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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】環状テトラペプチドおよびそれらの金属錯体
(51)【国際特許分類】
C07D 257/02 20060101AFI20240220BHJP
C07K 5/12 20060101ALI20240220BHJP
A61K 49/00 20060101ALI20240220BHJP
A61K 51/04 20060101ALI20240220BHJP
A61K 49/10 20060101ALI20240220BHJP
A61K 31/395 20060101ALI20240220BHJP
A61P 39/02 20060101ALI20240220BHJP
C09K 3/00 20060101ALI20240220BHJP
C07D 403/14 20060101ALI20240220BHJP
C07D 403/06 20060101ALI20240220BHJP
C07F 7/24 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C07D257/02
C07K5/12 ZNA
A61K49/00
A61K51/04 200
A61K49/10
A61K31/395
A61P39/02
C09K3/00 108D
C07D403/14
C07D403/06
C07F7/24
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023533353
(86)(22)【出願日】2021-12-03
(85)【翻訳文提出日】2023-05-30
(86)【国際出願番号】 EP2021084278
(87)【国際公開番号】W WO2022117877
(87)【国際公開日】2022-06-09
(31)【優先権主張番号】20211457.5
(32)【優先日】2020-12-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】515098691
【氏名又は名称】ウニヴェルズィテート チューリッヒ
(74)【代理人】
【識別番号】110001896
【氏名又は名称】弁理士法人朝日奈特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ショシャン、ミカル
(72)【発明者】
【氏名】タグワ、モハメド
【テーマコード（参考）】
4C063
4C085
4C086
4H045
4H049
【Ｆターム（参考）】
4C063AA01
4C063AA03
4C063BB03
4C063CC47
4C063DD25
4C063EE01
4C085HH03
4C085HH07
4C085HH13
4C085KA09
4C085KA28
4C085KA29
4C085KB56
4C085LL20
4C086AA01
4C086AA02
4C086AA03
4C086BC58
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZC37
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA35
4H045BA50
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA10
4H049VN04
4H049VP01
4H049VQ59
4H049VU31
4H049VW02
(57)【要約】
本発明は、交互にα－アミノ酸およびβ－アミノ酸からなる環状テトラペプチドならびにその金属錯体を提供する。環状テトラペプチドは、特にＰｂ、Ｃｄ、ＨｇおよびＡｓから選択される金属に配位するために有用である。さらに、本発明は、疾患、特に金属中毒、を治療することにおける環状テトラペプチドの使用、汚染された水および土壌のレメディエーションにおける使用を包含する。また、種々の基質における上記金属を検出するための方法も提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
式Ｉ、特に式Ｉａ：【化1】
任意の他のＲから独立して各Ｒは、－ＣＨ3および－Ｈから独立して選択され、
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルであり、ここで、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、５～１０員複素環、３～１０個、特に３～６個、の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されており、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され得る、
ＲB1およびＲB2は、互いに独立して
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、または
・検出マーカーまたは固体支持体に結合するために適切なリンカー、
・任意にはリンカーにより連結される、検出マーカー、または
・固体支持体に結合したリンカー
である）
の化合物。
【請求項2】
前記化合物が、式２、３、４、５、６または７、特に式２、５、６または７、より特には式２【化2】
【請求項3】
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルであり、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る、請求項１または２記載の化合物。
【請求項4】
ＲA1およびＲA2での環状炭化水素部分が、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびフェニルから選択され、特にフェニルである、請求項１～３のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項5】
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルであり、ここで、該フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る、請求項１～４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項6】
ＲA1およびＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ3、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－（ＣＨ2）2－ＳＯ3Ｈ－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ2－イミダゾリル、－ＣＨ2－メルカプトイミダゾリルおよび－ＣＨ2－フェニルから独立して選択される、請求項１～５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項7】
ＲB1およびＲB2は、・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分であって、ここで、該５～１０員複素環または該炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、部分
から独立して選択される、請求項１～６のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項8】
ＲB1およびＲB2は、・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキルから選択される部分であって、ここで、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキルは、－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、部分
から独立して選択される、請求項１～７のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項9】
ＲB1およびＲB2は、－Ｈ、－Ｃ3-6－アルキル、特に－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）2、－ＣＨ2－フェニル、－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＣＯＯＨおよび－（ＣＨ2）r－ＣＯＮＨから独立して選択され、ｍおよびｒは０、１、２または３である、請求項１～８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項10】
ＲA1およびＲA2でのおよび／またはＲB1およびＲB2でのヘテロシクリルが、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、特にイミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、オキサゾロニル、インドリル、メルカプトプリニル、ベンゾチオフェニルから選択される、請求項１～９のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項11】
ＲA1およびＲA2が同じであり、および／またはＲB1およびＲB2が同じである、請求項１～１０のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項12】
検出可能マーカーが、染料、アフィニティタグ、磁気ビーズおよび放射性同位体を含む部分から選択され、および／またはリンカーが、最大５０個のＣ原子を含む炭化水素部分であり、ここで１個または複数個のＣ原子がＯ、ＳまたはＮにより任意に置き換えられ得る、および／または
固体支持体が、樹脂、ビーズ、電極表面または反応容器の底／壁である、
請求項１～１１のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項13】
配位子および金属、特にＰｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇから選択される金属、からなる金属錯体であって、配位子が請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物である金属錯体。
【請求項14】
疾患の治療、特に金属中毒の治療、より特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒の治療、における、請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物の使用。
【請求項15】
基質、特に土壌または水溶液もしくは水性懸濁液から／基質、特に土壌または水溶液もしくは水性懸濁液中の、金属、特にＰｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇから選択される金属、より特にＰｂ、を除去および／または検出する方法であって、方法が請求項１～１２のいずれか１項に記載の化合物を用いることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、環状テトラペプチドおよびそれらの金属錯体に関する。環状テトラペプチドは、Ｐｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇ等の金属を配位するのに適している。本発明はさらに、疾患、特に金属中毒、の治療における、および該疾患の診断における、環状テトラペプチドの使用に関する。また、汚染された土壌や水などの物質に環状テトラペプチド適用することにより上記金属を除去または検出するための方法も提供される。
【背景技術】
【0002】
鉛（Ｐｂ）、ヒ素（Ａｓ）、水銀（Ｈｇ）およびカドミウム（Ｃｄ）などの有毒金属は、生存生物の生態系および健康に危険を及ぼす汚染された土壌または水において見出すことができる。例えば、有毒金属は、汚染された飲料水を介して人体に入る可能性がある。さらに、金属は食物連鎖において農作物や動物に蓄積され得、したがって、ヒトにより摂取され得る。
【0003】
鉛（Ｐｂ）は、非必須要素であり、ヒトの健康に最も有害であるとみなされる有毒金属である。Ｐｂ中毒は、世界中で年間１００万件もの死者を出している。驚くべきことに、子どもの３人に１人はＰｂ中毒であり、アメリカ合衆国でさえ、３％を超える子どもが危険なＰｂ血中濃度であることが分かっている。
【0004】
Ｐｂの毒性の分子的機序は様々であり、かつ細胞過程および臓器機能の両方への干渉を含む。生理学的条件のもと、Ｐｂは、種々のタンパク質、主にシステイン（Ｃｙｓ）のチオールおよびアスパラギン酸（Ａｓｐ）またはグルタミン酸（Ｇｌｕ）のと相互作用するＰｂ2+としてそのカチオン性の状態で優先的に見出される。この強固な金属結合は、酵素のコンフォメーションを変えて機能を低下させる。Ｐｂ2+はまた、金属タンパク質におけるいくつかの必須金属イオン、主にカルシウム（Ｃａ）および亜鉛（Ｚｎ）イオン、を置換し、タンパク質の機能障害を引き起こす。
【0005】
取り込み後、Ｐｂ2+は軟組織に分布し、肝臓および腎臓で最も高い蓄積レベルを示す。そのＣａ2+と同様のイオン半径により、Ｐｂ2+は血液脳関門を通過することができ、結果として脳に蓄積する。最終的には、Ｐｂの相当なフラクションが石灰化組織に貯蔵され、そして妊娠期間中血液に放出され、胎盤を横切る間の胎児への暴露源となる。
【0006】
キレート療法は、Ｐｂ中毒に対する最新の治療である。それはキレート化剤（ＣＡ）と呼ばれる薬物を投与することに基づくものであり、そのキレート化剤は、理想的にはいくつかの必須の特徴：（ａ）ＣＡおよび形成される錯体の低い毒性、（ｂ）個々の金属イオンに対する選択性、（ｃ）水溶性、（ｄ）除去可能な錯体の形成、および（ｅ）細胞および組織を透過する能力、を有すべきである。Ｐｂ中毒に対して使用されるＣＡは、優先的にエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）およびジメルカプトコハク酸（ＤＭＳＡ；図１）である。
【0007】
これらの低分子薬は、上述した要件のいくつかを達成する。だが、Ｐｂ中毒に対する一時治療であるにもかかわらず、それらは重大な欠点、主に必須金属を治療中に体内から枯渇させる結果となる低い金属選択性を有し、これは薬物毒性を増加させる。さらに、ＥＤＴＡは細胞膜を横切ることができず、その用途は細胞外の標的に限定される。それらは、Ｐｂ2+イオンを脳に再分配する疑いもある。結果として、これらのキレーターは、証明済みの極端に高い毒性金属レベルにおける医療用としてのみ承認されている。しかしながら、批判的に、それらは妊婦への使用は承認されておらず、まれな小児の症例のみに承認されている、たとえこれらのセグメントが最も影響を受ける集団の一つであるにもかかわらず。
【0008】
上記の先端技術に基づき、本発明の目的は、金属中毒の治療、およびその診断における手段および方法、ならびに汚染された水または土壌などの基質から金属を検出および除去するための手段および方法を提供することである。この目的は、本出願の独立請求項の構成要件により、また従属請求項、実施例、図面および本明細書の一般的な記載に説明されたさらなる有利な態様で達成される。
【発明の概要】
【0009】
本発明の第１の態様は、式Ｉ、特に式Ｉａ：
（式中、
任意の他のＲから独立して各Ｒは、－ＣＨ3および－Ｈから独立して選択され、
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルであり、ここで、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、５～１０員複素環、３～１０個、特に３～６個、の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されており、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され得る、
ＲB1およびＲB2は、互いに独立して
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、または
・検出マーカーまたは固体支持体に結合するために適切なリンカー、
・任意にはリンカーにより連結される、検出マーカー、または
・固体支持体に結合したリンカー
である）
の化合物に関する。
【化1】
任意の他のＲから独立して各Ｒは、－ＣＨ3および－Ｈから独立して選択され、
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルであり、ここで、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、５～１０員複素環、３～１０個、特に３～６個、の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されており、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され得る、
ＲB1およびＲB2は、互いに独立して
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、または
・検出マーカーまたは固体支持体に結合するために適切なリンカー、
・任意にはリンカーにより連結される、検出マーカー、または
・固体支持体に結合したリンカー
である）
の化合物に関する。
【0010】
式１の化合物は、２つのα－アミノ酸および２つのβ－アミノ酸からなる環状テトラペプチドである。アミノ酸は、頭尾環化を形成し、代替的には、環状－［Ｘａａ－βＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ］（配列番号０１２）（式中、Ｘａａはα－アミノ酸を示し、βＸａａはβ－アミノ酸を示す）により表され得る。
【0011】
環状テトラペプチドは金属と結合するのに適している。Ｐｂ2+などの毒性金属と人間にとって必須である他のイオンとの間の区別は、形成されるキャビティーとＲAおよびＲBでの金属結合基の数と選択の組み合わせによって達成される。
【0012】
α－アミノ酸のＲA1およびＲA2は金属結合に寄与する。特に、Ｐｂの結合については、ＲA1およびＲA2は各々、ソフトまたは中間の結合部分を含む。そのような部分の非限定的な例は、チオールまたはカルボン酸部分、例えばシステインのチオール部分またはアスパラギン酸のβ－カルボン酸部分である。
【0013】
β－アミノ酸のＲB1およびＲB2は、金属結合に寄与する、水溶性を媒介する、合成において環化を促進する、および環構造と金属錯体を安定化するなどの様々な機能を満たし得る。
【0014】
β－アラニンがβＸａａとして使用される、すなわちＲBがＨである場合、合成中の分子内環化が促進され、環状テトラペプチドの環構造の安定性が強化される。
【0015】
環状テトラペプチドの水溶性は、アルコール、アミド、カルボン酸または一級アミンなどの官能基を含む部分ＲBを使用することにより増大され得る。
【0016】
金属結合アフィニティーの増強は、追加の配位部位により、または好適なＲBにより提供される第二配位圏により達成され得る。また、選択性は、立体制御により改善され得る。例えば、ＲB1および／またはＲB2での脂肪族または芳香族残基によりＨｇなどのより小さな金属イオンとの錯体形成が可能となる。
【0017】
環状テトラペプチドのさらなる機能化は、ＲB1および／またはＲB2での、リンカー、固体支持体に結合されたリンカー、または検出可能なマーカーにより達成され得る。そのような環状テトラペプチドは、金属中毒の診断、水または土壌などの基質の汚染の度合いを決定すること、または金属汚染された土壌または水のレメディエーションに使用され得る。
【0018】
本発明の第２の態様は、配位子および金属からなる金属錯体であって、配位子が本発明の第１の態様に係る化合物である金属錯体に関する。
【0019】
上述したように、本発明の第１の態様に係る化合物は、ＲAおよびＲBでの好適な部分を介して金属に結合し得る。例えば、チオールおよび／またはカルボン酸部分がその脱プロトン化された形態でＰｂ2+と錯体を形成し得る。金属錯体は、ただ１つの配位子（単量体錯体）または２つの配位子（二量体錯体）を含み得る。
【0020】
本発明の第３の態様は、疾患の治療における本発明の第１の態様に係る化合物の使用に関する。
【0021】
本発明の第４の態様は、金属中毒の治療における本発明の第１の態様に係る化合物の使用に関する。
【0022】
別の実施態様では、本発明は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る塩の少なくとも１つ、および少なくとも１つの、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【0023】
本発明の第５の態様は、患者が金属中毒であるか、または金属中毒を発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
ａ．患者から採取されたエクソビボの血液、血漿または血清試料において本発明の第１の態様に係る化合物を用いて金属のレベルを決定すること、および
ｂ．金属の濃度の統計学的有意性を立証すること
を含む方法に関する。
ａ．患者から採取されたエクソビボの血液、血漿または血清試料において本発明の第１の態様に係る化合物を用いて金属のレベルを決定すること、および
ｂ．金属の濃度の統計学的有意性を立証すること
を含む方法に関する。
【0024】
特に、ＲBで、任意にはリンカーによって結合された、検出可能なマーカーを含む本発明の第１の態様に係る化合物は、試料中の金属の量を決定するために適している。
【0025】
本発明の第６の態様は、基質から金属を除去する方法であって、本発明の第１の態様に係る化合物を用いることを含む、方法に関する。
【0026】
上述のように、Ｐｂなどの金属によって汚染されている土壌および水をレメディエートする一定の需要がある。
【0027】
本発明の第７の態様は、基質中の金属を検出する方法であって、本発明の第１の態様に係る化合物を用いることを含む、方法に関する。
【0028】
特に、ＲBで、任意にはリンカーによって結合された、検出可能なマーカーを含む本発明の第１の態様に係る化合物は、汚染された水または土壌などの基質中の金属、例えばＰｂの検出に適している。
【0029】
用語および定義
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適切である限り、単数で使用される用語は、複数も含むものであり、逆もまたしかりである。下記に設定されるあらゆる定義は、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合は、その設定された定義は制御される。
本明細書を解釈するために、以下の定義が適用され、適切である限り、単数で使用される用語は、複数も含むものであり、逆もまたしかりである。下記に設定されるあらゆる定義は、参照により本明細書に組み込まれる任意の文書と矛盾する場合は、その設定された定義は制御される。
【0030】
用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含有する（containing）」および「包含する（including）」、および他の同様の形態、およびそれらの文法的等価物は、本明細書において使用される場合、意味において等価であるべきこと、およびこれらの単語の先にある項目または複数の項目は、そのような項目または複数の項目の限定列挙であることを意味するものではなく、挙げられた項目または複数の項目のみに限定されるべきことを意味するものでもないという点において非限定的であるべきことを意図される。例えば、成分Ａ、Ｂ、およびＣを「含む」項目は、成分Ａ、Ｂ、およびＣからなる（すなわち、のみを含有する）ことができ、または成分Ａ、Ｂ、およびＣのみならず１つまたは複数の他の成分も含有することができる。そのため、「含む」およびその同様の形態、およびそれらの文法的等価物は、「本質的にからなる」または「からなる」の態様の開示を包含することが意図されかつ理解される。
【0031】
値の範囲が与えられる場合、文脈により明確に別段の指示がない限り、その範囲の上限および下限と、その他の定められた値または間にある値との間の、下限の単位の１０分の１までの間にある各値は、定められた範囲内で具体的に除外される制限にしたがって、本開示に包含されることが理解される。定められた範囲が限界の１つまたは両方を包含する場合、限界に含まれるそれらのいずれかまたは両方を排除する範囲も本開示に包含される。
【0032】
本明細書における値またはパラメータの「約」への言及は、その値またはパラメータそれ自体に向けられるバリエーションを包含する（および説明する）。例えば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を包含する。
【0033】
「ａ」、「ｏｒ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に別段の指示がない限り、複数の指示物を含む。
【0034】
特段の断りがない限り、本明細書に使用されるすべての技術的および科学的用語は、本技術分野における（例えば、細胞培養物、分子遺伝学、核酸化学、ハイブリダイゼーション技術および生化学における）当業者により一般に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技術は、分子学的、遺伝学的および生化学的手法（通常、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed. (2012) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. および Ausubel et al., Short Protocols in Molecular Biology (2002) 5th Ed, John Wiley & Sons, Inc. 参照）および科学的手法のために使用される。
【0035】
用語「テトラペプチド」は、本明細書の文脈において、アミノ酸がペプチド結合によって結合されている直鎖を形成する４つのアミノ酸からなる分子を示す。テトラペプチドは、２つのα－アミノ酸および２つのβ－アミノ酸を含む。
【0036】
用語「環状テトラペプチド」は、上述のテトラペプチドであって、アミノ酸が式１に表される頭尾環状を形成するテトラペプチドを示す。
【0037】
アミノ酸残基配列は、アミノ末端からカルボキシル末端へ与えられる。配列位置に対して大文字が１文字コードでＬ－アミノ酸に向けられる（Stryer, Biochemistry, 3rd ed. p. 21）。アミノ酸配列位置に対する小文字はまたはアミノ酸名またはアミノ酸コードの前に記載された「Ｄ」は、対応するＤ－または（２Ｒ）－アミノ酸を指す。配列は左から右へとアミノ末端からカルボキシル末端への方向で書かれる。標準的な命名法にしたがい、α－アミノ酸残基配列は、以下に示すように、３文字または１文字コードのいずれかで命名される。アラニン（Ａｌａ、Ａ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、およびバリン（Ｖａｌ、Ｖ）。３文字または１文字コードはまた、対応するα－アミノ酸の残基と同一のβ－炭素の残基を含むβアミノ酸については、ギリシャ文字「β」の後に使用され、例えば「β－Ａｌａ」または「βＡｌａ」はβ－アミノ酸、β－アラニンを示す。側鎖における追加のメチレン橋（－ＣＨ2－）により相違するα－アミノ酸またはβ－アミノ酸のホモログは、「ホモ」アミノ酸、例えばホモシステインと称される。「ホモ」はまた、「ｈ」と略され、例えばｈＣｙｓはα－アミノ酸ホモシステインを示し、「βｈＧｌｕ」はβ－ホモグルタミン酸を示す。
【0038】
本発明の文脈において、用語「５～１０員ヘテロシクリル」は、５～１０個の炭素原子からなり、１個または複数個の炭素原子がヘテロ原子Ｎ、ＳまたはＯ、特にＮにより置換されている化合物に関する。同様に、「５～６員ヘテロシクリル」は５～６個の炭素原子からなり、１個または複数個の炭素原子がヘテロ原子Ｎ、ＳまたはＯ、特にＮにより置換されている。炭素原子および１個または複数個のヘテロ原子は、単結合および／または二重結合により結合し、環構造を形成する。環構造は単環または二環であり得る。
【0039】
用語「３～１０個の炭素原子を含む炭化水素部分」は、炭素－炭素単結合、二重結合および／または三重結合、特に炭素－炭素単結合および／または炭素－炭素二重結合を含む炭化水素部分に関する。炭素原子は、直鎖、分岐鎖または環状構造またはその組み合わせを形成し得る。
【0040】
用語、アルキルは、直鎖または分岐鎖炭化水素部分に関する。本明細書の文脈においてＣ1-4－アルキルは、１、２、３または４個の炭素原子を有する飽和直鎖または分岐鎖炭化水素に関する。同様に、Ｃ1-3－アルキルは、３個までの炭素原子を有する直鎖または分岐鎖炭化水素に関する。Ｃ1-4－アルキルの非限定的な例は、メチル、エチル、プロピル、ｎ－ブチル、２－メチルプロピル、tert－ブチルを含む。ある実施態様においては、Ｃ1-4－アルキルは、メチル（Ｍｅ）、エチル（Ｅｔ）、プロピル（Ｐｒ）、イソプロピル（ｉＰｒ）、ｎ－ブチル（Ｂｕ）およびtertブチル（ｔＢｕ）を指す。
【0041】
用語、環状炭化水素部分は、炭素－炭素単結合、二重結合および／または三重結合、特に炭素－炭素単結合および／または炭素－炭素二重結合を含む、単環式または多環式炭化水素部分に関する。多環式炭化水素部分の環構造は、架橋、融合またはスピロ環であり得る。環状炭化水素部分の非限定的な例は、アリル、例えばフェニル、およびシクロアルキル、例えばシクロヘキシルである。
【0042】
本明細書の文脈において、用語、Ｃ5-6－シクロアルキルは、５または６個の炭素原子を有する飽和炭化水素環に関する。
【0043】
本明細書の文脈において、用語、蛍光染料は、可視または近赤外線スペクトルにおいて蛍光発光可能な低分子に関する。
【図面の簡単な説明】
【0044】
【図1】Ｐｂ中毒に対するベンチマーク薬としてのＤＭＳＡおよびＥＤＴＡを示す図である。
【図2a】１２０ｍＭのＤＨ ５α細胞（１０当量）におけるインビボでの最も高い投与濃度でベンチマーク薬およびグルタチオン（ＧＳＨ）と比較した試験ペプチドの解毒能力を示す図である。値は、各三重で行われた３回より多くの繰り返しの平均＋ＳＤである。
【図2b】１０ｍＭのＨＴ－２９細胞（５当量）におけるインビトロでの最も高い投与濃度でベンチマーク薬およびグルタチオン（ＧＳＨ）と比較した試験ペプチドの解毒能力を示す図である。値は、各三重で行われた３回より多くの繰り返しの平均＋ＳＤである。
【図2c】８および２つの薬物のＨＴ－２９細胞における濃度依存的解毒能力を示す図である。値は、各三重で行われた３回より多くの繰り返しの平均＋ＳＤである。
【図2d】Ｃａ塩対Ｎａ塩として、ＥＤＴＡおよび８のＨＴ－２９細胞における濃度依存的解毒能力を示す図である。値は、各三重で行われた３回より多くの繰り返しの平均＋ＳＤである。
【図2e】８および２つの薬物のＨＴ－２９細胞における毒性を示す図である。値は、各三重で行われた３回より多くの繰り返しの平均＋ＳＤである。
【図3a】Ｐｂおよび単量体配位子として環状［Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ］からなる金属錯体を示す図である。
【図3b】Ｐｂおよび二量体配位子として環状［Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ］からなる金属錯体を示す図である。
【図4】Ｐｂ（ＮＯ3）2（２ｍＭ）、その後Ｎａ2８ａ、ＣａＮａ2ＥＤＴＡ、およびＮａ2ＤＭＳＡで処置した（Ｐｂ2+イオンの添加の１時間後；値は、陰性対照としてＰｂ2+イオンで中毒とした細胞に対して計算した。）ＨＴ－２９細胞の用量依存的回復を示す図である。
【図5a】試験終了日（１８日目）に採取し、ＩＣＰ－ＭＳで分析した、１グループ８匹のマウスの平均血中鉛濃度（ＢＬＬ）を示す図である。
【図5b】試験終了日（１８日目）に採取し、ＩＣＰ－ＭＳで分析した、１グループ８匹のマウス（４０匹のうち３４匹のみ）の尿中Ｐｂを示す図である。
【図6】ポリスチレンテンタゲル樹脂（polystyrene tentagel resin）に連結されたペプチド１ｆ（Ｒ＝ＳＨ）および８ｆ（Ｒ＝ＣＯＯＨ）を示す図である。
【図7】ＩＣＰ－ＭＳにより検出され、陰性対照０ｆと２つの固定化ペプチド１ｆおよび８ｆとの間において、２つのろ過ラウンド（暗いグレー）およびＥＤＴＡによる１つの再生ラウンド（明るいグレー）の、元の溶液と比較して計算されたＰｂ濃度を示す図である。
【図8】ＩＣＰ－ＭＳにより検出され、０ｆ（黒色棒）、１ｆ（明るいグレー棒）および８ｆ（中間グレー棒）（すべての塩溶液は２５ｍＭである。）の、等モルのＺｎＣｌ2＋Ｐｂ（ＮＯ3）2溶液およびＣａＣｌ2＋Ｐｂ（ＮＯ3）2溶液ならびにＰｂ（ＮＯ3）2を打ち込んだヒト血清の元の溶液と比較して計算したＰｂ濃度を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0045】
本発明の第１の態様は、式Ｉ、特に式Ｉａ：
（式中、
任意の他のＲから独立して各Ｒは、－ＣＨ3および－Ｈから独立して選択され、
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルであり、ここで、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、５～１０員複素環、３～１０個、特に３～６個、の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されており、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特に－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され得る、
ＲB1およびＲB2は、互いに独立して
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、または
・検出マーカーまたは固体支持体に結合するために適切なリンカー、
・任意にはリンカーにより連結される、検出マーカー、または
・固体支持体に結合したリンカー
である）
の化合物に関する。
【化2】
任意の他のＲから独立して各Ｒは、－ＣＨ3および－Ｈから独立して選択され、
ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルであり、ここで、Ｃ1-4－アルキルまたはフェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＮＨＣ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、５～１０員複素環、３～１０個、特に３～６個、の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数の置換基により置換されており、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特に－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され得る、
ＲB1およびＲB2は、互いに独立して
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換される、または
・検出マーカーまたは固体支持体に結合するために適切なリンカー、
・任意にはリンカーにより連結される、検出マーカー、または
・固体支持体に結合したリンカー
である）
の化合物に関する。
【0046】
ある実施態様においては、少なくとも１つのＲがＨであり、かつ他のＲが－ＣＨ3である。
【0047】
ある実施態様においては、少なくとも２つのＲがＨであり、かつ他のＲが－ＣＨ3である。
【0048】
ある実施態様においては、少なくとも３つのＲがＨであり、かつ他のＲが－ＣＨ3である。
【0049】
ある実施態様においては、部分ＲA1およびＲA2の少なくとも１つは、ヘテロ原子Ｓ、ＮまたはＯ、特にＳを含む。式１の化合物が金属を結合するために使用される場合、ＲAのヘテロ原子が、Ｐｂ、Ｈｇ、ＡｓおよびＣｄなどの金属、特にＰｂとの結合を形成する。Ｐｂ、Ｈｇ、ＡｓおよびＣｄ、特にＰｂ、の結合は、セリンの側鎖におけるようなヒドロキシル部分によっては達成されない可能性がある。したがって、α－セリンは好適なＲAを提供するための好適なアミノ酸ではない。しかしながら、β－セリンはまだ、環状テトラペプチドの水溶性を増強させる部分ＲBを提供するために使用される可能性がある。
【0050】
ある実施態様においては、化合物は、式２、３、４、５、６または７、特に式２ａ、３ａ、４ａ、５ａ、６ａまたは７ａの化合物である。
【化3】
【0051】
環状テトラペプチドは、Ｌ－またはＤ－アミノ酸またはその混合物から形成され得る。経済的な理由から、特にＬ－アミノ酸が、それらが対応するＤ－アミノ酸よりも通常安いため使用される。
【0052】
安定な金属錯体形成のため、金属結合部分ＲA1およびＲA2は、特に、その好ましい固有の片側に向けられた配置（hemidirected geometry）でＰｂ2+を捕捉するために、同じ方向に向けるべきである。
【0053】
ある実施態様においては、環状テトラペプチドのα－アミノ酸は、両方ともＬ－アミノ酸であるか、または両方ともＤ－アミノ酸であり、特に両方ともＬ－アミノ酸である。これは、ＲA1およびＲA2が両方ともにアップウェッジボンド（up-wedge bond）によりα－炭素原子と結合されるか、またはＲA1およびＲA2が両方ともにダウンウェッジボンドによりα－炭素原子と結合される。
【0054】
ある実施態様においては、化合物は、式２、５、６または７、特に式２ａ、５ａ、６ａまたは７ａの化合物である。
【0055】
ある実施態様においては、化合物は、式２または５、特に式２ａまたは５ａの化合物である。
【0056】
ある実施態様においては、化合物は、式２、特に式２ａの化合物である。
【0057】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルであり、ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特にＣ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る。
【0058】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルであり、ここで、該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る。
【0059】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2の複素環は、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、オキサゾロニル、インドリル、メルカプトプリニル、ベンゾチオフェニル、特にイミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリル、より特にメルカプトイミダゾリルから選択される。
【0060】
チオフランはチオフェンとも称される。
【0061】
ベンゾチオフェンは、ベンゾチオフランとも称される。
【0062】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、オキサゾロニルから選択される。
【0063】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、オキサゾロニルから選択される。
【0064】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニルから選択される。
【0065】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリルから選択される。
【0066】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、イミダゾリル、インドリルから選択される。
【0067】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2でのヘテロシクリルが、イミダゾリルから選択される。
【0068】
ある実施態様においては、イミダゾリルは、１Ｈ－イミダゾル－４－イルである。例えば、ＲAは、ヒスチジンがα－アミノ酸として使用される場合、１Ｈ－イミダゾル－４－イルである。
【0069】
ある実施態様においては、インドリルは、１Ｈ－インドル－３－イルである。例えば、ＲAは、トリプトファンがα－アミノ酸として使用される場合、１Ｈ－インドル－３－イルである。
【0070】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2での環状炭化水素部分は、シクロペンチル、シクロヘキシルおよびフェニルから選択される。
【0071】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2での環状炭化水素部分はフェニルである。
【0072】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルであり、ここで、該フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る。
【0073】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルである。
【0074】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルであり、ここで、該フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得る。
【0075】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ3、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－（ＣＨ2）2－ＳＯ3Ｈ－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ2－イミダゾリル、－ＣＨ2－メルカプトイミダゾリルおよび－ＣＨ2－フェニルから独立して選択される。
【0076】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－ＣＨ2－Ｓ－ＣＨ3、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－（ＣＨ2）2－ＳＯ3Ｈ－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－（ＣＨ2）2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－（ＣＨ2）2－ＣＯＮＨ2から独立して選択される。
【0077】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ2－イミダゾリル、および－ＣＨ－フェニルから独立して選択される。
【0078】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＯＯＨから独立して選択される。
【0079】
ある実施態様においては、
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該環状炭化水素部分は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で置換され、かつ
ここで、該５～１０員複素環は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特にＣ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され、および／または
－ＲA1は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、および－ＣＯＯＨ、特に－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨから選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、かつ
ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特にＣ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得え、
特に、ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～６員複素環、特にイミダゾリル、メルカプトイミダゾリルまたはチオフラニル、フェニル、特に置換されていないフェニルから独立して選択される１つまたは２つ、特に１つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該フェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキルから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換されていてもよく、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該環状炭化水素部分は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で置換され、かつ
ここで、該５～１０員複素環は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特にＣ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され、および／または
－ＲA1は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、および－ＣＯＯＨ、特に－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨから選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、かつ
ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～１０員複素環、３～６個の炭素原子を含む環状炭化水素部分から独立して選択される１つまたは複数、特に１つまたは２つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該５～１０員複素環または該環状炭化水素部分は、Ｃ1-4－アルキル、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、（＝Ｏ）、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、特にＣ1-4－アルキル、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2から選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換され得え、
特に、ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、５～６員複素環、特にイミダゾリル、メルカプトイミダゾリルまたはチオフラニル、フェニル、特に置換されていないフェニルから独立して選択される１つまたは２つ、特に１つ、の置換基により置換された、Ｃ1-4－アルキル、特にＣ1-3アルキル、より特にはＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該フェニルは、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキルから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換されていてもよく、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
【0080】
ある実施態様においては、
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、ここで、フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨから、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で置換され、および／または
－ＲA1は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨ、特に－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨから選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、かつ
ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換されていてもよく、
特に、ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリルおよびフェニル、特に置換されていない、フェニルまたはイミダゾリルから独立して選択される１つまたは２つの置換基、特に１つの置換基、により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数の置換基、特に１つの置換基、で任意に置換されていてもよく、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、ここで、フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨから、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で置換され、および／または
－ＲA1は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨ、特に－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキルおよび－ＣＯＯＨから選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、かつ
ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＳＯ3Ｈ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、インドリルおよびフェニルから独立して選択される１つまたは２つの置換基により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数、特に１つ、の置換基で任意に置換されていてもよく、
特に、ＲA2は、－ＳＨ、－Ｓ－ＣＨ3、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－ＣＨ3、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、イミダゾリルおよびフェニル、特に置換されていない、フェニルまたはイミダゾリルから独立して選択される１つまたは２つの置換基、特に１つの置換基、により置換された、Ｃ1-3アルキル、特にＣ1-2アルキルから選択され、
ここで、該フェニルは、－ＳＨおよび－ＳｅＨ、特に－ＳＨから選択される１つまたは複数の置換基、特に１つの置換基、で任意に置換されていてもよく、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
【0081】
ある実施態様においては、
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－ＣＨ2－ＣＯＯＨおよび－ＣＨ2－イミダゾリルから選択され、および／または
－ＲA1は、－ＣＨ2－ＳＨおよび－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）から選択され、かつ
ＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ2－イミダゾリルおよび－ＣＨ2－フェニルから選択され、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
－ＲA1およびＲA2は、同一かつ、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＨ2－ＳＨ）、－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）、－フェニル－ＳＨ、－ＣＨ2－ＳＯ3Ｈ、－ＣＨ2－ＣＯＯＨおよび－ＣＨ2－イミダゾリルから選択され、および／または
－ＲA1は、－ＣＨ2－ＳＨおよび－ＣＨ（ＳＨ）（－ＣＯＯＨ）から選択され、かつ
ＲA2は、－ＣＨ2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－ＳＨ、－（ＣＨ2）2－Ｓ－ＣＨ3、－ＣＨ2－ＣＯＯＨ、－ＣＨ2－ＮＨ2、－ＣＨ2－ＣＯＮＨ2、－ＣＨ2－イミダゾリルおよび－ＣＨ2－フェニルから選択され、
ＲA2は、ＲA1と異なるように選択される。
【0082】
ある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は同一である。
【0083】
本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、ＲA1のまたはＲA2のアルキル部分は５－～６－員複素環または環状炭化水素部分により置換されていない。
【0084】
本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、ＲA1のまたはＲA2のアルキル部分は環状炭化水素部分により置換されていない。
【0085】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分であって、
ここで、該５～１０員複素環または該炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から互いに独立している。
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分であって、
ここで、該５～１０員複素環または該炭化水素部分は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から互いに独立している。
【0086】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分であって、
ここで、該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から互いに独立して選択される。
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択される部分であって、
ここで、該環状炭化水素部分は、－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から互いに独立して選択される。
【0087】
本発明に係る環状テトラペプチドの水溶性を増強させるため、１つまたは両方の部分ＲB1およびＲB2は、親水性部分を含み得る。ある実施態様においては、少なくとも１つのＲB1およびＲB2は、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択され、ここで、－ＯＨ、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基により任意に置換されている、部分から独立して選択される。
【0088】
金属結合アフィニティーを増強させるため、ＲB1およびＲB2は、追加の配位部位および／または第２配位圏を提供する部分を含み得る。ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、互いに独立して、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択され、ここで、該５～１０員複素環または炭化水素部分は、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分である。ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2の少なくとも１つは、独立して、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環または１～１２個のＣ原子を含む炭化水素部分から選択され、ここで、該炭化水素部分は、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている。
【0089】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキル、特にＣ1-4アルキル、から選択される部分であって、
ここで、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキル、特にＣ1-4アルキルは、－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され、かつ
５～１０員複素環は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈから独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から独立して選択される。
・－Ｈ、または
・－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈ、５～１０員複素環、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキル、特にＣ1-4アルキル、から選択される部分であって、
ここで、シクロペンチル、シクロヘキシル、フェニルまたはＣ1-8アルキル、特にＣ1-4アルキルは、－ＯＨ、－ＳＨ、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈおよび５～１０員複素環から独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換され、かつ
５～１０員複素環は、－ＯＨ、（＝Ｏ）、－ＳＨ、（＝Ｓ）、－Ｓ－Ｃ1-4－アルキル、－ＳｅＨ、－Ｓｅ－Ｃ1-4－アルキル、－ＣＯＯＨ、－ＮＨ2、－ＮＨ－Ｃ1-4－アルキル、－ＮＨ－Ｃ（＝ＮＨ）（ＮＨ2）、－ＣＯＮＨ2、－ＳＯ3Ｈから独立して選択される１つまたは複数の置換基で任意に置換されている、部分
から独立して選択される。
【0090】
ある実施態様においては、ＲBのシクロペンチル、シクロヘキシルまたはフェニルは置換されていない。
【0091】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2のヘテロシクリルは、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、特にイミダゾリル、メルカプトイミダゾリル、チオフラニル、オキサゾロニル、インドリル、メルカプトプリニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾイミダゾリル、キノリル、イソキノリル、ジアザナフタレニルから選択される。
【0092】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2のヘテロシクリルは、ピペリジニル、ピペラジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピラジニル、ピリダジニル、ピロリル、ピラゾリル、イミダゾリル、特にイミダゾリル、インドリルから選択される。
【0093】
ある実施態様においては、ＲB1および／またはＲB2のヘテロシクリルは、ＲA1およびＲA2について定義されたように定義される。ＲA1およびＲA2に関する個々の実施態様を引用する。
【0094】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、Ｈ、－Ｃ3-6アルキル、特に、－ＣＨ2－ＣＨ（ＣＨ3）2、－ＣＨ2－フェニル、－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＣＯＯＨおよび－（ＣＨ2）r－ＣＯＮＨ2から独立して選択され、ｍおよびｒは０、１、２または３である。
【0095】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、Ｈ、－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＳＨ、－（ＣＨ2）m－ＣＯＯＨおよび－（ＣＨ2）r－ＣＯＮＨ2から独立して選択され、ｍおよびｒは０、１、２または３である。
【0096】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、Ｈ、－（ＣＨ2）m－ＣＯＯＨおよび－（ＣＨ2）r－ＣＯＮＨ2から独立して選択され、ｍおよびｒは０、１、２または３である。
【0097】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、Ｈ、－（ＣＨ2）m－ＣＯＯＨおよび－ＣＯＮＨ2から独立して選択され、ｍは１、２または３である。
【0098】
ある実施態様においては、ｍは１、２または３である。
【0099】
ある実施態様においては、ｒは０または１、特に１である。
【0100】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は、－Ｈである。
【0101】
ある実施態様においては、ＲB1およびＲB2は同一である。
【0102】
本発明に係る環状テトラペプチドおよび／または本発明に係る環状テトラペプチドを含む金属錯体による検出を促進するために、環状テトラペプチドは検出可能なマーカーを含み得る。
【0103】
ある実施態様においては、検出可能なマーカーは、染料、アフィニティタグ、磁気ビーズおよび放射性同位体を含む部分から選択される。
【0104】
好適な染料は、例えば当業者に既知の蛍光染料である。
【0105】
アフィニティタグによる環状テトラペプチドの検出については、一般に知られたタグを使用することができる。アフィニティタグの非限定的な例は、ストレプ－タグ、グルタチオン－Ｓ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）タグ、ポリ（Ｈｉｓ）タグである。
【0106】
ある実施態様においては、リンカーは、最大５０個のＣ原子、特に最大２０個のＣ原子を含む炭化水素部分であり、ここで１個または複数個のＣ原子がＯ、ＳまたはＮにより任意に置き換えられていてもよい。
【0107】
ある実施態様においては、固体支持体は、樹脂、ビーズ、電極表面または反応容器の底／壁、特に電極表面、樹脂またはビーズ、より特に樹脂またはビーズである。
【0108】
本発明の第１の態様に係る化合物は、９６ウェルプレートなどの反応容器にまたはフロースルー装置にリンカーを介して結合され得る。これは、診断／検出方法における化合物の使用、および汚染された水および土壌のレメディエーションにおける化合物の使用のそれぞれを促進することになる。
【0109】
ある実施態様においては、本発明の第１の態様に係る化合物は、式Ｘ１～Ｘ２２、特に式Ｘ１～１１またはＸ１４～２２の化合物である。
【化4】
【0110】
本明細書に記載された本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は－ＣＨ2－イミダゾリルではなく、かつＲA1およびＲA2は－ＣＨ2－フェニルではない。
【0111】
本明細書に記載された本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は－ＣＨ2－イミダゾリルではない。
【0112】
本明細書に記載された本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、ＲA1およびＲA2は－ＣＨ2－フェニルではない。
【0113】
本明細書に記載された本発明のいずれかの態様のある実施態様においては、式１の化合物は、式Ｄ１またはＤ２の化合物ではない。
【化5】
【0114】
本発明の第２の態様は、配位子および金属からなる金属錯体であって、配位子が本発明の第１の態様に係る化合物である金属錯体に関する。
【0115】
上述したように、本発明の第１の態様に係る化合物は、ＲAおよびＲBでの好適な部分を介して金属に結合し得る。
【0116】
ある実施態様においては、本発明の第１の態様に係る化合物の結合部分が、その脱プロトン化された形態で金属に結合する。例えば、チオールおよび／またはカルボン酸部分がその脱プロトン化された形態で、以下に示すようにＰｂ2+との錯体を形成し得る（図３も参照）。
【化6】
【0117】
ある実施態様においては、リガンドはアニオンである。
【0118】
通常、金属対ペプチドの比は、１：１または１：２であり、すなわち錯体は単量体または二量体である。
【0119】
ある実施態様においては、錯体は二量体、特にホモ二量体である。
【0120】
ある実施態様においては、金属はＰｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇから選択され、特に金属はＰｂである。
【0121】
リガンドについては、本発明の第１の態様の実施形態を引用する。
【0122】
本発明の第３の態様は、疾患の治療における本発明の第１の態様に係る化合物の使用に関する。
【0123】
ある実施態様においては、本発明の第１の態様に係る化合物は、疾患の治療における使用のためのものである。
【0124】
化合物については、本発明の第１の態様の実施態様を引用する。
【0125】
本発明の第４の態様は、金属中毒の治療における本発明の第１の態様に係る化合物の使用に関する。
【0126】
ある実施態様においては、本発明の第１の態様に係る化合物は、金属中毒の治療における使用のためのものである。
【0127】
ある実施態様においては、金属中毒は、Ｐｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒から選択される。
【0128】
ある実施態様においては、金属中毒はＰｂ中毒である。
【0129】
医学的文脈において、本発明の第１の態様に係る化合物は、Ｓｅａｒｓ，Ｍ．Ｅ．（２００３）に記載される標準方法によって適用され得る。
【0130】
化合物については、本発明の第１の態様の実施態様を引用する。
【0131】
本発明の第５の態様は、患者が金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にＰｂ中毒であるか、または金属中毒を発症するリスクがあるかどうかを決定する方法であって、
ａ．患者から採取されたエクソビボの血液、血漿または血清試料において本発明の第１の態様に係る化合物を用いて金属、特にＰｂ、Ａｓ、Ｃｄおよび／またはＨｇのレベルを決定すること、および
ｂ．金属の濃度の統計学的有意性を立証すること
を含む方法に関する。
ａ．患者から採取されたエクソビボの血液、血漿または血清試料において本発明の第１の態様に係る化合物を用いて金属、特にＰｂ、Ａｓ、Ｃｄおよび／またはＨｇのレベルを決定すること、および
ｂ．金属の濃度の統計学的有意性を立証すること
を含む方法に関する。
【0132】
特に、ＲBで、任意にはリンカーによって結合された、検出可能なマーカーを含む本発明の第１の態様に係る化合物は、試料中の金属の量を決定するために適している。
【0133】
統計学的有意性は、遊離のリガンド、すなわち本発明の第１の態様に係る化合物、の金属錯体に対する比率を決定することにより立証され得る。マーカーが検出される場合に得られる信号は、標準と比較され得る。
【0134】
化合物について、本発明の第１の態様の実施態様を引用する。
【0135】
本発明はさらに、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にはＰｂ中毒の発症の検出のためのキットの製造における使用のための本発明の第１の態様に係る化合物の使用を包含する。
【0136】
単一の分離可能な特徴についての代替は、本明細書に「実施態様」としてどこで説明されていても、そのような代替は、本明細書に開示された発明の個別の実施態様を形成するために自由に組み合わせることができるということは理解されるべきである。したがって、検出可能なラベルについての代替的な実施態様のいずれかは、本発明の第１の態様に係るリガンド／化合物の代替的な実施態様のいずれかと組み合わせることができ、これらの組み合わせは、本明細書に記載された任意の医薬的適用または診断方法と組み合わせることができる。
【0137】
本発明の第６の態様は、基質、特に土壌または水溶液または水懸濁液、から金属、特にＰｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇから選択される金属、より特にＰｂ、を除去する方法であって、本発明の第１の態様に係る化合物を用いることを含む、方法に関する。
【0138】
特に、検出可能なマーカー、例えばアフィニティタグ、を含むかまたは固体支持体にリンカーを介して結合されている本発明の第１の態様に係る化合物がこの方法に好適である。
【0139】
化合物については、本発明の第１の態様の実施態様を引用する。
【0140】
本発明の第７の態様は、基質、特に土壌または水溶液または水懸濁液、のなかの金属、特にＰｂ、Ａｓ、ＣｄおよびＨｇから選択される金属、より特にＰｂ、を検出する方法であって、本発明の第１の態様に係る化合物を用いることを含む、方法に関する。
【0141】
特に、ＲBで、任意にはリンカーによって結合された、検出可能なマーカーを含む本発明の第１の態様に係る化合物は、試料中の金属の量を決定するために適している。
【0142】
化合物については、本発明の第１の態様の実施態様を引用する。
【0143】
本発明の別の態様は、本発明の第１の態様に係る化合物の製造に関する。製造は、次の工程：
－２つのα－アミノ酸Ｘａａおよび２つのβ－アミノ酸βＸａａからなるテトラペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端への配列βＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ－Ｘａａ（配列番号０１３）またはＸａａ－βＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ（配列番号０１４）、特にβＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ－Ｘａａ（配列番号０１３）により特徴づけられるテトラペプチドを提供する工程、
－カップリング試薬および塩基を添加して反応混合物を得る工程、
－希釈工程において、反応混合物を有機溶媒、特にＣＨ2Ｃｌ2またはＤＭＦ、より特にＣＨ2Ｃｌ2に希釈する工程
を含む。
－２つのα－アミノ酸Ｘａａおよび２つのβ－アミノ酸βＸａａからなるテトラペプチドであって、Ｎ末端からＣ末端への配列βＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ－Ｘａａ（配列番号０１３）またはＸａａ－βＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ（配列番号０１４）、特にβＸａａ－Ｘａａ－βＸａａ－Ｘａａ（配列番号０１３）により特徴づけられるテトラペプチドを提供する工程、
－カップリング試薬および塩基を添加して反応混合物を得る工程、
－希釈工程において、反応混合物を有機溶媒、特にＣＨ2Ｃｌ2またはＤＭＦ、より特にＣＨ2Ｃｌ2に希釈する工程
を含む。
【0144】
ある実施態様においては、カップリング剤は、ＰｙＢＯＰ、ＨＡＴＵ（１－［ビス（ジメチルアミノ）メチレン］－１Ｈ－１，２，３－トリアゾロ［４，５－ｂ］ピリジニウム ３－オキシド ヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号１４８８９３－１０－１）、ＨＣＴＵ（Ｏ－（１Ｈ－６－クロロベンゾトリアゾール－１－イル）－１，１，３，３－テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号３３０６４５－８７－９）、ＨＯＢｔ／ＤＩＣ（ベンゾトリアゾル－１－オール、ＣＡＳ番号２５９２－９５－２）およびＮ，Ｎ’－ジ（プロパン－２－イル）メタンジイミン、ＣＡＳ番号６９３－１３－０）、ＤＣＣ（Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルメタンジイミン、ＣＡＳ番号５３８－７５－０）、ＤＰＰＡ（ジフェニルリン酸アジド、ＣＡＳ番号２６３８６－８８－９）から選択される。
【0145】
ある実施態様においては、カップリング剤はＰｙＢＯＰである。用語「ＰｙＢＯＰ」は、ベンゾトリアゾル－１－イル－オキシトリピロリジノホスホニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＣＡＳ番号１２８６２５－５２－５）に関わる。
【0146】
ある実施態様においては、テトラペプチドのモル量に関して１～２モル当量のカップリング剤が使用される。
【0147】
ある実施態様においては、テトラペプチドのモル量に関して１．５モル当量が使用される。
【0148】
ある実施態様においては、塩基はヒューニッヒ塩基である。用語「ヒューニッヒ塩基」は、Ｎ－エチル－Ｎ－（プロパン－２－イル）プロパン－２－アミン（ＣＡＳ番号７０８７－６８－５）に関する。
【0149】
ある実施態様においては、テトラペプチドのモル量に対して２～６モル当量の塩基が使用される。
【0150】
ある実施態様においては、テトラペプチドのモル量に対して３モル当量の塩基が使用される。
【0151】
ある実施態様においては、希釈工程におけるテトラペプチドの濃度は、０．０１ｍＭ～１０ｍＭ、特に０．０５ｍＭ～２ｍＭである。
【0152】
ある実施態様においては、希釈工程におけるテトラペプチドの濃度は、０．１ｍＭである。
【0153】
ある実施態様においては、希釈工程は、１２時間～７２時間、特に１６時間～４８時間行われる。
【0154】
ある実施態様においては、希釈工程は、蒸発工程に追随される。速い蒸発を可能とするために、ＣＨ2Ｃl2などの低沸点溶媒が使用され得る。溶媒、例えばＤＭＦの沸点がより高い場合、蒸発が面倒となり得る。
【0155】
ある実施態様においては、本方法は、１５℃～４０℃の範囲、特に２０℃～２５℃の範囲の温度で行われる。本方法は、周囲温度で行われてもよい。反応混合物を加熱または冷却する必要はない。
【0156】
テトラペプチドは保護基を含み得る。好適な保護基ならびに脱保護の方法は、当業者に公知である。
【0157】
医学的処置、剤形および塩
同様に、必要とする患者に本発明の第１の態様に係る化合物を投与することを含む、その患者における、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にＰｂ中毒、の治療方法は、本発明の範囲内である。
同様に、必要とする患者に本発明の第１の態様に係る化合物を投与することを含む、その患者における、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にＰｂ中毒、の治療方法は、本発明の範囲内である。
【0158】
同様に、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にＰｂ中毒、の予防または治療のための剤形が提供され、本発明の上記態様または実施態様のいずれかに係る化合物を含む。
【0159】
当業者は、本明細書に言及された任意の具体的に記載された薬物化合物が、上記薬物の薬学的に許容され得る塩として存在し得ることが分かっている。薬学的に許容され得る塩は、イオン化された薬物と反対の電荷を帯びた対イオンを含む。薬学的に許容され得る陰イオン塩の形態の非限定的な例は、酢酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、酸性酒石酸塩、臭化物、炭酸塩、塩化物、クエン酸塩、エデト酸塩、エジシル酸塩、エンボン酸塩、エストラート、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化物、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル、硫酸メチル、ムチン酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、パモ酸塩、リン酸塩、二リン酸塩、サリチル酸塩、二サリチル酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、トリエトヨウ化物および吉草酸塩を含む。薬学的に許容され得る陽イオン塩の形態の非限定的な例は、アルミニウム、ベンザチン、カルシウム、エチレンジアミン、リジン、マグネシウム、メグルミン、カリウム、プロカイン、ナトリウム、トロメタミンおよび亜鉛を含む。
【0160】
剤形は、鼻、口腔、直腸、経皮または経口投与などの経腸投与、または吸入形態のためのもの、または座薬であってもよい。あるいは、非経口投与も使用することができ、皮下、静脈内、肝内または筋肉内注射形態などである。任意には、薬学的に許容され得る担体および／または賦形剤が存在してもよい。
【0161】
局所投与もまた本発明の有益な使用の範囲内である。当業者は、Benson and Watkinson（Eds.）, Topical and Transdermal Drug Delivery：Principles and Practice（1st Edition, Wiley 2011, ISBN-13: 978-0470450291）；およびGuy and Handcraft：Transdermal Drug Delivery Systems: Revised and Expanded（2nd Ed., CRC Press 2002, ISBN-13: 978-0824708610）；Osborne and Amann（Eds.）：Topical Drug Delivery Formulations（1st Ed. CRC Press 1989; ISBN-13: 978-0824781835）の内容により例示されるように、局所製剤を提供する可能なレシピの広い範囲を承知している。
【0162】
医薬組成物および投与
本発明の別の態様は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施態様においては、組成物は、本明細書に記載されているものなどの少なくとも２つの薬学的に許容され得る担体を含む。
本発明の別の態様は、本発明の化合物またはその薬学的に許容され得る塩、および薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物に関する。さらなる実施態様においては、組成物は、本明細書に記載されているものなどの少なくとも２つの薬学的に許容され得る担体を含む。
【0163】
本発明のある実施態様においては、本発明の化合物は、典型的には、薬物の容易に制御可能な投薬を提供するためおよび滑らかかつ容易に取り扱い可能な製品を患者に与えるため医薬投与形態に製剤化される。
【0164】
本発明の化合物の局所使用に関連する本発明の実施態様においては、医薬組成物は、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲルまたはスプレー可能な製剤、例えばエアロゾルなどによる送達のためのもの、など局所投与に適するような方法で製剤化され、活性剤を当業者に知られている可溶化剤、安定化剤、等張化促進剤、緩衝剤および保存料の１つまたは複数と一緒に含む。
【0165】
医薬組成物は、経腸投与、特に経口投与または直腸投与のために製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（カプセル、錠剤、ピル、顆粒、粉末または座薬を含むがこれらに限定されない）、または液体形態（溶液、懸濁液またはエマルジョンを含むがこれらに限定されない）に作ることができる。
【0166】
医薬組成物は、例えば、ｉ．ｖ．注入、皮内、皮下または筋肉内投与による、非経口投与のために製剤化することができる。
【0167】
本発明の化合物の投薬レジメンは、特定の薬剤の薬力学的特徴およびその投与モードおよび経路；レシピエントの、種、年齢、性別、健康状態、医学的状態および体重；症状の特質および程度；併用療法の種類；治療の頻度；投与経路；患者の腎および肝機能；および所望の効果などの公知の因子により変化する。ある実施態様においては、本発明の化合物は、毎日１回の服用で投与されてもよく、または１日当たりの総投薬量が１日に２回、３回または４回の分割用量で投与されてもよい。
【0168】
ある実施態様においては、本発明の医薬組成物または組み合わせは、約５０～７０ｋｇの対象に約１～１０００ｍｇの活性成分の単位投薬量である。化合物、医薬組成物またはその組み合わせの治療に効果的な投薬量は、対象の種、体重、年齢および個人の状態、障害または疾患または処置されるその重症度による。当業者である医師、臨床医または獣医は、障害または疾患の進行を予防する、治療するまたは阻害するために必要な各活性成分の有効量を容易に決定することができる。
【0169】
本発明の医薬組成物は、滅菌などの従来の製薬工程に付すことができ、および／または従来の不活性な希釈剤、潤滑剤、または緩衝剤、ならびに保存料、安定化剤、湿潤剤、乳化剤およびバッファーなどのアジュバントを含有することができる。それらは、標準的なプロセスにより、例えば従来の混合、造粒、溶解または凍結乾燥プロセスにより製造してもよい。多くのそのような医薬組成物を製造するための手順および方法は、本技術分野で公知であり、例えば、L. Lachman et al. The Theory and Practice of Industrial Pharmacy, 4th Ed, 2013（ISBN 8123922892）参照。
【0170】
本発明に係る製造方法および治療方法
本発明は、追加的な態様として、上記に詳細に定めた、本発明の第１の態様に係る化合物またはその薬学的に許容され得る塩の、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にはＰｂ中毒の治療または予防のための医薬の製造方法における使用のための使用をさらに包含する。
本発明は、追加的な態様として、上記に詳細に定めた、本発明の第１の態様に係る化合物またはその薬学的に許容され得る塩の、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にはＰｂ中毒の治療または予防のための医薬の製造方法における使用のための使用をさらに包含する。
【0171】
同様に、本発明は、金属中毒、特にＰｂ中毒、Ａｓ中毒、Ｃｄ中毒およびＨｇ中毒、より特にはＰｂ中毒、と関連する疾患と診断されている患者の治療方法を包含する。この方法は、患者に、本明細書に詳細に定めた、本発明の第１の態様に係る化合物またはその薬学的に許容され得る塩を投与することを必然的に伴う。
【0172】
本発明は、以下の実施例および図面によりさらに説明され、そこからさらなる実施態様および利益が導き出される。これらの実施例は、本発明を説明することを意図しており、その範囲を制限することを意図したものではない。
【実施例】
【0173】
実施例１：環状テトラペプチドの合成
この実施例において説明される化合物のために、配列、環状－［Ｘａａ－βＡｌａ－Ｘａａ－βＡｌａ］（配列番号０１５）（Ｘａａは任意のα－ＡＡを描写する；スキーム１）から構成されるスキャフォールドが選択され、安定性の増強に加え、βＡｌａがテトラペプチドの難しい分子内環化を促進することが期待された。
この実施例において説明される化合物のために、配列、環状－［Ｘａａ－βＡｌａ－Ｘａａ－βＡｌａ］（配列番号０１５）（Ｘａａは任意のα－ＡＡを描写する；スキーム１）から構成されるスキャフォールドが選択され、安定性の増強に加え、βＡｌａがテトラペプチドの難しい分子内環化を促進することが期待された。
【化7】
【0174】
ここで、本発明者らは、Ｐｂ2+イオンを解毒するために設計された環状テトラペプチドのファミリーを提示する。ペプチドは、Ｐｂ暴露バクテリアおよびヒト細胞を回復するそれらの能力について調べられ、そこで１つの特別なペプチド（８）が、ベンチマークキレート剤（ＣＡ）よりも大いに優れていた。成功したペプチドの機構研究は、その生物学的結果および医学的可能性に光を当てた。
【0175】
本発明者らは、９つの側鎖保護線状ペプチド（表１、１－９）を合成することにより、彼らの研究を開始した。典型的には、頭尾環化は溶媒としてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で生じ、５量体よりも短いペプチドでは極めてまれである（White et a;, 2011）。本発明者らは、ＤＭＦのような高沸点溶媒の不存在下でテトラペプチドを環化することを目指した。条件スクリーニングに際し、本発明者らは、次の理想的な条件：それぞれカップリング試薬および塩基として、ＰｙＢＯＰおよびヒューニッヒ塩基（それぞれ１．５および３．０当量）、および完全変換が得られるまで１６～４８時間、ＣＨ2Ｃｌ2中の超高度希釈ペプチド（０．１ｍＭ）、を見出した。環状ペプチドは、次いで、側鎖を脱保護され、ＨＰＬＣを必要とせずに精製され、２工程（環化および脱保護）にわたり６２～８７％の収率で、９５％超の純度を達成した。ＨＲ－ＥＳＩ－ＭＳおよび1Ｈおよび13Ｃ ＮＭＲは、所望のテトラマーを形成するための排他的な分子内環化を示した。
【0176】
【表1】
【0177】
実施例２：インビボおよびインビトロ解毒
その後、脱塩ペプチドは、Ｐｂを解毒するそれらの能力について評価された（図２ａ－ｄ）。本発明者らは、細菌でのインビボとその後のヒト細胞でのインビトロの両方で潜在的なＣＡの迅速かつ信頼できるスクリーニングのための２つのアッセイを設計した。簡単に説明すると、ＤＨ５αまたはＨＴ－２９細胞をまずＰｂ（ＮＯ3）2にわずかに最小阻害濃度未満で暴露し、その後、調査されるＣＡの０．１～１０当量の範囲の種々の濃度で処置した。細胞の生存率は、コロニー計数によりまたはクリスタルバイオレットにより（Feoktistova et al., 2016）、細菌およびヒト細胞についてそれぞれ決定し、陰性対照としていずれのＣＡでも処置しなかった中毒細胞と比較した。主に、インビボアッセイは固化培地上のＣＡを検査し、化合物の低い溶解性に由来する制限を排除するため、両アッセイを行うことは非常に価値があることが判明した。他方、化合物をヒト細胞で試験することは、不溶性化合物では行うことができないが、医療目的により関連する。
その後、脱塩ペプチドは、Ｐｂを解毒するそれらの能力について評価された（図２ａ－ｄ）。本発明者らは、細菌でのインビボとその後のヒト細胞でのインビトロの両方で潜在的なＣＡの迅速かつ信頼できるスクリーニングのための２つのアッセイを設計した。簡単に説明すると、ＤＨ５αまたはＨＴ－２９細胞をまずＰｂ（ＮＯ3）2にわずかに最小阻害濃度未満で暴露し、その後、調査されるＣＡの０．１～１０当量の範囲の種々の濃度で処置した。細胞の生存率は、コロニー計数によりまたはクリスタルバイオレットにより（Feoktistova et al., 2016）、細菌およびヒト細胞についてそれぞれ決定し、陰性対照としていずれのＣＡでも処置しなかった中毒細胞と比較した。主に、インビボアッセイは固化培地上のＣＡを検査し、化合物の低い溶解性に由来する制限を排除するため、両アッセイを行うことは非常に価値があることが判明した。他方、化合物をヒト細胞で試験することは、不溶性化合物では行うことができないが、医療目的により関連する。
【0178】
９つのペプチドのうち、４つがベンチマーク化合物と比較して中毒Ｅ．ｃｏｌｉを解毒するのに傑出した結果を発揮した（図２ａ）。それら４つは全て、少なくとも１つのＣｙｓおよびＰｂ2+に結合することができる追加的な残基；ペプチド１、２、６および８それぞれにＣｙｓ、ＤＣｙｓ、ＭｅｔおよびＡｓｐを含有する。１での処置は回復を８倍より多く増加させ、一方ＬＣｙｓの１つのＤＣｙｓでの置換は、ペプチド２の解毒能力を減少させた。これは、その好ましい固有の片側に向けられた配置においてＰｂ2+を捕捉する結合部分が同じ方向を向くべきであるという要件を指摘する。驚くべきことに、ホモ－機能化ペプチド３～５は、不十分な活性を示し、乏しい金属選択性または低いＰｂ親和性を示した。特筆すべきは、ペプチド１～８の線状アナログもインビボで試験され、全てのケースでほとんど解毒能力がないことが示された。本発明者らは、予期された増強されたタンパク質分解安定性に加え、環化はまた、配位特性を向上させることによりその金属親和性を与える配位子のプレ組織化を育成すると結論付けた。
【0179】
インビボでの高い活性にもかかわらず、ペプチド１、２および６は、低い水溶性を示し、潜在的なＣＡとしてのそれらの有効性を減じた。種々のｐＨ条件、ＰＥＧとの製剤化、またはＤＭＳＯとの共溶媒系などのそれらを溶解させようとする試みは失敗した。したがって、βＡｌａはβＡｓｐまたはβｈＧｌｕに置き換えられて、ペプチド１ａおよび１ｂをそれぞれ形成している１の２つのアナログが合成された。これらのペプチドは、ＮａまたはＣａ塩として高い溶解性を示したが、バクテリアにおけるそれらの解毒能力は満足できるものではなかった（図２ａ）。それらの低い活性は、（ａ）Ｐｂ2+との配位における２つのカルボキシレートによる競争、これが錯体形成を不安定化する、または（ｂ）それらの金属選択性および配位アルカリまたはアルカリ土塁金属イオンの減少、のいずれかに関係すると考えられる。
【0180】
それにもかかわらず、本発明者らは、インビトロで１ａおよび他の可溶性ペプチドを、中毒化されたヒト細胞を回復させるそれらの能力について試験した（図２ｂ）。全ての化合物の中でも、ペプチド８が、回復率３３４±４２％で、ＤＭＳＡの１１０±１０％およびＮａ2ＣａＥＤＴＡの９５±１６％と比較して、非常に優れた程度でＰｂ2+を解毒した。このペプチドは、天然の参照ペプチドとしてのベンチマーク薬およびグルタチオン（ＧＳＨ）と比較して高濃度で劇的に優れていた（図２ｂ、２ｃ）。本発明者らは、細胞レベルに対するＰｂ2+の効果およびキレート機序は、両方の系において同様であるということを示唆する、２つのアッセイ間でほとんどの化合物において同様のパターンも観察した。
【0181】
ＣＡとしてのＥＤＴＡの投与は、Ｃａ2+イオンの望まれない枯渇を減少するために、そのＮａ塩からＮa2ＣaＥＤＴＡへと変化させた。したがって、８の場合でも、対陽イオンがその活性に影響を与えるかどうかが試験された（図２ｄ）。Ｃａ－塩として高い活性を示すＥＤＴＡとは異なり、８は対陽イオンによりほとんど影響を受けない（図２ｄ）。これらの相違点は、８のＰｂ2+に対する能力は、ＥＤＴＡの場合とは異なり、ＣＡに結合しないＣａ2+イオンよりも高いことを暗示している。高濃度でのＣａ８のより低い活性は、Ｎａ2８と比較してこの塩のわずかに低い溶解性と関連付けられる。
【0182】
８の有効性を結論付けるために、本発明者らは、母集団のたった１５±５％の生存率を阻害する、ＤＭＳＡおよびＮａ2ＣａＥＤＴＡのものよりも劇的に低いそのインビトロでの毒性（図２ｅ）を評価した。
【0183】
材料および方法
本明細書に記載されたペプチドは、スキーム２に示される反応にしたがい合成される。Ｒはα－またはβ－アミノ酸の側鎖を示す。側鎖は適切な保護基（Ｒ’）により保護され得る。テトラペプチドは、塩化クロロトリチル樹脂上で標準的なＦｍｏｃに基づくプロトコルを用いて標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により得られる。切断（１％ＴＦＡ）は、各１分の５ラウンドでＣＨ2Ｃｌ2中のＴＦＡを用いて達成される。環化は、側鎖保護ペプチドをＰｙＢＯＰ（カップリング試薬として）およびヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ；塩基として）と、ペプチドに対してＰｙＢＯＰについて１．５当量、塩基について３当量の比率で反応させることにより得られる。ペプチドは、二量化を避けるために高度に希釈され（０．１ｍＭ）、溶媒はＣＨ2Ｃｌ2単独である。反応混合物は一晩（１６～４８時間）インキュベートされる。側鎖は、個々のアミノ酸組成に対して調整されているＴＦＡカクテルで脱保護される。典型的には、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：Ｈ2Ｏ（８７．５：２．５：７．５：２．５）の混合物が１時間適用される。最終的には、環状テトラペプチドが、ＨＰＬＣを必要とすることなく水溶液中での沈殿により精製される。純度９５％以上および収率６２％～８７％（精製後）の範囲が達成される。最終工程において、ペプチドは、ＴＦＡが毒であるためＣｌ-イオンがＴＦＡアニオンに置き換えられるようにＨＣｌと反応される。ＴＦＡの完全な除去は、19Ｆ ＮＭＲでモニターされる。
本明細書に記載されたペプチドは、スキーム２に示される反応にしたがい合成される。Ｒはα－またはβ－アミノ酸の側鎖を示す。側鎖は適切な保護基（Ｒ’）により保護され得る。テトラペプチドは、塩化クロロトリチル樹脂上で標準的なＦｍｏｃに基づくプロトコルを用いて標準的な固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により得られる。切断（１％ＴＦＡ）は、各１分の５ラウンドでＣＨ2Ｃｌ2中のＴＦＡを用いて達成される。環化は、側鎖保護ペプチドをＰｙＢＯＰ（カップリング試薬として）およびヒューニッヒ塩基（ＤＩＰＥＡ；塩基として）と、ペプチドに対してＰｙＢＯＰについて１．５当量、塩基について３当量の比率で反応させることにより得られる。ペプチドは、二量化を避けるために高度に希釈され（０．１ｍＭ）、溶媒はＣＨ2Ｃｌ2単独である。反応混合物は一晩（１６～４８時間）インキュベートされる。側鎖は、個々のアミノ酸組成に対して調整されているＴＦＡカクテルで脱保護される。典型的には、ＴＦＡ：ＴＩＰＳ：ＥＤＴ：Ｈ2Ｏ（８７．５：２．５：７．５：２．５）の混合物が１時間適用される。最終的には、環状テトラペプチドが、ＨＰＬＣを必要とすることなく水溶液中での沈殿により精製される。純度９５％以上および収率６２％～８７％（精製後）の範囲が達成される。最終工程において、ペプチドは、ＴＦＡが毒であるためＣｌ-イオンがＴＦＡアニオンに置き換えられるようにＨＣｌと反応される。ＴＦＡの完全な除去は、19Ｆ ＮＭＲでモニターされる。
【0184】
【化8】
【0185】
以下の環状テトラペプチドは上述のように合成した。
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｃｙｓ－βＡｌａ（配列番号００１）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ12Ｈ21Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３４９．０９９８７；測定値：３４９．０９９４６
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｍｅｔ－βＡｌａ（配列番号００６）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ25Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３７７．１３１１７；測定値：３７７．１３１２０
Ｈｉｓ－βＡｌａ－Ｈｉｓ－βＡｌａ（配列番号００４）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ18Ｈ26Ｎ8Ｏ4 2+［Ｍ＋２Ｈ］2+についての計算値：２０９．１０３３０；測定値：２０９．１０３４１
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｈｉｓ－βＡｌａ（配列番号００７）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ15Ｈ23Ｎ6Ｏ4Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３８３．１４９６０；測定値：３８３．１４９７１
Ａｓｐ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ（配列番号００５）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ19Ｎ4Ｏ8 -［Ｍ－Ｈ］-についての計算値：３７１．１２０８４；測定値：３７１．１２０６５
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ（配列番号００８）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ13Ｈ21Ｎ4Ｏ6Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３６１．１１７６３；測定値：３６１．１１７７１
Ｃｙｓ－βＡｌａ－ＤＣｙｓ－βＡｌａ（配列番号００２）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ12Ｈ21Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３４９．０９９８７；測定値：３４９．０９９７８
Ｃｙｓ－βＡｓｐ－Ｃｙｓ－βＡｓｐ（配列番号０１０）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ19Ｎ4Ｏ8Ｓ2 -［Ｍ－Ｈ］-についての計算値：４３５．０６４９８；測定値：４３５．０６５６４
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｐｈｅ－βＡｌａ（配列番号００９）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ18Ｈ25Ｎ4Ｏ4Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３９３．１５９１０；測定値：３９３．１５８８８
Ｍｅｔ－βＡｌａ－Ｍｅｔ－βＡｌａ（配列番号００３）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ16Ｈ28Ｎ4Ｏ4ＳＮａ+［Ｍ＋Ｎａ］+についての計算値：４２７．１４４４２；測定値：４２７．１４４４７
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｃｙｓ－βＡｌａ（配列番号００１）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ12Ｈ21Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３４９．０９９８７；測定値：３４９．０９９４６
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｍｅｔ－βＡｌａ（配列番号００６）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ25Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３７７．１３１１７；測定値：３７７．１３１２０
Ｈｉｓ－βＡｌａ－Ｈｉｓ－βＡｌａ（配列番号００４）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ18Ｈ26Ｎ8Ｏ4 2+［Ｍ＋２Ｈ］2+についての計算値：２０９．１０３３０；測定値：２０９．１０３４１
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｈｉｓ－βＡｌａ（配列番号００７）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ15Ｈ23Ｎ6Ｏ4Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３８３．１４９６０；測定値：３８３．１４９７１
Ａｓｐ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ（配列番号００５）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ19Ｎ4Ｏ8 -［Ｍ－Ｈ］-についての計算値：３７１．１２０８４；測定値：３７１．１２０６５
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ（配列番号００８）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ13Ｈ21Ｎ4Ｏ6Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３６１．１１７６３；測定値：３６１．１１７７１
Ｃｙｓ－βＡｌａ－ＤＣｙｓ－βＡｌａ（配列番号００２）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ12Ｈ21Ｎ4Ｏ4Ｓ2 +［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３４９．０９９８７；測定値：３４９．０９９７８
Ｃｙｓ－βＡｓｐ－Ｃｙｓ－βＡｓｐ（配列番号０１０）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ14Ｈ19Ｎ4Ｏ8Ｓ2 -［Ｍ－Ｈ］-についての計算値：４３５．０６４９８；測定値：４３５．０６５６４
Ｃｙｓ－βＡｌａ－Ｐｈｅ－βＡｌａ（配列番号００９）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ18Ｈ25Ｎ4Ｏ4Ｓ+［Ｍ＋Ｈ］+についての計算値：３９３．１５９１０；測定値：３９３．１５８８８
Ｍｅｔ－βＡｌａ－Ｍｅｔ－βＡｌａ（配列番号００３）
ＨＲＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ：Ｃ16Ｈ28Ｎ4Ｏ4ＳＮａ+［Ｍ＋Ｎａ］+についての計算値：４２７．１４４４２；測定値：４２７．１４４４７
【0186】
インビボ回収試験
ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＴ細胞の単コロニーを、抗生物質なしのトリス最小培地（ＴＭＭ、ｐＨ６．０；５ｍＬ）中、３７℃および２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。その後、培養物を、総容量５ｍＬまでの追加のＴＭＭでＯＤ600が０．０３まで希釈し、そのＯＤ600をモニターした。細胞密度が０．２５となったら、１ｍＬの培養物を細胞培養管に移し、陽性対照として標識化した。さらなる３ｍＬの培養物に、３６μＬのＰｂ（ＮＯ3）2 １Ｍを添加した（最終濃度１２ｍＭ）。両培養物を３７℃および２２０ｒｐｍでさらに５時間振とうした。
ＤＨ５α Ｅ．ｃｏｌｉ ＷＴ細胞の単コロニーを、抗生物質なしのトリス最小培地（ＴＭＭ、ｐＨ６．０；５ｍＬ）中、３７℃および２２０ｒｐｍで一晩増殖させた。その後、培養物を、総容量５ｍＬまでの追加のＴＭＭでＯＤ600が０．０３まで希釈し、そのＯＤ600をモニターした。細胞密度が０．２５となったら、１ｍＬの培養物を細胞培養管に移し、陽性対照として標識化した。さらなる３ｍＬの培養物に、３６μＬのＰｂ（ＮＯ3）2 １Ｍを添加した（最終濃度１２ｍＭ）。両培養物を３７℃および２２０ｒｐｍでさらに５時間振とうした。
【0187】
各ＣＡの水性の原液を、各化合物の最終濃度が、５０μＬの毒を入れる前の培地中のＰｂ（ＮＯ3）2の量と比較して、０．５、１、２、５および１０当量と等しくなるように新しく調製したアガーＬＢプレート上に置いた。原液は、各溶液の３０μＬをプレーティングおよび均一拡散がＣＡの所望の量を提供するように調製された。追加の２つのプレートに、３０μＬのＨ2Ｏを加えた。
【0188】
５０μＬの毒を入れる前の培養物を、培養物に金属を添加する５時間前に、各ＣＡ含有プレートに均一に拡散させた。Ｐｂ含有培養物も２つのＨ2Ｏ含有プレートの１つに置き、陰性対照として標識した。最後に、５０μＬの毒を入れていない培養物を、第２のＨ2Ｏ含有プレートに置き、陽性対照として標識した。その後、全てのプレート（陽性対照および陰性対照および各試験化合物に対する５つのプレート）を、３７℃で一晩インキュベートした。その後プレートを撮影し、コロニーを計数した（Vilber Quantum Visualization Systemで）。ＣＡの各濃度の回復は、等式１にしたがい計算した。
＃ＣＡｘ－ＣＡをＸｍＭ含有するプレートにおける毒を入れる前の培養物のコロニー数
＃ＮＥＧ－ＣＡを含有するプレートにおける毒を入れる前位の培養物のコロニー数
【数1】
＃ＮＥＧ－ＣＡを含有するプレートにおける毒を入れる前位の培養物のコロニー数
【0189】
各実験は、３つの独立した場合について行った。値は、三重に行われた各３回より多くの繰り返しの平均±ＳＤである。
【0190】
インビトロ回復試験
ＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１％のＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）スーパー（規格）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＲＰＭＩ－１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。９６ウェルプレートを、各ウェルが１００μＬの培地に１０，０００細胞を含むように準備し、細胞を一晩接着させた。陽性対照以外の全てのウェルに、１０μＬの２２ｍＭ Ｐｂ（ＮＯ3）2を加えた（最終濃度２ｍＭ）。１０μＬのＨ2Ｏを陽性対照のウェルに加えた。金属の添加６０分後に、試験ＣＡ（２．４、６、１２、２４、４８および１２０ｍＭ）の各溶液１０μＬを、最終濃度０．２、０．５、１、２、４および１０ｍＭ（それぞれ０．１、０．２５、０．５、１、２および５当量）に到達するまで加えた。金属を含まない陽性対照ウェルおよび金属を含むがＣＡを含まない陰性対照ウェルに１０μＬのＨ2Ｏを加えた。各条件は三重で行った。プレートを３７℃および５％ＣＯ2でさらに２３時間インキュベートし、その後培地を除去し、各ウェルに新鮮な培地および５０μＬのクリスタルバイオレット溶液（２０ｍＬ ＭｅＯＨおよび８０ｍＬ Ｈ2Ｏ中０．５％クリスタルバイオレット粉末）で洗浄し、そしてプレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうした。その後、プレートをＨ2Ｏで結合していない染料が観察されなくなるまで洗浄し、一晩乾燥した。２００μＬのＭｅＯＨを各ウェルに加え、プレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうし、その後それらの５６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで読んだ。ＣＡの各濃度の回復率を等式２にしがたって計算した。
Ａ［ＣＡｘ］－ＸｍＭのＣＡの存在下での毒を入れる前のウェルの吸光度
Ａ［ブランク］－（なにも含まない）ブランクウェルの吸光度
Ａ［ＮＥＧ］－ＣＡを含まない毒を入れる前のウェルの吸光度
ＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１％のＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）スーパー（規格）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＲＰＭＩ－１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。９６ウェルプレートを、各ウェルが１００μＬの培地に１０，０００細胞を含むように準備し、細胞を一晩接着させた。陽性対照以外の全てのウェルに、１０μＬの２２ｍＭ Ｐｂ（ＮＯ3）2を加えた（最終濃度２ｍＭ）。１０μＬのＨ2Ｏを陽性対照のウェルに加えた。金属の添加６０分後に、試験ＣＡ（２．４、６、１２、２４、４８および１２０ｍＭ）の各溶液１０μＬを、最終濃度０．２、０．５、１、２、４および１０ｍＭ（それぞれ０．１、０．２５、０．５、１、２および５当量）に到達するまで加えた。金属を含まない陽性対照ウェルおよび金属を含むがＣＡを含まない陰性対照ウェルに１０μＬのＨ2Ｏを加えた。各条件は三重で行った。プレートを３７℃および５％ＣＯ2でさらに２３時間インキュベートし、その後培地を除去し、各ウェルに新鮮な培地および５０μＬのクリスタルバイオレット溶液（２０ｍＬ ＭｅＯＨおよび８０ｍＬ Ｈ2Ｏ中０．５％クリスタルバイオレット粉末）で洗浄し、そしてプレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうした。その後、プレートをＨ2Ｏで結合していない染料が観察されなくなるまで洗浄し、一晩乾燥した。２００μＬのＭｅＯＨを各ウェルに加え、プレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうし、その後それらの５６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで読んだ。ＣＡの各濃度の回復率を等式２にしがたって計算した。
【数2】
Ａ［ブランク］－（なにも含まない）ブランクウェルの吸光度
Ａ［ＮＥＧ］－ＣＡを含まない毒を入れる前のウェルの吸光度
【0191】
各実験は、３つの独立した場合について行った。値は、三重に行われた各３回より多くの繰り返しの平均±ＳＤである。
【0192】
インビトロ毒性試験
ＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１％のＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）スーパー（規格）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＲＰＭＩ－１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。９６ウェルプレートを、各ウェルが１００μＬの培地に１０，０００細胞を含むように準備し、細胞を一晩接着させた。陽性対照以外の全てのウェルに、試験ＣＡ（２．４、６、１２、２４、４８および１２０ｍＭ）の各溶液１０μＬを、最終濃度０．２、０．５、１、２、４および１０ｍＭに到達するまで加えた。陽性対照ウェルに１０μＬのＨ2Ｏを加えた。各条件は三重で行った。プレートを３７℃および５％ＣＯ2で２４時間インキュベートし、その後培地を除去し、各ウェルに新鮮な培地および５０μＬのクリスタルバイオレット溶液（２０ｍＬ ＭｅＯＨおよび８０ｍＬ Ｈ2Ｏ中０．５％クリスタルバイオレット粉末）で洗浄し、そしてプレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうした。その後、プレートをＨ2Ｏで結合していない染料が観察されなくなるまで洗浄し、一晩乾燥した。２００μＬのＭｅＯＨを各ウェルに加え、プレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうし、その後それらの５６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで読んだ。ＣＡの各濃度の毒性を等式３にしがたって計算した。
Ａ［ＣＡｘ］－ＸｍＭのＣＡの存在下での毒を入れる前のウェルの吸光度
Ａ［ブランク］－（なにも含まない）ブランクウェルの吸光度
Ａ［ＰＯＳ］－ＣＡを含まないウェルの吸光度
ＨＴ－２９細胞（ＡＴＣＣから購入）を、１％のＬ－グルタミン、１％のペニシリン／ストレプトマイシンおよび１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）スーパー（規格）を補充した２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ ＲＰＭＩ－１６４０培地中で３７℃および５％ＣＯ2で増殖させた。９６ウェルプレートを、各ウェルが１００μＬの培地に１０，０００細胞を含むように準備し、細胞を一晩接着させた。陽性対照以外の全てのウェルに、試験ＣＡ（２．４、６、１２、２４、４８および１２０ｍＭ）の各溶液１０μＬを、最終濃度０．２、０．５、１、２、４および１０ｍＭに到達するまで加えた。陽性対照ウェルに１０μＬのＨ2Ｏを加えた。各条件は三重で行った。プレートを３７℃および５％ＣＯ2で２４時間インキュベートし、その後培地を除去し、各ウェルに新鮮な培地および５０μＬのクリスタルバイオレット溶液（２０ｍＬ ＭｅＯＨおよび８０ｍＬ Ｈ2Ｏ中０．５％クリスタルバイオレット粉末）で洗浄し、そしてプレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうした。その後、プレートをＨ2Ｏで結合していない染料が観察されなくなるまで洗浄し、一晩乾燥した。２００μＬのＭｅＯＨを各ウェルに加え、プレートを２０分間、穏やかに（６０ｒｐｍ）振とうし、その後それらの５６０ｎｍでの吸光度をプレートリーダーで読んだ。ＣＡの各濃度の毒性を等式３にしがたって計算した。
【数3】
Ａ［ブランク］－（なにも含まない）ブランクウェルの吸光度
Ａ［ＰＯＳ］－ＣＡを含まないウェルの吸光度
【0193】
各実験は、３つの独立した場合について行った。値は、三重に行われた各３回より多くの繰り返しの平均±ＳＤである。
【0194】
Ｐｂ解毒能の決定のためのインビトロおよびインビボアッセイの設定は表２に示される。
【0195】
【表2】
【0196】
実施例３：ペプチド８ａ
インビトロおよびインビボの解毒結果
すべての調査したペプチド内で最良の結果が明らかになり、かつ標準医療（ＳＯＣ）をも打ち負かすペプチド（図４）は、配列環状［ＳＡｓｐ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ］（８ａ；配列番号１６）を有する。
インビトロおよびインビボの解毒結果
すべての調査したペプチド内で最良の結果が明らかになり、かつ標準医療（ＳＯＣ）をも打ち負かすペプチド（図４）は、配列環状［ＳＡｓｐ－βＡｌａ－Ａｓｐ－βＡｌａ］（８ａ；配列番号１６）を有する。
【化9】
【0197】
その後、ペプチド８ａをマウスで試験した。６～８週齢の４０匹の雄性マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）に、７日間（１日目～７日目）、唯一の水分供給として２０ｍＭのＰｂ（ＯＡｃ）2溶液を与えた。この中毒化経路は、ヒトにおける慢性暴露を模倣している。きれいな水に戻してから２日後（９日目）、それらを無作為に８匹のマウスの５つのグループに分けた。それらは、陰性対照として供されたグループ１以外、７日間、１日１回、３０ｍｇｋｇ-1の濃度でＣａＮａ2ＥＤＴＡ、ＤＭＳＡまたは８ａのいずれかの治療を受けた（表３）。
【0198】
血液試料（１００μＬ）を、１０～１５日目のマウスに投薬する前および最後の投薬の２日後である１８日目に採取し、その日に実験は終結された。尿も１８日目に３４匹のマウスから採取し、分析まで凍結維持した。
【0199】
【表3】
【0200】
最終日の血液試料は、８ａは、経口およびＩＶで投与された両方の場合に、２つのＳＯＣよりもより有効であるということを明らかに示す（表３、図５Ａ）。具体的には、ＩＶで投与された場合、８ａは平均血中鉛レベル（ＢＬＬ）を未処置と比べて２．１倍、ＣａＮａ2ＥＤＴＡ（ＩＶ投与）と比べて１．６倍減少させた。経口で投与された場合、そのペプチドは、ＢＬＬを未処置と比べて１．９倍、ＤＭＳＡと比べて１．３倍減少した。
【0201】
実験の最終日に採取された３４匹（４０匹中；図５Ｂ）のマウスの尿中のＰｂ含有量は、８ａの作用機序がキレート化と尿を介した有毒金属の排出によるものであることを示す。グループ４および５の尿中の高いＰｂレベルは、グループ１～３と比較したこれらのグループの減少されたＢＬＬと一致する。ペプチドのＩＶおよび経口投与を比較すると、Ｐｂは未処置グループと比べてそれぞれ２．９および２．８倍排出された。そのペプチドはまた、１．３～２．２倍の範囲でＳＯＣと比べてＰｂの上昇された除去を可能とした。
【0202】
固定化ペプチドによる水のレメディエーション
堅く選択的にＰｂ2+イオンに結合することが予期される２つのペプチドを、長く柔軟なリンカー（（ＰＥＧ２）2）および光開裂可能な部分で固体支持体に固定化した（図６）。
堅く選択的にＰｂ2+イオンに結合することが予期される２つのペプチドを、長く柔軟なリンカー（（ＰＥＧ２）2）および光開裂可能な部分で固体支持体に固定化した（図６）。
【0203】
加えて、第２のＰＥＧ２がアセチル化されている陰性対照（０ｆ）を合成した。その後、３つの装置すべては、２５ｍＭのＰｂ（ＮＯ3）2溶液からのＰｂ2+イオンの捕捉のためのそれらの能力について試験した。金属溶液の装置への添加の１時間後、溶液をろ過し、それらの各々におけるＰｂ濃度をＩＣＰ－ＭＳにより定量した。有効性は、１００％のＰｂ含有量として元の溶液で検出された濃度で各溶液の濃度を割ることにより算出した（図７）。
【0204】
０ｆが汚染された溶液のＰｂ濃度を減少させることができない一方、１ｆおよび８ｆはＰｂ濃度をそれぞれ６２±４％および３６±７％減少させ（図７、左暗いグレー棒）、水溶液からＰｂ2+イオンを除去するそれらの有効性を示した。
【0205】
その後、樹脂を１００ｍＭのＮａ2ＥＤＴＡ溶液で１０分間処理し、有効な樹脂再生を示すためにそれらのＰｂ濃度を定量した（図７の明るいグレー棒）。その後、ろ過実験を繰り返し（図７、暗いグレー右棒）、最初のラウンドと同様の結果を示し、費用効率の高いＥＤＴＡ溶液でＰｂを良く洗浄することにより樹脂を元に戻すことが可能であることは明らかとなった。
【0206】
我々の装置の金属選択性を検出するために、同様のろ過実験を、ＺｎＣｌ2＋Ｐｂ（ＮＯ3）2およびＣａＣｌ2＋Ｐｂ（ＮＯ3）2の等モル混合物と２５ｍＭのＰｂ（ＮＯ3）2を打ち込んだヒト血清（ＨＢＳ）で行った（図８）。Ｐｂ濃度、ならびに最初の２つの実験のＣａまたはＺｎ濃度は、ろ液中で検出されたＺｎおよびＣａの量が最低限であったため、１ｆおよび８ｆがこれらの必須金属を捕捉しないことを明らかにした。特筆すべきは、これらの装置は、追加の金属塩が存在しない最初の実験におけるのと同程度にＰｂを除去したということであり、我々の装置の金属選択性を示した。同様の結果はＰｂ打ち込みＨＢＳにおいても達成された（図８）。
【0207】
［参考文献］
Sears, Margaret E. Chelation: Harnessing and Enhancing Heavy Metal Detoxification - A Review. 2013. The Scientific World Journal, Volume 2013, Article ID 219840, 13 pages
White, C. J.; Yudin, A. K. Contemporary Strategies for Peptide Macrocyclization. Nat. Chem. 2011, 3 (7), 509-524. https://doi.org/10.1038/nchem.1062.
Feoktistova, M.; Geserick, P.; Leverkus, M. Crystal Violet Assay for Determining Viability of Cultured Cells. Cold Spring Harb. Protoc. 2016, 2016 (4), 343-346. https://doi.org/10.1101/pdb.prot087379.
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【図1】
【図2a】
【図2b】
【図2c】
【図2d】
【図2e】
【図3a】
【図3b】
【図4】
【図5a】
【図5b】
【図6】
【図7】
【図8】
【配列表】
【国際調査報告】