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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】ＡＡＶ２親和剤
(51)【国際特許分類】
C12N 15/12 20060101AFI20240220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240220BHJP
C12P 21/02 20060101ALI20240220BHJP
C07K 1/22 20060101ALI20240220BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/12 ZNA
C12N15/63 Z
C12P21/02 C
C07K1/22
C12N1/21
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023539144
(86)(22)【出願日】2022-02-22
(85)【翻訳文提出日】2023-06-26
(86)【国際出願番号】 US2022017252
(87)【国際公開番号】W WO2022178396
(87)【国際公開日】2022-08-25
(31)【優先権主張番号】63/151,622
(32)【優先日】2021-02-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523099840
【氏名又は名称】アヴィタイド エルエルシー
(74)【代理人】
【識別番号】100078282
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 秀策
(74)【代理人】
【識別番号】100113413
【弁理士】
【氏名又は名称】森下 夏樹
(74)【代理人】
【識別番号】100181674
【弁理士】
【氏名又は名称】飯田 貴敏
(74)【代理人】
【識別番号】100181641
【弁理士】
【氏名又は名称】石川 大輔
(74)【代理人】
【識別番号】230113332
【弁護士】
【氏名又は名称】山本 健策
(72)【発明者】
【氏名】ヌドン， クリスチャン
(72)【発明者】
【氏名】ベルク， ジョナサン
(72)【発明者】
【氏名】ヴァレンティーニ， サラ
(72)【発明者】
【氏名】カーンズ， ケリー
(72)【発明者】
【氏名】スカンロン， トーマス
(72)【発明者】
【氏名】ケット， ウォーレン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE12
4B065AA01X
4B065AA26X
4B065AB01
4B065BA02
4B065CA24
4B065CA44
4H045AA30
4H045BA20
4H045CA40
4H045EA50
4H045FA74
4H045GA26
(57)【要約】
本開示は、クロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の単離における使用に適した新規な親和性リガンド及び親和剤に関する。したがって、本開示は、親和性リガンド自体、本開示による親和性リガンドを含むクロマトグラフィー分離マトリックス（親和剤）、及び本開示によるリガンドが使用されるＡＡＶ単離、特にＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）単離のプロセスを包含する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
親和性リガンドであって、Ｎ末端からＣ末端へ、次の式で表されるアミノ酸配列を含む３ヘリックスバンドルタンパク質を含み、Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３Ａ
（配列番号５１）
式中、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩまたはＲ、好ましくはＷであり、
Ｘ７は、Ｒ、Ａ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、ＤまたはＱ、好ましくはＲであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、ＴまたはＮ、好ましくはＤであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、ＷまたはＱ、好ましくはＦであり、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＶ、好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、
Ｘ１８は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＲであり、
Ｘ４１は、Ｈ、Ｙ、ＲまたはＡ、好ましくはＨであり、
Ｘ４２は、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＮ、好ましくはＱであり、
Ｘ４３は、Ｓ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、ＡまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ４６は、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、ＴまたはＹ、好ましくはＮであり、
Ｘ４９は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、ＮまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、ＲまたはＦ、好ましくはＱであり、
Ｘ５３は、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、ＥまたはＩ、好ましくはＬであり、
［Ｚ］はαヘリックス形成ペプチドドメイン、好ましくはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱであり、さらに
前記親和性リガンドは、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子もしくはキャプシド、またはＡＡＶ２粒子もしくはキャプシドの変異体と特異的に相互作用する、前記親和性リガンド。
【請求項2】
前記式が、ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＲＡＰＫ、
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、または
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（それぞれ配列番号５２～５５）のうちのいずれか１つである、請求項１に記載の親和性リガンド。
【請求項3】
［Ｚ］が、ＳＰＡ Ｚドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン及びＥドメイン、好ましくはＺドメイン、またはそれらのいずれかのアルカリ安定性変異体のうちのいずれか１つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡ（ＳＰＡ）ドメインのヘリックス２を含む、請求項１または２に記載の親和性リガンド。
【請求項4】
［Ｚ］が、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＰＱ（配列番号３８）、ＬＰＮＬＴＥＥＲＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号３９）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＧＰＳＱ（配列番号４０）、ＬＰＹＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４１）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＩＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４２）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＴＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４３）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＰＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４４）またはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４５）を含むアミノ酸配列を有するペプチドのうちのいずれか１つから選択される、請求項１～３のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項5】
前記リガンドの前記Ｎ末端の前に、ＭまたはＭＡＱＧＴ（配列番号４６）が存在する、請求項１～４のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項6】
前記リガンドの前記Ｃ末端の後に、ＶＤ、ＶＤＧＥＫＰＥＫ（配列番号４７）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号４８）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）、またはＧＱＡＧＱＧＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）が続く、請求項１～５のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項7】
前記リガンドが、配列番号３～３０、３２、または３４～３７のいずれか１つを含む、請求項１に記載の親和性リガンド。
【請求項8】
前記リガンドが、配列番号３０を含む、請求項７に記載の親和性リガンド。
【請求項9】
ペプチドタグを含み、任意に、前記タグがヘマグルチニン、ｃ－ｍｙｃ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＭＢＰ、ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰタグ、またはＦＬＡＧタグである、請求項１～８のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項10】
Ｃ末端システインまたはリジンをさらに含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の親和性リガンド。
【請求項11】
請求項１～１０のいずれか一項に記載の複数の親和性リガンドを含む多量体。
【請求項12】
２量体、３量体、４量体、５量体、６量体、７量体、８量体または９量体である、請求項１２に記載の多量体。
【請求項13】
前記親和性リガンドが配列番号３０を含む、請求項１１または１２に記載の多量体。
【請求項14】
配列番号３１または３３を含む、請求項１１に記載の多量体。
【請求項15】
前記リガンドまたは多量体が、前記親和性リガンドに作動可能に連結され、それによってコンジュゲートまたは融合タンパク質を形成する少なくとも１つの異種薬剤をさらに含む、請求項１～１４のいずれか一項に記載の親和性リガンドまたは多量体。
【請求項16】
前記異種薬剤が、１つまたは複数の小分子診断薬または小分子治療薬；ペプチドタグ、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ－ＲＮＡ分子；追跡可能なマーカー；放射性物質；抗体；単鎖可変ドメイン；及び免疫グロブリンフラグメントからなる群から選択される、請求項１５に記載の親和性リガンドまたは多量体。
【請求項17】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の少なくとも１つの親和性リガンドまたは多量体を含む分離マトリックス。
【請求項18】
前記親和性リガンドまたは前記多量体が固体支持体に結合している、請求項１７に記載の分離マトリックス。
【請求項19】
前記親和性リガンドまたは多量体がチオール結合を介して前記固体支持体に結合している、請求項１８に記載の分離マトリックス。
【請求項20】
前記固体支持体が、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックスである、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の分離マトリックス。
【請求項21】
前記固体支持体が架橋アガロースマトリックスである、請求項２０に記載の分離マトリックス。
【請求項22】
アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子またはキャプシドを単離する方法であって、前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシドを請求項１７～２１のいずれか一項に記載の分離マトリックスと接触させることと、前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシドを回収することとを含む、前記方法。
【請求項23】
前記方法が、（ａ）請求項１７～２１のいずれか一項に記載の分離マトリックスを、前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシドを含む組成物と接触させることと、（ｂ）洗浄緩衝液で前記分離マトリックスを洗浄することと、（ｃ）溶出緩衝液を用いて前記分離マトリックスから前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシドを溶出することと、（ｄ）前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシドを回収することと、を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
（ｅ）前記残留物質のマトリックスを洗浄し、前記分離マトリックスの前記ＡＡＶ２粒子結合能またはＡＡＶ２キャプシド結合能の少なくとも８０％を再生するのに十分な時間、前記分離マトリックスをアルカリ性洗浄溶液で処理することをさらに含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項25】
前記アルカリ性洗浄溶液が、約０．１Ｍ ＮａＯＨ～約０．５Ｍ ＮａＯＨを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
工程（ａ）～（ｅ）が少なくとも５回、好ましくは少なくとも１０回繰り返された場合に、前記分離マトリックスがそのＡＡＶ２粒子結合能またはＡＡＶ２キャプシド結合能の少なくとも８０％を保持する、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項27】
工程（ａ）～（ｅ）が分離マトリックスの単一バッチで少なくとも１０回繰り返される、請求項２４～２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項28】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の親和性リガンドまたは多量体をコードする核酸またはベクター。
【請求項29】
請求項２８に記載の前記核酸またはベクターを含む発現ベクターであって、前記親和性リガンドまたは多量体の前記コード領域が１つまたは複数の発現制御エレメントに作動可能に連結されている、前記発現ベクター。
【請求項30】
請求項２８または２９に記載の核酸またはベクターを含む宿主細胞。
【請求項31】
宿主細胞がＥ．ｃｏｌｉまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓである、請求項３０に記載の宿主細胞。
【請求項32】
請求項３０または３１に記載の前記宿主細胞を、前記宿主細胞が前記親和性リガンドまたは前記多量体を発現するための条件下で一定時間培養することを含む、親和性リガンドまたは多量体を生成する方法。
【請求項33】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の親和性リガンドまたは多量体を固体表面にコンジュゲートさせることを含む、分離マトリックスの作製方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
本ＰＣＴ出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１５１，６２２号の利益を主張するものであり、参照により、その内容全体が本明細書に組み込まれる。
本ＰＣＴ出願は、２０２１年２月１９日に出願された米国仮特許出願第６３／１５１，６２２号の利益を主張するものであり、参照により、その内容全体が本明細書に組み込まれる。
【0002】
本開示は、クロマトグラフィーの分野に関し、より具体的には、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の単離における使用に適した新規な親和性リガンド及び親和剤に関する。したがって、本開示は、親和性リガンド自体、本開示による親和性リガンドを含むクロマトグラフィー分離マトリックス（親和剤）、及び本開示によるリガンドが使用されるＡＡＶ単離、特にＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）単離のプロセスを包含する。
【背景技術】
【0003】
生物学的に生成された治療薬の純度は、安全性と有効性を確保するために、当局によって厳しく精査され、規制されている。したがって、生物学的に生成された治療薬を高純度まで効率的に精製することが必要とされている。
【0004】
治療用タンパク質の臨床的取り組みをサポートするために、遺伝子組換え源からタンパク質を効率的に精製するための組成物と方法が必要である。親和性精製は、数ステップまたは単一ステップでタンパク質を単離及び／または所望の純度を達成するための手段である。しかし、固体支持体に結合した親和性リガンドを含む分離マトリックスの開発は、リソース集約的で時間のかかる作業になる可能性があるため、親和性－分離マトリックスは非常に少数のタンパク質に対してのみに存在する。親和性－分離マトリックスがない場合、精製は通常、マルチカラムプロセスなどの非効率的なプロセスを伴う。
【0005】
パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、エンベロープを持たない小さなウイルスである。ＡＡＶ粒子は、約４．７キロベース（ｋｂ）の一本鎖ＤＮＡゲノムを取り囲む６０個のキャプシドタンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３で構成されるＡＡＶキャプシドを含む。これらのＶＰ１、ＶＰ２、及びＶＰ３タンパク質は、約１：１：１０の予測比率で存在し、２０面体対称に配置される。個々の粒子は１本のＤＮＡ分子ストランドのみをパッケージ化するが、これはプラス鎖またはマイナス鎖のいずれかであり得、どちらも感染性がある。ほとんどのウイルスとは異なり、ＡＡＶは本質的に非病原性で、免疫原性が低く、向性が広範である。変数の親和性を持つ多数のＡＡＶ血清型が同定されている。ＡＡＶの組織特異性は、ウイルスのキャプシドの血清型によって決まる。この特異性により、目的の遺伝子を特定の組織や細胞にターゲティングすることができる。非病原性、非分裂細胞を含む広い宿主範囲の感染性、及び統合の特性により、ＡＡＶ２などのＡＡＶ血清型は魅力的な送達媒体になる。
【0006】
組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、ヒトにおける遺伝子治療の送達のために最も研究されているウイルスベクターの１つである。組換えＡＡＶには、ウイルスの統合と複製に不可欠な２つの遺伝子が欠けている。その結果、ｒＡＡＶは主にエピソームのままであり、非分裂細胞に長期間存続することができる。これらの特性により、特定の組織タイプを標的とする能力とともに、組換えＡＡＶは研究及び遺伝子治療用途に使用される主要なウイルスベクターの１つとなっている。ＡＡＶ血清型は、細胞への侵入と発現のための核への遺伝子カーゴの送達を可能にするために、様々な細胞親和性と細胞受容体との相互作用を示す。ｒＡＡＶの製造は難しく、費用がかかる。細胞培養の生産性は低く、通常、１リットルあたり１０１３～１０１５のウイルスカプシドしか達成することができず、これは約０．１～１０ｍｇ／Ｌに相当する。精製は、主に親和性クロマトグラフィーを使用して行われるが、ＡＡＶの精製に使用できる親和性樹脂は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸ、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８、及びＡＶＢ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを含めわずかであり、これらは必ずしも選択的ではなく、高価である。さらに、これらの樹脂には、水酸化ナトリウムで洗浄することができず、数サイクルしか再利用できないという２つの大きな欠点がある。これにより、樹脂の消費量が増加し、精製アプリケーションの樹脂コストが高くなる。したがって、個々のＡＡＶ血清型に対して特異性を有する親和性リガンド及び樹脂が必要とされている。本開示は、ＡＡＶ２及びＡＡＶ２変異体の精製のニーズを満たす、ビリオン及びキャプシドを含むＡＡＶ２及びＡＡＶ２変異体に対して高い特異性を有するアルカリ安定性リガンド及び樹脂を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【0007】
ＡＡＶ２に結合し、ＡＡＶ２ウイルス粒子もしくはキャプシド及び／またはＡＡＶ２変異体ウイルス粒子もしくはキャプシドの単離及び／または親和性精製に有用な親和性リガンド及び親和性樹脂（または親和剤）を本明細書に記載する。
【0008】
一態様では、本開示は、Ｎ末端からＣ末端へ、以下の式によって表されるアミノ酸配列を含む３ヘリックスバンドルタンパク質を含む、ＡＡＶ２キャプシドまたはＡＡＶ２キャプシドの変異体（またはＡＡＶ２粒子もしくはその変異体）に特異的に結合する親和性リガンドを提供し、
Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３Ａ
（配列番号５１）
式中、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩまたはＲ、好ましくはＷであり、
Ｘ７は、Ｒ、Ａ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、ＤまたはＱ、好ましくはＲであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、ＴまたはＮ、好ましくはＤであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、ＷまたはＱ、好ましくはＦであり、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＶ、好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、
Ｘ１８は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＲであり、
Ｘ４１は、Ｈ、Ｙ、ＲまたはＡ、好ましくはＨであり、
Ｘ４２は、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＮ、好ましくはＱであり、
Ｘ４３は、Ｓ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、ＡまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ４６は、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、ＴまたはＹ、好ましくはＮであり、
Ｘ４９は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、ＮまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、ＲまたはＦ、好ましくはＱであり、
Ｘ５３は、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、ＥまたはＩ、好ましくはＬであり、
［Ｚ］はαヘリックス形成ペプチドドメイン、好ましくはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱであり、さらに
親和性リガンドは、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子もしくはキャプシド、またはＡＡＶ２粒子もしくはキャプシドの変異体と特異的に相互作用する。
Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３Ａ
（配列番号５１）
式中、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩまたはＲ、好ましくはＷであり、
Ｘ７は、Ｒ、Ａ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、ＤまたはＱ、好ましくはＲであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、ＴまたはＮ、好ましくはＤであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、ＷまたはＱ、好ましくはＦであり、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＶ、好ましくはＥであり、
Ｘ１５は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＥであり、
Ｘ１８は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸、好ましくはＲであり、
Ｘ４１は、Ｈ、Ｙ、ＲまたはＡ、好ましくはＨであり、
Ｘ４２は、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＮ、好ましくはＱであり、
Ｘ４３は、Ｓ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、ＡまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ４６は、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、ＴまたはＹ、好ましくはＮであり、
Ｘ４９は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、ＮまたはＴ、好ましくはＳであり、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、ＲまたはＦ、好ましくはＱであり、
Ｘ５３は、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、ＥまたはＩ、好ましくはＬであり、
［Ｚ］はαヘリックス形成ペプチドドメイン、好ましくはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱであり、さらに
親和性リガンドは、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子もしくはキャプシド、またはＡＡＶ２粒子もしくはキャプシドの変異体と特異的に相互作用する。
【0009】
いくつかの実施形態では、リガンドの式は、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＲＡＰＫ
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、または
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（それぞれ、配列番号５２～５５）のうちのいずれか１つであり、式中、すべてのＸ部分及びＺ部分は、前の段落で定義したとおりである。
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＲＡＰＫ
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ、または
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（それぞれ、配列番号５２～５５）のうちのいずれか１つであり、式中、すべてのＸ部分及びＺ部分は、前の段落で定義したとおりである。
【0010】
本開示の実施形態では、［Ｚ］部分は、ＳＰＡ Ｚドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン及びＥドメイン、好ましくはＺドメイン、またはそれらのいずれかのアルカリ安定性変異体のうちのいずれか１つのＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡ（ＳＰＡ）ドメインのヘリックス２を含むことができる。特定の実施形態では、［Ｚ］は、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＰＱ（配列番号３８）、ＬＰＮＬＴＥＥＲＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号３９）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＧＰＳＱ（配列番号４０）、ＬＰＹＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４１）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＩＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４２）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＴＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４３）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＰＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４４）またはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４５）を含むアミノ酸配列を有するペプチドのいずれか１つであり得、好ましくは、後者の配列である。
【0011】
本開示によれば、親和性リガンドの実施形態は、独立して、リガンドのＮ末端の前にＭもしくはＭＡＱＧＴ（配列番号４６）が来るか、またはリガンドのＣ末端の後にＶＤ、ＶＤＧＥＫＰＥＫ（配列番号４７）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号４８）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）、またはＧＱＡＧＱＧＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）が続く、任意の及びすべての置換を含む。
【0012】
特定の実施形態では、親和性リガンドは、配列番号３～３０、３２、または３４～３７のうちのいずれか１つを含み、好ましくは配列番号３０を含む。
【0013】
なおさらなる実施形態では、本開示の親和性リガンドのいずれかは、Ｃ末端システインまたはリジンをさらに含む。
【0014】
本開示のさらなる態様は、本開示による複数の親和性リガンドを含む多量体に関する。このような多量体には、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体及び九量体が含まれる。いくつかの実施形態では、多量体の親和性リガンドは、配列番号３０を含む。いくつかの実施形態では、多量体は、配列番号３１または３３を含む。
【0015】
本明細書に記載される他の態様では、本明細書に開示される親和性リガンドまたは多量体はさらに、前記親和性リガンドまたは多量体に作動可能に連結して複合体または融合タンパク質を形成する少なくとも１つの異種薬剤を含む。
【0016】
本開示のさらに他の態様は、分離マトリックスに関する。このような分離マトリックスは、本開示の少なくとも１つの親和性リガンドまたは本開示の少なくとも１つの多量体及び固体支持体を含む。実施形態では、リガンドまたは多量体は、チオール結合またはカルバメート結合を介して固体支持体に結合することができる。本開示のそのような固体支持体には、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックス、膜、モノリス、ビーズなどが含まれる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、アガロースを含む。いくつかの実施形態では、固体支持体は架橋アガロースマトリックスである。
【0017】
さらにまた、本開示は、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子またはキャプシドを単離する方法を提供し、本方法は、前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシド（またはいずれかの変異体）を本開示の分離マトリックスと接触させることと、前記ＡＡＶ２粒子またはキャプシド（またはその変異体）を回収することとを含む。
【0018】
いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）本開示の分離マトリックスを、ＡＡＶ２粒子またはキャプシド（または変異体）を含む組成物と接触させることと、（ｂ）洗浄緩衝液で分離マトリックスを洗浄することと、（ｃ）溶出緩衝液を用いて分離マトリックスからＡＡＶ２粒子またはキャプシド（または変異体）を溶出することと、（ｄ）ＡＡＶ２粒子またはキャプシド（または変異体）を回収することと、を含む。これらの方法はいずれも、残留物質の前記マトリックスを洗浄し、分離マトリックスの前記ＡＡＶ２粒子結合能またはＡＡＶ２キャプシド結合能の少なくとも８０％を再生するのに十分な時間、分離マトリックスをアルカリ性洗浄溶液で処理することをさらに含むことができる。典型的なアルカリ性洗浄溶液は、約０．１Ｍ ＮａＯＨ～約０．５Ｍ ＮａＯＨを含む。
【0019】
本方法のさらなる実施形態では、本開示の分離マトリックスは、ステップ（ａ）～（ｄ）及び洗浄ステップ［本明細書ではステップ（ｅ）とも称される］を少なくとも５回、好ましくは少なくとも１０回繰り返した場合に、そのＡＡＶ２粒子またはＡＡＶ２キャプシド結合能力の少なくとも８０％を維持する。いくつかの実施形態では、本開示のこれらの方法は、元の結合能力の８０％を超える損失を生じることなく、分離マトリックスを少なくとも１０回再利用することを可能にする。いくつかの実施形態では、少なくとも８５、９０、及び９５％の結合能力が保持される。このような分離マトリックスはアルカリ安定性であり、精製コストを削減する。
【0020】
本開示のさらなる態様は、本開示の親和性リガンドまたは本開示の多量体をコードする核酸またはベクター、及び１つまたは複数の発現制御要素に作動可能に連結された親親和性リガンドまたは多量体のコード領域を有するそれらの核酸またはベクターを含む発現ベクターに関する。本開示のさらなる実施形態は、本開示の親和性リガンドまたは多量体の組換え産生のための宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉまたはＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓを対象とする。
【0021】
別の態様では、本開示は、本開示の宿主細胞を、宿主細胞が親和性リガンドまたは多量体を発現するための条件下で一定時間培養することによって、親和性リガンドまたは多量体を産生する方法を提供する。
【0022】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示によるリガンドまたは本開示による多量体を固体表面にコンジュゲートさせることを含む、分離マトリックスの作製方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】配列番号２７に対応するビオチン化リガンドへのＡＡＶ２キャプシドの結合に関するセンサーグラムを示す。
【0024】
【図2】配列番号３０に対応するリガンドを有する親和性樹脂の１分間の滞留時間における機能的結合能力の測定を示す。
【発明を実施するための形態】
【0025】
定義
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を以下に定義する。本明細書で他に定義されない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
本開示をより容易に理解するために、特定の用語を以下に定義する。本明細書で他に定義されない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。
【0026】
単位、接頭辞、及び記号は、Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ（ＳＩ）で承認された形式で示される。数値範囲は、その範囲を定義する数を含むものとする。特に明記しない限り、アミノ酸配列は、アミノからカルボキシの方向で左から右に書かれている。本明細書で提供される見出しは、本明細書全体を参照することによって得ることができる、本開示の様々な態様または実施形態の限定ではない。したがって、すぐ下で定義される用語は、明細書全体を参照することによってより完全に定義される。
【0027】
「ａ」または「ａｎ」という用語の本質は、その本質の１つまたは複数を指すことに注意されたく、例えば、「親和性リガンド」は、１つまたは複数の親和性リガンドを表すと理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」、及び「少なくとも１つ」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【0028】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、「およそ」または「約」という用語は、目的の１つ以上の値に適用される場合、記載された基準値に類似した値を指す。ある特定の実施形態において、「およそ」または「約」という用語は、別段の記載がない限り、または異なる意味が文脈から明らかでない限り、記載された参照値のいずれかの方向（上回るまたは下回る）で、２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に収まる値の範囲を指す（ただし、そのような値が、取り得る値の１００％を超える場合を除く）。
【0029】
生物活性：本明細書で使用される「生物活性」という用語は、生物系、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特徴を指す。例えば、生物に投与されると、その生物に対して生物学的または生理学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。
【0030】
変異体及び突然変異体：「変異体」という用語は通常、科学文献で定義されており、本明細書では、受け入れられている標準とは何らかの形で遺伝的に異なる生物を指すために使用される。「変異体」は、遺伝的ではない表現型の違いを説明するためにも使用できる（Ｋｉｎｇ ａｎｄ Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ，２００２，Ａ ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃｓ，６ｔｈ ｅｄ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ）。
【0031】
「突然変異」という用語は、ほとんどの辞書で定義されており、遺伝子の構造に遺伝的変化を導入するプロセスを参照して本明細書で使用され（Ｋｉｎｇ ＆ Ｓｔａｎｓｆｉｅｌｄ，２００２）、それによって「突然変異体」を生成する。「変異体」という用語は、科学的及び非科学的な文献で「変異」という用語の代わりに段々使用されている。本用語は、本明細書において同義に使用される。
【0032】
保存的及び非保存的置換：「保存的」アミノ酸置換とは、１つのアミノ酸残基が、類似の側鎖を有する他のアミノ酸残基に置換されているアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基ファミリーは、当該技術分野において定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ））、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ））、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）、チロシン（Ｙ）、システイン（Ｃ））、非極性側鎖（例えば、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、プロリン（Ｐ）、フェニルアラニン（Ｆ）、メニン（ｍｅｎｉｎｅ）（Ｍ）、トリプトファン（Ｗ））、ベータ分岐側鎖（例えば、トレオニン（Ｔ）、バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ））及び芳香族側鎖（例えば、チロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ））を含む。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は保存的置換である。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合を付与または改善する。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの結合を減少または無効にしない。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合に有意な影響を及ぼさない。選択的結合親和性を与える、変更する、または維持するヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換及び非保存的置換を同定する方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０－１１８７（１９９３）、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９－８８４（１９９９）、及びＢｕｒｋｓ，ＰＮＡＳ ９４：４１２－４１７（１９９７）を参照）。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合を付与または改善する。いくつかの実施形態では、リガンドの配列における非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの結合を減少または無効にしない。いくつかの実施形態では、非保存的アミノ酸置換は、目的の標的へのリガンドの特異的結合に有意な影響を及ぼさない。
【0033】
親和性クロマトグラフィー：本明細書で使用される「親和性クロマトグラフィー」という用語は、親和性リガンドが「ロックキー」方式で生物学的親和性を介して標的と相互作用する特定のモードのクロマトグラフィーを指す。親和性クロマトグラフィーにおける有用な相互作用の例には、例えば、酵素－基質相互作用、ビオチンーアビジン相互作用、抗体－抗原相互作用などが挙げられる。
【0034】
親和性リガンド及びリガンド：「親和性リガンド」及び「リガンド」という用語は、本明細書では同義に使用される。これらの用語は、本明細書では、それに特異的な部分、例えばポリペプチドまたはタンパク質または目的の標的に高親和性で可逆的に結合することができる分子を指すために使用される。
【0035】
タンパク質ベースのリガンド：本明細書で使用される「タンパク質ベースのリガンド」という用語は、標的ポリペプチドまたはタンパク質に可逆的に結合するペプチドもしくはタンパク質、またはペプチドもしくはタンパク質の一部を含むリガンドを意味する。本開示の「リガンド」はタンパク質ベースのリガンドであることが理解される。
【0036】
親和剤：本明細書で使用する場合、「親和剤」という用語は、生体特異的親和性リガンドが共有結合している固体支持体またはマトリックスに関する。通常、固体支持体またはマトリックスは、標的分子が精製される系に不溶性である。「親和剤」及び「親和性分離マトリックス（ｃｅｓ）」及び「分離マトリックス（ｃｅｓ）」という用語は、本明細書では同義に使用される。
【0037】
リンカー：本明細書で使用される場合、「リンカー」は、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインまたは構造ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと表面との間に位置するペプチドまたは他の化学結合である。
【0038】
天然に存在する：核酸分子、ポリペプチド、及び宿主細胞などの生体物質に関連して使用される場合の「天然に存在する」という用語は、自然界に存在し、人間によって改変されていないものを指す。逆に、「非天然」または「合成」は、生体物質に関連して使用される場合、自然界には見られない、及び／または人間によって改変されたものを指す。
【0039】
「非天然アミノ酸」、「アミノ酸類似体」、及び「非標準アミノ酸残基」は、本明細書では同義に使用される。本明細書で提供されるリガンドにおいて置換され得る非天然アミノ酸は、当技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、非天然アミノ酸は、プロリンに置換できる４－ヒドロキシプロリン、リジンに置換できる５－ヒドロキシリジン、ヒスチジンに置換できる３－メチルヒスチジン、セリンに置換できるホモセリン、及び、リジンに置換できるオルニチンである。ポリペプチドリガンドで置換できる非天然アミノ酸の追加の例には、これらの分子に限定されないが、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、アルファ－アミノイソ酪酸、Ａ－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、ガンマ－Ａｂｕ、エプシロン－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ベータ－アラニン、ランチオニン、デヒドロアラニン、γ－アミノ酪酸、セレノシステイン、及びピロリジンフルオロアミノ酸、ベータ－メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、Ｃアルファ－メチルアミノ酸、及びＮアルファ－メチルアミノ酸が挙げられる。
【0040】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸分子」：本明細書で同義に使用される場合、ポリヌクレオチド及び核酸分子は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらの用語には、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ（相補的ＤＮＡ）、ｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）、ｒＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（小型ヘアピンＲＮＡ）、ｓｎＲＮＡ（小型核ＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ（短核小体ＲＮＡ）、ｍｉＲＮＡ（マイクロＲＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、合成ＲＮＡ、及び／またはｔＲＮＡ（トランスファーＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。
【0041】
作動可能に連結した：本明細書で使用される「作動可能に連結した」という用語は、構成要素が正常に機能し、これらの構成要素のうちの少なくとも１つが他の構成要素のうちの少なくとも１つに与えられる機能を媒介し得る可能性を許容するように配置されるように、２つ以上の構成要素が配置されていることを示す。２つの分子は、直接的または間接的に結合されているかどうかにかかわらず、「作動可能に結合」している。
【0042】
ペプチドタグ：本明細書で使用される「ペプチドタグ」という用語は、得られる融合物に機能を提供するために、別のタンパク質の一部であるか、別のタンパク質に（例えば、遺伝子工学によって）付着しているペプチド配列を指す。このような機能には、タンパク質の溶解度の変更、タンパク質の発現の調節、及びタンパク質の別の実体への結合または相互作用の促進が挙げられるが、これらに限定されない。ペプチドタグは、通常、それらが融合しているタンパク質と比較して比較的短いが、常にそうとは限らない。いくつかの実施形態では、ペプチドタグは、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、または２５以上のアミノ酸など、長さが４以上のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるペプチドタグには、「タグ」（例えば、ＧＦＰ）または特定の特性の促進因子として作用することができる第２のタンパク質が含まれる。いくつかの実施形態では、リガンドは、ペプチドタグを含むタンパク質である。本明細書で提供される用途を有する多数のペプチドタグが当技術分野で知られている。リガンド融合タンパク質の成分またはリガンドによって結合された標的（例えば、リガンド融合タンパク質）であり得るペプチドタグの例には、ＨＡ（ヘマグルチニン）、ｃ－ｍｙｃ、ヘルペスシンプレックスウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＭＢＰ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰタグ、及びＦＬＡＧタグ（Ｅａｓｔｍａｎ Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，Ｎ．Ｙ．）が挙げられるが、これらに限定されない。同様に、タグに対する抗体エピトープは、例えば親和性精製、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡアッセイ、及び細胞の免疫染色における融合タンパク質の検出及び局在化を可能にする。
【0043】
ポリペプチド：本明細書で使用される「ポリペプチド」という用語は、ペプチド結合を介して互いに連結されたアミノ酸の連続鎖を指す。この用語は、任意の長さのアミノ酸鎖を指すために使用されるが、当業者は、この用語が長い鎖に限定されず、ペプチド結合を介して互いに連結された２つのアミノ酸を含む最小鎖を指すことができることを理解するであろう。当業者に知られているように、ポリペプチドはプロセシング及び／または改変され得る。
【0044】
タンパク質：本明細書で使用される「タンパク質」という用語は、別個の単位として機能する１つまたは複数のポリペプチドを指す。単一のポリペプチドが別個の機能単位であり、別個の機能単位を形成するために他のポリペプチドとの永続的または一時的な物理的会合を必要としない場合、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同義に使用され得る。別個の機能単位が互いに物理的に会合する複数のポリペプチドから構成される場合、「タンパク質」という用語は、物理的に結合され、別個の単位として一緒に機能する複数のポリペプチドを指す。
【0045】
特異的に結合する：リガンドに関して本明細書で使用される「特異的に結合する」または「選択的親和性を有する」という用語は、リガンドがより頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、より大きな親和性で、またはそれらの組み合わせで、関係のないタンパク質を含む代替物質とよりも、特定のエピトープ、タンパク質、または標的分子に対して反応または会合することを意味する。異なる種の相同タンパク質間の配列同一性のため、特異的結合は、複数の種のタンパク質または標的を認識する、例えば、二重特異性または三重特異性である結合剤を含み得る。同様に、異なるタンパク質のポリペプチド配列のある領域内の相同性のため、特異的結合は、複数のタンパク質または標的を認識する結合剤を含み得る。特定の実施形態では、第１の標的に特異的に結合する結合剤は、第２の標的に特異的に結合してもしなくてもよいことが理解される。したがって、「特異的結合」は、排他的結合、すなわち、単一の標的への結合を必ずしも必要としない（含めることはできるが）。したがって、リガンドまたは親和剤は、特定の実施形態では、複数の標的に特異的に結合し得る。特定の実施形態では、複数の標的が、親和剤上の同じ結合部位によって結合され得る。
【0046】
実質的に：本明細書で使用される場合、用語「実質的に」は、目的の特徴または特性の全または近完全（ｎｅａｒ－ｔｏｔａｌ）程度または度合いを示すという定量的状態を指す。生物学分野の当業者は、生物学的及び化学的現象が、もし存在する場合、めったに完了しないこと、及び／またはめったに完全に進まないこと、または絶対的な結果を達成または回避することはめったにないことを理解するであろう。従って「実質的に」という用語は、多くの生物学的現象及び化学的現象に固有の完全性の潜在的な欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
【0047】
ＡＡＶ２親和性リガンド
本開示の様々な態様及び実施形態の親和性リガンドは、ＡＡＶ２キャプシド及び／またはＡＡＶ２変異体キャプシドに可逆的に結合するタンパク質リガンドを提供する。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ２キャプシドへの結合は、ＡＡＶ２粒子またはＡＡＶ２ビリオンまたはそれらの変異体への結合と同義である。多数のＡＡＶ２変異体が当技術分野で知られている。（例えば、ＡＡＶ変異体（Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ２５２Ｆ）及びＡＡＶ２．７ｍ８変異体；ＧｅｎｅＭｅｄｉ）。Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０１９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６：２７０５３－２７０６２）も参照されたい。標的化されたＡＡＶ２は、天然に存在するウイルス粒子であっても、または組換えウイルス粒子であってもよい。標的化された分子の非限定的な用途には、治療及び診断用途が含まれる。
本開示の様々な態様及び実施形態の親和性リガンドは、ＡＡＶ２キャプシド及び／またはＡＡＶ２変異体キャプシドに可逆的に結合するタンパク質リガンドを提供する。本明細書で使用される場合、ＡＡＶ２キャプシドへの結合は、ＡＡＶ２粒子またはＡＡＶ２ビリオンまたはそれらの変異体への結合と同義である。多数のＡＡＶ２変異体が当技術分野で知られている。（例えば、ＡＡＶ変異体（Ｙ４４４Ｆ、Ｙ７３０Ｆ、Ｙ５００Ｆ、Ｙ２７２Ｆ、Ｙ７０４Ｆ、Ｙ２５２Ｆ）及びＡＡＶ２．７ｍ８変異体；ＧｅｎｅＭｅｄｉ）。Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ，（２０１９ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １１６：２７０５３－２７０６２）も参照されたい。標的化されたＡＡＶ２は、天然に存在するウイルス粒子であっても、または組換えウイルス粒子であってもよい。標的化された分子の非限定的な用途には、治療及び診断用途が含まれる。
【0048】
本開示の親和性リガンドは、Ｎ末端からＣ末端へ、次の式で表されるアミノ酸配列を含む３ヘリックスバンドルタンパク質であって、
Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３Ａ
（配列番号５１）
式中、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩまたはＲであり、
Ｘ７は、Ｒ、Ａ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、ＤまたはＱであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、ＴまたはＮであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、ＷまたはＱであり、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＶであり、
Ｘ１５は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸であり、
Ｘ４１は、Ｈ、Ｙ、Ｒ、またはＡであり、
Ｘ４２は、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＮであり、
Ｘ４３は、Ｓ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、Ａ、またはＴであり、
Ｘ４６は、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、ＴまたはＹであり、
Ｘ４９は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、ＮまたはＴであり、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、ＲまたはＦであり、
Ｘ５３は、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｅ、またはＩであり、
［Ｚ］は、αヘリックス形成ペプチドドメインであり、さらに、
親和性リガンドは、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子もしくはキャプシド、またはＡＡＶ２粒子もしくはキャプシドの変異体と特異的に相互作用する。
Ｘ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３Ａ
（配列番号５１）
式中、
Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、ＩまたはＲであり、
Ｘ７は、Ｒ、Ａ、Ｗ、Ｖ、Ｈ、Ｙ、Ｔ、ＤまたはＱであり、
Ｘ８は、Ｄ、Ｑ、Ｅ、Ｉ、ＴまたはＮであり、
Ｘ１１は、Ｆ、Ｉ、Ｓ、Ｙ、Ｌ、Ｋ、Ｖ、ＷまたはＱであり、
Ｘ１４は、Ｅ、Ｄ、Ｈ、Ｋ、Ｓ、Ｎ、Ｇ、ＡまたはＶであり、
Ｘ１５は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸であり、
Ｘ１８は、ＣまたはＰを除く任意のアミノ酸であり、
Ｘ４１は、Ｈ、Ｙ、Ｒ、またはＡであり、
Ｘ４２は、Ｓ、Ｇ、Ｑ、Ｔ、Ｆ、Ｗ、ＡまたはＮであり、
Ｘ４３は、Ｓ、Ｑ、Ｆ、Ｙ、Ａ、またはＴであり、
Ｘ４６は、Ｎ、Ｒ、Ｗ、Ｓ、Ｑ、Ｇ、ＴまたはＹであり、
Ｘ４９は、Ｆ、Ｗ、Ｓ、Ｅ、Ｄ、Ｙ、ＮまたはＴであり、
Ｘ５０は、Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｔ、ＲまたはＦであり、
Ｘ５３は、Ｌ、Ｇ、Ｈ、Ｔ、Ａ、Ｖ、Ｆ、Ｙ、Ｅ、またはＩであり、
［Ｚ］は、αヘリックス形成ペプチドドメインであり、さらに、
親和性リガンドは、アデノ随伴ウイルスサブタイプ２（ＡＡＶ２）粒子もしくはキャプシド、またはＡＡＶ２粒子もしくはキャプシドの変異体と特異的に相互作用する。
【0049】
いくつかの実施形態では、親和性リガンドは、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ
（配列番号５２）、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（配列番号５３）、
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ
（配列番号５４）、または
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（配列番号５５）によって表されるアミノ酸を含み、式中、各Ｘ部分及び［Ｚ］は上で定義したとおりである。
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ
（配列番号５２）、
ＶＤＡＫＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（配列番号５３）、
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＱＡＰＫ
（配列番号５４）、または
ＶＤＡＥＸ５ＤＸ７Ｘ８ＬＥＸ１１ＡＲＸ１４Ｘ１５ＩＥＸ１８－［Ｚ］－Ｘ４１Ｘ４２Ｘ４３ＬＬＸ４６ＥＡＸ４９Ｘ５０ＬＮＸ５３ＡＲＡＰＫ
（配列番号５５）によって表されるアミノ酸を含み、式中、各Ｘ部分及び［Ｚ］は上で定義したとおりである。
【0050】
示されるとおり、開示の［Ｚ］部分は、αヘリックス形成ペプチドドメインを含み、好ましくはアルカリ安定性である。αヘリックス構造を形成するペプチドドメインは当技術分野で周知であり、さまざまな供給源から得ることができる。いくつかの実施形態では、［Ｚ］部分は、１９～２４アミノ酸長の範囲であり、好ましくは２１、２２または２３アミノ酸、より好ましくは２２アミノ酸長である。いくつかの実施形態では、αヘリックス形成ペプチドドメインはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓプロテインＡ（ＳＰＡ）ドメインである。特定の実施形態では、ＳＰＡドメインは、ＳＰＡ Ｚドメイン、Ａドメイン、Ｂドメイン、Ｃドメイン、Ｄドメイン、または、Ｅドメインのうちのいずれか１つのＳＰＡドメインのヘリックス２、もしくはそのアルカリ安定性変異体を含む。（例えば、Ｎｉｌｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１：１０７－１１３）、及び米国特許第６５３４６２８号、同第６８３１１６１号、同第７８３４１５８号、同第９１８７５５５号、同第９６６３５５８号、同第９６８３０１３号、同第１０３０８６９０号、同第１０５０１５５７号、及び同第１０７０３７７４号を参照されたい）。ＳＰＡドメインのヘリックス２は一般に残基１９～４０に見出される（本明細書の式で使用される番号付けに基づき、アミノ酸ＶＤＡＫまたはその等価物は、ドメインのアミノ酸１～４であり、そこからさらに続く）。
【0051】
特定の好ましい実施形態では、［Ｚ］は、アミノ酸配列ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＰＱ（配列番号３８）、ＬＰＮＬＴＥＥＲＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号３９）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＧＰＳＱ（配列番号４０）、ＬＰＹＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４１）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＩＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４２）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＴＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４３）、ＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＰＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４４）またはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４５）を含み、好ましくはＬＰＮＬＴＥＥＱＲＲＡＦＩＥＳＬＲＤＤＰＳＱ（配列番号４５）である。
【0052】
前述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の親和性リガンドのＮ末端は、ＭまたはＭＡＱＧＴ（配列番号４６）によって先行され得る。
【0053】
本開示の親和性リガンドの前述の実施形態のいずれかにおいて、リガンドのＣ末端の後には、アミノ酸ＶＤ、ＶＤＧＥＫＰＥＫ（配列番号４７）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ（配列番号４８）、ＶＤＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号４９）、またはＧＱＡＧＱＧＧＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＨＨＨＨＨＨ（配列番号５０）が続くことができる。このような追加のアミノ酸には、親和性リガンドの固体支持体への結合を容易にするためのペプチドタグ及びアミノ酸が含まれる。
【0054】
いくつかの実施形態では、本開示の親和性リガンドは、配列番号３～３０、３２、または３４～３７のいずれか１つを含み、好ましくは配列番号３０を含むリガンドである。
【0055】
本開示の親和性リガンドのいずれも、ペプチドタグを含むことができる。そのようなペプチドタグには、ヘマグルチニン、ｃ－ｍｙｃ、単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ、Ｔ７、ＧＳＴ、ＧＦＰ、ＭＢＰ、Ｓｔｒｅｐタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、ＴＡＰタグ、またはＦＬＡＧタグが挙げられるが、これらに限定されない。
【0056】
前述の実施形態のいずれかにおいて、本開示の親和性リガンドは、Ｃ末端システインまたはリジンをさらに含む。このような残基は固体支持体への結合を促進する。
【0057】
本開示の別の態様では、本開示の複数の親和性リガンドを含む多量体を提供する。そのような複数は、同種（すなわち、本開示の単一のリガンド）であっても、不均一（すなわち、本開示の２つ以上の異なるリガンドを含む）であってもよい。実施形態において、多量体は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体、または九量体であり得る。本発明の多量体の例としては、親和性リガンド配列番号３１及び３３が挙げられ、それぞれ二量体及び四量体である。
【0058】
本開示のさらなる態様では、本明細書に記載される親和性リガンドまたは多量体は、前記親和性リガンドに作動可能に連結され、それによってコンジュゲートまたは融合タンパク質を形成する少なくとも１つの異種薬剤をさらに含む。異種薬剤の例としては、１つまたは複数の小分子診断薬または小分子治療薬；ペプチドタグ（本明細書で定義される）、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはハイブリッドＤＮＡ－ＲＮＡ分子；追跡可能なマーカー；放射性物質；抗体；単鎖可変ドメイン；または免疫グロブリンフラグメントが挙げられるが、これらに限定されない。このようなコンジュゲート及び融合タンパク質は、当技術分野で知られている方法によって作製することができる。
【0059】
ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に結合するリガンド
ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドなど、標的に結合するリガンドまたは多量体の特徴は、そのような活性を評価するための当技術分野で知られている既知のまたは改変されたアッセイ、バイオアッセイ、及び／または動物モデルを使用して決定することができる。
ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドなど、標的に結合するリガンドまたは多量体の特徴は、そのような活性を評価するための当技術分野で知られている既知のまたは改変されたアッセイ、バイオアッセイ、及び／または動物モデルを使用して決定することができる。
【0060】
本明細書で使用される場合、「標的に対する結合親和性」、「標的に結合する」、「ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドに結合する」などの用語は、例えば、親和定数（例えば、所定の濃度で結合及び解離するリガンドの量）の決定を通じて直接測定され得る本開示のリガンドの特性を示す。このような分子相互作用を特徴付けるために、例えば、競合分析、平衡分析及び微量熱量分析、並びに表面プラズモン共鳴相互作用に基づくリアルタイム相互作用分析（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ装置などを使用）など、いくつかの方法を利用することができる。これらの方法は当業者に周知であり、Ｎｅｒｉ Ｄ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｔｉｂｔｅｃｈ １４：４６５－４７０及びＪａｎｓｓｏｎ Ｍ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７２：８１８９－８１９７などの刊行物で論じられている。
【0061】
所定のリガンド結合イベントの親和性要件は、結合マトリックスの組成と複雑さ、リガンドと標的分子の両方の原子価と密度、及びリガンドの機能的適用を含むがこれらに限定されない様々な要因に左右される。いくつかの実施形態では、本開示のリガンドは、５×１０－３Ｍ、１０－３Ｍ，５×１０－４Ｍ、１０－４Ｍ、５×１０－５Ｍ、または１０－５Ｍ以下の解離定数（ＫＤ）でＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドに結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、５×１０－６Ｍ、１０－６Ｍ，５×１０－７Ｍ、１０－７Ｍ、５×１０－８Ｍ、または１０－８Ｍ以下のＫＤで目的の標的に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、５×１０－９Ｍ、１０－９Ｍ、５×１０－１０Ｍ、１０－１０Ｍ、５×１０－１１Ｍ、１０－１１Ｍ、５×１０－１２Ｍ、１０－１２Ｍ，５×１０－１３Ｍ、１０－１３Ｍ、５×１０－１４Ｍ、１０－１４Ｍ、５×１０－１５Ｍ、または１０－１５Ｍ以下のＫＤで目的の標的に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法により生成されたリガンドは、約１０－４Ｍ～約１０－５Ｍ，約１０－５Ｍ～約１０－６Ｍ、約１０－６Ｍ～約１０－７Ｍ、約１０－７Ｍ～約１０－８Ｍ、約１０－８Ｍ～約１０－９Ｍ、約１０－９Ｍ～約１０－１０Ｍ、約１０－１０Ｍ～約１０－１１Ｍ、または約１０－１１Ｍ～約１０－１２Ｍの解離定数を有する。
【0062】
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドまたは多量体は、０．１～１０－７秒－１、１０－２～１０－７秒－１、または０．５×１０－２～１０－７秒－１の範囲のｋｏｆｆでＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、５×１０－２秒－１、１０－２秒－１、５×１０－３秒－１、または１０－３秒－１未満のオフ速度（ｋｏｆｆ）で目的の標的を結合する。いくつかの実施形態では、リガンドは、５×１０－４秒－１、１０－４秒－１、５×１０－５秒－１、または１０－５秒－１、５×１０－６秒－１、１０－６秒－１、５×１０－７秒－１、または１０－７秒－１未満のオフ速度（ｋｏｆｆ）で目的の標的を結合する。
【0063】
いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体は、約１０３～１０７Ｍ－１秒－１、１０３～１０６Ｍ－１秒－１、または１０３～１０５Ｍ－１秒－１の範囲のｋｏｎでＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシドに特異的を結合する。いくつかの実施形態では、リガンド（例えば、リガンド融合タンパク質）は、１０３Ｍ－１秒－１、５×１０３Ｍ－１秒－１、１０４Ｍ－１秒－１、または５×１０４Ｍ－１秒－１超のオン速度（ｋｏｎ）で目的の標的を結合する。追加の実施形態では、リガンドは、１０５Ｍ－１秒－１、５×１０５Ｍ－１秒－１、１０６Ｍ－１秒－１、５×１０６Ｍ－１秒－１、または１０７Ｍ－１秒－１超のｋｏｎで目的の標的を結合する。
【0064】
リンカー
「リンカー」及び「スペーサー」という用語は、本明細書では同義に使用され、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。２つ以上の連結したリガンドを連結するのに適したリンカーは、一般に、ペプチド、タンパク質または他の有機分子を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、薬学的使用を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適している。
「リンカー」及び「スペーサー」という用語は、本明細書では同義に使用され、そうでなければ独立した機能ドメインを連結するように機能するペプチドまたは他の化学結合を指す。いくつかの実施形態では、リンカーは、リガンドと、そうでなければ独立した機能ドメインを含む別のポリペプチド成分との間に位置する。２つ以上の連結したリガンドを連結するのに適したリンカーは、一般に、ペプチド、タンパク質または他の有機分子を連結するために当技術分野で使用される任意のリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、薬学的使用を目的とするタンパク質またはポリペプチドを構築するのに適している。
【0065】
リガンドとリガンド融合タンパク質の追加成分を単鎖アミノ酸配列で作動可能に連結するのに適したリンカーには、グリシンリンカー、セリンリンカー、混合グリシン／セリンリンカー、グリシン及びセリンに富むリンカー、または大部分が極性のポリペプチドフラグメントで構成されるリンカーなどのポリペプチドリンカーが含まれるが、これらに限定されない。
【0066】
いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、アラニン、プロリン、アスパラギン、アスパラギン酸、トレオニン、グルタミン、及びリジンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、リガンドリンカーは、立体的に妨げられていない大部分のアミノ酸から構成される。いくつかの実施形態では、リンカーは、グリシン、セリン、及び／またはアラニンから選択されるアミノ酸の大部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、ポリグリシン（（Ｇｌｙ）５及び（Ｇｌｙ）８など）、ポリ（Ｇｌｙ－Ａｌａ）、及びポリアラニンから選択される。
【0067】
リンカーは、リガンドが目的の標的に結合することを可能にする方法でリガンドを作動可能に連結できる限り、任意のサイズまたは組成のものであってよい。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１～５０個のアミノ酸、約１～２０個のアミノ酸、約１～１５個のアミノ酸、約１～１０個のアミノ酸、約１～５個のアミノ酸、約２～２０個のアミノ酸、約２～１５個のアミノ酸、約２～１０個のアミノ酸、または約２～５個のアミノ酸である。リンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度、及び／または他の特性が、目的の標的、または、目的の複数の他の標的タンパク質、または目的ではないタンパク質（つまり、非標的タンパク質）に対する親和性、特異性、または結合力など、親和剤で使用するためのリガンドの特定の特性に影響を与え得ることは明らかなはずである。いくつかの実施形態では、２つ以上のリンカーが利用される。いくつかの実施形態では、２つ以上のリンカーが同じである。いくつかの実施形態では、２つ以上のリンカーが異なる。
【0068】
いくつかの実施形態では、リンカーは、アルキルリンカーまたはＰＥＧリンカーなどの非ペプチドリンカーである。例えば、－ＮＨ－（ＣＨ２）ｓ－Ｃ（０）－（式中、ｓ＝２～２０）などのアルキルリンカーを使用することができる。これらのアルキルリンカーは、低級アルキル、例えば、Ｃ１Ｃ６）低級アシル、ハロゲン（例えば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、フェニルなどの任意の非立体障害基によってさらに置換されていてもよい。代表的な非ペプチドリンカーはＰＥＧリンカーである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧリンカーは、約１００～５０００ｋＤａ、または約１００～５００ｋＤａの分子量を有する。
【0069】
リンカーは、本明細書に記載の技術及び／またはそうでなければ当技術分野で知られている技術を使用して評価することができる。いくつかの実施形態では、リンカーは、標的分子に結合するリガンドの能力を変更しない（例えば、破壊しない）。
【0070】
共役リガンドを含む親和剤：親和性分離マトリックス
親和剤を調製するために、リガンドまたは目的の標的への特異的結合を促進するリガンドまたは多量体を、クロマトグラフィーで使用される様々な表面、例えばビーズ、樹脂、ゲル、膜、モノリスなどに化学的に結合させることができる。本開示の親和剤は、ＡＡＶ２ビリオン、キャプシド、または前述のいずれかの変異体の精製、及びこれらの部分が関わる用途の製造に特に有用である。
親和剤を調製するために、リガンドまたは目的の標的への特異的結合を促進するリガンドまたは多量体を、クロマトグラフィーで使用される様々な表面、例えばビーズ、樹脂、ゲル、膜、モノリスなどに化学的に結合させることができる。本開示の親和剤は、ＡＡＶ２ビリオン、キャプシド、または前述のいずれかの変異体の精製、及びこれらの部分が関わる用途の製造に特に有用である。
【0071】
いくつかの実施形態では、本開示のリガンド（例えば、リガンド融合タンパク質）は、少なくとも１つの反応性残基を含む。反応性残基は、例えば、化学療法薬または診断薬などのコンジュゲートの結合部位として有用である。例示的な反応性アミノ酸残基には、例えば、リジンまたはシステインが挙げられる。反応性残基は、いずれかの末端で、またはリガンド配列内でリガンドに付加することができ、及び／またはリガンドの配列中の別のアミノ酸と置換することができる。適切な反応性残基（例えば、リジン、システインなど）は、付加または置換を必要とせずに、同定されたリガンドの配列内に位置することもできる。
【0072】
固体表面への結合
「固体表面」、「支持体」、または「マトリックス」は、本明細書では同義に使用され、制限なく、直接的または間接的に（例えば、リンカーなどの他の結合パートナー中間体を介して）本開示のリガンドまたは多量体が結合し得る（すなわち、カップリング、連結、または接着）、またはリガンドまたは多量体が埋め込まれている可能性がある（例えば、受容体またはチャネルを介して）、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、または金チップ）、または膜（合成（例えば、フィルター）または生物学的（例えば、リポソームまたはベシクル））を指す。ポリペプチドを固体支持体に結合させるための試薬及び技術は、当技術分野で周知であり、例えば、カルバメートカップリングである。適切な固体支持体には、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－４ＦＦアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイターディッシュのウェルの壁または床、シリカベースのバイオチップ、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。リガンド及び他の組成物は、当技術分野で知られている試薬及び技術を使用して、非共有結合または共有結合によって支持体材料に結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、リンカーを使用してクロマトグラフィー材料に結合される。
「固体表面」、「支持体」、または「マトリックス」は、本明細書では同義に使用され、制限なく、直接的または間接的に（例えば、リンカーなどの他の結合パートナー中間体を介して）本開示のリガンドまたは多量体が結合し得る（すなわち、カップリング、連結、または接着）、またはリガンドまたは多量体が埋め込まれている可能性がある（例えば、受容体またはチャネルを介して）、任意のカラム（またはカラム材料）、ビーズ、試験管、マイクロタイター皿、固体粒子（例えば、アガロースまたはセファロース）、マイクロチップ（例えば、シリコン、シリコンガラス、または金チップ）、または膜（合成（例えば、フィルター）または生物学的（例えば、リポソームまたはベシクル））を指す。ポリペプチドを固体支持体に結合させるための試薬及び技術は、当技術分野で周知であり、例えば、カルバメートカップリングである。適切な固体支持体には、クロマトグラフィー樹脂またはマトリックス（例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ－４ＦＦアガロースビーズ）、プラスチック製マイクロタイターディッシュのウェルの壁または床、シリカベースのバイオチップ、ポリアクリルアミド、アガロース、シリカ、ニトロセルロース、紙、プラスチック、ナイロン、金属、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。リガンド及び他の組成物は、当技術分野で知られている試薬及び技術を使用して、非共有結合または共有結合によって支持体材料に結合することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、リンカーを使用してクロマトグラフィー材料に結合される。
【0073】
一態様では、本開示は、不溶解性支持体に結合する上記のリガンドまたは多量体から構成される親和剤（親和性分離マトリックス）を提供する。そのような支持体は、ビーズ、膜、フィルター、毛細血管、モノリス、及びクロマトグラフィーで一般的に使用されるその他の形式などの１つまたは複数の粒子であり得る。親和性分離マトリックスの有利な実施形態では、支持体は、ビーズとしても知られる実質的に球状の粒子から構成される。適切な粒子サイズは、１０～１００μｍ、例えば２０～８０μｍなどの５～５００μｍの直径範囲であり得る。別の実施形態では、支持体は膜である。高い吸着能力を得るために、支持体は多孔質であることが好ましく、リガンドは外面だけでなく細孔面にも結合することができる。この態様の有利な実施形態では、支持体は多孔質である。
【0074】
別の態様では、本開示は、クロマトグラフィー親和剤を調製する方法に関し、この方法は、上記のリガンドを提供すること、及びリガンドを支持体にカップリングすることを含む。カップリングは、例えば、リガンドの窒素または硫黄原子を介して行うことができる。リガンドは、支持体表面とリガンドとの間に適切な距離を提供するために、スペーサー要素を介して直接的または間接的に支持体に結合され得る。タンパク質リガンドを多孔質または非多孔質表面に固定化する方法は、この分野でよく知られている。
【0075】
リガンドの生成
本開示のいくつかの実施形態を実施するのに有用なリガンド及び多量体の生成は、当技術分野で知られている化学合成、半合成法、及び組換えＤＮＡ方法論のための様々な標準技術を使用して行うことができる。また、リガンドまたは多量体を個別にまたはマルチドメイン融合タンパク質の一部として、可溶性薬剤及び細胞関連タンパク質として生成する方法も提供される。いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体の全体的な生成スキームは、基準タンパク質足場を取得すること、及び改変のために足場内の複数の残基を同定することを含む。実施形態に応じて、基準足場は、１つまたは複数のアルファヘリックス領域を有するタンパク質構造、または他の三次構造を含み得る。いったん同定されると、複数の残基のいずれかを、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換によって改変することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、自然アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのうちの１つ）は改変のために基準足場の標的位置に置換される。いくつかの実施形態において、改変は、システインまたはプロリンのいずれかにおける置換を含まない。特定の実施形態において所望される同定された位置で改変が行われた後、得られた改変ポリペプチド（例えば、候補リガンド）は、例えば、プラスミド、細菌、ファージ、または他のベクターにおいて組換え発現され得る（例えば、改変ポリペプチドのそれぞれの数を増加させるために）。次いで、改変ポリペプチドを精製し、スクリーニングして、目的の特定の標的、例えば、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に特異的に結合する改変ポリペプチドを同定することができる。改変ポリペプチドは、基準足場と比較してＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に対して増強された結合特異性を示し得るか、または所定の目的の標的（または非標的タンパク質）に対してほとんど、または、全く結合を示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に応じて、基準足場は、目的の標的との何らかの相互作用（例えば、非特異的相互作用）を示し得るが、特定の改変ポリペプチドは、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍（またはそれ以上）増加した目的の標的に対する結合特異性を示すであろう。リガンドの生成、選択、及び単離に関する追加の詳細は、以下でより詳細に提供される。
本開示のいくつかの実施形態を実施するのに有用なリガンド及び多量体の生成は、当技術分野で知られている化学合成、半合成法、及び組換えＤＮＡ方法論のための様々な標準技術を使用して行うことができる。また、リガンドまたは多量体を個別にまたはマルチドメイン融合タンパク質の一部として、可溶性薬剤及び細胞関連タンパク質として生成する方法も提供される。いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体の全体的な生成スキームは、基準タンパク質足場を取得すること、及び改変のために足場内の複数の残基を同定することを含む。実施形態に応じて、基準足場は、１つまたは複数のアルファヘリックス領域を有するタンパク質構造、または他の三次構造を含み得る。いったん同定されると、複数の残基のいずれかを、例えば、１つまたは複数のアミノ酸の置換によって改変することができる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の非保存的置換が行われる。いくつかの実施形態では、自然アミノ酸（例えば、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、またはバリンのうちの１つ）は改変のために基準足場の標的位置に置換される。いくつかの実施形態において、改変は、システインまたはプロリンのいずれかにおける置換を含まない。特定の実施形態において所望される同定された位置で改変が行われた後、得られた改変ポリペプチド（例えば、候補リガンド）は、例えば、プラスミド、細菌、ファージ、または他のベクターにおいて組換え発現され得る（例えば、改変ポリペプチドのそれぞれの数を増加させるために）。次いで、改変ポリペプチドを精製し、スクリーニングして、目的の特定の標的、例えば、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に特異的に結合する改変ポリペプチドを同定することができる。改変ポリペプチドは、基準足場と比較してＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に対して増強された結合特異性を示し得るか、または所定の目的の標的（または非標的タンパク質）に対してほとんど、または、全く結合を示さない可能性がある。いくつかの実施形態では、目的の標的に応じて、基準足場は、目的の標的との何らかの相互作用（例えば、非特異的相互作用）を示し得るが、特定の改変ポリペプチドは、少なくとも約２倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約５０倍、または少なくとも約１００倍（またはそれ以上）増加した目的の標的に対する結合特異性を示すであろう。リガンドの生成、選択、及び単離に関する追加の詳細は、以下でより詳細に提供される。
【0076】
リガンドの組換え発現
いくつかの実施形態では、リガンド融合タンパク質などのリガンドは、「組換えにより生成される」（すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される）。リガンド融合タンパク質を合成するために利用可能な例示的な組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの合成、コンカテマー化、シームレスクローニング、及び再帰的方向性ライゲーション（ＲＤＬ）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３：３５７－３６７（２００２），Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７：６６５－６７０（２００５），Ｈａｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２：１３９－１５０（２００５）；及び、ＭｃＭｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２（１１）：３６４３－３６４６（１９９９）を参照）。
いくつかの実施形態では、リガンド融合タンパク質などのリガンドは、「組換えにより生成される」（すなわち、組換えＤＮＡ技術を使用して生成される）。リガンド融合タンパク質を合成するために利用可能な例示的な組換え法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）ベースの合成、コンカテマー化、シームレスクローニング、及び再帰的方向性ライゲーション（ＲＤＬ）が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｍｅｙｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３：３５７－３６７（２００２），Ｋｕｒｉｈａｒａ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．２７：６６５－６７０（２００５），Ｈａｉｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍ．２：１３９－１５０（２００５）；及び、ＭｃＭｉｌｌａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ３２（１１）：３６４３－３６４６（１９９９）を参照）。
【0077】
別の態様では、本明細書で開示した実施形態によるリガンドまたは多量体をコードするポリヌクレオチド配列を含む核酸も提供される。したがって、本開示は、ポリペプチド（リガンド）または多量体をコードするＲＮＡ及びＤＮＡなどの本発明の核酸配列のすべての形態を包含する。本開示は、コード配列に加えて、本開示によるポリペプチドまたは多量体の発現に必要なシグナル配列を含む、プラスミドなどのベクターを提供する。そのようなポリヌクレオチドは、場合により、１つまたは複数の発現制御エレメントをさらに含む。例えば、ポリヌクレオチドは、発現制御エレメントとして、１つまたは複数のプロモーターまたは転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及びポリアデニル化シグナルを含むことができる。ポリヌクレオチドは、発現のために任意の適切な宿主細胞内に含めることができる任意の適切なベクター内に挿入することができる。一実施形態では、ベクターは、本開示による多量体をコードする核酸を含み、各ユニットをコードする別個の核酸は、相同または異種のＤＮＡ配列を有し得る。
【0078】
リガンドおよび多量体をコードする核酸の発現は、典型的には、リガンドをコードする核酸を発現ベクター内のプロモーターに作動可能に連結することによって達成される。典型的な発現ベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、及び所望の核酸配列の発現の制御に有用なプロモーターを含有する。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現に有用なプロモーターの例には、例えば、Ｔ７プロモーターが挙げられる。
【0079】
適切な転写／翻訳制御シグナルと一緒にリガンドをコードする核酸配列を含む発現ベクターを構築するために、当業者に周知の方法を用いることができる。これらの方法は、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、及び、インビボ遺伝子組換え／遺伝的組換えが含むが、これらに限定されない。ポリヌクレオチドの発現は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、植物細胞または哺乳動物細胞を含むがこれらに限定されない、当技術分野で知られている任意の適切な発現宿主で行うことができる。いくつかの実施形態では、リガンドをコードする核酸配列は、核酸配列が宿主においてリガンドに転写及び／または翻訳されるように、適切なプロモーター配列に作動可能に連結される。
【0080】
様々な宿主発現ベクター系を利用して、リガンドをコードする核酸を発現させることができる。リガンドをコードする核酸（例えば、個々のリガンドサブユニットまたはリガンド融合体）またはその一部もしくは断片を含むベクターには、プラスミドベクター、一本鎖及び二本鎖ファージベクター、並びに一本鎖及び二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターが含まれる。ファージ及びウイルスベクターは、感染及び形質導入のための既知の技術を使用して、パッケージ化またはカプセル化されたウイルスの形態で宿主細胞に導入することもできる。さらに、ウイルスベクターは、複製可能であるか、または代替的に複製欠陥であり得る。あるいは、無細胞翻訳系を用いて、ＤＮＡ発現構築物由来のＲＮＡを用いてタンパク質を生成することもできる（例えば、ＷＯ８６／０５８０７及びＷＯ８９／０１０３６、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号を参照）。
【0081】
一般に、任意のタイプの細胞または培養細胞株を使用して、本明細書で提供されるリガンドまたは多量体を発現させることができる。いくつかの実施形態では、操作された宿主細胞を生成するために使用されるバックグラウンド細胞株は、ファージ、細菌細胞、酵母細胞、または哺乳動物細胞である。リガンド融合タンパク質のコード配列を発現させるために、様々な宿主発現ベクター系を使用することができる。哺乳動物細胞を、目的の標的のコード配列及び融合ポリペプチドのコード配列を含む組換えプラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターでトランスフェクトされた宿主細胞系として使用することができる。細胞は、形質転換またはトランスジェニック性質の生物、培養物、または細胞株からの一次分離株であり得る。
【0082】
好適な宿主細胞には、微生物、例えば、リガンドコード配列を含む、組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）；リガンドコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ）；リガンドコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染するか、またはリガンドコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
【0083】
リガンドを生成する際の宿主細胞として有用な原核生物には、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓなどのグラム陰性生物またはグラム陽性生物が含まれる。原核宿主細胞で使用するための発現ベクターは、一般に、１つまたは複数の表現型選択マーカー遺伝子（例えば、抗生物質耐性を付与するタンパク質または独立栄養要求を供給するタンパク質をコードする遺伝子）を含む。有用な原核宿主発現ベクターの例としては、ｐＫＫ２２３－３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）、ｐＥＴ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ）及びｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）のベクターシリーズが挙げられる（例えば、Ｓｔｕｄｉｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１９：３７（１９９１）及びＳｃｈｏｅｐｆｅｒ，Ｇｅｎｅ １２４：８３（１９９３）を参照）。原核宿主細胞発現ベクターで頻繁に使用される例示的なプロモーター配列には、Ｔ７（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ ５６：１２５－１３５（１９８７）），ｂｅｔａ－ｌａｃｔａｍａｓｅ（ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎａｓｅ）、ｌａｃｔｏｓｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２７５：６１５（１９７８））、及び、Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ２８１：５４４（１９７９）），ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ（ｔｒｐ）ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｙｓｔｅｍ（Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．８：４０５７，（１９８０））、及び、ｔａｃ ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）が挙げられる。
【0084】
いくつかの実施形態では、リガンドのコード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母細胞を含む、真核宿主細胞系が使用される。本開示の組成物を生成するために使用できる例示的な酵母には、サッカロミセス属、ピキア属、アクチノミセス属、及びクルイベロミセス属由来の酵母が含まれる。酵母ベクターは通常、２ｍｕ酵母プラスミド由来の複製開始配列、自律複製配列（ＡＲＳ）、プロモーター領域、ポリアデニル化のための配列、転写終結のための配列、及び選択マーカー遺伝子を含む。酵母発現構築物におけるプロモーター配列の例としては、メタロチオネイン、３－ホスホグリセリン酸キナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７３（１９８０））、及び、他の糖分解酵素、例えば、エノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼのプロモーターが挙げられる。酵母発現及び酵母形質転換プロトコルで使用するための追加の適切なベクター及びプロモーターは、当技術分野で知られている。例えば、Ｆｌｅｅｒ，Ｇｅｎｅ １０７：２８５－１９５（１９９１）及びＨｉｎｎｅｎ，ＰＮＡＳ ７５：１９２９（１９７８）を参照。
【0085】
昆虫及び植物宿主細胞培養系もまた、本開示の組成物を生成するために有用である。このような宿主細胞系には、例えば、リガンドのコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、またはリガンドのコード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系が挙げられ、限定されないが、米国特許第６，８１５，１８４号、米国出願第６０／３６５，７６９号、及び同第６０／３６８，０４７号、並びにＷＯ２００４／０５７００２、ＷＯ２００４／０２４９２７、及びＷＯ２００３／０７８６１４に教示された発現系を含む。
【0086】
いくつかの実施形態では、組換えウイルス発現ベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス）に感染した動物細胞系を含む宿主細胞系を使用することができ、これには、２分染色体で安定して増幅されたリガンド（ＣＨＯ／ｄｈｆｒ）、または不安定に増幅されたリガンド（例：マウス細胞株）のいずれかをコードするＤＮＡの複数のコピーを含むように操作された細胞株を含む。いくつかの実施形態では、リガンドをコードするポリヌクレオチド（複数可）を含むベクターは多シストロン性である。これらの組成物を生成するのに有用な例示的な哺乳動物細胞には、２９３細胞（例えば、２９３Ｔ及び２９３Ｆ）、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＮＳ０細胞、ＳＰ２／０細胞、ＹＯミエローマ細胞、Ｐ３Ｘ６３マウスミエローマ細胞、ＰＥＲ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６（Ｃｒｕｃｅｌｌ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）細胞ＶＥＲＹ、Ｈｅｌａ細胞、ＣＯＳ細胞、ＭＤＣＫ細胞、３Ｔ３細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＴ４８３細胞、Ｈｓ５７８Ｔ細胞、ＨＴＢ２細胞、ＢＴ２０細胞、Ｔ４７Ｄ細胞、ＣＲＬ７Ｏ３０細胞、ＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞、ハイブリドーマ細胞、及びその他の哺乳動物細胞が挙げられる。本開示の実施形態を実施するのに有用なさらなる例示的な哺乳動物宿主細胞には、Ｔ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な発現系及び選択方法は当技術分野で知られており、以下の参考文献及びそこで引用されている参考文献に記載されているものを含む：Ｂｏｒｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７１（４）：２６６－７３（２０００）、Ｗｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｚｎｅｉｍｉｔｔｅｌｆｏｒｓｃｈｕｎｇ／Ｄｒｕｇ Ｒｅｓ．４８（８）：８７０－８０（１９９８），Ａｎｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：１１７－１２３（２００２），Ｃｈａｄｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１８８－１９４（２００１）、及び、Ｇｉｄｄｉｎｇｓ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：４５０－４５４（２００１）。発現系及び選択方法のさらなる例は、Ｌｏｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ ８１：３５５－３５９（１９８４），Ｂｉｒｔｎｅｒ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１－５４４（１９８７））に記載されている。哺乳動物宿主細胞発現ベクターの転写及び翻訳制御配列は、ウイルスゲノムに由来することが多い。哺乳動物発現ベクターで一般的に使用されるプロモーター配列及びエンハンサー配列には、ポリオーマウイルス、アデノウイルス２、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、及びヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来の配列が含まれる。哺乳動物宿主細胞で使用するための例示的な市販の発現ベクターには、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が含まれる。
【0087】
核酸を宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、微量注入法、電気穿孔法等が含まれる。ベクター及び／または外因性核酸を含む細胞を生成する方法は、当技術分野で周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を参照されたい。
【0088】
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物（例えば、ヒト）細胞に遺伝子を挿入するために最も広く使用される方法になっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号及び同第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【0089】
目的のＤＮＡ及びＲＮＡポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する方法には、細胞のエレクトロポレーションが含まれ、このエレクトロポレーションでは、細胞膜の透過性を高めるために細胞に電場を印加し、化学物質、薬物、またはポリヌクレオチドを宿主細胞に導入できるようにする。ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物を含むリガンドは、エレクトロポレーションを使用して哺乳動物細胞または原核細胞に導入することができる。
【0090】
いくつかの実施形態では、細胞のエレクトロポレーションは、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞の表面上でリガンド－ＣＡＲの発現をもたらす。そのような発現は、細胞の寿命にわたって一過性または安定であり得る。エレクトロポレーションは、ＭａｘＣｙｔｅ ＧＴ（登録商標）及びＳＴＸ（登録商標）Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＭａｘＣｙｔｅ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を含む当技術分野で知られている方法で達成することができる。
【0091】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段には、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、並びに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、及びリポソームを含む脂質に基づく系が含まれる。インビトロ及びインビボで送達ビヒクルとして使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。非ウイルス送達系が利用される場合、例示的な送達ビヒクルはリポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）のために企図される。いくつかの実施形態において、核酸は、脂質と関連する。脂質と関連する核酸は、リポソームの水性内部に封入され、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に関連する連結分子を介してリポソームに付着し、リポソームに捕捉され、リポソームと複合体を形成し、脂質を含む溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わされ、脂質中に懸濁液として含まれ、ミセルを含むかミセルと複合体を形成し、またはそうでなければ脂質と会合されてもよい。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それらは、ミセルとして、または「崩壊した」構造で、二重層構造に存在することができる。また、単に溶液中に点在している可能性があり、サイズや形状が均一でない凝集体を形成する可能性がある。脂質は、天然脂質または合成脂質である脂肪物質である。例えば、脂質には、細胞質で自然に発生する脂肪滴、及び、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、アルデヒドなどの長鎖脂肪族炭化水素とその誘導体を含む化合物のクラスが含まれる。
【0092】
使用に好適な脂質は商業的供給源から入手することができる。例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから入手することができ；ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）は、Ｋ＆Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ）から入手することができ；コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手することができ；ジミリストイルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及びその他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）から入手することができる。クロロホルムまたはクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムはメタノールよりも容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用することができる。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される、様々な単層及び多層の脂質ビヒクルを包含する総称である。リポソームは、リン脂質二重層膜及び内部の水性媒体を有する小胞構造を有することを特徴とすることができる。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁すると自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造を形成する前に自己再編成を受け、脂質二重層の間に水と溶解した溶質を閉じ込める（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－５１０（１９９１））。しかしながら、通常の小胞構造とは異なる構造を溶液中で有する組成物も含まれる。例えば、脂質はミセル構造をとるか、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在する可能性がある。また、リポフェクタミン－核酸複合体も企図される。
【0093】
外因性核酸を宿主細胞に導入するために使用される方法に関係なく、宿主細胞における組換え核酸配列の存在は、当技術分野で知られている様々なアッセイによって日常的に確認することができる。そのようなアッセイには、例えば、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ａｎｄ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ、ＲＴ－ＰＣＲ及びＰＣＲなど、「分子生物学的」アッセイ；例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びＷｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｓ）または本明細書に記載のアッセイによって、特定のペプチドの存在または非存在を検出して、本開示の範囲内に入る薬剤を同定するような「生化学的」アッセイが含まれる。
【0094】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定し、制御配列の機能性を評価するために使用される。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物、組織もしくは細胞に存在せず、またはそれによって発現されず、発現がいくつかの容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により明らかになるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後の好適な時点でアッセイされる。好適なレポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベータ－ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリ性ホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４７９：７９－８２（２０００））。好適な発現系は当該技術分野において周知であり、既知の技法を使用して調製されるか、または商業的に入手することができる。一般に、レポーター遺伝子の最高レベルの発現を示す最小の５’フランキング領域を持つ構築物がプロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、通常、レポーター遺伝子に連結することができ、プロモーター駆動転写を調節する能力について薬剤を評価するために使用することができる。
【0095】
単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン－グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ ２２：８１７（１９８０））遺伝子を含むがこれらに限定されない多数の選択系を哺乳動物宿主－ベクター発現系で使用することができる。さらに、代謝拮抗剤耐性は、例えば、ｄｈｆｒ、ｇｐｔ、ｎｅｏ、ｈｙｇｒｏ、ｔｒｐＢ、ｈｉｓＤ、ＯＤＣ（オルニチンデカルボキシラーゼ）、及びグルタミンシンターゼ系の選択の基礎として使用することができる。
【0096】
いくつかの実施形態では、イニシエーターのＮ末端メチオニンは、リガンドのＮＨ末端に含まれる。多くの場合、リガンドは、発現中に切断されると推定されるＮ末端メチオニン残基なしで単離される。多くの場合、Ｎ末端メチオニンを含有する精製されたリガンドの一部のみを含む混合物が得られる。Ｎ末端メチオニンの存在または非存在が、本明細書に記載のリガンド及び親和剤の機能性に影響を及ぼさないことは、当業者には明らかである。
【0097】
リガンド精製
リガンドまたはリガンド融合タンパク質または多量体が組換え発現によって生成されると、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術による、組換えタンパク質の精製のための当技術分野で公知の方法によって精製することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、精製を容易にするために、本明細書に具体的に開示されているか、またはそうでなければ当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に場合によって融合される。いくつかの実施形態において、親和性精製のためのリガンド親和性カラムのためのリガンド（例えば、抗体及び他の親和性マトリックス）、及び場合により、これらのリガンドによって結合されるリガンドまたはリガンド融合組成物の他の成分は、当技術分野で知られている技術を使用して、リガンドの最終調製の前に組成物から除去される。
リガンドまたはリガンド融合タンパク質または多量体が組換え発現によって生成されると、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他の標準的な技術による、組換えタンパク質の精製のための当技術分野で公知の方法によって精製することができる。いくつかの実施形態では、リガンドは、精製を容易にするために、本明細書に具体的に開示されているか、またはそうでなければ当技術分野で知られている異種ポリペプチド配列に場合によって融合される。いくつかの実施形態において、親和性精製のためのリガンド親和性カラムのためのリガンド（例えば、抗体及び他の親和性マトリックス）、及び場合により、これらのリガンドによって結合されるリガンドまたはリガンド融合組成物の他の成分は、当技術分野で知られている技術を使用して、リガンドの最終調製の前に組成物から除去される。
【0098】
リガンドの化学合成
組換え法に加えて、当技術分野で知られている様々な液相及び固相化学プロセスを使用して、所望のポリペプチドの有機化学合成を使用してリガンド生成を行うこともできる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１－３４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１－２８４；Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３０：７０５ ７３９（１９８７）；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．１９９０，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１－１９；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８９を参照されたい。これらの方法論の１つの利点は、リガンドの配列への非天然アミノ酸残基の組み込みを可能にすることである。
組換え法に加えて、当技術分野で知られている様々な液相及び固相化学プロセスを使用して、所望のポリペプチドの有機化学合成を使用してリガンド生成を行うこともできる。様々な自動合成装置が市販されており、既知のプロトコルに従って使用することができる。例えば、Ｔａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６４４２（１９８３）；Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３２：３４１－３４７（１９８６）；Ｂａｒａｎｙ ａｎｄ Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｇｒｏｓｓ ａｎｄ Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１－２８４；Ｂａｒａｎｙ ｅｔ ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓ．，３０：７０５ ７３９（１９８７）；Ｋｅｌｌｅｙ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｓｅｔｌｏｗ，Ｊ．Ｋ．，ｅｄ．Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ．１９９０，ｖｏｌ．１２，ｐｐ．１－１９；Ｓｔｅｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｌｉｄ－Ｐｈａｓｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８９を参照されたい。これらの方法論の１つの利点は、リガンドの配列への非天然アミノ酸残基の組み込みを可能にすることである。
【0099】
本開示の方法で使用されるリガンド及び多量体は、合成または翻訳の間または後に、例えば、グリコシル化、アセチル化、ベンジル化、リン酸化、アミド化、ペグ化、ホルミル化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、抗体分子への結合、ヒドロキシル化、ヨウ素化、メチル化、ミリストイル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、セレノイル化、硫酸化、ユビキチン化などによって、改変され得る。（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，２ｄ Ｅｄ．（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，１９９２）；Ｐｏｓｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｖａｌｅｎｔ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｊｏｈｎｓｏｎ，ｅｄ．（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８３），ｐｐ．１－１２；Ｓｅｉｆｔｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１８２：６２６－６４６（１９９０）；Ｒａｔｔａｎ，Ａｎｎ．ＮＹ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，６６３：４８－６２（１９９２）を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ペプチドは、Ｎ末端でアセチル化され、及び／またはＣ末端でアミド化される。
【0100】
多数の化学修飾のいずれも、アセチル化、ホルミル化などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって行うことができる。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含むことができる。
【0101】
いくつかの実施形態では、ペプチド主鎖の環化または大環状化は、側鎖から側鎖への結合形成によって達成される。これを達成するための方法は当技術分野で周知であり、天然及び非天然のアミノ酸を必要とし得る。アプローチには、ジスルフィド形成、ランチオニン形成またはチオールアルキル化（例えば、マイケル付加）、アミノ側鎖とカルボキシレート側鎖間のアミド化、クリックケミストリー（例えば、アジド－アルキン縮合）、ペプチドステープル、閉環メタセシス、及び酵素の使用が含まれる。
【0102】
精製用親和剤
親和性クロマトグラフィーに基づく精製では、目的の標的（例えば、タンパク質または分子）は、典型的にはクロマトグラフィーマトリックスに共有結合されているリガンドに特異的かつ可逆的に結合する能力に従って選択的に単離される。本開示の親和性リガンドは、清澄化細胞培養液（ＣＣＣＦ）、または生体サンプルなどの天然源からのＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）の親和性精製のための試薬として使用することができる。
親和性クロマトグラフィーに基づく精製では、目的の標的（例えば、タンパク質または分子）は、典型的にはクロマトグラフィーマトリックスに共有結合されているリガンドに特異的かつ可逆的に結合する能力に従って選択的に単離される。本開示の親和性リガンドは、清澄化細胞培養液（ＣＣＣＦ）、または生体サンプルなどの天然源からのＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）の親和性精製のための試薬として使用することができる。
【0103】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）に特異的に結合するリガンドまたは多量体を、アガロースビーズなどのビーズ上に固定化して親和性分離マトリックスを形成し、次いで、標的を親和性精製するために使用される。
【0104】
タンパク質を表面に共有結合させる方法は当業者に知られており、リガンドを固体表面に結合させるために使用できるペプチドタグは当業者に知られている。さらに、リガンドは、当技術分野で知られている任意の試薬または技術を使用して、固体表面に結合（すなわち、カップリング、連結、または付着）することができる。いくつかの実施形態では、固体支持体は、ビーズ、ガラス、スライド、チップ、及び／またはゼラチンを含む。したがって、当技術分野で知られている技術を使用して、一連のリガンドを使用して固体表面上にアレイを作成することができる。例えば、米国出願公開第２００４／０００９５３０号は、アレイを調製する方法を開示しており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【0105】
いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体を使用して、親和性クロマトグラフィーによってＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）を単離する。いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体は固体支持体上に固定化される。リガンドまたは多量体は、本明細書に記載、そうでなければ当技術分野で周知の技術及び試薬を使用して固体支持体上に固定化することができる。適切な固体支持体は、本明細書に記載されているか、そうでなければ当技術分野で周知であり、特定の実施形態では、クロマトグラフィーカラムを充填するのに適している。親和剤は、様々なサイズのカラムに充填し、様々な線速度で操作することができ、または、固定化された親和性リガンドを、リガンドとＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）との間で複合体を形成するのに適した条件下で溶液と接触させることができる。非結合物質は洗い流すことができる。当業者は、適切な洗浄条件を容易に決定することができる。適切な洗浄条件の例は、Ｓｈｕｋｌａ ａｎｄ Ｈｉｎｃｋｌｅｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ．２００８ Ｓｅｐ－Ｏｃｔ；２４（５）：１１１５－２１．ｄｏｉ：１０．１００２／ｂｔｐｒ．５０に記載されている。
【0106】
いくつかの実施形態において、クロマトグラフィーは、目的の標的及びリガンドを含有する溶液を混合し、次いで目的の標的及びリガンド、例えば、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）を含むライセート及びリガンドの複合体を単離することによって実施される。例えば、リガンドまたは多量体は、ビーズなどの固体支持体に固定され、次いで濾過によってＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）とともに溶液から分離される。いくつかの実施形態では、リガンドまたは多量体は、固定化金属親和性クロマトグラフィー樹脂またはストレプトアビジンコーティング基材を使用して複合体が形成された後、リガンドまたは多量体を単離するために使用できる、ポリ－Ｈｉｓテールまたはストレプトアビジン結合領域などのペプチドタグを含む融合タンパク質である。分離されると、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）は、溶出条件下でリガンドまたは多量体から放出され、精製された形で回収される。
【0107】
いくつかの実施形態では、本開示のリガンドまたは多量体は、バイオプロセス用途に有用な高度に架橋されたアガロースベースマトリックスに結合される。リガンドまたは多量体のベースマトリックスへの結合は、リガンドへの接近性を確保し、その後高い結合能力をもたらす柔軟なスペーサーを介して行うことができる。本開示のリガンド及び多量体の親和性は、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）の特異的結合を確実にする。さらに、本開示のリガンドは、アルカリ安定性を高めるように設計されており、定置洗浄（ＣＩＰ）及び消毒用途において０．１Ｍ～０．５ＭのＮａＯＨを繰り返し使用することを可能にする。
【0108】
別の態様では、本開示は、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）を単離する方法を提供し、本方法では、上記で開示した分離マトリックスが使用される。特定の実施形態では、この方法は、（ａ）ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）を含む液体サンプルを上記に開示される分離マトリックスと接触させる工程、（ｂ）分離マトリックスを洗浄液で洗浄する工程、（ｃ）ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）を溶出液で分離マトリックスから溶出する工程、及び（ｄ）ＣＩＰ洗浄（ＣＩＰ）液とも呼ばれる洗浄液で、例えば、少なくとも１分、例えば１分～４分以上の接触（インキュベーション）時間、分離マトリックスを洗浄する工程を含む。
【0109】
液体サンプル、洗浄液及び溶出液の適切な組成、ならびに分離を実施するための一般的な条件は、親和性クロマトグラフィーの分野で周知である。ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）を含む液体サンプルは、例えばＨＥＫ２９３Ｔ細胞などの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含み得る。宿主細胞タンパク質は、工程（ｂ）の間に脱着され得る。
【0110】
ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）の結合は、広範囲のイオン強度（例えば、１００～４００ｍＭ ＮａＣｌ）にわたって中性付近のｐＨ（６～９）の緩衝液で示されている。従来の緩衝液、例えばリン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリスを平衡化及びローディングに使用することができる。
【0111】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）を含む溶液またはサンプルは、溶液を分離マトリックスと接触させる前に、例えば限外濾過によって濃縮される。例えば、ＡＡＶ２含有溶液、例えば、清澄化された細胞培養フィードは、最大２０倍まで濃縮され得る。ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）の濃度により、親和性クロマトグラフィーのロード時間が短縮される。濃度の増加は、熱力学的平衡効果により結合能力にもプラスの影響を与える可能性があり、これにより精製に必要な分離マトリックスの量が減少する可能性がある。ＡＡＶ２を含むフィードストリームを濃縮すると、処理時間が大幅に増加する可能性もある。
【0112】
あるいは、ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれかの変異体）を含む溶液またはサンプルは、非濃縮または希釈溶液、例えば、清澄化細胞培養フィード（ＣＣＣＦ）である。本開示の親和性分離マトリックスは、ＣＣＣＦを高い体積流量で処理する能力によって特徴付けられ、希薄ＣＣＣＦ供給流からの捕捉を可能にする。
【0113】
ＡＡＶ親和性精製に有用な洗浄溶液の例には、ＰＢＳ、０．０１％ポロクサマーＰ１８８（または他のＡＡＶ２適合性界面活性剤）を含むＰＢＳ、５０ｍＭトリス、４００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５、または５０ｍＭトリス、２５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．３などの分離マトリックス平衡バッファーが挙げられる。洗浄液の任意の添加剤を使用してＨＣＰを減らすことができ、例えば、５０～２５０ｍＭのアルギニン；０．２５～１Ｍのカオトロピック剤（例えば、尿素、グアニジン）；０．２～１Ｍの高濃度の塩（例えば、ＮａＣｌ、ＭｇＣｌ２）；２５～１００ｍＭのオクタン酸（カプリル酸）；０．５～１Ｍの塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）が挙げられる。場合によっては、５～２０％の有機アルコール（例えば、プロピレングリコール、１，６－ヘキサンジオール、エタノール）、及び５～２０％のトレハロース、スクロースまたはグリシンベタインなどの浸透圧保護剤が有効である。
【0114】
ＡＡＶ２ビリオン及びキャプシドの溶出は、一般に、ｐＨを、例えばｐＨ２．０～３．０に下げることによって達成されるが、より高いｐＨを使用することもできる。ＡＡＶ２ビリオンまたはキャプシド（またはいずれか１つの変異体）の溶出のための最適条件は、当業者によって容易に決定され得る。
【0115】
本開示の親和剤は耐アルカリ性であり得、洗浄のために最大０．５Ｍの濃度のＮａＯＨの使用を可能にする。特定の実施形態では、例えば、１サイクル当たり最大３０～６０分の０．５Ｍ ＮａＯＨ曝露のＣＩＰレジメンは、例えば、１５～３０サイクルなどのいくつかのサイクルで一貫したクロマトグラフィー性能を保証し、７０％～９０％の初期結合能力と低い残留ＤＮＡ及びＨＣＰレベル、ならびに流動能力の実質的な変化がないことを含む。
【0116】
本発明のいくつかの実施形態を例示として説明してきたが、本発明は、多くの修正、変形、及び適合により、また、当業者の範囲内で、本発明の精神から逸脱することなく、または特許請求の範囲を超えることなく、多数の均等物または代替解決策を使用して実施できることは明らかであろう。
【0117】
全ての出版物、特許、及び特許出願は、各個別出版物、特許、または特許出願が、その全体で参照することにより組み込まれるように特異的かつ個別に示された場合と同一の程度に、それらの全体で参照することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【0118】
本明細書に提示される実施例は、本発明の特定の実施形態を表す。しかしながら、これらの実施例は説明のみを目的としており、本発明の条件及び範囲に関して完全に限定的であることを意図するものではなく、また、そのように解釈されるべきではないことを理解されたい。実施例は、特に詳細に記載されている場合を除き、当業者によく知られ日常的な標準的な技術を使用して実施された。
【0119】
実施例１．一般的な方法
ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成技術によって合成し、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの純度は、ＵＶ及び四重極飛行時間型質量分析検出の両方を備えたＲＰ－ＵＰＬＣによって評価した。
ペプチドを、標準的なＦｍｏｃ固相ペプチド合成技術によって合成し、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。ペプチドの純度は、ＵＶ及び四重極飛行時間型質量分析検出の両方を備えたＲＰ－ＵＰＬＣによって評価した。
【0120】
組換え親和性リガンドは、標準的な技術を使用してＥ．ｃｏｌｉで発現された。リガンドを、マルチカラムクロマトグラフィーを使用して精製した。Ｈｉｓタグ付きリガンドの場合、固定化金属親和性クロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）を一次捕捉工程として使用した。ビオチン化リガンドを、ＡｖｉＴａｇ（商標）システム（Ａｖｉｄｉｔｙ，Ａｕｒｏｒａ，ＣＯ）で生成した。ＡｖｉＴａｇ（商標）配列を持つ非ビオチン化リガンドは、外因性ビオチンを省略して調製した。組換えタンパク質リガンドの純度と同一性を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＲＰＵＰＬＣ、四重極飛行時間型質量分析、及びサイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｓ７５、Ｃｙｔｉｖａ、Ｍａｒｌｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ）の組み合わせによって評価した。多くの場合、リガンドは、発現中に切断されると推定されるＮ末端メチオニン残基なしで単離される。
【0121】
実施例３．ＡＡＶ２親和性リガンドの生成
ＡＡＶ２リガンドを、Ｔ７プロモーター（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ）の制御下でプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングし、Ｔ７発現系を使用してＢＬ２１細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で発現させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドを、ＩＭＡＣ及びイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。
ＡＡＶ２リガンドを、Ｔ７プロモーター（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標）、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ／Ｓｉｇｍａ）の制御下でプラスミドｐＥＴ２８ａ（＋）にクローニングし、Ｔ７発現系を使用してＢＬ２１細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）で発現させた。Ｈｉｓタグ付きリガンドを、ＩＭＡＣ及びイオン交換クロマトグラフィーを使用して精製した。
【0122】
実施例３．例示的なＡＡＶ２親和性リガンド
この実施例は、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、ＡＡＶ２キャプシドへのビオチン化リガンドの結合を示す。ビオチン化親和性リガンドをセンサーに固定し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．０に５×１０１１ｖｐ／ｍＬを含むＡＡＶ２溶液でインキュベートした。ブランクセンサーを対照として含めた。
この実施例は、バイオレイヤー干渉法（ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｍｅｎｌｏ ｐａｒｋ，ＣＡ）を使用して、ＡＡＶ２キャプシドへのビオチン化リガンドの結合を示す。ビオチン化親和性リガンドをセンサーに固定し、１０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン、及び０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ－１００、ｐＨ７．０に５×１０１１ｖｐ／ｍＬを含むＡＡＶ２溶液でインキュベートした。ブランクセンサーを対照として含めた。
【0123】
関連付けフェーズは、ＡＡＶでは典型的な反応の最初の直線的な増加を示した。センサーが飽和するにつれて、センサーグラムはより大きな曲率を示した。各リガンドについて、３６００秒のインキュベーション時間後に反応が測定され、表１に示す。図１は、典型的なセンサーグラム（リガンド２７）を示している。
【表1】
【0124】
実施例３．親和性リガンドのアルカリ安定性
この実施例は、ビオチン化親和性リガンドの水酸化ナトリウム安定性を実証する。示された親和性リガンドを０．１Ｍ ＮａＯＨで２４時間インキュベートした後、中和した。ＮａＯＨ処理リガンドの結合を実施例２に記載のように測定し、未処理リガンドと比較した。保持された結合は、次の式に従って計算した。
％結合保持＝
（ＮａＯＨ処理後に測定された反応）÷（未処理の測定された反応）×１００
この実施例は、ビオチン化親和性リガンドの水酸化ナトリウム安定性を実証する。示された親和性リガンドを０．１Ｍ ＮａＯＨで２４時間インキュベートした後、中和した。ＮａＯＨ処理リガンドの結合を実施例２に記載のように測定し、未処理リガンドと比較した。保持された結合は、次の式に従って計算した。
％結合保持＝
（ＮａＯＨ処理後に測定された反応）÷（未処理の測定された反応）×１００
【0125】
表２のデータは、多くの親和性リガンドがテスト条件下で高い安定性を呈することを示している。
【表2】
【0126】
実施例４．例示的な親和性樹脂の構築
この実施例は、本開示のリガンドを含む親和性樹脂の生成及び特徴付けを実証する。親和性樹脂を、リガンド内の単一の遊離チオールを介してリガンドをブロモアセチル活性化アガロースビーズにコンジュゲートさせることによって調製した。したがって、ＲＡＰＩＤ ＲＵＮ６％アガロースビーズ（ＡＢＴ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）及びＰｒａｅｓｔｏ（登録商標）ＪｅｔｔｅｄＡ５０ビーズ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を炭酸ジスクシンイミジルで活性化し、エチレンジアミンと反応させた後、ブロモアセテートで洗浄して遊離アミンを官能化した。親和性リガンドを、ＥＤＣ活性化（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を用いて、カルボキシ末端システインを介して室温でブロモアセチル活性化ビーズにコンジュゲートした。標的リガンド密度は１～８ｇ／Ｌの範囲で変化した。洗浄後、ビーズを過剰のチオグリセロールで不活性化させた。実際のリガンド密度は、次の式に従ってサブトラクティブＲＰ－ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
実際のリガンド密度＝（フィード中で測定された［リガンド］－排水中で測定された［リガンド］）。
この実施例は、本開示のリガンドを含む親和性樹脂の生成及び特徴付けを実証する。親和性樹脂を、リガンド内の単一の遊離チオールを介してリガンドをブロモアセチル活性化アガロースビーズにコンジュゲートさせることによって調製した。したがって、ＲＡＰＩＤ ＲＵＮ６％アガロースビーズ（ＡＢＴ，Ｍａｄｒｉｄ，Ｓｐａｉｎ）及びＰｒａｅｓｔｏ（登録商標）ＪｅｔｔｅｄＡ５０ビーズ（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ，Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）を炭酸ジスクシンイミジルで活性化し、エチレンジアミンと反応させた後、ブロモアセテートで洗浄して遊離アミンを官能化した。親和性リガンドを、ＥＤＣ活性化（１－エチル－３－（３－ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）を用いて、カルボキシ末端システインを介して室温でブロモアセチル活性化ビーズにコンジュゲートした。標的リガンド密度は１～８ｇ／Ｌの範囲で変化した。洗浄後、ビーズを過剰のチオグリセロールで不活性化させた。実際のリガンド密度は、次の式に従ってサブトラクティブＲＰ－ＨＰＬＣ法を使用して測定した。
実際のリガンド密度＝（フィード中で測定された［リガンド］－排水中で測定された［リガンド］）。
【0127】
実施例５．ＡＡＶ２精製
この実施例は、短い滞留時間でウイルス粒子を親和性捕捉するための親和性樹脂の機能的結合能力を実証する。総キャプシドの力価が１．１５×１０１２ｖｐ／ｍＬのウイルスキャプシドを含む清澄細胞培養フィードストリーム（ＣＣＣＦ）を使用し、リガンド密度５ｍｇ／ｍＬでリガンド３０から調製した親和性樹脂にロードした。樹脂を０．３×５ｃｍカラムに充填し、表３に示すように操作した。溶出された物質を、ストリップ画分と一緒にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
この実施例は、短い滞留時間でウイルス粒子を親和性捕捉するための親和性樹脂の機能的結合能力を実証する。総キャプシドの力価が１．１５×１０１２ｖｐ／ｍＬのウイルスキャプシドを含む清澄細胞培養フィードストリーム（ＣＣＣＦ）を使用し、リガンド密度５ｍｇ／ｍＬでリガンド３０から調製した親和性樹脂にロードした。樹脂を０．３×５ｃｍカラムに充填し、表３に示すように操作した。溶出された物質を、ストリップ画分と一緒にＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析した。
【0128】
【0129】
表３及び４の略語。ＣＶ、カラム容量。Ｒｅｓ、滞留。
【0130】
実施例６．３つのＡＡＶ２含有供給流の精製
それぞれＡＡＶ２キャプシドを含む、３つの異なる製造業者からの３つの異なる供給流を、実施例５のように調製したカラムで精製し、表４に記載のように操作した。表５に示す、各フィードに異なる負荷量と条件を使用した。総キャプシドＥＬＩＳＡを使用してキャプシド量を定量した。各精製サイクルからの画分を収集し、Ｃｙｇｎｕｓ（商標）ＣＨＯ宿主細胞タンパク質第３世代アッセイ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイをそれぞれ使用して、残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び残留宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）について分析した。精製されたウイルスキャプシドの分析を表５に示す。
それぞれＡＡＶ２キャプシドを含む、３つの異なる製造業者からの３つの異なる供給流を、実施例５のように調製したカラムで精製し、表４に記載のように操作した。表５に示す、各フィードに異なる負荷量と条件を使用した。総キャプシドＥＬＩＳＡを使用してキャプシド量を定量した。各精製サイクルからの画分を収集し、Ｃｙｇｎｕｓ（商標）ＣＨＯ宿主細胞タンパク質第３世代アッセイ及びＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｑｕａｎｔ－ｉＴ（商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（商標）アッセイをそれぞれ使用して、残留宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）及び残留宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤＮＡ）について分析した。精製されたウイルスキャプシドの分析を表５に示す。
【表4】
【表5】
【0131】
実施例７．多量体リガンドを使用した精製
実施例４に記載したように、様々な単量体及び多量体親和性リガンドを樹脂に結合させた。各樹脂の静的結合能（ＳＢＣ）を測定した。結果を表６に示す。
実施例４に記載したように、様々な単量体及び多量体親和性リガンドを樹脂に結合させた。各樹脂の静的結合能（ＳＢＣ）を測定した。結果を表６に示す。
【表6】
【0132】
実施例８．ヘリックス２の役割
表１及び２のリガンド１３、１６、１８、１９、２６、２７、２９、及び３０のリガンド結合データは、ヘリックス２における配列変異の役割を示している。これらの結果は、ヘリックス２における修飾がリガンド結合を維持していることを示す。
表１及び２のリガンド１３、１６、１８、１９、２６、２７、２９、及び３０のリガンド結合データは、ヘリックス２における配列変異の役割を示している。これらの結果は、ヘリックス２における修飾がリガンド結合を維持していることを示す。
【0133】
本明細書に記載された本開示の多くの修正及び他の実施形態は、前述の説明及び関連する図面に提示された教示の恩恵を受けて、本開示が関係する当業者に思い浮かぶ。したがって、本開示は開示された特定の実施形態に限定されるべきではなく、修正及び他の実施形態が添付の特許請求の範囲、及び、本明細書に開示される実施形態の一覧内に含まれることが意図されていることを理解されたい。本明細書では特定の用語が使用されているが、それらは一般的かつ説明的な意味でのみ使用されており、限定の目的では使用されていない。
【0134】
本明細書に開示される方法は、列挙された順序で実行される必要はない。本明細書で開示される方法は、開業医によって行われる特定の行動を含むが、ただし、明示的または暗示的に、これらの行動に関する第三者の指示を含めることもできる。
【表7-1】
【表7-2】
【表7-3】
【表7-4】
【0135】
＊＊配列番号１、２及び５１～５５中の各Ｘは、本開示の詳細な説明の「ＡＡＶ２親和性リガンド」というタイトルのセクションに定義されている。
【図1】
【図2】
【配列表】
【国際調査報告】