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▶ アーケシュフース ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフの特許一覧
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-28
(54)【発明の名称】クリアランスアッセイ
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240220BHJP
C07K 14/47 20060101ALN20240220BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02 ZNA
C07K14/47
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023554382
(86)(22)【出願日】2022-03-08
(85)【翻訳文提出日】2023-10-26
(86)【国際出願番号】 EP2022055950
(87)【国際公開番号】W WO2022189463
(87)【国際公開日】2022-09-15
(31)【優先権主張番号】21161384.9
(32)【優先日】2021-03-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521455419
【氏名又は名称】アーケシュフース ウニヴェルスィテーツスィーケフース ハーエフ
(74)【代理人】
【識別番号】110000796
【氏名又は名称】弁理士法人三枝国際特許事務所
(72)【発明者】
【氏名】フラッドビー トールモー
(72)【発明者】
【氏名】ウェッターグリーン マリアンヌ
(72)【発明者】
【氏名】シャルマ クルブーシャン
(72)【発明者】
【氏名】ギスラドッティル バーグリンド
(72)【発明者】
【氏名】キルセボム ビョルン－エイヴィン
【テーマコード（参考）】
4B063
4H045
【Ｆターム（参考）】
4B063QA01
4B063QA18
4B063QQ08
4B063QQ79
4B063QQ91
4B063QR48
4B063QS33
4H045BA10
4H045CA40
4H045EA50
(57)【要約】
神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法である。方法は、ｉ）ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、ｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、ＭＰＳ細胞による疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、ｉｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、ｉｖ）疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程とを含む。疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、前記方法は、ｉ）ＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、前記ＭＰＳ細胞による前記疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料における前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、前記作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含み、ここで、
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する前記作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定し、かつ、
前記疾患マーカー産物がＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）である場合、工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片又はＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片の細胞内量を検出することを含む、方法。
【請求項2】
前記ＭＰＳ細胞は、ミクログリア細胞、マクロファージ、又は単球、好ましくは単球である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法は、単球をマクロファージに分化させる工程を含む、請求項２～４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＰＳ細胞は、ヒト被験体から得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＭＰＳ細胞は、ＣＳＦ試料又は血液試料、好ましくは血液試料から得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞を培養することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質若しくは阻害物質であるか、又は炎症性活性化物質であり、好ましくは、前記作用物質は、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、ＦＦＡＲ４アゴニスト、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭ、ラパマイシン、バフィロマイシン、ネプリライシン阻害物質、ＩＤＥ阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭの組合せ、又はＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質の組合せであり、好ましくは、前記ＦＦＡＲ４アゴニストは、ＤＨＡであり、前記α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭは、ＮＳ１７３８であり、かつ前記ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭの組合せは、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せである、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、タウタンパク質、α－シヌクレイン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）若しくはＴＤＰ－４３、若しくはそれらの断片であるか、又は前記断片は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片若しくはＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片である、請求項１～７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、アルツハイマー病に関連している、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項10】
工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１、残基３４、又は残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４０（配列番号２）の断片又はＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片の細胞内量を検出することを含む、請求項８又は９に記載の方法。
【請求項11】
工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端、配列番号６のＣ末端、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又はＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項13】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端又はＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の領域の２つ以上を検出することによって、好ましくは、ｉ）残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、及び残基３１～残基３４又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、
ｉｉ）配列番号６のＮ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、好ましくは、配列番号６の残基１～残基６、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
ｉｉｉ）配列番号６のＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又は、
ｉｖ）Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
前記少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものである、請求項９～１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項15】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、抗体、好ましくは配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な又は配列番号４に特異的な抗体、好ましくはまた配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１０～１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
工程ｉｉｉ）は、タウ、α－シヌクレイン、ＴＤＰ－４３、又はＭＢＰの少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記断片は、タウがアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間、又はアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間、アミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又はアミノ酸残基７２とアミノ酸残基７３との間、又はアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又はアミノ酸残基９０とアミノ酸残基９１との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間、又はアミノ酸残基３２０とアミノ酸残基３２１との間、又はアミノ酸残基３２３とアミノ酸残基３２４との間、又はアミノ酸残基３６０とアミノ酸残基２６１との間、アミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間、又はアミノ酸残基２８５とアミノ酸残基２８５との間、及び／又はアミノ酸残基３３１とアミノ酸残基３３２との間で切断されたもの、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項１６に記載の方法。
【請求項18】
前記断片は、タウタンパク質がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたもの、又は、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
工程ｉｉｉ）は、前記疾患マーカー産物の２つ以上の断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
工程ｉｉ）において、前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質又は活性化物質であり、かつ工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞の試料を炎症性活性化物質に加えて前記作用物質に曝露することを含み、好ましくは、前記炎症性活性化物質はＬＰＳである、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記コントロールＭＰＳ細胞は、請求項１の工程ｉ）及び工程ｉｉ）を経た細胞であるが、但し、前記コントロールＭＰＳ細胞は、前記作用物質には曝露されていない、請求項１～２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項22】
前記方法は、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対する一連の作用物質の効果を比較し、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対して最大の効果を有する前記作用物質を特定するものである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項23】
前記方法は、前記神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
前記方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する疾患又は病態の診断において使用するものである、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記方法は、個別化医療において作用物質がヒト被験体に有効な治療であるかどうかを判定するのに使用するものであり、ここで、前記方法の工程ｉ）は、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持することを含み、かつ前記作用物質の前記ヒト被験体に対する有効性を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する、請求項１～２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
を含むキット。
【請求項27】
前記キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、
タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、
を含む、請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定する方法に関する。本発明はまた、そのような方法において使用されるキットに関する。
【背景技術】
【0002】
Ａβの異化及び除去（クリアランス）は、シナプスで、脳実質において、脳血管系に沿って、それぞれアルツハイマー病（ＡＤ）及び脳アミロイド血管症（ＣＡＡ）におけるアミロイド沈着を回避するのに不可欠である（非特許文献１、非特許文献２）。シナプス前及び関連の酵素活性によりシナプス周囲間質液（ＩＳＦ）へのＡβの放出が誘発され、そこから拡散、血管周囲輸送、ミクログリア及びニューロンによる取り込みによって、クリアランスが促進される（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８）。年齢、ＡＰＯεＥ４アレル、ＡＰＰに関連する遺伝因子、Ａβ、シナプス前β部位ＡＰＰ切断酵素１（ＢＡＣＥ１）、及び骨髄性細胞は、ＡＤにとっての主要な危険因子である（非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１）。拡散によるクリアランス、血管周囲クリアランス、並びに例えば日周パターン、日中の活動、及び併発感染症の一部としてのニューロン活性及び免疫活性における変化を通じて、これらの因子は恒常性のバランスを保ち、それによって神経毒性代謝物の形成が制限される。この防護機能は、シナプス及び実質のミクログリア、血管周囲のマクロファージ、並びに周皮細胞によって補助されている。恒常性が十分に損なわれると、続いてＡβ代謝異常、並びにアミロイド斑及び血管周囲アミロイドの沈着が起こる。他の疾患関連のペプチド及びタンパク質の脳沈着は、他の神経変性疾患及び神経変性に関連する病態における単球食作用系（ＭＰＳ）代謝異常にも関連している。ＡＤ及びその他の神経変性疾患においては、遺伝的危険因子及び後天的危険因子、炎症、自然免疫不活性化、並びに小血管疾患によって代謝恒常性が損なわれている可能性がある。
【0003】
Ａβのクリアランスは複雑な過程であり、その中でもＡβの食作用及び分解／異化が２つの重要な要素である。脳の自然免疫細胞（すなわち、ミクログリア）及び末梢血の自然免疫細胞（例えば、単球及びマクロファージ）における異化は、Ａβクリアランスに寄与する（非特許文献１２）。幾つかのプロテアーゼは、細胞内活性、細胞膜活性、及び細胞外活性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ（非特許文献１３）及びｉｎ ｖｉｖｏ（非特許文献１４によるＣＴＡＤポスター）の両方でＡβを分解する。プロテアーゼ活性は細胞の活性化状態を表し得ることから、これらを、治療を目的として操作することができる。細胞内プロテアーゼの活性により、幾つかの異なる残基に欠損を有する幾つかのＡβ中間ドメインペプチド（すなわち、中間ドメイン断片）が生ずる（非特許文献１５）。Ａβ１－４２命名法におけるアミノ酸残基１９（Ｐｈｅ）とアミノ酸残基２０（Ｐｈｅ）との間、及びアミノ酸残基３４（Ｌｅｕ）とアミノ酸残基３５（Ｍｅｔ）との間の２つの切断部位により、Ａβ２０－３４ペプチドが生成される（図１及び図２）。
【0004】
Ａβの毒性は、タンパク質分解も阻害し得る中央の二量体／ヘアピン構造（図１）を含むＡβペプチドのより短い断片において保持される（非特許文献１６）。これを裏付けるように、以前の質量分析実験では、おおよそアミノ酸残基２０及びアミノ酸残基３３／３４でのＡβ１－４２の優先的な細胞内単球食作用系（ＭＰＳ）触媒作用の証拠が示されたが、介在するセグメントにおいては触媒作用が欠如している。これらの実験により、エンドソームの再循環及びＡＰＰ分解を起源とすることが推定されるＡＰＰ由来ペプチドの内因性起源の証拠も明らかになった（図２；非特許文献１７）。実際、Ａβ１－４２のアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間での切断により得られる中間ドメインＡβｘ－３４断片は、アミロイドクリアランスのマーカーであることが示唆されている（非特許文献１８）。
【0005】
Ａβの異化の治療による強化は、ＡＤ治療にとって魅力的な注目点である。この目的のために、ラパマイシン類似体（「ラパログ」）、エンドリソソーム酵素活性の強化、及びマクロオートファジーが提案されている（非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献１７、非特許文献１）。
【0006】
ＡＤ等の神経変性疾患には炎症も関与しており、ここで、神経炎症は部分的に神経免疫軸によって調節されており、その際、自然免疫細胞上のα７－ニコチン性受容体（α７ニコチン性アセチルコリン受容体；α７ ｎＡＣｈＲ）の刺激が重要な要素である（非特許文献２１、非特許文献２２）。ＡＤへの進行は炎症によっても特徴付けられることが明らかになっており（非特許文献２３）、現在では、初期のＡＤにおいてミクログリアの特性が変化し、患者がＡＤ誘発性認知症に向かって進行するにつれて炎症性表現型を獲得すると考えられている。非特許文献２４では、Ａβの一般的な形態であるＡβ４０が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）による炎症の収束に重要な役割を果たす特異的炎症収束性メディエーター（specialized proresolving mediator）（ＳＰＭ）の産生を減少させることが実証された。Ω３脂肪酸（Ω３－ＰＵＦＡ）を含む多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）は、以前にドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ；ＩＵＰＡＣ名（４Ｚ，７Ｚ，１０Ｚ，１３Ｚ，１６Ｚ，１９Ｚ）－４，７，１０，１３，１６，１９－ドコサヘキサエン酸））が豊富なサプリメントを使用して実証されたように自然免疫活性を改変し、この種類の介入はＡＤ関連のＰＢＭＣ及びミクログリアのプロファイルを改善し、認知力の向上と関連していることが明らかになっている（非特許文献２４、非特許文献２５）。ＭＰＳに対するΩ３ ＰＵＦＡの効果は、主に遊離脂肪酸受容体４（ＦＦＡＲ４）に起因する（非特許文献２６）。Ω３ ＰＵＦＡはＮＦ－κＢを間接的に阻害することから、炎症に対抗することができる（非特許文献２７、非特許文献２８）。ＮＦ－κＢ及びポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）を含むα７アゴニストは、α７ ｎＡＣｈＲの発現を調節することができる。活性化されたα７ ｎＡＣｈＲは、重病を含む多くの疾患に対する潜在的な防護的役割を伴う広範な抗炎症反応及び免疫調節反応に関連しているが、上方調節されたＣＨＲＦＡＭ７Ａの転写及び発現はＣＨＲＮＡ７発現又はα７ ｎＡＣｈＲ機能を妨げることが知られていることから、炎症性活性化を促進し、α７ニコチン作動性シグナル伝達を妨げることが推定される（非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２）。
【0007】
ＡＤ患者、その他の神経変性疾患を伴う患者、及び炎症性病態を伴う患者では、恐らく部分的にはＬＰＳ／Ｔｏｌｌ様受容体系の活性化のため、自然免疫活性化が増加している（非特許文献３３、非特許文献３４）。
【0008】
自然免疫モデル系における細胞のＤＨＡ処理により、Ａβ１－４２の食作用及び分解が増加し、食作用の増加は原形質膜でのＣＨＲＮＡ７発現の増加によって媒介されることが明らかになっている（特許文献１）。したがって、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭを使用する併用治療がＡＤの治療に提案されている（特許文献１）。
【0009】
個別化医療又は精密医療は、急速に発展している分野である。Ａβの幾つかの異なる突然変異がＡＤを引き起こすことが知られており（その一部を図１に示す）、患者によって異なる突然変異を有する。同様に、喫煙及び肥満等のライフスタイル要因を原因とするような自然免疫関連のエピジェネティックな変化は、ＡＤ発症のリスクに影響を与えると考えられており、ＭＰＳの様々な部分に影響を与える可能性がある。Ａβに対する様々な突然変異及び様々なエピジェネティックな変化は、ＭＰＳ細胞における様々なエンドリソソーム酵素がＡβ及びその断片を異化する効力に影響を及ぼすことになり、それによってＡβのクリアランスに影響が及ぼされる。（図３に示される通り）、治療薬によってＭＰＳの標的とする部分が異なり、影響を与えるエンドリソソーム酵素が異なると考えられている。したがって、ＡＤの個々の原因を考慮して、個別化医療及び精密医療を提供することが求められている。
【0010】
アミロイド血管症、ウイルス感染症、パーキンソン病、多発性硬化症、前頭側頭型認知症、及び筋萎縮性側索硬化症等の神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する他の病態もＭＰＳの機能不全を特徴とするため、ペプチドの異常なクリアランスが引き起こされ、バイオマーカー産物又はその断片が存在する。例えば、ＡＤ、パーキンソン病（ＰＤ）、進行性核上性麻痺、及び前頭側頭型認知症のそれぞれに関連するタウも、ＭＰＳによって触媒される（図３）。神経変性及び／又は炎症性活性化に関連するタンパク質は、ペプチドの凝集又は蓄積及び／又は神経毒性に関連する領域を有することが判明している。例えば、突然変異誘発により、タウの凝集の誘導におけるタウのＲ３領域（残基３０６～残基３３６）の重要性が明らかになっており、タウの残基２４４～残基３７２に対応する断片により、細胞及び動物モデルにおけるタウの凝集挙動の多くが再現される（非特許文献３５）。ＴＤＰ－４３の２つの領域、すなわち、ＴＤＰ－４３のＲＲＭ－２ドメイン及びＣ末端ドメインそれぞれにおける残基２４６～残基２５８及び残基３１１～残基３２３は、顕著な凝集を示すことが判明している（非特許文献３６）。これらの領域内で、残基２４６～残基２５５及び残基３１１～残基３２０が非常に凝集しやすいことが判明している（非特許文献３６）。非特許文献３７により、ＴＤＰ－４３のＳｅｇＡ（残基３１１～残基３６０）及びＳｅｇＢ（残基２８６～残基３３１）がヒトＴＤＰ－４３凝集の病原性コアであると思われることが報告された。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）も、脱髄疾患においてオリゴデンドロサイトの内部又は神経細胞の周囲で凝集し、ＭＢＰの結合がニューロン特異的な毒性を誘導し得ることが以前に示唆されている（非特許文献３８）。ＭＢＰは分解されにくい形態で凝集することも示唆されている（非特許文献３８）。さらに、ウイルスカプシドの選択的ＭＰＳエンドリソソーム触媒作用は、場合によってはウイルスの複製に必要とされ、ＬＰＳ／Ｔｏｌｌ様受容体系によって強化される（非特許文献３９、非特許文献４０）。同一の触媒酵素がＡβタンパク質の触媒作用に関与する（非特許文献４１、非特許文献４２）。したがって、ＭＰＳ機能不全に関連する他の神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物の異化も、介入の標的となり得る疾患進行の必須要素に関連する測定可能な異化産物をもたらすことが予想される。
【0011】
したがって、ＭＰＳの機能不全に関連する神経変性疾患の疾患マーカー産物及びその断片のＭＰＳ細胞による異化及び細胞内クリアランスを研究することが必要とされる。特に神経変性疾患及びＭＰＳ機能不全に関連する炎症性活性化が、細胞内クリアランス及びその調節に及ぼす効果を研究することも必要とされる。また、特にＭＰＳ内の様々な治療標的を考慮して、様々な療法がＭＰＳの機能並びに疾患マーカー産物及びその断片のクリアランスをどのように調節するかを特徴付け、神経変性疾患及び炎症性活性化を治療する新しい改良された療法を特定することも必要とされる。さらに、神経変性疾患に関連する個々の遺伝的変異体及びエピジェネティック変異体を考慮して個別化医療方法を開発することが必要とされる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0012】
【特許文献1】国際公開第２０２０／２１２６２７号
【非特許文献】
【0013】
【非特許文献1】Sikanyika, Parkington et al. 2019
【非特許文献2】Greenberg, Bacskai et al. 2020
【非特許文献3】Cirrito, Yamada et al. 2005
【非特許文献4】Roberts, Elbert et al. 2014
【非特許文献5】Bakker, Bacskai et al. 2016
【非特許文献6】Ries and Sastre 2016
【非特許文献7】Clayton, Van Enoo et al. 2017
【非特許文献8】Yuksel and Tacal 2019
【非特許文献9】Belloy, Napolioni et al. 2019
【非特許文献10】Jansen, Savage et al. 2019
【非特許文献11】Tamura, Chiu et al. 2020
【非特許文献12】Simard et al. 2006
【非特許文献13】Rogeberg et al. 2014
【非特許文献14】Torsetnes et al. 2019
【非特許文献15】Rogeberg et al. 2015
【非特許文献16】Schmidt, Rohou et al. 2015
【非特許文献17】Malik, Maddison et al. 2019
【非特許文献18】Henium et al., 2020
【非特許文献19】Du, Liang et al. 2013
【非特許文献20】Jha, Jha et al. 2015
【非特許文献21】Maldifassi et al., 2018
【非特許文献22】Eduardo et al., 2019
【非特許文献23】Nordengen et al. 2019
【非特許文献24】Wang et al. 2015
【非特許文献25】Antonietta et al. 2012
【非特許文献26】Im, 2016
【非特許文献27】Dyall, 2015
【非特許文献28】Cirpo et al., 2015
【非特許文献29】Ren et al., 2017
【非特許文献30】Can et al., 2019
【非特許文献31】de Lucas-Cerrillo et al., 2011
【非特許文献32】Marioli et al., 2019
【非特許文献33】Zhan, Stamova & Sharp, 2018
【非特許文献34】Gambuzza et al., 2014
【非特許文献35】Stohr et al., 2017
【非特許文献36】Saini & Chauhan, 2011
【非特許文献37】Cao et al 2019
【非特許文献38】Frid et al., 2015
【非特許文献39】Pislar et al., 2020
【非特許文献40】Creasy & McCoy et al., 2011
【非特許文献41】Hook et al., 2002
【非特許文献42】Cermak et al., 2016
【発明の概要】
【0014】
本発明は、ＣＮＳ疾患バイオマーカー産物の恒常性の低下を、自然免疫細胞、すなわちＭＰＳによる異化を測定及び監視することによって調べることができ、自然免疫活性化を調節することによって恒常性を改善することができるという知見からもたらされる。特に、本発明は、神経変性疾患及びＭＰＳ機能不全における凝集及び／又は毒性に関連するタンパク質の領域が、触媒作用を受けにくい断片に対応するという知見からもたらされる。したがって、これらの中間ドメイン断片の異化を測定及び監視することによって、ＣＮＳ疾患バイオマーカー産物の恒常性の低下を調べることができる。
【0015】
したがって、本発明の第１の態様において、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、方法は、
ｉ）ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、ＭＰＳ細胞による疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含み、ここで、
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する、方法が提供される。
ｉ）ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、ＭＰＳ細胞による疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含み、ここで、
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する、方法が提供される。
【0016】
好ましくは、ＭＰＳ細胞は、ミクログリア細胞、マクロファージ、又は単球、好ましくは単球である。
【0017】
好都合には、方法は、単球をマクロファージに分化させる工程を含む。
【0018】
有利には、ＭＰＳ細胞は、ヒト被験体から得られる。
【0019】
好ましくは、ＭＰＳ細胞は、ＣＳＦ試料又は血液試料から得られる。
【0020】
好都合には、ＭＰＳ細胞は、血液試料から得られる。
【0021】
有利には、工程ｉｉ）は、ＭＰＳ細胞を培養することを含む。
【0022】
好都合には、作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質若しくは阻害物質であるか、又は炎症性活性化物質である。
【0023】
好ましくは、作用物質は、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、ＦＦＡＲ４アゴニスト、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭ、ラパマイシン、バフィロマイシン、ネプリライシン阻害物質、ＩＤＥ阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭの組合せ、又はＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質の組合せであり、好ましくは、ＦＦＡＲ４アゴニストは、ＤＨＡであり、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭは、ＮＳ１７３８であり、かつＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭの組合せは、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せである。
【0024】
好都合には、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片はアルツハイマー病に関連している。
【0025】
有利には、疾患マーカー産物は、Ａβ１－４２（配列番号１）、Ａβ１－４０（配列番号２）、タウタンパク質、α－シヌクレイン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、又はＴＤＰ－４３である。
【0026】
好都合には、少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）、Ａβ１－４０（配列番号２）、タウタンパク質、α－シヌクレイン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、又はＴＤＰ－４３の断片であり、ここで、Ａβ１－４２（配列番号１）の断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含む。
【0027】
有利には、方法の工程ｉｉｉ）は、疾患マーカー産物の少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することを含む。
【0028】
好都合には、方法の工程ｉｉｉ）は、疾患マーカー産物の２つ以上の断片の細胞内量を検出することを含む。
【0029】
有利には、方法の工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１、残基３４、又は残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４０（配列番号２）の断片又はＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片の細胞内量を検出することを含む。
【0030】
好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0031】
好都合には、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端、配列番号６のＣ末端、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又はＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0032】
有利には、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端、配列番号６のＣ末端、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又はＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0033】
好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端又はＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の領域の２つ以上を検出することによって、好ましくは、
ｉ）残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、及び残基３１～残基３４又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、
ｉｉ）配列番号６のＮ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、好ましくは、配列番号６の残基１～残基６、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
ｉｉｉ）配列番号６のＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又は、
ｉｖ）Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
ｉ）残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、及び残基３１～残基３４又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、
ｉｉ）配列番号６のＮ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、好ましくは、配列番号６の残基１～残基６、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
ｉｉｉ）配列番号６のＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又は、
ｉｖ）Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、好ましくは残基２１～残基２９を含む断片の領域、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0034】
好ましくは、少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものである。したがって、本発明の方法において検出されるＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片は、そのＮ末端として残基２０を含み、及び／又はＣ末端として残基３４を含む。
【0035】
好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端を検出し、かつ配列番号６のＣ末端を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0036】
有利には、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端を検出し、配列番号６のＣ末端を検出し、かつ配列番号１又は配列番号２のＣ末端を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0037】
好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）は、抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0038】
有利には、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な又は配列番号４に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0039】
好都合には、方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、配列番号６のＣ末端に特異的な又は配列番号４に特異的な抗体、及び配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む。
【0040】
好ましくは、方法の工程ｉｉｉ）は、α－シヌクレイン（配列番号１０）、タウ（配列番号１４）、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）、又はＭＢＰ（配列番号２０）の少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することを含む。
【0041】
有利には、断片は、
タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基２３２との間、又はアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間、アミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又はアミノ酸残基７２とアミノ酸残基７３との間、又はアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又はアミノ酸残基９０とアミノ酸残基９１との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間、又はアミノ酸残基３２０とアミノ酸残基３２１との間、又はアミノ酸残基３２３とアミノ酸残基３２４との間、又はアミノ酸残基３６０とアミノ酸残基２６１との間、アミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間、又はアミノ酸残基２８５とアミノ酸残基２８５との間、及び／又はアミノ酸残基３３１とアミノ酸残基３３２との間で切断されたもの、
ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である。
タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基２３２との間、又はアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間、アミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又はアミノ酸残基７２とアミノ酸残基７３との間、又はアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又はアミノ酸残基９０とアミノ酸残基９１との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間、又はアミノ酸残基３２０とアミノ酸残基３２１との間、又はアミノ酸残基３２３とアミノ酸残基３２４との間、又はアミノ酸残基３６０とアミノ酸残基２６１との間、アミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間、又はアミノ酸残基２８５とアミノ酸残基２８５との間、及び／又はアミノ酸残基３３１とアミノ酸残基３３２との間で切断されたもの、
ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である。
【0042】
したがって、本発明の方法において検出されるα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片は、そのＮ末端として残基３９、残基５３、又は残基７６を含み、及び／又はそのＣ末端として残基５３、残基７２、又は残基９０を含む。しかしながら、Ｎ末端が残基５３である場合、Ｃ末端は残基５３ではなく、かつＮ末端が残基７６である場合、Ｃ末端は残基５３でも残基７２でもない。本発明の方法において検出されるタウの断片は、そのＮ末端として残基２８１又は残基３０６を含み、及び／又はそのＣ末端として残基３２２を含む。本発明の方法において検出されるＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片は、そのＮ末端として残基３１１を含み、及び／又はそのＣ末端として残基３２０若しくは残基３３４を含み、又はそのＮ末端として残基２４６を含み、及び／又はそのＣ末端として残基２５５を含む。本発明の方法において検出されるＭＢＰ（配列番号２０）の断片は、そのＮ末端として残基３０を含み、及び／又はそのＣ末端として残基７０を含む。
【0043】
好都合には、断片は、
タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたもの、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である。
タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたもの、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である。
【0044】
好都合には、工程ｉｉ）において、作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質又は活性化物質であり、かつ工程ｉｉ）は、ＭＰＳ細胞の試料を炎症性活性化物質に加えて作用物質に曝露することを含む。
【0045】
有利には、炎症性活性化物質はＬＰＳである。
【0046】
好ましくは、コントロールＭＰＳ細胞は、方法の工程ｉ）及び工程ｉｉ）を経た細胞であるが、但し、コントロールＭＰＳ細胞は、作用物質には曝露されていない。
【0047】
好都合には、方法は、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対する一連の作用物質の効果を比較し、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対して最大の効果を有する作用物質を特定するものである。
【0048】
有利には、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである。
【0049】
好都合には、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の診断において使用するものである。
【0050】
好ましくは、方法は、個別化医療において作用物質がヒト被験体に有効な治療であるかどうかを判定するのに使用するものであり、ここで、方法の工程ｉ）は、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持することを含み、かつ作用物質のヒト被験体に対する有効性を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する。
【0051】
本発明の第２の態様において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
を含むキットが提供される。
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
を含むキットが提供される。
【0052】
好ましくは、キットは、
Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、
タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、
を含む。
Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、
タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、
を含む。
【0053】
有利には、キットは、配列番号３に特異的な抗体、配列番号４に特異的な抗体、配列番号５に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体を含む。
【0054】
好都合には、配列番号７に特異的な抗体、配列番号８に特異的な抗体、及び配列番号９に特異的な抗体。
【0055】
有利には、キットは、配列番号３に特異的な抗体、配列番号４に特異的な抗体、及び配列番号５に特異的な抗体を含む。
【0056】
好ましくは、キットは、配列番号５に特異的な抗体、配列番号７に特異的な抗体、配列番号８に特異的な抗体、及び配列番号９に特異的な抗体を含む。
【0057】
本明細書において使用される「疾患マーカー産物」という用語は、人体内の分子の異常なレベルが病状と相関している分子を指す。幾つかの実施の形態において、疾患マーカー産物は疾患マーカーのタンパク質又はポリペプチドである。
【0058】
本明細書において使用される「単球食作用系細胞」又は「ＭＰＳ細胞」という用語は、異物の食作用及び分解に関与する自然免疫細胞を指す。これらの細胞は全て骨髄系譜に属し、同様の個体発生分化過程を経て、共通のエピジェネティック修飾が生じ、発生の後期になって初めて異なるサブセットに分化する。ＭＰＳ細胞としては、限定されるものではないが、単球、マクロファージ、ミクログリア、及び様々な種類の組織特異的マクロファージ（例えば、肺胞マクロファージ及び間質性肺マクロファージ）が挙げられ、これらは、例えば皮膚樹状細胞のような他の骨髄性細胞と密接に関連している。
【0059】
本明細書において使用される「中間ドメインペプチド」という用語は、神経変性及び／又はＭＰＳ機能不全、及び／又はその病理、症状、及び／又は効果に関連する、凝集に関連し、かつ触媒作用を受けにくい断片を生成するタンパク質の切断によって生成されたペプチドを指す。例えば、１つの中間ドメインペプチドは、Ａβ１－４２のアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間での切断によって生成される。「中間ドメイン断片」という用語は、「中間ドメインペプチド」という用語と区別なく使用され得る。
【0060】
本明細書において使用される「ＭＰＳ刺激物質」という用語は、ＭＰＳによる食作用及び／又は触媒作用を増加させる作用物質を指す。この用語には、エンドリソソーム酵素の活性を増加させる作用物質が含まれる。
【0061】
本明細書において使用される「ＭＰＳ阻害物質」という用語は、ＭＰＳによる食作用及び／又は触媒作用を減少させる作用物質を指す。この用語には、エンドリソソーム酵素の活性を減少させる作用物質が含まれる。
【0062】
本明細書において使用される「炎症性活性化物質」という用語は、炎症性応答を誘導する作用物質を指す。
【0063】
本明細書において使用される「ＦＦＡＲ４」という用語は、「ロドプシン様」Ｇタンパク質共役受容体（ＧＰＣＲ）ファミリーのメンバーであり、長鎖脂肪酸によって選択的に活性化される遊離脂肪酸受容体を指す。ＦＦＡＲ４は、以前はＧＰＲ１２０として知られていた。その更なる詳細は、Free Fatty Acid Receptors, Springer, 2018, pp33-56（引用することにより本明細書の一部をなす）に見出し得る。
【0064】
本明細書において使用される「α７ ｎＡＣｈＲ」という用語は、５つの同一のα７サブユニットから構成されるニコチン性アセチルコリン受容体を指す。
【0065】
本明細書において使用される「アゴニスト」という用語は、受容体に結合して直接活性化する物質を指す。これには、完全なアゴニスト及び部分的なアゴニスト（すなわち、完全なアゴニストと比較して部分的な効力しか有しないアゴニスト）の両方が含まれる。
【0066】
本明細書において使用される「オメガ－３脂肪酸」という用語は、末端メチル基から３原子離れたところに二重結合が存在することによって特徴付けられるｎ－３多価不飽和脂肪酸を指す。
【0067】
本明細書において使用される「ポジティブモジュレーター」という用語は、標的タンパク質に対する一次リガンドの効果を間接的に増加させる物質を指す。
【0068】
本明細書において使用される「ポジティブアロステリックモジュレーター」という用語は、オルソステリック結合部位とは異なる部位に結合することにより、標的タンパク質を直接活性化することなしに、該タンパク質に対するアゴニストの効果の増加を間接的に誘導させる物質を指す。
【0069】
本明細書において使用される「その薬学的に許容可能な塩」という用語は、遊離型化合物を酸又は塩基と反応させることによって形成される塩を意味する。薬学的に許容可能な塩の例として、フッ化水素酸塩、塩酸塩、臭化水素酸塩、及びヨウ化水素酸塩等のハロゲン化水素酸塩；塩酸塩、硝酸塩、過塩素酸塩、硫酸塩、及びリン酸塩等の無機酸塩；メタンスルホン酸塩、トリフルオロメタンスルホン酸塩、及びエタンスルホン酸塩等の低級アルカンスルホン酸塩；ベンゼンスルホン酸塩、及びｐ－トルエンスルホン酸塩等のアリールスルホン酸塩；酢酸塩、リンゴ酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩、シュウ酸塩、及びマレイン酸塩等の有機酸塩；ナトリウム塩、カリウム塩、及びリチウム塩等のアルカリ金属塩；カルシウム塩、及びマグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩；アルミニウム塩、及び鉄塩等の金属塩；アンモニウム塩等の無機塩；ｔ－オクチルアミン塩、ジベンジルアミン塩、モルホリン塩、グルコサミン塩、フェニルグリシンアルキルエステル塩、エチレンジアミン塩、Ｎ－メチルグルカミン塩、グアニジン塩、ジエチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、Ｎ，Ｎ’－ジベンジルエチレンジアミン塩、クロロプロカイン塩、プロカイン塩、ジエタノールアミン塩、Ｎ－ベンジルフェネチルアミン塩、ピペラジン塩、テトラメチルアンモニウム塩、及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩等の有機塩を含むアミン塩；並びにグリシン塩、リジン塩、アルギニン塩、オルニチン塩、グルタミン酸塩、及びアスパラギン酸塩等のアミノ酸塩が挙げられる。
【0070】
本明細書において使用される「医薬組成物」という用語は、意図されるヒト又は動物の被験体に対する治療目的の投与に適した医薬製剤を意味する。幾つかの実施の形態において、医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。
【図面の簡単な説明】
【0071】
【図1】二量体化Ａβ１－４２の二次構造（非特許文献１６）、Ａβ１－４２（配列番号１）の一次構造、抗体が産生されたエピトープ（配列番号２～配列番号４）、及びＡＤを引き起こすＡβ１－４２における最も一般的な突然変異の位置を示す図である。
【図2】単球において見られるＡβペプチドのペプチド結合切断パターンを示す図である。四角形は、Ａβ１－４２内のペプチドについてのペプチド結合切断（ｐｂｂ）を示すのに対して、菱形はＡＰＰ配列全体のペプチドからのｐｂｂである。ｘ軸はペプチド結合の数を示し、ｙ軸は各ペプチド結合が破断された回数を示す。ボックス内の数字は、最も頻度の高い切断部位を強調している。
【図3】Ａβ及びタウの細胞内触媒作用経路を示す図である。
【図4】Ａβ２０－ｘ（Ａ）、Ａβｘ－３４（Ｂ）、及びＡβｘ－４０（Ｃ）のそれぞれの分解に対するエンドリソソーム酵素阻害物質（バフィロマイシン）及びオートファゴソーム活性化物質（ラパマイシン）の効果を示す図である。
【図5】Ａβ２０－ｘ（Ａ）、Ａβｘ－３４（Ｂ）、及びＡβｘ－４０（Ｃ）のそれぞれの分解に対する様々なエンドリソソーム酵素阻害物質（ＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質）及びそれらの３種の組合せの効果を示す図である。
【図6】Ａβ２０－ｘ（Ａ）、Ａβｘ－３４（Ｂ）、及びＡβｘ－４０（Ｃ）のそれぞれの分解に対する、ＦＦＡＲ４アゴニスト（ＤＨＡ）、α７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ（ＮＳ１７３８）、並びにＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭの組合せ（ＤＨＡ＋ＮＳ１７３８）のそれぞれの効果を示す図である。
【図7】Ａβ２０－ｘ（Ａ）、Ａβｘ－３４（Ｂ）、及びＡβｘ－４０（Ｃ）のそれぞれの分解に対するＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭの組合せ（ＤＨＡ＋ＮＳ１７３８）の効果と、エンドリソソーム酵素阻害物質（バフィロマイシン）及びオートファゴソーム活性化物質（ラパマイシン）の効果との比較を示す図である。
【図8】Ａβ２０－ｘ（Ａ）、Ａβｘ－３４（Ｂ）、及びＡβｘ－４０（Ｃ）のそれぞれの分解に対する、ＬＰＳによって誘導される炎症性活性化を背景とするＦＦＡＲ４アゴニスト（ＤＨＡ）、α７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ（ＮＳ１７３８）、並びにＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭの組合せ（ＤＨＡ＋ＮＳ１７３８）のそれぞれの効果を示す図である。
【図9】実施例４のイムノアッセイにおいて使用されるＡβ断片及び抗体を示す図である。
【図10】実施例４において単球試料を用いて得られた検量線を示す図である。
【図11】細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与する５つの異なる酵素：カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、エンドセリン変換酵素－１（ＥＣＥ－１）、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、及びネプリライシン（ＮＥＰ）によるα－シヌクレインのペプチド結合切断パターンを示す図である。ｘ軸はペプチド結合の数を示し、ｙ軸は各ペプチド結合が破断された回数を示す。
【図13】細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与する４つの異なる酵素：カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、エンドセリン変換酵素－１（ＥＣＥ－１）、及びインスリン分解酵素（ＩＤＥ）によるタウのペプチド結合切断パターンを示す図である。ｘ軸はペプチド結合の数を示し、ｙ軸は各ペプチド結合が破断された回数を示す。
【図14】細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与する４つの異なる酵素：カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、エンドセリン変換酵素－１（ＥＣＥ－１）、及びインスリン分解酵素（ＩＤＥ）によるＭＢＰのペプチド結合切断パターンを示す図である。ｘ軸はペプチド結合の数を示し、ｙ軸は各ペプチド結合が破断された回数を示す。
【発明を実施するための形態】
【0072】
配列表の簡単な説明
配列番号１は、Ａβ１－４２のアミノ酸配列である。
配列番号１は、Ａβ１－４２のアミノ酸配列である。
【0073】
配列番号２は、Ａβ１－４０のアミノ酸配列である。
【0074】
配列番号３は、抗体が産生されたＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0075】
配列番号４は、抗体が産生されたＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0076】
配列番号５は、抗体が産生されたＡβ１－４２（配列番号１）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0077】
配列番号６は、Ａβ１－４２及びＡβ１－４０の中間ドメイン断片、すなわち、Ａβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の残基２０～残基３４のアミノ酸配列である。
【0078】
配列番号７は、抗体が産生されたＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0079】
配列番号８は、抗体が産生されたＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0080】
配列番号９は、Ａβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の中間ドメイン断片を検出するＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）のエピトープのアミノ酸配列である。
【0081】
配列番号１０は、α－シヌクレインのアミノ酸配列である。
【0082】
配列番号１１は、α－シヌクレインの中間ドメイン断片、すなわち、α－シヌクレインの残基３９～残基５３のアミノ酸配列である。
【0083】
配列番号１２は、α－シヌクレインの中間ドメイン断片、すなわち、α－シヌクレインの残基５３～残基７２のアミノ酸配列である。
【0084】
配列番号１３は、α－シヌクレインの中間ドメイン断片、すなわち、α－シヌクレインの残基７６～残基９０のアミノ酸配列である。
【0085】
配列番号１４は、タウのアミノ酸配列である。
【0086】
配列番号１５は、タウの中間ドメイン断片、すなわち、タウの残基３０６～残基３２２のアミノ酸配列である。
【0087】
配列番号１６は、タウの中間ドメイン断片、すなわち、タウの残基２８１～残基３２２のアミノ酸配列である。
【0088】
配列番号１７は、ＴＤＰ－４３のアミノ酸配列である。
【0089】
配列番号１８は、ＴＤＰ－４３の中間ドメイン断片、すなわち、ＴＤＰ－４３の残基３１１～残基３３４のアミノ酸配列である。
【0090】
配列番号１９は、ＴＤＰ－４３の中間ドメイン断片、すなわち、ＴＤＰ－４３の残基２４６～残基２５５のアミノ酸配列である。
【0091】
配列番号２０は、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）のアミノ酸配列である。
【0092】
配列番号２１は、ＭＢＰの中間ドメイン断片、すなわち、残基３０～残基７０のアミノ酸配列である。
【0093】
詳細な説明
本発明がもたらされるのは、目下、驚くべきことに、Ａβ１－４２の残基２０～残基３４（配列番号５）等のいわゆる「中間ドメイン断片」に対応するＡβ１－４２（配列番号１）の断片を、ＭＰＳの機能又は機能不全、Ａβ１－４２の異化及びクリアランスの尺度として使用し、ＭＰＳの様々な点での様々な作用物質の効果を評価することができることが明らかになったからである。特に、Ａβ１－４２の中間ドメイン断片は触媒作用及び分解を受けにくいことが目下明らかになった（図２）。これらの中間ドメイン断片は毒性を保持しており、かつアルツハイマー病（ＡＤ、図１）を引き起こす既知の家族性突然変異と一致するため、これらの断片の触媒作用及びクリアランスを測定及び監視して、ＭＰＳの機能又は機能不全を監視し、ＭＰＳのＡβの触媒作用に対する様々な作用物質の効果を評価するのに有用である。神経変性及びＭＰＳ機能不全に関連する他のタンパク質の中間ドメイン断片（この中間ドメイン断片は凝集及び／又は毒性に関連する）は、触媒作用及びクリアランスを受けにくいことも判明した。したがって、これらの中間ドメイン断片を、ＭＰＳの機能又は機能不全、タンパク質の異化及びクリアランスの尺度として使用し、ＭＰＳの様々な点での様々な作用物質の効果を評価することもできると予想される。
本発明がもたらされるのは、目下、驚くべきことに、Ａβ１－４２の残基２０～残基３４（配列番号５）等のいわゆる「中間ドメイン断片」に対応するＡβ１－４２（配列番号１）の断片を、ＭＰＳの機能又は機能不全、Ａβ１－４２の異化及びクリアランスの尺度として使用し、ＭＰＳの様々な点での様々な作用物質の効果を評価することができることが明らかになったからである。特に、Ａβ１－４２の中間ドメイン断片は触媒作用及び分解を受けにくいことが目下明らかになった（図２）。これらの中間ドメイン断片は毒性を保持しており、かつアルツハイマー病（ＡＤ、図１）を引き起こす既知の家族性突然変異と一致するため、これらの断片の触媒作用及びクリアランスを測定及び監視して、ＭＰＳの機能又は機能不全を監視し、ＭＰＳのＡβの触媒作用に対する様々な作用物質の効果を評価するのに有用である。神経変性及びＭＰＳ機能不全に関連する他のタンパク質の中間ドメイン断片（この中間ドメイン断片は凝集及び／又は毒性に関連する）は、触媒作用及びクリアランスを受けにくいことも判明した。したがって、これらの中間ドメイン断片を、ＭＰＳの機能又は機能不全、タンパク質の異化及びクリアランスの尺度として使用し、ＭＰＳの様々な点での様々な作用物質の効果を評価することもできると予想される。
【0094】
さらに、ＡＤに関連する炎症性活性化とＭＰＳの機能との関係だけでなく、様々な作用物質が炎症性活性化を背景とするＭＰＳを調節する能力も評価することができる。特に、様々な作用物質がＭＰＳ炎症性活性化及びＡβ１－４２異化の両方をどのように変化させるかを評価することが目下可能である。
【0095】
また、驚くべきことに、ヒト被験体から得られた生きたＭＰＳ細胞をＭＰＳ機能及び炎症性活性化の評価において使用することができ、これがＡＤ治療用の個別化医療の開発に有益であることも判明した。特に、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞はｉｎ ｖｉｖｏで存在したのと同じＭＰＳ機能不全を保持している。それというのも、これらは遺伝的変化及びエピジェネティックな変化によって引き起こされるからである。したがって、ヒト被験体からの生きたＭＰＳ細胞をそのヒト被験体のＭＰＳのモデルとして使用することができ、そのヒト被験体を治療する様々な作用物質の効力を評価して、その被験体に対して最も有効な治療の選択を可能にすることができる。
【0096】
上記で論じたように、同様にＭＰＳ機能不全を示すＡＤ以外の神経変性疾患及び炎症性活性化を伴う疾患に関連する疾患マーカー産物及びその断片に関しても、ＭＰＳの同様の評価を行うことができると考えられる。特に、ＭＰＳによる異化によって産生されるこのような他の疾患マーカー産物の断片は、Ａβ１－４２中間ドメイン断片と同様に、毒性を保持し、かつ疾患に影響を与える可能性が高い。
【0097】
方法
一般的に、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法である。方法は、
ｉ）ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、ＭＰＳ細胞による疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含む。
一般的に、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法である。方法は、
ｉ）ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、ＭＰＳ細胞による疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）ＭＰＳ細胞の試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含む。
【0098】
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する。
【0099】
幾つかの実施形態において、工程ｉｉ）の部分工程（すなわち、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露する部分工程、及びＭＰＳ細胞の試料を疾患マーカー産物に曝露する部分工程）を同時に行う。他の実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露する部分工程を行った後に、ＭＰＳ細胞の試料を疾患マーカー産物に曝露する。更なる実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を疾患マーカー産物に曝露した後にＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露する部分工程を行う。
【0100】
ＭＰＳ細胞
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、細胞バンク又はヒト被験体から得られたものであってもよい。実施例５に示されるように、本発明の方法を使用して、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞における疾患マーカー産物の断片を確実に検出することができる。ヒトドナーから得られる場合に、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、血液試料又はＣＳＦ試料から分離されたものであってもよい。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料は血液試料から得られる。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は同じ供給源から得られたものであり、例えば、どちらも同じヒト被験体からの血液試料又はＣＳＦ試料から得られたものである。したがって、幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞はどちらも、ヒト被験体からの血液試料から得られたものである。特に、血液試料はＣＳＦ試料よりも収集が容易であり、収集するのにより侵襲性が低い。
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、細胞バンク又はヒト被験体から得られたものであってもよい。実施例５に示されるように、本発明の方法を使用して、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞における疾患マーカー産物の断片を確実に検出することができる。ヒトドナーから得られる場合に、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、血液試料又はＣＳＦ試料から分離されたものであってもよい。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料は血液試料から得られる。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は同じ供給源から得られたものであり、例えば、どちらも同じヒト被験体からの血液試料又はＣＳＦ試料から得られたものである。したがって、幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞はどちらも、ヒト被験体からの血液試料から得られたものである。特に、血液試料はＣＳＦ試料よりも収集が容易であり、収集するのにより侵襲性が低い。
【0101】
血液試料及びＣＳＦ試料からＭＰＳ細胞を分離する方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、フローサイトメトリー、磁気抽出、密度勾配遠心分離、ビーズ分離、「ＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ」、プラスチックへの付着、又は抗体の使用によるものである。
【0102】
ＭＰＳ細胞の試料がヒト被験体から得られる場合、ヒト被験体は健康であっても、又は神経変性疾患及び／又は炎症性活性化を患っているか、又はそれを患っている疑いがあってもよい。幾つかの実施形態において、ヒト被験体は、ＡＤ、パーキンソン病（ＰＤ）、多発性硬化症、前側頭型認知症、又は筋萎縮性側索硬化症を患っている疑いがあっても、又はそれらを患っていると診断されていてもよい。
【0103】
細胞型
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、脳ＭＰＳ細胞又は末梢ＭＰＳ細胞であってもよい。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、マクロファージ、単球、又はミクログリア細胞である。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、単球である。ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は同じ型であっても、又は異なる型であってもよいが、好ましい実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞はどちらも単球である。
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、脳ＭＰＳ細胞又は末梢ＭＰＳ細胞であってもよい。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、マクロファージ、単球、又はミクログリア細胞である。好ましくは、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して、単球である。ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は同じ型であっても、又は異なる型であってもよいが、好ましい実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞はどちらも単球である。
【0104】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を分化させる工程を含む。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を分化させる工程を行った後に、細胞を疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する。ＭＰＳ細胞がヒト被験体から得られたものである実施形態において、ヒト被験体から得られた試料からのＭＰＳ細胞を分離した後に、ＭＰＳ細胞を分化させる工程を行ってから、細胞を疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する。
【0105】
幾つかの実施形態において、細胞バンク又はヒト被験体から得られたヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）を、ミクログリア、単球、又はマクロファージ等のＭＰＳ細胞に分化させる。ヒト被験体から得られたｈｉＰＳＣは、好ましくは、ヒト被験体から得られた線維芽細胞に由来する。例えば、ｈｉＰＳＣをミクログリアに分化させることができる。代替的には、ｈｉＳＰＣを単球に分化させ、任意に更にマクロファージに分化させることができる。ｈｉＰＳＣを生成する方法、及びｈｉＰＳＣをＭＰＳ細胞に分化させる方法は既知であり、いずれも本発明の方法において使用することができる。
【0106】
幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、独立して単球であり、本発明の方法は、単球をマクロファージに分化させる工程を含む。単球は、上記で論じたようにｈｉＰＳＣに由来するものであってもよく、又は細胞バンク若しくはヒト被験体から直接得られたものであってもよい。単球をマクロファージに分化させる当該分野において知られるあらゆる方法を使用することができる。
【0107】
ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下でのＭＰＳ細胞の維持
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞を、ＭＰＳ細胞を生きた状態に保つのに適切な培地に播種する。このような適切な培地は当該技術分野において知られており、例えば、ＲＰＭＩ １６４０又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＢＭ）であり得る。細胞を成長させる必要はないが、ＭＰＳの機能及び細胞の任意の作用物質への曝露の効果を効果的に評価することができるように、細胞が生きたままとなることが必要とされる。さらに、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞がヒト被験体から得られたものである場合、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト被験体のＭＰＳ細胞に影響を与えるあらゆる遺伝的変化又はエピジェネティックな変化は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されるため、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞はヒト被験体のＭＰＳのモデルを提供する。
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞を、ＭＰＳ細胞を生きた状態に保つのに適切な培地に播種する。このような適切な培地は当該技術分野において知られており、例えば、ＲＰＭＩ １６４０又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＢＭ）であり得る。細胞を成長させる必要はないが、ＭＰＳの機能及び細胞の任意の作用物質への曝露の効果を効果的に評価することができるように、細胞が生きたままとなることが必要とされる。さらに、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞がヒト被験体から得られたものである場合、ｉｎ ｖｉｖｏでヒト被験体のＭＰＳ細胞に影響を与えるあらゆる遺伝的変化又はエピジェネティックな変化は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞においてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持されるため、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞はヒト被験体のＭＰＳのモデルを提供する。
【0108】
方法がＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を分化させる工程を含む場合、この分化工程を行った後に、それぞれのＭＰＳ細胞を疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する工程を行うことができる。言い換えると、ＭＰＳ細胞を分化させる工程を行った後に、方法の工程ｉｉ）を行うことができる。幾つかの実施形態において、細胞を分化させる工程は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を生きたままとなる条件下で維持する工程（方法の工程ｉ））中に行われる。したがって、幾つかの実施形態において、方法の工程ｉ）は、単球であるＭＰＳ細胞の試料をマクロファージに分化させることと、ＭＰＳ細胞の試料をＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持することとを含む。したがって、ＭＰＳ細胞を生きたままとなる条件下で維持する工程は、未分化の細胞（すなわち、単球）及び分化した細胞（たとえば、マクロファージ）の両方に適用される。
【0109】
幾つかの実施形態において、単球であるＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞をマクロファージに分化させる工程は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール１３－アセテート（ＴＰＡ）又はマクロファージコロニー刺激物質（ＭＣＳＦ）に曝露した後に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露することを含む。好ましくは、単球がｈｉＰＳＣ由来の単球である場合、単球をＭＣＳＦに曝露して、これらをマクロファージに分化させる。幾つかの実施形態において、細胞をＴＰＡに曝露した０時間～１４時間後に、これらを疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する。細胞をＴＰＡに曝露した０時間後に、これらを疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する場合、これは、ＴＰＡを細胞に添加した直後に、細胞を疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片と、適宜、作用物質とに曝露する工程を行うことを意味する。
【0110】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を培養して、細胞を成長させる工程を含む。
【0111】
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、最大４８時間、最大３６時間、最大２４時間、最大１２時間、最大１１時間、最大１０時間、最大９時間、最大８時間、最大７時間、最大６時間、最大５時間、最大４時間、最大３時間、最大２時間、又は最大１時間生きたままにすることができるか、又は培養することができる。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、最低でも３０分間、又は最低でも１時間生きたままにすることができるか、又は培養することができる。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、又は１０時間、好ましくは６時間生きたままにすることができるか、又は培養することができる。幾つかの実施形態において、細胞を得た直後に、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露し、コントロールＭＰＳ細胞を疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露する。
【0112】
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を凍結させ、引き続き融解させた後に、細胞を生きたままとなる条件下で維持することができる。
【0113】
作用物質及び疾患マーカー産物への曝露
ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露する。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露した後に、これを疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露する。
ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露する。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露した後に、これを疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露する。
【0114】
コントロールＭＰＳ細胞は、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露されるが、作用物質には曝露されない。
【0115】
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞の曝露は、好ましくは、細胞が生き続ける条件下で行われる。
【0116】
幾つかの実施形態において、方法は、適宜、作用物質及び／又は疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露している間にＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を培養する工程を含む。
【0117】
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に１時間～４時間、好ましくは２時間曝露する。
【0118】
ＭＰＳ細胞の試料を、作用物質に１時間～１６時間、好ましくは４時間曝露する。
【0119】
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に１０ｎｇ／ｍｌ～１０００ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ～７５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ～７５０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ～６００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～５００ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～２５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、又は１００ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露することができる。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は１００ｎｇ／ｍｌ又は５００ｎｇ／ｍｌの濃度である。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の濃度は１００ｎｇ／ｍｌである。２つ以上の疾患マーカー産物及び／又はそれらの少なくとも１つの断片が使用される場合（例えば、疾患マーカー産物及び／又はその１つの断片、又は疾患マーカー産物の２つの断片）、それぞれは上記の濃度であってもよい。
【0120】
ＭＰＳ細胞の試料を、作用物質に５０ｎＭ～２００μＭ、５０ｎＭ～１５０μＭ、５０ｎＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～１００μＭ、２００ｎＭ～１００μＭ、１００ｎＭ～１μＭ、又は２００ｎｍ～１μＭの濃度で曝露することができる。幾つかの実施形態において、作用物質は１００ｎＭ、２００ｎＭ、１μＭ、１０μＭ、又は１００μＭの濃度である。
【0121】
ＭＰＳ細胞の試料を、作用物質に５０ｎｇ／ｍｌ～２００ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、７５ｎｇ／ｍｌ～１５０ｎｇ／ｍｌ、又は７５ｎｇ／ｍｌ～１００ｎｇ／ｍｌの濃度で曝露することができる。幾つかの実施形態において、作用物質は５０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、又は１５０ｎｇ／ｍｌの濃度である。
【0122】
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の検出
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞における細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を検出する工程を、当該技術分野において知られるあらゆる技術を使用して実施することができる。例えば、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する工程は、イムノアッセイ、質量分析技術、ウェスタンブロット等の半定量的技術、顕微鏡法、フローサイトメトリー、又はＥＬＩＳＡ技術を使用することができる。ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、作用物質及び／又は疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露している間に細胞を生きた状態に保つ条件下で維持するが、細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を検出する工程は、典型的には、細胞の溶解を必要とする。
ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞における細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を検出する工程を、当該技術分野において知られるあらゆる技術を使用して実施することができる。例えば、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する工程は、イムノアッセイ、質量分析技術、ウェスタンブロット等の半定量的技術、顕微鏡法、フローサイトメトリー、又はＥＬＩＳＡ技術を使用することができる。ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、作用物質及び／又は疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露している間に細胞を生きた状態に保つ条件下で維持するが、細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を検出する工程は、典型的には、細胞の溶解を必要とする。
【0123】
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する工程は、疾患マーカー産物及び／又はその断片のあらゆる部分を検出することができる。幾つかの実施形態において、検出は、疾患マーカー産物及び／又はその断片の１つの末端、例えば、タンパク質又はペプチドである疾患マーカー産物及び／又はその断片のＮ末端又はＣ末端を検出することを含む。
【0124】
幾つかの実施形態において、方法は、疾患マーカー産物の少なくとも１つの断片を検出することを含み得る。幾つかの実施形態において、方法は、疾患マーカー産物の２つ以上の断片を検出することを含む。好ましくは、方法は、疾患マーカー産物の２つ、より好ましくは３つの断片を検出することを含む。
【0125】
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する工程は、当該技術分野において知られるあらゆる適切な検出技術を使用することができる。幾つかの実施形態において、細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する工程は抗体検出を使用する。
【0126】
本発明の方法は、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を洗浄する工程と、細胞溶解物を生成する工程との後に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程を含み得る。方法は、追加的に又は代替的に、溶解物を、例えば－８０℃で凍結させる工程の後に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程を含む。溶解物が凍結された後に検出工程を行う場合、溶解物を解凍した後に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程を行う。
【0127】
作用物質
ＭＰＳ細胞の試料が曝露される作用物質は、既知の又は疑いのあるＭＰＳモジュレーター（例えば、刺激物質又は阻害物質）又は炎症性活性化物質であり得る。ＭＰＳモジュレーターは、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系を調節する。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料が曝露される作用物質は、作用物質又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物である。
ＭＰＳ細胞の試料が曝露される作用物質は、既知の又は疑いのあるＭＰＳモジュレーター（例えば、刺激物質又は阻害物質）又は炎症性活性化物質であり得る。ＭＰＳモジュレーターは、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系を調節する。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料が曝露される作用物質は、作用物質又はその薬学的に許容可能な塩を含む医薬組成物である。
【0128】
幾つかの実施形態において、ＭＰＳモジュレーターは、ラパマイシン、ラパマイシン類似体（いわゆる「ラパログ」）、ＦＦＡＲ４アゴニスト、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）、バフィロマイシン、ＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質若しくはＢＡＣＥ阻害物質、又はそれらの２つ以上の組合せである。
【0129】
幾つかの実施形態において、ＭＰＳモジュレーターはＭＰＳ刺激物質である。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ刺激物質は、ラパマイシン、ラパマイシン類似体（いわゆる「ラパログ」）、ＦＦＡＲ４アゴニスト若しくはα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはポジティブアロステリックモジュレーター（ＰＡＭ）、又はそれらの２つ以上の組合せである。幾つかの実施形態において、作用物質は、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭの組合せである。幾つかの実施形態において、作用物質は、ラパマイシン、ＤＨＡ等のＰＵＦＡ、ＮＳ１７３８、又はＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せである。特に、ラパマイシンはマクロオートファジーを強化することが知られており（Spilman et al, 2010、非特許文献１７）、図４は、ラパマイシンがＡβ断片のＡβｘ－３４のクリアランスを増加させることを示している。さらに、ＤＨＡはＡβ１－４２の食作用及び分解を増加させることが明らかになっている（特許文献１）。図６は、ＭＰＳ細胞をＤＨＡ単独に曝露すると、Ａβ断片のＡβｘ－３４の量が減少し、ＤＨＡをα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ ＮＳ１７３８と組み合わせて投与すると、Ａβ断片のＡβ２０－ｘ、Ａβｘ－３４、及びＡβｘ－４０の３つ全ての量が大幅に減少することを示している。さらに、α７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ ＮＳ１７３８単独で処理すると、Ａβ断片のＡβｘ－３４の量が減少する。したがって、ラパマイシン、ＤＨＡ、及び／又はＮＳ１７３８を、ＭＰＳ機能を評価する、特に特定のヒト被験体のＭＰＳ機能及び様々な治療に対するヒト被験体のＭＰＳ機能の調節を評価する作用物質として使用することができる。さらに、図８は、ＬＰＳによって誘導される炎症性活性化の存在下で、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８が３つのＡβ断片のＡβ２０－ｘ、Ａβｘ－３４、及びＡβｘ－４０のレベルに影響を及ぼし続けるため、本発明の方法を使用して、炎症性活性化を背景とするＭＰＳ機能に対する作用物質の効果を評価することができることを示している。
【0130】
幾つかの実施形態において、ＭＰＳモジュレーターはＭＰＳ阻害物質である。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ阻害物質は、バフィロマイシン、ＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質若しくはＢＡＣＥ阻害物質、又はそれらの２つ以上の組合せである。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ阻害物質は、ＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質の組合せである。特に、図４及び図５は、これらのＭＰＳ阻害物質がＡβ断片のＡβ２０－ｘ及びＡβｘ－４０の量を増加させること、並びに様々な阻害物質が様々なＡβ断片のレベルに影響を与えることを示している。したがって、ＭＰＳ阻害物質を使用して、ＭＰＳ機能をその様々な点で評価することができる。
【0131】
代替的に、作用物質は炎症性活性化物質であり得る。幾つかの実施形態において、炎症性活性化物質は、リポ多糖（ＬＰＳ）、ＴＰＡ、又はビグリカン、ヒアルロナン、ヘパラン硫酸等の損傷関連分子パターン（ＤＡＭＰ）、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、又はＡβ１－４２若しくはＡβ１－４０の断片である。特に、Ａβは炎症誘発性機能を調節し、炎症誘発性サイトカインであるＭＣＰ－１／ＪＥがＡβに応答して放出されることが明らかになっている（Meda et al., 1996）。幾つかの実施形態において、作用物質は、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、又はＡβ１－４２若しくはＡβ１－４０の断片であり、好ましくはＡβ１－４２又はＡβ１－４０である。これらの実施形態において、疾患マーカー産物は、以下に記載されるＡβ１－４２、Ａβ１－４０、又はＡβ１－４２若しくはＡβ１－４０のあらゆる断片のいずれかであり得る。好ましくは、炎症性活性化物質はＬＰＳである。
【0132】
幾つかの実施形態において、作用物質はＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質であり、ＭＰＳ細胞の試料を作用物質に曝露する工程は、ＭＰＳ細胞の試料を炎症性活性化物質に曝露することを更に含む。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を、ＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質、及び炎症性活性化物質に曝露し、コントロールＭＰＳ細胞を、同じＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質に曝露するが、炎症性活性化物質には曝露しない。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を、ＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質、及び炎症性活性化物質に曝露し、コントロールＭＰＳ細胞を、同じ炎症性活性化物質に曝露するが、ＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質には曝露しない。幾つかの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料を、ＭＰＳ刺激物質又はＭＰＳ阻害物質、及び炎症性活性化物質に曝露し、コントロールＭＰＳ細胞を、ＭＰＳ刺激物質、ＭＰＳ阻害物質、及び炎症性活性化物質のいずれにも曝露しない。図８に示されるように、治療的介入を、炎症性活性化の文脈におけるＭＰＳに対するそれらの効果について評価することができる。これは、ＭＰＳ機能、及び炎症性背景があるＭＰＳ機能に対する候補となる治療的介入等の作用物質の効果を評価することができるという利点をもたらす。これにより、ｉｎ ｖｉｖｏのＭＰＳ機能のより正確なモデルが提供される。さらに、本発明の方法は、神経変性病態以外の、炎症性活性化及びＭＰＳ機能不全に関連する病態を、ＭＰＳによるクリアランスから生じる関連する疾患マーカー産物の断片を検出することによって研究することができることを意味する。このような炎症性病態に対する候補となる介入のＭＰＳ機能に対する効果を評価することもできる。
【0133】
幾つかの実施形態において、方法は、同じ供給源からのＭＰＳ細胞の試料を一連の作用物質に曝露することと、ＭＰＳ機能に対する各作用物質の効果を比較することとを含む。これは、ＭＰＳ細胞の試料を多数の部分試料に分けることを含み得る。したがって、幾つかの実施形態において、方法は、ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下でＭＰＳ細胞の２つ以上の試料を維持することと、ＭＰＳ細胞の各試料を同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片に曝露することと、ＭＰＳ細胞の各試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することと、ＭＰＳ細胞の各試料を様々な作用物質に曝露することと、ＭＰＳ細胞の各試料における疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を互いに比較するだけでなく、一切の作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞とも比較することとを含む。したがって、本発明の方法は、一連の作用物質の中でどの作用物質がＭＰＳ機能に対して最も大きな効果（すなわち、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用）を有するか、又はＭＰＳ機能を所望のように変更するかを特定するためのものであり得る。
【0134】
ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞の比較
ＭＰＳ細胞の試料において検出された細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を、コントロールＭＰＳ細胞において検出された細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量と比較する。２つの量の差は、ＭＰＳ細胞の試料に投与された作用物質のＭＰＳに対する効果、及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用を示すことから、それによりＭＰＳの機能性の指標が提供される。検出された断片の種類によって、ＭＰＳの機能性、詳細には、神経変性及び／又は炎症性活性化によって影響が与えられるＭＰＳの部分の指標も提供され得る。したがって、検出された疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量、並びに疾患マーカー産物の断片の種類は、ＭＰＳ細胞の試料が曝露された作用物質の効果を示す。特に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量の差は、ＭＰＳ細胞の試料が曝露された作用物質によって影響が与えられる特定のエンドリソソーム酵素の指標となる。さらに、方法が、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を炎症性活性化物質に曝露する工程を含む場合、細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量の差は、この作用物質が炎症性活性化とどのように相互作用してＭＰＳに影響を与えるかを示すこともできる。
ＭＰＳ細胞の試料において検出された細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量を、コントロールＭＰＳ細胞において検出された細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量と比較する。２つの量の差は、ＭＰＳ細胞の試料に投与された作用物質のＭＰＳに対する効果、及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用を示すことから、それによりＭＰＳの機能性の指標が提供される。検出された断片の種類によって、ＭＰＳの機能性、詳細には、神経変性及び／又は炎症性活性化によって影響が与えられるＭＰＳの部分の指標も提供され得る。したがって、検出された疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量、並びに疾患マーカー産物の断片の種類は、ＭＰＳ細胞の試料が曝露された作用物質の効果を示す。特に、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量の差は、ＭＰＳ細胞の試料が曝露された作用物質によって影響が与えられる特定のエンドリソソーム酵素の指標となる。さらに、方法が、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を炎症性活性化物質に曝露する工程を含む場合、細胞内疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の量の差は、この作用物質が炎症性活性化とどのように相互作用してＭＰＳに影響を与えるかを示すこともできる。
【0135】
疾患マーカー産物及びその断片
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連している。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び関連する神経変性及び／又は炎症性活性化は、ＭＰＳ機能不全、及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の異常なクリアランスと関連している。好ましくは、神経変性は炎症性活性化と関連している。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、炎症性病態若しくは炎症性疾患、自己免疫疾患、又はＲＮＡウイルス感染症等の感染性疾患に関連している。幾つかの実施形態において、神経変性及び／又は炎症性活性化、及び妥当な関連する疾患マーカー産物は、以下のうちの１つである：
ＡＤ：Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、タウタンパク質、又はα－シヌクレイン、
アミロイド血管症：Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、基底層タンパク質、脂質、及びリポタンパク質、
ＰＤ：ユビキチン、タウタンパク質、又はα－シヌクレイン、
多発性硬化症：ミエリン塩基性タンパク質、
前頭側頭型認知症：タウタンパク質又はＴＤＰ－４３、
筋萎縮性側索硬化症：タウタンパク質又はＴＤＰ－４３、
レビー小体型認知症：α－シヌクレイン、
血管性認知症（アミロイド血管症、アテローム性動脈硬化症、及び動脈硬化症）を含む炎症成分を伴う血管変性疾患：基底層タンパク質、脂質、及びリポタンパク質、
多系統萎縮症：α－シヌクレイン、
進行性核上性麻痺：タウタンパク質、
ＲＮＡウイルス感染症：カプシドタンパク質。
疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連している。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び関連する神経変性及び／又は炎症性活性化は、ＭＰＳ機能不全、及び疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の異常なクリアランスと関連している。好ましくは、神経変性は炎症性活性化と関連している。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、炎症性病態若しくは炎症性疾患、自己免疫疾患、又はＲＮＡウイルス感染症等の感染性疾患に関連している。幾つかの実施形態において、神経変性及び／又は炎症性活性化、及び妥当な関連する疾患マーカー産物は、以下のうちの１つである：
ＡＤ：Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、タウタンパク質、又はα－シヌクレイン、
アミロイド血管症：Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、基底層タンパク質、脂質、及びリポタンパク質、
ＰＤ：ユビキチン、タウタンパク質、又はα－シヌクレイン、
多発性硬化症：ミエリン塩基性タンパク質、
前頭側頭型認知症：タウタンパク質又はＴＤＰ－４３、
筋萎縮性側索硬化症：タウタンパク質又はＴＤＰ－４３、
レビー小体型認知症：α－シヌクレイン、
血管性認知症（アミロイド血管症、アテローム性動脈硬化症、及び動脈硬化症）を含む炎症成分を伴う血管変性疾患：基底層タンパク質、脂質、及びリポタンパク質、
多系統萎縮症：α－シヌクレイン、
進行性核上性麻痺：タウタンパク質、
ＲＮＡウイルス感染症：カプシドタンパク質。
【0136】
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及びその少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物の１つ以上の断片、例えば、２つの断片又は３つの断片を検出する。２つ以上の断片を検出する場合、２つ以上の断片は、重複するアミノ酸のストレッチを含み得る（すなわち、２つ以上の断片は、断片に共通のアミノ酸のストレッチを含む）。代替的には、２つ以上の断片を検出する場合、２つ以上の断片は、２つ以上の断片間で重複しないアミノ酸のストレッチを含み得る（すなわち、２つ以上の断片は、共通のアミノ酸のストレッチを含まない）。これは、ＭＰＳ機能及び異化の様々な点に対する作用物質の効果を評価するのに有利である。
【0137】
幾つかの実施形態において、２つ以上の異なる疾患マーカー産物を検出する。幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物及び異なる疾患マーカー産物の少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、異なる疾患マーカー産物の２つ以上の断片を検出する。疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のそれぞれを上記リストから選択することができる。これらの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及び／又はコントロールＭＰＳ細胞を、単一の多重化試験又は部分試料に対する別個の試験のいずれかにおいて２つ以上の異なる疾患マーカー産物及び／又はそれらの断片に曝露し、細胞内量を比較する工程（すなわち、工程ｉｖ）は、ＭＰＳ細胞の試料における各疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、コントロールＭＰＳ細胞における同じ又は対応する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較することを含む。
【0138】
幾つかの実施形態において、適宜、疾患マーカー産物及び／又はその断片のそれぞれに、ＭＰＳ細胞の別個の試料を使用する。幾つかの実施形態において、適宜、疾患マーカー産物（複数の場合もある）及び／又はその各断片の検出を多重化して、同時の検出を可能にする。
【0139】
Ａβ
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）、好ましくはＡβ１－４０（配列番号２）である。特に、実施例は、Ａβ１－４０（配列番号２）の幾つかの様々な断片を検出することができ、そのクリアランスに対する様々な作用物質の効果を評価することができることを示している。したがって、これらの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料が、神経変性疾患を患っていることが疑われるヒト被験体、又は神経変性疾患を患っていると診断されたヒト被験体から得られる場合、神経変性疾患はＡＤである。特に、上記で論じたように、Ａβ１－４２及びＡβ１－４０のより短い断片は毒性を保持しているため、これらは測定可能なＡβの触媒作用における岐路となる。Ａβ１－４２及びＡβ１－４０は、例えば残基１８と残基１９との間、残基１９と残基２０との間、残基２０と残基２１との間、残基３３と残基３４との間、及び／又は残基３４と残基３５との間の切断によって、中間ドメイン断片に異化されることが知られているため（非特許文献１５、Henjum et al., 2020）、中間ドメイン断片のＮ末端及び／又はＣ末端の検出によって触媒作用産物を検出することが可能である。これらの中間ドメイン断片はＭＰＳによる触媒作用の影響を受けにくいため、これらの中間ドメイン断片はＭＰＳ細胞において細胞内に保持され、したがって検出可能であることが予想される。したがって、上記で論じたように、ＡβのクリアランスにおけるＭＰＳの機能及び効力だけでなく、ＭＰＳに対する様々な作用物質の効果及び炎症との相互作用も評価することが可能である。
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）、好ましくはＡβ１－４０（配列番号２）である。特に、実施例は、Ａβ１－４０（配列番号２）の幾つかの様々な断片を検出することができ、そのクリアランスに対する様々な作用物質の効果を評価することができることを示している。したがって、これらの実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料が、神経変性疾患を患っていることが疑われるヒト被験体、又は神経変性疾患を患っていると診断されたヒト被験体から得られる場合、神経変性疾患はＡＤである。特に、上記で論じたように、Ａβ１－４２及びＡβ１－４０のより短い断片は毒性を保持しているため、これらは測定可能なＡβの触媒作用における岐路となる。Ａβ１－４２及びＡβ１－４０は、例えば残基１８と残基１９との間、残基１９と残基２０との間、残基２０と残基２１との間、残基３３と残基３４との間、及び／又は残基３４と残基３５との間の切断によって、中間ドメイン断片に異化されることが知られているため（非特許文献１５、Henjum et al., 2020）、中間ドメイン断片のＮ末端及び／又はＣ末端の検出によって触媒作用産物を検出することが可能である。これらの中間ドメイン断片はＭＰＳによる触媒作用の影響を受けにくいため、これらの中間ドメイン断片はＭＰＳ細胞において細胞内に保持され、したがって検出可能であることが予想される。したがって、上記で論じたように、ＡβのクリアランスにおけるＭＰＳの機能及び効力だけでなく、ＭＰＳに対する様々な作用物質の効果及び炎症との相互作用も評価することが可能である。
【0140】
したがって、幾つかの実施形態において、方法は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の２つ以上の断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、方法は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の２つの断片、好ましくは３つの断片を検出することを含む。
【0141】
方法は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がそれらのアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はそれらのアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものであるＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の少なくとも１つの断片を検出することを含み得る。
【0142】
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がそれらのアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間で切断されたものである。これらの断片は、本明細書においては「Ａβ２０－ｘ」と呼称される。これらの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域を検出することによって、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、残基２１を含む上述の領域のいずれか１つを検出するか、又は配列番号６のＮ末端を検出し、更にＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４又は残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸残基を含む断片の領域、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域を検出し、より好ましくは配列番号９を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域を検出し、かつＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号３のＮ末端及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域を検出し、好ましくは配列番号６のＮ末端を検出し、かつ配列番号９を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体を使用して、好ましくは配列番号３に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、好ましくは配列番号９に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号９に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。
【0143】
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がそれらのアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものである。これらの断片は、本明細書においては「Ａβｘ－３４」と呼称される。これらの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３１～残基３４を含む断片の領域を検出することによって、好ましくは配列番号６のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、残基３４を含む上述の領域のいずれか１つ又は配列番号６のＣ末端を検出し、更にＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、より好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＣ末端を検出し、かつＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域を検出することによって、より好ましくは配列番号６のＣ末端を検出し、かつＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＣ末端を検出し、かつ配列番号７を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、好ましくは配列番号４に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体、好ましくは配列番号７に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＣ末端に特異的な抗体、及び配列番号７に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。
【0144】
幾つかの実施形態において、少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及びアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものであるため、少なくとも１つの断片は、配列番号６に示されるアミノ酸配列を有する。これらの実施形態において、配列番号６のＮ末端又はＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端又はＣ末端に特異的な抗体、好ましくは配列番号３又は配列番号４に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片にそのＣ末端で結合する抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつ配列番号６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号３に特異的な抗体、及び配列番号４に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。
【0145】
幾つかの実施形態において、方法は、配列番号１又は配列番号２のＮ末端を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）若しくはＡβ１－４０（配列番号２）又はそれらの少なくとも１つの断片を検出する工程を含む。幾つかの実施形態において、方法は、配列番号１又は配列番号２のＣ末端を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）若しくはＡβ１－４０（配列番号２）又はそれらの少なくとも１つの断片を検出する工程を含む。これらのペプチド及びそれらの断片は、本明細書においては「Ａβｘ－４０」と呼称される。これらの実施形態において、検出は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによるものであり得る。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸の領域を検出することによって、好ましくは配列番号２のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）の残基３９～残基４２、残基３４～残基４０、若しくは残基３４～残基４１を含む断片の領域、又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、残基４０を含む上述の領域のいずれか１つ又は配列番号２のＣ末端を検出し、更にＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、より好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２のＣ末端を検出し、かつＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、より好ましくは配列番号２のＣ末端及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、Ａβ１－４２（配列番号１）の残基３９～残基４２、残基３４～残基４０、若しくは残基３４～残基４１を含む断片の領域、又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０を含む断片の領域を検出し、かつＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、上述の領域のいずれか１つ又は配列番号１若しくは配列番号２のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号５に特異的な抗体、配列番号８に特異的な抗体、又は配列番号９に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号９に特異的な抗体は、配列番号８及び／又は配列番号５にも特異的である。幾つかの実施形態において、配列番号８に特異的な抗体は、配列番号５にも特異的であり、その逆も同様である。幾つかの実施形態において、配列番号７に特異的な抗体、及び配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。
【0146】
幾つかの実施形態において、方法は、Ａβ２０－ｘ、Ａβｘ－３４、及びＡβｘ－４０を検出する工程を含む。他の実施形態において、方法は、Ａβ２０－ｘ及びＡβｘ－３４、Ａβ２０－ｘ及びＡβｘ－４０、又はＡβｘ－３４及びＡβｘ－４０を検出する工程を含む。これらの断片のそれぞれを、上記の方法のいずれかを使用して検出することができる。幾つかの実施形態において、これらの断片のそれぞれを、上記のように、それぞれのＮ末端又はＣ末端に特異的な抗体を使用して検出する。幾つかの実施形態において、これらの断片のそれぞれを、配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、配列番号４に特異的な抗体、及び配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用して検出する。これは、Ａβの様々な断片のクリアランスにおけるＭＰＳの効力を評価し、かつ様々なエンドリソソーム酵素が作用物質によってどのように影響を受けるかを評価するのに有益である。
【0147】
抗体を使用して疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出する方法において、Ａβ１－４０（配列番号２）又はＡβ１－４２（配列番号１）に特異的なより包括的な抗体を、検出方法の一部として使用することができる。
【0148】
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物は、α－シヌクレイン（配列番号１０）、タウ（配列番号１４）、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）、又はＭＢＰ（配列番号１９）である。特に、α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰのそれぞれには、エンドリソソーム酵素による切断の影響を受けにくいと予想される領域があることが判明しており（図１１～図１４）、これらの領域は、神経変性疾患及びＭＰＳ機能不全における凝集及び／又は毒性において重要であると以前に考えられた領域と関連している（上記で論じた）。したがって、目下、これらの中間ドメイン断片はＭＰＳ細胞において細胞内に保持され、検出することができるため、これらの断片はＭＰＳの機能又は機能不全、並びにＭＰＳ及びタンパク質の異化及びクリアランスに対する様々な作用物質の効果を評価するのに有用となることが予想される。さらに、ＴＤＰ－４３の幾つかの領域が凝集に重要であることが知られており（非特許文献３６、非特許文献３７）、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰの分解されにくい断片と、凝集及び／又は毒性に関連する断片との関連性を考慮すると、ＴＤＰ－４３のこれらの領域も分解されにくいことが目下予想される。したがって、ＴＤＰ－４３のこれらの中間ドメイン断片を検出して、ＭＰＳの機能又は機能不全、並びにＭＰＳ及びタンパク質の異化及びクリアランスに対する様々な作用物質の効果を監視及び測定することができると予想される。
【0149】
α－シヌクレイン
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はα－シヌクレイン（配列番号１０）であり、方法は、α－シヌクレイン（配列番号１０）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、図１１及び図１２は、残基３９と残基５３との間には、エンドリソソーム酵素による切断の影響を受けにくい領域があることを示しており、こうして、α－シヌクレインのこの断片は分解されにくく、ＭＰＳ細胞において細胞内で検出される可能性がより高いことが示される。したがって、ＭＰＳ細胞におけるこの断片のレベルを検出及び測定することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価することができる。
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はα－シヌクレイン（配列番号１０）であり、方法は、α－シヌクレイン（配列番号１０）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基５３を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む、好ましくは残基３９～残基４２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、図１１及び図１２は、残基３９と残基５３との間には、エンドリソソーム酵素による切断の影響を受けにくい領域があることを示しており、こうして、α－シヌクレインのこの断片は分解されにくく、ＭＰＳ細胞において細胞内で検出される可能性がより高いことが示される。したがって、ＭＰＳ細胞におけるこの断片のレベルを検出及び測定することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価することができる。
【0150】
幾つかの実施形態において、方法は、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又は残基７２と残基７３との間で切断されたものを検出することを含む。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３～残基５６を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む、好ましくは残基５３～残基５６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＣ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３～残基５６を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む、好ましくは残基５３～残基５６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１２のＮ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１２のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＣ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む、好ましくは残基５３～残基５６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１２のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、図１１及び図１２は、残基５３と残基７２との間には、エンドリソソーム酵素による切断の影響を受けにくい領域があることを示しており、こうして、α－シヌクレインのこの断片は分解されにくく、ＭＰＳ細胞において細胞内で検出される可能性がより高いことが示される。したがって、ＭＰＳ細胞におけるこの断片のレベルを検出及び測定することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価することができる。
【0151】
幾つかの実施形態において、方法は、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又は残基９０と残基９１との間で切断されたものを検出することを含む。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６～残基７９を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む、好ましくは残基７６～残基７９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＮ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＣ末端を検出し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６～残基７９を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む、好ましくは残基７６～残基７９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１３のＮ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１３のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１３のＣ末端に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む、好ましくは残基７６～残基７９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１２のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１３のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、図１１及び図１２は、残基７６と残基９０との間には、エンドリソソーム酵素による切断の影響を受けにくい領域があることを示しており、こうして、α－シヌクレインのこの断片は分解されにくく、ＭＰＳ細胞において細胞内で検出される可能性がより高いことが示される。したがって、ＭＰＳ細胞におけるこの断片のレベルを検出及び測定することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価することができる。
【0152】
幾つかの実施形態において、α－シヌクレイン（配列番号１０）の２つ以上の断片、例えば、２つ以上のα－シヌクレイン（配列番号１０）を検出する。α－シヌクレイン（配列番号１０）の２つ以上の断片のそれぞれは、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、α－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又は残基７２と残基７３との間で切断されたもの、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）がアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又は残基９０と残基９１との間で切断されたもののあらゆる組合せであり得る。断片の上述の領域のいずれかと、Ｎ末端及びＣ末端とをいずれかの組合せで検出することによって、２つ以上の断片を検出することができる。ＭＰＳ細胞におけるα－シヌクレインの２つ以上の中間ドメイン断片の量を検出及び測定することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全をより良好に評価することができる。
【0153】
タウ
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はタウ（配列番号１４）であり、方法は、タウ（配列番号１４）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間、好ましくは残基２８０と残基２８１との間、及び／又は残基３２２と残基３２３との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３０６～残基３０９を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基２８１～残基２８４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端、好ましくは配列番号１６のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端を検出し、かつタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端を検出し、かつタウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６若しくは残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１５若しくは配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１５若しくは配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、タウのＲ３領域（残基３０６～残基３３６）がタウの凝集の誘導において重要であることが以前に明らかになっており、タウの残基２４４～残基３７２により、細胞及び動物モデルにおけるタウの凝集挙動の多くが再現される（非特許文献３５）。タウ（配列番号１４）の残基２８１と残基３２２との間には、凝集に関連し、かつエンドリソソーム酵素による切断を受けにくい領域があることが目下判明している（図１３）。したがって、ＭＰＳの機能又は機能不全、並びにタウの異化及びクリアランスに対する作用物質の効果を、タウのこの中間ドメイン断片の異化及びクリアランスを測定及び監視することによって評価することができると予想される。
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はタウ（配列番号１４）であり、方法は、タウ（配列番号１４）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、タウ（配列番号１４）がアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間、好ましくは残基２８０と残基２８１との間、及び／又は残基３２２と残基３２３との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３０６～残基３０９を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基２８１～残基２８４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端、好ましくは配列番号１６のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端を検出し、かつタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端を検出し、かつタウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、タウ（配列番号１４）の残基３０６若しくは残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１５若しくは配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１５若しくは配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３０６又は残基２８１を含む、好ましくは残基３０６～残基３０９又は残基２８１～残基２８４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１５又は配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１５又は配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。特に、タウのＲ３領域（残基３０６～残基３３６）がタウの凝集の誘導において重要であることが以前に明らかになっており、タウの残基２４４～残基３７２により、細胞及び動物モデルにおけるタウの凝集挙動の多くが再現される（非特許文献３５）。タウ（配列番号１４）の残基２８１と残基３２２との間には、凝集に関連し、かつエンドリソソーム酵素による切断を受けにくい領域があることが目下判明している（図１３）。したがって、ＭＰＳの機能又は機能不全、並びにタウの異化及びクリアランスに対する作用物質の効果を、タウのこの中間ドメイン断片の異化及びクリアランスを測定及び監視することによって評価することができると予想される。
【0154】
ＴＤＰ－４３
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はＴＤＰ－４３（配列番号１７）であり、方法は、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１～残基３１４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１～残基３１４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はＴＤＰ－４３（配列番号１７）であり、方法は、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１～残基３１４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１～残基３１４を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む、好ましくは残基３１１～残基３１４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。
【0155】
幾つかの実施形態において、検出は、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）がアミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６～残基２４９を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号１９のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む、好ましくは残基２４６～残基２４９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端を検出し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６～残基２４９を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む、好ましくは残基２４６～残基２４９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む、好ましくは残基２４６～残基２４９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。
【0156】
上記で論じたように、ＴＤＰ－４３の領域、すなわち残基２４６～残基２５５、残基２４６～残基２５８、残基２８６～残基３３１、残基３１１～残基３２３、及び残基３１１～残基３６０は凝集しやすいことが報告されている（非特許文献３６、非特許文献３７）。特に、非特許文献３６により、残基３１１～残基３２３、特に残基３１１～残基３２０（両端を含む）にわたるペプチドは、増加した凝集傾向を有することが示された。しかしながら、非特許文献３６は、これらのペプチドの凝集をＣ末端で伸長したペプチドと比較しておらず、触媒作用に関しては、ペプチドの結合特性が凝集に重要である可能性がある。非特許文献３７は、Ｃｒｙｏ－ＥＭを使用して、残基３１２から残基３４６まで延びるペプチドが緊密な結合で凝集することを示し、このペプチドのコア領域が残基３１２～残基３３４であることを明らかにした。目下、神経変性疾患及び／又は炎症性活性化における凝集及び／又は毒性、及びＭＰＳの異常な機能に関連するタンパク質は、凝集しやすく、かつリソソーム酵素により分解されにくい中間ドメイン断片を含むことが分かっているため、ＴＤＰ－４３のこれらの凝集しやすい領域は、リソソーム酵素により分解されにくいことが予想される。したがって、ＴＤＰ－４３のこれらの中間ドメイン断片を使用して、ＭＰＳによる異化を監視及び測定し、ＭＰＳの機能又は機能不全に対する作用物質の効果を評価することができると予想される。さらに、非特許文献３６及び非特許文献３７の教示を考慮して、凝集に関連し、かつＭＰＳ細胞において細胞内に保持されるＴＤＰ－４３の断片は、これらを使用してＭＰＳの機能又は機能不全を測定及び監視することができるように、ＴＤＰ－４３の残基２４６～残基２５５及び残基３１１～残基３３４であることが予想される。
【0157】
ＭＢＰ
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はＭＢＰ（配列番号２０）であり、方法は、ＭＢＰ（配列番号２０）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又はアミノ酸残基７０とアミノ酸残基７１との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端を検出し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端を検出し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。エンドリソソーム酵素により分解されにくいＭＢＰの領域があることが分かっており、この領域はＭＢＰのアミノ酸残基３０とアミノ酸残基７０との間（及びそれらを含む）にある（図１４）。ＭＢＰの凝集が神経変性疾患と関連していることが知られており、凝集したＭＢＰは多発性硬化症（ＭＳ；非特許文献３８）において神経毒性効果を有すると考えられている。神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する病態は、上記で論じたようにＭＰＳの機能不全を特徴とすることが知られているので、したがって、これは今まで知られていなかったこのＭＢＰの分解されにくい断片を測定及び監視して、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価するのに有用である。特に、凝集、ＭＰＳの機能不全、及び神経変性疾患に関連するタンパク質断片は、エンドリソソーム酵素により分解されにくく、かつ凝集に重要なタンパク質の領域と少なくとも重複する領域を含むことが目下判明した。また、これらの分解されにくい中間ドメイン断片を測定及び監視することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全に対する作用物質の効果を評価することも可能であると予想される。
幾つかの実施形態において、疾患マーカー産物はＭＢＰ（配列番号２０）であり、方法は、ＭＢＰ（配列番号２０）又はその少なくとも１つの断片を検出することを含む。幾つかの実施形態において、検出は、ＭＢＰ（配列番号２０）がアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又はアミノ酸残基７０とアミノ酸残基７１との間で切断されたものの検出であり得る。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出する。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出し、更にＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端を検出し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端を検出し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３を含む断片の領域を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端及びＣ末端を検出することによって、少なくとも１つの断片を検出することができる。上述の領域のいずれか又はＣ末端若しくはＮ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域に特異的な、又は配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体を使用し、かつＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む、好ましくは残基３０～残基３３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。幾つかの実施形態において、配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体を使用して、少なくとも１つの断片を検出することができる。エンドリソソーム酵素により分解されにくいＭＢＰの領域があることが分かっており、この領域はＭＢＰのアミノ酸残基３０とアミノ酸残基７０との間（及びそれらを含む）にある（図１４）。ＭＢＰの凝集が神経変性疾患と関連していることが知られており、凝集したＭＢＰは多発性硬化症（ＭＳ；非特許文献３８）において神経毒性効果を有すると考えられている。神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する病態は、上記で論じたようにＭＰＳの機能不全を特徴とすることが知られているので、したがって、これは今まで知られていなかったこのＭＢＰの分解されにくい断片を測定及び監視して、ＭＰＳの機能又は機能不全を評価するのに有用である。特に、凝集、ＭＰＳの機能不全、及び神経変性疾患に関連するタンパク質断片は、エンドリソソーム酵素により分解されにくく、かつ凝集に重要なタンパク質の領域と少なくとも重複する領域を含むことが目下判明した。また、これらの分解されにくい中間ドメイン断片を測定及び監視することによって、ＭＰＳの機能又は機能不全に対する作用物質の効果を評価することも可能であると予想される。
【0158】
使用
本発明の方法は、図８によって示されるように、炎症性活性化を背景とすることを含むＭＰＳ機能を評価及び研究するのに有用である。したがって、本発明の方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連するＭＰＳ機能不全の研究において使用される。特に、本発明の方法により、疾患マーカー産物のクリアランスに対するＭＰＳの様々な部分の阻害又は活性化の効果を研究することが可能となる。実施例は、Ａβクリアランスの正確な細胞内作用を測定することができ、それを行う方法が、提案された治療的介入の効果を測定するのに十分な感度であることを明らかにしている。これらの研究は、Ａβクリアランスが「創薬可能」であり、既存の薬物及び栄養補助食品によって強い効果が示されることも明らかにしている。α－シヌクレイン、タウ、ＴＤＰ－４３、及びＭＢＰ等の神経変性疾患及びＭＰＳ機能不全に関連する他のタンパク質の細胞内クリアランスも同様にして測定することができると予想される。
本発明の方法は、図８によって示されるように、炎症性活性化を背景とすることを含むＭＰＳ機能を評価及び研究するのに有用である。したがって、本発明の方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化に関連するＭＰＳ機能不全の研究において使用される。特に、本発明の方法により、疾患マーカー産物のクリアランスに対するＭＰＳの様々な部分の阻害又は活性化の効果を研究することが可能となる。実施例は、Ａβクリアランスの正確な細胞内作用を測定することができ、それを行う方法が、提案された治療的介入の効果を測定するのに十分な感度であることを明らかにしている。これらの研究は、Ａβクリアランスが「創薬可能」であり、既存の薬物及び栄養補助食品によって強い効果が示されることも明らかにしている。α－シヌクレイン、タウ、ＴＤＰ－４３、及びＭＢＰ等の神経変性疾患及びＭＰＳ機能不全に関連する他のタンパク質の細胞内クリアランスも同様にして測定することができると予想される。
【0159】
幾つかの実施形態において、本発明の方法は、新しい治療的介入を特定するものである。これらの実施形態において、疾患マーカー産物のクリアランスによって判断される、ＭＰＳ機能に対する１つ以上の候補作用物質の効果を評価することができる。したがって、幾つかの実施形態において、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである。幾つかの実施形態において、方法は、アルツハイマー病、アミロイド血管症、ＰＤ、多発性硬化症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、血管性認知症を含む炎症成分を伴う血管変性疾患、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、及び／又はＲＮＡウイルス感染症の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである。幾つかの実施形態において、方法は、アルツハイマー病及び／又はアミロイド血管症の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである。
【0160】
幾つかの実施形態において、方法は、疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対する効果を評価することによって、ＭＰＳ機能に対する一連の様々な作用物質の効果を比較するものである。幾つかの実施形態において、方法は、触媒作用に対して最も大きな効果を有する作用物質を特定するものである。
【0161】
本発明の方法を、個別化医療に使用することもできる。このような実施形態において、ＭＰＳ細胞の試料及びコントロールＭＰＳ細胞は、ＭＰＳ機能不全に関連する神経変性及び／又は炎症性活性化を患っていると診断された又はそれら患っていると疑われるヒト被験体から得られたものである。ＭＰＳ細胞の試料とコントロールＭＰＳ細胞との間の疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量の差は、ヒト被験体の治療における試験された作用物質の効力を示す。したがって、ＭＰＳ細胞の試料を生きた状態に維持して、ヒト被験体のＭＰＳ機能を維持することが特に有利である。幾つかの実施形態において、方法は、ヒト被験体からのＭＰＳ細胞の２つ以上の試料及びコントロールＭＰＳ細胞に対して一連の作用物質を試験することと、ＭＰＳ細胞の２つ以上の試料及びコントロールＭＰＳ細胞において疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片を検出することによってＭＰＳ機能に対する様々な作用物質の効果を比較することと、ヒト被験体に対して最も大きな有益な効果を有する作用物質を特定することとを含む。幾つかの実施形態において、方法は、特定された作用物質をヒト被験体に投与して、神経変性及び／又は炎症性活性化を治療することを含む。
【0162】
幾つかの実施形態において、方法は、神経変性疾患及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する疾患又は病態の診断において使用するものである。幾つかの実施形態において、方法は、アルツハイマー病、アミロイド血管症、ＰＤ、多発性硬化症、前頭側頭型認知症、筋萎縮性側索硬化症、レビー小体型認知症、血管性認知症を含む炎症成分を伴う血管変性疾患、多系統萎縮症、進行性核上性麻痺、及び／又はＲＮＡウイルス感染症の診断において使用するものである。幾つかの実施形態において、方法は、アミロイド血管症の診断において使用するものである。
【0163】
幾つかの実施形態において、方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化の遺伝的原因及びエピジェネティックな原因の研究に有用である。特に、生きた状態に維持された又は培養されたＭＰＳ細胞は、それらの起源（特定の細胞系統又はヒト被験体等）の遺伝的変化及びエピジェネティックな変化を保持する。
【0164】
キット
本発明はまた、疾患マーカー産物及び／又はその１つ以上の断片に特異的な抗体を含むキットに関する。幾つかの実施形態において、キットは２つ以上の抗体を含み、ここで、これらの抗体は疾患マーカー断片及びその少なくとも１つの断片に特異的であるか、又はこれらの抗体は疾患マーカー産物の様々な断片に特異的である。
本発明はまた、疾患マーカー産物及び／又はその１つ以上の断片に特異的な抗体を含むキットに関する。幾つかの実施形態において、キットは２つ以上の抗体を含み、ここで、これらの抗体は疾患マーカー断片及びその少なくとも１つの断片に特異的であるか、又はこれらの抗体は疾患マーカー産物の様々な断片に特異的である。
【0165】
幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）及び／又はそれらの断片の上記の領域のいずれか１つ、又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端を検出する１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１、残基３４、又は残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３１～残基３４を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な、好ましくはＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３９及び残基４０を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な抗体、又は配列番号６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１若しくは配列番号２のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号６のＮ末端に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３９及び残基４０を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の上述の領域、Ｎ末端、及びＣ末端のそれぞれに特異的な抗体、例えば、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体を含む。
【0166】
幾つかの実施形態において、キットは、配列番号３に対して産生された抗体、配列番号４に対して産生された抗体、及び配列番号５に対して産生された抗体、配列番号７に対して産生された抗体、配列番号８に対して産生された抗体、及び配列番号９に対して産生された抗体のうちの１つを含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号７に対して産生された抗体、及び配列番号４、配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に対して産生された抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号７に対して産生された抗体、及び配列番号５又は配列番号８に対して産生された抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号７に対して産生された抗体、及び配列番号４に対して産生された抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号３に対して産生された抗体、及び配列番号９に対して産生された抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号２に対して産生された抗体、及び配列番号４に対して産生された抗体、配列番号２に対して産生された抗体、及び配列番号５、配列番号８、若しくは配列番号９に対して産生された抗体、又は配列番号４に対して産生された抗体、及び配列番号５、配列番号８、若しくは配列番号９に対して産生された抗体を含む。好ましくは、キットは、配列番号３に対して産生された抗体、配列番号４に対して産生された抗体、及び配列番号５に対して産生された抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号７に対して産生された抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、配列番号７に対して産生された抗体、及び配列番号８に対して産生された抗体、又は配列番号９に対して産生された抗体、及び配列番号６のＮ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号７に対して産生された抗体、配列番号８に対して産生された抗体、配列番号９に対して産生された抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、並びに配列番号６のＮ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号３に対して産生された抗体、配列番号４に対して産生された抗体、配列番号７に対して産生された抗体、配列番号８に対して産生された抗体、及び配列番号９に対して産生された抗体を含む。
【0167】
幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン及び／又はそれらの断片の上記の領域のいずれか１つ、又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端を検出する１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９、残基５３、残基７２、残基７６、又は残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２、残基５０～残基５３、残基５３～残基５６、残基６９～残基７２、残基７６～残基７９、又は残基８７～残基９０を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９～残基４２を含む断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５０～残基４３を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３～残基５６を含む断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基６９～残基７２を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６～残基７９を含む断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な、好ましくはα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基８７～残基９０を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号１１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１１のＣ末端に特異的な抗体、又は配列番号１２のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１２のＣ末端に特異的な抗体、又は配列番号１３のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１３のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の上述の領域、Ｎ末端、及びＣ末端のそれぞれに特異的な抗体、例えば、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体を含む。これらの実施形態において、キットは、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の第１の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の第２の領域に特異的な抗体を含み、ここで、第１の領域は第２の領域とは異なる。
【0168】
幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）及び／又はそれらの断片の上記の領域のいずれか１つ、又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端を検出する１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）の残基２８１、残基３０６、残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）の残基２８１～残基２８４、残基３０６～残基３０９、又は残基３１９～残基３２２を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基２８１～残基２８４を含む断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３０６～残基３０９を含む断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な、好ましくはタウ（配列番号１４）の残基３１９～残基３２２を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号１５のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１５のＣ末端に特異的な抗体、又は配列番号１６のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１６のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、タウ（配列番号１４）の上述の領域、Ｎ末端、及びＣ末端のそれぞれに特異的な抗体、例えば、タウ（配列番号１４）の残基２１８を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基３０５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体を含む。
【0169】
幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）及び／又はそれらの断片の上記の領域のいずれか１つ、又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端を検出する１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６、残基２５５、残基３１１、又は残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６～残基２４９、残基２５２～残基２５５、残基３１１～残基３１４、又は残基３３１～残基３３４を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６～残基２４９を含む断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５２～残基２５５を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１～残基３１４を含む断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な、好ましくはＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３１～残基３３４を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号１８のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１８のＣ末端に特異的な抗体、又は配列番号１９のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号１９のＣ末端に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の上述の領域、Ｎ末端、及びＣ末端のそれぞれに特異的な抗体、例えば、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸残基を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体を含む。
【0170】
幾つかの実施形態において、キットは、ＭＢＰ（配列番号２０）及び／又はそれらの断片の上記の領域のいずれか１つ、又はそれらのＮ末端若しくはＣ末端を検出する１つ以上の抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０又は残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３又は残基６７～残基７０を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０～残基３３を含む断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な、好ましくはＭＢＰ（配列番号２０）の残基６７～残基７０を含む断片の領域に特異的な抗体を含む。幾つかの実施形態において、キットは、配列番号２１のＮ末端に特異的な抗体、及び配列番号２１のＣ末端に特異的な抗体を含む。
【0171】
幾つかの実施形態において、キットは、２つ以上のタンパク質の断片を検出する抗体を含む。これらの実施形態において、キットは、上記の抗体のあらゆる組合せを含み得る。
【0172】
キットを本発明の方法において上記開示のように使用することができる。
【実施例】
【0173】
統計学（実施例１～実施例４）
様々な実験についての測定値の日間変動を調整するのに、実験の各日の基準としてベースライン条件を使用し、以下の式を使用して値を正規化した：［（バイオマーカー値／平均バイオマーカー値）／１００）］。一元配置ＡＮＯＶＡモデルを使用して統計分析を実施した。有意な（ｐ＜０．０５）オムニバス（Ｆ検定）ＡＮＯＶＡが示された場合、仮説に従って計画的比較を実施した。これは、参照条件と実験条件（エンドリソソーム阻害物質及びオートファゴソーム活性化物質）との間の主比較を含んでいた。したがって、図面は、各バー内に、基準条件（１００％）と比較した場合の、パーセンテージ変化、及び関連する統計的有意性（ｐ値）又はその欠如（有意ではない）を示している（すなわち、主比較）。一部の実験（図４、図５、及び図７）では、仮説に従って実験条件間の追加の比較を行った。これらの比較についての群間の有意差を、関連する統計的有意性（ｐ値）又はその欠如（有意ではない）を伴う水平バーで示す。
様々な実験についての測定値の日間変動を調整するのに、実験の各日の基準としてベースライン条件を使用し、以下の式を使用して値を正規化した：［（バイオマーカー値／平均バイオマーカー値）／１００）］。一元配置ＡＮＯＶＡモデルを使用して統計分析を実施した。有意な（ｐ＜０．０５）オムニバス（Ｆ検定）ＡＮＯＶＡが示された場合、仮説に従って計画的比較を実施した。これは、参照条件と実験条件（エンドリソソーム阻害物質及びオートファゴソーム活性化物質）との間の主比較を含んでいた。したがって、図面は、各バー内に、基準条件（１００％）と比較した場合の、パーセンテージ変化、及び関連する統計的有意性（ｐ値）又はその欠如（有意ではない）を示している（すなわち、主比較）。一部の実験（図４、図５、及び図７）では、仮説に従って実験条件間の追加の比較を行った。これらの比較についての群間の有意差を、関連する統計的有意性（ｐ値）又はその欠如（有意ではない）を伴う水平バーで示す。
【0174】
実施例１
Ａβの異化及び解毒、並びにそれらに対する例示的な阻害物質及び活性化物質の効果を、細胞内Ａβ中間ドメインペプチド、すなわち異化産物に特異的な抗体を使用して測定した。特に、エンドリソソーム活性の阻害は、分解を減少させ、種の濃度を増加させると予想され、ここでは、Ｖ－ＡＴＰアーゼを遮断し、エンドリソソームの酸性化を阻害し、それによってエンドリソソームの酵素活性を阻害するバフィロマイシンを用いて研究した。エンドリソソーム酵素の阻害物質であるネプリライシン（Saido 2013）及びインスリン分解酵素の添加は、同様の効果をもたらすと予想されるが（非特許文献２０、非特許文献１）、ＢＡＣＥ１はＡβ生成及び３４’－触媒作用の両方に関与する（Vassar, Kovacs et al. 2009、Liebsch, Kulic et al. 2019）。ラパマイシンを使用したマクロオートファジーの強化もＡβの異化を増加させると予想される（図３；Spilman, Podlutskaya et al. 2010、非特許文献１７）。
Ａβの異化及び解毒、並びにそれらに対する例示的な阻害物質及び活性化物質の効果を、細胞内Ａβ中間ドメインペプチド、すなわち異化産物に特異的な抗体を使用して測定した。特に、エンドリソソーム活性の阻害は、分解を減少させ、種の濃度を増加させると予想され、ここでは、Ｖ－ＡＴＰアーゼを遮断し、エンドリソソームの酸性化を阻害し、それによってエンドリソソームの酵素活性を阻害するバフィロマイシンを用いて研究した。エンドリソソーム酵素の阻害物質であるネプリライシン（Saido 2013）及びインスリン分解酵素の添加は、同様の効果をもたらすと予想されるが（非特許文献２０、非特許文献１）、ＢＡＣＥ１はＡβ生成及び３４’－触媒作用の両方に関与する（Vassar, Kovacs et al. 2009、Liebsch, Kulic et al. 2019）。ラパマイシンを使用したマクロオートファジーの強化もＡβの異化を増加させると予想される（図３；Spilman, Podlutskaya et al. 2010、非特許文献１７）。
【0175】
抗体及び一次アッセイ
イムノアッセイを、アミロイドβタンパク質の様々なエピトープ（図１に示す；配列番号３～配列番号５）に対する独自開発した抗体を使用して、単一分子アレイ（single molecule array）（Ｓｉｍｏａ）プラットフォーム（Quanterix、米国）上で展開した。Ａβｘ－４０／４２アッセイは、４０～４２の末端に特異的なヒツジモノクローナルＡＢ．４Ｄ７（Bioventix plc、英国）を捕捉抗体として使用し、中間ドメインエピトープ（配列番号７）に関するヒツジモノクローナルＡＢ．２Ａ９（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用した。４０～４２の末端に特異的な抗体は、配列番号５に示されるエピトープに対して産生され、Ａβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の両方のＣ末端に結合する。Ａβ２０－ｘアッセイは、同じＡＢ．４Ｄ７抗体を捕捉抗体として使用し、高度に特異的な２０カットポイントのヒツジモノクローナル抗体ＡＢＮＴ．２Ｂ８（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用した。Ａβｘ－３４アッセイでは、ＡＢ．２Ａ９を捕捉抗体として使用し、配列番号６のＣ末端を有する断片に優先的に結合する抗複合体抗体のＢＶＸ．３３４２０／Ｈ３（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用し、こうして中間ドメインｘ～３４の特異性を保証した。
イムノアッセイを、アミロイドβタンパク質の様々なエピトープ（図１に示す；配列番号３～配列番号５）に対する独自開発した抗体を使用して、単一分子アレイ（single molecule array）（Ｓｉｍｏａ）プラットフォーム（Quanterix、米国）上で展開した。Ａβｘ－４０／４２アッセイは、４０～４２の末端に特異的なヒツジモノクローナルＡＢ．４Ｄ７（Bioventix plc、英国）を捕捉抗体として使用し、中間ドメインエピトープ（配列番号７）に関するヒツジモノクローナルＡＢ．２Ａ９（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用した。４０～４２の末端に特異的な抗体は、配列番号５に示されるエピトープに対して産生され、Ａβ１－４２（配列番号１）及びＡβ１－４０（配列番号２）の両方のＣ末端に結合する。Ａβ２０－ｘアッセイは、同じＡＢ．４Ｄ７抗体を捕捉抗体として使用し、高度に特異的な２０カットポイントのヒツジモノクローナル抗体ＡＢＮＴ．２Ｂ８（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用した。Ａβｘ－３４アッセイでは、ＡＢ．２Ａ９を捕捉抗体として使用し、配列番号６のＣ末端を有する断片に優先的に結合する抗複合体抗体のＢＶＸ．３３４２０／Ｈ３（Bioventix plc、英国）を検出抗体として使用し、こうして中間ドメインｘ～３４の特異性を保証した。
【0176】
試薬
アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド（１～４０）ヒト、カタログ番号Ａ１１２４（ApexBio、米国）。バフィロマイシンＡ１、カタログ番号Ｂ１７９３（Sigma、米国）。ラパマイシン、カタログ番号Ｒ０３９５（Sigma、米国）。ネプリライシン阻害物質；ホスホラミドン二ナトリウム塩、カタログ番号６３３３（Tocris、英国）。ＢＡＣＥ阻害物質；ＬＹ２８８６７２１、カタログ番号７０８１（Tocris、英国）。インスリン分解酵素阻害物質；６ｂＫ、カタログ番号５４０２（Tocris、英国）。
アミロイドベータ（Ａβ）ペプチド（１～４０）ヒト、カタログ番号Ａ１１２４（ApexBio、米国）。バフィロマイシンＡ１、カタログ番号Ｂ１７９３（Sigma、米国）。ラパマイシン、カタログ番号Ｒ０３９５（Sigma、米国）。ネプリライシン阻害物質；ホスホラミドン二ナトリウム塩、カタログ番号６３３３（Tocris、英国）。ＢＡＣＥ阻害物質；ＬＹ２８８６７２１、カタログ番号７０８１（Tocris、英国）。インスリン分解酵素阻害物質；６ｂＫ、カタログ番号５４０２（Tocris、英国）。
【0177】
チェイスアッセイ
ＴＨＰ－１細胞を、１００ｎＭのＴＰＡ（１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート）で４８時間処理することによってマクロファージへと分化させた。培地を、オートファジー系／エンドリソソーム系のモジュレーター：１００ｎＭのバフィロマイシン、１００ｎＭのラパマイシン、１００μＭのネプリライシン阻害物質、２００ｎＭのＢＡＣＥ阻害物質、若しくは１μＭのＩＤＥ阻害物質、又は酵素阻害物質であるネプリライシン阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、及びＩＤＥ阻害物質の３種の組合せを含む又は含まない新しい培地と交換した。細胞を１時間インキュベートした後に、１００ｎｇ／ｍｌのＡβ４０を細胞に加えた。細胞を更に２時間インキュベートした後に、Ａβ４０を除去し、それぞれのモジュレーターの存在下又は不存在下で４時間追跡を続けた。細胞を洗浄した後に、溶解緩衝液を加えた。溶解物を分析まで－８０℃で維持した。
ＴＨＰ－１細胞を、１００ｎＭのＴＰＡ（１２－Ｏ－テトラデカノイルホルボール－１３－アセテート）で４８時間処理することによってマクロファージへと分化させた。培地を、オートファジー系／エンドリソソーム系のモジュレーター：１００ｎＭのバフィロマイシン、１００ｎＭのラパマイシン、１００μＭのネプリライシン阻害物質、２００ｎＭのＢＡＣＥ阻害物質、若しくは１μＭのＩＤＥ阻害物質、又は酵素阻害物質であるネプリライシン阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、及びＩＤＥ阻害物質の３種の組合せを含む又は含まない新しい培地と交換した。細胞を１時間インキュベートした後に、１００ｎｇ／ｍｌのＡβ４０を細胞に加えた。細胞を更に２時間インキュベートした後に、Ａβ４０を除去し、それぞれのモジュレーターの存在下又は不存在下で４時間追跡を続けた。細胞を洗浄した後に、溶解緩衝液を加えた。溶解物を分析まで－８０℃で維持した。
【0178】
結果
これらのアッセイの結果を図４及び図５に示す。特に、図４及び図５は、Ａβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘが４時間の追跡中に有意に減少するのに対して、Ａβｘ－３４は不変であることを示している。これらの結果はまた、エンドリソソーム阻害（バフィロマイシン）がＡβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘを有意に増加させ、Ａβｘ－３４を非有意に増加させること、そしてラパマイシンを使用したオートファジーの強化によりＡβｘ－４０／４２レベル及びＡβ２０－ｘレベルは不変のままであるが、Ａβｘ－３４レベルが大幅に減少することも示している。図５は、４時間の追跡と比較して、酵素阻害物質の３種の組合せ（ネプリライシン阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、及びＩＤＥ阻害物質）により、Ａβｘ－４０／４２レベルが有意に増加するが、Ａβ２０－ｘのレベルには影響せず、Ａβｘ－３４の非有意の増加（傾向レベル）がもたらされる（幾つかの実験）ことを示している。ネプリライシン阻害物質のみを使用した阻害により、Ａβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘが増加するのに対して（それぞれ図５Ｃ及び図５Ａ）、Ａβｘ－３４レベルは不変である。ＢＡＣＥ阻害物質のみを使用した阻害により、Ａβ２０－ｘは増加するが、Ａβｘ－３４又はＡβｘ－４０／４２に対して影響は及ぼされない。ＩＤＥ阻害物質を使用した阻害により、Ａβ２０－ｘは増加するが、Ａβｘ－３４又はＡβｘ－４０／４２のレベルに対して影響は及ぼされない。
これらのアッセイの結果を図４及び図５に示す。特に、図４及び図５は、Ａβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘが４時間の追跡中に有意に減少するのに対して、Ａβｘ－３４は不変であることを示している。これらの結果はまた、エンドリソソーム阻害（バフィロマイシン）がＡβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘを有意に増加させ、Ａβｘ－３４を非有意に増加させること、そしてラパマイシンを使用したオートファジーの強化によりＡβｘ－４０／４２レベル及びＡβ２０－ｘレベルは不変のままであるが、Ａβｘ－３４レベルが大幅に減少することも示している。図５は、４時間の追跡と比較して、酵素阻害物質の３種の組合せ（ネプリライシン阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、及びＩＤＥ阻害物質）により、Ａβｘ－４０／４２レベルが有意に増加するが、Ａβ２０－ｘのレベルには影響せず、Ａβｘ－３４の非有意の増加（傾向レベル）がもたらされる（幾つかの実験）ことを示している。ネプリライシン阻害物質のみを使用した阻害により、Ａβｘ－４０／４２及びＡβ２０－ｘが増加するのに対して（それぞれ図５Ｃ及び図５Ａ）、Ａβｘ－３４レベルは不変である。ＢＡＣＥ阻害物質のみを使用した阻害により、Ａβ２０－ｘは増加するが、Ａβｘ－３４又はＡβｘ－４０／４２に対して影響は及ぼされない。ＩＤＥ阻害物質を使用した阻害により、Ａβ２０－ｘは増加するが、Ａβｘ－３４又はＡβｘ－４０／４２のレベルに対して影響は及ぼされない。
【0179】
したがって、ＭＰＳ機能及びＭＰＳの様々な特定の点に対する様々なＭＰＳ阻害物質及び活性化物質の効果を評価することができる。この方法は、様々な阻害物質及び活性化物質の効果を測定するのに十分な感度がある。
【0180】
実施例２
ＭＰＳ機能の指標として、ＡＤについて提案されている治療的介入（すなわち、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ；特許文献１）のＡβの異化及び解毒に対する効果も評価した。
ＭＰＳ機能の指標として、ＡＤについて提案されている治療的介入（すなわち、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲ ＰＡＭ；特許文献１）のＡβの異化及び解毒に対する効果も評価した。
【0181】
方法
実施例１と同じ抗体及び実施例１と同様の方法を使用して、メソスケールプラットフォーム上でイムノアッセイを構成した。細胞をＤＨＡ（１００μＭ）及び／又はＮＳ１７３８（１０μＭ）とともに一晩（１６時間）インキュベートした。Ａβ１－４０を５００ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、培地から除去した後に４時間の追跡を行った。ＤＨＡ及びＮＳ１７３８を４時間の追跡中に培地から除去した。
実施例１と同じ抗体及び実施例１と同様の方法を使用して、メソスケールプラットフォーム上でイムノアッセイを構成した。細胞をＤＨＡ（１００μＭ）及び／又はＮＳ１７３８（１０μＭ）とともに一晩（１６時間）インキュベートした。Ａβ１－４０を５００ｎｇ／ｍｌの濃度で加え、培地から除去した後に４時間の追跡を行った。ＤＨＡ及びＮＳ１７３８を４時間の追跡中に培地から除去した。
【0182】
結果
図６は、ＤＨＡ＋ＮＳ１７３８の組合せがＡβ２０－ｘ、Ａβｘ－３４、及びＡβｘ－４０の３つ全てを有意に減少させ、ＮＳ１７３８単独及びＤＨＡ単独のそれぞれがＡβｘ－３４を減少させたことを示している。この実施例において、主比較についての基準条件は、Ａβ４０の４時間の追跡であった。
図６は、ＤＨＡ＋ＮＳ１７３８の組合せがＡβ２０－ｘ、Ａβｘ－３４、及びＡβｘ－４０の３つ全てを有意に減少させ、ＮＳ１７３８単独及びＤＨＡ単独のそれぞれがＡβｘ－３４を減少させたことを示している。この実施例において、主比較についての基準条件は、Ａβ４０の４時間の追跡であった。
【0183】
したがって、ＭＰＳ機能及びその特定の点に対するＡＤについての様々な治療的介入の効果を、様々な触媒作用産物に対する治療的介入の効果を測定することによって評価することができる。
【0184】
実施例３
ＭＰＳ機能に対するＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せの効果を、ラパマイシン及びバフィロマイシンの効果と比較した。イムノアッセイ法は実施例２と同じであり、これらの結果を図７に示す。
ＭＰＳ機能に対するＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せの効果を、ラパマイシン及びバフィロマイシンの効果と比較した。イムノアッセイ法は実施例２と同じであり、これらの結果を図７に示す。
【0185】
図７は、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せが３つ全てのＡβ断片のレベルを有意に減少させたことを示しており、この薬物の組合せがＭＰＳ機能の改善に有効であることが明らかになる。
【0186】
実施例４
ＡＤは炎症性活性化と関連しているため、炎症性活性化を背景とするＭＰＳ機能及びＡβクリアランスに対する様々な薬物及び薬物の組合せの効果を評価した。
ＡＤは炎症性活性化と関連しているため、炎症性活性化を背景とするＭＰＳ機能及びＡβクリアランスに対する様々な薬物及び薬物の組合せの効果を評価した。
【0187】
方法
メソスケールプラットフォーム上でイムノアッセイを構成した。ＴＨＰ－１細胞を、１２－Ｏ－テトラ－デカノイルホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）との４８時間のインキュベーション中に、食作用性の単球／マクロファージへと分化させた。培地を、ＬＰＳ単独、又はＬＰＳとＤＨＡ若しくはＮＳ１７３８とを一緒に、又はＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せを含む新たな培地と交換し、一晩インキュベート（１６時間）した。マーカータンパク質（Ａβ１－４０）を細胞に加えて、更に２時間インキュベートした。培地を、添加剤を一切含まない新たな培地と交換し、細胞を更に４時間の追跡期間にわたってインキュベートした。細胞を冷たく保ち、培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。プロテアーゼ阻害剤及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解緩衝液を細胞に加えた。溶解後に、細胞を剥離してチューブに移し、－８０℃の冷凍庫内に保管した。溶解物を超音波処理し、ＤＮアーゼで処理した後に、分解アッセイで分析した。
メソスケールプラットフォーム上でイムノアッセイを構成した。ＴＨＰ－１細胞を、１２－Ｏ－テトラ－デカノイルホルボール－１３－アセテート（ＴＰＡ）との４８時間のインキュベーション中に、食作用性の単球／マクロファージへと分化させた。培地を、ＬＰＳ単独、又はＬＰＳとＤＨＡ若しくはＮＳ１７３８とを一緒に、又はＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せを含む新たな培地と交換し、一晩インキュベート（１６時間）した。マーカータンパク質（Ａβ１－４０）を細胞に加えて、更に２時間インキュベートした。培地を、添加剤を一切含まない新たな培地と交換し、細胞を更に４時間の追跡期間にわたってインキュベートした。細胞を冷たく保ち、培地を除去し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。プロテアーゼ阻害剤及びドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を含む溶解緩衝液を細胞に加えた。溶解後に、細胞を剥離してチューブに移し、－８０℃の冷凍庫内に保管した。溶解物を超音波処理し、ＤＮアーゼで処理した後に、分解アッセイで分析した。
【0188】
結果
図８は、クリアランスアッセイの結果を示し、全ての薬物及びそれらの組合せが、３つ全てのＡβ断片を有意に減少させることを示している。この実験では、主比較についての基準条件は、ＬＰＳ＋Ａβ４０の４時間の追跡であった。
図８は、クリアランスアッセイの結果を示し、全ての薬物及びそれらの組合せが、３つ全てのＡβ断片を有意に減少させることを示している。この実験では、主比較についての基準条件は、ＬＰＳ＋Ａβ４０の４時間の追跡であった。
【0189】
したがって、クリアランスアッセイを使用して神経変性疾患に関連する炎症性背景をモデル化し、治療的介入のｉｎ ｖｉｖｏ効果のより正確な評価をもたらすことができる。さらに、炎症性活性化とＭＰＳ機能との間の相互作用を評価することもできる。
【0190】
注目すべきは、Ａβｘ－３４エピトープと比較した場合の、Ａβ２０－ｘエピトープ及びＡβｘ－４０エピトープの触媒作用に対するエンドリソソーム酵素阻害物質の効果における顕著な差である（図５Ｂに対する図５Ａ及び図５Ｃ）。しかしながら、ＤＨＡ及びＮＳによる処理は、全ての断片について同様に有効であった（図７及び図８）。これらの差は、触媒作用が異なる酵素の結合により生ずる可能性が高く、ここで、ＤＨＡ及びＮＳは炎症（Ａβ誘発性又はＬＰＳ誘発性）に対抗し、構成的なカテプシンプロテアーゼに結合する可能性が高い（非特許文献４０）。このように、Ａβｘ－３４アッセイは際だっており、カテプシンの結合及び調節について広く適用可能である可能性が高いマーカーが生ずる（非特許文献４１、非特許文献４２）。
【0191】
実施例５
Ａβクリアランスアッセイを、血液ドナーから得られた単球を使用して検証した。
Ａβクリアランスアッセイを、血液ドナーから得られた単球を使用して検証した。
【0192】
方法
イムノアッセイを、Quanterix（米国カリフォルニア州）の単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）プラットフォーム上で展開し、独自開発の抗中間ドメインヒツジモノクローナル抗体（ｍＡｂ ２Ａ９）を捕捉抗体として使用した（米国特許第９，６２５，４７４号に開示される）。検出試薬は、最適なＡβ中間ドメインペプチド特異性及びアッセイ感度を補助する抗複合体抗体（Bio-Rad HuCAL technology）であった（非特許文献１４によるＣＴＡＤポスター）。これらを図９に示す。抗複合体抗体は、Ａｂ２Ａ９及び３４を末端とする中間ドメインＡβペプチドの両方が存在する場合にのみ結合する（非特許文献１４）。
イムノアッセイを、Quanterix（米国カリフォルニア州）の単一分子アレイ（Ｓｉｍｏａ）プラットフォーム上で展開し、独自開発の抗中間ドメインヒツジモノクローナル抗体（ｍＡｂ ２Ａ９）を捕捉抗体として使用した（米国特許第９，６２５，４７４号に開示される）。検出試薬は、最適なＡβ中間ドメインペプチド特異性及びアッセイ感度を補助する抗複合体抗体（Bio-Rad HuCAL technology）であった（非特許文献１４によるＣＴＡＤポスター）。これらを図９に示す。抗複合体抗体は、Ａｂ２Ａ９及び３４を末端とする中間ドメインＡβペプチドの両方が存在する場合にのみ結合する（非特許文献１４）。
【0193】
密度勾配遠心分離及びStemCell Technologies（カナダ）製のＲｏｓｅｔｔｅＳｅｐ抗体の組合せを使用して、白血球画分から血液ドナー由来の単球を分離した。単球計数を行った後に細胞溶解し、単球濃度を１μｌ当たり２００００個の細胞に調整した。
【0194】
健康なドナー（１８名の女性及び１５名の男性）からの３３個の試料を年齢別にしたところ、２０歳～７０歳の範囲に及んでいた。
【0195】
結果
Ｓｉｍｏａプラットフォームにおいて分析された２つの抗Ａβ中間ドメイン抗体を用いたアッセイにより、０．７８ｐｇ／ｍｌの検出限界（ＬＯＤ）及び１．３８ｐｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ）（ＬＯＤ及びＬＬＯＱはＳｉｍｏａ ４ＰＬアッセイ開発ツールによって評価された）でＡβ中間ドメインペプチドを検出する高感度のイムノアッセイがもたらされたため、単球溶解物において測定可能なレベルのペプチドが得られた（図１０及び表１）。
Ｓｉｍｏａプラットフォームにおいて分析された２つの抗Ａβ中間ドメイン抗体を用いたアッセイにより、０．７８ｐｇ／ｍｌの検出限界（ＬＯＤ）及び１．３８ｐｇ／ｍｌの定量下限（ＬＬＯＱ）（ＬＯＤ及びＬＬＯＱはＳｉｍｏａ ４ＰＬアッセイ開発ツールによって評価された）でＡβ中間ドメインペプチドを検出する高感度のイムノアッセイがもたらされたため、単球溶解物において測定可能なレベルのペプチドが得られた（図１０及び表１）。
【0196】
【表1】
【0197】
希釈係数及びスパイク、並びに単球溶解物における回収：プールされた試料をアリコートに分け、希釈効果だけでなく、様々な量の標的中間ドメインＡβペプチドを加えた効果についても試験した。回収結果を表２に示す。
【0198】
【表2】
【0199】
枯渇研究：プールした試料をアリコートに分け、標的中間ドメインＡβペプチドを試料の半分に加えた。非特異的抗体（ＬＢ５０９）及び捕捉抗体（ｍＡｂ ２Ａ９）を、処理済の試料及び未処理の試料の両方で別々にプレインキュベートした。ここで、これらの抗体は、表２の作成に使用した判定工程において使用した捕捉抗体の量と比較して１：３の比率で添加される。この枯渇研究の結果を表３に示す。
【0200】
【表3】
【0201】
したがって、イムノアッセイは健康な血液ドナー由来の単球中のＡβ中間ドメインペプチドを定量し、これによりスパイク希釈研究（表２）における良好な回収を通じて信頼性のある結果が実証された。さらに、過剰な抗体を用いた枯渇研究によりシグナルを除去した（表３）。これはイムノアッセイが細胞内Ａβを検出することができ、生体試料において許容可能な特異性を有し、高感度であることを示している。
【0202】
実施例６
細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与することが知られている酵素を使用して、α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰを酵素分解し、消化産物を特性評価した。
細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与することが知られている酵素を使用して、α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰを酵素分解し、消化産物を特性評価した。
【0203】
細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与することが知られる５つの酵素：カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、エンドセリン変換酵素－１（ＥＣＥ－１）、インスリン分解酵素（ＩＤＥ）、及びネプリライシン（ＮＥＰ）を用いてα－シヌクレインを消化した。
【0204】
細胞内タンパク質分解及び細胞外タンパク質分解に関与することが知られる４つの酵素：カテプシンＢ（ＣａｔＢ）、カテプシンＤ（ＣａｔＤ）、エンドセリン変換酵素－１（ＥＣＥ－１）、及びインスリン分解酵素（ＩＤＥ）を用いてタウ及びＭＢＰを消化した。
【0205】
ペプチド加水分解産物をＬＣ－ＭＳによって特定した。酵素消化産物を様々なインキュベーション時間後に特性評価し、こうして最初の切断部位及びより長い消化時間で生成された全てのペプチドの完全な概要の両方を特定した。
【0206】
材料
α－シヌクレイン（カタログ番号Ｓ－１００１－２、rPeptide、米国ジョージア州）を１ｍｇ／ｍｌの濃度まで１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、アリコートに分け、使用するまで－２０℃で貯蔵した。
α－シヌクレイン（カタログ番号Ｓ－１００１－２、rPeptide、米国ジョージア州）を１ｍｇ／ｍｌの濃度まで１ｍｌのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に溶解し、アリコートに分け、使用するまで－２０℃で貯蔵した。
【0207】
タウ－４４１、２Ｎ４Ｒ（カタログ番号Ｔ－１００１－２、rPeptide、米国ジョージア州）を１ｍｇ／ｍｌの濃度まで１ｍｌの水中に溶解し、アリコートに分け、使用するまで－２０℃で貯蔵した。
【0208】
ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（アミノ酸１～１９７、Ｈｉｓタグ付き）（カタログ番号ＰＡＴ－８２３４７－２、Nordic Biosite）を０．５ｍｇ／ｍｌの濃度で供給し、アリコートに分け、使用するまで－２０℃で貯蔵した。
【0209】
ＣａｔＤ（ヒト肝臓、製品番号Ｃ８６９６、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州、セントルイス）を冷えた１００ｍＭのギ酸（ＦＡ）／ギ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ３．３）中に６．２５Ｕ／ｍＬの濃度まで溶解し、アリコートに分け、使用するまで－８０℃で貯蔵した。活性ＣａｔＢ（ストック濃度２０ｎｇ／μｌ、Sigma-Aldrich、米国ミズーリ州、セントルイス）。０．０８ｍｇ／ｍＬのＮＥＰ（ヒト、組換え体、アミノ酸５３～７５０、カタログ番号ＢＭＬ－ＳＥ５３２－００１０、Enzo Life Sciences、スイス、ラウゼン）、０．５５ｍｇ／ｍＬのＩＤＥ（ラット、組換え体、アミノ酸４３～１０１９、カタログ番号Ｉ８６０１－０４）及び０．５０ｍｇ／ｍＬのＥＣＥ－１（マウス、組換え体、アミノ酸８９～７６９、カタログ番号Ｅ３６５０－０２）（どちらも、USBiological（米国、マサチューセッツ州）から購入）の水溶液を、使用するまで－８０℃で貯蔵した。製造業者の推奨に従い、組換え酵素を使用前に精製せず、ネガティブコントロール実験も行わなかった。ＺｎＣｌ２（０．１Ｍ）、ＮＨ３水溶液（２５％（容量／容量））、及びＬＣ－ＭＳ品質の水、並びに０．１％のＦＡを含むアセトニトリルをSigma-Aldrichから入手した。緩衝液の調製及びｐＨ調整のために、ＮａＣｌ、ＨＣｌ、及びＭＥＳヘミナトリウム塩をSigma-Aldrichから購入し、一方で、ＮａＯＨ及びトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）をMerck（ドイツ、ダルムシュタット）から購入した。
【0210】
酵素消化
α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰ（全て３０ｎｇ／μｌの最終濃度）を各酵素で消化して、ペプチド分解パターンを調べた。酵素と基質との比率は、ＣａｔＢ及びＣａｔＤの場合は１：５０であり、ＩＤＥ、ＥＣＥ－１、及びＮＥＰの場合は１：２５であった。ＥＣＥ－１加水分解にはＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を使用し、ＣａｔＢ加水分解にはＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭのＭＥＳ、０．０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を使用し、ＩＤＥにはトリス緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を使用し、ＮＥＰにはトリス緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ９．０）を使用し、ＣａｔＤの消化を１００ｍＭのギ酸ナトリウム／ＦＡ緩衝液（ｐＨ３．３）中で行い、全ては製造業者の推奨に従った。インキュベーションを３７℃で様々な時間（０．５分、１０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、及び２１０分）にわたって行った。ＩＤＥ消化及びＥＣＥ－１消化にＺｎＣｌ２を加えて（それぞれ５４ｐｍｏｌ及び７３ｐｍｏｌ）、高い酵素活性を実現した。所望の時間後に、ＣａｔＤの場合にはＮＨ３（２５％（容量／容量））水酸化アンモニウム水溶液を、そしてＣａｔＢ、ＥＣＥ－１、ＩＤＥ、及びＮＥＰの場合には濃ＦＡを１％（容量／容量）の最終濃度まで添加することにより、酵素反応を停止させた。
α－シヌクレイン、タウ、及びＭＢＰ（全て３０ｎｇ／μｌの最終濃度）を各酵素で消化して、ペプチド分解パターンを調べた。酵素と基質との比率は、ＣａｔＢ及びＣａｔＤの場合は１：５０であり、ＩＤＥ、ＥＣＥ－１、及びＮＥＰの場合は１：２５であった。ＥＣＥ－１加水分解にはＭＥＳ緩衝液（５０ｍＭのＭＥＳ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０）を使用し、ＣａｔＢ加水分解にはＭＥＳ緩衝液（２５ｍＭのＭＥＳ、０．０５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ５．０）を使用し、ＩＤＥにはトリス緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．１ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）を使用し、ＮＥＰにはトリス緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ９．０）を使用し、ＣａｔＤの消化を１００ｍＭのギ酸ナトリウム／ＦＡ緩衝液（ｐＨ３．３）中で行い、全ては製造業者の推奨に従った。インキュベーションを３７℃で様々な時間（０．５分、１０分、３０分、６０分、９０分、１２０分、１５０分、１８０分、及び２１０分）にわたって行った。ＩＤＥ消化及びＥＣＥ－１消化にＺｎＣｌ２を加えて（それぞれ５４ｐｍｏｌ及び７３ｐｍｏｌ）、高い酵素活性を実現した。所望の時間後に、ＣａｔＤの場合にはＮＨ３（２５％（容量／容量））水酸化アンモニウム水溶液を、そしてＣａｔＢ、ＥＣＥ－１、ＩＤＥ、及びＮＥＰの場合には濃ＦＡを１％（容量／容量）の最終濃度まで添加することにより、酵素反応を停止させた。
【0211】
液体クロマトグラフィー－質量分析
カラムを含む全てのＬＣ－ＭＳ装置をThermo Scientific（米国マサチューセッツ州、ウォルサム）から入手した。ＩＤＥタンパク質分解、ＥＣＥ－１タンパク質分解、及びＮＥＰタンパク質分解から得られたペプチドの場合は、Ａｃｃｅｌａ １２５０ ＵＨＰＬＣポンプ及びＣ４ Ａｃｃｕｃｏｒｅカラム（２．１ｍｍの内径（ｉ．ｄ．）×１５０ｍｍの長さ（Ｌ）、２．６μｍの粒子）に接続されたＰＡＬオートサンプラーを使用してＬＣ分離を実施したのに対して、ＣａｔＤでタンパク質分解されたペプチドの場合はＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８（２．１ｍｍのｉ．ｄ．×５０ｍｍのＬ、５μｍの粒子）を使用した。全ての分析に３００μＬ／分の流速を使用し、注入容量を２０μＬに設定した。Ａｃｃｕｃｏｒｅカラムでのペプチド分離の場合は、２０分で０．１％のギ酸（ＦＡ）を含む水中１％から４５％までに及ぶアセトニトリルの溶媒勾配を適用し、ＢｉｏＢａｓｉｃカラムの場合は２７．５分で２％から７０％までに及ぶメタノール水（０．１％のＦＡ）のメタノール勾配を適用した。ＢｉｏＢａｓｉｃカラム及びＡｃｃｕｃｏｒｅカラムの場合は、溶媒をそれぞれ０．５分間及び２．５分間、廃棄物へとそらした。
カラムを含む全てのＬＣ－ＭＳ装置をThermo Scientific（米国マサチューセッツ州、ウォルサム）から入手した。ＩＤＥタンパク質分解、ＥＣＥ－１タンパク質分解、及びＮＥＰタンパク質分解から得られたペプチドの場合は、Ａｃｃｅｌａ １２５０ ＵＨＰＬＣポンプ及びＣ４ Ａｃｃｕｃｏｒｅカラム（２．１ｍｍの内径（ｉ．ｄ．）×１５０ｍｍの長さ（Ｌ）、２．６μｍの粒子）に接続されたＰＡＬオートサンプラーを使用してＬＣ分離を実施したのに対して、ＣａｔＤでタンパク質分解されたペプチドの場合はＢｉｏＢａｓｉｃ Ｃ１８（２．１ｍｍのｉ．ｄ．×５０ｍｍのＬ、５μｍの粒子）を使用した。全ての分析に３００μＬ／分の流速を使用し、注入容量を２０μＬに設定した。Ａｃｃｕｃｏｒｅカラムでのペプチド分離の場合は、２０分で０．１％のギ酸（ＦＡ）を含む水中１％から４５％までに及ぶアセトニトリルの溶媒勾配を適用し、ＢｉｏＢａｓｉｃカラムの場合は２７．５分で２％から７０％までに及ぶメタノール水（０．１％のＦＡ）のメタノール勾配を適用した。ＢｉｏＢａｓｉｃカラム及びＡｃｃｕｃｏｒｅカラムの場合は、溶媒をそれぞれ０．５分間及び２．５分間、廃棄物へとそらした。
【0212】
＋３．２ｋＶで動作する加熱型エレクトロスプレーイオン化源を備えたＱ－Ｅｘａｃｔｉｖｅ Ｏｒｂｉｔｒａｐにおいて質量分析を実施した。データ依存型ＭＳ／ＭＳによって、７００００（ＭＳ）及び１７５００（ＭＳ／ＭＳ）の分解能、ｍ／ｚ ４００～１５００のスキャン範囲、並びに３ｅ６（ＭＳ）及び２ｅ５（ＭＳ／ＭＳ）のＡＧＣターゲットを使用して、データを記録した。正規化された衝突エネルギーを２５％～３５％に設定し、アンダーフィル比を１％に設定した。３０秒のダイナミックエクスクルージョン並びに＋１及び＋６以上の電荷を有するペプチドの除外を適用した。モノプロトン化ペプチド（＋１の電荷）を、確実な確認のためにターゲットＭＳ／ＭＳ法を使用して個別に分析した。
【0213】
結果
これらの結果を図１１～図１４に示す。特に、これらの図面は、酵素が多数の切断部位を標的とするものの、各タンパク質が、少数の切断部位を有する又は切断部位を有しない少なくとも１つの領域を含むことも示している。特に、α－シヌクレインの場合、分解されにくいこれらの領域は残基３９～残基５３、残基５３～残基７２、及び残基７６～残基９０であり、タウの場合、分解されにくい領域は残基２８１～残基３２２であり、ＭＢＰの場合、分解されにくい領域は残基３０～残基７０である。これらの結果は、これらの分解されにくい断片がＭＰＳ細胞において保持されているため検出することができると予想され得ることを示している。
これらの結果を図１１～図１４に示す。特に、これらの図面は、酵素が多数の切断部位を標的とするものの、各タンパク質が、少数の切断部位を有する又は切断部位を有しない少なくとも１つの領域を含むことも示している。特に、α－シヌクレインの場合、分解されにくいこれらの領域は残基３９～残基５３、残基５３～残基７２、及び残基７６～残基９０であり、タウの場合、分解されにくい領域は残基２８１～残基３２２であり、ＭＢＰの場合、分解されにくい領域は残基３０～残基７０である。これらの結果は、これらの分解されにくい断片がＭＰＳ細胞において保持されているため検出することができると予想され得ることを示している。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11-1】
【図11-2】
【図12】
【図13】
【図14】
【配列表】
【手続補正書】
【提出日】2023-11-17
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、前記方法は、ｉ）ＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、前記ＭＰＳ細胞による前記疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料における前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、前記作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含み、ここで、
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する前記作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定し、かつ、
前記疾患マーカー産物がＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）である場合、工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片又はＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片の細胞内量を、Ａβ １－４２ （配列番号１）又はＡβ １－４０ （配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによって検出することを含む、方法。
【請求項2】
前記ＭＰＳ細胞は、ミクログリア細胞、マクロファージ、又は単球である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法は、単球をマクロファージに分化させる工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＰＳ細胞は、ヒト被験体から得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＭＰＳ細胞は、ＣＳＦ試料又は血液試料から得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞を培養することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質若しくは阻害物質であるか、又は炎症性活性化物質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記作用物質は、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、ＦＦＡＲ４アゴニスト、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭ、ラパマイシン、バフィロマイシン、ネプリライシン阻害物質、ＩＤＥ阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭの組合せ、又はＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質の組合せである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記作用物質は、前記ＦＦＡＲ４アゴニストは、ＤＨＡであり、前記α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭは、ＮＳ１７３８であり、かつ前記ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭの組合せは、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、タウタンパク質、α－シヌクレイン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）若しくはＴＤＰ－４３、若しくはそれらの断片であるか、又は前記断片は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片若しくはＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、アルツハイマー病に関連している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端、配列番号６のＣ末端、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又はＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端又はＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の領域の２つ以上を検出することによって、Ａβ
１－４２
（配列番号１）又はＡβ
１－４０
（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
工程ｉｉｉ）は、
ｉ）残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、及び残基３１～残基３４又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、
ｉｉ）配列番号６のＮ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域の残基３４～４０残基又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
ｉｉｉ）配列番号６のＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、及び／又は、
ｉｖ）Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、抗体を使用してＡβ
１－４２
（配列番号１）又はＡβ
１－４０
（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な又は配列番号４に特異的な抗体を使用してＡβ
１－４２
（配列番号１）又はＡβ
１－４０
（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
工程ｉｉｉ）は、タウ、α－シヌクレイン、ＴＤＰ－４３、又はＭＢＰの少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記断片は、タウがアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間、又はアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間、アミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又はアミノ酸残基７２とアミノ酸残基７３との間、又はアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又はアミノ酸残基９０とアミノ酸残基９１との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間、又はアミノ酸残基３２０とアミノ酸残基３２１との間、又はアミノ酸残基３２３とアミノ酸残基３２４との間、又はアミノ酸残基３６０とアミノ酸残基２６１との間、アミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間、又はアミノ酸残基２８５とアミノ酸残基２８５との間、及び／又はアミノ酸残基３３１とアミノ酸残基３３２との間で切断されたもの、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記断片は、タウタンパク質がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたもの、又は、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
工程ｉｉｉ）は、前記疾患マーカー産物の２つ以上の断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
工程ｉｉ）において、前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質又は活性化物質であり、かつ工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞の試料を炎症性活性化物質に加えて前記作用物質に曝露することを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記コントロールＭＰＳ細胞は、請求項１の工程ｉ）及び工程ｉｉ）を経た細胞であるが、但し、前記コントロールＭＰＳ細胞は、前記作用物質には曝露されていない、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記方法は、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対する一連の作用物質の効果を比較し、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対して最大の効果を有する前記作用物質を特定するものである、前記方法は、前記神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである、
前記方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する疾患又は病態の診断において使用するものである、又は
前記方法は、個別化医療において作用物質がヒト被験体に有効な治療であるかどうかを判定するのに使用するものであり、ここで、前記方法の工程ｉ）は、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持することを含み、かつ前記作用物質の前記ヒト被験体に対する有効性を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
を含むキット。
【請求項28】
前記キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、
タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、
を含む、請求項２７に記載のキット。
【手続補正書】
【提出日】2023-12-15
【手続補正1】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項1】
神経変性及び／又は炎症性活性化に関連する疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の単球食細胞系（ＭＰＳ）細胞による触媒作用に対する作用物質の効果を判定するｅｘ ｖｉｖｏの方法であって、前記方法は、ｉ）ＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持する工程と、
ｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料を作用物質及び疾患マーカー産物に曝露して、前記ＭＰＳ細胞による前記疾患マーカー産物の食作用を可能にする工程と、
ｉｉｉ）前記ＭＰＳ細胞の試料における前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量を検出する工程と、
ｉｖ）前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量と、前記作用物質の不存在下でのコントロールＭＰＳ細胞において測定された同じ疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の細胞内量とを比較する工程と、
を含み、ここで、
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片のＭＰＳ細胞による触媒作用に対する前記作用物質の効果を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定し、かつ、
前記疾患マーカー産物がＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）である場合、工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片又はＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片の細胞内量を、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによって検出することを含む、方法。
【請求項2】
前記ＭＰＳ細胞は、ミクログリア細胞、マクロファージ、又は単球である、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記方法は、単球をマクロファージに分化させる工程を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項4】
前記ＭＰＳ細胞は、ヒト被験体から得られる、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
前記ＭＰＳ細胞は、ＣＳＦ試料又は血液試料から得られる、請求項４に記載の方法。
【請求項6】
工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞を培養することを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質若しくは阻害物質であるか、又は炎症性活性化物質である、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記作用物質は、Ａβ１－４２、Ａβ１－４０、ＦＦＡＲ４アゴニスト、α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭ、ラパマイシン、バフィロマイシン、ネプリライシン阻害物質、ＩＤＥ阻害物質、ＢＡＣＥ阻害物質、ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト若しくはＰＡＭの組合せ、又はＩＤＥ阻害物質、ネプリライシン阻害物質、及びＢＡＣＥ阻害物質の組合せである、請求項７に記載の方法。
【請求項9】
前記作用物質は、前記ＦＦＡＲ４アゴニストは、ＤＨＡであり、前記α７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭは、ＮＳ１７３８であり、かつ前記ＦＦＡＲ４アゴニスト及びα７ ｎＡＣｈＲアゴニスト又はＰＡＭの組合せは、ＤＨＡ及びＮＳ１７３８の組合せである、請求項７又は８に記載の方法。
【請求項10】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、タウタンパク質、α－シヌクレイン、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）若しくはＴＤＰ－４３、若しくはそれらの断片であるか、又は前記断片は、Ａβ１－４０（配列番号２）の断片若しくはＡβ１－４２（配列番号１）の残基４１を含むＡβ１－４２（配列番号１）の断片である、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項11】
前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片は、アルツハイマー病に関連している、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項12】
工程ｉｉｉ）は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４、残基３１～残基３４、又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項13】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端、配列番号６のＣ末端、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２９を含む断片の領域、及び／又はＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１又は１２に記載の方法。
【請求項14】
工程ｉｉｉ）は、配列番号６のＮ末端又はＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の領域の２つ以上を検出することによって、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項15】
工程ｉｉｉ）は、ｉ）残基２１～残基２４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、及び残基３１～残基３４又は残基３９及び残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含む断片の領域、
ｉｉ）配列番号６のＮ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
ｉｉｉ）配列番号６のＣ末端、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、及び／又は、
ｉｖ）Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１～残基２４を含む断片の領域、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４～残基４０又は残基３４～残基４１を含む断片の領域、
を検出することによってＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項16】
前記少なくとも１つの断片は、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）がアミノ酸残基１９とアミノ酸残基２０との間、及び／又はアミノ酸残基３４とアミノ酸残基３５との間で切断されたものである、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項17】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１～１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号３又は配列番号７に特異的な抗体、及び配列番号６のＣ末端に特異的な又は配列番号４に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項19】
前記方法の工程ｉｉｉ）は、配列番号５、配列番号８、又は配列番号９に特異的な抗体を使用してＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片を検出することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
工程ｉｉｉ）は、タウ、α－シヌクレイン、ＴＤＰ－４３、又はＭＢＰの少なくとも１つの断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記断片は、タウがアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間、又はアミノ酸残基３０５とアミノ酸残基３０６との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間、アミノ酸残基５２とアミノ酸残基５３との間、及び／又はアミノ酸残基７２とアミノ酸残基７３との間、又はアミノ酸残基７５とアミノ酸残基７６との間、及び／又はアミノ酸残基９０とアミノ酸残基９１との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間、又はアミノ酸残基３２０とアミノ酸残基３２１との間、又はアミノ酸残基３２３とアミノ酸残基３２４との間、又はアミノ酸残基３６０とアミノ酸残基２６１との間、アミノ酸残基２４５とアミノ酸残基２４６との間、及び／又はアミノ酸残基２５５とアミノ酸残基２５６との間、又はアミノ酸残基２８５とアミノ酸残基２８５との間、及び／又はアミノ酸残基３３１とアミノ酸残基３３２との間で切断されたもの、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
前記断片は、タウタンパク質がアミノ酸残基２８０とアミノ酸残基２８１との間、及び／又はアミノ酸残基３２２とアミノ酸残基３２３との間で切断されたもの、
α－シヌクレインがアミノ酸残基３８とアミノ酸残基３９との間、及び／又はアミノ酸残基５３とアミノ酸残基５４との間で切断されたもの、
ＴＤＰ－４３がアミノ酸残基３１０とアミノ酸残基３１１との間、及び／又はアミノ酸残基３３４とアミノ酸残基３３５との間で切断されたもの、又は、
ＭＢＰがアミノ酸残基２９とアミノ酸残基３０との間、及び／又は残基７０と残基７１との間で切断されたもの、
である、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
工程ｉｉｉ）は、前記疾患マーカー産物の２つ以上の断片の細胞内量を検出することを含む、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項24】
工程ｉｉ）において、前記作用物質は、ＭＰＳのオートファジー系及び／又はエンドリソソーム系の刺激物質又は活性化物質であり、かつ工程ｉｉ）は、前記ＭＰＳ細胞の試料を炎症性活性化物質に加えて前記作用物質に曝露することを含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項25】
前記コントロールＭＰＳ細胞は、請求項１の工程ｉ）及び工程ｉｉ）を経た細胞であるが、但し、前記コントロールＭＰＳ細胞は、前記作用物質には曝露されていない、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項26】
前記方法は、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対する一連の作用物質の効果を比較し、前記疾患マーカー産物及び／又はその少なくとも１つの断片の触媒作用に対して最大の効果を有する前記作用物質を特定するものである、前記方法は、前記神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する病態の治療において使用される作用物質をスクリーニングするものである、
前記方法は、神経変性及び／又は炎症性活性化及び／又は神経変性に関連する疾患又は病態の診断において使用するものである、又は
前記方法は、個別化医療において作用物質がヒト被験体に有効な治療であるかどうかを判定するのに使用するものであり、ここで、前記方法の工程ｉ）は、ヒト被験体から得られたＭＰＳ細胞の試料を前記ＭＰＳ細胞が生きたままとなる条件下で維持することを含み、かつ前記作用物質の前記ヒト被験体に対する有効性を、工程ｉｖ）の比較結果によって判定する、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項27】
Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基７６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基９０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
タウ（配列番号１４）の残基３０６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２４６を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基２５５を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体から選択される１つ以上の抗体、
を含むキット。
【請求項28】
前記キットは、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基２１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片の領域に特異的な抗体、Ａβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、及びＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の残基４０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＡβ１－４２（配列番号１）又はＡβ１－４０（配列番号２）の断片に特異的な抗体、
α－シヌクレイン（配列番号１０）の残基３９を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、及びα－シヌクレイン（配列番号１０）の残基５３を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むα－シヌクレイン（配列番号１０）の断片の領域に特異的な抗体、
タウ（配列番号１４）の残基２８１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、及びタウ（配列番号１４）の残基３２２を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むタウ（配列番号１４）の断片の領域に特異的な抗体、
ＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３１１を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、及びＴＤＰ－４３（配列番号１７）の残基３３４を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＴＤＰ－４３（配列番号１７）の断片の領域に特異的な抗体、又は、
ＭＢＰ（配列番号２０）の残基３０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、及びＭＢＰ（配列番号２０）の残基７０を含む少なくとも４つのアミノ酸を含むＭＢＰ（配列番号２０）の断片の領域に特異的な抗体、
を含む、請求項２７に記載のキット。
【国際調査報告】