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特表2024-508876ヒト臍帯由来組成物及び神経障害の治療のためのその使用
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】ヒト臍帯由来組成物及び神経障害の治療のためのその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 35/51 20150101AFI20240220BHJP
A61K 9/10 20060101ALI20240220BHJP
A61K 47/42 20170101ALI20240220BHJP
A61K 47/10 20170101ALI20240220BHJP
A61K 47/34 20170101ALI20240220BHJP
A61K 47/32 20060101ALI20240220BHJP
A61P 25/02 20060101ALI20240220BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240220BHJP
A61K 45/00 20060101ALI20240220BHJP
A61K 47/22 20060101ALI20240220BHJP
A61K 47/36 20060101ALI20240220BHJP
A61K 47/02 20060101ALI20240220BHJP
【ＦＩ】
A61K35/51
A61K9/10
A61K47/42
A61K47/10
A61K47/34
A61K47/32
A61P25/02
A61P43/00 121
A61K45/00
A61K47/22
A61K47/36
A61K47/02
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553116
(86)(22)【出願日】2022-02-04
(85)【翻訳文提出日】2023-09-28
(86)【国際出願番号】 US2022015256
(87)【国際公開番号】W WO2022186946
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】17/461,830
(32)【優先日】2021-08-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/237,602
(32)【優先日】2021-08-27
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/156,123
(32)【優先日】2021-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】517415528
【氏名又は名称】アクソジェン コーポレーション
(74)【代理人】
【識別番号】100105957
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 誠
(74)【代理人】
【識別番号】100068755
【弁理士】
【氏名又は名称】恩田 博宣
(74)【代理人】
【識別番号】100142907
【弁理士】
【氏名又は名称】本田 淳
(74)【代理人】
【識別番号】100152489
【弁理士】
【氏名又は名称】中村 美樹
(72)【発明者】
【氏名】ハマカー、キリ ケイ．
(72)【発明者】
【氏名】ラブ、トレイシー
(72)【発明者】
【氏名】サイモン、アレック
【テーマコード（参考）】
4C076
4C084
4C087
【Ｆターム（参考）】
4C076AA09
4C076AA22
4C076AA32
4C076BB11
4C076CC01
4C076DD23A
4C076DD59
4C076EE10P
4C076EE23P
4C076EE24P
4C076EE37P
4C076EE41
4C076EE41P
4C076FF12
4C076FF35
4C076FF61
4C076FF68
4C076GG23
4C084AA19
4C084MA02
4C084MA05
4C084MA23
4C084MA28
4C084MA66
4C084NA05
4C084NA10
4C084ZA082
4C084ZA201
4C084ZA202
4C084ZA292
4C084ZB112
4C084ZC751
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB59
4C087MA02
4C087MA05
4C087MA23
4C087MA28
4C087MA66
4C087NA05
4C087NA10
4C087NA14
4C087ZA20
4C087ZC75
(57)【要約】
本開示は、ヒト臍帯（ｈＵＣ）材料から抽出された改良された生体材料を提供する。前記材料は、機械的に粉砕されることで微粉化粒子を生成し、さらにプロテアーゼで処理され、任意選択でゲル形成剤と混合される。これらの材料は、改善された炎症性／抗炎症性プロファイルを有し得、ｈＵＣ抽出物の局所投与による末梢神経障害の治療において特に有用性を提供し得る。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＥＣＭ分解プロテアーゼで処理されたヒト臍帯（ｈＵＣ）組織の微粉化粒子を含む、生理学的に緩衝化されたｈＵＣ抽出物組成物。
【請求項2】
前記ｈＵＣは、ｈＵＣ膜、ｈＵＣ間質、又はｈＵＣ膜とｈＵＣ間質の組み合わせを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
ゲル形成剤、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
前記ゲル形成剤は、約０．１～８ｍｇ／ｍｌで存在する、請求項３に記載の組成物。
【請求項5】
ゲニピン又はトランスグルタミナーゼなどの架橋剤をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項6】
前記ゲル形成剤は、フィブリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩ、コラーゲンＸＸＩＶ、又はコラーゲンＸＸＶＩＩ、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ゼラチンメタクリロイル、及びメタクリル化ヒアルロン酸のうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項7】
前記ＥＣＭ分解プロテアーゼで処理されたｈＵＣ組織はｈＵＣ膜を含み、かつ前記ゲル形成剤はフィブリンではない、請求項１に記載の組成物。
【請求項8】
前記組成物は、約ｐＨ７．２～７．４に緩衝化された生理食塩水ベースの懸濁液であるか、又は前記組成物はヒドロゲルなどのゲルとして製剤化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項9】
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、ＰＥＧ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸＩＩ、コラーゲンＸＩＩＩ、コラーゲンＸＩＶ、コラーゲンＸＶ、コラーゲンＸＶＩ、コラーゲンＸＶＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ、コラーゲンＸＩＸ、コラーゲンＸＸ、コラーゲンＸＸＩ、コラーゲンＸＸＩＩ、コラーゲンＸＸＩＩＩ、コラーゲンＸＸＶ、コラーゲンＸＸＶＩ及び／又はコラーゲンＸＸＶＩＩＩのうちの１つ以上をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項10】
前記微粉化粒子の大部分は、約８０ｎｍから約１８０ｎｍの間の直径、例えば約１４０ｎｍから約１６０ｎｍの間の直径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項11】
ヒト臍帯（ｈＵＣ）抽出物を製造する方法であって、（ａ）ｈＵＣ膜及び／又はｈＵＣ間質を提供するステップと、
（ｂ）前記ｈＵＣ膜及び／又はｈＵＣ間質を機械的に衝突させることで微粉化粒子を生成するステップと、
（ｃ）ＥＣＭ分解プロテアーゼで、（ｉ）機械的衝突の前の前記ステップ（ａ）の組成物；（ｉｉ）機械的衝突中の前記ステップ（ｂ）の組成物；及び（ｉｉｉ）前記ステップ（ｂ）から得られる微粉化粒子のうちの１つ以上を処理するステップと
を含む方法。
【請求項12】
前記プロテアーゼを不活性化することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項13】
前記ＥＣＭ分解プロテアーゼを不活性化した後、ゲル形成剤、例えば、ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤を添加が添加される、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
前記ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤を重合させることをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記重合は架橋剤の存在下で行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記架橋剤はゲニピン又はトランスグルタミナーゼである、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
前記ゲル形成剤は、フィブリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩ、コラーゲンＸＸＩＶ、又はコラーゲンＸＸＶＩＩ、ポリエチレングリコール、ポリ（乳酸－グリコール酸）、ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート、ゼラチンメタクリロイル、及びメタクリル化ヒアルロン酸のうちの１つ以上を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項18】
前記ゲル形成剤は、約０．１～８ｍｇ／ｍｌで存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項19】
０．５～１．０ｃｍ２のｈＵＣ膜及び／又はｈＵＣ間質がステップ（ａ）で提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項20】
ステップ（ａ）で提供される前記ｈＵＣ膜及び／又はｈＵＣ間質は、約ｐＨ６．０～８．０に緩衝化された生理食塩水ベースの懸濁液中に分散される、請求項１１に記載の方法。
【請求項21】
前記機械的衝突は、約３４００ＲＰＭから約３７００ＲＰＭの範囲の速度で、１サイクル当たり約６０秒の継続時間で１サイクルから約５サイクル実施される、請求項１１に記載の方法。
【請求項22】
ＥＣＭ分解プロテアーゼ処理の前に前記微粉化粒子を遠心分離することをさらに含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
前記ＥＣＭ分解プロテアーゼは、コラゲナーゼ又はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項24】
前記プロテアーゼは、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩＩ、コラゲナーゼＩＶ、コラゲナーゼＶ、コラゲナーゼＶＩ、コラゲナーゼＶＩＩ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、及びＭＭＰ－７のうちの１つ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項25】
前記コラゲナーゼは、コラゲナーゼＩ及びコラゲナーゼＩＩＩのうちの１つ以上である、請求項２３に記載の方法。
【請求項26】
ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、ＰＥＧ、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸＩＩ、コラーゲンＸＩＩＩ、コラーゲンＸＩＶ、コラーゲンＸＶ、コラーゲンＸＶＩ、コラーゲンＸＶＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ、コラーゲンＸＩＸ、コラーゲンＸＸ、コラーゲンＸＸＩ、コラーゲンＸＸＩＩ、コラーゲンＸＸＩＩＩ、コラーゲンＸＸＶＩ及びコラーゲンＸＸＶＩＩＩのうちの１つ以上が、前記ＥＣＭ分解プロテアーゼの不活性化後に前記組成物に添加される、請求項１１に記載の方法。
【請求項27】
前記機械的衝突は、約８０ｎｍから約１８０ｎｍの間の直径、例えば約１４０ｎｍから約１６０ｎｍの間の直径を有する微粉化粒子の大部分を提供する、請求項１１に記載の方法。
【請求項28】
末梢神経障害を治療する方法であって、請求項１に記載の組成物を対象の末梢神経障害の部位に注射することを含む方法。
【請求項29】
末梢神経障害を治療する方法であって、請求項１１に記載の方法によって作製された組成物を対象の末梢神経障害の部位に注射することを含む方法。
【請求項30】
前記対象がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項31】
鎮痛療法、ＮＳＡＩＤ治療、又は抗けいれん薬などの第２の療法で前記対象を治療することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項32】
前記組成物を前記部位に二度目に注射することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項33】
ヒト臍帯（ｈＵＣ）組織の微粉化粒子及び緩衝液を含む組成物であって、対象への注射用に製剤化されている、組成物。
【請求項34】
ゲルとして製剤化されている、請求項３３に記載の組成物。
【請求項35】
前記ｈＵＣ組織はプロテアーゼで処理されたものである、請求項３３に記載の組成物。
【請求項36】
１．０μｇ／ｍＬ未満のデコリンを含む、請求項３３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本開示は、概して、神経生物学、医学、及び医療処置の分野に関する。より具体的には、改善された炎症性／抗炎症性プロファイルを有するヒト臍帯（ｈＵＣ）材料から抽出された改善された生体材料、及び神経障害の治療におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【0002】
痛みを伴う神経障害は主に非外科的に治療され、多くの場合、痛みを治療するために鎮痛剤又はＮＳＡＩＤの全身投与が行われる。損傷の種類によっては、防御の第一線として、鎮痛薬及びＮＳＡＩＤが神経因性疼痛を解決し得る。しかし、鎮痛剤やＮＳＡＩＤ治療で痛みが解消しない場合、二次治療の選択肢は、抗炎症ステロイド薬（例えば、コルチコステロイド）、抗けいれん薬（例えば、プレガバリン）による治療、あるいは手術など、侵襲性又は危険性が高くなる。
【0003】
残念ながら、鎮痛剤やＮＳＡＩＤなどの現在の第一選択治療の限界は、多くの患者の痛みを伴う神経障害の解決には効果的ではないということである。多くの患者は、副作用のリスクがより高い手術や投薬（すなわち、ステロイド又は抗けいれん薬）などの二次治療選択肢を受けることになる。これらのより危険な薬で治療されるほとんどの患者が一般的に経験する副作用には、体液貯留、体重増加、頭痛、胃痛、腫れなどがある。したがって、神経障害を治療するための改善された組成物及び方法が必要とされている。
【発明の概要】
【0004】
少なくとも１つの態様において、本開示は、ＥＣＭ分解プロテアーゼで処理されたヒト臍帯（ｈＵＣ）組織の微粉化粒子を含む、生理学的に緩衝化されたｈＵＣ抽出物組成物を提供する。ｈＵＣ組織は、ｈＵＣ膜、ｈＵＣ間質、又はｈＵＣ膜とｈＵＣ間質の組み合わせを含むか、それらからなるか、又は本質的にそれらからなるものであり得る。組成物は、１つ以上のゲル形成剤、架橋剤、生体分子、酵素、及び／又は緩衝液をさらに含み得る。例えば、組成物は、ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤を含み得る。ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤は、約０．１～８ｍｇ／ｍｌで存在し得る。
【0005】
組成物は、適切な架橋剤の中でも特に、ゲニピンやトランスグルタミナーゼなどの架橋剤をさらに含み得る。ゲル形成剤、例えば、重合ゲル形成剤、例えば、熱重合ゲル形成剤は、フィブリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩ、コラーゲンＸＸＩＶ、又はコラーゲンＸＸＶＩＩのうちの１つ以上であり得るか、又はそれらを含み得る。いくつかの例では、ＥＣＭ分解プロテアーゼで処理されたｈＵＣ組織はｈＵＣ膜を含み、熱重合ゲル形成剤はフィブリンではない。組成物は、約ｐＨ７．２～７．４に緩衝化された生理食塩水ベースの懸濁液であり得る。
【0006】
組成物は、１つ以上の生体分子、例えば、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、ＰＥＧ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸＩＩ、コラーゲンＸＩＩＩ、コラーゲンＸＩＶ、コラーゲンＸＶ、コラーゲンＸＶＩ、コラーゲンＸＶＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ、コラーゲンＸＩＸ、コラーゲンＸＸ、コラーゲンＸＸＩ、コラーゲンＸＸＩＩ、コラーゲンＸＸＩＩＩ、コラーゲンＸＸＶＩ及び／又はコラーゲンＸＸＶＩＩＩをさらに含み得る。少なくとも１つの例では、組成物はコンドロイチン硫酸を含まない。組成物は微粉化粒子を含み得る。例えば、微粉化粒子の大部分は、約１４０ｎｍから約１６０ｎｍの間の直径を有し得る。
【0007】
そのような組成物の製造方法も提供される。例えば、この方法は、ヒト臍帯（ｈＵＣ）抽出物を生成することができ、この方法は、（ａ）ｈＵＣ膜及び／又は間質を提供するステップと、（ｂ）前記ｈＵＣ膜及び／又は間質を機械的に衝突させることで微粉化粒子を生成するステップと、（ｃ）ＥＣＭ分解プロテアーゼで、（ｉ）機械的衝突の前のステップ（ａ）の組成物；（ｉｉ）機械的衝突中のステップ（ｂ）の組成物；及び（ｉｉｉ）ステップ（ｂ）から得られる微粉化粒子のうちの１つ以上を処理するステップとを含む。
【0008】
本明細書の方法は、プロテアーゼを不活性化することをさらに含み得る。ＥＣＭ分解プロテアーゼを不活性化した後、ｉｎ ｓｉｔｕゲル形成剤、例えば、重合ゲル形成剤を添加してもよい。この方法は、ゲル形成剤を重合させることをさらに含み得る。重合は、ゲニピンやトランスグルタミナーゼなどの架橋剤の存在下で行われ得る。
【0009】
ゲル形成剤は、フィブリン、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＸ、コラーゲンＸＩ、コラーゲンＸＸＩＶ、又はコラーゲンＸＸＶＩＩのうちの１つ以上であり得るか、又はそれらを含み得る。ｉｎ ｓｉｔｕゲル形成剤、例えば重合ゲル形成剤は、約０．１ｍｇ／ｍｌ～８ｍｇ／ｍｌで存在し得る。ｈＵＣ膜及び／又は間質を含む約０．５～１．０ｃｍ２のｈＵＣ組織がステップ（ａ）で提供され得る。ステップ（ａ）で提供されるｈＵＣ膜及び／又は間質は、約ｐＨ６．０～８．０に緩衝化された生理食塩水ベースの懸濁液中に分散され得る。
【0010】
機械的衝突は、１サイクルから約５サイクル実施され得る。さらに、例えば、機械的衝突は、例えば約３４００ＲＰＭから約３７００ＲＰＭの範囲の速度で、１サイクル当たり約６０秒の継続時間で実施され得る。本明細書の方法は、ＥＣＭ分解プロテアーゼ処理の前に、例えば約５０００×ｇの速度で微粉化粒子を遠心分離することをさらに含み得る。
【0011】
プロテアーゼ、例えばＥＣＭ分解プロテアーゼは、コラゲナーゼＩ、コラゲナーゼＩＩＩ、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３、又はＭＭＰ－７などのコラゲナーゼ又はマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）であり得る。ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、ＰＥＧ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＩＸ、コラーゲンＸＩＩ、コラーゲンＸＩＩＩ、コラーゲンＸＩＶ、コラーゲンＸＶ、コラーゲンＸＶＩ、コラーゲンＸＶＩＩ、コラーゲンＸＶＩＩＩ、コラーゲンＸＩＸ、コラーゲンＸＸ、コラーゲンＸＸＩ、コラーゲンＸＸＩＩ、コラーゲンＸＸＩＩＩ、コラーゲンＸＸＶＩ及び／又はコラーゲンＸＸＶＩＩＩのうちの１つ以上が、例えばＥＣＭ分解プロテアーゼの不活性化後に組成物に添加され得る。機械的衝突は、約１４０ｎｍ～約１６０ｎｍの直径を有する微粉化粒子の大部分、例えば、約１４０ｎｍ～約１５０ｎｍの範囲の平均直径を有する粒度分布を提供し得る。
【0012】
本開示はまた、本明細書に記載の組成物を対象の末梢神経障害部位又はその近傍に投与する、例えば注射することを含む、末梢神経障害を治療する方法も含む。例えば、末梢神経障害を治療する方法は、本明細書に定義される方法によって作製された組成物を対象の末梢神経障害部位又はその近傍に注射することを含み得る。対象はヒト、霊長類、非ヒト哺乳動物、又は他の脊椎動物又は動物であり得る。この方法は、鎮痛療法、ＮＳＡＩＤ治療、及び／又は抗けいれん薬などの第２の療法で前記対象を治療することをさらに含み得る。本明細書における方法は、前記組成物を前記対象に少なくとも２回、３回、４回もしくは５回、又は継続的もしくは永久的、慢性的に投与、例えば注射することをさらに含み得る。
【0013】
本明細書で使用される場合、「１つ」は、１つ又は複数を意味する。本明細書で使用される場合、「含む」という単語と組み合わせて使用される場合、「１つ」という単語は、１つ又は複数を意味する。
【0014】
「又は」という用語の使用は、代替案のみを指すか、又は代替案が相互に排他的であることが明示的に示されていない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替案及び「及び／又は」のみを指す定義をサポートしている。本明細書で使用される場合、「別の」とは、少なくとも第２の又は２つ以上を意味する。
【0015】
本出願全体を通じて、「約」という用語は、値が、デバイスに固有の誤差の変動、その値を決定するために使用される方法に固有の誤差の変動、又は研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。特に断りのない限り、「約」という用語は、特定の量又は値の±５％を包含すると理解されるべきである。
【0016】
本開示の他の目的、特徴及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び特定の例は、本発明の特定の実施形態を示しているが、この詳細な説明から、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が当業者には明らかであるため、例示のみを目的として提供されていることが理解されるべきである。特定の化合物が１つの特定の一般式に属しているという理由だけで、それが別の一般式に属し得ないことを意味するわけではないことに注意されたい。
【0017】
以下の図面は、本願の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される例示的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面のうちの１つ以上を参照することによって、よりよく理解され得る。
【0018】
特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許又は特許出願の公開公報のコピーは、請求と必要な手数料の支払いに応じて、庁によって提供される。
【図面の簡単な説明】
【0019】
【図1B】実施例１で述べるｈＵＣ膜抽出物の調製を示す。ＣｏｏｌＰｒｅｐ（商標）サンプルホルダー内で６ｍ／秒の速度設定で６０秒間３サイクルホモジナイズし、続いて５０００×Ｇで１０分間遠心分離した場合の均質化ｈＵＣ。
【図2】実施例２で述べる、２６Ｇ針でシリンジから排出されたｈＵＣ膜抽出物を示す。
【図3】円形型内で３７℃で３０分間インキュベートすることを含む、実施例２で述べるコラーゲンゲル及びｈＵＣ膜抽出物の重合を示す。
【図4】実施例２で述べるコラーゲンゲルとｈＵＣ膜抽出物の重合を示す。予備重合ゲル抽出混合物を２６Ｇ針でシリンジから排出し、続いて３７℃で６０分間インキュベートした。
【図5】図５～６は、実施例３で述べる重合プロファイルを示す。ｈＵＣ抽出物をロードしたゲルは、ゲル架橋剤を添加せずに３７℃で１０分以内に重合し、架橋剤を添加すると８分以内に重合し、即効性のｉｎ ｓｉｔｕゲル重合を示した。
【図6】同上。
【図7】実施例２で述べるゲル分解プロファイルを示す。重合ゲルは、架橋剤を添加せずに生理的条件下で１日間、ゲル架橋剤を添加すると最大３６日間、その質量の５０％以上を保持した。
【図8B】抽出物は、調製条件に応じて変動する粒子分散度及び粒度分布プロファイルを含んでいた。
【図9】実施例４で述べる免疫調節アッセイの結果を示す。ｈＵＣ抽出物は、免疫バイオマーカー：ＩＬ－１ｂ、ＩＬ－１０、及びＭＭＰ－９の分泌反応を変化させることによって、炎症誘発中にｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト末梢血単核細胞の免疫応答を調節することが観察された。
【図10A】図１０Ａ～１０Ｂは、実施例４で述べるヒトＵ－９３７細胞株由来マクロファージ様細胞における免疫応答調節を示す。ｈＵＣ抽出物は、免疫バイオマーカー：ＩＬ－１β及びＩＬ－１０の分泌反応を変化させることによって、炎症誘発中にｉｎ ｖｉｔｒｏでヒトＵ９３７細胞株由来マクロファージ様細胞の免疫応答を調節した。
【図10B】同上。
【図11】実施例５で述べるコラーゲンポリマー形成のコラゲナーゼ破壊を示す。破壊されたコラーゲンポリマー断片の濃度は、コラゲナーゼでの処理により減少した。
【図12】ｈＵＣゲル組成物を調製するための例示的な概略図を示す。ｈＵＣ組成物は、抽出物を得るためにｈＵＣ組織を機械的に処理すること、抽出物を精製する（例えば、細胞破片を除去する）こと、精製抽出物をプロテアーゼで処理して炎症性成分を低減すること、及び処理／精製されたｈＵＣ抽出物を、注射に適したヒドロゲルとして製剤化することによって調製され得る。
【図13】実施例６で述べるデコリンの発現の減少を示す。ＭＭＰ－７で処理したｈＵＣ組成物は、未処理の対照と比較してデコリン（ＤＣＮ）の発現の低下を示した。
【図14A】実施例７で述べるヒトＵ－９３７細胞株由来マクロファージ様細胞における免疫応答調節を示す。
【図14B】実施例７で述べる処理及び未処理のｈＵＣ抽出物の総タンパク質含量を報告する。
【図15】実施例７で述べる免疫調節アッセイを実施するための例示的な概略図を示す。
【図16B】同上。
【図17】実施例７で述べるプロテアーゼ処理したｈＵＣ抽出物におけるデコリンの発現の低下を示す。
【図18B】同上。
【発明を実施するための形態】
【0020】
詳細な説明
上記で述べたように、羊膜／出産材料の使用は、神経障害の領域を含む組織再生の治療に有望な手段である。本開示は、改善された生体材料を生成する方法及びその使用方法を提供する。概して、本開示は、ヒト臍帯（ｈＵＣ）膜及びｈＵＣ間質切片の機械的衝突（例えば、ビーズビーティング（ｂｅａｄ－ｂｅａｔｉｎｇ）均質化）によって生成される、ｈＵＣ材料由来の生理食塩水ベースの懸濁液を対象とする。この製造技術は、炎症の調節及び健康な組織の回復に関連する可溶性生理活性成分を生理食塩水ベースの懸濁液へ豊富に放出しつつ、同じ懸濁液中のＤＮＡ、サイトゾルＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン）、及びＥＣＭタンパク質断片などのｈＵＣ膜及び間質の炎症性成分の可溶性の内容物を減少させるように設計される。この懸濁液は、ＥＣＭ－プロテアーゼ酵素（例えば、コラゲナーゼ又はＭＭＰ－７などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））とのインキュベーションによって炎症性タンパク質断片を減少させるためにさらに処理され得る。この懸濁液には、局所組織への治療薬の持続送達を促進するために、様々な濃度のコラーゲンゲルを補充することもできる。このｈＵＣ膜及び間質由来の生理食塩水ベースの懸濁液は、注射などによって組織損傷（例えば、神経障害）部位に送達され得る。本開示のこれら及び他の特徴は、以下で詳細に説明される。
上記で述べたように、羊膜／出産材料の使用は、神経障害の領域を含む組織再生の治療に有望な手段である。本開示は、改善された生体材料を生成する方法及びその使用方法を提供する。概して、本開示は、ヒト臍帯（ｈＵＣ）膜及びｈＵＣ間質切片の機械的衝突（例えば、ビーズビーティング（ｂｅａｄ－ｂｅａｔｉｎｇ）均質化）によって生成される、ｈＵＣ材料由来の生理食塩水ベースの懸濁液を対象とする。この製造技術は、炎症の調節及び健康な組織の回復に関連する可溶性生理活性成分を生理食塩水ベースの懸濁液へ豊富に放出しつつ、同じ懸濁液中のＤＮＡ、サイトゾルＤＡＭＰ（損傷関連分子パターン）、及びＥＣＭタンパク質断片などのｈＵＣ膜及び間質の炎症性成分の可溶性の内容物を減少させるように設計される。この懸濁液は、ＥＣＭ－プロテアーゼ酵素（例えば、コラゲナーゼ又はＭＭＰ－７などのマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ））とのインキュベーションによって炎症性タンパク質断片を減少させるためにさらに処理され得る。この懸濁液には、局所組織への治療薬の持続送達を促進するために、様々な濃度のコラーゲンゲルを補充することもできる。このｈＵＣ膜及び間質由来の生理食塩水ベースの懸濁液は、注射などによって組織損傷（例えば、神経障害）部位に送達され得る。本開示のこれら及び他の特徴は、以下で詳細に説明される。
【0021】
Ｉ．神経障害
神経障害とは、一般に神経損傷を指す。末梢神経障害とは、中枢神経系以外の神経の損傷、つまり脳と脊髄以外の神経の損傷を指す。例えば、末梢神経障害には、脳及び脊髄を体の他の部分につなげる感覚神経及び運動神経の損傷が含まれる。（末梢神経の損傷は、損傷の程度と影響を受ける末梢神経に応じて、感覚、運動、及び機能を損なう可能性がある。末梢神経障害には可逆的又は永続的な損傷が含まれ、その影響には突然発症する急性のもの、急速に進行するもの、又は微妙に始まり時間の経過とともに進行する症状を伴う慢性的なものがある。末梢神経障害の原因は、遺伝性又は特発性（原因不明）である可能性があり、他の病状や処方薬を伴う場合もある。
神経障害とは、一般に神経損傷を指す。末梢神経障害とは、中枢神経系以外の神経の損傷、つまり脳と脊髄以外の神経の損傷を指す。例えば、末梢神経障害には、脳及び脊髄を体の他の部分につなげる感覚神経及び運動神経の損傷が含まれる。（末梢神経の損傷は、損傷の程度と影響を受ける末梢神経に応じて、感覚、運動、及び機能を損なう可能性がある。末梢神経障害には可逆的又は永続的な損傷が含まれ、その影響には突然発症する急性のもの、急速に進行するもの、又は微妙に始まり時間の経過とともに進行する症状を伴う慢性的なものがある。末梢神経障害の原因は、遺伝性又は特発性（原因不明）である可能性があり、他の病状や処方薬を伴う場合もある。
【0022】
ＩＩ．臍帯材料及びその抽出方法
本明細書の組成物は、膜及び／又は間質を含む臍帯組織に由来する。臍帯抽出物は、他の種類の組織に由来する物質よりも神経障害の治療に利点があり得る。理論に束縛されるものではないが、例えば、臍帯組織はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を欠損しているため、臍帯組織に由来する本明細書の組成物は免疫応答の低下をもたらす可能性があると考えられる。さらに、臍帯組織は、神経修復の促進に有益であり得る生物活性成長因子、幹細胞、浮遊タンパク質、及びグルコサミンを高レベルで含む。
本明細書の組成物は、膜及び／又は間質を含む臍帯組織に由来する。臍帯抽出物は、他の種類の組織に由来する物質よりも神経障害の治療に利点があり得る。理論に束縛されるものではないが、例えば、臍帯組織はヒト白血球抗原（ＨＬＡ）を欠損しているため、臍帯組織に由来する本明細書の組成物は免疫応答の低下をもたらす可能性があると考えられる。さらに、臍帯組織は、神経修復の促進に有益であり得る生物活性成長因子、幹細胞、浮遊タンパク質、及びグルコサミンを高レベルで含む。
【0023】
本明細書に記載の組成物は、本明細書に記載のヒト臍帯材料から調製することができる。これらの材料は、任意の適切な供給源から入手できる。例えば、構成成分の少なくとも１つはヒトの組織から得ることができる。構成成分は商業的供給源から入手することもできる。構成成分は、精製されたもの、実質的に精製されたもの、部分的に精製されたもの、又は非精製のものであり得る。
【0024】
ヒト臍帯組織は、例えば、商業的供給源から、又は病院もしくは外科／出産センターから入手することができる。組織は通常、新鮮な状態又は凍結した状態で取得される。過剰な保存緩衝液、血液、又は汚染物質を除去するために、組織を洗浄することができる。過剰な液体は、例えば簡単な遠心分離ステップを使用して、又は他の手段によって除去することができる。組織は、後の均質化を容易にするために、例えば液体窒素又は他の冷却手段を使用して凍結することができる。臍帯組織の供給源は、ヒト臍帯（ｈＵＣ）であり得る。ｈＵＣ材料全体は、例えば、外科用切断ツール、手動式切断機、又は自動切断機の使用を通じて、膜及び／又は間質に無関係な材料を除去するために創面切除され得る。
【0025】
ｈＵＣはまた、「ビーズビーティング」技術などの機械的衝突を使用して抽出物を生成するために処理され得る。このような処理により、細胞デブリが除去され得る。ビーズビーティングは、水性媒体に懸濁した試料と混合したガラス、セラミック、又はスチールビーズなどを使用して生物学的試料を処理するための実験室規模の機械的方法である。試料とビーズの混合物は、例えば、スターラー又は振とうによって撹拌される。ビーズは組織材料と衝突し、組織を機械的に破壊することで治療用の生物活性分子を放出する。これは、他の機械的処理方法に比べて、生物活性分子と小さい粒子が独自に分布した微粉化抽出物を生成でき、相互汚染の心配なく一度に多くの試料を処理でき、潜在的に有害なエアロゾルをプロセス中に放出しないという利点がある。
【0026】
この方法の一例では、ある量のビーズ、例えば、組織の量と比較して等量のビーズを容器内の組織懸濁液に添加し、試料を実験室用ボルテックスミキサーで激しく混合する。処理時間は比較的遅く、特殊な振とう機よりも３～１０倍の時間がかかるが、組織を効果的に処理でき、安価である。より大きい体積かつより速い処理時間によるスケールアップ手順が検討されている。
【0027】
ビーズビーティングが成功するかどうかは、振とう機の設計機能（１分あたりの振とう振動数、シェーキングスロー又は距離、振とうの向き、及びバイアルの向きを勘案して）だけでなく、正しいビーズサイズ、ビーズの組成（ガラス、セラミック、スチール）、及びバイアル内のビーズ負荷の選択にも依存し得る。
【0028】
高エネルギービーズビーティング装置は通常、均質化中のビーズの摩擦衝突により試料を加温する。酵素などの熱に弱いタンパク質の損傷を防ぐために、ビーズビーティング中又はその後の試料の冷却が必要な場合がある。試料の加温は、短い時間間隔でビーズビーティングすること、及び／又は各間隔の間に氷／ドライアイス上で冷却すること、予め冷却したアルミニウムバイアルホルダー内で試料を処理すること、ビーズビーティング中に装置内にガス状冷却剤を循環させることによって制御できる。本明細書のいくつかの例では、処理チャンバ内の試料は、例えばＭＰ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ製の装置を使用して、ドライアイスで冷却される。
【0029】
より大きい試料体積に適した別のビーズビーター構成では、１５、５０、又は２００ｍｌチャンバー内で回転するフルオロカーボンローターを使用してビーズを撹拌する。この構成では、チャンバーを静的冷却ジャケットで囲むことができる。これと同じローター／チャンバー構成を使用して、何リットルもの細胞懸濁液を処理するのに大型の市販機械を使用することができる。現在、これらの機械は酵母、藻類、細菌などの単細胞生物の処理に限定されている。
【0030】
この最初の処理により、ｈＵＣ組織の微粉化粒子が生成され得る。例えば、ｈＵＣ抽出物は、処理条件に応じて、単峰性又は二峰性の粒度分布を有する粒子を含み得る。本明細書のいくつかの例では、組成物（以下でさらに述べるプロテアーゼによる処理の前及び／又は後）は、約５０ｎｍ～約５００ｎｍ、例えば約７０ｎｍ～約２５０ｎｍ、約８０ｎｍ～約１８０ｎｍ、約１２０ｎｍ～約３５０ｎｍ、約１５０ｎｍ～約３００ｎｍ、約１６５ｎｍ～約２００ｎｍ、約１４０ｎｍ～約１６０ｎｍ、約２００ｎｍ～約２７５ｎｍ、約１７５ｎｍ～約３２５ｎｍ、又は約２５０ｎｍ～約４５０ｎｍの範囲の平均直径を有し得る。いくつかの例では、所与の閾値を超える粒子は除去されてもよく（例えば、均質化中に放出される大きいプロテオグリカン及び／又は大きい組織断片などを除去する）、その結果、所望の単峰性又は二峰性の粒度分布が得られる。粒径は、例えば、ナノ粒子トラッキング解析法（ＮＴＡ）又は多角度動的光散乱法（ＭＡＤＬＳ）によって測定され得る。
【0031】
任意選択で、衝突プロセスの前に組織を凍結することができる。凍結ステップは、任意の適切な冷却プロセスによって行うことができる。例えば、液体窒素を使用して組織を急速冷凍することができる。あるいは、材料をイソプロパノール／ドライアイス槽の中に入れること、又は他の冷却剤で急速冷凍することもできる。市販の急速冷凍プロセスを使用することができる。さらに、材料を急速冷凍するのではなく、冷凍庫に入れて、よりゆっくりと保管温度に平衡化させることができる。組織は任意の温度で保存できる。例えば、－２０℃、－８０℃、又はその他の温度を保管に使用できる。凍結前ではなく凍結中に組織を破壊することは、組織を調製するための１つの任意選択的な方法である。
【0032】
ｈＵＣ調製物は、液体、懸濁液、又は乾燥（凍結乾燥を含むがこれに限定されない）形態であり得る。抗生物質や抗真菌剤などの抗菌剤を添加してもよい。材料は、使用前に包装して、例えば室温、又は例えば－２０℃又は－８０℃で保管することができる。
【0033】
いくつかの実施形態では、本明細書の組成物、例えばゲル組成物を調製するために使用されるｈＵＣ材料は、乾燥製剤として存在する。乾燥製剤はより小さい体積で保存でき、時間の経過による製剤の劣化を防ぐために同じ低温保存要件を必要としない場合がある。乾燥製剤は保存しておいて、使用前に再構成することができる。乾燥製剤は、例えば、本明細書に記載されるように凍結細片化ｈＵＣを調製し、次いで組成物中の水の少なくとも一部を除去することによって調製することができる。水は、任意の適切な手段によって調製物から除去することができる。水を除去する例示的な方法は、市販の凍結乾燥機を使用する凍結乾燥の使用による。適切な装置は、例えば、ニューヨーク州ガーディナーのＶｉｒｔｉｓ、ニューヨーク州ストーンリッジのＦＴＳ Ｓｙｓｔｅｍｓ、及びＳｐｅｅｄ Ｖａｃ（ニューヨーク州ファーミングデールのＳａｖａｎｔ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ Ｉｎｃ．）を通じて見つけることができる。特定の実施形態では、乾燥製剤の水分含有量は、製剤の約２０重量％未満、約１０重量％まで、約５重量％まで、又は約１重量％までとなる。いくつかの実施形態では、実質的にすべての水分が除去される。次いで、凍結乾燥した組成物を保存することができる。保管温度は、約－１９６℃未満、－８０℃未満、－５０℃未満、又は－２０℃未満から約２３℃超まで様々であり得る。必要に応じて、保存前に組成物を特性評価することができる（重量、タンパク質含量など）。
【0034】
凍結乾燥組成物は、使用前に適切な溶液又は緩衝液で再構成することができる。例示的な溶液には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、及び平衡塩類溶液（ＢＳＳ）が含まれるが、これらに限定されない。溶液のｐＨは必要に応じて調整できる。ｈＵＣの濃度は必要に応じて様々であり得る。本明細書のいくつかの例では、より濃縮されたｈＵＣ溶液が有用であるが、他の例では、低濃度のｈＵＣを含む溶液が有用である。追加の化合物を溶液に添加することができる。再構成製剤に添加できる例示的な化合物には、ｐＨ調整剤、緩衝液、コラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、抗生物質、界面活性剤、安定剤、タンパク質などが含まれるが、これらに限定されない（以下でさらに説明する）。
【0035】
ＩＩ．臍帯抽出物組成物
本開示によれば、上記のようなｈＵＣ組成物が提供される。これらの組成物に、１つ以上のゲル形成剤、架橋剤、生体分子、酵素、及び／又は緩衝液を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の他の材料をさらに処理又は補充してもよい。本明細書の組成物は、溶液又はゲルの形態などで、対象に投与するために製剤化され得る。
本開示によれば、上記のようなｈＵＣ組成物が提供される。これらの組成物に、１つ以上のゲル形成剤、架橋剤、生体分子、酵素、及び／又は緩衝液を含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の他の材料をさらに処理又は補充してもよい。本明細書の組成物は、溶液又はゲルの形態などで、対象に投与するために製剤化され得る。
【0036】
Ａ．ゲル形成剤
本明細書の組成物は、１つ以上のゲル形成剤を含み得る。適切なゲル形成剤は、人体の温度、約３７℃（９８～９９°Ｆ）で熱重合可能であり得る。例示的なゲル形成剤としては、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、及びＸＸＶＩＩ；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリ（乳酸－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）；ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（ＰＥＧＤＡ）；ゼラチンメタクリロイル（ＧｅｌＭＡ）；メタクリル化ヒアルロン酸（ＭｅＨＡ）；及びフィブリンが挙げられるが、これらに限定されない。フィブリンは、第Ｉａ因子とも呼ばれ、血液凝固に関与する繊維状の非球状タンパク質である。
本明細書の組成物は、１つ以上のゲル形成剤を含み得る。適切なゲル形成剤は、人体の温度、約３７℃（９８～９９°Ｆ）で熱重合可能であり得る。例示的なゲル形成剤としては、コラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、及びＸＸＶＩＩ；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；ポリ（乳酸－グリコール酸）（ＰＬＧＡ）；ポリ（エチレングリコール）ジアクリラート（ＰＥＧＤＡ）；ゼラチンメタクリロイル（ＧｅｌＭＡ）；メタクリル化ヒアルロン酸（ＭｅＨＡ）；及びフィブリンが挙げられるが、これらに限定されない。フィブリンは、第Ｉａ因子とも呼ばれ、血液凝固に関与する繊維状の非球状タンパク質である。
【0037】
ゲル形成剤の量は通常、約０．１ｇ／ｍＬ～約８ｍｇ／ｍＬ、例えば約０．５ｇ／ｍＬ～約５ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ～約４ｍｇ／ｍＬ、又は約３．５ｍｇ／ｍＬ～約４．５ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【0038】
コラーゲン
少なくとも１つの態様では、ｈＵＣ抽出物を含む組成物は、１つ以上のコラーゲンタイプを含み得る。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、又はＸＸＶＩＩ型を含むフィブリル形成又はネットワーク形成コラーゲンは、ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤として使用され得る（後述）。他のコラーゲンも同様に組成物に含まれ得る。
少なくとも１つの態様では、ｈＵＣ抽出物を含む組成物は、１つ以上のコラーゲンタイプを含み得る。Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩＩＩ、Ｘ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、又はＸＸＶＩＩ型を含むフィブリル形成又はネットワーク形成コラーゲンは、ｉｎ ｓｉｔｕ重合ゲル形成剤として使用され得る（後述）。他のコラーゲンも同様に組成物に含まれ得る。
【0039】
別の態様では、ｈＵＣ抽出物を含む組成物は、いずれもフィブリル形成性又はネットワーク形成性ではない１つ以上のコラーゲンタイプを含み得る。
コラーゲンは、体内の様々な結合組織の細胞外マトリックスにある主要な構造タンパク質である。結合組織の主成分として、これは哺乳類に最も豊富に含まれるタンパク質であり、体タンパク質含有量全体のうち２５％～３５％を占める。コラーゲンは、コラーゲンヘリックスとして知られる細長いフィブリルの三重らせんを形成するように結合したアミノ酸できている。それは主に腱、靱帯、皮膚などの線維組織に見られる。
コラーゲンは、体内の様々な結合組織の細胞外マトリックスにある主要な構造タンパク質である。結合組織の主成分として、これは哺乳類に最も豊富に含まれるタンパク質であり、体タンパク質含有量全体のうち２５％～３５％を占める。コラーゲンは、コラーゲンヘリックスとして知られる細長いフィブリルの三重らせんを形成するように結合したアミノ酸できている。それは主に腱、靱帯、皮膚などの線維組織に見られる。
【0040】
以下のいずれか１つ以上がｈＵＣ抽出物の組成に含まれ得る：
線維性（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶＩＩ型）
非線維性
ＦＡＣＩＴ（三重らせんが中断されたフィブリル関連コラーゲン（Ｆｉｂｒｉｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ））（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ型）
ネットワーク形成コラーゲン（ＶＩＩＩ、ＩＶ、Ｘ型）
マルチプレキシン（中断のある複数の三重らせんドメイン）（ＸＶ、ＸＶＩＩＩ型）
ＭＡＣＩＴ（三重らせんが中断された膜関連コラーゲン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ））（ＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ型）
膜貫通型コラーゲン（ＸＸＩＩＩ）
その他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩＩ型）
最も一般的な５つのタイプは、Ｉ型（皮膚、腱、血管系、器官、骨（骨の有機部分の主成分）、ＩＩ型（軟骨、軟骨の主なコラーゲン成分）、ＩＩＩ型（網状、細網線維の主成分、Ｉ型と並んで一般的に見られる）、ＩＶ型（基底膜の上皮分泌層である基底層を形成）、及びＶ型（細胞表面、毛髪、胎盤）である。
線維性（Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、Ｖ、ＸＩ、ＸＸＩＶ、ＸＸＶＩＩ型）
非線維性
ＦＡＣＩＴ（三重らせんが中断されたフィブリル関連コラーゲン（Ｆｉｂｒｉｌ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ））（ＩＸ、ＸＩＩ、ＸＩＶ、ＸＶＩ、ＸＩＸ、ＸＸ、ＸＸＩ、ＸＸＩＩ型）
ネットワーク形成コラーゲン（ＶＩＩＩ、ＩＶ、Ｘ型）
マルチプレキシン（中断のある複数の三重らせんドメイン）（ＸＶ、ＸＶＩＩＩ型）
ＭＡＣＩＴ（三重らせんが中断された膜関連コラーゲン（Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｃｏｌｌａｇｅｎｓ ｗｉｔｈ Ｉｎｔｅｒｒｕｐｔｅｄ Ｔｒｉｐｌｅ Ｈｅｌｉｃｅｓ））（ＸＩＩＩ、ＸＶＩＩ型）
膜貫通型コラーゲン（ＸＸＩＩＩ）
その他（ＶＩ、ＶＩＩ、ＸＸＶＩ、ＸＸＶＩＩＩ型）
最も一般的な５つのタイプは、Ｉ型（皮膚、腱、血管系、器官、骨（骨の有機部分の主成分）、ＩＩ型（軟骨、軟骨の主なコラーゲン成分）、ＩＩＩ型（網状、細網線維の主成分、Ｉ型と並んで一般的に見られる）、ＩＶ型（基底膜の上皮分泌層である基底層を形成）、及びＶ型（細胞表面、毛髪、胎盤）である。
【0041】
創傷治癒の４つの段階を通して、コラーゲンは創傷治癒において次の機能の一部又はすべてを担うと理解されている：
誘導機能：コラーゲン線維は線維芽細胞を誘導する役割を果たす。線維芽細胞は結合組織マトリックスに沿って移動する。
誘導機能：コラーゲン線維は線維芽細胞を誘導する役割を果たす。線維芽細胞は結合組織マトリックスに沿って移動する。
【0042】
走化性特性：コラーゲン線維上で利用できる大きい表面積は、線維形成細胞を引き付けることができ、これは治癒に役立つ。
核形成：コラーゲンは、特定の中性塩分子の存在下で、原線維構造の形成を引き起こす核形成剤として作用することができる。コラーゲン創傷包帯は、新しいコラーゲンの沈着と毛細血管の成長を方向付けるためのガイドとして機能し得る。
核形成：コラーゲンは、特定の中性塩分子の存在下で、原線維構造の形成を引き起こす核形成剤として作用することができる。コラーゲン創傷包帯は、新しいコラーゲンの沈着と毛細血管の成長を方向付けるためのガイドとして機能し得る。
【0043】
止血特性：血小板はコラーゲンと相互作用して止血栓を形成する。
Ｂ．架橋剤
本明細書の組成物は、追加的又は代替的に架橋剤を含み得る。架橋剤は総じて、あるポリマー鎖を別のポリマー鎖に連結する結合を提供する。これらの結合は共有結合又はイオン結合の形をとることがあり、ポリマーは合成ポリマー又は天然ポリマー（タンパク質など）のいずれかであり得る。ポリマー化学において、「架橋」は通常、ポリマーの物理的特性の変化を促進するために架橋を使用することを指す。生物学で「架橋」が使用される場合、それは通常、タンパク質間相互作用をチェックするか、又は生物学的材料全体の強化を生み出すために、タンパク質同士を結合する薬剤の使用を指す。
Ｂ．架橋剤
本明細書の組成物は、追加的又は代替的に架橋剤を含み得る。架橋剤は総じて、あるポリマー鎖を別のポリマー鎖に連結する結合を提供する。これらの結合は共有結合又はイオン結合の形をとることがあり、ポリマーは合成ポリマー又は天然ポリマー（タンパク質など）のいずれかであり得る。ポリマー化学において、「架橋」は通常、ポリマーの物理的特性の変化を促進するために架橋を使用することを指す。生物学で「架橋」が使用される場合、それは通常、タンパク質間相互作用をチェックするか、又は生物学的材料全体の強化を生み出すために、タンパク質同士を結合する薬剤の使用を指す。
【0044】
本開示に有用な架橋剤の例としては、ゲニピン、トランスグルタミナーゼ、イミドエステル架橋剤のジメチルスベリミダート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤ＢＳ３、及びホルムアルデヒドが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、例えば、本明細書の組成物は、１つ以上の光架橋性成分を含んでもよく、例えば、架橋を開始するためにＵＶ光が使用されてもよい。
【0045】
架橋剤のジメチルスベリミダート、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル架橋剤ＢＳ３、及びホルムアルデヒドは通常、リジンのアミノ基の求核攻撃とその後の架橋剤を介した共有結合を誘導することによって結合を形成する。長さゼロのカルボジイミド架橋剤ＥＤＣは、カルボキシルを、リジン残基又は他の利用可能な第一級アミンに結合するアミン反応性イソ尿素中間体に変換することによって機能する。ＳＭＣＣ又はその水溶性アナログであるＳｕｌｆｏ－ＳＭＣＣは、抗体開発用の抗体－ハプテンコンジュゲートの調製に使用され得る。
【0046】
ゲニピンは、クチナシ果実抽出物に含まれる化合物である。これは、クチナシ（Ｇａｒｄｅｎｉａ ｊａｓｍｉｎｏｉｄｅｓ）の果実に含まれるゲニポシドと呼ばれるイリドイド配糖体に由来するアグリコンである。ゲニピンは、タンパク質、コラーゲン、ゼラチン、及びキトサンの架橋のための天然の架橋剤である。急性毒性は低く、マウスでのＬＤ５０ｉ．ｖ．は３８２ｍｇ／ｋｇであり、したがって、グルタルアルデヒドや他の多くの一般的に使用される合成架橋試薬よりもはるかに毒性が低い。さらに、ゲニピンは薬物送達の調節剤として、またアルカロイド合成の中間体として使用できる。Ｉｎ ｖｉｔｒｏ実験では、ゲニピンが酵素脱共役タンパク質２の作用をブロックすることが示されている。
【0047】
架橋剤の別のクラスはトランスグルタミナーゼである。これは、本来、グルタミン残基側鎖のγ－カルボキサミド基（－（Ｃ＝Ｏ）ＮＨ２）とリジン残基側鎖のε－アミノ基（－ＮＨ３）との間のイソペプチド結合の形成と、それに続くアンモニア（ＮＨ３）の放出を主に触媒する酵素である。この架橋（別々の分子間）又は分子内（同じ分子内）反応が起こるように、リジン及びグルタミン残基はペプチド又はタンパク質に結合される必要がある。トランスグルタミナーゼによって形成される結合は、タンパク質分解に対して高い耐性を示す。これらの酵素は、水の存在下でグルタミン残基を脱アミド化してグルタミン酸残基にすることもできる。例えば、ストレプトマイセス・モバラエンシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ）細菌から単離されたトランスグルタミナーゼは、カルシウム非依存性酵素である。トランスグルタミナーゼの中でも、哺乳類のトランスグルタミナーゼは補因子としてＣａ２＋イオンを必要とする。
【0048】
トランスグルタミナーゼは、広範囲に架橋された、通常は不溶性のタンパク質ポリマーを形成する。これらの生体ポリマーは、生物がバリアや安定した構造を形成するために不可欠である。例としては、血栓（凝固第ＸＩＩＩ因子）、及び皮膚や毛髪である。触媒反応は通常は不可逆的であると考えられており、制御機構を通じて注意深く監視する必要がある。
【0049】
架橋剤の量は、約０．１ｍＭ～約５ｍＭ、例えば約０．５ｍＭ～約３ｍＭ、約３ｍＭ～約４ｍＭ、約１．５ｍＭ～約２．５ｍＭ、又は約１ｍＭ～約２ｍＭの範囲であり得る。
Ｃ．他の生体分子
すでに述べた作用剤に加えて、ｈＵＣ組成物は、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの１つ以上の成分をさらに含み得る。
Ｃ．他の生体分子
すでに述べた作用剤に加えて、ｈＵＣ組成物は、例えばヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、キトサン、及び／又はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの１つ以上の成分をさらに含み得る。
【0050】
ヒアルロン酸はヒアルロナンとも呼ばれ、結合組織、上皮組織、及び神経組織全体に広く分布するアニオン性の非硫酸化グリコサミノグリカンである。これは、硫酸化されていないこと、ゴルジ体の代わりに原形質膜で形成されること、及び非常に大きくなり得るという点で、グリコサミノグリカンの中でも独特である。ヒト滑膜ＨＡは、１分子あたり平均約７００万Ｄａ、又は二糖モノマー約２０，０００個である。他の情報源では３００万から４００万Ｄａと言及されている。ヒアルロナンは、細胞外マトリックスの主成分の１つとして、細胞の増殖と移動に大きく寄与しており、一部の悪性腫瘍の進行にも関与している可能性がある。
【0051】
コンドロイチン硫酸は、交互の糖（Ｎ－アセチルガラクトサミンとグルクロン酸）の鎖を含む硫酸化グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）である。これは通常、プロテオグリカンの一部としてタンパク質に結合している。コンドロイチン鎖には１００を超える個別の糖が含まれることがあり、それぞれの糖が硫酸化される位置や量は様々である。
【0052】
本明細書のいくつかの例では、組成物は、減少した量の１種以上のプロテオグリカン（例えば、ビグリカン、デコリン、バーシカンなど）及び／又は天然ｈＵＣ組織に関連する硫酸化ＧＡＧを含む。いくつかの例では、組成物は、１種以上のプロテオグリカン及び／又は天然ｈＵＣ組織に関連する硫酸化ＧＡＧを含まない。例えば、本明細書の組成物は、天然のｈＵＣ組織と比較して、ビグリカン、デコリン、及び／又はバーシカンの量が減少していてもよい。いくつかの例では、本明細書の組成物は、天然のｈＵＣ組織に存在する１つ以上のプロテオグリカン、例えば、ビグリカン、デコリン、及び／又はバーシカンを含まない（例えば、検出以下のレベルを有する）。
【0053】
キトサンは、キチンから得られるランダムに分布したβ－（１→４）－結合Ｄ－グルコサミン（脱アセチル化ユニット）とＮ－アセチル－Ｄ－グルコサミン（アセチル化ユニット）から構成される直鎖多糖である。これは、エビや他の甲殻類のキチン質の殻を水酸化ナトリウムなどのアルカリ性物質で処理することにより作られる。
【0054】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、分子量に応じてポリエチレンオキシド（ＰＥＯ）又はポリオキシエチレン（ＰＯＥ）としても知られるポリエーテル化合物である。ＰＥＧの構造は一般的にＨ－（Ｏ－ＣＨ２－ＣＨ２）ｎ－ＯＨとして表される。ＰＥＧを軸索融合に使用できる可能性は、末梢神経及び脊髄損傷を研究している研究者によって調査されている最中である。
【0055】
Ｄ．酵素処理
ｈＵＣ組織の１つ以上の処理ステップ（例えば、ビーズビーティングによる機械的衝突）の後、得られるｈＵＣ抽出物は、タンパク質モノマー及びＥＣＭ断片などの破壊されたタンパク質断片を含み得る。このような成分は、患者に投与すると副作用を引き起こしたり、悪影響をもたらす可能性がある。例えば、ｈＵＣ抽出物の特定の成分は、神経損傷部位に注射された場合、炎症反応及び／又は免疫応答を誘発するか、又は炎症反応及び／又は免疫応答に関連する可能性がある。本明細書の組成物は、神経修復の促進に有用な生物活性成分を同時に保持しながら、特定の成分を選択的に除去、減少、又は不活性化するプロテアーゼでの処理によって調製され得る。少なくとも部分的に、実質的に、又は完全に除去され得る成分には、例えば、デコリン、ビグリカン、及び／又はバーシカンなどの天然プロテオグリカンが含まれ得る。
ｈＵＣ組織の１つ以上の処理ステップ（例えば、ビーズビーティングによる機械的衝突）の後、得られるｈＵＣ抽出物は、タンパク質モノマー及びＥＣＭ断片などの破壊されたタンパク質断片を含み得る。このような成分は、患者に投与すると副作用を引き起こしたり、悪影響をもたらす可能性がある。例えば、ｈＵＣ抽出物の特定の成分は、神経損傷部位に注射された場合、炎症反応及び／又は免疫応答を誘発するか、又は炎症反応及び／又は免疫応答に関連する可能性がある。本明細書の組成物は、神経修復の促進に有用な生物活性成分を同時に保持しながら、特定の成分を選択的に除去、減少、又は不活性化するプロテアーゼでの処理によって調製され得る。少なくとも部分的に、実質的に、又は完全に除去され得る成分には、例えば、デコリン、ビグリカン、及び／又はバーシカンなどの天然プロテオグリカンが含まれ得る。
【0056】
理論に束縛されるものではないが、プロテアーゼ処理は、ＴＬＲ４経路を介した炎症に関連するＥＣＭに存在するデコリンなどのプロテオグリカンの分解又は発現の低下を引き起こす可能性があると考えられる。例えば、デコリンは炎症細胞によってＤＡＭＰとして認識され、炎症性シグナル伝達事象に影響を与えると考えられる。デコリンのようなプロテオグリカンを除去又はその量を減少させることにより、本明細書の組成物を投与した場合の対象による炎症反応のリスクを低減することができる。本開示の実施形態は、免疫応答の潜在的に有害な側面を軽減又は防止しながら、治癒を促進するように免疫系を効果的に誘導することができる。
【0057】
例えば、本明細書におけるｈＵＣ組成物の作製は、１つ以上のＥＣＭ分解プロテアーゼで処理することを含み得る。プロテアーゼは、コラゲナーゼＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖ、ＶＩもしくはＶＩＩなどのコラゲナーゼ、又は、ＭＭＰ－２、ＭＭＰ－３もしくはＭＭＰ－７などのＭＭＰを含むがこれらに限定されない他の適切なプロテアーゼであり得る。酵素処理は、ゲル形成剤（上述）の導入に先立って行うことができ、及び／又は上述の種類のコラーゲン及び／又は他のゲル形成剤を含む１つ以上の他の成分のさらなる導入に先立って行うことができる。
【0058】
コラゲナーゼは、コラーゲン内のペプチド結合を切断する酵素である。それらは、クロストリジウムなどの細菌の病因における細胞外構造の破壊を助ける。それらはガス壊疽の蔓延を促進する病原性因子と考えられている。通常、それらは筋肉細胞や他の身体器官における結合組織を標的とする。動物の細胞外マトリックスの重要な成分であるコラーゲンは、細胞から分泌された後、コラゲナーゼによるプロコラーゲンの切断によって形成される。これにより、細胞自体の内部に大きい構造が形成されるのが阻止される。コラゲナーゼは、一部の細菌によって生成されるだけでなく、通常の免疫応答の一部として体によっても生成される。この生成は、線維芽細胞や骨芽細胞などの細胞を刺激するサイトカインによって誘導され、間接的な組織損傷を引き起こす可能性がある。
【0059】
プロテアーゼの濃度は、約０．１μｇ／ｍＬ～約２５μｇ／ｍＬ、例えば約０．５μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ～約２μｇ／ｍＬ、約２．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ～約８μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ～約１５μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ～約１８μｇ／ｍＬ、約１５μｇ／ｍＬ～約２２μｇ／ｍＬの範囲であり得る。さらに、例えば、ｈＵＣ抽出物は、約５分～約１８時間、例えば、約１時間～約１６時間、約４時間～約１２時間、約８時間～約１６時間、約１２時間～約１６時間、約２時間～約８時間、約３０分～約５時間、又は約５分～約２時間の範囲の時間、プロテアーゼで処理され得る。非限定的な例において、ｈＵＣ抽出物は、約０．５μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬのプロテアーゼで、約１時間～約１６時間の範囲の時間処理され得る。
【0060】
本明細書のいくつかの例によれば、組成物を調製する方法は、プロテアーゼを少なくとも部分的に不活性化することを含む。例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、イロマスタット（例えば、ＧＭ－６００１又はＧａｌａｒｄｉｎ（商標））、又はＴＩＭＰメタロペプチダーゼ阻害剤１（ＴＩＭＰ－１）などの作用剤を添加して酵素を不動態化することができる。そのような作用剤は、ｈＵＣ抽出物中の生物活性成分に損傷を与えることなく、又は損傷を最小限に抑えながら、酵素を標的とするように選択され得る。
【0061】
Ｅ．緩衝液
本明細書の組成物、例えば修飾抽出物は、目標ｐＨを維持するために緩衝液と有利に組み合わせることができる。通常、緩衝液（例えば、ｐＨ緩衝液や水素イオン緩衝液）は、弱酸とその共役塩基又はその逆の混合物の水溶液である。緩衝液のｐＨは、少量の強酸又は強塩基を加えてもほとんど変化しない。緩衝液は、様々な化学用途でｐＨをほぼ一定の値に保つために使用される。
本明細書の組成物、例えば修飾抽出物は、目標ｐＨを維持するために緩衝液と有利に組み合わせることができる。通常、緩衝液（例えば、ｐＨ緩衝液や水素イオン緩衝液）は、弱酸とその共役塩基又はその逆の混合物の水溶液である。緩衝液のｐＨは、少量の強酸又は強塩基を加えてもほとんど変化しない。緩衝液は、様々な化学用途でｐＨをほぼ一定の値に保つために使用される。
【0062】
緩衝剤を含む溶液のｐＨは、通常、溶液中に他に何が存在するかに関係なく、限られた範囲内で変化する。生体系では、これにより酵素が意図した機能を果たすことができる。溶液のｐＨ値が上昇又は低下しすぎると、変性として知られるプロセスで酵素の有効性が低下し、これは不可逆的な場合がある。研究で使用される生体試料の大部分は、約ｐＨ７．４の緩衝液、多くの場合リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で保管される。
【0063】
生理学的ｐＨに関連するいくつかの例示的な緩衝剤には、クエン酸及びＫＨ２ＰＯ４が含まれる。ｐＫａ値の差が２以下である物質同士を組み合わせ、ｐＨを調整することにより、幅広い緩衝液を得ることができる。クエン酸は、２未満の間隔で３つのｐＫａ値を有するため、緩衝混合物の有用な成分である。他の緩衝剤を添加することにより、緩衝範囲を広げることができる。Ｎａ２ＨＰＯ４とクエン酸から構成される様々なマッキルベイン（Ｍｃｉｌｖａｉｎｅ）緩衝液は、ｐＨ３～８の緩衝液範囲を有する。本開示に適した生体系に有用な他の緩衝液としては、乳酸リンゲル液（ＬＲＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、ハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）、ゲイ平衡塩類溶液（ＧＢＳＳ）、ＴＡＰＳＯ、４－（２－ヒドロキシエチル）－１－ピペラジンエタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］－２－アミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、３－（Ｎ－モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、ピペラジン－Ｎ，Ｎ’－ビス（２－エタンスルホン酸）（ＰＩＰＥＳ）、カコジル酸塩、及び２－（Ｎ－モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）が挙げられる。
【0064】
図１２は、上記の議論及び以下の実施例に従ってｈＵＣゲル組成物を調製するための例示的な概略図を示す。示されるように、組成物は、ｈＵＣ組織の抽出物を得るための機械的処理（例えば、ビーズビーティング又は他の適切な技術）、抽出物の精製（例えば、細胞デブリを除去することを含み得る）、精製した抽出物をプロテアーゼで処理して炎症性成分を低減すること、及び処理／精製したｈＵＣ抽出物を注射に適したヒドロゲルとして製剤化することによって調製され得る。
【0065】
ＩＶ．治療方法
本開示によれば、対象における組織損傷（筋肉、腱、靱帯などを含むがこれらに限定されない）を治療する方法、特に神経障害を治療する方法も提供される。この方法は、鎮痛治療や現在利用可能な羊膜／出生組織由来の流動性製品（例えば、Ｍｉｍｅｄｘ社のＯｒｔｈｏＦｌｏなど）と比較して、末梢神経障害などの疼痛部位の優れた治療を提供し、局所組織を正常な機能を備えた健康な状態に戻すように設計されている。これは、外科的介入を受ける可能性のある患者、及びそうでない患者について症状を軽減することを目的としている。注射療法として、この方法は侵襲性が最小限になるように設計されている。注射療法としてのこの治療の低侵襲性と多用途性により、体内の痛みを伴う神経障害に対する様々な解剖学的領域の治療へのアクセスが可能になる。
本開示によれば、対象における組織損傷（筋肉、腱、靱帯などを含むがこれらに限定されない）を治療する方法、特に神経障害を治療する方法も提供される。この方法は、鎮痛治療や現在利用可能な羊膜／出生組織由来の流動性製品（例えば、Ｍｉｍｅｄｘ社のＯｒｔｈｏＦｌｏなど）と比較して、末梢神経障害などの疼痛部位の優れた治療を提供し、局所組織を正常な機能を備えた健康な状態に戻すように設計されている。これは、外科的介入を受ける可能性のある患者、及びそうでない患者について症状を軽減することを目的としている。注射療法として、この方法は侵襲性が最小限になるように設計されている。注射療法としてのこの治療の低侵襲性と多用途性により、体内の痛みを伴う神経障害に対する様々な解剖学的領域の治療へのアクセスが可能になる。
【0066】
したがって、少なくとも１つの態様では、この方法は、損傷部位へのｈＵＣ由来材料の注射を伴う。医療専門家は、足、手、及び関節（肩、肘、手首、膝など）の症状と診断に基づいて適切な部位を評価することができる。同様に、医師は、注射と画像誘導送達や患部の外科的切除を組み合わせるなど、作用剤の送達に適切な外科的処置を決定できる。
【0067】
上述したように、本明細書の組成物は、損傷部位又は治療が必要な部位又はその近傍に注射するためのゲル、例えばヒドロゲルとして製剤化することができる。組成物をゲルとして製剤化すると、より長い期間の治療が可能となり、例えば、ゲルは、その粘度、凝集性などの要因により、意図された標的部位により長く留まり得る。したがって、ゲル組成物を使用することによって徐放が達成され得る。ゲルは、分解速度、密度、剛性、及び／又はカーゴ充填量などの所望の特性を提供するように製剤化することができる。
【0068】
この方法は、一定期間にわたる複数の治療、例えば、継続的又は永続的、慢性的な治療を含み得る。例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５回以上の治療を含む任意の数の治療が行われ得る。そのような治療は、数日、数週間、数か月、さらには数年の間隔を置くこともある。
【0069】
この方法はまた、食事の変更及び／又はＮＳＡＩＤ、鎮痛剤又は抗けいれん剤の投与などの、神経障害に対する１つ又は複数の認知された治療法と併せて、本明細書に記載のｈＵＣ組成物の投与を使用する併用療法を含み得る（上記で詳細に説明されており、参照により本明細書に組み込まれる）。
【0070】
Ｖ．実施例
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を実証するために含まれるが、本質的に限定するものではない。本開示は、前述の説明及び以下の実施例と一致する追加の実施形態を包含することが理解される。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表しており、従って、その実施のための例示的なモードを構成すると考えることができることを当業者は理解するはずである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えても、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様の結果を得ることができることを理解するはずである。
以下の実施例は、本開示の例示的な実施形態を実証するために含まれるが、本質的に限定するものではない。本開示は、前述の説明及び以下の実施例と一致する追加の実施形態を包含することが理解される。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施において良好に機能することが本発明者らによって発見された技術を表しており、従って、その実施のための例示的なモードを構成すると考えることができることを当業者は理解するはずである。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、開示された特定の実施形態に多くの変更を加えても、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく同様の結果を得ることができることを理解するはずである。
【0071】
実施例１
ｈＵＣ抽出物の調製
組成物を、以下のようにｈＵＣ抽出物から調製した。ｈＵＣ膜組織の試料をチューブに充填し、７００μＬの１×ＰＢＳを添加した（図１Ａ）。次いで、試料を、ＣｏｏｌＰｒｅｐ（商標）サンプルホルダー内で６ｍ／秒の速度設定で６０秒間３サイクルホモジナイズし、続いて５０００×ｇの速度で１０分間遠心分離した（図１Ｂ）。
ｈＵＣ抽出物の調製
組成物を、以下のようにｈＵＣ抽出物から調製した。ｈＵＣ膜組織の試料をチューブに充填し、７００μＬの１×ＰＢＳを添加した（図１Ａ）。次いで、試料を、ＣｏｏｌＰｒｅｐ（商標）サンプルホルダー内で６ｍ／秒の速度設定で６０秒間３サイクルホモジナイズし、続いて５０００×ｇの速度で１０分間遠心分離した（図１Ｂ）。
【0072】
実施例２
ｈＵＣゲルの調製
ｈＵＣ抽出物とゲル形成剤によるゲルの形成を評価する研究を行った。実施例１に従って調製したｈＵＣ抽出物を注射器に充填し、２６Ｇ針を通して押し出し（図２）、ゲル形成剤としてのコラーゲンとともに３７℃で重合させてゲル（例えば、低侵襲性注射療法としての使用に適した製剤）にした。図３は、円形型内で３７℃で３０分間インキュベートした後のコラーゲンゲルとｈＵＣ膜抽出物の重合を示す。図４は、コラーゲンゲルとｈＵＣ膜抽出物の重合を示しており、予備重合したゲル抽出混合物を２６Ｇ針でシリンジから排出し、その後３７℃で６０分間インキュベートした。
ｈＵＣゲルの調製
ｈＵＣ抽出物とゲル形成剤によるゲルの形成を評価する研究を行った。実施例１に従って調製したｈＵＣ抽出物を注射器に充填し、２６Ｇ針を通して押し出し（図２）、ゲル形成剤としてのコラーゲンとともに３７℃で重合させてゲル（例えば、低侵襲性注射療法としての使用に適した製剤）にした。図３は、円形型内で３７℃で３０分間インキュベートした後のコラーゲンゲルとｈＵＣ膜抽出物の重合を示す。図４は、コラーゲンゲルとｈＵＣ膜抽出物の重合を示しており、予備重合したゲル抽出混合物を２６Ｇ針でシリンジから排出し、その後３７℃で６０分間インキュベートした。
【0073】
試料を、ゲル形成剤として様々な量のコラーゲン（１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、及び４ｍｇ／ｍＬ）を使用し、架橋剤としてゲニピン（２ｍＭ）を使用した場合と使用しない場合の両方で３０分間のインキュベーション期間をかけて調製することで、重合時間への影響を決定した。４１０ｎｍにおける吸光度を重合度の指標として使用した。結果を図５及び６に示す。ｈＵＣ抽出物をロードしたゲルは、ゲル架橋剤を添加しない場合は３７℃で８分以内、架橋剤を添加すると１０分以内に重合することが観察され、即効性のｉｎ ｓｉｔｕゲル重合が示された。架橋剤の非存在下でゲル形成剤の量を増やすと、より速い重合が観察された。４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを使用し、ゲニピンを使用せずに調製した試料は最も速い重合時間を示し、次に２ｍｇ／ｍＬのコラーゲンを使用し、ゲニピンを使用せずに調製した試料が続いた。４ｍｇ／ｍＬ及び２ｍｇ／ｍＬのコラーゲン、２ｍＭゲニピンを使用して調製した試料は、同様の重合時間を示した。最も遅い重合は、１ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと２ｍＭゲニピンで調製された試料によって示された。
【0074】
ゲル形成剤として４ｍｇ／ｍＬのコラーゲンと、架橋剤として様々な量のゲニピン（０、０．５ｍＭ、１ｍＭ、２ｍＭ、及び５ｍＭ）を組み合わせたｈＵＣ抽出物で調製した試料を使用して、時間の経過（合計６４日）に伴う重合ゲルの分解を調べるためにさらなる研究を行った。試料を１ｍＬの消化コラゲナーゼ酵素溶液中で３７℃、３０分間、６週間にわたってインキュベートした。研究は、重合及び過剰な液体の除去後に実施され、その後毎週重量を測定することで出発質量を決定し、分解に抵抗する能力を評価した。各秤量後に新鮮な酵素溶液を使用した。重合ゲルは、架橋剤を添加しない場合は生理的条件で１日間、ゲル架橋剤を添加すると最大３６日間、その質量の５０％を超える量を保持することが観察された（図７）。
【0075】
実施例３
ｈＵＣ抽出物粒径の特性評価
実施例１に従って調製したｈＵＣ抽出物を分析して、粒度分布を決定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａアナライザーを使用して、多角度動的光散乱法（ＭＡＤＬＳ）による平均直径を測定した。図８Ａは、ｈＵＣ膜組織（臍帯膜（ＵＣＭ））を４ｍ／秒、１サイクル当たり６０秒で１サイクル、２サイクル、及び３サイクルホモジナイズした試料の結果を示し、均質化時間が長くなるにつれて、粒度分布がわずかに広くなることを示している。これらのデータは、試料調製における一貫性、例えば、均質化されたｈＵＣ膜組織からの成分の一貫した混合を裏付けている。試料は、直径１６０～１８０ｎｍの範囲の粒子の大部分を有する単分散粒子懸濁液を含んでいた（図８Ａ）。粒径への影響を調べるために、さらなる研究を、速度（４ｍ／秒、５ｍ／秒、又は６ｍ／秒）とサイクル数（１、３、又は５サイクル、１サイクルあたり６０秒）の両方を変化させて行った。抽出物は、調製条件に応じて変化する粒子分散度及び粒度分布プロファイルを含んでいた（図８Ｂ）。
ｈＵＣ抽出物粒径の特性評価
実施例１に従って調製したｈＵＣ抽出物を分析して、粒度分布を決定した。Ｍａｌｖｅｒｎ Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｕｌｔｒａアナライザーを使用して、多角度動的光散乱法（ＭＡＤＬＳ）による平均直径を測定した。図８Ａは、ｈＵＣ膜組織（臍帯膜（ＵＣＭ））を４ｍ／秒、１サイクル当たり６０秒で１サイクル、２サイクル、及び３サイクルホモジナイズした試料の結果を示し、均質化時間が長くなるにつれて、粒度分布がわずかに広くなることを示している。これらのデータは、試料調製における一貫性、例えば、均質化されたｈＵＣ膜組織からの成分の一貫した混合を裏付けている。試料は、直径１６０～１８０ｎｍの範囲の粒子の大部分を有する単分散粒子懸濁液を含んでいた（図８Ａ）。粒径への影響を調べるために、さらなる研究を、速度（４ｍ／秒、５ｍ／秒、又は６ｍ／秒）とサイクル数（１、３、又は５サイクル、１サイクルあたり６０秒）の両方を変化させて行った。抽出物は、調製条件に応じて変化する粒子分散度及び粒度分布プロファイルを含んでいた（図８Ｂ）。
【0076】
実施例４
ｈＵＣ抽出物による免疫調節
ヒトＵ９３７細胞株由来のヒト末梢血単核球の免疫応答を調節するｈＵＣ抽出物の能力を、以下の免疫バイオマーカー：ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、及びＭＭＰ－９の分泌反応を変化させることにより、２つの炎症誘発中にｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した（図９及び１０Ａ～１０Ｂ）。最初の研究（図９）では、４０００ｒｐｍで１サイクル当たり３分間のｈＵＣ膜組織の均質化、合計４～５サイクルでｈＵＣ抽出物を調製した。第２の研究（図１０Ａ～１０Ｂ）では、６ｍ／秒で１サイクル当たり６０秒間のｈＵＣ膜組織の均質化、合計３サイクルでｈＵＣ抽出物を調製した。免疫調節アッセイでは、Ｕ９３７細胞培養物を２０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセタート（ＰＭＡ）で４８時間処理してマクロファージ様細胞を生成し、その後Ｍ１分化刺激（５０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ）を与えたか（「Ｓｔｉｍ」）又は刺激を与えなかった（「Ｕｎｓｔｉｍ」）。比較のために、Ｍ１培養物をそれぞれのｈＵＣ抽出物（「ＵＣ」）で処理した。結果は、ｈＵＣ抽出物が、免疫バイオマーカーＩＬ－１β及びＩＬ－１０の分泌反応を変化させることによって、炎症誘発中のヒトＵ９３７細胞株由来マクロファージ様細胞の免疫応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節することを示している。図９は、４８時間の時点での結果を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、２４、４８、７２、及び９６時間の時点での結果を示す。
ｈＵＣ抽出物による免疫調節
ヒトＵ９３７細胞株由来のヒト末梢血単核球の免疫応答を調節するｈＵＣ抽出物の能力を、以下の免疫バイオマーカー：ＩＬ－１β、ＩＬ－１０、及びＭＭＰ－９の分泌反応を変化させることにより、２つの炎症誘発中にｉｎ ｖｉｔｒｏで調査した（図９及び１０Ａ～１０Ｂ）。最初の研究（図９）では、４０００ｒｐｍで１サイクル当たり３分間のｈＵＣ膜組織の均質化、合計４～５サイクルでｈＵＣ抽出物を調製した。第２の研究（図１０Ａ～１０Ｂ）では、６ｍ／秒で１サイクル当たり６０秒間のｈＵＣ膜組織の均質化、合計３サイクルでｈＵＣ抽出物を調製した。免疫調節アッセイでは、Ｕ９３７細胞培養物を２０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセタート（ＰＭＡ）で４８時間処理してマクロファージ様細胞を生成し、その後Ｍ１分化刺激（５０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ）を与えたか（「Ｓｔｉｍ」）又は刺激を与えなかった（「Ｕｎｓｔｉｍ」）。比較のために、Ｍ１培養物をそれぞれのｈＵＣ抽出物（「ＵＣ」）で処理した。結果は、ｈＵＣ抽出物が、免疫バイオマーカーＩＬ－１β及びＩＬ－１０の分泌反応を変化させることによって、炎症誘発中のヒトＵ９３７細胞株由来マクロファージ様細胞の免疫応答をｉｎ ｖｉｔｒｏで調節することを示している。図９は、４８時間の時点での結果を示す。図１０Ａ～１０Ｂは、２４、４８、７２、及び９６時間の時点での結果を示す。
【0077】
実施例５
ｈＵＣ抽出物のプロテアーゼ（コラゲナーゼ）処理
対照との比較のためにコラゲナーゼ処理（２５μｇ／ｍＬ）を用いて研究を行い、結果を図１１に示す。示されているように、破壊されたコラーゲンポリマー断片の濃度は、未処理の対照と比較して、コラゲナーゼでの処理により減少した。コラゲナーゼ処理した試料と対照試料を、４ｍ／秒（６０分を１サイクル）及び６ｍ／秒（６０分を３サイクル）の速度設定で均質化し、両方の速度設定において、コラゲナーゼ群では対照群と比較してコラーゲンポリマー断片が減少した。
ｈＵＣ抽出物のプロテアーゼ（コラゲナーゼ）処理
対照との比較のためにコラゲナーゼ処理（２５μｇ／ｍＬ）を用いて研究を行い、結果を図１１に示す。示されているように、破壊されたコラーゲンポリマー断片の濃度は、未処理の対照と比較して、コラゲナーゼでの処理により減少した。コラゲナーゼ処理した試料と対照試料を、４ｍ／秒（６０分を１サイクル）及び６ｍ／秒（６０分を３サイクル）の速度設定で均質化し、両方の速度設定において、コラゲナーゼ群では対照群と比較してコラーゲンポリマー断片が減少した。
【0078】
実施例６
ｈＵＣ抽出物のプロテアーゼ（ＭＭＰ－７）処理
ＭＭＰ－７プロテアーゼによる処理を研究するために、修飾／処理されたｈＵＣ抽出物を調製した。ｈＵＣ組織を、６ｍ／秒で１サイクル当たり１分間のホモジナイズにより、合計３サイクル機械的に処理し、その後、ＭＭＰ－７（０．８μｇ／ｍＬ）で１６時間処理した（「処理ＵＣ」）。これは、図１２のプロセスに概略的に示されている。ＭＭＰ－７処理を行わない別の対照（「ＵＣ」）を調製した。図１３に示すように、ＭＭＰ－７で処理した抽出物は、未処理の対照と比較して、デコリン（ＤＣＮ）の発現の減少を示した。デコリンはＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
ｈＵＣ抽出物のプロテアーゼ（ＭＭＰ－７）処理
ＭＭＰ－７プロテアーゼによる処理を研究するために、修飾／処理されたｈＵＣ抽出物を調製した。ｈＵＣ組織を、６ｍ／秒で１サイクル当たり１分間のホモジナイズにより、合計３サイクル機械的に処理し、その後、ＭＭＰ－７（０．８μｇ／ｍＬ）で１６時間処理した（「処理ＵＣ」）。これは、図１２のプロセスに概略的に示されている。ＭＭＰ－７処理を行わない別の対照（「ＵＣ」）を調製した。図１３に示すように、ＭＭＰ－７で処理した抽出物は、未処理の対照と比較して、デコリン（ＤＣＮ）の発現の減少を示した。デコリンはＥＬＩＳＡキット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて測定した。
【0079】
追加のｈＵＣ抽出物を調製し、図１３と同じ条件下でＭＭＰ－７で処理した。図１４Ａに示されるデコリン発現レベルから、プロテアーゼ処理によるデコリンの約４５％の減少が確認される。デコリンの相対量の違いは、例えば異なるドナーから得られた組織又は同じ組織源内で得られた組織間の変動に関連している可能性がある。図１４Ｂは、処理試料及び対照試料について測定された総タンパク質含有量（μｇ／ｍＬ）を示しており、同様のレベルを示している。ＢＣＡ（ビシンコニン酸）タンパク質アッセイキット（ＴｈｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して総タンパク質含有量を測定し、６００種類の異なるタンパク質を試験し、そのうち４４８個のタンパク質バイオマーカーを同定した。これは、ＭＭＰ－７処理が、潜在的に有益な成分を含む他のタンパク質に重大な損傷を与えることなく、デコリン内容物を除去することに成功したことを示唆している。
【0080】
実施例７
プロテアーゼ処理したｈＵＣ抽出物による免疫調節
実施例６に従って調製した図１４Ａ～１４Ｂの試料を、免疫調節アッセイでさらに調査することで、免疫バイオマーカーＩＬ－１β及びＩＬ－１０に対するそれらの効果を決定した。Ｕ９３７細胞培養物を２０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセタート（ＰＭＡ）で４８時間処理してマクロファージ様細胞を生成し、次いでＭ１分化刺激（５０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ）を与えるか（「Ｓｔｉｍ」）、又は刺激を与えなかった（「Ｕｎｓｔｉｍ」）。また、Ｍ１培養物を未処理ｈＵＣ抽出物（「ＵＣ」）及びＭＭＰ－７処理ｈＵＣ抽出物（「処理ＵＣ」）で処理した。このアッセイを図１５に概略的に示す。図１６Ａ及び１６Ｂの結果は、プロテアーゼ処理がＩＬ－１β及びＩＬ－１０の分泌反応の低下をもたらしたことを示す。理論に束縛されるものではないが、処理ｈＵＣ抽出物中のデコリンの量が少ないと、炎症反応が減少すると考えられる。
プロテアーゼ処理したｈＵＣ抽出物による免疫調節
実施例６に従って調製した図１４Ａ～１４Ｂの試料を、免疫調節アッセイでさらに調査することで、免疫バイオマーカーＩＬ－１β及びＩＬ－１０に対するそれらの効果を決定した。Ｕ９３７細胞培養物を２０ｎｇ／ｍＬのホルボール１２－ミリスチン酸１３－アセタート（ＰＭＡ）で４８時間処理してマクロファージ様細胞を生成し、次いでＭ１分化刺激（５０ｎｇ／ｍＬ ＬＰＳ＋１０ｎｇ／ｍＬ ＩＦＮ－γ）を与えるか（「Ｓｔｉｍ」）、又は刺激を与えなかった（「Ｕｎｓｔｉｍ」）。また、Ｍ１培養物を未処理ｈＵＣ抽出物（「ＵＣ」）及びＭＭＰ－７処理ｈＵＣ抽出物（「処理ＵＣ」）で処理した。このアッセイを図１５に概略的に示す。図１６Ａ及び１６Ｂの結果は、プロテアーゼ処理がＩＬ－１β及びＩＬ－１０の分泌反応の低下をもたらしたことを示す。理論に束縛されるものではないが、処理ｈＵＣ抽出物中のデコリンの量が少ないと、炎症反応が減少すると考えられる。
【0081】
処理ｈＵＣ抽出物からの残留プロテアーゼのＩＬ－１β及びＩＬ－１０に対する影響を調査するために、追加の研究を行った。実施例６に記載されているように、ｈＵＣ抽出物を調製し、ＭＭＰ－７で処理した。未処理ｈＵＣ抽出物対照（「ＵＣ」）及びＭＭＰ－７処理ｈＵＣ抽出物（「処理ＵＣ」）のデコリンレベルを、実施例６に記載のように測定した。図１７に示される結果から、処理ｈＵＣ抽出物ではデコリンの減少が確認される。
【0082】
処理及び未処理のｈＵＣ抽出物試料を、上記のように免疫調節アッセイに供した。図１８Ａ及び１８Ｂは、それぞれ、ｈＵＣ抽出物を含まない未刺激培養物（「Ｕｎｓｔｉｍ」）、ｈＵＣ抽出物を含まない模擬（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）培養物（「Ｓｔｉｍ」）、未処理ｈＵＣ抽出物を含む模擬（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）培養物（「ＵＣ」）、ＭＭＰ－７処理ｈＵＣ抽出物を含む模擬（ｓｉｍｕｌａｔｅｄ）培養物（「処理ＵＣ」）、及びｈＵＣ抽出物を含まずＭＭＰ－７（０．８μｇ／ｍＬ）を含む刺激培養物（「ＭＭＰ－７」）についてのＩＬ－１β及びＩＬ－１０のレベルを報告している。これらの結果は、図１６Ａ～１６Ｂの結果と一致して、ｈＵＣ抽出物のプロテアーゼ処理がＩＬ－１β及びＩＬ－１０の有意な減少をもたらしたことを示している。ＭＭＰ－７単独では、「Ｓｔｉｍ」対照と比較してＩＬ－１βに影響を与えることは観察されず（図１８Ａ）、対照と比較してＩＬ－１０のわずかな（統計的に有意ではない）減少を引き起こした（図１８Ｂ）。これは、炎症反応の低下が残留プロテアーゼによるものではないことを示唆しており、プロテアーゼ処理によるデコリンの除去が免疫応答を低下させるという結論を裏付けている。
【0083】
本明細書に開示され特許請求されるすべての方法は、本開示及び当業者の知識に照らして、過度の実験を行うことなく作成及び実施することができる。本開示の組成物及び方法を例示的な実施形態に関して説明してきたが、本開示の概念、趣旨、及び範囲から逸脱することなく、本方法及び記載された方法のステップ又はステップの順序にバリエーションを適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する特定の作用剤を本明細書に記載の作用剤の代わりに使用しても、同じ又は類似の結果が得られる可能性があることは明らかである。当業者には明らかなそのような類似の代替物及び修正はすべて、添付の特許請求の範囲によって定義される開示の趣旨、範囲及び概念内にあるとみなされる。
【図1A】
【図1B】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8A】
【図8B】
【図9】
【図10A】
【図10B】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14A】
【図14B】
【図15】
【図16A】
【図16B】
【図17】
【図18A】
【図18B】
【国際調査報告】