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特表2024-508800（ポリ）ペプチド及びオリゴヌクレオチドのライゲーション方法
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】（ポリ）ペプチド及びオリゴヌクレオチドのライゲーション方法
(51)【国際特許分類】
C12P 21/02 20060101AFI20240220BHJP
C12N 15/11 20060101ALI20240220BHJP
C07K 14/00 20060101ALI20240220BHJP
C07K 7/06 20060101ALN20240220BHJP
C07K 5/06 20060101ALN20240220BHJP
C07K 5/08 20060101ALN20240220BHJP
C07K 5/10 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12P21/02 B
C12N15/11 Z
C07K14/00
C07K7/06 ZNA
C07K5/06
C07K5/08
C07K5/10
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023550641
(86)(22)【出願日】2022-02-23
(85)【翻訳文提出日】2023-09-26
(86)【国際出願番号】 SG2022050088
(87)【国際公開番号】W WO2022182294
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】10202101791Y
(32)【優先日】2021-02-23
(33)【優先権主張国・地域又は機関】SG
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ノニデット
(71)【出願人】
【識別番号】506076891
【氏名又は名称】ナンヤン テクノロジカル ユニヴァーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ファン、アン トゥアン
(72)【発明者】
【氏名】タン、デリック ジン ヤン
(72)【発明者】
【氏名】リム、カー ワイ
(72)【発明者】
【氏名】チョン、ヴィー ヴィー
【テーマコード（参考）】
4B064
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B064AG01
4H045AA10
4H045AA20
4H045AA30
4H045BA10
4H045BA11
4H045BA12
4H045BA13
4H045BA14
4H045BA15
4H045EA20
4H045EA60
4H045FA33
4H045GA21
(57)【要約】
本発明は、酵素的（ポリ）ペプチドライゲーションの技術分野に属し、特に、（ポリ）ペプチドとオリゴヌクレオチドのライゲーションを可能にする方法に関する。本方法は、ペプチドタグで修飾された少なくとも１つのカーゴ分子、及びカーゴ分子にライゲーションされる少なくとも１つのポリ（ペプチド）を提供することを含み、ペプチドタグ及び／又は（ポリ）ペプチドは、ペプチドリガーゼのためのライゲーションモチーフ、好ましくはソルターゼ及びペプチジルアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）、例えばブテラーゼ－１、ＶｙＰＡＬ２又はＯａＡＥＰ１ｂを含む。本発明はまた、得られるコンジュゲート及び対応する使用にも関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
（ポリ）ペプチドとカーゴ分子との酵素的ライゲーションのための方法であって、（ｉ）ペプチドタグで修飾された少なくとも１つのカーゴ分子、及び前記カーゴ分子にライゲーションされる少なくとも１つのポリ（ペプチド）を提供する工程であって、前記ペプチドタグ及び／又は前記（ポリ）ペプチドはペプチドリガーゼのライゲーションモチーフを含む、前記提供する工程；及び
（ｉｉ）前記カーゴ分子及び前記ポリ（ペプチド）を、前記ペプチドタグと前記（ポリ）ペプチドとを前記ライゲーションモチーフを介してライゲーションするペプチドリガーゼと接触させる工程
を含む方法。
【請求項2】
前記カーゴ分子は、１つ以上のペプチドタグを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記ペプチドタグは、最大１０アミノ酸の長さ、好ましくは２～７アミノ酸の長さである、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項4】
前記ペプチドタグは、足場部分を介して前記カーゴ分子に結合される、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
ペプチドリガーゼの前記ライゲーションモチーフは、ライゲーションされる前記（ポリ）ペプチドのＣ末端に位置する、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
前記ペプチドリガーゼは、ソルターゼ及びペプチジルアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）、任意選択でブテラーゼ－１、ＶｙＰＡＬ２又はＯａＡＥＰ１ｂから選択される、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記カーゴ分子は、色素、薬物、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記カーゴ分子はオリゴヌクレオチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記ペプチドタグは、５’末端、３’末端に結合されるか、又は前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド鎖に組み込まれるか、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
前記ペプチドタグは、前記オリゴヌクレオチドの骨格、糖部分又は塩基部分に結合されるか、又はそれらの任意の組み合わせである、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
前記オリゴヌクレオチドは、修飾塩基、修飾糖、ホスホロチオアート結合、ホスホロジアミダートモルホリノユニット、ロック核酸モノマー、又はそれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドアナログである、請求項８～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
ペプチドタグで修飾された前記オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、好ましくはホスホロアミダイト基又はホスホロアミダート基に結合することができる反応性基を含む足場に結合した前記ペプチドタグを、前記反応性基と前記オリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする条件下で前記オリゴヌクレオチドと反応させることで、ペプチドタグで修飾された前記オリゴヌクレオチドを生成することによって得られる、請求項８～１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記足場は、アミノ酸アナログ、好ましくは４－ヒドロキシプロリノール、セリノール、スレオニノール、Ｎ－メチル－セリノール、又はＮ－メチルスレオニノールであり、それぞれホスホロアミダイト基又はホスホロアミダート基を含むものであるか、（Ａ）「Ｙ」で表される前記ペプチドタグがカルボニル基を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され：
（Ａ１）
【表1】
式中、Ｒは
【表2】
から選択され、式中、Ｘは反応性基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表すか、
（Ａ２）
【表3】
式中、「塩基」は核酸塩基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表し、Ｘは反応性基を表すか、
（Ａ３）
【表4】
式中、「塩基」は核酸塩基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表し、前記ホスホロアミダイト基が前記反応性基であるか、
（Ａ４）
【表5】
式中、Ｘは反応性基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表すか、
（Ａ５）
【表6】
式中、前記ホスホロアミダイト基が前記反応性基であり、
（Ａ１）～（Ａ５）において、Ｙは任意選択で
【表7】
から選択され、式中、Ｆｍｏｃはアミノ基及びイミノ基の保護基を表す、
あるいは
（Ｂ）「Ｚ」で表される前記ペプチドタグがアミノ基を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され：
（Ｂ１）
【表8】
式中、Ｒは
【表9】
から選択され、式中、Ｘは反応性基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表すか、
（Ｂ２）
【表10】
式中、「塩基」は核酸塩基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表し、Ｘは反応性基を表すか、
（Ｂ３）
【表11】
式中、「塩基」は核酸塩基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表し、前記ホスホロアミダイト基が前記反応性基であるか、
（Ｂ４）
【表12】
式中、Ｘは反応性基を表し、「ＤＭＴ」はヒドロキシルの保護基を表すか、
（Ｂ５）
【表13】
式中、前記ホスホロアミダイト基が前記反応性基であり、
（Ｂ１）～（Ｂ５）において、Ｚは任意選択で
【表14】
から選択され、式中、ＲはＮＨ２又はＯ－Ｐ６であり、Ｐ６はカルボン酸保護基であり、
（Ａ１）～（Ａ５）及び（Ｂ１）～（Ｂ５）において、
ｍは０～８であり、
ｎは０～８であり、
Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の保護基であり、
Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の保護基であり、
Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の保護基であり、
Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適したペントース糖の２’－Ｏ上の保護基であり、
Ｐ５は、ＵＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した保護基である、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記カーゴ分子とペプチドリガーゼを有する前記ポリ（ペプチド）とのライゲーションは、同じであっても異なっていてもよいペプチドリガーゼに対する少なくとも２つのライゲーションモチーフを含む二機能性アダプターを介するものである、請求項１～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法に従って得られるコンジュゲート。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、酵素的（ポリ）ペプチドライゲーションの技術分野に属し、特に、（ポリ）ペプチドとオリゴヌクレオチドのライゲーションを可能にする方法に関する。本発明はまた、得られるコンジュゲート及び対応する使用にも関する。
【背景技術】
【0002】
ペプチド及びオリゴヌクレオチド（オリゴ）は、化学的及び分子生物学的ツールとして広く利用されており、近年、実行可能で効果的な薬剤クラスとして浮上している。２つの方式を結合することで、両方の利点を活用して組み合わせ、これらの活性の範囲を拡大する機会が得られる。例えば、ペプチドはオリゴを運ぶことができ、逆に、アプタマーはペプチドを生体内又は細胞内の所望の作用部位に運ぶことで、治療薬又はイメージングツールとして機能することができる。しかし、ペプチドとオリゴの固相合成の間の化学的適合性が限られているため、ペプチド－オリゴコンジュゲート（ＰＯＣ）の生成は依然として場当たり的で手間のかかる方法のままである。したがって、ペプチドとオリゴのライゲーションに向けた合理化された方法は、ケミカルバイオロジーのツールボックスを拡張し、治療薬開発のためのＰＯＣの生産を促進する手段を提供するであろう。
【0003】
現在までに、ＰＯＣの合成には２つの一般的な戦略が利用可能である（非特許文献１～４）。１つ目は、同じ固体支持体上へのアミノ酸及びヌクレオチドモノマーの連続添加によるインライン合成を伴う（非特許文献５～１３）。単純ではあるものの、この戦略は、２つの実体の段階的なカップリングと全体的な脱保護に対照的な化学反応が使用されることを考慮すると、適合する保護基の選択肢が限られているため制約を受ける。一方、合成後の結合には、結合前にペプチドとオリゴヌクレオチドを別々に合成、脱保護、及び精製することが含まれる（非特許文献１４～１９）。これにより適合性の問題は回避されるが、多くの場合、複数の合成と精製のステップはこのアプローチを面倒かつ収量が制限されたものにする。さらに、選択される結合化学は、ペプチドの反応性側鎖との副反応を防ぐために、もっぱら直交している必要がある。
【0004】
ペプチドリガーゼは、マッチング配列又は化学モチーフを含む２つのペプチド末端の結合を触媒する。それらは、タンパク質工学に広く応用されている（非特許文献２０）。それは、大環状化（非特許文献２１～２４）やペプチドの部位特異的標識（非特許文献２５～２９）から、分子間ペプチド及びタンパク質ライゲーション（非特許文献３０～３２）まで多岐にわたる。
【0005】
高い位置選択性を示す酵素の使用により、クリーンな反応が確実に行われると同時に、ほとんどのフォールディングされたペプチド及びタンパク質と適合する穏やかな水性条件下でライゲーションを進行させることができる。したがって、このような酵素的アプローチをＰＯＣの合成後の生成に適応させることは、非常に望ましいことである。しかし、このアプローチを利用したＰＯＣ作成の報告はほとんどなく（非特許文献３３、３４）、多様なＰＯＣを作成するための合理化された方法の必要性が残っている。
【0006】
本発明は、ＰＯＣの調製を大幅に簡素化する、ペプチド及びオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションに対するホスホロアミダイトタグに基づくアプローチを提供するという点で、既存のニーズを満たす。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｔｕｎｇ＆Ｓｔｅｉｎ Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０００，１１（５），６０５－１８
【非特許文献2】ＭａｃＣｕｌｌｏｃｈ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１９，１７（７），１６６８－１６８２
【非特許文献3】Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ＆Ｋｉｍ Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００６，１０６（９），３７１２－６１
【非特許文献4】Ｌｕ ｅｔ．ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０１０，２１（２），１８７－２０２
【非特許文献5】Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９８７，２８，５１９９－５２０２
【非特許文献6】Ｂｅｒｇｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９５，３６，１８３９－１８４２
【非特許文献7】Ｓｏｕｋｃｈａｒｅｕｎ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ １９９５，６（１），４３－５３
【非特許文献8】Ｔｒｕｆｆｅｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，２３５３－２３５６
【非特許文献9】ｄｅ ｌａ Ｔｏｒｒｅ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ．１９９４，３５，２７３３－２７３６
【非特許文献10】Ｚａｒａｍｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６（４３），１４０２９－３５
【非特許文献11】Ｏｃａｍｐｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ ２００５，７（２０），４３４９－５２
【非特許文献12】Ｓｔｅｔｓｅｎｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ ２００２，４（１９），３２５９－６２
【非特許文献13】Ａｎｔｏｐｏｌｓｋｙ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ ２００２，４３（３），５２７－５３０
【非特許文献14】Ｅｒｉｔｊａ ｅｔ ａｌ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ １９９１，４７，４１１３－４１２０
【非特許文献15】Ｃｏｒｅｙ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２００４，２８３，１９７－２０６
【非特許文献16】Ａｓｔａｋｈｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｂｉｏｍｏｌ Ｃｈｅｍ ２０１３，１１（２５），４２４０－９
【非特許文献17】Ｓａｎｃｈｅｚ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ Ｃｈｅｍ．２０１２，２３（２），３００－７
【非特許文献18】Ｔａｓｋｏｖａ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０１７，２８（３），７６８－７７４
【非特許文献19】Ｂｏｎｇａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９９４，２２（２２），４６８１－８
【非特許文献20】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１７，３８，１－７
【非特許文献21】Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１９，９（１），１０８２０
【非特許文献22】Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，１０（９），７３２－８
【非特許文献23】Ｗｕ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ）２０１１，４７（３２），９２１８－２０
【非特許文献24】Ｓｃｈｍｉｄｔ ｅｔ ａｌ．ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ ２０１９，２０（１２），１５２４－１５２９
【非特許文献25】Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１５，５４（４６），１３７８７－９１
【非特許文献26】Ｒｅｈｍ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１９，１４１（４３），１７３８８－１７３９３
【非特許文献27】Ａｎｔｏｓ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１（３１），１０８００－１０８０１
【非特許文献28】Ｗｅｅｋｓ＆Ｗｅｌｌｓ Ｎａｔ Ｃｈｅｍ Ｂｉｏｌ ２０１８，１４（１），５０－５７
【非特許文献29】Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．２０１６，６，３１８９９
【非特許文献30】Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１５，５４（５２），１５６９４－８
【非特許文献31】Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．Ｏｒｇ Ｌｅｔｔ２０１８，２０（２１），６６９１－６６９４
【非特許文献32】Ｈｅｎａｇｅｒ Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１６，１３（１１），９２５－９２７
【非特許文献33】Ｋｏｕｓｓａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４，６７（２），１３４－４１
【非特許文献34】Ｈａｒｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０１８，２９（１０），３２４５－３２４９
【発明の概要】
【0008】
第１の態様では、本発明は、（ポリ）ペプチドとカーゴ分子との酵素的ライゲーションのための方法を対象とし、この方法は：
（ｉ）ペプチドタグで修飾された少なくとも１つのカーゴ分子、及び前記カーゴ分子にライゲーションされる少なくとも１つのポリ（ペプチド）を提供する工程であって、前記ペプチドタグ及び／又は前記（ポリ）ペプチドはペプチドリガーゼのライゲーションモチーフを含む、前記提供する工程；及び
（ｉｉ）前記カーゴ分子及び前記ポリ（ペプチド）を、前記ペプチドタグと前記（ポリ）ペプチドとを前記ライゲーションモチーフを介してライゲーションするペプチドリガーゼと接触させる工程
を含む。
（ｉ）ペプチドタグで修飾された少なくとも１つのカーゴ分子、及び前記カーゴ分子にライゲーションされる少なくとも１つのポリ（ペプチド）を提供する工程であって、前記ペプチドタグ及び／又は前記（ポリ）ペプチドはペプチドリガーゼのライゲーションモチーフを含む、前記提供する工程；及び
（ｉｉ）前記カーゴ分子及び前記ポリ（ペプチド）を、前記ペプチドタグと前記（ポリ）ペプチドとを前記ライゲーションモチーフを介してライゲーションするペプチドリガーゼと接触させる工程
を含む。
【0009】
様々な実施形態において、前記カーゴ分子は、１つ以上のペプチドタグを含む。前記ペプチドタグは、最大１０アミノ酸の長さ、好ましくは２～７アミノ酸の長さであり得る。前記ペプチドタグは、足場部分を介して前記カーゴ分子に結合され得る。
【0010】
様々な実施形態において、ペプチドリガーゼの前記ライゲーションモチーフは、ライゲーションされる前記（ポリ）ペプチドのＣ末端に位置する。
様々な実施形態において、前記ペプチドリガーゼは、ソルターゼ及びペプチジルアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）から選択される。適切なＰＡＬには、ブテラーゼ－１、ＶｙＰＡＬ２及びＯａＡＥＰ１ｂが含まれるが、これらに限定されない。
様々な実施形態において、前記ペプチドリガーゼは、ソルターゼ及びペプチジルアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）から選択される。適切なＰＡＬには、ブテラーゼ－１、ＶｙＰＡＬ２及びＯａＡＥＰ１ｂが含まれるが、これらに限定されない。
【0011】
前記カーゴ分子は、色素、薬物、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択され得る。
様々な実施形態において、前記カーゴ分子はオリゴヌクレオチドである。そのような実施形態では、前記ペプチドタグは、５’末端、３’末端に結合することができ、又は前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド鎖に組み込まれることができ、あるいは複数のペプチドタグが使用される場合には、それらの任意の組み合わせである。前記ペプチドタグは、前記オリゴヌクレオチドの骨格、糖部分又は塩基部分に結合され得、又は複数のペプチドタグが使用される場合にはそれらの任意の組み合わせである。
様々な実施形態において、前記カーゴ分子はオリゴヌクレオチドである。そのような実施形態では、前記ペプチドタグは、５’末端、３’末端に結合することができ、又は前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド鎖に組み込まれることができ、あるいは複数のペプチドタグが使用される場合には、それらの任意の組み合わせである。前記ペプチドタグは、前記オリゴヌクレオチドの骨格、糖部分又は塩基部分に結合され得、又は複数のペプチドタグが使用される場合にはそれらの任意の組み合わせである。
【0012】
様々な実施形態において、前記オリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾塩基、少なくとも１つの修飾糖、少なくとも１つのホスホロチオアート結合、少なくとも１つのホスホロジアミダートモルホリノユニット、少なくとも１つのロック核酸（ｌｏｃｋｅｄ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ）モノマー、又はそれらの組み合わせを含むオリゴヌクレオチドアナログである。
【0013】
様々な実施形態において、ペプチドタグで修飾された前記オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、好ましくはホスホロアミダイト基又はホスホロアミダート基に結合することができる反応性基を含む足場に結合した前記ペプチドタグを、前記反応性基と前記オリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする条件下で前記オリゴヌクレオチドと反応させることで、ペプチドタグで修飾された前記オリゴヌクレオチドを生成することによって得られる。前記足場は、アミノ酸アナログ、好ましくは４－ヒドロキシプロリノール、セリノール、スレオニノール、Ｎ－メチル－セリノール、又はＮ－メチルスレオニノールであってもよく、それぞれホスホロアミダイト基又はホスホロアミダート基を含む。
【0014】
様々な実施形態において、前記ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0015】
【表1】
【0016】
このような実施形態では、Ｒは以下から選択され得る。
【0017】
【表2】
【0018】
他の様々な実施形態において、前記ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0019】
【表3】
【0020】
さらに他の実施形態では、前記ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0021】
【表4】
【0022】
さらに他の実施形態では、前記ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は前記オリゴヌクレオチドの任意の位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る。
【0023】
【表5】
【0024】
さらに他の実施形態では、前記ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は前記オリゴヌクレオチドの末端の位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る。
【0025】
【表6】
【0026】
上記の構造では、前記リンカーは保護基としてのＤＭＴ（ジメトキシトリチル）と共に示されており、これは、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）、Ｔｒｔ（トリチル）、及び２－Ｃｌ－Ｔｒｔ（２－クロロ－トリチル）を含むがこれらに限定されない他の適切な保護基と交換することができる。これらの構造において、Ｘは、固相オリゴヌクレオチド合成（ＳＰＯＳ）でヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ、例えば、モルホリノ）鎖に効果的に結合できる任意の適合性基（例えば、ホスホロアミダイト及びホスホロアミダート基）、あるいは、固体支持体（例えば、ＳＰＯＳの固体支持体－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－）を表す。Ｙは、以下に示すものを含むがこれらに限定されない、任意のタグモチーフを表す。
【0027】
上記の構造において
ｍは０～８
ｎは０～８
Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の任意の保護基（例えば、ｄｍｆ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、Ｂｚ（ベンジル）、Ａｃ（アセチル））；
Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の任意の保護基（例えば、Ｂｚ、Ｐａｃ（フェノキシアセチル））；
Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の任意の保護基（例えば、ｉＢｕ（イソブチリル）、ｄｍｆ、ｉＰｒ－Ｐａｃ（イソプロピルフェノキシアセチル））；
Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適したペントース糖の２’－Ｏ上の任意の保護基（例えば、ＴＯＭ（２－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＴＢＤＭＳ（２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）、Ａｃ）；
Ｐ５は、ＵＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した任意の保護基（例えばＢｚ）である。
ｍは０～８
ｎは０～８
Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の任意の保護基（例えば、ｄｍｆ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、Ｂｚ（ベンジル）、Ａｃ（アセチル））；
Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の任意の保護基（例えば、Ｂｚ、Ｐａｃ（フェノキシアセチル））；
Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の任意の保護基（例えば、ｉＢｕ（イソブチリル）、ｄｍｆ、ｉＰｒ－Ｐａｃ（イソプロピルフェノキシアセチル））；
Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適したペントース糖の２’－Ｏ上の任意の保護基（例えば、ＴＯＭ（２－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＴＢＤＭＳ（２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）、Ａｃ）；
Ｐ５は、ＵＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した任意の保護基（例えばＢｚ）である。
【0028】
これらの構造では、ＹはＣ末端を介して結合されたペプチドタグであり、以下から選択され得る。
【0029】
【表7】
【0030】
【表8】
【0031】
様々な実施形態において、前記ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0032】
【表9】
【0033】
そのような実施形態では、Ｒは以下から選択され得る。
【0034】
【表10】
【0035】
他の様々な実施形態において、前記ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0036】
【表11】
【0037】
さらに他の実施形態において、前記ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は以下からなる群から選択され得る。
【0038】
【表12】
【0039】
さらに他の実施形態において、前記ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は前記オリゴヌクレオチドの任意の位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る。
【0040】
【表13】
【0041】
さらに他の実施形態では、前記ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して前記足場に結合される場合、前記足場は前記オリゴヌクレオチドの末端位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る。
【0042】
【表14】
【0043】
上記の構造では、前記リンカーは保護基としてのＤＭＴ（ジメトキシトリチル）と共に示されており、これは、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）、Ｔｒｔ（トリチル）、及び２－Ｃｌ－Ｔｒｔ（２－クロロ－トリチル）を含むがこれらに限定されない他の適切な保護基と交換することができる。これらの構造において、Ｘは、固相オリゴヌクレオチド合成（ＳＰＯＳ）でヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ、例えば、モルホリノ）鎖に効果的に結合できる任意の適合性基（例えば、ホスホロアミダイト及びホスホロアミダート）、あるいは、固体支持体（例えば、ＳＰＯＳの固体支持体－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－）を表す。Ｙは、以下に示すものを含むがこれらに限定されない、任意のタグモチーフを表す。
【0044】
上記の構造において
ｍは０～８
ｎは０～８
Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の任意の保護基（例えば、ｄｍｆ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、Ｂｚ（ベンジル）、Ａｃ（アセチル））；
Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の任意の保護基（例えば、Ｂｚ、Ｐａｃ（フェノキシアセチル））；
Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の任意の保護基（例えば、ｉＢｕ（イソブチリル）、ｄｍｆ、ｉＰｒ－Ｐａｃ（イソプロピルフェノキシアセチル））；
Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適したペントース糖の２’－Ｏ上の任意の保護基（例えば、ＴＯＭ（２－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＴＢＤＭＳ（２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）、Ａｃ）；
Ｐ５は、ＵＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した任意の保護基（例えばＢｚ）である。
ｍは０～８
ｎは０～８
Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の任意の保護基（例えば、ｄｍｆ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、Ｂｚ（ベンジル）、Ａｃ（アセチル））；
Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の任意の保護基（例えば、Ｂｚ、Ｐａｃ（フェノキシアセチル））；
Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の任意の保護基（例えば、ｉＢｕ（イソブチリル）、ｄｍｆ、ｉＰｒ－Ｐａｃ（イソプロピルフェノキシアセチル））；
Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適したペントース糖の２’－Ｏ上の任意の保護基（例えば、ＴＯＭ（２－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＴＢＤＭＳ（２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）、Ａｃ）；
Ｐ５は、ＵＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した任意の保護基（例えばＢｚ）である。
【0045】
これらの構造において、ＺはそのＮ末端を介して連結されたペプチドタグであり、以下から選択され得る。
【0046】
【表15】
【0047】
【表16】
【0048】
これらの構造において、ＲはＮＨ２（アミド化されたＣ末端）又はＯ－Ｐ６であり、Ｐ６は、ＳＰＯＳでの使用に適した任意の適切なカルボン酸保護基、例えば、ＯＭｅ（メトキシ）、ＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ－ブトキシ）、及びＯＴｒｔ（トリチルオキシ）である。
【0049】
本明細書に記載の方法の様々な実施形態では、前記カーゴ分子とペプチドリガーゼを有する前記ポリ（ペプチド）とのライゲーションは、ペプチドリガーゼに対する少なくとも２つのライゲーションモチーフ（同じであっても異なっていてもよい）を含む二機能性アダプターを介する。様々な実施形態において、これらの少なくとも２つの結合部位及びライゲーション部位は異なり、異なるリガーゼによって結合される。二機能性アダプターは、それらの側鎖及び／又はＮ末端を介して連結された遊離Ｃ末端を有する２つのペプチドを含み得る。適切なアダプターは、以下のスキームＳ５の化合物（４）である。
【0050】
別の態様では、本発明は、本発明の方法のいずれか１つに従って得られるコンジュゲートにも関する。
【図面の簡単な説明】
【0051】
【図1】単一又は複数のペプチドとオリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションに対するホスホロアミダイトタグベースのアプローチの概略図。（ａ）固相オリゴヌクレオチド合成によるホスホロアミダイトタグのオリゴヌクレオチド鎖（灰色のリボン）へのカップリング、それに続く、同族ライゲーションハンドルを含むペプチド対応物（薄い灰色のリボン）のタグ標識オリゴヌクレオチドとの酵素的ライゲーションにより所望のペプチド－オリゴヌクレオチドコンジュゲートが生成される。（ｂ）２つの異なるホスホロアミダイトタグ（１及び２）をオリゴヌクレオチド上にモジュラーカップリングすると、その後の同族リガーゼによるマッチングライゲーションハンドルを含む２つのペプチドのライゲーションの位置制御が可能になる。
【図2】ａ）タグ標識オリゴヌクレオチドと同族ライゲーションハンドルを含むタンパク質との間のリガーゼ補助ライゲーションの概略図。ｂ）ＯＤＮ１とＣＦＰＳＯＲＴのソルターゼ補助ライゲーションのための粗製ライゲーション混合物のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動。ＣＦＰＳＯＲＴをＯＤＮ１とライゲーションすることで、同族酵素ソルターゼの存在下でＰＯＣを生成した。
【図3】ホスホロアミダイトタグ１及び２は両方とも、末端又は内部の位置に組み込まれることができる。複数のホスホロアミダイトタグ又はホスホロアミダイトタグの混合物の組み込みも可能である。
【図4】（ａ）ソルターゼ又は（ｂ）ＯａＡＥＰ１を使用した、ペプチドのＮ末端へのタグの組み込み及びカーゴ分子とのライゲーション反応の簡略図。カーゴ分子は、色素、薬物、オリゴヌクレオチド、アプタマー、ペプチド、タンパク質、又は抗体であり得る。
【図5】二機能性アダプターの概略図。アダプターは、Ｎ末端結合タンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートなどの困難なキメラ生体分子へのアクセスを可能にする。
【発明を実施するための形態】
【0052】
詳細な説明
本発明は、ペプチドタグの付いたホスホロアミダイトユニットがオリゴヌクレオチドに容易に組み込まれ、したがって選択した（ポリ）ペプチドへのライゲーションを可能にする機能的部分（ペプチドタグ）を与えることができるという本発明者らの発見に基づいている。この原理は、このようなライゲーションモチーフ又はライゲーションハンドルとして機能する短いペプチドをタグ付けできる他の非ペプチドカーゴ分子にも使用できる。
本発明は、ペプチドタグの付いたホスホロアミダイトユニットがオリゴヌクレオチドに容易に組み込まれ、したがって選択した（ポリ）ペプチドへのライゲーションを可能にする機能的部分（ペプチドタグ）を与えることができるという本発明者らの発見に基づいている。この原理は、このようなライゲーションモチーフ又はライゲーションハンドルとして機能する短いペプチドをタグ付けできる他の非ペプチドカーゴ分子にも使用できる。
【0053】
本明細書で使用される「ライゲーションモチーフ」という用語は、リガーゼによって認識され切断されるペプチド配列、例えば、ＮＧＬ、ＮＡＬ、ＮＳＬ又はＮＨＬを含む、ＰＡＬ用のＮ／Ｄ含有ペプチドモチーフ、あるいはソルターゼ用のＬＰＸＴＧ含有モチーフに関する。Ｎ／Ｄ含有モチーフはＰＡＬによって切断されることにより、Ｃ末端からＮ／Ｄまでのすべてのアミノ酸が切断され、次いでＮ／Ｄ残基のＣ末端が別の（ポリ）ペプチドのＮ末端にライゲーションされる。ＬＰＸＴＧモチーフは、Ｃ末端からＴ残基まで切断され、次いでＣ末端にＧ残基を有する（ポリ）ペプチドのＮ末端にライゲーションされる。したがって、ソルターゼやＰＡＬなどのリガーゼに関して本明細書で使用される「ライゲーションモチーフ」という用語は、典型的には、ライゲーション反応においてそのＣ末端が別の（ポリ）ペプチドのＮ末端にライゲーションされるペプチド配列に関する。
【0054】
「ライゲーションハンドル」という用語は、切断されたライゲーションモチーフのＣ末端に連結される所与の（ポリ）ペプチドのＮ末端上のペプチド配列に関する。したがって、ソルターゼやＰＡＬなどのリガーゼに関して本明細書で使用される「ライゲーションハンドル」という用語は、典型的には、そのＮ末端によって別の（ポリ）ペプチドのＣ末端にライゲーションされる遊離Ｎ末端を有するペプチド配列に関する。
【0055】
本明細書で使用される「（ポリ）ペプチド」という用語は、ペプチド及びポリペプチドを指す。本明細書で使用される「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から作られたポリマーに関する。本明細書で定義されるポリペプチドは、５０個を超えるアミノ酸、好ましくは１００個以上のアミノ酸を含むことができる。本明細書で使用される「ペプチド」は、ペプチド結合によって結合されたアミノ酸から作られたポリマーに関する。本明細書で定義されるペプチドは、２個以上のアミノ酸、好ましくは５個以上のアミノ酸、より好ましくは１０個以上のアミノ酸、例えば１０～５０個のアミノ酸を含むことができる。様々な実施形態において、「ペプチド」という用語は、最大５０個のアミノ酸を有するペプチドに関し、「ポリペプチド」という用語は、５０個を超えるアミノ酸を有するペプチドに関する。
【0056】
本明細書に記載の方法により、（ポリ）ペプチドとカーゴ分子との酵素的ライゲーションが可能になる。カーゴ分子は、任意の非ペプチド部分であってもよく、色素、様々な薬学的に活性な有機化合物、特に小分子、アプタマー、及びオリゴヌクレオチドを含む。この方法は、本明細書ではカーゴ分子としてのオリゴヌクレオチドの使用を参照して記載されているが、それらの用途に限定されず、他のカーゴ分子タイプのライゲーションにも容易に使用できることが理解される。
【0057】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチド及びそのアナログのオリゴマー及びポリマーを指す。したがって、様々な実施形態において、「オリゴヌクレオチド」という用語は、「ポリヌクレオチド」及びその任意のアナログ又はバリアント、特に本明細書に記載されたものも包含する。このようなオリゴヌクレオチドは、３個以上のヌクレオチド、典型的には１０～１００個のヌクレオチドを含み得る。ただし、長さは使用目的によって異なる。ヌクレオチドを識別タグとして使用する場合、通常は最大１００ヌクレオチドの長さで十分である。長さは、通常、１０～１０００ヌクレオチド、好ましくは１０～５００又は１０～１００ヌクレオチドの範囲であり得る。様々な実施形態において、長さは、１０～５０、１０～３０、又は１０～２５、又は１２～２０ヌクレオチドである。実施例では、長さ１０～１８ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドが使用される。オリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はそれらの任意のバリアントであり得る。ＤＮＡ及びＲＮＡは両方ともヌクレオチドのバリアント及びアナログを含み得る。ＲＮＡヌクレオチド及びＤＮＡヌクレオチドの両方を含むオリゴヌクレオチドを有することも可能である。ヌクレオチドバリアント／アナログは、修飾塩基、修飾糖、ホスホロチオアート結合、ホスホロジアミダートモルホリノユニット、ロック核酸モノマー、又はそれらの任意の組み合わせを有し得る。具体的な例は、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｕ、Ｃなどのすべての一般的なヌクレオチドに利用できるロック核酸モノマーである。さらに修飾ヌクレオチド（糖修飾）には、２’－Ｏ－メチル修飾又は２’－Ｏ－メトキシエチル修飾ヌクレオチド、拘束エチル（ｃＥｔ）ヌクレオチド、トリシクロＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）ヌクレオチド、２’－フルオロ修飾を有するヌクレオチド、及び修飾塩基／糖を有するヌクレオチド、例えば、限定するものではないが、２－アミノプリン、５－ブロモｄＵ、２’－デオキシウリジン、２，６－ジアミノプリン、ジデオキシシチジン、２’－デオキシイノシン、ヒドロキシメチルｄＣ、逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ｄＴ、ｉｓｏ－ｄＧ、ｉｓｏ－ｄＣ、逆（ｉｎｖｅｒｔｅｄ）ジデオキシＴ、５－メチルｄＣ、５－ニトロインドール、５－ヒドロキシブチル－２’－デオキシウリジン、８－アザ－７－デアザグアノシン、又は８－アザ－７－デアザ－アデノシンなどが含まれる。
【0058】
本発明の方法は、（ｉ）ペプチドタグで修飾された少なくとも１つのカーゴ分子、及び前記カーゴ分子にライゲーションされる少なくとも１つのポリ（ペプチド）を提供する工程を含み、前記ペプチドタグ及び／又は前記（ポリ）ペプチドは、ペプチドリガーゼのライゲーションモチーフを含む。
【0059】
前記ペプチドタグは、上記で定義したようなライゲーションモチーフ又はライゲーションハンドルを含むか、あるいはそれらからなるものであってもよい。ライゲーションを容易にするためにペプチドタグをできるだけ短く保つことは、その合成の労力を節約し、ライゲーションされた（ポリ）ペプチド－カーゴ分子／オリゴヌクレオチドコンジュゲートに存在し得る不必要な追加配列も防ぐため、有利であり得る。したがって、ペプチドタグは、様々な実施形態において、２０アミノ酸まで、好ましくは１８アミノ酸まで、１６アミノ酸まで、１４アミノ酸まで、１２アミノ酸まで、又は１０アミノ酸までの長さであり得る。いくつかの実施形態では、それは２～７アミノ酸の長さである。ペプチドタグがライゲーションハンドルである場合、それは通常さらに短く、わずか２～４個、例えば２又は３個のアミノ酸を含む。それがライゲーションモチーフの場合、それはもう少し長く、通常、ＰＡＬの場合は３アミノ酸、ソルターゼの場合は５アミノ酸である。したがって、ライゲーションモチーフペプチドタグの長さは、典型的には３～７アミノ酸又は３～５アミノ酸である。
【0060】
ライゲーションされる（ポリ）ペプチドは、典型的には、特定の、例えば生物学的機能を有するペプチド又はポリペプチドであり、したがって、様々な実施形態において、少なくとも１０、少なくとも１５、又は少なくとも２０アミノ酸の長さを有する。通常、その長さは、１０００アミノ酸など、数千アミノ酸までとすることができるが、様々な実施形態では、約１５～５００アミノ酸の長さを有する。
【0061】
（ポリ）ペプチドは、任意の種類のペプチド又はポリペプチドであってよく、ペプチドホルモン、酵素、細胞傷害性ペプチド、抗体、抗体様ポリペプチド（抗体模倣物）及び抗体フラグメント、マーカータンパク質、例えば蛍光タンパク質、ペプチドアプタマー、及びその他の治療用タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。具体的な例としては、グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ－１）及びＲＧＤ含有ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。
【0062】
本明細書に記載の方法において、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドはさらに有機部分に結合されてもよい。この目的のために、（ポリ）ペプチドは、典型的にはライゲーションされる末端ではないところに反応性基を含み得る。アミノ酸の側鎖であってもよい前記反応性基は、次いで、本方法のさらなる工程において対象の有機部分に結合され得る。有機部分は、任意の分子又は基であってもよく、薬学的に活性な薬剤及び蛍光マーカーやビオチンなどの検出可能なマーカーを含む。様々な実施形態において、活性薬剤は、ドキソルビシンなどのアントラサイクリンを含むがこれに限定されない、がん治療薬などの小有機分子医薬品であり得る。
【0063】
本明細書に開示される方法及び使用に従ってライゲーション又は環化される（ポリ）ペプチドは、Ａｓｘ含有タグがライゲーション又は融合しようとする対象の（ポリ）ペプチドにＣ末端で融合されている融合ペプチド又はポリペプチドであり得る。Ａｓｘ含有タグは、好ましくは、本明細書で定義されるアスパラギニルリガーゼの結合及びライゲーション部位のアミノ酸配列を有する。通常、シグナル伝達部分又は検出可能部分も担持するカーゴ分子のペプチドタグなどのペプチドタグにライゲーションされ得るポリペプチド及びタンパク質には、限定されないが、上記のものが含まれる。
【0064】
様々な実施形態において、リガーゼ活性は、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）などのフルオレセイン、又は７－アミノ－４－メチルクマリンなどのクマリンを含む蛍光基などの検出可能な部分を有するペプチドを、ポリペプチド又はタンパク質、例えば上記のものに融合するために使用される。様々な実施形態において、タンパク質は、抗体フラグメント又は抗体模倣物であり得る。
【0065】
本発明の方法及び使用において有用な検出可能なマーカーには、フルオレセインもしくはその誘導体、及び／又は元素Ｉ－１２５もしくはＩ－１３１で容易に放射性標識できるペプチドが含まれる。これにより、臓器切片又は生検で、ＰＥＴ又はＳＰＥＣＴとそれに続く蛍光検出を使用した生体内腫瘍の単一試薬の画像化を使用することが可能になる。
【0066】
ライゲーションモチーフが、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドに含まれる場合、オリゴヌクレオチド上のペプチドタグにより、それへのライゲーションが可能になり、またその逆も同様である。様々な実施形態において、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドは、切断部位に対するＣ末端の部分が切断されるため、典型的にはＣ末端又はＣ末端の近くにライゲーションモチーフを含む。そのような実施形態では、オリゴヌクレオチド上のペプチドタグは、対応するライゲーションハンドルを含むか、又はそれからなる。このような実施形態では、オリゴヌクレオチド上のペプチドタグは、（ポリ）ペプチドのＣ末端へのライゲーションに使用されるため、遊離かつアクセス可能なＮ末端を有し得る。これは、ペプチドタグがそのＣ末端を介してオリゴヌクレオチドに結合することを意味し得る。あるいは、ライゲーションモチーフはペプチドタグに含まれ得る。このような実施形態では、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドは、切断されたライゲーションモチーフのＣ末端へのライゲーションを可能にする末端、典型的にはＮ末端を有する。これは、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドがそのＮ末端にライゲーションハンドルを含むことを意味し得る。前記ライゲーションハンドルは、その天然配列の一部であり得る。そのような実施形態では、ペプチドタグは典型的には、そのＮ末端を介してオリゴヌクレオチドに結合されることで、遊離かつアクセス可能なＣ末端を提供する。
【0067】
ペプチドタグのオリゴヌクレオチドへの結合は、ペプチドタグ上に提供され、オリゴヌクレオチドへの、そのオリゴヌクレオチドのいずれかの末端、すなわち、その３’末端又は５’末端、又は内部での組み込みを、例えば、新生オリゴヌクレオチドへの組み込みによって可能にする足場によって促進され得る。通常、ペプチドタグはオリゴヌクレオチドの５’末端、３’末端、又は内部に位置し得る。
【0068】
いくつかの実施形態では、単一のオリゴヌクレオチドは複数のペプチドタグを含み得、これらは両端、片端及び内部、又はすべて内部に位置し得る。
オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかへの容易な組み込みを促進する、本明細書で使用される非常に適切な足場の１つは、ホスホロアミダイト基含有足場である。足場は、ヒドロキシ基を介してホスホロアミダイト基に結合した、スレオニノール、セリノール、４－ヒドロキシプロリノール、Ｎ－メチルセリノール、及びＮ－メチルスレオニノールなどの還元アミノ酸であり得る。好ましくは、２つのヒドロキシル基を含み、一方は好ましくは第一級ヒドロキシル基（典型的には還元されたカルボキシル基）であり、他方は第二級ヒドロキシル基であるアミノ酸バリアントである。これら２種類のヒドロキシル基により、特に第一級ヒドロキシル基を優先するＤＭＴ（４，４’－ジメトキシトリチル）基を使用して第一級ヒドロキシル基を選択的に保護できる。
オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかへの容易な組み込みを促進する、本明細書で使用される非常に適切な足場の１つは、ホスホロアミダイト基含有足場である。足場は、ヒドロキシ基を介してホスホロアミダイト基に結合した、スレオニノール、セリノール、４－ヒドロキシプロリノール、Ｎ－メチルセリノール、及びＮ－メチルスレオニノールなどの還元アミノ酸であり得る。好ましくは、２つのヒドロキシル基を含み、一方は好ましくは第一級ヒドロキシル基（典型的には還元されたカルボキシル基）であり、他方は第二級ヒドロキシル基であるアミノ酸バリアントである。これら２種類のヒドロキシル基により、特に第一級ヒドロキシル基を優先するＤＭＴ（４，４’－ジメトキシトリチル）基を使用して第一級ヒドロキシル基を選択的に保護できる。
【0069】
通常、本発明の方法で使用される好ましいホスホロアミダイト基は、式：
【0070】
【化1】
【0071】
を有する。
塩基に不安定であり、ホスファイト基を保護する２－エチルシアノエチル基は、他の任意の適切な保護基で置換され得ることが理解される。同様に、イソプロピル基は他の適切なアルキル基で置換され得る。
塩基に不安定であり、ホスファイト基を保護する２－エチルシアノエチル基は、他の任意の適切な保護基で置換され得ることが理解される。同様に、イソプロピル基は他の適切なアルキル基で置換され得る。
【0072】
このようなホスホロアミダイトの可能な代替物には、式：
【0073】
【化2】
【0074】
を有するホスホロアミダートが含まれる。
どちらの式でも、波線は足場又はペプチドタグの残りの部分への結合点を示す。上記の基の両方は、例えばヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基によって足場又はペプチドタグの残りの部分に結合され得る。結合が足場の残りの部分に対するものである場合、足場はさらに、ペプチドタグのＣ末端又はＮ末端と反応してペプチド結合を形成するアミノ基又はカルボキシル基を含み得る。
どちらの式でも、波線は足場又はペプチドタグの残りの部分への結合点を示す。上記の基の両方は、例えばヒドロキシル基に由来する－Ｏ－基によって足場又はペプチドタグの残りの部分に結合され得る。結合が足場の残りの部分に対するものである場合、足場はさらに、ペプチドタグのＣ末端又はＮ末端と反応してペプチド結合を形成するアミノ基又はカルボキシル基を含み得る。
【0075】
適切なホスホロアミダイト基含有足場には、限定するものではないが、
【0076】
【化3】
【0077】
が含まれ、ここでＤＭＴは保護基であり、波線はペプチドタグのＣ末端への結合を示し、配列ＧＧＧ、ＡＡＡ、ＧＬ、ＧＧ、ＲＬ、ＡＬ、ＰＬ、ＨＶを有し得る。これらの実施形態では、前述のペプチドタグのすべてがそのＣ末端を介してオリゴヌクレオチドに連結され、従って遊離Ｎ末端を有するため、ペプチドタグはライゲーションハンドルであることが好ましい。ＧＧＧ及びＡＡＡはソルターゼの好ましいライゲーションハンドルであり、一方、ＧＬ、ＲＬ、ＰＬ、ＨＶ、及びＧＧはＰＡＬの好ましいライゲーションハンドルである。
【0078】
適切な足場のより具体的な例は実施例に記載されており、以下に開示される例示的な化合物をさらに含む。
様々な実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は以下からなる群から選択され得る：
様々な実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は以下からなる群から選択され得る：
【0079】
【表17】
【0080】
これらの実施形態において、Ｙは、そのＣ末端又は側鎖カルボキシル基を介して前記核酸塩基に連結されるペプチドタグを表し、また、上記のものなどの１つのリンカーアミノ酸アナログを含み得る。これらの式において、Ｒはヌクレオチドの糖－リン酸部分、好ましくは糖－ホスホロアミダイト又は－ホスホロアミダート部分を表す。そのような実施形態では、Ｒは以下から選択され得る
【0081】
【表18】
【0082】
これらの実施形態において、Ｘは、好ましくは、ホスホロアミダイト又はホスホロアミダート基であり、好ましくは上に示した構造のものである。通常、Ｘは、任意選択で固相オリゴヌクレオチド合成（ＳＰＯＳ）を介して、あるいは固体支持体（例えば、ＳＰＯＳの固体支持体－Ｃ（＝Ｏ）－（ＣＨ２）２－Ｃ（＝Ｏ）－）を介して、オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチドアナログ、例えばモルホリノ）鎖の末端に効果的に結合できるか、又は新生鎖に組み込むことができる、任意の適合性基を表す。
【0083】
前述の化合物では、ペプチドタグは核酸塩基を介してヌクレオチド構成ブロックに結合される。しかし、次の構造に例示されるように、同様に糖に結合されることもある。
他の様々な実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は、以下からなる群から選択され得る：
他の様々な実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は、以下からなる群から選択され得る：
【0084】
【表19】
【0085】
これらの式において、Ｘは上記と同じ意味を有する。
さらに他の実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、結合は骨格を介したものであってもよく、足場は以下からなる群から選択され得る：
さらに他の実施形態において、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、結合は骨格を介したものであってもよく、足場は以下からなる群から選択され得る：
【0086】
【表20】
【0087】
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は、塩基、糖及び骨格部分を含むヌクレオチドアナログではなく、むしろ化学的に異なる部分である。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの任意の位置を標識するのに適しており、すなわち、末端に結合されるか、又は新生オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれることができ、以下からなる群から選択され得る：
【0088】
【表21】
【0089】
これらの式において、Ｘは上記と同じ意味を有する。
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は、塩基、糖及び骨格部分を含むヌクレオチドアナログではなく、むしろ、ホスホロアミダイトリンカー部分などの化学的に異なる部分である。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの末端の標識に適しており、以下からなる群から選択され得る：
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがカルボニル基、例えばそのＣ末端を介して足場に結合される場合、足場は、塩基、糖及び骨格部分を含むヌクレオチドアナログではなく、むしろ、ホスホロアミダイトリンカー部分などの化学的に異なる部分である。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの末端の標識に適しており、以下からなる群から選択され得る：
【0090】
【表22】
【0091】
上記の構造において、ＹはそのＣ末端又は側鎖のカルボン酸／カルボキシラート基を介して結合されたペプチドタグであり、以下から選択され得る（波線は構造の残りの部分への結合を示す）：
【0092】
【表23】
【0093】
これらは、Ｙがライゲーションハンドルを表す、すなわち、そのＮ末端を介してライゲーションされたライゲーションのＣ末端部分である実施形態である。
様々な代替実施形態において、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場は、アミノ基への結合を可能にするように設計され得る。そのような場合、結合に適した核酸塩基構造は以下からなる群から選択され得る：
様々な代替実施形態において、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場は、アミノ基への結合を可能にするように設計され得る。そのような場合、結合に適した核酸塩基構造は以下からなる群から選択され得る：
【0094】
【表24】
【0095】
これらすべての構造において、Ｚは、そのＮ末端又は側鎖アミノ基を介して前記核酸塩基に連結されるペプチドタグを表し、また、上記のものなどの１つのリンカーアミノ酸アナログを含み得る。これらの式において、Ｒはヌクレオチドの糖－リン酸部分、好ましくは糖－ホスホロアミダイト又は－ホスホロアミダート部分を表す。そのような実施形態において、Ｒは、上で既に開示されたものから選択され得る。
【0096】
他の様々な実施形態において、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、それは糖部分に結合され得る。そのような様々な実施形態では、足場は以下からなる群から選択され得る：
【0097】
【表25】
【0098】
Ｚは、上で定義したような意味を有する。「塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルなどの任意の核酸塩基を示す。Ｘは上記と同じ意味を有する。
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に、具体的にはホスホロアミダイトに結合されている場合、足場は以下からなる群から選択され得る：
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に、具体的にはホスホロアミダイトに結合されている場合、足場は以下からなる群から選択され得る：
【0099】
【表26】
【0100】
「塩基」及びＺは、上記の意味を有する。
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場は、塩基、糖及び骨格部分を含むヌクレオチドアナログではなく、むしろ化学的に異なる部分である。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの任意の位置を標識するのに適しており、すなわち、末端に結合されるか、又は新生オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれることができ、以下からなる群から選択することができる：
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場は、塩基、糖及び骨格部分を含むヌクレオチドアナログではなく、むしろ化学的に異なる部分である。これらのコンジュゲートは、オリゴヌクレオチドの任意の位置を標識するのに適しており、すなわち、末端に結合されるか、又は新生オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれることができ、以下からなる群から選択することができる：
【0101】
【表27】
【0102】
ここで、Ｚ及びＸは上記のとおりの意味を有する。
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場はオリゴヌクレオチドの末端位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る：
さらに他の実施形態では、ペプチドタグがアミノ基、例えばそのＮ末端を介して足場に結合される場合、足場はオリゴヌクレオチドの末端位置を標識するためのものであり、以下からなる群から選択され得る：
【0103】
【表28】
【0104】
ここで、Ｚは上記の意味を有する。
これらの構造において、ＺはそのＮ末端又は側鎖アミノ基を介して連結されたペプチドタグであり、以下から選択され得る：
これらの構造において、ＺはそのＮ末端又は側鎖アミノ基を介して連結されたペプチドタグであり、以下から選択され得る：
【0105】
【表29】
【0106】
あるいは、ソルターゼペプチドタグは、ＬＰＥＴＧ（配列番号６）であり得る。
【0107】
【表30】
【0108】
これらの構造において、ＲはＮＨ２（アミド化Ｃ末端）又はＯ－Ｐ６であり、Ｐ６は、ＯＭｅ（メトキシ）、ＯｔＢｕ（ｔｅｒｔ－ブトキシ）及びＯＴｒｔ（トリチルオキシ）などの、ＳＰＯＳでの使用に適した任意の適切なカルボン酸保護基である。
【0109】
上記の構造では、－ＯＨ基を望ましくない修飾から保護するＤＭＴ（ジメトキシトリチル）保護基を有するいくつかの化合物が示されている。これらの保護基は、ＭＭＴ（モノメトキシトリチル）、Ｔｒｔ（トリチル）、及び２－Ｃｌ－Ｔｒｔ（２－クロロ－トリチル）を含むがこれらに限定されない他の適切な保護基と容易に交換することができる。これらすべての構造において、Ｙは、以下に示す特定のペプチドタグを含むがこれらに限定されない、任意のペプチドタグを表す。
【0110】
上記の構造において、
ｍは０～８、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７又は８、例えば、０又は１～４、又は０～２であり；
ｎは０～８、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７又は８、例えば、０又は１～４、又は０～２である。
ｍは０～８、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７又は８、例えば、０又は１～４、又は０～２であり；
ｎは０～８、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７又は８、例えば、０又は１～４、又は０～２である。
【0111】
Ｐ１からＰ５は、ペプチドタグを有するオリゴヌクレオチドの合成中に望ましくない副反応から保護されるべき不安定な基の保護基である。Ｐ１は、ＳＰＯＳでの使用に適したシトシンのＮ４上の任意の保護基（例えば、ｄｍｆ（Ｎ，Ｎ－ジメチルホルムアミド）、Ｂｚ（ベンジル）、Ａｃ（アセチル））である。Ｐ２は、ＳＰＯＳでの使用に適したアデニンのＮ６上の任意の保護基（例えば、Ｂｚ、Ｐａｃ（フェノキシアセチル））である。Ｐ３は、ＳＰＯＳでの使用に適したグアニンのＮ２上の任意の保護基（例えば、ｉＢｕ（イソブチリル）、ｄｍｆ、ｉＰｒ－Ｐａｃ（イソプロピルフェノキシアセチル））である。Ｐ４は、ＲＮＡのＳＰＯＳでの使用に適した、ペントース糖の２’－Ｏ上の任意の保護基（例えば、ＴＯＭ（２－Ｏ－トリイソプロピルシリルオキシメチル）、ＴＢＤＭＳ（２’－Ｏ－ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル）、Ａｃ）である。Ｐ５は、ＵＮＡ（アンロック核酸、ＲＮＡの非環式アナログ）のＳＰＯＳでの使用に適した任意の保護基（例えば、Ｂｚ）である。
【0112】
本発明の方法で使用されるペプチドタグで修飾されたオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、好ましくはホスホロアミダイト又はホスホロアミダート基に結合することができる反応性基を含む足場に結合したペプチドタグを、前記反応性基とオリゴヌクレオチドとのカップリングを可能にする条件下でオリゴヌクレオチドと反応させることで、ペプチドタグで修飾されたオリゴヌクレオチドを生成することによって得られる。オリゴヌクレオチドに組み込むか連結することができるヌクレオチド又は基にカップリングするのに適した前記ペプチドタグ足場分子の具体例は、上に開示されている。
【0113】
本発明の方法において、本方法の第２の工程は、（ｉｉ）カーゴ分子及びポリ（ペプチド）を、ライゲーションモチーフを介してペプチドタグと（ポリ）ペプチドとをライゲーションするペプチドリガーゼと接触させることである。上述したように、ペプチドタグは、ライゲーションハンドル及びライゲーションモチーフにライゲーションされる（ポリ）ペプチドを含んでもよく、又はその逆でもよい。そのようなモチーフの例は本明細書に記載されている。
【0114】
ペプチドリガーゼのライゲーションモチーフは、ライゲーションされる（ポリ）ペプチドのＣ末端又はその近くに位置し得る。これは、通常はライゲーションハンドルよりも長いため、組換え手段によってライゲーションされる（ポリ）ペプチドに付加でき、それに応じて修飾された（ポリ）ペプチドが宿主細胞内で組換え発現されるため、有利であり得る。これにより、効果的にライゲーションハンドルとなるペプチドタグを可能な限り短く保つことができ、合成の労力を最小限に抑えることができる。
【0115】
様々な実施形態において、ペプチドリガーゼは、ソルターゼ及びペプチジルアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ；本明細書では「アスパラギニルリガーゼ」とも呼ばれる）から選択される。適切なＰＡＬは、例えば国際公開第２０２０／２２６５７２号などの当技術分野で記載されており、当業者には一般的に知られている。このようなＰＡＬの例としては、ブテラーゼ－１、ＶｙＰＡＬ２、及びＯａＡＥＰ１ｂが挙げられるが、これらに限定されない。
【0116】
本発明に従う有用なリガーゼは、タンパク質ライゲーション活性を示す、すなわち、２つのアミノ酸残基間にペプチド結合を形成することができ、これらの２つのアミノ酸残基はペプチドタグ上、及びライゲーションされる（ポリ）ペプチド上に位置する。様々な実施形態において、このタンパク質ライゲーション活性は、エンドペプチダーゼ活性を含む。すなわち、２つのアミノ酸残基間のペプチド結合は、既存のペプチド結合の切断後に生じる。
【0117】
アスパラギニルリガーゼは、ライゲーションが起こるアミノ酸のＣ末端、すなわちライゲーションされるペプチドのＣ末端がアスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）又はアスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）であるという点で「Ａｓｘ特異的」であり得る。
【0118】
リガーゼは天然に存在する酵素であってもよく、単離された形態で提供されてもよい。本明細書で使用される「単離された」とは、天然に存在するか会合する他の細胞成分から少なくとも部分的に分離された形態のポリペプチドに関する。リガーゼは、組換えポリペプチド、すなわち、前記ポリペプチドを天然には産生しない遺伝子操作された生物において産生されるポリペプチドであってもよい。天然ポリペプチド及び組換えポリペプチドはどちらも、Ｎ結合型グリコシル化によって翻訳後修飾され得る。
【0119】
様々な実施形態において、アスパラギニルリガーゼは、ブテラーゼ－１（配列番号２及び５）、ＶｙＰＡＬ２（配列番号１及び４）、及びＯａＡＥＰ１ｂ（配列番号３）から選択され、配列番号１～５のいずれか１つ又はその任意の機能的断片もしくはバリアントのアミノ酸配列を有し得る。
【0120】
このようなバリアントは、参照アミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０．５％、９１％、９１．５％、９２％、９２．５％、９３％、９３．５％、９４％、９４．５％、９５％、９５．５％、９６％、９６．５％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％、９９．２５％、又は少なくとも９９．５％同一である。バリアントは、それぞれの参照配列の活性を保持するその断片であってもよい。そのような断片は、典型的には参照配列のＣ末端及び／又はＮ末端トランケート型であり、好ましくは、例えば国際公開第２０２０／２２６５７２号に記載されている酵素活性の決定基を含む。
【0121】
核酸配列又はアミノ酸配列の同一性は、通常、配列比較によって決定される。この配列比較は、既存技術で確立され、一般的に使用されているＢＬＡＳＴアルゴリズムに基づいており（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９０）“Ｂａｓｉｃ ｌｏｃａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｓｅａｒｃｈ ｔｏｏｌ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０、及びＡｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９７）：“Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ ａｎｄ ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴ：ａ ｎｅｗ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｄａｔａｂａｓｅ ｓｅａｒｃｈ ｐｒｏｇｒａｍｓ”；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５，ｐ．３３８９－３４０２参照）、原理的には、それぞれ核酸配列及びアミノ酸配列におけるヌクレオチド又はアミノ酸の類似の連続を相互に関連させることによってもたらされる。関連する位置の表形式の関連付けは、「アライメント」と呼ばれる。配列比較（アライメント）、特に多重配列比較は、一般に、利用可能であり当業者に知られているコンピュータプログラムを使用して準備される。
【0122】
この種の比較では、比較されている配列の相互の類似性に関するステートメントも可能になる。これは通常、同一性のパーセンテージ、すなわち、アライメントにおいて同じ位置又は互いに対応する位置にある同一のアミノ酸残基の割合として示される。同一性の表示は、ポリペプチド全体にわたって、又は個々の領域にわたってのみ生じることがある。したがって、様々なアミノ酸配列の同一領域は、配列内の一致によって定義される。そのような領域は、多くの場合、同一の機能を示す。それらは小さい場合があり、少数のアミノ酸のみを含む場合がある。この種の小さな領域は、タンパク質の全体的な活性に不可欠な機能を発揮することが多い。そのため、個々の、場合によっては小さい領域のみに一致する配列を参照することが有用であり得る。しかしながら、別段の指示がない限り、本明細書における同一性の指標は、それぞれ示された核酸配列又はアミノ酸配列の全長を指す。
【0123】
全てのアミノ酸残基は、本明細書では通常、その一文字コード、場合によっては三文字コードを参照することによって言及される。この命名法は当業者にはよく知られており、本明細書では当分野で理解されているとおりに使用される。
【0124】
本明細書に記載の方法及び使用において、一方では酵素、すなわちリガーゼ、そして他方では基質、すなわちペプチドタグ及びライゲーションされる（ポリ）ペプチドを有するカーゴ分子は、１：１００以上、好ましくは１：４００以上、より好ましくは少なくとも１：１０００のモル比で使用することができる。反応は通常、適切な緩衝系中、最適な酵素活性を可能にする温度、通常は周囲温度（２０℃）から４０℃の間で行われる。
【0125】
本発明の方法において、リガーゼは固体支持体上に固定化され得る。固体支持体上での固定化の主な利点は、部位分離と擬似希釈を提供することで、トランス自己分解による分解を防止し、安定性を向上させることである。固定化酵素の部位分離により、高濃度の酵素を使用してライゲーション反応を加速することで、ワンポット条件又は連続フローリアクターでのライゲーション反応などを数分で完了させることができる。適切な支持体材料には、クロマトグラフィーカラムなどに使用される様々な樹脂及びポリマーが含まれる。支持体はビーズの形態を有していてもよく、又はマイクロタイタープレートなどのより大きい構造の表面であってもよい。固定化により、基質との接触が非常に容易かつ簡素になるだけでなく、合成後の酵素と基質の分離も容易になる。酵素機能を有するポリペプチドが固体カラム材料に固定化されている場合、ライゲーション／環化を連続プロセスとし、かつ／又は基質／生成物溶液をカラム上で循環させてもよい。
【0126】
様々な実施形態において、リガーゼはグリコシル化され、固定化は、固体支持体に共有結合した炭水化物結合部分、好ましくはコンカナバリンＡ部分又はそのバリアントとの相互作用によって促進される。そのような実施形態では、固体支持体はアガロースビーズであり得る。
【0127】
他の様々な実施形態において、リガーゼはビオチン化され、固定化は、固体支持体に共有結合したビオチン結合部分、好ましくはストレプトアビジン、アビジンもしくはニュートラアビジン部分又はそのバリアントとの相互作用によって促進される。ビオチンによる酵素の機能化は、スクシンイミジル－６－（ビオチンアミド）ヘキサノアートなどのＮ－ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）とのビオチンエステルによる機能化などの当技術分野で公知の方法を使用して達成することができる。そのような実施形態では、固体支持体はアガロースビーズであってもよく、ビオチン結合部分はニュートラアビジン（脱グリコシル化アビジン）などのアビジンバリアントであってもよい。
【0128】
他の様々な実施形態において、リガーゼは、例えばリジン側鎖からのポリペプチド中の遊離アミノ基と固体支持体の表面上のＮ－ヒドロキシスクシンイミド官能基との反応によって固体支持体上に固定化される。固体支持体はアガロースビーズであり得る。
【0129】
本明細書に記載の方法の様々な実施形態では、カーゴ分子とポリ（ペプチド）とのペプチドリガーゼでのライゲーションは、同じであっても異なっていてもよいペプチドリガーゼに対する少なくとも２つのライゲーションモチーフを含む二機能性アダプターを介する。様々な実施形態において、これらの少なくとも２つのライゲーションモチーフ部位は異なり、異なるリガーゼによって結合される。二機能性アダプターは、その側鎖及び／又はＮ末端を介して、任意選択でアダプター足場に連結される遊離Ｃ末端を有する２つのペプチド又はライゲーションモチーフを含み得る。一方のライゲーションモチーフは、本明細書に記載されるＰＡＫＬライゲーションモチーフを含むか、又はそれから構成され得、他方は、異なるＰＡＬライゲーションモチーフ又はソルターゼライゲーションモチーフを含むか、又はそれから構成され得、すべて本明細書に記載されている。そのような実施形態では、ライゲーションされるオリゴヌクレオチド及び（ポリ）ペプチドの両方は、ライゲーションハンドルに対応するペプチドモチーフを含み、そのＮ末端がアダプター中に存在するライゲーションモチーフのＣ末端に結合することを可能にする。適切なアダプターは、以下のスキームＳ５の化合物（４）である。原理は図５に大まかに示されている。
【0130】
本発明はさらに、入手可能な、又は本明細書に記載の方法に従って得られる特定のライゲーション産物に関する。
本発明の別の態様は、本明細書に開示される特定のペプチドタグ足場、例えば特定のホスホロアミダイトタグ、及び記載される修飾オリゴヌクレオチドに関する。
本発明の別の態様は、本明細書に開示される特定のペプチドタグ足場、例えば特定のホスホロアミダイトタグ、及び記載される修飾オリゴヌクレオチドに関する。
【0131】
本発明は、以下の非限定的な実施例及び添付の特許請求の範囲によってさらに説明される。
実施例
全般的な方法
試薬及び溶媒を商業供給元（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｍｅｒｃｋ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）から購入した。ＤＮＡホスホロアミダイトモノマー及びチオ修飾剤Ｃ６Ｓ－Ｓホスホロアミダイトを、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸をＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。すべての試薬をさらに精製せずに使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｉｌクロマトグラフィーシリカ媒体（４０～６３μｍ）を使用して実施した。反応を、Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムプレートを使用してモニタリングした。ＴＬＣを、ＵＶ光、ｐ－アニスアルデヒド染色又はニンヒドリン染色によって視覚化した。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ３００分光計で記録した。ＨＲＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＭＳで実行した。
実施例
全般的な方法
試薬及び溶媒を商業供給元（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｍｅｒｃｋ、Ａｌｆａ Ａｅｓａｒ）から購入した。ＤＮＡホスホロアミダイトモノマー及びチオ修飾剤Ｃ６Ｓ－Ｓホスホロアミダイトを、Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈから購入した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸をＧＬ Ｂｉｏｃｈｅｍから購入した。すべての試薬をさらに精製せずに使用した。フラッシュカラムクロマトグラフィーを、Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｉｌクロマトグラフィーシリカ媒体（４０～６３μｍ）を使用して実施した。反応を、Ｍｅｒｃｋ ＴＬＣシリカゲル６０Ｆ２５４アルミニウムプレートを使用してモニタリングした。ＴＬＣを、ＵＶ光、ｐ－アニスアルデヒド染色又はニンヒドリン染色によって視覚化した。ＮＭＲスペクトルをＢｒｕｋｅｒ Ａｖａｎｃｅ３００分光計で記録した。ＨＲＭＳ分析を、Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－ｔｏｆ Ｐｒｅｍｉｅｒ ＭＳで実行した。
【0132】
実施例１：（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）ホスホロアミダイトタグの合成手順
【0133】
【化4】
【0134】
（２Ｒ，３Ｒ）－３－アミノ－４－（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）ブタン－２－オール（Ｓ２）
Ｆｍｏｃ－スレオニノールＳ１（３００ｍｇ、９１６μｍｏｌ）を無水ピリジン（４．００ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴｒ－Ｃｌ（３４２ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を１０分間隔で３回に分けて加えた。得られた溶液を窒素下で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で半分の体積まで除去し、酢酸エチルで希釈した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、無水ＤＭＦ（１．４４ｍＬ）を加えて油を溶解した。ピペリジン（３１２．１ｍｇ、０．３６ｍＬ、３．６６５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、Ｓ２（３６６．４ｍｇ、９８．１％）を黄色がかった油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ６．２７，スレオニノール ＣＨ３），２．６０－２．６８（１Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈα），３．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５．８５ ９．４１ スレオニノール ＣＨ２），３．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４．１７ ９．４１ スレオニノール ＣＨ２），３．６５（１Ｈ，クインテット，スレオニノール Ｈβ），３．７７（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．８２，Ｈ－Ａｒ），７．１５－７．３５（７Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．３８－７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９．９６，５５．２６，５７．１６，６５．９７，６８．０４，８６．２０，１１３．２１，１２６．８８，１２７．９１，１２８．１６，１３０．０８，１３６．０１，１３６．１０，１４４．９０，１５８．５７。Ｃ２５Ｈ３０ＮＯ４のＨＲＭＳ計算：４０８．２１７５；実測：４０８．２１７４。
Ｆｍｏｃ－スレオニノールＳ１（３００ｍｇ、９１６μｍｏｌ）を無水ピリジン（４．００ｍＬ）に溶解し、ＤＭＴｒ－Ｃｌ（３４２ｍｇ、１．０１ｍｍｏｌ）を１０分間隔で３回に分けて加えた。得られた溶液を窒素下で５時間撹拌した。溶媒を減圧下で半分の体積まで除去し、酢酸エチルで希釈した。混合物を飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機相をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、無水ＤＭＦ（１．４４ｍＬ）を加えて油を溶解した。ピペリジン（３１２．１ｍｇ、０．３６ｍＬ、３．６６５ｍｍｏｌ）をゆっくりと加え、得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～２％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、Ｓ２（３６６．４ｍｇ、９８．１％）を黄色がかった油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１．０７（３Ｈ，ｄ，Ｊ６．２７，スレオニノール ＣＨ３），２．６０－２．６８（１Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈα），３．０８（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ５．８５ ９．４１ スレオニノール ＣＨ２），３．２４（１Ｈ，ｄｄ，Ｊ４．１７ ９．４１ スレオニノール ＣＨ２），３．６５（１Ｈ，クインテット，スレオニノール Ｈβ），３．７７（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），６．８２（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．８２，Ｈ－Ａｒ），７．１５－７．３５（７Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．３８－７．４６（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ１９．９６，５５．２６，５７．１６，６５．９７，６８．０４，８６．２０，１１３．２１，１２６．８８，１２７．９１，１２８．１６，１３０．０８，１３６．０１，１３６．１０，１４４．９０，１５８．５７。Ｃ２５Ｈ３０ＮＯ４のＨＲＭＳ計算：４０８．２１７５；実測：４０８．２１７４。
【0135】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｒ）－４－（（Ｒ）－１－ヒドロキシエチル）－１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－６，９，１２－トリオキソ－１－フェニル－２－オキサ－５，８，１１－トリアザトリデカン－１３－イル）カルバマート（Ｓ３）
無水ＤＭＦ（３．５ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（５０５ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４７６ｍｇ、０．６４ｍＬ、３．６８ｍｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（１６６ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（５１２ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｓ２（５００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液にゆっくりと加えた。得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。次いで、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～６％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物Ｓ３（８９９．１ｍｇ、９１．５％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＭｅＯＤ）：δ１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ６．３８，スレオニノール－ＣＨ３），３．０６－３．１８（１Ｈ，ｍ，スレオニノール ＣＨ２），３．２４－３．３３（１Ｈ，ｍ，スレオニノール ＣＨ２），３．７３（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３．８２（２Ｈ，ｓ，Ｇｌｙ－ＣＨ２）３．８７－４．０３（５Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈα及び２×Ｇｌｙ－ＣＨ２）４．０３－４．１３（１Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈβ），４．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ６．４５，Ｆｍｏｃ－ＣＨ），４．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．７６，Ｆｍｏｃ－ＣＨ２），６．８３（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．８４，Ｈ－Ａｒ），７．１４－７．４８（１３Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５７－７．６９（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．５０，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ２０．３３，４３．４６，４３．８８，４５．１５，４８．２９，５５．６７，５６．５７，８７．３２，１１４．０６，１２０．９０，１２６．１８，１２７．７０，１２８．１５，１２８．７３，１２８．７８，１２９．２８，１３１．２４，１３７．２１，１３７．２９，１４２．５３，１４５．１６，１４５．１９，１４６．４２，１５９．２９，１５９．９９，１７１．６２，１７２．０９，１７３．１４。Ｃ４６Ｈ４９Ｎ４Ｏ９のＨＲＭＳ計算：８０１．３５００；実測：８０１．３５０３。
無水ＤＭＦ（３．５ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－ＯＨ（５０５ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（４７６ｍｇ、０．６４ｍＬ、３．６８ｍｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（１６６ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（５１２ｍｇ、１．３５ｍｍｏｌ）の溶液を、Ｓ２（５００ｍｇ、１．２３ｍｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（３ｍＬ）溶液にゆっくりと加えた。得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。次いで、有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～６％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）で精製して、生成物Ｓ３（８９９．１ｍｇ、９１．５％）を淡黄色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＭｅＯＤ）：δ１．０８（３Ｈ，ｄ，Ｊ６．３８，スレオニノール－ＣＨ３），３．０６－３．１８（１Ｈ，ｍ，スレオニノール ＣＨ２），３．２４－３．３３（１Ｈ，ｍ，スレオニノール ＣＨ２），３．７３（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３．８２（２Ｈ，ｓ，Ｇｌｙ－ＣＨ２）３．８７－４．０３（５Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈα及び２×Ｇｌｙ－ＣＨ２）４．０３－４．１３（１Ｈ，ｍ，スレオニノール Ｈβ），４．１７（１Ｈ，ｔ，Ｊ６．４５，Ｆｍｏｃ－ＣＨ），４．３６（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．７６，Ｆｍｏｃ－ＣＨ２），６．８３（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．８４，Ｈ－Ａｒ），７．１４－７．４８（１３Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５７－７．６９（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．７９（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．５０，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＭｅＯＤ）：δ２０．３３，４３．４６，４３．８８，４５．１５，４８．２９，５５．６７，５６．５７，８７．３２，１１４．０６，１２０．９０，１２６．１８，１２７．７０，１２８．１５，１２８．７３，１２８．７８，１２９．２８，１３１．２４，１３７．２１，１３７．２９，１４２．５３，１４５．１６，１４５．１９，１４６．４２，１５９．２９，１５９．９９，１７１．６２，１７２．０９，１７３．１４。Ｃ４６Ｈ４９Ｎ４Ｏ９のＨＲＭＳ計算：８０１．３５００；実測：８０１．３５０３。
【0136】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（４Ｒ）－４－（（１Ｒ）－１－（（（２－シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）エチル）－１，１－ビス（４－メトキシフェニル）－６，９，１２－トリオキソ－１－フェニル－２－オキサ－５，８，１１－トリアザトリデカン－１３－イル）カルバマート（１）
無水ＤＣＭ（３．３４ｍＬ）に懸濁したＳ３（３４６．８ｍｇ、４３３．０μｍｏｌ）にＤＩＰＥＡ（１３９．９ｍｇ、０．１９ｍＬ、１．０８３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１２３．０ｍｇ、１１５．９μＬ、５１９．６μｍｏｌ）を数分間かけて滴下し、得られた溶液を窒素下、室温で３０分間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１（３０６．９ｍｇ、７０．８％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４８．１３，１４８．８２。
無水ＤＣＭ（３．３４ｍＬ）に懸濁したＳ３（３４６．８ｍｇ、４３３．０μｍｏｌ）にＤＩＰＥＡ（１３９．９ｍｇ、０．１９ｍＬ、１．０８３ｍｍｏｌ）を加えた。次いで、２－シアノエチルＮ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１２３．０ｍｇ、１１５．９μＬ、５１９．６μｍｏｌ）を数分間かけて滴下し、得られた溶液を窒素下、室温で３０分間撹拌した。反応混合物をＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィー（０～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、１（３０６．９ｍｇ、７０．８％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４８．１３，１４８．８２。
【0137】
実施例２：（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）ホスホロアミダイトタグの合成手順
【0138】
【化5】
【0139】
（３Ｒ，５Ｓ）－５－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）ピロリジン－３－オール（Ｓ４）
化合物（Ｓ４）を、Ｐｒａｋａｓｈらによって報告された手順に従って合成した。（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０１４，４２（１３），８７９６－８０７）。
化合物（Ｓ４）を、Ｐｒａｋａｓｈらによって報告された手順に従って合成した。（Ｐｒａｋａｓｈ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．２０１４，４２（１３），８７９６－８０７）。
【0140】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシピロリジン－１－イル）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）カルバマート（Ｓ５）
Ｓ４（２００ｍｇ、４７７μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１６８ｍｇ、４７７μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１８５ｍｇ、０．２５ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９９ｍｇ、５２４μｍｏｌ）及びＨｏＢｔ（６４．４ｍｇ、４７７μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．８ｍＬ）の撹拌溶液に加えた。得られた混合物を窒素下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む３０～５０％ＥＡ／Ｈｅｘ）で精製して、Ｓ５（３０４．７ｍｇ、８４．７％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８１－１．０５（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４９－１．６０（２Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ），１．７０－１．８０（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．９１－２．２３（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’／Ｈ３”），３．０７－３．１６（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．４５－３．６０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”），３．６５－３．７３（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５’），３．７８（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３８８－４．１０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），４．１４－４．２５（１Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ），４．２７－４．４０（２Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ２），４．４０－４．６７（３Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２，Ｈ４，Ｌｅｕ Ｈα），５．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．５２，ＮＨ），６．６４－６．８８（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．１７－７．４３（１３Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５２－７．６３（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．５３，２２．１１，２３．２６，２４．６５，３６．４５，４２．０６，４２．５１，４５．６３，４７．１６，５０．８７，５５．２０，５５．７３，５６．０２，５９．９７，６３．０１，６７．１６，７０．４９，８６．０１，１１３．０８，１１９．９５，１２５．１７，１２６．７９，１２７．０８，１２７．６９，１２７．７７，１２８．０９，１２９．１４，１３０．０１，１３５．９５，１３６．１３，１４１．２９，１４３．７４，１４３．７８，１４３．９１，１４４．９６，１５８．４６，１７１．６０。Ｃ４７Ｈ５０Ｎ２Ｏ７のＨＲＭＳ計算：７５５．３６９６；実測：７５５．３６８７。
Ｓ４（２００ｍｇ、４７７μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１ｍＬ）溶液を、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｅｕ－ＯＨ（１６８ｍｇ、４７７μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１８５ｍｇ、０．２５ｍＬ、１．４３ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（１９９ｍｇ、５２４μｍｏｌ）及びＨｏＢｔ（６４．４ｍｇ、４７７μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．８ｍＬ）の撹拌溶液に加えた。得られた混合物を窒素下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を減圧下で除去し、粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む３０～５０％ＥＡ／Ｈｅｘ）で精製して、Ｓ５（３０４．７ｍｇ、８４．７％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ０．８１－１．０５（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４９－１．６０（２Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ），１．７０－１．８０（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．９１－２．２３（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’／Ｈ３”），３．０７－３．１６（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．４５－３．６０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”），３．６５－３．７３（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５’），３．７８（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３８８－４．１０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），４．１４－４．２５（１Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ），４．２７－４．４０（２Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ２），４．４０－４．６７（３Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２，Ｈ４，Ｌｅｕ Ｈα），５．５２（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．５２，ＮＨ），６．６４－６．８８（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．１７－７．４３（１３Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５２－７．６３（２Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．７６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ８．５３，２２．１１，２３．２６，２４．６５，３６．４５，４２．０６，４２．５１，４５．６３，４７．１６，５０．８７，５５．２０，５５．７３，５６．０２，５９．９７，６３．０１，６７．１６，７０．４９，８６．０１，１１３．０８，１１９．９５，１２５．１７，１２６．７９，１２７．０８，１２７．６９，１２７．７７，１２８．０９，１２９．１４，１３０．０１，１３５．９５，１３６．１３，１４１．２９，１４３．７４，１４３．７８，１４３．９１，１４４．９６，１５８．４６，１７１．６０。Ｃ４７Ｈ５０Ｎ２Ｏ７のＨＲＭＳ計算：７５５．３６９６；実測：７５５．３６８７。
【0141】
（Ｓ）－２－アミノ－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシピロリジン－１－イル）－４－メチルペンタン－１－オン（Ｓ６）
Ｓ５（３６９．４ｍｇ、４８９．３μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．７ｍＬ）溶液にピペリジン（１６６．７ｍｇ、１９３μＬ、１．９５７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む０～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、Ｓ６（１８３．７ｍｇ、７０．５％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８０－０．９７（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４１－１．６１（２Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ），１．６７－１．８７（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．８９－２．０４（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’），２．０５－２．２０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３”），２．９６－３．１５（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．４６－３．６４（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”，Ｌｅｕ Ｈα），３．６７－３．８２（８Ｈ，ｍ，２×ＯＣＨ３，Ｈ５’，Ｈ５”，），３．８２－３．９６（２Ｈ，ｍ，ＮＨ２），４．３９－４．４８（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２），４．５１（１Ｈ，ｓ，プロリノールＨ４），６．７４－６．８６（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．１３－７．３０（７Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．３０－７．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．６８，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．０８，２３．２９，２４．６７，３６．１０，４３．７９，４４．７６，５０．７９，５５．２２，５５．２８，５５．８４，５６．１６，６２．８７，７０．４２，８５．９４，１１３．１０，１２６．７８，１２７．７８，１２８．１１，１３０．０２，１３５．９８，１３６．１９，１４５．００，１５８．４６。Ｃ３２Ｈ４０Ｎ２Ｏ５のＨＲＭＳ計算：５３３．３０１５；実測：５３３．３０１６。
Ｓ５（３６９．４ｍｇ、４８９．３μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．７ｍＬ）溶液にピペリジン（１６６．７ｍｇ、１９３μＬ、１．９５７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を窒素下、室温で２時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液で２回、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。次いで、粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む０～５％ＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、Ｓ６（１８３．７ｍｇ、７０．５％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８０－０．９７（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４１－１．６１（２Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ），１．６７－１．８７（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．８９－２．０４（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’），２．０５－２．２０（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３”），２．９６－３．１５（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．４６－３．６４（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”，Ｌｅｕ Ｈα），３．６７－３．８２（８Ｈ，ｍ，２×ＯＣＨ３，Ｈ５’，Ｈ５”，），３．８２－３．９６（２Ｈ，ｍ，ＮＨ２），４．３９－４．４８（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２），４．５１（１Ｈ，ｓ，プロリノールＨ４），６．７４－６．８６（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．１３－７．３０（７Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．３０－７．３８（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．６８，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．０８，２３．２９，２４．６７，３６．１０，４３．７９，４４．７６，５０．７９，５５．２２，５５．２８，５５．８４，５６．１６，６２．８７，７０．４２，８５．９４，１１３．１０，１２６．７８，１２７．７８，１２８．１１，１３０．０２，１３５．９８，１３６．１９，１４５．００，１５８．４６。Ｃ３２Ｈ４０Ｎ２Ｏ５のＨＲＭＳ計算：５３３．３０１５；実測：５３３．３０１６。
【0142】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシピロリジン－１－イル）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）アミノ）－２－オキソエチル）カルバマート（Ｓ７）
無水ＤＭＦ（１．６ｍＬ）中のＳ６（２９３．５ｍｇ、５５１．０μｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１６３．８ｍｇ、５５１．０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２８４．９ｍｇ、０．３８ｍＬ、２．２０４ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（２２９．９ｍｇ、６０６．１μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を添加した。得られた混合物を窒素下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～１００％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ７（３２１．７ｍｇ、７１．９％）を淡黄色の泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．７８－１．０２（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４６－１．７３（３Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．８４－２．２４（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’／Ｈ３”），２．９３－３．１１（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．５１－３．６７（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”，プロリノールＨ５’），３．６０－３．６９（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），３．７１（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３．７９－３．９１（２Ｈ，ｍ，Ｇｌｙ Ｈα），３．９６－４．０８（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），４．０９－４．２４（１Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．５４，ＦｍｏｃＣＨ２），４．５２－４．４０（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２’，プロリノールＨ４’），４．７２－４．９２（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈα），６．１８（１Ｈ，ｓ，Ｇｌｙ ＮＨ），６．７５（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．４９，Ｈ－Ａｒ）７．０９－７．２８（１０Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ及びＬｅｕＮＨ），７．２９－７．４３（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．１７，Ｈ－Ａｒ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．５３，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１９，２３．１２，２４．６６，３５．９８，４２．０５，４４．１５，４７．０６，４９．４９，５５．１３，５６．０４，５６．２２，６２．６０，６７．２０，７０．３６，８５．８５，１１３．０２，１１９．８９，１２５．１５，１２６．７３，１２７．０９，１２７．６７，１２７．７２，１２８．０３，１２９．９５，１２９．９９，１３５．８５，１３６．１３，１４１．２２，１４３．８１，１４４．９３，１５８．４０，１６９．５０，１７１．４３。Ｃ４９Ｈ５３Ｎ３Ｏ８のＨＲＭＳ計算：８１２．３９０９；実測：８１２．３９１１。
無水ＤＭＦ（１．６ｍＬ）中のＳ６（２９３．５ｍｇ、５５１．０μｍｏｌ）の撹拌溶液に、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（１６３．８ｍｇ、５５１．０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（２８４．９ｍｇ、０．３８ｍＬ、２．２０４ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（２２９．９ｍｇ、６０６．１μｍｏｌ）の無水ＤＭＦ（１．５ｍＬ）溶液を添加した。得られた混合物を窒素下、室温で１時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～１００％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ７（３２１．７ｍｇ、７１．９％）を淡黄色の泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．７８－１．０２（６Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ２×ＣＨ３），１．４６－１．７３（３Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈβ，Ｌｅｕ Ｈγ），１．８４－２．２４（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ３’／Ｈ３”），２．９３－３．１１（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１’），３．５１－３．６７（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ１”，プロリノールＨ５’），３．６０－３．６９（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），３．７１（６Ｈ，ｓ，２×ＯＣＨ３），３．７９－３．９１（２Ｈ，ｍ，Ｇｌｙ Ｈα），３．９６－４．０８（１Ｈ，ｍ，プロリノールＨ５”），４．０９－４．２４（１Ｈ，ｍ，ＦｍｏｃＣＨ），４．３３（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．５４，ＦｍｏｃＣＨ２），４．５２－４．４０（２Ｈ，ｍ，プロリノールＨ２’，プロリノールＨ４’），４．７２－４．９２（１Ｈ，ｍ，Ｌｅｕ Ｈα），６．１８（１Ｈ，ｓ，Ｇｌｙ ＮＨ），６．７５（４Ｈ，ｄ，Ｊ８．４９，Ｈ－Ａｒ）７．０９－７．２８（１０Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ及びＬｅｕＮＨ），７．２９－７．４３（４Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．１７，Ｈ－Ａｒ），７．７２（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．５３，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１９，２３．１２，２４．６６，３５．９８，４２．０５，４４．１５，４７．０６，４９．４９，５５．１３，５６．０４，５６．２２，６２．６０，６７．２０，７０．３６，８５．８５，１１３．０２，１１９．８９，１２５．１５，１２６．７３，１２７．０９，１２７．６７，１２７．７２，１２８．０３，１２９．９５，１２９．９９，１３５．８５，１３６．１３，１４１．２２，１４３．８１，１４４．９３，１５８．４０，１６９．５０，１７１．４３。Ｃ４９Ｈ５３Ｎ３Ｏ８のＨＲＭＳ計算：８１２．３９０９；実測：８１２．３９１１。
【0143】
（２Ｓ，４Ｒ）－１－（（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グリシル－Ｌ－ロイシル）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（（２－シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）ピロリジン－３－イリウム（２）
ＤＩＰＥＡ（１１９．１ｍｇ、０．１６ｍＬ、９２１．２μｍｏｌ）を、窒素下で無水ＤＣＭ（２．８５ｍＬ）中のＳ７（２９９．２ｍｇ、３６８．５μｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１０４．７ｍｇ、９８．６４μＬ、４４２．２μｍｏｌ）を反応混合物に数分間かけて滴下し、得られた溶液を窒素下、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を無水ＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～６５％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、２（３３３．２ｍｇ、８９．４％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４７．４５，１４７．９６，１４８．１６，１４８．５７。
ＤＩＰＥＡ（１１９．１ｍｇ、０．１６ｍＬ、９２１．２μｍｏｌ）を、窒素下で無水ＤＣＭ（２．８５ｍＬ）中のＳ７（２９９．２ｍｇ、３６８．５μｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（１０４．７ｍｇ、９８．６４μＬ、４４２．２μｍｏｌ）を反応混合物に数分間かけて滴下し、得られた溶液を窒素下、室温で３０分間撹拌した。反応混合物を無水ＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～６５％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、２（３３３．２ｍｇ、８９．４％）を白色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４７．４５，１４７．９６，１４８．１６，１４８．５７。
【0144】
実施例３：（Ｐｒｏ－Ｌｅｕ）ホスホロアミダイトタグの合成手順
【0145】
【化6】
【0146】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（Ｓ）－２－（（（Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－ヒドロキシピロリジン－１－イル）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボキシラート（Ｓ８）
無水ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中のＳ６（２５９．４ｍｇ、４８７．０μｍｏｌ）の溶液を、無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（１６４．３ｍｇ、４８７．０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１８８．８ｍｇ、０．２６ｍＬ、１．４６１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２０３．２ｍｇ、５３５．８μｍｏｌ）及びＨｏＢｔ（６５．８ｍｇ、４８６．９μｍｏｌ）の撹拌溶液に滴下した。得られた溶液を窒素下、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～９０％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ８（２２８．０ｍｇ、５５．０％）を黄色泡状物として得た。
無水ＤＭＦ（１．７ｍＬ）中のＳ６（２５９．４ｍｇ、４８７．０μｍｏｌ）の溶液を、無水ＤＭＦ（１．２ｍＬ）中のＦｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ（１６４．３ｍｇ、４８７．０μｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（１８８．８ｍｇ、０．２６ｍＬ、１．４６１ｍｍｏｌ）、ＨＢＴＵ（２０３．２ｍｇ、５３５．８μｍｏｌ）及びＨｏＢｔ（６５．８ｍｇ、４８６．９μｍｏｌ）の撹拌溶液に滴下した。得られた溶液を窒素下、室温で１．５時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。合わせた有機層を水、続いてブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む５０～９０％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ８（２２８．０ｍｇ、５５．０％）を黄色泡状物として得た。
【0147】
（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メチル（２Ｓ）－２－（（（２Ｓ）－１－（（２Ｓ，４Ｒ）－２－（（ビス（４－メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）メチル）－４－（（（２－シアノエトキシ）（ジイソプロピルアミノ）ホスファニル）オキシ）ピロリジン－１－イル）－４－メチル－１－オキソペンタン－２－イル）カルバモイル）ピロリジン－１－カルボキシラート（Ｓ９）
ＤＩＰＥＡ（８６．５ｍｇ、０．１２ｍＬ、６６９．０μｍｏｌ）を、アルゴン下、無水ＤＣＭ（２．０７ｍＬ）中のＳ８（２２８．０ｍｇ、２６８．０μｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（７６．０ｍｇ、７１．６μＬ、３２１．０μｍｏｌ）を反応混合物に数分間かけて滴下し、得られた溶液をアルゴン下室温で３０分間撹拌した。反応混合物を無水ＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む４０～６０％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ９（２１７．８ｍｇ、７７．３％）を淡黄色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４７．５２，１４７．７５，１４７．８５，１４７．９９，１４８．０３，１４８．３９。
ＤＩＰＥＡ（８６．５ｍｇ、０．１２ｍＬ、６６９．０μｍｏｌ）を、アルゴン下、無水ＤＣＭ（２．０７ｍＬ）中のＳ８（２２８．０ｍｇ、２６８．０μｍｏｌ）の撹拌溶液に添加した。次いで、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルクロロホスホロアミダイト（７６．０ｍｇ、７１．６μＬ、３２１．０μｍｏｌ）を反応混合物に数分間かけて滴下し、得られた溶液をアルゴン下室温で３０分間撹拌した。反応混合物を無水ＤＣＭで希釈し、飽和ＫＣｌ溶液で抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（１％ＴＥＡを含む４０～６０％ＥＡ／Ｈｅｘ）によって精製して、Ｓ９（２１７．８ｍｇ、７７．３％）を淡黄色泡状物として得た。３１Ｐ ＮＭＲ（１６２ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ１４７．５２，１４７．７５，１４７．８５，１４７．９９，１４８．０３，１４８．３９。
【0148】
実施例４：Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－Ｇｌｙ－Ｌｅｕ－ＯｔＢｕタグの合成手順
【0149】
【化7】
【0150】
ｔｅｒｔ－ブチル（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）グリシル－Ｌ－ロイシナート（Ｓ１１）
無水ＤＭＦ（１．３５ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（４７６ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６２１ｍｇ、０．８４ｍＬ、３当量、４．８１ｍｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（２１６ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（６６８ｍｇ、１．１当量、１．７６ｍｍｏｌ）の溶液を、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したｔｅｒｔ－ブチルＬ－ロイシナートＳ１０（３００ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。得られた溶液を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。次いで、合わせた有機層をブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｓ１１（６８４．４ｍｇ、９１．６％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８５－０．９７（６Ｈ，ｍ，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．４４（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．４６－１．７５（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），３．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ５．１６，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．１７（１Ｈ，ｔ，Ｕ７．１１，ＣＨ－Ｆｍｏｃ），４．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．９５，ＣＨ２－Ｆｍｏｃ），４．４７－４．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），５．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．１６，ＮＨ－Ｇｌｙ），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ７．９１，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．２７，Ｈ－Ａｒ），７．３７（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．４０，Ｈ－Ａｒ），７．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３８，Ｈ－Ａｒ），７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．４７，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１１，２２．８１，２４．９７，２８．０３，４１．７７，４４．４２，４７．１１，５１．４８，６７．３５，８２．１１，１２０．０２，１２５．１７，１２７．１３，１２７．７６，１４１．３２，１４３．８５，１５６．６，１８．７９，１７２．１８。Ｃ２７Ｈ３５Ｎ２Ｏ５のＨＲＭＳ計算：４６７．２５４６；実測：４６７．２５６５。
無水ＤＭＦ（１．３５ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ（４７６ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）、ＤＩＰＥＡ（６２１ｍｇ、０．８４ｍＬ、３当量、４．８１ｍｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（２１６ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（６６８ｍｇ、１．１当量、１．７６ｍｍｏｌ）の溶液を、無水ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したｔｅｒｔ－ブチルＬ－ロイシナートＳ１０（３００ｍｇ、１当量、１．６０ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に加えた。得られた溶液を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。次いで、合わせた有機層をブラインで洗浄した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｓ１１（６８４．４ｍｇ、９１．６％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８５－０．９７（６Ｈ，ｍ，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．４４（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．４６－１．７５（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），３．９４（２Ｈ，ｄ，Ｊ５．１６，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．１７（１Ｈ，ｔ，Ｕ７．１１，ＣＨ－Ｆｍｏｃ），４．３７（２Ｈ，ｄ，Ｊ６．９５，ＣＨ２－Ｆｍｏｃ），４．４７－４．６３（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），５．８３（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．１６，ＮＨ－Ｇｌｙ），６．７６（１Ｈ，ｄ，Ｊ７．９１，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．２７（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．２７，Ｈ－Ａｒ），７．３７（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．４０，Ｈ－Ａｒ），７．５７（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３８，Ｈ－Ａｒ），７．７３（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．４７，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１１，２２．８１，２４．９７，２８．０３，４１．７７，４４．４２，４７．１１，５１．４８，６７．３５，８２．１１，１２０．０２，１２５．１７，１２７．１３，１２７．７６，１４１．３２，１４３．８５，１５６．６，１８．７９，１７２．１８。Ｃ２７Ｈ３５Ｎ２Ｏ５のＨＲＭＳ計算：４６７．２５４６；実測：４６７．２５６５。
【0151】
ｔｅｒｔ－ブチルグリシル－Ｌ－ロイシナート（Ｓ１２）
Ｓ１１（６８４．４ｍｇ、１当量、１．４６７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．３２ｍＬ）溶液にピペリジン（４９９．６ｍｇ、０．５８ｍＬ、４当量、５．８６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を窒素下で１時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１２（２３９．０ｍｇ、６６．６８％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．９５（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．０５，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．４７（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．５０－１．７７（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），１．８３（２Ｈ，ＮＨ２－Ｇｌｙ），３．３９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．４５－４．６２（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．０６，ＮＨ－Ｌｅｕ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１１，２２．８８，２５．０１，２８．０３，４１．９１，４４．６４，５０．９２，８１．７９，１７２．３４。Ｃ１２Ｈ２５Ｎ２Ｏ３のＨＲＭＳ計算値：２４５．１８６５；実測：２４５．１８５５。
Ｓ１１（６８４．４ｍｇ、１当量、１．４６７ｍｍｏｌ）のＤＭＦ（２．３２ｍＬ）溶液にピペリジン（４９９．６ｍｇ、０．５８ｍＬ、４当量、５．８６７ｍｍｏｌ）を加えた。得られた溶液を窒素下で１時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製して、Ｓ１２（２３９．０ｍｇ、６６．６８％）を無色の油として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．９５（６Ｈ，ｄ，Ｊ６．０５，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．４７（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．５０－１．７７（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），１．８３（２Ｈ，ＮＨ２－Ｇｌｙ），３．３９（２Ｈ，ｓ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．４５－４．６２（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），７．５４（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．０６，ＮＨ－Ｌｅｕ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１１，２２．８８，２５．０１，２８．０３，４１．９１，４４．６４，５０．９２，８１．７９，１７２．３４。Ｃ１２Ｈ２５Ｎ２Ｏ３のＨＲＭＳ計算値：２４５．１８６５；実測：２４５．１８５５。
【0152】
ｔｅｒｔ－ブチルＮ２－（（（９Ｈ－フルオレン－９－イル）メトキシ）カルボニル）－Ｎ４－トリチル－Ｌ－アスパラギニルグリシル－Ｌ－ロイシナート（Ｓ１３）
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解したＳ１２（２２１．５ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３５１．５ｍｇ、０．４８ｍＬ、３当量、２．７２０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ（２．８ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（５４０．９ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（１２２．５ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（３７８．２ｍｇ、１．１当量、９９７．２μｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた黄色の溶液を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。次いで、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｓ１３（７０３ｍｇ、９４．２％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８５（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．０８ ２．００，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．３０－１．６７（１２Ｈ，ｍ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），２．５６－２．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈβ－Ａｓｎ），２．９４－３．１１（１Ｈ，ｍ，Ｈβ－Ａｓｎ），３．７０－３．９９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．０５－４．２３（１Ｈ，ｍ，ＣＨ－Ｆｍｏｃ），４．３０－４．５７（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｆｍｏｃ，Ｈα－Ｌｅｕ及びＨα－Ａｓｎ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ６．６０，ＮＨ－Ａｓｎ），６．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ７．４４，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．１０－７．３２（１９Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ，ＮＨ－Ｇｌｙ及びＮＨ－Ａｓｎ側鎖），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ），７．７２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ７．３８ ３．２１，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２０．２０，２２．６４，２４．９０，２８．３０，３８．５３，４１．２６，４３．１７，４７．１６，５１．５３，５２．１９，６７．３２，７０．８９，８１．８１，１２０．０５，１２５．１９，１２７．１８，１２７．７９，１２８．０３，１２８．７１，１４１．３４，１４３．７７，１４４．２８，１６８．３０，１７０．１３，１７１．２９，１７２．２２。
無水ＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解したＳ１２（２２１．５ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）及びＤＩＰＥＡ（３５１．５ｍｇ、０．４８ｍＬ、３当量、２．７２０ｍｍｏｌ）の溶液に、無水ＤＭＦ（２．８ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ（５４０．９ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）、ＨｏＢｔ（１２２．５ｍｇ、１当量、９０６．５μｍｏｌ）及びＨＢＴＵ（３７８．２ｍｇ、１．１当量、９９７．２μｍｏｌ）の溶液を加えた。得られた黄色の溶液を窒素雰囲気下、室温で２時間撹拌した。反応混合物を氷冷水中に注ぎ、酢酸エチルで２回抽出した。次いで、合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、Ｓ１３（７０３ｍｇ、９４．２％）を白色固体として得た。１Ｈ ＮＭＲ（３００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８５（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．０８ ２．００，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．３０－１．６７（１２Ｈ，ｍ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），２．５６－２．７５（１Ｈ，ｍ，Ｈβ－Ａｓｎ），２．９４－３．１１（１Ｈ，ｍ，Ｈβ－Ａｓｎ），３．７０－３．９９（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．０５－４．２３（１Ｈ，ｍ，ＣＨ－Ｆｍｏｃ），４．３０－４．５７（４Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｆｍｏｃ，Ｈα－Ｌｅｕ及びＨα－Ａｓｎ），６．３６（１Ｈ，ｄ，Ｊ６．６０，ＮＨ－Ａｓｎ），６．８２（１Ｈ，ｄ，Ｊ７．４４，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．１０－７．３２（１９Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ，ＮＨ－Ｇｌｙ及びＮＨ－Ａｓｎ側鎖），７．３６（２Ｈ，ｔ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ），７．５６（２Ｈ，ｄ，Ｊ７．３５，Ｈ－Ａｒ），７．７２（２Ｈ，ｄｄ，Ｊ７．３８ ３．２１，Ｈ－Ａｒ）。１３Ｃ ＮＭＲ（７５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２０．２０，２２．６４，２４．９０，２８．３０，３８．５３，４１．２６，４３．１７，４７．１６，５１．５３，５２．１９，６７．３２，７０．８９，８１．８１，１２０．０５，１２５．１９，１２７．１８，１２７．７９，１２８．０３，１２８．７１，１４１．３４，１４３．７７，１４４．２８，１６８．３０，１７０．１３，１７１．２９，１７２．２２。
【0153】
ｔｅｒｔ－ブチルＮ４－トリチル－Ｌ－アスパラギニルグリシル－Ｌ－ロイシナート（３）
Ｓ１３（７０３ｍｇ、１当量、８５４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５０ｍＬ）に溶解した。溶液にピペリジン（２９１ｍｇ、０．３４ｍＬ、４当量、３．４２ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を窒素下で１時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、３（３０８．８ｍｇ、６０．２％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８８（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．４４ ２．５６，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．３２－１．６７（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），１．４１（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．９１（２Ｈ，ｓ，ＮＨ２），２．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ５．８８，Ｈβ－Ａｓｎ），３．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．８６，Ｈα－Ａｓｎ），３．７４－３．９６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．３６－４．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．０１，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．１３－７．２８（１５Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．９０－８．０５（２Ｈ，ｍ，ＮＨ－Ｇｌｙ及びＮＨ－Ａｓｎ側鎖）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１９，２２．６７，２４．８８，２８．０１，４１．４０，４１．５１，４２．９３，５１．４７，５２．３６，７０．４９，８１．７６，１２６．９２，１２７．８７，１２８．６９，１４４．６５，１６８．６０，１７０．３２，１７２．１５，１７４．８０。Ｃ３５Ｈ４５Ｎ４Ｏ５のＨＲＭＳ計算：６０１．３３９０；実測：６０１．３３９２。
Ｓ１３（７０３ｍｇ、１当量、８５４μｍｏｌ）をＤＭＦ（１．５０ｍＬ）に溶解した。溶液にピペリジン（２９１ｍｇ、０．３４ｍＬ、４当量、３．４２ｍｍｏｌ）を加え、得られた溶液を窒素下で１時間撹拌した。反応混合物をクロロホルムで希釈し、飽和重炭酸ナトリウム溶液、続いてブラインで抽出した。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、溶媒を減圧下で除去した。粗生成物をシリカフラッシュカラムクロマトグラフィーで精製して、３（３０８．８ｍｇ、６０．２％）を白色泡状物として得た。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ；ＣＤＣｌ３）：δ０．８８（６Ｈ，ｄｄ，Ｊ６．４４ ２．５６，２×ＣＨ３－Ｌｅｕ），１．３２－１．６７（３Ｈ，ｍ，Ｈγ－Ｌｅｕ及びＨβ－Ｌｅｕ），１．４１（９Ｈ，ｓ，３×ＣＨ３－ｔＢｕ），１．９１（２Ｈ，ｓ，ＮＨ２），２．６２（２Ｈ，ｄ，Ｊ５．８８，Ｈβ－Ａｓｎ），３．６０（１Ｈ，ｔ，Ｊ５．８６，Ｈα－Ａｓｎ），３．７４－３．９６（２Ｈ，ｍ，ＣＨ２－Ｇｌｙ），４．３６－４．４５（１Ｈ，ｍ，Ｈα－Ｌｅｕ），７．００（１Ｈ，ｄ，Ｊ８．０１，ＮＨ－Ｌｅｕ），７．１３－７．２８（１５Ｈ，ｍ，Ｈ－Ａｒ），７．９０－８．０５（２Ｈ，ｍ，ＮＨ－Ｇｌｙ及びＮＨ－Ａｓｎ側鎖）。１３Ｃ ＮＭＲ（１０１ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）：δ２２．１９，２２．６７，２４．８８，２８．０１，４１．４０，４１．５１，４２．９３，５１．４７，５２．３６，７０．４９，８１．７６，１２６．９２，１２７．８７，１２８．６９，１４４．６５，１６８．６０，１７０．３２，１７２．１５，１７４．８０。Ｃ３５Ｈ４５Ｎ４Ｏ５のＨＲＭＳ計算：６０１．３３９０；実測：６０１．３３９２。
【0154】
実施例５：オリゴヌクレオチドの合成
すべてのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で、標準的なホスホロアミダイト化学を使用して化学合成された。ホスホロアミダイト１の無水ＤＣＭ溶液（０．１２Ｍ）又は２の無水ＡＣＮ溶液（０．１２Ｍ）をカップリングに使用し、カップリング時間を１０分間延長した。プレパックされた１μｍｏｌ官能化制御細孔ガラスカラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、５’又は内部タグ付きオリゴヌクレオチド用に使用し、１μｍｏｌ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を３’タグ付きオリゴヌクレオチド用に使用した。オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、ＮＨ３濃水溶液により５５℃で１６時間脱保護した。次いで、オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（２５０×１０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８）により、ＡＣＮ／ＴＥＡＡ移動相混合物を使用して、８分間かけて５％～３５％ＡＣＮの勾配、続いて１２分間で３５％～１００％ＡＣＮの勾配を用いて精製した。ＤＭＴを、ＰｏｌｙＰａｋカートリッジ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で、ＰＯオリゴヌクレオチド又はＰＳオリゴヌクレオチドに対してそれぞれ２％又は３％のＴＦＡ溶液を使用して除去した。次いで、精製されたオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｅｎ Ｐａｋ２．５脱塩カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して脱塩した。次いで、脱塩されたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、脱イオン水に溶解し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量した。
すべてのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｉｎｃ．（ＡＢＩ）３９４ＤＮＡ／ＲＮＡ合成装置で、標準的なホスホロアミダイト化学を使用して化学合成された。ホスホロアミダイト１の無水ＤＣＭ溶液（０．１２Ｍ）又は２の無水ＡＣＮ溶液（０．１２Ｍ）をカップリングに使用し、カップリング時間を１０分間延長した。プレパックされた１μｍｏｌ官能化制御細孔ガラスカラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、５’又は内部タグ付きオリゴヌクレオチド用に使用し、１μｍｏｌ ＵｎｙＬｉｎｋｅｒ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を３’タグ付きオリゴヌクレオチド用に使用した。オリゴヌクレオチドを支持体から切断し、ＮＨ３濃水溶液により５５℃で１６時間脱保護した。次いで、オリゴヌクレオチドを、逆相ＨＰＬＣ（２５０×１０ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ、ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ Ｃ１８）により、ＡＣＮ／ＴＥＡＡ移動相混合物を使用して、８分間かけて５％～３５％ＡＣＮの勾配、続いて１２分間で３５％～１００％ＡＣＮの勾配を用いて精製した。ＤＭＴを、ＰｏｌｙＰａｋカートリッジ（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）上で、ＰＯオリゴヌクレオチド又はＰＳオリゴヌクレオチドに対してそれぞれ２％又は３％のＴＦＡ溶液を使用して除去した。次いで、精製されたオリゴヌクレオチドを、Ｇｌｅｎ Ｐａｋ２．５脱塩カラム（Ｇｌｅｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して脱塩した。次いで、脱塩されたオリゴヌクレオチドを凍結乾燥し、脱イオン水に溶解し、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量した。
【0155】
実施例６：ペプチドの調製
すべてのペプチドはＣｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｍｉｔｅｄから購入した。ペプチドをＤＩ水に溶解して、Ｐｅｐ１及びＰｅｐ３については５ｍＭ、Ｐｅｐ２については９．９５ｍＭ、Ｐｅｐ４については０．７２ｍＭのストック溶液を作製した。
すべてのペプチドはＣｈｅｍｐｅｐｔｉｄｅ Ｌｉｍｉｔｅｄから購入した。ペプチドをＤＩ水に溶解して、Ｐｅｐ１及びＰｅｐ３については５ｍＭ、Ｐｅｐ２については９．９５ｍＭ、Ｐｅｐ４については０．７２ｍＭのストック溶液を作製した。
【0156】
実施例７：アダプターＡｃ－Ｅ（ＮＧＬ）ＬＰＥＴＧＧＷ－ＮＨ２（配列番号７）の合成
【0157】
【化8】
【0158】
ペプチドＳ１４、Ａｃ－Ｅ（ＯＡＩＩ）ＬＰＥＴＧＧＷ（配列番号８）を、Ｆｍｏｃ化学を使用する１０ｍＬリアクターで、Ｂｉｏｔａｇｅ Ｉｎｉｔｉａｔｏｒ＋Ａｌｓｔｒａマイクロ波ペプチド合成装置を使用して、Ｒｉｎｋ Ａｍｉｄｅ樹脂（ＧＬ－ｂｉｏｃｈｅｍ、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ）上で０．２ｍｍｏｌスケールで自動的に合成した。樹脂を７０℃で２０分間膨潤させた。Ｆｍｏｃ脱保護は室温で２段階で行われ、最初に樹脂をＤＭＦ中２０％ピペリジンで３分間処理し、続いてＤＭＦ中２０％ピペリジンで１０分間処理した。カップリングは、５当量のＦｍｏｃ－アミノ酸モノマー、５当量のオキシマ及び５当量のＤＭＦ中のＤＩＣを使用して７５℃で５分間実施した。Ｎ末端を５当量の無水酢酸、６当量のピリジンを使用して室温で２０分間キャッピングした。ＯＡＩＩ保護基を、ＤＣＭ：ＤＭＦ（３：１、４ｍＬ）に溶解したＰｄ（ＰＰｈ３）４（２４ｍｇ）、ＤＭＢＡ（３１０ｍｇ）を用いて窒素雰囲気下で２時間除去した。脱保護カクテルを排出し、樹脂をＤＭＦ中の０．８Ｍ ＬｉＣｌで洗浄して、樹脂に結合したＳ１５を得た。各カップリングにつき５当量のトリペプチド３、５当量のオキシマ及び５当量のＤＩＣを使用して、トリペプチド３をＳ１５に７５℃で５分間ダブルカップリングさせた。合成が完了した後、樹脂をＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥させた。ＴＦＡ－フェノール－Ｈ２Ｏ－ＴＩＰＳ（８８：５：５：２）のカクテルを用いて、室温で３．５時間、固体支持体からペプチドを切断した。切断カクテルを窒素流により蒸発させ、粗生成物を冷エーテルから沈殿させ、真空下で乾燥させた。次いで生成物を、逆相分取カラム（１０ｍｍ×２５０ｍｍ、ＸＢｒｉｄｇｅ Ｐｅｐｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ ＯＢＤ）を使用し、０．１％ＴＦＡを含むＡＣＮ／Ｈ２Ｏ移動相混合物を使用した２５分間にわたる１０％～７０％ＡＣＮの直線勾配でＨＰＬＣによって精製した。溶媒を凍結乾燥により除去し、アダプターペプチド４を得た。次に、生成物を脱イオン水で再構成し、２８０ｎｍでのＵＶ吸光度によって定量した。ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ計算値：１２１２．６；実測［Ｍ＋３Ｎａ］＋：１２８０．９。
【0159】
実施例８：ソルターゼＡの発現
ソルターゼＡ変異体であるソルターゼ－７Ｍ（配列番号１９にＣ末端６×Ｈｉｓタグを有するもの）をコードする遺伝子断片を含むプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅから購入し、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を、抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して１８℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いて５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで予め平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。ソルターゼ－７Ｍタンパク質を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、－８０℃で保存した。
ソルターゼＡ変異体であるソルターゼ－７Ｍ（配列番号１９にＣ末端６×Ｈｉｓタグを有するもの）をコードする遺伝子断片を含むプラスミドをＡｄｄｇｅｎｅから購入し、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を、抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して１８℃で一晩誘導した。細胞を遠心分離によって回収し、細胞ペレットを５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、続いて５０ｍＭトリス－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールで予め平衡化したサイズ排除クロマトグラフィー（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。ソルターゼ－７Ｍタンパク質を、１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、濃度はビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、－８０℃で保存した。
【0160】
実施例９：ＯａＡＥＰ１ｂの発現
ヒトユビキチン（１～７６ａａ）及びＣ２４７Ａ変異を有するＯａＡＥＰ１ｂ（２４～４７４ａａ）を有するＮ末端ヒスチジンタグをコードする遺伝子断片（配列番号２０）を合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を、Ｙａｎｇらによって記載されている手順（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９（１５），５３５１－５３５８）に若干の変更を加えて発現させ、精製した。簡単に説明すると、細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２２０ｒｐｍ、１６℃で一晩振盪して誘導した。細胞を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収し、細胞ペレットを５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．０５％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ－４０を含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間の遠心分離によって清澄化した。可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＱ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。精製したタンパク質画分を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む緩衝液中で混合した。ＯａＡＥＰ１ｂタンパク質を、サンプルのｐＨ４．０を達成するために氷酢酸を添加してＯａＡＥＰ１ｂのキャップドメインを除去することにより活性化した。タンパク質を室温で一晩放置し、反応の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニタリングした。活性化されたＯａＡＥＰ１ｂタンパク質を１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、－８０℃で保存した。
ヒトユビキチン（１～７６ａａ）及びＣ２４７Ａ変異を有するＯａＡＥＰ１ｂ（２４～４７４ａａ）を有するＮ末端ヒスチジンタグをコードする遺伝子断片（配列番号２０）を合成し（ＩＤＴ）、ｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を、Ｙａｎｇらによって記載されている手順（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９（１５），５３５１－５３５８）に若干の変更を加えて発現させ、精製した。簡単に説明すると、細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加し、２２０ｒｐｍ、１６℃で一晩振盪して誘導した。細胞を１０，０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離して回収し、細胞ペレットを５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール及び０．０５％（ｖ／ｖ）ノニデットＰ－４０を含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で２０分間の遠心分離によって清澄化した。可溶性タンパク質を、Ｎｉアフィニティークロマトグラフィー（ＨｉｓＴｒａｐ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）及び陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨｉＴｒａｐＱ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって精製した。精製したタンパク質画分を、２０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロールを含む緩衝液中で混合した。ＯａＡＥＰ１ｂタンパク質を、サンプルのｐＨ４．０を達成するために氷酢酸を添加してＯａＡＥＰ１ｂのキャップドメインを除去することにより活性化した。タンパク質を室温で一晩放置し、反応の完全性をＳＤＳ－ＰＡＧＥによってモニタリングした。活性化されたＯａＡＥＰ１ｂタンパク質を１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮し、タンパク質濃度をビシンコニン酸タンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して決定し、－８０℃で保存した。
【0161】
実施例１０：シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）のクローニング及び発現。
シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰＰＡＬ）（配列番号９）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＱＤＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＷＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＩＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＮＧＬ
ＣＦＰＰＡＬをコードする遺伝子断片をｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２２０ｒｐｍ、１８℃で一晩振盪して誘導した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で７分間の遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。粗溶解物を濾過した後、アフィニティー精製のためにＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。精製したタンパク質画分を合わせ、２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液中で１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰＰＡＬ）（配列番号９）
ＭＧＳＳＨＨＨＨＨＨＳＱＤＰＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＷＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＩＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＮＧＬ
ＣＦＰＰＡＬをコードする遺伝子断片をｐＥＴＤｕｅｔ－１ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２２０ｒｐｍ、１８℃で一晩振盪して誘導した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で７分間の遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｗ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。粗溶解物を濾過した後、アフィニティー精製のためにＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。精製したタンパク質画分を合わせ、２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、１５０ｍＭ ＫＣｌを含む緩衝液中で１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
【0162】
シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰＳＯＲＴ）（配列番号１０）
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＷＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＩＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＬＰＥＴＧＬＥＨＨＨＨＨＨ
ＣＦＰＳＯＲＴをコードする遺伝子断片をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２２０ｒｐｍ、１８℃で一晩振盪して誘導した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で７分間の遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。粗溶解物を濾過した後、アフィニティー精製のためにＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。精製したタンパク質画分を合わせ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で、１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
ＭＶＳＫＧＥＥＬＦＴＧＶＶＰＩＬＶＥＬＤＧＤＶＮＧＨＫＦＳＶＳＧＥＧＥＧＤＡＴＹＧＫＬＴＬＫＦＩＣＴＴＧＫＬＰＶＰＷＰＴＬＶＴＴＬＴＷＧＶＱＣＦＳＲＹＰＤＨＭＫＱＨＤＦＦＫＳＡＭＰＥＧＹＶＱＥＲＴＩＦＦＫＤＤＧＮＹＫＴＲＡＥＶＫＦＥＧＤＴＬＶＮＲＩＥＬＫＧＩＤＦＫＥＤＧＮＩＬＧＨＫＬＥＹＮＹＩＳＨＮＶＹＩＴＡＤＫＱＫＮＧＩＫＡＮＦＫＩＲＨＮＩＥＤＧＳＶＱＬＡＤＨＹＱＱＮＴＰＩＧＤＧＰＶＬＬＰＤＮＨＹＬＳＴＱＳＫＬＳＫＤＰＮＥＫＲＤＨＭＶＬＬＥＦＶＴＡＡＧＩＴＬＧＭＤＥＬＹＫＬＰＥＴＧＬＥＨＨＨＨＨＨ
ＣＦＰＳＯＲＴをコードする遺伝子断片をｐＥＴ－２８ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）にクローニングし、Ｒｏｓｅｔｔａ Ｔ１Ｒ細胞に形質転換した。細胞を抗生物質を含むＬＢ中でＯＤ６０００．６～０．８まで増殖させ、０．５ｍＭ ＩＰＴＧを添加して２２０ｒｐｍ、１８℃で一晩振盪して誘導した。１０，０００ｒｐｍ、４℃で７分間の遠心分離によって細胞を回収し、細胞ペレットを２０ｍＭ Ｋｐｉ ｐＨ７．０、５００ｍＭ ＫＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、１０％（ｖ／ｖ）グリセロール、２０ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液に再懸濁した。細胞を超音波処理によって溶解し、粗溶解物を２１，０００ｒｐｍ、４℃で１時間の遠心分離によって清澄化した。粗溶解物を濾過した後、アフィニティー精製のためにＮｉ－ＮＴＡカラム（Ｑｉａｇｅｎ）にロードした。精製したタンパク質画分を合わせ、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む緩衝液中で、１０ｋＤａ ＭＷＣＯセントリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用して濃縮した。
【0163】
実施例１１：ペプチドとのライゲーション反応
ＯａＡＥＰ１ｂを使用するライゲーション反応を、別段の定めがない限り、２０ｍＭリン酸緩衝液、ＯａＡＥＰ１ｂリガーゼ（０．０１～０．３当量）、ペプチド基質（２００μＭ）及びオリゴヌクレオチド基質（５００ｕＭ～１ｍＭ）を含む２０μＬの反応混合物中で３７℃で実施した。
ＯａＡＥＰ１ｂを使用するライゲーション反応を、別段の定めがない限り、２０ｍＭリン酸緩衝液、ＯａＡＥＰ１ｂリガーゼ（０．０１～０．３当量）、ペプチド基質（２００μＭ）及びオリゴヌクレオチド基質（５００ｕＭ～１ｍＭ）を含む２０μＬの反応混合物中で３７℃で実施した。
【0164】
ソルターゼＡを使用するライゲーション反応を、別段の定めがない限り、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液、ソルターゼＡリガーゼ（１～３当量）、ペプチド基質（２００μＭ）及びオリゴヌクレオチド基質（１ｍＭ）を含む２０μＬの反応混合物中で４℃で実施した。
【0165】
コンジュゲートキメラ生成物を、Ｎｅｘｅｒａ ＵＨＰＬＣシステム（島津製作所）にて３５分間かけて５％～４０％アセトニトリル／ＴＥＡＡの直線勾配で、逆相分析カラム（２５０×４．６ｍｍ、ＹＭＣ－Ｔｒｉａｒｔ Ｃ１８）を使用して精製した。濃度（１０、５０、１００、１５０、及び２００μＭ）に対する２６０ｎｍでのＯＤＮｒｅｆピーク面積の直線フィットをキャリブレーションプロットとして使用した。コンジュゲートキメラ生成物に対応する２６０ｎｍのピークを積分し、線形校正プロットから収率を導き出した。ＨＰＬＣピークの同一性を、ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ（ＪＥＯＬ ＪＭＳ－Ｓ３０００）分析によって確認した。
【0166】
実施例１２：ＣＦＰとのライゲーション反応
ＯａＡＥＰ１ｂを使用したライゲーション反応を、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、タンパク質基質（１００μＭ）、オリゴヌクレオチド基質（１ｍＭ）及びＯａＡＥＰ１ｂリガーゼ（０．０２当量）を含む５μＬの反応混合物中で３７℃で１時間実施した。反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニタリングした。
ＯａＡＥＰ１ｂを使用したライゲーション反応を、２０ｍＭリン酸緩衝液ｐＨ７．４、タンパク質基質（１００μＭ）、オリゴヌクレオチド基質（１ｍＭ）及びＯａＡＥＰ１ｂリガーゼ（０．０２当量）を含む５μＬの反応混合物中で３７℃で１時間実施した。反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニタリングした。
【0167】
ソルターゼＡを使用するライゲーション反応を、５０ｍＭトリスＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液、タンパク質基質（５０μＭ）、オリゴヌクレオチド基質（５００μＭ）及びソルターゼＡリガーゼ（１当量）を含む５μＬの反応混合物中で４℃で１６時間実施した。反応はＳＤＳ－ＰＡＧＥでモニタリングした。
【0168】
【表31-1】
【0169】
【表31-2】
【0170】
【表32】
【0171】
【表33】
【0172】
本明細書では、ＰＯＣの調製を大幅に簡素化する、ペプチド及びオリゴヌクレオチドの酵素的ライゲーションに対するホスホロアミダイトタグに基づくアプローチを開示する（図１）。短いペプチド認識モチーフ（≦３アミノ酸）は、自動合成中にオリゴに容易に組み込まれることができるタグホスホロアミダイトに変換され（図１ａ、上）、続いて、マッチングライゲーションハンドルを含む対応するペプチドと、同族リガーゼによりライゲーションされる（図１ａ、下）。この方法の有用性は、ソルターゼを用いて（Ｍａｚｍａｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９９，２８５（５４２８），７６０－３；Ｍａｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６（９），２６７０－１；Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１１，１０８（２８），１１３９９－４０４；Ｐｏｐｐ＆Ｐｌｏｅｇｈ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２０１１，５０（２２），５０２４－３２）及びペプチドアスパラギニルリガーゼ（ＰＡＬ）を用いて（Ｎｇｕｙｅｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１４，１０（９），７３２－８；Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１５，６，１０１９９；Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１７，１３９（１５），５３５１－５３５８；Ｊａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ２０１８，９（１），２４１１；Ｈｅｍｕ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ２０１９，１１６（２４），１１７３７－１１７４６）実証されており、これらはタンパク質工学で広く使用されている２つの異なるクラスのリガーゼである。このライゲーション戦略は、様々な範囲のオリゴ及びペプチド構築物に適用することに成功し、さらにタンパク質とオリゴのライゲーションにも拡張された。タグの組み込みのモジュール性により、制御可能な方法で複数のペプチド／タンパク質をオリゴにコンジュゲートする機会がさらに提供される。したがって、我々のアプローチは、ＰＯＣの合理化された開発と生産に向けた直接的な道を提供する。
【0173】
ソルターゼは、タンパク質を細菌の細胞壁に固定するトランスペプチダーゼのファミリーである。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）由来のソルターゼＡは、コンセンサス選別モチーフＬＰＸＴＧを含むＣ末端にＮ末端ポリグリシンをライゲーションする。したがって、スレオニノール（Ｓ１）足場から開始して、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙライゲーションモチーフを含むホスホロアミダイトタグ（１）（図１ｂ、赤色）を合成した（スキームＳ１）。化合物１はホスホロアミダイトベースの固相オリゴヌクレオチド合成と十分に適合するため、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙタグをオリゴヌクレオチドに直接組み込むことができる（図１ａ、上）。
【0174】
同族ライゲーションハンドルを含むモデルペプチド（Ｐｅｐ１、表２）に対して、組換えソルターゼＡを使用して５’－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）タグ付き１６ヌクレオチド（ｎｔ）オリゴ配列（Ｈｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．２０１５，７（３１４），３１４ｒａ１８５）（ＯＤＮ１、表１）のライゲーションが進められた（Ｗｕｅｔｈｒｉｃｈ ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ２０１４，９（１０），ｅ１０９８８３；Ｗｉｔｔｅ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ２０１５，１０，５０８）。ライゲーション反応を、１５０ｍＭ ＮａＣｌを含む５０ｍＭトリス－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液中、４℃で１６時間、ペプチド：オリゴヌクレオチドの比１：５で実施した。ライゲーション産物を逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣで単離し、その質量をＭＡＬＤＩ－ＴＯＦで確認した（表３）。陰性対照として、ソルターゼＡを反応混合物から除外した場合、及びタグのない参照オリゴ（ＯＤＮｒｅｆ）を反応に使用した場合、ライゲーション産物は観察されなかった（表３）。同じ配列の５’－（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ）タグ付き完全ホスホロチオアート（ＰＳ）修飾オリゴ（ＯＤＮ２、表１）とＰｅｐ１のライゲーションも同様に成功したため（表３）、ヌクレアーゼ耐性を向上させるためにＰＳ骨格化学が広く使用されている治療用オリゴとのコンジュゲートに対するこのアプローチの適用可能性が検証された。加えて、ＰＯＣライゲーションは、オリゴの３’末端（ＯＤＮ３）又は内部位置（ＯＤＮ４）のいずれかでのタグの交互の配置に関係なく達成された（表３）。さらに、ＯＤＮ２は、Ｃ末端に選別モチーフを含む３８アミノ酸（ａａ）長のグルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ１）バリアントへのライゲーションにも成功した（Ｐｅｐ２、表２、表３）。
【0175】
次に、ＰＡＬを用いたＰＯＣライゲーションを行った。ＰＡＬは、シクロチド生成植物に見出されるアスパラギニル特異的リガーゼのファミリーであり、その中には、ブテラーゼ１（Ｎｇｕｙｅｎら、前出）及びＯａＡＥＰ１ｂ（Ｈａｒｒｉｓら、前出；Ｙａｎｇら、前出）が含まれる。ＯａＡＥＰ１ｂの天然基質は、Ｎ末端とＣ末端にそれぞれペプチド配列ＧＬとＮＧＬを含む。この例では、我々はヒドロキシプロリノール（Ｓ４）足場から開始して、固相オリゴヌクレオチド合成と十分に適合性のある（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）ライゲーションモチーフ（図１ｂ）を含むホスホロアミダイトタグ（２）を合成した（スキームＳ２）。（Ｇｌｙ－Ｌｅｕ）での５’タグ付きＯＤＮｒｅｆの天然型、ＰＳ修飾型、及びロック核酸（ＬＮＡ）ギャップマーバージョン（それぞれＯＤＮ５、ＯＤＮ６、及びＯＤＮ７、表１）はすべて、２０ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７）中の組換えＯａＡＥＰ１ｂをペプチド：オリゴヌクレオチド比１：２．５で使用する同族ライゲーションハンドルを含む（表３）モデルペプチド（Ｐｅｐ３、表２）へのコンジュゲートに成功した。ＰＡＬファミリーの高い効率のおかげで、ＯａＡＥＰ１ｂとのわずか３０分のインキュベーション後にライゲーション産物が得られた。Ｐｅｐ３と他の様々なオリゴ構築物（ライゲーションタグの異なる配置（ＯＤＮ８及びＯＤＮ９）からなるか、又は追加のオリゴ修飾（ジスルフィド修飾剤を含むＯＤＮ Ｓ８、表Ｓ１）を含むもの）とのライゲーションも同様に成功した。一方、Ｃ末端にライゲーションハンドルを含む３４ａａのＧＬＰ１バリアント（Ｐｅｐ４、表２）とＯＤＮ５及びＯＤＮ６とのライゲーションも、リガーゼと１６時間インキュベートした後に成功した（表３）。
【0176】
様々なペプチド及びオリゴヌクレオチドのライゲーションに対するタグベースのアプローチの適応性を実証したので、次に、タンパク質とオリゴヌクレオチドとのライゲーションに対するその応用を調査した。この目的のために、Ｃ末端にＬＰＥＴＧ（配列番号６）（ソルターゼＡ用；ＣＦＰＳＯＲＴ）又はＮＧＬ（ＯａＡＥＰ１ｂ用；ＣＦＰＰＡＬ）ライゲーションハンドルを保持するようにシアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）バリアントを操作した（図２ａ）。両方のタンパク質を、ソルターゼＡ及びＯａＡＥＰ１ｂを使用して、異なるオリゴ構築物のパネルに対してライゲーションした。ソルターゼＡでは、総じてすべての構築物でＣＦＰライゲーションの成功が観察され（図２ｂ）、ＯＤＮ１、ＯＤＮ２、及びポリｄＴオリゴ（ＯＤＮ Ｓ１、表Ｓ１）では、特に高い収率が得られた。ＯａＡＥＰ１ｂでも、総じて試験した構築物のＣＦＰライゲーションの成功が、わずか１時間のインキュベーション時間であっても観察された（データは不掲載）。これらの例は、タンパク質とオリゴヌクレオチドのライゲーションに対するタグベースのアプローチを実証しており、オリゴヌクレオチドと他のタンパク質の対応物とのライゲーションに容易に適応できるはずである。
【0177】
化学的コンジュゲーションは、適合性のある直列型ペプチド及びオリゴ合成の設計から、合成後のコンジュゲーションのためのペプチド及びオリゴフラグメントの官能化に至るまで、ＰＯＣの開発に対する一般的なアプローチである。本発明は、ＰＯＣ生成に酵素的次元をもたらす。カスタムホスホロアミダイトタグの設計を通じてライゲーションモチーフをオリゴに直列で組み込むことにより、オリゴは、同族リガーゼによってマッチングライゲーションハンドルを含むペプチド／タンパク質の対応物と容易に結合できる。具体的には、このアプローチの有用性は、ペプチド及びタンパク質工学で広く使用されている２つの異なるリガーゼクラスであるソルターゼとＰＡＬを使用して実証された。
【0178】
タンパク質工学においてリガーゼは広く採用されているにもかかわらず、ＰＯＣ生成へのリガーゼの適応に関する報告はほとんどなかった。Ｋｏｕｓｓａらは、ソルターゼを使用したＤＮＡ－タンパク質ハイブリッドの構築について報告した（Ｋｏｕｓｓａ ｅｔ ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ２０１４，６７（２），１３４－４１）。一方、Ｈａｒｍａｎｄらは、ソルターゼＡとブテラーゼ１を組み合わせることで、ＤＮＡリンカーを介してＣ－ｔｏ－Ｃ融合タンパク質を生成した（Ｈａｒｍａｎｄ ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ Ｃｈｅｍ ２０１８，２９（１０），３２４５－３２４９）。どちらの場合も、タンパク質コンジュゲーションはオリゴの５’末端に局在しており、ライゲーション用のオリゴを調製するために中間工程が必要であった。本発明では、ホスホロアミダイトタグは自動固相合成中にオリゴ鎖に直接結合され、標準的な切断、脱保護、及び精製プロトコール後にライゲーションの準備が整った。さらに、５’末端／３’末端であろうと内部位置であろうと、オリゴへのタグの組み込みのポイントに関係なく、ＰＯＣが問題なく生成されることが示された。原理的には、同じホスホロアミダイトタグの複数のコピーを、同じペプチド／タンパク質の複数のコピーとコンジュゲートさせるために、オリゴ上にタンデムに又は別々の遺伝子座で結合させることができる（図３）。異なるホスホロアミダイトタグを組み合わせて、アドレス指定可能な方法で２つ以上の異なるペプチド／タンパク質を単一のオリゴにコンジュゲートさせることもできる（図１ｂ及び図３）。
【0179】
ホスホロアミダイトタグベースのアプローチを、様々なオリゴ、様々なペプチド、及びタンパク質のパネルに対して検証した。使用したオリゴ構築物の多様な性質（表Ｓ１）は、タグ付けの部位（例えば、５’末端：ＯＤＮ１／ＯＤＮ２／ＯＤＮ５／ＯＤＮ６／ＯＤＮ７、３’末端：ＯＤＮ３／ＯＤＮ８；内部：ＯＤＮ４／ＯＤＮ９）から、追加の修飾剤の存在（例えば、ジスルフィド修飾剤：ＯＤＮ Ｓ８）又は完全に骨格修飾されている（例えば、ＰＳ：ＯＤＮ２／ＯＤＮ６、ＰＳ ＬＮＡギャップマー：ＯＤＮ７）まで、非標準的な構造形式（例えば、Ｇ四重鎖形成モチーフ：ＯＤＮ Ｓ３／ＯＤＮ Ｓ４／ＯＤＮ Ｓ９）の採用まで、提案された方法論の多用途性を裏付けた。さらに、コンジュゲーションにリガーゼを利用することで、酵素ライゲーションの高い効率と特異性を活用することが可能になった。ペプチドと、対応するライゲーションハンドルを含む対応するオリゴとを同族リガーゼと単純にインキュベートするだけで、副生成物を最小限にして望ましいＰＯＣが得られる。ＰＡＬの場合、ＰＯＣはリガーゼとのインキュベーションの開始からわずか３０分で生成できる。ペプチド及びオリゴ対応物の標準的な固相合成及び精製以外に、追加の活性化や準備工程は必要ない。賢明な実験設計（例えば、ＣＦＰＳＯＲＴのように、ライゲーションハンドル後のペプチド／タンパク質Ｃ末端にＨｉｓ×６ラベルを組み込むなど）を使用すると、ＰＯＣ精製をさらに簡素化できる。未反応のペプチド／タンパク質は、脱離基及びリガーゼとともに、そのすべてにＨｉｓ×６標識が含まれており、ニッケルカラムを通過させることで反応混合物から容易に除去できるため、液体クロマトグラフィーによって過剰なオリゴ基質からＰＯＣを直接分離できる。
【0180】
近年、標的送達又は有効性の増強を達成するために、ＲＮＡ治療薬とペプチド及びタンパク質のコンジュゲーションに対する関心が高まっている。使用されるペプチド／タンパク質部分は、短いペプチドモチーフ（例えば、インテグリン結合ＲＧＤ）から中間の長さのオリゴペプチド（例えば、ＧＬＰ１）又は高分子抗体までの範囲に及ぶ。本明細書では、ＧＬＰ１バリアントを最小限のステップでＰＳオリゴと高収率でライゲーションできることが示され、この戦略はより大きいタンパク質成分の状況で問題なく適用された。ライゲーションアプローチは、治療薬としての追加のペプチド－／タンパク質－オリゴヌクレオチドコンジュゲートの開発及び生産を促進するために容易に適応できるはずである。
【0181】
さらに、異なる構成からなるオリゴとペプチド及びタンパク質のＣ末端とのライゲーションが実証された。ペプチド又はタンパク質のＮ末端へのライゲーションを実現するには、少なくとも２つの可能な代替戦略が考えられる。１つ目は、ペプチドとオリゴのライゲーションハンドルを直接交換することである（つまり、オリゴ上のＬＰＥＴＧタグ、ソルターゼＡのペプチド上のＧＧＧハンドル；オリゴ上のＮＧＬタグ、ＯａＡＥＰ１ｂのペプチド上のＧＬハンドル）。したがって、ＬＰＥＴＧ（配列番号６）又はＮＧＬホスホロアミダイトタグは、その後のライゲーションのためにオリゴ末端上にライゲーションハンドルの組み込みをもたらすであろう。２つ目の戦略は、オリゴ末端にＧＧＧ又はＧＬタグを保持しつつ、ペプチドのＮ末端からＮＧＬ及びＬＰＥＴＧ（配列番号６）ライゲーションハンドルを突き出させるものである。ペプチドに対する後者の戦略の実装は、固相ペプチド合成中にＬＰＥＴＧ又はＮＧＬ（３、スキームＳ４）ペプチドモチーフをＮ末端又はＮ末端残基の側鎖にカップリングすることで比較的簡単である（図４）。このようにして、側鎖残基から突き出たマッチングライゲーションハンドルでのライゲーションを通じて、オリゴをペプチドの内部残基にコンジュゲートさせることもできる。一方、タンパク質のＮ末端でのＬＰＥＴＧ又はＮＧＬペプチドモチーフのカップリングは、カスタムリンカー又はアダプター、例えばＬＰＥＴＧ及びＮＧＬモチーフの両方を突き出させる二機能性タグ（４、スキームＳ５）の助けを借りて達成できる（図５）。原則として、化合物３及び４の使用はＰＯＣ自体に限定されるものではなく、むしろペプチド／タンパク質を別の実体、例えばタンパク質のＮ対Ｎ融合及びタンパク質と小分子とのＮ末端コンジュゲーションと結合させるためにより広い範囲で適用できる。
【0182】
２つのホスホロアミダイトタグの設計において、タグモチーフ（ＧＧＧ及びＧＬ）が組み込まれたａａ様リンカー（ソルターゼＡ用のスレオニノール（Ｓ１）、ＯａＡＥＰ１ｂ用のヒドロキシプロリン（Ｓ４））を選択した。これらの部分は、（ｉ）コンパクトな足場、（ｉｉ）ペプチド合成との十分な適合性、したがってタグ生成中のアミノ酸残基の連続結合、及び（ｉｉｉ）異なる反応性を有する２つのヒドロキシル基の存在、中でも、（ｉｉｉａ）一方はオリゴへのカップリングのためにアミダイト官能基に変換され、（ｉｉｉｂ）他方はオリゴ鎖を延長するために保護基（例えば、４，４’－ジメトキシトリチル；ＤＭＴ）に結合されることにより、リンカーとしてよく適している。他の様々な足場をリンカーとして、例えば、タグモチーフが糖、リン酸、又は核酸塩基の構成要素のいずれかに直接標識されているヌクレオチドホスホロアミダイト、又はさらに本明細書に記載のようなヌクレオチドアナログの他の化学修飾基として適所に使用できる可能性がある。
【0183】
ここでは、Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ（ソルターゼＡ）及びＧｌｙ－Ｌｅｕ（ＰＡＬ）をホスホロアミダイトタグのライゲーションモチーフとして利用した。本明細書に記載されているように、このアプローチはライゲーションモチーフの変化に影響を受けやすいことが判明した。前者の場合、ポリアラニンモチーフが、化膿レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のソルターゼＡとのペプチド－タンパク質ライゲーションに以前に使用された（Ｒａｅｅｓｚａｄｅｈ－Ｓａｒｍａｚｄｅｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｏｌｌｏｉｄｓ Ｓｕｒｆ．Ｂ．Ｂｉｏｉｎｔｅｒｆａｃｅｓ ２０１５，１２８，４５７－４６３）。ＰＡＬの場合、米国特許出願第２０１９／０２１８５８６号に示されているように、（Ａｒｇ－Ｌｅｕ）及び（Ｐｒｏ－Ｌｅｕ；Ｓ９、スキームＳ３）を含むバリアントは、ＯａＡＥＰ１ｂとのライゲーション効率がより優れているとは言わないまでも、同様の結果につながると予想される。さらに、ＰＡＬ及びＡＥＰのファミリーのメンバーは異なる配列優先性を示すため、使用できる追加の潜在的なタグモチーフが提供される。モチーフ選択空間は、追加のリガーゼファミリー、例えばサブチリガーゼを考慮してさらに拡張することができる（Ｗｅｅｋｓ ｅｔ ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０２０，１２０（６），３１２７－３１６０）。選択したリガーゼに関係なく、ＰＯＣのタグ補助酵素ライゲーションの中心原理が適用される。
【0184】
結論として、各リガーゼに合わせたホスホロアミダイトタグの開発による、ＰＯＧ生成のための２つの別個のリガーゼの使用が、本明細書で成功することが実証された。多様なオリゴ及びペプチド／タンパク質構築物が高効率で問題なくライゲーションされた。ライゲーションアプローチは、ＰＯＣの合理化された開発と生産への直接的な道を提供する。
【0185】
本明細書で参照されるすべての文書は、その全体が参照により組み込まれる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【配列表】
【国際調査報告】