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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】局所用のバイオポリマー
(51)【国際特許分類】
C08B 37/00 20060101AFI20240220BHJP
A61K 8/73 20060101ALI20240220BHJP
A61Q 19/00 20060101ALI20240220BHJP
A61Q 19/08 20060101ALI20240220BHJP
A61K 31/716 20060101ALI20240220BHJP
A61P 17/16 20060101ALI20240220BHJP
C12P 19/04 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C08B37/00 P
A61K8/73
A61Q19/00
A61Q19/08
A61K31/716
A61P17/16
C12P19/04 C
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554289
(86)(22)【出願日】2022-03-08
(85)【翻訳文提出日】2023-10-04
(86)【国際出願番号】 US2022019290
(87)【国際公開番号】W WO2022192216
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】63/158,268
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(31)【優先権主張番号】63/251,205
(32)【優先日】2021-10-01
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523337878
【氏名又は名称】エキソポリマー インコーポレイテッド
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】ウェルズ デレク
【テーマコード（参考）】
4B064
4C083
4C086
4C090
【Ｆターム（参考）】
4B064AF12
4B064CA02
4B064CA19
4B064CC24
4B064CE03
4B064DA01
4C083AA031
4C083AA032
4C083AA122
4C083AB032
4C083AC012
4C083AC072
4C083AC122
4C083AC212
4C083AC242
4C083AC272
4C083AC352
4C083AC422
4C083AC442
4C083AC472
4C083AC482
4C083AC682
4C083AC782
4C083AC852
4C083AD092
4C083AD211
4C083AD212
4C083CC01
4C083CC05
4C083DD23
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4C083FF01
4C086AA01
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4C086MA16
4C086MA22
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4C086ZA89
4C090AA01
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4C090BA70
4C090BB03
4C090BB12
4C090BB13
4C090BB29
4C090BB32
4C090BB35
4C090BB52
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4C090BB72
4C090BB92
4C090BB97
4C090BC20
4C090BD03
4C090BD24
4C090BD36
4C090BD37
4C090CA36
4C090CA39
4C090DA03
4C090DA05
4C090DA23
4C090DA26
(57)【要約】
反復多糖単位を含むバイオポリマー、バイオポリマーの調製物、及びバイオポリマーを含む局所組成物、並びに使用方法が本明細書に提供される。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、前記グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、前記ガラクトースの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％がピルビル化されている、バイオポリマー調製物。
【請求項2】
前記グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、請求項１に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項3】
構造：【化1】
【請求項4】
前記バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．４～１：０．６～１である、請求項１～３のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項5】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項１～４のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項6】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項１～４のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項7】
前記バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％がバイオポリマーであるか、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、請求項１～６のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項8】
等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、請求項１～７のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項9】
前記バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％の量の水を吸収することができる、請求項１～８のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項10】
吸水率が、前記バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項９又は１０に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項11】
前記バイオポリマー調製物の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満若しくは１％未満がスクシノグリカンであるか、又は前記バイオポリマー調製物がスクシノグリカンを実質的に含まない、請求項１～１０のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項12】
固体又は粉末である、請求項１～１１のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項13】
前記バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、請求項１～１２のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項14】
グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、前記グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、前記ガラクトースの１５％未満、１０％未満又は５％未満がピルビル化されている、バイオポリマー調製物。
【請求項15】
前記グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、請求項１４に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項16】
バイオポリマー調製物であって、バイオポリマーが、構造：【化2】
【請求項17】
前記バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．５未満：０．６～１である、請求項１４～１６のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項18】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項19】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項１４～１７のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項20】
前記バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、請求項１４～１９のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項21】
等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、請求項１４～２０のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項22】
前記バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、請求項１４～２１のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項23】
吸水率が、前記バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項２１又は２２に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項24】
前記バイオポリマー調製物の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満又は１％未満がスクシノグリカンである、請求項１４～２３のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項25】
固体又は粉末である、請求項１４～２４のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項26】
前記バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、請求項１４～２５のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項27】
構造：【化3】
【請求項28】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項２７に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項29】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が１．６ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項２７に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項30】
前記バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％がバイオポリマーであるか、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、請求項２７～２９のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項31】
等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、請求項２７～３０のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項32】
前記バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、請求項２７～３１のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項33】
吸水率が、前記バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項３１又は３２に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項34】
固体又は粉末である、請求項２７～３３のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項35】
前記バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、請求項２７～３４のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項36】
反復多糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、各多糖単位が２個～１５個又は２個～１２個又は２個～１０個の単糖を含み、前記バイオポリマーの前記反復多糖単位中の負電荷：単糖の比率が、少なくとも０．３又は少なくとも０．３５又は少なくとも０．４又は少なくとも０．４５である、バイオポリマー調製物。
【請求項37】
前記多糖単位が、少なくとも１つのグルコースに連結された少なくとも１つのガラクトースを含む、請求項３６に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項38】
少なくとも１つのガラクトースがβ－１，３グリコシド結合を介してグルコースに連結されている、請求項３７に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項39】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項40】
前記バイオポリマー調製物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項３６～３８のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項41】
前記バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、請求項３６～４０のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項42】
等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、請求項３６～４１のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項43】
前記バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、請求項３６～４２のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項44】
吸水率が、前記バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項４２又は４３に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項45】
固体又は粉末である、請求項３６～４４のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項46】
前記バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、請求項３６～４５のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物。
【請求項47】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成され、前記グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、前記ガラクトースの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％がピルビル化されている、局所組成物。
【請求項48】
前記グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、請求項４７に記載の局所組成物。
【請求項49】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、構造：【化4】
【請求項50】
前記バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．４～１：０．６～１である、請求項４７～４９のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項51】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項４７～５０のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項52】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項４７～５１のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項53】
前記バイオポリマーが、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項54】
前記バイオポリマーが、該バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％の量の水を吸収することができる、請求項４７～５３のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項55】
吸水率が、前記バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項５３又は５４に記載の局所組成物。
【請求項56】
請求項１～１３のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物を含む、請求項４７～５５のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項57】
スクシノグリカンを実質的に含まない、請求項４７～５６のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項58】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成され、前記グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、前記ガラクトースの１５％未満、１０％未満又は５％未満がピルビル化されている、局所組成物。
【請求項59】
前記グルコース及びガラクトースがβ－１，３結合及びα－１，３結合によって連結されている、請求項５８に記載の局所組成物。
【請求項60】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、構造：【化5】
【請求項61】
前記バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．５未満：０．６～１である、請求項５８～６０のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項62】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項63】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項５８～６１のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項64】
前記バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、請求項５８～６３のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項65】
前記バイオポリマー調製物が、前記バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、請求項５８～６４のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項66】
吸水率が、前記バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項６４又は６５に記載の局所組成物。
【請求項67】
請求項１４～２６のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物を含む、請求項５８～６６のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項68】
スクシノグリカンを実質的に含まない、請求項５８～６７のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項69】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、構造：【化6】
【請求項70】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項６９に記載の局所組成物。
【請求項71】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が１．６ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項６９に記載の局所組成物。
【請求項72】
前記バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、請求項６９～７１のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項73】
前記バイオポリマー調製物が、前記バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、請求項６９～７２のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項74】
吸水率が、前記バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項７２又は７３に記載の局所組成物。
【請求項75】
請求項２７～３５のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物を含む、請求項６９～７４のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項76】
バイオポリマーを含む局所組成物であって、前記バイオポリマーが、反復多糖単位から構成され、各多糖単位が２個～１５個又は２個～１２個又は２個～１０個の単糖を含み、前記バイオポリマーの前記反復多糖単位中の負電荷：単糖の比率が、少なくとも０．３又は少なくとも０．３５又は少なくとも０．４又は少なくとも０．４５である、局所組成物。
【請求項77】
前記多糖単位が、少なくとも１つのグルコースに連結された少なくとも１つのガラクトースを含む、請求項７６に記載の局所組成物。
【請求項78】
少なくとも１つのガラクトースがβ－１，３グリコシド結合を介してグルコースに連結されている、請求項７７に記載の局所組成物。
【請求項79】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項80】
前記局所組成物中の前記バイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、請求項７６～７８のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項81】
前記バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、請求項７６～８０のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項82】
前記バイオポリマー調製物が、前記バイオポリマーの初期乾燥重量と比べて少なくとも同等、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍の量の水を吸収することができる、請求項７６～８１のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項83】
吸水率が、前記バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、請求項８１又は８２に記載の局所組成物。
【請求項84】
請求項３６～４６のいずれか一項に記載のバイオポリマー調製物を含む、請求項７６～８３のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項85】
０．０１％～１０％（ｗ／ｗ）又は０．０５％～５％（ｗ／ｗ）の前記バイオポリマーを含む、請求項４７～８４のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項86】
１つ以上の増粘剤、安定剤、乳化剤、皮膚軟化剤、保湿剤、レオロジー調整剤、皮膜形成剤、酸化防止剤、添加剤、活性剤、バター、精油、浸出油、粘土、泥、抽出物、ヒドロゾル水、角質除去剤、補給剤、ワックス、濃厚剤、塩、ミネラル、酸、塩基、キャリアオイル、固定油、界面活性剤、防腐剤、パール化剤、品質改良剤、構造化剤、増白剤、湿潤剤、浸透圧調節物質、閉塞剤、洗浄剤、着色剤、顔料、香料、ＵＶ－Ａ遮断薬、ＵＶ－Ｂ遮断薬、及び／又は栄養剤を含む、請求項４７～８５のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項87】
ヒアルロン酸を含む、請求項４７～８６のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項88】
ヒアルロン酸を含まない、請求項４７～８６のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項89】
クリーム、ローション、軟膏、バーム、チンキ、リニメント、シャンプー、石鹸、コンディショナー、日焼け止め、リンス、デオドラント又は化粧品である、請求項４７～８８のいずれか一項に記載の局所組成物。
【請求項90】
請求項４７～８９のいずれか一項に記載の局所組成物を適用することを含む、被験体における皮膚状態を治療又は予防する方法。
【請求項91】
前記皮膚状態が乾燥皮膚、しわの多い皮膚、たるんだ皮膚、老化した皮膚、傷のある皮膚、負傷した皮膚、染みのある皮膚、座瘡及び／又は日焼けした皮膚の１つ以上である、請求項９０に記載の方法。
【請求項92】
前記皮膚状態が炎症性皮膚状態である、請求項９０に記載の方法。
【請求項93】
前記炎症性皮膚状態が乾癬、湿疹又はアトピー性皮膚炎である、請求項９２に記載の方法。
【請求項94】
前記局所組成物を前記被験体の顔、耳、額、首、腕、上胸部、脚、足及び／又は手に適用する、請求項９０～９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項95】
前記局所組成物が経表皮水分喪失を減少させ、経表皮水分喪失を逆転させ、表皮水分保持を改善し、しわの出現を軽減し、皮膚のたるみを減少させ、皮膚の滑らかさを増加させ、皮膚の膨潤を増加させ、皮膚の柔軟性を改善し、皮膚のきめを改善し、皮膚の染みを減少させ、及び／又は皮膚の乾燥を減少させる、請求項９０～９４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
［関連出願の相互参照］
本願は、２０２１年３月８日付で出願された米国仮出願第６３／１５８，２６８号及び２０２１年１０月１日付で出願された米国仮出願第６３／２５１，２０５号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。
本願は、２０２１年３月８日付で出願された米国仮出願第６３／１５８，２６８号及び２０２１年１０月１日付で出願された米国仮出願第６３／２５１，２０５号の優先権の利益を主張し、それぞれの全体があらゆる目的で引用することにより本明細書の一部をなす。
【0002】
反復多糖単位を含むバイオポリマー、バイオポリマーの調製物、及びバイオポリマーを含む局所組成物、並びに使用方法が本明細書に提供される。
【背景技術】
【0003】
水を結合し、保持するポリマーが、そのアンチエイジング効果及び抗しわ効果のためにパーソナルケア製品及び化粧品において求められている。これらの特性を有するポリマーは、皮膚の表面に適用した場合に、上皮の保水性（hydration）を増加させる。分子量が十分に低いポリマーは、皮膚上皮の外層を通過することができる。保水性及び水分量の増加がしわの出現を効果的に軽減し、より滑らかでより柔軟な皮膚をもたらすため、水を結合し、保持する能力は重要である。
【0004】
アンチエイジング配合物、特に高級パーソナルケア製品に最も一般的に使用されているポリマーは、ヒアルロン酸（ＨＡ）である。ＨＡは動物の皮膚、結合組織及び滑液に自然に見られる高分子量（ＨＭＷ）ポリマーであり、水分を保持し、潤滑性を与えることによって機能する。ＨＡは栄養補助食品、関節潤滑のための注射剤、癒着防止のための外科手術補助剤、皮膚充填剤、皮膚表面保湿剤として、またＬＭＷ製品の上述の皮膚浸透特性、水結合特性から、パーソナルケア製品及び化粧品に広く使用されている。ＨＡは通例、動物由来であり、従来は雄鶏のとさかに由来し、またブタ又はウシの加工施設からの副産物としても得られる。ＨＡは、自然にＨＡを細胞莢膜に組み込む病原性細菌であるストレプトコッカス・ズーエピデミカス（Streptococcus zooepidemicus）又は近縁種の発酵によっても生産され得る。
【0005】
動物由来及び発酵由来のＨＡの製造コストはどちらも高い。動物の場合、コストは、比較的低い組織量当たりのＨＡの収量と、精製製品を生産するのに必要とされる幾つかの下流の処理工程とに左右される。Ｓ．ズーエピデミカス（S. zooepidemicus）のＨＡの場合、生産生物が感染因子であるため、大規模発酵を厳密に規制された条件下で行う必要がある。さらに、最終製品に入り込む可能性がある、細菌によって産生されるあらゆる潜在的な毒素を低減するために、下流の処理工程が必要とされる場合もある。最後に、どちらの製品も、皮膚浸透を可能にする分子量のＨＡを生産するために化学的又は酵素的に処理する必要がある。
【0006】
コスト及び製造上の制限にもかかわらず、ＨＡ市場は、化粧品におけるＨＡの強力な抗しわ性能及びアンチエイジング性能のために成長し続けている。現在、ＨＡと同じか又はより良好な機能性をもたらす競合技術は殆どない。改善された水分結合を示し、表面上に留まることができるか、又は皮膚に浸透することができ、実質的により低コストで生産することができる代替製品は、市場の大幅な成長及び拡大を可能にするであろう。パーソナルケア業界及び化粧品業界における幅広いニーズに対応するために、水分結合性の炭水化物ベースのポリマーが必要とされており、また不足している。
【発明の概要】
【0007】
本開示は、ＨＡ等の既知の作用物質と比較して改善された水分結合能を有する、自然に生産された非動物由来の炭水化物バイオポリマーを提供する。本明細書に提示される実施例に示されるように、本開示のバイオポリマーは、ＨＡと比べて顕著に改善された水分結合能を示す。本開示のバイオポリマーは、パーソナルケア用途及び化粧品用途に特に適しており、標準試験において細胞毒性を欠く。さらに、本開示のバイオポリマーは、ローションベース中の機能性成分として使用した場合に、改善された皮膚保水性能を示す。
【0008】
幾つかの実施の形態において、本開示のバイオポリマーは、経皮浸透性を示す。幾つかの実施の形態において、皮膚に浸透することが可能なバイオポリマーは、常に低い分子量を有する。幾つかの実施の形態において、浸透性バイオポリマーの分子量は、３ｋＤａ未満である。幾つかの実施の形態において、浸透性バイオポリマーの分子量は、３ｋＤａ～０．５ｋＤａの範囲である。
【0009】
本開示のバイオポリマーは、少なくとも動物源に由来せず、農産物原料を用いた非病原性微生物の発酵によって作製することができるため、ＨＡ等の作用物質よりも改善されている。
【0010】
実施の形態１．グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％がピルビル化されている（pyruvylated）、バイオポリマー調製物。
【0011】
実施の形態２．グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、実施の形態１のバイオポリマー調製物。
【0012】
実施の形態３．構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、バイオポリマー調製物。
【化1】
【0013】
実施の形態４．バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．４～１：０．６～１である、実施の形態１～３のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0014】
実施の形態５．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態１～４のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0015】
実施の形態６．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態１～４のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0016】
実施の形態７．バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％がバイオポリマーであるか、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0017】
実施の形態８．等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0018】
実施の形態９．バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％の量の水を吸収することができる、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0019】
実施の形態１０．吸水率が、バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態９又は１０のバイオポリマー調製物。
【0020】
実施の形態１１．バイオポリマー調製物の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満若しくは１％未満がスクシノグリカンであるか、又はバイオポリマー調製物がスクシノグリカンを実質的に含まない、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0021】
実施の形態１２．固体又は粉末である、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0022】
実施の形態１３．バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、上記の実施の形態のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0023】
実施の形態１４．グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの１５％未満、１０％未満又は５％未満がピルビル化されている、バイオポリマー調製物。
【0024】
実施の形態１５．グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、実施の形態１４のバイオポリマー調製物。
【0025】
実施の形態１６．バイオポリマー調製物であって、バイオポリマーが、構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成され、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の１５％以下、１０％以下又は５％以下がピルビル化されている、バイオポリマー調製物。
【化2】
【0026】
実施の形態１７．バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．５未満：０．６～１である、実施の形態１４～１６のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0027】
実施の形態１８．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態１４～１７のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0028】
実施の形態１９．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態１４～１７のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0029】
実施の形態２０．バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、実施の形態１４～１９のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0030】
実施の形態２１．等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、実施の形態１４～２０のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0031】
実施の形態２２．バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、実施の形態１４～２１のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0032】
実施の形態２３．吸水率が、バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態２１又は２２のバイオポリマー調製物。
【0033】
実施の形態２４．バイオポリマー調製物の２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満又は１％未満がスクシノグリカンである、実施の形態１４～２３のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0034】
実施の形態２５．固体又は粉末である、実施の形態１４～２４のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0035】
実施の形態２６．バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、実施の形態１４～２５のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0036】
実施の形態２７．構造：
（ここで、点線は多糖単位間の結合を表す）の反復多糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、多糖単位の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がアセチル部分を欠き、多糖単位の１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、バイオポリマー調製物。
【化3】
【0037】
実施の形態２８．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態２７のバイオポリマー調製物。
【0038】
実施の形態２９．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が１．６ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態２７のバイオポリマー調製物。
【0039】
実施の形態３０．バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％がバイオポリマーであるか、又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、実施の形態２７～２９のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0040】
実施の形態３１．等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、実施の形態２７～３０のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0041】
実施の形態３２．バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、実施の形態２７～３１のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0042】
実施の形態３３．吸水率が、バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態３１又は３２のバイオポリマー調製物。
【0043】
実施の形態３４．固体又は粉末である、実施の形態２７～３３のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0044】
実施の形態３５．バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、実施の形態２７～３４のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0045】
実施の形態３６．反復多糖単位から構成されるバイオポリマーを含むバイオポリマー調製物であって、各多糖単位が２個～１５個又は２個～１２個又は２個～１０個の単糖を含み、バイオポリマーの反復多糖単位中の負電荷：単糖の比率が、少なくとも０．３又は少なくとも０．３５又は少なくとも０．４又は少なくとも０．４５である、バイオポリマー調製物。
【0046】
実施の形態３７．多糖単位が、少なくとも１つのグルコースに連結された少なくとも１つのガラクトースを含む、実施の形態３６のバイオポリマー調製物。
【0047】
実施の形態３８．少なくとも１つのガラクトースがβ－１，３グリコシド結合を介してグルコースに連結されている、実施の形態３７のバイオポリマー調製物。
【0048】
実施の形態３９．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態３６～３８のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0049】
実施の形態４０．バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態３６～３８のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0050】
実施の形態４１．バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）がバイオポリマーである、実施の形態３６～４０のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0051】
実施の形態４２．等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、実施の形態３６～４１のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0052】
実施の形態４３．バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、実施の形態３６～４２のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0053】
実施の形態４４．吸水率が、バイオポリマー調製物の乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態４２又は４３のバイオポリマー調製物。
【0054】
実施の形態４５．固体又は粉末である、実施の形態３６～４４のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0055】
実施の形態４６．バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である、実施の形態３６～４５のいずれか１つのバイオポリマー調製物。
【0056】
実施の形態４７．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成され、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％がピルビル化されている、局所組成物。
【0057】
実施の形態４８．グルコース及びガラクトースがβ－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている、実施の形態４７の局所組成物。
【0058】
実施の形態４９．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成され、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、局所組成物。
【化4】
【0059】
実施の形態５０．バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．４～１：０．６～１である、実施の形態４７～４９のいずれか１つの局所組成物。
【0060】
実施の形態５１．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態４７～５０のいずれか１つの局所組成物。
【0061】
実施の形態５２．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態４７～５１のいずれか１つの局所組成物。
【0062】
実施の形態５３．バイオポリマーが、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、実施の形態４７～５３のいずれか１つの局所組成物。
【0063】
実施の形態５４．バイオポリマーが、バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％の量の水を吸収することができる、実施の形態４７～５３のいずれか１つの局所組成物。
【0064】
実施の形態５５．吸水率が、バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態５３又は５４の局所組成物。
【0065】
実施の形態５６．実施の形態１～１３のいずれか１つのバイオポリマー調製物を含む、実施の形態４７～５５のいずれか１つの局所組成物。
【0066】
実施の形態５７．スクシノグリカンを実質的に含まない、実施の形態４７～５６のいずれか１つの局所組成物。
【0067】
実施の形態５８．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成され、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの１５％未満、１０％未満又は５％未満がピルビル化されている、局所組成物。
【0068】
実施の形態５９．グルコース及びガラクトースがβ－１，３結合及びα－１，３結合によって連結されている、実施の形態５８の局所組成物。
【0069】
実施の形態６０．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成され、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の１５％以下、１０％以下又は５％以下がピルビル化されている、局所組成物。
【化5】
【0070】
実施の形態６１．バイオポリマー中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比が１：１：０．５未満：０．６～１である、実施の形態５８～６０のいずれか１つの局所組成物。
【0071】
実施の形態６２．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態５８～６１のいずれか１つの局所組成物。
【0072】
実施の形態６３．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態５８～６１のいずれか１つの局所組成物。
【0073】
実施の形態６４．バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、実施の形態５８～６３のいずれか１つの局所組成物。
【0074】
実施の形態６５．バイオポリマー調製物が、バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、実施の形態５８～６４のいずれか１つの局所組成物。
【0075】
実施の形態６６．吸水率が、バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態６４又は６５の局所組成物。
【0076】
実施の形態６７．実施の形態１４～２６のいずれか１つのバイオポリマー調製物を含む、実施の形態５８～６６のいずれか１つの局所組成物。
【0077】
実施の形態６８．スクシノグリカンを実質的に含まない、実施の形態５８～６７のいずれか１つの局所組成物。
【0078】
実施の形態６９．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、構造：
（ここで、点線は多糖単位間の結合を表す）の反復多糖単位から構成され、多糖単位の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がアセチル部分を欠き、多糖単位の１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、局所組成物。
【化6】
【0079】
実施の形態７０．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態６９の局所組成物。
【0080】
実施の形態７１．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が１．６ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態６９の局所組成物。
【0081】
実施の形態７２．バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍又は少なくとも１．５倍の水を吸収することができる、実施の形態６９～７１のいずれか１つの局所組成物。
【0082】
実施の形態７３．バイオポリマー調製物が、バイオポリマーの初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％又は少なくとも４００％の量の水を吸収することができる、実施の形態６９～７２のいずれか１つの局所組成物。
【0083】
実施の形態７４．吸水率が、バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態７２又は７３の局所組成物。
【0084】
実施の形態７５．実施の形態２７～３５のいずれか１つのバイオポリマー調製物を含む、実施の形態６９～７４のいずれか１つの局所組成物。
【0085】
実施の形態７６．バイオポリマーを含む局所組成物であって、バイオポリマーが、反復多糖単位から構成され、各多糖単位が２個～１５個又は２個～１２個又は２個～１０個の単糖を含み、バイオポリマーの反復多糖単位中の負電荷：単糖の比率が、少なくとも０．３又は少なくとも０．３５又は少なくとも０．４又は少なくとも０．４５である、局所組成物。
【0086】
実施の形態７７．多糖単位が、少なくとも１つのグルコースに連結された少なくとも１つのガラクトースを含む、実施の形態７６の局所組成物。
【0087】
実施の形態７８．少なくとも１つのガラクトースがβ－１，３グリコシド結合を介してグルコースに連結されている、実施の形態７７の局所組成物。
【0088】
実施の形態７９．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である、実施の形態７６～７８のいずれか１つの局所組成物。
【0089】
実施の形態８０．局所組成物中のバイオポリマーの平均分子量が０．５ｋＤａ～４０ｋＤａである、実施の形態７６～７８のいずれか１つの局所組成物。
【0090】
実施の形態８１．バイオポリマー調製物が、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる、実施の形態７６～８０のいずれか１つの局所組成物。
【0091】
実施の形態８２．バイオポリマー調製物が、バイオポリマーの初期乾燥重量と比べて少なくとも同等、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍又は少なくとも５倍の量の水を吸収することができる、実施の形態７６～８１のいずれか１つの局所組成物。
【0092】
実施の形態８３．吸水率が、バイオポリマーの乾燥サンプルを３０℃の加湿チャンバーに５日間置くことによって測定される、実施の形態８１又は８２の局所組成物。
【0093】
実施の形態８４．実施の形態３６～４６のいずれか１つのバイオポリマー調製物を含む、実施の形態７６～８３のいずれか１つの局所組成物。
【0094】
実施の形態８５．０．０１％～１０％（ｗ／ｗ）又は０．０５％～５％（ｗ／ｗ）のバイオポリマーを含む、実施の形態４７～８４のいずれか１つの局所組成物。
【0095】
実施の形態８６．１つ以上の増粘剤、安定剤、乳化剤、皮膚軟化剤、保湿剤、レオロジー調整剤、皮膜形成剤、酸化防止剤、添加剤、活性剤、バター、精油、浸出油、粘土、泥、抽出物、ヒドロゾル水、角質除去剤、補給剤、ワックス、濃厚剤、塩、ミネラル、酸、塩基、キャリアオイル及び固定油、界面活性剤、防腐剤、パール化剤、品質改良剤、構造化剤、増白剤、湿潤剤、浸透圧調節物質、閉塞剤、洗浄剤、着色剤、顔料、香料、ＵＶ－Ａ遮断薬及びＵＶ－Ｂ遮断薬、及び／又は栄養剤を含む、実施の形態４７～８５のいずれか１つの局所組成物。
【0096】
実施の形態８７．ヒアルロン酸を含む、実施の形態４７～８６のいずれか１つの局所組成物。
【0097】
実施の形態８８．ヒアルロン酸を含まない、実施の形態４７～８６のいずれか１つの局所組成物。
【0098】
実施の形態８９．クリーム、ローション、軟膏、バーム、チンキ、リニメント、シャンプー、石鹸、コンディショナー、日焼け止め、リンス、デオドラント又は化粧品である、実施の形態４７～８８のいずれか１つの局所組成物。
【0099】
実施の形態９０．実施の形態４７～８９のいずれか１つの局所組成物を適用することを含む、被験体における皮膚状態を治療又は予防する方法。
【0100】
実施の形態９１．皮膚状態が乾燥皮膚、しわの多い皮膚、たるんだ皮膚、老化した皮膚、傷のある皮膚、負傷した皮膚、染みのある皮膚、座瘡及び／又は日焼けした皮膚の１つ以上である、実施の形態９０の方法。
【0101】
実施の形態９２．皮膚状態が炎症性皮膚状態である、実施の形態９０の方法。
【0102】
実施の形態９３．炎症性皮膚状態が乾癬、湿疹又はアトピー性皮膚炎である、実施の形態９２の方法。
【0103】
実施の形態９４．局所組成物を被験体の顔、耳、額、首、腕、上胸部、及び／又は手に適用する、実施の形態９０～９３のいずれか１つの方法。
【0104】
実施の形態９５．局所組成物が経表皮水分喪失を減少させ、経表皮水分喪失を逆転させ、表皮水分保持を改善し、しわの出現を軽減し、皮膚のたるみを減少させ、皮膚の滑らかさを増加させ、皮膚の膨潤を増加させ、皮膚の柔軟性を改善し、皮膚のきめを改善し、皮膚の染みを減少させ、及び／又は皮膚の乾燥を減少させる、実施の形態９０～９４のいずれか１つの方法。
【図面の簡単な説明】
【0105】
【図1】多糖バイオポリマーの代表的な反復単位を示す図である。個々の糖残基は、グリコシド結合によって連結されている。多糖ベースのバイオポリマーは、グリコシド結合によって接続された糖残基の主鎖からなる。主鎖は糖残基からなる側鎖を有することもあり、それぞれが異なる化学修飾を有することがある。バイオポリマーの主鎖及び側鎖は、化学修飾とともに反復単位を構成する。反復単位はグリコシド結合によって接続され、より長いポリマーを生成する。
【図2】バイオポリマー構造を示す図である。ガラクトグルカンは、ガラクトース及びグルコースの反復二量体であり、ピルビル修飾及びアセチル修飾を有する。スクシノグリカンは、１つのガラクトース及び７つのグルコース残基の反復八量体であり、ピルビル修飾、アセチル修飾及びスクシニル修飾を有する。グルクロノグリカンは、２つのガラクトース、２つのグルクロン酸及び５つのグルコース残基の反復九量体であり、ピルビル修飾及びアセチル修飾を有する。
【図3】ＨＡと比較した単離バイオポリマー及び混合バイオポリマーの吸水率を示す図である。質量増加によって測定される、水を結合する能力を個々のバイオポリマー及び混合バイオポリマーについて決定した。各バイオポリマーの質量増加をヒアルロン酸（ＨＡ）の質量増加で除算し、水分保持の相対倍率変化を導き出した。
【図4】負電荷と吸水率との間の相関を示す図である。各バイオポリマーの電荷を酸性修飾基又は糖酸のｐＫａに基づいて生理的ｐＨで算出した。次いで、この値を反復単位中の糖残基の数で除算し、各バイオポリマーについての比率を得た。電荷密度を各バイオポリマーの質量増加パーセントに対してプロットした。
【図6】バイオポリマーの細胞毒性を示す図である。細胞毒性試験をＩＳＯ １０９９３－５規格に従って行った。バイオポリマーを１％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＢＳに溶解し、加熱殺菌し、細胞毒性アッセイに使用した。各バイオポリマーについての値を陽性対照及び陰性対照の両方と比較した。
【図7】皮膚保水性測定を示す図である。Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ８２５（Courage + Khazaka）を用いて測定を行った。２人の健康ボランティアが、０．２％（ｗ／ｖ）のガラクトグルカンを含有するローションベース又は対照ベース（等量の水を含有する）のいずれかを身体の２つの異なる部位、すなわち手及び肘に４８時間にわたって塗布した。各参加者について身体の各部位のベースライン測定からの保水性の変化の平均値（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒによって測定される任意単位）を示す。
【図8】ガラクトグルカン処置によるしわの出現の軽減を示す図である。実施例８からの参加者Ｐ１の手の甲の画像。丸印は、しわの出現の軽減が観察され得る部位を強調している。
【図9】経皮浸透性及び皮膚保持性アッセイの結果を示す図である。ｅｘ ｖｉｖｏヒト皮膚組織を介した一方向の透過性を、フランツセルを用いて決定した。５％（ｗ／ｖ）の非ピルビル化ガラクトグルカンのドナー溶液で４時間処理した後の代表的なレセプターチャンバー（透過液）内の炭水化物の量についての結果を示す。フランツセルアッセイの終了後に皮膚サンプルをすすぎ、続いてＰＢＳに浸漬して、皮膚表面に吸収された又は付随する炭水化物を溶出させた。レセプター溶液又は溶出皮膚サンプル中の全炭水化物を、アントロンアッセイを用いて決定した。対照レセプターチャンバー及び皮膚サンプルからのバックグラウンドレベルを減算して、報告値を導き出した。
【発明を実施するための形態】
【0106】
低分子量（ＬＭＷ）であり、非病原性微生物の発酵によって生産される、改善された水分結合特性を有する天然産物バイオポリマーは、多数の異なる理由から魅力的である。第一に、かかるバイオポリマーは、従来のヒアルロン酸よりも生産面のコスト効率が高く、パーソナルケア製品及び化粧品により高濃度で添加し、改善された抗しわ性能及びアンチエイジング性能を達成することができる。第二に、これらのバイオポリマーは、皮膚浸透性及び保水性により性能が改善されるリップバーム、シェービングクリーム、日焼け止め、シャンプー、コンディショナー及び石鹸等の実質的により広範なパーソナルケア製品に添加することができる。第三に、微生物発酵によって生産されるバイオポリマーは、動物由来ＨＡの魅力的な代替品であり、動物使用に関連する社会的及び／又は倫理的問題を軽減する。無害な微生物に由来するバイオポリマーは、病原性微生物とは対照的に、安全な製品を製造するために必要とされる下流の処理工程がより少ない。最後に、ＬＭＷで自然に生産されるバイオポリマーは、性能仕様を達成するために幾つかの付加的な下流の処理工程を必要とする現在のＬＭＷ ＨＡ製造プロセスに比べてかなりの利点を有する。
【0107】
本発明は、土壌細菌の非病原性種によって産生される菌体外多糖をベースとしたバイオポリマーの組成物、並びにその化粧品的及び／又は皮膚科学的若しくは医薬的使用を提供する。高い水結合能及び皮膚保持性／浸透性は、アンチエイジング効果及び抗しわ効果を有するパーソナルケア成分の望ましい特性である。これらの特性を有する、最も広く使用されているポリマーは、ヒアルロン酸であり、動物又は病原性細菌のいずれかに由来する。ヒアルロン酸と比較して実質的に改善された水結合特性を有する単離バイオポリマーが本明細書に提供される。幾つかの実施形態において、単離バイオポリマーは、リゾビウム科細菌に由来する。これらの細菌は、皮膚に浸透する能力を有する低分子量バイオポリマーを自然に産生する。発酵によるこれらのバイオポリマーの製造は、ヒアルロン酸の生産プロセスと比べて非常に有利である。
【0108】
本発明者らは、ＨＡよりも優れた水分保持特性を有するため、広範なパーソナルケア配合物及び化粧品配合物におけるアンチエイジング製品としての使用に理想的な或る特定のバイオポリマーを特定した。第１の分子であるガラクトグルカンは、ピルビル修飾及びアセチル修飾を有するガラクトース及びグルコースの反復二糖である。ガラクトグルカンは、細菌シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）（別名エンシフェル・メリロティ（Ensifer meliloti））に由来し、発酵中に低分子量（ＬＭＷ）で自然に産生される。ガラクトグルカンは、この生物によって自然に産生される２つのバイオポリマーのうちの１つであり、水分結合特性は、もう一方のバイオポリマーであるスクシノグリカンとは独立してガラクトグルカンでのみ観察することができる。本発明者らは、ガラクトグルカンがＨＡの３．５倍超の水分保持能を有することを実証した。ピルビル修飾を欠くガラクトグルカンの変異体は、ＨＡの１．７倍の水分保持能を示す。第２の分子であるグルクロノグリカンは、ピルビル修飾及びアセチル修飾を有するガラクトース、グルクロン酸及びグルコースを含む反復九糖である。グルクロノグリカンは、細菌シノリゾビウム・フレディイ（Sinorhizobium fredi）（別名エンシフェル・フレディイ（Ensifer fredii））に由来し、高分子量及び低分子量の混合物として自然に産生される。本発明者らは、グルクロノグリカンがＨＡの１．７倍の水分保持能を有することを実証した。
【0109】
水分保持性能の増大に加えて、ガラクトグルカン及びグルクロノグリカンは、標準前臨床モデルにおいて非毒性であり、これは化粧品的及び皮膚科学的用途における化合物の適性の前提条件である。幾つかの実施形態において、これらのＬＭＷバイオポリマー画分は、ｉｎ ｖｉｔｒｏフランツセルアッセイにおいて皮膚サンプルに浸透する。パーソナルケア配合物では、幾つかの実施形態において、代表的なローションベースにリゾビウム科由来のバイオポリマーを加えることで、皮膚への保水性の改善がもたらされる。
【0110】
本発明は、パーソナルケア配合物及び化粧品配合物にアンチエイジング成分及び抗しわ成分として使用するための有益な性能特徴である水分保持性、皮膚表面保持性及び／又は浸透性を有する微生物ポリマーを提供する。これらの微生物バイオポリマーは、アンチエイジング特性のために多くのスキンケア製品に使用されている業界標準の有効成分であるヒアルロン酸と比較して実質的に改善された水分保持性を示す。本明細書に記載されるリゾビウム科由来のバイオポリマーは、広範な水性スキンケア配合物への使用に適しており、多くの消費者製品において皮膚保水性の効力の増大をもたらすことができる。さらに、発酵によるＬＭＷバイオポリマーの生産は、下流の処理を殆ど必要とせず、特定の分子量の動物又は微生物由来のＨＡの製造のための既存の技術と比較して経済的に有利な生産方法を提供する。
【0111】
バイオポリマー及びバイオポリマー調製物
土壌中に生息する共生細菌の科であるリゾビウム科は、そのマメ科植物宿主に固定窒素を供給する能力について数十年にわたって研究されてきたが、現在までバイオ産製品、医薬品又は化粧品の生産のための発酵微生物としては十分に活用されていなかった。これらの細菌は、宿主植物との共生及びバイオフィルム形成の両方に関与する水溶性の菌体外多糖、すなわちバイオポリマーを自然に産生する。リゾビウム科が産生する菌体外多糖の多様性から、幾つかの市場に相当な付加価値を与え得る新たな機能性を有する新規のバイオポリマーの幅広さが示唆される。
土壌中に生息する共生細菌の科であるリゾビウム科は、そのマメ科植物宿主に固定窒素を供給する能力について数十年にわたって研究されてきたが、現在までバイオ産製品、医薬品又は化粧品の生産のための発酵微生物としては十分に活用されていなかった。これらの細菌は、宿主植物との共生及びバイオフィルム形成の両方に関与する水溶性の菌体外多糖、すなわちバイオポリマーを自然に産生する。リゾビウム科が産生する菌体外多糖の多様性から、幾つかの市場に相当な付加価値を与え得る新たな機能性を有する新規のバイオポリマーの幅広さが示唆される。
【0112】
スクシノグリカン及びガラクトグルカン
シノリゾビウム（エンシフェル）・メリロティは、２つの酸性菌体外多糖：スクシノグリカン（ＥＰＳ Ｉ）及びガラクトグルカン（ＥＰＳ ＩＩ）を自然に産生する（Barnett 2018）。スクシノグリカンは、Ｓ．メリロティ（S. meliloti）によって産生される主要な菌体外多糖である。スクシノグリカンの反復単位（図２）は、７：１の比率のグルコース及びガラクトースからなり、アセチル修飾、ピルビル修飾及びスクシニル修飾を有する（Reuber 1993）。スクシノグリカンは、Ｓ．メリロティによって高分子量及び低分子量の両方で自然に産生される。スクシノグリカン生合成の一般的機構は、比較的よく理解されており、同様のバイオポリマーを産生する関連生物で共通している可能性が高い。
シノリゾビウム（エンシフェル）・メリロティは、２つの酸性菌体外多糖：スクシノグリカン（ＥＰＳ Ｉ）及びガラクトグルカン（ＥＰＳ ＩＩ）を自然に産生する（Barnett 2018）。スクシノグリカンは、Ｓ．メリロティ（S. meliloti）によって産生される主要な菌体外多糖である。スクシノグリカンの反復単位（図２）は、７：１の比率のグルコース及びガラクトースからなり、アセチル修飾、ピルビル修飾及びスクシニル修飾を有する（Reuber 1993）。スクシノグリカンは、Ｓ．メリロティによって高分子量及び低分子量の両方で自然に産生される。スクシノグリカン生合成の一般的機構は、比較的よく理解されており、同様のバイオポリマーを産生する関連生物で共通している可能性が高い。
【0113】
ガラクトグルカン産生は、系統学的にＳ．メリロティに近い種に限定される。ガラクトグルカンの反復単位（図２）は、１：１の比率のグルコース及びガラクトースからなり、アセチル修飾及びピルビル修飾を有する（Glazebrook 1989）。特定の結合は、β－Ｄ－Ｇｌｃｐ－（１－３）－α－Ｄ－Ｇａｌｐ－（１－３）であり、殆どのＤ－グルコース残基に６－Ｏ－アセチル、全てのＤ－ガラクトースに４，６－Ｏ－ピルビルを有する（Her 1990）。ガラクトグルカンは、Ｓ．メリロティによって低分子量で自然に産生される。スクシノグリカンと比較して、ガラクトグルカンの生合成経路については比較的僅かしか知られていない。
【0114】
グルクロノグリカン
シノリゾビウム（エンシフェル）・フレディイは、５：２：２の比率のグルコース、ガラクトース及びグルクロン酸からなり、アセチル修飾及びピルビル修飾を有する酸性菌体外多糖を自然に産生する（Djordjevic 1986）（図２）。図２に示すバイオポリマーは、ＮＧＲ２３４、ＨＨ１０３（ＡＴＣＣ５１８０９）、及びおそらくはＵＳＤＡ２５７を含む幾つかのＳ．フレディイ（S. fredii）基準株によって産生される（Gray 1991、Pueppke 1999、Rodriguez-Navarro 2014）。構造分析によると、グルクロノグリカンの側鎖上の末端ガラクトースは、４，６－ピルビル化されており、同じ糖残基の２番目、３番目のいずれか又は両方の炭素でアセチル化されている可能性がある。ＨＨ１０３株に由来するグルクロノグリカンには、第３のアセチル基も検出されており、したがって他の株も同様である可能性が高いが、その位置は解明されていない（Staehelin 2006、Rodriguez-Navarro 2014）。これらのＳ．フレディイ種のエキソ領域は２８ｋｂに及び、スクシノグリカン生合成に関与するＳ．メリロティクラスターと高度のシンテニーを有する。その遺伝子の多くは、Ｓ．メリロティのエキソ遺伝子と相同性を有する（Zhan 1990）。グルクロノグリカンは、スクシノグリカンと類似した構造を有するが、グルクロン酸を含み、スクシニル化されていない。グルクロノグリカンの主鎖は、６つの糖残基からなるが、スクシノグリカンの主鎖は、４つの糖残基を含む。グルクロノグリカンは、Ｓ．フレディイ株によって高分子量及び低分子量の両方で産生される（Staehelin 2006）。
シノリゾビウム（エンシフェル）・フレディイは、５：２：２の比率のグルコース、ガラクトース及びグルクロン酸からなり、アセチル修飾及びピルビル修飾を有する酸性菌体外多糖を自然に産生する（Djordjevic 1986）（図２）。図２に示すバイオポリマーは、ＮＧＲ２３４、ＨＨ１０３（ＡＴＣＣ５１８０９）、及びおそらくはＵＳＤＡ２５７を含む幾つかのＳ．フレディイ（S. fredii）基準株によって産生される（Gray 1991、Pueppke 1999、Rodriguez-Navarro 2014）。構造分析によると、グルクロノグリカンの側鎖上の末端ガラクトースは、４，６－ピルビル化されており、同じ糖残基の２番目、３番目のいずれか又は両方の炭素でアセチル化されている可能性がある。ＨＨ１０３株に由来するグルクロノグリカンには、第３のアセチル基も検出されており、したがって他の株も同様である可能性が高いが、その位置は解明されていない（Staehelin 2006、Rodriguez-Navarro 2014）。これらのＳ．フレディイ種のエキソ領域は２８ｋｂに及び、スクシノグリカン生合成に関与するＳ．メリロティクラスターと高度のシンテニーを有する。その遺伝子の多くは、Ｓ．メリロティのエキソ遺伝子と相同性を有する（Zhan 1990）。グルクロノグリカンは、スクシノグリカンと類似した構造を有するが、グルクロン酸を含み、スクシニル化されていない。グルクロノグリカンの主鎖は、６つの糖残基からなるが、スクシノグリカンの主鎖は、４つの糖残基を含む。グルクロノグリカンは、Ｓ．フレディイ株によって高分子量及び低分子量の両方で産生される（Staehelin 2006）。
【0115】
幾つかの実施形態において、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーであって、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％又は少なくとも９９％がピルビル化されている、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、グルコース及びガラクトースは、β－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている。幾つかの実施形態において、構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成されるバイオポリマーであって、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の６０％以下、５５％以下、５０％以下、４５％以下、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、バイオポリマーは、バイオポリマー調製物に含まれる。幾つかのかかる実施形態において、バイオポリマー調製物中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比は、１：１：０．４～１：０．６～１である。幾つかの実施形態において、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満又は１％未満のスクシノグリカンを含むバイオポリマーの調製物が提供される。幾つかの実施形態において、バイオポリマーの調製物は、スクシノグリカンを実質的に含まない。
【化7】
【0116】
幾つかの実施形態において、グルコース及びガラクトースを含む反復二糖単位から構成されるバイオポリマーであって、グルコースの少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％又は少なくとも９０％がアセチル化されており、ガラクトースの１５％未満、１０％未満又は５％未満がピルビル化されている、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、グルコース及びガラクトースは、β－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されている。幾つかの実施形態において、構造：
（ここで、点線は二糖単位間の結合を表す）の反復二糖単位から構成されるバイオポリマーであって、二糖単位の４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下又は５％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の１５％以下、１０％以下又は５％以下がピルビル化されている、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、バイオポリマーは、バイオポリマー調製物に含まれる。幾つかのかかる実施形態において、バイオポリマー調製物中のグルコース：ガラクトース：ピルビル：アセチルのモル比は、１：１：０．５未満：０．６～１である。幾つかの実施形態において、２５％未満、２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、３％未満又は１％未満のスクシノグリカンを含むバイオポリマーの調製物が提供される。幾つかの実施形態において、バイオポリマーの調製物は、スクシノグリカンを実質的に含まない。
【化8】
【0117】
幾つかの実施形態において、バイオポリマーであって、バイオポリマーが構造：
（ここで、点線は多糖単位間の結合を表す）の反復多糖単位から構成され、多糖単位の３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下又は１％以下がアセチル部分を欠き、二糖単位の１０％以下、５％以下又は１％以下がピルビル部分を欠く、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、多糖単位は１つ、２つ又は３つのアセチル基を含む。幾つかの実施形態において、１多糖単位当たりのアセチル基の平均数は１～３である。
【化9】
【0118】
幾つかの実施形態において、バイオポリマーであって、バイオポリマーが反復多糖単位から構成され、各多糖単位が２個～１５個又は２個～１２個又は２個～１０個の単糖を含み、バイオポリマーの反復多糖単位中の負電荷：単糖の比率が、少なくとも０．３又は少なくとも０．３５又は少なくとも０．４又は少なくとも０．４５である、バイオポリマーが提供される。幾つかの実施形態において、多糖単位は、少なくとも１つのグルコースに連結された少なくとも１つのガラクトースを含む。幾つかのかかる実施形態において、少なくとも１つのガラクトースは、β－１，３グリコシド結合を介してグルコースに連結されている。
【0119】
様々な実施形態において、バイオポリマー調製物であって、バイオポリマー調製物の少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％（ｗ／ｗ）が本明細書に提供されるバイオポリマーである、バイオポリマー調製物が提供される。幾つかの実施形態において、バイオポリマー調製物は、固体又は粉末である。幾つかの実施形態において、バイオポリマー調製物の５％未満、４％未満、３％未満、２％未満又は１％未満が水である。
【0120】
様々な実施形態において、バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量は３０００ｋＤａ未満、１０００ｋＤａ未満、３００ｋＤａ未満、１００ｋＤａ未満又は４０ｋＤａ未満である。幾つかの実施形態において、バイオポリマー調製物中のバイオポリマーの平均分子量は、０．５ｋＤａ～４０ｋＤａ又は１．６ｋＤａ～４０ｋＤａである。
【0121】
幾つかの実施形態において、バイオポリマーは、等量のヒアルロン酸と比べて少なくとも同量、少なくとも１．１倍、少なくとも１．２倍、少なくとも１．３倍、少なくとも１．４倍、１．５倍、少なくとも２倍又は少なくとも３倍の水を吸収することができる。幾つかの実施形態において、バイオポリマーは、バイオポリマー調製物の初期乾燥重量の少なくとも１００％、少なくとも２００％、少なくとも３００％、少なくとも４００％又は少なくとも５００％の量の水を吸収することができる。吸水率は、例えばバイオポリマー又はバイオポリマー調製物の乾燥サンプルを、ほぼ一定温度の加湿チャンバーに一定時間にわたって置くことによって測定することができる。幾つかの実施形態において、温度は約２０℃、約２５℃、約３０℃、約３５℃又は約３７℃である。幾つかの実施形態において、一定時間は１日、２日、３日、４日、５日、６日又は１週間である。
【0122】
株の構築
Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイはどちらも遺伝子改変に適しており、株操作の一般的な方法は、相同組換え、抗生物質耐性及びスクロース対抗選択（Quandt 1993）を用いて、ゲノム中の特定の領域を欠失させることである。改変されたゲノム領域を含むプラスミドを構築した後、天然の領域を標的変化に置き換えるために使用することができる。これらの非複製プラスミドを接合伝達によって導入することで、単一組込みを有する株を抗生物質耐性によって選択し、ＰＣＲによって確認することができる。副次的には、スクロースの存在下でグラム陰性細菌に致死的なレバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の存在により、組込みプラスミドを対抗選択することができる。次いで、抗生物質感受性のスクロース耐性株が野生型に組み換えられるか、又は構築したプラスミドに存在していた欠失、挿入若しくは他の改変が組み込まれる。改変株は、ＰＣＲ及びシークエンシングによって確認することができる。
Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイはどちらも遺伝子改変に適しており、株操作の一般的な方法は、相同組換え、抗生物質耐性及びスクロース対抗選択（Quandt 1993）を用いて、ゲノム中の特定の領域を欠失させることである。改変されたゲノム領域を含むプラスミドを構築した後、天然の領域を標的変化に置き換えるために使用することができる。これらの非複製プラスミドを接合伝達によって導入することで、単一組込みを有する株を抗生物質耐性によって選択し、ＰＣＲによって確認することができる。副次的には、スクロースの存在下でグラム陰性細菌に致死的なレバンスクラーゼをコードするｓａｃＢ遺伝子の存在により、組込みプラスミドを対抗選択することができる。次いで、抗生物質感受性のスクロース耐性株が野生型に組み換えられるか、又は構築したプラスミドに存在していた欠失、挿入若しくは他の改変が組み込まれる。改変株は、ＰＣＲ及びシークエンシングによって確認することができる。
【0123】
Ｓ．メリロティの未改変の非馴化株は、スクシノグリカン及びガラクトグルカンの両方を産生し、両方のバイオポリマーの同時生産に適している。Ｒｍ１０２１（ＡＴＣＣ５１１２４）等の或る特定の基準株においては、ガラクトグルカンを産生する能力は、実験室での株馴化のために失われている（Charoenpanich 2015）。馴化株の場合、ガラクトグルカン産生株を構築することができる方法は幾つかある。例としては、無傷のｅｘｐＲ遺伝子の修復、ｍｕｃＲのノックアウト、ＷｇｇＲの過剰発現（Bahlawane 2008）又はリン酸塩制限培地での成長（Mendrygal 2000）が挙げられる。
【0124】
ガラクトグルカンの非存在下でのスクシノグリカンの生産には、基準株Ｒｍ１０２１を使用することができる。幾つかの調節遺伝子を改変して、スクシノグリカンを過剰産生する株を得ることができる。これらの遺伝子としては、ｅｘｏＲ、ｅｘｏＳ、ｃｈｖＩ、ｓｙｒＭ及びｎｏｄＤ３が挙げられる（Barnett 2015）。他にはｓｙｒＡ、ｍｕｃＲ（Keller 1995）及びｅｘｏＸ（Zhan 1990）が挙げられる。Ｓ．メリロティの非馴化株を使用する場合、スクシノグリカンのみを産生する株を作製するためにガラクトグルカン生合成遺伝子をノックアウトする必要がある。ガラクトグルカン生合成に必要とされる遺伝子は、ｐＳｙｍＢの３２ｋｂ領域に含まれ、６つの予測グリコシルトランスフェラーゼと、ｄＴＤＰ－グルコース及びｄＴＤＰ－ラムノースの合成に必要なタンパク質をコードすると予測される４つの遺伝子とが含まれる（Becker 1997）。ガラクトグルカンの産生を排除するために、ｗｇａＢ又はｗｇｅＢ等の幾つかのグリコシルトランスフェラーゼのいずれかを切除することができる。
【0125】
スクシノグリカンの非存在下でガラクトグルカンを生産するために、スクシノグリカン生合成遺伝子に突然変異を有するＳ．メリロティの野生型株を、ｐＪＱ２００ＳＫを用いて作製することができる。さらに、上記の方法のいずれかによってガラクトグルカンを産生する能力を回復させた馴化株を使用してもよい。スクシノグリカンに特異的な生合成クラスターは、ｐＳｙｍＢ上の２２ｋｂ領域に位置する。このクラスターの遺伝子の幾つかに構造的及び調節的役割が割り当てられている（Reuber 1993）。スクシノグリカン生合成を排除するために、ｅｘｏＡ、ｅｘｏＦ、ｅｘｏＬ、ｅｘｏＭ、ｅｘｏＰ、ｅｘｏＱ、ｅｘｏＴ又はｅｘｏＹ等の幾つかの遺伝子のいずれかを遺伝学的に切除することができる。
【0126】
グルクロノグリカンは、野生型Ｓ．フレディイの主要産物であり、このバイオポリマーの生産に株の改変は必要とされない。上述の株のいずれかを物質の生産及び更なる分析に使用することができる。
【0127】
バイオポリマーを作製する方法
バイオポリマーの生産には、幾つかの異なる液体成長培地を使用することができる。Ｓ．メリロティ株は、ＬＢ培地又はＴＹ培地でよく成長し、産物の産生を増進するために、これらにグルコース、スクロース又はコハク酸塩等の付加的な炭素源を添加してもよい。Ｓ．フレディイは、ＴＹ培地で成長させることができ、付加的な炭素源の添加は産生に有益である。Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイはどちらも、Ｍ９又はＭＯＰＳ－マンニトール等の規定の最小培地で成長させることができ、より高い収量を得ることができる。最小培地により、リン酸塩濃濃度、ｐＨ、微量栄養素、硫酸塩濃度及び炭素源等の発酵変数の正確な制御が可能となる。
バイオポリマーの生産には、幾つかの異なる液体成長培地を使用することができる。Ｓ．メリロティ株は、ＬＢ培地又はＴＹ培地でよく成長し、産物の産生を増進するために、これらにグルコース、スクロース又はコハク酸塩等の付加的な炭素源を添加してもよい。Ｓ．フレディイは、ＴＹ培地で成長させることができ、付加的な炭素源の添加は産生に有益である。Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイはどちらも、Ｍ９又はＭＯＰＳ－マンニトール等の規定の最小培地で成長させることができ、より高い収量を得ることができる。最小培地により、リン酸塩濃濃度、ｐＨ、微量栄養素、硫酸塩濃度及び炭素源等の発酵変数の正確な制御が可能となる。
【0128】
発酵後のバイオポリマーを精製するためにアルコール沈殿を用いてもよい。通例、細胞は遠心分離又は濾過によって発酵ブロスから除去される。発酵ブロスの高い粘度により、細胞分離手順を補助するために１容量～２容量の水の添加を要する場合がある。残留細胞又は細胞残屑を更に除去するために、無細胞上清をプロテアーゼとともにインキュベートしてもよい。バイオポリマーを沈殿させるために、１ｍＭ前後の濃度範囲のイソプロパノール又はエタノール、更にはＫＣｌ又はＣａＣｌ２等の一価又は二価カチオンを、通例は培養液量の１倍～２倍で無細胞上清に添加してもよい。バイオポリマーは混合により沈殿し、遠心分離又は濾過によって単離することができる。この時点で、塩濃度を低下させるか、又はポリマーとともに沈殿した可能性がある任意の細胞残屑を低減するために更なる精製工程を行ってもよい。これらの工程としては、所望の最終用途に適した付加的なアルコール洗浄、プロテアーゼ処理、再水和、遠心分離、透析、溶媒洗浄、凍結乾燥等を挙げることができる。精製した生成物を質量が安定するまで（全ての非結合水が蒸発するまで）炉内で乾燥させることができる。乾燥させた生成物を粉砕、摩砕又は他の形で処理して、最終的な精製バイオポリマーを生成することができる。
【0129】
局所組成物
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、皮膚の老化に重要な役割を果たし、ＨＡ添加を多くのパーソナルケアローション及びクリームに見ることができる。或る特定の一般的な配合物においては、ＨＭＷ ＨＡが皮膚の表面上に留まり、空気から水を吸収することによって保水することから使用される。他の配合物においては、ＬＭＷ ＨＡが皮膚に浸透し、アンチエイジング効果又は抗しわ効果をもたらし得ることから使用される。皮膚浸透性がポリマーの長さに直接関連することが示されている（Essendoubi 2016、Witting 2015）。表皮の下層への浸透性、水の結合及び皮膚の膨潤が、しわの出現の軽減に寄与する。したがって、これらの性能を有する分子は、老化の出現を軽減するスキンケア配合物に強く求められている。
ヒアルロン酸（ＨＡ）は、皮膚の老化に重要な役割を果たし、ＨＡ添加を多くのパーソナルケアローション及びクリームに見ることができる。或る特定の一般的な配合物においては、ＨＭＷ ＨＡが皮膚の表面上に留まり、空気から水を吸収することによって保水することから使用される。他の配合物においては、ＬＭＷ ＨＡが皮膚に浸透し、アンチエイジング効果又は抗しわ効果をもたらし得ることから使用される。皮膚浸透性がポリマーの長さに直接関連することが示されている（Essendoubi 2016、Witting 2015）。表皮の下層への浸透性、水の結合及び皮膚の膨潤が、しわの出現の軽減に寄与する。したがって、これらの性能を有する分子は、老化の出現を軽減するスキンケア配合物に強く求められている。
【0130】
機能性成分は通例、パーソナルケア製品に２％（ｗ／ｖ）以下の濃度で含まれる。より高濃度であれば、皮膚外観の改善により効果的であり得るが、原料コストのために２％を超えるレベルで成分を加えることができない可能性が高い。高いコストのために、一般的に使用されるパーソナルケア製品により広範に使用することができない可能性もある。これらの制限にもかかわらず、皮膚充填剤及び局所アンチエイジングパーソナルケア配合物においてＨＡの性能及び効力に競合し得る代替製品は殆どない。皮膚充填剤の代替品としては、生体鉱物のヒドロキシルアパタイト等の製品又はポリメチルメタクリレート等の石油由来の製品が挙げられる。生物学的代替品としては、ＨＡと組み合わせて使用されることが多いアガロース、非炭水化物ベースのポリグルタミン酸（ＰＧＡ）、又はタマリンド種子抽出物に由来するポリマーが挙げられる。
【0131】
局所的に適用される製品の例としては、クリーム、ローション、セラム、軟膏、バーム（リップバーム等）、チンキ、リニメント、シャンプー、石鹸、コンディショナー、日焼け止め、リンス、化粧品、デオドラント又は皮膚に直接使用される任意の他の治療剤等の任意の水溶液、アルコール又は水中油型エマルションが挙げられる。本明細書に提供される局所組成物は、概ね流体であってもよく、膏薬、エマルション、クリーム、乳液、軟膏、含浸パッド、合成洗剤、溶液、セラム、ゲル、スプレー若しくはエアロゾル、フォーム、懸濁液、ローション、又はスティックの形態であってもよい。
【0132】
様々な実施形態において、本明細書に提供される少なくとも１つのバイオポリマーを含む局所組成物が提供される。幾つかの実施形態において、局所組成物は、本明細書に提供されるバイオポリマーの１つ、２つ又は３つを含む。幾つかの実施形態において、組成物は０．０１％～３０％、１％～３０％、０．０１％～２０％、１％～２０％、０．０１％～１０％又は０．０５％～５％（ｗ／ｖ）の本明細書に提供されるバイオポリマーを含む。幾つかの実施形態において、局所組成物は、本明細書に提供される少なくとも１つのバイオポリマーとヒアルロン酸とを含む。幾つかのかかる実施形態において、ヒアルロン酸は０．０１％～５％、０．０１％～３％、０．０１％～２％、０．０１％～１％、０．１％～２％又は０．１％～１％（ｗ／ｖ）の濃度で存在する。
【0133】
様々な実施形態において、本明細書に提供される局所組成物は、１つ以上の薬学的及び／又は美容的に許容可能な増粘剤、安定剤、乳化剤、皮膚軟化剤、保湿剤、レオロジー調整剤、皮膜形成剤、酸化防止剤、添加剤、活性剤、バター、精油、浸出油、粘土、泥、抽出物、ヒドロゾル水、角質除去剤、補給剤、ワックス、濃厚剤、塩、ミネラル、酸、塩基、キャリアオイル及び固定油、界面活性剤、防腐剤、パール化剤、品質改良剤、構造化剤、増白剤、湿潤剤、浸透圧調節物質、閉塞剤、洗浄剤、着色剤、顔料、香料、ＵＶ－Ａ遮断薬及びＵＶ－Ｂ遮断薬、及び／又は栄養剤を含む。当業者であれば、所望の用途に基づいて局所組成物に適した成分を選択することができる。好適な成分の多くのリスト及び説明が当該技術分野で利用可能であり、例えばcir-safety.org及び／又はwww.fda.gov/cosmetics/cosmetic-products-ingredientsが挙げられる。非限定的な粘度及び／又はレオロジー調整剤の例としては、ポリアクリレート、その誘導体及びコポリマー、ポリソルベート及び誘導体、ミリステート、ポリクオタニウム、セルロース及び誘導体、セテアリルアルコール、カルボマー、キサンタンガム、ダイユータンガム、カプリン酸グリセリド、加工糖、他の多糖ポリマー、パラフィン、ポリエチレングリコール、グリセロール、プロパンジオール、オレイン酸誘導体、並びにヒアルロン酸が挙げられる。非限定的な保湿剤の例としては、ヒアルロン酸、メチルグルコースエーテル、エチル化メチルグルコース、グリセロール、ポリエチレングリコール、グリコール誘導体、コラーゲン、尿素、ソルビトール、アラントイン及びαヒドロキシ酸が挙げられる。非限定的な皮膚軟化剤の例としては、鉱油、ラノリン、シアバター、ココアバター、ヤシ油、蜜蝋、ヒマワリ油、他の植物油、植物性及び動物性脂肪、ワセリン、並びにスクアレンが挙げられる。局所組成物の付加的な成分としては、シリコーン誘導体（滑沢剤）、トコフェロール（ビタミンＥ）、パラベン（防腐剤）、ステアリン酸及びオレイン酸、ラウリル硫酸ナトリウム（界面活性剤）、ケラチン、エラスチン（タンパク質）、アミノ酸及びペプチド、並びにベントナイト粘土が挙げられるが、これらに限定されない。
【0134】
局所組成物の使用
皮膚は熱、感染、毒性物質への曝露、及び水分喪失等の外的課題に対するヒト身体の防御の第一線である。表皮の最外層は、角質層と呼ばれ、保水しない積み重なった非生存細胞から構成される。角質層の主要機能は、過剰な経表皮水分喪失を防ぐことによって皮膚の恒常性を維持することである。角質層の下に残りの表皮があり、ケラチノサイト及びメラノサイト等の様々なタイプの代謝活性細胞から構成される。表皮の下には真皮及び皮下組織があり、血管、神経細胞及びアポクリン腺を含む（Abd 2016）。
皮膚は熱、感染、毒性物質への曝露、及び水分喪失等の外的課題に対するヒト身体の防御の第一線である。表皮の最外層は、角質層と呼ばれ、保水しない積み重なった非生存細胞から構成される。角質層の主要機能は、過剰な経表皮水分喪失を防ぐことによって皮膚の恒常性を維持することである。角質層の下に残りの表皮があり、ケラチノサイト及びメラノサイト等の様々なタイプの代謝活性細胞から構成される。表皮の下には真皮及び皮下組織があり、血管、神経細胞及びアポクリン腺を含む（Abd 2016）。
【0135】
角質層が水分喪失に対する一次障壁であるが、表皮の代謝活性層におけるＨＡの存在が、皮膚の全体的な保水レベルにおいて最も重要な因子であることが示されている。加齢又は老化した皮膚は、ポリマーの長さの減少及び表皮中のポリマーの全体的な喪失の両方を特徴とする（Papakonstantinou 2012）。角質層の障壁を通過し、表皮に浸透することができる水分保持ポリマーは、上述の皮膚老化の影響を潜在的に相殺する可能性がある。クリーム、ローション、セラム又は他の局所組成物を皮膚に適用することで、ポリマーが表皮のより深層に浸透し、皮膚に保持される水分量が全体的に増加し得る。これにより皮膚が膨潤し、しわの出現が全体的に軽減され得る。水分保持ポリマーは、他の有効成分の乾燥作用に対抗するか、又は更なる保湿及び／又は消費者への価値を与える配合物を作り出すために、更なる保水性が有用である多数の他のパーソナルケア製品にも使用され得る。
【0136】
幾つかの実施形態において、本明細書に提供されるバイオポリマーを含む局所組成物を適用することを含む、皮膚状態を治療又は予防する方法が提供される。幾つかの実施形態において、皮膚状態は乾燥皮膚、しわの多い皮膚、たるんだ皮膚、老化した皮膚、傷のある皮膚、負傷した皮膚、染みのある皮膚、座瘡及び／又は日焼けした皮膚の１つ以上である。幾つかの実施形態において、皮膚状態は乾癬、湿疹又はアトピー性皮膚炎等の炎症性皮膚状態である。幾つかの実施形態において、皮膚状態は創傷皮膚である。幾つかの実施形態において、局所組成物は、被験体の顔、耳、額、首、腕、上胸部、脚、足及び／又は手に適用される。
【0137】
様々な実施形態において、局所組成物の適用は、経表皮水分喪失を減少させ、経表皮水分喪失を逆転させ、表皮水分保持を改善し、しわの出現を軽減し、皮膚のたるみを減少させ、皮膚の滑らかさを増加させ、皮膚の膨潤を増加させ、皮膚の柔軟性を改善し、皮膚のきめを改善し、皮膚の染みを減少させ、及び／又は皮膚の乾燥を減少させる。幾つかの実施形態において、改善は、局所組成物の最初の適用の直前である第１の時点と比較して第２の時点で決定される。幾つかの実施形態において、局所組成物は１日３回、１日２回、１日１回、２日に１回、３日に１回又は１週間に１回適用される。幾つかの実施形態において、局所組成物は１週間、２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年又はそれ以上にわたって適用される。幾つかの実施形態において、改善は２週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月若しくは１年、又はそれ以上にわたって局所組成物を使用した後に明らかになる。
【実施例】
【0138】
実施例１．Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイによって産生される天然バイオポリマー
選択リゾビウム科株が産生する自然発生バイオポリマーを図２に示す。ＥＰＳＩとも称されるスクシノグリカンは、シノリゾビウム・メリロティによって産生される。反復単位は、１つのガラクトース及び３つのグルコース単糖の線状主鎖と、４つのグルコース分子の側鎖とからなる。主鎖糖は、β－１，３グリコシド結合及びβ－１，４グリコシド結合によって連結されている。側鎖糖は、β－１，３グリコシド結合及びβ－１，６グリコシド結合によって連結されている。スクシノグリカンは、主鎖のグルコース３でアセチル化され、側鎖のグルコース３でスクシニル化され、側鎖の末端グルコースでピルビル化されている（Reuber 1993）。ＥＰＳＩＩとも称されるガラクトグルカンも、Ｓ．メリロティによって産生される。ガラクトグルカンは、β－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されたガラクトース及びグルコースの線状の反復二量体である（Glazebrook 1989）。ガラクトース残基は完全にピルビル化されており、グルコース単位のおよそ７０％がアセチル化されている（Her 1990）。グルクロノグリカンは、シノリゾビウム・フレディイによって産生される。グルクロノグリカンは、β－１，３グリコシド結合、β－１，４グリコシド結合及びβ－１，６グリコシド結合によって連結された１つのガラクトース及び５つのグルコース単糖から構成される主鎖と、α－１，３グリコシド結合、α－１，４グリコシド結合及びβ－１，４グリコシド結合によって連結された２つのグルクロン酸及び末端ガラクトースの側鎖とからなる。側鎖上の末端ガラクトースは、アセチル化され（炭素２及び／又は炭素３で）、かつ４，６－ピルビル化されている（Djordjevic 1986）。グルクロノグリカンは、第３の未知の位置でアセチル化されることがある（Rodriquez-Navarro 2014）。
選択リゾビウム科株が産生する自然発生バイオポリマーを図２に示す。ＥＰＳＩとも称されるスクシノグリカンは、シノリゾビウム・メリロティによって産生される。反復単位は、１つのガラクトース及び３つのグルコース単糖の線状主鎖と、４つのグルコース分子の側鎖とからなる。主鎖糖は、β－１，３グリコシド結合及びβ－１，４グリコシド結合によって連結されている。側鎖糖は、β－１，３グリコシド結合及びβ－１，６グリコシド結合によって連結されている。スクシノグリカンは、主鎖のグルコース３でアセチル化され、側鎖のグルコース３でスクシニル化され、側鎖の末端グルコースでピルビル化されている（Reuber 1993）。ＥＰＳＩＩとも称されるガラクトグルカンも、Ｓ．メリロティによって産生される。ガラクトグルカンは、β－１，３グリコシド結合及びα－１，３グリコシド結合によって連結されたガラクトース及びグルコースの線状の反復二量体である（Glazebrook 1989）。ガラクトース残基は完全にピルビル化されており、グルコース単位のおよそ７０％がアセチル化されている（Her 1990）。グルクロノグリカンは、シノリゾビウム・フレディイによって産生される。グルクロノグリカンは、β－１，３グリコシド結合、β－１，４グリコシド結合及びβ－１，６グリコシド結合によって連結された１つのガラクトース及び５つのグルコース単糖から構成される主鎖と、α－１，３グリコシド結合、α－１，４グリコシド結合及びβ－１，４グリコシド結合によって連結された２つのグルクロン酸及び末端ガラクトースの側鎖とからなる。側鎖上の末端ガラクトースは、アセチル化され（炭素２及び／又は炭素３で）、かつ４，６－ピルビル化されている（Djordjevic 1986）。グルクロノグリカンは、第３の未知の位置でアセチル化されることがある（Rodriquez-Navarro 2014）。
【0139】
実施例２．株の構築
選択されたＯＲＦの標的欠失、挿入要素の切除又はＳＮＰの修正のために、ポジティブ選択マーカー及びネガティブ選択マーカーを有する非複製プラスミドベクターを使用した。Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイは、どちらも標準的な分子生物学及び株操作の手法を用いた遺伝子改変に適しているため、この方法により、それらのゲノムを迅速かつ正確に変化させ、所望の遺伝子型を作り出すことが可能である。初めに、欠失カセットを有するｐＪＱ２００ＳＫプラスミド（Quandt 1993）の誘導体を作製した。欠失カセットについては、開始コドン及び終止コドンを含む標的ＯＲＦの上流及び下流の領域（通常は５００ｂｐ）をＰＣＲによって増幅した。野生型ＤＮＡの導入については、挿入要素の上流及び下流の領域をＰＣＲによって増幅した。次に、ＣＰＥＣ法（Quan 2009）を用いてプラスミドを組み立て、Ｓ．メリロティへの導入前に配列を検証した。プラスミドを三親交雑によってＳ．メリロティに導入し、相同ゲノム領域に単一組込みを含む株を抗生物質耐性について選択し、増幅領域外のプライマーを用いたＰＣＲによって検証した。次いで、プラスミドの組込みについて陽性の株を画線培養して精製し、スクロース上で成長する能力について選択した。組み込まれたｐＪＱ２００プラスミド上のｓａｃＢ遺伝子の存在は、株をスクロース上で成長させた場合に致死を引き起こす。したがって、スクロース上で増殖する株は、ｓａｃＢ自体に突然変異を有するか、又は組み換えられて組込みプラスミドが「ループアウト」し、野生型に戻るか、又はプラスミド中に元々存在していた欠失若しくは改変された配列を有することになる。
選択されたＯＲＦの標的欠失、挿入要素の切除又はＳＮＰの修正のために、ポジティブ選択マーカー及びネガティブ選択マーカーを有する非複製プラスミドベクターを使用した。Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイは、どちらも標準的な分子生物学及び株操作の手法を用いた遺伝子改変に適しているため、この方法により、それらのゲノムを迅速かつ正確に変化させ、所望の遺伝子型を作り出すことが可能である。初めに、欠失カセットを有するｐＪＱ２００ＳＫプラスミド（Quandt 1993）の誘導体を作製した。欠失カセットについては、開始コドン及び終止コドンを含む標的ＯＲＦの上流及び下流の領域（通常は５００ｂｐ）をＰＣＲによって増幅した。野生型ＤＮＡの導入については、挿入要素の上流及び下流の領域をＰＣＲによって増幅した。次に、ＣＰＥＣ法（Quan 2009）を用いてプラスミドを組み立て、Ｓ．メリロティへの導入前に配列を検証した。プラスミドを三親交雑によってＳ．メリロティに導入し、相同ゲノム領域に単一組込みを含む株を抗生物質耐性について選択し、増幅領域外のプライマーを用いたＰＣＲによって検証した。次いで、プラスミドの組込みについて陽性の株を画線培養して精製し、スクロース上で成長する能力について選択した。組み込まれたｐＪＱ２００プラスミド上のｓａｃＢ遺伝子の存在は、株をスクロース上で成長させた場合に致死を引き起こす。したがって、スクロース上で増殖する株は、ｓａｃＢ自体に突然変異を有するか、又は組み換えられて組込みプラスミドが「ループアウト」し、野生型に戻るか、又はプラスミド中に元々存在していた欠失若しくは改変された配列を有することになる。
【0140】
Ｒｍ１０２１株等のＳ．メリロティの馴化株は、ガラクトグルカンを産生する能力を失っており（Pellock 2002）、この機能を回復させるために導入することができる遺伝子改変が幾つかある。これらの改変としては、ｍｕｃＲ遺伝子の欠失、野生型対立遺伝子ｅｘｐＲ１０１のｅｘｐＲ遺伝子座への復元（Gonzalez 1996）、又は野生型ｅｘｐＲ ＯＲＦ及びプロモーターの導入（Charoenpanich 2015）が挙げられる。これらの変化は全て、スクシノグリカンに加えてガラクトグルカンを産生するＲｍ１０２１由来株をもたらす。本研究では、上記の方法を用いて野生型ｅｘｐＲをＲｍ１０２１株に導入した。これにより、Ｓ．メリロティの両方のバイオポリマーを同時に産生するＥＸＯ３株が得られた。
【0141】
ＥＸＯ３株を用いて、いずれかの菌体外多糖の生合成に関与することが知られているＯＲＦを欠失させることにより、スクシノグリカン又はガラクトグルカンのいずれかを単独で産生する誘導株を作製した。例えば、スクシノグリカンを産生する株は、ガラクトグルカンの合成に関与するｗｇａＢ又はｗｇｅＢを含む幾つかのグリコシルトランスフェラーゼのいずれかの欠失によって作製することができる（Becker 1997）。ガラクトグルカンを産生する株は、スクシノグリカン生合成の初期段階に関与するｅｘｏＦ、ｅｘｏＡ又はｅｘｏＹ（Gonzalez 1996、Glazebrook 1989）等の幾つかのグリコシルトランスフェラーゼのいずれかの欠失によって作製することができる。上記の手法を用いて、ｗｇｅＢ ＯＲＦを欠失させ、スクシノグリカンのみを産生することが可能なＥＸＯ３誘導体を作製した。ガラクトグルカン産生株を作製するために、ＥＸＯ３においてｅｘｏＹ ＯＲＦを欠失させた。これらの株であるＥＸＯ１及びＥＸＯ２（表１）を、その後のスクシノグリカン又はガラクトグルカンの生産にそれぞれ使用した。
【0142】
上記の標的欠失方法を用いて、化学修飾を欠くような変異体バイオポリマーを産生する株を作製することができる。例えば、スクシノグリカンのスクシニル化及びアセチル化に関与する遺伝子であるｅｘｏＨ及びｅｘｏＺをＳ．メリロティのゲノムから欠失させてもよい。修飾型のガラクトグルカンを生成するために、ピルビル化に関与する遺伝子であるｗｇａＥをＳ．メリロティから切除した。
【0143】
【表1】
【0144】
実施例３．バイオポリマーの生産及び精製
ベンチスケールでの成長及びバイオポリマー生産については、振盪フラスコでのバッチ培養を用いた。産生株を培養プレートからＴＹ培地に接種し、３０℃の振盪インキュベーター内で一晩成長させた。翌日、一晩培養物を、通例は１：１００又は１：２００の比率で産生培地へと希釈した。産生培地は、２％～４％（ｗ／ｖ）の濃度のグルコース又はスクロースのいずれかの炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源、中性ｐＨを維持するためのバッファー、ＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２等の二価カチオン、微量元素、並びにビタミンを含有するＭ９等の規定の最小培地からなるものであった（米国特許第７３７１５５８号）。株を産生培地中で最大３日間成長させた後、精製のために採取した。
ベンチスケールでの成長及びバイオポリマー生産については、振盪フラスコでのバッチ培養を用いた。産生株を培養プレートからＴＹ培地に接種し、３０℃の振盪インキュベーター内で一晩成長させた。翌日、一晩培養物を、通例は１：１００又は１：２００の比率で産生培地へと希釈した。産生培地は、２％～４％（ｗ／ｖ）の濃度のグルコース又はスクロースのいずれかの炭素源、硫酸アンモニウム等の窒素源、中性ｐＨを維持するためのバッファー、ＭｇＳＯ４及びＣａＣｌ２等の二価カチオン、微量元素、並びにビタミンを含有するＭ９等の規定の最小培地からなるものであった（米国特許第７３７１５５８号）。株を産生培地中で最大３日間成長させた後、精製のために採取した。
【0145】
バイオポリマーの回収及び精製は、初期細胞分離後のアルコール沈殿によって行った。高分子量ポリマーについては、培養物を２容量又は３容量のいずれかの水で希釈し、上清を遠心分離によって細胞から分離した。低分子量バイオポリマーについては、細胞分離前に培養ブロスを希釈する必要はなかった。次いで、およそ１ｍＭのＣａＣｌ２を上清に添加し、２容量のイソプロピルアルコールの添加によってバイオポリマーを室温で沈殿させた。沈殿物を遠心分離によって単離した後、７０％又は９０％のいずれかのエチルアルコールで洗浄した。洗浄工程後に、沈殿物を低速遠心分離によって再び単離し、残留水がないことを示す重量減少の安定まで６０℃の炉内で一晩乾燥させた。次いで、乳鉢及び乳棒を用いるか、又はベンチスケールミルを用いて最終生成物を粉砕した。
【0146】
実施例４．バイオポリマーの特性評価
バイオポリマーを分析法によって特性評価する。場合によっては、ＮＭＲ分光法を用いて、組成、配列分布、置換パターン及び分子量についての構造情報を決定することができる。バイオポリマーを溶液ＮＭＲ又は固体ＮＭＲによってアッセイしてもよい。多糖の溶液ＮＭＲでは、物質の高い粘度のために、サンプルを酵素消化又は前処理に供することがある（Her et al. 1990）。１３Ｃ交差分極マジック角回転（ＣＰＭＡＳ）ＮＭＲ（Schaefer 1976）等の固体法を用いて、サンプルを前処理なしにアッセイすることができる。より詳細な構造分析及び／又は定量化は、例えばYao 2021に記載されているような２Ｄ ＮＭＲによって評定することができる。当業者は、各分析法が明白な利点及び不利点を有することを理解し、バイオポリマーの構造、修飾の程度、及び／又は純度レベルに関する所望の情報を生成するために適切な分析法を選択することができる。これらの方法を用いて、多糖鎖中の糖の修飾の程度を定量化することができる。例えば、アセチル化、ピルビル化、スクシニル化又は他の修飾化学基のレベルをバイオポリマーのサンプルについて決定することができる。
バイオポリマーを分析法によって特性評価する。場合によっては、ＮＭＲ分光法を用いて、組成、配列分布、置換パターン及び分子量についての構造情報を決定することができる。バイオポリマーを溶液ＮＭＲ又は固体ＮＭＲによってアッセイしてもよい。多糖の溶液ＮＭＲでは、物質の高い粘度のために、サンプルを酵素消化又は前処理に供することがある（Her et al. 1990）。１３Ｃ交差分極マジック角回転（ＣＰＭＡＳ）ＮＭＲ（Schaefer 1976）等の固体法を用いて、サンプルを前処理なしにアッセイすることができる。より詳細な構造分析及び／又は定量化は、例えばYao 2021に記載されているような２Ｄ ＮＭＲによって評定することができる。当業者は、各分析法が明白な利点及び不利点を有することを理解し、バイオポリマーの構造、修飾の程度、及び／又は純度レベルに関する所望の情報を生成するために適切な分析法を選択することができる。これらの方法を用いて、多糖鎖中の糖の修飾の程度を定量化することができる。例えば、アセチル化、ピルビル化、スクシニル化又は他の修飾化学基のレベルをバイオポリマーのサンプルについて決定することができる。
【0147】
実施例５．吸水率
バイオポリマーの水結合能を決定するために、サンプルを密閉加湿チャンバーに５日間入れ、質量増加をヒアルロン酸と比較して測定した。バイオポリマーを実施例３の手順に従って精製した。吸水実験を行う前に、バイオポリマーサンプルを６０℃で３０分間乾燥させ、残留水が全て蒸発することを確実にした。次いで、少量（通例２５ｍｇ～５０ｍｇ）を秤量し（値ｍ０）、個々の風袋計量済プラスチック又はアルミニウムトレイに入れた。全てのサンプルを２５０ｍｌの温水（およそ３５℃）の入った密閉プラスチックチャンバー内の台上に置いた。次いで、全てのサンプルを入れたチャンバー全体を３０℃のインキュベーターに入れた。５日後に、加湿チャンバーを開け、個々のサンプルを秤量し（値ｍ）、質量増加を算出した。各サンプルの水結合能（ＷＢＣ）を以下の式：（ｍ－ｍ０）／ｍ０に従って算出した。この生の値は膨潤の程度を表し、１００を乗算することによって質量増加パーセントとして表すことができる。
バイオポリマーの水結合能を決定するために、サンプルを密閉加湿チャンバーに５日間入れ、質量増加をヒアルロン酸と比較して測定した。バイオポリマーを実施例３の手順に従って精製した。吸水実験を行う前に、バイオポリマーサンプルを６０℃で３０分間乾燥させ、残留水が全て蒸発することを確実にした。次いで、少量（通例２５ｍｇ～５０ｍｇ）を秤量し（値ｍ０）、個々の風袋計量済プラスチック又はアルミニウムトレイに入れた。全てのサンプルを２５０ｍｌの温水（およそ３５℃）の入った密閉プラスチックチャンバー内の台上に置いた。次いで、全てのサンプルを入れたチャンバー全体を３０℃のインキュベーターに入れた。５日後に、加湿チャンバーを開け、個々のサンプルを秤量し（値ｍ）、質量増加を算出した。各サンプルの水結合能（ＷＢＣ）を以下の式：（ｍ－ｍ０）／ｍ０に従って算出した。この生の値は膨潤の程度を表し、１００を乗算することによって質量増加パーセントとして表すことができる。
【0148】
ヒアルロン酸の純粋な５ｋＤａ調製物（HAworks）を水結合実験の対照として使用した。上記のように測定したヒアルロン酸のＷＢＣは、通例２００％～３００％であった。より高分子量のＨＡ（１００ｋＤａ、HAworks及び１０００ｋＤａ超、Acros Organics）を試験したところ、低分子量サンプルと同様の吸水能が示された。実験サンプルの倍率変化を算出するために、バイオポリマーの質量増加についてのＷＢＣ値を実験内のＨＡについてのＷＢＣ値に対して正規化した。
【0149】
図３は、単離ガラクトグルカンのＷＢＣがＨＡと比較して３．５倍も増加していることを示す。このＷＢＣ値は、複数の実験にわたって再現可能であった。生の質量増加パーセントは、ガラクトグルカンについては６５０％であり、ＨＡについて測定された１８５％の増加よりも相当高かった。加湿チャンバー内での更なるインキュベーション後に、ガラクトグルカンの質量増加は、その初期質量の７２０％にまで達した。ガラクトグルカンがグルコース、スクロース及びコーンシロップを含む複数の炭素源に由来する場合も結果は同様であった。Ｓ．フレディイから単離されたグルクロノグリカンは、ＨＡと比べて１．７倍の水結合性の増加を示した。グルクロノグリカンについての質量増加パーセントの生の値は、３１１％であった。単離スクシノグリカンは、ガラクトグルカン及びグルクロノグリカンとは対照的に、ＨＡと比較して水結合性の減少を示し（０．７倍への減少又は１２９％の生の質量増加）、スクシノグリカン及びガラクトグルカンの混合物は、更に減少した（０．３倍への減少又は６０％の生の質量増加）。ガラクトグルカンの場合、ＷＢＣの改善は、ガラクトグルカンを独立して精製した場合にのみ観察され、Ｓ．メリロティに由来するガラクトグルカン及びスクシノグリカンの両方の自然発生混合物としては観察されなかった。
【0150】
単糖のタイプ及び含有量、化学修飾、グリコシド結合、並びに分子量は全て、バイオポリマーの挙動に影響を及ぼす可能性があるが、これらのリゾビウム科の種に由来するバイオポリマーについては、負電荷の程度がＷＢＣにおける支配的な因子であるようである。図４は、Ｓ．メリロティ及びＳ．フレディイのバイオポリマーについて、負電荷と水結合性能との間に相関があることを示す。ｘ軸の値については、各反復単位の負電荷を生理的ｐＨでの化学基又は糖酸のｐＫａに基づいて算出した。例えば、グルクロノグリカンの２つのグルクロン酸及びピルベート修飾は、それぞれ中性ｐＨで１つの負電荷をもたらすため、反復単位中の全糖に対する負電荷の比率は１：３、すなわち０．３３となる。ガラクトグルカンでは、この比率は１：２、スクシノグリカンでは、この比率は１：４である。これらの比率を各バイオポリマーの質量増加パーセントの値に対してプロットした。図４に示されるように、反復単位中の単糖に対する負電荷の比率が最も高い分子であるガラクトグルカンは、最も高い水結合能を有していた。他の根粒菌バイオポリマーは、この近似曲線に高いＲ２値で正確に適合した。単糖に対する電荷の比率が同様に１：２であるヒアルロン酸（灰色の丸）は、近似曲線に適合せず、この分子については、電荷比以外の又はそれに加えて何かが水分保持に影響を及ぼすことが示された。キサンタンガム（Modernist Pantry）は、ＨＡと比較して低い水結合能を示し、同様に近似曲線に適合しなかった。
【0151】
図５は、ｗｇａＥ遺伝子を切除したＳ．メリロティ株に由来する非ピルビル化ガラクトグルカン分子（ＮＰ－ガラクトグルカン）の構造を示す。ＮＰ－ガラクトグルカン分子も、完全にピルビル化されたガラクトグルカンほどではないにせよ、ＨＡ対照よりも多くの水を保持した。ＨＡと比較して、ＮＰ－ガラクトグルカン分子は、水を結合する能力の１．７倍の増加を示した。
【0152】
実施例６．細胞毒性
細胞毒性について試験するために、バイオポリマーを実施例３に従って精製し、Ｃａ、Ｍｇを含まないＰＢＳ溶液に１％（ｗ／ｖ）の濃度で再懸濁した。次いで、これらの溶液を水浴内にて６０℃で３０分間加熱殺菌した。下記の細胞毒性アッセイをカリフォルニア州ハーキュリーズのPacific Biolabsで行った。
細胞毒性について試験するために、バイオポリマーを実施例３に従って精製し、Ｃａ、Ｍｇを含まないＰＢＳ溶液に１％（ｗ／ｖ）の濃度で再懸濁した。次いで、これらの溶液を水浴内にて６０℃で３０分間加熱殺菌した。下記の細胞毒性アッセイをカリフォルニア州ハーキュリーズのPacific Biolabsで行った。
【0153】
試験手順：総表面積１．０ｃｍ２の平らな表面を有する滅菌濾紙を、約０．１ｍＬの試験溶液で飽和させ、１０ｃｍ２のウェルの中央の細胞培養単層上に直接置いた。三連の調製物を調製した。三連の陽性対照及び陰性対照を試験品と同様に試験した。全てのウェルを５±１％のＣＯ２の入った加湿インキュベーター内にて３７±１℃で２４時間以上インキュベートした。インキュベーション後に、試験品及び対照をウェルから静かに取り出した。細胞培養物を倒立顕微鏡下にて倍率１００倍で細胞毒性応答について試験した。応答は０～４の段階で等級分けした。２を超える等級数の達成を細胞毒性効果とみなす。
【0154】
本研究はＩＳＯ １０９９３－５：２００９に従って行った。値０は反応性なしとみなし、値１は僅かに反応性を有するとみなす。図６は、単離されたスクシノグリカン、ガラクトグルカン、グルクロノグリカン、並びにスクシノグリカン及びガラクトグルカンの混合物が本アッセイにより細胞毒性を有しないことを示す。
【0155】
実施例７．スキンケア用の局所配合物
バイオポリマー及び／又はその誘導体を実施例３に従って生産し、精製する。精製バイオポリマーを以下の市販のローションベース：Ｄｅｒｍａｂａｓｅ Ｃｒｅａｍ（商標）（Paddock Laboratories）、Ｃｒａｆｔｅｒ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ（商標） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ（Crafter's Choice Brands LLC）及びＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｅａｓｙ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ（Stephenson）、又は他の同様のベースに添加する。これらのローションベースは、様々な室温で安定したスキンケア用の水中油型エマルションである。バイオポリマーは、ローションベースに直接添加するか、又は適切な最終濃度を達成するために添加前に水若しくはＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇを含まない）に再懸濁する。典型的な配合物としては、最終濃度が０．１％～２％（ｗ／ｖ）のバイオポリマー又は誘導体が挙げられる。
バイオポリマー及び／又はその誘導体を実施例３に従って生産し、精製する。精製バイオポリマーを以下の市販のローションベース：Ｄｅｒｍａｂａｓｅ Ｃｒｅａｍ（商標）（Paddock Laboratories）、Ｃｒａｆｔｅｒ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ（商標） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ（Crafter's Choice Brands LLC）及びＳｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｅａｓｙ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ（Stephenson）、又は他の同様のベースに添加する。これらのローションベースは、様々な室温で安定したスキンケア用の水中油型エマルションである。バイオポリマーは、ローションベースに直接添加するか、又は適切な最終濃度を達成するために添加前に水若しくはＰＢＳ（Ｃａ、Ｍｇを含まない）に再懸濁する。典型的な配合物としては、最終濃度が０．１％～２％（ｗ／ｖ）のバイオポリマー又は誘導体が挙げられる。
【0156】
ローションベースの成分：
Ｄｅｒｍａｂａｓｅ Ｃｒｅａｍ（商標）－精製水、鉱油、ワセリン、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、パルミチン酸イソプロピル、イミダゾリジニル尿素、メチルパラベン及びプロピルパラベン。
Ｃｒａｆｔｅｒ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ（商標） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ－水、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート－６０、ステアリルアルコール、ヒマワリ油、アラントイン、プロピレングリコール、パルミチン酸イソプロピル、ワセリン、ジアゾリジニル尿素、メチルパラベン、プロピルパラベン、ＢＨＴ、カルボマー、ベンゾフェノン－４、ステアリン酸。
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｅａｓｙ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ－水、ヒマワリ種子油、ポリソルベート２０、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル、フェノキシエタノール、カルボマー、ソルビン酸カリウム、水酸化ナトリウム。
Ｄｅｒｍａｂａｓｅ Ｃｒｅａｍ（商標）－精製水、鉱油、ワセリン、セトステアリルアルコール、プロピレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、パルミチン酸イソプロピル、イミダゾリジニル尿素、メチルパラベン及びプロピルパラベン。
Ｃｒａｆｔｅｒ’ｓ Ｃｈｏｉｃｅ（商標） Ｂａｓｉｃ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ－水、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル、ポリソルベート－６０、ステアリルアルコール、ヒマワリ油、アラントイン、プロピレングリコール、パルミチン酸イソプロピル、ワセリン、ジアゾリジニル尿素、メチルパラベン、プロピルパラベン、ＢＨＴ、カルボマー、ベンゾフェノン－４、ステアリン酸。
Ｓｔｅｐｈｅｎｓｏｎ Ｅａｓｙ Ｌｏｔｉｏｎ Ｂａｓｅ－水、ヒマワリ種子油、ポリソルベート２０、セテアリルアルコール、ステアリン酸グリセリル、フェノキシエタノール、カルボマー、ソルビン酸カリウム、水酸化ナトリウム。
【0157】
バイオポリマーの皮膚保水性試験については、以下の水中油型ベースローションを使用した：蒸留水、パパヴェル・ソムニフェルム（Papaver Somniferum）（ポピーシード）種子油、グリセリン、ペンチレングリコール（植物由来）、オリーブスクアラン、ステアリン酸ポリグリセリル－２、ステアリン酸グリセリル、ステアリルアルコール、トコフェロール、ロニセラ・ジャポニカ（Lonicera Japonica）（スイカズラ）花エキス、ロニセラ・カプリフォリウム（Lonicera Caprifolium）（スイカズラ）花エキス、０．２％（ｗ／ｖ）ガラクトグルカン、アラビアゴム、キサンタンガム、フィチン酸ナトリウム、アルコール及び乳酸。
【0158】
実施例８．ｉｎ ｖｉｖｏ皮膚保水性研究
実施例７に記載したバイオポリマー含有ローションベース配合物を、プラシーボ組成物とともに皮膚の水分量の比較ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用する。バイオポリマーを含有する各ローションベースのプラシーボ組成物は、等容量のＰＢＳ又は滅菌水を添加することで生成する。
実施例７に記載したバイオポリマー含有ローションベース配合物を、プラシーボ組成物とともに皮膚の水分量の比較ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用する。バイオポリマーを含有する各ローションベースのプラシーボ組成物は、等容量のＰＢＳ又は滅菌水を添加することで生成する。
【0159】
皮膚保水性研究では、バイオポリマーを含有するローションベースの標準量を顔の右側、プラシーボ組成物を顔の左側に塗布するよう被験体に指示する。被験体には、常に同じ組成物を顔の同じ側に塗布するよう指示する。被験体は、これらの組成物を１日２回、規定の時間にわたって塗布し、研究組成物とは無関係のいかなる他の局所組成物の使用も控えるよう指示される。皮膚保水性の測定は、Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ８２５（Courage and Khazaka）を用いて行う。
【0160】
ガラクトグルカンを上記の手順に従って精製し、皮膚保水性研究に使用した。皮膚保水性は、０．２％（ｗ／ｖ）ガラクトグルカン又は対照として等量の水のいずれかを含有する、実施例７に記載したポピーシードオイル配合物を用い、４８時間にわたって測定した。４７歳の男性（Ｐ１）及び４９歳の女性（Ｐ２）の２人の健康ボランティアについてのベースライン皮膚保水性測定（Ｃｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ ８２５による任意単位）を研究の開始前に行った。本研究では、任意単位でのＣｏｒｎｅｏｍｅｔｅｒ測定値は通例、２０～５０の範囲であり、機器の最大値は１２０である。参加者には、およそ０．３ｍｌを身体の２つの異なる部位、すなわち手の甲及び肘に塗布するよう指示した。試験サンプル及び対照サンプルを１日４回塗布し、各塗布の前に皮膚保水性の変化をモニタリングした。図７は、２４時間の処置後に行った測定での身体の各部位についてのベースラインからの保水性の変化の平均値を示す。ガラクトグルカンを含有するローションベースでの処置は、ローションベース対照と比較して、Ｐ１及びＰ２の両方について身体の両部位で保水性値の一貫した増加をもたらした。注目すべきは、処置の２４時間後に保水性の傾向が十分に確立され、保水効果が累積的であり、より長時間の処置により、ガラクトグルカンを含有するローションと対照との間に更に大きな保水性の差が生じることが示唆される。図８は、処置の３６時間後の参加者Ｐ１の手の甲の画像を示し、対照ローションベースで処置した手と比較して、ガラクトグルカンで処置した手では、しわの出現の明らかな軽減を観察することができる。丸印は、しわの出現の軽減が特に明らかな部位を強調している。参加者は、実験処置又は対照処置のいずれでも赤み、刺激、腫れ、過敏又は不快感を報告しなかった。
【0161】
実施例９．バイオポリマーのｉｎ ｖｉｔｒｏ経皮吸収
ｅｘ ｖｉｖｏ皮膚研究を用いて、皮膚浸透性を評定し、透過性又は蓄積性の点でバイオポリマーをランク付けし、配合物を効力について最適化する。ヒト又はブタの皮膚を用いて、フランツ拡散セル（Franz 1975）内で研究を行い、経皮吸収を評定する。バイオポリマー配合物をフランツセルの上（外）面に適用し、下（漿膜）面と接触するバッファーが入ったリザーバから所定の時点でサンプルを取り出し、測定する。対照ポリマー又は他の化合物は、品質管理のために同時投与するか（試験バイオポリマーが溶液中の場合）、又は並行して実行する（試験バイオポリマーが他の何らかのタイプの配合物中の場合）。皮膚を研究の終了時に摘出し、試験化合物の蓄積性を定量化してもよい。
ｅｘ ｖｉｖｏ皮膚研究を用いて、皮膚浸透性を評定し、透過性又は蓄積性の点でバイオポリマーをランク付けし、配合物を効力について最適化する。ヒト又はブタの皮膚を用いて、フランツ拡散セル（Franz 1975）内で研究を行い、経皮吸収を評定する。バイオポリマー配合物をフランツセルの上（外）面に適用し、下（漿膜）面と接触するバッファーが入ったリザーバから所定の時点でサンプルを取り出し、測定する。対照ポリマー又は他の化合物は、品質管理のために同時投与するか（試験バイオポリマーが溶液中の場合）、又は並行して実行する（試験バイオポリマーが他の何らかのタイプの配合物中の場合）。皮膚を研究の終了時に摘出し、試験化合物の蓄積性を定量化してもよい。
【0162】
非ピルビル化ガラクトグルカンサンプルを用いてフランツセルアッセイを行った。具体的には、単一ドナーから切除したヒト死体皮膚の厚さを測定した後、３７℃にサーモスタット制御されたフランツ垂直拡散セル（ＦＤＣ－６、Logan instruments、ニュージャージー州サマセット）に取り付けた。レセプター溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）を添加し、３７℃で３０分間平衡化した（３２℃の皮膚表面温度に達するように）。平衡化時間の後、レセプター溶液の全容量（およそ１１ｍｌ）を取り出して捨て、新たな予め温めたレセプター溶液と交換し、実験開始前にバッファー中に放出された内因性バックグラウンドを除去した。
【0163】
５％（ｗ／ｖ）のバイオポリマーをＰＢＳ（ｐＨ７．４）に添加し、５０℃で３０分間インキュベートすることによって投与溶液を調製した。１ｍｌの投与溶液を各ドナーチャンバーに添加した。このため、各チャンバーのバイオポリマーの総量は５０ｍｇであった。ドナー溶液は０時間、８時間及び２４時間の時点でサンプリングした。レセプター溶液は０．５時間、１時間、２時間、４時間、８時間及び２４時間の時点でサンプリングした。２４時間後に組織を取り外し、透過時間後にブランクＰＢＳで軽くすすぎ、秤量し、個別に－２０℃で保存した。バイオポリマーの定量では、レセプターサンプル中のタンパク質バックグラウンドを低減するために、アントロン法（Morris 1948）をカレッツ（Carrez）試薬（EMD Millipore）とともに用いた。アントロン法は、溶液中の炭水化物の存在を検出するために一般的に用いられる。レセプターサンプルについては、１．５ｍＬチューブに入れた４００μＬのサンプルに４μＬのカレッツ試薬Ｉを添加し、チューブをボルテックスによって混合した。次いで、更に４μＬのカレッツ試薬ＩＩを添加し、チューブを再び混合した。試薬を２．５μＬの１Ｎ ＮａＯＨで中和し、チューブを１６０００×ｇで５分間遠心分離した。濃硫酸中の６２５μＬの０．２％アントロンを氷上で３２５μＬの上清と混合した。サンプルを９９℃で１５分間加熱した後、氷上で冷却した。
【0164】
皮膚に保持されたバイオポリマーを検出するために、取り外したサンプルを、２ｍＬチューブに入れた１ｍＬのＰＢＳに３７℃で４時間、次いで４℃で３日間浸漬した。ＰＢＳを回収し、１６０００×ｇで５分間の遠心分離を２回行い、残屑を除去した。カレッツ試薬を用いてサンプルを上記のように清澄化した後、ＰＢＳで１０倍に希釈した。
【0165】
全てのサンプルについて吸光度を６２０ｎｍで測定し、カレッツ試薬を用いて明確化した標準曲線との比較によって炭水化物濃度を決定した。対照フランツセル（バイオポリマーを含まない）のバックグラウンド吸光度を算出し、値から減算して、炭水化物濃度を導き出した。図９は、４時間のインキュベーション後のレセプターチャンバー（透過液）からの代表的な結果を示す。このサンプル中で検出された炭水化物は、バイオポリマーが表皮層に浸透したことを示す。レセプターチャンバー内のバイオポリマーの最高濃度は通例、これらの時点で観察された。図９はまた、取り外したサンプルを上記のようにＰＢＳに浸漬した後に、或る特定量のバイオポリマーが皮膚自体に含まれるか、又は付随することを示す（皮膚）。これらの所見から、フランツセルのドナーチャンバー内の物質の一部が皮膚サンプルを完全に透過し、別の部分が皮膚サンプル内に保持されるか、又は付随することが示される。いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、非ピルビル化ガラクトグルカンの皮膚浸透性画分は、サンプル中で最も低分子量である可能性があり、より高分子量の画分が表皮表面に吸収され、及び／又は保持される可能性がある。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】