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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】補体Ｃ３抗原結合タンパク質
(51)【国際特許分類】
C12N 15/13 20060101AFI20240220BHJP
C07K 16/46 20060101ALI20240220BHJP
C07K 16/18 20060101ALI20240220BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240220BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240220BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240220BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240220BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240220BHJP
C12P 21/08 20060101ALI20240220BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240220BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240220BHJP
A61P 27/02 20060101ALI20240220BHJP
A61P 27/06 20060101ALI20240220BHJP
A61P 9/10 20060101ALI20240220BHJP
A61P 29/00 20060101ALI20240220BHJP
A61P 19/02 20060101ALI20240220BHJP
A61P 17/06 20060101ALI20240220BHJP
G01N 33/53 20060101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
C12N15/13
C07K16/46 ZNA
C07K16/18
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P21/08
A61P43/00 111
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P27/02
A61P27/06
A61P9/10
A61P29/00 101
A61P19/02
A61P17/06
G01N33/53 D
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548779
(86)(22)【出願日】2022-02-11
(85)【翻訳文提出日】2023-08-09
(86)【国際出願番号】 EP2022053308
(87)【国際公開番号】W WO2022171771
(87)【国際公開日】2022-08-18
(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/053526
(32)【優先日】2021-02-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】503385923
【氏名又は名称】ベーリンガー インゲルハイム インターナショナル ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング
(71)【出願人】
【識別番号】523304401
【氏名又は名称】ツェーデーエァ－ライフ アクチェンゲゼルシャフト
(74)【代理人】
【識別番号】100094569
【弁理士】
【氏名又は名称】田中 伸一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100103610
【弁理士】
【氏名又は名称】▲吉▼田 和彦
(74)【代理人】
【識別番号】100109070
【弁理士】
【氏名又は名称】須田 洋之
(74)【代理人】
【識別番号】100119013
【弁理士】
【氏名又は名称】山崎 一夫
(74)【代理人】
【識別番号】100123777
【弁理士】
【氏名又は名称】市川 さつき
(74)【代理人】
【識別番号】100111796
【弁理士】
【氏名又は名称】服部 博信
(74)【代理人】
【識別番号】100123766
【弁理士】
【氏名又は名称】松田 七重
(74)【代理人】
【識別番号】100156982
【弁理士】
【氏名又は名称】秋澤 慈
(72)【発明者】
【氏名】ボラス レオナルド
(72)【発明者】
【氏名】エッシャー ドミニク
(72)【発明者】
【氏名】ユングミヒェル シュテファニ
(72)【発明者】
【氏名】ライズナー クリスティアン
(72)【発明者】
【氏名】リヒレ フィリップ ローベルト
(72)【発明者】
【氏名】シャイフェレ ファビアン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
4C085
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG27
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA13
4B065AA01X
4B065AA57X
4B065AA72X
4B065AA87X
4B065AA92Y
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA25
4B065CA44
4C085AA13
4C085AA14
4C085BB41
4C085BB44
4C085CC01
4C085CC07
4C085DD62
4C085EE01
4C085GG10
4H045AA11
4H045AA30
4H045DA76
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA74
(57)【要約】
【課題】補体Ｃ３に対する特異性を有する抗原結合タンパク質を提供する。
【解決手段】補体Ｃ３及びＣ３ｂに対する特異性を有する抗原結合タンパク質が提供される。補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置する方法、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び／又は代替経路（ＡＰ）の活性を阻害する方法、並びに脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害する方法もまた提供される。
【選択図】なし
【解決手段】補体Ｃ３及びＣ３ｂに対する特異性を有する抗原結合タンパク質が提供される。補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置する方法、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び／又は代替経路（ＡＰ）の活性を阻害する方法、並びに脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害する方法もまた提供される。
【選択図】なし
【特許請求の範囲】
【請求項1】
補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片であって、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）及び代替経路（ＡＰ）を含む補体活性化経路を阻害することができる抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項2】
補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる、請求項１に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項3】
補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合がＣ３転換酵素の形成を妨げる、請求項１に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項4】
ブルッフ膜を貫通することができる、請求項１～３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項5】
Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる、請求項１～４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項6】
一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、小抗体模倣物又は単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、Ｖ－Ｎａｒ又はＶＨＨを含む、請求項１～５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項7】
配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項8】
可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨが、配列番号１、４、７、１３、及び１９からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２、５、８、１４、及び２０からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ２配列、配列番号３、６、９、１５、及び２１からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、
ＶＬが、配列番号１０、１６、及び２２からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１、１７、及び２３からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ２配列、並びに配列番号１２、１８、及び２４からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項9】
ＶＨが、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬが、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項１～８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項10】
ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨが、配列番号７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号８のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、
ＶＬが、配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項11】
ＶＨが配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号２８のアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項12】
ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨが、配列番号１３のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１４のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；
ＶＬが、配列番号１６のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１７のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項13】
ＶＨが配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号３０のアミノ酸配列を含む、請求項１２に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項14】
ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨが、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；
ＶＬが、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項15】
ＶＨが配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＶＬが配列番号３２のアミノ酸配列を含む、請求項１４に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項16】
ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインが、配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項17】
ＶＨＨドメインが配列番号２５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項18】
ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインが、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項19】
ＶＨＨドメインが配列番号２６のアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項20】
Ｃ３及びＣ３ｂに対する少なくとも約１０-8Ｍの結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項21】
Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍの結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項22】
Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-10Ｍ～約１０-12Ｍの結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項23】
Ｃ３及びＣ３ｂに対するほぼ同等の結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項24】
Ｃ３に対する結合親和性が、Ｃ３ｂに対する結合親和性の１０倍以内である、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項25】
Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５、及び／又はＣ５ｂに対する約１０-4Ｍ又はそれより弱い結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項26】
Ｃ３及びＣ３ｂに対する結合親和性と比較して、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する弱い結合親和性を含む、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項27】
Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する結合親和性を含まない、請求項１～１９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項28】
ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路からなる群のいずれか１つの活性を阻害することができる、請求項１～２７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項29】
ＣＰ、ＬＰ、及び／又はＡＰ補体経路の活性を少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％阻害することができる、請求項１～２８のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項30】
ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性をほぼ同等に阻害することができる、請求項１～２９のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項31】
ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性の阻害が、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である、請求項３０に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項32】
ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性が、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下における赤血球溶血のレベルと比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下における赤血球溶血のレベルを測定することによって決定される、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項33】
ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性が、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下での膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成と比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下でのＭＡＣ形成を測定することによって決定される、請求項２８～３１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項34】
Ｃ３転換酵素の活性を少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％阻害することができる、請求項１～３３のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項35】
Ｃ３転換酵素増幅ループを阻害することができる、請求項１～３４のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項36】
脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる、請求項１～３５のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項37】
約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量を含む、請求項１～３６のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項38】
約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項39】
約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項40】
約２５ｋＤａの分子量を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項41】
約１５ｋＤａの分子量を含む、請求項１～３７のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項42】
抗原結合タンパク質又はその断片が、カニクイザルＣ３との交差反応性を含む、請求項１～４１のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項43】
対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置するための医薬組成物を調製するための、請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片の使用。
【請求項44】
請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項45】
低粘度を含む、請求項４３又は４４に記載の医薬組成物。
【請求項46】
粘度が約１ｃＰ～約５０ｃＰである、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項47】
粘度が約２０ｃＰ未満又はそれに等しい、請求項４５に記載の医薬組成物。
【請求項48】
請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片をコードする単離された核酸分子。
【請求項49】
請求項４８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項50】
請求項４９に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項51】
請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片を製造する方法であって、（ｉ）請求項１～４２のいずれか１項に記載のタンパク質の発現を可能にする条件下で、請求項５０に記載の宿主細胞を培養する工程と、
（ｉｉ）タンパク質を回収する工程と、任意で
（ｉｉｉ）タンパク質をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化する工程と
を含む方法。
【請求項52】
対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項53】
対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、請求項１～４２及び５２のいずれか１項の抗原結合タンパク質又はその断片を投与することを含む方法。
【請求項54】
抗原結合タンパク質又はその断片が、局所、結膜下、硝子体内、球後、及び／又は前房内投与によって投与される、請求項５３に記載の方法、又は請求項５２に記載の使用するための抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項55】
補体Ｃ３介在性疾患又は障害が、加齢性黄斑変性、地図状萎縮、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児の網膜症、水晶体後線維形成症、自己免疫性ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、リウマチ性関節炎、乾癬及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される、請求項５３又は５４に記載の方法、又は請求項５２若しくは５４に記載の使用するための抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項56】
補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の活性を阻害することによって、又は脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害することによって、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片。
【請求項57】
補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３を、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片と接触させることを含む方法。
【請求項58】
脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片を眼内投与することを含む方法。
【請求項59】
抗原結合タンパク質又はその断片が補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる、請求項５７又は５８に記載の方法。
【請求項60】
抗原結合タンパク質又はその断片が、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、そのような結合がＣ３転換酵素の形成を妨げる、請求項５７～５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項61】
抗原結合タンパク質又はその断片が、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８、及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる、請求項５７～６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項62】
抗原結合タンパク質又はその断片が、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、小抗体模倣物又は単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、Ｖ－Ｎａｒ又はＶＨＨを含む、請求項５７～６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項63】
抗原結合タンパク質又はその断片が、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項64】
抗原結合タンパク質又はその断片が可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨが、配列番号１、４、７、１３、及び１９からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２、５、８、１４、及び２０からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ２配列、配列番号３、６、９、１５、及び２１からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ３配列を含み、
ＶＬが、配列番号１０、１６、及び２２からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１、１７、及び２３からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ２配列、並びに配列番号１２、１８、及び２４からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ３配列を含む、請求項５７～６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項65】
ＶＨが、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬが、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有する、請求項６４に記載の方法。
【請求項66】
抗原結合タンパク質又はその断片がブルッフ膜を貫通することができる、請求項５７～６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項67】
抗原結合タンパク質又はその断片が脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる、請求項５７～６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項68】
抗原結合タンパク質又はその断片が約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量を含む、請求項５７～６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項69】
抗原結合タンパク質又はその断片が、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を含む、請求項５７～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項70】
抗原結合タンパク質又はその断片が約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む、請求項５７～６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項71】
抗原結合タンパク質又はその断片が約２５ｋＤａの分子量を含む、請求項５７～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項72】
抗原結合タンパク質又はその断片が約１５ｋＤａの分子量を含む、請求項５７～６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項73】
生物学的試料中のＣ３及びＣ３ｂの一方又は両方を検出する方法であって、（ａ）試料を、請求項１～４２のいずれか１項に記載の少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片と接触させる工程と、
（ｂ）試料中のＣ３及びＣ３ｂの一方又は両方と抗原結合タンパク質又はその断片との間の複合体の形成を可能にする工程と、
（ｃ）前記抗原結合タンパク質又はその断片を検出する工程と
を含む方法。
【請求項74】
抗原結合タンパク質又はその断片が、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる、請求項７３に記載の方法。
【請求項75】
抗原結合タンパク質又はその断片が、検出可能なシグナルによって検出される、請求項７３又は７４に記載の方法。
【請求項76】
生物学的試料が、網膜組織などの組織試料である、請求項７３～７５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項77】
Ｃ３を検出するためのキットであって、請求項１～４２のいずれか１項に記載の抗原結合タンパク質又はその断片及び使用説明書を含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、補体Ｃ３を標的とする抗原結合タンパク質、及び補体Ｃ３介在性疾患を処置する方法に関する。
【背景技術】
【0002】
ある特定の眼疾患及び眼障害の処置における主要な課題は、網膜の深層への治療分子の送達である。送達は、眼内の複数の物理的境界を含む複数の因子によって妨げられる。これらの境界には、角膜及び結膜上皮、血液－水性関門（ＢＡＢ）、並びに毛細血管内皮細胞（内側ＢＲＢ）及び網膜色素上皮細胞などの血液網膜関門（ＢＲＢ）が含まれる（例えば、Jiang et al. Int J Ophthalmol. 2018; 11(6): 1038-1044を参照されたい）。網膜への送達が特に重要な眼疾患は、地図状萎縮（ＧＡ）などの補体介在性疾患である。
地図状萎縮（ＧＡ）は、黄斑における網膜色素上皮及び光受容体の消失によって特徴付けられる加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の進行型である。ＧＡが中心窩を侵すと、不可逆的な視力低下が起こる。ＧＡの初期段階の患者は、典型的には、視力が影響を受ける前でも視機能障害を経験する。
地図状萎縮の基礎にある病態生理は完全には解明されていないが、補体活性の調節障害が寄与因子であると考えられている。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ－９及び補体因子Ｈ（ＣＦＨ）を含むいくつかの補体活性化産物は、対照と比較してＧＡ患者の硝子体試料、ブルッフ膜、及び脈絡膜の他の部分において上昇したレベルを示している。さらに、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成の膜結合型阻害剤であるＣＤ５９、及び補体因子Ｉ（ＣＦＩ）の補因子活性を有する膜結合型補体調節因子である膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）などの補体阻害剤は、ＧＡにおいてレベルが減少していることが報告されている。
地図状萎縮（ＧＡ）は、黄斑における網膜色素上皮及び光受容体の消失によって特徴付けられる加齢黄斑変性（ＡＭＤ）の進行型である。ＧＡが中心窩を侵すと、不可逆的な視力低下が起こる。ＧＡの初期段階の患者は、典型的には、視力が影響を受ける前でも視機能障害を経験する。
地図状萎縮の基礎にある病態生理は完全には解明されていないが、補体活性の調節障害が寄与因子であると考えられている。Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、Ｃ５ｂ－９及び補体因子Ｈ（ＣＦＨ）を含むいくつかの補体活性化産物は、対照と比較してＧＡ患者の硝子体試料、ブルッフ膜、及び脈絡膜の他の部分において上昇したレベルを示している。さらに、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成の膜結合型阻害剤であるＣＤ５９、及び補体因子Ｉ（ＣＦＩ）の補因子活性を有する膜結合型補体調節因子である膜補因子タンパク質（ＭＣＰ）などの補体阻害剤は、ＧＡにおいてレベルが減少していることが報告されている。
【0003】
現在のところ、ＧＡに対する承認された処置法はない。補体経路を標的とした複数の調査的アプローチが検討されているが、まだ承認されておらず、有効であることが証明されていない。このようなアプローチのいくつかの例には、エクリズマブ／ＳＯＬＩＲＩＳ（Ａｌｅｘｉｏｎ）、ＬＦＧ－３１６（Ｎｏｖａｒｔｉｓ／ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ）、ＡＲＣ－１９０５（Ｏｐｈｔｈｏｔｅｃｈ）、ＰＯＴ－４（ＡＬ－７８８９８Ａ；Ａｌｃｏｎ）及びランパリズマブ（ＦＣＦＤ４５１４２）が含まれる。
さらに最近では、ＡＰＬ－２の第ＩＩ相臨床試験（臨床試験ＮＣＴ０２５０３３２「地図状萎縮患者におけるＡＰＬ－２療法の研究（ＦＩＬＬＹ）」）の知見が、ＧＡの病因に補体経路をさらに関与させ、補体阻害を介したＧＡの進行抑制において正の処置効果を示す。これらの結果はまた、Ｃ３（全ての補体経路の収束である；図１を参照されたい）における補体カスケードの中心的なＡＰＬ－２阻害が、補体経路の部分的阻害をもたらす阻害剤により可能であることよりも効果的にＧＡを処置する可能性を有し得ることを示唆する。にもかかわらず、ＡＰＬ－２により得られたＧＡにおける病変増殖の減少は依然として僅かである。ＡＰＬ－２には、その有効性を制限する可能性のある特徴がある。環状トリデカペプチドコンプスタチンのペグ化誘導体であるＡＰＬ－２（補体成分Ｃ３の阻害剤）は、３５０ｋＤａの大きな分子量当量と約７．８ｎｍの流体力学的半径を有し、網膜に深く浸透することを困難にする。ＡＰＬ－２は、おそらく３．５ｍＭの低濃度のため、有効期間が１カ月しかない。ＡＰＬ－２はまた、ＰＥＧ化分子であり、その粘度を増加させ、眼への注入を困難にする可能性がある。したがって、より効率的にＧＡ進行を減少させる必要がある。
さらに最近では、ＡＰＬ－２の第ＩＩ相臨床試験（臨床試験ＮＣＴ０２５０３３２「地図状萎縮患者におけるＡＰＬ－２療法の研究（ＦＩＬＬＹ）」）の知見が、ＧＡの病因に補体経路をさらに関与させ、補体阻害を介したＧＡの進行抑制において正の処置効果を示す。これらの結果はまた、Ｃ３（全ての補体経路の収束である；図１を参照されたい）における補体カスケードの中心的なＡＰＬ－２阻害が、補体経路の部分的阻害をもたらす阻害剤により可能であることよりも効果的にＧＡを処置する可能性を有し得ることを示唆する。にもかかわらず、ＡＰＬ－２により得られたＧＡにおける病変増殖の減少は依然として僅かである。ＡＰＬ－２には、その有効性を制限する可能性のある特徴がある。環状トリデカペプチドコンプスタチンのペグ化誘導体であるＡＰＬ－２（補体成分Ｃ３の阻害剤）は、３５０ｋＤａの大きな分子量当量と約７．８ｎｍの流体力学的半径を有し、網膜に深く浸透することを困難にする。ＡＰＬ－２は、おそらく３．５ｍＭの低濃度のため、有効期間が１カ月しかない。ＡＰＬ－２はまた、ＰＥＧ化分子であり、その粘度を増加させ、眼への注入を困難にする可能性がある。したがって、より効率的にＧＡ進行を減少させる必要がある。
【0004】
ＧＡの処置における大きな課題の１つは、観察された補体活性の調節異常が網膜の深層で起こることである。本発明者らは、ＧＡにおける病変増殖のより大きな減少を達成するためには、疾患関連網膜組織（すなわち、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、ブルッフ膜、及び脈絡膜の他の部分）へのより良好な浸透が必要であると仮定する。このため、小抗体断片は、他の生物製剤及び抗体と比較していくつかの利点を有する。小抗体フォーマットは、１）関連する網膜組織へのより良好な眼内浸透；及び２）硝子体内注射により送達される１ｍｇ又はｍＬあたりのより多くの薬物を可能にし得る。
【発明の概要】
【0005】
本開示は、補体Ｃ３に対する特異性を有する抗原結合タンパク質を提供する。
一態様では、本開示は、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片であって、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）を含む補体活性化の経路を阻害することができる抗原結合タンパク質又はその断片を提供する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合は、Ｃ３転換酵素の形成を妨げる。
一態様では、本開示は、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片であって、古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）を含む補体活性化の経路を阻害することができる抗原結合タンパク質又はその断片を提供する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合は、Ｃ３転換酵素の形成を妨げる。
【0006】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８、及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、小抗体模倣物又は単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、Ｖ－Ｎａｒ又はＶＨＨを含む。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、小抗体模倣物又は単一ドメイン抗体、例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、Ｖ－Ｎａｒ又はＶＨＨを含む。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ｓｃＦｖ又はＶＨＨを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
【0007】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号１、４、７、１３、及び１９からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２、５、８、１４、及び２０からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号３、６、９、１５、及び２１からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号１０、１６、及び２２からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１、１７、及び２３からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１２、１８、及び２４からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
【0008】
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有する。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号８のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号７のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号８のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号９のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号１０のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１２のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは配列番号２７のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号２８のアミノ酸配列を含む。
【0009】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１３のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号１４のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号１５のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号１６のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１７のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１８のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは配列番号２９のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３０のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨ及びＶＬを含み、ＶＨは、配列番号１９のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２０のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号２１のＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；ＶＬは、配列番号２２のＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号２３のＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号２４のＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
【0010】
ある特定の実施形態では、ＶＨは配列番号３１のアミノ酸配列を含み、ＶＬは配列番号３２のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインは、配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインは、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインは、配列番号１のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号３のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨＨドメインは、配列番号２５のアミノ酸配列を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＶＨＨドメインを含み、ＶＨＨドメインは、配列番号４のＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号５のＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号６のＣＤＲ－Ｈ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨＨドメインは、配列番号２６のアミノ酸配列を含む。
【0011】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する少なくとも約１０-8Ｍの結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-9Ｍ～約１０-14Ｍの結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-10Ｍ～約１０-12Ｍの結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対するほぼ同等の結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、Ｃ３に対する結合親和性は、Ｃ３ｂに対する結合親和性の１０倍以内である。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する約１０-4Ｍ又はそれより弱い結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する結合親和性と比較して、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５、及び／又はＣ５ｂに対する弱い結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する結合親和性を含まない。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する約１０-4Ｍ又はそれより弱い結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する結合親和性と比較して、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５、及び／又はＣ５ｂに対する弱い結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する結合親和性を含まない。
【0012】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性を少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性を同等又はほぼ同等に阻害することができる。ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性の阻害は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下における赤血球溶血のレベルと比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下における赤血球溶血のレベルを測定することによって決定される。
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成と比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下におけるＭＡＣ形成を測定することによって決定される。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性を同等又はほぼ同等に阻害することができる。ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性の阻害は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下における赤血球溶血のレベルと比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下における赤血球溶血のレベルを測定することによって決定される。
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、抗原結合タンパク質又はその断片の非存在下における膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成と比較して、抗原結合タンパク質又はその断片の存在下におけるＭＡＣ形成を測定することによって決定される。
【0013】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３転換酵素の活性を少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３転換酵素増幅ループを阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ブルッフ膜を貫通することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３転換酵素増幅ループを阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ブルッフ膜を貫通することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる。
【0014】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２５ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１５ｋＤａの分子量を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、カニクイザルＣ３との交差反応性を含む。
一態様では、本開示は、上述の抗原結合タンパク質又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。したがって、一態様は、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置するための医薬組成物の調製における本発明の結合タンパク質の使用である。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、低粘度を含む。
ある特定の実施形態では、粘度は、約１ｃＰ～約５０ｃＰである。ある特定の実施形態では、粘度は、約２０ｃＰ未満又はそれに等しい。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、カニクイザルＣ３との交差反応性を含む。
一態様では、本開示は、上述の抗原結合タンパク質又はその断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。したがって、一態様は、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置するための医薬組成物の調製における本発明の結合タンパク質の使用である。
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、低粘度を含む。
ある特定の実施形態では、粘度は、約１ｃＰ～約５０ｃＰである。ある特定の実施形態では、粘度は、約２０ｃＰ未満又はそれに等しい。
【0015】
一態様では、本開示は、上述の抗原結合タンパク質又はその断片をコードする単離された核酸分子を提供する。
別の態様では、本開示は、上述の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
さらに別の態様では、本開示は、上述の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の態様では、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載されるタンパク質の発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程と、
ｉｉ）タンパク質を回収する工程と、任意に
ｉｉｉ）タンパク質をさらに精製し及び／又は修飾し及び／又は製剤化する工程と
を含む方法が提供される。
別の態様では、本開示は、上述の核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
さらに別の態様では、本開示は、上述の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
さらに別の態様では、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載されるタンパク質の発現を可能にする条件下で、上記の宿主細胞を培養する工程と、
ｉｉ）タンパク質を回収する工程と、任意に
ｉｉｉ）タンパク質をさらに精製し及び／又は修飾し及び／又は製剤化する工程と
を含む方法が提供される。
【0016】
一態様では、本開示は、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法であって、それを必要とする対象に、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を投与することを含む方法を提供する。したがって、本開示はまた、補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を提供する。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、局所、結膜下、硝子体内、球後、及び／又は前房内投与を介して投与される。
特定の実施形態では、補体Ｃ３介在性疾患又は障害は、年齢関連黄斑変性、地図状萎縮、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維形成、自己免疫性ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、関節リウマチ、乾癬及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
特定の実施形態では、補体Ｃ３介在性疾患又は障害は、年齢関連黄斑変性、地図状萎縮、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維形成、自己免疫性ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、関節リウマチ、乾癬及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。
【0017】
一態様では、本開示は、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３を、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片と接触させることを含む方法を提供する。したがって、本開示は、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の活性を阻害することによって、補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、本明細書に記載される抗原結合タンパク質又はその断片を提供する。本開示はまた、脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害することによって、補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を提供する。
一態様では、本開示は、脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片の眼内投与を含む方法を提供する。
一態様では、本開示は、脈絡膜局在化補体Ｃ３の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片の眼内投与を含む方法を提供する。
【0018】
本明細書に記載される方法のある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合は、Ｃ３転換酵素の形成を妨げる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８、及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、又はＶＨＨを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合は、Ｃ３転換酵素の形成を妨げる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８、及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ断片、又はＶＨＨを含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、配列番号３、配列番号６、配列番号９、配列番号１５、及び配列番号２１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有するＣＤＲ－Ｈ３を含む。
【0019】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、可変重鎖（ＶＨ）及び可変軽鎖（ＶＬ）を含み、ＶＨは、配列番号１、４、７、１３、及び１９からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ１配列、配列番号２、５、８、１４、及び２０からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ２配列、及び配列番号３、６、９、１５、及び２１からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｈ３配列を含み；配列番号１０、１６、及び２２からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ１配列、配列番号１１、１７、及び２３からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ２配列、及び配列番号１２、１８、及び２４からなる群から選択されるＣＤＲ－Ｌ３配列を含む。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有する。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の類似性を有する。
ある特定の実施形態では、ＶＨは、配列番号２５、２６、２７、２９、及び３１からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有し、並びに／又はＶＬは、配列番号２８、３０、及び３２からなる群の配列と少なくとも８０％の同一性を有する。
【0020】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ブルッフ膜を貫通することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量、例えば、約５０ｋＤａ又はそれ未満、約４０ｋＤａ又はそれ未満、約３５ｋＤａ又はそれ未満、約３０ｋＤａ又はそれ未満、約２５ｋＤａ又はそれ未満、約２０ｋＤａ又はそれ未満、約１５ｋＤａ又はそれ未満を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２５ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１５ｋＤａの分子量を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、脈絡膜Ｃ３活性を阻害することができる。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量、例えば、約５０ｋＤａ又はそれ未満、約４０ｋＤａ又はそれ未満、約３５ｋＤａ又はそれ未満、約３０ｋＤａ又はそれ未満、約２５ｋＤａ又はそれ未満、約２０ｋＤａ又はそれ未満、約１５ｋＤａ又はそれ未満を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約２５ｋＤａの分子量を含む。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、約１５ｋＤａの分子量を含む。
【0021】
一態様において、本開示は、生物学的試料中のＣ３及びＣ３ｂの１つ又は両方を検出する方法であって、
（ａ）試料を、上述の少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片と接触させる工程と、
（ｂ）試料中のＣ３及びＣ３ｂの一方又は両方と抗原結合タンパク質又はその断片との間の複合体の形成を可能にする工程と、
（ｃ）上記抗原結合タンパク質又はその断片を検出する工程と
を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出可能なシグナルによって検出される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
（ａ）試料を、上述の少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片と接触させる工程と、
（ｂ）試料中のＣ３及びＣ３ｂの一方又は両方と抗原結合タンパク質又はその断片との間の複合体の形成を可能にする工程と、
（ｃ）上記抗原結合タンパク質又はその断片を検出する工程と
を含む方法を提供する。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３及びＣ３ｂに結合することができる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出可能なシグナルによって検出される。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
【0022】
生物学的試料は、組織試料、例えば、固定組織試料などのヒト対象の網膜組織であり得る。固定組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋の組織試料であり得る。
一態様では、Ｃ３を検出するためのキットであって、上述の抗原結合タンパク質又はその断片及び使用説明書を含むキットが提供される。
本発明の上述した並びに他の特徴及び利点は、添付の図面と関連して取られる例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解される。この特許又は特許出願公開の写し及びカラー図面（複数可）は、請求及び必要な手数料の納付があったときは、特許庁により提供される。
一態様では、Ｃ３を検出するためのキットであって、上述の抗原結合タンパク質又はその断片及び使用説明書を含むキットが提供される。
本発明の上述した並びに他の特徴及び利点は、添付の図面と関連して取られる例示的な実施形態の以下の詳細な説明からより完全に理解される。この特許又は特許出願公開の写し及びカラー図面（複数可）は、請求及び必要な手数料の納付があったときは、特許庁により提供される。
【図面の簡単な説明】
【0023】
【図1】Ｃ３に収束する３つの補体経路である古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）及び代替経路（ＡＰ）を示す図である。
【図2】抗Ｃ３抗体ライブラリーを作製するプロセスを示す図である。
【図3A-3B】ウサギ及びラマにおけるＣ３に対する優れた免疫応答を確認するＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。図３Ａは、ヒト血漿から単離されたＣ３タンパク質を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。図３Ｂは、図３Ａに示される単離されたヒトＣ３を注射されたウサギ（上段パネル）及びラマ（下段パネル）の血清中の抗Ｃ３抗体の存在を試験するＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図5】抗Ｃ３抗体のスクリーニングのプロセスを示す図である。
【図6】Ｃ３を標的とする候補抗体の、ヒト血清中の３つの全ての補体経路を阻害するそれらの能力についてのスクリーニングを示す図である。各抗体を２μＭの濃度で使用した。
【図7A-7D】３つの全ての補体経路を阻害する４つの抗Ｃ３抗体が、Ｃ３上の３つの異なるエピトープを認識することを示す図である。図７Ａは、Ｍ０１２２と他の３つの抗Ｃ３抗体それぞれとの間に競合がないことを示す競合アッセイを示す。図７Ｂは、Ｍ０１２４と他の３つの抗Ｃ３抗体それぞれとの間に競合がないことを示す競合アッセイを示す。図７Ｃは、Ｍ０２２８とＭ０２５１の間に競合があるが、Ｍ０１２４とＭ０１２２の間に競合がないことを示す競合アッセイを示す。図７Ｄは、Ｍ０１２３とＭ０２５１、及びＭ０１２３とＭ０２２８の間に競合があるが、Ｍ０１２４とＭ０１２２の間に競合がないことを示す競合アッセイを示す。
【図8A-8B】、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８がＣ３とＣ３ｂの両方に直接結合することを示す図である。図８Ａは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８がＣ３に直接結合することを示すＥＬＩＳＡアッセイを示す。図８Ｂは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８がＣ３ｂに直接結合することを示すＥＬＩＳＡアッセイを示す。
【図9A-9B】Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８が古典経路及び代替経路を強力に阻害することを示す図である。図９Ａは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８が古典経路を強力に阻害することを示す。図９Ｂは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８が代替経路を強力に阻害することを示す。
【図10】Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８の親和性パラメータを示す図である。
【図11】網膜及び脈絡膜、例えばブルッフ膜の解剖学的構造の概略図を示す。本開示の抗Ｃ３ ｓｃＦｖ抗体は、ブルッフ膜を貫通して脈絡膜に深く入ることができ、一方、比較Ｃ３結合治療薬ＡＰＬ－２は、ブルッフ膜を貫通することができないものとして示される。同じ原理は、本発明の他の抗原結合タンパク質フォーマットにも適用される。
【図12】流体力学的半径と透過性の間の負の関係を示し、本開示のｓｃＦｖと比較して示される補体結合療法を示す図である。
【図13】図１３Ａ及び図１４Ｂは、ブルッフ膜を貫通するためのｓｃＦｖ及びＡＰＬ－２代理物の比較を示す図である。図１４Ａはヨウ化バリウム染色（ＰＥＧ）を示し、図１３Ｂはクーマシー染色（タンパク質）を示す。ＡＰＬ２－代理物は、４０ｋＤａの線状ＰＥＧ上に１つのＡＰＬ－１部分を含む。ＳＣ－試料チャンバー、ＤＣ－拡散物チャンバー、ＬＣ－ローディングコントロール（ＳＣの初期濃度）。
【図14A-14C】Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１が、シアノ血清中の古典経路、代替経路及びレクチン経路を強力に阻害することを示す図である。図１４Ａは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１が、３つの全ての経路を強力に阻害することを示す。各抗体を２μＭの濃度で使用した。図１４Ｂは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１が古典経路を強力に阻害することを示す。図１４Ｃは、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１が代替経路を強力に阻害することを示す。
【図16】Ｍ０１２２、Ｍ０１２３及びＭ０１２４がレクチン経路を強力に阻害することを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【0024】
補体Ｃ３及び補体Ｃ３切断産物であるＣ３ｂに対する結合特異性を有する抗原結合タンパク質が提供される。補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置又は予防する方法もまた提供される。
ある特定の態様では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）を阻害することができる。本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、３つの全ての経路を同時に阻害し得る。本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜における３つの全ての経路を阻害し得る。
ある特定の態様では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）を阻害することができる。本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、３つの全ての経路を同時に阻害し得る。本明細書に記載される抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜における３つの全ての経路を阻害し得る。
【0025】
一般に、本明細書に記載される細胞及び組織の培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸の化学、及びハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用される。本明細書において提供される方法及び技術は、一般に、当該技術分野において周知である従来の方法に従って、また、別段の指示がない限り、本明細書全体にわたって引用され検討される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されているように行われる。酵素反応及び精製技術は、当該技術分野において一般的に達成されるか又は本明細書に記載されるように、製造業者の仕様に従って行われる。本明細書に記載される分析化学、有機合成化学、及び医薬品化学に関連して使用される命名法、並びにそれらの実験手順及び技術は周知であり、当該技術分野において一般的に使用されている。標準的な技術は、化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、送達、及び患者の処置に使用される。
【0026】
本明細書に別段の定義がない限り、本明細書において使用される科学用語及び技術用語は、当業者に一般的に理解される意味を有する。いずれかの潜在的な曖昧さがある場合、本明細書に提供される定義は、辞書又は外来の定義よりも優先される。文脈上別段の要求がない限り、単数語は複数を含み、複数語は単数語を含むものとする。「又は」の使用は、特に断らない限り、「及び／又は」を意味する。用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、並びに「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」などの他の形態の使用は、非限定的である。
本発明をより容易に理解できるように、最初に特定の用語を定義する。
本発明をより容易に理解できるように、最初に特定の用語を定義する。
【0027】
抗原結合タンパク質
本明細書で使用される場合、用語「抗体」又は「抗原結合タンパク質」とは、抗原又はエピトープに特異的に結合するか、又は免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方、並びに機能性抗体断片、例えば、限定されないが、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ＶＨＨ）断片が含まれる。用語「抗体」には、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）などの、免疫グロブリンの遺伝的に操作されたか又は他には修飾された形態が含まれる。別段の記載がない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含するものと理解されるべきである。本明細書で使用される用語「抗体断片」には、抗原、すなわち抗体模倣物を選択的に結合するように設計された人工タンパク質が含まれる。典型的には、１つ以上のＣＤＲは、非Ｉｇ足場にグラフトされ、それによって親抗体からのＣＤＲコンホメーションを模倣する。このような抗体模倣物の非限定的な例には、ゆらぎ調節親和性タンパク質（ＦＬＡＰ）、モノボディ及びアフィマーが含まれる。抗体模倣物は、本明細書に記載されるように、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「抗体」又は「抗原結合タンパク質」とは、抗原又はエピトープに特異的に結合するか、又は免疫学的に反応性である免疫グロブリン分子を指し、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方、並びに機能性抗体断片、例えば、限定されないが、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ’）2断片、Ｆａｂ’断片、Ｆｖ断片、組換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ、ＶＨＨ）断片が含まれる。用語「抗体」には、イントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、タンデムジ－ｓｃＦｖ、タンデムトリ－ｓｃＦｖ）などの、免疫グロブリンの遺伝的に操作されたか又は他には修飾された形態が含まれる。別段の記載がない限り、用語「抗体」は、その機能性抗体断片を包含するものと理解されるべきである。本明細書で使用される用語「抗体断片」には、抗原、すなわち抗体模倣物を選択的に結合するように設計された人工タンパク質が含まれる。典型的には、１つ以上のＣＤＲは、非Ｉｇ足場にグラフトされ、それによって親抗体からのＣＤＲコンホメーションを模倣する。このような抗体模倣物の非限定的な例には、ゆらぎ調節親和性タンパク質（ＦＬＡＰ）、モノボディ及びアフィマーが含まれる。抗体模倣物は、本明細書に記載されるように、ＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つを含み得る。
【0028】
本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」は、可変軽鎖（ＶＬ）ドメイン及び軽鎖（ＣＬ）の定常ドメイン、並びに可変重鎖（ＶＨ）ドメイン及び重鎖の第１定常ドメイン（ＣＨ１）を含む軽鎖断片を含む抗体断片である。Ｆａｂ断片は、一般に、約５０ｋＤａの分子量及び約３．０ｎｍの流体力学的半径を有する。
本明細書で使用される場合、「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗原結合タンパク質である。ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインは、あらゆる適切な技術分野において認識されたリンカーを介して連結される。このようなリンカーには、限定されないが、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそのバリアントが含まれる。ｓｃＦｖは、一般に、抗体定常ドメイン領域を含まないが、本開示のｓｃＦｖは抗体定常ドメイン領域（例えば、抗体Ｆｃドメイン）に連結又は結合されて、限定されないが、増加した血清又は組織半減期を含むｓｃＦｖの種々の特性を変化させることができる。ｓｃＦｖは、一般に、約２５ｋＤａの分子量及び約２．５ｎｍの流体力学的半径を有する。
本明細書で使用される場合、「ＶＨＨ」、「ナノボディ」、又は「重鎖のみの抗体」は、ラクダ、ラマ、アルパカを含む、ラクダ科の種に由来する単一の重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質である。ＶＨＨは、一般に約１５ｋＤａの分子量を有する。
本明細書で使用される場合、「一本鎖可変断片」（ｓｃＦｖ）は、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む抗原結合タンパク質である。ｓｃＦｖのＶＨ及びＶＬドメインは、あらゆる適切な技術分野において認識されたリンカーを介して連結される。このようなリンカーには、限定されないが、反復ＧＧＧＧＳアミノ酸配列又はそのバリアントが含まれる。ｓｃＦｖは、一般に、抗体定常ドメイン領域を含まないが、本開示のｓｃＦｖは抗体定常ドメイン領域（例えば、抗体Ｆｃドメイン）に連結又は結合されて、限定されないが、増加した血清又は組織半減期を含むｓｃＦｖの種々の特性を変化させることができる。ｓｃＦｖは、一般に、約２５ｋＤａの分子量及び約２．５ｎｍの流体力学的半径を有する。
本明細書で使用される場合、「ＶＨＨ」、「ナノボディ」、又は「重鎖のみの抗体」は、ラクダ、ラマ、アルパカを含む、ラクダ科の種に由来する単一の重鎖可変ドメインを含む抗原結合タンパク質である。ＶＨＨは、一般に約１５ｋＤａの分子量を有する。
【0029】
本明細書で使用される場合、用語「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」とは、抗原特異性及び結合親和性を付与する抗体可変領域内のアミノ酸の非隣接配列を指す。一般に、各重鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、ＣＤＲ－Ｈ３）が存在し、各軽鎖可変領域には３つのＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３）が存在する。「フレームワーク領域」又は「ＦＲ」は、当該技術分野において、重鎖及び軽鎖の可変領域の非ＣＤＲ部分を指すことが公知である。一般に、各重鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ－Ｈ１、ＦＲ－Ｈ２、ＦＲ－Ｈ３、及びＦＲ－Ｈ４）が存在し、各軽鎖可変領域には４つのＦＲ（ＦＲ－Ｌ１、ＦＲ－Ｌ２、ＦＲ－Ｌ３、及びＦＲ－Ｌ４）が存在する。ＶＨＨ抗体に関しては、３つの重鎖ＣＤＲのみが存在し、軽鎖ＣＤＲは存在しない。
【0030】
所与のＣＤＲ又はＦＲの正確なアミノ酸配列境界は、いくつかの周知のスキームのいずれかによって容易に決定することができ、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Lefranc M P et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55-77（「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、及びHonegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70（ＡＨｏ番号付けスキーム）に記載されるものが含まれる。
【0031】
所与のＣＤＲ又はＦＲの境界は、同定に使用されるスキームに応じて変化し得る。例えば、Ｋａｂａｔスキームは構造的整列に基づいており、一方、Ｃｈｏｔｈｉａスキームは構造的情報に基づいている。ＫａｂａｔスキームとＣｈｏｔｈｉａスキームの両方の番号付けは、挿入文字、例えば、「３０ａ」によって収容される挿入、及びいくつかの抗体に現れる欠失を伴う、最も一般的な抗体領域配列長に基づく。２つのスキームは、ある特定の挿入及び欠失（「インデル」）を異なる位置に配置し、差分的な番号付けをもたらす。コンタクトスキームは複雑な結晶構造の解析に基づいており、多くの点でＣｈｏｔｈｉａ番号付けスキームと類似している。
【0032】
本明細書に提供される抗体のバリアントは、フレームワーク及び／又はＣＤＲに欠失、置換、付加、及び／又は修飾を導入することによって生成することができる。次に、抗体バリアントは、本明細書に記載される方法を用いて、所望の機能について試験することができる。生成されたバリアントが適切な方法を用いてスクリーニングすることができる所望の特徴を有するという条件で、欠失、置換、付加、修飾及び挿入のあらゆる組合せ（複数可）を抗原結合タンパク質又はその断片に対して行うことができる。
【0033】
本明細書で使用される場合、「保存的置換」とは、親抗体の機能的特性を維持する修飾を指す。例えば、保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の特性を有するアミノ酸残基で置換されるものを含む。例えば、アラニン（Ａ）をバリン（Ｖ）で置換する；アルギニン（Ｒ）をリジン（Ｋ）で置換する；アスパラギン（Ｎ）をグルタミン（Ｑ）で置換する；アスパラギン酸（Ｄ）をグルタミン酸（Ｅ）で置換する；システイン（Ｃ）をセリン（Ｓ）で置換する；グルタミン酸（Ｅ）をアスパラギン酸（Ｄ）で置換する；グリシン（Ｇ）をアラニン（Ａ）で置換する；ヒスチジン（Ｈ）をアルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）で置換する；イソロイシン（Ｉ）をロイシン（Ｌ）で置換する；メチオニン（Ｍ）をロイシン（Ｌ）で置換する；フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）で置換する；セリン（Ｓ）をスレオニン（Ｔ）で置換する；トリプトファン（Ｗ）をチロシン（Ｙ）で置換する；フェニルアラニン（Ｆ）をトリプトファン（Ｗ）で置換する；及び／又はバリン（Ｖ）をロイシン（Ｌ）で置換し、逆も同様である。
【0034】
したがって、別段の指定がない限り、所与の抗体又はその領域、例えばその可変領域の「ＣＤＲ」若しくは「相補的決定領域」、又は個々の特定のＣＤＲ（例えば、「ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２」）は、公知のスキームのいずれかによって定義されるように、ある（又は特定の）相補的決定領域を包含することが理解されるべきである。同様に、別段の指定がない限り、所与の抗体又はその領域、例えばその可変領域の「ＦＲ」若しくは「フレームワーク領域」、又は個々の特定のＦＲ（例えば、「ＦＲ－Ｈ１」、「ＦＲ－Ｈ２」）は、公知のスキームのいずれかによって定義されるように、ある（又は特定の）フレームワーク領域を包含することが理解されるべきである。場合によっては、特定のＣＤＲ又はＦＲを識別するためのスキーム、例えば、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、Ｃｏｎｔａｃｔ、ＩＭＧＴ、又はＡＨｏ法によって定義されるＣＤＲが特定される。他の場合には、ＣＤＲ又はＦＲの特定のアミノ酸配列が与えられる。ＣＤＲ及びＦＲの番号付けは、Kabat et al. (1991), “Sequences of Proteins of Immunological Interest,” 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md.（「Ｋａｂａｔ」番号付けスキーム）、Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273, 927-948（「Ｃｈｏｔｈｉａ」番号付けスキーム）、MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996), “Antibody-antigen interactions: Contact analysis and binding site topography,” J. Mol. Biol. 262, 732-745（「Ｃｏｎｔａｃｔ」番号付けスキーム）、Lefranc M P et al., “IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains,” Dev Comp Immunol, 2003 January; 27(1):55-77 （「ＩＭＧＴ」番号付けスキーム）、及びHonegger A and Pluckthun A, “Yet another numbering scheme for immunoglobulin variable domains: an automatic modeling and analysis tool,” J Mol Biol, 2001 Jun. 8; 309(3):657-70（ＡＨｏ番号付けスキーム）にさらに記載される。
【0035】
用語「競合する」又は「交差競合する」は、抗体分子、例えば本明細書に記載される抗原結合タンパク質の、標的、例えばヒトＣ３及び／又はＣ３ｂへの結合と干渉する抗体分子の能力を意味するために、本明細書において互換的に使用される。結合の干渉は、直接的又は間接的であり得る（例えば、抗原結合分子又は標的のアロステリック調節を介する）。抗原結合分子が標的への別の抗原結合分子の結合と干渉することができる程度、したがって、それが競合すると言えるかどうかは、競合結合アッセイ、例えば、ＦＡＣＳアッセイ、ＥＬＩＳＡ又はＢＩＡＣＯＲＥアッセイを用いて決定することができる。一部の実施形態では、競合結合アッセイは、定量的競合アッセイである。一部の実施形態では、第１の抗原結合分子は、標的への第１の抗体分子の結合が、競合結合アッセイ（例えば、本明細書に記載される競合アッセイ）において、１０％以上、例えば２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上減少する場合、第２の抗原結合分子と標的に対する結合について競合するといわれる。
【0036】
本明細書で使用される場合、用語「親和性」とは、抗体の抗原結合部位とそれが結合するエピトープの間の相互作用の強度を指す。当業者に容易に理解されるように、抗体又は抗原結合タンパク質親和性は、モル濃度（Ｍ）の解離定数（ＫD）として報告することができる。本開示の抗体は、１０-5～１０-12Ｍの範囲のＫD値を有し得る。高親和性抗体は、１０-9Ｍ（１ナノモル、ｎＭ）以下のＫD値を有する。例えば、高親和性抗体は、約１ｎＭ～約０．０１ｎＭの範囲のＫD値を有することができる。高親和性抗体は、約１ｎＭ、約０．９ｎＭ、約０．８ｎＭ、約０．７ｎＭ、約０．６ｎＭ、約０．５ｎＭ、約０．４ｎＭ、約０．３ｎＭ、約０．２ｎＭ、又は約０．１ｎＭのＫD値を有し得る。非常に高親和性の抗体は、１０-12Ｍ（１ピコモル、ｐＭ）以下のＫD値を有する。弱い又は低い親和性の抗体は、１０-1～１０-4Ｍの範囲のＫD値を有することができる。低親和性の抗体は、１０-4Ｍ、１０-3Ｍ、１０-2Ｍ、又は１０-1Ｍなどの１０-4Ｍ以上のＫD値を有することができる。
【0037】
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-8Ｍ～約１０-14Ｍの結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する約１０-10Ｍ～約１０-12Ｍの結合親和性を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する少なくとも約１０-8Ｍ、少なくとも約１０-9Ｍ、少なくとも約１０-10Ｍ、少なくとも約１０-11Ｍ、又は少なくとも約１０-12Ｍの結合親和性を有する。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対するほぼ同等の結合親和性を含む。例えば、限定するものではないが、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-10Ｍの結合親和性、及びＣ３ｂに対する約１０-10Ｍの結合親和性を含むことができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-11Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-11Ｍの結合親和性を含む。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-12Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-12Ｍの結合親和性を含む。
ある特定の実施形態では、Ｃ３に対する結合親和性は、Ｃ３ｂに対する結合親和性の１０倍以内である。例えば、限定するものではないが、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-10Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-11Ｍの結合親和性を含むことができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-11Ｍの結合親性及びＣ３ｂに対する約１０-12Ｍの結合親和性を含む。
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３及びＣ３ｂに対するほぼ同等の結合親和性を含む。例えば、限定するものではないが、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-10Ｍの結合親和性、及びＣ３ｂに対する約１０-10Ｍの結合親和性を含むことができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-11Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-11Ｍの結合親和性を含む。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-12Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-12Ｍの結合親和性を含む。
ある特定の実施形態では、Ｃ３に対する結合親和性は、Ｃ３ｂに対する結合親和性の１０倍以内である。例えば、限定するものではないが、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-10Ｍの結合親和性及びＣ３ｂに対する約１０-11Ｍの結合親和性を含むことができる。特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、Ｃ３に対する約１０-11Ｍの結合親性及びＣ３ｂに対する約１０-12Ｍの結合親和性を含む。
【0038】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、カニクイザルＣ３との交差反応性を含む。カニクイザル（Ｍａｃａｃａ ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）Ｃ３はヒトＣ３と９５．１％同一であり、交差反応性は関連動物モデルにおける本開示の抗原結合タンパク質の前臨床及び毒性試験を可能にする。
疑義を避けるために、また別段の指示がない限り、本明細書で使用されるＣ３は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１０２４の補体成分３のヒト、及びそのタンパク質をコードする核酸配列を指す。Ｃ３ｂは天然のＣ３に由来し、Ｃ３の切断によって形成される２つのエレメントのうち大きい方である。
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、一価であり、生体層干渉測定法（ＢＬＩ）を用いて測定した場合、約２００ｎＭ又はそれ未満のＫDでヒトＣ３及びＣ３ｂに結合する。ある特定の実施形態では、ＫDは、約２００ｐＭ又はそれ未満であり、例えば、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、約１ｐＭ、又は約０．１ｐＭである。
疑義を避けるために、また別段の指示がない限り、本明細書で使用されるＣ３は、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１０２４の補体成分３のヒト、及びそのタンパク質をコードする核酸配列を指す。Ｃ３ｂは天然のＣ３に由来し、Ｃ３の切断によって形成される２つのエレメントのうち大きい方である。
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、一価であり、生体層干渉測定法（ＢＬＩ）を用いて測定した場合、約２００ｎＭ又はそれ未満のＫDでヒトＣ３及びＣ３ｂに結合する。ある特定の実施形態では、ＫDは、約２００ｐＭ又はそれ未満であり、例えば、約１００ｐＭ、約１０ｐＭ、約１ｐＭ、又は約０．１ｐＭである。
【0039】
抗原結合ドメインが特異的抗原決定基に結合する能力は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）又は当業者によく知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ機器で分析する）（Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)）及び従来の結合アッセイ（Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)）のいずれかを介して測定され得る。
【0040】
抗補体Ｃ３抗原結合タンパク質
一態様では、本開示は、補体Ｃ３タンパク質に対する結合特異性を有する抗原結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ断片、又はＶＨＨである。
例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質ＣＤＲは、下記の表１に列挙される。例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、下記の表２に列挙される。以下に列挙する例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、ヒト血漿から単離されたヒトＣ３タンパク質を用いて、ウサギ及びラマを免疫化することによって生成された。Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、及びＭ０１２４の例示的なＶＨ及びＶＬドメインは、ヒトＣ３タンパク質を用いて免疫化されたウサギに由来し、野生型ウサギ配列である。Ｍ０２２８及びＭ０２５１の例示的なＶＨＨドメインは、ヒトＣ３タンパク質を用いて免疫化されたラマに由来し、野生型ラマ配列である。
一態様では、本開示は、補体Ｃ３タンパク質に対する結合特異性を有する抗原結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、ｓｃＦｖｓ、Ｆａｂ断片、又はＶＨＨである。
例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質ＣＤＲは、下記の表１に列挙される。例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質可変重鎖ドメイン及び可変軽鎖ドメインは、下記の表２に列挙される。以下に列挙する例示的な抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、ヒト血漿から単離されたヒトＣ３タンパク質を用いて、ウサギ及びラマを免疫化することによって生成された。Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、及びＭ０１２４の例示的なＶＨ及びＶＬドメインは、ヒトＣ３タンパク質を用いて免疫化されたウサギに由来し、野生型ウサギ配列である。Ｍ０２２８及びＭ０２５１の例示的なＶＨＨドメインは、ヒトＣ３タンパク質を用いて免疫化されたラマに由来し、野生型ラマ配列である。
【0041】
【表1】
【0042】
【表2】
【0043】
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、表１又は表２のいずれかの配列との少なくとも約８０％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、若しくは１００％の配列類似性又は同一性を含む。
【0044】
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、１種以上の補体経路である古典経路、代替経路、及びレクチン経路を阻害するそれらの能力について選択される。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、３つの全ての補体経路、古典経路、代替経路、及びレクチン経路を阻害する能力について選択される。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、眼において３つの全ての補体経路を阻害することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜領域における３つの全ての補体経路を阻害することができる。脈絡膜領域は、眼の裏側を覆う血管を含む層であり、網膜と強膜の間に位置する。脈絡膜領域は、ハラー層、サトラー層、脈絡毛細管、及びブルッフ膜の４層に分かれる。ブルッフ膜は硝子体板としても公知であり、脈絡膜の最内層であり、網膜色素上皮（ＲＰＥ）に隣接している。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、ブルッフ膜を貫通又は拡散し、脈絡膜の他の層、例えば、限定されないが、脈絡毛細管に入ることができる。
【0045】
網膜は、治療効果の減少をもたらす可能性のある深層に浸透するために、完全長免疫グロブリンなどの大きな分子を妨げる可能性がある実質的な物理的障壁を有する（Jackson et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2003;44(5): 2141-6）。より小さな抗体誘導体は、対照的に、網膜により深く浸透することがある。約６０ｋＤａ又はより低い分子量を有する例示的な抗体誘導体は、抗体断片であり、限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’断片、ｓｃＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ断片、ナノボディ、ＶＨＨ、ｄＡｂ、Ｖ－Ｎａｒ、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、並びに二重特異性及び二価抗体、例えば、一本鎖ダイアボディ（ｓｃＤｂ）、又はＤＡＲＴが含まれる。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量、例えば、約５５ｋＤａ、約５０ｋＤａ、約４５ｋＤａ、約４０ｋＤａ、約３５ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約１５ｋＤａ又はそれ未満を有する。
【0046】
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、部分的にはそのサイズが貫通を容易にするのに十分に低いため、ブルッフ膜を貫通又は拡散することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質のサイズは、分子量によって測定される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約６０ｋＤａ未満の分子量を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ又は約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２５ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約１５ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質のサイズは、それらの流体力学的半径によって測定される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約３．０ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２．５ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２．０ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。
【0047】
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、Ｍ０１２４、Ｍ０２２８、及びＭ０２５１を含む１種以上の抗原結合タンパク質と競合することができる。抗体競合は、当該技術分野において公知であるあらゆるアッセイによって測定することができる。ある特定の実施形態では、１つの抗体は、ビオチンなどのマーカーで標識され、Ｃ３結合ＥＬＩＳＡにおいて他の抗Ｃ３抗体とともにインキュベートすることができる。通常、競合する抗原結合タンパク質が過剰に存在する場合、それは、本明細書に記載されるように、Ｃ３及び／又はＣ３ｂに対する抗原結合タンパク質又はその断片の特異的結合を減少させ、すなわち、少なくとも４０～４５％、４５～５０％、５０～５５％、５５～６０％、６０～６５％、６５～７０％、７０～７５％又は７５％又はそれ以上、結合を交差遮断する。ある特定の実施形態では、競合する抗原結合タンパク質の存在下で本明細書に記載される抗原結合タンパク質又はその断片の結合は、少なくとも８０～８５％、８５～９０％、９０～９５％、９５～９７％、若しくは９７％又はそれ以上減少する。
【0048】
補体Ｃ３は、１３の異なるドメインで構成され、分子サイズが１８５キロダルトンである大きなタンパク質である。補体活性化の間、Ｃ３は、異なる部位でタンパク質分解的切断と構造的修飾を受ける。Ｃ３由来断片は、異なるエフェクター機能を発揮し、３つの補体経路に増幅ループを入れる転換酵素を形成する。古典経路及びレクチン経路Ｃ３転換酵素であるＣ４ｂＣ２ａは、全長Ｃ３をＣ３ｂ及びアナフィラトキシンＣ３ａに切断する。代替経路はまた、Ｃ３ｂとＣ３ａを生成するが、代替経路Ｃ３転換酵素であるＣ３ｂＢｂを利用する。さらに、補体経路では、さらなるＣ３分解産物が生成される可能性がある。補体因子Ｉ（ＣＦＩ）は血漿セリンプロテアーゼであり、Ｃ３ｂをｉＣ３ｂに永久的に不活性化することができる。次に、ｉＣ３ｂは、ＣＦＩによってさらなる断片（Ｃ３ｄｇ及びＣ３ｃ）に切断される。さらなるＣ３タンパク質分解産物であるＣ３ｄは補体受容体２（ＣＲ２）に結合し、Ｂ細胞の細胞周期制御に重要な役割を果たしている可能性がある。Ｃ３由来タンパク質産物とともに、補体経路には、限定されないが、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ４ａ、Ｃ５、Ｃ５ｂ、Ｃ５ａ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、Ｃ９、Ｃ１ｑ、Ｃ１ｒ、Ｃ１ｓ、因子Ｂ、因子Ｄ、因子Ｐ、因子Ｈ、因子Ｉ、ＣＤ４６（ＭＣＰ）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９（ＭＡＣ－ＩＰ）、ＣＲ１（ＣＤ３５）、ＣＲ２（ＣＤ２１）、ＣＲ３、ＣＲ４、Ｃ３ａＲ、Ｃ５ａＲ１、Ｃ５ａＲ２、ＣＲＩｇ、Ｃ４ＢＰα鎖、Ｃ４ＢＰβ鎖、フィコリン－１、マンノース結合レクチン（ＭＢＬ）、ＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ－１（ＭＡＳＰ－１）、及びＭＢＬ関連セリンプロテアーゼ－２（ＭＡＳＰ－２）が含まれる。補体経路及び種々の補体経路成分は、Noris et al. Semin Nephrol. 2013; 33(6): 479-492にさらに詳細に記載されている。
【0049】
ある特定の実施形態では、本開示は、Ｃ３とＣ３ｂの両方に結合することができる抗Ｃ３抗原結合タンパク質を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、Ｃ３及びＣ３ｂに対する結合親和性よりも弱い、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５、及び／又はＣ５ｂに対する結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５及び／又はＣ５ｂに対する約１０-4Ｍ又はそれより弱い結合親和性を含む。ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗原結合タンパク質は、Ｃ３ａ、ｉＣ３ｂ、Ｃ４、Ｃ４ｂ、Ｃ５、及び／又はＣ５ｂに対する結合親和性を含まない。本明細書で使用される場合、「結合親和性がない」とは、限定されないが、ＥＬＩＳＡアッセイなどの、当該技術分野において公知である１種以上の結合親和性アッセイによる、バックグラウンドに対する検出可能な結合親和性がないことを意味する。
【0050】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質は、補体Ｃ３上のエピトープに結合することができ、このような結合はＣ３転換酵素の形成を妨げる。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｃ３転換酵素の活性を阻害する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、Ｃ３転換酵素増幅ループを阻害する。
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗体は、以下に列挙される以下の特性により、他の治療法と比較して、ＧＡ又は他の眼障害の処置においてより良好な効力及び安全性を有することが期待される。
ある特定の実施形態では、本開示の抗Ｃ３抗体は、以下に列挙される以下の特性により、他の治療法と比較して、ＧＡ又は他の眼障害の処置においてより良好な効力及び安全性を有することが期待される。
【0051】
本開示の抗Ｃ３抗体は、限定されないが、約６０ｋＤａ未満の分子量を有するｓｃＦｖ及びＶＨＨ抗体断片を含むことができる。例えば、限定するものではないが、本開示のｓｃＦｖは、約２５ｋＤａの分子量を有することができ、本開示のＶＨＨは、約１５ｋＤａの分子量を有することができ、他の治療剤は、より大きな分子量を有することができる。流体力学的半径推定に基づいて、本開示の抗Ｃ３抗体は、脈絡膜Ｃ３に対してより良好な阻害を有することが期待される。これは、それらは、より効率的にブルッフ膜を貫通し、眼の脈絡膜により効率的に入り得るためである。
【0052】
本開示の抗Ｃ３抗体は、１カ月より長い治療有効期間を有し得、他の治療剤と比較して長い期間であり得る。増大した治療有効期間は、７ｍＭ程度に達することができる本開示の抗Ｃ３抗体のモル濃度に起因し得る。
本開示の抗Ｃ３抗体は、他の治療剤と比較して容易に眼に注入することができる。本開示の抗Ｃ３抗体はＰＥＧを含まず、それによってそれらの粘度を減少させる。したがって、本開示の抗Ｃ３抗体の粘度は、他の治療剤の粘度よりも低いことが予想される。２０センチポアズ（ｃＰ）未満又はそれに等しい溶液などの粘度減少した溶液は、背圧の減少のために、より容易に眼に注入される。
本開示の抗Ｃ３抗体は、他の治療剤と比較して容易に眼に注入することができる。本開示の抗Ｃ３抗体はＰＥＧを含まず、それによってそれらの粘度を減少させる。したがって、本開示の抗Ｃ３抗体の粘度は、他の治療剤の粘度よりも低いことが予想される。２０センチポアズ（ｃＰ）未満又はそれに等しい溶液などの粘度減少した溶液は、背圧の減少のために、より容易に眼に注入される。
【0053】
抗原結合ポリペプチドの発現
一態様では、本明細書に開示される結合ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドを発現することを含む結合ポリペプチドを作製する方法はまた提供される。
本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望量の請求された抗体、又はその断片を産生するために使用することができる宿主細胞内に導入するため、発現ベクターに挿入される。したがって、ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
一態様では、本明細書に開示される結合ポリペプチド（例えば、抗原結合タンパク質）をコードするポリヌクレオチドが提供される。これらのポリヌクレオチドを発現することを含む結合ポリペプチドを作製する方法はまた提供される。
本明細書に開示される結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、典型的には、所望量の請求された抗体、又はその断片を産生するために使用することができる宿主細胞内に導入するため、発現ベクターに挿入される。したがって、ある特定の態様では、本発明は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを含む発現ベクター、並びにこれらのベクター及びポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
【0054】
用語「ベクター」又は「発現ベクター」は、本明細書において、細胞内に所望の遺伝子を導入し、発現するためのビヒクルとして本発明に従って使用されるベクターを意味するために使用される。当業者に公知であるように、このようなベクターは、プラスミド、ファージ、ウイルス及びレトロウイルスからなる群から容易に選択され得る。一般に、本発明に適合するベクターは、選択マーカー、所望の遺伝子のクローニングを容易にするための適切な制限部位、及び真核細胞又は原核細胞に入り及び／又は複製する能力を含む。
多数の発現ベクター系を本発明の目的のために使用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、ＭＯＭＬＶなど）、又はＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系の使用が伴う。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）又は銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、又は同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡの合成を最適化するために、さらに別のエレメントを必要とすることができる。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。一部の実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は、上記で検討したように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト定常領域遺伝子）とともに発現ベクターに挿入される。
多数の発現ベクター系を本発明の目的のために使用することができる。例えば、あるクラスのベクターは、ウシパピローマウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、バキュロウイルス、レトロウイルス（例えば、ＲＳＶ、ＭＭＴＶ、ＭＯＭＬＶなど）、又はＳＶ４０ウイルスなどの動物ウイルスに由来するＤＮＡエレメントを利用する。他には、内部リボソーム結合部位を有するポリシストロン系の使用が伴う。さらに、ＤＮＡをそれらの染色体に組み込んだ細胞は、トランスフェクトされた宿主細胞の選択を可能にする１種以上のマーカーを導入することによって選択することができる。マーカーは、栄養要求性宿主に対する原栄養性、殺生物剤耐性（例えば、抗生物質）又は銅などの重金属に対する耐性を提供することができる。選択マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ配列に直接連結され得るか、又は同時形質転換によって同じ細胞に導入され得る。ｍＲＮＡの合成を最適化するために、さらに別のエレメントを必要とすることができる。これらのエレメントは、シグナル配列、スプライスシグナル、並びに転写プロモーター、エンハンサー、及び終結シグナルを含み得る。一部の実施形態では、クローニングされた可変領域遺伝子は、上記で検討したように合成された重鎖及び軽鎖定常領域遺伝子（例えば、ヒト定常領域遺伝子）とともに発現ベクターに挿入される。
【0055】
他の実施形態では、結合ポリペプチドは、ポリシストロン性構築物を用いて発現され得る。このような発現系において、抗体の重鎖及び軽鎖などの目的の複数の遺伝子産物を単一のポリシストロン性構築物から産生することができる。これらのシステムは、真核生物宿主細胞において比較的高レベルのポリペプチドを提供するために内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を有利に使用する。互換性のあるＩＲＥＳ配列が米国特許第６，１９３，９８０号に開示され、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。当業者は、このような発現系を用いて、本出願において開示されるポリペプチドの全範囲を効果的に生成することができることを理解する。
【0056】
より一般的には、抗体若しくはその断片をコードするベクター又はＤＮＡ配列を調製した後、発現ベクターを適切な宿主細胞に導入することができる。すなわち、宿主細胞は形質転換され得る。プラスミドの宿主細胞への導入は、当業者に周知の種々の技術によって達成することができる。これらには、限定されないが、トランスフェクション（電気泳動及び電気穿孔を含む）、プロトプラスト融合、リン酸カルシウム沈殿、エンベロープＤＮＡとの細胞融合、マイクロインジェクション、及び無傷ウイルスとの感染が含まれる。Ridgway, A. A. G. “Mammalian Expression Vectors” Chapter 24.2, pp. 470-472 Vectors, Rodriguez and Denhardt, Eds. (Butterworths, Boston, Mass. 1988)を参照されたい。宿主へのプラスミドの導入は、エレクトロポレーションによって可能である。形質転換された細胞は、軽鎖及び／又は重鎖の産生に適した条件下で増殖され、重鎖及び／又は軽鎖タンパク質合成についてアッセイされる。例示的なアッセイ技術には、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光活性化細胞ソーター分析（ＦＡＣＳ）、免疫組織化学などが含まれる。
【0057】
本明細書で使用される場合、用語「形質転換」は、広い意味において、遺伝子型を変化させ、結果的にレシピエント細胞に変化をもたらす、レシピエント宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入を指すために使用されなければならない。遺伝的に修飾されたレシピエント細胞は、一過性又は安定な形質転換によって外因性配列を含有することができる。例えば、外因性配列は、レシピエント細胞のゲノム配列内、標的部位で、又はランダム部位に安定に組み込まれ得る。遺伝子編集方法（例えば、相同組換え、トランスポゾン介在性システム、ｌｏｘＰ－Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＴＡＬＥＮを使用する方法）によって修飾された細胞は、本開示の範囲内である。ある特定の実施形態では、安定な細胞株は、抗原結合タンパク質又はその断片の産生のために生成される。これは、一貫した産生抗原結合タンパク質又はその断片の均一な品質及び収率を有利にもたらす。
これらの同じ株とともに、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを用いて形質転換された細胞を指す。組換え宿主からのポリペプチドを単離するプロセスの説明において、「細胞」及び「細胞培養」という用語は、別段の明確な指定がない限り、抗体の供給源を示すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された全細胞からの、又は培地と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。
これらの同じ株とともに、「宿主細胞」とは、組換えＤＮＡ技術を用いて構築され、少なくとも１つの異種遺伝子をコードするベクターを用いて形質転換された細胞を指す。組換え宿主からのポリペプチドを単離するプロセスの説明において、「細胞」及び「細胞培養」という用語は、別段の明確な指定がない限り、抗体の供給源を示すために互換的に使用される。言い換えれば、「細胞」からのポリペプチドの回収は、遠心分離された全細胞からの、又は培地と懸濁細胞の両方を含有する細胞培養からのいずれかを意味し得る。
【0058】
一実施形態では、抗体発現に使用される宿主細胞株は、哺乳動物起源である。当業者は、その中で発現される所望の遺伝子産物に最も適した特定の宿主細胞株を決定することができる。例示的な宿主細胞株としては、限定されないが、ＤＧ４４及びＤＵＸＢ１１（チャイニーズハムスター卵巣系、ＤＨＦＲマイナス）、ＨＥＬＡ（ヒト子宮頸癌腫）、ＣＶ－１（サル腎臓系）、ＣＯＳ（ＳＶ４０Ｔ抗原を伴うＣＶ－１の誘導体）、Ｒ１６１０（チャイニーズハムスター線維芽細胞）、ＢＡＬＢＣ／３Ｔ３（マウス線維芽細胞）、ＨＡＫ（ハムスター腎臓系）、ＳＰ２／Ｏ（マウス骨髄腫）、ＢＦＡ－１ｃ１ＢＰＴ（ウシ内皮細胞）、ＲＡＪＩ（ヒトリンパ球）、２９３（ヒト腎臓）などが挙げられる。一実施形態では、細胞株は、そこから発現される抗体（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）（Ｃｒｕｃｅｌｌ）又はＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞株（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）細胞）（Ｂｉｏｗａ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．））の変更されたグリコシル化、例えば非フコシル化を提供する。宿主細胞株は、典型的には、商業サービス、例えば、米国組織培養コレクションから、又は公開された文献から入手可能である。
【0059】
インビトロでの産生は、大量の所望のポリペプチドを与えるためのスケールアップを可能にする。組織培養条件下での哺乳動物細胞培養の技術は、当該技術分野において公知であり、例えば、エアリフト反応器又は連続撹拌反応器内での均一な懸濁培養、又は、例えば、中空繊維、マイクロカプセル、アガロースマイクロビーズ又はセラミックカートリッジでの固定化若しくは取り込まれた細胞培養を含む。必要及び／又は所望であれば、ポリペプチドの溶液は、通常のクロマトグラフィー法、例えば、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、ＤＥＡＥ－セルロース上のクロマトグラフィー及び／又は（免疫）アフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【0060】
本発明において特徴付けられる抗原結合タンパク質をコードする遺伝子はまた、細菌又は酵母又は昆虫又は植物細胞などの非哺乳動物細胞において発現され得る。この点に関して、種々の単細胞非哺乳動物微生物、例えば細菌はまた形質転換され、すなわち、培養又は発酵において増殖され得るものであることが理解される。形質転換を受けやすい細菌には、大腸菌又はサルモネラ菌などの腸内細菌科の細菌；枯草菌などのバシラス属；肺炎球菌；レンサ球菌；及びインフルエンザ菌などがある。さらに、細菌において発現された場合、タンパク質は封入体の一部となり得ることが理解される。タンパク質は単離され、精製され、次に、機能的な分子に組み立てられなければならない。
【0061】
原核生物に加えて、真核微生物もまた使用され得る。出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、又は一般的なパン酵母は、真核微生物の中で最も一般的に使用されているが、他のいくつかの菌株が一般的に入手可能である。サッカロミセスにおける発現については、プラスミドＹＲｐ７、例えば（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)；Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)；Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)）が一般的に使用される。このプラスミドはすでにＴＲＰ１遺伝子を含んでおり、トリプトファン中で増殖する能力を欠く酵母の突然変異株、例えば、ＡＴＣＣ Ｎｏ．４４０７６又はＰＥＰ４－１（Jones, Genetics, 85:12 (1977)）の選択マーカーを提供する。次に、酵母宿主細胞ゲノムの特徴としてのｔｒｐ１損傷の存在は、トリプトファンの非存在下での増殖による形質転換を検出するための効果的な環境を提供する。
したがって、一態様では、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載されるタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程と、
ｉｉ）タンパク質を回収する工程と、任意で
ｉｉｉ）タンパク質をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化する工程と
を含む方法が提供される。
したがって、一態様では、上述の抗原結合タンパク質又はその断片を製造する方法であって、
ｉ）本明細書に記載されるタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を培養する工程と、
ｉｉ）タンパク質を回収する工程と、任意で
ｉｉｉ）タンパク質をさらに精製及び／又は修飾及び／又は製剤化する工程と
を含む方法が提供される。
【0062】
抗原結合タンパク質を投与する方法
抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に開示される抗原結合タンパク質）を調製し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。本開示の抗原結合タンパク質の投与経路は、経口、非経口、吸入、局所、又は眼内であり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣内投与を含む。本明細書で使用される眼内という用語は、限定されないが、結膜下、硝子体内、球後、又は前房内を含む。本明細書で使用される局所という用語は、限定されないが、液体又は溶液の点眼薬、エマルジョン（例えば、水中油型エマルジョン）、懸濁液、及び軟膏による投与を含む。
抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に開示される抗原結合タンパク質）を調製し、対象に投与する方法は、当業者に周知であるか、又は当業者によって容易に決定される。本開示の抗原結合タンパク質の投与経路は、経口、非経口、吸入、局所、又は眼内であり得る。本明細書で使用される非経口という用語は、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、直腸又は膣内投与を含む。本明細書で使用される眼内という用語は、限定されないが、結膜下、硝子体内、球後、又は前房内を含む。本明細書で使用される局所という用語は、限定されないが、液体又は溶液の点眼薬、エマルジョン（例えば、水中油型エマルジョン）、懸濁液、及び軟膏による投与を含む。
【0063】
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、眼内に投与される。網膜などの眼の異なる構造への治療化合物の送達は困難である。課題には、限定されないが、いくつかの制限的な眼球関門、まばたき及び送達された化合物の洗い流しを含む涙のメカニズム、制限された局所注入量、制限された局所バイオアベイラビリティ、並びに不純物及び汚染物質に対する低い耐性が含まれる（例えば、Patel et al. World J Pharmacol. 2013; 2(2): 47-64；Morrison et al. Ther. Deliv. 2014; 5(12): 1297-1315を参照されたい）。本開示の抗原結合タンパク質は、これらの課題を克服することができる。本開示の抗原結合タンパク質は、約６０ｋＤａ又はそれ未満の分子量を有する。約６０ｋＤａ又はそれ未満の抗原結合タンパク質の例としては、限定されないが、ｓｃＦｖ、ＶＨＨ、及びＦａｂ断片が挙げられる。全長抗体と比較して本開示の抗原結合タンパク質のサイズが小さいほど、注射あたりより多くの治療抗体の送達を可能にする。これは、眼に対して抗体の高濃度を可能にする。本開示の抗原結合タンパク質のサイズが小さいほど、疾患関連組織、すなわち、眼の脈絡膜領域へのそれらの浸透を改善することもできる。抗原結合タンパク質は、ハラー層、サトラー層、脈絡毛細管、及びブルッフ膜を含む脈絡膜領域の１つ以上の層を貫通し、それによって脈絡膜領域のそれらの層内の補体Ｃ３及びＣ３ｂを標的とすることができる。
【0064】
ある特定の実施形態では、眼内投与は、脈絡膜上薬物送達デバイス又は網膜下薬物送達デバイスなどの薬物送達デバイスを用いて達成される。脈絡膜上投与手順は、眼の脈絡膜上腔への薬物の投与を伴い、通常、マイクロニードルを有するマイクロインジェクター（例えば、Hariprasad, Retinal Physician; 2016; 13: 20-23；Goldstein, 2014, Retina Today 9(5): 82-87を参照されたい；各々はその全体が参照により本明細書に組み込まれる）などの脈絡膜上薬物送達デバイスを用いて行われる。脈絡膜上腔において本開示の抗原結合タンパク質を沈着させるために用いることができる脈絡膜上薬物送達デバイスには、限定されないが、Ｃｌｅａｒｓｉｄｅ（登録商標）Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ，Ｉｎｃ．によって製造された脈絡膜上薬物送達デバイスが含まれる（例えば、Hariprasad, 2016、上掲を参照されたい）。本開示の抗原結合タンパク質を網膜下腔に脈絡膜上腔を介して沈着させるために使用することができる網膜下薬物送達デバイスには、限定されないが、Ｊａｎｓｓｅｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって製造された網膜下薬物送達デバイスが含まれる（例えば、国際特許出願公開第２０１６／０４０６３５号を参照されたい）。
【0065】
ある特定の実施形態では、眼内投与は、硝子体内経路を介して達成される。硝子体内投与は、しばしば、シリンジ及び２７ゲージから３０ゲージの針を用いて行われる（例えば、Jiang et al、上掲を参照されたい）。
これらの投与形態は全て、本開示の範囲内にあると明確に考えられるが、投与形態は、注射用の溶液、特に硝子体内注射用の溶液である。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。しかしながら、本明細書における教示と適合する他の方法では、修飾された抗体は、有害な細胞集団の部位に直接送達することができ、それによって、疾患組織の治療剤への曝露を増加させることができる。
これらの投与形態は全て、本開示の範囲内にあると明確に考えられるが、投与形態は、注射用の溶液、特に硝子体内注射用の溶液である。通常、注射に適した医薬組成物は、緩衝液（例えば、酢酸塩、リン酸塩又はクエン酸塩緩衝液）、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）、任意で安定剤（例えば、ヒトアルブミン）などを含み得る。しかしながら、本明細書における教示と適合する他の方法では、修飾された抗体は、有害な細胞集団の部位に直接送達することができ、それによって、疾患組織の治療剤への曝露を増加させることができる。
【0066】
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、低粘度の溶液に製剤化される。溶液の粘度はセンチポアズ（ｃＰ）単位で測定される。高粘度の抗体溶液は、眼への本開示の抗原結合タンパク質の投与のための課題を提起し得る。例えば、５０ｃＰを超える粘度を有する溶液は、背圧が高いため、細い針で投与することが困難な場合がある。したがって、本開示の抗原結合タンパク質を低粘度溶液中で処方することが望ましい。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質及びその医薬組成物は、約１ｃＰ～約５０ｃＰの粘度を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質及びその医薬組成物は、約２０ｃＰ、約１５ｃＰ、約１０ｃＰ、約５ｃＰ、約４ｃＰ、約３ｃＰ、約２ｃＰ、若しくは約１ｃＰ未満又はそれに等しい粘度を有する。抗体粘度に関するさらなる詳細は、Tomar et al. MAbs. 2016; 8(2): 216-228、及びFennell et al. MAbs. 2013; 5(6): 882-895に記載される。
【0067】
投与のための製剤には、無菌の水性若しくは非水性溶液、懸濁液、及びエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、及び注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョン又は懸濁液が含まれ、生理食塩水及び緩衝媒体が含まれる。本開示の組成物及び方法において、薬学的に許容される担体には、限定されないが、０．０１～０．１Ｍもしく０．０５Ｍリン酸緩衝液、又は０．８％生理食塩水が含まれる。他の一般的な非経口ビヒクルには、リン酸ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸リンゲル、固定油などが含まれる。静脈内ビヒクルには、限定されないが、流体及び栄養補充剤、電解質補充剤、例えばリンゲルブドウ糖に基づくものなどが含まれる。例えば、抗微生物剤、酸化防止剤、キレート剤、不活性ガスなどの保存剤及び他の添加剤もまた存在することができる。ある特定の実施形態では、注射可能な使用に適した医薬組成物は、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射可能溶液又は分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。このような場合には、組成物は滅菌されていなければならず、容易に注射可能である程度の流体でなければならない。これは製造及び貯蔵の条件下で安定であるべきであり、また、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対しても保存されるべきである。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びそれらの適切な混合物を含む溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散剤の場合に必要な粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって維持することができる。
【0068】
微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、又は塩化ナトリウムもまた組成物に含まれ得る。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含有させることによってもたらすことができる。
【0069】
いずれの場合においても、必要な量の活性化合物（例えば、抗原結合タンパク質又はその断片）を、必要に応じて、本明細書に列挙された成分の１つ又は組合せとともに適切な溶媒中に取り込み、次に、濾過滅菌することによって、滅菌注射用溶液を調製することができる。一般に、分散液は、活性化合物を、塩基性分散媒及び上記に列挙したものから必要な他の成分を含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射用溶液の調製のための無菌粉末の場合、調製方法は、典型的には、真空乾燥及び凍結乾燥を含み、活性成分の粉末と、先に無菌濾過されたその溶液からのあらゆる追加の所望の成分とを生じる。注射剤の調製物は、処理され、アンプル、バッグ、ボトル、注射器又はバイアルなどの容器に充填され、当該技術分野において公知である方法に従って無菌条件下で密封される。
【0070】
本開示の組成物の有効用量は、上述の状態の処置のために、投与手段、標的部位、患者の身体的状態、患者がヒトであるか又は動物であるか、投与される他の医薬、及び処置が予防的であるか又は治療的であるかなどの多数の異なる因子に依存して変化する。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含む非ヒト哺乳動物もまた処置可能である。処置用量は、安全性及び効力を最適化するために当業者に公知の通常の方法を用いて漸増することができる。
先に検討したように、本開示の抗原結合タンパク質、免疫反応性断片又はその組換え体は、哺乳動物障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。この点に関して、開示された抗原結合タンパク質は、活性剤の投与を容易にし、安定性を促進するように製剤化されることが理解される。
先に検討したように、本開示の抗原結合タンパク質、免疫反応性断片又はその組換え体は、哺乳動物障害のインビボ処置のために薬学的に有効な量で投与することができる。この点に関して、開示された抗原結合タンパク質は、活性剤の投与を容易にし、安定性を促進するように製剤化されることが理解される。
【0071】
本開示による医薬組成物は、典型的には、生理食塩水、非毒性緩衝液、保存剤などの薬学的に許容される非毒性の滅菌担体を含む。本出願の目的のために、治療剤にコンジュゲートされたか又はコンジュゲートされていない、修飾された抗原結合タンパク質、その免疫反応性断片又は組換え体の薬学的に有効な量は、抗原への有効な結合を達成し、利益を達成するのに十分な量を意味するように、例えば、疾患若しくは障害の症状を改善し、又は物質若しくは細胞を検出するために、保持されなければならない。腫瘍細胞の場合、修飾された結合ポリペプチドは、典型的には、腫瘍性又は免疫反応性細胞上の選択された免疫反応性抗原と相互作用することができ、それらの細胞の死を増加させる。当然に、本開示の医薬組成物は、修飾された結合ポリペプチドの薬学的に有効な量を提供するために、単回又は複数回用量で投与することができる。
【0072】
本開示の範囲に従い、本開示の抗原結合タンパク質は、治療効果又は予防効果をもたらすのに十分な量で、前述の処置方法に従ってヒト又は他の動物に投与することができる。本開示の抗原結合タンパク質は、公知の技術に従って、本開示の抗体を従来の薬学的に許容される担体又は希釈剤と組み合わせることによって調製される通常の投与形態で、このようなヒト又は他の動物に投与することができる。薬学的に許容される担体又は希釈剤の形態及び特性は、それが組み合わされるべき活性成分の量、投与経路及び他の周知の変数によって決定されることは当業者によって認識される。当業者は、本開示に記載される結合ポリペプチドの１つ以上の種を含むカクテルが、特に有効であることが証明され得ることをさらに理解する。
【0073】
本明細書において定義される医薬組成物の生物学的活性は、補体阻害アッセイ、例えば、限定するものではないが、ヒト血清中の機能的古典経路、レクチン経路、及び代替補体経路活性を決定するための酵素イムノアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、本明細書に定義される医薬組成物の阻害活性は、補体系スクリーンＷｉｅｓｌａｂ（登録商標）（Ｅｕｒｏ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃａ ＡＢ、Ｍａｌｍｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて評価することができる。
補体経路を阻害する本開示の抗体の能力を研究するための機能的アッセイは、精製された補体成分を用いて実施することができ、そこから、Okroj et al. PLoS One.; 2012; 7(10): e47245に記載されるように、酵素複合体が赤血球又は人工マトリックスの表面上で再構成される。
標準的な５０％溶血性補体（ＣＨ５０）アッセイはまた、Jaskowski et al. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology; 1999; 6(1):137-9に記載されるように、古典補体経路の機能的活性を阻害する化合物の能力を評価する、一般的に使用される方法である。
補体経路を阻害する本開示の抗体の能力を研究するための機能的アッセイは、精製された補体成分を用いて実施することができ、そこから、Okroj et al. PLoS One.; 2012; 7(10): e47245に記載されるように、酵素複合体が赤血球又は人工マトリックスの表面上で再構成される。
標準的な５０％溶血性補体（ＣＨ５０）アッセイはまた、Jaskowski et al. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology; 1999; 6(1):137-9に記載されるように、古典補体経路の機能的活性を阻害する化合物の能力を評価する、一般的に使用される方法である。
【0074】
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、本開示の抗原結合タンパク質の非存在下での赤血球溶血のレベルと比較して、本開示の抗原結合タンパク質の存在下での赤血球溶血のレベルを測定することによって決定することができる。ある特定の実施形態では、抗体感作ヒツジ赤血球を用いて、古典経路によって媒介される補体依存性溶血を測定することができる。ある特定の実施形態では、抗体感作ウサギ赤血球を用いて、Tomlinson et al. J Immunol.1997; 159 (11): 5606-5609に記載されるように、代替経路によって媒介される補体依存性溶血を測定することができる。
【0075】
ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性は、本開示の抗原結合タンパク質の非存在下での膜侵襲複合体（ＭＡＣ）形成と比較して、本開示の抗原結合タンパク質の存在下でのＭＡＣ形成を測定することによって決定することができる。ヒト血清中の古典補体経路のＩｇＭ介在性活性化のＭＡＣアッセイは、ＩｇＭ被覆したＥＬＩＳＡプレート上にＭＡＣの沈着をもたらす。ＭＡＣ形成は、Ｃ５ｂ－９に対するアルカリホスファターゼ標識抗体を用いて検出することができる。本開示の抗原結合タンパク質の存在下で、ＥＬＩＳＡシグナルは用量依存的に減少される。代替経路を試験するために、ヒト血清中の代替補体経路のＬＰＳ介在性活性化のためのＭＡＣアッセイが、ＬＰＳ被覆したＥＬＩＳＡプレート上へのＭＡＣの沈着のために使用することができる。適切なＭＡＣアッセイには、限定されないが、パシフィックバイオマーカー補体膜侵襲複合体（ＳＣ５ｂ－９）ＥＬＩＳＡアッセイが含まれる。
【0076】
本明細書で使用される「効力」又は「インビボ効力」とは、例えば、標準的な眼科学的反応基準などの標準化された反応基準を用いて、本開示の医薬組成物による治療への応答を指す。本開示の医薬組成物を使用する治療の成功又はインビボ効力は、その意図された目的のための組成物の有効性、すなわち、その所望の効果、すなわち、眼における補体経路の阻害を引き起こす組成物の能力を指す。インビボ効力は、種々の眼疾患について確立された標準的方法によってモニタリングすることができる。モニタリング方法には、限定されないが、アムスラーグリッド試験、オプタルモスコピー、眼底顕微鏡検査、眼球コンピュータ断層撮影、及び光干渉断層撮影が含まれる。さらに、種々の疾患特異的な臨床化学パラメータ及び他の確立された標準的方法を使用することができる。
【0077】
抗体工学と最適化
本開示の抗原結合タンパク質は、操作又は最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化された」又は「最適化」とは、１つ以上の機能的特性を改善するための抗原結合タンパク質の変更を指す。変更は、限定されないが、抗原結合タンパク質内の１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、及び／又は修飾を含む。
本明細書で使用される場合、用語「機能的特性」は、抗原結合タンパク質の特性であって、その改善（例えば、従来の抗原結合タンパク質に対する）が、例えば、抗原結合タンパク質の製造特性又は治療効力を改善するために、当業者にとって望ましく及び／又は有利である特性である。一実施形態では、機能的特性は安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態では、機能的特性は、溶解性（例えば、細胞条件下）である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、凝集挙動である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、タンパク質発現（例えば、原核細胞における）である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、製造プロセスにおける封入体可溶化後の再折り畳み挙動である。ある特定の実施形態では、機能的特性は、抗原結合親和性の改善ではない。別の実施形態では、１種以上の機能的特性の改善は、抗原結合タンパク質の結合親和性において実質的な効果を有さない。
本開示の抗原結合タンパク質は、操作又は最適化することができる。本明細書で使用される場合、「最適化された」又は「最適化」とは、１つ以上の機能的特性を改善するための抗原結合タンパク質の変更を指す。変更は、限定されないが、抗原結合タンパク質内の１つ以上のアミノ酸の欠失、置換、付加、及び／又は修飾を含む。
本明細書で使用される場合、用語「機能的特性」は、抗原結合タンパク質の特性であって、その改善（例えば、従来の抗原結合タンパク質に対する）が、例えば、抗原結合タンパク質の製造特性又は治療効力を改善するために、当業者にとって望ましく及び／又は有利である特性である。一実施形態では、機能的特性は安定性（例えば、熱安定性）である。別の実施形態では、機能的特性は、溶解性（例えば、細胞条件下）である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、凝集挙動である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、タンパク質発現（例えば、原核細胞における）である。さらに別の実施形態では、機能的特性は、製造プロセスにおける封入体可溶化後の再折り畳み挙動である。ある特定の実施形態では、機能的特性は、抗原結合親和性の改善ではない。別の実施形態では、１種以上の機能的特性の改善は、抗原結合タンパク質の結合親和性において実質的な効果を有さない。
【0078】
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はｓｃＦｖであり、抗原結合タンパク質において、目的のアミノ酸位置（例えば、品質管理（ＱＣ）アッセイにより選択されるような少なくとも１つの望ましい特性を有するｓｃＦｖ配列のデータベースと、成熟抗体配列のデータベース、例えばＫａｂａｔデータベースとを比較することによって同定されるアミノ酸位置）で置換、欠失、及び／又は付加される好ましいアミノ酸残基を同定することによって最適化される。したがって、本開示は、さらに、特定のアミノ酸残基を選択するための「濃縮／排除」方法を提供する。なおさらに、本開示は、本明細書に記載される「機能的コンセンサス」アプローチを用いて同定された特定のフレームワークアミノ酸位置を突然変異させることによって、抗原結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ）を操作する方法を提供する。ある特定の実施形態では、フレームワークアミノ酸位置は、本明細書に記載される「濃縮／排除」分析方法を用いて、「濃縮された」残基であることが見出される残基により既存のアミノ酸残基を置換することによって突然変異される。一態様では、本開示は、ＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を有する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）における突然変異のためのアミノ酸位置を同定する方法であって、該方法は、ａ）ｓｃＦｖ ＶＨ、ＶＬ又はＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を、多数の抗体ＶＨ、ＶＬ又はＶＨ及びＶＬアミノ酸配列を含むデータベースに入力し、それにより、ｓｃＦｖ ＶＨ、ＶＬ又はＶＨ及びＶＬアミノ酸配列が、データベースの抗体ＶＨ、ＶＬ又はＶＨ及びＶＬアミノ酸配列と整列させ；ｂ）ｓｃＦｖ ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位置を、データベースの抗体ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内の対応する位置と比較し；ｃ）ｓｃＦｖ ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位置が、データベースの抗体ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内の対応する位置で保存されているアミノ酸残基によって占められているか否かを決定し；及びｄ）アミノ酸位置がデータベースの抗体ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内の対応する位置に保存されていないアミノ酸残基によって占められている場合、ｓｃＦｖ ＶＨ又はＶＬアミノ酸配列内のアミノ酸位置を突然変異のためのアミノ酸位置として同定することを含む。ＳｃＦＶ最適化は、国際公開第２００８１１０３４８号、国際公開第２００９００００９９号、国際公開第２００９００００９８号、及び国際公開第２００９１５５７２５号においてさらに詳細に記載され、これらは全て参照により本明細書に組み込まれる。
【0079】
ヒト化：
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒト化され得る。本明細書で使用される場合、用語「ヒト化された」とは、ヒトにおいて天然に産生された抗体に対するそれらの類似性を増加させるように修飾された非ヒトドナー抗体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」とは、非ヒトドナー抗体をヒト化するプロセスを指す。ヒト化は、可溶性であり、安定な軽鎖及び／又は重鎖ヒト抗体フレームワーク領域など、ヒト又はヒト化抗体受容体フレームワーク領域に非ヒトドナー抗体のＣＤＲ（例えば、ウサギ又はラマ抗体ＣＤＲ）をグラフトすることによって達成することができる。ヒト受容体フレームワークにＣＤＲをグラフトする一般的な方法は、米国特許第５，２２５，５３９号におけるＷｉｎｔｅｒ、及び国際公開第１９９００７８６１号におけるＱｕｅｅｎらにより開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。適切な受容体フレームワーク領域は、改善された可溶性及び安定性などの優れた機能的特性を示すことができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はウサギ抗体である。前記ウサギ抗体のＣＤＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９１５５７２６号に記載されるフレームワーク領域などの、ユニバーサル受容体フレームワーク領域にグラフトされ得る。
ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、ヒト化され得る。本明細書で使用される場合、用語「ヒト化された」とは、ヒトにおいて天然に産生された抗体に対するそれらの類似性を増加させるように修飾された非ヒトドナー抗体を指す。本明細書で使用される場合、用語「ヒト化」とは、非ヒトドナー抗体をヒト化するプロセスを指す。ヒト化は、可溶性であり、安定な軽鎖及び／又は重鎖ヒト抗体フレームワーク領域など、ヒト又はヒト化抗体受容体フレームワーク領域に非ヒトドナー抗体のＣＤＲ（例えば、ウサギ又はラマ抗体ＣＤＲ）をグラフトすることによって達成することができる。ヒト受容体フレームワークにＣＤＲをグラフトする一般的な方法は、米国特許第５，２２５，５３９号におけるＷｉｎｔｅｒ、及び国際公開第１９９００７８６１号におけるＱｕｅｅｎらにより開示されており、参照により本明細書に組み込まれる。適切な受容体フレームワーク領域は、改善された可溶性及び安定性などの優れた機能的特性を示すことができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質はウサギ抗体である。前記ウサギ抗体のＣＤＲは、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００９１５５７２６号に記載されるフレームワーク領域などの、ユニバーサル受容体フレームワーク領域にグラフトされ得る。
【0080】
ある特定の実施形態では、非ヒト抗体のヒト化／安定化、又はヒト抗体の安定化のためのヒトフレームワークは、改善されたタンパク質安定性及び減少した凝集傾向を有するκ－λキメラ可変軽鎖ドメインをもたらすλ接合セグメントによるκ可変軽鎖ドメインにおけるκ接合セグメントの置換に関する。さらに、タンパク質の安定性をさらに改善し、凝集傾向をさらに減少させるために、κ－λキメラ可変軽鎖ドメインにおけるλ接合セグメントのパッキングを支援するための、ＡＨｏ１０１位のκコンセンサス残基の突然変異及びλコンセンサス残基による置換に関する。これらのヒトフレームワーク領域に関するさらなる詳細は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１４２０６５６１号及び国際公開第２０１９０５７７８７号に記載される。
【0081】
補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置する方法
補体Ｃ３介在性疾患又は障害を患う対象において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を用いて補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置する方法が提供される。
ある特定の実施形態では、補体Ｃ３介在性疾患又は障害は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維形成、自己免疫性ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、関節リウマチ、乾癬及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｃ３介在性疾患は、ＡＭＤの形態である。ＡＭＤは一般に、萎縮型ＡＭＤと滲出型ＡＭＤの２つの主なクラスに分けられる。非滲出性ＡＭＤとしても公知である萎縮型ＡＭＤは、黄斑部にドルーゼン（黄色の沈着物）が存在することによって特徴付けられる。滲出性ＡＭＤ又は新生血管性ＡＭＤとしても公知である滲出型ＡＭＤは、黄斑下の脈絡膜からの異常な血管の増殖によって特徴付けられる。このプロセスは脈絡膜血管新生とも呼ばれ、網膜の内部及び周囲に血液などの液体が漏れ出すことがある。地図状萎縮は、萎縮性ＡＭＤ又は進行性萎縮型ＡＭＤとしても公知であり、網膜細胞の進行性であり、不可逆的な喪失をもたらし得るＡＭＤの進行型である。
補体Ｃ３介在性疾患又は障害を患う対象において、本明細書に記載される抗原結合タンパク質を用いて補体Ｃ３介在性疾患及び障害を処置する方法が提供される。
ある特定の実施形態では、補体Ｃ３介在性疾患又は障害は、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、地図状萎縮（ＧＡ）、新生血管緑内障、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、水晶体後線維形成、自己免疫性ブドウ膜炎、脈絡網膜炎、網膜炎、関節リウマチ、乾癬及びアテローム性動脈硬化症からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、Ｃ３介在性疾患は、ＡＭＤの形態である。ＡＭＤは一般に、萎縮型ＡＭＤと滲出型ＡＭＤの２つの主なクラスに分けられる。非滲出性ＡＭＤとしても公知である萎縮型ＡＭＤは、黄斑部にドルーゼン（黄色の沈着物）が存在することによって特徴付けられる。滲出性ＡＭＤ又は新生血管性ＡＭＤとしても公知である滲出型ＡＭＤは、黄斑下の脈絡膜からの異常な血管の増殖によって特徴付けられる。このプロセスは脈絡膜血管新生とも呼ばれ、網膜の内部及び周囲に血液などの液体が漏れ出すことがある。地図状萎縮は、萎縮性ＡＭＤ又は進行性萎縮型ＡＭＤとしても公知であり、網膜細胞の進行性であり、不可逆的な喪失をもたらし得るＡＭＤの進行型である。
【0082】
上述のＡＭＤなどの眼疾患を処置することは特に困難である。前述したように、眼への治療剤の送達は、限定されないが、ＲＰＥなどの血液－網膜関門を含むいくつかの関門のために制限される。ＲＰＥを貫通し、眼の脈絡膜に入る能力は、薬物の治療可能性を高める。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜領域のＲＰＥ及びブルッフ膜を貫通し、それによって脈絡膜領域の補体Ｃ３を標的とすることができる。本開示の抗原結合タンパク質がＲＰＥ及びブルッフ膜を貫通する能力は、補体Ｃ３介在性疾患又は障害の処置におけるそれらの治療可能性を改善する。本開示の抗原結合タンパク質は、部分的にはそのサイズが貫通を容易にするのに十分に低いため、ＲＰＥ及びブルッフ膜を貫通することができる。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質のサイズは、分子量によって測定される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約６０ｋＤａ未満の分子量を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２０ｋＤａ～約３０ｋＤａ又は約１０ｋＤａ～約２０ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２５ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約１５ｋＤａである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質のサイズは、それらの流体力学的半径によって測定される。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約３．０ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２．５ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、約２．０ｎｍ未満又はそれに等しい流体力学的半径を有する。
【0083】
一態様では、本開示は、補体古典経路（ＣＰ）、レクチン経路（ＬＰ）、及び代替経路（ＡＰ）の活性を阻害する方法であって、補体Ｃ３を、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片と接触させることを含む方法を提供する。本開示の抗原結合タンパク質が３つの全ての補体経路を阻害する能力は、補体Ｃ３介在性疾患又は障害の処置におけるそれらの治療可能性をさらに改善する。理論に拘束されることを望まないが、３つの全ての補体経路を阻害することは、１つの活性経路の疾患促進効果が他の不活性化経路を代償することを妨げることによって、本開示の抗原結合タンパク質の治療可能性を改善し得る。
【0084】
ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性をほぼ同等に阻害することができる。例えば、限定するものではないが、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＣＰ経路の活性を少なくとも８０％阻害することができ、ＬＰの活性を少なくとも８０％阻害することができ、ＡＰの活性を少なくとも８０％阻害することができる。ある特定の実施形態では、ＣＰ、ＬＰ、及びＡＰ補体経路の活性の阻害は、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約９５％である。
【0085】
別の態様では、本開示は、補体Ｃ３上のエピトープに結合する抗原結合タンパク質又はその断片の眼内投与を介して、脈絡膜局在補体Ｃ３の活性を阻害する方法を提供する。眼の脈絡膜領域における活性化された補体経路は、補体Ｃ３介在性疾患又は障害に寄与する可能性がある。したがって、本開示の目的は、脈絡膜領域内に浸透又は拡散することができ、補体Ｃ３及びＣ３ｂを標的とすることができる抗原結合タンパク質を提供することである。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜領域におけるＣ３転換酵素の活性を阻害する。ある特定の実施形態では、本開示の抗原結合タンパク質は、眼の脈絡膜領域におけるＣ３転換酵素増幅ループを阻害する。
【0086】
医学的用途
本発明はまた、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、本明細書に開示される抗原結合タンパク質又はその断片に関する。抗原結合タンパク質又はその断片に関する本開示に記載される全ての技術的特徴が適用可能である。
本発明はまた、対象における補体Ｃ３介在性疾患又は障害を処置する方法において使用するための、本明細書に開示される抗原結合タンパク質又はその断片に関する。抗原結合タンパク質又はその断片に関する本開示に記載される全ての技術的特徴が適用可能である。
【0087】
キット
本発明はまた、本明細書に記載される少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片を含むキットを包含する。一実施形態では、キットは、有効量の前記抗原結合タンパク質又はその断片を単位投与形態で含有する組成物を含む。このようなキットは、組成物を含む無菌容器を含むことができ、このような容器の非限定的な例としては、限定されないが、バイアル、アンプル、ボトル、チューブ、シリンジ、ブリスターパックが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、容器は、医薬を保持するのに適した材料で作られる。一実施形態では、キットは、第１の容器に、凍結乾燥形態の抗原結合タンパク質又はその断片、及びその断片の抗原結合タンパク質の再構成又は希釈のための希釈剤（例えば、滅菌水）を含む第２の容器を含み得る。一部の実施形態では、前記希釈剤は、薬学的に許容される希釈剤である。
典型的には、キットは、使用のための説明書とともに容器内又は容器とともに供給される別個のシート、パンフレット又はカードをさらに含む。キットが医薬用途を意図する場合、それは、補体Ｃ３介在性疾患又は障害を有する対象に組成物を投与するための情報、及び投薬スケジュール、治療剤の説明、予防、警告、適応、対抗適応、過量投与情報及び／又は副作用のうちの１つ以上をさらに含むことができる。
本発明はまた、本明細書に記載される少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片を含むキットを包含する。一実施形態では、キットは、有効量の前記抗原結合タンパク質又はその断片を単位投与形態で含有する組成物を含む。このようなキットは、組成物を含む無菌容器を含むことができ、このような容器の非限定的な例としては、限定されないが、バイアル、アンプル、ボトル、チューブ、シリンジ、ブリスターパックが挙げられる。一部の実施形態では、組成物は医薬組成物であり、容器は、医薬を保持するのに適した材料で作られる。一実施形態では、キットは、第１の容器に、凍結乾燥形態の抗原結合タンパク質又はその断片、及びその断片の抗原結合タンパク質の再構成又は希釈のための希釈剤（例えば、滅菌水）を含む第２の容器を含み得る。一部の実施形態では、前記希釈剤は、薬学的に許容される希釈剤である。
典型的には、キットは、使用のための説明書とともに容器内又は容器とともに供給される別個のシート、パンフレット又はカードをさらに含む。キットが医薬用途を意図する場合、それは、補体Ｃ３介在性疾患又は障害を有する対象に組成物を投与するための情報、及び投薬スケジュール、治療剤の説明、予防、警告、適応、対抗適応、過量投与情報及び／又は副作用のうちの１つ以上をさらに含むことができる。
【0088】
診断用途及び／又は検出
本発明の抗原結合タンパク質又はその断片は、インビボ及び／又はインビトロでの検出又は診断目的に使用することができる。例えば、特定の細胞又は組織における発現を検出するための抗原結合タンパク質を含む広範囲のイムノアッセイが、当業者に公知である。このような用途のために、本明細書に開示される抗原結合タンパク質又はその断片は、標識されても標識されなくてもよい。例えば、限定するものではないが、非標識抗原結合タンパク質を使用し、本明細書に記載される抗原結合タンパク質上のエピトープを認識する二次抗体によって検出することができる。別の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出物質（複数可）によって認識することができる１種以上の物質とコンジュゲートしており、例えば、抗原結合タンパク質又はその断片は、ストレプトアビジンによって検出することができるビオチンとコンジュゲートしている。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、試料中のＣ３及び／又はＣ３ｂの存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、試料は生物学的試料である。本明細書で使用される場合、用語「検出する」は、定量的及び／又は定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒト患者由来の細胞又は組織、例えば網膜組織を含む。
本発明の抗原結合タンパク質又はその断片は、インビボ及び／又はインビトロでの検出又は診断目的に使用することができる。例えば、特定の細胞又は組織における発現を検出するための抗原結合タンパク質を含む広範囲のイムノアッセイが、当業者に公知である。このような用途のために、本明細書に開示される抗原結合タンパク質又はその断片は、標識されても標識されなくてもよい。例えば、限定するものではないが、非標識抗原結合タンパク質を使用し、本明細書に記載される抗原結合タンパク質上のエピトープを認識する二次抗体によって検出することができる。別の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出物質（複数可）によって認識することができる１種以上の物質とコンジュゲートしており、例えば、抗原結合タンパク質又はその断片は、ストレプトアビジンによって検出することができるビオチンとコンジュゲートしている。ある特定の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、試料中のＣ３及び／又はＣ３ｂの存在を検出するのに有用である。ある特定の実施形態では、試料は生物学的試料である。本明細書で使用される場合、用語「検出する」は、定量的及び／又は定性的検出を包含する。ある特定の実施形態では、生物学的試料は、ヒト患者由来の細胞又は組織、例えば網膜組織を含む。
【0089】
ある特定の実施形態では、本方法は、生物学的試料を、本発明の少なくとも１つの抗原結合タンパク質又はその断片と接触させ；試料中のＣ３（存在する場合）と抗原結合タンパク質又はその断片の間の複合体の形成を可能にし；次に、前記抗原結合タンパク質又はその断片を検出することを含む。好ましい実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、補体Ｃ３とＣ３ｂの両方に結合することができる。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出可能なシグナルによって検出される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
生物学的試料は、網膜組織などの組織試料であり得る。組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋された組織試料などの固定組織試料であり得る。
一実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、検出可能なシグナルによって検出される。別の実施形態では、抗原結合タンパク質又はその断片は、ＥＬＩＳＡ、免疫細胞化学（ＩＣＣ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、ウエスタンブロッティング及び／又はフローサイトメトリーによって検出される。
生物学的試料は、網膜組織などの組織試料であり得る。組織試料は、ホルマリン固定及びパラフィン包埋された組織試料などの固定組織試料であり得る。
【0090】
一実施形態では、このような方法は、患者を選択するため、すなわち、本明細書に記載されるように、抗原結合タンパク質又はその断片を用いた治療に対する対象の適格性を決定するために使用される。
当業者には、本明細書に記載される方法の他の適切な修飾及び適応が、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用してなされ得ることが容易に明らかである。ここで、ある特定の実施形態を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することによって、本明細書はより明確に理解され、例示の目的のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではない。
当業者には、本明細書に記載される方法の他の適切な修飾及び適応が、本明細書に開示される実施形態の範囲から逸脱することなく、適切な同等物を使用してなされ得ることが容易に明らかである。ここで、ある特定の実施形態を詳細に説明したが、以下の実施例を参照することによって、本明細書はより明確に理解され、例示の目的のためにのみ含まれ、限定することを意図するものではない。
【実施例】
【0091】
（実施例１）
抗Ｃ３抗体ライブラリーの作製及び特徴付け
補体カスケードを阻害する抗体を、補体の部分的阻害剤で可能なものよりも効率的に生成するために、多様なエピトープ認識を有する抗Ｃ３抗体の広範な収集は、所望の機能を有する抗体の単離の確率を増加させると仮定された。このために、Ｃ３で免疫化された動物のＢ細胞由来の抗体可変ドメインをコードするゲノム情報を用いて、大型抗体ファージライブラリーを構築した。
Ｃ３上の異なるエピトープを認識することができる多数の抗体を生成するために、３匹のニュージーランド白色ウサギ及び２匹のラマを、血清から精製された天然ヒトＣ３タンパク質で免疫化した（図２）。各動物は、完全又は不完全フロイントアジュバントを用いて、異なる時点でＣ３タンパク質の４回の注射を受けた（図３Ａ）。各動物の免疫応答をＥＬＩＳＡを用いて試験し、免疫化動物の血清試料中に存在する抗Ｃ３抗体を定量した。血清中の抗体価は優れた免疫応答を示した（図３Ｂ）。
抗Ｃ３抗体ライブラリーの作製及び特徴付け
補体カスケードを阻害する抗体を、補体の部分的阻害剤で可能なものよりも効率的に生成するために、多様なエピトープ認識を有する抗Ｃ３抗体の広範な収集は、所望の機能を有する抗体の単離の確率を増加させると仮定された。このために、Ｃ３で免疫化された動物のＢ細胞由来の抗体可変ドメインをコードするゲノム情報を用いて、大型抗体ファージライブラリーを構築した。
Ｃ３上の異なるエピトープを認識することができる多数の抗体を生成するために、３匹のニュージーランド白色ウサギ及び２匹のラマを、血清から精製された天然ヒトＣ３タンパク質で免疫化した（図２）。各動物は、完全又は不完全フロイントアジュバントを用いて、異なる時点でＣ３タンパク質の４回の注射を受けた（図３Ａ）。各動物の免疫応答をＥＬＩＳＡを用いて試験し、免疫化動物の血清試料中に存在する抗Ｃ３抗体を定量した。血清中の抗体価は優れた免疫応答を示した（図３Ｂ）。
【0092】
ＰＣＲ増幅によりウサギから単離されたＰＢＭＣ及び脾臓リンパ球から抽出したＲＮＡからｓｃＦｖ抗体ｃＤＮＡライブラリーを構築した。可変軽鎖及び重鎖ドメインのコード配列を別々に増幅し、一連のオーバーラップポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）工程を通して連結して、最終ｓｃＦｖ産物を得た。
ラマについては、大量の出血が行われ、そこからＲＮＡが単離され、逆転写酵素Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡに転写された。ｃＤＮＡをクリーニングし、重鎖断片をリーダー配列領域及びＣＨ２領域でのプライマーアニーリングを用いて増幅した。
ウサギ由来のｓｃＦｖ及びラマ由来のＶＨＨをコードする増幅されたＤＮＡ配列を、適切な制限酵素を用いて消化し、その後、ファージミドベクターに連結した。ファージミドベクターは、抗体ファージディスプレイライブラリー作製によく適したＴＧ１電気コンピテント細胞に形質転換された。これらのプロセスは、１０8個のクローンより大きいサイズを有する４つの抗体ライブラリーをもたらし、１００％インサートパーセンテージに近かった（図４Ａ及び図４Ｂ）。
ラマについては、大量の出血が行われ、そこからＲＮＡが単離され、逆転写酵素Ｋｉｔを用いてｃＤＮＡに転写された。ｃＤＮＡをクリーニングし、重鎖断片をリーダー配列領域及びＣＨ２領域でのプライマーアニーリングを用いて増幅した。
ウサギ由来のｓｃＦｖ及びラマ由来のＶＨＨをコードする増幅されたＤＮＡ配列を、適切な制限酵素を用いて消化し、その後、ファージミドベクターに連結した。ファージミドベクターは、抗体ファージディスプレイライブラリー作製によく適したＴＧ１電気コンピテント細胞に形質転換された。これらのプロセスは、１０8個のクローンより大きいサイズを有する４つの抗体ライブラリーをもたらし、１００％インサートパーセンテージに近かった（図４Ａ及び図４Ｂ）。
【0093】
（実施例２）
３つの全ての補体経路を阻害する抗Ｃ３抗体のスクリーニング
Ｃ３は１３個の異なるドメインで構成される大きなタンパク質であり、分子サイズは１８５キロダルトンである。補体活性化の間、Ｃ３は異なる部位でタンパク質分解的切断と構造的修飾を受ける。Ｃ３由来断片は、異なるエフェクター機能を発揮し、補体経路の増幅ループに燃料を供給する転換酵素を形成する。Ｃ３転換酵素という酵素は、強力な増幅ループにおいて複数のＣ３分子をＣ３ｂに切断し、より多くのＣ３転換酵素を生成する能力を有し、補体系の完全な活性化をもたらす。本明細書に記載されるスクリーニングを用いて、Ｃ３とＣ３ｂの両方の異なるエピトープに結合し、補体活性化の３つの全ての経路（古典、レクチン、及び代替）を効果的に遮断する抗体を同定した。
高親和性の抗Ｃ３抗体をスクリーニングするために、ファージ上に提示されたｓｃＦｖｓ及びＶＨＨ抗体を産生し、血清から精製された天然ヒトＣ３に対する数回のバイオパニング（選択）に供した。選択のストリンジェンシーは、バイオパニングにおいて使用されるＣ３タンパク質の濃度を低下させるか、又は洗浄のストリンジェンシーを増加させることによって、各ラウンドとともに増加した。約３８０のモノクローナルファージを選択し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣ３に結合する能力についてスクリーニングした（図５）。
ＥＬＩＳＡデータ及びＤＮＡフィンガープリントに基づいて、４１個のファージクローンを配列決定のために選択し、抗体タンパク質として組換え的に産生し、ヒトＣ３及びＣ３ｂに結合するそれらの能力及びさらなる特徴付けについて評価した（図５）。
３つの全ての補体経路を阻害する抗Ｃ３抗体のスクリーニング
Ｃ３は１３個の異なるドメインで構成される大きなタンパク質であり、分子サイズは１８５キロダルトンである。補体活性化の間、Ｃ３は異なる部位でタンパク質分解的切断と構造的修飾を受ける。Ｃ３由来断片は、異なるエフェクター機能を発揮し、補体経路の増幅ループに燃料を供給する転換酵素を形成する。Ｃ３転換酵素という酵素は、強力な増幅ループにおいて複数のＣ３分子をＣ３ｂに切断し、より多くのＣ３転換酵素を生成する能力を有し、補体系の完全な活性化をもたらす。本明細書に記載されるスクリーニングを用いて、Ｃ３とＣ３ｂの両方の異なるエピトープに結合し、補体活性化の３つの全ての経路（古典、レクチン、及び代替）を効果的に遮断する抗体を同定した。
高親和性の抗Ｃ３抗体をスクリーニングするために、ファージ上に提示されたｓｃＦｖｓ及びＶＨＨ抗体を産生し、血清から精製された天然ヒトＣ３に対する数回のバイオパニング（選択）に供した。選択のストリンジェンシーは、バイオパニングにおいて使用されるＣ３タンパク質の濃度を低下させるか、又は洗浄のストリンジェンシーを増加させることによって、各ラウンドとともに増加した。約３８０のモノクローナルファージを選択し、ＥＬＩＳＡアッセイにおいてＣ３に結合する能力についてスクリーニングした（図５）。
ＥＬＩＳＡデータ及びＤＮＡフィンガープリントに基づいて、４１個のファージクローンを配列決定のために選択し、抗体タンパク質として組換え的に産生し、ヒトＣ３及びＣ３ｂに結合するそれらの能力及びさらなる特徴付けについて評価した（図５）。
【0094】
３つの全ての補体経路を遮断する抗体を同定するために、Ｗｉｅｓｌａｂ（登録商標）補体系スクリーン（Ｓｖａｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ＡＢ、Ｍａｌｍｏ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて、ヒト血清中の機能的な古典補体経路、レクチン補体経路及び代替補体経路の定性的決定のための酵素イムノアッセイを用いて抗体をスクリーニングした。Ｃ５ｂ－Ｃ９ネオ抗原の生成量は補体経路の機能的活性に比例する。図６に示されるように、５つの抗体であるＭ０２５１、Ｍ０２２８、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３及びＭ０１２４は、ヒト血清（Ｑｕｉｄｅｌ）において、２μＭの固定濃度で、３つの全ての補体経路を少なくとも９０％阻害することができた。
【0095】
（実施例３）
抗Ｃ３抗体：Ｍ０２５１、Ｍ０２２８、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、及びＭ０１２４の特徴付け
Ｍ０２５１、Ｍ０２２８、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３及びＭ０１２４は、Ｃ３上の同じ領域（エピトープ）を標的とするものを同定するために、ペアワイズコンビナトリアル様式で試験された。簡単に説明すると、１つの抗体をビオチン化により標識し、Ｃ３結合ＥＬＩＳＡにおいて他の抗体クローンとともにインキュベートした。同一の結合領域に対して競合するこれらの抗Ｃ３抗体は、類似のエピトープを共有し、したがって、類似の機能を有すると考えられた。この情報は、エピトープの多様性を維持しながら、潜在的な抗体候補の数を減少させることを可能にする。３つの全ての補体経路を阻害する５つの抗体のうち、Ｍ０２５１、Ｍ０２２８及びＭ０１２３は、Ｃ３上で同じエピトープを共有すると考えられた（図７Ｄ）。阻害リードは、Ｃ３上の３つの異なるエピトープに結合すると考えられた（図７Ａ－７Ｄ）。
抗Ｃ３抗体：Ｍ０２５１、Ｍ０２２８、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３、及びＭ０１２４の特徴付け
Ｍ０２５１、Ｍ０２２８、Ｍ０１２２、Ｍ０１２３及びＭ０１２４は、Ｃ３上の同じ領域（エピトープ）を標的とするものを同定するために、ペアワイズコンビナトリアル様式で試験された。簡単に説明すると、１つの抗体をビオチン化により標識し、Ｃ３結合ＥＬＩＳＡにおいて他の抗体クローンとともにインキュベートした。同一の結合領域に対して競合するこれらの抗Ｃ３抗体は、類似のエピトープを共有し、したがって、類似の機能を有すると考えられた。この情報は、エピトープの多様性を維持しながら、潜在的な抗体候補の数を減少させることを可能にする。３つの全ての補体経路を阻害する５つの抗体のうち、Ｍ０２５１、Ｍ０２２８及びＭ０１２３は、Ｃ３上で同じエピトープを共有すると考えられた（図７Ｄ）。阻害リードは、Ｃ３上の３つの異なるエピトープに結合すると考えられた（図７Ａ－７Ｄ）。
【0096】
３つの全ての補体経路を阻害することができるものとして同定された抗体は、ＥＬＩＳＡにおいてカニクイザルＣ３と結合するそれらの能力について評価された。簡単に説明すると、９６ウェルのＥＬＩＳＡプレートは、ｃｙｎｏ Ｃ３に対して交差反応性であると考えられるポリクローナルヤギ抗血清を用いて被覆され、続いて、カニクイザル血清（ＢｉｏＩＶＴ、ＮＢ－１５１５５８）のカスタム調製物と二次的に会合させた。抗体分子の連続希釈物をＥＬＩＳＡプレートに添加し、ウサギ抗ヒトカッパＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０２５４９）又はマウス抗Ｈｉｓ Ｔａｇ ＨＲＰ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＭＡＢ０５０Ｈ）を用いてｃｙｎｏ Ｃ３に結合する抗体を検出した。リードＭ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１は、カニクイザルＣ３に用量反応的に結合することを示す。興味深いことに、Ｍ０２５１、Ｍ０２２８及びＭ０１２３はヒトＣ３上の同じエピトープに対して競合するが、ｃｙｎｏ Ｃ３に対して結合活性を示したのはＭ０２５１のみであった（図１５Ａ及び１５Ｂ）。
【0097】
Ｗｉｅｓｌａｂ補体系スクリーンを用いて、カニクイザル血清中の補体活性化の全ての経路を阻害する抗Ｃ３抗体の能力を評価した。抗Ｃ３抗体をｃｙｎｏ血清のカスタム調製物に添加した。図１４Ａは、２μＭの固定濃度でＭ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１による３つの全ての補体経路の強力な阻害を示し、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１が、ｃｙｎｏ血清における補体介在性ＭＡＣ形成の強力な阻害剤であることを示唆する。Ｍ０２２８は、ｃｙｎｏ血清において補体経路の阻害活性を示さず、この抗体がｃｙｎｏＣ３に対して観察された結合活性の欠如を確認した（図１４Ｂ）。カニクイザル血清における古典経路及び代替経路の用量依存的阻害は、対応するＷｉｅｓｌａｂ補体系キットを用いて、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２５１についてさらに評価された（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。
Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８は、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＣ３とＣ３ｂの両方に結合する能力について評価された（図８Ａ及び図８Ｂ）。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、精製された天然ヒトＣ３又はＣ３ｂ（Complement Technology、A113及びA114）で被覆された。抗体分子の連続希釈物をプレートに添加し、ウサギ抗ヒトカッパＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０２５４９）又はウサギ抗Ｈｉｓ Ｔａｇ ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８７）によって検出した。Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８は、ヒトＣ３とＣ３ｂの両方に高い親和性結合を示す。ヒトＣ３に対するＭ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８の結合動力学は、低ピコモル範囲の親和性を示すバイオレイヤー干渉法によってさらに分析された（図１０）。
Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８は、直接結合ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、ヒトＣ３とＣ３ｂの両方に結合する能力について評価された（図８Ａ及び図８Ｂ）。簡単に説明すると、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートは、精製された天然ヒトＣ３又はＣ３ｂ（Complement Technology、A113及びA114）で被覆された。抗体分子の連続希釈物をプレートに添加し、ウサギ抗ヒトカッパＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０２５４９）又はウサギ抗Ｈｉｓ Ｔａｇ ＨＲＰ抗体（Ａｂｃａｍ、ａｂ１１８７）によって検出した。Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８は、ヒトＣ３とＣ３ｂの両方に高い親和性結合を示す。ヒトＣ３に対するＭ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８の結合動力学は、低ピコモル範囲の親和性を示すバイオレイヤー干渉法によってさらに分析された（図１０）。
【0098】
ヒト血清中の代替経路及び古典経路の用量依存的阻害は、対応するＷｉｅｓｌａｂ補体系キットを用いて、Ｍ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８について評価された。抗Ｃ３抗体であるＭ０１２２、Ｍ０１２４及びＭ０２２８は、ヒト血清における代替経路及び古典経路の強力な阻害を示す（図９Ａ及び図９Ｂ）。抗Ｃ３抗体であるＭ０１２２、Ｍ０１２３及びＭ０１２４は、用量反応様式でレクチン経路を阻害するそれらの能力についてさらに評価された。図１６は、ヒト血清におけるレクチン経路の効率的な阻害を示す。全てを合わせると、これらの結果は、本発明の抗体による補体活性化の３つの全ての経路の効率的な阻害をさらに支持する。
【0099】
（実施例４）
抗Ｃ３抗体はＡＰＬ－２よりブルッフ膜を貫通する可能性が高い
現在では、補体系が地図状萎縮の病因に関与していることが公知である。しかしながら、補体活性がどのようにして眼において区画化されるか、及びＧＡ療法の効力が眼内の正しい解剖学的部位に治療薬を送達することに依存するかどうかは、まだ完全には理解されていない。本発明者らは、ＧＡにおける病変増殖の大幅な減少を達成するには、疾患に関連した網膜組織（すなわち、ＲＰＥ、ブルッフ膜及び脈絡膜）へのより良好な浸透が必要であり得るという仮説を立てた。脈絡膜の内側は脈絡毛細管と呼ばれ、ブルッフ膜（ＢｒＭ）と呼ばれる細胞外膜のシートによって隔てられた毛細血管を含有する（図１１）。
抗Ｃ３抗体はＡＰＬ－２よりブルッフ膜を貫通する可能性が高い
現在では、補体系が地図状萎縮の病因に関与していることが公知である。しかしながら、補体活性がどのようにして眼において区画化されるか、及びＧＡ療法の効力が眼内の正しい解剖学的部位に治療薬を送達することに依存するかどうかは、まだ完全には理解されていない。本発明者らは、ＧＡにおける病変増殖の大幅な減少を達成するには、疾患に関連した網膜組織（すなわち、ＲＰＥ、ブルッフ膜及び脈絡膜）へのより良好な浸透が必要であり得るという仮説を立てた。脈絡膜の内側は脈絡毛細管と呼ばれ、ブルッフ膜（ＢｒＭ）と呼ばれる細胞外膜のシートによって隔てられた毛細血管を含有する（図１１）。
【0100】
ブルッフ膜は抗体及び生物製剤に選択的な透過性である。Ｃｌａｒｋら（Front. Immunol. 2017. 8:1-10）によって報告されているように、補体経路タンパク質はＦＨＬ－１、Ｄ因子及びＣ５ａ以外はブルッフ膜を通過することができない。全体的に、大きな流体力学的半径を有する抗体及び生物製剤はブルッフ膜を通過しにくい。下記の表３に示されるように、ＡＰＬ－２及びＣＤＲ２（本開示の抗Ｃ３ ｓｃＦｖ）以外に、流体力学的半径が３．００より大きい列挙された分子は、ＦＨＬ－１を除きブルッフ膜を通過することができず；一方、流体力学的半径が３．００より大きい列挙された全ての分子は、Ｃ３ａを除きブルッフ膜を通過することができる。
【0101】
【表3】
【0102】
さらに、Ｐｉｔｋａｎｅｎら（Invest Ophthalmol Vis Sci. 2005; 46(2):641-6）は、４～８０ｋＤａの分子量のカルボキシフルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）標識デキストランについて、ウシの眼からの新鮮なＲＰＥ－脈絡膜検体の透過性を研究した。本発明者らは、分子サイズに対して透過性をプロットした（図１２、黒色のドット）。また、本発明者らは、Ｈｉｒｖｏｎｅｎら（Pharm Res. 2016;33(8):2025-32）が行った研究を用いて、流体力学的半径に基づいてｓｃＦｖ、ｌｕｃｅｎｔｉｓ、ｅｙｌｅａ及びＡＰＬ２の透過率値を導出し、分子量に対する透過性を同じグラフにプロットした（図１２、色付きのドット）。この傾向は、分子量が大きいほどブルッフ膜の透過性が低いことを示している。
【0103】
本発明者らは、流体力学的半径が約２．５ｎｍ若しくはそれよりも小さい、限定されないが、ｓｃＦｖ又はＶＨＨフォーマットなどの抗体断片としての本開示の抗Ｃ３抗体は、流体力学的半径が少なくとも７ｎｍであるＡＰＬ－２（４０ｋＤａの線状ＰＥＧに連結された２つの抗Ｃ３環状ＡＰＬ－１ペプチド、合計４３ｋＤａ）よりもブルッフ膜を良好に透過し得る可能性が高いと予測した。
【0104】
この仮説を検証するために、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーに設置した濃縮されたブタＢｒＭを用いて、抗Ｃ３分子のＢｒＭを通過する能力を評価した。簡単に説明すると、濃縮されたブルッフ膜をブタの眼から単離し、Ｕｓｓｉｎｇ拡散チャンバー（Ｍｕｌｔｉ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｓｙｓｔｅｍｓ ＭＣＳ ＧｍｂＨ、カタログ番号６６００２６）に設置した。いったん設置すると、直径５ｍｍのブルッフ膜が、２つの同一コンパートメント間の唯一のバリアであった。ブルッフ膜の両側は、室温で少なくとも５分間、１ｍｌのＰＢＳで洗浄された。漏れ試験のために、１ｍｌのＰＢＳを試料チャンバーに添加し、第２コンパートメントへの漏れを５分間追跡した。膜の完全性が損なわれることを示す漏れが検出されなかった場合、抗体タンパク質は、１００μｇ／ｍｌのＰＢＳ１ｍｌで、試料チャンバーに添加され、１ｍｌのＰＢＳは第２コンパートメント（拡散物チャンバー）に添加された。全Ｕｓｓｉｎｇチャンバーを室温で２４時間穏やかに振とうしながらインキュベートして、拡散タンパク質の勾配を生じさせないようにした。各チャンバーからの試料（１５μｌ）をゲル電気泳動によって分析した。プレキャスト４～１２％ＮｕＰＡＧＥ Ｂｉｓ Ｔｒｉｓ ＳＤＳゲル（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を還元条件下で４０分間、２００Ｖで泳動した。ゲルは、抗体タンパク質を検出するためにインスタントブルー染色（Ｅｘｐｅｄｅｏｎ）を用いて６０分間、室温で染色されたか、又はＰＥＧを検出するためにヨウ化バリウム溶液を用いて染色された（ゲルを０．１Ｍ過塩素酸で固定し、１５分後に２０ｍｌの５％ＢａＣｌ2と８ｍｌの０．１Ｍヨウ素溶液の予備混合物に置き換え、１０分後に１０分ごとに脱イオン水で１時間繰り返し置き換えた）。試料チャンバー又は拡散物チャンバー中のタンパク質のパーセンテージを計算するために、インスタントブルー染色又はＢａＩ2染色したＳＤＳゲル中のバンド密度をＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いて測定した。これらのバンドの平均強度は、１００％負荷タンパク質（すなわち、１００μｇ／ｍｌの１５μｌ）を表す対照バンドの密度と比較された。次に、計算されたパーセンテージのタンパク質を±ＳＤでプロットした。ブタＢｒＭを通過する能力は、Ｍ０１２３（２６ｋＤａ）のｓｃＦｖ誘導体及びＡＰＬ－２代理物（４０ｋＤａの線状ＰＥＧに連結した１つの抗Ｃ３環状ＡＰＬ－１ペプチド、合計４２ｋＤａ）について比較され、４つの異なるブタの眼からのＢｒＭ調製物上で同時にインキュベートされた。ＡＰＬ－２代理物と比較して、４つの全ての膜調製物において、有意に高い量のｓｃＦｖがＢｒＭを通過した（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。
【図1】
【図2】
【図3A】
【図3B】
【図4A】
【図4B】
【図5】
【図6】
【図7A】
【図7B】
【図7C】
【図7D】
【図8A】
【図8B】
【図9A】
【図9B】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13A】
【図13B】
【図14A】
【図14B】
【図14C】
【図15A】
【図15B】
【図16】
【配列表】
【国際調査報告】