▶ エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッドの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】標的タンパク質の高収率の精製方法
(51)【国際特許分類】
C07K 1/14 20060101AFI20240220BHJP
C12N 5/07 20100101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
C07K1/14
C12N5/07
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023552233
(86)(22)【出願日】2022-01-25
(85)【翻訳文提出日】2023-10-18
(86)【国際出願番号】 KR2022001307
(87)【国際公開番号】W WO2022182003
(87)【国際公開日】2022-09-01
(31)【優先権主張番号】10-2021-0026617
(32)【優先日】2021-02-26
(33)【優先権主張国・地域又は機関】KR
(81)【指定国・地域】
【公序良俗違反の表示】
（特許庁注：以下のものは登録商標）
１．ノニデット
(71)【出願人】
【識別番号】519038714
【氏名又は名称】エスケー バイオサイエンス カンパニー リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100107456
【弁理士】
【氏名又は名称】池田 成人
(74)【代理人】
【識別番号】100162352
【弁理士】
【氏名又は名称】酒巻 順一郎
(74)【代理人】
【識別番号】100123995
【弁理士】
【氏名又は名称】野田 雅一
(72)【発明者】
【氏名】キム， ハク
(72)【発明者】
【氏名】クォン， テウ
(72)【発明者】
【氏名】ソ， キ‐ウォン
【テーマコード（参考）】
4B065
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AC14
4B065BD15
4B065BD16
4B065CA44
4B065CA46
4B065CA60
4H045AA10
4H045AA20
4H045BA61
4H045CA53
4H045DA50
4H045EA20
4H045EA50
4H045FA71
4H045GA01
4H045GA15
(57)【要約】
本発明は、高収率で標的タンパク質を精製するための方法に関する。より詳細には、本発明は、高収率で膜タンパク質を精製するための方法に関する。本発明の精製方法は、膜タンパク質の分離及び精製のプロセスの間の粉砕及び溶出条件を最適化し、これを使用して膜タンパク質を精製する場合、膜タンパク質は、従来のホモジナイザー又は音波破砕を使用することによって膜タンパク質を精製する場合の１００倍以上高い収率で精製され得る。また、本発明の精製方法を使用することによって膜タンパク質を精製する場合、核、ペルオキシソーム、及びリソソームが除去され、それによってＤＮＡ混入、及びプロテアーゼによるタンパク質損傷が減少する。したがって、本発明を有用に使用して、膜タンパク質を精製し得る。
【選択図】 図１
【選択図】 図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
標的タンパク質を精製するための方法であって、ｉ）ソニケーター、ホモジナイザー、又はマイクロフルイダイザーを使用して、細胞を破砕するステップ；
ｉｉ）細胞膜画分を得るステップ；
ｉｉｉ）前記ソニケーター、前記ホモジナイザー、又は前記マイクロフルイダイザーを使用して、前記細胞膜画分を破砕するステップ；及び
ｉｖ）前記標的タンパク質を分離させるステップ
を含む、方法。
【請求項2】
ステップｉ）において、前記マイクロフルイダイザーが３，５００ｐｓｉ～６，０００ｐｓｉの圧力で１回～７回繰り返し行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
ステップｉｉ）において、前記細胞膜画分が分画遠心分離によって得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項4】
前記分画遠心分離が、一次遠心分離及び二次遠心分離によって２回行われる、請求項３に記載の方法。
【請求項5】
前記一次遠心分離が８，０００×ｇ～１１，０００×ｇの速度で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
前記二次遠心分離が１４０，０００×ｇ～１６０，０００×ｇの速度で行われる、請求項４に記載の方法。
【請求項7】
ステップｉｉｉ）において、前記マイクロフルイダイザーが１５，０００ｐｓｉ～２５，０００ｐｓｉの圧力で３回～７回繰り返し行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項8】
ステップｉｉｉ）において、界面活性剤を含む抽出バッファーが前記細胞膜画分に加えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項9】
前記界面活性剤が、ＳＤＳ、トリトンＸ－１００、ノニデットＰ－４０、オクチル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド、及びツヴィッタージェント３－１６からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
ステップｉｖ）において、分離させる前記ステップが超遠心分離を使用する、請求項１に記載の方法。
【請求項11】
前記超遠心分離が８０，０００×ｇ～１２０，０００×ｇの速度で行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
前記標的タンパク質が膜タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
前記細胞が動物細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項14】
前記動物細胞が昆虫細胞である、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記昆虫細胞が、イラクサギンウワバのＢＴ１－Ｔｎ－５Ｂ１－４細胞、マイマイガのＬＤ６５２Ｙ細胞、ツマジロクサヨトウのＳｆ９細胞、ツマジロクサヨトウのＳｆ２１細胞、ショウジョウバエ属のＫｃ１細胞、ショウジョウバエ属のＳＬ２細胞、及び蚊細胞株からなる群から選択されるいずれか１種である、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記標的タンパク質を精製するための方法が、ステップｉ）において、１０回～２０回ホモジナイゼーションを行うこと；ステップｉｉ）において、２，５００×ｇ～３，５００×ｇの速度で１０分間～３０分間一次遠心分離を行い、次いで４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、３回～７回ホモジナイゼーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項17】
前記標的タンパク質を精製するための方法が、ステップｉ）において、５分間～３０分間ソニケーションを行うこと；ステップｉｉ）において、１００×ｇ～１，０００×ｇの速度で１分間～３分間一次遠心分離を行い、次いで１２，０００×ｇ～１４，０００×ｇの速度で１０分間～２０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、１０分間～３０分間ソニケーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、１０，０００×ｇ～１５，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項18】
ステップｉ）において、界面活性剤がさらに処理される、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、高収率で標的タンパク質を精製するための方法に関する。より詳細には、本発明は、高収率で膜タンパク質を精製するための方法に関する。
【背景技術】
【0002】
膜タンパク質は、細胞の内外でシグナルを伝達する重要なタンパク質であり、種々の疾患と関連する。特に、膜タンパク質は細胞の内外でイオン濃度の差を発生させるか、又はＡＴＰ合成に使用され、神経細胞又は筋細胞における電気シグナルの発生及び伝達に関与する。特に、膜タンパク質は、活性医薬成分の主な標的であり、最近開発されている治療用モノクローナル抗体の標的でもある。
【0003】
最新の多数の膜タンパク質が依然として未知であり、膜タンパク質の特徴及び機能を明らかにするために調査が必要である。しかしながら、膜タンパク質は、細胞質に存在するタンパク質よりも高い疎水性を有し、脂質二重層に存在するので、抽出及び精製は容易ではなく、関連する調査の進行は遅い。膜タンパク質関連調査において、細胞膜に存在する膜タンパク質自体の量が非常に少なく、膜タンパク質が存在する細胞膜が多量の脂質及び糖を有し、そのため膜タンパク質を精製するのが困難であるという制限がある。
【0004】
現在は、Ｍｏｌｌｏｙらによって、膜タンパク質を分離及び精製するための方法として、ディタージェントを使用して膜タンパク質を抽出するための方法が開発されており、尿素、チオ尿素、ＣＨＡＰＳ等を使用することによる３段階抽出方法によって特徴づけられる。Ｍｏｌｌｏｙらによる方法によれば、細胞又は組織が粉砕され、遠心分離を通して上清が除去され、膜タンパク質を含む沈殿物が収集され、ディタージェントを使用することによって脂質層又は細胞壁に結合した膜タンパク質が抽出される。この方法で主に使用されるディタージェントとしては、トリトンＸ１００、ノニデットＰ－４０（ＮＰ－４０）、４－オクチルベンゾイルアミドスルホベタイン（ａｍｉｄｏｓｕｌｆｏｂｅｔｉｎｅ）、ＡＳＢ１４等が挙げられる。また、膜を分離及び精製するための別の方法は、試料を遠心分離することである。この方法において、細胞を粉砕及び遠心分離して、膜画分を分離させる。この方法の不利な点は、さらなる確認プロセスが必要であり、長い時間がかかることである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【0005】
【非特許文献1】Ｍ．Ｗａｌｉｄ Ｑｏｒｏｎｆｌｅｈら、Ｊ Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年１０月２９日；２００３（４）：２４９～２５５頁
【発明の概要】
【0006】
［技術的問題］
また、標識及びクロマトグラフィー方法、ｐＨで異なる特徴を有する限外濾過によってタンパク質を選択的に濃縮するための方法、樹脂を使用すること及び分離されたリン酸ペプチドを濃縮することによってリン酸ペプチドを非リン酸ペプチドから分離させるための方法、並びにガラスビーズを使用した相分配によって膜タンパク質を選択的に濃縮するための方法が公知である（Ｍ．Ｗａｌｉｄ Ｑｏｒｏｎｆｌｅｈら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年１０月２９日；２００３（４）：２４９～２５５頁）。しかしながら、関連技術の膜タンパク質分離及び精製技術は、十分な収率をもたらしていない。したがって、高い効率で膜タンパク質を分離及び精製するための技術に関する調査及び開発の必要がある。
また、標識及びクロマトグラフィー方法、ｐＨで異なる特徴を有する限外濾過によってタンパク質を選択的に濃縮するための方法、樹脂を使用すること及び分離されたリン酸ペプチドを濃縮することによってリン酸ペプチドを非リン酸ペプチドから分離させるための方法、並びにガラスビーズを使用した相分配によって膜タンパク質を選択的に濃縮するための方法が公知である（Ｍ．Ｗａｌｉｄ Ｑｏｒｏｎｆｌｅｈら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２００３年１０月２９日；２００３（４）：２４９～２５５頁）。しかしながら、関連技術の膜タンパク質分離及び精製技術は、十分な収率をもたらしていない。したがって、高い効率で膜タンパク質を分離及び精製するための技術に関する調査及び開発の必要がある。
【課題を解決するための手段】
【0007】
したがって、本発明者らは、高い効率で膜タンパク質を分離及び精製するための技術を研究して開発し、結果として、最適な破砕及び溶出条件を確立し、上述の条件を使用して膜タンパク質を分離及び精製した場合に高収率で膜タンパク質を得られることを見出し、それによって本発明を完成させた。
【0008】
上述の目的を達成するために、本発明の一態様は、標的タンパク質を精製するための方法であって、ｉ）ソニケーター、ホモジナイザー、又はマイクロフルイダイザーを使用して、細胞を破砕するステップ；ｉｉ）細胞膜画分を得るステップ；ｉｉｉ）ソニケーター、ホモジナイザー、又はマイクロフルイダイザーを使用して、細胞膜画分を破砕するステップ；及びｉｖ）標的タンパク質を分離させるステップを含む、方法を提供する。
【発明の効果】
【0009】
本発明の精製方法は、膜タンパク質を分離及び精製するプロセスの間に、最適化された破砕及び溶出条件を有し、本発明の精製方法を使用して膜タンパク質を精製させる場合、膜タンパク質は、従来のホモジナイザー又はソニケーションを使用することによって膜タンパク質を精製する場合よりも少なくとも１００倍高い収率で精製され得る。また、本発明の精製方法を使用することによって膜タンパク質を精製する場合、核、ペルオキシソーム及びリソソームが除去され、そのためＤＮＡ混入、及びプロテアーゼによるタンパク質損傷が減少し得る。したがって、本発明を効果的に使用して、膜タンパク質を精製し得る。
【図面の簡単な説明】
【0010】
【図1】膜タンパク質を分離及び精製するプロセスにおける破砕及び溶出条件を最適化するステップを説明する概略図である。
【図2】ホモジナイザーを使用することによる破砕及び溶出実験の結果を示す図である。
【図3】ソニケーターを使用することによる破砕及び溶出実験の結果を示す図である。
【図4】マイクロフルイダイザーを使用することによる破砕及び溶出実験の結果を示す図である。
【図5】ホモジナイザー、ソニケーター、及びマイクロフルイダイザーを使用することによる破砕及び溶出実験の結果の比較を示す図である。
【発明を実施するための最良の形態】
【0011】
以下、本発明をより詳細に説明する。
【0012】
本発明の一態様は、標的タンパク質を精製するための方法であって、ｉ）ソニケーター、ホモジナイザー、又はマイクロフルイダイザーを使用して、細胞を破砕するステップ；ｉｉ）細胞膜画分を得るステップ；ｉｉｉ）ソニケーター、ホモジナイザー、又はマイクロフルイダイザーを使用して、細胞膜画分を破砕するステップ；及びｉｖ）標的タンパク質を分離させるステップを含む、方法を提供する。
【0013】
ホモジナイザー、ソニケーター、又はマイクロフルイダイザーは、化学抽出がより効率的に進行し得るように、膜画分を物理的に破砕し得る。一般的な化学抽出の場合、少量の細胞ペレット又は膜画分をピペッティング等によって破砕し、次いで予め決定された時間及び温度で、撹拌、振とう、揺動等をしながら培養するが、大量の細胞ペレット又は膜画分からタンパク質を抽出する場合、ピペッティングを単独で使用することによってそれらを破砕することは難しく、抽出効率が低下する。この場合、ホモジナイザー、ソニケーター、又はマイクロフルイダイザーの適用によって破砕が非常に小さいサイズに均質化され、そのため抽出効率が増大し、培養時間が減少し、それによって標的タンパク質がより効率的に得られる。
【0014】
マイクロフルイダイザーを使用することによって標的タンパク質を精製するための方法
ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは３，５００ｐｓｉ～６，０００ｐｓｉの圧力で１回～７回繰り返し行われ得る。特に、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは３，５００ｐｓｉ～６，０００ｐｓｉ、３，８００ｐｓｉ～５，７００ｐｓｉ、４，１００ｐｓｉ～５，４００ｐｓｉ、又は４，４００ｐｓｉ～５，１００ｐｓｉの圧力で行われ得る。また、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは１回～７回、２回～６回、又は３回～５回繰り返し行われ得る。本発明の一実施形態では、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは５，０００ｐｓｉの圧力で３回～５回繰り返し行われた。
ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは３，５００ｐｓｉ～６，０００ｐｓｉの圧力で１回～７回繰り返し行われ得る。特に、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは３，５００ｐｓｉ～６，０００ｐｓｉ、３，８００ｐｓｉ～５，７００ｐｓｉ、４，１００ｐｓｉ～５，４００ｐｓｉ、又は４，４００ｐｓｉ～５，１００ｐｓｉの圧力で行われ得る。また、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは１回～７回、２回～６回、又は３回～５回繰り返し行われ得る。本発明の一実施形態では、ステップｉ）において、マイクロフルイダイザーは５，０００ｐｓｉの圧力で３回～５回繰り返し行われた。
【0015】
ステップｉ）において、細胞破砕の間に、界面活性剤を含まない溶解バッファーが使用され得る。ステップｉ）において、細胞破砕の間に溶解バッファーに界面活性剤が含まれる場合、核膜が破裂し、ＤＮＡが漏出し、それによって純粋な標的タンパク質を分離させることが難しくなる。また、標的タンパク質は、エンドソーム、リソソーム等の膜の破裂によって漏出したプロテアーゼによって損傷され得る。
【0016】
特に、ステップｉ）において、界面活性剤を含まない溶解バッファーを使用し得、これはトリス、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、及びプロテアーゼ阻害剤を含み得る。本発明の一実施形態では、２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤を含み、ｐＨ８．５を有する溶液が、細胞破砕の間に、界面活性剤を含まない溶解バッファーとして使用された。
【0017】
ステップｉｉ）において、細胞膜画分は分画遠心分離によって得られ得る。分画遠心分離は、一次遠心分離及び二次遠心分離によって２回行われ得る。一次遠心分離は８，０００×ｇ～１１，０００×ｇの速度で行われ得る。特に、一次遠心分離は８，０００×ｇ～１１，０００×ｇ、８，５００×ｇ～１０，５００×ｇ、又は９，０００×ｇ～１０，０００×ｇの速度で行われ得る。本発明の一実施形態では、一次遠心分離は、９，５００×ｇ、５分間、及び４℃の条件で行われた。二次遠心分離は、１４０，０００×ｇ～１６０，０００×ｇの速度で行われ得る。特に、二次遠心分離は、１４０，０００×ｇ～１６０，０００×ｇ、１４１，０００×ｇ～１５９，０００×ｇ、１４２，０００×ｇ～１５８，０００×ｇ、１４３，０００×ｇ～１５７，０００×ｇ、１４４，０００×ｇ～１５６，０００×ｇ、１４５，０００×ｇ～１５５，０００×ｇ、１４６，０００×ｇ～１５４，０００×ｇ、１４７，０００×ｇ～１５３，０００×ｇ、１４８，０００×ｇ～１５２，０００×ｇ、又は１４９，０００×ｇ～１５１，０００×ｇの速度で行われ得る。本発明の一実施形態では、二次遠心分離は、１５０，０００×ｇ、９０分間、及び４℃の条件で行われた。
【0018】
ステップｉｉｉ）において、マイクロフルイダイザーは、１５，０００ｐｓｉ～２５，０００ｐｓｉの圧力で３回～７回繰り返し行われ得る。特に、ステップｉｉｉ）において、マイクロフルイダイザーは、１５，０００ｐｓｉ～２５，０００ｐｓｉ、１６，０００ｐｓｉ～２４，０００ｐｓｉ、１７，０００ｐｓｉ～２３，０００ｐｓｉ、１８，０００ｐｓｉ～２２，０００ｐｓｉ、又は１９，０００ｐｓｉ～２１，０００ｐｓｉの圧力で行われ得る。また、ステップｉｉｉ）において、マイクロフルイダイザーは、３回～７回又は４回～６回繰り返し行われ得る。本発明の一実施形態では、ステップｉｉｉ）において、マイクロフルイダイザーは、２０，０００ｐｓｉの圧力で５回繰り返し行われた。
【0019】
ステップｉｉｉ）において、界面活性剤を含む抽出バッファーが細胞膜画分に加えられ得る。ステップｉｉｉ）において、界面活性剤がない場合、膜画分は再度破砕され得るのみで、膜タンパク質は抽出され得ない。この場合、マイクロフルイダイザーの役割は、膜画分をナノ粒子のサイズで非常に小さく且つ均質に破砕することであり、そのため界面活性剤は膜を効率的に可溶化して、膜タンパク質を抽出し得る。
【0020】
特に、膜タンパク質は疎水性を有し、そのため水溶液に溶解しないが、同様に疎水性である膜に埋め込まれる。膜画分は膜及び膜タンパク質が小塊として塊になる状態であり、この状態で、界面活性剤が処理されても、膜画分小塊の表面のみが可溶化され、そのため効率的な抽出は行われ得ない。マイクロフルイダイザーを使用すると、膜は、ナノサイズの断片に細かく、且つ均等に破砕され得、界面活性剤が作用し得る表面積は増大し、そのため抽出が効率的に行われ得る。
【0021】
界面活性剤は、ＳＤＳ、トリトンＸ－１００、ノニデットＰ－４０、オクチル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド、及びツヴィッタージェント（Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ）３－１６からなる群から選択されるいずれか１種であり得る。特に、界面活性剤を含む溶解バッファーは、トリス、トリトンＸ－１００、ＮａＣｌ、ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤を含み得る。本発明の一実施形態では、２５ｍＭトリス、１％トリトンＸ－１００、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、及びプロテアーゼ阻害剤を含み、ｐＨ８．５を有する溶液が、細胞膜画分の破砕の間に、界面活性剤を含む溶解バッファーとして使用された。
【0022】
ステップｉｖ）において、超遠心分離を使用して標的タンパク質を分離し得る。超遠心分離は、８０，０００×ｇ～１２０，０００×ｇの速度で３０分間～９０分間行われ得る。特に、超遠心分離は、８０，０００×ｇ～１２０，０００×ｇ、８５，０００×ｇ～１１５，０００×ｇ、９０，０００×ｇ～１１０，０００×ｇ、又は９５，０００×ｇ～１０５，０００×ｇの速度で、３０分間、４０分間、５０分間、６０分間、７０分間、８０分間、又は９０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、超遠心分離は、１００，０００×ｇ、４０分間、及び４℃の条件で行われた。
【0023】
標的タンパク質は、膜タンパク質であり得る。膜タンパク質は、ウイルスのスパイクタンパク質であり得る。特に、膜タンパク質は、中東呼吸器症候群コロナウイルスのスパイクタンパク質であり得る。中東呼吸器症候群コロナウイルスのスパイクタンパク質（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ）はまた、Ｓタンパク質とも呼ばれ、中東呼吸器症候群コロナウイルスの表面糖タンパク質を意味する。また、スパイクタンパク質は、被覆中東呼吸器症候群コロナウイルス粒子の表面のスパイク又はペプロマーを構成する三量体として発現される糖タンパク質である。
【0024】
細胞は動物細胞であり得る。特に、動物細胞は昆虫細胞であり得、昆虫細胞は、イラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉ）のＢＴ１－Ｔｎ－５Ｂ１－４細胞、マイマイガ（Ｌｙｍａｎｔｒｉａ ｄｉｓｐａｒ）のＬＤ６５２Ｙ細胞、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）のＳｆ９細胞、ツマジロクサヨトウのＳｆ２１細胞、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）のＫｃ１細胞、ショウジョウバエ属のＳＬ２細胞、及び蚊細胞株からなる群から選択されるいずれか１種であり得る。好ましくは、昆虫細胞は、ツマジロクサヨトウのＳｆ９細胞であり得る。本発明の一実施形態では、ツマジロクサヨトウのＳｆ９細胞が使用された。
【0025】
ホモジナイザーを使用することによって標的タンパク質を精製するための方法
標的タンパク質を精製するための方法は、ステップｉ）において、１０回～２０回ホモジナイゼーションを行うこと；ステップｉｉ）において、２，５００×ｇ～３，５００×ｇの速度で１０分間～３０分間一次遠心分離を行い、次いで４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、３回～７回ホモジナイゼーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含み得る。
標的タンパク質を精製するための方法は、ステップｉ）において、１０回～２０回ホモジナイゼーションを行うこと；ステップｉｉ）において、２，５００×ｇ～３，５００×ｇの速度で１０分間～３０分間一次遠心分離を行い、次いで４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、３回～７回ホモジナイゼーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含み得る。
【0026】
ステップｉ）において、ホモジナイゼーションは、ホモジナイザーを使用することによって、１０回～２０回行われ得る。特に、ステップｉ）において、ホモジナイゼーションは、ホモジナイザーを使用することによって、１０回、１１回、１２回、１３回、１４回、１５回、１６回、１７回、１８回、１９回、又は２０回行われ得る。本発明の一実施形態では、ホモジナイゼーションは、１２回行われた。
【0027】
ステップｉ）において、細胞破砕の間に、界面活性剤を含まない溶解バッファーを使用し得る。特に、界面活性剤を含まない溶解バッファーは、トリス、ＥＤＴＡ、ＮａＣｌ、及びプロテアーゼ阻害剤を含み得る。本発明の一実施形態では、２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤を含み、ｐＨ８．５を有する溶液が、細胞破砕の間に、界面活性剤を含まない溶解バッファーとして使用された。
【0028】
ステップｉｉ）において、細胞膜画分は分画遠心分離によって得られ得る。ステップｉｉ）において、細胞膜画分は、２，５００×ｇ～３，５００×ｇの速度で１０分間～３０分間一次遠心分離を行い、次いで４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間二次遠心分離を行うことによって得られ得る。一次遠心分離は、２，５００×ｇ～３，５００×ｇ、２，６００×ｇ～３，４００×ｇ、２，７００×ｇ～３，３００×ｇ、２，８００×ｇ～３，２００×ｇ、又は２，９００×ｇ～３，１００×ｇの速度で１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、一次遠心分離は、３，０００×ｇの速度で２０分間行われた。二次遠心分離は、４，０００×ｇ～６，０００×ｇ、４，４００×ｇ～５，９００×ｇ、４，８００×ｇ～５，８００×ｇ、又は５，２００×ｇ～５，７００×ｇの速度で２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、又は４０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、二次遠心分離は、５，４００×ｇの速度で３０分間行われた。
【0029】
ステップｉｉｉ）において、ホモジナイゼーションは、ホモジナイザーを使用することによって、３回～７回行われ得る。特に、ステップｉｉｉ）において、ホモジナイゼーションは、ホモジナイザーを使用することによって、３回、４回、５回、６回、又は７回行われ得る。本発明の一実施形態では、ホモジナイゼーションは５回行われた。
【0030】
ステップｉｉｉ）において、界面活性剤を含む抽出バッファーが細胞膜画分に加えられ得る。界面活性剤は、ＳＤＳ、トリトンＸ－１００、ノニデットＰ－４０、オクチル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド、及びツヴィッタージェント３－１６からなる群から選択されるいずれか１種であり得る。特に、界面活性剤を含む溶解バッファーは、トリス、トリトンＸ－１００、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡを含み得る。本発明の一実施形態では、０．５％トリトン１００、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む溶液が、細胞膜画分の破砕の間に、界面活性剤を含む溶解バッファーとして使用された。
【0031】
ステップｉｖ）において、遠心分離は、４，０００×ｇ～６，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間行われ得る。遠心分離は、４，０００×ｇ～６，０００×ｇ、４，４００×ｇ～５，９００×ｇ、４，８００×ｇ～５，８００×ｇ、又は５，２００×ｇ～５，７００×ｇの速度で２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、又は４０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、遠心分離は、５，４００×ｇの速度で３０分間行われた。
【0032】
標的タンパク質は、マイクロフルイダイザーを使用することによって標的タンパク質を精製するための方法に記載されたものと同じである。
【0033】
ソニケーターを使用することによって標的タンパク質を精製するための方法
標的タンパク質を精製するための方法は、ステップｉ）において、５分間～３０分間ソニケーションを行うこと；ステップｉｉ）において、１００×ｇ～１，０００×ｇの速度で１分間～３分間一次遠心分離を行い、次いで１２，０００×ｇ～１４，０００×ｇの速度で１０分間～２０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、１０分間～３０分間ソニケーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、１０，０００×ｇ～１５，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含み得る。
標的タンパク質を精製するための方法は、ステップｉ）において、５分間～３０分間ソニケーションを行うこと；ステップｉｉ）において、１００×ｇ～１，０００×ｇの速度で１分間～３分間一次遠心分離を行い、次いで１２，０００×ｇ～１４，０００×ｇの速度で１０分間～２０分間二次遠心分離を行うこと；ステップｉｉｉ）において、１０分間～３０分間ソニケーションを行うこと；及びステップｉｖ）において、１０，０００×ｇ～１５，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間遠心分離を行うことを含み得る。
【0034】
ステップｉ）において、ソニケーションは、ソニケーターによって、５分間～３０分間行われ得る。特に、ステップｉ）において、ソニケーションは、ソニケーターを使用することによって、５分間、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間又は３０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、ソニケーションは、２０分間行われた。
【0035】
ステップｉ）において、ソニケーションに低張溶解バッファーを使用し得る。特に、低張溶解バッファーは、トリスバッファーを含み得る。本発明の一実施形態では、１０ｍＭトリスバッファーを含み、ｐＨ７．５を有する溶液が、細胞破砕の間に低張溶解バッファーとして使用された。この場合、ステップｉ）における細胞破砕の間に、界面活性剤がさらに処理され得る。
【0036】
ステップｉｉ）において、細胞膜画分は分画遠心分離によって得られ得る。ステップｉｉ）において、細胞膜画分は、１００×ｇ～１，０００×ｇの速度で１分間～３分間一次遠心分離を行い、次いで１２，０００×ｇ～１４，０００×ｇの速度で１０分間～２０分間二次遠心分離を行うことによって得られ得る。一次遠心分離は、１００×ｇ～１，０００×ｇ、２００×ｇ～９００×ｇ、３００×ｇ～８００×ｇ、又は４００×ｇ～７００×ｇの速度で１分間、２分間、又は３分間行われ得る。本発明の一実施形態では、一次遠心分離は、５００×ｇの速度で１分間行われた。二次遠心分離は、１２，０００×ｇ～１４，０００×ｇ、１２，１００×ｇ～１３，９００×ｇ、１２，２００×ｇ～１３，８００×ｇ、１２，３００×ｇ～１３，７００×ｇ、１２，４００×ｇ～１３，６００×ｇ、１２，５００×ｇ～１３，５００×ｇ、１２，６００×ｇ～１３，４００×ｇ、１２，７００×ｇ～１３，３００×ｇ、１２，８００×ｇ～１３，２００×ｇ、又は１２，９００×ｇ～１３，１００×ｇの速度で１０分間、１５分間、又は２０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、二次遠心分離は、１３，０００×ｇの速度で１５分間行われた。
【0037】
ステップｉｉｉ）において、ソニケーションは、１０分間～３０分間行われ得る。特に、ステップｉｉｉ）において、ソニケーションは、ソニケーターを使用することによって、１０分間、１５分間、２０分間、２５分間、又は３０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、ソニケーションは、２０分間行われ得る。
【0038】
ステップｉｉｉ）において、界面活性剤を含む抽出バッファーが細胞膜画分に加えられ得る。界面活性剤は、ＳＤＳ、トリトンＸ－１００、ノニデットＰ－４０、オクチル－ｂ－Ｄ－グルコピラノシド、ｎ－ドデシル－ｂ－Ｄ－マルトシド、及びツヴィッタージェント３－１６からなる群から選択されるいずれか１種であり得る。特に、界面活性剤を含む溶解バッファーは、トリス、トリトンＸ－１００、ＮａＣｌ、及びＥＤＴＡを含み得る。本発明の一実施形態では、４０ｍＭトリス、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ－１００を含み、ｐＨ７．８を有する溶液が、細胞膜画分の破砕の間に、界面活性剤を含む溶解バッファーとして使用された。
【0039】
ステップｉｖ）において、遠心分離は、１０，０００×ｇ～１５，０００×ｇの速度で２０分間～４０分間行われ得る。遠心分離は、１０，０００×ｇ～１５，０００×ｇ、１０，５００×ｇ～１４，５００×ｇ、１１，０００×ｇ～１４，０００×ｇ、１１，５００×ｇ～１３，８００×ｇ、１２，０００×ｇ～１３，６００×ｇ、又は１２，５００×ｇ～１３，４００×ｇの速度で２０分間、２５分間、３０分間、３５分間、又は４０分間行われ得る。本発明の一実施形態では、遠心分離は、１３，０００×ｇの速度で３０分間行われた。
【0040】
標的タンパク質は、マイクロフルイダイザーを使用することによって標的タンパク質を精製するための方法に記載されたものと同じである。
【発明の形態】
【0041】
以下、下記の実施例を参照して、本発明をより詳細に記載する。しかしながら、下記の実施例は本発明を説明するためのみであり、本発明の範囲はそれに限定されない。
【0042】
Ｉ．膜タンパク質を分離及び精製するプロセスにおける破砕及び溶出条件の最適化
１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度でＳｆ９細胞を培養し、次いで０．１のＭＯＩでＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ組換えバキュロウイルスに感染させ、３～５日後に収集した。収集したＳｆ９細胞は、表面で、及び小胞体（ＥＲ）膜で、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質を発現していた。収集されたＳｆ９細胞から可能な限り多くの不純物を排除するために、及び細胞膜で発現されるＳタンパク質を溶出するために、細胞破砕、遠心分離、及びＳタンパク質溶出条件が研究された。
１×１０６個の細胞／ｍＬの濃度でＳｆ９細胞を培養し、次いで０．１のＭＯＩでＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓ組換えバキュロウイルスに感染させ、３～５日後に収集した。収集したＳｆ９細胞は、表面で、及び小胞体（ＥＲ）膜で、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質を発現していた。収集されたＳｆ９細胞から可能な限り多くの不純物を排除するために、及び細胞膜で発現されるＳタンパク質を溶出するために、細胞破砕、遠心分離、及びＳタンパク質溶出条件が研究された。
【0043】
この場合、最適な細胞破砕方法を見出すために、ホモジナイゼーション、ソニケーション、及びマイクロフルイダイザー技術を比較及び試験した。破砕された細胞から不純物を除去し、形質膜及びＥＲ膜のみを得るために、遠心分離条件実験を行った。また、細胞膜からＳタンパク質を溶出させるために、ホモジナイゼーション、ソニケーション、及びマイクロフルイダイザー技術を比較及び試験した（図１）。
【0044】
実施例１． Ｓｆ９細胞調製及び組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓバキュロウイルス接種
実施例１．１． Ｓｆ９細胞培養
実験で使用するためのＳｆ９細胞を調製するために、Ｓｆ９細胞をまず解凍した。特に、バイアル１つ分のＳｆ９細胞ストックを液体窒素から出し、恒温水槽中、２８℃で２分間解凍した。Ｓｆ９細胞がほとんど解凍されると、表面を７０％エタノールで拭い、安全キャビネット（ＢＳＣ）に入れた。次いで、Ｓｆ９細胞を、室温で、９．０ｍＬの培地を含む１５ｍＬファルコンチューブに入れた。
実施例１．１． Ｓｆ９細胞培養
実験で使用するためのＳｆ９細胞を調製するために、Ｓｆ９細胞をまず解凍した。特に、バイアル１つ分のＳｆ９細胞ストックを液体窒素から出し、恒温水槽中、２８℃で２分間解凍した。Ｓｆ９細胞がほとんど解凍されると、表面を７０％エタノールで拭い、安全キャビネット（ＢＳＣ）に入れた。次いで、Ｓｆ９細胞を、室温で、９．０ｍＬの培地を含む１５ｍＬファルコンチューブに入れた。
【0045】
１２５×ｇで５分間、遠心分離を行った。上清を除去し、細胞ペレットを１０ｍＬの培地に再懸濁し、次いで２５ｃｍ２のフラスコに入れた。フラスコを２７℃でインキュベーターに静置し、４８時間インキュベートした。４８時間後に、培地を除去し、新鮮な１０ｍＬの培地を加えた。再び、フラスコを２７℃でインキュベーターに静置し、さらに４８時間インキュベートした。
【0046】
４８時間後に、ピペットの補助を使用することによって、フラスコの底に付着したＳｆ９細胞を剥離させ、１５ｍＬの培地を含む７５ｃｍ２のフラスコに移した。その後、フラスコを２７℃でインキュベーターに静置し、さらに７２時間インキュベートした。７２時間後、ピペットの補助を使用することによって、フラスコの底に付着したＳｆ９細胞を剥離させ、５０ｍＬの培地を含むコニカルチューブに移した。
【0047】
血球計数器を使用することによって、バイアルの細胞密度を計算した。最初の細胞濃度が５．０×１０５個の細胞／ｍＬになるように、５０ｍＬの培地を調製し、次いで１２５ｍＬのスピナーフラスコに移した。スピナーフラスコを、振とうインキュベーター中２７℃で４８時間、９０ｒｐｍでインキュベートした。４８時間後に、細胞生存率及び細胞濃度を調べた。この場合、細胞濃度が２．０×１０６～３．０×１０６個の細胞／ｍＬに達すると、最初の細胞濃度が５．０×１０５個の細胞／ｍＬに達するように細胞を新鮮な培地に移した。同様にして、２～３日毎に１回培地を新鮮な培地に置換した。
【0048】
実施例１．２ 組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓバキュロウイルス接種及び獲得
実施例１．１のＳｆ９細胞を、１．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で１Ｌのスピナーフラスコに播種した。その後、組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳを取り出し、恒温水槽中２７℃で２分間解凍した。完全に解凍した組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳを、０．１のＭＯＩでＳｆ９細胞に接種した。３～５日間の接種の後、Ｓｆ９細胞を組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳに感染させ、培地とともに収集した。次いで、収集した培地を４℃で１５分間、６，０００×ｇで遠心分離し、沈殿させた。
実施例１．１のＳｆ９細胞を、１．０×１０６個の細胞／ｍＬの濃度で１Ｌのスピナーフラスコに播種した。その後、組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳを取り出し、恒温水槽中２７℃で２分間解凍した。完全に解凍した組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳを、０．１のＭＯＩでＳｆ９細胞に接種した。３～５日間の接種の後、Ｓｆ９細胞を組換えＭＥＲＳ－ＣｏＶ ＳバキュロウイルスＲＷＶＳＳに感染させ、培地とともに収集した。次いで、収集した培地を４℃で１５分間、６，０００×ｇで遠心分離し、沈殿させた。
【0049】
実施例２． ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の破砕及び溶出実験
実施例２．１． ホモジナイザーでの実験
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、加えられた冷たい溶解バッファー（２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５、及びプロテアーゼ阻害剤）とともに３０分間インキュベートし、氷上で冷却し、次いでホモジナイザーを使用することによって、氷上で１２回ストロークを行った。その後、２０分間４℃及び３，０００×ｇで遠心分離を行った。次いで、ペレットを除去し、上清のみを分離し、４℃及び５，４００×ｇで３０分間再び遠心分離した。上清を除去した後、ペレットを収集し、０．５％トリトン１００、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む冷却されたバッファーで処理し、その後ホモジナイザーで５回ストロークを行った。次いで、抽出物を４℃及び５，４００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性画分を沈殿させ、上清を採取して可溶性膜画分を得た。
実施例２．１． ホモジナイザーでの実験
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、加えられた冷たい溶解バッファー（２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．５、及びプロテアーゼ阻害剤）とともに３０分間インキュベートし、氷上で冷却し、次いでホモジナイザーを使用することによって、氷上で１２回ストロークを行った。その後、２０分間４℃及び３，０００×ｇで遠心分離を行った。次いで、ペレットを除去し、上清のみを分離し、４℃及び５，４００×ｇで３０分間再び遠心分離した。上清を除去した後、ペレットを収集し、０．５％トリトン１００、１３０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭトリス、及び１ｍＭ ＥＤＴＡを含む冷却されたバッファーで処理し、その後ホモジナイザーで５回ストロークを行った。次いで、抽出物を４℃及び５，４００×ｇで３０分間遠心分離して、不溶性画分を沈殿させ、上清を採取して可溶性膜画分を得た。
【0050】
得られた画分をサンプリングすることによって、試料を調製した。試料をそれぞれ１４μＬ取り出し、次いでＥＰチューブに静置した。その後、５μＬの４Ｘ ＳＤＳローディングバッファー及び１μＬの２－メルカプトエタノールをＥＰチューブに加えた。ＥＰチューブを振とうした後、ＥＰチューブを９６℃で８分間放置した。８分後に、ＥＰチューブを１分間６，０００ｒｐｍで遠心沈殿させた。
【0051】
次いで、前処理した試料をそれぞれ１５μＬ、４％～１２％勾配ＰＡＧＥゲルに４０分間２００ボルトでロードした。この時、８μＬの着色タンパク質マーカーをともにロードした。この場合、各レーンにロードされた試料を下記の表１に示す。
【0052】
【表1】
【0053】
次いで、電気泳動デバイスからゲルを分離させ、ゲルを注意深くプレートから除去し、不要な部分を切除した。転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ、ｉＢｌｏｔ２転写スタック、ＰＶＤＦ、通常サイズ（カタログ番号ＩＢ２４００１））を調製し、次いで使用してゲルを膜に転写させた。
【0054】
次いで、２０ｍＬの５％スキムミルク溶液をウエスタンブロット容器に加え、膜を加え、膜を２０ｒｐｍで振とうし、４℃で４時間以上ブロッキングプロセスを行った。
【0055】
１５ｍＬの０．０５％スキムミルク溶液を１５ｍＬのファルコンチューブに加え、一次抗体を１：２，０００の比で加えて、一次抗体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ＃ＰＡ５－８１７８６）結合溶液を調製した。ここで一次抗体は、ＭＥＲＳ－ＣｏＶスパイクタンパク質に特異的に結合するポリクローナル抗体である。
【0056】
ブロッキングプロセスが完了した後の膜をウエスタンブロット容器に移し、１５ｍＬの一次抗体結合溶液を加え、膜を、２０ｒｐｍで振とう機を使用することによって、４℃で少なくとも１時間反応させた。
【0057】
膜を１Ｘ ＰＢＳ－Ｔバッファーで３回洗浄した。１５ｍＬの１Ｘ ＰＢＳ－Ｔバッファーを１５ｍＬのファルコンチューブに加え、ＨＲＰ標識ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ＃ａｂ２０５７１８）である二次抗体を１：５，０００の比で加えて、二次抗体結合溶液を調製した。洗浄された膜をウエスタンブロット容器に移し、１５ｍＬの、以前作成した二次抗体溶液を加え、２０ｒｐｍで１時間振とうした。次いで、膜を１Ｘ ＰＢＳ－Ｔバッファーで３回洗浄した。
【0058】
最後の洗浄ステップにおいて、製造業者の使用説明書に従って、４℃で保存した、カセット、透明なビニール袋、及びＥＣＬキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ＃３２１３４）を行い、カセットカバーを閉めて光を遮断して、暗室でＸ線フィルムを使用してカセットを露光することによって結果を確認した。
【0059】
結果として、タンパク質は可溶性膜画分として抽出されたが、少量のＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質が抽出された。ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質のほとんどは溶解せず、ペレットとして沈殿した（図２）。
【0060】
実施例２．２． ソニケーターでの実験
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、冷たい低張溶解バッファーに再懸濁した。その後、下記の表２に列挙される６種の条件で破砕実験を行った。
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、冷たい低張溶解バッファーに再懸濁した。その後、下記の表２に列挙される６種の条件で破砕実験を行った。
【0061】
【表2】
【0062】
６種の条件での破砕実験を行った後、Ｓｆ９細胞が破砕されたか否かを顕微鏡によって確かめた。結果を下記の表３に示す。
【0063】
【表3】
【0064】
表３に示されるように、低張溶解バッファーが加えられ、２０分間ソニケーションされた場合、破砕は最も良く行われた。３番及び６番の条件の試料は、最も溶解しており、表４に示される２種の条件で遠心分離された。
【0065】
【表4】
【0066】
２種の条件で分画された試料を、抽出バッファー（４０ｍＭトリス、３０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１％トリトンＸ－１００、ｐＨ７．８）の添加に供し、その後２０分間のソニケーション、及び溶出に供した。次いで、抽出物を１３，０００×ｇで３０分間遠心分離した。遠心分離された溶液をサンプリングすることによって、試料を調製した。その後、実施例２．１と同様にウエスタンブロットを行った。抽出プロセスの条件を下記の表５に示す。
【0067】
【表5】
【0068】
結果として、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の一部のみが、１％トリトンＸ－１００及び２０分間のソニケーションでも溶解及び溶出したが、そのほとんどはペレットとして沈殿した。また、１６０ｋＤａの辺りの２つのバンドの間で、上のバンドのみが溶解及び溶出し、下のバンドは全く溶出していなかった。上のバンドは糖鎖付加等の翻訳後修飾の後に正常に膜に移動したタンパク質であると推定され、下のバンドは、過剰発現及びタンパク質折り畳みの誤りのために適切に翻訳後修飾に供されないタンパク質であり、溶解せずに凝集体を形成すると推定される（図３）。
【0069】
また、トリトンＸ－１００の濃度は、既にＣＭＣ値を大きく超えており、濃度がタンパク質溶出のために一般に使用される最大濃度に達しているために、さらなる増大は有効であると予想されず、反応温度又は時間の増大は、標的タンパク質であるＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の安定性の低下、及びプロテアーゼによるタンパク質分解の増大のリスクが高いため、試みていない。代わりに、物理的力を増大させることによって溶出をさらに容易にするために、マイクロフルイダイザーを使用することによって、さらなる実験を行った。
【0070】
実施例２．３． マイクロフルイダイザーでの実験
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、４℃で保存された溶解バッファー（２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、及びｐＨ８．５）に再懸濁させた。次いで、５，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを使用することによって、細胞懸濁液を３回～５回破砕した。
実施例１．２で収集したＳｆ９細胞を、４℃で保存された溶解バッファー（２５ｍＭトリス、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、プロテアーゼ阻害剤、及びｐＨ８．５）に再懸濁させた。次いで、５，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを使用することによって、細胞懸濁液を３回～５回破砕した。
【0071】
細胞溶解物を４℃及び９，５００×ｇで１５分間遠心分離して、核、ミトコンドリア、リソソーム、及びペルオキシソームを除去した。次いで、超遠心分離機を４℃及び１５０，０００×ｇで９０分間使用することによって上清を超遠心分離してサイトゾル等を除去して、ペレットを得た（形質膜、ＥＲ、及びゴルジ）。
【0072】
得られたペレットを、４℃で保存された抽出バッファー（２５ｍＭトリス、１％トリトンＸ－１００、４０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、プロテアーゼ阻害剤、及びｐＨ８．５）に再懸濁させた。２０，０００ｐｓｉでマイクロフルイダイザーを使用することによって、膜ペレットを３回～５回破砕した。４℃及び１００，０００×ｇで４０分間超遠心分離機を使用することによって、破砕された試料を超遠心分離して、上清を得た。
【0073】
上清をサンプリングすることによって、試料を調製した。その後、実施例２．１と同様に、ウエスタンブロットを行った。この場合、各レーンにロードした試料を下記の表６に示す。
【0074】
【表6】
【0075】
結果として、マイクロフルイダイザー及び分画遠心分離を使用することによって、細胞破砕を通して、核、ＤＮＡ、小胞体、細胞質タンパク質等が除去され、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質を含む細胞膜画分が適切に溶出したことが確かめられた。また、可溶性ＭＥＲＳ－ＣｏＶ Ｓタンパク質の溶出もまた、他の方法を使用することと比較して、非常に適切に行われたことが確かめられた。また、図４に示されるように、右側のウエスタンブロットの結果の場合、大量の標的タンパク質のためにフィルムが焼き切れ、着色部分が白くなる現象があった（図４の１、２、４、及び５レーンの矢印部分）。したがって、マイクロフルイダイザーを使用した破砕及び溶出実験が、昆虫細胞での標的膜タンパク質の発現を必要とするサブユニットワクチンに有用に適用され得ることが確かめられた。
【0076】
実施例３． 膜タンパク質を分離及び精製するプロセスにおける破砕及び溶出条件の最適化
実施例２．１のホモジナイザー又は実施例２．２のソニケーターを使用することによって細胞が破砕及び溶出される場合、精製の完了後の最終的なタンパク質収率は高くて０．１ｍｇ／Ｌであるが、実施例２．３のマイクロフルイダイザーを使用した場合、最終的なタンパク質収率は、少なくとも１００倍、約１０ｍｇ／Ｌに増大したことが確かめられた。これを通して、マイクロフルイダイザーを使用することによる細胞破砕及び溶出の方法が最も適切であることが確かめられる（図５）。
実施例２．１のホモジナイザー又は実施例２．２のソニケーターを使用することによって細胞が破砕及び溶出される場合、精製の完了後の最終的なタンパク質収率は高くて０．１ｍｇ／Ｌであるが、実施例２．３のマイクロフルイダイザーを使用した場合、最終的なタンパク質収率は、少なくとも１００倍、約１０ｍｇ／Ｌに増大したことが確かめられた。これを通して、マイクロフルイダイザーを使用することによる細胞破砕及び溶出の方法が最も適切であることが確かめられる（図５）。
【0077】
特に、マイクロフルイダイザーを使用することによって細胞を破砕及び溶出させる場合、分画遠心分離を使用することによる細胞分画を適用し、それによって純度を向上させることによって、形質膜及び膜結合タンパク質を除くほとんどの異物（細胞溶解物、細胞質タンパク質、核、ミトコンドリア、ペルオキシソーム、リソソーム等）を除去することが有利であり、特に、核、ペルオキシソーム、及びリソソームを除去することによって、ＤＮＡ混入、及びプロテアーゼによるタンパク質損傷が減少し得ることが確かめられる。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【国際調査報告】