ジエステル結合によって互いに結合した２以上の連結されたヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体を含むオリゴマーまたはポリマーを示す。ポリヌクレオチドは、また、例えば、ヌクレオチド類似体、またはリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えば、リン酸三エステル結合、ホスホルアミダート結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合またはペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡおよびＲＮＡ誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖ポリヌクレオチド、例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）だけでなく、ＲＮＡまたはＤＮＡのうちいずれか１つの類似体を含む。
【0071】
本明細書において使用される用語「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」とは、好適な宿主内でＤＮＡを発現させることができる好適な調節配列に作動可能に連結されたＤＮＡ配列を含有するＤＮＡ作製物を意味する。ベクターは、プラスミド、ファージ粒子、または簡単に潜在的ゲノム（ｇｅｎｏｍｅ）挿入物であってもよい。好適な宿主に形質転換されると、ベクターは、宿主のゲノムと関係なく複製し、機能することができるか、または場合によっては、ゲノムそれ自体に統合されていてもよい。プラスミドが現在ベクターの最も通常的に使用される形態であるから、用語「プラスミド（ｐｌａｓｍｉｄ）」および「ベクター（ｖｅｃｔｏｒ）」は、時には相互交換的に使用されてもよい。しかしながら、本発明は、当業界において知られたまたは知られるものと同等な機能を有するベクターの他の形態を含む。
【0072】
本発明のルビスコトランジットペプチドは、配列番号２で表されるアミノ酸配列を含んでもよいし、また、ＡＭＶカプシドタンパク質は、配列番号４で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。また、本発明のルビスコトランジットペプチドのアミノ酸配列には、配列番号２の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的には、前記ペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。また、本発明のＡＭＶカプシドタンパク質のアミノ酸配列には、配列番号４の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的には、前記タンパク質配列番号４のアミノ酸配列と９０％以上、より好ましくは、９５％以上、最も好ましくは、９８％以上の配列相同性を有するアミノ酸配列を含んでもよい。
【0073】
また、本発明の組み換えベクターは、配列番号６で表されるアミノ酸配列を含むポリヒスチジンタグ（Ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｔａｇ）をコードするポリヌクレオチドを
さらに含んでもよい。前記ポリヒスチジンタグは、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号５で表されるポリヌクレオチドによってコードされる。
さらに含んでもよい。前記ポリヒスチジンタグは、配列番号５で表される塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号５で表されるポリヌクレオチドによってコードされる。
【0074】
前記ポリヒスチジンタグは、本発明の目的タンパク質であるＡＭＶに加えて、さらに容易な分離のために含まれるものであり、これを代替できるタグ用遺伝子としては、代表的にＡｖｉタグ、Ｃａｌｍｏｄｕｌｉｎタグ、ｐｏｌｙｇｌｕｔａｍａｔｅタグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ １タグ、Ｓｏｆｔａｇ ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれてもよい。
【0075】
また、前記ポリヒスチジンタグは、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端またはＣ末端に連結されたものであってもよく、好ましくは、Ｃ末端に連結されたものであってもよい。
【0076】
また、本発明の組み換えベクターは、プロモーターとターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間に、（１）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されているか；または（２）ルビスコトランジットペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンタグをコードするポリヌクレオチド、およびＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドが順次に連結されているものであってもよいが、連結順序が制限されるものではない。前記（１）の場合、組み換えベクターに挿入される全体ｉｎｓｅｒｔ配列は、配列番号１１の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされ、最も好ましくは、配列番号１１で表されるポリヌクレオチドによってコードされるが、配列番号１１の塩基配列と８０％以上、より好ましくは、９０％以上、さらに好ましくは、９５％以上の配列相同性を有する塩基配列によってコードされてもよい。
【0077】
前記プロモーターには、ｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれてもよく、最も好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであってもよい。前記ターミネータは、一例として、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどが含まれてもよく、最も好ましくは、ＨＳＰターミネータであってもよい。しかしながら、前記のようなプロモーターまたはターミネータの例は、ただ例示であり、これらに限定されない。
ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ ｍｏｓａｉｃ ｖｉｒｕｓ）由来１９Ｓ ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（Ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ ｖｉｒｕｓ ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉａｌ ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ－１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ－１ ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれてもよく、最も好ましくは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターであってもよい。前記ターミネータは、一例として、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１ Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウムツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどが含まれてもよく、最も好ましくは、ＨＳＰターミネータであってもよい。しかしながら、前記のようなプロモーターまたはターミネータの例は、ただ例示であり、これらに限定されない。
【0078】
本発明の他の様態として、本発明による組み換えベクターで形質転換された、形質転換植物体を提供することができる。
【0079】
本明細書において使用される用語「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」は、注入されたＤＮＡによって生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換植物体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｐｌａｎｔ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入
して製造された植物体であり、好ましくは、本発明の組み換え発現ベクターにより形質転換された植物体であり、前記植物体は、本発明の目的を達成するためのものであれば、制限がない。
して製造された植物体であり、好ましくは、本発明の組み換え発現ベクターにより形質転換された植物体であり、前記植物体は、本発明の目的を達成するためのものであれば、制限がない。
【0080】
また、本発明による形質転換植物体は、形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法（ｐａｒｔｉｃｌｅ ｇｕｎ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）、超音波処理法（ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ）、電気衝撃法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、またはＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎ ｇｌｙｃｏｌ）媒介形質転換方法などの方法で製造することができるが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。
【0081】
本発明の他の様態として、本発明は、下記段階を含む、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；および
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；および
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階。
【0082】
本発明は、また、前記分離精製方法によって溶出された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を提供する。
【0083】
本発明によるタンパク質抽出緩衝溶液は、１０～１００ｍＭ トリス（Ｔｒｉｓ）、１００～１５００ｍＭ 塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）、０．０１～１％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））Ｘ－１００（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ ｐ－（１，１，３，３－ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ）－ｐｈｅｎｙｌｅｔｈｅｒ）、および５～３００ｍＭ イミダゾール（Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）を含んでもよい。より好ましくは、前記タンパク質抽出緩衝溶液は、１０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、５００～１２００ｍＭ ＭｇＣｌ２、０．０１～０．７％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））Ｘ－１００、および５～１００ｍＭ イミダゾールを含んでもよい。最も好ましくは、前記タンパク質抽出緩衝溶液は、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１Ｍ ＭｇＣｌ２、０．５％ トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標））Ｘ－１００、および１０ｍＭ イミダゾールを含んでもよい。本発明において、トリス（Ｔｒｉｓ）はＨＣｌであり、ｐＨが８．０に滴定されたものであってもよい（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）。
【0084】
また、本発明によるタンパク質抽出緩衝溶液は、ｐＨが７～９であってもよく、好ましくは、ｐＨが７．５～８．５であってもよい。最も好ましくは、前記タンパク質抽出緩衝溶液は、ｐＨが８であってもよい。
【0085】
本発明によるアガロースは、Ｎｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースであってもよい。
【0086】
また、本発明において前記（Ｓｔｅｐ １）段階は、組み換えベクターが導入されたバクテリアを用いて植物体を形質転換させるものであってもよく、前記バクテリアは、好ましくは、アグロバクテリウムツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）であってもよい。
【0087】
本発明において、前記植物体は、シロイヌナズナ、大豆、タバコ、ナス、唐辛子、ジャガイモ、トマト、白菜、キャベツ、およびレタスからなる群から選ばれる双子葉植物；または稲、麦、小麦、ライ麦、とうもろこし、サトウキビ、エンバク、およびタマネギからなる群から選ばれる単子葉植物であってもよい。
【0088】
本明細書において使用される用語「植物体」は、本発明の組み換えタンパク質を大量生産できる植物であれば、制限なしで使用することができるが、より具体的には、前記列挙した植物体群から選ばれるものであってもよく、好ましくは、タバコであってもよい。本発明におけるタバコは、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｇｅｎｕｓ）植物であり、タンパク質を過発現できるものであれば、特に種類の制限を受けず、形質転換方法とタンパク質大量生産の目的に合うように適切な品種を選択して本発明を実施することができる。例えば、ニコチアナベンサミアナＬ．（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ Ｌ．）またはニコチアナタバカムｃｖ．クサンチ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔａｂａｃｕｍ ｃｖ．Ｘａｎｔｈｉ）などの品種を用いることができる。
【0089】
本明細書において使用される用語「カプシド（ｃａｐｓｉｄ）」は、ウイルスの皮（ｃｏａｔ）を構成するタンパク質を指す。自然的に、カプシドは、自己集合（ｓｅｌｆ－ａｓｓｅｍｂｌｙ）してウイルス皮を形成し、ウイルスのゲノムは、前記皮内にパッケージング（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）される。ウイルス様粒子の場合、ウイルスゲノムなしでカプシドのみで構成される。本発明による組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、個別的（単量体）に存在したり、多量体（例えば、三量体）の状態で存在していてもよく、ウイルス様粒子で自己集合した状態で存在していてもよい。また、本発明による組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の三量体は、サイズ排除クロマトグラフィー（ｓｉｚｅ－ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）で分子量が約１００ｋＤａで現れることができる。本明細書の全般において、用語「約」は、±１０％を意味する。したがって、分子量約１００ｋＤａは、９０ｋＤａ～１１０ｋＤａを意味する。
【0090】
本発明は、また、下記段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ－ｌｉｋｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ；ＶＬＰ）の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階；および
（Ｓｔｅｐ ７）前記（Ｓｔｅｐ ６）で溶出されたタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体をタンパク質抽出緩衝溶液と混合し、植物体混合液を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した混合液から植物デブリ（ｄｅｂｒｉｓ）が除去された混合液を回収する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得した混合液をアガロース（ａｇａｒｏｓｅ）で充填されたカラムに注入し、ポリヒスチジンタグが連結された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を前記アガロースに吸着させる段階；
（Ｓｔｅｐ ５）洗浄溶液をカラムに注入し、洗浄する段階；
（Ｓｔｅｐ ６）溶出溶液をカラムに注入し、アガロースに吸着した前記組み換えタンパク質を溶出させる段階；および
（Ｓｔｅｐ ７）前記（Ｓｔｅｐ ６）で溶出されたタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階。
【0091】
また、本発明は、前記製造方法によって製造された、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を
提供する。
提供する。
【0092】
前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子は、サイズ排除クロマトグラフィーで分子量が約２，０００ｋＤａ以上で現れることもできる。
【0093】
また、前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子は、陰性染色法で染色後、透過電子顕微鏡で観察したとき、直径が１０ｎｍ以上４０ｎｍ以下、好ましくは、２０ｎｍ以上３０ｎｍ以下の球状または環状であってもよい。
【0094】
また、前記組み換えＡＭＶウイルス様粒子は、超低温透過電子顕微鏡で観察し、３Ｄ構造（３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を再構成（ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）したとき、３個の複合体（ｔｒｉｍｅｒｉｃ ｃｏｍｐｌｅｘ）が規則的な配列を通じて全２０個が組み立てられた球形のＶＬＰ（３×２０）であってもよい。
【0095】
本発明において前記（Ｓｔｅｐ ７）段階は、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれたタンパク質抽出緩衝溶液をウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液に交替することによって、ウイルス様粒子を製造することもできる。すなわち、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、前記ウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液中でウイルス様粒子に自己集合する。
【0096】
具体的には、前記ウイルス様粒子製造方法は、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が自己集合によってウイルス様粒子を形成できるように、フィルターを用いてタンパク質抽出緩衝溶液をウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液に交替する段階および濃縮する段階を含んでもよい。
【0097】
本発明において、前記ウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液は、２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。好ましくは、前記緩衝溶液は、３０～７０ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび３００～７００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。最も好ましくは、前記緩衝溶液は、５０ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。本明細書において、前記用語「ウイルス様粒子組み立て用緩衝溶液」は、「第２緩衝溶液」と相互交換的に使用される。
【0098】
また、前記緩衝溶液のｐＨは、ｐＨ６．９～７．５，好ましくは、ｐＨ６．９～７．２，最も好ましくは、ｐＨ７であってもよい。
【0099】
また、前記ウイルス様粒子製造方法は、自己集合した組み換えＡＭＶウイルス様粒子を精製するためにサイズ排除クロマトグラフィーを行う段階をさらに含んでもよい。
【0100】
本発明は、また、下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含むワクチン組成物の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階；および
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得したウイルス様粒子を極超低温電子顕微鏡を用いて３Ｄ構造を糾明する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記ウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をウイルス様粒子に製造する段階；および
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）段階で収得したウイルス様粒子を極超低温電子顕微鏡を用いて３Ｄ構造を糾明する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記ウイルス様粒子を含むワクチン組成物を製造する段階。
【0101】
すなわち、本発明は、本発明による組み換えＡＭＶウイルス様粒子および抗原タンパク質を有効成分として含むワクチン組成物を提供する。
【0102】
本発明において「ワクチン（ｖａｃｃｉｎｅ）」は、生体に免疫反応を起こす抗原を含有する生物学的な製剤であり、感染症の予防のためにヒトや動物に注射したり経口投与することによって、生体に免疫を生じさせる免疫原をいう。前記動物は、ヒトまたは非ヒト動物であり、前記非ヒト動物は、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ヤギ、ヒツジなどを指すが、これらに限定されない。
【0103】
本発明の「ワクチン組成物」または「薬物伝達体」は、それぞれ、通常の方法によって散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形および滅菌注射溶液の形態で剤形化して使用することができる。製剤化する場合には、通常使用される充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を用いて調製することができる。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記レシチン類似乳化剤に少なくとも１つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製することができる。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤をも使用することができる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などを使用することができ、頻繁に使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に様々な賦形剤、例えば、湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水溶性製剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤が含まれる。非水溶性製剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。
【0104】
本発明によるワクチン組成物または薬物伝達体の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が好ましい。本願に使用された用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液包内、胸骨内、硬膜内、病巣内および頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明のワクチン組成物は、また、直腸投与のための坐剤の形態で投与することができる。
【0105】
本発明によるワクチン組成物、薬学的組成物、または薬物伝達体の投与量は、個体の年齢、体重、性別、身体状態などを考慮して選択される。特別な副作用なしに個体に免疫保護反応を誘導するのに必要な量は、免疫原として使用された組み換えタンパク質および賦形剤の任意存在によって多様化することができる。
【0106】
本発明において前記ワクチン組成物の製造方法は、アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）を添加する段階をさらに含んでもよい。
【0107】
本発明において「アジュバント（Ａｄｊｕｖａｎｔ）」は、ワクチンまたは薬学的に活性がある成分に添加されて、免疫反応を増加させたり影響を与える物質または組成物をいう。代表的に、免疫原（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ）用キャリア（ｃａｒｒｉｅｒ）または補助物質および／または他の薬学的に活性がある物質または組成物を通常的に意味する。典型的に、用語「アジュバント」は、広い概念で解釈されるべきであり、前記アジュバントに統合されたり前記アジュバントとともに投与された抗原の免疫原性（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）を増進させることができる広い範囲の物質または策略（ｓｔｒａｔａｇｅｒｍ）を意味する。また、アジュバントは、これらに限定されず、免疫増強剤（ｉｍｍｕｎ
ｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）、抗原伝達系またはこれらの組み合わせに分けられる。
ｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｔｏｒ）、抗原伝達系またはこれらの組み合わせに分けられる。
【0108】
また、前記ワクチン組成物の製造方法は、下記特徴のうち１つを満たすことができる：（１）前記（Ｓｔｅｐ １）段階の組み換えベクターは、抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、前記抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結される；または（２）前記（Ｓｔｅｐ ５）は、ウイルス様粒子の表面に抗原タンパク質を結合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）させる段階を含む。
【0109】
本発明において「抗原タンパク質」は、本発明によるワクチン組成物を体内に注入したとき、抗体の生成を誘導するためのタンパク質を意味する。前記抗原タンパク質は、病原性タンパク質または組み換えタンパク質であってもよいが、抗体の生成を誘導できるタンパク質であれば、制限なしで含まれてもよい。前記抗原タンパク質は、本発明によるワクチン組成物の表面に提示（ｄｉｓｐｌａｙ）される。抗原タンパク質をコードするポリヌクレオチドがＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチドのＮ末端に連結される場合、抗原タンパク質は、本発明による組み換えベクターから組み換えＡＭＶカプシドタンパク質と共に発現し、カプシドタンパク質のウイルス様粒子の組み立て時に、当該表面に提示されるように一緒に組み立てられる。または、本発明によって組み換えＡＭＶウイルス様粒子を製造した後、当該表面に抗原タンパク質を結合させることによって、ワクチン組成物に抗原タンパク質を提示することができる。ウイルス様粒子の表面に外来タンパク質を結合させる方法は、当業界において知られたものであれば、制限なしで適用することができる。
【0110】
また、本発明は、前記ワクチン組成物製造方法によって製造されたワクチン組成物を提供する。
【0111】
前記ワクチン組成物には、アジュバントがさらに含まれてもよい。また、前記アジュバントは、アルム（ａｌｕｍ）であってもよいが、アジュバントとして使用するに適したいずれの種類のアルミニウム塩（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ ｓａｌｔ）も本発明に使用することができる。アルミニウム塩は、アルミニウムヒドロキシド（Ａｌ（ＯＨ）３）、アルミニウムホスフェート（ＡｌＰＯ４）、アルミニウムヒドロクロリド、アルミニウムサルフェート、アンモニウムアルム、ポタシウムアルムまたはアルミニウムシリケートなどが含まれる。好ましくは、アルミニウム塩アジュバントとして、アルミニウムヒドロキシドまたはアルミニウムホスフェートを使用することができる。
【0112】
また、本発明は、下記の段階を含む、組み換えＡＭＶウイルス様粒子を含む薬物伝達体の製造方法を提供する：
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質溶液を第１緩衝溶液に交替し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）の溶液に薬物を添加する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記（Ｓｔｅｐ ４）の第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替し、ウイルス様粒子を製造する段階。
（Ｓｔｅｐ １）本発明による組み換えベクターを用いて植物体を形質転換させる段階；
（Ｓｔｅｐ ２）前記（Ｓｔｅｐ １）段階で得た形質転換植物体から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を分離精製する段階；
（Ｓｔｅｐ ３）前記（Ｓｔｅｐ ２）段階で収得した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質溶液を第１緩衝溶液に交替し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体を製造する段階；
（Ｓｔｅｐ ４）前記（Ｓｔｅｐ ３）の溶液に薬物を添加する段階；および
（Ｓｔｅｐ ５）前記（Ｓｔｅｐ ４）の第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替し、ウイルス様粒子を製造する段階。
【0113】
本発明による薬物伝達体は、本発明による組み換えＡＭＶウイルス様粒子に薬物を含ませて、ウイルス様粒子を介して薬物を目標地点に伝達する。
【0114】
前記薬物には、抗がん剤などすべての種類の薬剤が制限なしで含まれてもよく、２つ以上の薬物が同時に本発明によるウイルス様粒子に担持されることもできる。
【0115】
本発明による薬物伝達体の製造方法において、前記（Ｓｔｅｐ ５）の第１緩衝溶液および第２緩衝溶液は、下記特徴を満たすことができる：（１）第１緩衝溶液は、１０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、および１００～５００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である；および（２）第２緩衝溶液は、２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウムを含み、ｐＨが６．９～７．５である。
【0116】
具体的には、本発明による組み換えベクターを植物体に形質転換させて組み換えＡＭＶカプシドタンパク質をタンパク質抽出緩衝溶液に分離精製した後、バッファーを第１緩衝溶液に交替すると、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質単量体が三量体を形成する。前記第１緩衝溶液は、１０～１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、および１００～５００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。好ましくは、前記緩衝溶液は、１０～５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、および２００～４００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。最も好ましくは、前記緩衝溶液は、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、および３００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。本発明において、トリス（Ｔｒｉｓ）は、ＨＣｌに滴定されたものであってもよい（Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ）。
【0117】
次に、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質三量体に薬物を添加した後、第１緩衝溶液を第２緩衝溶液に交替すると、薬物が担持された組み換えＡＭＶウイルス様粒子が製造される。前記薬物は、ウイルス様粒子の内部に含まれているか、またはウイルス様粒子の表面に結合されていてもよいが、位置が限定されない。前記第２緩衝溶液は、２０～１００ｍＭ ピロリン酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）および１００～１０００ｍＭ 塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含んでもよい。好ましくは、前記緩衝溶液は、３０～７０ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび３００～７００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。最も好ましくは、前記緩衝溶液は、５０ ｍＭ ピロリン酸ナトリウムおよび５００ｍＭ ＮａＣｌを含んでもよい。
【0118】
また、前記第１緩衝溶液および第２緩衝溶液のｐＨがｐＨ６．９～７．５、好ましくは、ｐＨ６．９～７．２、最も好ましくは、ｐＨ７であってもよい。
【0119】
本明細書および請求範囲に使用された用語や単語は、通常的または辞書的な意味に限定して解すべきものではなく、発明者は、自分の発明を最も最善の方法で説明するために用語の概念を適切に定義することができるという原則に基づいて本発明の技術的思想に符合する意味と概念で解すべきである。
【0120】
以下、本発明の理解を助けるために好適な実施例を示す。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【0121】
実施例１：組み換えＡＭＶカプシドタンパク質発現用植物発現ベクターの製作
図１の切断地図に示されたように、植物体で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を発現させることができるように組み換えした植物体発現用ベクターを製作した。
図１の切断地図に示されたように、植物体で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を発現させることができるように組み換えした植物体発現用ベクターを製作した。
【0122】
より具体的には、ＡＭＶカプシドタンパク質に対する遺伝子情報を確保し、ニコチアナベンサミアナ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ）における発現に最適化された配列で遺伝子（配列番号４）を合成した。ポリヒスチジンタグ（６ｘＨｉｓ－ｔａｇ
）の位置および標的細胞小器官によるＡＭＶカプシドタンパク質の発現パターンを確認するために、下記のように６種の発現用ベクターを製作した。
）の位置および標的細胞小器官によるＡＭＶカプシドタンパク質の発現パターンを確認するために、下記のように６種の発現用ベクターを製作した。
【0123】
細胞質に標的化される組み換えＡＭＶカプシドタンパク質植物発現ベクターは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨｓｐターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を中間に置いて前（Ｎ末端）または後（Ｃ末端）にそれぞれ６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を順次に連結して製作した。
【0124】
葉緑体に標的化される組み換えＡＭＶカプシドタンパク質植物発現ベクターは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨｓｐターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にルビスコトランジットペプチド（Ｒｕｂｉｓｃｏ ｔｒａｎｓｉｔ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）を順次に連結して製作した。この際、Ｎ末端ポリヒスチジンタグとＣ末端ポリヒスチジンタグを区分するために、ＡＭＶの前または後にそれぞれ６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を挿入した。
【0125】
小胞体に標的化される組み換えＡＭＶカプシドタンパク質植物発現ベクターは、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ３５Ｓプロモーター遺伝子とＨｓｐターミネータ（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ）との間にＮＢ（Ｎｅｗ ＢｉＰ）シグナルペプチド（ｓｉｇｎａｌ ｐｅｐｔｉｄｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号９）、ＡＭＶカプシドタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号３）およびＨＤＥＬ（Ｈｉｓ－Ａｓｐ－Ｇｌｕ－Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号７）を順に連結して製作した。この際、Ｎ末端ポリヒスチジンタグとＣ末端ポリヒスチジンタグを区分するために、ＡＭＶの前または後にそれぞれ６個の連続したヒスチジン（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードするポリヌクレオチド（配列番号５）を挿入した。
【0126】
実施例２：組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現の確認
２．１．植物発現ベクターの一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリアＬＢＡ４４０４菌株に電気衝撃法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍＬのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種し、２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、６００ｎｍの波長で吸光度（Ｏ．Ｄ）の値が１．０になるようにインフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー［１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのアセトシリンゴン］に懸濁させた。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナベンサミアナ葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。
２．１．植物発現ベクターの一過性発現（ｔｒａｎｓｉｅｎｔ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）
前記実施例１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリアＬＢＡ４４０４菌株に電気衝撃法（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリアを５ｍＬのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍｌを５０ｍｌの新しいＹＥＰ培地に接種し、２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリアは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、６００ｎｍの波長で吸光度（Ｏ．Ｄ）の値が１．０になるようにインフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー［１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのアセトシリンゴン］に懸濁させた。アグロバクテリア懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてニコチアナベンサミアナ葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーション（Ａｇｒｏ－ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を行った。
【0127】
２．２．形質転換植物体で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現の確認
前記実施例２．１で準備した植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、水溶性分画（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；Ｓ）にあるタンパク質と、ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）分画にあるタンパク質と、水溶性分画とペレットを全部含む分画（Ｔｏｔａｌ；Ｔ）をそれぞれ分離し、ウェスタンブロッティングで組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現を確認した。より詳しくは、各分画３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に
加熱した。次に、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、サイズ別に分離したタンパク質バンドを確認し、これをＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ
ｍｉｌｋ）を用いてブロッキング段階を経た後に、ポリヒスチジンと反応する抗体を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法に従って処理し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現を確認した。
前記実施例２．１で準備した植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、水溶性分画（Ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ；Ｓ）にあるタンパク質と、ペレット（Ｐｅｌｌｅｔ；Ｐ）分画にあるタンパク質と、水溶性分画とペレットを全部含む分画（Ｔｏｔａｌ；Ｔ）をそれぞれ分離し、ウェスタンブロッティングで組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現を確認した。より詳しくは、各分画３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に
加熱した。次に、１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルに電気泳動し、サイズ別に分離したタンパク質バンドを確認し、これをＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルク（ｓｋｉｍ
ｍｉｌｋ）を用いてブロッキング段階を経た後に、ポリヒスチジンと反応する抗体を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法に従って処理し、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の発現を確認した。
【0128】
その結果、図２に示されたように、葉緑体に標的化されるようにルビスコトランジットペプチドを融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が高効率で発現したことを確認し、発現した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の９０～９５％以上が水溶性分画で確認され、約５～１０％のＡＭＶカプシドタンパク質がペレット分画で観察された。これと比較して、細胞質および小胞体に標的化した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、葉緑体に標的化したｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓより発現効率が低かった。これによって、下記実施例は、葉緑体に標的化されるルビスコトランジットペプチドを融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質（Ｎ末端またはＣ末端にＨｉｓ－ｔａｇが付着）を用いて進めた。
【0129】
実施例３：形質転換植物で発現した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製
前記実施例２．１で準備したＮ末端またはＣ末端にポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）が融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を発現するそれぞれのニコチアナベンサミアナ葉５０ｇにタンパク質抽出溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）
Ｘ－１００］１００ｍＬを添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質抽出液をそれぞれ回収した。前記２つの条件（Ｎ末端またはＣ末端にポリヒスチジンタグが融合）のタンパク質抽出液から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製のために、Ｎｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースレジン（ａｇａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）で充填されたカラムで親和性クロマトグラフィーを同時に実施した。前記カラムにレジンを１０ｍＬ充填した後、１００ｍＬの洗浄溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で平衡化させた。回収したそれぞれのタンパク質抽出液を互いに異なる２つのカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄溶液１００ｍＬを流してレジンを洗浄し、溶出溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭまたは１００ｍＭまたは３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を溶出した。それぞれの組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれた溶出溶液は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）とｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験を通じて確認した。
前記実施例２．１で準備したＮ末端またはＣ末端にポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）が融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を発現するそれぞれのニコチアナベンサミアナ葉５０ｇにタンパク質抽出溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ ｉｍｉｄａｚｏｌｅ、０．５％ Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）
Ｘ－１００］１００ｍＬを添加し、ブレンダーで組織を破砕した後、１３，０００ｒｐｍで４℃で３０分間遠心分離し、タンパク質抽出液をそれぞれ回収した。前記２つの条件（Ｎ末端またはＣ末端にポリヒスチジンタグが融合）のタンパク質抽出液から組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の分離精製のために、Ｎｉ－ＩＤＡ（Ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）アガロースレジン（ａｇａｒｏｓｅ ｒｅｓｉｎ）で充填されたカラムで親和性クロマトグラフィーを同時に実施した。前記カラムにレジンを１０ｍＬ充填した後、１００ｍＬの洗浄溶液［２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ］で平衡化させた。回収したそれぞれのタンパク質抽出液を互いに異なる２つのカラムに適用し、平衡化させた後、洗浄溶液１００ｍＬを流してレジンを洗浄し、溶出溶液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１Ｍ ＭｇＣｌ２、５０ｍＭまたは１００ｍＭまたは３００ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ）で組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を溶出した。それぞれの組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれた溶出溶液は、電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）後、クマシー染色法（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ ｓｔａｉｎｉｎｇ）とｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ実験を通じて確認した。
【0130】
その結果、図３に示されたように、Ｃ末端にＨｉｓ－ｔａｇを融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が、Ｎ末端にＨｉｓ－ｔａｇを融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質に比べて、精製度および最終回収率がさらに高いことを確認した。これによって、以下の実施例では、Ｃ末端にＨｉｓ－ｔａｇを融合した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を用いて進めた。
【0131】
実施例４：組み換えＡＭＶカプシドタンパク質のＶＬＰ形成条件の確認
組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、自己集合を通じて組み換えＡＭＶウイルス様粒子を形成する。したがって、組み換えＡＭＶウイルス様粒子の形成のための条件テストおよび確認のためのサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
組み換えＡＭＶカプシドタンパク質は、自己集合を通じて組み換えＡＭＶウイルス様粒子を形成する。したがって、組み換えＡＭＶウイルス様粒子の形成のための条件テストおよび確認のためのサイズ排除クロマトグラフィーを行った。
【0132】
実施例３で回収した分離精製された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれた溶出溶液５ｍｇを第１緩衝溶液（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．０、３００ｍＭ ＮａＣｌ）で透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ）を進めた後、第１緩衝溶液で平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードし、１つのピーク分画を獲得した。標準ｓｉｚｅ
ｍａｒｋｅｒを用いて分子量を計算した結果、約１００ｋＤａの三量体（ｔｒｉｍｅｒ）構造を確認した（図４Ａ）。
ｍａｒｋｅｒを用いて分子量を計算した結果、約１００ｋＤａの三量体（ｔｒｉｍｅｒ）構造を確認した（図４Ａ）。
【0133】
また、実施例３で回収した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質が含まれた溶出溶液５ｍｇを第２緩衝溶液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ、ｐＨ７．０，５００ｍＭ ＮａＣｌ）で透析（Ｄｉａｌｙｓｉｓ）を進めた後、第２緩衝溶液で平衡化されたサイズ排除クロマトグラフィーカラムにロードし、ＡＭＶカプシドタンパク質のサイズの変化があることを確認した（図４Ｂ）。第１緩衝溶液と比較して、第２緩衝溶液の条件では、既存ピーク（Ｐ２）が減少したのに対し、新しいピーク（Ｐ１）が形成されることを確認し、Ｐ１およびＰ２がいずれも組み換えＡＭＶカプシドタンパク質であることをＳＤＳ－ＰＡＧＥで確認した。
【0134】
実施例５：組み換えＡＭＶウイルス様粒子の確認
サイズ排除クロマトグラフィーで分離したＰ１分画に含まれた組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を最終濃度が１００ｎＭになるように、第２緩衝溶液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．０，５００ｍＭ ＮａＣｌ）に希釈し、陰性染色（Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。５μＬのタンパク質溶液をカーボンがコートされた銅グリッドで１分間反応させた後、ろ紙を用いてタンパク質溶液を除去し、３次蒸留水で３回洗浄した。この際、カーボンがコートされた銅グリッドは、プラズマ（Ｐｌａｓｍａ）とともに１分間反応して疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）の特性を親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）特性に変換し、タンパク質をカーボンに良好に付着させる。最終的に、１％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で１分間反応させて、陰性染色（Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、ろ紙で染色溶液を除去し、常温で１２時間乾燥した。準備したグリッドは、透過電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１０，Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて２０，０００倍の倍率でイメージを獲得した。その結果、図５（ｐＨ７．０）に示されたように、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質で構成されたウイルス様粒子を観察することができた。
サイズ排除クロマトグラフィーで分離したＰ１分画に含まれた組み換えＡＭＶカプシドタンパク質を最終濃度が１００ｎＭになるように、第２緩衝溶液（５０ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ，ｐＨ７．０，５００ｍＭ ＮａＣｌ）に希釈し、陰性染色（Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。５μＬのタンパク質溶液をカーボンがコートされた銅グリッドで１分間反応させた後、ろ紙を用いてタンパク質溶液を除去し、３次蒸留水で３回洗浄した。この際、カーボンがコートされた銅グリッドは、プラズマ（Ｐｌａｓｍａ）とともに１分間反応して疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）の特性を親水性（ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ）特性に変換し、タンパク質をカーボンに良好に付着させる。最終的に、１％酢酸ウラニル（ｕｒａｎｙｌ ａｃｅｔａｔｅ）で１分間反応させて、陰性染色（Ｎｅｇａｔｉｖｅ－ｓｔａｉｎｉｎｇ）した後、ろ紙で染色溶液を除去し、常温で１２時間乾燥した。準備したグリッドは、透過電子顕微鏡（Ｔｅｃｎａｉ Ｔ１０，Ｐｈｉｌｉｐｓ）を用いて２０，０００倍の倍率でイメージを獲得した。その結果、図５（ｐＨ７．０）に示されたように、組み換えＡＭＶカプシドタンパク質で構成されたウイルス様粒子を観察することができた。
【0135】
また、ｐＨ条件の変化によるＶＬＰ安定性を確認するために、様々なｐＨ（３．０、５，０、９．０）の条件で緩衝溶液のｐＨを変化させたテストにおいてｐＨ３．０とｐＨ９．０の条件でＶＬＰの安定性が減少する現象が現れたのに対し、ｐＨ５．０とｐＨ７．０の条件では、ＶＬＰの安定性が維持されることを確認し、その結果を図５に示した。
【0136】
実施例６：組み換えＡＭＶカプシドタンパク質の構造
６．１．サンプルガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびデータ収集
前記実施例５で確認された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質のＶＬＰ構造を分析するために、極低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用した。３μｌの組み換えＡＭＶカプシドタンパク質ＶＬＰを１５ｍＡで１分間ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｇｌｏｗ－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ２００ｍｅｓｈ，ＳＰＩ）に適用後、４℃、１００％湿度（ｈｕｍｉｄｉｔｙ）条件のＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ装置で６．５秒間ｂｌｏｔｔｉｎｇし、液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で温度を低くした液体エタン（ｌｉｑｕｉｄ ｅｔｈａｎｅ）に浸漬し、迅速に固定した。ＡＭＶ ＶＬＰのＣｒｙｏ－ＥＭイメージは、３００ｋＶ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙでＦａｌｃｏｎ ３ＥＣ ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて確認し、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＥＰＵ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で収集した（図６Ａ参照）。
６．１．サンプルガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）およびデータ収集
前記実施例５で確認された組み換えＡＭＶカプシドタンパク質のＶＬＰ構造を分析するために、極低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を使用した。３μｌの組み換えＡＭＶカプシドタンパク質ＶＬＰを１５ｍＡで１分間ｎｅｇａｔｉｖｅｌｙ ｇｌｏｗ－ｄｉｓｃｈａｒｇｅｄ ｈｏｌｅｙ ｃａｒｂｏｎ ｇｒｉｄ（Ｑｕａｎｔｉｆｏｉｌ Ｒ１．２／１．３ Ｃｕ ２００ｍｅｓｈ，ＳＰＩ）に適用後、４℃、１００％湿度（ｈｕｍｉｄｉｔｙ）条件のＶｉｔｒｏｂｏｔ Ｍａｒｋ ＩＶ装置で６．５秒間ｂｌｏｔｔｉｎｇし、液体窒素（ｌｉｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ）で温度を低くした液体エタン（ｌｉｑｕｉｄ ｅｔｈａｎｅ）に浸漬し、迅速に固定した。ＡＭＶ ＶＬＰのＣｒｙｏ－ＥＭイメージは、３００ｋＶ Ｔｉｔａｎ Ｋｒｉｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙでＦａｌｃｏｎ ３ＥＣ ｄｉｒｅｃｔ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）を用いて確認し、Ａｕｔｏｍａｔｉｃ ｄａｔａ ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＥＰＵ；Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＳＡ）で収集した（図６Ａ参照）。
【0137】
６．２．ＡＭＶ ＶＬＰ ３次構造分析のためのイメージプロセッシング（ｉｍａｇｅ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ）とモデルビルディング（ｍｏｄｅｌ ｂｕｉｌｄｉｎｇ）
前記実施例６．１で収集した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質のＶＬＰイメージを分析するために、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ｖ２ソフトウェアを使用した。ビーム誘導モーション補正（Ｂｅａｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）と線量加重値（ｄｏｓｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）は、ソフトウェアに含まれたｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて補正した後、ｐａｔｃｈ ＣＴＦ（Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いてＣＴＦ変数を測定した。モーションドリフト（ｍｏｔｉｏｎ ｄｒｉｆｔ）が発生したイメージまたはｄｅｆｏｃｕｓが非常に高いか低いイメージは、イメージプロセッシングに使用できないので、目視で確認して除去し、１，８０３枚のイメージから４８２，２２４個のＡＭＶ ＶＬＰを抽出し、２Ｄ ｃｌａｓｓ
ａｖｅｒａｇｅイメージを製作した。このイメージを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として相関関係の低いイメージをさらに除去した後、２７９，７５５個のＡＭＶ ＶＬＰを最終的に選定し、これを用いて新しい２Ｄ ｃｌａｓｓ ａｖｅｒａｇｅを製作した（図６Ａの下段）。新規２Ｄイメージに基づいて２０面体（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ）の３Ｄ構造を再構成し（図６Ｂを参照）、ＡＭＶ ＶＬＰの３次構造に基づいて分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を測定した結果は、図６Ｃに示し、２．４１Åの高分解能構造を獲得した。イメージプロセッシングとモデルビルディングの進行手続きは、図６Ｄにｆｌｏｗ ｃｈａｒｔで示した。また、極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および構造分析ソフトウェアを用いて組み換えＡＭＶ ＶＬＰの全体的な構造、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の構造およびアミノ酸の位置を分析した結果は、図７Ａ～図７Ｄに示した。
前記実施例６．１で収集した組み換えＡＭＶカプシドタンパク質のＶＬＰイメージを分析するために、ｃｒｙｏＳＰＡＲＣ ｖ２ソフトウェアを使用した。ビーム誘導モーション補正（Ｂｅａｍ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）と線量加重値（ｄｏｓｅ ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ）は、ソフトウェアに含まれたｍｏｔｉｏｎ ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて補正した後、ｐａｔｃｈ ＣＴＦ（Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を用いてＣＴＦ変数を測定した。モーションドリフト（ｍｏｔｉｏｎ ｄｒｉｆｔ）が発生したイメージまたはｄｅｆｏｃｕｓが非常に高いか低いイメージは、イメージプロセッシングに使用できないので、目視で確認して除去し、１，８０３枚のイメージから４８２，２２４個のＡＭＶ ＶＬＰを抽出し、２Ｄ ｃｌａｓｓ
ａｖｅｒａｇｅイメージを製作した。このイメージを鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）として相関関係の低いイメージをさらに除去した後、２７９，７５５個のＡＭＶ ＶＬＰを最終的に選定し、これを用いて新しい２Ｄ ｃｌａｓｓ ａｖｅｒａｇｅを製作した（図６Ａの下段）。新規２Ｄイメージに基づいて２０面体（ｉｃｏｓａｈｅｄｒａｌ）の３Ｄ構造を再構成し（図６Ｂを参照）、ＡＭＶ ＶＬＰの３次構造に基づいて分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）を測定した結果は、図６Ｃに示し、２．４１Åの高分解能構造を獲得した。イメージプロセッシングとモデルビルディングの進行手続きは、図６Ｄにｆｌｏｗ ｃｈａｒｔで示した。また、極超低温電子顕微鏡（Ｃｒｙｏ－ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）および構造分析ソフトウェアを用いて組み換えＡＭＶ ＶＬＰの全体的な構造、単量体（ｍｏｎｏｍｅｒ）の構造およびアミノ酸の位置を分析した結果は、図７Ａ～図７Ｄに示した。
【0138】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【0139】
本発明は、葉緑体に標的化される植物発現ベクターを用いて植物で組み換えＡＭＶを高効率で生産する方法およびこれを用いた組み換えＡＭＶ ＶＬＰの製造方法に関する。高分解能で糾明された３次構造の特性上、本発明による組み換えＡＭＶ ＶＬＰは、ワクチン、治療剤、および薬物伝達体などの開発のためのプラットフォーム（Ｐｌａｔｆｏｒｍ）として活用可能である。また、本発明は、植物発現システムを用いるので、生産費用を格別に低減することができ、従来広く知られた方法（動物細胞や微生物でタンパク質を生産した後、分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、がん遺伝子、腸毒素など）を確実に遮断することができる。また、本発明は、動物細胞が必須的に含む翻訳後修飾過程が起こる真核生物タンパク質の合成経路を含んでいて、生理活性を維持しているタンパク質生産が可能であり、商品化段階でも動物細胞やバクテリアとは異なって、種子（ｓｅｅｄ ｓｔｏｃｋ）として管理が可能であるという点から有利である。さらには、当該物質の需要が急増する場合、大量生産に必要な設備技術やコスト面において、従来の動物細胞またはバクテリアを用いた生産システムと比較して、さらに効率的かつ経済的であるから、需要の発生に合わせて短期間に大量生産および供給が可能であるという長所もある。したがって、本発明は、ワクチンおよび薬物伝達技術を含んでウイルス様粒子を活用する様々な産業分野において有用に活用されることが期待される。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6A】
【図6B】
【図6C】
【図6D】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【配列表】
【国際調査報告】