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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】ＭＳＩ癌を診断する方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/6886 20180101AFI20240220BHJP
C12Q 1/6869 20180101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/6886 Z
C12Q1/6869 Z
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023546091
(86)(22)【出願日】2022-01-28
(85)【翻訳文提出日】2023-09-22
(86)【国際出願番号】 EP2022052080
(87)【国際公開番号】W WO2022162162
(87)【国際公開日】2022-08-04
(31)【優先権主張番号】21305121.2
(32)【優先日】2021-01-29
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】511074305
【氏名又は名称】インセルム（インスティチュート ナショナル デ ラ サンテ エ デ ラ リシェルシェ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】518390284
【氏名又は名称】アシスタンス パブリック－オピトークス ド パリ
(71)【出願人】
【識別番号】518170446
【氏名又は名称】ソルボンヌ ウニベルシテ
(71)【出願人】
【識別番号】520504471
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ デ リール
(71)【出願人】
【識別番号】523286059
【氏名又は名称】セントレ ホスピタリエール リージョナル ウニベルシテール デ リール
(74)【代理人】
【識別番号】100114775
【弁理士】
【氏名又は名称】高岡 亮一
(74)【代理人】
【識別番号】100121511
【弁理士】
【氏名又は名称】小田 直
(74)【代理人】
【識別番号】100202751
【弁理士】
【氏名又は名称】岩堀 明代
(74)【代理人】
【識別番号】100208580
【弁理士】
【氏名又は名称】三好 玲奈
(74)【代理人】
【識別番号】100191086
【弁理士】
【氏名又は名称】高橋 香元
(72)【発明者】
【氏名】デュヴァル，アレックス
(72)【発明者】
【氏名】ラトヴォマナナ，トキ
(72)【発明者】
【氏名】ルノー，フローレンス
(72)【発明者】
【氏名】コルーラ，アダ
(72)【発明者】
【氏名】ジョンチェレ，ヴィンセント
(72)【発明者】
【氏名】アンドレ，ティエリー
(72)【発明者】
【氏名】ブハード，オリヴィエ
(72)【発明者】
【氏名】クーレット，フローレンス
【テーマコード（参考）】
4B063
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA13
4B063QA17
4B063QA19
4B063QQ03
4B063QQ42
4B063QQ58
4B063QR08
4B063QR42
4B063QR55
4B063QR56
4B063QR62
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、ＭＳＩ癌の診断の分野に関する。本研究において、本発明者らは、ＩＣＩでの臨床試験に関与する多施設前向き患者からのｄＭＭＲ／ＭＳＩ ｍＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの性能を評価した。本発明の分析は、ｍＣＲＣおよびｎｍＣＲＣにおいてＭＳＩを同定するためのＦＤＡ認可のあるＮＧＳに基づく診断テストが、ゴールドスタンダード参照法に比較した場合に、不正確な結果を与えることを実証した。結果として、全試料からの全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）データがさらに、ＣＲＣおよび他の原発腫瘍の型におけるＭＳＩゲノムシグナルの検出を改善するために解析された。これにより、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界を同定することができ、新たに最適化されたアルゴリズム、即ちＭＳＩＣａｒｅを設計および検証することができた。ＣＲＣおよび非ＣＲＣ腫瘍におけるＭＳＩの検出のためのＭＳＩＣａｒｅの高い正確性が、汎癌におけるＭＳＩを評定するための将来の参照テストになることが可能なはずである。このため本発明は、とりわけ、腫瘍試料と、入手可能なら正常試料と、からＤＮＡを抽出してシークエンシングすること、およびＭＮＲの解析を操作すること、を含む、必要とする患者においてＭＳＩを診断する方法に関する。
【選択図】なし
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料と、入手可能ならば正常試料と、からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、または対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する前記腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）前記正常試料が入手可能であるか否かに応じて各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）前記ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法。
【請求項2】
ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、ならびにｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、請求項１に記載の必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法。
【請求項3】
ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する前記腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）前記ＭＮＲのための正常な多型ゾーンを評価すること、ｉｖ）各ＭＮＲの前記正常な多型ゾーンの外部のみの前記腫瘍試料中に出現した変異型ＭＮＲを評価すること、ｖ）前記腫瘍試料から得られた各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｖｉ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖｉｉ）調整Δ比を計算すること、ｖｉｉｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、請求項１に記載の必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法。
【請求項4】
前記癌が、転移性であるか、または転移性でない、請求項１～３に記載の方法。
【請求項5】
前記癌が、大腸癌、胃癌または子宮内膜癌である、請求項１～４に記載の方法。
【請求項6】
前記結果を前記患者に伝達する更なるステップが追加される、請求項１～５に記載の方法。
【請求項7】
必要とする患者においてＭＳＩの変異を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ならびにｖｉ）前記調整Δ比が＜５０％であれば前記ＭＮＲが野生型であると結論づけて、前記調整Δ比が≧５０％であれば前記ＭＮＲが変異していると結論づけること、を含む、方法。
【請求項8】
請求項１～６に記載の方法によりＭＳＩ癌を有すると同定された患者において癌を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量の放射線療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合わせを施すことを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、特に、腫瘍試料と、入手可能なら正常試料と、からＤＮＡを抽出してシークエンシングすること、およびＭＮＲの解析を操作すること、を含む、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）と称されるヒト腫瘍表現型は、ミスマッチ修復（ＭＭＲ）遺伝子内の改変を不活性化することに関連する。ＭＳＩは最初、リンチ症候群に関連する遺伝性腫瘍において報告された。これは、ヒトにおいて最も多い癌素因性症候群の１つであり、特異的な治療および遺伝的カウンセリングを必要とする。ＭＳＩは、後に散発性大腸癌（ＣＲＣ）において観察され、より希少であるが他の原発腫瘍において観察された（１～４）。ＭＳＩを有する腫瘍は一般に、細胞障害性Ｔ細胞リンパ球を有する高密度浸透を示す（５）。近年になり、ＭＳＩ腫瘍およびとりわけＭＳＩ ＣＲＣが、免疫チェックポイント（ＩＣＫ）関連タンパク質を過剰発現して、免疫エスケープを可能にすることにより、この敵対する免疫微小環境に抵抗することが、報告された（６、７）。さらに、ＭＳＩ状態が、転移性ＣＲＣ（ｍＣＲＣ）の患者におけるＩＣＫ阻害剤（ＩＣＩ）からの臨床的利益を予測することが示された（８～１１）。これらの観察は、全ての新しく診断されたＣＲＣの汎用性ＭＳＩ／ｄＭＭＲスクリーニングを推奨する国際ガイドラインにつながった（１２）。発生部位の起源組織にかかわらず、全てのヒト腫瘍におけるＭＳＩ状態の評価を裏づける証拠も増えつつある。
【0003】
本発明者らの施設をはじめとする複数の特化された癌施設は、ＣＲＣにおいてＭＳＩおよびｄＭＭＲをテストするための許容された参照方法、即ち、ＭＳＩのためのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく方法（１３～１５）およびｄＭＭＲのための免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）（レビューについて１６も参照）を標準化および検証することを目的とする。ｍＣＲＣにおいて、本発明者らは近年になり、これらのゴールドスタンダート法を使用したＭＳＩおよび／またはＭＭＲテストの結果の間違った解釈が、ＩＣＩへの一次耐性を示したほとんどの症例の原因である可能性があることを強調した（１７）。その間、次世代シークエンシング（ＮＧＳ）技術に基づく別のＦＤＡ認可された方法が、ＣＲＣをはじめとする汎癌のＭＳＩスクリーニングのために報告された（１８）。これは、腫瘍および対の正常試料における指定されたマイクロサテライト領域の配列のリードを分析し、腫瘍における累積スコアとしての不安定な座位の割合％を報告するアルゴリズム、即ちＭＳＩＳｅｎｓｏｒに基づくものであった（１９）。しかし、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの診断性能は依然として、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ状態が参照ＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲ法を用いて既に確立された患者コホートにおいて、とりわけＩＣＩで処置されたｍＣＲＣ患者の前向き設定においては、まだ評価されていない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0004】
従って本発明の研究において、本発明者らの目的は、ＩＣＩによる臨床試験（ＮＣＴ０２８４０６０４およびＮＣＴ０３３５０１２６０）に関与する多施設前向き患者からのｄＭＭＲ／ＭＳＩ ｍＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のための、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの性能を評価することであった。誤診を回避するために、発明者らは、ＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲを使用して専門施設において全てのＣＲＣ試料中のｄＭＭＲおよびＭＳＩ状態をあらかじめ再評価した。ヒトの癌においてＭＳＩＳｅｎｓｏｒで得られた結果をさらに評価するために、発明者らは、後ろ向き多施設試験シリーズのｍＣＲＣおよび非転移性ＣＲＣ（ｎｍＣＲＣ）に加え、公開され入手可能な一連のＣＲＣシリーズおよびＭＳＩを頻繁に示す他の原発腫瘍の型も分析した。本発明の知見から、ｍＣＲＣおよびｎｍＣＲＣにおいてＭＳＩを同定するためのＦＤＡ認可のＮＧＳを基にした診断テストは、ゴールドスタンダードの参照法と比較された場合に不正確な結果を示すことが実証される。重要なこととして、この誤診には、ＩＣＩに対して陽性反応を示したが、ＩＨＣおよびＭＳＩ ＰＣＲ法を参照せずにＭＳＩＳｅｎｓｏｒのみがＭＳＩスクリーニングに用いられた場合は処置されなかったであろう、ｍＣＲＣ患者３名が含まれていた。結論として、全ての試料からの全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）データが、ＣＲＣおよび他の原発腫瘍の型におけるＭＳＩゲノムシグナルの検出を改善するためにさらに分析された。これにより発明者らは、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界を同定することができ、その後、新たに最適化されたアルゴリズム、即ちＭＳＩＣａｒｅを設計および検証することができた。ＣＲＣおよび非ＣＲＣ腫瘍におけるＭＳＩ検出のためのＭＳＩＣａｒｅの高い正確度が、汎癌においてＭＳＩを評定するための将来の参照テストになることを可能にするはずである。
【0005】
このように本発明は、特に、腫瘍試料と、入手可能なら正常試料と、からＤＮＡを抽出してシークエンシングすること、およびＭＮＲの解析を操作すること、を含む、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法に関する。詳細には本発明は、特許請求の範囲により定義される。
【課題を解決するための手段】
【0006】
従って本発明者らは、患者からの腫瘍試料が入手可能な場合に、そして任意選択で前記患者からの正常試料もまた入手可能な場合に、用いられ得る方法を開発した。
【0007】
このため本発明は、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料と、入手可能ならば正常試料と、からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、または対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する、腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）正常試料が入手可能であるか否かに応じて各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0008】
特別な態様において、本発明は、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料と、入手可能ならば正常試料と、からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、または対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する、腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）正常試料が入手可能であるか否かに応じて各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）ｉｖ）で計算されたＴＰを加味して調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0009】
腫瘍試料および正常試料が、患者から入手可能である場合、本発明の方法は、以下のとおり記載される。
【0010】
このため本発明の第一の実施形態は、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、ならびにｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0011】
この特別な実施形態において、本発明は、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）ｉｖ）で計算されたＴＰを加味して調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、ならびにｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0012】
本発明の第一の実施形態によれば、「前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること」は、この方法では、患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するＭＮＲのみが考慮されるが、腫瘍試料では、対応するＭＮＲが、どんなサイズであってもシークエンシングされることを表す。例えば特定の座位で、正常試料中の１２核酸のＭＮＲがシークエンシングされ、腫瘍試料では、同じくシークエンシングされる対応するＭＮＲは、例えば変異に応じて、１１核酸または１０核酸の長さを有し得る。
【0013】
本発明の第一の実施形態によれば、正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列の数（Ｎ）は、これらの反復が正常試料および腫瘍試料の両方で少なくとも２０のマッピングリードによりカバーされる場合には、本発明による方法において考慮される。
【0014】
本明細書で用いられる用語「Δ比」は、正常試料と比較した腫瘍試料におけるリードの数の推定を表し、以下のとおり計算される：各ＭＮＲについて、正常組織での正規化リード数が、各ＭＮＲでの腫瘍組織での正規化リード数から差し引かれる［Δ比＝％腫瘍－％正常］。例えば特定の座位について、正常試料において２０ＡのＭＮＲのリードが９８、および１９ＡのＭＮＲのリードが２であり、腫瘍試料において２０ＡのＭＮＲのリードが９０、および１９ＡのＭＮＲのリードが１０である場合、Δ比は、ＭＮＲ １９Ａで１０－２＝８となる。
【0015】
その場合、座位の全てで、ＭＳＩ指数は、各ＭＮＲのΔ比の合計となる。
【0016】
本明細書で用いられる、「ＭＳＩ指数」または「ＭＳＩシグナル」または「ＭＳＩｇ」は、全ての候補ＭＮＲのΔ比の値の合計に対応する。
【0017】
本明細書で用いられる用語「腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）」は、正常組織による腫瘍への混入の割合％の推定値を表し、以下のとおり本発明の第一の実施形態により計算される：前記患者の正常試料において１４以上（＝１４核酸の長さ以上；Ｊｏｎｃｈｅｒｅ ｅｔ ａｌ．２０１８参照）のＭＮＲおよび腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲであって、正常組織で少なくとも２０リード、腫瘍試料で少なくとも３０リードによりカバーされるＭＮＲで得られるＭＳＩ指数の中央値をとること。
【0018】
幾つかの実施形態において、１４または１３のＭＮＲから、前記ＭＮＲの変異頻度は高く、それゆえスコアの決定が、より精密になる。特にＴＰは、１４のＭＮＲで充分に効果的である。
【0019】
本発明によれば、１４以上のＭＮＲが、この座位の中にあり得る：
ｃｈｒ７：１２１０９９９０８－１２１０９９９２３、ｃｈｒ２：１１９６４７０５３－１１９６４７０６７、ｃｈｒ２：４４３１８０９５－４４３１８１１０、ｃｈｒ１：１００２６７６５１－１００２６７６６５、ｃｈｒ１：２１４６５３４６７－２１４６５３４８２。
ｃｈｒ７：１２１０９９９０８－１２１０９９９２３、ｃｈｒ２：１１９６４７０５３－１１９６４７０６７、ｃｈｒ２：４４３１８０９５－４４３１８１１０、ｃｈｒ１：１００２６７６５１－１００２６７６６５、ｃｈｒ１：２１４６５３４６７－２１４６５３４８２。
【0020】
本明細書で用いられる用語「調整Δ比」は、ＴＰを加味したΔ比の正規化を意味し、以下のとおり計算される：調整Δ比＝特定のＭＮＲでのΔ比×腫瘍試料の推定ＴＰ。該ＭＮＲでの調整Δ比が＜５０％である場合、ＮＭＲが野生型であることを意味し、調整Δ比が≧５０％である場合、ＭＮＲが変異されていることを意味する。
【0021】
本明細書で用いられる用語「ＭＳＩｃａｒｅスコア」は、ＭＮＲのΔ比の総数（＝変異のある調整Δ比＋変異のない調整Δ比）に対する、変異のある調整Δ比のＭＮＲ数の比を表す。結果は、０～１００（％）の間の数である。解析の数に応じて、ＭＳＩ大腸癌のＭＳＩｃａｒｅカットオフは、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％および２５％であり得、より具体的には２０％または２１％である。本発明により、大腸癌では、ＭＳＩｃａｒｅスコアが、２１未満、特に２０未満である場合、大腸癌は、ＭＳＩ大腸癌ではなく、ＭＳＩｃａｒｅスコアが、２１を超える、特に２０を超える場合、大腸癌は、ＭＳＩ大腸癌である。
【0022】
幾つかの実施形態において、純粋なＭＳＩシグナルは、この長いＭＮＲにおいて少なくとも２ｂｐ以上の体細胞欠失を考慮することのみによって捕捉され得る。特に腫瘍試料からのＭＮＲと正常試料からのＭＮＲとの少なくとも２ｂｐの差。
【0023】
本発明の第二の実施形態において、ＭＳＩ癌の診断では、医療専門家が、本発明の方法を実施するために患者から入手可能な正常試料を有していない、という事実に直面する場合がある。彼らは、ＭＳＩ癌を有する疑いのある患者からの腫瘍試料を有し得るに過ぎない。この場合、反復の正常な多型ゾーンの同定は、各反復のフリーデータベースの助けを借りて実行され得る。その場合、腫瘍試料からは、この正常な多型ゾーンの外部で観察された変異型反復のみが考慮される。この多型ゾーンの外部では、正常試料中のリードの数は、零と見なされる。これに関連して、本発明の方法の複数のステップが、これを考慮して実行され得る。
【0024】
こうして幾つかの実施形態において、ＭＳＩＣａｒｅは、腫瘍試料のみにより実現され得る。
【0025】
こうして第二の実施形態において、本発明はまた、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する、腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）ＭＮＲのための正常な多型ゾーンを評価すること、ｉｖ）各ＭＮＲの正常な多型ゾーンの外部のみの腫瘍試料中に出現した変異型ＭＮＲを評価すること、ｖ）腫瘍試料から得られた各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｖｉ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖｉｉ）調整Δ比を計算すること、ｖｉｉｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する（結果の「ＣＲＣの正常試料不含の固形腫瘍におけるＭＳＩｃａｒｅ診断」参照）。
【0026】
この特別な実施形態において、本発明はまた、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する、腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）ＭＮＲのための正常な多型ゾーンを評価すること、ｉｖ）各ＭＮＲの正常な多型ゾーンの外部のみの腫瘍試料中に出現した変異型ＭＮＲを評価すること、ｖ）正常組織中のリードの正規化数が各多型ゾーンの外部で零になることを考慮して、腫瘍試料から得られた各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｖｉ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖｉｉ）調整Δ比を計算すること、ｖｉｉｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0027】
この特別な実施形態において、本発明はまた、必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する、腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）ＭＮＲのための正常な多型ゾーンを評価すること、ｉｖ）各ＭＮＲの正常な多型ゾーンの外部のみの腫瘍試料中に出現した変異型ＭＮＲを評価すること、ｖ）正常組織中のリードの正規化数が各多型ゾーンの外部で零になることを考慮して、腫瘍試料から得られた各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｖｉ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖｉｉ）ｖｉ）で計算されたＴＰを加味して調整Δ比を計算すること、ｖｉｉｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られたＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0028】
本明細書で用いられる「対応する正常試料」または「類似の正常試料」に関係する情報は、ゲノムの反復を参照するデータベース、特にフリーデータベースから得られる。
【0029】
本明細書で用いられる用語「反復」は、特定の座位の反復された核酸（または核酸塩基）の数を表す。そのため用語「反復」は、核酸の長さを表す。例えば反復が、核酸Ａ（アデニン）で１２である場合、これは、核酸Ａが特定の座位で連続して１２回反復されていることを意味する。本発明によれば、本明細書で用いられるとおり、用語「反復」は「マイクロサテライト」と同じ意味である。
【0030】
本明細書で用いられる用語「変異型反復」（または「変異型ＭＮＲ」）は、反復が正常反復（正常試料中に見出される）と比較して変異されていること（１つまたは複数の核酸の欠失または付加）を表す。反復は、例えばＭＳＩ癌に関連して変異されている。
【0031】
本明細書で用いられる用語「非変異型反復」（または「非変異型ＭＭＲ」）は、反復が正常反復（正常試料中で見出される）と比較して変異（１つまたは複数の核酸の欠失または付加）を有さないことを表す。
【0032】
本明細書で用いられる用語「多型」または「多型反復」は、本発明者らが試料中で見出し得る異なる反復サイズを表す。このため「多型ゾーン」は、本発明者らが試料中で見出し得る異なる反復を表し、「正常多型ゾーン」は、本発明者らが正常試料（変異していない）中で見出し得る異なる反復を表す。例えば、所与の反復での正常な状況（またはＭＳＳの状況）では、前記反復は、１５または１６核酸のサイズを有し得る。ＭＳＩの状況では、同じ反復が、１３、１４、１５または１６核酸のサイズを有し得る。このため、この例において、正常試料での正常多型ゾーンは、１５～１６の間であり、１３または１４核酸の反復全てが、変異型反復と見なされ、このため本発明の第二の態様により考慮される。このため、そして第二の実施形態により、Δ比は、上記と同じ方法を利用して計算される。例えば、多型ゾーンの外部で同定される変異では、％正常率が、零（０）と等しくなり得て、このためΔ比は、先に記載された％腫瘍率と等しくなり得る。
【0033】
本発明の第二の実施形態によれば、正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列の数（Ｎ）は、これらの反復が腫瘍試料のみで少なくとも２０のマッピングリードによりカバーされていれば、本発明による方法において考慮される。
【0034】
本発明の第二の実施形態によれば、腫瘍純度は、以下のとおり計算される：（例えばデータベースの助けを借りて得られた）正常試料中の１４以上（＝１４核酸の長さ以上）のＭＮＲと、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中にあり腫瘍試料で少なくとも３０リードによりカバーされる、対応するＭＮＲと、で得られたＭＳＩ指数の中央値をとること。
【0035】
本明細書で用いられる用語「モノヌクレオチド反復」（ＭＮＲ）は、反復が特有の核酸の繰返しのみを有することを表す。例えば核酸Ａでの１２の長さを有するモノヌクレオチド反復は、核酸Ａを連続で１２回繰り返すことことを意味する。
【0036】
本明細書で用いられる用語「座位」は、特定の遺伝子または遺伝子マーカが置かれた染色体上の特定の固定位置に関する。座位という用語は、用語「ＭＮＲ」または「マーカ」を包含する。
【0037】
本明細書で用いられる用語「反復の数」は、特定の座位の特定の長さ（例えば、１４の連続した核酸Ａ）の「反復」が反復される場合の回数を表す。このため、「反復の数」はまた、所与の反復を含有する座位の数を表す。
【0038】
用いられる用語「リード」は、シークエンシングされる座位（またはＭＮＲまたはマーカ）の部分的、または厳密なコピーであり、核酸の含有量および配列順序を決定するために用いられる、シークエンサ装置により生成されるＤＮＡ断片を表す。
【0039】
特別な実施形態において、シークエンシング後の座位あたりのリード数は、１０～５０００の間、１０～４０００の間、特に１００～４０００の間、特に１０００～３０００の間、より具体的には１５００～２５００の間である。特にシークエンシング後の座位あたりのリード数は、２０、３０、４０、５０、１００、１５０、２００、２５０；３００、３５０または４００である。
【0040】
本明細書で用いられる用語「Ｎ」は、１つの特定のシークエンシングアッセイの反復の最大数を表し、テストされた座位（またはマーカ）の数にも対応する。この数は、１から始まり、より多数までであり得る。
【0041】
特別な実施形態において、本発明によるシークエンシングは、１０～１００００００の間、１０～１００００の間、特に１００～１００００の間、より具体的には１００～１０００の間の座位の数まで実行される。
【0042】
幾つかの実施形態において、この数は、１～１０００の間、特に１～４４１の間、より具体的には２１以上である。特にこの数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１である。
【0043】
幾つかの実施形態において、該方法のより良好なロバスト性のために、シークエンシングされた反復の数は、少なくとも２１である。
【0044】
幾つかの実施形態において、存在するマーカが多いほど、テストがより最適かつロバストになる。
【0045】
本発明の方法によれば、モノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）のシークエンシングは、全エクソーム（ＷＥ）または特に座位で実行され得る。
【0046】
幾つかの実施形態において、Ｎ反復の数が、試験され、腫瘍により影響された臓器に応じて、変異したＮの数が変動し得る。
【0047】
本明細書で用いられる用語「試料」は、ＤＮＡ、特に胚性ＤＮＡ、特に癌性ＤＮＡ（癌細胞からのＤＮＡ）を含有するおそれのある、患者から得られた任意の生体試料を指す。典型的には試料としては、固形試料（例えば、生検）または血液、血漿もしくは血清などの体液試料が挙げられるが、これらに限定されない。
【0048】
特別な実施形態において、試料は、正常試料または腫瘍試料である。
【0049】
本明細書で用いられる用語「正常試料」は、健常組織からのＤＮＡを指す。特に、正常試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または粘液である。
【0050】
本発明によれば、「正常試料」はまた、変異（ＭＳＩ癌）を含有する腫瘍試料と比較して、非癌性細胞または癌性細胞（ＭＳＳ癌）から得られた、「健常試料」または「野生型試料」、即ち、変異を含まない試料を意味する。
【0051】
本明細書で用いられる用語「腫瘍試料」は、腫瘍ＤＮＡ、特に循環腫瘍ＤＮＡ初代血液細胞（ＰＢＣ）を含有する任意の生体試料を指す。特別な実施形態において、試料は、腫瘍循環細胞であるか、または腫瘍塊である。特別な実施形態において、ＰＢＭＣまたはＰＢＣから得られた胚性ＤＮＡは、ＭＳＩ癌を診断するために用いられる。特別な実施形態において、試料は、凍結され得るか、または凍結され得ず、試料は、原発腫瘍または転移腫瘍から生成され得る。
【0052】
幾つかの実施形態において、腫瘍試料は、固形腫瘍に対応する。
【0053】
本明細書で用いられる用語「固形腫瘍」は、当該技術分野における一般的意味を有し、通常は嚢胞または液体領域（例えば、生検）を含有しない組織の異常な塊に関する。固形腫瘍は、良性（癌でない）または悪性（癌）であり得る。固形腫瘍の異なる型は、それらを形成する細胞の型について命名される。固形腫瘍の例は、肉腫および癌腫である。
【0054】
幾つかの実施形態において、腫瘍試料は、液体腫瘍に対応する。
【0055】
本明細書で用いられる用語「液体腫瘍」は、当該技術分野における一般的意味を有し、血液、骨髄またはリンパ節中に生じる腫瘍に関する。異なる液体腫瘍としては、白血病、リンパ腫および骨髄腫の型が挙げられる。
【0056】
本明細書で用いられる用語「ＭＳＩ癌」は、不安定性が少なくとも２種のマイクロサテライトマーカで検出されることを表す。対照的に、不安定性が、１種のマイクロサテライトマーカで検出される、または全く検出されない場合、前記癌は、「ＭＳＳ癌」である。この定義は、診断がペンタプレックス法により実行された場合に限り、価値がある（例えば、Ｓｕｒａｗｅｅｒａ Ｎ ｅｔ ａｌ．， Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｕｍｏｒ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｕｓｉｎｇ ｆｉｖｅ ｑｕａｓｉｍｏｎｏｍｏｒｐｈｉｃ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ ａｎｄ ｐｅｎｔａｐｌｅｘ ＰＣＲ． Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ． ２００２、またはＢｕｈａｒｄ Ｏ ｅｔ ａｌ．， Ｍｕｌｔｉｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ ｉｎ ｆｉｖｅ ｍｏｎｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｒｅｐｅａｔｓ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｙｉｔｙ ｓｔａｔｕｓ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｔｕｍｏｒｓ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００６を参照）。「ＭＳＳ癌」は、安定したマイクロサテライトを有する癌を表す。「ＭＳＩ癌」は、マイクロサテライトを不安定にさせる癌を指す。
【0057】
特に本発明の方法は、ＭＳＳ癌よりＭＳＩ癌を区別するのに有用である。
【0058】
幾つかの実施形態において、ＭＳＩｃａｒｅは、欠損タンパク質にかかわらず、ＭＳＩ診断のために実行され得る。
【0059】
特にＭＳＩｃａｒｅは、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２のような遺伝子が欠損している（例えば、変異または非機能的である）状況で用いられ得る。
【0060】
本明細書で用いられる用語「患者」または「対象」は、哺乳動物を表す。典型的には、本発明による患者は、ＭＳＩ癌に罹った任意の対象（特にヒト）を指す。
【0061】
本明細書で用いられる用語「核酸」または「核酸塩基」は、当該技術分野における一般的意味を有し、コーディングまたは非コーディング核酸配列を指す。核酸としては、ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）およびＲＮＡ（リボ核酸）の核酸を含む。このため核酸の例としては、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、およびｓｎＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。このため核酸は、ゲノム（即ち、核ゲノムまたはミトコンドリアゲノム）のコーディングおよび非コーディング領域を包含する。
【0062】
特別な実施形態において、特定の反復内の核酸の長さ（ｘ）（または数）は、１２～３０の間、特に１２～１８の間である。本発明によれば、特定の反復内の核酸の長さ（ｘ）（または数）は、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０であり得る。
【0063】
本明細書で用いられる用語「癌」は、当該技術分野における一般的意味を有し、固形腫瘍および血液由来の腫瘍が挙げられるが、これらに限定されない。癌という用語は、皮膚、組織、臓器、骨、軟骨、血液および血管の疾患を包含する。用語「癌」はさらに、原発癌および転移癌の両方を包含する。癌の例としては、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、または子宮の癌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。加えて癌は、具体的には以下の組織学的型のものであってもよいが、これらに限定されない：新生物、悪性；癌腫；未分化癌；巨細胞および紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛質性上皮癌；移行細胞癌；乳頭状移行細胞癌；腺癌；悪性ガストリノーマ；胆管癌；肝細胞癌；混合型肝癌；柱状腺癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープにおける腺癌；家族性腺癌性大腸ポリポーシス；固形癌；悪性カルチノイド腫瘍；細気管支肺胞腺癌；乳頭腺癌；嫌色素性癌；好酸性細胞癌；酸親和性腺癌；好塩基性細胞癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞性腺癌；乳頭濾胞性腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭漿液嚢胞腺癌；ムチン様嚢胞腺癌；ムチン様腺癌；印環体細胞癌；浸潤管癌；髄質癌；小葉癌；炎症性癌；乳房パジェット病；腺房細胞癌；腺扁平上皮癌；扁平化生を伴う腺癌；悪性胸腺腫；悪性卵巣間質腫瘍；悪性莢膜腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性神経芽腫；セルトリ細胞癌；悪性ライディヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍；悪性パラガングリオーマ；悪性乳腺外パラガングリオーマ；褐色細胞腫；血球管血管肉腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表在拡大型黒色腫；巨大色素母斑における悪性黒色腫；上皮様細胞黒色腫；悪性青色母斑；肉腫；線維肉腫；悪性線維性組織球腫；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；肺胞性横紋筋肉腫；間質肉腫；悪性混合腫瘍；ミューラー管混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；癌肉腫；悪性間葉腫；悪性ブレンナー腫瘍；悪性葉状腫瘍；滑膜肉腫；悪性中皮腫；未分化胚細胞腫；胎生期癌；悪性奇形腫；悪性卵巣甲状腺腫；絨毛癌；悪性中腎腫；血管肉腫；悪性血管内皮腫；カポジ肉腫；悪性血管周囲細胞腫；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨骨肉腫；軟骨肉腫；悪性軟骨芽細胞腫；間葉軟骨肉腫；骨の巨細胞腫瘍；ユーイング肉腫；悪性歯原性腫瘍；エナメル上皮歯牙肉腫；悪性エナメル上皮腫；エナメル上皮線維肉腫；悪性松果体腫；脊索腫；悪性神経膠腫；上衣腫；星状細胞腫；原形質性星状細胞腫；線維性星状細胞腫；星状芽細胞腫；神経膠芽細胞腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽細胞腫；始原神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽腫；網膜芽腫；嗅覚神経原性腫瘍；悪性髄膜腫；神経線維肉腫；悪性神経鞘腫；悪性顆粒細胞腫瘍；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキンリンパ腫；側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；大細胞型びまん性悪性リンパ腫；濾胞性悪性リンパ腫；菌状息肉腫；他の明記された非ホジキンリンパ腫；悪性組織球増加症；多発性骨髄腫；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ様白血病；プラズマ細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；肥満細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄性肉腫；ヘアリーセル白血病；リンチ症候群（遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）症候群として知られる）およびＣＭＭＲＤ（体質性ミスマッチ修復機能欠損）症候群。幾つかの実施形態において、患者は、大腸癌、より具体的には転移性大腸癌に罹患している。
【0064】
特別な実施形態において、癌は、転移癌である。
【0065】
特別な実施形態において、癌は、大腸癌、胃癌または子宮内膜癌である。
【0066】
特別な実施形態において、癌は、転移性大腸癌、転移性胃癌または転移性子宮内膜癌である。
【0067】
一実施形態において、結果を患者に伝達する更なるステップが、本発明の方法に追加されてもよい。
【0068】
特別な実施形態において、先に記載された方法は、ＭＳＳ癌をＭＳＩ癌と区別することを可能にする。
【0069】
本発明によれば、該方法は、エクスビボ法またはインビトロ法である。
【0070】
本発明のＭＳＩＣａｒｅは、入力データを操作して出力を作成することにより機能を実施する１つまたは複数のコンピュータプログラムを実行する１つまたは複数のプログラム可能なプロセッサにより実行され得る。アルゴリズムもまた、特別な目的の論理回路、例えばＦＰＧＡ（現場でプログラム可能なゲートアレイ）またはＡＳＩＣ（特定用途向け集積回路）により実施され得て、装置もまた該論理回路として実装され得る。コンピュータプログラムの実行に適したプロセッサとしては、例えば一般目的および特定目的の両方のマイクロプロセッサ、ならびに任意の種類のデジタルコンピュータの任意の１つまたは複数のプロセッサが挙げられる。一般にプロセッサは、リードオンリーメモリもしくはランダムアクセスメモリ、またはその両方から命令およびデータを受け取る。コンピュータの本質的要素が、命令を実施するためのプロセッサと、命令およびデータを保存するための１つまたは複数のメモリデバイスと、になる。一般にコンピュータはまた、データを保存するために１つまたは複数の大量保存デバイス、例えば磁気、光磁気ディスク、または光ディスクを含む、あるいはそれらの保存デバイスからデータを受け取る、もしくはそれかにデータを送信する、またはその両方のために動作可能に連結される。しかし、コンピュータは、そのようなデバイスを有する必要はない。その上コンピュータは、別のデバイスに埋め込まれる可能性がある。コンピュータプログラムの命令およびデータを保存するのに適したコンピュータ可読媒体としては、例えば半導体メモリデバイス、例えばＥＰＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭおよびフラッシュメモリデバイス；磁気ディスク、例えば内部ハードディスクまたはリムーバブルディスク；光磁気ディスク；ならびにＣＤ－ＲＯＭおよびＤＶＤ－ＲＯＭディスクをはじめとする不揮発性メモリ、媒体およびメモリデバイスの全ての形態が挙げられる。プロセッサおよびメモリは、特定目的の論理回路により補足され得る、または該回路の中に組み込まれ得る。ユーザとの対話を提供するために、本発明の実施形態は、情報をユーザに提示するためのディスプレイデバイス、例えば非限定的例として、ＣＲＴ（陰極線管）またはＬＣＤ（液晶ディスプレイ）モニタと、ユーザが入力情報をコンピュータに提供し得るキーボードおよびポインティングデバイス、例えばマウスまたはトラックボールと、を有するコンピュータに実装され得る。デバイスの他の種類もまた、ユーザとの対話を提供するために用いられ得て、例えばユーザに提供されるフィードバックが、感覚フィードバック、例えば視覚的フィードバック、聴覚的フィードバック、または触覚フィードバックの任意の形態であり得て、ユーザからの入力情報が、音響、言語、触覚の入力情報をはじめとする任意の形態で受け取られ得る。したがって幾つかの実施形態において、アルゴリズムは、バックエンドコンポーネントを、例えばデータサーバとして、含む、またはミドルウェアコンポーネント、例えばアプリケーションサーバを含む、またはフロントエンドコンポーネント、例えばユーザが本発明の実装と対話し得るグラフィカルユーザインターフェースもしくはＷｅｂブラウザを有するクライアントコンピュータを含む、または１つもしくは複数のそのようなバックエンド、ミドルウエア、もしくはフロントエンドコンポーネントの任意の組合わせを含む、コンピュータシステムに実装され得る。該システムのコンポーネントは、デジタルデータ通信、例えば通信網の任意の形態または媒体により相互に接続され得る。通信網の例としては、ローカルエリアネットワーク（「ＬＡＮ」）およびワイドエリアネットワーク（「ＷＡＮ」）、例えばインターネットが挙げられる。コンピューティングシステムは、クライアントおよびサーバを含み得る。クライアントおよびサーバは一般に、互いに遠隔であり、典型的には通信網を通して対話する。クライアントおよびサーバの関連性は、各コンピュータで実行し、互いにクライアント－サーバ関連性を有するコンピュータプログラムのおかげで成り立つ。
【0071】
本発明の別の目的は、コンピュータにより実装された場合に先に記載された方法を実行するためのコード命令を含むコンピュータプログラム製品である。
【0072】
ＭＳＩｃａｒｅスコアの比較に用いられる所定の参照値は、本明細書に記載されたとおり決定され得る「カットオフ」値または「閾」値を含んでもよい。ＭＳＩｃａｒｅスコアレベルの各参照（「カットオフ」）値は、例えば
ａ）癌に罹患した患者からの試料の採取物を提供するステップと；
ｂ）ステップａ）で提供された採取物中に含有される各試料のＭＳＩｃａｒｅを決定するステップと；
ｃ）腫瘍組織試料を前記レベルに従ってランクづけするステップと；
ｄ）前記試料を、発現レベルに従ってランクづけされたメンバーの数を増加させるか、または減少させるサブセットの対に分類するステップと；
ｅ）ステップａ）で提供された各試料について、対応する癌患者の実際の臨床転帰に関係する情報を提供するステップと；
ｆ）試料のサブセットの各対について、カプラン・マイヤーの生存率％曲線を得るステップと；
ｇ）試料のサブセットの各対について、両方のサブセットの間の統計学的有意性（ｐ値）を計算するステップと；
ｈ）レベルの参照値として、ｐ値が最小となるレベルの値を選択するステップと、
を含む方法を実行することにより予め決定されてもよい。
ａ）癌に罹患した患者からの試料の採取物を提供するステップと；
ｂ）ステップａ）で提供された採取物中に含有される各試料のＭＳＩｃａｒｅを決定するステップと；
ｃ）腫瘍組織試料を前記レベルに従ってランクづけするステップと；
ｄ）前記試料を、発現レベルに従ってランクづけされたメンバーの数を増加させるか、または減少させるサブセットの対に分類するステップと；
ｅ）ステップａ）で提供された各試料について、対応する癌患者の実際の臨床転帰に関係する情報を提供するステップと；
ｆ）試料のサブセットの各対について、カプラン・マイヤーの生存率％曲線を得るステップと；
ｇ）試料のサブセットの各対について、両方のサブセットの間の統計学的有意性（ｐ値）を計算するステップと；
ｈ）レベルの参照値として、ｐ値が最小となるレベルの値を選択するステップと、
を含む方法を実行することにより予め決定されてもよい。
【0073】
例えばＭＳＩｃａｒｅスコアは、患者１００名の膵臓癌試料１００例について評定されている。１００例の試料は、それらの発現レベルに従ってランクづけされる。試料１は、最良の発現レベルを有し、試料１００は、最低の発現レベルを有する。最初の群分けは、２つのサブセット、つまり一方の側で試料番号１を、そして他方の側で他の９９の試料を提供する。次の群分けは、一方の側で試料１および２を、そして他方の側で残り９８の試料を提供し、最後の群分けが一方の側で試料１～９９を、そして他方の側で試料番号１００を提供するまで行われる。対応する膵臓癌患者の実際の臨床転帰に関係する情報に従って、カプラン・マイヤー曲線が、２つのサブセットの９９群それぞれについて作成される。９９群のそれぞれについても、両方のサブセットの間のｐ値が、計算された。
【0074】
最小ｐ値の基準に基づく識別が最強になるように、参照値が選択される。言い換えれば、ｐ値が最小になる両方のサブセットの間の境界に対応する発現レベルが、参照値と見なされる。参照値が必ずしも発現レベルの中央値でないことが、留意されなければならない。
【0075】
日常の作業において、参照値（カットオフ値）は、膵臓癌試料を、つまり対応する患者を識別するために本発明の方法で用いられてもよい。
【0076】
時間の関数としての生存率％のカプラン・マイヤー曲線が、処置後の特定量の時間にわたり生存した患者の割合を測定するために一般に用いられ、当業者に周知である。
【0077】
当業者はまた、タンパク質の発現レベルの同じ評価技術が当然ながら、参照値を得るために使用され、そしてその後に本発明の方法に供される患者のタンパク質の発現レベルの評定に使用されなければならないことを理解している。
【0078】
本発明によれば、ＭＳＩＣａｒｅカットオフは、最初のコホートにおいて、感度と特異度の合計の最大値が得られる丸め値を選択することにより決定された（受信者動作特性（ＲＯＣ）解析）。解析の数に応じて、ＭＳＩ大腸癌のＭＳＩｃａｒｅカットオフは、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％および２５％の間であり得て、より具体的には２０％または２１％である。これを実行するために、本発明者らは、異なる使用可能な方法のうちで、バイナリ分類タスクにおいて特定のメトリクスを最適化するカットポイントを推定して、ブーストラッピングを利用して性能を検証する、「ｃｕｔｐｏｉｎｔｒ」パッケージ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｔｈｉｅ１ｅ／ｃｕｔｐｏｉｎｔｒ） を適用した。本明細書で用いられる、≪特定のメトリクス≫は、感度と特異度の合計を表す。
【0079】
本発明の別の態様は、必要とする患者においてＭＮＲの変異を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ならびにｖｉ）調整Δ比が＜５０％であればＭＮＲが野生型であると結論づけて、調整Δ比が≧５０％であればＭＮＲが変異していると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0080】
この特別な態様によれば、本発明はまた、必要とする患者においてＭＮＲの変異を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の正常試料のＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の腫瘍試料のＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）ｉｖ）で計算されたＴＰを加味して調整Δ比を計算すること、ならびにｖｉ）調整Δ比が＜５０％であればＭＮＲが野生型であると結論づけて、調整Δ比が≧５０％であればＭＮＲが変異していると結論づけること、を含む、方法に関する。
【0081】
本発明の方法によれば、変異は、癌細胞の出現に関与する。
【0082】
一実施形態において、変異は、ＭＳＩ癌の出現に関与する反復またはマイクロサテライトである。
【0083】
シークエンシング法：
本発明によれば、シークエンシングステップは、非限定的にマキサム・ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５， ４９９－５６０ （１９８０））を用いた化学的シークエンシング；サンガー法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３－６７ （１９７７））を用いた酵素的シークエンシング；質量分析シークエンシング；チップを基にした技術を用いたシークエンシング；およびリアルタイム定量ＰＣＲをはじめとする任意の方法により遂行されてもよい。
本発明によれば、シークエンシングステップは、非限定的にマキサム・ギルバート法（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５， ４９９－５６０ （１９８０））を用いた化学的シークエンシング；サンガー法（Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ７４， ５４６３－６７ （１９７７））を用いた酵素的シークエンシング；質量分析シークエンシング；チップを基にした技術を用いたシークエンシング；およびリアルタイム定量ＰＣＲをはじめとする任意の方法により遂行されてもよい。
【0084】
化学的シークエンシングにおいて、塩基特異性修飾が、放射性標識または蛍光標識されたＤＮＡ断片の塩基特異性切断をもたらす。４種の異なる塩基特異的切断反応を利用して、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）により長さに従って分離されたネスト化断片の４セットが、生成される。ゲル内の各バンド（断片）は、塩基特異的切断事象に由来するため、オートラジオグラフィーの後、配列が直接読み出され得る。こうして４つの「ラダー」の中の断片の長さが、ＤＮＡ配列内の特定の位置に直接変換される。
【0085】
酵素シークエンシングでは、プライマー／テンプレート系で開始してプライマーを未知のＤＮＡ配列エリア内に延長し、それによりテンプレートをコピーして、連鎖停止試薬の存在下で、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓからのＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、または改変Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ（Ｔａｂｏｒ ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｌ． ＵＳＡ ８４， ４７６７－４７７１ （１９８７））などのＤＮＡポリメラーゼにより相補鎖を合成することにより、４つの塩基特異的なＤＮＡ断片のセットが形成される。
【0086】
ＤＮＡシークエンシングのための複数の新しい方法（ハイスループットシークエンシング（ＨＴＳ）法）が、１９９０年代中期～後期に開発され、２０００年までに市販のＤＮＡシークエンサに実装された。これらはひとまとめに、「次世代」または「第二世代」シークエンシング法と呼ばれた。これらのＨＴＳとして、一分子リアルタイムシークエンシング、イオン半導体、パイロシークエンシング、合成によるシークエンシング、ライゲーションによるシークエンシング、ナノポアシークエンシング、連鎖停止およびハイブリダイゼーションによるシークエンシングが挙げられるが、これに限定されない。これらの方法の幾つかは、全遺伝子シークエンシング（ＷＧＳ）、全エクソームシークエンシング（ＷＥＳ）またはターゲットシークエンシングを可能にする。
【0087】
特別な実施形態において、本発明の方法によるシークエンシングは、ゲノム内の特定の領域パネル、本明細書ではモノヌクレオチドマイクロサテライト、がシークエンシングされる手段により、ターゲットの多量並行シークエンシングアプローチを利用して実施される第二世代シークエンシング（ＮＧＳ）のようなウルトラディープシークエンシングである（例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ， Ｓ ａｎｄ ａｌｌ， ２０１６． Ｃｏｍｉｎｇ ｏｆ ａｇｅ： Ｔｅｎ ｙｅａｒｓ ｏｆ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ参照）。
【0088】
処置の方法
別の態様において、本発明はまた、本発明の方法によりＭＳＩ癌を有すると同定された患者において癌を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量の放射線療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合わせを施すことを含む、方法に関する。
別の態様において、本発明はまた、本発明の方法によりＭＳＩ癌を有すると同定された患者において癌を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量の放射線療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合わせを施すことを含む、方法に関する。
【0089】
本明細書で用いられる用語「処置」または「処置する」は、疾患に罹るリスクがある、または該疾患に罹っている疑いがある対象、および病気である、または疾患もしくは医学的状態に罹患していると診断された対象の処置をはじめとする防護的または予防的処置、および治癒的処置または疾患修飾処置の両方を指し、臨床的再燃の抑制を含む。処置は、障害または再発した障害を予防する、治癒する、発病を遅延させる、重症度を低減する、または１つもしくは複数の症状を好転させるため、あるいはそのような処置の非存在下で予測を超えて対象の生存を延長させるために、医学的障害を有する対象、または該障害を最終的に獲得し得る対象に施されてもよい。「治療レジメン」は、病気の処置パターン、例えば治療中に用いられる投薬パターンを意味する。治療レジメンは、誘導レジメンおよび維持レジメンを含んでもよい。語句「誘導レジメン」または「誘導期間」は、疾患の初回処置に用いられる治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。誘導レジメンの一般的ゴールは、処置レジメンの初回期間に高レベルの薬物を対象に提供することである。誘導レジメンは、「負荷レジメン」を用いてもよく（一部または全体）、負荷レジメンは、維持レジメンの間に医師が用いるより大容量の薬物を投与すること、維持レジメンの間に医師が投与するより頻繁に薬物を投与すること、またはそれらの両方を含んでもよい。語句「維持レジメン」または「維持期間」は、病気の処置の間、対象の維持のために、例えば対象を長期間（数か月または数年）の寛解を保持するために、用いられる治療レジメン（または治療レジメンの一部）を指す。維持レジメンは、連続治療（例えば、薬物を規則的間隔で、例えば週１回、月１回、年１回などで投与すること）または間欠的治療（例えば、断続的処置、間欠的処置、再燃時の処置、特別な所定の基準へ［例えば、疾患の発現など］の到達時の処置）を利用してもよい。
【0090】
用語「化学療法薬」は、腫瘍成長を阻害するのに効果的である化合物を指す。化学療法薬の例としては、チオテパおよびシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾデパ、カルボコン、メツレデパおよびウレデパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチロールメラミンをはじめとするエチレンイミンおよびメチラメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体ＫＷ－２１８９およびＣＢＩ－ＴＭＩを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチイン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロルエタミン、メクロルエタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；エンジイン抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシン（１１およびカリケアマイシン２１１；例えば、Ａｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）参照）などの抗生物質；ダイネマイシンＡなどのダイネマイシン；エスペラマイシン；およびネオカルジノスタチン発色団および関連色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オースラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシンおよびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサートおよび５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗物質；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、５－ＦＵなどのピリミジン類似体；カルステロン、ドロモスタノロンプロピオナート（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗アドレナール；フロリン酸などの葉酸補給剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトザントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ－２毒素、ベルラクリンＡ、ロリジンＡおよびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ニュージャージー州プリンストン）およびドキセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，フランス アントニー）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセロダ；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸または誘導体が挙げられる。同じくこの定義に含まれるのは、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害剤４（５）－イミダゾール、４－ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストンおよびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）をはじめとする抗エストロゲン；ならびにフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリドおよびゴセレリンなどの抗アンドロゲンなどの腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤；ならびに上記のいずれかの医薬的に許容できる塩、酸または誘導体である。
【0091】
患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけられる場合、医師は、患者に標的療法を施すことを選択することができる。
【0092】
標的癌治療は、癌の成長、進行、および伝播に関与する特異的分子（「分子ターゲット」）で妨害することにより、癌の成長および伝播を遮断する薬物または他の物質である。標的癌治療は、「分子標的薬」、「分子標的療法」、「精密医療」、または類似の名称で呼ばれる場合がある。
【0093】
幾つかの実施形態において、標的治療は、患者にチロシンキナーゼ阻害剤を投与することからなる。用語「チロシンキナーゼ阻害剤」は、受容体および／または非受容体チロシンキナーゼの選択的または非選択的阻害剤として作用する種々の治療薬または薬物のいずれかを指す。チロシンキナーゼ阻害剤および関連の化合物は、当該技術分野で周知であり、全体として参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号に記載される。チロシンキナーゼ阻害剤に関係する化合物がチロシンキナーゼ阻害剤の効果を反復すること、例えば関連の化合物が、チロシンキナーゼのチロシンキナーゼ阻害剤と同じ効果を生じるためにチロシンキナーゼシグナル伝達経路の異なるメンバーに作用することは、当業者に認識されよう。本発明の実施形態の方法での使用に適したチロシンキナーゼ阻害剤および関連の化合物の例としてはダサチニブ（ＢＭＳ－３５４８２５）、ＰＰ２、ＢＥＺ２３５、サラカチニブ、ゲフィチニブ（Ｉｒｅｓｓａ）、スニチニブ（Ｓｕｔｅｎｔ；ＳＵ１１２４８）、エルロチニブ（Ｔａｒｃｅｖａ；ＯＳＩ－１７７４）、ラパチニブ（ＧＷ５７２０１６；ＧＷ２０１６）、カネルチニブ（ＣＩ １０３３）、セマキシニブ（ＳＵ５４１６）、バタラニブ（ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２２５８４）、ソラフェニブ（ＢＡＹ ４３－９００６）、イマチニブ（Ｇｌｅｅｖｅｃ；ＳＴＩ５７１）、レフルノミド（ＳＵ１０１）、バンデタニブ（Ｚａｃｔｉｍａ；ＺＤ６４７４）、ＭＫ－２２０６（８－［４－アミノシクロブチル）フェニル］－９－フェニル－１，２，４－トリアゾロ［３，４－ｆ］［１，６］ナフチリジン－３（２Ｈ）－オン塩酸）、それらの誘導体、それらの類似物、およびそれらの組合わせが挙げられるが、これらに限定されない。本発明における使用に適した追加のチロシンキナーゼ阻害剤およびの関連の化合物は、例えば、米国特許出願公開第２００７／０２５４２９５号、米国特許第５，６１８，８２９号、同第５，６３９，７５７号、同第５，７２８，８６８号、同第５，８０４，３９６号、同第６，１００，２５４号、同第６，１２７，３７４号、同第６，２４５，７５９号、同第６，３０６，８７４号、同第６，３１３，１３８号、同第６，３１６，４４４号、同第６，３２９，３８０号、同第６，３４４，４５９号、同第６，４２０，３８２号、同第６，４７９，５１２号、同第６，４９８，１６５号、同第６，５４４，９８８号、同第６，５６２，８１８号、同第６，５８６，４２３号、同第６，５８６，４２４号、同第６，７４０，６６５号、同第６，７９４，３９３号、同第６，８７５，７６７号、同第６，９２７，２９３号、および同第６，９５８，３４０号に記載されており、それらの全てが、全体として参照により本明細書に組み入れられる。特定の実施態様において、チロシンキナーゼ阻害剤は、経口投与されていて、少なくとも１つの第Ｉ相臨床試験、より好ましくは少なくとも１つの第ＩＩ相臨床試験、更により好ましくは少なくとも１つの第ＩＩＩ相臨床試験の対象であり、最も好ましくは少なくとも１種の血液学的または腫瘍学的適応症のためにＦＤＡにより認可されている、低分子キナーゼ阻害剤である。そのような阻害剤の例としては、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、カネルチニブ、ＢＭＳ－５９９６２６（ＡＣ－４８０）、ネラチニブ、ＫＲＮ－６３３、ＣＥＰ－１１９８１、イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ、ＡＺＭ－４７５２７１、ＣＰ－７２４７１４、ＴＡＫ－１６５、スニチニブ、バタラニブ、ＣＰ－５４７６３２、バンデタニブ、ボスチニブ、レスタウルチニブ、タンズチニブ、ミドスタウリン、エンザスタウリン、ＡＥＥ－７８８、パゾパニブ、アキシチニブ、モタセニブ、ＯＳＩ－９３０、セディラニブ、ＫＲＮ－９５１、ドビチニブ、セリシクリブ、ＳＮＳ－０３２、ＰＤ－０３３２９９１、ＭＫＣ－Ｉ（Ｒｏ－３１７４５３；Ｒ－４４０）、ソラフェニブ、ＡＢＴ－８６９、ブリバニブ（ＢＭＳ－５８２６６４）、ＳＵ－１４８１３、テラチニブ、ＳＵ－６６６８、（ＴＳＵ－６８）、Ｌ－２１６４９、ＭＬＮ－８０５４、ＡＥＷ－５４１、およびＰＤ－０３２５９０１が挙げられるが、これらに限定されない。
【0094】
患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけられる場合、医師は、患者に免疫療法薬を投与することを選択することができる。
【0095】
本明細書で用いられる用語「免疫療法薬」は、直接的または間接的に、癌細胞に対する身体の免疫反応を増強する、刺激する、もしくは増加させる、および／または他の抗癌療法の副作用を減少させる、化合物、組成物、または処置を指す。このため、免疫療法は、直接的にまたは間接的に、癌細胞に対する免疫系の反応を刺激する、もしくは増強する、および／または他の抗癌剤により起こり得る副作用を減少させる治療である。免疫療法はまた、当該技術分野において、免疫療法、生物学的治療、生物学的応答修飾療法、および生物療法と称される。当該技術分野において公知の一般的な免疫療法薬の例としては、サイトカイン、癌ワクチン、モノクローナル抗体、および非サイトカインアジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。あるいは免疫療法処置は、患者に一定量の免疫細胞（Ｔ細胞、ＮＫ細胞、樹状細胞、Ｂ細胞など）を投与することからなってもよい。
【0096】
免疫療法薬は、非特異的であり得て、即ち、ヒトの身体が癌細胞の成長および／もしくは伝播と戦うのにより効果的になるように、全体的に免疫系をブーストすることができ、または免疫療法薬は、特異的であり得て、即ち、癌細胞自体を標的化することができ、免疫療法レジメンは、非特異的免疫療法薬と特異的免疫療法薬との使用を組み合わせ得る。
【0097】
非特異的免疫療法薬は、免疫系を刺激する、または間接的に改善する物質である。非特異的免疫療法薬は、癌の処置のための主な治療として単独で、および主な治療に加えて使用されてきており、後者の場合、非特異的免疫療法薬は、他の治療（例えば、癌ワクチン）の有効性を増強するアジュバントとして機能する。非特異的免疫療法薬は、この後者の状況において、他の治療、例えば特定の化学療法薬により誘導される骨髄抑制の副作用を低減するのにも機能し得る。非特異的免疫療法薬は、重要な免疫系細胞に作用することができ、サイトカインおよび免疫グロブリンの生成増加などの二次反応を引き起こすことができる。あるいは、該薬剤はそれ自体が、サイトカインを含むことができる。非特異的免疫療法薬は、一般的にはサイトカインまたは非サイトカインアジュバントとして分類される。
【0098】
複数のサイトカインは、免疫系をブーストするように設計された一般的な非特異的免疫療法、または他の治療と共に提供されるアジュバントのどちらかとして、癌処置における用途を見出してきた。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、インターロイキン、およびコロニー刺激因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【0099】
本発明により企図されるインターフェロン（ＩＦＮ）としては、一般的な型のＩＦＮ、ＩＦＮ－アルファ（ＩＦＮ－α）、ＩＦＮ－ベータ（ＩＦＮ－β）、およびＩＦＮ－ガンマ（ＩＦＮ－γ）が挙げられる。ＩＦＮは、例えばその成長を緩徐化すること、より正常な挙動の細胞への発達を促進すること、および／または抗原の生成を増加させることにより、免疫系に癌細胞をより容易に認識させ、破壊させること、により、癌細胞に直接作用し得る。ＩＦＮはまた、例えば、血管新生を緩徐化すること、免疫系をブーストすること、ならびに／またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、およびマクロファージを刺激すること、により、癌細胞に間接的に作用し得る。組換えＩＦＮ－アルファは、Ｒｏｆｅｒｏｎ（Ｒｏｃｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）およびＩｎｔｒｏｎ Ａ（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）として市販される。単独または他の免疫療法薬もしくは化学療法薬と併用でのＩＮＦ－アルファの使用は、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、腎臓癌（転移性腎臓癌を含む）、乳癌、前立腺癌、および子宮頸癌（転移性子宮頸癌を含む）をはじめとする様々な癌の処置に有効性を示している。
【0100】
本発明により企図されるインターロイキンとしては、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－１１、およびＩＬ－１２が挙げられる。市販の組換えインターロイキンの例としては、Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）（ＩＬ－２；Ｃｈｉｒｏｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）およびＮｅｕｍｅｇａ（登録商標）（ＩＬ－１２；Ｗｙｅｔｈ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）が挙げられる。Ｚｙｍｏｇｅｎｅｔｉｃｓ， Ｉｎｃ．（Ｓｅａｔｔｌｅ， Ｗａｓｈ．）は現在、同じく本発明の組合わせにおける使用に企図されるＩＬ－２１の組換え形態をテストしている。インターロイキンは、単独で、または他の免疫療法薬もしくは化学療法薬と併用で、腎臓癌（転移性腎臓癌を含む）、黒色腫（転移性黒色腫を含む）、卵巣癌（再発性卵巣癌を含む）、子宮頸癌（転移性子宮頸癌を含む）、乳癌、大腸癌、肺癌、脳癌、および前立腺癌をはじめとする様々な癌の処置に有効性を示している。
【0101】
インターロイキンはまた、様々な癌の処置においてＩＦＮ－アルファとの併用で良好な活性を示している（Ｎｅｇｒｉｅｒ ｅｔ ａｌ．， Ａｎｎ Ｏｎｃｏｌ． ２００２ １３（９）：１４６０－８； Ｔｏｕｒａｎｉｅｔａｌ， Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｏｎｃｏｌ． ２００３ ２１（２１）：３９８７９４）。
【0102】
本発明により企図されるコロニー刺激因子（ＣＳＦ）としては、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦまたはフィルグラスチム）、顆粒球－マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦまたはサルグラモスチム）、およびエリスロポイエチン（エポエチンアルファ、ダルベポイエチン）が挙げられる。１種または複数の成長因子による処置は、伝統的な化学療法を受けている対象において新たな血液細胞の生成を刺激するのに役立ち得る。したがって、ＣＳＦによる処置は、化学療法に関連する副作用を減少させるのに有用になり得て、より高い用量の化学療法薬を使用し得る。様々な組換えコロニー刺激因子、例えば、Ｎｅｕｐｏｇｅｎ（登録商標）（Ｇ－ＣＳＦ；Ａｍｇｅｎ）、Ｎｅｕｌａｓｔａ（ペルフィルグラスチム；Ａｍｇｅｎ）、Ｌｅｕｋｉｎｅ（ＧＭ－ＣＳＦ；Ｂｅｒｌｅｘ）、Ｐｒｏｃｒｉｔ（エリスロポイエチン；Ｏｒｔｈｏ Ｂｉｏｔｅｃｈ）、Ｅｐｏｇｅｎ（エリスロポイエチン；Ａｍｇｅｎ）、Ａｒｎｅｓｐ（エリスロポイエチン）が、市販されている。コロニー刺激因子は、黒色腫、大腸癌（転移性大腸癌を含む）、および肺癌の処置において有効性を示している。
【0103】
本発明の組合わせにおける使用に適した非サイトカインアジュバントとしては、レビマソール、水酸化アルミニウム（ａｌｕｍ）、カルメット・ゲラン桿菌（ＡＣＧ）、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）、ＱＳ－２１、ＤＥＴＯＸ、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）およびジニトロフェニル（ＤＮＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。他の免疫療法薬および／または化学療法薬と併用での非サイトカインアジュバントは、例えば結腸癌および大腸癌（レビマソール（Ｌｅｖｉｍａｓｏｌｅ））；黒色腫（ＢＣＧおよびＱＳ－２１）；腎臓癌および膀胱癌（ＢＣＧ）をはじめとする様々な癌への有効性を実証している。
【0104】
免疫療法薬は、特異的または非特異的ターゲットを有することに加え、能動的であり得る、即ち、身体自身の免疫応答を刺激し得る、またはそれらは、受動的であり得る、即ち身体の外部で作製された免疫系成分を含み得る。
【0105】
受動的な特異的免疫療法は典型的には、癌細胞の表面に見出される特別な抗原に特異的である、または特別な細胞増殖因子に特異的である、１種または複数のモノクローナル抗体の使用を含む。モノクローナル抗体は、例えば、化学療法薬、放射性粒子または毒素などの薬剤に連結またはコンジュゲートされた場合に、特異的な癌の型への対象の免疫反応を増強するために、血管新生に関与する因子などの特異的細胞増殖因子を標的とすることにより、または癌細胞への他の抗癌剤の送達を増強することにより、癌細胞の成長を妨害するために、複数の方法で癌の処置に用いられてもよい。
【0106】
本発明の組合わせに包含させるのに適した癌免疫療法薬として現在使用されているモノクローナル抗体としては、リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標））、トラスツズマブ（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標））、イブリツモマブ・チウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））、トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標））、セツキシマブ（Ｃ－２２５、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））、ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標））、ゲムツズマブ・オゾガミシン（Ｍｙｌｏｔａｒｇ（登録商標））、アレムツズマブ（Ｃａｍｐａｔｈ（登録商標））、およびＢＬ２２が挙げられるが、これらに限定されない。モノクローナル抗体は、乳癌（進行転移性乳癌を含む）、大腸癌（進行および／または転移性大腸癌を含む）、卵巣癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌、黒色腫および脳腫瘍をはじめとする広範囲の癌の処置に用いられる。他の例としては、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、イピリムマブ）、抗ＰＤ１抗体、抗ＰＤＬ１抗体、抗ＴＩＭＰ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗Ｂ７Ｈ３抗体、抗Ｂ７Ｈ４抗体、または抗Ｂ７Ｈ６抗体が挙げられる。
【0107】
本発明によりＣＭＭＲＤまたはＭＳＩ白血病／リンパ腫を有すると診断された患者は、単独もしくは併用で抗ＣＴＬＡ－４、抗ＰＤ１、抗ＰＤ－Ｌ１を含む免疫チェックポイント遮断のような免疫療法、または腫瘍特異性抗原を基にした抗癌ワクチンもしくは樹状細胞ワクチンにより処置され得る。
【0108】
活性特異性免疫療法は、典型的には癌ワクチンの使用を含む。全癌細胞、癌細胞の一部または癌細胞に由来する１種もしくは複数の抗原を含む癌ワクチンが、開発された。単独での、または１種もしくは複数のさらなる免疫もしくは化学療法薬と併用の癌ワクチンは、黒色腫、腎臓癌、卵巣癌、乳癌、大腸癌および肺癌をはじめとする複数の型の癌の処置において調査されている。非特異性免疫療法薬は、身体の免疫反応を増強するための癌ワクチンとの併用において有用である。
【0109】
免疫療法での処置は、Ｎｉｃｈｏｌａｓ Ｐ． Ｒｅｓｔｉｆｏ， Ｍａｒｋ Ｅ． Ｄｕｄｌｅｙ ａｎｄ Ｓｔｅｖｅｎ Ａ． Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ “Ａｄｏｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｃａｎｃｅｒ： ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｒｅｓｐｏｎｓｅ， Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ， Ｖｏｌｕｍｅ １２， Ａｐｒｉｌ ２０１２により記載されたとおり、養子免疫療法からなってもよい。養子免疫療法では、対象の循環リンパ球または腫瘍浸潤リンパ球が、インビトロで単離され、ＩＬ－２などのリンフォカインにより活性化されるか、または腫瘍壊死のための遺伝子を導入され（ｔｒａｎｓｕｄｅｄ）、再投与される（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．， １９８８；１９８９）。活性化リンパ球は、最も好ましくはより早期に血液または腫瘍試料から単離されてインビトロで活性化された（または「増殖された」）対象自身の細胞である。この形態の免疫療法は、黒色腫および腎臓癌の複数の退縮例を生じた。
【0110】
患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけられる場合、医師は、患者に放射線療法薬を投与することを選択することができる。
【0111】
本明細書で用いられる用語「放射線療法薬」は、非限定的に癌を処置する、または好転させるのに効果的である、当業者に公知の任意の放射線療法薬を指すものとする。例えば放射線療法薬は、小線源療法または放射性核種療法で投与される薬物などの薬物であり得る。そのような方法は、場合によりさらに、非限定的に化学療法薬および／または別の放射線療法などの１種または複数の追加的癌治療の実施を含み得る。
【0112】
本発明のキットまたはデバイス：
本発明の更なる目的は、試料からＤＮＡを抽出してシークエンシングするための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキットまたはデバイスに関する。
本発明の更なる目的は、試料からＤＮＡを抽出してシークエンシングするための手段を含む、本発明の方法を実施するためのキットまたはデバイスに関する。
【0113】
幾つかの実施形態において、キットまたはデバイスは、座位あたり少なくとも１組のプライマーを含む。
【0114】
本発明はさらに、以下の図および実施例により示される。しかしこれらの実施例および図は、本発明の範囲を限定するものと解釈されてはならない。
【図面の簡単な説明】
【0115】
【図1】背景および試験計画。ＦＤＡ 食品医薬品局；ＭＳＩ マイクロサテライト不安定；ＣＲＣ 大腸癌；ｍＣＲＣ 転移性大腸癌；ｎｍＣＲＣ 非転移性大腸癌；ＷＥＳ 全エクソームシークエンシング；ＩＣＩ 免疫チェックポイント阻害剤；ＩＨＣ 免疫組織化学的検査。
【図2A】ＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲ状態が過去にゴールドスタンダード参照法で評定されている、転移性および非転移性ＣＲＣの前向きおよび後向きコホートにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒを用いたＭＳＩの再評定。ボックスプロットは、前向きコホート（コホート１、Ｃ１）からの転移性ＣＲＣのＭＳＩ（赤色）患者２５名およびＭＳＳ（青色）患者７７名のＷＥＳから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア）を示す。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（緑色の点線）。非転移性試料が円形で表され、転移性試料が菱形で表される。水平のバープロットは、各コホートの真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図2B】ＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲ状態が過去にゴールドスタンダード参照法で評定されている転移性および非転移性ＣＲＣの前向きおよび後向きコホートにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒを用いたＭＳＩの再評定。ボックスプロットは、後向きコホート（コホート２、Ｃ２）からの非転移性ＣＲＣのＭＳＩ患者８８名（左）および転移性ＣＲＣのＭＳＩ（右）患者２５名のＷＥＳから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア）を示す。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（緑色の点線）。非転移性試料が円形で表され、転移性試料が菱形で表される。水平のバープロットは、各コホートの真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図2C】ＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲ状態が過去にゴールドスタンダード参照法で評定されている転移性および非転移性ＣＲＣの前向きおよび後向きコホートにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒを用いたＭＳＩの再評定。ボックスプロットは、ＭＳＩ患者５１名、ＭＳＩ－Ｌ患者１４名およびＭＳＳ患者５３名（コホート３、Ｃ３）を含むＴＣＧＡ患者１１８名のＷＥＳから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア）を示す。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（緑色の点線）。非転移性試料が円形で表され、転移性試料が菱形で表される。水平のバープロットは、各コホートの真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）、および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図3】ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界を同定することによりＣＲＣにおけるＭＳＩのコンピュータ援助検出を改善する。Ｃ１＋Ｃ２（左）およびＣ３（右）コホートにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアの密度プロット。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から分別するために用いられた（緑色の点線）。隣接するヒストグラムは、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアによる腫瘍試料の分布を表す。
【図4A】ＭＳＩＣａｒｅの診断性能をテストする。Ｃ１およびＣ２コホートにおけるＭＳＩＣａｒｅスコアの密度プロット。
【図4B】ＭＳＩＣａｒｅの診断性能をテストする。Ｃ３コホートにおけるＭＳＩＣａｒｅスコアの密度プロット。
【図5A】ＴＣＧＡからの胃腫瘍および子宮内膜腫瘍におけるＭＳＩの同定のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒおよびＭＳＩＣａｒｅの性能比較。ボックスプロットは、コホート３のＴＣＧＡ ＧＣ患者１０４名（ＭＳＩ ５５名、ＭＳＩ－Ｌ ９名およびＭＳＳ ４２名を含む）およびＴＣＧＡ ＥＣ患者２７８名（ＭＳＩ １５９名、ＭＳＩ－Ｌ １７名およびＭＳＳ １０２名を含む）のＷＥＳから得られたＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアを示す。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（緑色の点線）。
【図5B】ＴＣＧＡからの胃腫瘍および子宮内膜腫瘍におけるＭＳＩの同定のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒおよびＭＳＩＣａｒｅの性能比較。ボックスプロットは、ＣＲＣ、ＧＣまたはＥＣを有する同じＴＣＧＡ患者のＷＥＳから得られたＭＳＩＣａｒｅスコアを示す。２０のカットオフＭＳＩＣａｒｅスコアが、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（緑色の点線）。
【図6A】ＭＳＩを検出するためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界の同定（感度の欠如）。マイクロサテライトの各カテゴリー（モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－またはペンタ－ヌクレオチド反復）についてのＷＥＳデータ（Ｃ１およびＣ２）からのＭＳＩＳｅｎｓｏｒで同定された体細胞変異の総数の分布。モノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列が、ｄＭＭＲ結腸癌において群を抜いて最も不安定なカテゴリーであり、それゆえＭＳＩＳｅｎｓｏｒ（たとえば、モノ－、ジ－、トリ－、テトラ－またはペンタ－）により用いられた他の反復形態よりも、ＭＳＩをＭＳＳ ＣＲＣから識別するのに良好である。
【図6B】ＭＳＩを検出するためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界の同定（感度の欠如）。サイズによる変異型ＭＮＲの割合％（５～１２の範囲。ＭＳＩＣａｒｅスコア）（Ｃ１およびＣ２）。５＋ ５ｂｐ以上の長さのモノヌクレオチド反復全てを含む；６＋ ６ｂｐ以上の長さのモノヌクレオチド反復全てを含む、など。１２ｂｐ以上の長いＭＮＲは、２つの表現型を識別するのに最良であった（青色の長方形）。
【図7】ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアによるゲノム不安定性指数。コホートＣ１およびＣ２のＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ｘ軸）による腫瘍のゲノム不安定性指数の分布（モノヌクレオチド反復不安定性に基づく。詳細は材料と方法を参照）。
【図8A】ＭＳＩを検出するためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界の同定（特異度の欠如）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより変異型マイクロサテライトを有すると同定された３種の腫瘍におけるヘテロ接合性喪失（ＬＯＨ）の３例についての反復長によるリードの密度プロット。
【図8B】ＭＳＩを検出するためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界の同定（特異度の欠如）。Ｔ１６マイクロサテライトの野生型および変異型プロファイルが示される（正常ＤＮＡ、野生型 緑色；ＭＳＩ腫瘍ＤＮＡ、変異型 黄色）。これは、スタッタリング（Ｔ１５）のために、純粋なＭＳＩシグナルが、この長いＭＮＲにおける２ｂｐ以上の体細胞欠失を考慮することのみによって捕捉され得ることを示している。
【図9A】ターゲットパネルシークエンシングデータを用いたＭＳＩの同定のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒおよびＭＳＩＣａｒｅの性能比較。ボックスプロットは、Ｃ１およびＣ２コホートからの患者のＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア）を示す（全患者 右パネル；ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２のいずれかが欠損したＣＲＣの同患者 左パネル）。１０のカットオフＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（ＦＤＡ推奨）が、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（点線）。水平なバープロットは、真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図9B】ターゲットパネルシークエンシングデータを用いたＭＳＩの同定のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒおよびＭＳＩＣａｒｅの性能比較。ボックスプロットは、Ｃ１およびＣ２コホートからの患者のＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）から得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＣａｒｅスコア）を示す（全患者 右パネル；ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２のいずれかが欠損したＣＲＣの同患者 左パネル）。２０のカットオフＭＳＩＣａｒｅスコアが、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた（点線）。水平なバープロットは、真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図9C】ターゲットパネルシークエンシングデータを用いたＭＳＩの同定のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒおよびＭＳＩＣａｒｅの性能比較。ボックスプロットは、Ｃ４コホートからの患者のターゲットシークエンシングに続いて得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアおよび／またはＭＳＩＣａｒｅスコア）を示す（全患者 右パネル；ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２のいずれかが欠損したＣＲＣの同患者 左パネル）。唯一の誤診例のペンタプレックスプロファイルが、ボックス内に示される。水平なバープロットは、真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図10】ＭＳＩＤＩＡＧでのターゲットシークエンシングに続くＭＳＩＳｅｎｓｏｒの評定。ボックスプロットは、Ｃ４コホートからの患者のターゲットシークエンシングに続いて得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア）を示す（全患者 左パネル；ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２のいずれかが欠損したＣＲＣの同患者 右パネル）。水平なバープロットは、真陰性（ＴＮ）、真陽性（ＴＰ）、偽陰性（ＦＮ）および偽陽性（ＦＰ）の割合％を示す。
【図11】脳腫瘍におけるＭＳＩレベル評価。脳腫瘍であるＭＭＲｐ（ＩＨＣによる）患者８名およびｄＭＭＲ（ＩＨＣによる）患者２４名のＷＥＳからのパネルシークエンシングから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＭＳＩＣａｒｅスコア）のバープロット。ｄＭＭＲ患者のうち４名は、体質性ミスマッチ修復欠損ＣＭＭＲＤを呈し、３名は、リンチ症候群を有し、１７名は、テモゾロミド処置後にｄＭＭＲ腫瘍を有する（ｐｏｓｔ＿ＴＭＺ）。ｙ軸は、ｌｏｇ１０スケールを有する。
【図12】ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅを利用したＣＲＣ正常試料不含の固形腫瘍におけるＭＳＩ状態の診断。ボックスプロットは、ターゲットシークエンシングに続いて腫瘍のみの試料から得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅスコア）を示す。試料は、ＩＨＣによりＭＭＲｄまたはＭＭＲｐのどちらかであった。
【図13】ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅを用いた腫瘍循環ＤＮＡにおけるＭＳＩ状態の診断。バープロットは、任意の正常比較を用いずに患者４名の循環ＤＮＡからのパネルシークエンシングから得られた変異型マイクロサテライトの割合％（ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅスコア）を示す。「Ｔ１」試料は、最初の免疫療法処置の当日に抽出された。「Ｔ２」試料は、最初の免疫療法処置の３か月後に抽出された。患者ＭＳ－ＣＩＲＣ－０４１は、ＩＨＣによりｐＭＭＲであることが分かっている。患者ＭＳ－ＣＩＲＣ－００５、ＭＳ－ＣＩＲＣ－０１２およびＭＳ－ＣＩＲＣ－０４５は、ＩＨＣによりｄＭＭＲであることが分かる。２０のカットオフＭＳＩＣａｒｅスコアが、ＭＳＳ腫瘍をＭＳＩ腫瘍から識別するために用いられた。
【発明を実施するための形態】
【0116】
【表1】
【0117】
実施例：
材料と方法
試験集団
この試験の臨床的根拠および設計が、図１に提示されている。ｍＣＲＣの患者１０２名（コホートＣ１、図１）は、２０１５年５月～２０１９年１１月の間に患者が発生した２つの多施設フランス臨床試験（ＮＣＴ０２８４０６０４およびＮＣＴ０３３５０１２６０）を起源とした。
材料と方法
試験集団
この試験の臨床的根拠および設計が、図１に提示されている。ｍＣＲＣの患者１０２名（コホートＣ１、図１）は、２０１５年５月～２０１９年１１月の間に患者が発生した２つの多施設フランス臨床試験（ＮＣＴ０２８４０６０４およびＮＣＴ０３３５０１２６０）を起源とした。
【0118】
ＮＣＴ０２８４０６０４は、エクソーム解析が患者の日常的ケアで実行可能であり、それにより標的治療へのアクセスを改善し、遺伝性癌の素因の検出を改善することを示すことを目的とした。ゲノムシークエンシング（ＷＥＳ）は、フランス ディジョンのＧｅｏｒｇｅｓ－Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ， Ｇｅｎｏｍｉｃ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅで実施された。患者は、少なくとも１ラインの全身治療の間に進行した局所進行性の手術不能または転移性の癌を呈した場合に、適格とされた。ＮＩＰＩＣＯＬ治験（ＮＣＴ０３３５０１２６０）は、ニボルマブ（抗ＰＤ－１）およびイピリムマブ（抗ＣＴＬＡ－４）でのＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｍＣＲＣ患者の処置を含む。ＩＣＩへのｍＣＲＣの応答は、Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ Ｃｒｉｔｅｒｉａ ｉｎ Ｓｏｌｉｄ Ｔｕｍｏｒｓ（ＲＥＣＩＳＴ）に従って決定された（２０）。ＮＣＴ０３３５０１２６０コホートからの２６例が、ＩＣＩで処置された。これらのうち、２３例は、ＭＳＩ／ｄＭＭＲであることが確認され、３例は、中央判定によるＭＳＩおよびＭＭＲ状態の再評定に続いてＭＳＳ／ｐＭＭＲとして後に同定された。ゲノムシークエンシング（ＷＥＳ）は、ＩｎｔｅｇｒａＧｅｎ ＳＡ（フランス エブリー）により実施された。全ての患者が、この治験およびゲノム解析のためのインフォームドコンセントの署名を提供した。患者は、同意を与えた後、体質性遺伝子検査の結果を説明する遺伝学者との協議を受けた。この協議に続いて、患者は、体質性エクソーム解析のために血液試料を提供することを容認または拒絶することができた。この治験プロトコルは、治験審査委員会により認可され、ヘルシンキ宣言に従って実施された。
【0119】
歴史的な後向きコホートもまた、解析された（コホートＣ２、図１）。これは、フランスの病院６施設において１９９８年～２０１６年の間にＭＳＩまたはｄＭＭＲと診断されたｍＣＲＣ患者２５名（１７）、および１９９８～２００７年の間にＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｎｍＣＲＣを有すると診断されたパリのＳａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌからの患者８８名を含んだ（２１）。ｍＣＲＣの原発および／または転移腫瘍組織が、ＷＥＳを用いてＩｎｔｅｇｒａＧｅｎ ＳＡ（フランス エブリー）により解析された。患者は全て、記入された同意書を提供し、試験は、参加施設の施設内治験審査委員会／倫理委員会により認可された。
【0120】
本発明者らはさらに、第３の独立した腫瘍コホート（Ｃ３）においてＭＳＩＣａｒｅおよびＭＳＩＳｅｎｓｏｒの性能を評価および比較した。これは、ＭＳＩ状態が過去にベセスダマイクロサテライトパネルを用いてＰＣＲにより評定されていて、ＷＥＳデータがＴＣＧＡから公開されているＣＲＣ患者１１８名を含んだ。ＭＳＩ－Ｈ（ｎ＝５１）またはＭＳＩ－Ｌ（ｎ＝１４）を有するＣＲＣ患者全て、および同様の割合のＭＳＳ患者（ｎ＝５３）が含まれた（２２）。Ｃ３もまた、相対的に高い発生率のＭＳＩ、即ち胃癌（ＭＳＩ－Ｈ ５３名、ＭＳＩ－Ｌ ９名、ＭＳＳ ４２名）および子宮内膜癌（ＭＳＩ－Ｈ １５９名、ＭＳＩ－Ｌ １７名、ＭＳＳ １０２名）を有するＴＣＧＡからの結腸外腫瘍３８２名を含んだ。
【0121】
ＷＥＳは臨床ケアで日常的に用いられないため、標的ＮＧＳを用いて新しい後向きコホートが検査された（コホートＣ４）（詳細は以下参照）。Ｃ４は、後向きの非連続性であり、過去にＭＳＩ ＰＣＲおよびＩＨＣを用いてＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲ ＣＲＣ（ＭＳＩ １３７名、ＭＳＳ １５名）を有すると診断されたパリのＳａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびＬｉｌｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌからの新しい患者１５２名を招集した。Ｓａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ ＨｏｓｐｉｔａｌからのｄＭＭＲ／ＭＳＩ ＣＲＣ症例は、腫瘍中で検出されたＭＭＲ欠陥にかかわらず、１９９８～２０２１年の間にｄＭＭＲ／ＭＳＩであると過去に診断された。腫瘍および非腫瘍の両方のＤＮＡ材料が、これらの症例について入手でき、それらは、過去にＷＥＳにより解析されなかった（Ｃ２コホートと重複しない）。２０１６～２０２１年に入手可能な材料を有するＬｉｌｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ＨｏｓｐｉｔａｌからのｄＭＭＲ／ＭＳＩ ＣＲＣ症例は、単離されたＭＳＨ６またはＰＭＳ２発現の損失を呈した。それらは、これらの希少なｄＭＭＲ／ＭＳＩ ＣＲＣ環境において、特により診断が困難であることが知られるＭＳＨ６欠乏ＣＲＣにおいてＭＳＩを同定するためのＭＳＩＣａｒｅの性能をさらに評価するために選択された２１。
【0122】
汎癌においてＭＳＩ表現型を調査するために、非ＣＲＣ患者の追加的な公的後向きコホート（コホートＣ５）もまた、ＷＥＳを用いて解析された。このコホートは、ＷＥＳがＴＣＧＡから公開されている患者３４名を含む。このコホートは、浸潤性乳癌（ＢＲＣＡ、ｎ＝８）子宮頸扁平上皮癌および子宮内膜腺癌（ＣＥＳＣ、ｎ＝７）、食道癌（ＥＳＣＡ、ｎ＝３）、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣ、ｎ＝３）、急性骨髄性白血病（ＬＡＭＬ、ｎ＝４）、肺扁平上皮癌（ＬＵＳＣ、ｎ＝４）および皮膚黒色腫（ＳＫＣＭ、ｎ＝５）を含む。これらの患者は、ＤＮＡ修復欠損を示唆する変異の特徴、より具体的にはＭＭＲ、ＭＭＲ／ＰＯＬＥまたはＰＯＬＥの特徴を有する場合に、選択された。その後、ＭＳＩＣａｒｅおよびＭＳＩｓｅｎｓｏｒが、正常組織および腫瘍組織の両方を考慮してシークエンシングデータで比較しながら用いられた。
【0123】
さらに、非ＣＲＣ試料中のＭＳＩｃａｒｅの性能を調査するために、脳腫瘍患者３２名のコホート（Ｃ６）もまた試験された。このコホートは、パリのＩｎｓｔｉｔｕｔ ｄｕ Ｃｅｒｖｅａｕ － ＩＣＭからの患者を含み、患者は、４群、つまり先天性ミスマッチ修復欠損（ＣＭＭＲＤ、ｎ＝４）、リンチ症候群（Ｌｙｎｃｈ、ｎ＝３）、テモゾロミド処置後の神経膠芽腫再発（ｐｏｓｔ＿ＴＭＺ、ｎ＝１７）およびＭＭＲプロフィシェント神経膠芽腫（ｎ＝８）に層別された。ＭＳＩＣａｒｅが、診断が困難であることが知られるこの腫瘍部位において適用された。
【0124】
最後に、液体生検を使用したＭＳＩ診断の実行可能性を評定するために、転移性ＣＲＣの患者４名のパイロットの血液試料が分析された（コホート７）。これらの患者は最初、ＮＩＰＣＯＬ治験（Ｃ１、ＮＣＴ０３３５０１２６０）に含まれ、それぞれ参照法ＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲを用いて、４名のうち３名が、ｄＭＭＲ／ＭＳＩであり、１名がｐＭＭＲ／ＭＳＳであった。腫瘍循環ＤＮＡ（ｃｔＤＮＡ）のシークエンシングデータが、ＭＳＩｃａｒｅ正常試料不含を用いて解析された（ＷＩＮＤ－ＭＳＩｃａｒｅ、以下参照）。
【0125】
患者は全て、記入された同意書を提供し、試験は、参加施設の施設内治験審査委員会／倫理委員会により認可された。
【0126】
試料
前向きコホート（Ｃ１、臨床試験ＮＣＴ０２８４０６０４およびＮＣＴ０３３５０１２６０）では、ｍＣＲＣ試料は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋され（ＦＥＰＥ）、原発または転移のどちらかの腫瘍組織で構成された。後向きコホート（Ｃ２）では、ｎｍＣＲＣ試料は全て（ｎ＝８８）が、ＤＮＡ抽出まで－８０℃で貯蔵された。ｍＣＲＣ患者（ｎ＝２５）では、ＦＦＰＥに保持された原発腫瘍および転移の両方が（ｎ＝４５；原発腫瘍２５例および転移２０例）が、この希少なＣＲＣサブタイプのより完全な記載を提供するために、いつでも可能な時に回収および解析された。公的な後向きコホート（Ｃ３）では、凍結された組織試料が、記載されたとおり原発腫瘍部位（大腸、胃、子宮内膜）から回収された（２２）。Ｃ４後向きコホートでは、ＣＲＣ試料（Ｎ＝１５２；原発または転移）および適合する非腫瘍試料は、ＤＮＡの様々な技術条件および性質の下でＭＳＩＣａｒｅ法の実行可能性を認識するために、ＦＦＰＥ（Ｎ＝８７）または凍結された（Ｎ＝６５）。全てのコホートにおいて、ＮＧＳに基づくＭＳＩを実施するために、適合した正常結腸粘膜試料が、考慮された。
前向きコホート（Ｃ１、臨床試験ＮＣＴ０２８４０６０４およびＮＣＴ０３３５０１２６０）では、ｍＣＲＣ試料は、ホルマリン固定およびパラフィン包埋され（ＦＥＰＥ）、原発または転移のどちらかの腫瘍組織で構成された。後向きコホート（Ｃ２）では、ｎｍＣＲＣ試料は全て（ｎ＝８８）が、ＤＮＡ抽出まで－８０℃で貯蔵された。ｍＣＲＣ患者（ｎ＝２５）では、ＦＦＰＥに保持された原発腫瘍および転移の両方が（ｎ＝４５；原発腫瘍２５例および転移２０例）が、この希少なＣＲＣサブタイプのより完全な記載を提供するために、いつでも可能な時に回収および解析された。公的な後向きコホート（Ｃ３）では、凍結された組織試料が、記載されたとおり原発腫瘍部位（大腸、胃、子宮内膜）から回収された（２２）。Ｃ４後向きコホートでは、ＣＲＣ試料（Ｎ＝１５２；原発または転移）および適合する非腫瘍試料は、ＤＮＡの様々な技術条件および性質の下でＭＳＩＣａｒｅ法の実行可能性を認識するために、ＦＦＰＥ（Ｎ＝８７）または凍結された（Ｎ＝６５）。全てのコホートにおいて、ＮＧＳに基づくＭＳＩを実施するために、適合した正常結腸粘膜試料が、考慮された。
【0127】
この試験におけるＣ４からの全てのＣＲＣ試料は、免疫組織学的検査（ＩＨＣ）を用いてｄＭＭＲ状態について、そして過去に記載されたとおり１４－１６ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＭＳＩについて、この試験に関与する専門施設（フランス パリのＳａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ ＨｏｓｐｉｔａｌおよびフランスのＬｉｌｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において、中央判定により再評定された。
【0128】
公的な後向き非ＣＲＣコホート（Ｃ５）では、凍結組織試料が、記載されたとおり２４原発腫瘍部位から回収された。同じく脳腫瘍コホート（Ｃ６）では、全ての試料がＦＦＰＥされ、ＭＭＲ状態が、ＩＨＣを用いて評定された。このコホートでは、正常粘膜または血液ＤＮＡが、適合した正常試料として用いられた。
【0129】
最後に、液体生検試料（Ｃ７）では、血液ＤＮＡが、免疫チェックポイント阻害剤で処置された転移性ＣＲＣ患者の血漿から抽出された。それぞれ処置前および処置の３か月後に、２つのタイムポイントＴ１およびＴ２が実施された。
【0130】
免疫組織化学的検査およびＭＳＩ－ＰＣＲ
この事後試験で用いられたＣ１およびＣ２からの全てのＣＲＣ試料が、過去に記載されたとおり（１３～１５）免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を用いてｄＭＭＲ状態について、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＭＳＩについて、本発明者らの専門施設（フランス パリのＳａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において中央判定により再評定された。
この事後試験で用いられたＣ１およびＣ２からの全てのＣＲＣ試料が、過去に記載されたとおり（１３～１５）免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）を用いてｄＭＭＲ状態について、そしてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＭＳＩについて、本発明者らの専門施設（フランス パリのＳａｉｎｔ Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ）において中央判定により再評定された。
【0131】
ＭＳＩＳｅｎｓｏｒのエンドポイント
Ｃ１およびＣ２からの偽陰性が、それぞれＭＳＩ－ＰＣＲおよびＩＨＣを用いて最初はＭＳＩまたはｄＭＭＲと診断されたが完全エクソームデータを考慮すると陰性ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（１０％以下）を示した試料として定義された（１８、１９）。これは、ディジョンのＧｅｏｒｇｅｓ－Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、およびパリのＳａｉｎｔ－Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌでの中央判定により実行された。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度は、真陽性および偽陰性例全体のうちの真陽性例の割合％として計算された。
Ｃ１およびＣ２からの偽陰性が、それぞれＭＳＩ－ＰＣＲおよびＩＨＣを用いて最初はＭＳＩまたはｄＭＭＲと診断されたが完全エクソームデータを考慮すると陰性ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア（１０％以下）を示した試料として定義された（１８、１９）。これは、ディジョンのＧｅｏｒｇｅｓ－Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ、およびパリのＳａｉｎｔ－Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌでの中央判定により実行された。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度は、真陽性および偽陰性例全体のうちの真陽性例の割合％として計算された。
【0132】
ＩｍＰａｃｔ（商標）遺伝子パネル（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３）１９、２０；（ｉｉ）または腫瘍のターゲットシークエンシングに続くマーカのＭＳＩＤＩＡＧマイクロサテライトパネル（Ｃ４）（以下参照）。これは、パリのＳａｉｎｔ－Ａｎｔｏｉｎｅ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、Ｃ４）、ディジョンのＧｅｏｒｇｅｓ－Ｆｒａｎｃｏｉｓ Ｌｅｃｌｅｒｃ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃ１）、またはＬｉｌｌｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｈｏｓｐｉｔａｌ（Ｃ４）での中央判定により実行された。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度は、真陽性および偽陰性例全体のうち真陽性例の割合％として計算された。
【0133】
ＭＳＩＳｅｎｓｏｒを用いた全エクソームシークエンシングおよびＮＧＳに基づくＭＳＩ診断
前向き（Ｃ１）および後向き（Ｃ２）コホートでは、ＷＥＳ手順が、製造業者により推奨されたとおり（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ Ｋｉｔ ｖ５， ７５ ＭＢ；Ａｇｉｌｅｎｔ，フランス レ・ジュリス）、そして過去に記載されたとおり（２３）実施された。転移腫瘍試料では、作成されたリードが、参照ゲノムｈｇ３８（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされ、後向き非転移試料では、リードが、ｈｇ１９（ＧＲＣ３７）にマッピングされた。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、ＷＥＳデータからのマイクロサテライトの変異状態を評価するためにデフォルト設定で用いられた（１９）。
前向き（Ｃ１）および後向き（Ｃ２）コホートでは、ＷＥＳ手順が、製造業者により推奨されたとおり（ＳｕｒｅＳｅｌｅｃｔ Ｈｕｍａｎ Ｅｘｏｎ Ｋｉｔ ｖ５， ７５ ＭＢ；Ａｇｉｌｅｎｔ，フランス レ・ジュリス）、そして過去に記載されたとおり（２３）実施された。転移腫瘍試料では、作成されたリードが、参照ゲノムｈｇ３８（ＧＲＣｈ３８）にマッピングされ、後向き非転移試料では、リードが、ｈｇ１９（ＧＲＣ３７）にマッピングされた。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、ＷＥＳデータからのマイクロサテライトの変異状態を評価するためにデフォルト設定で用いられた（１９）。
【0134】
ＣＲＣおよび他の腫瘍におけるＭＳＩ検出の感度を上昇させるための最適化されたＮＧＳに基づくＭＳＩＣａｒｅ法の実装
新しい方法（ＭＳＩＣａｒｅ）は、ＷＥＳデータからの正常試料と腫瘍試料の間のリード分布の比較に基づいてＭＳＩの検出を最適化するために開発された。１２ベースペア（ｂｐ）以上のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）が、正常試料と腫瘍試料の両方で少なくとも２０マッピングリードによりカバーされている場合のみ、解析のために考慮された。その後、各候補ＭＮＲをカバーするリードの総数が、腫瘍および適合する健常組織において正規化された（１００の任意の値）。各ＭＮＲでは、全ての候補ＭＮＲのΔ比値の合計に対応するＭＳＩ指数（ＭＳＩシグナル、ＭＳＩｇ）を作成するために、健常組織での正規化リード数が、腫瘍組織での正規化リード数から差し引かれた［Δ比＝％腫瘍－％正常］。その後、各腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を推定することにより、Δ比の値が調整され、推定されたＴＰは、腫瘍での少なくとも３０リードおよび正常組織での２０リードによりカバーされる１４ｂｐ以上の長さの全てのＭＮＲのためのＭＳＩシグナルの中央値に対応した。その後、Δ比の調整値が、所与のＭＮＲを野生型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ＜５０％）または変異型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ≧５０％）として分類するために用いられたが、但し、観察されたマイクロサテライト変異が、原発腫瘍試料においてヘテロ接合性またはホモ接合性のどちらかであり得ることを条件とした。最後に、腫瘍試料のＭＳＩＣａｒｅスコアは、このアプローチを用いて解析されたマイクロサテライトの総数のうちの変異されたマイクロサテライトの割合％に対応する。このシナリオおよび傍証は、Ｇｉｔｈｕｂのｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＭＳＩ．ＣＲＳＡ／ＭＳＩＣａｒｅを通して入手され得る。
新しい方法（ＭＳＩＣａｒｅ）は、ＷＥＳデータからの正常試料と腫瘍試料の間のリード分布の比較に基づいてＭＳＩの検出を最適化するために開発された。１２ベースペア（ｂｐ）以上のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）が、正常試料と腫瘍試料の両方で少なくとも２０マッピングリードによりカバーされている場合のみ、解析のために考慮された。その後、各候補ＭＮＲをカバーするリードの総数が、腫瘍および適合する健常組織において正規化された（１００の任意の値）。各ＭＮＲでは、全ての候補ＭＮＲのΔ比値の合計に対応するＭＳＩ指数（ＭＳＩシグナル、ＭＳＩｇ）を作成するために、健常組織での正規化リード数が、腫瘍組織での正規化リード数から差し引かれた［Δ比＝％腫瘍－％正常］。その後、各腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を推定することにより、Δ比の値が調整され、推定されたＴＰは、腫瘍での少なくとも３０リードおよび正常組織での２０リードによりカバーされる１４ｂｐ以上の長さの全てのＭＮＲのためのＭＳＩシグナルの中央値に対応した。その後、Δ比の調整値が、所与のＭＮＲを野生型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ＜５０％）または変異型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ≧５０％）として分類するために用いられたが、但し、観察されたマイクロサテライト変異が、原発腫瘍試料においてヘテロ接合性またはホモ接合性のどちらかであり得ることを条件とした。最後に、腫瘍試料のＭＳＩＣａｒｅスコアは、このアプローチを用いて解析されたマイクロサテライトの総数のうちの変異されたマイクロサテライトの割合％に対応する。このシナリオおよび傍証は、Ｇｉｔｈｕｂのｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ＭＳＩ．ＣＲＳＡ／ＭＳＩＣａｒｅを通して入手され得る。
【0135】
ＭＳＩＣａｒｅカットオフ決定
ＭＳＩＣａｒｅのカットオフ値が、異なるコホートのＭＳＳ試料からのＭＳＩ試料の識別を最適化するために推定された。これは、バイナリ分類タスクにおいてる最適なカットオフポイントを推定し、ブートストラッピングを利用してそれらの性能を検証する、ｃｕｔｐｏｉｎｔｒパッケージ（バージョン１．０．３２）を用いて実行された。２０のカットオフポイントが、７７のＭＳＳと１３８のＭＳＩとの発見セットを用いて決定され（Ｃ１＋Ｃ２；ＣＲＣ；発見セット）、その後、公的ＴＣＧＡデータからのＭＳＩの検証セット（Ｃ３；ＣＲＣおよび非ＣＲＣ、検証セット）に適用された（さらなる詳細について結果の節を参照）。ＭＳＫ－Ｉｍｐａｃｔ（商標）遺伝子パネルに制限された一部のＷＥＳデータのみを考慮した場合に、ＣＲＣ患者の同じコホートにおけるＭＳＩを同定するためのＭＳＩＣａｒｅをテストするために、同じカットオフが再度テストされた。
ＭＳＩＣａｒｅのカットオフ値が、異なるコホートのＭＳＳ試料からのＭＳＩ試料の識別を最適化するために推定された。これは、バイナリ分類タスクにおいてる最適なカットオフポイントを推定し、ブートストラッピングを利用してそれらの性能を検証する、ｃｕｔｐｏｉｎｔｒパッケージ（バージョン１．０．３２）を用いて実行された。２０のカットオフポイントが、７７のＭＳＳと１３８のＭＳＩとの発見セットを用いて決定され（Ｃ１＋Ｃ２；ＣＲＣ；発見セット）、その後、公的ＴＣＧＡデータからのＭＳＩの検証セット（Ｃ３；ＣＲＣおよび非ＣＲＣ、検証セット）に適用された（さらなる詳細について結果の節を参照）。ＭＳＫ－Ｉｍｐａｃｔ（商標）遺伝子パネルに制限された一部のＷＥＳデータのみを考慮した場合に、ＣＲＣ患者の同じコホートにおけるＭＳＩを同定するためのＭＳＩＣａｒｅをテストするために、同じカットオフが再度テストされた。
【0136】
マイクロサテライトマーカの最適化パネルでの一対の腫瘍および正常粘膜試料のターゲットシークエンシングに続いてＣＲＣ中のＭＳＩをＭＳＩＣａｒｅで診断する
臨床適用の観点から、ＭＳＩテストが、全エクソームシークエンシングのみならず、パネルテストにおいても重要である。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒに比較されたＭＳＩＣａｒｅの性能が再度、同じカットオフを用いて追加の独立した多施設ＣＲＣコホート（Ｃ４）で評定された。一対の腫瘍および正常粘膜試料でのこのコホートのシークエンシングが、マイクロサテライトマーカの最適化された標的化パネル、即ちＭＳＩＤＩＡＧを用いて実施された。このパネルは、不安定性がＷＥＳに続いてもっぱらＣ１、Ｃ２およびＣ３からのＭＳＩ腫瘍試料中で観察された１２ｂｐ以上のサイズを収容するＭＮＲの中から選択された４４１モノヌクレオチド反復を含む（ＭＳＳ ＣＲＣにおいて低頻度の体細胞変異；ｐ値＜０．０５でのカイ二乗検定）。捕捉およびシークエンシングの後、リードは、含まれるカバレッジデプスが１００Ｘ～５００Ｘの間であるヒトゲノム構築物（ｈｇ３８）にマッピングされた。ＭＳＩの診断は、過去にＣ１、Ｃ２およびＣ３のＷＥＳデータから実施されたため、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒまたはＭＳＩＣａｒｅ手順を用いて厳密に評定された（上記参照）。
臨床適用の観点から、ＭＳＩテストが、全エクソームシークエンシングのみならず、パネルテストにおいても重要である。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒに比較されたＭＳＩＣａｒｅの性能が再度、同じカットオフを用いて追加の独立した多施設ＣＲＣコホート（Ｃ４）で評定された。一対の腫瘍および正常粘膜試料でのこのコホートのシークエンシングが、マイクロサテライトマーカの最適化された標的化パネル、即ちＭＳＩＤＩＡＧを用いて実施された。このパネルは、不安定性がＷＥＳに続いてもっぱらＣ１、Ｃ２およびＣ３からのＭＳＩ腫瘍試料中で観察された１２ｂｐ以上のサイズを収容するＭＮＲの中から選択された４４１モノヌクレオチド反復を含む（ＭＳＳ ＣＲＣにおいて低頻度の体細胞変異；ｐ値＜０．０５でのカイ二乗検定）。捕捉およびシークエンシングの後、リードは、含まれるカバレッジデプスが１００Ｘ～５００Ｘの間であるヒトゲノム構築物（ｈｇ３８）にマッピングされた。ＭＳＩの診断は、過去にＣ１、Ｃ２およびＣ３のＷＥＳデータから実施されたため、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒまたはＭＳＩＣａｒｅ手順を用いて厳密に評定された（上記参照）。
【0137】
固形および液体生検の両方の正常試料不含（腫瘍のみ）のＤＮＡシークエンシングデータを用いてＣＲＣ中のＭＳＩ状態を検出するためのＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅの実装
正常試料と適合させることなくＭＳＩを検出するために、正常多型ゾーンが、７６４の正常試料のデータベースを用いて各反復について同定された。１２ベースペア（ｂｐ）以上の長さのモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）が、腫瘍試料中で少なくとも２０のマッピングリードによりカバーされている場合のみ、解析のために考慮された。その後、各候補ＭＮＲをカバーするリードの総数が、正規化された（１００の任意の値）。その後、腫瘍試料から、この正常多型ゾーンの外部で観察された変異型反復のみが、考慮された。この多型ゾーンの外部では、正常試料中のリード数が、各ＮＭＲについて零と見なされた［Δ比＝多型ゾーン外部の腫瘍％］。この状況では、ＭＳＩＣａｒｅ法の複数のステップ（上記参照）が、このことを考慮して実行された。
正常試料と適合させることなくＭＳＩを検出するために、正常多型ゾーンが、７６４の正常試料のデータベースを用いて各反復について同定された。１２ベースペア（ｂｐ）以上の長さのモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）が、腫瘍試料中で少なくとも２０のマッピングリードによりカバーされている場合のみ、解析のために考慮された。その後、各候補ＭＮＲをカバーするリードの総数が、正規化された（１００の任意の値）。その後、腫瘍試料から、この正常多型ゾーンの外部で観察された変異型反復のみが、考慮された。この多型ゾーンの外部では、正常試料中のリード数が、各ＮＭＲについて零と見なされた［Δ比＝多型ゾーン外部の腫瘍％］。この状況では、ＭＳＩＣａｒｅ法の複数のステップ（上記参照）が、このことを考慮して実行された。
【0138】
ＭＳＩ指数（ＭＳＩシグナル、ＭＳＩｇ）が作製され、全ての候補ＭＮＲのΔ比の値の合計に対応させた。その後、各腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を推定することにより、Δ比の値が調整され、推定されたＴＰは、腫瘍での少なくとも３０リードによりカバーされた１４ｂｐ以上の長さの全てのＭＮＲのためのＭＳＩシグナルの中央値に対応した。その後、Δ比の調整された値が、所与のＭＮＲを野生型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ＜５０％）または変異型（調整Δ比＝Δ比×推定ＴＰ≧５０％）として分類するために用いられたが、但し、観察されたマイクロサテライト変異が、原発腫瘍試料においてヘテロ接合性またはホモ接合性のどちらかであり得ることを条件とした。最後に、腫瘍試料のＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅ（Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ Ｎｏｒｍａｌ ＤＮＡ（正常ＤＮＡを含まない））スコアは、このアプローチを用いて解析されたマイクロサテライトの総数のうちの変異されたマイクロサテライトの割合％に対応する。
【0139】
この方法は、Ｃ４コホートからの患者の腫瘍（固形試料）に適用され、転移ＣＲＣを呈した患者４名のパイロット（Ｃ７）の液体生検（ｃｔＤＮＡ）にも適用された。この最後のコホートは、ＭＳＩＤＩＡＧパネルを用いてシークエンシングされ、解析に最大の感度を持たせるために、リードが、含まれるカバレッジデプスが３０００Ｘ～５０００Ｘの間であるヒトゲノム構築物（ｈｇ３８）にマッピングされた。
【0140】
結果
ｍＣＲＣとｎｍＣＲＣの両方におけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒでのＭＳＩの頻繁な誤診
Ｃ１およびＣ２からの全てのＣＲＣ試料が、ペンタプレックスＰＣＲおよびＩＨＣのゴールドスタンダード参照法を用いてＭＳＩおよびｄＭＮＲ状態について中央判定により再評定された（図１）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、前向きＣ１コホートから７７のＭＳＳ／ｐＭＭＲ ｍＣＲＣの状態を確認した（図１および図２Ａ；ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア≦１０％）。しかし、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｍＣＲＣ試料２５例のうちの４例の状態を確認することができなかった（図２Ａ；ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア≦１０％）。Ｃ１における誤診の頻度は、それゆえ１６％となった（Ｎ＝４／２５；感度８４％、９５％ＣＩ：６９～９９％）。
ｍＣＲＣとｎｍＣＲＣの両方におけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒでのＭＳＩの頻繁な誤診
Ｃ１およびＣ２からの全てのＣＲＣ試料が、ペンタプレックスＰＣＲおよびＩＨＣのゴールドスタンダード参照法を用いてＭＳＩおよびｄＭＮＲ状態について中央判定により再評定された（図１）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、前向きＣ１コホートから７７のＭＳＳ／ｐＭＭＲ ｍＣＲＣの状態を確認した（図１および図２Ａ；ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア≦１０％）。しかし、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｍＣＲＣ試料２５例のうちの４例の状態を確認することができなかった（図２Ａ；ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコア≦１０％）。Ｃ１における誤診の頻度は、それゆえ１６％となった（Ｎ＝４／２５；感度８４％、９５％ＣＩ：６９～９９％）。
【0141】
ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度がさらに、後向きＣ２コホートからのＭＳＩ／ｄＭＭＲのｍＣＲＣ患者２５名において評定された（図１）。ｍＣＲＣにおいて、誤診の頻度は、３２％でさらに高かった（Ｎ＝８／２５、３２％；感度６８％、９５％ＣＩ：４９．３～８６．７％）（図２Ｂ）。Ｃ２コホートからのＭＳＩ／ｄＭＮＲのｎｍＣＲＣ患者８８名において、誤診が９％で起こった（Ｎ＝８／８８、９％；感度９１％、９５％ＣＩ：８５％～９７％）（図２Ｂ）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒと類似の性能が、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）で観察された（詳細については材料と方法を参照）。ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ＣＲＣの中で検出された偽陰性例の全数は、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアを決定するために用いられたＭＳＫパネルの全３バージョンと非常に類似していた（データは示さない）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度は、ｎｍＣＲＣとｍＣＲＣの両方を含むＣＲＣ患者の公的Ｃ３コホートでも評定された（図１）。誤診の頻度は同じく、９．８％（Ｎ＝５／５１）で非常に類似しており、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ＣＲＣの患者において９０％（９５％ＣＩ：８２％～９８％）の感度を与えた。これは、１つのｍＣＲＣ誤診例を含んだ（１／３、３３％）（図２Ｃ）。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、Ｃ３からのＭＳＳ／ｐＭＭＲ ｍＣＲＣ ２例以外の全ての状態を確認し、このためこの方法の主な限界が感度の欠如であることが示された。Ｃ２およびＣ３コホートに比較したＣ１コホートにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒの全体的性能が、表１Ａに示される。
【0142】
ＣＲＣにおけるＤＮＡ反復のＭＳＩゲノムシグナルを解読することによりＭＳＩＳｅｎｓｏｒの弱点および限界を同定する
密度プロットが、この試験で解析された３つの患者コホートでのＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアの変動を示すために作成された（図３）。コホートＣ１およびＣ２における全ての試料のＭＳＩ／ｄＭＭＲおよびＭＳＳ／ｐＭＭＲ状態は、過去に中央判定で検証されているため、プールされた。本発明者らは、ＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲを用いてこれらの腫瘍の状態を独立して確認することができなかったため、公的コホートＣ３からのＣＲＣ試料は、別個に考慮された。密度プロファイルから、既に３つのコホートについて先に示されたとおり、ｄＭＭＲ ＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度の欠如が明確に強調された（図２および表１）。
密度プロットが、この試験で解析された３つの患者コホートでのＭＳＩＳｅｎｓｏｒスコアの変動を示すために作成された（図３）。コホートＣ１およびＣ２における全ての試料のＭＳＩ／ｄＭＭＲおよびＭＳＳ／ｐＭＭＲ状態は、過去に中央判定で検証されているため、プールされた。本発明者らは、ＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲを用いてこれらの腫瘍の状態を独立して確認することができなかったため、公的コホートＣ３からのＣＲＣ試料は、別個に考慮された。密度プロファイルから、既に３つのコホートについて先に示されたとおり、ｄＭＭＲ ＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度の欠如が明確に強調された（図２および表１）。
【0143】
本発明者らは次に、ＮＧＳデータの解析において特定のパラメータを修飾することにより、ＣＲＣにおけるＭＳＩの検出を改善することができるはずであると仮定した。これの裏づけとして、（ｉ）ＭＮＲ配列がｄＭＭＲ結腸腫瘍におけるマイクロサテライトの中で群を抜いて最も不安定なカテゴリーであり、それゆえＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより用いられた他のタイプの反復（例えば、ジ－、トリ－、テトラ－、ペンタ－）よりも、ＭＳＩをＭＳＳ ＣＲＣから識別する点でより良好であったこと（図６Ａ）；（ｉｉ）ＭＳＳ結腸腫瘍とＭＳＩ結腸腫瘍とを識別するＮＭＲの能力が長さに依存し、１２ｂｐ以上の長いＭＮＲがＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより用いられた他のマイクロサテライトに比較して最も識別していることが見出されたこと（図６Ｂ）；（ｉｉｉ）ＭＳＩＳｅｎｓｏｒが３０～４０％未満の推定ＴＰでＣＲＣ試料中のＭＳＩを検出するのに適さなかったこと、を理由に、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度が欠如することが、ＷＥＳ解析で明らかとなった。このことは、非腫瘍および炎症ｐＭＭＲ／ＭＳＳ細胞が高レベルで混入することが多いため、原発性ＭＳＩ ＣＲＣにおけるＭＳＩＳｅｎｓｏｒの感度への重要な限界である（図７）（本発明者らのレビュー（２４）およびさらなる詳細についての元となる発表１４、１５、２１、２３、２５も参照）。ＷＥＳ解析から、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒが２つの理由で特異度が欠如することも明らかとなった。第一に、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒのコンピュテーショナルツールは、ＭＮＲの幾つかで、真のＭＳＩシグナルをアレル欠失（ＬＯＨ）と混同した。ＬＯＨは、高レベルの染色体不安定性を有するＭＳＳ結腸腫瘍において起こることが多い（図８Ａ）。第二に、ＰＣＲ反応の間のＤＮＡポリメラーゼによるスタッタリングが、マイクロサテライトで、特に長いＭＮＲで起こることが多い。それゆえ、これらのマイクロサテライトにおける小さな１ｂｐの欠失が、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒによりＭＳＩを表すと見なされる場合に、ＭＳＩの誤診が起こり得る（図８Ｂ）。
【0144】
ＣＲＣにおいてＭＳＩのＮＧＳを基にした検出を改善するためにＭＳＩＣａｒｅを設計および検証する
ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの上述の落とし穴を回避するために、本発明者らは次に、ＭＳＩＣａｒｅと称される新しいコンピュテーショナルツールを設計して、ＷＥＳプロファイルの解析に基づくＣＲＣのＭＳＩを正確に検出した。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒと対照的に、ＭＳＩＣａｒｅは、ｄＭＭＲ癌からのＤＮＡにおいて長いＭＮＲ（≧１２ｂｐ）で起こり、対の正常組織からのＤＮＡでは起こらない少なくとも２ｂｐ長の体細胞欠失として定義された真のＭＳＩシグナルを同定する（さらなる詳細については材料と方法を参照）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が構築されて、ＭＳＩＣａｒｅスコアのバイナリ分類を推定した。これにより、２０％のカットオフ値を用いた場合に１００％の感度および１００％特異度を有するＣ１およびＣ２におけるｄＭＭＲとｐＭＭＲ ＣＲＣとの完璧な識別が明らかとなった（図４Ａ。データは示さない）。ｄＭＭＲ／ＭＳＩ試料は、８０％を超える平均ＭＳＩＣａｒｅスコアを示し、この値の前後にほとんど分散がないが、ｐＭＭＲ／ＭＳＳ試料の平均ＭＳＩＣａｒｅスコアは、１０％未満であることが示された。このため、ＭＳＩＣａｒｅは、ＭＳＩをＭＳＳ ＣＲＣ例と識別するのに非常に効果的であると思われる。２０％のカットオフ値を用いて実現された高レベルの識別が、公的なＣ３コホートにおいて検証され（図４Ｂ右パネル）、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒで偽陰性状態を示した真のＭＳＩである５例のうち３例を本発明者らに修正させた。興味深いこととして、過去にＴＣＧＡに従ってＰＣＲによりＭＳＩと分類された陰性ＭＳＩＳｅｎｓｏｒ状態の残り２例のＣＲＣ試料は、ＭＳＩＣａｒｅで依然として明確にＭＳＳであった。これらの両方の腫瘍のエクソームプロファイルの詳細な解析から、公知のＭＳＩターゲット遺伝子のコーディング領域内に存在するマイクロサテライト中に非常にわずかな変異が明らかとなった（データは示さない）。さらに、試料の１つから、ＴＣＧＡによるｐＭＭＲが示され、このため解釈が不確実なＭＳＩ状態が示唆された。Ｃ２およびＣ３コホートに比較したＣ１コホートにおけるＭＳＩＣａｒｅの全体的性能が、表１Ｂに示される。
ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの上述の落とし穴を回避するために、本発明者らは次に、ＭＳＩＣａｒｅと称される新しいコンピュテーショナルツールを設計して、ＷＥＳプロファイルの解析に基づくＣＲＣのＭＳＩを正確に検出した。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒと対照的に、ＭＳＩＣａｒｅは、ｄＭＭＲ癌からのＤＮＡにおいて長いＭＮＲ（≧１２ｂｐ）で起こり、対の正常組織からのＤＮＡでは起こらない少なくとも２ｂｐ長の体細胞欠失として定義された真のＭＳＩシグナルを同定する（さらなる詳細については材料と方法を参照）。受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線が構築されて、ＭＳＩＣａｒｅスコアのバイナリ分類を推定した。これにより、２０％のカットオフ値を用いた場合に１００％の感度および１００％特異度を有するＣ１およびＣ２におけるｄＭＭＲとｐＭＭＲ ＣＲＣとの完璧な識別が明らかとなった（図４Ａ。データは示さない）。ｄＭＭＲ／ＭＳＩ試料は、８０％を超える平均ＭＳＩＣａｒｅスコアを示し、この値の前後にほとんど分散がないが、ｐＭＭＲ／ＭＳＳ試料の平均ＭＳＩＣａｒｅスコアは、１０％未満であることが示された。このため、ＭＳＩＣａｒｅは、ＭＳＩをＭＳＳ ＣＲＣ例と識別するのに非常に効果的であると思われる。２０％のカットオフ値を用いて実現された高レベルの識別が、公的なＣ３コホートにおいて検証され（図４Ｂ右パネル）、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒで偽陰性状態を示した真のＭＳＩである５例のうち３例を本発明者らに修正させた。興味深いこととして、過去にＴＣＧＡに従ってＰＣＲによりＭＳＩと分類された陰性ＭＳＩＳｅｎｓｏｒ状態の残り２例のＣＲＣ試料は、ＭＳＩＣａｒｅで依然として明確にＭＳＳであった。これらの両方の腫瘍のエクソームプロファイルの詳細な解析から、公知のＭＳＩターゲット遺伝子のコーディング領域内に存在するマイクロサテライト中に非常にわずかな変異が明らかとなった（データは示さない）。さらに、試料の１つから、ＴＣＧＡによるｐＭＭＲが示され、このため解釈が不確実なＭＳＩ状態が示唆された。Ｃ２およびＣ３コホートに比較したＣ１コホートにおけるＭＳＩＣａｒｅの全体的性能が、表１Ｂに示される。
【0145】
本発明者らは、腫瘍におけるｄＭＭＲ欠陥の性質を考慮したＭＳＩＣａｒｅの性能を解析している。結果から、このテストの感度が、このコホートからＭＳＨ６欠損またはＰＭＳ２欠損の結腸腫瘍において依然として最適であることが示される（感度１００％）。
【0146】
ＭＳＩＣａｒｅは胃および子宮内膜腫瘍におけるＭＳＩの検出についてＭＳＩＳｅｎｓｏｒより良好な性能を有する可能性がある
ＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの性能が、ＭＳＩ表現型を示すことの多い２種の他の原発癌の型、即ち胃癌（ＧＣ）および子宮内膜癌（ＥＣ）において評定された。ＴＣＧＡからのＧＣおよびＥＣの入手できるＷＥＳデータの調査から、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒに比較して、ＭＳＩの検出におけるＭＳＩＣａｒｅのかなり良好な性能が明らかとなった（図５ＡおよびＢ、ならびに表１Ｂ）。
ＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの性能が、ＭＳＩ表現型を示すことの多い２種の他の原発癌の型、即ち胃癌（ＧＣ）および子宮内膜癌（ＥＣ）において評定された。ＴＣＧＡからのＧＣおよびＥＣの入手できるＷＥＳデータの調査から、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒに比較して、ＭＳＩの検出におけるＭＳＩＣａｒｅのかなり良好な性能が明らかとなった（図５ＡおよびＢ、ならびに表１Ｂ）。
【0147】
ターゲットＮＧＳを用いたＣＲＣにおいてＭＳＩを検出することにおけるＭＳＩＣａｒｅの性能の確認
ＷＥＳは、臨床ケアで日常的に用いられないため、本発明者らは最後に、対の正常粘膜試料に比較したＣＲＣ試料のターゲットシークエンシングに続いてＭＳＩを検出するためのＭＳＩＣａｒｅの高い性能を確認することを目的とした。これは最初、Ｃ１およびＣ２において実行され、制限されたＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）遺伝子パネルに含まれるマイクロサテライトのみを考慮した（詳細については材料と方法を参照）。これらの条件下でこれらのコホートからのＭＳＩ／ｄＭＭＲのうちで検出された偽陰性例の全数が、特にＭＳＨ６およびＰＭＳ２欠損状況では、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴの３バージョン全てのＭＳＩＳｅｎｓｏｒにとって重要であった（図９Ａ）（感度２８．６％、９５％ＣＩ；４．９％～６２％）（図９Ａ）。対照的に、ＭＳＩＣａｒｅの性能は、同条件下で依然として最適であった（感度１００％）（図９Ｂ）。
ＷＥＳは、臨床ケアで日常的に用いられないため、本発明者らは最後に、対の正常粘膜試料に比較したＣＲＣ試料のターゲットシークエンシングに続いてＭＳＩを検出するためのＭＳＩＣａｒｅの高い性能を確認することを目的とした。これは最初、Ｃ１およびＣ２において実行され、制限されたＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴ（商標）遺伝子パネルに含まれるマイクロサテライトのみを考慮した（詳細については材料と方法を参照）。これらの条件下でこれらのコホートからのＭＳＩ／ｄＭＭＲのうちで検出された偽陰性例の全数が、特にＭＳＨ６およびＰＭＳ２欠損状況では、ＭＳＫ－ＩＭＰＡＣＴの３バージョン全てのＭＳＩＳｅｎｓｏｒにとって重要であった（図９Ａ）（感度２８．６％、９５％ＣＩ；４．９％～６２％）（図９Ａ）。対照的に、ＭＳＩＣａｒｅの性能は、同条件下で依然として最適であった（感度１００％）（図９Ｂ）。
【0148】
次に本発明者らは、ＭＳＩＤＩＡＧと呼ばれる４４１のモノヌクレオチド反復（長さ≧１２ｂｐおよびＭＳＩ腫瘍における不安定性；詳細は方法を参照）の最適に設計されたパネルを作成した。このパネルを用いて、本発明者らは、患者１５２名（ＭＳＩ １３７名およびＭＳＳ １５名）を含み、ＭＳＨ６（患者３５名）またはＰＭＳ２（患者９名）が欠損したＣＲＣの多いＣ４コホートにおいて、ＭＭＲ欠陥にかかわらず、ＭＳＩＣａｒｅがＣＲＣにおいてなおも最適にＭＳＩを検出するが（感度９９．３％、９５％ＣＩ：９７．８％～１００．７％；特異度１００％）（図９Ｃ）、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒが予測では非特異的であったが依然としてより低い感度であること（感度９７．１％、９５％ＣＩ：９２．７％～９９．２％；特異度７３．３％、９５％ＣＩ：４４．９％～９２．２％）（図１０）を確認した。
【0149】
汎癌におけるＤＮＡ修復欠損の特徴を呈した患者におけるＭＳＩＣａｒｅとＭＳＩＳｅｎｓｏｒの分析比較
ＭＭＲ、ＭＭＲ／ＰＯＬＥまたはＰＯＬＥに関連する変異の特徴を呈するＴＣＧＡ汎癌患者３４名のうち、２２／３４が、ＭＳＩＣａｒｅでＭＳＩとして同定されたが（データは示さない）、１４／３４は、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒでＭＳＩと同定された（データは示さない）。侵襲性乳癌（ＢＲＣＡ）および食道癌（ＣＥＳＣ）において、ＭＭＲ変異の特徴を有する患者全員が、ＭＳＩＣａｒｅによりＭＳＩに分類され、ＰＯＬＥの特徴を有する患者は、ＭＳＳと同定される（データは示さない）。ＭＳＩｓｅｎｓｏｒを用いると、これらの２つの癌の型では、ＭＳＳと同定された（ＭＳＩｓｅｎｓｏｒスコア＜１０）患者の５／７が、ＭＭＲ変異の特徴を呈し、２／７が、ＰＯＬＥの特徴を呈する（データは示さない）。これは、ＭＳＩＣａｒｅの結果が侵襲性乳癌および食道癌におけるＭＭＲ変異の特徴と充分に相関するようであることを示唆している。
ＭＭＲ、ＭＭＲ／ＰＯＬＥまたはＰＯＬＥに関連する変異の特徴を呈するＴＣＧＡ汎癌患者３４名のうち、２２／３４が、ＭＳＩＣａｒｅでＭＳＩとして同定されたが（データは示さない）、１４／３４は、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒでＭＳＩと同定された（データは示さない）。侵襲性乳癌（ＢＲＣＡ）および食道癌（ＣＥＳＣ）において、ＭＭＲ変異の特徴を有する患者全員が、ＭＳＩＣａｒｅによりＭＳＩに分類され、ＰＯＬＥの特徴を有する患者は、ＭＳＳと同定される（データは示さない）。ＭＳＩｓｅｎｓｏｒを用いると、これらの２つの癌の型では、ＭＳＳと同定された（ＭＳＩｓｅｎｓｏｒスコア＜１０）患者の５／７が、ＭＭＲ変異の特徴を呈し、２／７が、ＰＯＬＥの特徴を呈する（データは示さない）。これは、ＭＳＩＣａｒｅの結果が侵襲性乳癌および食道癌におけるＭＭＲ変異の特徴と充分に相関するようであることを示唆している。
【0150】
ＭＳＩＣａｒｅを用いた脳腫瘍におけるＭＳＩレベルの評定
脳腫瘍患者では、マイクロサテライト不安定性レベルがＭＳＩＣａｒｅを用いたＭＭＲプロフィシェント脳腫瘍試料（ｎ＝８）よりもＣＭＭＲＤ（ｎ＝４）、ＬＹＮＣＨ（ｎ＝３）およびｐｏｓｔ＿ＴＭＺ（ｎ＝１７）ＭＭＲデフィシエント脳腫瘍試料で高いが、これがＭＳＩＳｅｎｓｏｒには当てはまらないことを、本発明者らは観察した（図１１）。これらの結果は、ＭＳＩｃａｒｅが脳腫瘍においてＭＳＩ癌を診断するのに用いられ得ることを示唆している。しかし、予想どおり、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ脳腫瘍試料は、例えばＭＳＩ ＣＲＣに比較して軽度のＭＳＩ表現型を呈したため、最適なカットオフ値を定義するには、追加の実験が必要となる（ＭＳＩ ＰＣＲが脳腫瘍においてＭＳＩを検出できないことを思い出させる）。
脳腫瘍患者では、マイクロサテライト不安定性レベルがＭＳＩＣａｒｅを用いたＭＭＲプロフィシェント脳腫瘍試料（ｎ＝８）よりもＣＭＭＲＤ（ｎ＝４）、ＬＹＮＣＨ（ｎ＝３）およびｐｏｓｔ＿ＴＭＺ（ｎ＝１７）ＭＭＲデフィシエント脳腫瘍試料で高いが、これがＭＳＩＳｅｎｓｏｒには当てはまらないことを、本発明者らは観察した（図１１）。これらの結果は、ＭＳＩｃａｒｅが脳腫瘍においてＭＳＩ癌を診断するのに用いられ得ることを示唆している。しかし、予想どおり、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ脳腫瘍試料は、例えばＭＳＩ ＣＲＣに比較して軽度のＭＳＩ表現型を呈したため、最適なカットオフ値を定義するには、追加の実験が必要となる（ＭＳＩ ＰＣＲが脳腫瘍においてＭＳＩを検出できないことを思い出させる）。
【0151】
ＣＲＣの正常試料不含の固形腫瘍におけるＭＳＩＣａｒｅ診断
それぞれＩＨＣおよびＰＣＲ ＭＳＩを用いて、１０８例がＭＭＲｄ／ＭＳＩで、２０例がＭＭＲｐ／ＭＳＳであったＣ４コホートからの一連の１２８例の大腸試料において、適合する正常ＤＮＡを参照しないＭＳＩＣａｒｅ法が、ＭＳＩを検出するために適用された。全試料が、このアプローチを用いて正しく分類され（図１２）、この新しいＭＳＩＣａｒｅバージョン、即ちＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅが、ＣＲＣにおいてＭＳＩを検出するのにＭＳＩＣａｒｅと同様に感度がある可能性があることが強調された。追加的実験が、汎癌においてＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅの性能を調査するために進行中である。
それぞれＩＨＣおよびＰＣＲ ＭＳＩを用いて、１０８例がＭＭＲｄ／ＭＳＩで、２０例がＭＭＲｐ／ＭＳＳであったＣ４コホートからの一連の１２８例の大腸試料において、適合する正常ＤＮＡを参照しないＭＳＩＣａｒｅ法が、ＭＳＩを検出するために適用された。全試料が、このアプローチを用いて正しく分類され（図１２）、この新しいＭＳＩＣａｒｅバージョン、即ちＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅが、ＣＲＣにおいてＭＳＩを検出するのにＭＳＩＣａｒｅと同様に感度がある可能性があることが強調された。追加的実験が、汎癌においてＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅの性能を調査するために進行中である。
【0152】
腫瘍循環ＤＮＡにおけるＭＳＩＣａｒｅ診断
ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅは、転移性ＣＲＣの患者（ＭＳＩ ３名、ＭＳＳ １名）の血液から抽出された循環腫瘍ＤＮＡにおいてＭＳＩを検出するために再度テストされた。このパイロット試験では、このアルゴリズムが、ＩＣＩ療法を受ける前のＭＳＩ ＣＲＣ患者からの３つの試料においてＭＳＩを検出することができた（図１３）。対照的に、予測どおりＭＳＳ ＣＲＣ患者において、そしてＩＣＩ療法を受けた後のＭＳＩ ＣＲＣ患者からの３つの試料においても、ＭＳＩを検出することができなかった（図１３）。それらが、小さな患者群のみで得られたとしても、これらの結果は、ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅがＭＳＩ ＣＲＣ患者の血漿中のＭＳＩを検出するのに利用できる可能性を示している。非転移性ＭＳＩ ＣＲＣの患者および／または転移性もしくは非転移性非大腸癌の患者において性能を調査するには、追加の結果が必要となる。
ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅは、転移性ＣＲＣの患者（ＭＳＩ ３名、ＭＳＳ １名）の血液から抽出された循環腫瘍ＤＮＡにおいてＭＳＩを検出するために再度テストされた。このパイロット試験では、このアルゴリズムが、ＩＣＩ療法を受ける前のＭＳＩ ＣＲＣ患者からの３つの試料においてＭＳＩを検出することができた（図１３）。対照的に、予測どおりＭＳＳ ＣＲＣ患者において、そしてＩＣＩ療法を受けた後のＭＳＩ ＣＲＣ患者からの３つの試料においても、ＭＳＩを検出することができなかった（図１３）。それらが、小さな患者群のみで得られたとしても、これらの結果は、ＷＩＮＤ－ＭＳＩＣａｒｅがＭＳＩ ＣＲＣ患者の血漿中のＭＳＩを検出するのに利用できる可能性を示している。非転移性ＭＳＩ ＣＲＣの患者および／または転移性もしくは非転移性非大腸癌の患者において性能を調査するには、追加の結果が必要となる。
【0153】
結論
複数の発表が、近年になり、全く別のコンピュテーショナルアルゴリズムを利用することによりヒト癌におけるＭＳＩの検出のためのＮＧＳの潜在性を強調した（１８、１９、２６～２９）。これらのうち、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、ＦＤＡ認可を受けており、腫瘍の原発部位にかかわらず、転移癌患者のＩＣＩ治療の処方を案内するのに用いられる。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒが、多数のＣＲＣをはじめとする進行固形癌でテストされた。しかし、このＮＧＳを元にしたテストの性能は、参照ＰＣＲおよびＩＨＣ法を用いて過去にＭＳＩ／ｄＭＭＲ状態を評定された大きなＣＲＣ群ではまだ評価されていない。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの正確性は、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｍＣＲＣと思われて次にＩＣＩで処置される患者にとって、特に重要である。この試験において、本発明者らは、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒがＭＳＩの検出のための感度が欠如しているという明確な証拠を提供する。これは、大規模な特化されたテスト施設で実施されたＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲ法により過去にＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲとして確認されたｍＣＲＣおよびｎｍＣＲＣ試料の大規模コホートで示された。これらの結果は、ＩＣＩ治療に特別な臨床関連性がある。それらの結果は、ＭＳＩ ｍＣＲＣ患者の前向きコホートにおいて、ＭＳＩ－ＰＣＲおよびＩＨＣテストを行わないＭＳＩＳｅｎｓｏｒのみからの結果の考察が、およそ１６％（４／１５）の患者がＩＣＩ処置を提供されないことにつながった。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより検出されなかった４名のうち、３名は、処置に応答することが見出された。大規模な後向き患者コホートにおいて本明細書で示されたｎｍＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のための感度の欠如は、リンチ症候群の検出不能などの他の有害な臨床結果も有する可能性がある。これらの知見から、それらは、ＣＲＣにおけるＭＳＩの同定のためのＮＧＳに基づく基準を緊急に変更する必要があると結論づけている。ＣＲＣ患者における本発明の結果は、見出されたＮＧＳが、ＩＣＫ遮断療法に対して長期の陽性反応を呈した前立腺患者２名からのｄＭＭＲ腫瘍においてＭＳＩを検出することができなかった別の試験の結果と一致する（３０）。両方の腫瘍が、多量の変異量および高密度の腫瘍内ＣＤ３細胞浸潤を示した。それゆえそれらは、ＴＣＧＡからの胃および子宮内膜腫瘍の本試験における解析によっても示唆されたとおり、ＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの低感度が、全ての腫瘍の型に適用される可能性を推定している。
複数の発表が、近年になり、全く別のコンピュテーショナルアルゴリズムを利用することによりヒト癌におけるＭＳＩの検出のためのＮＧＳの潜在性を強調した（１８、１９、２６～２９）。これらのうち、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒは、ＦＤＡ認可を受けており、腫瘍の原発部位にかかわらず、転移癌患者のＩＣＩ治療の処方を案内するのに用いられる。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒが、多数のＣＲＣをはじめとする進行固形癌でテストされた。しかし、このＮＧＳを元にしたテストの性能は、参照ＰＣＲおよびＩＨＣ法を用いて過去にＭＳＩ／ｄＭＭＲ状態を評定された大きなＣＲＣ群ではまだ評価されていない。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒの正確性は、ＭＳＩ／ｄＭＭＲ ｍＣＲＣと思われて次にＩＣＩで処置される患者にとって、特に重要である。この試験において、本発明者らは、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒがＭＳＩの検出のための感度が欠如しているという明確な証拠を提供する。これは、大規模な特化されたテスト施設で実施されたＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲ法により過去にＭＳＩ／ｄＭＭＲまたはＭＳＳ／ｐＭＭＲとして確認されたｍＣＲＣおよびｎｍＣＲＣ試料の大規模コホートで示された。これらの結果は、ＩＣＩ治療に特別な臨床関連性がある。それらの結果は、ＭＳＩ ｍＣＲＣ患者の前向きコホートにおいて、ＭＳＩ－ＰＣＲおよびＩＨＣテストを行わないＭＳＩＳｅｎｓｏｒのみからの結果の考察が、およそ１６％（４／１５）の患者がＩＣＩ処置を提供されないことにつながった。ＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより検出されなかった４名のうち、３名は、処置に応答することが見出された。大規模な後向き患者コホートにおいて本明細書で示されたｎｍＣＲＣにおけるＭＳＩの検出のための感度の欠如は、リンチ症候群の検出不能などの他の有害な臨床結果も有する可能性がある。これらの知見から、それらは、ＣＲＣにおけるＭＳＩの同定のためのＮＧＳに基づく基準を緊急に変更する必要があると結論づけている。ＣＲＣ患者における本発明の結果は、見出されたＮＧＳが、ＩＣＫ遮断療法に対して長期の陽性反応を呈した前立腺患者２名からのｄＭＭＲ腫瘍においてＭＳＩを検出することができなかった別の試験の結果と一致する（３０）。両方の腫瘍が、多量の変異量および高密度の腫瘍内ＣＤ３細胞浸潤を示した。それゆえそれらは、ＴＣＧＡからの胃および子宮内膜腫瘍の本試験における解析によっても示唆されたとおり、ＭＳＩの検出のためのＭＳＩＳｅｎｓｏｒの低感度が、全ての腫瘍の型に適用される可能性を推定している。
【0154】
ＭＳＩの検出のために本明細書で提案された新しいＭＳＩＣａｒｅバイオインフォマティクスツールは、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒに比較してかなり良好な性能を示す。それは、本明細書でテストされたＣＲＣコホートにおいてＰＣＲ－ＭＳＩに比較して１００％の感度および特異度を有し、こうしてゴールドスタンダートのＩＨＣおよびＭＳＩ－ＰＣＲ法の性能に一致する。重要なこととして、それは、最初にＭＳＩＳｅｎｓｏｒにより検出されなかった４例のｍＣＲＣにおいてＭＳＩを検出し、そのうち３例は、免疫療法に陽性反応を示した。臨床腫瘍学におけるＭＳＩの解析のための専門施設として、それらは、腫瘍ＤＮＡ中のＭＳＩ検出が特異度を有しながら高い感度になるように、このバイオアナリシスツールを最適化した。ＭＳＩＣａｒｅの使用により、ＭＳＩ原発腫瘍で当てはまることの多い、間質組織が多量に混入されたＣＲＣにおいてＭＳＩ癌を診断することを可能にした。注目すべきこととして、この新しいアルゴリズムは、ＭＬＨ１、ＭＳＨ２、ＭＳＨ６またはＰＭＳ２における原発ＭＭＲ欠陥にかかわらず、ＦＦＰＥおよび凍結した原発または転移組織試料の両方で同じ性能を示し、各々の組織材料が解析に適することが示唆される。
【0155】
とりわけＭＳＩＣａｒｅは、ＭＳＩ癌を診断することがより困難であるＭＳＨ６欠損のＣＲＣと、希少なＰＭＳ２欠損のＣＲＣと、においてＭＳＩを同定するのに、ＭＳＩＳｅｎｓｏｒと対照的に適していることが照合された。重要なこととして、同じくＭＳＩＳｅｎｓｏｒと対照的に、ＭＳＩの評定の性能は、マーカのＭＳＫ－Ｉｍｐａｃｔ（商標）パネルに制限された全体的または部分的エクソームデータで検定された場合に、依然として最適であった。ＭＳＩＣａｒｅはまた、腫瘍試料のターゲットシークエンシングに続いて最適に設計されたマイクロサテライトマーカセット（ＭＳＩＤＩＡＧ）と共に活用した場合に、素晴らしい性能を示した。独立したＣＲＣ群で異なるシークエンシング方策によりＭＳＩを検出するＭＳＩＣａｒｅの並外れた診断性能が、ＣＲＣにおいてＭＳＩを検出するこの方法の関連性を高レベルの証拠で検証する。ＭＳＩＤＩＡＧパネルは、腫瘍ＤＮＡ中のＭＳＩを検出するための特に興味深いモノヌクレオチド反復を含み、それゆえこのアッセイの最適感度のために、ターゲットシークエンシング解析においてこのパネルをＭＳＩＣａｒｅと共に使用することが、推奨される。要約すると、これらのデータは、ＭＳＩＣａｒｅが、自家製またはＦＤＡ認可のパネルを用いてＷＥＳまたはターゲットＮＧＳからのＣＲＣにおけるＭＳＩ表現型の決定のための新しいＮＧＳに基づく国際参照法になる潜在性を有することを確定している。特にＭＳＩは、転移環境で不可欠のセラノスティックバイオマーカになりつつあるため、ＣＲＣ患者の管理におけるトランスレーショナル・リサーチ、臨床試験および日常的臨床実技において非常に有用になるはずである。
【0156】
要約すると、特にＭＳＩは、転移環境で不可欠のセラノスティックバイオマーカになりつつあるため、ＭＳＩＣａｒｅは、ＣＲＣ患者および他の癌の管理において日常的臨床実技に非常に有用となろう。
【0157】
参考資料：
本出願全体を通して、様々な参考資料が、本発明が属する当該技術分野の先端技術を記載している。これらの参考資料の開示は、参照により本開示に組み入れられる。
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２７．Ｋａｕｔｔｏ ＥＡ， Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ Ｒ， Ｍｉｙａ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ＭＡＮＴＩＳ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：７４５２－７４６３．
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２７．Ｋａｕｔｔｏ ＥＡ， Ｂｏｎｎｅｖｉｌｌｅ Ｒ， Ｍｉｙａ Ｊ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐａｎ－ｃａｎｃｅｒ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｗｉｔｈ ＭＡＮＴＩＳ． Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ ２０１７；８：７４５２－７４６３．
２８．Ｖａｎｄｅｒｗａｌｄｅ Ａ， Ｓｐｅｔｚｌｅｒ Ｄ， Ｘｉａｏ Ｎ， ｅｔ ａｌ． Ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｉｎｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｓｔａｔｕｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｂｙ ｎｅｘｔ－ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ＰＤ－Ｌ１ ａｎｄ ｔｕｍｏｒ ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ ｂｕｒｄｅｎ ｉｎ １１，３４８ ｐａｔｉｅｎｔｓ． Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｄ ２０１８；７：７４６－７５６．
２９．Ｊｏｈａｎｓｅｎ ＡＦＢ， Ｋａｓｓｅｎｔｏｆｔ ＣＧ， Ｋｎｕｄｓｅｎ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏｓａｔｅｌｌｉｔｅ ｓｔａｔｕｓ ｕｓｉｎｇ ｗｈｏｌｅ ｅｘｏｍｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ ｆｒｏｍ ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ ｃａｎｃｅｒ ｐａｔｉｅｎｔｓ． ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ ２０１９；１９：９７１．
３０．Ａｎｔｏｎａｒａｋｉｓ ＥＳ， Ｐｉｕｌａｔｓ ＪＭ， Ｇｒｏｓｓ－Ｇｏｕｐｉｌ Ｍ， ｅｔ ａｌ． Ｐｅｍｂｒｏｌｉｚｕｍａｂ ｆｏｒ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ－Ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ Ｃａｓｔｒａｔｉｏｎ－Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ： Ｍｕｌｔｉｃｏｈｏｒｔ， Ｏｐｅｎ－Ｌａｂｅｌ Ｐｈａｓｅ ＩＩ ＫＥＹＮＯＴＥ－１９９ Ｓｔｕｄｙ． Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ ２０１９：ＪＣＯ１９０１６３８．
【図1】
【図2A】
【図2B】
【図2C】
【図3】
【図4A】
【図4B】
【図5A】
【図5B】
【図6A】
【図6B】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図9C】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【手続補正書】
【提出日】2023-10-02
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料と、入手可能ならば正常試料と、からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、または対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する前記腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）前記正常試料が入手可能であるか否かに応じて各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）前記ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、方法。
【請求項2】
ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ｖｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、ならびにｖｉｉ）ステップｖｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、請求項１に記載の必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法。
【請求項3】
ｉ）前記患者から得られた腫瘍試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記対応する正常試料中で少なくとも１２核酸の長さを有する前記腫瘍試料中のモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）前記ＭＮＲのための正常な多型ゾーンを評価すること、ｉｖ）各ＭＮＲの前記正常な多型ゾーンの外部のみの前記腫瘍試料中に出現した変異型ＭＮＲを評価すること、ｖ）前記腫瘍試料から得られた各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｖｉ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖｉｉ）調整Δ比を計算すること、ｖｉｉｉ）ＭＮＲのΔ比の総数に対する変異調整Δ比でのＭＮＲの数の比をとることによりＭＳＩＣａｒｅスコアを得ること、およびｉｘ）ステップｖｉｉｉ）で得られた前記ＭＳＩＣａｒｅスコアが、計算された閾値より大きい場合に、前記必要とする患者がＭＳＩ癌を有すると結論づけること、を含む、請求項１に記載の必要とする患者においてＭＳＩ癌を診断する方法。
【請求項4】
前記癌が、転移性であるか、または転移性でない、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記癌が、大腸癌、胃癌または子宮内膜癌である、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記結果を前記患者に伝達する更なるステップが追加される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
必要とする患者においてＭＳＩの変異を診断する方法であって、ｉ）前記患者から得られた腫瘍および正常試料からＤＮＡを抽出すること、ｉｉ）前記患者の前記正常試料の前記ＤＮＡ中の少なくとも１２核酸の長さを有するモノヌクレオチド反復（ＭＮＲ）配列と、前記患者の前記腫瘍試料の前記ＤＮＡ中の対応するＭＮＲと、の数（Ｎ）をシークエンシングすること、ｉｉｉ）各ＭＮＲのΔ比を計算すること、ｉｖ）前記腫瘍試料の腫瘍純度（ＴＰ）を計算すること、ｖ）調整Δ比を計算すること、ならびにｖｉ）前記調整Δ比が＜５０％であれば前記ＭＮＲが野生型であると結論づけて、前記調整Δ比が≧５０％であれば前記ＭＮＲが変異していると結論づけること、を含む、方法。
【請求項8】
請求項１～６のいずれか一項に記載のＭＳＩ癌を診断するための方法によりＭＳＩ癌を有すると同定された患者において癌を処置するための方法であって、前記患者に、治療有効量の放射線療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合わせを施すことを含む、方法。【国際調査報告】