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特表2024-508834好中球細胞外トラップを特異的に認識する抗切断ヒストンＨ３モノクローナル抗体

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-28

(54)【発明の名称】好中球細胞外トラップを特異的に認識する抗切断ヒストンＨ３モノクローナル抗体

(51)【国際特許分類】

C07K 16/18 20060101AFI20240220BHJP

C12N 1/15 20060101ALI20240220BHJP

C12N 1/19 20060101ALI20240220BHJP

C12N 1/21 20060101ALI20240220BHJP

C12N 5/12 20060101ALI20240220BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240220BHJP

C12N 15/13 20060101ALI20240220BHJP

A61P 7/02 20060101ALI20240220BHJP

A61P 25/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 31/04 20060101ALI20240220BHJP

A61P 31/12 20060101ALI20240220BHJP

A61P 31/10 20060101ALI20240220BHJP

A61P 29/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 37/06 20060101ALI20240220BHJP

A61P 35/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 35/04 20060101ALI20240220BHJP

A61P 17/06 20060101ALI20240220BHJP

A61P 9/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 17/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 19/02 20060101ALI20240220BHJP

A61P 1/04 20060101ALI20240220BHJP

A61P 3/10 20060101ALI20240220BHJP

A61P 13/12 20060101ALI20240220BHJP

A61P 3/00 20060101ALI20240220BHJP

A61P 7/00 20060101ALI20240220BHJP

G01N 33/577 20060101ALI20240220BHJP

G01N 33/53 20060101ALI20240220BHJP

【ＦＩ】

C07K16/18 ZNA

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/12

C12N15/63 Z

C12N15/13

A61P7/02

A61P25/00

A61P31/04

A61P31/12

A61P31/10

A61P29/00

A61P37/06

A61P35/00

A61P35/04

A61P17/06

A61P9/00

A61P17/00

A61P19/02

A61P29/00 101

A61P1/04

A61P3/10

A61P13/12

A61P3/00

A61P7/00

G01N33/577 B

G01N33/53 D

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023552074

(86)(22)【出願日】2022-02-17

(85)【翻訳文提出日】2023-10-25

(86)【国際出願番号】 EP2022054022

(87)【国際公開番号】W WO2022179937

(87)【国際公開日】2022-09-01

(31)【優先権主張番号】21159757.0

(32)【優先日】2021-02-26

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

【公序良俗違反の表示】

（特許庁注：以下のものは登録商標）

１．ＴＷＥＥＮ

２．ＴＲＩＴＯＮ

(71)【出願人】

【識別番号】501497655

【氏名又は名称】マックスプランクゲゼルシャフトツゥアーフェデルゥンデルヴィッセンシャフテンエーフォー

(74)【代理人】

【識別番号】110000578

【氏名又は名称】名古屋国際弁理士法人

(72)【発明者】

【氏名】ティリードロシアオグモア

(72)【発明者】

【氏名】ジクリンスキーアルトゥーロ

(72)【発明者】

【氏名】ヘルツィヒアルフ

【テーマコード（参考）】

4B065

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B065AA01X

4B065AA57X

4B065AA72X

4B065AA90X

4B065AA90Y

4B065AA92X

4B065AA94X

4B065AB01

4B065BA02

4B065CA43

4B065CA44

4B065CA46

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA09

4H045BA10

4H045DA76

4H045EA20

4H045EA50

4H045FA74

4H045GA25

(57)【要約】

本発明は、ＮＥＴにおいて切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合するモノクローナル抗体３Ｄ９に関し、モノクローナル抗体３Ｄ９は、切断されたヒストンＨ３を異なる起源のクロマチンと区別してＮＥＴを特異的に検出するために使用されることができる。本発明は更に、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ検出のための方法、およびＮＥＴ形成に関連する疾患状態を評価するための方法を提供する。本発明は更に、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離断片、およびヒト好中球細胞外トラップの特異的検出用の切断部位Ｌ４８Ｒ４９の使用に関する。本発明は更に、前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列、および前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む宿主細胞に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分であって、ここで、前記抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【請求項2】

請求項１に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分であって、ここで、前記抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【請求項3】

請求項１または請求項２に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分であって、
ここで、前記抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される、抗体。

【請求項4】

請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分をコードする一つ以上の核酸分子を含む、核酸組成物。

【請求項5】

請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分をコードする一つ以上の核酸分子を含む核酸組成物であって、ここで、前記核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列を含む、核酸組成物。

【請求項6】

請求項４または請求項５に記載の組換え核酸分子を含む宿主細胞。

【請求項7】

単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ検出のための方法であって、前記方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること。

【請求項8】

請求項７に記載の方法の方法であって、ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される、方法。

【請求項9】

個体における疾患状態をインビトロで評価するための方法であって：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、請求項１～請求項３のいずれか一項に記載の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択される、方法。

【請求項10】

請求項９に記載の方法であって、ここで、前記自己免疫疾患は、乾癬、血管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、免疫介在性または１型糖尿病、免疫介在性糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症、を含む群から選択される、方法。

【請求項11】

請求項９または請求項１０に記載の方法であって、ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される、方法。

【請求項12】

ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離された断片であって、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の前記断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、もしくはその断片からなる、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、もしくはその断片からなる、
単離された断片。

【請求項13】

請求項１～請求項３のいずれか一項に記載のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分、および／または請求項１２に記載のヒトヒストンＨ３の断片、を含む疾患を評価するためのキットであって、ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している、キット。

【請求項14】

請求項１３に記載の疾患を評価するためのキットであって、ここで、前記自己免疫疾患は、乾癬、血管炎、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、クローン病、免疫介在性または１型糖尿病、免疫介在性糸球体腎炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、抗リン脂質抗体症候群、免疫性血小板減少症、を含む群から選択される、キット。

【請求項15】

好中球細胞外トラップの特異的検出のための、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９に位置するヒストンＨ３の切断部位の使用。

【発明の詳細な説明】

【0001】

本発明は、ＮＥＴにおいて切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合するモノクローナル抗体３Ｄ９に関し、モノクローナル抗体３Ｄ９は、それらを異なる起源のクロマチンと区別してＮＥＴを特異的に検出するために使用されることができる。本発明は更に、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ検出のための方法、およびＮＥＴ形成に関連する疾患状態を評価するための方法を提供する。本発明は更に、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離された精製断片、およびヒト好中球細胞外トラップの特異的検出のための切断部位Ｌ４８Ｒ４９の使用に関する。本発明は更に、前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列、および前記ポリペプチドをコードする組換え核酸配列を含む宿主細胞に関する。

【0002】

［発明の背景］
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）は、好中球顆粒タンパク質または細胞質タンパク質と共局在する、脱凝縮したＤＮＡおよびヒストンの領域として組織学的に定義される。

【0003】

ＮＥＴｏｓｉｓは、病原体に対する宿主防御に寄与する好中球細胞死の制御された形態であり、２００４年に最初の記述後すぐに、様々な病気に関連があった。ＮＥＴｏｓｉｓの間、好中球は、抗菌タンパク質で装飾されたクロマチンを放出し、結果的に、病原体を捕らえて殺すことができる粘着性ＮＥＴをもたらし、病原体が拡散することを防ぐ。ＮＥＴにおける欠陥クリアランスは、ＮＥＴに関連するＤＮＡ、ヒストン、および他の細胞内タンパク質に対する免疫応答を引き起こす可能性があるので、この自己犠牲的な戦略は、自己免疫の方向に進歩してきた研究分野を開始した。５
好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）は、宿主防御だけでなく、癌、血栓症、自己免疫疾患、および神経疾患を含む多くの非感染性疾患にも役割を果たす。

【0004】

現在、ＮＥＴは、例えば、ミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）または好中球エラスターゼ（ＮＥ）などの抗好中球タンパク質、および抗クロマチン抗体、並びにＤＮＡ染色の組み合わせによって検出される。免疫蛍光顕微鏡法は、組織切片およびインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）実験においてＮＥＴを検出するために有用な方法である。しかしながら、ＮＥＴ構成要素は、大きな非凝縮構造全体に分散され、結果的に弱い信号もたらすので、これは困難な場合がある。例えば、好中球エラスターゼ（ＮＥ）に対する抗体の信号は、このプロテアーゼが高度に濃縮されている静止細胞の顆粒においてより、ＮＥＴにおいて著しく弱くなる。逆に、抗ヒストン抗体は、ＮＥＴを強く染色するが、クロマチンがコンパクトであり近づきにくいナイーブ好中球の核は染色しない。この示差的ヒストン染色特性は、現在、ＮＥＴの検出および定量化に利用される（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．，２０１２）。しかしながら、試料調製、および続く画像解析は、異なる研究室間で結果を比較することを困難にする。したがって、ＮＥＴ抗原に対する抗体を同定する必要がある。

【0005】

ＮＥＴは、ＮＥＴｏｓｉｓ中に起こる翻訳後修飾（ＰＴＭ）に基づいて検出されることもできる。これらのＰＴＭの１つは、アルギニン残基をシトルリンに変換させるプロテインアルギニンデイミナーゼ４（ＰＡＤ４）によるヒストン３（Ｈ３）シトルリン化であり、シトルリンはタンパク質が合成される時にタンパク質に組み込まれないアミノ酸である。シトルリン化Ｈ３（Ｈ３ｃｉｔ）は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）およびインビボ（ｉｎｖｉｖｏ）実験の両方においてＮＥＴの代替マーカーとして広く使用されている。シトルリン化は、ＮＥＴ形成に特異的でないことに注意することが重要である。

【0006】

ＮＥＴｏｓｉｓ中に発生し、およびＮＥＴｏｓｉｓに寄与する更なるＰＴＭは、顆粒由来の好中球プロテアーゼによるヒストンの切断（クリッピングとも呼ばれる）である。システインプロテアーゼまたはセリンプロテアーゼによるヒストン切断は、ヒストン尾部において複数の、より微妙なＰＴＭの全体的な除去を促進し、および酵母から哺乳動物まで保存される正真正銘のヒストンＰＴＭである。

【0007】

疾患における、および治療標的としてのＮＥＴの役割における研究は、ＮＥＴの検出のための信頼できる、および特異的な方法の欠如によって妨げられる。ＮＥＴを特異的に標識する利用可能な抗体はない。ＮＥＴ特異的抗体は、（１）研究者がＮＥＴを同定するために、および（２）診断について－複雑な組織がＮＥＴを含むかどうか決定するために有用であるだろう。

【0008】

本発明の目的は、化合物、より具体的には好中球細胞外トラップ（ＮＥＴ）を特異的に認識する抗体、を提供することである。この抗体は、より容易なＮＥＴ定量化も促進する。
本発明の目的は、独立請求項の教示によって解決される。本発明の更に有利な特徴、態様、および詳細は、本出願の従属請求項、明細書、図面、および実施例から明白である。

【0009】

［発明の簡単な説明］
ＮＥＴの特異的マーカーの検索において、本発明者らは、ヒトＮＥＴ形成において起こる独特のヒストンＨ３切断事象を同定しており、ヒストンＨ３切断事象はヒトＨ３ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９に位置される（図１、図２）。

【0010】

本発明者らは、この事象の特異性を利用して、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片のＲ４９で始まるＮ末端に位置されるデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）ヒストンＨ３エピトープに対するマウスモノクローナル抗体３Ｄ９（図３）を作製した。言い換えると、抗体は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する。

【0011】

顕微鏡法によって、この抗体は、精製細胞試料（図５）および混合細胞試料（図６）においてクロマチンからＮＥＴを識別し、研究における単純なＮＥＴ検出および定量化を促進する。重要なことに、３Ｄ９は、微生物および宿主由来の生理的刺激の両方によって誘導されたヒトＮＥＴを認識する（図５）。さらに、この抗体は、ヒト組織切片におけるＮＥＴも検出する（図８～図１０）。抗体を、半自動方法および自動方法によるＮＥＴ定量化にも使用することができる（図４）。重要なことに、抗体３Ｄ９は、好中球におけるＮＥＴｏｓｉｓと他の形態の細胞死とを区別することができ（図７Ａ）、一方、抗クロマチン抗体ＰＬ２．３は、区別しない（図７Ｂ）。

【0012】

したがって、本発明者らは、この抗体がＮＥＴを検出する、および定量するための新しいツールであり、研究室間の結果の比較を容易にし、およびＮＥＴに関して生検を行う、および他の複雑な組織を調べるためのツールであることを実証している。

【0013】

本発明の抗体は、ＮＥＴ形成中にのみ現れるヒストンＨ３におけるＲ４９位に位置されるデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）エピトープを認識する。したがって、この抗体は、ＮＥＴを特異的に認識する最初の抗体である。

【0014】

今まで、ヒストンシトルリン化Ｈ３ｃｉｔは、ＮＥＴにおける抗体に基づく検出のために使用されている唯一のＰＴＭファミリーである。本明細書において、発明者らは、ヒト試料からのＮＥＴにおける広範な検出に使用されることができる新しいヒストンＰＴＭとして、Ｈ３Ｒ４９でのヒストン切断を示している。ＮＥＴの検出についてＨ３ｃｉｔの使用は、議論がないわけではない。全てのＮＥＴが、シトルリン化されるのではなく、ＮＥＴ形成は、シトルリン化酵素の非存在下または阻害下で起こる可能性がある。正確なヒストン切断部位を同定することによって、本発明者らは、このことを更に解明した。最も一般的に使用されるＨ３ｃｉｔ抗体は、Ｒ２、Ｒ８、およびＲ１７のシトルリン化を検出する。しかしながら、Ｒ４９でのヒストン切断は、Ｈ３ｃｉｔエピトープを除去することになり、これらのＮＥＴ定義ＰＴＭを、単一のヒストンレベルで相互排他的にする。実際に、炎症を起こした腎臓（図８Ｃ）、胆嚢（図９）、および虫垂（図１０）のパラフィン切片における抗Ｈ３ｃｉｔおよび３Ｄ９による同時染色は、２つのマークの広範な相互排除、および３Ｄ９による脱凝縮されたクロマチンのより豊富な染色を明らかにした。したがって、本発明者らは、３Ｄ９が、ＮＥＴの広範な検出を可能にすることになるが、より成熟した、またはタンパク質分解処理されたＮＥＴを優先して表示し得ることを示している。

【0015】

本研究とは対照的に、ヒストン切断は、ＮＥＴ形成の異なる経路間を区別するとして最近報告された（Ｐｉｅｔｅｒｓｅｅｔａｌ．，２０１８，Ａｎｎａｌｓｏｆｔｈｅｒｈｅｕｍａｔｉｃｄｉｓｅａｓｅｓ７７，１７９０－１７９８）。サンドイッチＥＬＩＳＡアプローチを使用して、Ｐｉｅｔｅｒｓｅらは、一般的に、Ｎ末端ヒストン尾部が、ＮＯＸ依存性のＮＥＴ形成で除去されるが、ＮＯＸ非依存性のＮＥＴ形成では除去されないと結論を出した。彼らは、Ｈ２Ｂ、Ｈ３、およびＨ４に対して一連のＮ末端指向性抗体を使用し、全てのＨ３エピトープは、切断部位Ｈ３Ｒ４９にＮ末端を位置していた。しかしながら、最終的な生物学的試料試験において、著者らはＨ３を試験しなかった。興味深いことに、著者らは、免疫蛍光顕微鏡法により、全てのヒストンＮ末端抗体は、細胞溶解後の時点でＮＥＴを染色することができなかったことを観察した。

【0016】

本発明者らは、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）実験および組織学的試料からの固定した、または変性したヒト試料においてＮＥＴを検出した。
したがって、Ｈ３Ｒ４９でのヒストン切断は、真核生物において新規であり、および今までのところ記述されていない切断部位である。

【0017】

珍しいことに、切断部位Ｈ３Ｒ４９は、Ｈ３の非構造化尾部領域というよりもむしろ球状に位置している。
したがって、本発明は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分に関し、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0018】

本発明はまた、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体またはその抗原結合部分も対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0019】

本発明の好ましい実施形態は、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0020】

本発明の他の好ましい実施形態は、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分をコードする一つ以上の核酸分子を含む、核酸組成物を対象とする。

【0021】

本発明のより好ましい実施形態は、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分をコードする一つ以上の核酸分子を含む核酸組成物を対象とし、ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列を含む。

【0022】

本発明の更に好ましい実施形態は、上述の組換え核酸分子を含む宿主細胞を対象とする。
本発明の他の実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること。

【0023】

本発明の更なる実施形態は、上述の方法を提供し、ここで切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0024】

本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体を、上述の切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択される。

【0025】

本発明の他の好ましい実施形態は、上述の方法を提供し、ここで、自己免疫疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される。

【0026】

本発明の他の好ましい実施形態は、上述の方法を提供し、ここで切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0027】

本発明の更に好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離された断片を提供し、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、もしくはその断片からなる、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、もしくはその断片からなる。

【0028】

他の態様において、本発明は、上述のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分、および／または上述のヒトヒストンＨ３の断片、を含む疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択される。

【0029】

更なる態様において、本発明は、上述のキットを提供し、ここで、自己免疫疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される。

【0030】

特定の態様において、本発明は、好中球細胞外トラップの特異的検出のための、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９に位置するヒストンＨ３の切断部位の使用を提供する。
［本発明の説明］
本発明は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分に関し、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0031】

［定義］
「切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体」は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片のＲ４９から始まるＮ末端に位置するデノボ（ｄｅｎｏｖｏ）ヒストンＨ３エピトープに特異的に結合する抗体を指す。

【0032】

「Ｌ４８Ｒ４９」および「Ｈ３Ｒ４９」は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５を参照する場合、切断部位を示すために、本明細書において互いに交換可能で使用される。
ＳＥＱＩＤＮＯ２５は、最初のＭｅｔを有さないヒストンＨ３配列Ｑ７１ＤＩ３に対応する。したがって、ＳＥＱＩＤＮＯ２５における切断部位Ｌ４８Ｒ４９は、Ｑ７１ＤＩ３における、および他のＨ３変異体配列Ｐ０ＤＰＫ２、Ｑ６ＮＸＴ２、Ｑ１６６９５、Ｐ８４２４３、およびＰ６８４３１における切断部位Ｌ４９Ｒ５０に対応する（実施例９）。

【0033】

したがって、切断部位Ｌ４８Ｒ４９は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むヒストンＨ３の他の変異体またはホモログに存在する切断部位も指す。

【0034】

部位Ｌ４８Ｒ４９での切断自体は、ヒストンＨ３のＮ末端ドメインの近くで起こる。このことは２つの断片をもたらし、２つの断片の１つは、ヒストンＨ３の「Ｎ末端断片」と呼ばれる。もう１つのより大きな断片は、ヒストンＨ３の非構造化「Ｃ末端ドメイン」および主要な「らせん状ドメイン」で構成される。抗原エピトープは、このらせん状ドメインのＮ末端に位置され、本明細書においてヒストンＨ３の「Ｃ末端断片」とも呼ばれる。

【0035】

したがって、本発明はまた、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分に関し、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0036】

本発明はまた、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分も対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0037】

本発明はさらに、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0038】

したがって、本発明はまた、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分に関し、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、および
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0039】

【0040】

本発明の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、および
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0041】

本発明の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0042】

本発明の更により好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0043】

本発明の好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0044】

本発明の更に好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0045】

本発明の更により好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する単離された抗体、またはその抗原結合部分を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0046】

［核酸］
本発明の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子を含む、核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0047】

本発明の他の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子を含む、核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0048】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0049】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0050】

より好ましくは、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0051】

本発明の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0052】

本発明の他の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0053】

【0054】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択され；
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0055】

［宿主細胞］
本発明はまた、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードするための組換え核酸分子を含む宿主細胞を提供する。

【0056】

したがって、本発明の他の実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0057】

本発明の他の好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0058】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0059】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0060】

したがって、本発明の実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0061】

本発明の他の実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0062】

【0063】

本発明の他の更に好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、をコードする一つ以上の核酸分子、を含む核酸組成物を含む宿主細胞を対象とし、ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択され；
ここで、核酸組成物は、ＳＥＱＩＤＮＯ：９と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、およびＳＥＱＩＤＮＯ：１０と９０％を超える配列同一性を有する核酸配列、を含む。

【0064】

［ＮＥＴのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法］
本発明の他の実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0065】

本発明の更なる実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0066】

本発明の他の好ましい実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0067】

本発明の他のより好ましい実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0068】

いくつかの実施形態において、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、または抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。
したがって、本発明の他の実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、または抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0069】

本発明の更なる実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、または抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0070】

本発明の他の好ましい実施形態は、単離された生体試料中の好中球細胞外トラップのインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）検出のための方法を提供し、方法は以下を含む：
１）前記単離された生体試料を、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること、
２）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
３）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が、前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択され、
ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、または抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0071】

【0072】

生体試料は、好ましくは、細胞試料、混合細胞試料、細胞株試料、初代細胞試料、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、好中球試料、組織試料、組織学的組織試料、例えばパラフィンに包埋された組織試料または凍結保存組織試料など、から選択される。

【0073】

［ＮＥＴ形成と関連する疾患のインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）評価のための方法］
本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0074】

【0075】

したがって、本発明のより好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、生体試料は、細胞試料、混合細胞試料、細胞株試料、初代細胞試料、血液試料、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料、好中球試料、組織試料、組織学的組織試料、パラフィンに包埋された組織試料、または凍結保存組織試料、から選択される。

【0076】

本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0077】

本発明のより好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0078】

本発明の更により好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0079】

本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３。

【0080】

本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域。

【0081】

本発明のより好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0082】

本発明の更により好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0083】

本発明の好ましい実施形態は、個体における疾患状態をインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）で評価する方法を提供し：
ｉ）前記個体から得られた単離された生体試料を、上述の切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分と接触させること；
ｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な前記抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合することを可能にするために十分な条件を提供すること、
ｉｉｉ）切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分が前記単離された生体試料に結合するかどうかを決定すること、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、前記疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0084】

【0085】

【0086】

【0087】

本発明の他の好ましい実施形態は、上述の方法を提供し、ここで、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的な抗体、またはその抗原結合部分は、検出可能な標識に連結される。

【0088】

好ましくは、本明細書において使用される「検出可能な標識」は、蛍光分子、リン光分子、化学発光分子、生物発光分子、放射性同位体、発色団、を含む群から選択される。
Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３の断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）および切片（ｓｅｇｍｅｎｔ）。

【0089】

本発明者らは、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９でのヒストンＨ３の切断は、２つの主要な断片：ＳＥＱＩＤＮＯ２５のアミノ酸Ａ１～Ｌ４８を含むＨ３の「Ｎ末端断片」、およびＳＥＱＩＤＮＯ２５のアミノ酸Ｒ４９～Ａ１３５を含むＨ３の「Ｃ末端断片」を生成することを明らかにしている。

【0090】

さらに、Ｌ４８Ｒ４９で切断されたＨ３の「Ｎ末端断片」は、ＮＥＴ形成およびＮＥＴｏｓｉｓの間に、より小さな切片にさらに切断されることができ、ここで、前記切片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の２５のアミノ酸Ａ１～Ｌ４８の間のアミノ酸配列に含まれる。同様に、Ｌ４８Ｒ４９で切断されたＨ３の「Ｃ末端断片」は、ＮＥＴ形成およびＮＥＴｏｓｉｓの間に、より小さな切片にさらに切断されることができ、ここで、前記切片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のアミノ酸Ｒ４９～Ａ１３５の間のアミノ酸配列に含まれる。

【0091】

したがって、本明細書において使用されるヒストンＨ３の用語「断片」は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９での切断によって生成されたヒストンＨ３の断片を指す。前記断片は、Ｈ３の「Ｎ末端断片」またはＨ３の「Ｃ末端断片」である。

【0092】

本明細書において使用されるヒストンＨ３の用語「切片」は、ＮＥＴ形成またはＮＥＴｏｓｉｓ中に、Ｌ４８Ｒ４９での切断の前後におけるヒストンＨ３またはヒストンＨ３断片の更なる切断によって生成されたＨ３の切片を指す。

【0093】

したがって、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のアミノ酸Ａ１～Ｌ４８を含むＨ３の「Ｎ末端断片」、またはその切片、および／またはＳＥＱＩＤＮＯ２５のアミノ酸Ｒ４９～Ａ１３５を含むＨ３の「Ｃ末端断片」、またはその切片を対象とする。

【0094】

本明細書において開示されるヒストンＨ３の「Ｎ末端断片」、またはその切片は、好ましくは５～４８アミノ酸長、好ましくは１０～４８アミノ酸長、好ましくは１５～４８アミノ酸長、好ましくは２０～４８アミノ酸長、好ましくは２５～４８アミノ酸長、好ましくは３０～４８アミノ酸長、好ましくは３５～４８アミノ酸長、好ましくは５～３８アミノ酸長、好ましくは１０～３８アミノ酸長、好ましくは１５～３８アミノ酸長、好ましくは２０～３８アミノ酸長、好ましくは２５～３８アミノ酸長、好ましくは３０～３８アミノ酸長、好ましくは５～２８アミノ酸長、好ましくは１０～２８アミノ酸長、好ましくは１５～２８アミノ酸長、好ましくは２０～２８アミノ酸長、好ましくは２５～２８アミノ酸長、好ましくは５～１８アミノ酸長、好ましくは１０～１８アミノ酸長、好ましくは１５～１８アミノ酸長、好ましくは２～１０アミノ酸長、好ましくは５～１０アミノ酸長、である。

【0095】

本明細書において開示されるヒストンＨ３の「Ｃ末端断片」、またはその切片は、好ましくは５～８７アミノ酸長、好ましくは１０～８７アミノ酸長、好ましくは１５～８７アミノ酸長、好ましくは２０～８７アミノ酸長、好ましくは２５～８７アミノ酸長、好ましくは３０～８７アミノ酸長、好ましくは３５～８７アミノ酸長、好ましくは４５～８７アミノ酸長、好ましくは５５～８７アミノ酸長、好ましくは６５～８７アミノ酸長、好ましくは７５～８７アミノ酸長、好ましくは５～７０アミノ酸長、好ましくは１０～７０アミノ酸長、好ましくは１５～７０アミノ酸長、好ましくは２０～７０アミノ酸長、好ましくは２５～７０アミノ酸長、好ましくは３０～７０アミノ酸長、好ましくは３５～７０アミノ酸長、好ましくは４５～７０アミノ酸長、好ましくは５５～７０アミノ酸長、好ましくは６５～７０アミノ酸長、好ましくは５～６０アミノ酸長、好ましくは１０～６０アミノ酸長、好ましくは１５～８７アミノ酸長、好ましくは２０～６０アミノ酸長、好ましくは２５～６０アミノ酸長、好ましくは３０～６０アミノ酸長、好ましくは３５～６０アミノ酸長、好ましくは４５～６０アミノ酸長、好ましくは５５～６０アミノ酸長、好ましくは５～５０の間のアミノ酸長、好ましくは１０～５０アミノ酸長、好ましくは１５～５０アミノ酸長、好ましくは２０～５０アミノ酸長、好ましくは２５～５０アミノ酸長、好ましくは３０～５０アミノ酸長、好ましくは３５～５０アミノ酸長、好ましくは４０～５０アミノ酸長、好ましくは５～４０アミノ酸長、好ましくは１０～４０アミノ酸長、好ましくは１５～４０アミノ酸長、好ましくは２０～４０アミノ酸長、好ましくは２５～４０アミノ酸長、好ましくは３０～４０アミノ酸長、好ましくは３５～４０アミノ酸長、好ましくは５～３０アミノ酸長、好ましくは１０～３０アミノ酸長、好ましくは１５～３０アミノ酸長、好ましくは２０～３０アミノ酸長、好ましくは５～２０アミノ酸長、好ましくは１０～２０アミノ酸長である。

【0096】

したがって、本発明の好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離された断片を提供し、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその切片からなり、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその切片からなる。

【0097】

本明細書において使用される用語タンパク質またはその断片は、タンパク質の、またはその断片もしくは切片の「変異体」も含み、当技術分野で公知の方法によるアラインメントに対して、参照タンパク質または断片または切片と特定のアミノ酸配列同一性を共有するタンパク質または断片または切片を指す。タンパク質の、または断片の、またはその切片の変異体は、他のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフトまたは再配列を含むことができる。いくつかの実施形態において、変異体は、天然タンパク質と、またはその断片もしくは切片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を共有する。

【0098】

したがって、本発明のより好ましい実施形態は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の単離された断片を提供し、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３の断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその切片、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその切片からなり、ここで、ヒトヒストンＨ３の断片またはその切片は、ヒトヒストンＨ３の天然断片またはその切片と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を共有する。

【0099】

言い換えると、前記Ｎ末端断片および前記Ｃ末端断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５と少なくとも９０％の同一性を有する配列を含むヒストンＨ３の他の変異体または相同体に由来することもできる。注目すべきことに、ＳＥＱＩＤＮＯ２５は、最初のＭｅｔを有さないヒストンＨ３配列Ｑ７１ＤＩ３に相当する。

【0100】

ＮＥＴ形成と関連する疾患を評価するためのキット
他の態様において、本発明は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0101】

他の態様において、本発明は、切断されたヒストンＨ３のＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0102】

好ましくは、抗原結合断片は、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片、を含む群から選択される。

【0103】

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0104】

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0105】

更なる態様において、本発明は上述のキットを提供し、ここで、自己免疫疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される。

【0106】

したがって、本発明は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0107】

他の態様において、本発明は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0108】

【0109】

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0110】

他の態様において、本発明は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９で切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、抗体は以下を含む：
Ｉ）ＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：１のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む重鎖可変領域；および
ＩＩ）ＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：２のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含む軽鎖可変領域、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0111】

本発明の更なる実施形態は、ヒトヒストンＨ３における断片を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＲ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５のＡ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0112】

本発明の更に好ましい実施形態は、ヒトヒストンＨ３における断片を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＲ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５のＡ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0113】

本発明の他の実施形態は、ヒトヒストンＨ３における断片を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＲ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片またはその切片は、ヒトヒストンＨ３の天然断片またはその切片の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を共有し、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0114】

本発明の更に好ましい実施形態は、ヒトヒストンＨ３における断片を含む、疾患を評価するためのキットを提供し、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＲ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、またはＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）またはその断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）は、ヒトヒストンＨ３における天然断片（ｆｒａｇｍｅｎｔ）またはその断片（ｓｅｇｍｅｎｔ）の配列と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性を共有し、および
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0115】

更により好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分を含む、疾患を評価するためのキットを対象とし、ここで、疾患は、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択され、ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連しており、
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、または
ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0116】

更により好ましい実施形態は、切断されたヒストンＨ３におけるＣ末端断片に特異的に結合する抗体、またはその抗原結合部分、を含む、疾患を評価するためのキットを対象とし、ここで、疾患は、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される自己免疫疾患であり、および
ここで、抗体は以下を含む：
ａ）ＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：３のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ１；
ｂ）ＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：４のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ２；
ｃ）ＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：５のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＨ－ＣＤＲ３；
ｄ）ＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：６のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ１；
ｅ）ＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：７のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ２；
ｆ）ＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列、またはＳＥＱＩＤＮＯ：８のアミノ酸配列と９０％を超える配列同一性を有するアミノ酸配列、を含むＬ－ＣＤＲ３、
ここで、前記ヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片であり、ここで、部位Ｌ４８Ｒ４９で切断されたヒトヒストンＨ３における断片は、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ｒ４９～Ａ１３５の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、または
ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基Ａ１～Ｌ４８の間に含まれるアミノ酸配列、またはその断片からなり、
ここで、前記疾患はＮＥＴ形成と関連している。

【0117】

［ヒストンＨ３の切断部位の使用］
本発明の更に好ましい実施形態は、好中球細胞外トラップの特異的検出のための、ＳＥＱＩＤＮＯ２５のＬ４８Ｒ４９に位置されるヒストンＨ３の切断部位の使用を提供する。

【0118】

「抗体」（Ａｂｓ）および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗体および一般的に抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方を含む。用語「抗体」および「免疫グロブリン」は、最も広い意味において互いに交換可能で使用され、モノクローナル抗体（例えば、全長または無傷のモノクローナル抗体など）、ポリクローナル抗体、ヒト抗体、多重特異性（またはヘテロ複合体）抗体（例えば、二重特異性抗体など）、一価抗体、多価抗体、抗原結合抗体断片、例えば、エピトープ結合領域を含む単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、可変ドメイン（Ｆｖ）断片、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆ（ａｂ）２断片、ペプチド、またはタンパク質分解断片など、Ｆｖ断片、ｓｄＡｂ、ＶＨＨ、抗体融合体（ｆｕｓｉｏｎｓ）、および合成抗体（または抗体模倣体）、を含む。抗体は、キメラ、ヒト、ヒト化、および／または親和性成熟であることができる。

【0119】

本明細書において使用される用語「抗原」は、免疫応答を誘発することができる任意の物質として定義される。
本明細書において使用される用語「免疫原性」は、免疫原、抗原、またはワクチンの免疫応答を刺激する能力を指す。

【0120】

本明細書において使用される用語「エピトープ」は、抗体の、またはＴ細胞受容体の抗原結合部位と接触する抗原分子の部分として定義される。
本明細書において使用される用語「特異的結合」または「特異的に結合する（ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｂｉｎｄｉｎｇ）」または「特異的に結合する（ｂｉｎｄｓｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ）」は、結合対（例えば、抗体および抗原など）間の相互作用を指す。

【0121】

「完全長抗体」、「無傷抗体」または「全抗体」は、本明細書において互いに交換可能に使用され、天然の抗体構造に実質的に同様の構造を有する抗体を指す。
「抗体の抗原結合部分」は、完全長抗体として同じ抗原を結合することができる完全長抗体の部分を指す。抗体断片の例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、二重特異性抗体、線状抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ、など）、単一ドメイン抗体、抗体断片から形成される多重特異性抗体、を含むが、限定されない。

【0122】

抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」は、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（ＶＨおよびＶＬ、それぞれ）は、一般的に類似の構造を有する。単一のＶＨまたはＶＬドメインは、抗原結合特異性を与えるのに十分であり得る。

【0123】

用語「可変」は、可変ドメインの特定の部分が、抗体間で配列において広く異なり、特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性において使用されるという事実を指す。しかしながら、可変性は、軽鎖可変ドメインおよび重鎖可変ドメインの両方において、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる３つの断片に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然の重鎖および軽鎖における可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、主にベータシート構造を採用し、３つのＣＤＲによって接続され、それらはループを形成してベータシート構造を接続し、場合によってはベータシート構造の一部を形成する。各鎖においてＣＤＲは、ＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、もう一方の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔｅｔａｌ．，ＳｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆＰｒｏｔｅｉｎｓｏｆＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｔｅｒｅｓｔ，第５版、国立衛生研究所、ベセスダ、メリーランド州（１９９１））。定常ドメインは、抗原に抗体を結合することにおいて直接関与していないが、さまざまなエフェクター機能、例えば、抗体の抗体依存性細胞毒性への関与など、を示す。

【0124】

本明細書において使用される「超可変領域」または「ＨＶＲ」は、配列において超可変であり、および／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの各領域を指す。一般に、天然の抗体は、６個のＨＶＲ：重鎖可変ドメイン、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３個、および軽鎖可変ドメイン、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３個、を有する４本の鎖を含む。単一ドメイン抗体は、重鎖可変ドメインに３個のＨＶＲのみを含む。ＨＶＲは、一般的に、超可変ループからのアミノ酸残基および／または「相補性決定領域」（ＣＤＲ）からのアミノ酸残基を含む。別段の指示がない限り、可変ドメインにおいてＨＶＲ残基および他の残基（例えば、ＦＲ残基など）は、本明細書においてＫａｂａｔら、１９９１に従って番号付けされる。

【0125】

本明細書において使用される「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」は、最も高い配列可変性を有する、および／または抗原認識に関与する、可変ドメインの超可変領域内の領域を指す。一般に、天然の抗体は、６個のＣＤＲ：重鎖可変ドメイン、ＶＨ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）に３個、および軽鎖可変ドメイン、ＶＬ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）に３個、を有する４本の鎖を含む。例示的なＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２、およびＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２のアミノ酸残基５０～５６、Ｌ３のアミノ酸残基８９～９７、Ｈ１のアミノ酸残基３１～３５、Ｈ２のアミノ酸残基５０～６５、およびＨ３のアミノ酸残基９５～１０２に存在する（Ｋａｂａｔら、１９９１）。

【0126】

「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４個のＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）に続く配列で現れる：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４。

【0127】

「天然の抗体」は、天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然のＩｇＧ抗体は、約１５０ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２本の同一の軽鎖および２本の同一の重鎖で構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、各重鎖は、可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）を有し、その後に３個の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）が続く。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各軽鎖は、可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）を有し、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメインが続く。抗体の軽鎖は、当該定常ドメインにおけるアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）とラムダ（λ）と呼ばれる２つの型の一つに割り当てられてもよい。

【0128】

本明細書において使用される「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能性のある変異抗体（例えば、変異抗体は、自然に発生する、またはモノクローナル抗体の生産中に発生する変異を含み、一般的に少量で存在する）を除いて、同一である、および／または同じエピトープに結合する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、抗原における単一の決定基に対するものである。したがって、用語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるような抗体の性質を示し、任意の特定の方法による抗体の生産を必要とするとして解釈されるべきではない。

【0129】

「キメラ抗体」とは、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の供給源または種に由来し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りの部分が異なる供給源または種に由来する、抗体を指す。

【0130】

「ヒト化抗体」とは、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸配列およびヒトＦＲ由来のアミノ酸配列を含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態において、ヒト化抗体は、実質的に単一ドメイン抗体を含み、単一ドメイン抗体において、ＣＤＲの全て、または実質的に全てが非ヒト抗体のＣＤＲに対応し、ＦＲの全て、または実質的に全てがヒト抗体のＦＲに対応する。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでもよい。抗体の「ヒト化形態」、例えば、非ヒト抗体などは、ヒト化を受けている抗体を指す。

【0131】

「ヒト抗体」とは、ヒトもしくはヒト細胞によって生産される抗体、またはヒト抗体レパートリーもしくは他のヒト抗体コード化配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体、のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する抗体を指す。ヒト抗体におけるこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特に除外する。

【0132】

「Ｆｃ領域」または「Ｆｃ抗体断片」とは、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む二量体複合体を指し、ここで、Ｃ末端ポリペプチド配列は、無傷の抗体のパパイン消化によって得られるものである。Ｆｃ領域は、天然または変異Ｆｃ配列を含み得る。

【0133】

「Ｆａｂ断片」は、軽鎖の可変ドメインおよび定常ドメイン、並びに重鎖の可変ドメインおよび第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。抗体のパパイン消化は、２つの同一の「Ｆａｂ」断片を生成し、それぞれは単一の抗原結合部位、および残りの「Ｆｃ」断片を有し、その名前は、容易に結晶化する当該能力を反映する。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、さらに交差結合することができるＦ（ａｂ’）２断片を生み出す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインにおけるカルボキシ末端にいくつかの残基を加えることによってＦａｂ断片と異なる。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、Ｆ（ａｂ’）２抗体断片の間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として本来は生産された。抗体断片における他の化学結合も当技術分野で知られている。

【0134】

「Ｆｖ断片」とは、完全な抗原認識および結合部位を含む抗体断片を指す。この領域は、堅く結合した１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、例えば、ｓｃＦｖなどにおいて、１つの重鎖可変ドメインおよび１つの軽鎖可変ドメインは、本質的に共有結合されることができる。この配置において、各可変ドメインの３つのＨＶＲは、相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面における抗原結合部位を定義する。

【0135】

集合的に、６つのＨＶＲまたはそのサブセットは、抗体に対して抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）でさえも、通常は結合部位全体よりも低い親和性ではあるけれども、抗原を認識し、結合する能力を有する。

【0136】

「単鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」は、抗体のＶＨドメインおよびＶＬドメインを含む抗体断片を指し、ここで、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが所望の抗原結合構造を形成することができるようにＶＨドメインとＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含む。

【0137】

「単離された」抗体、またはタンパク質、またはタンパク質断片は、自然環境の成分から同定され、分離され、および／または回収されているものである。当該自然環境における汚染成分は、抗体、またはタンパク質、またはタンパク質断片についての研究、診断、または治療的使用を妨げることになる物質であり、並びに酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質を含み得る。通常、単離された抗体またはタンパク質またはタンパク質断片は、少なくとも１つの精製ステップによって調製されることになる。

【0138】

「配列同一性」の割合は、参照配列の全長についての「比較ウィンドウ」にわたって、２つの最適に配列された核酸配列またはポリペプチド配列を比較することによって決定される。本明細書で使用される「比較ウィンドウ」とは、２つの配列が最適に配列された後の、参照配列と変異配列との間の最適な配列を指し、ここで、比較ウィンドウ内の変異核酸またはポリペプチド配列は、最適な配列の用の参照配列（参照配列は付加または欠失を含まない）と比較して、２０パーセント以下、通常は５パーセントから１５パーセント、または１０パーセントから１２パーセントの付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。同一性割合は、両方の配列において、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定し、一致した位置の数を得て、一致した位置の数を参照配列（すなわち、アミノ酸またはヌクレオチドの全長）内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けることによって算出され、配列同一性の割合を得る。２つの核酸、またはタンパク質、またはペプチド、またはポリペプチド配列は、上述のように最適に配列した場合に２つの配列内のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が同じであるなら、「同一」であると言われる。「配列同一性」の割合を、ＮＣＢＩＷｅｂサイトで入手可能な「ＢＬＡＳＴ２Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」ツールを用いてｂｌａｓｔｐを利用して、上記に定義された比較ウィンドウで決定することができる。（ＴａｔｕｓｏｖａＡ．ｅｔａｌ．，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌＬｅｔｔ．１９９９，１７４：２４７－２５０）。

【0139】

代替方法として、変異配列は、以下の式に従って、親配列における任意の数の位置で許容される置換から生じる任意のアミノ酸配列であってもよい：
Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、およびＡｓｎによって置換されるＳｅｒ；
Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｉｎ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕの一つによって置換されるＡｒｇ；
Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ、およびＶａｌの一つによって置換されるＬｅｕ；
Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、およびＴｈｒの一つによって置換されるＰｒｏ；
Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、およびＧｉｎの一つによって置換されるＴｈｒ；
Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ、およびＰｒｏの一つによって置換されるＡｌａ；
Ｖａｌ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、およびＬｅｕの一つによって置換されるＶａｌ；
Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、およびＳｅｒの一つによって置換されるＧｌｙ；
Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕの一つによって置換されるＩｌｅ；
Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｔｙｒ、ｌｉｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕの一つによって置換されるＰｈｅ；
Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、およびＬｅｕの一つによって置換されるＴｙｒ；
Ｈｉｓ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｇｉｎ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇの一つによって置換されるＨｉｓ；
Ｇｉｎ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｈｉｓ、Ｔｈｒ、およびＡｒｇの一つによって置換されるＧｌｎ；
Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｉｎ、およびＳｅｒの一つによって置換されるＡｓｎ；
Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇの一つによって置換されるＬｙｓ；
Ａｓｐ、Ｇｌｕ、およびＡｓｎの一つによって置換されるＡｓｐ；
Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、およびＡｒｇの一つによって置換されるＧｌｕ；
Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＴｙｒの一つによって置換されるＭｅｔ。

【0140】

親配列と比較して変異配列におけるアミノ酸欠失または置換の数は、好ましくは最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０個のアミノ酸である。

【0141】

本明細書において互いに交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡポリメラーゼもしくはＲＮＡポリメラーゼによって、または合成反応によってポリマーに組み込まれることができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチドなど、およびそれらの類似体を含んでもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの構築前または構築後に与えてもよい。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば、標識との結合などによって、合成後に更に修飾されてもよい。他の型の修飾は、例えば、「キャップ」、類似体を用いての一つ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合を用いての置換（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメートなど）、および荷電結合を用いての置換（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、ペンダント部分、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ－Ｌ－リジンなど）などを含む置換、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラレンなど）を用いての置換、キレート剤（例えば、金属、放射性金属、ホウ素、酸化金属など）を含む置換、アルキル化剤を含む置換、修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸など）を用いての置換などを含み、および未修飾形態のポリヌクレオチドを含む。更に、糖において通常存在するヒドロキシル基のいずれかは、追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製するために、例えば、ホスホネート基、ホスフェート基によって置換され、標準的な保護基によって保護され、または活性化されてもよく、または固体もしくは半固体支持体に結合させてもよい。５’末端および３’末端のＯＨを、リン酸化することができ、またはアミンを用いて、もしくは１個から２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分を用いて置換することができる。他のヒドロキシルを、標準的な保護基に誘導体化してもよい。

【0142】

本明細書において使用される「オリゴヌクレオチド」は、短い、一般に一本鎖の、一般に合成ポリヌクレオチドを指し、一般に、必ずしも長さが約２００ヌクレオチド未満ではない。用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は、相互排他的ではない。ポリヌクレオチドに関する上記の説明は、オリゴヌクレオチドに対して、等しく、および完全に適用可能である。

【0143】

本明細書において使用される用語「ベクター」は、結合している核酸に他の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことを意図している。ベクターの１つの型は「プラスミド」であり、プラスミドは、追加のＤＮＡ断片が連結される得る環状二本鎖ＤＮＡループを指す。他の型のベクターはファージベクターである。他の型のベクターは、ウイルスベクターであり、ここで、追加のＤＮＡ断片は、ウイルスゲノムに連結され得る。特定のベクターは、ベクターが導入された宿主細胞内で自己複製することができる。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれることができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、ベクターが動作可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。当該ベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」または「組換えベクター」）と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターは、しばしばプラスミドの形態である。本明細書において、プラスミドは、ベクターにおける最も一般的に使用される形態であるので、「プラスミド」および「ベクター」は互いに交換可能に使用され得る。

【0144】

核酸分子は、天然配列（すなわち、抗体または抗体の一部をコードする内因性配列）を含んでもよく、または当該配列の変異体を含んでもよい。
核酸変異体は、コードされた抗体の免疫反応性が参照の天然抗体と比べて実質的に異ならないように、一つ以上の置換、付加、欠失および／または挿入を含む。いくつかの実施形態において、核酸変異体は、親核酸配列に対して少なくとも約７０％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約８０％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約８５％の同一性、いくつかの実施形態において、少なくとも約９０％の同一性、およびいくつかの実施形態において、少なくとも約９５％の同一性を示し、ここで、配列同一性の割合は、上述のように決定される。これらの値は、限定することを意味するものではなく、列挙された割合間の増分は、本開示の一部として具体的に想定される。

【0145】

本開示における核酸分子を、化学合成、組換え法、またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して得ることができる。化学的ポリヌクレオチド合成の方法は、当技術分野でよく知られており、本明細書において詳細に記述される必要はない。当業者は、本明細書において提供される配列、および市販のＤＮＡ合成装置を使用して、所望のＤＮＡ配列を生成することができる。組換え法を使用してポリヌクレオチドを調製するために、本明細書において更に議論されるように、所望の配列を含むポリヌクレオチドを、適切なベクターに挿入することができ、次に、ベクターを、複製および増幅のための適切な宿主細胞に導入することができる。ポリヌクレオチドは、当技術分野で知られている任意の方法によって宿主細胞に挿入され得る。細胞は、直接取り込み、エンドサイトーシス、トランスフェクション、Ｆ－接合（ｍａｔｉｎｇ）またはエレクトロポレーションによって、外因性ポリヌクレオチドを導入することにより形質転換される。導入されると、外因性ポリヌクレオチドは、非組み込み型ベクター（プラスミドなど）として細胞内に維持されることができ、または宿主細胞ゲノムに組み込まれることができる。このように増幅されたポリヌクレオチドを、当技術分野でよく知られている方法によって宿主細胞から単離することができる。

【0146】

適切なクローニングベクターおよび発現ベクターは、様々な成分、例えば、プロモーター、エンハンサー、および他の転写調節配列などを含むことができる。ベクターは、抗体可変ドメインを異なるベクターへ続くクローニングすることを可能にするように構築されてもよい。適切なクローニングベクターは、標準的な技術に従って構築されてもよく、または当技術分野で利用可能な多数のクローニングベクターから選択されてもよい。選択されるクローニングベクターは、使用されることを目的とした宿主細胞に従って異なり得るが、有用なクローニングベクターは、一般に自己複製能力を有することになり、特定の制限エンドヌクレアーゼに対する単一の標的を有してもよく、および／またはベクターを含むクローンを選択することにおいて使用されることができるマーカー用の遺伝子を有してもよい。適切な例は、プラスミドおよび細菌ウイルス、例えば、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ブルースクリプト（Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ）（例えば、ｐＢＳＳＫ＋など）および当該誘導体、ｍｐ１８、ｍｐ１９、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、ＣｏｌＥ１、ｐＣＲ１、ＲＰ４、ファージＤＮＡなど、並びにシャトルベクター、例えば、ｐＳＡ３およびｐＡＴ２８など、を含む。これらの、および多くの他のクローニングベクターは、例えば、メルク社（Ｍｅｒｃｋ）、バイオラッド社（ＢｉｏＲａｄ）、ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）、およびインビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）など、の販売業者から入手可能である。

【0147】

さらに、本発明は、本明細書に開示される単一ドメイン抗体またはその変異体のいずれかをコードする核酸配列を含む発現ベクター、並びに当該発現ベクターを含む宿主細胞も想定する。発現ベクターは、エピソームとして、または染色体ＤＮＡの不可欠な部分として宿主細胞内において複製可能でなければならないことを暗示する。ベクター成分は、一般的に、以下の一つ以上を含み得るが、これらに限定されない：シグナル配列；複製起点；一つ以上のマーカー遺伝子；適切な転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、およびターミネーターなど）。発現（すなわち、翻訳）に関して、一つ以上の翻訳制御エレメント、例えば、リボソーム結合部位、翻訳開始部位、および終止コドンなども、通常、必要とされる。

【0148】

目的の核酸分子および／または核酸分子自体を含むベクターを、エレクトロポレーション、塩化カルシウム、塩化ルビジウム、リン酸カルシウム、ＤＥＡＥ－デキストラン、または他の物質を使用するトランスフェクション；マイクロプロジェクタイル衝撃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）；リポフェクション；および感染（例えば、ベクターが感染性因子、例えば、ワクシニアウイルスなどである場合）を含む、多数の適切な方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。特定の手順の選択は、しばしば、宿主細胞の特徴に依存することになる。

【0149】

本明細書において使用される用語「インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）」または「エクスビボ（ｅｘｖｉｖｏ）」は、人工環境、および人工環境内で起こる工程または反応、を指し、例えば試験管および細胞培養物を指すが、これらに限定されない。用語「インビボ（ｉｎｖｉｖｏ）」は、自然環境（例えば、動物または細胞）、および自然環境内で起こる工程または反応、を指す。

【0150】

本発明に関して「自己免疫疾患」は、個体自身の組織、または共分離、またはその発現、またはそこから生じる状態、に起因する、および向けられた疾患（ｄｉｓｅａｓｅ）または障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）である。このクラスの障害は、異なる種類の自己免疫疾患間および自己免疫疾患内で非常に多様であり、そのことは診断および効果的な治療を複雑にする。自己免疫疾患の原因も、ほとんど理解されておらず、そのことは、結果的に症状に主に焦点を合わせる治療過程をもたらす。

【0151】

ＮＥＴ形成に関連する疾患は、好ましくは、血栓性疾患、神経疾患、細菌感染症、ウイルス感染症、真菌感染症、炎症性疾患、自己免疫疾患、癌疾患、癌転移疾患、を含む群から選択される。

【0152】

ＮＥＴ形成に関連する「自己免疫疾患」は、好ましくは、乾癬；血管炎；全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）；関節リウマチ；潰瘍性大腸炎；クローン病；免疫介在性または１型糖尿病；免疫介在性糸球体腎炎；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）；抗リン脂質抗体症候群；免疫性血小板減少症、を含む群から選択される。

【0153】

「全身性エリテマトーデス」（ＳＬＥ）は、複数の臓器に損傷を与え、慢性腎不全を誘発し、重篤な疾病率および死亡率を引き起こす可能性のある消耗性自己免疫疾患である。ＳＬＥの特性は、細胞残屑と免疫複合体を形成し、末端臓器障害を引き起こす抗核自己抗体の存在である。現在の治療計画は、非特異的免疫抑制および炎症性症状の管理に限定される。

【0154】

本明細書において使用される用語「ループス」は、結合組織を攻撃する抗体が一般的に関与する自己免疫疾患または自己免疫障害である。ループスの主な形態は、全身性形態、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）であり、皮膚ＳＬＥおよび亜急性皮膚ＳＬＥを含み、並びに、腎炎、腎外性の（ｅｘｔｒａｒｅｎａｌ）、脳炎、小児、腎外性の（ｎｏｎ－ｒｅｎａｌ）、円板状の、および脱毛症を含む他の型のループスである。特定の実施形態において、用語「全身性エリテマトーデス」とは、皮膚病変、関節痛、および腫れ、腎臓病（ループス腎炎）、心臓および／または肺の周囲の液体、および心臓の炎症、および様々な他の全身状態を結果的にもたらし得る慢性自己免疫疾患を指す。特定の実施形態において、用語「ループス腎炎」とは、ＳＬＥ患者に生じる腎臓の炎症を指す。ループス腎炎は、例えば、糸球体腎炎および／または間質性腎炎などを含んでもよく、高血圧、タンパク尿、および腎不全を引き起こす可能性がある。ループス腎炎のクラスは、クラスＩ（微小メサンギウムループス腎炎）、クラスＩＩ（メサンギウム増殖性ループス腎炎）、クラス１ＩＩ（限局性ループス腎炎）、クラスＩＶ（びまん性部分的（ＩＶ－Ｓ）またはびまん性全体的（ＩＶ－Ｇ）ループス腎炎、クラスＶ（膜性ループス腎炎）、およびクラスＶＩ（進行性硬化性ループス腎炎）、を含む。

【0155】

「癌」および「癌性」とは、典型的に、細胞増殖性疾患によって特徴付けられる哺乳類の生理学的状態を指す、または説明する。癌は、一般的に、癌腫、リンパ腫（例えば、ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫）、芽細胞腫、肉腫、および白血病を含み得るが、これらに限定されない。癌のより具体的な例は、扁平上皮癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌、腹膜癌、肝細胞癌、消化管癌、膵臓癌、神経膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝細胞癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、乳癌、結腸癌、大腸癌、子宮内膜癌または子宮癌、唾液腺癌、腎臓癌、肝臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌（ｈｅｐａｔｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ）、白血病、および他のリンパ増殖性疾患、および様々な種類の頭頸部癌、を含み得る。

【0156】

本明細書において使用される用語「個体」、「対象」、および「患者」とは、本明細書において互いに交換可能で使用され、ヒトおよび非ヒト動物の両方を指す。本開示の用語「非ヒト動物」とは、全ての脊椎動物、例えば哺乳類および非哺乳類、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ニワトリ、両生類、爬虫類などを含む。好ましくは、対象は、自己免疫疾患に罹っているヒト患者、または自己免疫疾患を患っているヒト患者である。
［図面の説明］

【図面の簡単な説明】

【0157】

【図1】図１は、ＰＭＡ誘導ヒストンＨ３切断が、Ｎ末端ドメインで起こり、セリンプロテアーゼ阻害によって阻止されることを示す。（Ａ）図に示されるように、好中球を、微小遠心管内でセリンプロテアーゼ阻害剤ＡＥＢＳＦと共に３０分間プレインキュベートし、その後、ＰＭＡを用いて刺激した。溶解物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分離し、Ｈ３に対するＮ末端抗体およびＣ末端抗体を用いてイムノブロットした。ＧＡＰＤＨを、ローディング対照として使用した。データは、セリンプロテアーゼが特定のアミノ酸でＨ３のＮ末端を切断することを示す。（Ｂ）ＮＥＴ形成の免疫蛍光共焦点顕微鏡検査を示す。図に示されるように、好中球をカバースリップ上に播種し、ＡＥＢＳＦと共にプレインキュベートし、その後、ＰＭＡ（５０ｎＭ）を用いて刺激した。１５０分で細胞を固定し、ＤＡＰＩ（４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール）を使用して、好中球エラスターゼ（ＮＥ）、クロマチン（Ｈ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＤＮＡ抗体ＰＬ２．３を使用する）、およびＤＮＡ、を染色した。ＮＳ：無刺激。画像を６３×で撮影し、スケールバーは、２０μｍである。

【図2A】図２は、ＮＥＴ形成におけるヒストンＨ３切断部位の同定を示す。Ａ）ＮＥＴからの酸抽出ヒストンにおける代表的なＲＰ－ＨＰＬＣクロマトグラム、並びにＨ３およびＨ４含有画分を同定するための対応する１Ｄ－ＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロットを示す。ヒストン豊富な上清を、ＰＭＡを用いて９０分間刺激された好中球から調製した。（Ｂ）２Ｄ電気泳動によって分離された、プールＨ３画分の代表的なクマシー染色ブロットを示す。差し込み図は、質量分析法によりヒストンＨ３として同定された全てのスポット（１～５）の拡大である。

【図2B】（Ｃ）Ｈ３の直鎖配列およびヌクレオソームコンテクスト（ｃｏｎｔｅｘｔ）の両方における切断されたＨ３産物における切断部位の略図を示す。Ｈ３を青で表し、およびピンクの尾部領域および部分的なアルファヘリックスは、除去されるＨ３の部分を表す。ヌクレオソーム構造は、ＰＤＢ２Ｆ８Ｎから適用される。構造は、Ｘ線結晶構造解析によって組み立てられ、および複数の種からのヒストンで構成される。Ｈ３変異体は、アフリカツメガエルのＨ３．２であるが、ヒトＨ３．２と１００％の同一性を有する。アフリカツメガエルおよびヒトに関してのタンパク質識別子は、それぞれＰ８４２３３およびＱ７１ＤＩ３である。

【図3A】図３は、３Ｄ９によって切断されたＨ３およびＮＥＴのスクリーニングおよび検出を示す。（Ａ）ＰＭＡを用いて刺激され、指示された時間で固定された好中球の免疫蛍光顕微鏡検査を示す。試料を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）（ＤＮＡ－青）および３Ｄ９（アレクサフルオロ（Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ－５６８）結合二次抗体－赤）を用いて染色した。ＮＳ：無刺激。画像を、２０×で、正立蛍光顕微鏡で撮影した。スケールバー－５０μｍ（フルフィールド）および１０μｍ（差し込み図）。

【図3B】（Ｂ）図に示された時間についてＰＭＡ（５０ｎＭ）を用いて刺激された好中球から調製された溶解物のイムノブロットを示す。Ｈ３Ｃ末端抗体を、全てのＨ３形態を検出するための対照として使用し、一方、単一のバンド（切断されたＨ３）は、新たに生成されたモノクローナル抗体である３Ｄ９によって検出された。（Ｃ）ＮＥＴ、クロマチン（Ａ５４９肺上皮細胞）、組換えヒストンＨ３、およびＤＮＡにおける切断されたＨ３の直接ＥＬＩＳＡを示す。試料を、それぞれ、ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）分析およびビシンコニン酸分析によって決定されたＤＮＡ含有量（ＮＥＴ、クロマチン、およびＤＮＡに関して）またはタンパク質含有量（組換えヒストンＨ３に関して）に従って、段階希釈し、高親和性ＥＬＩＳＡプレートに固定化した。開始濃度は、１μｇ／ｍｌＤＮＡまたはタンパク質であった。切断されたＨ３を、３Ｄ９（２μｇ／ｍｌ）およびＨＲＰ結合抗マウス二次抗体を使用して検出し、反応を、ＴＭＢ（３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン）を基質として使用して展開させた。データは、希釈２００ｎｇ／ｍｌについて示される。ＲＥＩＲＲは、ＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＳＥＱＩＤＮＯ２６によって形成される非結合分岐免疫ペプチド対照を示す。このペプチドを、２０ｎｇ／ｍｌで被覆した。データは、独立したドナーを使用した３回の実験の平均±ＳＤを表す。

【図3C】（Ｄ）ＥＬＩＳＡ、および続くインハウス（ｉｎｈｏｕｓｅ）イムノブロットおよび免疫蛍光顕微鏡スクリーニング戦略を示す。

【図3D】（Ｅ）競合ペプチドおよび対照ペプチドの存在下で、ＰＭＡを用いて３時間刺激され、３Ｄ９（１μｇ／ｍｌ）と共に染色された好中球の免疫蛍光顕微鏡を示す。染色前に、３Ｄ９を、示されたモル濃度比で免疫化分岐ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１１および１２）および陰性対照分岐ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１６および１７）と共に４℃で一晩プレインキュベートした。（Ｆ、Ｇ）好中球を、１０ｍｌのペトリ皿に播種し、ＰＭＡを用いて３時間刺激した。全細胞溶解および免疫沈降の前に、ＮＥＴを、抗体結合のために、ベンゾナーゼを用いて消化し、ヒストンおよび八量体を遊離させた。ライン１：ＩＳＯ、ライン２：３Ｄ９、ライン３：ビーズのみ；ＩＮＰ：インプット；Ｍ：マーカー。

【図3E】（Ｆ）３Ｄ９またはアイソタイプ対照によって免疫沈降されたタンパク質のクマシー染色ゲル、および対応する銀染色ゲルを示す。予測された切断Ｈ３バンドおよび無傷Ｈ３バンドを示す。ＨＣ－Ａｂ：抗体の重鎖、ＬＣ－Ａｂ：抗体の軽鎖。

【図3F】（Ｇ）３Ｄ９またはアイソタイプ対照抗体によって免疫沈降されたタンパク質における総Ｈ３（Ｃ末端抗体）および切断Ｈ３についてのイムノブロット、および並行して実行した試料におけるクマシー染色ゲルを示す。ゲルは３つの独立した実験の代表するものである。

【図4A】図４は、抗クロマチン抗体ＰＬ２．３対３Ｄ９を用いたＮＥＴ定量化の比較を示す。（Ａ）ＰＭＡを用いて刺激され（１８０分）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）および抗クロマチン抗体（ＰＬ２．３）または３Ｄ９を用いて染色された好中球の共焦点免疫蛍光顕微鏡の図を示す。差し込み図は、高倍率（６３×）で調べられ、グレースケールの分割チャネルとして表示される、または全視野により統合される（２０×倍率）、選択された細胞を表す。白色スケールバー－５０μｍ、シアンスケールバー－１０μｍ。画像は、３つの実験の代表である。

【図4B】（Ｂ）ＰＭＡ刺激細胞のＰＬ２．３染色と３Ｄ９染色における経時的（６時間）な蛍光分布の比較を示す。染色強度は、それぞれの時間経過の全ての画像にわたって正規化された。ＮＳ：３６０：３６０分で無刺激。分析を、３つ～４つの独立した時間経過実験の代表するものである１つのデータセットに対して行う。

【図4C】（Ｃ）クロマチン抗体（ＰＬ２．３）および切断Ｈ３抗体（または３Ｄ９）に関して、手動または自動のしきい値処理およびセグメンテーション手順を使用したＮＥＴ定量化の比較を示す。手動しきい値処理は、弱い信号を有する細胞／ＮＥＴを除外し、一方、自動しきい値処理は、信号に関係なく全ての対象を含む。分析用の画像を、蛍光顕微鏡を用いて撮影した。グラフは、平均±標準偏差を表し、ここでｎ＝３～４である。

【図5】図５は、様々な刺激からのＮＥＴにおける３Ｄ９による検出を示す。未刺激のまま置かれた好中球（ＮＳ）、ＰＭＡ（５０ｎＭ、２．５時間）を用いて刺激された好中球、二ゲリシン（１５μＭ、２．５時間）を用いて刺激された好中球、ＴＮＦ感作され、その後、ヘム（２０μＭ、６時間）を用いて刺激された好中球、カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）菌糸（ＭＯＩ５）を用いて４時間共培養された好中球、の免疫蛍光顕微鏡検査の図を示す。試料を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗－好中球エラスターゼ（ＮＥ）、および３Ｄ９を用いて染色した。スケールバー－５０μｍ。画像は、共焦点顕微鏡で２０×で撮影され、独立したドナーを用いての３回の実験の代表である。スケールバー－２０μｍ。

【図6】図６は、混合細胞画分におけるＮＥＴの検出を示す。ＮＥＴ刺激、ＰＭＡ（５０ｎＭ、２．５時間）または二ゲリシン（１５μＭ、２．５時間）を用いて処理され、その後、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗－好中球エラスターゼ（ＮＥ）および３Ｄ９またはＰＬ２．３を用いて染色された未精製の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）画分の免疫蛍光顕微鏡検査の図を示す。画像を、正立蛍光顕微鏡で２０×倍率で撮影し、選択された画像は、３つの独立した実験の代表である。スケールバー－５０μｍ。

【図7A】図７は、アポトーシス、ネクロプトーシス、および壊死性細胞死刺激に応答した３Ｄ９検出の比較を示す。Ａ）様々な細胞死刺激を用いて刺激され、続いてヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗好中球エラスターゼ（ＮＥ）および３Ｄ９を用いて染色された好中球の共焦点免疫蛍光顕微鏡の図を示す。ＮＥＴは、ＰＭＡ（１００ｎＭ、３時間）を用いて誘導された。一晩刺激無しで２４時間インキュベートすることにより、休止している好中球においてアポトーシスを誘導した。好中球は、カスパーゼ阻害剤Ｚ－ＶＡＤ－ＦＭＫ（５０μＭ）プラスＳＭＡＣ模倣物（１００ｎＭ）プラスＴＮＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて、６時間刺激され、ネクロプトーシスを誘導した。ネクローシスは、孔形成毒素α－溶血素（２５μｇ／ｍｌ）を用いて誘発された。画像を、２０×で撮影し、３つの実験の代表である。スケールバー２０μｍ。ｎｓ：無刺激。

【図7B】Ｂ）比較を、クロマチン抗体ＰＬ２３を用いて染色された並行試料で行った。ｎｓ：無刺激。

【図8A】図８は、ヒト組織において切り取られたヒストン３およびＮＥＴの検出を示す。パラフィン包埋された切片を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗ＮＥ、および３Ｄ９、またはＨ３ｃｉｔ抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡によって検査した。スケールバー－１０μｍ（Ａ）炎症を起こしたヒト扁桃腺（Ｂ＆Ｃ）炎症を起こしたヒト腎臓。

【図8B】図８は、ヒト組織において切り取られたヒストン３およびＮＥＴの検出を示す。パラフィン包埋された切片を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗ＮＥ、および３Ｄ９、またはＨ３ｃｉｔ抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡によって検査した。スケールバー－１０μｍ（Ａ）炎症を起こしたヒト扁桃腺（Ｂ＆Ｃ）炎症を起こしたヒト腎臓。

【図9】図９は、胆嚢における切り取られたＨ３、Ｈ３ｃｉｔ、およびＨ２Ｂ染色の比較を示す。パラフィン包埋された切片を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗ＮＥおよびヒストン抗体３Ｄ９、Ｈ３ｃｉｔおよびＨ２Ｂを用いて染色し、共焦点顕微鏡によって検査した。スケールバー－２０μｍ。

【図10】図１０は、虫垂において切り取られたＨ３、Ｈ３ｃｉｔ、およびＨ２Ｂ染色の比較を示す。パラフィン包埋された切片を、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、抗ＮＥ、および３Ｄ９またはＨ３ｃｉｔ抗体を用いて染色し、共焦点顕微鏡によって検査した。スケールバー－２０μｍ。

【発明を実施するための形態】

【0158】

以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を明示するために含まれる。以下の実施例において開示される技術は、発明者によって、本発明の実施において良好に機能することを発見された技術を表し、従って、当該実施のための好ましい様式を構成すると考えることができることが、当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、さらに同様の（ｌｉｋｅ）、または類似（ｓｉｍｉｌａｒ）の結果を得ることを理解すべきである。

【0159】

本発明の様々な態様における更なる修正および代替実施形態は、この明細書を考慮すると当業者にとって明らかとなるだろう。したがって、この明細書は、例示としてのみ解釈されるべきであり、本発明を実行する一般的な方法を当業者に教示することを目的としている。本明細書に示され、および記述された本発明の形態は、実施形態の例として解釈されるべきであることを理解すべきである。要素および材料は、本明細書に説明され、記述されるものと置き換えられてもよく、部分および工程を逆にしてもよく、本発明の特定の特徴を、全ては、本発明におけるこの明細書の利益を得た後に、当業者に明らかになるように、独立して利用してもよい。以下の特許請求の範囲に記述されている本発明の精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記述される要素に変更を加えてもよい。

【0160】

［実施例］
材料および方法
試薬
全ての試薬を、実験室用試薬の一般的な供給業者、例えば、特に明記しない限りシグマアルドリッチ社（ＳｉｇｍａＡｌｄｒｉｃｈ）またはＶＷＲドイツ社から購入した。

【0161】

採血および倫理審査による承認
静脈血を、ヘルシンキ宣言に従ってインフォームドコンセントを提供した健康なドナーから採取した。倫理審査による承認は、シャリテーベルリン医科大学（Ｃｈａｒｉｔｅ－ＵｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉｚｉｎＢｅｒｌｉｎ）の医療委員会によって提供され、血液は、シャリテーベルリン病院（ＣｈａｒｉｔｅＨｏｓｐｉｔａｌＢｅｒｌｉｎ）で、匿名で提供された。

【0162】

ヒト末梢血好中球の精製および培養
好中球を、Ａｍｕｌｉｃら（２０１７）の記述に従って単離した。簡潔に、静脈全血を、ＥＤＴＡ中に収集し、等量のヒストパーク（Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ）１１１９上に重層し、８００ｇ（２０分）で遠心分離することによって分離した。ピンク色がかった好中球豊富な画分を収集し、および３容量の洗浄緩衝液（０．５％［ｗ／ｖ］ヒト血清アルブミン［ＨＳＡ、グリフォルス社（Ｇｒｉｆｏｌｓ）］を補充されたＭｇ^２＋またはＣａ^２＋を含まないＰＢＳ［ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）］）の添加によって１回洗浄し、３００ｇ（１０分）で遠心分離した。好中球画分を、密度勾配遠心分離－パーコール（Ｐｅｒｃｏｌｌ）（ファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））、８５％～６５％（ｖ／ｖ）の勾配、によって更に精製した。精製細胞を、８０％～７０％画分から収集し、洗浄バッファーに再懸濁する前に１回洗浄した。ＣＡＳＹ細胞計数器を使用して細胞を計数した。

【0163】

全ての実験に関して、特に指示されない限り、好中球を、１０ｍＭヘペス（ＨＥＰＥＳ）および０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを補充され、ＣＯ_２条件で１時間予め平衡化されたＲＰＭＩ（ＧＩＢＣＯ３２４０４０１４）で培養した。いくつかの刺激に関して、図の凡例に示されるように、ＨＳＡ含有量を、０．０５％または０％ＨＳＡに減らした。特に指示されない限り、細胞を、３７℃、５％ＣＯ_２で日常的に培養した。全ての実験に関して、ＲＰＭＩで新たに希釈された１０×のワーキングストック溶液として、刺激を細胞反応に加えた。阻害実験に関して、１０×の阻害剤ストックおよび適切なビヒクル対照を、細胞に添加し、図の凡例に記載されている時間についてプレインキュベートした。

【0164】

好中球およびＮＥＴ溶解物の調製
タンパク質を分析するために、溶解物を、刺激された好中球、または休止している好中球から調製した。細胞を、１．５ｍｌ微小遠心管中の培地に、１×１０^７細胞／ｍｌで、時点当たり５×１０^６細胞で播種した。阻害剤またはアゴニストの添加後、細胞を穏やかに混合し、穏やかに回転しながら３７℃でインキュベートした。指定の時点で、プロテアーゼ阻害剤－１ｍＭＡＥＢＳＦ、２０μＭカテプシンＧ阻害剤Ｉ（カルバイオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ））、２０μＭ好中球エラスターゼ阻害剤ＧＷ３１１６１６Ａ（バイオモル（Ｂｉｏｍｏｌ））、２ＸＨａｌｔプロテアーゼ阻害剤カクテル（ＰＩＣ、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））、１０ｍＭＥＤＴＡ、２ｍＭＥＧＴＡ－を細胞懸濁液に直接添加した。細胞を穏やかに混合し、１０００ｇ（３０秒）で遠心分離し、全ての残留液体を収集した。沸騰した５Ｘサンプルローディングバッファー（５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌｐＨ６．８、２％［ｗ／ｖ］ＳＤＳ、１０％グリセロール、０．１％［ｗ／ｖ］ブロモフェノールブルー、１００ｍＭＤＴＴ）を試料に加え、その後、手短にボルテックスし、９８℃で１０分間煮沸し、液体窒素中で急速冷凍し、－８０℃で保存した。

【0165】

１ＤＳＤＳ－ＰＡＧＥおよびイムノブロット
ルーチンタンパク質分析に関して、試料を、１ＤＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、イムノブロットした。試料を氷上で解凍し、９８℃で煮沸し（１０分）、超音波処理して粘度を下げた（ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ソニケーター、１０秒、サイクル７、出力７０％）。タンパク質を、ＮｕＰＡＧＥ１２％ゲル（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、サーモフィッシャー社（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ））に適用し、ＭＥＳ緩衝液（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））中で、１５０Ｖで実行した。バイオラッド（ＢｉｏＲａｄ）湿式転写システム（緩衝液：２５ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１９２ｍＭグリシン、２０％メタノール、プロトコール：１００ｍＡで３０分、４００ｍＡで１２０分）を使用して、ＰＶＤＦ（０．２μｍ孔径、アマシャムＧＥヘルスケア社（ＡｍｅｒｓｈａｍＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ））にウェスタンブロットによってタンパク質を転写した。ブロッティング効率を、ポンソー（Ｐｏｎｃｅａｕ）Ｓ染色によって評価した。ブロットを、５％［ｗ／ｖ］スキムミルクを有するＴＢＳＴ（ＴＢＳｐＨ７．５、０．１％［ｖ／ｖ］ツイ―ン（Ｔｗｅｅｎ）－２０）で、１時間、ＲＴでブロックした。その後、ブロットを以下の一次抗体とともに、一晩、４℃で、または２時間室温でインキュベートした。ウサギ抗ヒストンＨ３Ｃ末端ｐＡｂ、１：１５０００（アクティブモティフ社（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）＃６１２７７）：ラット抗ヒストンＨ３Ｎ末端ｍＡｂ、１：１０００（アクティブモティフ社（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）＃６１６４７、ａａ１－１９）；ヒストンＨ４Ｃ末端、１：５０００（アブカム社（Ａｂｃａｍ）１０１５８－Ｃ末端にａａ５０）；ウサギ抗ヒストンＨ４Ｎ末端ｍＡｂ、１：３０，０００（アップステイト（Ｕｐｓｔａｔｅ）、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）＃０５－８５８、ａａ１７－２８）；ウサギＧＡＰＤＨｍＡｂ、１：５０００（セルシグナリングテクノロジー社（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、＃２１１８）；マウス３Ｄ９１ｕｇ／ｍｌ（この研究において生産された）は、全て３％（ｗ／ｖ）スキムミルクを有するＴＢＳＴで希釈された。ＴＢＳＴ（３×５分）を用いて洗浄後、以前の通り、ブロットを、１５分間ブロックし、その後、二次ＨＲＰ結合抗体（ジャックソンイムノリサーチ社（ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）－５％スキムミルクＴＢＳＴで１：２００００に希釈された）を用いて１時間、室温でプローブした。ブロットを、ＴＢＳＴ（３×５分）で洗浄し、スーパーシグナル（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ）（商標）ＷｅｓｔＤｕｒａＥｘｔｅｎｄｅｄＤｕｒａｔｉｏｎＳｕｂｓｔｒａｔｅ（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））およびイメージクオントゲルイメージャー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔＧｅｌｉｍａｇｅｒ）（ＧＥヘルスケア社（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して現像した。

【0166】

インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）試料における免疫蛍光染色
精製細胞の免疫蛍光イメージングに関して、好中球／ＰＢＭＣを、ガラスカバースリップを含む２４ウェルディッシュに、１ウェルあたり１×１０^５細胞を用いて播種し、および３７℃で１時間インキュベートし、カバースリップに付着させた。この段階で、示されるように、阻害剤およびプライミング因子を含んだ。反応を、パラホルムアルデヒド（２％［ｗ／ｖ］）の添加によって、２０分間室温で、または４℃で一晩で、停止させた。固定後、細胞を洗浄し、以前に記述されるように染色した（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら２０１２）。簡潔に、全てのステップを、実験用パラフィルム上で緩衝液滴の上に逆さまのカバーガラスを浮かせることによって実行した。細胞を、ＰＢＳ、ｐＨ７．５、０．５％（ｖ／ｖ）トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００を用いて３分間、透過処理した。スクリーニングおよび定量実験のために、この透過化ステップを、１０分に延長した。試料を、ＰＢＳ、０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０を用いて洗浄し（３×５分）、ブロッキング緩衝液－ＰＢＳｐＨ７．５、０．０５％（ｖ／ｖ）ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、３％（ｖ／ｖ）正常ヤギ血清、３％（ｗ／ｖ）淡水魚ゼラチン、１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ－を用いて２０分間、室温でインキュベートし、その後、ブロッキングバッファーで希釈された一次抗体を用いてプローブし、および４℃で一晩インキュベートした。一次抗体：抗クロマチン（Ｈ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＤＮＡ複合体）マウスｍＡｂ、１μｇ／ｍｌ（ロスマン（Ｌｏｓｍａｎ）１９９２）；好中球エラスターゼ、ウサギｐＡｂ１：５００（カルバイオケムＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）；スクリーニング用マウス血清、１：１００；ハイブリドーマ上清、ニート（ｎｅａｔ）；３Ｄ９マウスｍＡｂ、１μｇ／ｍｌ。試料を、その後、以前の通り洗浄した。アレクサ（Ａｌｅｘａ）標識二次抗体（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、ブロッキング緩衝液で１／５００に希釈し、２時間、室温でインキュベートした。ＤＮＡを、ヘキスト（Ｈｏｅｓｃｈｔ）３３３４２（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、分子プローブ）１μｇ／ｍｌを用いて染色し、二次抗体ステップでインキュベートした。試料を、ＰＢＳ、続いて水で洗浄し、モウィオール（Ｍｏｗｉｏｌ）封入剤に封入した。

【0167】

好中球からのヒストン抽出
ヒストン豊富な画分を、Ｓｈｅｃｈｔｅｒらから改変された方法に従って、休止している好中球およびＮＥＴから調製した（Ｓｈｅｃｈｔｅｒ，Ｄ．，Ｄｏｒｍａｎｎ，Ｈ．Ｌ．，Ａｌｌｉｓ，Ｃ．Ｄ．，およびＨａｋｅ，Ｓ．Ｂ．（２００７）。ヒストンの抽出、精製および分析（Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｈｉｓｔｏｎｅｓ）．ＮａｔＰｒｏｔｏｃ２、１４４５－１４５７）。好中球（４～８×１０^７）を、１５ｍｌポリプロピレンチューブ中で１３ｍｌのＲＰＭＩ（ＨＳＡ無し）に再懸濁し、ローラー上で、３７℃で、ＰＭＡ５０ｎＭと共に９０分間インキュベートした。刺激後、１ｍＭＡＥＢＳＦを添加し、ＮＳＰによる更なる分解を阻害し、細胞を、氷上で１０分間冷却した。全ての続くステップを、氷上で、または可能な場合は４℃で実行した。細胞およびＮＥＴを、１０００ｇで、１０分間の遠心分離によりペレット状にした。試料を、氷冷した低張溶解緩衝液（１０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌｐＨ８．０、１ｍＭＫＣＬ、１．５ｍＭＭｇＣｌ_２、使用直前にプロテアーゼ阻害剤を補充された１ｍＭＤＴＴ－１ｍＭＡＥＢＳＦ、２０μＭＮＥｉ、２０μＭＣＧｉ、２ＸＰＩＣ、１０ｍＭＥＤＴＡ）中に、１ｍｌの緩衝液／５×１０^６細胞を使用して再懸濁した。その後、細胞を、回転装置上で、４℃で、３０分間インキュベートした後、無傷細胞の溶解およびせん断を助けるためにシリンジに通した。核およびＮＥＴを、１０，０００ｇで、１０分間、遠心分離によって収集し、上清を廃棄した。核を破壊するために、試料を、以前の通り、プロテアーゼ阻害剤を補充されたｄＨ_２Ｏ（１ｍｌ／１ｘ１０^７細胞）に再懸濁し、断続的にボルテックスしながら氷上で、５分間インキュベートした。ＮＰ４０（０．２％［ｖ／ｖ］）を、ＮＥＴの溶解および破壊を助けるために添加し、試料を短時間超音波処理した（１０秒、モード７、出力７０％）。ヒストンを抽出するために、Ｈ_２ＳＯ_４（０．４Ｎ）を、試料に加え、短時間ボルテックスした。その後、試料を、回転させながら２～３時間インキュベートした。試料を複数の１．５ｍｌ微小遠心管に等分し、１６，０００ｇで１０分間、遠心分離し、続いて上清を収集することによって、ヒストン豊富な画分を収集した。ヒストンにおける更なる処理を最小限に抑えるために、トリクロロ酢酸を３３％の最終濃度まで滴下し、その後、混合することにより、タンパク質を、一晩、直ちに沈殿させた。翌日、沈殿したタンパク質を、１６，０００ｇで、１０分間の遠心分離によりペレット状にした。上清を廃棄し、ワックス状ペレットを、０．２％（ｖ／ｖ）ＨＣｌを有する等量の氷冷アセトンを用いて１回洗浄し、氷冷アセトン単独で５回洗浄した。ペレットを、５分間空気乾燥させた後、１ｍＭのＡＥＢＳＦを加えた１ｍｌ（５×１０^６細胞当たり）のｄＨ_２Ｏを用いて再懸濁した。再懸濁するのは困難であるペレットに関して、混合物を、以前の通り、４℃で一晩激しく振とうし、試料を遠心分離して未溶解のタンパク質を除去した。各試料についてプール上清を凍結乾燥し、ヒストン分別まで－８０℃で保存した。

【0168】

ヒストンＨ３の精製
ヒストンを、以前に記述された方法に従ってＲＰ－ＨＰＬＣによって画分した。凍結乾燥後、試料を、３００μｌの緩衝液Ａ（５％アセトニトリル、０．１％トリフルオロ酢酸）に再懸濁し、１４，０００ｇで遠心分離し、粒子状物質を除去した。Ｓｃｈｅｃｈｔｅｒらの記述（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００７，２，１４４５－１４５７）に従って、１５０μｌの精製試料を、４０μｌの緩衝液Ａと混合した後、Ｃ１８カラム（＃２１８ＴＰ５３、グレイブバイダック（ＧｒａｖｅＶｙｄａｃ））に適用し、ＲＰ－ＨＰＬＣ（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）６２６ＬＣシステム，マサチューセッツ州，米国）にかけた。流量を１ｍｌ分^－１に設定し、３０分から５５分まで３０秒間隔で画分を収集した。全ての画分を凍結乾燥し、分析まで－８０℃で保存した。どの画分がＨ３および切断種を含むかを決定するために、各画分を、５０μｌのｄＨ_２Ｏに溶解し、および５μｌを、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにかけ、クマシーブルー染色を用いて染色し、またはＰＶＤＦに移し、すでに記述されているようにＨ３およびＨ４についてイムノブロットした。

【0169】

精製ヒストンにおける２Ｄ電気泳動（２－ＤＥ）
切断部位を決定するために、Ｈ３を含む画分をプールし、前述の改変された２－ＤＥ手順にかけた。簡潔に、プールされた画分を、９Ｍ尿素、７０ｍＭＤＴＴ、２％セルバライト（Ｓｅｒｖａｌｙｔｅ）２－４および２％チャップス（Ｃｈａｐｓ）で変性した。試料（３０μｌ）を、１．５ｍｍ厚の等電点電気泳動（ＩＥＦ）ゲルに適用し、短縮ＩＥＦプロトコルを使用した：長さ８ｃｍのＩＥＦチューブゲルに２０分１００Ｖ、２０分２００Ｖ、２０分４００Ｖ、１５分６００Ｖ、５分８００Ｖ、および３分１０００Ｖ（合計８３分、および５００Ｖ／ｈ）。２次元での分離を、６．５ｃｍ×８．５ｃｍ×１．５ｍｍのＳＤＳ－ＰＡＧＥゲルで行った。重複ゲル（Ｄｕｐｌｉｃａｔｅｇｅｌ）を調製した。１つは質量分析による同定のためのスポットの除去用にクマシーブリリアントブルーＲ２５０を用いて染色した。２つ目は、次の通りにＰＶＤＦに転写した。タンパク質を、１００ｍＭホウ酸塩のブロッティング緩衝液中で、セミドライブロッティング手順を用いて、ＰＶＤＦブロッティング膜（０．２μｍ）にブロットした。スポットを、クマシーブリリアントブルーＲ２５０によって染色し、Ｎ末端エドマン分解シーケンシング（プロテオームファクトリー（ＰｒｏｔｅｏｍｅＦａｃｔｏｒｙ）、ベルリン、ドイツ）によって分析した。

【0170】

抗体生成
免疫ペプチドおよびスクリーニングペプチドは次の通りである：免疫化用にＫＬＨに結合したＲＥＩＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ１１）およびＲＥＩＲＲＫＣ－ＮＨ_２（ＳＥＱＩＤＮＯ１２）によって形成される分岐ペプチド、ネガティブスクリーニング用にＡＡＲＫＳ（ＳＥＱＩＤＮＯ１３）およびＡＡＲＫＳＫＣ－ＮＨ_２（ＳＥＱＩＤＮＯ１４）によって形成される分岐ペプチド、検証用にＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＲＥＩＲＲＫＣ－ＮＨ_２（ＳＥＱＩＤＮＯ１５）によって形成される競合分岐ペプチド、並びに検証用にネガティブ対照として、ＴＧＧＶＫ（ＳＥＱＩＤＮＯ１６）およびＴＧＧＶＫＫ－ＮＨ_２（ＳＥＱＩＤＮＯ１７）によって形成される分岐ペプチド、ポジティブスクリーニングおよびイライザ（Ｅｌｉｓａ）用に、ＫＬＨに結合されないＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＲＥＩＲＲＫＣ－ＮＨ_２（ＳＥＱＩＤＮＯ２６）。分岐ペプチドにおいて、第一のペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１１、ＳＥＱＩＤＮＯ１３、またはＳＥＱＩＤＮＯ１６）は、５位のアミノ酸のカルボキシル末端と第二のペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１２、ＳＥＱＩＤＮＯ１４、ＳＥＱＩＤＮＯ１５、ＳＥＱＩＤＮＯ１７、またはＳＥＱＩＤＮＯ２６）の６位のリジンの側鎖アミンとの間のアミド結合を介して結合される。これらのペプチドを、ユーロジェネティック社（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ）（ベルギー）によって合成した。一部は、免疫化のためにキーリンパ球ヘモグルチニン（ＫｅｙＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅＨａｅｍｏｇｌｕｔｉｎｉｎ）（ＫＬＨ）に更に結合された。マウスの免疫化、予備的なＥＬＩＳＡスクリーニング、およびハイブリドーマの産生は、以下の通り、ジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって行われた。６匹のマウス（３ｘＢａｌｂ／ｃおよび３ｘＣ５７／ＢＬ６）を、分岐ペプチドを用いて免疫化した。マウスから採血し、直接ＥＬＩＳＡを使用して効果的な免疫化を評価した。ＥＬＩＳＡ、および続くインハウス（ｉｎｈｏｕｓｅ）イムノブロット、および免疫蛍光顕微鏡スクリーニング戦略の概要を図３Ｄに示す。効果的に免疫化された動物の選択に続いて、免疫原の更なる追加注射を、ハイブリドーマ産生のための脾臓細胞の単離前に行った。結果的に得られたハイブリドーマ上清を、同様にスクリーニングした。上清の大規模培養および抗体の精製は、ジェンスクリプト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）によって行われた。

【0171】

ＥＬＩＳＡ
ＮＥＴに対する３Ｄ９特異性を評価するために、３Ｄ９を、間接ＥＬＩＳＡに使用し、精製ＮＥＴ、クロマチン、組換えＨ３、およびＤＮＡにおいて切断されたＨ３を検出した。６ウェルディッシュに３×１０^６個の好中球を播種し、１００ｎＭＰＭＡとともに３～６時間インキュベートすることによってＮＥＴを調製した。ＮＥＴを等量のＰＢＳを用いて３回穏やかに洗浄した後、３００μｌのＰＢＳ中に集めた。凝集したＮＥＴを、短時間超音波処理（３秒、モード７、出力７０％－ブラウン（Ｂｒａｕｎ）ソニケーター）することによって破砕し、その後、瞬間凍結し、－８０℃で保存した。クロマチンを、Ｓｈｅｃｈｔｅｒら（Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．２００７，２，１４４５－１４５７）によって以前に記述されるように、肺上皮細胞（Ａ５４９）から調製した。最終的な核ペレットを、ｄＨ_２Ｏ中に再懸濁し、以前の通り超音波処理し、－８０℃で保存した。ＮＥＴおよびクロマチンにおけるＤＮＡ含有量は、製造者の指示（サーモフィッシャーサイエンティフィック社（ＴｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））に従って、ピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）分析によって評価した。１μｇ／ｍｌ（ＤＮＡ含有量）から開始して、ＮＥＴ、クロマチン、および仔ウシ胸腺ＤＮＡ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））における段階希釈物を、ｌｏ－ＤＮＡ結合エッペンドルフ微小遠心管内で調製した。組換えヒストンＨ３（ニューイングランドバイオラボズ社（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））の同様の希釈系列を、１μｇ／ｍｌタンパク質から開始して調製した。全ての希釈をＰＢＳで行った。各試料の１００マイクロリットルを、１μｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌの希釈で、ディプリケートで、ヌンクマキシソーブ（ＮｕｎｃＭａｘｉｓｏｒｂ）９６ウェルディッシュに分取し、４℃、２５０ｒｐｍで一晩固定化した。免疫ペプチド、ＲＥＩＲＲ（１０ｎｇ／ｍｌ）を、陽性対照として使用した。翌日、全てのウェルを、洗浄緩衝液（ＰＢＳ、０．０５％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）を用いて６回洗浄し、その後２００μｌのブロッキング溶液（洗浄緩衝液中に１％ＢＳＡ）を用いて２時間（室温）ブロッキングした。ウェルを、洗浄緩衝液を用いて１回洗浄し、および１００μｌの３Ｄ９（２μｇ／ｍｌ、ブロッキング溶液中）と共に室温（２時間）で穏やかに振とう（２５０ｒｐｍ）しながらインキュベートした。ウェルを、以前の通りに６回洗浄し、その後、ブロッキング溶液で１：１０，００００に希釈の１００μｌの二次ＨＲＰ結合抗マウス（ジャクソンラボラトリーズ社（Ｊａｃｋｓｏｎｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））と共にインキュベートし、以前の通りにインキュベートした。最後に、ウェルを、以前の通りに６回洗浄し、製造業者の指示に従って（１５～３０分間インキュベートする）、ＴＭＢ（３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン）試薬（ＢＤＯｐｔＥＩＡ（商標））を使用してＨＲＰ活性を検出した。分析を、１００μｌのＨ_２ＳＯ_４（０．１６Ｍ）の添加によって停止し、吸光度（４５０ｎｍ）を、９６ウェルプレートリーダー（ＶＥＲＳＡマックス（ｍａｘ）、モレキュラーデバイスズ社（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州、米国）で測定した。

【0172】

イメージＪおよびＲによる染色特性の定量化
ＮＥＴ形成中の抗体における染色特性を評価するために、発明者らは、イメージＪおよびＲスクリプトのバンドルを開発した。これらのスクリプトは、一連の実験（ＤＮＡ染色、抗体染色）の２チャンネル顕微鏡画像から始まり、個々の細胞におけるグラフィック表示および分類、並びに最終的にこれらの分類をグラフィックオーバーレイとして元の画像に戻ってマッピングするまでの自動化されたワークフローを可能にする。最初のステップにおいて、核は、サイズ選択の下限および上限に関してのオプションを含む、強度しきい値（プログラムの、または手動のいずれか）に基づいて断片化される。同じしきい値が実験シリーズ全体に適用され、およびサイズの上限は、個々の細胞に割り当てられることができない融合構造を除外するために使用される。品質スコアは、個々の細胞（またはＮＥＴ）に割り当てられることができるＤＮＡ染色領域全体の割合に基づいて、全ての画像に割り当てられる。このスコアは、分析における全ての他のパラメーターと共に、レポートファイルとしてエクスポートされ、分析から画像を自動的に除外するために使用されることができる。さらに、スクリプトのこの部分は、情報、例えば、プログラムで割り当てられることができる時点または刺激などと共に、全ての検出された核に対する各チャネルの面積、円周（Ｘ、Ｙ座標として）、および累積的強度を含む結果ファイルを生成する。これらのデータセットを分析するために、我々は、Ｒに一連の機能を実行した。これらの機能は、イメージ（Ｉｍａｇｅ）Ｊ結果ファイルのインポート、核領域および染色強度に基づく細胞の分類、様々なプロットおよびデータエクスポート機能、さらに色分けされた円周としての核の分類を、元の画像に重ねて表示することを可能にするマッピング機能も含む。

【0173】

イメージＪによるＮＥＴの定量化
ＮＥＴは、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎらによって記述された半自動方法によって（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，ｅｔａｌ．（２０１２）．インビトロＮＥＴ形成における自動定量化（ＡｕｔｏｍａｔｉｃｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｉｎｖｉｔｒｏＮＥＴｆｏｒｍａｔｉｏｎ）．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓｉｎｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ３，４１３）、および自動定量を可能にする第２の修正方法を介して定量化した。全ての顕微鏡画像データセットを、両方の方法によって処理し、比較を可能にする。ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）を使用して全ＤＮＡを染色し、およびＮＥＴを、前の節に従って、抗クロマチン（ＰＬ２．３）または３Ｄ９抗体（１μｇ／ｍｌ）、およびアレクサ（Ａｌｅｘａ）－５６８結合二次抗体を用いてさらに染色した。画像を、ジェノプティック（Ｊｅｎｏｐｔｉｃ）Ｂ／Ｗデジタル顕微鏡カメラおよび１０×または２０×対物レンズを備えているライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＲ正立蛍光顕微鏡を用いて取得した。各実験に関して、同じ露出設定を、全ての試料に使用し、および最低限の３つのランダムな視野（ＦＯＶ）を収集した。画像を、イメージ（ＩｍａｇｅＪ）／ＦＩＪＩソフトウェアを用いて分析した。Ｂｒｉｎｋｍａｎｎら、２０１２によって記述されるように、各チャンネルを、イメージシーケンスとしてインポートし、スタックに変換した。視野（ＦＯＶ）あたりの合計細胞／ＮＥＴをカウントするために、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）チャネルスタックをインポートし、半径１５およびパラメーター１を３５に設定した自動しきい値関数（Ｂｅｒｎｓｅｎ法）を使用して断片化し、黒および白のしきい値画像を生成した。その後、粒子分析を実行し、細胞核のサイズ以上のサイズの全ての対象物をカウントし（１０×対物レンズ：粒子サイズ２５～無限大；２０×対物レンズ：粒子サイズ１００～無限大）、およびバックグラウンド染色アーティファクトを除外した。その後、抗クロマチン（ＰＬ２．３）または３Ｄ９チャネルを使用して、総ＮＥＴを、適切にカウントした。上記の方法に関して、静止細胞核における強度の低い染色が除外されるように、手動で調整されたしきい値を使用して、抗クロマチン染色を、断片化した。その後、粒子分析を実行し、静止細胞核より大きい全ての対象物をカウントした（１０×対物レンズ：粒子サイズ７５～無限大；２０×対物レンズ：粒子サイズ２５０～無限大）。これを３Ｄ９についても実行した。第二の自動ＮＥＴ分析を、ワークフローが修正されたことを除いて、手動半自動分析として実行し、したがって、自動Ｂｅｒｎｓｅｎしきい値処理および断片化は、ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）チャネルおよびＮＥＴチャネルの両方、総細胞、およびＮＥＴ、それぞれに関して使用された。各方法に関して、ＦＯＶ当たりのＮＥＴの割合は、（ＦＯＶ当たりの総ＮＥＴ／ＦＯＶ当たりの総細胞）ｘ１００として算出された。その後、ＦＯＶ当たりの結果を、試料に従って平均化した。

【0174】

組織切片からの組織試料における免疫蛍光染色
パラフィン切片（２μｍ厚）を、１００％キシレンで５分ずつ、２回交換して脱パラフィン処理し、その後１００％エタノールで５分ずつ、続いて９０％および７０％エタノールで５分ずつ、２回交換して再水和した。切片を、脱イオン水を３回交換して洗浄し、およびＴＢＳ（トリス緩衝生理食塩水）中でインキュベートした。抗原回復のために、標的賦活化溶液（ＴａｒｇｅｔＲｅｔｒｉｅｖａｌＳｏｌｕｔｉｏｎ）（ＴＲＳｐＨ９）（ダコ社（Ｄａｋｏ）Ｓ２３６７）を使用して、スライドをスチームクッカー（ブラウン社Ｂｒａｕｎ）で、２０分間インキュベートした。抗原賦活化緩衝液中で室温まで冷却した後、スライドを脱イオン水で３回リンスし、更なる処理までＴＢＳ中でインキュベートした。スライドを、ブロッキング緩衝液（ＴＢＳ中に、１％ＢＳＡ、５％正常ロバ血清、５％冷水魚ゼラチン、および０．０５％ツィーン（Ｔｗｅｅｎ２０）を有する溶液、ｐＨ７．４）を用いて３０分間ブロッキングした。ブロッキング緩衝液を除去し、切片をブロッキング緩衝液（０．０５％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）－Ｘ１００を含む）中で適切に希釈した一次抗体と共に一晩、室温でインキュベートした。切片を、ＴＢＳでリンスし、その後、適切な濃度（１：１００）で二次抗体と共に、４５分間、暗所で、室温でインキュベートし、その後、ＴＢＳで５分間、３回リンスし、続いて脱イオン水を用いてリンスした。スライドを、ＤＮＡ染色ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）３３３４２（１：５０００）を用いて、５分間インキュベートし、水を用いてリンスした後、モウィオール（Ｍｏｗｉｏｌ）を用いて封入した。ＮＥＴの検出用の一次抗体は次の通りであった：マウス抗切断ヒストン３クローン３Ｄ９（２μｇ／ｍｌ）、ラット抗カルグラヌリンＡクローン８Ｈ６、インハウス（ｉｎ－ｈｏｕｓｅ）ＭＰＩＩＢ（１：１００）、ウサギ抗ヒストンＨ３抗体（シトルリンＲ２＋Ｒ８＋Ｒ１７；ａｂ５１０３、アブカム（Ａｂｃａｍ））、ウサギ抗ヒストンシトルリンＨ４抗体（シトルリン３）ミリポア０７－５９６（１：１００）ニワトリ抗ヒストンＨ２Ｂａｂ１３４２１１アブカム（Ａｂｃａｍ）（１：４００）、ウサギ抗フィブリノーゲンミリポアＡＢＴ２５９（１：２００）。二次抗体は、次の通りであった：ロバ抗ウサギ免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖および軽鎖（Ｈ＆Ｌ）アレクサフルオロ（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ）４８８（ジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）７１１－２２５－１５２）およびロバ抗マウスＩｇＧＨ＆ＬＣｙ３（ジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）７１５－１６５－１５１）。ロバ抗ニワトリＩｇＹＨ＆ＬＣｙ３（ジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ）７０３－１６５－１５５）、ロバ抗ラット免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）重鎖および軽鎖（Ｈ＆Ｌ）Ｃｙ５（ジャックソン（Ｊａｃｋｓｏｎ））。蛍光イメージングに関して、ジェノプティック（ＪＥＮＯＰＴＩＫ）Ｂ／Ｗデジタル顕微鏡カメラまたはライカ（Ｌｅｉｃａ）共焦点顕微鏡ＳＰ８を備えている正立広視野顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ）ＤＭＲ）を使用した。Ｚスタック画像を、６３ｘの倍率で収集した。ヒト扁桃腺および腎臓のパラフィン組織ブロックを、ＡＭＳｂｉｏ社から購入し、炎症組織－胆嚢および虫垂－のパラフィン切片は、Ｄｒ．ＳｔｅｆａｎＦｌｏｒｉａｎ、シャリテー（Ｃｈａｒｉｔｅ）ベルリン、から提供された。

【0175】

細胞毒性分析
阻害剤の毒性を評価するために、ＬＤＨ放出を、製造業者の指示に従って、サイトトックス（ＣｙｔｏＴｏｘ）９６（登録商標）非放射性細胞毒性分析（プロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ））を使用して、評価した。好中球を、６ウェルプレートのＲＰＭＩに１×１０^５細胞／１００μｌで播種した。阻害剤を、図に示された濃度で、細胞と共に３０分間、３７℃でプレインキュベートした。

【0176】

活性酸素種分析
活性酸素種（ＲＯＳ）生成を、Ａｍｕｌｉｃらによって記述されたルミノールＨＲＰ分析を使用して測定した（Ａｍｕｌｉｃ，Ｂ．，Ｋｎａｃｋｓｔｅｄｔ，Ｓ．Ｌ．，ＡｂｕＡｂｅｄ，Ｕ．，Ｄｅｉｇｅｎｄｅｓｃｈ，Ｎ．，Ｈａｒｂｏｒｔ，Ｃ．Ｊ．，Ｃａｆｆｒｅｙ，Ｂ．Ｅ．，Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｖ．，Ｈｅｐｐｎｅｒ，Ｆ．Ｌ．，Ｈｉｎｄｓ，Ｐ．Ｗ．，Ｚｙｃｈｌｉｎｓｋｙ，Ａ．（２０１７）。細胞周期タンパク質は好中球細胞外トラップの生成を制御する（Ｃｅｌｌ－ＣｙｃｌｅＰｒｏｔｅｉｎｓＣｏｎｔｒｏｌＰｒｏｄｕｃｔｉｏｎｏｆＮｅｕｔｒｏｐｈｉｌＥｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒＴｒａｐｓ）．ＤｅｖＣｅｌｌ４３，４４９－４６２ｅ４４５．）。さらに、分析の全ての段階は、大気条件で行われるので、正常組織培養培地は、以前の通り、炭酸塩を含み、フェノールレッド無添加のＲＰＭＩ（シーホース（Ｓｅａｈｏｒｓｅ）ＸＦＲＰＭＩ培地＃１０３３３６－１００、アジレント社（Ａｇｉｌｅｎｔ））に置き換えられた。阻害剤を、図に示された濃度で、細胞と共に３０分間、３７℃でプレインキュベートした。刺激の直前に、ルミノール（５０μＭ）およびＨＲＰ（１．２Ｕ／ｍｌ）を添加し、続いて５０ｎＭＰＭＡを添加した。発光測定を、発光プレートリーダー（ビクターライト（ＶＩＣＴＯＲＬｉｇｈｔ）発光カウンター、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））を使用して３０秒ごとに行い、相対的な光単位（ＲｅｌａｔｉｖｅＬｉｇｈｔＵｎｉｔｓ）（ＲＬＵ）として表した。

【0177】

質量分析法
タンパク質スポットを切除し、０．５ｍｌエッペンドルフチューブに移した。試料を、５０％アセトニトリル（ＡＣＮ）中に２００ｍＭ重炭酸アンモニウム（ＡＢＣ）を有する溶液の５００μｌ中で、３０分間、３７℃で脱色し、２００μｌの５０ｍＭＡＢＣ、５％ＡＣＮ中で、３０分間、３７℃で平衡化した。その後、試料を、室温で６０分間乾燥した。タンパク消化を、２５μｌの５０ｍＭＡＢＣ、５％ＡＣＮ中で１００ｎｇのトリプシンを用いて（スポット１、３、７は２００ｎｇ用いて）、３７℃で、一晩行った。上清を、新しいエッペンドルフチューブに移し、追加のペプチドを、６０％ＡＣＮ、０．５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を有する溶液を２５μｌ、１０分間適用し、続いて２５μｌの１００％ＡＣＮを１０分間適用することによって抽出した。全ての上清を合わせ、エッペンドルフ濃縮器で、４５℃で乾燥した。１５μｌの０．１％ＴＦＡ中で可溶化後、ペプチドを、ジップチップス（ＺｉｐＴｉｐｓ）を用いて脱塩し、１μｌのａ－シアノ－４－ヒドロキシ桂皮酸（６０％ＣＡＮ、０．３％ＴＦＡ中で５ｍｇ／ｍｌ）を用いてＭＡＬＤＩプレート上に溶出した。最も強度の高い５つのピークのペプチドマスフィンガープリント（ＰＭＦ）および断片スペクトル（ＭＳＭＳ）を、４７００プロテオミクス分析装置（ＰｒｏｔｅｏｍｉｃｓＡｎａｌｙｚｅｒ）（ＡＢサイエックス社（Ｓｃｉｅｘ））を使用して測定した。データベース検索を、ヒトタンパク質におけるスウィス－プロット（Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ）サブセットを検索するためのマスコット（Ｍａｓｃｏｔ）ＭＳ／ＭＳイオン検索機能を適用して行った。断片質量許容差に関して、３０ｐｐｍ、および±０．３Ｄａのペプチド質量許容差を可能にした。１つの欠落した切断（ｍｉｓｓｅｄｃｌｅａｖａｇｅ）、メチオニンの酸化、タンパク質のＮ末端アセチル化、システイン残基でのプロピオンアミド、およびＮ末端ピログルタミン酸の形成を、可変修飾として定義した。以下の同定基準を使用した：最低３０％の配列カバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）；または、最低１５％の配列カバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）、および１回のＭＳ／ＭＳ確認；また１５％未満の配列カバレージ（ｃｏｖｅｒａｇｅ）、および少なくとも２回のＭＳ／ＭＳ確認。

【0178】

切り取られた（ｃｌｉｐｐｅｄ）ヒストンにおける免疫沈降（ＩＰ）
磁性タンパク質Ｇ結合ビーズ（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を、等量のＰＢＳを用いて洗浄した（×３）。各ＩＰ試料に関して、２０μｌのビーズを調製した。３Ｄ９は、マウスＩｇＧ１であるので、架橋抗体（抗マウス、アクティブモティフ社（Ａｃｔｉｖｅｍｏｔｉｆ）＃５３０１７）を、タンパク質Ｇ結合ビーズへの結合を改善するために使用した。架橋抗体（５０μｇ）を、２０μｌの磁気ビーズと共に、１時間、４℃で、穏やかに反転させながらインキュベートした。ビーズを、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。その後、ビーズを５０μｇの３Ｄ９、またはアイソタイプ対照（ＩｇＧ１、ｋ－ジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）クローン１Ｈ７Ａ８）と共に、３時間、室温で（穏やかに回転させながら）インキュベートした。ビーズを３回洗浄し、１５ｍｌファルコンチューブ中の２ｍｌのＰＢＳに再懸濁した。抗体を永久に架橋するために、ＰＦＡ固定を使用した。２ｍｌの１％ＰＦＡ（ＰＢＳ中）を、ビーズに添加し、直ちに１分間ボルテックスした。その後、反応を、１２５ｍＭグリシン（ｐＨ８．０）を用いてクエンチし、氷上で５分間インキュベートした。その後、ビーズを、ＩＰ溶解緩衝液（２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００、ｐＨ７．５）を用いて５回洗浄し、ＩＰ溶解緩衝液中に１％ＢＳＡを有する溶液を用いて、１時間、室温でブロッキングした。ビーズを直ぐに使用するか、または４℃で一晩保存した。翌日、好中球（１×１０^７）を、１０ｍｌの培地を有するペトリ皿に播種し、刺激せずに放置、または１００ｎＭＰＭＡを用いて、３時間、３７℃で刺激した。刺激後、細胞／ＮＥＴを、等量のＰＢＳ（１ｍＭＡＥＢＳＦを加えて）で非常に穏やかに洗浄した（×３）。最後の洗浄後、ＮＥＴを、２５０Ｕベンゾナーゼ（シグマ社（Ｓｉｇｍａ）Ｅ１０１４）および１ｍＭＡＥＢＳＦ、２０μＭＮＥｉおよびＣＧｉを有する１ｍｌのベンゾナーゼ緩衝液（２０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）－ＨＣｌ、ｐＨ７．６、２ｍＭＭｇＣｌ_２、１ｍＭＣａＣｌ_２）中で、緩衝液を分散するために断続的に揺動しながら、３０分間、３７℃で消化した。反応を、４ｍＭＥＤＴＡおよび４ｍＭＥＧＴＡを添加して停止した。３００μｌの５×ＩＰ溶解緩衝液（５×プロテアーゼ阻害剤を加えて）を添加して、細胞を更に溶解した。皿を、氷上で１０分間インキュベートした。その後、細胞およびＮＥＴを、エッペンドルフチューブにこすり取ることによって収集した。同じ時点および刺激での複数の皿に関して、試料をプールし、実行されるＩＰステップに直ちに分割した。各ＩＰに関して、１×１０^７細胞からの溶解物を、１５μｌの結合ビーズと共に使用し、穏やかに回転しながら、４℃で一晩インキュベートした。翌日、ビーズを、ＩＰ溶解緩衝液と阻害剤とを用いて５回洗浄した。最終洗浄後、ビーズを、３０μｌの１×ＳＤＳ－ＰＡＧＥ試料ローディング緩衝液に再懸濁した。試料を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分析し、示されているように染色またはイムノブロットを行った。クマシーインスタントブルー（ＣｏｏｍａｓｓｉｅＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ）染色またはサーモフィッシャー（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）銀染色キットを、製造業者の指示に従って使用した。

【0179】

ペプチド競合分析
好中球を２４ウェルディッシュでカバースリップ上に播種し（１×１０^５細胞／ウェル）、およびＰＭＡを用いて３時間刺激し、および２％ＰＦＡを用いて固定した。染色前に、３Ｄ９（２μｇ／ｍｌ＝～１２．９ｎＭ）を、０．０１～２００倍モル過剰の分岐ＲＥＩＲＲペプチドを有するＰＢＳ中で、４℃で回転させながら一晩プレインキュベートした。ＴＧＧＶＫ分岐ペプチドを、陰性対照として使用した。翌日、競合した抗体－ペプチド溶液を、ブロッキング緩衝液を用いて１：１に希釈し、および免疫染色手順を以前の通りに行った。ペプチド競合を、蛍光顕微鏡により視覚的に評価した。

【0180】

エピトープマッピング
ヒトＨ３への抗体結合を、ペプスキャンプレスト社（ＰｅｐｓｃａｎＰｒｅｓｔｏＢ．Ｖ．）（ライデン、オランダ）によって行われたペプチド合成およびＥＬＩＳＡ分析を用いて、線状、立体構造、およびアミノ酸置換分析エピトープマッピングの組み合わせによって評価した。標的分子におけるエピトープ（ＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬＳＥＱＩＤＮＯ：２５のＨ３アミノ酸残基３０～７０）を再構成するために、ペプチドベースのペプチド模倣体のライブラリーを、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成を使用して合成した。アミノ官能化ポリプロピレン支持体を、独自の親水性ポリマー製剤を用いてグラフト化し（ｇｒａｆｔｉｎｇ）、続いて、Ｎ－ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）と共にジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を使用してｔ－ブチルオキシカルボニル－ヘキサメチレンジアミン（ＢｏｃＨＭＤＡ）と反応させ、続いて、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用してＢｏｃ基を切断することによって得た。標準的なＦｍｏｃペプチド合成を使用して、特注で改変されたヤヌス（ＪＡＮＵＳ）液体ハンドリングステーション（ＪＡＮＵＳｌｉｑｕｉｄｈａｎｄｌｉｎｇｓｔａｔｉｏｎｓ）（パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ））によってアミノ官能基化固体支持体上でペプチドを合成した。構造模倣体の合成（構造解析）を、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）独自のスキャフォールド上で化学的に結合するペプチド（ＣｈｅｍｉｃａｌｌｙＬｉｎｋｅｄＰｅｐｔｉｄｅｓｏｎＳｃａｆｆｏｌｄｓ）（ＣＬＩＰＳ）技術を使用して行った。合成されたペプチドのそれぞれに対する抗体の結合を、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）ベースのイライザ（ＥＬＩＳＡ）で試験した。ペプチド配列を、線状および立体構造解析の場合は０．０２μｇ／ｍｌで一次抗体（３Ｄ９またはアイソタイプ対照）を用いて、アミノ酸置換分析の場合は０．５μｇ／ｍｌで一次抗体を用いてインキュベートした（４℃で一晩）。洗浄後、ペプチド配列を、１／１０００希釈のウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＨＲＰコンジュゲート（サウザーンバイオテック（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ）、バーミンガム、アラバマ州、米国）とともに２５℃で１時間インキュベートした。洗浄後、ペルオキシダーゼ基質である２，２’－アジノ－ジ－３－エチルベンズチアゾリンスルホネート（ＡＢＴＳ）および２０μｌ／ｍｌの３％Ｈ_２Ｏ_２を添加した。１時間後、発色現像を、電荷結合素子（ＣＣＤ）－カメラおよび画像処理システムを使用して定量化した。ＣＣＤカメラから得られた値は、０～３０００ｍＡＵの範囲であり、標準的な９６ウェルプレートイライザ（ＥＬＩＳＡ）リーダーと同様であった。結果を定量化し、ペップラボ（Ｐｅｐｌａｂ）データベースに保存した。合成されたペプチドの品質を検証するために、陽性対照ペプチドおよび陰性対照ペプチドの個別のセットを並行して合成した。これらは、市販の抗体３Ｃ９および５７を用いてスクリーニングした（Ｐｏｓｔｈｕｍｕｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ａ．，Ｓｃｈａａｐｅｒ，Ｗ．Ｍ．，ｖａｎＮｉｅｕｗｓｔａｄｔ，Ａ．Ｐ．，Ｅｎｊｕａｎｅｓ，Ｌ．，およびＭｅｌｏｅｎ，Ｒ．Ｈ．（１９９０）。伝染性胃腸炎ウイルスにおける中和エピトープの分析およびシミュレーション（Ａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｏｆａｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｉｔｏｐｅｏｆｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓｖｉｒｕｓ．）．ＪＶｉｒｏｌ６４，３３０４－３３０９）。

【0181】

ハイブリドーマ抗体遺伝子シーケンシング
ハイブリドーマ３Ｄ９の抗体遺伝子のシーケンシングは、ジェンスプリト社（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）（ニュージャージー州、米国）によって実行された。簡潔に、全ＲＮＡを、トリゾール（ＴＲＩｚｏｌ）（登録商標）試薬の技術マニュアルに従って、３Ｄ９ハイブリドーマの５クローンから単離した。その後、全ＲＮＡを、プライムスクリプト（ＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ）ＴＭファーストストランド（１ｓｔＳｔｒａｎｄ）ｃＤＮＡ合成キットの技術マニュアルに従って、アイソタイプ特異的アンチセンスプライマー、またはユニバーサルプライマーのいずれかを使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。重鎖および軽鎖の抗体断片を、ｃＤＮＡ末端の高速増幅（ＲＡＣＥ）のためのジェンスクリプト（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）の標準操作手順に従って増幅した。増幅した抗体断片を、クローニングベクターｐＣＥ２ＴＡ／ブラント－ゼロ（Ｂｌｕｎｔ－ｚｅｒｏ）ベクター（ＣＡＴ＃Ｃ６０１－０１－ヴァゼムバイオテック社（ＶａｚｙｍｅＢｉｏｔｅｃｈＣｏ．，Ｌｔｄ），中国）にクローニングした。コロニーＰＣＲを実行し、正しいサイズのインサートを有するクローンをスクリーニングした。コンセンサス配列を提供し、その断片は、アプライドバイオシステムズ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）３７３０ＤＮＡアナライザーを使用して配列を決定した。その後、配列を、ＮＣＢＩＩｇブラスト（Ｂｌａｓｔ）の結果を使用してアラインメントし、注釈付けした。

【0182】

【表1-1】

【0183】

【表1-2】

【0184】

実施例１：ＮＥＴ形成中のヒストンＨ３のＮ末端尾部におけるセリンプロテアーゼ依存性切断
ヒストンは、ホルボール１２ミリステート１３アセテート－ＰＭＡ、および他のＮＥＴ刺激に応答して処理される。ＰＭＡとインキュベートされたヒト好中球における経時的実験において、本発明者らは、早ければ刺激後３０分で～１４ｋＤａのＨ３切断生成物を検出し（図１）、その後、約１３ｋＤａおよび１０ｋＤａの切断生成物を得た。Ｃ末端ヒストン抗体は、Ｈ３の切断生成物を検出したが、Ｎ末端ヒストン抗体は、Ｈ３の切断生成物を検出しなかった（図１Ａ）。図１Ａは、ＰＭＡ誘導性ヒストンＨ３切断が、Ｎ末端ドメインで起こり、セリンプロテアーゼ阻害によって妨げられることを示す。これらの結果は、切断されたＨ３において、Ｎ末端が、切り取られることを示す。

【0185】

好中球のアズール顆粒は、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）でヒストンを分解することができるセリンプロテアーゼが豊富である。したがって、ＮＥＴ形成中のＨ３切断に対するこれらのプロテアーゼの寄与を試験した。セリンプロテアーゼ阻害剤であるＡＥＢＳＦ（４－［２－アミノエチル］ベンゼンスルホニルフルオリド）とのプレインキュベーション（図１Ａ）は、ＰＭＡ刺激時のＨ３切断を阻害した。免疫蛍光顕微鏡によって示されるように、ＡＥＢＳＦは、ＮＥＴ形成および核の脱凝縮も阻害した（図１Ｂ）。このデータは、セリンプロテアーゼが、ＮＥＴ形成の初期にＨ３のＮ末端を切断することを示す。

【0186】

実施例２：ヒストンＨ３は、球状ドメインの新規部位で切断される
正確なＨ３切断部位を同定するために、本発明者らは、ＰＭＡを用いて９０分間刺激された初代好中球からヒストン豊富な抽出物を調製し、その後、方法の節に記述されたようにＨ３を精製した。本発明者らは、抗Ｈ３Ｃ末端抗体を用いてウェスタンブロットにより、Ｈ３および当該切断生成物を含む画分を同定した。Ｈ３は、４５～４６分で溶出する最後のコアヒストンであった（図２Ａ）。本発明者らは、２Ｄ電気泳動（２Ｄ－Ｅ）によって、Ｈ３および当該切断型を分離し、質量分析によってそれらの同一性を確認した（図２Ａ）。図２Ｂは、２Ｄ電気泳動によって分離されたプールされたＨ３画分における代表的なクマシー染色されたブロットを示す。

【0187】

配列範囲は、Ｈ３変異体の区別を可能にする残基を含まなかった。図２Ｂに示される分離されたＨ３断片のＮ末端は、２つの独立した実験からエドマン分解によって配列決定された（表１）。最大分子量のＨ３スポットにおけるＮ末端配列は、無傷Ｈ３のＮ末端配列と一致した（スポット１）。我々は、スポット２およびスポット３における信頼できる配列決定は得られなかったが、スポット４およびスポット５における切断部位を同定した。最も切断されたＨ３断片（スポット５）は、ヌクレオソームコア構造内のタンパク質の球状ドメインにおけるＬ４８とＲ４９との間で切断された。これは、Ｈ３において以前に同定されていない切断部位であり、したがって、本発明者らは、Ｈ３Ｒ４９での切断を、ＮＥＴの候補マーカーとして選択した。

【0188】

【表2】

【0189】

実施例３：ヒストンＨ３切断部位モノクローナル抗体の生成
切断されたヒストン部位に対する抗体を高めるために、本発明者らは、Ｈ３Ｒ４９切断部位に対する５アミノ酸カルボキシル基を含むリジン分岐免疫原を用いてマウスを免疫化した（図３Ｄ）。最初に、血清を、および、その後のハイブリドーマ上清を、免疫原（ＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＳＥＱＩＤＮＯ１２によって形成される分岐ペプチド）および対照ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１３およびＳＥＱＩＤＮＯ１４）に対して、ＥＬＩＳＡによってスクリーニングした。その後、ＰＭＡ刺激好中球細胞溶解物のイムノブロットにおいて切断されたＨ３を検出した血清またはクローンについてのスクリーニングを実行した。切断されたＨ３に加えて全長ヒストンＨ３を検出した血清およびクローンを除外した（図３Ａおよび３Ｂ）。並行して、血清をスクリーニングし、免疫蛍光顕微鏡法によってＮＥＴを検出するがナイーブ好中球の静止クロマチンを検出しないクローンを選択した。免疫化された６匹のマウスのうち、ウェスタンブロットおよび顕微鏡法の両方において機能する１匹の安定なクローン、３Ｄ９、を得た。

【0190】

３Ｄ９は、ＰＭＡを用いて１２０分間以上刺激された好中球において～１０ｋＤａのタンパク質を認識したが、静止細胞または初期刺激細胞においてタンパク質を検出しなかった（図３Ｂ）。このバンドは、Ｈ３Ｃ末端抗体によって検出された最小のＨ３断片とサイズが一致した。興味深いことに、顕微鏡検査によって、３Ｄ９は、クロマチンの脱凝縮を伴ってＮＥＴｏｓｉｓを起こしている好中球をただ認識しただけであった（図３Ａ）。ＮＥＴにおけるデノボＮ末端Ｈ３エピトープに対する抗体の特異性を検証するために、本発明者らは、分岐免疫ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＳＥＱＩＤＮＯ１２）、および分岐陰性対照ペプチド（ＳＥＱＩＤＮＯ１６およびＳＥＱＩＤＮＯ１７）を用いた競合実験を行い、免疫蛍光顕微鏡法によって示されるように、ＮＥＴへの３Ｄ９結合を阻止することができたことを実証した（図３Ｅ）。

【0191】

間接Ｅｌｉｓａ実験は、３Ｄ９が配列ＲＥＩＲＲ（ＳＥＱＩＤＮＯ１１およびＳＥＱＩＤＮＯ２４）を含む分岐免疫ペプチドに、および単離されたＮＥＴに結合するように、３Ｄ９は切断されたＨ３に特異的に結合することを示したが、直接ＥＬＩＳＡによって、等濃度のクロマチン、組換えＨ３、または精製ウシ胸腺ＤＮＡには結合しないことを示した（図３Ｃ）。さらに、免疫沈降実験において、３Ｄ９は、ナイーブ好中球と活性化好中球との両方の溶解物においてＨ３をプルダウン（ｐｕｌｌｅｄｄｏｗｎ）するが、活性化細胞からはＨ３の切断断片のみをプルダウンし、アイソタイプ対照ではプルダウンしなかった（図３Ｆ）。本発明者らは、クマシーゲルおよび銀染色ゲルの両方によって、これらのプルダウンを検出した。同様の実験において、免疫沈降物を、Ｃ末端抗体および３Ｄ９を用いてイムノブロットし（図３Ｇ）、本発明のモノクローナルのみが切断されたＨ３を認識することを示した。結果として、これらのデータは、３Ｄ９がＳＤＳ－ＰＡＧＥの変性条件下では切断されたＨ３に対して選択的であるが、ＩＰのより天然の条件下で全長Ｈ３も認識することを示す。

【0192】

実施例４：ヒストンＨ３に対する抗体クローン３Ｄ９のエピトープマッピング
本発明者らは、Ｈ３Ｒ４９切断部位周囲の配列（ＰＡＴＧＧＶＫＫＰＨＲＹＲＰＧＴＶＡＬＲＥＩＲＲＹＱＫＳＴＥＬＩＲＫＬＰＦＱＲＬ＝ＳＥＱＩＤＮＯ２５の残基３０～７０）に基づいて、重複直鎖ペプチド配列およびらせん形のペプチド模倣体配列を用いてＥＬＩＳＡによって、ヒストンＨ３における３Ｄ９の結合部位を決定した。新たに明らかになったＮ末端Ｒ４９で生成される潜在的な電荷を模倣するために、配列は未修飾ペプチドの配列を含んだ。重複ペプチドに基づいて、直鎖配列における推定のコアエピトープは、（Ｒ）ＥＩＲＲであった。ＲＥＩＲＲで終了するペプチドは、全ての場合において各ペプチド模倣体の上位２つに入っていた。興味深いことに、Ｎ末端で伸長したペプチドも認識された。さらに、ＲＥＩＲＲ配列で終了するペプチドのＮ末端でのアセチル化は、結合に影響を与えず、遊離のＮ末端が抗体によって認識されない可能性があることを示唆している。エピトープマッピングを、ＲＥＩＲＲで終了する直鎖ペプチド、およびらせん形のペプチド模倣体におけるアミノ酸置換分析によって精密化した。Ｇｌｕ５１、Ｉｌｅ５２、およびＡｒｇ５４での変異は、シグナルに悪影響を及ぼし、これらの残基がエピトープ認識に重要であることを示す。

【0193】

実施例５：顕微鏡によるインビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）生成されたＮＥＴの自動定量化
本発明者らは、試料全体への抗体の分配を促進するために透過処理（トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ－１００、０．５％、１０分間）された試料において、３Ｄ９がどのようにＮＥＴを染色するかを免疫蛍光顕微鏡により試験した。３Ｄ９は、ほぼ排他的に非凝縮クロマチンを検出した（図４Ａ）。対照的に、Ｈ２Ａ－Ｈ２Ｂ－ＤＮＡエピトープに対する抗クロマチン抗体（クローンＰＬ２．３）は、凝縮した核に加えてＮＥＴを染色した。

【0194】

ＮＥＴ形成中の３Ｄ９およびＰＬ２．３の染色特性を比較した。核面積およびシグナル強度を、複数の視野から指定された時点で決定した（図４Ｂ）。両方の抗体は、シミュレーション後の１５分～１８０分の間に、ＮＥＴｏｓｉｓの特徴的な核面積の増加を検出した。後の時点で、ＰＬ２．３染色の強度は低下し、静止細胞核とＮＥＴとを区別することができなかった。対照的に、３Ｄ９は、ＮＥＴｏｓｉｓを起こしている核を、非活性化細胞の核よりも明るく染色した。

【0195】

公的に入手可能なソフトウェアイメージ（ＩｍａｇｅＪ）を、インビトロ（ｉｎｖｉｔｒｏ）ＮＥＴｏｓｉｓを定量化するために使用することができる。３Ｄ９を用いての染色は、以前に公開された手動半自動画像解析（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎｅｔａｌ．，２０１２）および修正された自動方法によって、抗クロマチン抗体に対して比較された。両方の方法は、ＤＮＡチャンネル（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ））の自動しきい値処理を使用して、全細胞／対象物を計数した。歴史的な手動半自動方法は、ＮＥＴｏｓｉｓの細胞を計数するために、凝縮クロマチン（弱いシグナル）に対する脱凝縮クロマチン（高いシグナル）におけるクロマチン抗体による示差染色を利用する。この方法は、手動のしきい値化および断片化手順を使用する（図において手動と示される）。この手動しきい値化ステップは、観察者バイアスの影響を受ける。対照的に、修正された方法は、両方の段階：総細胞およびＮＥＴの計数で自動しきい値化を使用する。両方の方法は、サイズ排除粒子分析ステップを使用し、したがって、静止核より大きい構造のみを計数する。３Ｄ９抗体およびＰＬ２．３抗体の両方は、以前に公開された方法（図４Ｃ－手動）を使用して効果的にＮＥＴを定量化した。しかしながら、ＰＬ２．３は、特に刺激後の初期の時点（１５分）で、全自動方法を用いてＮＥＴの数を正確に定量化することができず、ここで、弱く染色された分葉状の核は細胞の活性化および接着中に、より大きな表面積に広がる可能性がある。総合的に、これらのデータは、３Ｄ９染色を使用する修正された自動方法が実験バイアスを軽減することを示す。

【0196】

実施例５：３Ｄ９は、複数の刺激によって誘導されたＮＥＴを検出する
ヒストンＨ３切断は、複数の刺激によって誘導されたＮＥＴにおいて起こる。３Ｄ９は、ＮＡＤＰＨオキシダーゼ活性化とは独立してＮＥＴを誘導する細菌毒素ナイゲリシンによって、ＴＮＦ感作された好中球のヘムによって、および真菌病原体カンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）によって誘導されるＮＥＴを検出した（図５）。興味深いことに、Ｃ．アルビカンス（ａｌｂｉｃａｎｓ）感染において、３Ｄ９陽性ＮＥＴおよび３Ｄ９陰性ＮＥＴの両方を検出した。

【0197】

実施例６：３Ｄ９は、混合細胞試料においてＮＥＴを識別する
ヒストンＨ３クリッピング（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）は、Ｎ末端尾部の他の部位ではあるが、肥満細胞および非刺激ＰＢＭＣ画分において観察された。注目すべきことに、ＰＢＭＣ画分は、汚染好中球をしばしば含む。３Ｄ９が、ＮＥＴ刺激を用いて処理された好中球を特異的に染色したかどうかを試験するために、ＰＢＭＣをＰＭＡまたはナイゲリシンと共にインキュベートした（図６）。重要なことに、３Ｄ９は、特異的な好中球マーカーであるＮＥに対して陽性であった細胞内で脱凝縮したように見えた核のみを検出した。対照的に、クロマチン抗体は、ＮＥＴｏｓｉｓの好中球および他の細胞の核の両方を染色した。これは、３Ｄ９が他の血液細胞の存在下でさえも、ＮＥＴを特異的に検出することを示す。

【0198】

実施例７：３Ｄ９は、好中球においてＮＥＴｏｓｉｓと他の形態の細胞死とを区別する
好中球は異なる細胞死経路に関与することができることはよく知られている。本発明者らは、ＳＭＡＣ（第２のミトコンドリア由来カスパーゼ活性化因子）模倣体およびカスパーゼ阻害の存在下で、一晩インキュベートすることによってアポトーシス、およびＴＮＦα刺激を用いてネクロプトーシスを誘導した。興味深いことに、抗クロマチン抗体ＰＬ２．３（図７Ｂ）は、アポトーシスを起こしている細胞の凝縮核を染色したが、３Ｄ９（図７Ａ）は染色せず、どちらの抗体もブドウ球菌毒素α－溶血素によって誘導されたネクローシス中の細胞を染色しなかった。

【0199】

実施例８：３Ｄ９は、ヒト組織切片においてＮＥＴを標識化する
ＮＥＴは、クロマチンと顆粒メーカーとの並置、およびシトルリン化Ｈ３の検出に基づいて、炎症組織において発見される。３Ｄ９は、炎症を起こしたヒト扁桃腺（図８Ａ）、ヒト腎臓（図８Ｂ）の両方において、ＮＥと共局在する脱凝縮ＤＮＡの領域を染色する（ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ））。このことは、３Ｄ９が組織学的試料においてＮＥＴを標識化することを示す。実際に、腎臓（図８Ｃ）、炎症を起こした虫垂（図９）、および胆嚢（図１０）において、３Ｄ９は、抗Ｈ３ｃｉｔ抗体または抗Ｈ２Ｂ抗体と同じクラスター内のＤＮＡを標識化した。興味深いことに、３Ｄ９は、脱凝縮した、よりＮＥＴ様の構造を染色したが、一方、抗Ｈ３ｃｉｔ抗体または抗Ｈ２Ｂ抗体は、相対的に凝縮クロマチンを染色した。

【0200】

実施例９：他のヒストンＨ３変異体における切断部位Ｌ４８Ｒ４９の同定
配列アラインメント分析を行うことにより、最初のＭｅｔを有さないヒストンＨ３配列Ｑ７１ＤＩ３に対応するＳＥＱＩＤＮＯ２５におけるＬ４８Ｒ４９の切断部位が、他のヒストンＨ３変異体Ｐ０ＤＰＫ２、Ｑ６ＮＸＴ２、Ｑ１６６９５、Ｐ８４２４３、およびＰ６８４３１においても同じ位置で存在することを観察した。したがって、ＳＥＱＩＤＮＯ２５の切断部位Ｌ４８Ｒ４９は、Ｑ７１ＤＩ３、Ｐ０ＤＰＫ２、Ｑ６ＮＸＴ２、Ｑ１６６９５、Ｐ８４２４３、およびＰ６８４３１の部位Ｌ４９Ｒ５０に対応する。

【図1】