知財求人 - 知財ポータルサイト「IP Force」
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】操作を受けた免疫細胞及びその使用
(51)【国際特許分類】
C12N 5/10 20060101AFI20240220BHJP
A61K 35/17 20150101ALI20240220BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240220BHJP
A61P 35/02 20060101ALI20240220BHJP
C12N 5/0783 20100101ALN20240220BHJP
C12N 15/62 20060101ALN20240220BHJP
C12N 15/12 20060101ALN20240220BHJP
C12N 15/13 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12N5/10 ZNA
A61K35/17
A61P35/00
A61P35/02
C12N5/0783
C12N15/62 Z
C12N15/12
C12N15/13
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554001
(86)(22)【出願日】2022-03-11
(85)【翻訳文提出日】2023-10-13
(86)【国際出願番号】 US2022019980
(87)【国際公開番号】W WO2022192691
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】63/160,338
(32)【優先日】2021-03-12
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】501335771
【氏名又は名称】ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティ
(74)【代理人】
【識別番号】100147485
【弁理士】
【氏名又は名称】杉村 憲司
(74)【代理人】
【識別番号】230118913
【弁護士】
【氏名又は名称】杉村 光嗣
(74)【代理人】
【識別番号】100214259
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 睦也
(72)【発明者】
【氏名】マイケル エス ファン
(72)【発明者】
【氏名】ジャクリーン ダグラス
(72)【発明者】
【氏名】エミリー ハン－チュン シュエ
(72)【発明者】
【氏名】ケネス ダブリュ キンズラー
(72)【発明者】
【氏名】ブライアン ジェイ モグ
(72)【発明者】
【氏名】ニコラス パパドプーロス
(72)【発明者】
【氏名】アレクサンダー エイチ パールマン
(72)【発明者】
【氏名】バート フォーゲルシュタイン
(72)【発明者】
【氏名】シビン ジョウ
【テーマコード（参考）】
4B065
4C087
【Ｆターム（参考）】
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AA94X
4B065AA94Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA01
4B065CA24
4B065CA44
4C087AA01
4C087AA02
4C087BB63
4C087NA14
4C087ZB26
4C087ZB27
(57)【要約】
本出願は、免疫細胞及び使用方法、ここで、前記免疫細胞は、キメラ抗原レセプター(CAR)、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む；及び、阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される；並びに、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される、を提供する。
【選択図】図１
【選択図】図１
【特許請求の範囲】
【請求項1】
以下を含む免疫細胞：(a) キメラ抗原レセプター(CAR)、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む；及び、
(b) 阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、
ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される；並びに、
ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される。
【請求項2】
請求項１に記載の免疫細胞、ここで、前記免疫細胞は、T細胞である。
【請求項3】
請求項１又は２に記載の免疫細胞、ここで、前記第1のエピトープは、第1の対立遺伝子から発現する、及び前記第2のエピトープは、第2の対立遺伝子から発現する、ここで、前記第1の対立遺伝子及び前記第2の対立遺伝子は、同じ遺伝子に由来する。
【請求項4】
請求項３に記載の免疫細胞、ここで、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen (HLA)）遺伝子から発現する。
【請求項5】
請求項１から４の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記第1のエピトープは、腫瘍-関連抗原（tumor-associated antigen (TAA)）である。
【請求項6】
請求項１から５の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記第2のエピトープは、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現する。
【請求項7】
請求項１から６の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン中に存在する。
【請求項8】
請求項１から６の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、HLA分子によって細胞の表面上に提示される、細胞内タンパク質中に存在する。
【請求項9】
請求項１から８の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記CARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメインを含む。
【請求項10】
請求項１から９の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記CARのヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域を含む。
【請求項11】
請求項１から１０の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン又はCD3-ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。
【請求項12】
請求項１から１１の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記iCARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、又はCTLA-4膜貫通ドメイン、を含む。
【請求項13】
請求項１から１２の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記iCARのヒンジ領域は、CD8-アルファ・ヒンジ領域、PD-1ヒンジ領域、又はCTLA-4ヒンジ領域、を含む。
【請求項14】
請求項１から１３の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記iCARの細胞内シグナリング・ドメインは、PD-1阻害性ドメイン又はCTLA-4阻害性ドメイン、を含む。
【請求項15】
請求項１から１４の何れか一項に記載の免疫細胞、ここで、前記CAR及び前記iCARは、前記免疫細胞において、コンディショナルに発現する。
【請求項16】
請求項１５に記載の免疫細胞、ここで、前記CAR及び前記iCARは、腫瘍微小環境中の前記免疫細胞において、発現する。
【請求項17】
請求項１６に記載の免疫細胞、ここで、前記免疫細胞は、synNotchレセプターを更に含む、ここで、前記synNotchレセプターは、前記免疫細胞が前記腫瘍微小環境中にある場合に、前記CAR発現及び前記iCAR発現、を活性化する。
【請求項18】
請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫細胞、及び薬学的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物。
【請求項19】
疾患を有する対象を治療する方法、ここで、前記方法は、請求項１から１７の何れか一項に記載の免疫細胞、又は請求項１８に記載の医薬組成物、を前記対象に投与するステップを含む。
【請求項20】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記疾患は、がんである。
【請求項21】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記疾患は、LOHがある前がん性の病態である。
【請求項22】
請求項２０に記載の方法、ここで、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、以前に受けたことがある。
【請求項23】
請求項２０に記載の方法、ここで、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、受ける予定である。
【請求項24】
請求項２０に記載の方法、ここで、前記がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん(esophageal cancer)、卵管がん、胆嚢がん、消化管がん、頭部及び頸部がん、血液がん、ホジキン・リンパ腫、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん(stomach cancer)、甲状腺がん、膵臓がん、腎細胞がん腫(renal cell carcinoma)、グリア芽腫及び前立腺がん、より選択される。
【請求項25】
請求項２１に記載の方法、ここで、前記前がん性の病態は、骨髄異形成症候群、後天性再生不良性貧血、ファンコニ貧血(Fanconi anemia)、発作性夜間ヘモグロビン尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)）、5q-症候群、又はクローン性LOHを有する病態細胞を特徴とする任意の症状、より選択される。
【請求項26】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記免疫細胞は、血液悪性腫瘍に存在するLOHをターゲット化する。
【請求項27】
請求項２６に記載の方法、ここで、前記血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome (MDS)）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia (AML)）、又は急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia (ALL)）、より選択される。
【請求項28】
請求項２６に記載の方法、ここで、前記血液悪性腫瘍は、マッチした、ミス-マッチの、及びハプロ同一の、血液又は骨髄移植後に、再発している。
【請求項29】
請求項１９に記載の方法、ここで、前記免疫細胞は、がん細胞中に存在する、且つ、ターゲット化したCAR T細胞療法後に又は腫瘍関連抗原に対するバイスペシフィック抗体(bispecific antibody)療法後に、再発を引き起こす、LOHを、ターゲット化する。
【請求項30】
請求項２９に記載の方法、ここで、前記腫瘍関連抗原は、CD19又はNY-ESO-1、である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本出願は、2021年3月12日に出願された米国仮特許出願第63/160,338号の優先権を主張する。この先願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、その全体がこの出願に取り込まれる。
本出願は、2021年3月12日に出願された米国仮特許出願第63/160,338号の優先権を主張する。この先願の開示は、本出願の開示の一部とみなされ、その全体がこの出願に取り込まれる。
【0002】
［技術分野］
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、操作を受けた免疫細胞に関する。
本開示は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、操作を受けた免疫細胞に関する。
【0003】
［配列リスト］
この出願は、448070389WO1seqlistingという名前のASCIIテキスト・ファイルとして電子的に提出された配列リストを含む。2011年3月11日に作成されたASCIIテキスト・ファイルのサイズは、88.7キロバイトである。ASCIIテキスト・ファイル中の内容は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
この出願は、448070389WO1seqlistingという名前のASCIIテキスト・ファイルとして電子的に提出された配列リストを含む。2011年3月11日に作成されたASCIIテキスト・ファイルのサイズは、88.7キロバイトである。ASCIIテキスト・ファイル中の内容は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
【0004】
［連邦政府が支援する研究又は開発］
この発明は、米国国立衛生研究所（the National Institutes of Health）が付与したグラントAR048522、CA006973、CA009071、CA230400及びGM073009の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において、ある種の権利を有する。
この発明は、米国国立衛生研究所（the National Institutes of Health）が付与したグラントAR048522、CA006973、CA009071、CA230400及びGM073009の下、政府の支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において、ある種の権利を有する。
【背景技術】
【0005】
がん細胞は非-がん細胞とは異なる。しかし、長年の研究にもかかわらず、がん細胞と非-がん細胞との間の分子的差異を利用して、がん細胞を選択的にターゲット化し、治療レジメン及び患者のアウトカムを改善することは、依然として活発な取り組みが行われている領域である。
【0006】
キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)を使って操作を受けた免疫細胞(例えば、T細胞) (CAR-T)は、がんなどの疾患を治療することに対する、大きな治療的可能性を有する。CAR-T治療薬は、T細胞に強力なターゲット親和性及びシグナル伝達機能を付与する。しかしながら、がん細胞を、それらを正常な細胞と区別しながら、検出することができる、及び特異的にターゲット化することができる、免疫細胞を開発する、というアンメット・ニーズ（unmet need）が依然として存在する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0007】
本開示は、本出願に記載する操作を受けた免疫細胞（例えば、T細胞）が、がん細胞を、対応する非-がん性細胞ではなく、より選択的にターゲット化とすることができる、という発見に基づく。本出願が提供する免疫細胞によって、対象におけるがんを選択的に治療すること、及び／又は非-がん細胞におけるオン-ターゲットでオフ-腫瘍の細胞傷害性を低減すること、が提供され得る。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、操作を受けた免疫細胞を、疾患(例えば、がん)における遺伝子欠損をターゲット化とするように、生成することができること、が発見された。
【0008】
本出願は、以下を含む免疫細胞：(a) キメラ抗原レセプター(CAR)、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む；及び、(b) 阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される；並びに、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される、を提供する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、T細胞である。
【0009】
いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープは、第1の対立遺伝子から発現する、及び前記第2のエピトープは、第2の対立遺伝子から発現する、ここで、前記第1の対立遺伝子及び前記第2の対立遺伝子は、同じ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen (HLA)）遺伝子から発現する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープは、腫瘍-関連抗原（tumor-associated antigen (TAA)）である。いくつかの実施形態では、前記第2のエピトープは、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン中に存在する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又はその両方は、HLA分子によって細胞の表面上に提示される、細胞内タンパク質中に存在する。
【0010】
いくつかの実施形態では、前記CARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記CARのヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記CARの細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン又はCD3-ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、又はCTLA-4膜貫通ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARのヒンジ領域は、CD8-アルファ・ヒンジ領域、PD-1ヒンジ領域、又はCTLA-4ヒンジ領域、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの細胞内シグナリング・ドメインは、PD-1阻害性ドメイン又はCTLA-4阻害性ドメイン、を含む。
【0011】
いくつかの実施形態では、前記CAR及び前記iCARは、前記免疫細胞において、コンディショナルに発現する。いくつかの実施形態では、前記CAR及び前記iCARは、腫瘍微小環境中の前記免疫細胞において、発現する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、synNotchレセプターを更に含む、ここで、前記synNotchレセプターは、前記免疫細胞が前記腫瘍微小環境中にある場合に、前記CAR発現及び前記iCAR発現、を活性化する。
【0012】
本出願は、本出願に記載の免疫細胞のうちの何れか1種、及び薬学的に許容可能な担体、を含む、医薬組成物、を提供する。
【0013】
本出願は、疾患を有する対象を治療する方法、ここで、前記方法は、本出願に記載の免疫細胞のうちの何れか1種、又は本出願に記載の医薬組成物のうちの何れか1種、を前記対象に投与するステップを含む、を提供する。いくつかの実施形態では、前記疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、前記疾患は、LOHがある前がん性の病態である。
【0014】
いくつかの実施形態では、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、以前に受けたことがある。いくつかの実施形態では、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、受ける予定である。いくつかの実施形態では、前記がんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん(esophageal cancer)、卵管がん、胆嚢がん、消化管がん、頭部及び頸部がん、血液がん、ホジキン・リンパ腫、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん(stomach cancer)、甲状腺がん、膵臓がん、腎細胞がん腫(renal cell carcinoma)、グリア芽腫及び前立腺がん、より選択される。
【0015】
いくつかの実施形態では、前記前がん性の病態は、骨髄異形成症候群、後天性再生不良性貧血、ファンコニ貧血(Fanconi anemia)、発作性夜間ヘモグロビン尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)）、5q-症候群、又はクローン性LOHを有する病態細胞を特徴とする任意の症状、より選択される。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、血液悪性腫瘍に存在するLOHをターゲット化する。いくつかの実施形態では、前記血液悪性腫瘍は、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome (MDS)）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia (AML)）、又は急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia (ALL)）、より選択される。いくつかの実施形態では、前記血液悪性腫瘍は、マッチした、ミス-マッチの、及びハプロ同一の、血液又は骨髄移植後に、再発している。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、がん細胞中に存在する、且つ、ターゲット化したCAR T細胞療法後に又は腫瘍関連抗原に対するバイスペシフィック抗体(bispecific antibody)療法後に、再発を引き起こす、LOHを、ターゲット化する。いくつかの実施形態では、前記腫瘍関連抗原は、CD19又はNY-ESO-1、である。
【0016】
別途定義されない限り、本出願で使用される全ての技術用語及び科学用語は、この発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本出願に記載されている方法及び材料と、類似な又は均等な、方法及び材料を使用して、本発明を実施することができるが、好適な方法及び材料を以下に記載する。全ての刊行物、特許出願、特許、及び本出願で言及されている他の参考文献は、その全体が参照により取り込まれる。相反がある場合、定義を含む本明細書を優先する。加えて、材料、方法、及び実施例は、説明にしかすぎず、限定することを意図するものではない。
【0017】
本発明の1つ以上の実施形態の詳細を、添付の図面及び本明細書に記載する。本発明の、他の特徴、目的、及び長所は、本明細書及び図面、並びに特許請求の範囲、から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【0018】
【図1】図１は、がんにおけるヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity (LOH)）事象をターゲット化するための細胞工学的な方策を説明する例示的な概略図を示す。「対立遺伝子A」及び「対立遺伝子B」とのラベルが付けられた矢印は、がんにおけるLOHに供される多型遺伝子の転写及び翻訳の結果としての多型タンパク質の産生を示す。NASCAR（新生物-ターゲティングの対立遺伝子-検出 CAR (Neoplasm-targeting Allele-Sensing CAR)）プラットホームは、T細胞において、CARレセプター及びiCARレセプターのペアを含む。両方のレセプターが同時に係合すると、iCARが媒介することで、近くのCARシグナル伝達がクエンチングを受ける、そして両方の対立遺伝子を発現する正常な細胞によるT-細胞活性化は回避される（左側）。しかしながら、LOHが起きたがん細胞は、前記CARをトリガーするが、iCARをトリガーしないため、NASCAR T-細胞が活性化を受ける（右側）。
【図2】図２は、in vitroで転写を行う、キャッピングを行う、及びテイリングを行う、65種の直鎖化したCARプラスミドを示す、ここで、得られたmRNAを、RNA TapeStationゲル解析によって、分解していないこと及び予想される転写物のサイズであること、について評価した。
【図3】図３は、CAR mRNAをエレクトロポレーションした後の初代ヒトT細胞のフロー・サイトメトリー評価を示す。5種の固有なCAR mRNAを、T細胞の中にエレクトロポレーションしたが、モックは、mRNAを用いずにエレクトロポレーションしたT細胞を示す。差し込み画像は、CAR mRNAをエレクトロポレーションした後のT細胞に関する、明視野画像及び蛍光画像を示す。GFP蛍光を用いてトランスフェクションの効率を評価した。
【図4】図４Ａ-４Ｃは、ファージディスプレイ技術を用いた、HLA-A3対立遺伝子-特異的scFvの同定を示す一組のグラフである。図４Ａは、GAP.A3(α-A3)又はBB7.2(α-A2)scFvの何れかを移植したCARを発現するT細胞を、A2及びA3(T2A3)を発現するターゲット細胞株と、又はA2のみ(T2)を発現するターゲット細胞株と、共-インキュベーションし、分泌IFN-γについてのELISAにより、T-細胞活性化を、評価した場合の結果を示す。図４Ｂは、A2及びA3(T2A3細胞)を、又はA2のみ(T2細胞)を、発現する細胞株への結合について、フロー・サイトメトリーにより、富化した候補A3ファージ・クローンを評価した、結果を示す。NCは、ファージが無いコントロールを示す。図４Ｃは、BB7.2(α-A2)又はクローン13(α-A3)scFvの何れかを移植したCARを発現するT細胞を、示したHLA-A又はHLA-B対立遺伝子をトランスフェクションしたCOS-7細胞と、1:1というE:T比率で、共-インキュベーションした場合の結果を示す。T-細胞の活性化を、分泌IFN-γについてのELISAによって、評価した。
【図5】図５Ａ-５Ｃは、HLA-A対立遺伝子-ターゲティングscFv及び同質遺伝子の細胞株モデルの作製に関する結果を示す。図５Ａは、様々な固定化したHLA対立遺伝子に対するA2-scFvの結合性を、ELISAによって評価したグラフである。図５Ｂは、様々な固定化したHLA対立遺伝子に対するA3-scFvの結合性を、ELISAによって評価したグラフである。図５Ｃは、CRISPRを媒介してHLA-A遺伝子座を破壊した後の、HLA KO同質遺伝子がん細胞株に関する、α-A2(BB7.2-PE)及びα-A3(GAP.A3-APC)抗体を用いたフロー・サイトメトリー評価を示す。
【図7】図７Ａ-７Ｆは、NASCARの最適化中に使用する、CAR及びiCARデザインの概要を示す、例示的な概略図である。図７Ａは、CD28-ヒンジ式の第2世代CARを示す。図７Ｂは、CD8α-ヒンジ式の第2世代CARを示す。図７Ｃは、CD8αのヒンジ及び膜貫通ドメインを有するPD-1細胞質ドメインのiCARを示す。図７Ｄは、内因性PD-1のヒンジ及び膜貫通ドメインを有するPD-1細胞質ドメインのiCARを示す。図７Ｅは、CD8αヒンジ及び膜貫通ドメインを有するCTLA-4細胞質ドメインのiCARを示す。図７Ｆは、内因性CTLA-4のヒンジ及び膜貫通ドメインを有するCTLA-4細胞質ドメインのiCARを示す。
【図8】図８は、示したCAR及びバリアントiCARの組合せで構成されたT細胞を、示したHLA-A対立遺伝子をトランスフェクトしたCOS-7細胞と、1:1というE:T比率で、共-インキュベーションした場合の結果を示す棒グラフである。T-細胞活性化を、分泌IFN-γについてのELISAによって評価した。
【図9】図９は、示したヒンジ・バリアントCAR及びiCARの組合せで構成されたT細胞を、示したHLA-A対立遺伝子の状態であるCFPAC-1 HLA KO同質遺伝子細胞株と、1:1のE:T比率で、共-インキュベーションした場合の棒グラフである。T-細胞活性化を、分泌IFN-γについてのELISAによって評価した。
【図10】図１０は、エレクトロポレーションしたmRNAとCAR発現との間の相関を示すグラフである。CAR発現を、GFPレベルによって評価されるように、フロー・サイトメトリーによって評価した、ここで、示した量のCAR mRNAを、初代ヒトT細胞の中にエレクトロポレーションした。
【図11】図１１は、対立遺伝子-特異的な阻害についてのNASCARの化学量論的な最適化を示すグラフである。示した量及び比率のCAR及びiCARで構成されたT細胞を、示したHLA-A対立遺伝子の状態であるCFPAC-1 HLA KO同質遺伝子細胞株と、1:1というE:T比率で、共-インキュベーションした。T-細胞活性化を、分泌IFN-γについてのELISAによって評価した。
【図12】図１２Ａ-１２Ｃは、in vitroでのNASCARの特異性を示す一組の棒グラフである。LOHに関する3種の同質遺伝子がん細胞株を用いて、NASCARの特異性を決定した。示したHLA-A対立遺伝子の状態であるがん細胞を、示した対立遺伝子-ターゲティングCAR及びiCARレセプターの組合せで構成された、CAR又はNASCAR T細胞と、2:1というE:T比率で、共-インキュベーションした。T-細胞活性化を、ヒトIFN-γ、hIFN-γ（図１２Ａ）及びヒトIL-2、hIL-2（図１２Ｂ）の放出についてのELISAによって、評価した。CAR又はNASCAR T細胞によって媒介される細胞傷害性を、CellTiter-Glo(CFPAC-1、NCI-H441)又はSteady-Glo(RPMI-6666)によって測定した（図１２Ｃ）。
【図13】図１３Ａ-１３Ｂは、「自己」T細胞における、NASCAR自己反応性及び再-チャレンジ、に関する評価を示す一組の棒グラフである。図１３Ａは、示したHLA-A対立遺伝子を有する、2つの異なるドナー(donor)に由来する、A2-CAR T細胞又はA3消失をターゲティングするNASCAR T細胞を独立して培養し、分泌されたIFN-γについてのELISAによって、T-細胞自己反応性を評価した、場合の結果を示す。図１３Ｂは、示したHLA-A対立遺伝子を有する、2つの異なるドナー(donor)に由来する、A2-CAR T細胞又はA3消失をターゲティングするNASCAR T細胞を、示したHLA-A対立遺伝子の状態である、CFPAC-1 HLA KO同質遺伝子細胞株と、1:1というE:T比率で、共-インキュベーションした場合の結果を示す。CFPAC-1ターゲット細胞への再-チャレンジ時のT-細胞活性化を、分泌されたIFN-γについてのELISAによって評価した。
【図14】図１４Ａ-１４Ｄは、CRISPR-操作を受けたNASCAR T細胞の生成及び対立遺伝子-特異性を示す。図１４Ａは、同時にTRAC KOを伴う又は伴わない、示した発現カセットをB2M遺伝子座でノックインした後の、CRISPR-操作を受けたA3-CAR T細胞又はA2の消失をターゲティングするNASCAR T細胞に関する、タンパク質L及びα-CD3抗体を用いた、フロー・サイトメトリー評価を示す。図１４Ｂは、同時にTARC KOを伴う、示した発現カセットをB2M遺伝子座でノックインした後の、CRISPR-操作を受けたA3-CAR T細胞又はA2の消失をターゲティングするNASCAR T細胞に関する、A2又はA3 pHLA四量体を用いた、フロー・サイトメトリー評価を示す。図１４Ｃ-１４Ｄは、CRISPR-操作を受けたA3-CAR T細胞又はA2の消失をターゲティングするNASCAR T細胞を、示したHLA-A対立遺伝子の状態である、CFPAC-1 HLA KO同質遺伝子細胞株と、1:1という編集効率-補正済みのE:T比率で、共-インキュベーションし、T-細胞活性化を、分泌IFN-γ（図１４Ｃ)及びIL-2（図１４Ｄ)についてのELISAによって評価した場合の結果を示す、一組の棒グラフである。
【図15】図１５Ａ-１５Ｂは、in vivoでのNASCAR抗腫瘍活性に関する評価を示す。図１５Ａは、片方の横腹の皮下(SQ)での異種移植片モデルを示す例示的な概略図である、ここで、NSGマウスを使用し、CRISPR-操作を受けたA3-CAR T細胞又はA2の消失をターゲティングするNASCAR T細胞を、腫瘍接種の10日後に、尾静脈(IV)注射投与を介して導入した。腫瘍を、腫瘍接種後75日間、隔週で測定した。図１５Ｂは、外部キャリパー測定によって連続的にモニタリングした、腫瘍増殖曲線を示す一組のグラフである。差し込みグラフは、治療の最初の45日間に関する、拡大ウィンドウを示す。N=1群当たり6匹のマウス。
【図16】図１６は、片方の横腹の皮下での異種移植片モデルを示す一組の図である、ここで、NSGマウスを用い、CRISPR-操作を受けたA3-CAR T細胞又はA2の消失をターゲティングするNASCAR T細胞を、腫瘍接種の10日後に、尾静脈IV注射投与を介して導入した。マウスの体重を、75-日間の実験期間を通して、連続的にモニターした。N=1群当たり6匹のマウス。
【図17】図１７Ａ-１７Ｆは、次世代LOHターゲティングを示す例示的な概略図である。図１７Ａは、遺伝子的にリンクしていない分子に適用されるNASCARターゲティングを示す。図１７Ｂは、HLA分子の中で細胞表面上に提示される細胞内多型ペプチドに適用される、NASCARターゲティングを示す。図１７Ｃ-１７Ｅは、NASCAR-ベースのターゲティングに適したLOHによって明らかにされた腫瘍-特異的な阻害性マーカーに関するモデルを示す。図１７Ｆは、NASCAR発現カセットに関する、TAA-特異的なsynNotchレセプター-駆動のコンディショナルな発現を示す。TFは、転写因子を示す。
【図18】図１８は、がんにおけるLOH事象をターゲット化するための提案する方策を説明する例示的な概略図である。LOH事象の入力は、構成的に発現する、タンデムLOH-感知Notchレセプターによって統合を受け、IL-2転写出力プログラムを調節する。そのIL-2発現カセットを、他の所望の導入遺伝子（例えば、CAR、治療抗体、細胞傷害性因子等）と置き換えることができる。
【図19】図１９は、IL-2についてのELISAによって評価した、synNotch-NASCAR活性を示す棒グラフである。示したHLA-A対立遺伝子の状態であるCFPAC-1がん細胞を、示した対立遺伝子-ターゲティングsynNotch活性化因子の及び／又は抑制性因子のmRNA、並びにIL-2 DNA応答エレメント、の組合せを用いて構成されたsynNotch-NASCAR T細胞と共-インキュベーションした。
【図20】図２０Ａ-２０Ｃは、対をなすCAR構築物及びiCARバリアントに関する例示的な概略図である。図２０Ａは、前記CAR構築物が、scfv、CD8アルファ・ヒンジ・ドメイン、CD28膜貫通及び細胞内ドメイン、並びにCD3ゼータ細胞内ドメイン、から構成される例示的な概略図を示す。前記iCARは、scfv、CD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにPD-1細胞内ドメイン、から構成される。図２０Ｂは、前記CAR構築物が、scfv、CD28ヒンジ／膜貫通／細胞内ドメイン、及びCD3ゼータ細胞内ドメイン、から構成される例示的な概略図を示す。前記iCARは、scfv、CD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにPD-1細胞内ドメイン、から構成される。図２０Ｃは、前記CAR構築物が、scfv、ヒトCD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、並びにCD3ゼータ細胞内ドメイン、から構成される例示的な概略図を示す。提示された2種のiCARは両方とも、マウスCD8アルファ・ヒンジ・ドメインに結合したscfvを有する（ヘテロ二量体化を防止するため）。1つのiCARバリアントは、SHP-1ドメインに連結したマウスCD8アルファ膜貫通ドメインを含む。もう1つ他のiCARバリアントは、LAIR1膜貫通及び細胞内ドメイン、並びにPTPN6 SH2ドメインがCD148ホスファターゼ・ドメインに連結している別個のキメラ分子、を含む。
【図21】図２１は、CAR及びiCAR相同組換え修復(homology directed repair)テンプレートの例示的な概略図を示す、ここで、CAR及びiCAR構築物は、CRISPR Cas9によって二本鎖DNA切断が誘導された後、B2M遺伝子座での相同組換え修復(homology directed repair)を介して、dsDNAテンプレートとして、T細胞の中に導入されるように、設計されている。ホモロジーアーム、2A配列、CAR、iCAR、及びポリAターミネーター等の主要な構成要素には、ラベルが付けられている。
【図22】図２２Ａ-２２Ｂは、CAR及びiCAR構築物に関するフロー特性評価を示す、ここで、B2M遺伝子座に対してターゲット化したCas9 RNP、及びdsDNA相同組換え修復(homology directed repair)テンプレートを、エレクトロポレーションすることを介して、CAR及びiCAR構築物を、初代ヒトT細胞の中に導入する。T細胞を、最初にエレクトロポレーションをした6日後に、フロー・サイトメトリーを介して、アッセイした。図２２Ａは、単一の生細胞のタンパク質L標識を示す（A3-CARのラベルを付けた）。図２２Ｂは、単一の生細胞のA2及びA3四量体染色を示す。
【発明を実施するための形態】
【0019】
［詳細な説明］
本開示は、本出願に記載する操作を受けた免疫細胞（例えば、T細胞）が、がん細胞を、対応する非-がん性細胞ではなく、より選択的にターゲット化とすることができる、という発見に基づく。本出願が提供する免疫細胞によって、対象における、がん若しくは前がん病態（例えば、骨髄異形成症候群などの骨髄性障害）を選択的に治療すること、及び／又は非-がん細胞におけるオン-ターゲットでオフ-腫瘍の細胞傷害性を低減すること、ここで、操作を受けた免疫細胞は、疾患（例えば、がん）における細胞表面抗原の消失をターゲット化するように生成されうるということが発見されている、が提供され得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)を使って操作を受けた免疫細胞(例えば、T細胞) (CAR-T)は、がん等の疾患を治療するための大きな治療可能性を有する。CAR治療薬は、T細胞に強力なターゲット親和性及びシグナル伝達機能を付与する。しかしながら、がん細胞を、それらを正常な細胞と区別しながら、検出することができる、及び特異的にターゲット化することができる、免疫細胞を開発する、というアンメット・ニーズ（unmet need）が依然として存在する。
本開示は、本出願に記載する操作を受けた免疫細胞（例えば、T細胞）が、がん細胞を、対応する非-がん性細胞ではなく、より選択的にターゲット化とすることができる、という発見に基づく。本出願が提供する免疫細胞によって、対象における、がん若しくは前がん病態（例えば、骨髄異形成症候群などの骨髄性障害）を選択的に治療すること、及び／又は非-がん細胞におけるオン-ターゲットでオフ-腫瘍の細胞傷害性を低減すること、ここで、操作を受けた免疫細胞は、疾患（例えば、がん）における細胞表面抗原の消失をターゲット化するように生成されうるということが発見されている、が提供され得る。いくつかの実施形態では、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)を使って操作を受けた免疫細胞(例えば、T細胞) (CAR-T)は、がん等の疾患を治療するための大きな治療可能性を有する。CAR治療薬は、T細胞に強力なターゲット親和性及びシグナル伝達機能を付与する。しかしながら、がん細胞を、それらを正常な細胞と区別しながら、検出することができる、及び特異的にターゲット化することができる、免疫細胞を開発する、というアンメット・ニーズ（unmet need）が依然として存在する。
【0020】
いくつかの実施形態では、本出願は、CAR、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、及び、阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープ（例えば、がん細胞の表面に存在しないエピトープ）に特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、を含む免疫細胞を提供する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される。
【0021】
これらの免疫細胞に関する、様々な非-限定的な態様を、本出願は記載する、及び限定することなく任意の組合せで使用することができる。免疫細胞の様々な構成要素の更なる態様は、当該技術分野において公知である。
【0022】
本出願で使用する場合、用語「投与」は、組成物を対象に投与することを、又は前記組成物である、若しくは前記組成物中に含まれる、作用因子の送達を達成するためのシステムを、典型的には指す。当業者は、適切な状況において、対象（例えば、ヒト）への投与のために利用され得る様々な経路を、分かるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、投与は、眼、経口、非経口、局所、等、であることがある。いくつかの特定の実施形態では、投与は、気管支（例えば、気管支点滴注入による）、口腔、皮膚（例えば、それは、前記皮膚への局所、皮内（intradermal）、皮内（interdermal）、経皮などのうちの1種以上、であることがある、又は、を含むことがある)、経腸、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、くも膜下腔(intrathecal)、静脈内、脳室・心室内（intraventricular）、特定の臓器内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻腔内、口、直腸、皮下、舌下、局所、気管内（例えば、気管内点滴注入による）、膣、硝子体、等、であることがある。いくつかの実施形態では、投与は、単回用量のみを含むことがある。いくつかの実施形態では、投与は、一定回数の用量の適用を含むことがある。いくつかの実施形態では、投与は、断続的な（例えば、時間的に分離された複数の用量）投薬である投薬、及び／又は周期的な（例えば、通常の時間期間で分離された個々の用量）投薬である投薬、を含むことがある。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択した時間期間、連続的な投薬（例えば、潅流）を含むことがある。
【0023】
当該技術分野で知られているように、「親和性」は、特定のリガンドがそのパートナーに結合する厳密さに関する尺度である。親和性は、様々な方法で測定することができる。いくつかの実施形態では、親和性を、定量的なアッセイによって測定する。いくつかのそのような実施形態では、結合パートナーの濃度を、生理学的状態を模倣するように、リガンド濃度を過剰にして、固定することがある。代替的に又は追加的に、いくつかの実施形態では、結合パートナーの濃度及び／又はリガンドの濃度を、変化させることがある。いくつかのそのような実施形態では、親和性を、比較可能な条件（例えば、濃度）下で、参照と、比較することがある。
【0024】
本出願で使用する場合、用語「抗体作用因子」は、特定の抗原に特異的に結合する作用因子を指す。いくつかの実施形態では、前記用語は、特異的な結合を付与するのに充分な免疫グロブリンの構造的な要素を含む、任意のポリペプチド又はポリペプチド複合体、を包含する。例示的な抗体作用因子としては、限定されるものではないが、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、及びそれらのフラグメント、が挙げられる。いくつかの実施形態では、当該技術分野で知られているように、抗体作用因子は、ヒト化した、霊長類化した、キメラ化した、等、の1つ以上の配列要素、を含むことがある。多くの実施形態では、用語「抗体作用因子」を、代替的な提示において、抗体の構造的な及び機能的な特徴を利用するための、当該技術分野で既知の又は開発された、構築物又はフォーマット、のうちの1つ以上を指すために使用する。例えば、いくつかの実施形態では、本出願において提供される材料及び方法に従って使用される抗体作用因子は、限定されるものではないが、インタクトなIgA、IgG、IgE又はIgM抗体；バイ-又はマルチ-スペシフィック抗体（例えば、Zybody(登録商標)など）；抗体フラグメント、例えば、Fabフラグメント、Fab’フラグメント、F(ab')2フラグメント、Fd'フラグメント、Fdフラグメント、及び単離したCDR又はそれらのセット；単鎖Fv(scFv)；ポリペプチド-Fc融合物；単一ドメイン抗体（例えば、IgNAR又はそのフラグメント等のサメ単一ドメイン抗体）；ラクダ抗体（cameloid antibody）；マスクされた抗体（例えば、Probody(登録商標))；小型モジュール式免疫医薬品（Small Modular ImmunoPharmaceuticals (“SMIPTM”)）；単鎖又はタンデムのダイアボディ(TandAb(登録商標))；VHH； Anticalin(登録商標)；Nanobody(登録商標)ミニボディ（minibody）；BiTE(登録商標)；アンキリン・リピート・タンパク質又はDARPIN(登録商標)；Avimer(登録商標)；DART；TCR-様抗体；Adnectin(登録商標)；Affilin(登録商標)；Trans-body(登録商標)；Affibody(登録商標)；TrimerX(登録商標)；MicroProtein； Fynomer(登録商標)、Centyrin(登録商標)及びKALBITOR(登録商標)、より選択されるフォーマットである。いくつかの実施形態では、抗体作用因子は、ポリペプチド（そのアミノ酸配列は、免疫グロブリン可変ドメインとして当業者によって認識される構造要素を含む）、である、又は、を含む。いくつかの実施形態では、抗体作用因子は、免疫グロブリン-結合ドメインと相同である、又は大部分相同である、結合ドメインを有するポリペプチド・タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗体作用因子は、キメラ抗原レセプター(CAR)の少なくとも一部、である、又は、を含む。いくつかの実施形態では、抗体作用因子は、T細胞レセプター（TCR）、である、又は、を含む。
【0025】
本出願で使用する場合、用語「抗原」は、抗体作用因子に結合する作用因子を指す。いくつかの実施形態では、抗原は、抗体作用因子に結合する、及び生物において、特定の生理学的反応を誘導することがある、又はしないことがある。一般的に、抗原は、例えば、低分子、核酸、ポリペプチド、糖質(carbohydrate)、脂質、ポリマー（例えば、生物学的ポリマー［例えば、核酸及び／若しくはアミノ酸ポリマー］、並びに生物学的ポリマー以外のポリマー［例えば、核酸若しくはアミノ酸ポリマー以外］等）等の任意の化学的実体、であることがある、又は、を含むことがある。いくつかの実施形態では、抗原は、ポリペプチド、である、又は、を含む。いくつかの実施形態では、抗原は、グリカン、である、又は、を含む。当業者は、一般的に、抗原は、単離された形態、又は純粋な形態、で提供されることがある、あるいは粗形態で提供されることがある（例えば、他の物質と一緒に、例えば、細胞抽出物等の抽出物又は抗原を含有する源の他の比較的粗製の調製物として）、ということを理解するであろう。いくつかのある特定の実施形態では、抗原は、細胞の環境の中で存在する（例えば、抗原は、細胞の表面上で発現する、又は細胞中で発現する）。いくつかの実施形態では、抗原は、組換え抗原である。
【0026】
本出願で使用する場合、「抗原-結合ドメイン」は、ターゲット部分又は実体に、特異的に結合する、抗体作用因子又はその一部分、を指す。典型的には、抗原結合ドメインとそのターゲットとの間の相互作用は、非-共有結合性である。いくつかの実施形態では、ターゲット部分又は実体は、例えば、糖質(carbohydrate)、脂質、核酸、金属、ポリペプチド、又は低分子等を含む、任意の化学的クラスのものであることがある。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、ポリペプチド（又はその複合体）、であることがある、又は、を含むことがある。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、融合ポリペプチドの一部である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、キメラ抗原レセプター(CAR)の一部である。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、T細胞レセプターの一部である。
【0027】
本出願で使用する場合、用語「結合」は、典型的には2つ以上の実体の間の、非-共有結合的な相互作用を指す。「直接的な」結合としては、実体又は部分間の、物理的な接触、が挙げられる；間接的な結合としては、1つ以上の中間的な実体との物理的な接触を介した物理的な相互作用、が挙げられる。2つ以上の実体間の結合を、任意の様々な状況において［例えば、単離して、又はより複雑なシステムの状況で（例えば、担体実体と、共有結合的に、若しくはその他の様式で、相互作用した状況で、及び／若しくは、生物学的なシステムの中で、若しくは細胞の中で）、相互作用する、実体又は部分を、研究する状況等］、典型的には評価することができる。
【0028】
本出願で使用する場合、用語「がん」、「悪性腫瘍」、「新生物」、「腫瘍」、及び「がん腫(carcinoma)」は、比較して、異常な、コントロールされない、及び／又は自律的な、増殖、を示す細胞を指し、その結果、それら細胞は、細胞増殖のコントロールを有意に消失することを特徴とする、異常な増殖の表現型を示す。いくつかの実施形態では、腫瘍は、前がん性（例えば、良性）、悪性、前-転移性、転移性、及び／又は非-転移性、である細胞、であることがある、又は、を含むことがある。本開示は、具体的には、その教示が特に関連することがある、ある特定のがんを、具体的に同定する。いくつかの実施形態では、関連するがんを、固形腫瘍によって、特徴付けることがある。いくつかの実施形態では、関連するがんを、血液腫瘍によって、特徴付けることがある。一般的に、当該技術分野で既知の様々なタイプのがんの例としては、例えば、造血系がん［例えば、白血病、リンパ腫（ホジキン・リンパ腫及び非-ホジキン・リンパ腫）、骨髄腫及び骨髄増殖性疾患等］；肉腫、メラノーマ、腺腫、固形組織のがん腫(carcinoma)、口腔の、咽喉の、喉頭の、及び肺の、扁平上皮がん腫(squamous cell carcinoma)、肝臓がん、例えば、前立腺の、頸部の、膀胱の、子宮の、及び子宮内膜の、がん等の泌尿生殖器がん、及び腎細胞がん腫(renal cell carcinoma)、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、皮膚又は眼内メラノーマ、内分泌システムのがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、頭部及び頸部がん、乳がん、胃腸がん及び神経系がん、例えばパピローマ等の良性病変、前がん性病態、例えば、骨髄異形成症候群、後天性再生不良性貧血、ファンコニ貧血(Fanconi anemia)、発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)及び5q-症候群、等が挙げられる。
【0029】
本出願で使用する場合、用語「化学療法剤」は、1つ以上の、アポトーシス促進性の、細胞増殖抑制性の、及び／又は細胞傷害性の作用因子（例えば、望ましくない細胞増殖に関連する、1つ以上の疾患、障害、又は症状、を治療する際の使用に、利用される及び／又は推奨される、作用因子を具体的に含む）を指すことがある。多くの実施形態では、化学療法剤は、がんを治療する際に有用である。いくつかの実施形態では、化学療法剤は、1種以上のアルキル化剤類、1種以上のアントラサイクリン類、1種以上の細胞骨格破壊剤類（例えば、タキサン類、メイタンシン及びそれらの類似体等の微小管ターゲット化作用因子類、並びにそれらの類似体）、1種以上のエポチロン類、1種以上のヒストン・デアセチラーゼ阻害剤類HDAC、1種以上のトポイソメラーゼ阻害剤類（例えば、トポイソメラーゼI阻害剤及び／若しくはトポイソメラーゼII阻害剤）、1種以上のキナーゼ阻害剤類、1種以上のヌクレオチド類似体類若しくはヌクレオチド前駆物質類似体類、1種以上のペプチド抗生物質類、1種以上の白金をベースとした作用因子類、1種以上のレチノイド類、1種以上のビンカ・アルカロイド類、並びに／又は1種以上の、以下の1種以上の類似体（即ち、関連する抗-増殖活性を共有する）、であることがある、又は、を含むことがある。いくつかの実施形態では、化学療法剤を、抗体-薬物コンジュゲートの状況において、利用することがある。
【0030】
本出願で使用する場合、用語「キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)」及び「CAR」を、互換的に使用する、並びに免疫細胞の活性化を、誘発することができる、又は阻害することができる、操作を受けた免疫レセプターを指す。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、リガンド／抗原-結合ドメイン）、膜貫通ドメイン及び1つ以上の細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。例示定なCAR、CAR内の例示的なドメイン、及びその誘導体（例えば、CARバリアント）は、例えば、PCT出願US 2014/016527号；Fedorov et al. Sci Transl Med (2013) ;5(215):215ra172; Glienke et al. Front Pharmacol (2015) 6:21; Kakarla & Gottschalk 52 Cancer J (2014) 20(2):151-5; Riddell et al. Cancer J (2014) 20(2):141-4; Pegram et al. Cancer J (2014) 20(2):127-33; Cheadle et al. Immunol Rev (2014) 257(1):91-106; Barrett et al. Annu Rev Med (2014) 65:333-47; Sadelain et al. Cancer Discov (2013) 3(4):388-98; Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol (2010) 956304、に記載されている；それらの開示は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。いくつかの実施形態では、CARは、阻害性キメラ抗原レセプター（inhibitory chimeric antigen receptor (iCAR)）を含むことがある。本出願で使用する場合、用語「阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)」は、免疫細胞の活性化を阻害することができる、操作を受けた免疫レセプターを指す。いくつかの実施形態では、iCARは、細胞外抗原結合ドメイン（例えば、リガンド／抗原-結合ドメイン)、膜貫通ドメイン及び1つ以上の細胞内阻害性シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナリング・ドメインは、T細胞応答性を制限する。いくつかの実施形態では、前記iCARの阻害効果は、一時的である。いくつかの実施形態では、前記iCARの阻害効果は、可逆的である。いくつかの実施形態では、前記iCARの阻害効果は、永続的である。いくつかの実施形態では、前記iCARの阻害効果は、不可逆的である。
【0031】
本出願で使用する場合、用語「操作を受けた」は、人間の手によって操作を受けた態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチド配列を人間の手によって操作を受けた場合、「操作を受けた」ものと考えられる。例えば、本発明のいくつかの実施形態では、操作を受けたポリペプチドは、参照ポリペプチド配列の中に、人間の手によって導入された、1つ以上のアミノ酸の、変異、欠失及び／又は挿入、を含む配列を含む。いくつかの実施形態では、操作を受けたポリペプチドは、in vivoで天然には生じないであろう融合ポリペプチドを形成するために、人間の手によって、1つ以上の更なるポリペプチドに融合した（即ち、共有結合的に連結した）、ポリペプチドを含む。同様に、細胞又は生物体は、その遺伝性情報が改変されるように操作を受けた場合、「操作を受けた」とみなされる（例えば、以前に存在しなかった新しい遺伝性物質が、例えば、形質転換、交配、体細胞ハイブリダイゼーション、トランスフェクション、形質導入、若しくは他のメカニズム、によって導入される、又は以前に存在した遺伝性物質が、例えば、置換若しくは欠失変異によって、若しくは交配プロトコルによって、改変を受ける若しくは除去される)。慣例であるように、及び当業者によって理解されるように、操作を受けた、ポリペプチド又は細胞、の誘導体及び／又は後代は、実際の操作が以前の実体に対して行われたとしても、典型的には依然、「操作を受けた」として、称される。
【0032】
本出願で使用する場合、用語「エピトープ」は、(i)抗原に特異的に結合する抗原-結合ドメインの部分上の全ての単量体（例えば、個々のアミノ酸残基、糖側鎖、及び翻訳後修飾を受けたアミノ酸残基）と、(ii)抗原-結合ドメインが特異的に結合する抗原の部分上の全ての単量体（例えば、個々のアミノ酸残基、糖側鎖、翻訳後修飾を受けたアミノ酸残基）との間の一組の物理的な相互作用を通じて、抗原-結合ドメインが特異的に結合する抗原の部分を指す。エピトープは、例えば、表面のアクセス可能なアミノ酸残基、糖側鎖、リン酸化アミノ酸残基、メチル化アミノ酸残基、及び／又はアセチル化アミノ酸残基、からなることがある、並びに、特異的な三次元構造特性と特異的な電荷特性、を有することがある。立体配座的な及び非-立体配座的なエピトープは、変性溶媒の存在下では、前者への結合は失われ得るが、後者への結合は失われ得ない、という点で区別される。いくつかの実施形態では、エピトープは、少なくとも約3から6個のアミノ酸の、又は約10から15個のアミノ酸の、直鎖状アミノ酸配列によって、定義される。いくつかの実施形態では、エピトープは、三次元構造（例えば、タンパク質折り畳み）によって画定される、全長タンパク質の一部又はその一部、を指す。いくつかの実施形態では、エピトープは、タンパク質折り畳みを介して一つになった不連続なアミノ酸配列によって、画定される。いくつかの実施形態では、エピトープは、四次構造（例えば、2つの異なったポリペプチド鎖の相互作用によって形成される裂け目）によって一つになった不連続なアミノ酸配列によって、画定される。前記エピトープを画定する残基間のアミノ酸配列は、前記エピトープの三次元構造にとって重要ではない場合がある。抗原-結合タンパク質構築物の結合を、直鎖状のエピトープが生成されるように前記抗原を変性させた型と、比較するアッセイを使用して、立体配座的なエピトープを、決定することがある、及びスクリーニングすることがある。エピトープは、前記結合に直接的に関与するアミノ酸残基、及び前記結合に直接的に関与しない他のアミノ酸残基、を含むことがある。抗原-結合ドメインが特異的に結合するエピトープを同定するための方法は、当該技術分野において既知である［例えば、（例えば、前記抗原、及び／又は前記抗原-抗原-結合ドメイン複合体、についての）構造に基づく解析（例えば、X-線結晶学、NMR、及び／若しくは電顕法）並びに／又は変異誘発に基づく解析（例えば、アラニン・スキャニング変異誘発、グリシン・スキャニング変異誘発、及びホモロジー・スキャニング変異誘発）、ここで、変異を結合パートナーとの結合アッセイで測定する、それらの多くは、当該技術分野において既知である］。
【0033】
本出願で使用する場合、用語「医薬組成物」は、活性作用因子が、1種以上の薬学的に許容可能な担体と共に製剤化された、組成物を指す。いくつかの実施形態では、前記組成物は、ヒトの又は動物の対象への投与に適している。いくつかの実施形態では、前記活性作用因子は、適切な母集団に投与した場合に、所定の治療効果を達成することに関して、統計的に有意な確率を示す治療レジメンの中での投与に適した単位用量として、存在する。
【0034】
本出願で使用する場合、語句「細胞の表面上に存在する」（例えば、哺乳動物細胞）は(i)細胞の原形質膜に、物理的に結合している、若しくは少なくとも部分的に包埋されている、抗原（例えば、膜貫通タンパク質、細胞膜周辺タンパク質、脂質-アンカー型タンパク質（例えば、GPI-アンカー）、N-ミリストイル化タンパク質、若しくはS-パルミトイル化タンパク質）、又は(ii)その同族レセプターに結合している抗原、ここで、前記同族レセプターは、細胞の原形質膜に、物理的に結合している（例えば、その同族レセプターに結合しているリガンド、ここで、前記同族レセプターは、前記原形質膜に、物理的に結合している）。細胞（例えば、哺乳動物細胞）の表面上の抗原の存在を決定するための非-限定的な方法としては、蛍光-活性化細胞選別（FACS）、免疫組織化学、細胞-分画アッセイ及びウエスタン・ブロッティング、が挙げられる。
【0035】
本出願で使用する場合、「単鎖可変フラグメント、scFv」は、リンカーによって連結した重鎖可変ドメイン(VH)及び軽鎖可変ドメイン(VL)（前記リンカーは、2つのドメインを一つに相互作用させて抗原-結合部位を形成させる）を含む組換えタンパク質として規定される抗体のフラグメントを指す。
【0036】
本出願で使用する場合、用語「特異的な結合」は、結合が起こる環境において、結合することができるパートナーを識別する能力を指す。他の潜在的なターゲットが存在する場合に1つの特定のターゲットと相互作用する結合作用因子は、それが相互作用するターゲットに対して、「特異的に結合する」、と言われる。いくつかの実施形態では、特異的な結合を、前記結合作用因子とそのパートナーとの間の相互作用の程度を、検出することによって、又は決定することによって、評価する；いくつかの実施形態では、特異的な結合を、結合作用因子-パートナー複合体の解離の程度を、検出することによって、又は決定することによって、評価する；いくつかの実施形態では、特異的な結合を、そのパートナーと別の実体との間で競合して相互作用が置き換わる結合作用因子の能力を、検出することによって、又は決定することによって、評価する。いくつかの実施形態では、特異的な結合を、様々な濃度にわたって、そのような検出又は決定を行うことによって、評価する。
【0037】
本出願で使用する場合、用語「対象」は、生物体、典型的には哺乳動物（例えば、ヒト、いくつかの実施形態では、出生前のヒトの形体を含む）、を指す。いくつかの実施形態では、対象は、重要な疾患、障害、又は症状に、罹患している。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は症状に、罹患し易い。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は症状の、1つ以上の症状(symptom)又は特性、を示す。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は症状の、症状(symptom)又は特性、を示さない。いくつかの実施形態では、対象は、疾患、障害、又は症状、に罹患し易い、又は、のリスクがある、といった1つ以上の特性を有するヒトである。いくつかの実施形態では、対象は、患者である。いくつかの実施形態では、対象は、診断及び／又は療法が、施される及び／又は施されたことがある、個体である。
【0038】
操作を受けた免疫細胞
いくつかの実施形態では、本出願は、以下を含む免疫細胞：(a) キメラ抗原レセプター(CAR)、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む；及び、(b) 阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される；並びに、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される、を提供する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、T細胞である。
いくつかの実施形態では、本出願は、以下を含む免疫細胞：(a) キメラ抗原レセプター(CAR)、ここで、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む；及び、(b) 阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、ここで、前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される；並びに、ここで、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される、を提供する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、T細胞である。
【0039】
本出願で使用する場合、「免疫細胞」は、リンパ球（例えば、T細胞、B細胞、NK細胞及びNKT細胞）、好中球、及び単球／マクロファージとして分類され得る、免疫システムの細胞、を指す。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、T細胞である。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、操作を受けた免疫細胞（これは、前記免疫細胞が遺伝的に改変を受けて、非-天然タンパク質［例えば、キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)］を発現する、又は外因性核酸を含む、ことを意味する）である。
【0040】
前記免疫細胞(例えば、T細胞)を、1つ以上の様式で、改変することがある。免疫細胞（例えば、T細胞）は、1つ以上のタイプの細胞の表面上に存在する抗原に対するレセプターである、少なくとも1つの非-天然分子、を発現することがある。いくつかの実施形態では、免疫細胞は、自然には見出されない少なくとも1つの合成分子を、含むように、又は発現するように、操作を受けているために、自然には見出されない免疫細胞（例えば、T細胞）を含む。特定の実施形態では、前記免疫細胞（例えば、T細胞）は、少なくとも1つのキメラ抗原レセプター(CAR)［例えば、特定の腫瘍抗原をターゲット化するCAR等］を発現するように操作を受ける。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、2つ以上のキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)［例えば、第1のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原）をターゲット化するCAR、及び第2のエピトープ（例えば、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現する抗原）をターゲット化する阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)等］を発現するように操作を受ける。
【0041】
特定の実施形態では、前記免疫細胞は、限定されるものではないが、T細胞、例えば、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、Treg細胞、Th1 T細胞、Th2 T細胞、Th17 T細胞、非特異的T細胞、又は前記のいずれかの組合せを含むT細胞の集団、ナチュラル・キラーT(NKT)細胞、ナチュラル・キラー(NK)細胞、又はマクロファージ、であることがある。キメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor) を有するように操作を受けた免疫細胞(例えば、T細胞) (CAR T細胞)は、がんを治療するための大きな治療可能性を有する。CARを用いると、レセプターは、抗原（結合すると、免疫細胞を活性化してその抗原を発現する細胞を傷害する）を認識するように、プログラムすることができる。従って、腫瘍細胞上に発現した抗原に対するCARを発現する免疫細胞は、前記腫瘍細胞をターゲット化することができる、及び傷害することができる。例えば、血液悪性腫瘍に対する、CD19-ターゲット化CAR-形質導入T細胞(CD19-CAR T細胞)に関する最近の臨床試験は、CAR T技術の強い効果を示した。(Kochenderfer, J. N. et al. (2010) Blood 116: 4099-4102; Porter, D. L., et al. (2011) N. Engl. J. Med. 365: 725-733; Grupp, S. A. et al. (2013) N. Engl. J. Med. 368: 1509-1518; Kochenderfer, J. N. et al. (2015) J. Clin. Oncol. 33: 540-549; Brown, C. E. et al. (2016) N. Engl. J. Med. 375: 2561-2569)。CAR Tの臨床上の成功は、少なくとも部分的には、前記CARの融合構造（これは、高-親和性の抗原-結合ドメインを、複数のシグナリング・ドメインと、人工的に組合わせることによって、作製される）に帰する（Maus, M. V. et al. (2014) Blood 123: 2625-2635; van der Stegen, S. J. et al. (2015) Nat. Rev. Drug Discov. 14: 499-509）。
【0042】
いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けた免疫細胞は、自己T細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けた免疫細胞は、患者ではない対象から得られた免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態では、治療方法で使用するための操作を受けたT細胞は、同系である（ドナー(donor)及びレシピエント(recipient)は、異なっているが、同一の双生児）。いくつかの実施形態では、治療方法で使用するための操作を受けたT細胞は、レシピエント(recipient)対象として、同種異系である（同じ種に由来するが、ドナー(donor)が異なっている）。いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けたT細胞は、（自己幹細胞療法又はASCTのための）自己幹細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けた免疫細胞は、非-自己T細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けた免疫細胞は、健常なドナー(donor)から得られた免疫細胞に由来する。いくつかの実施形態では、本出願が提供する操作を受けた免疫細胞は、がん又は腫瘍に罹患した対象から得られた免疫細胞に由来する。
【0043】
キメラ抗原レセプター(Chimeric Antigen receptor)(CAR)
当該技術分野で知られているように、CARは、典型的には、少なくとも、細胞外抗原-結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、及び細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原-結合ドメインは、腫瘍-関連抗原を認識することができる単鎖可変フラグメント（scFv）を含む。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原-結合ドメイン、ヒンジ・ドメイン又はスペーサ、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、CARは、共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、CARは、2つの共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、CARは、2つ以上の共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン又はCD3-ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。例えば、Abate-Daga et al、Molecular Therapy Oncolytics(2016)3, 16014を参照のこと、その開示は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
当該技術分野で知られているように、CARは、典型的には、少なくとも、細胞外抗原-結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、及び細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原-結合ドメインは、腫瘍-関連抗原を認識することができる単鎖可変フラグメント（scFv）を含む。いくつかの実施形態では、CARは、細胞外抗原-結合ドメイン、ヒンジ・ドメイン又はスペーサ、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、CARは、共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、CARは、2つの共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、CARは、2つ以上の共-刺激ドメインを更に含む。いくつかの実施形態では、前記膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記ヒンジ領域は、CD28ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞内シグナリング・ドメインは、CD28細胞内シグナリング・ドメイン又はCD3-ゼータ細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。例えば、Abate-Daga et al、Molecular Therapy Oncolytics(2016)3, 16014を参照のこと、その開示は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
【0044】
阻害性キメラ抗原レセプター(Chimeric Antigen receptor)(iCARS)
当該技術分野で知られているように、阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)は、少なくとも、細胞外抗原-結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、及び細胞内阻害性シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原-結合ドメインは、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現される抗原を認識することができるscFVを含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、又はCTLA-4膜貫通ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARのヒンジ領域は、CD8-アルファ・ヒンジ領域、PD-1ヒンジ領域、又はCTLA-4ヒンジ領域、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの細胞内シグナリング・ドメインは、PD-1阻害性ドメイン、CTLA-4阻害性ドメイン、又は阻害活性を媒介することができる任意の他のドメイン、を含む。
当該技術分野で知られているように、阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)は、少なくとも、細胞外抗原-結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、及び細胞内阻害性シグナリング・ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記細胞外抗原-結合ドメインは、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現される抗原を認識することができるscFVを含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの膜貫通ドメインは、CD8-アルファ膜貫通ドメイン、PD-1膜貫通ドメイン、又はCTLA-4膜貫通ドメイン、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARのヒンジ領域は、CD8-アルファ・ヒンジ領域、PD-1ヒンジ領域、又はCTLA-4ヒンジ領域、を含む。いくつかの実施形態では、前記iCARの細胞内シグナリング・ドメインは、PD-1阻害性ドメイン、CTLA-4阻害性ドメイン、又は阻害活性を媒介することができる任意の他のドメイン、を含む。
【0045】
本出願に記載のCAR及び／又はiCARの何れかに関するいくつかの実施形態では、抗原及び／又はエピトープに対する、細胞外抗原-結合ドメインの結合親和性に関する解離平衡定数（KD）は、約1 pMと約10 μMとの間（例えば、約1 x 10-12Mから約1 x 10-6 M, 1 x 10-12 Mから約1 x 10-7M, 1 x 10-12 Mから約1 x 10-8 M, 1 x 10-12 Mから約1 x 10-9M, 1 x 10-12 Mから約1 x 10-10 M, 1 x 10-12 Mから約1 x 10-11M, 1 x 10-11 Mから約1 x 10-6 M, 1 x 10-10 Mから約1 x 10-6M, 1 x 10-9 Mから約1 x 10-6 M, 1 x 10-8 Mから約1 x 10-6M, 1 x 10-7 Mから約1 x 10-6 M,の間、又は、間である任意の範囲）であることがある。いくつかの実施形態では、抗原及び／又はエピトープに対する、細胞外抗原-結合ドメインの結合親和性に関する解離平衡定数（KD）は、約1 x 10-5M未満、約1 x 10-6 M未満、約1 x 10-7 M未満、約1 x 10-8M未満、約1 x 10-9 M未満、約1 x 10-10 M未満、約1 x 10-11M未満、約1 x 10-12 M未満, 又は更なる未満、であることがある。
【0046】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARで使用するための膜貫通ドメインは、活性化NK細胞レセプター、免疫グロブリン・タンパク質、B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD137, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3デルタ, CD3イプシロン, CD3ガンマ, CD3ゼータ, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8アルファ, CD8ベータ, CD96 (Tactile), CD11a,CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CTLA-4, CRTAM, サイトカイン・レセプター, DAP-10,DNAM1 (CD226), Fcガンマ・レセプター, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1,Igアルファ (CD79a), IL-2Rベータ, IL-2Rガンマ, IL-7Rアルファ, 誘導性T細胞共刺激因子（inducible T cell costimulator (ICOS)）, インテグリン, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM,ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, LFA-1, CD83に特異的に結合するリガンド, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), リンパ球機能-関連抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1)）, MHC クラス1分子, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, プログラム死-1（programmed death-1 (PD-1)）, PSGL1, SELPLG (CD162), シグナリング・リンパ球活性化分子（Signaling Lymphocytic Activation Molecule (SLAM タンパク質)）, SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, TNF レセプター・タンパク質, TNFR2, TNFSF14, Tollリガンド・レセプター, TRANCE/RANKL, VLA1, 及びVLA-6、より選択される内因性ポリペプチド由来の膜貫通ドメイン、を含む。
【0047】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARで使用するための膜貫通ドメインは、2つ以上の内因性タンパク質中に存在する膜貫通ドメインの一部を含む、その結果、そのキメラ膜貫通ドメインは、正確に折り畳まれ且つ細胞膜を貫通する能力を保持する。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARは、内因性タンパク質中に存在する膜貫通ドメインとは、1つ以上のアミノ酸（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はより多くのアミノ酸）が異なる、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARは、内因性タンパク質中に存在する膜貫通ドメインと、ある程度のアミノ酸配列同一性を共有する膜貫通ドメインを含む。例えば、本出願が提供するCAR及び／又はiCARで使用するための膜貫通ドメインは、内因性タンパク質中に存在する膜貫通ドメインと、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を、共有することがある。
【0048】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、活性化NK細胞レセプター、免疫グロブリン・タンパク質、B7-H3, BAFFR, BLAME (SLAMF8), BTLA, CD100 (SEMA4D), CD103, CD137, CD160 (BY55), CD18, CD19, CD19a, CD2, CD247, CD27, CD276 (B7-H3), CD28, CD29, CD3デルタ, CD3イプシロン, CD3ガンマ, CD3ゼータ, CD30, CD4, CD40, CD49a, CD49D, CD49f, CD69, CD7, CD84, CD8, CD8アルファ, CD8ベータ, CD96 (Tactile), CD11a,CD11b, CD11c, CD11d, CDS, CEACAM1, CTLA-4, CRT AM, サイトカイン・レセプター, DAP-10,DNAM1 (CD226), Fcガンマ・レセプター, GADS, GITR, HVEM (LIGHTR), IA4, ICAM-1,Igアルファ (CD79a), IL-2Rベータ, IL-2Rガンマ, IL-7Rアルファ, 誘導性T細胞共刺激因子（inducible T cell costimulator (ICOS)）, インテグリン, ITGA4, ITGA6, ITGAD, ITGAE, ITGAL, ITGAM, ITGAX, ITGB2, ITGB7, ITGB1, KIRDS2, LAT, CD83に特異的に結合するリガンド, LIGHT, LTBR, Ly9 (CD229), Lyl08, リンパ球機能-関連抗原-1（lymphocyte function-associated antigen-1 (LFA-1)）, MHC クラス1分子, NKG2C, NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, NKp80 (KLRF1), OX-40, PAG/Cbp, プログラム死-1（programmed death-1 (PD-1)）, PSGL1, SELPLG (CD162), シグナリング・リンパ球活性化分子（Signaling Lymphocytic Activation Molecule (SLAM タンパク質)）, SLAM (SLAMF1), SLAMF4 (CD244), SLAMF6 (NTB-A), SLAMF7, SLP-76, TNF レセプター・タンパク質, TNFR2, TNFSF14, Tollリガンド・レセプター, TRANCE/RANKL, VLA1, 及びVLA-6、又はそれらの任意の組合わせ、より選択される内因性ポリペプチド由来の細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。
【0049】
いくつかの実施形態では、iCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、阻害性レセプターに由来することがある。いくつかの実施形態では、iCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、T細胞活性化に拮抗することがある。いくつかの実施形態では、本出願が提供するiCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、CTLA-4, PD-1, LAG3 HAVCR2 (TIM3), KIR2DL2, LILRB1, TIGIT, CEACAM1, CSF1R, CDS, CD96, CD22, LAIR, 2B4, BTLA, CD3-ゼータ、又はそれらの任意の組合わせ、より選択される内因性ポリペプチド由来の細胞内シグナリング・ドメイン、を含む。
【0050】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、2つ以上の内因性タンパク質中に存在する細胞内シグナリング・ドメインの一部を含む、その結果、そのキメラ細胞内シグナリング・ドメインは、正確に折り畳まれて、シグナル伝達を媒介する能力を保持する（CARの場合は活性化し、iCARの場合はシグナルを阻害する）。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARは、内因性タンパク質中に存在する細胞内シグナリング・ドメインとは、1つ以上のアミノ酸（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はより多くのアミノ酸）が異なる、細胞内シグナリング・ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及び／又はiCARは、内因性タンパク質中に存在する細胞内シグナリング・ドメインと、ある程度のアミノ酸配列同一性を共有する細胞内シグナリング・ドメインを含む。例えば、本出願が提供するCAR及び／又はiCARで使用するための細胞内シグナリング・ドメインは、内因性タンパク質中に存在する細胞内シグナリング・ドメインと、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を、共有することがある。
【0051】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARは、共-刺激ドメインを含むことがある。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARは、2つ以上の共-刺激ドメインを含むことがある。例えば、CARは、内因性ポリペプチド中に存在する共-刺激ドメインを含むことがある。本出願が提供する操作を受けた免疫レセプター中に含まれるのに適した共-刺激ドメインを有するポリペプチドの非-限定的な例としては、4-1BB(CD137)、CD28、CD2、CD4、OX40、ICOS、BTLA、CD27、CD30、GITR、及びHVEM、並びにCD8、が挙げられる。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARで使用するための共-刺激ドメインは、2つ以上の内因性タンパク質中に存在する共-刺激ドメインの一部を含む、その結果、そのキメラ共-刺激ドメインは、正確に折り畳まれて、シグナル伝達を増強する能力を保持する。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARは、内因性タンパク質中に存在する共-刺激ドメインとは、1つ以上のアミノ酸（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、又はより多くのアミノ酸）が異なる、共-刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本出願が提供するCARは、内因性タンパク質中に存在する共-刺激ドメインと、ある程度のアミノ酸配列同一性を共有する共-刺激ドメインを含む。例えば、本出願が提供するCARで使用するための共-刺激ドメインは、内因性タンパク質中に存在する共-刺激ドメインと、少なくとも80%、少なくとも81%、少なくとも82%、少なくとも83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上の配列同一性を、共有することがある。
【0052】
ヘテロ接合性対立遺伝子の消失をターゲット化する操作を受けた免疫細胞
クローン性のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity (LOH)）は、がん細胞に特異的な、広範な及び不可逆的な、遺伝子変化である。本出願で使用する場合、「ヘテロ接合性の消失」は、遺伝子全体の、及び周囲の染色体領域の、消失をもたらす染色体交差事象を指す。いくつかの実施形態では、LOH事象は、その消失した遺伝子によってコードされた細胞表面抗原の発現の消失をもたらすことがある。いくつかの実施形態では、がん細胞における対立遺伝子の消失を、活性化シグナルに「逆転させる」ことによって、LOH事象を、治療的にターゲット化することができる。いくつかの実施形態では、NOT-ゲート論理を組み込んだ操作を受けた免疫細胞（例えば、CAR T細胞）を使用して、がんにおけるLOH事象に起因して対抗的に発現した抗原をターゲット化することができる。いくつかの実施形態では、NIMPLY論理ゲートを組み込んだ操作を受けた免疫細胞（例えば、CAR T細胞）を使用して、がんにおけるLOH事象に起因して対抗的に発現した抗原をターゲット化することができる。NOT-ゲート論理は、取り込まれる、及びより一般的に理解可能であるが、全回路は、NIMPLY論理ゲートとして、より正確に記載される(https://en.wikipedia.org/wiki/NIMPLY_gate)。例えば、NIMPLY論理ゲートは、がん細胞中に保持されるヒト白血球抗原(HLA)の対立遺伝子から発現する抗原をターゲット化するキメラ抗原レセプター(CAR)；及びがん細胞中で消失したHLA対立遺伝子から発現する抗原をターゲット化する阻害性CAR(iCAR)、を含むことがある。いくつかの実施形態では、そのようなNIMPLY論理ゲートを取り込んだ操作を受けた免疫細胞は、in vitro及びマウス中で、遺伝的に予測可能な様式で、活性化し、関連するがん細胞を傷害する。
クローン性のヘテロ接合性の消失（loss of heterozygosity (LOH)）は、がん細胞に特異的な、広範な及び不可逆的な、遺伝子変化である。本出願で使用する場合、「ヘテロ接合性の消失」は、遺伝子全体の、及び周囲の染色体領域の、消失をもたらす染色体交差事象を指す。いくつかの実施形態では、LOH事象は、その消失した遺伝子によってコードされた細胞表面抗原の発現の消失をもたらすことがある。いくつかの実施形態では、がん細胞における対立遺伝子の消失を、活性化シグナルに「逆転させる」ことによって、LOH事象を、治療的にターゲット化することができる。いくつかの実施形態では、NOT-ゲート論理を組み込んだ操作を受けた免疫細胞（例えば、CAR T細胞）を使用して、がんにおけるLOH事象に起因して対抗的に発現した抗原をターゲット化することができる。いくつかの実施形態では、NIMPLY論理ゲートを組み込んだ操作を受けた免疫細胞（例えば、CAR T細胞）を使用して、がんにおけるLOH事象に起因して対抗的に発現した抗原をターゲット化することができる。NOT-ゲート論理は、取り込まれる、及びより一般的に理解可能であるが、全回路は、NIMPLY論理ゲートとして、より正確に記載される(https://en.wikipedia.org/wiki/NIMPLY_gate)。例えば、NIMPLY論理ゲートは、がん細胞中に保持されるヒト白血球抗原(HLA)の対立遺伝子から発現する抗原をターゲット化するキメラ抗原レセプター(CAR)；及びがん細胞中で消失したHLA対立遺伝子から発現する抗原をターゲット化する阻害性CAR(iCAR)、を含むことがある。いくつかの実施形態では、そのようなNIMPLY論理ゲートを取り込んだ操作を受けた免疫細胞は、in vitro及びマウス中で、遺伝的に予測可能な様式で、活性化し、関連するがん細胞を傷害する。
【0053】
NASCAR（新生物-ターゲティングの対立遺伝子-検出 CAR (Neoplasm-targeting Allele-Sensing CAR)）は治療的なアプローチであり、がんにおける細胞表面抗原の変化をもたらす他の多型遺伝子のLOHに拡張することができる。いくつかの実施形態では、NASCARは、がん細胞におけるLOH事象を、検出するための及びターゲット化するための、一対のキメラ抗原レセプター(chimeric antigen receptor)(CAR)を含むプラットホームである。いくつかの実施形態では、CAR及び阻害性CAR(iCAR)を、免疫細胞の中に導入する、ここで、前記CAR及びiCARは、2種の異なる抗原をターゲット化する。いくつかの実施形態では、2種の異なる抗原は、同じ遺伝子中の2つの対立遺伝子から発現する。いくつかの実施形態では、NASCARは、免疫細胞を活性化して、前記CAR抗原のみを発現する細胞を傷害する、一方、細胞がCAR及びiCAR抗原の両方を保有する場合、免疫細胞を不活性化する。いくつかの実施形態では、保持された対立遺伝子に対して前記CARをターゲット化させながら、LOHを通して消失した対立遺伝子に対して前記iCARをターゲット化させることによって、NASCARを使用する免疫細胞を、がんにおけるLOH事象に適用することができる（図１）。
【0054】
いくつかの実施形態では、前記CAR及び阻害性CAR(iCAR)は、同じ分子（例えば、抗原、エピトープ）の多型形体をターゲット化する（図１）。いくつかの実施形態では、同じ分子の多型形体は、細胞上で共-発現する。いくつかの実施形態では、前記CAR及びiCARは、様々な、非-遺伝子的に連結した分子をターゲット化する（図１７Ａ)。いくつかの実施形態では、前記CARは、LOH事象において消失した対立遺伝子に遺伝子的に連結しない抗原をターゲット化する。例えば、CAR抗原は、腫瘍-関連抗原(TAA)であることがある、一方、iCAR抗原は、がん細胞において消失しているが、正常な細胞上に存在する、多型対立遺伝子から発現する抗原であることがある。いくつかの実施形態では、NASCARがターゲット化する抗原は、細胞表面上に存在しない。いくつかの実施形態では、ターゲット抗原は、HLA分子によって、細胞表面上に提示されることがある（図１７Ｂ）。いくつかの実施形態では、NASCARは、保持された対立遺伝子における遺伝子欠失（例えば、ホモ接合性欠失）に起因するLOH事象において消失したマーカの消失を、ターゲット化することがある（図１７Ｃ）。いくつかの実施形態では、NASCARは、正常な単対立遺伝子発現（例えば、エピジェネティックなインプリンティング又は対立遺伝子発現）の消失をターゲット化することがある（図１７Ｄ）。いくつかの実施形態では、NASCARは、代謝的な目印の消失をターゲット化することがある（図１７Ｅ）。いくつかの実施形態では、NASCARは、CAR及びiCARを、コンディショナルに発現することがある（図１７Ｆ）。例えば、NASCARを有する免疫細胞は、合成Notch（synNotch）レセプターを含むことがある、ここで、前記synNotchレセプターは、そのターゲット抗原（例えば、腫瘍-関連抗原）に結合する場合、前記CAR及びiCARは、前記免疫細胞上で、コンディショナルに発現する（図１８）。
【0055】
2つの抗原-結合ドメインを有する操作を受けた免疫細胞
いくつかの実施形態では、本出願が提供する免疫細胞は、キメラ抗原レセプター(CAR)及び阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、を含む（例えば、NASCAR）。いくつかの実施形態では、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、及び前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される、並びに前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される。
いくつかの実施形態では、本出願が提供する免疫細胞は、キメラ抗原レセプター(CAR)及び阻害性キメラ抗原レセプター(inhibitory chimeric antigen receptor)(iCAR)、を含む（例えば、NASCAR）。いくつかの実施形態では、前記CARは、第1のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む、及び前記iCARは、第2のエピトープに特異的に結合する細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1のエピトープに結合し、且つ前記第2のエピトープに結合しない場合に、活性化される、並びに前記免疫細胞は、前記免疫細胞が前記第1及び第2のエピトープに結合する場合に、不活性化される。
【0056】
いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープは、第1の対立遺伝子から発現する、及び前記第2のエピトープは、第2の対立遺伝子から発現する、ここで、前記第1の対立遺伝子及び前記第2の対立遺伝子は、ターゲット細胞の同じ遺伝子に由来する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又は両方は、ヒト白血球抗原（human leukocyte antigen (HLA)）遺伝子から発現する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープは、腫瘍-関連抗原（tumor-associated antigen (TAA)）である。いくつかの実施形態では、前記第2のエピトープは、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又は両方は、ターゲット細胞の表面上に存在する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又は両方は、細胞表面タンパク質の細胞外ドメイン中に存在する。いくつかの実施形態では、前記第1のエピトープ、前記第2のエピトープ、又は両方は、HLA分子によって、細胞の表面上に提示される細胞内タンパク質中に存在する。
【0057】
いくつかの実施形態では、前記CARは、第1のエピトープ（例えば、腫瘍関連抗原）に特異的に結合することができる、及び前記iCARは、第2のエピトープ（例えば、がん細胞においては消失しているが、正常な細胞においては存在する、多型対立遺伝子から発現する抗原）に特異的に結合することができる。例えば、前記CARは、第1のエピトープに結合することがある、及び前記iCARは、ターゲット細胞上の第2のエピトープに結合することがある、ここで、前記第1及び第2のエピトープは、同じ遺伝子の対立遺伝子から発現する、並びにここで、前記iCARは、前記免疫細胞の活性化を阻害する。しかしながら、前記ターゲット細胞が遺伝子異常（例えば、ヘテロ接合性の消失［loss of heterozygosity (LOH)］）を含む場合、前記CARは、前記第1のエピトープに結合することがあるが、前記iCARは第2のエピトープに結合することができない、なぜなら、前記第2のエピトープを発現する対立遺伝子は、前記ターゲット細胞において消失しているからであり、それによって、前記免疫細胞を活性化する。
【0058】
いくつかの実施形態では、前記免疫細胞のCARに対する第1のエピトープのみの特異的な結合は、第1のエピトープ及び第2のエピトープの両方が前記免疫細胞に特異的に結合し、前記iCARが前記免疫細胞の活性化を阻害する場合と比較して、前記免疫細胞の活性化の増大をもたらす。いくつかの実施形態では、CAR及び／又はiCARを発現する免疫細胞の活性化を、測定する。免疫細胞の活性化を測定するための様々なアッセイの何れか（例えば、本出願に開示されるアッセイの何れか）を使用することがある。非-限定的な例としては、細胞溶解アッセイ又は細胞傷害性アッセイ（例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)放出）、サイトカイン放出アッセイ（例えば、インターロイキン-2(IL-2)及びインターフェロン-ガンマ(IFN-ガンマ)の放出を測定するサイトカイン放出アッセイ)、及び免疫シナプスでのF-アクチン集積を測定すること、が挙げられる。例えば、Stenken et al, "Bioanalytical Chemistry of Cytokines-A Review", Anal Chim Acta 2015; Turner et al, "Cytokines and chemokines: At the crossroads of cell signalling and inflammatory disease", Biochimica et Biophysica Acta Molecular Cell Research 2014; Clay et al, "Assays for monitoring cellular immune responses to active immunotherapy of cancer", Clin Cancer Res 2001; Wonderlich et al, "UNIT 3.11 Induction and Measurement of Cytotoxic T Lymphocyte Activity", Current Protocols in Immunology 2006、を参照、これらの各々は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。当業者は、免疫細胞の活性化に好適な他のアッセイを分かるであろう。
【0059】
いくつかの実施形態では、CAR及びiCARを発現する免疫細胞は、in vitro又はin vivo（例えば、哺乳動物がん細胞）で、ターゲット細胞に対して、細胞傷害性であることがある、又は細胞増殖抑制性であることがある。例えば、ターゲット細胞の表面上に発現する第1のエピトープのみがCARに特異的に結合する場合、前記免疫細胞は、ターゲット細胞に対して、細胞傷害性である、又は細胞増殖抑制性である。いくつかの実施形態では、第1のエピトープ及び第2のエピトープの両方が前記免疫細胞に特異的に結合し、前記iCARが前記免疫細胞の活性化を阻害する場合、前記免疫細胞では、非-ターゲット細胞（例えば、非-がん性哺乳動物細胞）に対する、細胞傷害性活性又は細胞増殖抑制活性、が低下することがある。
【0060】
いくつかの実施形態では、前記CAR及び前記iCARは、前記免疫細胞において、コンディショナルに発現する。いくつかの実施形態では、前記CAR及び前記iCARは、腫瘍微小環境中の前記免疫細胞において、発現する。いくつかの実施形態では、前記免疫細胞は、synNotchレセプターを更に含む、ここで、前記synNotchレセプターは、前記免疫細胞が前記腫瘍微小環境中にあるとき、前記CAR発現及び前記iCAR発現、を活性化する。例えば、Kingwell. K、Nat Rev Drug Discov(2016)15, 819、を参照のこと、その開示は、その全体が本出願に参照により取り込まれる。
【0061】
例えば、前記CAR構築物は、scfv、CD8アルファ・ヒンジ・ドメイン、CD28膜貫通及び細胞内ドメイン、並びにCD3ゼータ細胞内ドメイン、を含むことがある、並びに、前記iCARは、scfv、CD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにPD-1細胞内ドメイン、を含むことがある（図２０Ａ）。いくつかの実施形態では、CAR及びiCAR構築物の両方がCD8アルファ・ヒンジ・ドメインを含むので、T細胞表面上でヘテロ二量体化することがある。例えば、前記CAR構築物は、scfv、CD28ヒンジ／膜貫通／細胞内ドメイン、及びCD3ゼータ細胞内ドメイン、を含むことがある、並びに、前記iCARは、scfv、CD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、並びにPD-1細胞内ドメイン、を含むことがある（図２０Ｂ）。いくつかの実施形態では、CAR及びiCAR構築物は、異なるヒンジ及び膜貫通ドメインを含むので、ヘテロ二量体化しないことがある。例えば、前記CAR構築物は、scfv、ヒトCD8アルファ・ヒンジ及び膜貫通ドメイン、CD28細胞内ドメイン、並びにCD3ゼータ細胞内ドメイン、を含むことがある、並びに提示される2種のiCARの両方は、マウスCD8アルファ・ヒンジ・ドメインに結合したscfvを有する（図２０Ｃ）（ヘテロ二量体化を防止するため）。いくつかの実施形態では、1つのiCARバリアントは、SHP-1ドメインに接続したマウスCD8アルファ膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、他のiCARバリアントは、LAIR1膜貫通及び細胞内ドメイン、並びに、PTPN6 SH2ドメインがCD148ホスファターゼ・ドメインに連結した別個のキメラ分子、を含む。
【0062】
免疫細胞におけるCAR及びiCARの発現
CAR及びiCAR（例えば、本出願に記載のCAR及び／又はiCARの何れか）を発現する免疫細胞を生成する方法は、以下のステップを含む：組換え細胞を生成するために、前記CAR及びiCARをコードする核酸配列を細胞の中に導入するステップ；並びに前記CAR及びiCARを発現するのに充分な条件下で、前記組換え細胞を培養するステップ。いくつかの実施形態では、前記導入するステップは、組換え細胞を生成するために、前記CAR及びiCARをコードする配列を含む発現ベクターを、細胞の中に、導入するステップ、を含む。例えば、CAR及びiCAR構築物を、CRISPR Cas9によって二本鎖DNA切断が誘導された後、B2M遺伝子座での相同組換え修復(homology directed repair)を介して、dsDNAテンプレートとして、免疫細胞（例えば、T細胞）の中に導入されるように、設計することがある。いくつかの実施形態では、主要構成要素は、限定されるものではないが、相同性アーム、2A配列、CAR、iCAR、及びポリAターミネーター、を含むことがある（図２１）。
CAR及びiCAR（例えば、本出願に記載のCAR及び／又はiCARの何れか）を発現する免疫細胞を生成する方法は、以下のステップを含む：組換え細胞を生成するために、前記CAR及びiCARをコードする核酸配列を細胞の中に導入するステップ；並びに前記CAR及びiCARを発現するのに充分な条件下で、前記組換え細胞を培養するステップ。いくつかの実施形態では、前記導入するステップは、組換え細胞を生成するために、前記CAR及びiCARをコードする配列を含む発現ベクターを、細胞の中に、導入するステップ、を含む。例えば、CAR及びiCAR構築物を、CRISPR Cas9によって二本鎖DNA切断が誘導された後、B2M遺伝子座での相同組換え修復(homology directed repair)を介して、dsDNAテンプレートとして、免疫細胞（例えば、T細胞）の中に導入されるように、設計することがある。いくつかの実施形態では、主要構成要素は、限定されるものではないが、相同性アーム、2A配列、CAR、iCAR、及びポリAターミネーター、を含むことがある（図２１）。
【0063】
本出願に記載されるCAR及び／又はiCARを、任意の細胞（例えば、真核細胞又は原核細胞）によって、産生することがある。本出願で使用する場合、用語「真核細胞」は、はっきりとした、膜-結合核を有する細胞を指す。そのような細胞としては、例えば、哺乳動物（例えば、げっ歯類、非-ヒト霊長類、又はヒト）、昆虫、真菌、又は植物の細胞、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は、酵母細胞、例えば、Saccharomyces cerevisiae等、である。いくつかの実施形態では、前記真核細胞は、より高等な真核生物（例えば、哺乳動物、鳥類、植物、又は昆虫の細胞等）である。本出願で使用する場合、用語「原核生物細胞」は、はっきりとした、膜-結合核を有さない細胞を指す。いくつかの実施形態では、前記原核生物細胞は、バクテリア細胞である。
【0064】
いくつかの実施形態では、CD8+ T細胞及びCD4+ T細胞からなる群より選択される細胞において、CAR及びiCARを発現させることがある。いくつかの実施形態では、対象に投与することができる細胞（例えば、免疫細胞）（その細胞は、対象にとって自己である）において、CAR及びiCARを発現させる。例えば、免疫細胞を、対象から単離し、前記CAR及びiCARをコードする、1種の発現ベクター又は複数種の発現ベクターで、トランスフェクトし、続いて前記対象に投与して戻すことがある。いくつかの実施形態では、対象に投与することができる細胞（例えば、免疫細胞）（その細胞は、対象にとって同種異系である）において、CAR及びiCARを発現させる。例えば、免疫細胞を、ドナー（例えば、別のヒト）から単離し、前記CAR及びiCARをコードする、1種の発現ベクター又は複数種の発現ベクターで、トランスフェクトし、続いて前記対象に投与することがある。いくつかの実施形態では、人工多能性幹細胞(induced pluripotent stem cell)(iPSC)において、CAR及びiCARを発現させる、次いでそのiPSCを、前記対象に投与する。例えば、細胞（例えば、成体細胞）を対象から単離し、多能性幹細胞(pluripotent stem cell)になるように誘導し、更に免疫細胞（例えば、CD8+ T細胞又はCD4+ T細胞）になるように誘導することがある、ここで、（例えば、本出願に開示される方法の何れかを介して）前記細胞において、CAR及びiCARを発現させる。いくつかの実施形態では、CAR及びiCARをコードする、1種のベクター又は複数種のベクターを、免疫細胞になるように誘導する前のiPSCの中に、導入することがある。いくつかの実施形態では、iPSCから免疫細胞に分化するように誘導した後に、CAR及びiCARをコードする、1種のベクター又は複数種のベクターを、免疫細胞の中に導入することがある。
【0065】
細胞を培養する方法は、当該技術分野において、周知である。細胞を、増殖、分化及び成長に好適な条件下のin vitroで、維持することができる。簡潔に述べると、細胞（例えば、任意の細胞）を、細胞の生存能力及び成長をサポートするために必要な、成長因子及び補助物質、を含む細胞培養培地と接触させることによって、培養することがある。
【0066】
核酸及び発現ベクターを、細胞（例えば、真核細胞）の中に導入するステップに関する方法は、当該技術分野で既知である。核酸を細胞の中に導入するために使用することができる方法の非-限定的な例としては、リポフェクション、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム・トランスフェクション、デンドリマー-に基づくトランスフェクション、カチオン性ポリマー・トランスフェクション、細胞圧搾、ソノポレーション（sonoporation）、光学的なトランスフェクション、インペールフェクション（impalection）、流体力学的送達、マグネトフェクション（magnetofection）、ウイルス形質導入（例えば、アデノウイルス形質導入及びレンチウイルス形質導入)、及びナノ粒子トランスフェクション、が挙げられる。
【0067】
いくつかの実施形態では、細胞におけるCAR及びiCARの発現は、1種以上のメカニズムによって調節される。例えば、CARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、プロモーター、エンハンサー、又は両方に、作動可能に連結することがある。また、iCARをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を、プロモーター、エンハンサー、又は両方に、作動可能に連結することがある。細胞中でポリペプチドをコードするベクターの発現を調節するのに好適な、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）及びエンハンサー、は当業者にとって既知である。
【0068】
治療用途
いくつかの実施形態では、本出願は、疾患を有する対象を治療する方法、ここで、前記方法は、CAR及びiCARを発現する免疫細胞を含む又は送達する医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、前記疾患は、LOHがある前がん性の病態である。
いくつかの実施形態では、本出願は、疾患を有する対象を治療する方法、ここで、前記方法は、CAR及びiCARを発現する免疫細胞を含む又は送達する医薬組成物を、前記対象に投与するステップを含む。いくつかの実施形態では、前記疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、前記疾患は、LOHがある前がん性の病態である。
【0069】
がんは、身体における異常な細胞のコントロールされない増殖を特徴とする、広い群の疾患を指すことがある。調節されない細胞分裂及び増殖によって、隣接組織に浸潤する、及びリンパ系又は血流を介して身体の遠位部分に転移することもある、悪性腫瘍の形成がもたらされる。がん又はがん組織は、腫瘍を含むことがある。
【0070】
本開示の方法による治療に適したがんとしては、限定されるものではないが、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、子宮内膜がん、食道がん(esophageal cancer)、卵管がん、胆嚢がん、消化管がん、頭部及び頸部がん、血液がん、喉頭がん、肝臓がん、肺がん、リンパ腫、メラノーマ、中皮腫、卵巣がん、原発性腹膜がん、唾液腺がん、肉腫、胃がん(stomach cancer)、甲状腺がん、膵臓がん、腎細胞がん腫(renal cell carcinoma)、グリア芽腫及び前立腺がん、が挙げられる。がんの非-限定的な例としては、以下が挙げられる：急性リンパ芽球性白血病（acute lymphoblastic leukemia (ALL)）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia (AML)）、副腎皮質がん、肛門がん、虫垂がん、星状膠細胞腫、基底細胞がん(basal cell carcinoma)、脳腫瘍、胆管がん、膀胱がん、骨がん、乳がん、気管支腫瘍、バーキット・リンパ腫、原発不明がん腫(carcinoma)、心臓腫瘍、子宮頸がん、脊索腫、慢性リンパ球性白血病(CLL)、慢性骨髄性白血病(CML)、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸がん、結腸直腸がん、頭蓋咽頭腫(craniopharyngioma)、皮膚T-細胞リンパ腫、腺管がん腫(ductal carcinoma)、胎児性腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん(esophageal cancer)、鼻腔神経芽細胞腫、線維性組織球腫、ユーイング肉腫、眼がん、胚細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん(gastric cancer)、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、頭部及び頸部がん、ヘアリー細胞白血病(hairy cell leukemia)、肝細胞がん、組織球増殖症、ホジキン・リンパ腫、下咽頭がん、眼内メラノーマ、島細胞腫瘍、カポジ肉腫、腎臓がん(kidney cancer)、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭がん、白血病、口唇及び口腔がん、肝臓がん、小葉上皮内がん腫(carcinoma in situ)、肺がん、リンパ腫、マクログロブリン血症、悪性線維性組織球腫、メラノーマ、メルケル細胞がん腫(merkel cell carcinoma)、中皮腫、原発不明の転移性頸部扁平上皮がん、NUT遺伝子が関与する正中線がん腫(carcinoma)、口腔がん、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔のがん、鼻咽腔がん(nasopharyngeal cancer)、神経芽細胞腫、非-ホジキン・リンパ腫、非-小細胞肺がん、口腔咽頭がん、骨肉腫、卵巣がん、膵臓がん、乳頭腫症、傍神経節腫、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、下垂体腫瘍、胸膜肺芽腫、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂と尿管がん、網膜芽腫、ラブドイド腫瘍、唾液腺がん、セザリー症候群(Sezary Syndrome)、皮膚がん、小細胞肺がん、小腸がん、軟部肉腫、脊髄腫瘍、胃がん(stomach cancer)、T-細胞リンパ腫、奇形腫様腫瘍、精巣がん、咽喉がん(throat cancer)、胸腺腫及び胸腺がん腫(thymoma and thymic carcinoma)、甲状腺がん、尿道がん、子宮がん(uterine cancer)、膣がん(vaginal cancer)、外陰がん、並びにウィルムス腫瘍。
【0071】
いくつかの実施形態では、有効な用量は、前記がんのリスク及び／又は重症度、投与経路、前記対象の年齢及び全身の健康状態、賦形剤の使用、他の作用因子の使用等の他の治療的処置との併用の可能性、並びに治療する医師の判断、に応じて、変動することがある。CAR及びiCARを発現する免疫細胞の有効量は、前記対象に重大な毒性を生じさせることなく、前記対象内に存在するがんを治療する任意の量、であることがある。特定の対象が特定の量に応答しない場合、1種以上の分子（例えば、本出願に記載の改変したペプチドに結合することができる1種以上の抗原-結合ドメイン（例えば、scFv）等）の量を（例えば、2倍、3倍、4倍、又はそれ以上）増加させることがある。このより多い量を受けた後、治療に対する応答性及び毒性症状(symptom)の両方について、前記対象をモニタリングすることがある、並びにそれに応じて調整することがある。有効量は、一定のままであることがある、又は治療に対する前記対象の応答に応じて、スライド制として又は可変用量として、調整を受けることがある。様々な要因が、特定の用途に使用される実際の有効量に影響を及ぼすことがある。例えば、投与の頻度、治療期間、複数の治療作用因子の使用、投与経路、及び症状（例えば、がん）の重症度によって、投与する実際の有効量の増減が必要になることがある。
【0072】
いくつかの実施形態では、前記疾患は、前がん性の病理学的症状又は類似の前がん性症状であり、限定されるものではないが、例えば、骨髄異形成症候群、後天性再生不良性貧血、ファンコニ貧血(Fanconi anemia)、発作性夜間ヘモグロビン尿症（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria (PNH)）、5q-症候群、及びクローン性LOHを有する病態細胞を特徴とする任意の症状、が挙げられる。いくつかの実施形態では、前記疾患は、血液悪性腫瘍（例えば、骨髄異形成症候群（myelodysplastic syndrome (MDS)）、急性骨髄性白血病（acute myeloid leukemia (AML)）、急性リンパ球性白血病（acute lymphocytic leukemia (ALL)）等）である。いくつかの実施形態では、CAR及びiCARを発現する免疫細胞は、マッチした、ミス-マッチの、及びハプロ同一の、血液又は骨髄移植後に、再発する血液悪性腫瘍に存在するLOHをターゲット化することがある。いくつかの実施形態では、CAR及びiCARを発現する免疫細胞は、がん細胞中に存在する、且つ、ターゲット化したCAR T細胞療法後に又は腫瘍関連抗原（例えば、CD19又はNY-ESO-1）に対するバイスペシフィック抗体(bispecific antibody)療法後に、再発を引き起こす、LOHを、ターゲット化することがある。
【0073】
いくつかの実施形態では、本出願が提供するCAR及びiCARを発現する免疫細胞の投与頻度は、がんを有する哺乳動物を、前記哺乳動物に対して重大な毒性を生じさせることなく有効に治療する任意の頻度、であることがある。例えば、CAR及びiCARを発現する免疫細胞の投与頻度は、1週間に約2から約3回～1年に約2から約3回、あることがある。いくつかの場合では、がんを有する対象は、CAR及びiCARを発現する免疫細胞の単回投与を受けることがある。CAR及びiCARを発現する免疫細胞の投与頻度は、一定のままであることがある、又は治療期間中に可変であることがある。CAR及びiCARを発現する免疫細胞での治療の過程は、休止期を含むことがある。例えば、CAR及びiCARを発現する免疫細胞を、2年間にわたって隔月で投与し、その後、6ヶ月の休止期間が続くことがある、そして、このような投与レジメンを、複数回、反復することがある。有効量と同様に、様々な要因が、特定の用途に使用される実際の投与頻度に影響を及ぼすことがある。例えば、前記有効量、治療期間、複数の治療作用因子の使用、投与経路、及び症状（例えば、がん）の重症度によって、投与頻度の増減が必要になることがある。
【0074】
いくつかの実施形態では、CAR及びiCARを発現する免疫細胞を投与するための有効な期間は、前記対象に対して重大な毒性を生じさせることなく、前記対象内に存在するがんを有効に治療する任意の期間、であることがある。いくつかの場合では、有効な期間は、数ヶ月から数年まで、変動することがある。一般的に、がんを有する対象を治療するための有効な期間は、約1又は2ヶ月から5年間以上の期間、に及ぶことがある。複数の要因が、特定の治療に使用される実際の有効な期間に影響を及ぼすことがある。例えば、有効な期間は、投与頻度、有効量、複数の治療作用因子の使用、投与経路、及び治療するべき症状の重症度、によって変化することがある。
【0075】
ある特定の例では、対象内のがんをモニタリングすることによって、がん治療の有効性を評価することがある。任意の適切な方法を使用して、がんを有する対象が治療されるか否かを決定することがある。例えば、イメージング技術又は実験室でのアッセイを使用して、対象内に存在するがん細胞の個数及び／又は腫瘍の大きさを、評価することがある。例えば、イメージング技術又は実験室でのアッセイを使用して、対象内に存在するがん細胞及び／又は腫瘍の位置を評価することがある。
【0076】
いくつかの実施形態では、CAR及びiCARを発現する免疫細胞を、1種以上の追加的ながん治療を伴う併用療法として、がんを有する対象に投与することがある。がん治療は、任意の適切ながん治療を含むことがある。例えば、がん治療は、外科手術を含むことがある。例えば、がん治療は、放射線療法を含むことがある。例えば、がん治療は、1種以上の治療薬剤（例えば、1種以上の抗-がん剤）の投与を含むことがある。いくつかの場合では、抗-がん剤は、免疫療法（例えば、チェックポイント阻害剤）であることがある。いくつかの実施形態では、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、以前に受けたことがある。いくつかの実施形態では、前記対象は、電離放射線、化学療法剤、治療抗体、又はチェックポイント阻害剤、からなる群より選択される1種以上の追加的な抗がん療法を、受ける予定である。
【0077】
医薬組成物
いくつかの実施形態では、本開示は、CAR及びiCARを含む免疫細胞、並びに薬学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物、を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、バッファー、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、アジュバント、賦形剤、又はそれらの任意の組合せ、を含むことがある。いくつかの実施形態では、組成物は、必要に応じて、1種以上の追加的な治療活性物質を含むこともある。
いくつかの実施形態では、本開示は、CAR及びiCARを含む免疫細胞、並びに薬学的に許容可能な担体、を含む医薬組成物、を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、バッファー、希釈剤、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、アジュバント、賦形剤、又はそれらの任意の組合せ、を含むことがある。いくつかの実施形態では、組成物は、必要に応じて、1種以上の追加的な治療活性物質を含むこともある。
【0078】
いくつかの実施形態では、本開示の免疫細胞を、最初にそれらを、それらの培養培地から採取し、次いで、治療有効量での投与に適した培地及び含有システム（「薬学的に許容される」担体）で、その細胞を洗浄する、及び濃縮する、ことによって、製剤化する。好適な注入媒体は、任意の等張媒体配合、典型的には普通の生理食塩水、Normosol R(Abbott)又はPlasma-Lyte A(Baxter)、であることがあるが、5%デキストロース水溶液又は乳酸リンゲル液を利用することもある。前記注入媒体に、ヒト血清アルブミンを補充することがある。
【0079】
いくつかの実施形態では、組成物を、非経口投与用に製剤化する。例えば、本出願が提供する医薬組成物は、滅菌した注射可能な形態（例えば、皮下注射投与又は静脈内注入に適した形態）で、提供されることがある。例えば、いくつかの実施形態では、医薬組成物を、注射投与に好適な液状剤形で、提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、粉末（例えば、凍結乾燥した及び／又は滅菌した粉末）（任意選択的に減圧下で）として提供し、これを、注射投与する前に、水溶性希釈剤（例えば、水、バッファー、塩溶液、等）で再構成することがある。いくつかの実施形態では、医薬組成物を、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝生理食塩水、等で、希釈する及び／又は再構成する。いくつかの実施形態では、粉末を、水溶性希釈剤と穏やかに混合するべきである（例えば、振盪しない）。
【0080】
いくつかの実施形態では、本開示のCAR及びiCARを含む免疫細胞を、薬学的に許容される非経口媒体と共に、製剤化する。そのような媒体の例は、水、生理食塩水、リンゲル液（Ringer’s solution）、ブドウ糖液、及び1から10%ヒト血清アルブミン、である。リポソーム及び固定油などの非水系媒体を使用することもある。媒体又は凍結乾燥した粉末は、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）並びに化学的安定性（例えば、バッファー及び防腐剤）を維持する添加剤を含有することがある。いくつかの実施形態では、製剤を、既知の又は好適な技術によって滅菌する。医薬組成物は、更に、薬学的に許容される賦形剤（これは、本出願で使用する場合、所望の特定の投薬形体に適した、任意の及び全ての、溶媒、分散媒体、希釈剤、又は他の液状媒体、分散又は懸濁助剤、界面活性剤、等張剤、増粘又は乳化剤、防腐剤、固形結合剤、潤滑剤等、を含む）を含む。Remington’s The Science and Practice of Pharmacy, 21st Edition, A. R. Gennaro (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006)は、医薬組成物の製剤化に使用される様々な賦形剤、及びその調製のための既知の技術、を開示している。任意の従来の賦形剤媒体が、例えば、任意の望ましくない生物学的な効果を生じさせることによって、又は他の方法で医薬組成物の任意の他の構成要素と有害な様式で相互作用することによって、物質又はその誘導体と不適合である場合を除いて、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。
【実施例】
【0081】
本開示は、以下の実施例において更に記載されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定しない。
【0082】
実施例1 - HLA-A対立遺伝子に特異的な検出部分構造の同定
ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子複合体が存在する染色体6(6p)の短腕のヘテロ接合性の消失(LOH)は、乳がん、結腸がん、肺がん、脳がん(グリア芽腫)、及び膵臓がんのそれぞれ24%、40%、41%、41%、及び50%で、報告されている（表１）。HLA-A*02:01及びHLA-A*03:01（以降、「A2」及び「A3」と称する）は、ヒト集団において表される最もありふれたHLA-A対立遺伝子のうちの1つなので、これらの2つの対立遺伝子をターゲット化する試薬を、LOH-に向けられた治療から利益を得ることができる患者集団を最大化するために、開発した。
ヒト白血球抗原(HLA)遺伝子複合体が存在する染色体6(6p)の短腕のヘテロ接合性の消失(LOH)は、乳がん、結腸がん、肺がん、脳がん(グリア芽腫)、及び膵臓がんのそれぞれ24%、40%、41%、41%、及び50%で、報告されている（表１）。HLA-A*02:01及びHLA-A*03:01（以降、「A2」及び「A3」と称する）は、ヒト集団において表される最もありふれたHLA-A対立遺伝子のうちの1つなので、これらの2つの対立遺伝子をターゲット化する試薬を、LOH-に向けられた治療から利益を得ることができる患者集団を最大化するために、開発した。
【0083】
HLA対立遺伝子に特異的な抗体は、A2及びA3について、それぞれ、クローンBB7.2及びクローン13を使用した。新規なA3-特異的なscFv、クローン13、を開発した、ここで、3.6×1010という推定される複雑さを有するscFvファージ・ディスプレイ・ライブラリを、A3を選択的にターゲット化することができるが、他のHLA-A対立遺伝子をターゲット化することができない、結合剤を求めて、スクリーニングした。パニングの各ラウンド中に、種々のA3ペプチド-HLA(pHLA)単量体を用いて、ポジティブ選択を行い、HLA分子自体に対しての、且つ関連したペプチドに対してではない、という特異性を強化した、一方、非-A3 pHLA単量体のカクテルを用いて、ネガティブ選択を行った。富化した候補ファージ・クローンを、増幅し、フロー・サイトメトリーによって、A2単独(T2細胞)又はA2及びA3(T2A3細胞)の何れかを有する細胞への結合能について、評価した。クローン13を、試験した他のファージ・クローンと比較して、T2A3細胞に結合するが、T2細胞には結合しない、というその強い結合能が故に、選択した（図４Ｂ）。次いで、この選択したA3-特異的なscFvを、特異性を維持しながら、CAR分子上に機能的に移植することができるかどうかを、確認した。予想通り、クローン13-及びBB7.2-操作を受けたCAR T細胞は、IFN-γ放出によって評価した場合、それぞれA3又はA2でトランスフェクションしたCOS-7ターゲット細胞に曝露された場合にのみ、活性化した（図４Ｃ）。
【0084】
【表1】
【0085】
ターゲティング部分構造の特異性を、組換え発現させたscFvを使用するタイトレーション酵素-結合免疫吸着アッセイ（titration enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)）によって、更に評価した。A2-及びA3-特異的なscFvのバクテリア発現ベクターを、pAP-III6骨格中に、それぞれ、BB7.2及びクローン13配列に基づいて、作成した。一般的なHLA-B対立遺伝子(HLA-B*07:02)と同様に、4つのHLA-Aスーパーファミリーのそれぞれから由来するpHLA単量体を試験した。予想通り、A2及びA3 scFvは、それらの同族HLA対立遺伝子に対しては特異的に結合したが、試験した他の対立遺伝子のいずれにも結合しなかった（図５Ａ-５Ｂ）。pHLA単量体複合体は、W6/32、汎-HLAクラスI抗体を用いた検出を介したELISAによって確認した場合、同じ程度に折り畳まれることが確認された（図６）。
【0086】
実施例2 - HLA LOH同質遺伝子細胞株モデルの作製
次に、CRISPR技術を用いて、内因性A2及びA3対立遺伝子を発現するがん細胞株から同質遺伝子ノックアウト(KO)クローンを作製した。様々なHLA発現レベルを有する種々ながんタイプの3つの細胞株を、選択した - CFPAC-1(膵臓)、NCI-H441(肺)、RPMI-6666(ホジキン・リンパ腫) - 及び3つの細胞株全てについて、HLA単一-対立遺伝子KOクローンを、取得した（図５Ｃ）。前記クローンは、短いタンデム・リピート（short tandem repeat (STR)）プロファイリングによって評価した場合、それらの元の親細胞株と100%同一にマッチした（表２）。
次に、CRISPR技術を用いて、内因性A2及びA3対立遺伝子を発現するがん細胞株から同質遺伝子ノックアウト(KO)クローンを作製した。様々なHLA発現レベルを有する種々ながんタイプの3つの細胞株を、選択した - CFPAC-1(膵臓)、NCI-H441(肺)、RPMI-6666(ホジキン・リンパ腫) - 及び3つの細胞株全てについて、HLA単一-対立遺伝子KOクローンを、取得した（図５Ｃ）。前記クローンは、短いタンデム・リピート（short tandem repeat (STR)）プロファイリングによって評価した場合、それらの元の親細胞株と100%同一にマッチした（表２）。
【0087】
【表2】
【0088】
実施例3 - LOH検出の開発及び最適化
細胞ベースの治療プラットフォームを、多数のシグナル及びインプットを統合して、調和のとれた細胞反応プログラムを駆動する、という細胞の固有の機能のために、選択した。従って、A2又はA3のいずれかをターゲット化して、対立遺伝子の識別を可能にし得る、T細胞におけるキメラ・レセプターを開発した（即ち、新生物-ターゲティングの対立遺伝子-検出(Neoplasm-targeting Allele-Sensing (NASCAR) T細胞)）。最初に、mRNAエレクトロポレーション-に基づいた発現システムを用いて、候補構築物を、容易に且つ迅速に繰り返すことができるようにした。初代ヒトT細胞のために最適化したプロトコルを開発した、これにより、事実上全ての細胞は、エレクトロポレーション後の高い細胞生存率で、所望のタンパク質を発現するようになった（図２、図３）。
細胞ベースの治療プラットフォームを、多数のシグナル及びインプットを統合して、調和のとれた細胞反応プログラムを駆動する、という細胞の固有の機能のために、選択した。従って、A2又はA3のいずれかをターゲット化して、対立遺伝子の識別を可能にし得る、T細胞におけるキメラ・レセプターを開発した（即ち、新生物-ターゲティングの対立遺伝子-検出(Neoplasm-targeting Allele-Sensing (NASCAR) T細胞)）。最初に、mRNAエレクトロポレーション-に基づいた発現システムを用いて、候補構築物を、容易に且つ迅速に繰り返すことができるようにした。初代ヒトT細胞のために最適化したプロトコルを開発した、これにより、事実上全ての細胞は、エレクトロポレーション後の高い細胞生存率で、所望のタンパク質を発現するようになった（図２、図３）。
【0089】
LOH検出を可能にするために、HLA-A対立遺伝子に特異的なscFvを、活性化(CAR)又は阻害性(iCAR)シグナリング・ドメインの何れかを有するキメラ・レセプターに、移植した。特異性を最大化するために、NASCARターゲティング・プラットフォームの各々の構成要素に関する様々なパラメータ（即ち、iCARフォーマット、CARヒンジ、CARとiCARとの間の化学量論）を系統的に最適化した。
【0090】
CD3ζ細胞質ドメインに融合した、CD28ヒンジ・ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞質ドメイン、を含む、第2世代のCARを、活性化構築物として使用した（図７）。種々のヒンジ及び膜貫通の組合わせを有する、CTLA-4又はPD-1阻害性ドメインを取り込んだ、4つのiCAR構築物を、スクリーニングした。それぞれの阻害性ドメインについて、2つの組合せを試験した。CTLA-4若しくはPD-1細胞質ドメインの何れかを、CD8αヒンジ・ドメイン及び膜貫通ドメインに融合させた、又はCTLA-4若しくはPD-1細胞質ドメインを、各々の阻害性レセプターの同族ヒンジ・ドメイン及び膜貫通ドメインと共に、使用した（図７）。各々のiCAR構築物について、ターゲティングscFv部分構造を欠失させた、コントロールの構築物も作製した。iCAR性能を評価するために、CARを共-発現するT細胞を、それぞれの個々のiCARと組合わせて、A2又はA2+A3-トランスフェクションしたCOS-7細胞と、共-インキュベーションした。A2-トランスフェクションした細胞と比較して、A2+A3-トランスフェクションしたCOS-7細胞に対するIFN-γ分泌が減少することによって証明されるように、PD-1 iCAR構築物のみが、実質的な対立遺伝子-特異的な阻害をもたらした（図８）。CD8αヒンジ及び膜貫通ドメインを有するPD-1細胞質ドメインを含むiCAR構築物は、最も強力な対立遺伝子特異性を示した、従って、以下に記載される試験のためのNASCAR阻害性のモジュールとして選択された。
【0091】
CARヒンジ・ドメインを、CD28からCD8αに、調節すれば、CARとiCARとの間のCD8αヒンジのヘテロ二量体化が可能になることによって、近くのCARシグナリングを、より大きく、iCAR-媒介性に、抑制することが可能になるものと、仮定された（図７）。実際、iCAR-媒介性によるCAR活性の阻害は、IFN-γ放出によって評価した場合、A2及びA3の両方を発現するCFPAC-1ターゲット細胞と結合したとき、CD8α-ヒンジ式CARで、強化された（図９）。CD8α-ヒンジ式CARは、対立遺伝子特異性のウィンドウを増大させたので、それを、以下に記載する実験のためのNASCAR活性化モジュールとして選択した。
【0092】
キメラ・レセプターを初代ヒトT細胞に導入するためのmRNA-ベースの発現システムには、エレクトロポレーションしたmRNAの量とその対応するCAR発現レベルとの間に線形的な相関性があること、が観察された（図１０）。従って、CARとiCARとの間の化学量論を調整することによって、そのシステムに対する特異性をより大きくすることができるかどうか、を検討した。CAR:iCAR mRNAに関する1:1の比率は、かなりの対立遺伝子特異性を示したが、CFPAC-1 A2/A3ターゲット細胞を使用してIFN-γ分泌を検出することができたことで証明されるように、依然として著しいオフ-ターゲットの活性化があった。しかしながら、CAR:iCARの比率を1:3に減少させると、オフ-ターゲットA2/A3細胞に対するT-細胞活性化は、顕著に抑制された（図１１）。従って、CAR:iCARに関する1:3の比率を、以下に記載するNASCAR実験のために選択した。
【0093】
実施例4 - in vitroでのNASCAR特異性の決定
NASCARアプローチに関する、モジュール性、特異性、及び対称性をしっかりと実証するために、CAR及びiCARの両方の組合せ（即ち、A2-CAR+A3-iCAR、A3-CAR+A2-iCAR)を、3組の同質遺伝子の細胞株全てに対して試験した。IFN-γ及びインターロイキン-2(IL-2)サイトカイン放出によって評価した場合、T-細胞の活性化は、3種の細胞株バックグラウンド全てにわたって著しく類似しており、予想された対立遺伝子-特異的なターゲティング・プロファイルが明らかになった（図１２Ａ-１２Ｂ）。一貫して、細胞傷害性の程度は、サイトカイン放出の程度を反映した（図１２Ｃ）。
NASCARアプローチに関する、モジュール性、特異性、及び対称性をしっかりと実証するために、CAR及びiCARの両方の組合せ（即ち、A2-CAR+A3-iCAR、A3-CAR+A2-iCAR)を、3組の同質遺伝子の細胞株全てに対して試験した。IFN-γ及びインターロイキン-2(IL-2)サイトカイン放出によって評価した場合、T-細胞の活性化は、3種の細胞株バックグラウンド全てにわたって著しく類似しており、予想された対立遺伝子-特異的なターゲティング・プロファイルが明らかになった（図１２Ａ-１２Ｂ）。一貫して、細胞傷害性の程度は、サイトカイン放出の程度を反映した（図１２Ｃ）。
【0094】
上記のアッセイは、エフェクター細胞としてA2/A3-ネガティブのドナー(donor)由来の初代ヒトT細胞を用いた。そうでなければ、CARを有するがiCARを有さないコントロールの条件では、エフェクターT細胞は、ターゲット抗原を自己発現するために、同胞を傷害する。しかしながら、実際には、エフェクターT細胞は、A2及びA3の両方を発現する自己の起源に由来する可能性が高い。そのために、モデル「自己」抗原-ポジティブ(A2/A3) エフェクター・ドナー(donor)T細胞における自己反応性対モデル「同種異系」抗原-ネガティブ (A1/A24)エフェクター・ドナー(donor)T細胞における自己反応性を、アッセイした。A1/A24ドナー(donor)T細胞は、活性化抗原を欠くために、IFN-γシグナルを誘発しなかったが、A2/A3ドナー(donor)T細胞の中にCARだけを導入すると、予想された自己反応性がもたらされ、同胞を傷害するようになった。対照的に、A2/A3ドナー(donor)T細胞において、活性化モジュールと共に阻害性モジュールをNASCAR発現させると、同胞を傷害することはなかった（図１３Ａ）。更に、NASCAR-操作を受けたA2/A3ドナー(donor)T細胞は、IFN-γ放出によって評価した場合、LOHを有するがん細胞をターゲティングすることにおいて、A1/A24ドナー(donor)T細胞と同じくらい有効であった（図１３Ｂ）。
【0095】
実施例5 - in vivoでのNASCAR抗腫瘍活性の評価
NASCARアプローチをin vivoの環境に拡張することができるかどうかを決定するために、構築物を、一過性のmRNA-ベースの発現システムから安定的なCRISPR-ベースのノック-イン発現システムに、変換した。初代ヒトT細胞に導入したCAR構築物について、厳密な発現分布パターンを生成する、という作用能が報告されていることから、ノック-インの方策を、選択した。A3-CARを含む相同組換え修復(Homology directed repair)(HDR)テンプレート、又は2A自己切断ペプチド配列を間に挟んだA3-CAR及びA2-iCARを含むバイシストロニックなNASCAR構築物（bicistronic NASCAR construct）、を作製した。iCARを、CARに対して5'側に配置し、その比率を、前にあるレセプターにとって有利なものとした。HDRテンプレートを、B2M遺伝子座にターゲティングして、高いレベルの発現を可能にし、T-細胞レセプターα定常（T-cell receptor α constant (TRAC)）遺伝子座をターゲティングするガイドRNA(gRNA)を、同時に、エレクトロポレーション・カクテルに含めることによって、TRACを不活性化し、その結果、マウスで腫瘍を確立させるために使用したヒトがん細胞に対する同種反応性を低下させた。この安定的なNASCAR発現システムに関するin vitro特性評価により、TCRの発現がほぼ完全に破壊されること、導入した遺伝子の編集効率が約30%であること、及びCFPAC-1 HLA KO同質遺伝子ターゲット細胞株と共-インキュベーションした場合の予想される対立遺伝子認識パターン、が明らかになった（図１４Ａ-１４Ｃ）。in vivo特性評価は、CFPAC-1 A2/A3腫瘍又は -/A3腫瘍を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスの皮下異種移植片モデル、を用いた。治療のために、CRISPR-操作を受けたCAR又はNASCAR T細胞を、腫瘍が確立されて触知可能になったら、腫瘍接種の10日後に、尾静脈を介して、投与した（図１５Ａ）。CAR T細胞により治療をすると、両方の腫瘍を退縮させたが、NASCAR T細胞は、前記-/A3腫瘍を排除し、正常な組織を表すA2/A3ヘテロ接合性腫瘍を残した（図１５Ｂ）。正常な体重増加から大きく逸脱することはなかったことが証明するように、当該治療は、十分に忍容な治療であった（図１６）。
NASCARアプローチをin vivoの環境に拡張することができるかどうかを決定するために、構築物を、一過性のmRNA-ベースの発現システムから安定的なCRISPR-ベースのノック-イン発現システムに、変換した。初代ヒトT細胞に導入したCAR構築物について、厳密な発現分布パターンを生成する、という作用能が報告されていることから、ノック-インの方策を、選択した。A3-CARを含む相同組換え修復(Homology directed repair)(HDR)テンプレート、又は2A自己切断ペプチド配列を間に挟んだA3-CAR及びA2-iCARを含むバイシストロニックなNASCAR構築物（bicistronic NASCAR construct）、を作製した。iCARを、CARに対して5'側に配置し、その比率を、前にあるレセプターにとって有利なものとした。HDRテンプレートを、B2M遺伝子座にターゲティングして、高いレベルの発現を可能にし、T-細胞レセプターα定常（T-cell receptor α constant (TRAC)）遺伝子座をターゲティングするガイドRNA(gRNA)を、同時に、エレクトロポレーション・カクテルに含めることによって、TRACを不活性化し、その結果、マウスで腫瘍を確立させるために使用したヒトがん細胞に対する同種反応性を低下させた。この安定的なNASCAR発現システムに関するin vitro特性評価により、TCRの発現がほぼ完全に破壊されること、導入した遺伝子の編集効率が約30%であること、及びCFPAC-1 HLA KO同質遺伝子ターゲット細胞株と共-インキュベーションした場合の予想される対立遺伝子認識パターン、が明らかになった（図１４Ａ-１４Ｃ）。in vivo特性評価は、CFPAC-1 A2/A3腫瘍又は -/A3腫瘍を有するNOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)マウスの皮下異種移植片モデル、を用いた。治療のために、CRISPR-操作を受けたCAR又はNASCAR T細胞を、腫瘍が確立されて触知可能になったら、腫瘍接種の10日後に、尾静脈を介して、投与した（図１５Ａ）。CAR T細胞により治療をすると、両方の腫瘍を退縮させたが、NASCAR T細胞は、前記-/A3腫瘍を排除し、正常な組織を表すA2/A3ヘテロ接合性腫瘍を残した（図１５Ｂ）。正常な体重増加から大きく逸脱することはなかったことが証明するように、当該治療は、十分に忍容な治療であった（図１６）。
【0096】
実施例6 - 概念実証（Proof-of-concept）synNotch-NASCAR LOHターゲティング
synNotch-NASCAR T細胞が、LOHを、検出することができるかどうか及びターゲット化することができるかどうか、を決定するために、示したHLA-A対立遺伝子の状態であるCFPAC-1がん細胞を、示した対立遺伝子-ターゲティングsynNotch活性化因子の及び／又は抑制性因子のmRNA並びにIL-2 DNA応答エレメントの組合せを用いて構成されたsynNotch-NASCAR T細胞と、共-インキュベーションした。SynNotch-NASCAR活性を、IL-2についてのELISAによって、評価した（図１９）。
synNotch-NASCAR T細胞が、LOHを、検出することができるかどうか及びターゲット化することができるかどうか、を決定するために、示したHLA-A対立遺伝子の状態であるCFPAC-1がん細胞を、示した対立遺伝子-ターゲティングsynNotch活性化因子の及び／又は抑制性因子のmRNA並びにIL-2 DNA応答エレメントの組合せを用いて構成されたsynNotch-NASCAR T細胞と、共-インキュベーションした。SynNotch-NASCAR活性を、IL-2についてのELISAによって、評価した（図１９）。
【0097】
実施例7 - CAR及びiCAR構築物に関するフロー特性評価
CAR及びiCAR構築物は、CRISPR Cas9によって二本鎖DNA切断が誘導された後、B2M遺伝子座での相同組換え修復(homology directed repair)を介して、dsDNAテンプレートとして、T細胞の中に導入されるように、設計されている。使用した主要な構成要素には、ホモロジー・アーム、2A配列、CAR、iCAR、及びポリAターミネーター、が含まれる（図２１）。
CAR及びiCAR構築物は、CRISPR Cas9によって二本鎖DNA切断が誘導された後、B2M遺伝子座での相同組換え修復(homology directed repair)を介して、dsDNAテンプレートとして、T細胞の中に導入されるように、設計されている。使用した主要な構成要素には、ホモロジー・アーム、2A配列、CAR、iCAR、及びポリAターミネーター、が含まれる（図２１）。
【0098】
【表3-1】
【表3-2】
【表3-3】
【表3-4】
【表3-5】
【表3-6】
【表3-7】
【表3-8】
【表3-9】
【表3-10】
【表3-11】
【0099】
次いで、B2M遺伝子座に対してターゲット化したCas9 RNP、及びdsDNA相同組換え修復(homology directed repair)テンプレート、をエレクトロポレーションすることを介して、前記CAR及びiCAR構築物を、初代ヒトT細胞の中に導入した。T細胞を、最初のエレクトロポレーションの6日後にフロー・サイトメトリーを行うことによって、アッセイした、ここで、単一の生細胞のタンパク質L標識（A3-CARとラベル）（図２２Ａ）、並びに単一の生細胞のA2及びA3四量体染色、を測定した（図２２Ｂ）。
【0100】
実施例8 - CAR及びiCARの組合せに関する共-培養評価
CAR及びiCAR改変T細胞を、3種の異なった細胞株との共-培養において評価して、iCAR媒介性の阻害効力を決定した：CFPAC-1親株(HLA-A2+/HLA-A3+)、CFPAC-1 A2KO(HLA-A2-/HLA-A3+)、及びCFPAC-1 A3KO(HLA-A2+/HLA-A3-)。共-培養する前に、T細胞を、サイトカインを含まない培地で洗浄し、次いで、サイトカイン無しで16時間インキュベーションした。各ウェルにおいて、60k CAR/iCAR改変T細胞を、30kターゲット細胞と共に、サイトカイン無しで、20時間インキュベーションした。細胞培養上清中のIL-2（図２３Ａ）及びIFNg（図２３Ｂ）を、ELISAによって定量した。図２３Ｃは、CD8ヒンジ／膜貫通構築物のみによって分泌される、IL-2及びIFNg濃度を示す。
CAR及びiCAR改変T細胞を、3種の異なった細胞株との共-培養において評価して、iCAR媒介性の阻害効力を決定した：CFPAC-1親株(HLA-A2+/HLA-A3+)、CFPAC-1 A2KO(HLA-A2-/HLA-A3+)、及びCFPAC-1 A3KO(HLA-A2+/HLA-A3-)。共-培養する前に、T細胞を、サイトカインを含まない培地で洗浄し、次いで、サイトカイン無しで16時間インキュベーションした。各ウェルにおいて、60k CAR/iCAR改変T細胞を、30kターゲット細胞と共に、サイトカイン無しで、20時間インキュベーションした。細胞培養上清中のIL-2（図２３Ａ）及びIFNg（図２３Ｂ）を、ELISAによって定量した。図２３Ｃは、CD8ヒンジ／膜貫通構築物のみによって分泌される、IL-2及びIFNg濃度を示す。
【0101】
実施例9 - CAR:iCARの発現比率を改変する方策
相同組換え修復(Homology directed repair) テンプレート(HDRT)を、CAR:iCARの発現比率が変わるように設計した（図２４Ａ）。その構築物を、B2M遺伝子座に対してターゲット化したCas9 RNP及び特定の構築物をコードするdsDNA HDRTをエレクトロポレーションすることによって、初代ヒトT細胞に導入した。改変したT細胞を、A3四量体で染色してCAR発現を検出し、A2四量体で染色してiCAR発現を検出した。全ての構築物は、内因性B2Mプロモーターから発現されたが（図２４Ｂ）、一方で、内因性B2Mプロモーターと外因性EF1aプロモーターとの間の比較を示す（図２４Ｃ）。
相同組換え修復(Homology directed repair) テンプレート(HDRT)を、CAR:iCARの発現比率が変わるように設計した（図２４Ａ）。その構築物を、B2M遺伝子座に対してターゲット化したCas9 RNP及び特定の構築物をコードするdsDNA HDRTをエレクトロポレーションすることによって、初代ヒトT細胞に導入した。改変したT細胞を、A3四量体で染色してCAR発現を検出し、A2四量体で染色してiCAR発現を検出した。全ての構築物は、内因性B2Mプロモーターから発現されたが（図２４Ｂ）、一方で、内因性B2Mプロモーターと外因性EF1aプロモーターとの間の比較を示す（図２４Ｃ）。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22A-1】
【図22A-2】
【図22B-1】
【図22B-2】
【図23】
【図24A】
【図24B-1】
【図24B-2】
【図24C】
【配列表】
【国際調査報告】