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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-29
(54)【発明の名称】粒子分離装置システム、材料、および使用方法
(51)【国際特許分類】
C12Q 1/02 20060101AFI20240221BHJP
G01N 1/10 20060101ALI20240221BHJP
C12M 1/42 20060101ALN20240221BHJP
G01N 1/40 20060101ALN20240221BHJP
【ＦＩ】
C12Q1/02
G01N1/10 C
C12M1/42
G01N1/40
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023543302
(86)(22)【出願日】2022-01-19
(85)【翻訳文提出日】2023-09-15
(86)【国際出願番号】 US2022013018
(87)【国際公開番号】W WO2022159521
(87)【国際公開日】2022-07-28
(31)【優先権主張番号】63/139,301
(32)【優先日】2021-01-19
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】521242749
【氏名又は名称】レヴィタスバイオ・インコーポレイテッド
【氏名又は名称原語表記】ＬＥＶＩＴＡＳＢＩＯ， ＩＮＣ．
(74)【代理人】
【識別番号】100145403
【弁理士】
【氏名又は名称】山尾 憲人
(74)【代理人】
【識別番号】100106518
【弁理士】
【氏名又は名称】松谷 道子
(74)【代理人】
【識別番号】100138911
【弁理士】
【氏名又は名称】櫻井 陽子
(72)【発明者】
【氏名】ブロディー，セス
(72)【発明者】
【氏名】フェイサー，ジェフ
(72)【発明者】
【氏名】ジェット，スサナ
(72)【発明者】
【氏名】トラバース，ケビン
【テーマコード（参考）】
2G052
4B029
4B063
【Ｆターム（参考）】
2G052AA28
2G052AB16
2G052AD09
2G052AD29
2G052DA05
2G052ED01
2G052GA11
2G052HC28
4B029AA09
4B029BB11
4B029CC01
4B029DG06
4B029FA15
4B029GA08
4B029HA05
4B063QA20
4B063QQ08
4B063QS12
4B063QS39
4B063QX02
(57)【要約】
本発明は、磁気浮上を使用して、細胞破片、核破片、および死細胞から、細胞核および／または生細胞を分離し、および／または濃縮するための方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
細胞核を単離する方法であって、細胞核を含むサンプルと、常磁性化合物または磁性流体を含むサンプル媒体とを、分離チャネルに装填することと、
少なくとも１つの磁石を用いて前記サンプルに磁力をかけて、分離に影響を与えることと、
さらなる遠心分離なしで、細胞核を含む、前記分離されたサンプルの少なくとも１つの画分を収集することと、
前記分離前、前記分離中、および／または前記分離後に、前記サンプル中の前記細胞核を適宜撮像することと
を含む方法。
【請求項2】
前記サンプルが約５０～約１０，０００，０００の細胞核を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項3】
前記サンプルが、生細胞、死細胞、または細胞破片をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項4】
画分における細胞核の濃度が、元のサンプルから、少なくとも１．１倍に増加される、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項5】
元のサンプルにおける非細胞核粒子の濃度が、前記画分において少なくとも約１％減少される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項6】
サンプルからの画分における単離された細胞核の完全性が、遠心分離を含む方法によるサンプルからの画分における単離された細胞核の完全性よりも、少なくとも約３０％高い、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項7】
前記細胞核が、ヒト細胞、ヒト以外の動物細胞、または植物細胞から単離される、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項8】
前記細胞核が、正常細胞、異常細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞、または遺伝子組換え細胞から単離される、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項9】
生細胞および／または細胞核、死細胞および核破片を含む混合物から、前記生細胞および／または細胞核を分離するための方法であって、Ａ）流体サンプル処理装置であって、
（ｉ）処理チャネルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）前記入口チャネルを前記処理チャネルに接続する入口接続領域と、
（ｉｖ）前記処理チャネルのＸ軸に沿って前記処理チャネルの上側および下側に整列した複数の磁性部品と、
（ｖ）複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）前記処理チャネルを前記出口チャネルに接続する出口接続領域と、
（ｖｉｉ）出口接続領域において前記処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、
（ｖｉｉｉ）出口接続領域において前記処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、
（ｉｘ）前記第１の出口チャネルに関連する第１の流れ調整器および前記第２の出口チャネルに関連する第２の流れ調整器と
を備える、流体サンプル処理装置を用意することと、
Ｂ）前記混合物を、前記流体サンプル処理装置を通して流すことにより、前記生細胞および／または細胞核を富化した第１の回収サンプル、ならびに前記生細胞および／または細胞核を枯渇させた第２の回収サンプルをもたらすことと
を含む方法。
【請求項10】
前記第１の回収サンプルが細胞核を富化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項11】
前記第１の回収サンプルが生細胞を富化されている、請求項９に記載の方法。
【請求項12】
ａ）前記第１の回収サンプルにおける生細胞の収率が、前記混合物の全体の生細胞組成の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％であり、および／またはｂ）前記第１の回収サンプルにおける細胞核の収率が、前記混合物の前記生細胞組成からの全体の細胞核の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％である、
請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項13】
前記出口接続領域が、流れスプリッタ部分をさらに備える、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項14】
前記流れスプリッタ部分が、前記処理チャネルの中に突出し、流れを前記出口チャネルにおける別の流れへと分離するように構成および配置される、請求項１３に記載の方法。
【請求項15】
前記第１の出口チャネルに関連する第１の流量センサおよび前記第２の出口チャネルに関連する第２の流量センサをさらに備える、請求項９から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項16】
流量センサが、流れ調整器に動作可能に連結される、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
光センサと、前記光センサと相対する側に、または角度的に隣接して構成された照明光源とをさらに備え、前記照明光源が紫外線を放射してもよい、請求項９から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項18】
光検出器、マルチ画素撮像検出器、磁界検出器、電気化学検出器、光学的位相検出器、散乱検出器、ホールセンサ、磁気抵抗センサ、電磁放射測定センサ、表面弾性波センサ、バイオセンサ、容量性センサ、導電性センサ、熱センサ、流量センサ、超音波センサ、重力センサ、磁界センサまたはこれらの組み合せであるセンサと、複数の流れ調整器に動作可能に連結されたコントローラと
を備える、請求項９から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項19】
前記流体サンプル処理装置が、平面基板を備えるフローセルカートリッジを備え、前記平面基板が、（ｉ）上面および下面と、
（ｉｉ）撮像面を形成する第１の長手方向の面と、
（ｉｉｉ）照明面を形成する第２の長手方向の面と、
（ｉｖ）第１および第２の横面と、
（ｖ）上面における入口ウェルと、
（ｖｉ）入口チャネルと、
（ｖｉｉ）前記入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、
（ｖｉｉｉ）前記処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｉｘ）前記処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｘ）前記複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルと
を備え、
前記基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、前記処理チャネルが、前記撮像面に対して空間的に片寄るように前記基板の前記平面内でオフセットされる、
請求項９から１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項20】
前記流体サンプル処理装置が、平面基板を備えるフローセルカートリッジを備え、前記平面基板が、（ｉ）上面における入口ウェルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）サンプル処理チャネルと、
（ｉｖ）前記処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｖ）前記処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）前記複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルと
を備え、
前記基板が、光学的に透明な材料を含み、前記複数の出口チャネルの各々を合わせた容量が前記処理チャネルの容量よりも大きい、
請求項９から１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項21】
前記フローセルカートリッジの前記出口チャネルが、コンパクトな経路を辿り、たとえば前記出口チャネルが蛇行形状のチャネルである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項22】
生細胞および／または細胞核、死細胞および核破片を含む混合物から、前記生細胞および／または細胞核を分離する方法であって、処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備えるフローセルカートリッジを用意することであって、前記フローセルカートリッジの前記出口チャネルが、前記処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、
前記処理チャネルに、生細胞および死細胞を含むサンプル溶液と、常磁性化合物とを流すことと、
前記処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中に前記フローセルカートリッジを配置することと、
前記処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、前記処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、前記磁界の中に、流れ停止状態に保つことと、
生細胞および／または細胞核を富化したサンプル画分と、死細胞および核破片を富化したサンプル画分とを、前記出口チャネルに同時に回収することと
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
関連出願の相互参照
この出願は、２０２１年１月１９日出願の米国特許仮出願第６３／１３９，３０１号の優先権の利益を主張するものであり、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
この出願は、２０２１年１月１９日出願の米国特許仮出願第６３／１３９，３０１号の優先権の利益を主張するものであり、その開示の全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【0002】
本発明は、一般に、細胞または生体分子などの微粒子含有サンプルの濃縮に関し、濃縮は、媒体中のそのような粒子を単離する、また粒子枯渇媒体を単離する目的である。本発明は、いくつかの実施形態では、一般に、核破片および死細胞からの細胞核の分離および／または濃縮に関する。
【背景技術】
【0003】
媒体に含有される粒子の単離は、多くの化学的プロセスや生物学的プロセスにおいて重要なステップである。いくつかのプロセスでは、粒子の使用または操作を容易にするために、粒子を単純に単離する必要があり得る一方で、他のプロセスでは、粒子を、媒体の中に存在する他の粒子から分離する必要もあり得る。そのような粒子の単離や分離を容易にするために、様々な装置が開発されている。加えて、不均一な粒子の集団から関心のある粒子を分離するために、粒子およびその周囲の媒体の磁気特性に頼る装置の開発が試みられている。
【0004】
細胞を扱うときのよくある必要性は、細胞が懸濁される容量を低減して細胞を濃縮することである。細胞濃縮のための最も一般的な手順は、細胞を遠心分離して、ペレットを形成し、媒体の大部分を除去するものである。遠心分離は、遠心力を利用して、粒子のサイズ、形状、密度、媒体の粘度、およびローターの速度に応じて、溶液から粒子を分離することを含む。しかしながら、遠心分離には、細胞に損傷を与え得る、または細胞を活性化し得る、遠心分離が望ましくない場合がある。たとえば、Ｔ細胞は、遠心分離すると活性化する可能性がある。加えて、遠心分離などのバルク分離技術は、希少なサンプルまたは小容量のサンプルを扱うとき非常に浪費的になるかまたは面倒になることがあり、サンプルの分画が簡単ではないこともある。また、生物学的存在を扱うときなど、分離するべき粒子が脆弱であるかまたは不安定であると、粒子の安定性を良くするための正確な条件の難易度が高くなる可能性がある。
【0005】
処理が困難である組織およびサンプルを扱う場合、細胞核は、単一細胞の研究開発に関する主要な目標のうちの１つに、急速になってきた。細胞は、細胞核よりも、扱うのがはるかに簡単でより直接的なはずであるが、組織の処理は、実際には、大抵の場合、思ったよりもはるかに複雑かつ困難である。
【0006】
細胞組織は、処理されるとき、それらの細胞の組成、細胞外基質、および解離挙動が変化する。そのため、研究者は、高信頼度かつ高品質の単一細胞懸濁を生成し、十分に検証され、かつ均一に動作する解離および精製のプロトコルを確立するのは、ますます困難になることを見出した。あるいは、細胞核作業の流れは、単一細胞分析のためのはるかに均一で標準化された出発材料を用意するばかりでなく、細胞組織の解離および処理に関連した遺伝子発現変化の可能性のうちいくつかを解消することによって、これらの課題の多くを克服するものである。
【0007】
残念ながら、細胞核の調製はそれ自体に課題がある。具体的には、死細胞および破片から取り出した細胞核を精製する方法に課題がある。伝統的方法は、使用するのが困難で時間がかかり、細胞核の収率が悪く、純度も低い状態が続いている。ＬｅｖｉＣｅｌｌは、細胞核を精製するための、高速、簡単、かつ高効率の方法を提供する。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本明細書で説明される装置および方法は、粒子（たとえば細胞、細胞核）を濃縮するための代替方法を提供して、遠心分離中に必要とされる大きい機械力に依存せず粒子枯渇媒体を生成することにより、これらの問題に対処するものである。
【課題を解決するための手段】
【0009】
この発明の概要において提供される本発明の実施形態は、例示的なものにすぎず、本明細書で開示される選択された実施形態の概要を提供することを意図している。この発明の概要は、例示的かつ選択的なものであり、いかなる請求項の範囲も限定せず、本明細書で開示されるかまたは企図される本発明の進歩性のある実施形態の全体の範囲を提供するものではなく、この開示またはあらゆる特許請求される本発明の進歩性のある実施形態の範囲を限定または制約するものと解釈されるべきではない。
【0010】
本明細書で提供される流体濃縮装置は、入口チャネルと、処理チャネルと、少なくとも２つの出力チャネルと、流体濃縮装置を通して粒子含有サンプルを移動するためのポンプとを含む。濃縮装置は、粒子濃縮流れまたは粒子枯渇流れのすべてまたは画分を収集するように、弁または機能的に類似の分流技術によって制御され得る別個の分流チャネルを有し得る。濃縮装置は、自動制御された動作が可能であり、粒子の有無もしくは量、または粒子もしくはサンプル流の他の物理的性質または化学的性質を検出するために、処理チャネルまたは入口チャネルの一部の内部に、またはこれに隣接して、１つまたは複数のセンサをさらに備える。検出器の出力は、濃縮および分画の条件を最適化するように、濃縮器の制御装置（concentrator controls）に対して操作可能に連結され得る。粒子の濃縮／枯渇は、重力沈降、磁気浮上／磁力反発（magnetic levitation/repulsion）、およびこれらの組み合せによる装置によって物理的に達成され得る。入口チャネルの処理チャネルへの境界面は、好ましくは、幾何学的に、処理チャネルの乱流を低減するかまたは解消するように構成される。処理チャネルと出力チャネルとの間の境界面は、好ましくは、幾何学的に、層状流れ、粒子富化流れおよび粒子枯渇流れの、それぞれの出口チャネルへの収集を容易にするように構成される。
【0011】
また、本明細書が提供する流体濃縮装置は、磁性部品（magnetic component）が、処理チャネル（Ｘ軸）に沿って実質的に直線状に配置されており、その常磁性に基づき、処理チャネルの粒子の磁気的な反発または引力をもたらす。磁性部品は、処理チャネル内の粒子の沈降を誘起するかまたは増大するように機能し得る。処理チャネルに沿った磁性部品（magnet component）を備える流体濃縮装置を付加的に適用すると、そのような装置は、小さい重力または微小重力の環境でも動作することができる。あるいは、場合によっては、サンプル流体が不均質な粒子混合物であるとき、磁性部品が、サンプル流体の中のある特定の粒子の沈降を選択的に抑止し得る。いくつかの実施形態では、入口チャネルの内部に磁界を供給すると、入口チャネルから処理チャネルへの粒子流れの克服可能な阻害を提供することができるので、前濃縮の効果が得られる。入口チャネルの磁界は、磁石を、処理チャネルに沿って入口チャネルへと実質的に直線状に行き渡らせることによって誘起され得る。あるいは、磁性部品は、処理チャネルから独立して、入口チャネルと磁気伝達するように配置されてよい。これは、一実施形態では棒磁石であり、別の実施形態では、入口チャネルの一部またはすべてを取り囲む円環状磁石またはトロイダル磁石である。入口チャネルの磁石は、永久磁石でよく、または磁気コントローラによって制御される電磁石でもよい。以下に例示されるさらなる実施形態では、複数の磁性部品が、処理チャネルに対して実質的に直線状に配置され得る。そのような実施形態の１つでは、異なる磁界強度を供給する磁石が、処理チャネルに対して、互いに相対する側（たとえば最上部と最下部）に、平行かつ実質的に直線状に配置される。この実施形態は、前濃縮工程または装置構成と組み合わせたとき、不均質な粒子構成を含有しているサンプルの所定の粒子成分を選択的に濃縮するように作用することができる。処理チャネルの外部における粒子の蓄積は、サンプル流量と入口チャネル内のサンプル液媒体の中の粒子移動度とに依拠するパッシブプロセスであり得る。処理チャネルの外部における粒子の蓄積は、入口チャネル内の磁界を利用して磁界内の粒子を妨げるアクティブプロセスであり得る。入口チャネルから処理チャネルへの粒子移動の妨害は、流量または流れパターンを操作することによって克服され得る。たとえば、流量を増加させるか、またはチャネル圧力を増加させる、１つまたは複数のパルスを導入すると、入口チャネルの粒子移動度が向上する。入口チャネルに電磁界を誘導することによって粒子が阻止されたとき、入口チャネルの磁界の低減、入口チャネルの流量もしくは圧力の加減、または磁界とサンプルの流動性との組み合せによって、入口チャネルから処理チャネルへの粒子移動度が向上され得る。
【0012】
本明細書でさらに提供される粒子濃縮装置は、流体処理チャネル構造、少なくとも１つの磁性部品、および少なくとも２つの出力ポートを備え、流体処理チャネルが含む実質的に直線状の部分は、入力ポートと流体連通する先端と、出力ポートと流体連通する後端とを有する。少なくとも２つの出力ポートが実質的に平行に構成される。この実施形態によれば、出力ポートの各々が、少なくとも１つの収集経路を備え、収集経路は、後続の処理工程に必要な、所定の量の材料を含有する収集チャンバに通じる。流体チャネル構造は、一般的にはマイクロキャピラリーチャネルであり、粒子は、これを通って、自由に、または所望の速度で流れることができる。この装置は、流体を、入力ポートから流体チャネル構造を通して駆動するように構成された１つまたは複数のポンプをさらに備え得る。いくつかの実施形態では、この装置は、粒子の経路および／または流量を制御するための１つまたは複数の弁をさらに備える。
【0013】
サンプル濃縮の実施形態
本発明の方法の実施形態が、以下の番号付けされた実施形態においてさらに説明される。番号付けされた実施形態は、本発明を限定するものではなく、本明細書で説明されたさらなる要素および代替形態を組み込み得る。
本発明の方法の実施形態が、以下の番号付けされた実施形態においてさらに説明される。番号付けされた実施形態は、本発明を限定するものではなく、本明細書で説明されたさらなる要素および代替形態を組み込み得る。
【0014】
第１の実施形態（１）は、サンプルを濃縮する方法であって、（ｉ）処理チャネル、入口チャネル、および複数の出口チャネルを有する小容量の流体装置を用意することと、（ｉｉ）少なくとも粒子富化層および粒子枯渇層を有するサンプル流を生成する条件の下で、粒子含有サンプルを、入口チャネルを通して処理チャネルに流し込むことと、（ｉｉｉ）第１の出口チャネルを通して粒子富化層を流し、粒子富化流を生成することと、（ｉｖ）第２の出口チャネルを通して粒子枯渇層を流し、粒子枯渇流を生成することと、（ｖ）１つまたは複数の出口チャネルからの流れのうち１つまたは複数を収集することとを含む、方法である。
【0015】
第２の実施形態（２）は、粒子含有サンプルを、サンプル粒子の粒子富化流の中への沈降を誘起するのに十分な流れ状態にすることをさらに含む、第１の実施形態に記載の方法である。第３の実施形態（３）は、処理チャネルの最上部から、処理チャネルのＸ軸に整列した（aligned）磁界を供給して、サンプル中の粒子を粒子富化流の中へ反発させることをさらに含む、第１の実施形態（１）に記載の方法である。第４の実施形態（４）は、（ｉ）入口チャネルの内部に磁界を誘起して、粒子が入口チャネルから処理チャネルへ移動するのを妨げ、入口チャネル内にサンプル流の粒子濃縮部分を形成することと、（ｉｉ）サンプル流の粒子濃縮部分を処理チャネルに移動することと、（ｉｉｉ）粒子富化流を生成することと、（ｉｖ）出口チャネルを通して粒子富化流を流すことと、（ｖ）粒子富化流を捕捉することとをさらに含む、実施形態２または３に記載の方法である。
【0016】
第５の実施形態（５）は、（ｉ）入口チャネルの内部に磁界を誘起して、粒子が入口チャネルから処理チャネルへ移動するのを妨げ、入口チャネル内にサンプル流の粒子濃縮区間を形成することと、（ｉｉ）サンプル流の妨げられない部分を処理チャネルに移動することと、（ｉｉｉ）粒子枯渇流を生成することと、（ｉｖ）出口チャネルを通して粒子枯渇流を流すことと、（ｖ）粒子枯渇流を捕捉することとをさらに含む、実施形態２または３（２～３）に記載の方法である。
【0017】
第６の実施形態（６）は、処理チャネル内の粒子富化層における粒子を測定して、相対的な粒子の濃度または位置を判定することと、処理チャネル内の相対的に高い粒子の濃度または粒子の位置に基づき、粒子富化層の画分を収集することとをさらに含む、実施形態１から４（１～４）のいずれか１つに記載の方法である。第７の実施形態（７）は、処理チャネル内の粒子枯渇層における粒子を測定して、相対的な粒子の濃度を判定することと、相対的に低い粒子の濃度に基づき、粒子枯渇層の画分を収集することとをさらに含む、実施形態１から３（１～３）または実施形態５（５）に記載の方法である。
【0018】
第８の実施形態（８）は、処理チャネルの最上部から生成された磁界と連続している、処理チャネルのＸ軸に沿って整列された（aligned）入口チャネルの内部に、磁界を供給することをさらに含む、実施形態５（５）に記載の方法である。第９の実施形態（９）は、入口チャネルを取り囲むトロイダル磁界を生成することをさらに含む、実施形態５（５）に記載の方法である。第１０の実施形態（１０）は、入口チャネル内の磁界を調整して、入口チャネル内の粒子富化区間の処理チャネルへの移動を促進することをさらに含む、実施形態９（９）に記載の方法である。
【0019】
第１１の実施形態（１１）は、処理チャネル内の粒子特性を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１から１０（１～１０）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態１２（１２）は、粒子富化流の中の粒子特性を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１１（１１）に記載の方法である。実施形態１３（１３）は、処理チャネル内の粒子特性を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０または１２（１０または１２）に記載の方法である。
【0020】
第１４の実施形態（１４）は、粒子富化流の中の粒子特性を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１３（１３）に記載の方法である。
【0021】
第１５の実施形態（１５）は、入口チャネル内の粒子特性を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１から１０（１～１０）のいずれか１つに記載の方法である。第１６の実施形態（１６）は、入口チャネル内の粒子特性を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０（１０）に記載の方法である。第１７の実施形態（１７）は、相対的な粒子濃度または粒子密度を検出することをさらに含む、実施形態１１から１６（１１～１６）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態１８（１８）は、処理チャネル内の化学的性質を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０から１７（１０～１７）のいずれか１つに記載の方法である。第１９の実施形態（１９）は、粒子富化流の中の化学的性質を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０から１７（１０～１７）のいずれか１つに記載の方法である。
【0022】
第２０の実施形態（２０）は、処理チャネル内の化学的性質を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０から１７（１０～１７）のいずれか１つに記載の方法である。第２１の実施形態（２１）は、粒子富化流の中の化学的性質を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態２０（２０）に記載の方法である。第２２の実施形態（２２）は、入口チャネル内の化学的性質を検出することと、サンプル流量を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１から２１（１～２１）のいずれか１つに記載の方法である。
【0023】
実施形態２３（２３）は、入口チャネル内の化学的性質を検出することと、入口チャネル内の磁界を調整して、粒子富化流の中の粒子の濃度を操作することとをさらに含む、実施形態１０から２２（１０～２２）のいずれか１つに記載の方法である。
【0024】
実施形態２４（２４）は、特性が、電気化学特性、フォトニック特性、分光学的特性、または結合特性である、実施形態１８から２３（１８～２３）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態２５（２５）は、収集チャネルに粒子枯渇流を分流することと、粒子枯渇流の画分を捕捉することとをさらに含む、実施形態１から２４（１～２４）のいずれか１つに記載の方法である。
【0025】
実施形態２６（２６）は、収集チャネルに粒子富化流を分流することと、粒子富化流の画分を捕捉することとをさらに含む、実施形態１から２５（１～２５）のいずれか１つに記載の方法である。
【0026】
実施形態２７（２７）は、粒子枯渇流を分流することとそれぞれの収集チャネルに粒子富化流を分流することと、各流れの画分を捕捉することとをさらに含む、実施形態１から２６（１～２６）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態２８（２８）は、流れの複数の個別の画分を捕捉することをさらに含む、実施形態２７（２７）に記載の方法である。実施形態２９（２９）は、粒子枯渇流および粒子富化流から非同時の画分を捕捉することをさらに含む、実施形態２７または２８（２７または２８）に記載の方法である。
【0027】
実施形態３０（３０）は、サンプルに、入口チャネルに入る前に常磁性化合物を追加することをさらに含む、実施形態１から２９（１～２９）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態３１（３１）は、単離された画分に対して後続の反応を実行することをさらに含む、実施形態１から３０（１～３０）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態３２（３２）は、後続の反応が、結合反応、ＰＣＲ反応、シーケンシングサンプル調製反応、酵素分解反応、または酵素合成反応である、実施形態３１（３１）に記載の方法である。実施形態３３（３３）は、収集されたサンプルが、細胞培養、蛍光活性化細胞選別、または磁気浮上細胞選別を受ける、実施形態３１（３１）に記載の方法である。
【0028】
実施形態３４（３４）は、サンプル流体が、最初に、処理チャネルに対して、実質的に直線状には整列されない角度で流され、次いで、処理チャネルに対して実質的に直線状の角度で流される、実施形態１から３３（１～３３）のいずれか１つに記載の方法である。
【0029】
実施形態３５（３５）は、血液サンプルを分画する方法であって、（ｉ）全血サンプルまたは希釈血液サンプルを用意することと、（ｉｉ）全血サンプルまたは希釈血液サンプルに、実施形態１から３４（１～３４）のいずれか１つに記載のサンプル濃縮方法を施し、全血サンプルまたは希釈血液サンプルから血漿および／または血液細胞を単離することとを含む、血液サンプルを分画する方法である。第３６の実施形態（３６）は、血液サンプルの容量が約５０μＬ～約１０ｍＬである、実施形態３５（３５）に記載の方法である。第３７の実施形態（３７）は、血漿画分が、血液サンプル中の血液細胞の約１％未満を含有している、実施形態３６（３６）に記載の方法である。第３８の実施形態（３８）は、血漿画分が、血液サンプル中の血液細胞の約０．０１％未満を含有している、実施形態３７（３７）に記載の方法である。第３９の実施形態（３９）は、血漿画分には血液サンプル中の血液細胞が実質的にない、実施形態３８（３８）に記載の方法である。第４０の実施形態（４０）は、血液サンプルが、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、胎児血サンプル、または動脈血サンプルである、実施形態３５から３９（３５～３９）のいずれか１つに記載の方法である。第４１の実施形態（４１）は、単離された画分に対して診断分析を実行することをさらに含む、実施形態３５から４０（３５～４０）のいずれか１つに記載の方法である。第４２の実施形態（４２）は、分析が、酵素免疫アッセイ、化学発光の免疫アッセイ、赤血球凝集／粒子凝集アッセイ、核酸増幅技術アッセイ、薬物アッセイ、法医学アッセイ、または遺伝形質アッセイである、実施形態４１（４１）に記載の方法である。実施形態４３（４３）は、反応が、入口チャネルおよび／または処理チャネルの内部で、粒子または粒子枯渇層の成分に対して実行され、また、粒子の単離／濃縮と同時に実行されてもよい、実施形態１から４１（１～４１）のいずれか１つに記載の方法である。実施形態４４（４４）は、反応が結合反応または染色反応である、実施形態４３（４３）に記載の方法である。
【0030】
実施形態４５（４５）は、粒子が細胞または細胞核である、実施形態１（１）から４４（４４）のいずれか１つに記載の方法である。
【0031】
実施形態４６（４６）は、細胞核を含むサンプルと、常磁性化合物または磁性流体を含むサンプル媒体とを、分離チャネルに装填することと、少なくとも１つの磁石を用いてサンプルに磁力をかけて、分離に影響を与えることと、さらなる遠心分離なしで、細胞核を含む、分離されたサンプルの少なくとも１つの画分を収集することと、分離前、分離中、および／または分離後に、サンプル中の細胞核を適宜撮像することとを含む、細胞核を単離する方法である。
【0032】
実施形態４７（４７）は、サンプルが約５０～約１０，０００，０００の細胞核を含む、実施形態４６（４６）に記載の方法である。
【0033】
実施形態４８（４８）は、サンプルが、生細胞、死細胞、または細胞破片をさらに含む、実施形態４６（４６）または４７（４７）に記載の方法である。
【0034】
実施形態４９（４９）は、画分における細胞核の濃度が、元のサンプルから、少なくとも１．１倍に増加される、実施形態４６（４６）から４８（４８）のいずれか１つに記載の方法である。
【0035】
実施形態５０（５０）は、元のサンプルにおける非細胞核粒子の濃度が、画分において少なくとも約１％減少される、実施形態４６（４６）から４９（４９）のいずれか１つに記載の方法である。
【0036】
実施形態５１（５１）は、サンプルからの画分における単離された細胞核の完全性が、遠心分離を含む方法によるサンプルからの画分における単離された細胞核の完全性よりも、少なくとも約３０％高い、実施形態４６（４６）から５０（５０）のいずれか１つに記載の方法である。
【0037】
実施形態５２（５２）は、細胞核が、ヒト細胞、ヒト以外の動物細胞、または植物細胞から単離される、実施形態４６（４６）から５１（５１）のいずれか１つに記載の方法である。
【0038】
実施形態５３（５３）は、細胞核が、正常細胞、異常細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞、または遺伝子組換え細胞から単離される、実施形態４６（４６）から５２（５２）のいずれか１つに記載の方法である。
【0039】
実施形態５４は、生細胞および／または細胞核、死細胞および核破片を含む混合物から、前記生細胞および／または細胞核を分離するための方法であって、
Ａ）流体サンプル処理装置であって、
（ｉ）処理チャネルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）入口チャネルを処理チャネルに接続する入口接続領域と、
（ｉｖ）処理チャネルのＸ軸に沿って処理チャネルの上側および下側に整列した複数の磁性部品と、
（ｖ）複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）処理チャネルを出口チャネルに接続する出口接続領域と、
（ｖｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、
（ｖｉｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、
（ｉｘ）第１の出口チャネルに関連する第１の流れ調整器（flow modulator）および第２の出口チャネルに関連する第２の流れ調整器と
を備える、流体サンプル処理装置を用意することと、
Ｂ）混合物を、流体サンプル処理装置を通して流すことにより、前記生細胞および／または細胞核を富化した第１の回収サンプル、ならびに前記生細胞および／または細胞核を枯渇させた第２の回収サンプルをもたらすことと
を含む方法である。
Ａ）流体サンプル処理装置であって、
（ｉ）処理チャネルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）入口チャネルを処理チャネルに接続する入口接続領域と、
（ｉｖ）処理チャネルのＸ軸に沿って処理チャネルの上側および下側に整列した複数の磁性部品と、
（ｖ）複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）処理チャネルを出口チャネルに接続する出口接続領域と、
（ｖｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、
（ｖｉｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、
（ｉｘ）第１の出口チャネルに関連する第１の流れ調整器（flow modulator）および第２の出口チャネルに関連する第２の流れ調整器と
を備える、流体サンプル処理装置を用意することと、
Ｂ）混合物を、流体サンプル処理装置を通して流すことにより、前記生細胞および／または細胞核を富化した第１の回収サンプル、ならびに前記生細胞および／または細胞核を枯渇させた第２の回収サンプルをもたらすことと
を含む方法である。
【0040】
実施形態５５（５５）は、第１の回収サンプルが細胞核を富化されている、実施形態５４（５４）に記載の方法である。
【0041】
実施形態５６（５６）は、第１の回収サンプルが生細胞を富化されている、実施形態５４（５４）に記載の方法である。
【0042】
実施形態５７（５７）は、ａ）第１の回収サンプルにおける生細胞の収率が、混合物の全体の生細胞組成の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％であり、および／またはｂ）第１の回収サンプルにおける細胞核の収率が、混合物の生細胞組成からの全体の細胞核の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、もしくは少なくとも約７５％である、実施形態５４（５４）（454）から５６（５６）のいずれか１つに記載の方法である。
【0043】
実施形態５８（５８）は、出口接続領域が、流れスプリッタ部分をさらに備える、実施形態５４（５４）から５７（５７）のいずれか１つに記載の方法である。
【0044】
実施形態５９（５９）は、流れスプリッタ部分が、処理チャネルの中に突出し、流れを出口チャネルにおける別の流れへと分離するように構成および配置される、実施形態５８（５８）に記載の方法である。
【0045】
実施形態６０（６０）は、流体サンプル処理装置が、第１の出口チャネルに関連する第１の流量センサおよび第２の出口チャネルに関連する第２の流量センサをさらに備える、実施形態５４（５４）（46）から５９（５９）のいずれか１つに記載の方法である。
【0046】
実施形態６１（６１）は、流量センサが、流れ調整器に動作可能に連結される、実施形態６０（６０）に記載の方法である。
【0047】
実施形態６２（６２）は、流体サンプル処理装置が、光センサと、光センサと相対する側に、または角度的に隣接して、構成された照明光源とをさらに備え、照明光源が紫外線を放射してもよい、実施形態５４（５４）から６１（６１）のいずれか１つに記載の方法である。
【0048】
実施形態６３（６３）は、流体サンプル処理装置が、光検出器、マルチ画素撮像検出器、磁界検出器、電気化学検出器、光学的位相検出器、散乱検出器、ホールセンサ、磁気抵抗センサ、電磁放射測定センサ、表面弾性波センサ、バイオセンサ、容量性センサ、導電性センサ、熱センサ、流量センサ、超音波センサ、重力センサ、磁界センサまたはこれらの組み合せであるセンサと、複数の流れ調整器に動作可能に連結されたコントローラとをさらに備える、実施形態５４（５４）から６２（６２）のいずれか１つに記載の方法である。
【0049】
実施形態６４（６４）は、流体サンプル処理装置が、平面基板を備えるフローセルカートリッジをさらに備え、前記平面基板が、
（ｉ）上面および下面と、
（ｉｉ）撮像面を形成する第１の長手方向の面と、
（ｉｉｉ）照明面を形成する第２の長手方向の面と、
（ｉｖ）第１および第２の横面と、
（ｖ）上面における入口ウェルと、
（ｖｉ）入口チャネルと、
（ｖｉｉ）入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、
（ｖｉｉｉ）処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｉｘ）処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｘ）複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、
基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、処理チャネルが、撮像面に対して空間的に片寄るように基板の平面内でオフセットされる、実施形態５４（５４）から６３（６３）のいずれか１つに記載の方法である。
（ｉ）上面および下面と、
（ｉｉ）撮像面を形成する第１の長手方向の面と、
（ｉｉｉ）照明面を形成する第２の長手方向の面と、
（ｉｖ）第１および第２の横面と、
（ｖ）上面における入口ウェルと、
（ｖｉ）入口チャネルと、
（ｖｉｉ）入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、
（ｖｉｉｉ）処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｉｘ）処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｘ）複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、
基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、処理チャネルが、撮像面に対して空間的に片寄るように基板の平面内でオフセットされる、実施形態５４（５４）から６３（６３）のいずれか１つに記載の方法である。
【0050】
実施形態６５（６５）は、流体サンプル処理装置が、平面基板を備えるフローセルカートリッジをさらに備え、前記平面基板が、
（ｉ）上面における入口ウェルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）サンプル処理チャネルと、
（ｉｖ）処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｖ）処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、
基板が、光学的に透明な材料を含み、複数の出口チャネルの各々を合わせた容量（combined volume）が処理チャネルの容量よりも大きい、実施形態５４（５４）から６４（６４）のいずれか１つに記載の方法である。
（ｉ）上面における入口ウェルと、
（ｉｉ）入口チャネルと、
（ｉｉｉ）サンプル処理チャネルと、
（ｉｖ）処理チャネル内のサンプルスプリッタと、
（ｖ）処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、
（ｖｉ）複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、
基板が、光学的に透明な材料を含み、複数の出口チャネルの各々を合わせた容量（combined volume）が処理チャネルの容量よりも大きい、実施形態５４（５４）から６４（６４）のいずれか１つに記載の方法である。
【0051】
実施形態６６（６６）は、フローセルカートリッジの出口チャネルがコンパクトな経路を辿り、たとえば出口チャネルが蛇行形状のチャネルである、実施形態から６４（６４）または６５（６５）に記載の方法である。
【0052】
実施形態６７（６７）は、生細胞および／または細胞核、死細胞および核破片を含む混合物から、前記生細胞および／または細胞核を分離するための方法であって、
処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備えるフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルが、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、
処理チャネルに、生細胞および死細胞を含むサンプル溶液と、常磁性化合物とを流すことと、
処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、
処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保つことと、
生細胞および／または細胞核を富化したサンプル画分と、死細胞および核破片を富化したサンプル画分とを、出口チャネルに同時に回収することと
を含む、方法である。
処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備えるフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルが、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、
処理チャネルに、生細胞および死細胞を含むサンプル溶液と、常磁性化合物とを流すことと、
処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、
処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保つことと、
生細胞および／または細胞核を富化したサンプル画分と、死細胞および核破片を富化したサンプル画分とを、出口チャネルに同時に回収することと
を含む、方法である。
【0053】
濃縮装置の実施形態
本発明の装置の実施形態が、以下の番号付けされた実施形態においてさらに説明される。番号付けされた実施形態は、本発明を限定するものではなく、本明細書で説明されたさらなる要素および代替形態を組み込み得る。
本発明の装置の実施形態が、以下の番号付けされた実施形態においてさらに説明される。番号付けされた実施形態は、本発明を限定するものではなく、本明細書で説明されたさらなる要素および代替形態を組み込み得る。
【0054】
第１の実施形態（１）は、（ｉ）処理チャネルと、（ｉｉ）入口チャネルと、（ｉｉｉ）入口チャネルを処理チャネルに接続する入口接続領域と、（ｉｖ）複数の出口チャネルと、（ｖ）処理チャネルを出口チャネルに接続する出口接続領域と、（ｖｉ）出口接続領域において処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、（ｖｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、（ｖｉｉｉ）処理チャネルのＸ軸に沿って処理チャネルの上側または下側のいずれかに整列した磁石とを備える、磁気流体サンプル処理装置である。
【0055】
第２の実施形態（２）は、（ｉ）処理チャネルと、（ｉｉ）入口チャネルと、（ｉｉｉ）入口チャネルを処理チャネルに接続する入口接続領域と、（ｉｖ）複数の出口チャネルと、（ｖ）処理チャネルを出口チャネルに接続する出口接続領域と、（ｖｉ）出口接続領域において処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、（ｖｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、（ｖｉｉｉ）処理チャネルのＸ軸に沿って処理チャネルの上側および下側に整列した複数の磁性部品とを備える、磁気流体サンプル処理装置であって、粒子を、処理チャネルの中へ導入する前に前濃縮するように構成して配置される、磁気流体サンプル処理装置である。
【0056】
第３の実施形態（３）は、（ｉ）処理チャネルと、（ｉｉ）入口チャネルと、（ｉｉｉ）入口チャネルを処理チャネルに接続する入口接続領域と、（ｉｖ）複数の出口チャネルと、（ｖ）処理チャネルを出口チャネルに接続する出口接続領域と、（ｖｉ）出口接続領域において処理チャネルの上部の領域と流体連通する第１の出口チャネルと、（ｖｉｉ）出口接続領域において処理チャネルの下部の領域と流体連通する第２の出口チャネルと、（ｖｉｉｉ）入口チャネル流れコントローラとを備える、流体サンプル処理装置である。
【0057】
第４の実施形態（４）は、処理チャネルの上側の磁性部品と下側の磁性部品とが、処理チャネル内に、異なる強度の磁界を供給するように構成して配置される、実施形態２に記載の装置である。
【0058】
第５の実施形態（５）は、入口チャネルが第１の断面積を含み、処理チャネルが第２の断面積を含み、第１の断面積が第２の断面積よりも小さい、実施形態１から４（１～４）のいずれか１つに記載の装置である。第６の実施形態（６）は、チャネルが、マイクロフルイディックまたはキャピラリである、実施形態５（５）に記載の装置である。
【0059】
第７の実施形態（７）は、入口接続領域が９０度未満の角度で先細りになる、実施形態１から６（１～６）のいずれか１つに記載の装置である。第８の実施形態（８）では、角度が６０度以下である、実施形態７（７）に記載の装置が提供される。実施形態９（９）では、実施形態８（８）に記載の装置が４５度以下の接続角度を有する。
【0060】
第１０の実施形態（１０）は、出口接続領域が、流れスプリッタ部分をさらに備える、実施形態１から９（１～９）のいずれか１つに記載の装置を提供する。実施形態１１（１１）は、流れスプリッタ部分が、それぞれの流れをそれらの出口チャネルへと分離するように構成して配置され、処理チャネルの中に突出する、実施形態１０（１０）に記載の装置である。
【0061】
実施形態１２（１２）は、第１の出口チャネルが第１の出口収集チャネルおよび第１の出口分流チャネルを備える、実施形態１から１１（１～１１）のいずれか１つに記載の装置である。実施形態１３（１３）は、第１の出口チャネルの流れを、第１の出口収集チャネルまたは第１の出口分流チャネルに対して選択可能に流体連通させるように構成して配置された弁が、第１の出口チャネルにさらに備わっている、実施形態１２（１２）に記載の装置を提供するものである。
【0062】
実施形態１４（１４）は、第２の出口チャネルが第２の出口収集チャネルおよび第２の出口分流チャネルを備える、実施形態１から１３（１～１３）のいずれか１つに記載の装置である。
【0063】
実施形態１５（１５）は、第２の出口チャネルの流れを、第２の出口収集チャネルまたは第２の出口分流チャネルに対して選択可能に流体連通させるように構成して配置された弁が、第２の出口チャネルにさらに備わっている、実施形態１４（１４）に記載の装置である。実施形態１６（１６）は、流体装置が入口チャネルまたは入口領域にゲート磁界（ｇａｔｉｎｇ ｍａｇｎｅｔｉｃ ｆｉｅｌｄ）を生成する磁石をさらに備える、実施形態１から１５（１～１５）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。実施形態１７（１７）は、ゲート磁界を生成する磁石が、入口チャネルまたは入口領域を取り囲む円環状磁石またはトロイダル磁石である、実施形態１６（１６）に記載の装置である。実施形態１８（１８）では、ゲート磁界を生成する磁石が、処理チャネルに隣接して整列され、入口チャネルのチャネル入口領域まで、またはチャネル入口領域を越えて延在する、実施形態１６（１６）に記載の装置が提供される。
【0064】
第１９の実施形態（１９）は、光学的に透明な処理チャネルを備える、実施形態１から１８（１～１８）のいずれか１つに記載の装置である。実施形態２０では、実施形態１から１８（１～１８）のいずれか１つに記載の装置が、光学的に透明な入口チャネルを備える。実施形態２１は、入口チャネル流れコントローラ、第１の出口チャネルコントローラ、第２の出口チャネルコントローラ、またはこれらの組み合せをさらに備える、実施形態１から２０（１～２０）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。実施形態２２（２２）は、磁界コントローラ（円環状磁石またはトロイダル磁石に対して動作可能に連結されている）をさらに備える、実施形態１５から１８のいずれか１つに記載の装置である。
【0065】
実施形態２３（２３）は、流体装置が１つまたは複数のセンサを備える、実施形態１から２２（１～２２）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。実施形態２４（２４）は、センサが、光センサ、容量性センサ、導電性センサ、熱センサ、流量センサ、超音波センサ、重力センサ、磁界センサ、またはこれらの組み合せから選択される、実施形態２３（２３）に記載の装置である。実施形態２５（２５）は、センサが、光検出器、マルチ画素撮像検出器、磁界検出器、電気化学検出器、光学的位相検出器、散乱検出器、ホールセンサ、磁気抵抗センサ、電磁放射測定センサ、表面弾性波センサ、バイオセンサ、またはこれらの組み合せである、実施形態２４（２４）に記載の装置である。
【0066】
第２６（２６）の実施形態は、センサが、処理チャネルに組み込まれるか、または処理チャネルに隣接している、実施形態２３から２５（２３～２５）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。第２７の実施形態（２７）は、センサが、入口チャネルに組み込まれるか、または入口チャネルに隣接している、実施形態２３から２５（２３～２５）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。第２８の実施形態（２８）は、センサが、１つまたは複数の出口チャネルに組み込まれるか、または同出口チャネルに隣接している、実施形態２３から２５（２３～２５）のいずれか１つに記載の装置を提供するものである。実施形態２９（２９）は、流体装置が、処理チャネル内にあるかまたは処理チャネルに隣接する１つまたは複数のセンサ、入口チャネル内にあるかまたは入口チャネルに隣接する１つまたは複数のセンサ、少なくとも１つの出口チャネルにあるかまたは少なくとも１つの出口チャネルに隣接する１つまたは複数のセンサ、あるいはこれらの組み合せを備える、実施形態２３から２５（２３～２５）のいずれか１つに記載の装置である。
【0067】
実施形態３０（３０）は、入口チャネル流れコントローラをさらに備える装置であって、少なくとも１つのセンサが、入口流れコントローラに動作可能に連結される、実施形態２５から２７（２５～２７）のいずれか１つに記載の装置である。実施形態３１（３１）は、出口チャネル流れコントローラをさらに備える装置であって、少なくとも１つのセンサが、出口チャネル流れコントローラに動作可能に連結される、実施形態２５から２８（２５～２８）のいずれか１つに記載の装置である。実施形態３２は、入口チャネルまたは入口領域を取り囲む円環状磁石またはトロイダル磁石と、磁界コントローラとをさらに備える装置であって、円環状磁石またはトロイダル磁石の磁界を制御するために、センサが、磁界コントローラに対して動作可能に連結される、実施形態２３から２９（２３～２９）のいずれか１つに記載の装置である。
【0068】
実施形態３２（３２）は、入口チャネルが、処理チャネルに対して実質的に直線状の部分と、処理チャネルに対して角度Θだけ傾斜した部分において接続する、実質的に直線状には整列されていない部分からさらになり、Θが、Ｙ軸もしくはＺ軸に対して、またはＹ軸とＺ軸とに対して別個に、Θ≠１８０°であって、Θ≧９０°、Θ≧１００°、Θ≧１３５°、Θ≧１４０°、Θ≧１６５°、Θ＞１８０°、Θ≧２０５°、Θ≧２２５°、Θ≧２５０°、もしくはΘ≦２７０°である、実施形態１から３１（１～３１）のいずれか１つに記載の装置である。
【0069】
フローセルカートリッジの実施形態
本発明のフローセルカートリッジの第１の実施形態（１）は、平面基板を備え、この平面基板は、上面および下面と、撮像面を形成する第１の長手方向の面と、照明面を形成する第２の長手方向の面と、第１および第２の横面と、上面における入口ウェルと、入口チャネルと、入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、処理チャネル内のサンプルスプリッタと、処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、処理チャネルが、撮像面に対して空間的に片寄るように基板の平面内でオフセットされる。
本発明のフローセルカートリッジの第１の実施形態（１）は、平面基板を備え、この平面基板は、上面および下面と、撮像面を形成する第１の長手方向の面と、照明面を形成する第２の長手方向の面と、第１および第２の横面と、上面における入口ウェルと、入口チャネルと、入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、処理チャネル内のサンプルスプリッタと、処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、処理チャネルが、撮像面に対して空間的に片寄るように基板の平面内でオフセットされる。
【0070】
本発明のフローセルカートリッジの第２の実施形態（２）は、平面基板を備え、この平面基板は、上面における入口ウェルと、入口チャネルと、サンプル処理チャネルと、処理チャネル内のサンプルスプリッタと、処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、基板が、光学的に透明な材料を含み、複数の出口チャネルの各々を合わせた容量が処理チャネルの容量よりも大きい。
【0071】
第３の実施形態（３）は、出口チャネルがコンパクトな経路を辿り、例示的な構成の１つが蛇行形状のチャネルである、実施形態１または２に記載のフローセルカートリッジである。
【0072】
第４の実施形態（４）は、フローセルカートリッジの出口チャネルが平面基板内の凹部として形成され、第１の出口チャネルが平面基板の表面に凹部を備え、第２の出口チャネルが平面基板の反対側の面に凹部を備える、実施形態１から３のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジである。実施形態１から４において、チャネルは、平面基板をエッチング、機械加工、３Ｄプリント、または成型することによって形成される。
【0073】
第５の実施形態（５）は、実施形態４のフローセルカートリッジが、平面基板の凹部の上に配置された１つまたは複数の追加の平坦な層を備えて、密封したチャネルを形成するものである。
【0074】
第６の実施形態（６）は、実施形態１から５のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、基板が、非鉄金属、セラミック、ガラス、ポリマー、またはプラスチックからなり、基板と１つまたは複数の層とを有する実施形態の場合には、基板の材料と平坦な層の材料とは、同一でも異なってもよい。
【0075】
フローセルカートリッジの第７の実施形態（７）は、実施形態５または６に記載のフローセルカートリッジを備え、１つまたは複数の平坦な層が、平面基板に、圧縮、接着接合、好ましくは生体適合性のある接着剤、より好ましくはシリコーンまたはシリコーンベースの接着剤、溶剤結合、超音波接合、熱接着、溶接、または３Ｄプリントによって取り付けられる。
【0076】
フローセルカートリッジの第８の実施形態（８）は、実施形態５から７のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、平面基板と１つまたは複数の平坦な層とが、同一の材料からなる。
【0077】
フローセルカートリッジの第９の実施形態（９）は、実施形態１から８のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、平面基板がポリマー材料を含む。
【0078】
フローセルカートリッジの第１０の実施形態（１０）は、実施形態９に記載のフローセルカートリッジを備え、実施形態９のポリマー材料が、サイクリックオレフィンポリマーまたはサイクリックオレフィンコポリマーを含む。
【0079】
フローセルカートリッジの第１１の実施形態（１１）は、実施形態１から１０いずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、平面基板上に形成されて出口チャネルの端部と流体連通する収集ウェルをさらに備える。
【0080】
実施形態１から１１のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジの第１２の実施形態（１２）は、収集ウェルが、第１のウェル高さにおける内部チャネル入口および第２のウェル高さにおける内部出口をさらに備え、内部チャネル入口が、フローセルカートリッジの出口チャネルと流体連通し、第２のウェル高さは第１のウェル高さよりも高い。
【0081】
フローセルカートリッジの第１３の実施形態（１３）は、実施形態１１または１２に記載のフローセルカートリッジを備え、収集ウェルは、入口の末端開口から、収集ウェルへ、収集ウェルの床へと傾斜した移行をもたらすステップをさらに備える。
【0082】
フローセルカートリッジの第１４の実施形態（１４）は、実施形態１１から１３のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、１つまたは複数の収集ウェルの最上部を覆う密封フィルムをさらに備える。
【0083】
フローセルカートリッジの第１５の実施形態（１５）は、実施形態１１から１４のいずれか１つに記載のフローセルカートリッジを備え、このフローセルカートリッジは、平面基板に、収集ウェルと流体連通する収集ウェル出口チャネルをさらに備える。
【0084】
細胞または細胞核の分離システムの実施形態
本発明の第１の細胞分離システムの実施形態（１）は、フローセルカートリッジを保持するための収容ブロックと、光センサ、レンズ、および照明光源を備える光学システムと、複数の流れ調整部品とを備え、収容ブロックによって、フローセルカートリッジが、光学システムに対して光学的に位置合わせして、取外し可能に配置され、磁性部品が、フローセルの処理チャネルに隣接して、取外し可能に係合し、フローセルカートリッジの複数の出口チャネルが、複数の流れ調整部品と流体連通して取外し可能に配置される。
本発明の第１の細胞分離システムの実施形態（１）は、フローセルカートリッジを保持するための収容ブロックと、光センサ、レンズ、および照明光源を備える光学システムと、複数の流れ調整部品とを備え、収容ブロックによって、フローセルカートリッジが、光学システムに対して光学的に位置合わせして、取外し可能に配置され、磁性部品が、フローセルの処理チャネルに隣接して、取外し可能に係合し、フローセルカートリッジの複数の出口チャネルが、複数の流れ調整部品と流体連通して取外し可能に配置される。
【0085】
実施形態１は、第２の実施形態（２）において、平面基板内の処理チャネルを通る光伝送をもたらすように構成して配置された可視光の照明光源をさらに備える。
【0086】
実施形態１または２に記載のシステムは、第３の実施形態（３）において、紫外線の照明を当てるように構成して配置された１つまたは複数の紫外線照明光源をさらに備え、この光源は、約４７４ｎｍおよび／または５６０ｎｍの波長でよく、収容ブロックに保持された平面基板内の処理チャネルに対して角度のある配向でよい。
【0087】
実施形態３に記載のシステムを備える細胞分離システムの第４の実施形態（４）では、光学システムは、好ましくは約５２４ｎｍの波長と６２８ｎｍの波長とに中心がある帯域の放射を通す二重帯域通過フィルタを備える。
【0088】
生細胞－死細胞および／または細胞核の分離法の実施形態
生細胞と死細胞との混合物の分離のため、ならびに／あるいは核破片および／または死細胞からの細胞核の分離のための方法の第１の実施形態（１）は、処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備えるフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルが、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、処理チャネルに、生細胞および死細胞、および／または細胞核と常磁性化合物とを含むサンプル溶液を流すことと、処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保つことと、生細胞を富化したサンプル画分、および／または細胞核、ならびに死細胞を富化したサンプル画分、および／または無傷細胞および核破片を、出口チャネルに同時に回収することとを含む。
生細胞と死細胞との混合物の分離のため、ならびに／あるいは核破片および／または死細胞からの細胞核の分離のための方法の第１の実施形態（１）は、処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備えるフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルが、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、処理チャネルに、生細胞および死細胞、および／または細胞核と常磁性化合物とを含むサンプル溶液を流すことと、処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保つことと、生細胞を富化したサンプル画分、および／または細胞核、ならびに死細胞を富化したサンプル画分、および／または無傷細胞および核破片を、出口チャネルに同時に回収することとを含む。
【0089】
実施形態１に記載の方法を含む第２の実施形態（２）は、サンプル溶液を導入するまではいかなる液体または常磁性化合物も実質的に含んでいないフローセルカートリッジを用意することをさらに含む。
【0090】
実施形態１または２に記載の方法を含む分離方法の第３の実施形態（３）は、フローセルカートリッジを用意することであって、処理チャネルの断面積よりも小さい断面積を有する出口チャネルが、蛇行形状のチャネルの構成を一例とするコンパクトな経路を辿って配置される、フローセルカートリッジを用意することをさらに含む。
【0091】
実施形態１から３のいずれか１つに記載の方法を含む第４の実施形態（４）は、処理チャネルの最上部垂直面の近接および最下部垂直面の近接に磁界を供給することであって、それぞれの磁界が類似の強度を有し、表面磁界の強度が約０．８テスラ～約２．０テスラの間であり、約０．９テスラ～約１．４テスラの間でもよい、磁界を供給することをさらに含む。
【0092】
実施形態１から４のいずれか１つに記載の方法を含む第５の実施形態（５）の分離方法は、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度のサンプル溶液の中に常磁性化合物を供給することであって、サンプル溶液中の濃度が、約６５ｍＭ～約１７５ｍＭでよく、さらには約７０ｍＭ～約１５０ｍＭでもよい、常磁性化合物を供給することをさらに含む。
【0093】
実施形態１から５のいずれか１つに記載の分離方法を含む第６の実施形態（６）の分離方法は、サンプル画分を、約７５μＬ／分～約１５０μＬ／分の流量で出口チャネルに回収する工程であって、流量が、約７５μＬ／分、約９０μＬ／分、約１００μＬ／分、約１１０μＬ／分、約１２０μＬ／分、または約１５０μＬ／分でもよい、回収する工程をさらに含む。
【0094】
分離方法の第７の実施形態（７）は、実施形態１から６のいずれか１つに記載の分離方法を含み、富化して回収されるサンプル画分には、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％。または少なくとも約９０％の生細胞が含まれる。
【0095】
分離方法の第８の実施形態は、実施形態１から７のいずれか１つに記載の分離方法を含み、富化して回収されるサンプル画分における生細胞の収率は、サンプルの全体の生細胞組成の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％である。
【0096】
分離方法の第９の実施形態は、実施形態１から７のいずれか１つに記載の分離方法を含み、富化して回収されるサンプル画分における細胞核の収率は、サンプルの生細胞組成からの全体の細胞核の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％である。
【図面の簡単な説明】
【0097】
【図1】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の単一の磁性部品の各実施形態の断面図である。
【図2】本明細書で説明される、傾斜した入口チャネルを有する、粒子を濃縮して単離する装置の単一の磁性部品の各実施形態の断面図である。
【図3】本明細書で説明される、傾斜した入口チャネルおよび入口磁界部品を有する、粒子を濃縮して単離する装置の単一の磁性部品の各実施形態の断面図である。
【図4】本明細書で説明される、入口チャネルの一部を磁性部品が取り囲む、粒子を濃縮して単離する装置の各実施形態の断面図である。
【図5】本明細書で説明される、傾斜した入口チャネルおよび入口磁界部品を有する、粒子を濃縮して単離する装置の単一の磁性部品の各実施形態の断面図である。
【図6】本明細書で説明される一実施形態による、単一の磁性部品構成の処理チャネルの内部にかかる磁界を表す。
【図7】本明細書で説明される、傾斜した入口チャネルおよび入口磁界部品を有する、粒子を濃縮して単離する装置の複数の磁性部品の各実施形態の断面図である。
【図8】本明細書で説明される、傾斜した入口チャネルおよび入口磁界部品を有する、粒子を濃縮して単離する装置の各実施形態の断面図である。
【図9】説明される、選択可能な弁および入口チャネルポンプ部品を有する、粒子を濃縮して単離する装置の一実施形態の断面図である。
【図10】本明細書で説明される様々な実施形態による統合システムの模式図である。
【図11】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の、単一磁性部品の実施形態の動作を表す。
【図12】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の、傾斜した入口チャネルの実施形態の動作を表す。
【図13】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の作動状態の実施形態による、粒子含有サンプルの流れにより可能になった分画を表す。
【図14】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の実施形態による、入口チャネル磁界で支援されたサンプルの濃縮を表す。
【図15】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の実施形態による、入口チャネル磁界で支援されたサンプルの濃縮を表す。
【図16】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の作動状態の実施形態による、粒子含有サンプルの、メニスカスによって容易となった濃縮を表す。
【図17】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の一実施形態によって実行された、血液サンプルからの血液細胞の単離の顕微鏡写真である。
【図18】本明細書で説明される、粒子を濃縮して単離する装置の一実施形態の斜視図である。
【図19】例示のフローセルカートリッジの、長手方向の面における撮像面および第２の長手方向の面における照明面を示す図である。
【図20】例示のフローセルカートリッジの平面基板の上面および下面を示す詳細図である。
【図21】収集ウェルの例示の構成を示す。
【図22】例示のシステム収容ブロックと、複数の磁性部品に対する例示のフローセルの配向とを示す。
【図23】例示の収容ブロックを用いて配向された光学システムの一例を示す。
【図24】例示の粒子分離の画像と、出口チャネル圧力の安定性とを示す。
【図25】収集された細胞の生存率および生細胞の収率の例を示す。
【図26】様々な細胞タイプに関して収集された生細胞の純度および収率の例を示す。
【図27】肺組織から導出された、選別されていない細胞核の顕微鏡画像（Ａ）および選別された細胞核の顕微鏡画像（Ｂ）と、脳組織から導出された、選別されていない細胞核の顕微鏡画像（Ｃ）および選別された細胞核の顕微鏡画像（Ｄ）とを示す。
【図28】Ｊｕｒｋａｔ細胞から導出された、選別されていない細胞核のフローサイトメトリー分析（Ａ）および選別された細胞核のフローサイトメトリー分析（Ｂ）を示す。
【図29】ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムによって分離されたサンプルにおける核に特異的なターゲット（ＳＣＡＲＮＡ５）および混入している細胞質のターゲット（ＳＮＨＧ６）のレベルを、入力細胞核と比較して示す。
【発明を実施するための形態】
【0098】
Ｉ．定義／用語法
以下の定義は、本発明の理解を助けるために提供されるものである。本明細書で使用されるすべての技術用語、記号および他の科学用語もしくは工学用語または専門用語は、別様に定義されなければ、当業者によって一般に理解される意味を有するように意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語が、本明細書において、明瞭さおよび／または参照の容易さのために定義されることもあるが、本明細書がそのような定義を含有することは、当技術における一般的な理解との実質的な相違を表すものと想定されるべきではなく、そのような一般的な理解を補完するように意図されている。本明細書の定義が当技術における一般の理解と一致しない範囲において、明確に別様に明示されなければ、本明細書で与えられる定義と、当技術における一般的な理解との両方が、代替実施形態として本発明の範囲内にあると見なされるものとする。
以下の定義は、本発明の理解を助けるために提供されるものである。本明細書で使用されるすべての技術用語、記号および他の科学用語もしくは工学用語または専門用語は、別様に定義されなければ、当業者によって一般に理解される意味を有するように意図される。場合によっては、一般に理解されている意味を有する用語が、本明細書において、明瞭さおよび／または参照の容易さのために定義されることもあるが、本明細書がそのような定義を含有することは、当技術における一般的な理解との実質的な相違を表すものと想定されるべきではなく、そのような一般的な理解を補完するように意図されている。本明細書の定義が当技術における一般の理解と一致しない範囲において、明確に別様に明示されなければ、本明細書で与えられる定義と、当技術における一般的な理解との両方が、代替実施形態として本発明の範囲内にあると見なされるものとする。
【0099】
本明細書で使用される、「含有する」、「含有している」、「含む」、「含んでいる」などのオープンエンドの用語は、別段の指示がない限り、「備える」ことを意味する。
【0100】
本明細書におけるいくつかの実施形態は、数的範囲を企図する。数的範囲が与えられたとき、範囲は、別段の指示がない限り範囲の両端を含む。別段の指示がない限り、数的範囲は、あたかも明示的に書き出されたかのように、すべての値およびサブレンジを含む。
【0101】
本明細書で使用される、「１つの（ａ）」という冠詞は、別様に明示的に明言されなければ、１つまたは複数を意味する。
【0102】
本明細書では、いくつかの値が「約」という用語によって修飾される。いくつかの事例では、「約」という用語は、参照数値に関連して、その値から±１０％の範囲の値を含み得る。たとえば、「約１０」という数は、９～１１の数を含むことができる。他の実施形態では、「約」という用語は、参照数値に関連して、その値から、プラスマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲にある値を含み得る。一連の値に対して前置きされた「約」という用語は、その一連に含まれるそれぞれの値を修飾するように意図される。
【0103】
本明細書で磁界について使用される「非対称」という用語は、関連する流体チャネルの領域における磁界が、流体チャネルの中心を通過する１つまたは複数の平面のまわりで対称ではないことを意味し、好ましい実施形態によれば、水平面のまわりで対称ではないことを意味する。
【0104】
本明細書で使用さる「キャピラリ」または「キャピラリチューブ」という用語は、以下で定義されるチャネルを有するチューブを指す。
【0105】
本明細書で使用される、「チャネル」、「流路」、「流体チャネル」および「フルイディックチャネル」という用語は、区別なく使用され、流体装置において流体を流すことができる経路を指す。チャネルが含む経路の最大高さ寸法は、約１００ｍｍ、約５０ｍｍ、約３０ｍｍ、約２５ｍｍ、約２０ｍｍ、約１５ｍｍ、約１０ｍｍ、約５ｍｍ、約５ｍｍ、約３ｍｍ、約２ｍｍ、約１ｍｍ、または約０．５ｍｍである。磁石の間のチャネルの寸法は、約３０ｍｍ×０．５ｍｍ、約２５ｍｍ×１ｍｍ、約２０ｍｍ×２ｍｍ、約１５ｍｍ×３ｍｍ、約１０ｍｍ×５ｍｍ、約５ｍｍ×３ｍｍ、約３ｍｍ×２ｍｍ、約２ｍｍ×１ｍｍ、または約１ｍｍ×０．５ｍｍである。たとえば、磁石の間のチャネルの寸法は約２ｍｍ×１ｍｍである。チャネルの内部高さは、その断面にわたって均一でなくてよく、断面は、幾何学的に、円形、正方形、楕円形、長方形、または六角形を含む任意の形状でよい。「チャネル」という用語は、それだけではないが、マイクロチャネルおよびナノチャネルを含み、本明細書におけるチャネルに対するあらゆる参照に関して、そのようなチャネルはマイクロチャネルまたはナノチャネルを備え得る。
【0106】
本明細書で使用される「濃度」という用語は、第２の成分の中に含有される第１の成分の量を意味し、単位体積当たりの粒子数、単位体積当たりのモル量、単位体積当たりの重量に基づき得、あるいは組み合わされた成分の体積当たりの第１の成分の体積に基づき得る。
【0107】
本明細書で使用される「流体結合された」または「流体連通」という用語は、流体が、そのように結合された、または連通する、２つの部品の間を流れることができることを意味する。
【0108】
本明細書で使用される、「単離する」、「単離している」、「分離する」、「分離している」、「分画する」、または「分画している」という用語は区別なく使用され、成分に関連すると、そのような成分を他の成分から分離することを意味し、溶液の中のある成分の濃度を高めること、溶液の中のある成分を他の成分から分離すること、または、その両方の組み合せを含む。溶液中の粒子は、溶液の中で他の粒子から分画されている場合、および／または溶液の画定された部分の範囲内にある場合には、「単離されている」と見なされる。溶液中の粒子または成分は、溶液を処理した後に、そのような粒子または成分の濃度が、少なくとも約１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、６０倍、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、５倍、３倍または２倍に高まった場合にも「単離された」と見なされる。他の粒子を含有している溶液中の関心のある粒子は、そのような溶液を処理した後に、そのような関心のある粒子の濃度とそのような他の粒子の濃度との比が向上した場合、またはそのような関心のある粒子の濃度とそのような他の粒子の濃度との比が、少なくとも約１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％だけ向上した場合、または、そのような他の成分の濃度が、約２０％未満、１５％未満、１０％未満、８％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満、または０．５％未満に低下した場合には、「単離された」と見なされる。
【0109】
本明細書で使用される「流体の」という用語は、流体サンプルを、扱うため、処理するため、排出するため、および／または分析するための、上記で定義された少なくとも１つの「チャネル」を含む、システム、装置または要素を指す。「流体の」という用語は、それだけではないが、「微少流体の」および「超微少流体の」を含む。
【0110】
本明細書で使用される「流体の機能」という用語は、流体システムにおいて、流体またはサンプルに対して実行または表現される、濾過、ポンピング、流体の流量調節、流体の流れ制御などを含むがこれらに限定されない、何らかの動作、機能またはプロセスを指す。
【0111】
本明細書で使用される「粒子」という用語は、それだけではないが、原子、化学元素、分子、化合物、生体分子、細胞、壊死細胞、アポトーシスを起こした細胞、癌細胞、癌または腫瘍の循環細胞、細胞核、血液、血漿、タンパク質、脂質、体液、核酸、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、抗体、抗原、炭水化物、微生物、細菌、ウイルス、菌類、精子、配偶子、卵、胚、または、いかなる方向における最大寸法も、約３ｍｍ未満、２ｍｍ未満、１ｍｍ未満、０．５ｍｍ未満、０．２５ｍｍ未満、１００ミクロン未満、７５ミクロン未満、５０ミクロン未満、４０ミクロン未満、３０ミクロン未満、２０ミクロン未満、１０ミクロン未満、５ミクロン未満、２ミクロン未満、１ミクロン未満、または０．１ミクロン未満である何らかの物理的実体を含む、あらゆるものを指す。粒子は、いかなる方向の最大寸法も、約０．００１ミクロン～約３ｍｍ、約０．１ミクロン～約２ｍｍ、約０．５ミクロン～約１．５ｍｍ、約１０ミクロン～約１ｍｍ、または約２０ミクロン～約１００ミクロンであり得る。
【0112】
本明細書で使用される「ポート」という用語は、たとえば流体チャネルを使用して２つの要素の間を流体連通させるための構造体を指す。「入口ポート」、「入口開口」、「入力開口」、または「入力チャネル」という用語は区別なく使用され、本明細書で説明した装置にサンプル流体を注入する開口を指す。
【0113】
本明細書で使用される「濃縮する」または「濃縮」という用語は、水、水性もしくは非水性の媒体、または他の物質を除去することによって、媒体中の材料の個体群密度または純度を高めること（を指す。材料は、本明細書で説明された粒子のタイプまたは粒子の混合物である。本明細書で説明される濃縮は、一般的には、媒体中の粒子または粒子の混合物の沈降を促進することにより、特定の領域に粒子または粒子の混合物をもたらすことを包含する。あるいは、濃縮することは、粒子の混合物から特定のタイプの粒子を分離することと、一般的には液体媒体の所定の容量を有する収集チャネルに、特定のタイプの粒子を収集することとを包含し得る。この濃縮は、粒子を濃縮するために大量のサンプルを回したり回転させたりすることを包含する必要はない。本発明によって実行される濃縮により、粒子の深刻な損傷、溶解、または剪断なく、粒子を分離することが可能になる。加えて、本発明は、ある特定の動作条件の下で、動作中に、サンプルにおける凝集または結晶化と、凝集または結晶化したサンプルの粒子の単離とをもたらすものである。
【0114】
本明細書で説明される方法および工程が、ある特定の順序で生じるある特定のイベントを指示する場合には、当業者なら、ある特定の工程の順序付けが変更され得、そのような変更は、本発明の変形形態によるものであることを認識するであろう。加えて、ある特定の工程は、あるプロセスにおいて、可能であれば並行して同時に実行されてよく、順次に実行されてもよい。
【0115】
ＩＩ．磁界
本開示は、処理チャネルまたは入口チャネルの内部の磁界を使用して濃縮するための方法および装置を提供する。磁界の、サンプル流体中の粒子の常磁性に対する相互作用は、分離または濃縮を促進するために、粒子に対する斥力効果または引力効果をもたらすことができる。
本開示は、処理チャネルまたは入口チャネルの内部の磁界を使用して濃縮するための方法および装置を提供する。磁界の、サンプル流体中の粒子の常磁性に対する相互作用は、分離または濃縮を促進するために、粒子に対する斥力効果または引力効果をもたらすことができる。
【0116】
一実施形態によれば、磁石は永久磁石または電磁石である。一実施形態によれば、磁石の最大エネルギー積は、約１メガガウスエルステッド～約１０００メガガウスエルステッドの範囲であり、より好ましくは約１０メガガウスエルステッド～約１００メガガウスエルステッドの範囲である。一実施形態によれば、磁石の表面磁界の強度は、約０．１テスラ～約１００テスラの範囲であり、より好ましくは約１テスラ～約１０テスラの範囲である。一実施形態によれば、磁石の残留磁気は、約０．５テスラ～約５テスラの範囲であり、より好ましくは約１テスラ～約３テスラの範囲である。
【0117】
好ましい実施形態によれば、磁石は、鉄およびホウ素を含むネオジム合金、ネオジム、ニッケルを含むアルミニウムの合金、鉄を含むネオジム合金、アルミニウムおよびコバルトの鉄との合金、サマリウムコバルト、鉄とその他の希土類の合金、ニッケルと希土類合金の合金、フェライト、またはこれらの組み合せを含む材料から作製される。複数の磁石を備える一実施形態によれば、磁石は同一の材料から作製されるかまたは異なる材料から作製される。
【0118】
一実施形態によれば、流体チャネルの一方の側に強い磁性材料を使用して、相対する側には弱い磁性材料を使用することにより、非対称の磁界が実現される。好ましい実施形態によれば、流体チャネルの一方の側に磁性材料を使用して、相対する側には実質的に類似の磁性材料を使用することにより、非対称の磁界が実現される。そのような実施形態によれば、上部磁石と下部磁石とは実質的に同一のサイズであってもよい。そのような実施形態によれば、上部磁石がネオジムを含み得、下部磁石がサマリウムコバルトを含み得、両方の磁石が実質的に同一のサイズである。あるいは、上部磁石がサマリウムコバルトを含み得、下部磁石がネオジムを含み得、両方の磁石が実質的に同一のサイズである。
【0119】
一実施形態によれば、代替の磁石構成が使用され得る。本発明による装置は、流体チャネルのまわりに配置された複数の上部磁石および複数の下部磁石を含み得る。上部磁石は、前方の上部磁石、中央の上部磁石、および後方の上部磁石を含み得る。下部磁石は、前方の下部磁石、中央の下部磁石、および後方の下部磁石を含み得る。
【0120】
別の磁石構成によれば、装置は、前方の上部磁石、後方の上部磁石、前方の下部磁石、および後方の下部磁石を含み得、これらの磁石は流体チャネルのまわりに配置される。前方の上部磁石と後方の下部磁石とは、磁力が反発しあう配向に配置される。例示的なＮｄＦｅＢ磁性部品の寸法は、最下部の磁性部品については約５０×１５×２ｍｍ（１５ｍｍの軸を通じて磁化された）、最上部の磁性部品については５０×５×２ｍｍ（５ｍｍの軸を通じて磁化された）を含む。他の磁性部品の実施形態は、６０×１５×２ｍｍ、６０×５×２ｍｍ、７５×２０×３ｍｍ、および２５×１５×２ｍｍを含む。図６は、長方形の磁石が、処理チャネル１０４の最下部において実質的にＸ軸に沿って整列した一実施形態を示しており、処理チャネルの内部の磁力線および磁力を示す。追加の好ましい磁性部品の実施形態は、約７５×２０×３．２ｍｍの寸法を有する上部磁石および下部磁石を含み、上部磁石と下部磁石との間隔は、約２．５ｍｍ、約３．０ｍｍ、約３．５ｍｍ、約２．９ｍｍ、約３．０ｍｍ、約３．１ｍｍ、約３．２ｍｍ、約３．３ｍｍ、約２．７２ｍｍ、約２．８８ｍｍ、約２．９８ｍｍ、約３．１８ｍｍ、約３．２０ｍｍ、または約３．３７ｍｍを含む。
【0121】
好ましい実施形態では、装置は上部磁石および下部磁石を有し、下部（flower）磁石は入口チャネルへと延在する。下部磁石（bottom magnet）の寸法は、約５０ｍｍ～約１００ｍｍ×約１０ｍｍ～約３０ｍｍ×約２ｍｍ～約４ｍｍである。好ましい実施形態は、約７５ｍｍ、約８０ｍｍ、約８５ｍｍ、約９０ｍｍ、約９３ｍｍ、または約９５ｍｍ×約１５ｍｍ、約１８ｍｍ、約２０ｍｍ、約２３ｍｍ、または（and）約２５ｍｍ×約２ｍｍ、約２．３ｍｍ、約２．５ｍｍ、約２．７ｍｍ、約３ｍｍ、約３．１８ｍｍ、または（and）約３．５ｍｍを含む。上部磁石と下部磁石との磁石間隔は、好ましくは２～４．３ｍｍの間、約２．５ｍｍ、約４．０ｍｍ、約３．５ｍｍ、約２．９ｍｍ、約３．０ｍｍ、約３．１ｍｍ、約３．２ｍｍ、約３．３ｍｍ、または約２．７２ｍｍ、約２．８８ｍｍ、約２．９８ｍｍ、約３．１８ｍｍ、約３．２０ｍｍ、約３．３７ｍｍ、約３．５ｍｍ、約３．７ｍｍ、または約４ｍｍである。
【0122】
図７Ａ～Ｄに示される流体濃縮装置の実施形態では、磁性部品が、最上部と最下部とに平行に組み込まれ、処理チャネルのＸ軸に沿って実質的に整列している。
【0123】
ＩＩＩ．常磁性媒体
本発明による磁気促進濃縮によって処理されるサンプルには、通常は、常磁性成分または反磁性成分が追加される。本発明の方法によれば、関心のある粒子含有材料が常磁性媒体と組み合わされて処理溶液を生成する。常磁性媒体は常磁性体および溶媒を含む。好ましい実施形態によれば、常磁性媒体には生体適合性があり、すなわち、細胞の生存率に影響を与えることなく、または、たとえば遺伝子発現といった細胞の挙動に影響を与えることなく、生細胞と混合され得る。常磁性体は、ガドリニウム、チタン、バナジウム、ジスプロシウム、クロム、マンガン、鉄、ニッケル、ガリウム、そのイオンおよびこれらの組み合せを含むグループから選択され得る。一実施形態によれば、常磁性体は、３価チタンイオン、３価ガドリニウムイオン、１価バナジウムイオン、２価ニッケルイオン、３価クロムイオン、３価バナジウムイオン、３価ジスプロシウムイオン、２価コバルトイオン、および３価ガリウムイオンを含むグループから選択される。好ましい実施形態によれば、常磁性体はキレート化合物を含む。好ましい実施形態によれば、常磁性体は、ガドリニウムキレート化合物、ジスプロシウムキレート化合物、またはマンガンキレート化合物を含む。一実施形態によれば、常磁性媒体は、細胞の完全性を維持するように機能する常磁性体、塩類、および他の添加物を含む。本発明の一実施形態では、常磁性体は、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許出願第１４／４０７，７３６号に記述されているように、［Ａｌｉｑ］２［ＭｎＣｌ４］、［Ａｌｉｑ］３［ＧｄＣｌ６］、［Ａｌｉｑ］３［ＨｏＣｌ６］、［Ａｌｉｑ３］［ＨｏＢｒ６］、［ＢＭＩＭ］３［ＨｏＣｌ６］、［ＢＭＩＭ］［ＦｅＣｌ４］、［ＢＭＩＭ］２［ＭｎＣｌ４］、［ＢＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＢＤＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＢＤＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］［ＦｅＣｌ４］、［ＡｌａＣｌ］２［ＭｎＣｌ４］、［ＡｌａＣｌ］３［ＧｄＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］３［ＨｏＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＧｌｙＣ２］［ＦｅＣｌ４］でもよい。
本発明による磁気促進濃縮によって処理されるサンプルには、通常は、常磁性成分または反磁性成分が追加される。本発明の方法によれば、関心のある粒子含有材料が常磁性媒体と組み合わされて処理溶液を生成する。常磁性媒体は常磁性体および溶媒を含む。好ましい実施形態によれば、常磁性媒体には生体適合性があり、すなわち、細胞の生存率に影響を与えることなく、または、たとえば遺伝子発現といった細胞の挙動に影響を与えることなく、生細胞と混合され得る。常磁性体は、ガドリニウム、チタン、バナジウム、ジスプロシウム、クロム、マンガン、鉄、ニッケル、ガリウム、そのイオンおよびこれらの組み合せを含むグループから選択され得る。一実施形態によれば、常磁性体は、３価チタンイオン、３価ガドリニウムイオン、１価バナジウムイオン、２価ニッケルイオン、３価クロムイオン、３価バナジウムイオン、３価ジスプロシウムイオン、２価コバルトイオン、および３価ガリウムイオンを含むグループから選択される。好ましい実施形態によれば、常磁性体はキレート化合物を含む。好ましい実施形態によれば、常磁性体は、ガドリニウムキレート化合物、ジスプロシウムキレート化合物、またはマンガンキレート化合物を含む。一実施形態によれば、常磁性媒体は、細胞の完全性を維持するように機能する常磁性体、塩類、および他の添加物を含む。本発明の一実施形態では、常磁性体は、参照によって本明細書に組み込まれている米国特許出願第１４／４０７，７３６号に記述されているように、［Ａｌｉｑ］２［ＭｎＣｌ４］、［Ａｌｉｑ］３［ＧｄＣｌ６］、［Ａｌｉｑ］３［ＨｏＣｌ６］、［Ａｌｉｑ３］［ＨｏＢｒ６］、［ＢＭＩＭ］３［ＨｏＣｌ６］、［ＢＭＩＭ］［ＦｅＣｌ４］、［ＢＭＩＭ］２［ＭｎＣｌ４］、［ＢＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＢＤＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＢＤＭＩＭ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］［ＦｅＣｌ４］、［ＡｌａＣｌ］２［ＭｎＣｌ４］、［ＡｌａＣｌ］３［ＧｄＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］３［ＨｏＣｌ６］、［ＡｌａＣｌ］３［ＤｙＣｌ６］、［ＧｌｙＣ２］［ＦｅＣｌ４］でもよい。
【0124】
一実施形態によれば、常磁性媒体中の常磁性体の濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、１００ｍＭ、１２０ｍＭ、１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ、５００ｍＭ、または１Ｍでもよい。一実施形態によれば、常磁性媒体中の常磁性体の濃度は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、約５０ｍＭ～約１００ｍＭ、約１００ｍＭ～約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ～約２００ｍＭ、約２００ｍＭ～約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ～約３００ｍＭ、約３００ｍＭ～約５００ｍＭ、または約５００ｍＭ～約１Ｍでもよい。
【0125】
一実施形態によれば、常磁性体はガドリニウムを含み、常磁性媒体中の濃度は、少なくとも約１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または１００ｍＭである。一実施形態によれば、常磁性体はガドリニウムを含み、常磁性媒体中の濃度は、約１０ｍＭ～約５０ｍＭ、約２５ｍＭ～約７５ｍＭ、または約５０ｍＭ～約１００ｍＭである。
【0126】
ＩＶ．装置構成
図１～５および図７～１０を参照して、粒子の濃縮および単離のための本発明の粒子濃縮装置の様々な実施形態が示されており、装置の入口チャネル部分、処理チャネル部分、および出口チャネル部分は、分離して相互接続された個々の部品を備える。処理チャネルは、処理チャネル内の流れの層（この意味における「層」は、位置の、ｙ軸に沿った小さな範囲を指示する）の内部で粒子の濃縮に必要な滞留時間と、システムからの所望のスループットとに基づき、関心のある粒子含有流体を処理するための十分な時間を見込んで、好ましくは、ｘ軸に沿って十分な長さを有する細長い流体チャネルである。いくつかの実施形態では、処理チャネルは流体チャネルであり、高さは、約２００ミクロン～約３０ｍｍ、約２００ミクロン～約２０ｍｍ、約２００ミクロン～約１５ｍｍ、約２００ミクロン～約１０ｍｍ、約２００ミクロン～約５ｍｍ、約２００ミクロン～約２ｍｍ、約２００ミクロン～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約２ｍｍ、約０．５ｍｍ～約３ｍｍ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、または約１．５ｍｍ～約２ｍｍである。一実施形態によれば、処理チャネルの長さは、約２０ｍｍ～約２００ｍｍ、約２０ｍｍ～約１５０ｍｍ、約２０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約５０ｍｍ、約４０ｍｍ～約１００ｍｍ、約４０ｍｍ～約９０ｍｍ、または約４０ｍｍ～約８０ｍｍである。いくつかの実施形態については、チャネルの奥行き（Ｚ方向）は、約１００ミクロン～約５ｍｍ、約５００ミクロン～約３ｍｍ、約１ｍｍ～約２．５ｍｍ、または約１．５～約２ｍｍである。チャネル長の実施形態は、長さにおいて４０、４５、５０、６０、７０ｍｍでよい。例示的な処理チャネルの寸法は、１ｍｍおよび１．９ｍｍの高さ（画像において垂直なＹ軸）×０．８または１．０または１．５または２．０ｍｍの奥行き（Ｚ軸）を含み、長さ（Ｘ軸）は４０～７０ｍｍである。処理チャネルの好ましい実施形態では、例示的な処理チャネルの寸法は、約２ｍｍの高さ（画像において垂直なＹ軸）×約２．０ｍｍの奥行き（Ｚ軸）を含み、長さ（Ｘ軸）は約５０～７０ｍｍである。処理チャネルのさらに好ましい実施形態の長さは、約５５ｍｍ、約５６ｍｍ、約５７ｍｍ、約５８ｍｍ、約５９ｍｍ、約６０ｍｍ、約６１ｍｍ、約６２ｍｍ、約６３ｍｍ、約６４ｍｍ、約６５ｍｍ、または約６６ｍｍである。
図１～５および図７～１０を参照して、粒子の濃縮および単離のための本発明の粒子濃縮装置の様々な実施形態が示されており、装置の入口チャネル部分、処理チャネル部分、および出口チャネル部分は、分離して相互接続された個々の部品を備える。処理チャネルは、処理チャネル内の流れの層（この意味における「層」は、位置の、ｙ軸に沿った小さな範囲を指示する）の内部で粒子の濃縮に必要な滞留時間と、システムからの所望のスループットとに基づき、関心のある粒子含有流体を処理するための十分な時間を見込んで、好ましくは、ｘ軸に沿って十分な長さを有する細長い流体チャネルである。いくつかの実施形態では、処理チャネルは流体チャネルであり、高さは、約２００ミクロン～約３０ｍｍ、約２００ミクロン～約２０ｍｍ、約２００ミクロン～約１５ｍｍ、約２００ミクロン～約１０ｍｍ、約２００ミクロン～約５ｍｍ、約２００ミクロン～約２ｍｍ、約２００ミクロン～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約１ｍｍ、約０．５ｍｍ～約２ｍｍ、約０．５ｍｍ～約３ｍｍ、約１ｍｍ～約２ｍｍ、約１ｍｍ～約３ｍｍ、または約１．５ｍｍ～約２ｍｍである。一実施形態によれば、処理チャネルの長さは、約２０ｍｍ～約２００ｍｍ、約２０ｍｍ～約１５０ｍｍ、約２０ｍｍ～約１００ｍｍ、約２０ｍｍ～約５０ｍｍ、約４０ｍｍ～約１００ｍｍ、約４０ｍｍ～約９０ｍｍ、または約４０ｍｍ～約８０ｍｍである。いくつかの実施形態については、チャネルの奥行き（Ｚ方向）は、約１００ミクロン～約５ｍｍ、約５００ミクロン～約３ｍｍ、約１ｍｍ～約２．５ｍｍ、または約１．５～約２ｍｍである。チャネル長の実施形態は、長さにおいて４０、４５、５０、６０、７０ｍｍでよい。例示的な処理チャネルの寸法は、１ｍｍおよび１．９ｍｍの高さ（画像において垂直なＹ軸）×０．８または１．０または１．５または２．０ｍｍの奥行き（Ｚ軸）を含み、長さ（Ｘ軸）は４０～７０ｍｍである。処理チャネルの好ましい実施形態では、例示的な処理チャネルの寸法は、約２ｍｍの高さ（画像において垂直なＹ軸）×約２．０ｍｍの奥行き（Ｚ軸）を含み、長さ（Ｘ軸）は約５０～７０ｍｍである。処理チャネルのさらに好ましい実施形態の長さは、約５５ｍｍ、約５６ｍｍ、約５７ｍｍ、約５８ｍｍ、約５９ｍｍ、約６０ｍｍ、約６１ｍｍ、約６２ｍｍ、約６３ｍｍ、約６４ｍｍ、約６５ｍｍ、または約６６ｍｍである。
【0127】
処理チャネルは、任意の断面の幾何学的形状を有し得、断面の幾何学的形状は、正方形、長方形、円形または楕円形を含み得る。本明細書で説明された処理チャネルの幾何学的特性は、本発明の部品の形状に関して上記で説明された入口、出口、および他の流体チャネルに等しく適用可能である。
【0128】
入口チャネルの断面積（チャネルが円形のとき、ｒがチャネルの内径の半径であればπｒ２になる）は、処理チャネルの断面積よりも実質的に小さい。この状況では、特性的な断面寸法を記述するために「直径」が使用され、チャネルの断面が円形ではないこともある。様々な実施形態において、入口チャネルの断面積は、処理チャネルの断面積よりも小さく、せいぜい１／１００、１／８０、１／５０、１／４０、１／２０、１／１０、１／８、１／６、１／４、または１／２である。いくつかの実施形態では、入口チャネルの断面積は、処理チャネルの断面積よりも小さく、せいぜい１／１０である。いくつかの実施形態では、入口チャネルの断面積は、処理チャネルの断面積よりも小さく、せいぜい１／５である。いくつかの実施形態では、入口チャネルの断面積は、高々０．２ｍｍ２、高々０．８ｍｍ２、高々３．１ｍｍ２、高々７．１ｍｍ２、高々１２．６ｍｍ２、高々１９．６ｍｍ２、高々２８．３ｍｍ２、高々３８．５ｍｍ２、高々５０．３ｍｍ２、高々７８．５ｍｍ２、高々１７６．７ｍｍ２、または高々３１４．２ｍｍ２である。出口チャネルは、通常は入口チャネルと類似の寸法特性を有するが、断面積は、以下で説明されるように変化し得る。
【0129】
粒子濃縮装置の実施形態は、処理チャネル（１０３）の方へ先細りになる入口部分を含み、本発明の粒子単離装置は、渦流によって生じる乱流を低減することによって、異なる断面積の流体チャネルの接続に関連した、関連剪断力を低減するための、先細りになる進入ポートも含む。これらの渦流により、細胞または他の粒子が装置を通って流れることなく捕捉されてしまう場所が循環経路内に生じることにより、サンプルを処理する効率または速度が低下する可能性がある。渦流によって、細胞などの粒子に対する剪断応力が誘起されることもある。先細りの角度は、約１０°～約７０°の間、好ましくは約２０°～約６０°の間、または約３０°～約４５°の間であってもよく、いくつかの実施形態では約３０°であってもよい。
【0130】
装置の出口部分は、処理チャネルの中のサンプル流れの各部分を、単離またはさらなる処理のために、個別の流れへと分流するのを支援するスプリッタを備え得る。スプリッタは、好ましくは処理チャネルの内部に、ただし処理チャネルの終端の近くに配置され、そのため、流体が装置を出るとき、流体を処理チャネルに通すことによって実現されるあらゆる粒子単離が維持される。スプリッタは、出口チャネルから処理チャネルの終端まで延在する１つまたは複数の水平隔壁を備え得る。スプリッタは、処理チャネルの中へ、磁石が処理チャネルの相対する側に実質的にＸ軸に沿って整列する実施形態における磁石間距離の、０．５～３．５倍の間、１～３倍の間、１．５～２．５倍の間、１～２倍の間、または２倍の長さだけ延在し得る。粒子濃縮装置の単一磁石の実施形態に関して、スプリッタは、処理チャネルの中へ、Ｚ軸方向に、単一磁性部品の厚さの１～５倍、１．５～５倍、１．５～４倍、２～４倍、３～４倍、または４倍だけ延在し得る。処理チャネルのＸ軸に沿って整列した磁性部品がない実施形態については、スプリッタは、処理チャネル長さの、５～４０％の間、５～３０％の間、５～２５％の間、１０～３０％の間、１０～２０％の間、または１０～１５％の間だけ、好ましくは５％を超えて好ましくは３５％未満だけ、延在し得る。スプリッタは、処理チャネルの内部の末端のポイントまで先細りになる。先細りの角度は、約５°～約４５°の間、好ましくは約１０°～約３０の間°、約１５°～約２５°の間でよく、または、いくつかの実施形態では約２０°であってもよい。処理チャネルは、スプリッタを使用して水平に分割されてよい。加えて、スプリッタは、１つまたは複数の垂直隔壁を含み得、それによって、流出する流体の、複数の出口チャネルに通じる流体連通する出口開口の水平垂直グリッドをもたらす。この実施形態では、処理チャネルの終端近くの複数の出口チャネルが、出口ポートを通じて、収集チューブまたはエッペンドルフチューブのなどの複数の収集チャンバに達する。スプリッタ（複数可）は、複数の出口チャネルを画定する。一実施形態によれば、本発明の粒子濃縮装置が含むスプリッタは、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つまたは１０の出口チャネルを画定する。一実施形態によれば、本発明の粒子濃縮装置が含むスプリッタは、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、または少なくとも１０の出口チャネルを画定する。一実施形態によれば、本発明の粒子濃縮装置が含むスプリッタは、２～４、５～７、または８～１０の出口チャネルを画定する。本明細書で説明されたスプリッタと、これがもたらす様々な出口チャネルとは、本発明の部品の構成を参照して上記で説明された処理チャネルに組み込まれてもよい。
【0131】
複数の出口チャネルは、処理チャネルから、対応する複数の出口ポートまで延在する。複数の出口チャネルは、処理チャネルからそれぞれの流出液チャネルを通ってそれぞれの出口ポートへ流れる量を制御する、ポンプまたは出力弁などの流体の流れ調整器を含み得る。サンプル溶液の、それぞれの流出画分への分割は、個々の出口に向かう流れを、分割比を変更することができるように増減することによって実現され得る。一実施形態によれば、分割比は５０％まで加減され得る。たとえば、スプリッタが、断面が等しい２つのチャネルを含むなら、分割の幾何学的な比（geometric ratio）は１：１である。分割の比は、１つの画分に他の画分よりも大きい（または小さい）ポンピング率を適用して、より大量の（またはより小量の）流体を回収することにより、たとえば約３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または１０：１に変更され得る。好ましい実施形態では、そのような比に関する分割は、約２：１～約１：２の範囲になる。さらに好ましい実施形態では、そのような比に関する分割は、約１０：１～約１：１０の範囲になる。分割は、上部の出口チャネル流量と下部のチャネル流量との比を、それぞれ約１：１０、約１：９．５、約１：９、約１：８．５、約１：８、約１：７．５、約１：７、約１：６．５、約１：６、約１：５．５、約１：５、約１：４．５、約１：４、約１：３．５、約１：３、約１：２．５、約１：２、約１：１．５、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１、約５：５、約５．５：１、約６：１、約６．５：１、約７：１、約７．５：１、約８：１、約８．５：１、約９：１、約９．５：１、約１０：１、とすることができる。
【0132】
図１Ａが示す装置は、処理チャネル（１０４）の最上部のＸ軸に沿って実質的に整列した単一磁性部品（１０１）と、入口チャネル（１０２）および入口接続領域（１０３）と、複数の出口チャネル（１０６）および流れスプリッタ部分（１０５）とを有する。図１Ｂは、処理チャネルの最下部に沿って整列した単一の磁性部品（１０１）を有する類似の構成を示す。図１Ｃは、図１Ａの構成から、追加の磁性部品または部分（１０７）が、処理チャネルを越えて入口部分に延在する様子を示す。図１Ｄは、磁性部品が、処理チャネルの最下部のＸ軸に沿って実質的に整列し、入口部分に延在する、この種の構成を示す。一実施形態によれば、上部磁石と下部磁石との一方または両方を、システムの内部で移動可能に実装して、流体チャネルに対する磁石の垂直方向の位置調節を制御することにより、チャネルの中の磁界の強度を調節することが可能になる。本発明のある特定の実施形態では、処理チャネル内の粒子濃縮を調整するために、入口チャネルのジオメトリおよび入口チャネルの磁界が使用される。ある特定の実施形態は、処理チャネルの入口またはその近くに粒子を蓄積することによって粒子の相対的富化を変化させる流れの部分を生成する能力を提供する。たとえば、処理チャネルの入口またはその近くに粒子が蓄積すると、処理チャネル内の流れの中の粒子の量が即座に枯渇する可能性がある。粒子拘束力、沈降力、磁力またはこれらの組み合せを解放するかまたは克服することにより、処理チャネル内の流れの中の粒子濃縮が向上する。これによって、処理チャネル内の流れの粒子富化層の中の粒子富化のレベルが一時的に変化し得る。一態様において、この選択的な処理は、特に強化された（富化された）流れ画分または特に枯渇された流れ画分を識別して利用することができる本発明の装置および方法のユーザにとって、特に関心のある流れの画分を生成する際に有効である。
【0133】
図２Ａ～Ｄは、処理チャネルに対して実質的に直線状に整列した部分と、処理チャネルに対して角度Θだけ傾斜した部分に接続する、直線状に整列しない部分とを有する入口チャネル部分（２０３）をさらに備える単一磁性部品の構成を示す。非直線状の入口部分は１つまたは複数の交差チャネル（２０１）を含有し得、直線状の入口部分は１つまたは複数の交差チャネル（２０２）を備え得る。入口チャネルに対する交差チャネルは、液体、懸濁液、またはガスの導入または除去をもたらす。交差チャネルは、常磁性媒体、緩衝剤、凝集剤、サンプル前処理試薬または反応物などの試薬をサンプル流に導入することができる。交差チャネルは、入口チャネルまたは処理チャネルの中の粒子またはサンプル媒体の他の成分と反応させるための反応試薬をサンプル媒体に導入するためにも使用され得る。たとえば、細胞染色反応またはリガンド結合反応は、分離前に入口チャネルにおいて実行され得る。加えて、いくつかの実施形態では、沈降、凝集、または結晶化反応の場合には、反応は、必要に応じて、処理チャネルの中で実行または継続され得る。交差チャネルのうち１つまたは複数は、分離チャネルに入るのを退けられたかまたは妨げられた粒子を収集するための出力端としても使用され得る。図２Ａが示す流体濃縮装置では、処理チャネルの最上部において、磁性部品がＸ軸に沿って実質的に整列している。入口チャネルの非直線状の部分は、入口チャネルの実質的に直線状の部分に対して約９０°である。図２Ｂが示す類似の実施形態では、処理チャネルの最下部において、磁性部品が実質的に直線状に整列しており、入口チャネルの非直線状に整列した部分は、入口チャネルの実質的に直線状の部分に対して約２７０°である。図２Ｃは、図２Ａのような、磁性部品が処理チャネルの最下部に沿って整列した実施形態を示す。図２Ｄは、図２Ｂに類似の、磁性部品が処理チャネルの最下部に沿って整列した実施形態を示す。図２Ａ～Ｄの実施形態では、非直線状に整列した入口チャネル部分は、入口チャネルの実質的に直線状の部分に対して約９０°（図２Ｂ、２Ｄ）または約２７０°（図２Ａ、２Ｃ）のいずれかであり、角度Θは、装置要件によって決定され、Ｘ軸に対して、Θ≠０°、Θ≠１８０°、Θ≧３０°、Θ≧４５°、Θ≧７０°、Θ≧９０°、Θ≧１００°、Θ≧１３５°、Θ≧１４０°、Θ≧１６５°Θ＞１８０°、Θ≧２０５°、Θ≧２２５°、Θ≧２５０°、Θ≧２８０°、Θ≧３００°、もしくはΘ≦３３０°であり得、および／またはＹ軸やＺ軸に対して、独立して、任意の角度Θであり得る。たとえば、図２Ｅは、Θ（ｘ）＝９０°、Θ（ｙ）＝１８０°、Θ（ｚ）＝０°である平面図を示す。図２Ｆは、Θ（ｘ）＝９０°、Θ（ｙ）＝２２５°、Θ（ｚ）＝０°である平面図を示す。
【0134】
【0135】
図４Ａ～Ｄが示す流体濃縮装置の実施形態は、入口チャネルを取り囲む円環状磁石またはトロイダル磁石部品（環状磁石）であるさらなる部品（４０１）を有する。環状磁石が備え得る１つまたは複数の磁石は、それらの磁極に対して反発しあう配向で配置されており、それによって、入口チャネルのＸ軸に沿って対称な磁力をもたらす。一実施形態では、環状磁石が備える複数の長方形の磁石は、個々の反発しあう磁界が入口チャネルの内部で整列するように、入口のまわりに構成される。環状磁石からの力によって、粒子の常磁性に対する反発力が与えられ、粒子の流速が低下する。環状磁石は、入口チャネルの実質的に直線状の部分に構成され得、磁性部品は、図４Ａに示されるように、処理チャネルの最上部のＸ軸に沿って実質的に整列し、また、磁性部品は、図４Ｂに示されるように、処理チャネルの最下部のＸ軸に沿って実質的に整列する。図４Ｃは、図４Ａの構成から、追加の磁性部品または部分（１０７）が、処理チャネルを越えて入口部分に延在する様子を示す。図４Ｄは、処理チャネルの軸に沿って整列する磁性部品がなく、環状磁石が流体濃縮装置の入口部分を取り囲むように構成されている様子を示す。環状磁石は、図４Ａ～Ｄでは入口チャネルの直線状の部分を取り囲む環状磁石４０１として示されているが、これらの実施形態に限定されることなく、他の実施形態では、入口チャネルに沿って、入口チャネルの非直線状に整列した部分も含めて、どこにでも配置され得る。
【0136】
図５Ａ～Ｄが示す実施形態では、処理チャネルのＸ軸の最上部または最下部に沿って実質的に整列した単一磁性部品が、環状磁石４０１と、非直線状に整列した入口チャネル部分および交差チャネルとをさらに備える。交差チャネルのうち１つまたは複数は、分離チャネルに入るのを退けられたかまたは妨げられた粒子を収集するための出力端としても使用され得る。
【0137】
粒子濃縮装置の実施形態の多くは、処理チャネルのＸ軸の最上部または最下部のいずれかに沿って実質的に整列した単一磁性部品を備える。本明細書で説明される他の実施形態には、処理チャネルのかなりの部分に沿って整列した磁性部品はない。他の実施形態では、粒子濃縮装置は、処理チャネルのＸ軸の最上部および最下部に沿って実質的に整列した複数の磁性部品を備え得る。そのような実施形態により、チャネル内の常磁性粒子が磁気浮上することによって、処理チャネル内の不均質な粒子が分離される。一実施形態によれば、この磁気浮上装置が含む上部磁石または下部磁石は、連結された複数の磁石を制御する（すなわち、流体チャネルの処理区間にわたって積極的に磁界を生成させる）ことによって、磁界の大きさおよび勾配プロファイルを制御するように、移動可能に実装された複数の磁石を備える。時間の関数として磁界を制御することにより、試験中またはアッセイ中にいつでも変更され得る、より複雑なプロトコルが可能になる。これによって、静的システムに対する他の利益の中でも、特に、より融通性のあるサンプルの分割と、粒子の分離における、より高い分解能と、より融通性のある、流体経路のパージ、プライム、および処置のための方法と、試験またはアッセイを実行するとき、分離パラメータを最適化または変化させるフィードバックとが可能になる。
【0138】
一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石は細長い長方形の磁石（好ましくは棒磁石）を備え、その寸法は、高さ［ｙ軸（縦軸）方向］が約２ｍｍ～約２５ｍｍ、幅（ｘ軸方向）が約３０ｍｍ～約８０ｍｍまたは約９５ｍｍ、奥行き（ｚ軸方向）が約０．５ｍｍ～約７ｍｍの範囲である。好ましくは、上部磁石および下部磁石の寸法は、高さ（ｙ軸方向）が約４ｍｍ～約２０ｍｍ、幅（ｘ軸方向）が約４０ｍｍ～約６０ｍｍ、奥行き（ｚ軸方向）が約１ｍｍ～約３ｍｍの範囲である。本明細書で説明された好ましい磁石サイズは、１つの磁石によって、または複数の磁石を組み合わせることによって、実現され得る。一実施形態によれば、上部磁石と下部磁石との奥行きおよび幅は実質的に同一である。一実施形態によれば、上部磁石の高さは、下部磁石の高さよりも、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または５００％高い。一実施形態によれば、上部磁石の高さは、下部磁石の高さよりも、約２５％～約１００％、約１００％～約２００％、約２００％～約３００％、約３００％～約４００％、約４００％～約５００％、または約５００％～約６００％高い。一実施形態によれば、下部磁石の高さは、上部磁石の高さよりも、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または５００％高い。一実施形態によれば、下部磁石の高さは、上部磁石の高さよりも、約２５％～約１００％、約１００％～約２００％、約２００％～約３００％、約３００％～約４００％、約４００％～約５００％、または約５００％～約６００％高い。
【0139】
一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石と、流体チャネル、キャピラリまたは中央処理区間との間の縦軸に沿った距離は、少なくとも約１ミクロン、１０ミクロン、５０ミクロン、または１００ミクロンであり、および／または、せいぜい約５００ミクロン、１ｍｍ、２ｍｍ、３ｍｍ、４ｍｍ、または５ｍｍである。一実施形態によれば、磁石のうちどちらかと流体処理チャネルとの間の縦軸に沿った距離は、約１ミクロン～約５ｍｍの間であり、好ましく約１０ミクロン～約２ｍｍである。
【0140】
一実施形態によれば、上部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離は、下部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離よりも、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または５００％大きい。一実施形態によれば、上部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離は、下部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離よりも、少なくとも約２５％～約１００％、約１００％～約２００％、約２００％～約３００％、約３００％～約４００％、約４００％～約５００％、または約５００％～約６００％大きい。
【0141】
一実施形態によれば、下部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離は、上部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離よりも、少なくとも約２５％、５０％、７５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２２５％、２５０％、２７５％、３００％、３２５％、３５０％、３７５％、４００％、４２５％、４５０％、４７５％、または５００％大きい。一実施形態によれば、下部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離は、上部磁石と流体処理チャネルとの間の垂直距離よりも、少なくとも約２５％～約１００％、約１００％～約２００％、約２００％～約３００％、約３００％～約４００％、約４００％～約５００％、または約５００％～約６００％大きい。
【0142】
一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石は永久磁石または電磁石である。一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石の最大エネルギー積は、約１メガガウスエルステッド～約１０００メガガウスエルステッドの範囲であり、より好ましくは約１０メガガウスエルステッド～約１００メガガウスエルステッドの範囲である。一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石の表面磁界の強度は、約０．１テスラ～約１００テスラの範囲であり、より好ましくは約１テスラ～約１０テスラの範囲である。一実施形態によれば、上部磁石および下部磁石の残留磁気は、約０．５テスラ～約５テスラの範囲であり、より好ましくは約１テスラ～約３テスラの範囲である。
【0143】
好ましい実施形態によれば、処理チャネルの一方の側に強い磁性材料を使用して、相対する側には弱い磁性材料を使用することにより、非対称の磁界が実現される。好ましい実施形態によれば、流体チャネルの一方の側に磁性材料を使用して、相対する側には実質的に類似の磁性材料を使用することにより、非対称の磁界が実現される。そのような実施形態によれば、上部磁石と下部磁石とは実質的に同一のサイズでよい。そのような実施形態によれば、上部磁石がネオジムと鉄の合金を含み得、下部磁石がサマリウムコバルトを含み得、両方の磁石が実質的に同一のサイズである。あるいは、上部磁石がサマリウムコバルトを含み得、下部磁石がネオジムを含み得、両方の磁石が実質的に同一のサイズである。
【0144】
一実施形態によれば、代替の磁石構成が使用され得る。本発明による装置は、流体チャネルのまわりに配置された複数の上部磁石および複数の下部磁石を含み得る。上部磁石は、前方の上部磁石、中央の上部磁石、および後方の上部磁石を含み得る。下部磁石は、前方の下部磁石、中央の下部磁石、および後方の下部磁石を含み得る。
【0145】
別の磁石構成によれば、装置は、前方の上部磁石、後方の上部磁石、前方の下部磁石、および後方の下部磁石を含み得、これらの磁石は流体チャネルのまわりに配置される。前方の上部磁石と後方の下部磁石とは、磁力が反発しあう配向に配置される。非対称の磁気浮上装置は、参照によって本明細書に組み込まれている国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ１９／２４１３８においてさらに説明されている。
【0146】
図７Ａ～Ｄは、オプションの環状磁石４０１、および例示的な配向におけるオプションの入口チャネル部分２０１、２０２、および２０３を有する二重磁性部品の粒子濃縮装置の実施形態を示す。
【0147】
本明細書で説明される粒子濃縮装置のある特定の実施形態には、処理チャネルのかなりの部分に沿って整列した磁性部品はない。粒子濃縮は、沈降と、入口チャネル内の粒子の、克服可能な磁力反発や入口チャネルのジオメトリによって適宜強化され得る、流れによる前濃縮によって、入口チャネルにおける粒子を適宜前濃縮することとの組み合せによって実現される。図８Ａ～Ｄは、装置構成の実施形態を示す。図８Ｅ～Ｈは、オプションの交差チャネル（複数可）への流体の移動を制御する、入口チャネル弁（８０１、８０２、８０３）の組込みを示す。ポンプ（８０４）は、入口チャネル、入口交差チャネル、出口チャネル、分流チャネルなどの任意のチャネルに関連付けられてよい。ポンプは、本明細書でさらに説明されるように、様々な実施形態において、流体連通したチャネルに関連する複数のポンプで動作したとき、対応するチャネル内の流体および累積流れを駆動するのに必要な陽圧または陰圧を与えるように構成され得る。図８Ｈは、入口交差チャネル８０５および８０６を有する粒子濃縮装置を示す。図８Ｈに示されるように、入口交差チャネルは、環状磁石の上流、下流、または両方にあってよい。一実施形態では、入口交差チャネル（８０６）は、環状磁石の上流にある処理チャネルに対して実質的に直線状の入口チャネルの部分にのみ設けられる。
【0148】
図９は、単一磁性部品の粒子濃縮装置の一実施形態を示す。図９Ａは、流れを入口チャネルから処理チャネルへと駆動するポンプ（８０４）を有する粒子濃縮装置を示す。図９Ｂは、出口チャネルの流量を個々に制御する複数のポンプ（８０４）を有する粒子濃縮装置を示す。組み合わせた流量は、処理チャネルの流れと入口チャネルの流れとを加算したものである。流量は、粘度、粒子の濃度などのサンプル流体特性と、入口チャネル、処理チャネル、および出口チャネルの寸法および構成とに依拠して、０．１μＬ／分～１ｍＬ／分の範囲になり得る。好ましい実施形態では、処理チャネルおよび出口チャネルの流量は、約０．２μＬ／分～約２００μＬ／分、または約０．５μＬ／分～約４０μＬ／分になり得る。濃縮は、流れ停止または断続的な流れ動作の下でも実行され得る。出口チャネルを出口ポート（９０３）または（９０４）へと分流するために弁（９０２）が作動され得る。いくつかの実施形態では、入口チャネルポンプ（複数可）および出口チャネルポンプ（複数可）は、それぞれ処理チャネルに関連して、陽圧構成または陰圧構成のいずれかにおいて採用される。流れ停止状態の下でサンプルの分離が実行され、サンプルは、処理チャネル内の流れを再開することにより、別個の出口チャネルに取り出される。
【0149】
本発明によれば、粒子濃縮装置は、装置を通して流体を駆動するための１つまたは複数のポンプを含み得る。「ポンプ」は、装置における別々の位置の間に圧力差を印加するあらゆる装置を指すように使用される。ポンプは、システムの入口側［流体を出口（複数可）の方へ押す］、もしくは出口側［液体を入口（複数可）から引く］のいずれか、または両方の組み合せに配置されてよい。圧力差は陽圧または陰圧であり得る。圧力差は、複数の出口または入口にわたって共通に印加されてよく、または、それぞれの出口または入口が圧力差を直接印加されるように構成されてもよい。いくつかの実施形態では、入口チャネル内の、粒子の前濃縮力、磁力、沈降力、または力の組み合せを克服するために圧力差が印加され得る。ポンプは、印加する圧力差を制御できるように可変でよい。ポンプのタイプは、それだけではないが、シリンジポンプなどの容積型ポンプ（positive displacement pumps）と、蠕動ポンプと、ダイヤフラムポンプと、調整された静圧源と、液体の量の増減などの重力で制御される圧力源と、プラスチックブリスターまたはフォイルブリスターなどの手動の圧力源とを含む。
【0150】
いくつかの実施形態では、ポンプは、チャネル構造を通して流体を全体的に駆動するように入口ラインに含まれてよく、流体を、導かれた出口ラインを通して駆動するように、ある特定の出口チャネルまたは出口ポートに含まれてもよい。たとえば、ポンプは、関心のある１つまたは複数の粒子の粒子富化層または粒子枯渇層の高さ（複数可）に関連した１つまたは複数の出口ラインに含まれてよい。加えて、すべての出口ラインが、関心のある１つまたは複数の粒子の予期される流れの高さ（複数可）に基づいて活性化または非活性化され得る可変ポンプを含み得る。同様に、外部ポンプは可変圧力差を与えるよう制御され得る。実施形態は、１つまたは複数の出口収集チューブを保持するための受け口、１つまたは複数の入力チューブを保持するための受け口、たとえば、１つまたは複数の出口チューブをほぼ摂氏４℃の温度で保管する冷却板といった、１つまたは複数のチューブ用の温度制御される受け口を備える部品、あるいは入口または出口をマイクロプレートのウェルに結合するための位置決め手段を含み得るマイクロプレート保持具を含む、追加の部品をさらに備え得る。一実施形態では、出口チャネルまたは出口ポートはピペット操作ロボットに流体結合される。ピペット操作ロボットは、処理チャネルからの濃縮された粒子集団のアリコートまたは画分を選択的に分配し、代わりに、またはそれに加えて、処理チャネルからの粒子枯渇流出液のアリコートまたは画分を分配するように、粒子濃縮装置と統合され得る。粒子濃縮装置は、この装置による流体および／または粒子の流れおよび分離を記録し、分析し、および／または制御するようにプログラムされたマイクロプロセッサまたはコンピュータと統合されてもよい。
【0151】
図１０は、例示的な粒子濃縮装置を備える粒子濃縮システムを示す。粒子濃縮装置は、１つまたは複数のセンサをさらに備え得る。たとえば、粒子濃縮システムには処理チャネルセンサ（１００１）および入口チャネルセンサ（１００２）が実装され得る。システムインテグレータ（１００３）は、センサ（１００１）および（１００２）から信号を受け取るために信号プロセッサを備えることができ、事前にプログラムされた命令またはプログラマブル命令によって、入口ポンプ（複数可）（８０４）または出口チャネルポンプ、環状磁石（２０１）または他の電磁部品の磁界、弁または他のインターフェース装置もしくはインターフェース部品などの他の部品を制御する。センサは、光センサ、容量性センサ、導電性センサ、熱センサ、流量センサ、超音波センサ、重力センサ、磁界センサ、またはこれらの組み合せから選択される。実施形態では、センサは、光検出器、マルチ画素撮像検出器、磁界検出器、電気化学検出器、光学的位相検出器、散乱検出器、ホールセンサ、磁気抵抗センサ、電磁放射測定センサ、表面弾性波センサ、バイオセンサ、またはこれらの組み合せである。センサは、粒子の存否もしくは量、または粒子もしくはサンプル流の他の物理的性質または化学的性質を検出するために、処理チャネルまたは入口チャネルの一部の内部に、またはこれに隣接して、１つまたは複数のセンサをさらに備え得る。
【0152】
図１８の粒子濃縮装置の平面図に示されるように、粒子濃縮装置は、可視化部品または撮像センサ、センサ照明器、およびセンサ光学系をさらに備え得る。可視化部品は、粒子が処理チャネルを通過するときにリアルタイムで観察する能力および／または記録する能力を可能にするかまたは強化する任意の装置を備え得ることにより、粒子単離の程度および／または粒子単離の速度を含む、粒子単離の観測および／または測定を可能にする。可視化は、粒子および／またはサンプルの他の成分のサイズ、形状、または他の特性の分析も含み得る。一実施形態によれば、処理チャネルを取り囲むことによってこれを画定するために使用される材料は、少なくとも処理チャネルの一区間に沿って、ここを通る粒子の観測を容易にするために、澄んでいるかまたは透明である。可視化システムは、サンプル成分の明視野照明、暗視野照明、および／または蛍光検出を可能にするための光学系を採用し得る。
【0153】
一実施形態では、粒子濃縮装置は、チャネルの相対する側に、２つの光学的に澄んでいるかまたは透明なチャネル区間をそれぞれ備える。この実施形態によれば、前記澄んでいるかまたは透明な区間の一方の側に配置された可視化部品が、この区間を通して合焦され、また、相対する側に照明部品が配置され、前記澄んでいるかまたは透明な第２の区間を通して合焦される。照明部品は、可視化部品による処理チャネル内の粒子の可視化を容易にするのに十分な光を供給するように構成される。別の実施形態では、粒子濃縮装置は、チャネルの一方の側に、１つの澄んでいるかまたは透明な区間を含む。この実施形態によれば、前記澄んでいるかまたは透明な区間の一方の側に配置された可視化部品が、この区間を通して合焦され、また、同じ側に照明部品が配置され、前記澄んでいるかまたは透明な区間を通して合焦される。照明部品は、可視化部品による処理チャネル内の粒子の可視化を容易にするのに十分な光を供給するように構成される。
【0154】
好ましい実施形態では、照明システムは可視光または紫外線の光源である。照明光源は、処理チャネルを含む光学的に透明な流路においてサンプルを照光するように構成され得、光は、流路を通って、照明光源の反対側の光センサまで伝送される。一実施形態では、照明光源は、光センサに対して角度的に隣接し、そのため、光源からの光は、流路内のサンプルから光センサへと反射される。一実施形態では、光源は、紫外線の光源であって、サンプルに関連する人工蛍光または自然蛍光からの可視光が光センサによって検出されるように、流路内のサンプルを照光するように構成して配置される。
【0155】
Ｖ．粒子の単離および濃縮の方法
本発明の方法によって有機粒子または無機粒子が濃縮され得る。粒子は、細胞、細胞片、細胞器官（たとえば細胞核）、クラスタ、組織、組織成分、細菌、菌類（酵母および糸状菌）、ウイルス、原生動物、藻類を含む微生物、およびその断片、細胞器官、クラスタ、およびその他の成分などの生物学的存在でもよい。粒子は、高分子、合成物、キレート、コンジュゲート、結晶、非晶質固体、ゲル、凝固物などであり得る。ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質は、本発明の方法の下で濃縮され得る。ビーズ、シェル、ナノ粒子、積層物、ならびに沈澱物および共沈物は、同様に濃縮され得る。粒子の単離を必要とする多くの用途には、他の粒子から類似の粒子を分離する必要がある用途と、粒子の識別と、粒子の取扱いまたは操作とが含まれる。そのような用途は、それだけではないが、生細胞と死細胞とを分離すること、生細胞、死細胞および核破片から細胞核を分離すること、循環腫瘍細胞の単離および／または処置、エマルションＰＣＲ富化、多血小板血漿などの血漿の生産、性別選択などの特定の形質のために精子を単離すること、細菌負荷検査、抗生物質耐性検査、敗血症または血液汚染の識別、免疫細胞単離、化合物スクリーニング、エクソソーム分離、または細胞外小胞の分離を含む。本発明の粒子単離方法は、これらの用途のうち任意のものにおいて利用され得る。
本発明の方法によって有機粒子または無機粒子が濃縮され得る。粒子は、細胞、細胞片、細胞器官（たとえば細胞核）、クラスタ、組織、組織成分、細菌、菌類（酵母および糸状菌）、ウイルス、原生動物、藻類を含む微生物、およびその断片、細胞器官、クラスタ、およびその他の成分などの生物学的存在でもよい。粒子は、高分子、合成物、キレート、コンジュゲート、結晶、非晶質固体、ゲル、凝固物などであり得る。ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質は、本発明の方法の下で濃縮され得る。ビーズ、シェル、ナノ粒子、積層物、ならびに沈澱物および共沈物は、同様に濃縮され得る。粒子の単離を必要とする多くの用途には、他の粒子から類似の粒子を分離する必要がある用途と、粒子の識別と、粒子の取扱いまたは操作とが含まれる。そのような用途は、それだけではないが、生細胞と死細胞とを分離すること、生細胞、死細胞および核破片から細胞核を分離すること、循環腫瘍細胞の単離および／または処置、エマルションＰＣＲ富化、多血小板血漿などの血漿の生産、性別選択などの特定の形質のために精子を単離すること、細菌負荷検査、抗生物質耐性検査、敗血症または血液汚染の識別、免疫細胞単離、化合物スクリーニング、エクソソーム分離、または細胞外小胞の分離を含む。本発明の粒子単離方法は、これらの用途のうち任意のものにおいて利用され得る。
【0156】
サンプル媒体の中に存在する粒子は、粒子の濃度を実質的に富化してサンプル媒体の層を実質的に枯渇させる条件の下で、粒子濃縮装置において濃縮される。不均質な粒子集団を有するサンプル媒体は、サイズと、密度と、常磁性の不均質性および磁力の選択的配向と、処理チャネルの流量とに基づいて選択的に富化され得る。粒子の不均質な集団は生体サンプルから導出され得る。場合によっては、生体サンプルには、説明する例として、血液、唾液、尿、精液、血漿、血清、および便を含む体液と、肌スワブ、肛門スワブ、鼻スワブ、および膣スワブ、またはドアの取手からの環境スワブを含むスワブと、涙、肺からの洗浄液、または胸からの間質組織液を含む近位体液とがある。場合によっては、生体サンプルには、説明する例として、生細胞および死細胞、溶解細胞、循環腫瘍細胞、核酸、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、抗原、抗体、または免疫細胞（たとえば白血球、Ｔ細胞、食細胞）がある。場合によっては、生体サンプルには、説明する例として、生体分子、細胞、タンパク質、脂質、炭水化物、微生物、ウイルス、バイロン（viron）、または細菌がある。
【0157】
サンプル媒体における粒子濃縮に関する粒子富化画分の濃度のレベルは、少なくとも３０％、好ましくは４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％である。一実施形態では、粒子枯渇画分には実質的に粒子がない。
【0158】
試薬流体またはガスは、処理チャネルへの導入に先立って、サンプル媒体が、交差チャネルを含有している位置に沿って通過する前に、通過するのと同時に、または通過した後に、流れの中に導入されてよい。一実施形態では、処理チャネルにおける濃縮、単離または分析のための準備として、常磁性媒体、緩衝剤、凝集剤、サンプル前処理試薬または反応物が、サンプル媒体の中に導入して混合され得る。
【0159】
粒子は、ある流量で処理チャネルの中に導入され、そこで沈降し、および／または磁力反発および／または磁力吸引によって、流れの内部に粒子富化層および粒子枯渇層を形成する。様々な実施形態において、流れの中で、連続流れ状態、流れ停止状態、または断続的な流れ状態の下で、粒子富化層および粒子枯渇層が形成される。粒子富化層および／または粒子枯渇層は、処理チャネルにおいて流れに分割されるとき、収集される。粒子枯渇流れおよび／または粒子富化流れは、処理チャネルから流出すると、小分けまたは分画へと選択的に向けられる。関心のある粒子は、処理チャネルの内部で、流れ層におけるそれらの平衡高さ（またはほぼ平衡高さ）に一旦到達すると、処理溶液を複数の画分に分割するスプリッタを通過する。関心のある粒子は、処理溶液の内部で、幾何学的に単離されているので、実質的にすべてが、ある特定の幾何学的画分の流出液の中に保たれる。次いで、関心のある粒子を含有して流出する幾何学的画分（複数可）が収集され、関心のある粒子が複数の画分に存在する場合には再結合され、それによって、関心のある粒子を単離させる。いくつかの実施形態では、常磁性媒体から細胞を分離しなければならないことがある。常磁性媒体から細胞を分離することが望まれる場合、これは希釈によって行われ得る。
【0160】
あるいは、サンプル溶液の、それぞれの流出画分への分割は、個々の出口に向かう流体流れを、分割比を変更することができるように増減することによって実現され得る。一実施形態によれば、分割比は５０％まで加減され得る。たとえば、スプリッタが、断面が等しい２つのチャネルを含むなら、分割の比は１：１である。分割の比は、１つの画分に他の画分よりも大きい（または小さい）ポンピング率を適用して、より大量の（またはより小量の）流体を回収することにより、たとえば約３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または１０：１に変更され得る。好ましい実施形態では、そのような比に関する分割は、約２：１～約１：２の範囲になる。さらに好ましい実施形態では、そのような比に関する分割は、約１０：１～約１：１０の範囲になる。分割は、上部の出口チャネル流量と下部のチャネル流量との比を、それぞれ約１：１０、約１：９．５、約１：９、約１：８．５、約１：８、約１：７．５、約１：７、約１：６．５、約１：６、約１：５．５、約１：５、約１：４．５、約１：４、約１：３．５、約１：３、約１：２．５、約１：２、約１：１．５、約１：１、約１．５：１、約２：１、約２．５：１、約３：１、約３．５：１、約４：１、約４．５：１、約５：１、約５：５、約５．５：１、約６：１、約６．５：１、約７：１、約７．５：１、約８：１、約８．５：１、約９：１、約９．５：１、約１０：１、とすることができる。
【0161】
一実施形態では、濃縮された粒子を含むサンプル流体は、処理区間の最後尾に到達するまでは比較的遅い流速で流体チャネルを通過してから、そこで、流速が少なくとも２倍になる。好ましい実施形態では、サンプル流体の流速は、処理区間の最後尾において少なくとも４倍に増加する。場合によっては、サンプル流体は、本明細書で説明されたように、磁石環または対の上部磁石と下部磁石とによって生成された磁界にさらされる。場合によっては、サンプル流体は磁界にさらされない。
【0162】
アリコートまたは画分は、チューブまたはプレートなどのチャンバまたは容器へと分流され得る。画分またはアリコートは、さらなる処理、分析、または反応の対象になり得る（maybe subjected to）。一実施形態では、チャンバ、プレート、ウェル、および／またはチューブは、後続の処理工程のために必要な材料の所定量を含み、ユーザは、細胞を濃縮するばかりでなく、細胞をある媒体から別の媒体へと移すこと、または試薬を追加することもできる。例示的な試薬は、それだけではないが、ＲＮＡ単離、ＤＮＡ単離、ｍＲＮＡ単離、タンパク質単離、培養基、培地、および定着剤に関する試薬を含む。単離されたアリコートおよび／または画分は、磁気浮上および磁気分離、化学分析または生化学分析、分画、誘導体化、シークエンスサンプル調製、マススペクトル分析、ＮＭＲ分析、顕微鏡分析、ＦＡＣＳ選別および分析、およびＸ線回折分析を含むさらなる処理の対象になり得る。生体細胞は、収集された自然な状態において、または遺伝子組換えもしくは生化学的修飾を受けて、診断手順または治療手順に使用され得る。
【0163】
粒子は、入口チャネル、処理チャネル、または出口チャネルにある間に、速度、密度、生物学的、化学的、遺伝学的、分類学的、構成上の、生存率、濃度、または配向を含む特性をデータ収集し得る。データ収集は、入口チャネル、処理チャネル、出口チャネル、またはこれらの組み合せ、およびチャンバ、ウェル、プレートまたはチューブの内部にある、隣接した、または呼掛け信号を送信するように連結された、１つまたは複数のセンサまたはセンサの配列を用いて実行され得る。検出された特性は、独立した分析のために使用され得、システムの動作を制御するかまたは自動化するためにシステムコントローラ部品によって利用され得る。制御下のシステム部品およびパラメータは、サンプル媒体の流量と、磁界強度と、分流、収集、分画のための弁作動と、後続の反応条件とを含む。入口チャネル内のセンサは、一実施形態では、入口チャネル内のサンプル流れの中に試薬流体または試薬ガスを自動的に導入するために、システムコントローラに動作可能に連結されて統合される。
【0164】
図１１は、本発明の装置を利用する、粒子の濃縮を示す。粒子は、入口チャネルを通るサンプル媒体の流れによって処理チャネルに導入される。沈降力および／または磁気反発力が、流れの下部層において粒子を濃縮し、濃縮された粒子は、下部の出口チャネルを通って収集される。粒子枯渇層は上部の出口チャネルを通って収集される。この方法は、（ｉ）処理チャネル、入口チャネル、および複数の出口チャネルを有する小容量の流体装置を用意する工程と、（ｉｉ）少なくとも粒子富化層および粒子枯渇層を有するサンプル流を生成する条件の下で、粒子含有サンプルを、入口チャネルを通して処理チャネルに流し込む工程と、（ｉｉｉ）第１の出口チャネルを通して粒子富化層を流し、粒子富化流を生成する工程と、（ｉｖ） 第２の出口チャネルを通して粒子枯渇層を流し、粒子枯渇流を生成する工程と、（ｖ）１つまたは複数の出口チャネルからの流れのうち１つまたは複数を収集する工程と、を含む。
【0165】
図１２に示される流れ支援の粒子濃縮方法では、入口チャネルは、処理チャネルに対して実質的に直線状の部分と、角度Θだけ傾斜した部分に接続する、処理チャネルに対して非直線状に整列する部分とからさらになる。入口チャネル内の粒子を濃縮するために、粒子含有サンプル媒体が、入口チャネルの非直線状に整列した部分の内部での沈降を可能にするのに十分な流量で、入口チャネルを通して流される。流れの粒子富化層および粒子枯渇層を形成するために、連続した沈降またはさらなる沈降をもたらすように、適宜、粒子の磁力反発を用いて、処理チャネルへの粒子含有サンプルの流れが維持される。流れのそれぞれの層が、それぞれの出口チャネルに収集される。いかなる理論にも束縛されることなく、懸濁されている液体（たとえば水、溶媒）よりも密度が高い粒子の、重力がある状態において沈降する傾向と、磁界からの反発作用との組み合せによる、粒子の濃縮が考えられる。粒子は、少なくとも１分、少なくとも２分、少なくとも５分、少なくとも１０分、少なくとも２０分、少なくとも３０分、または少なくとも６０分にわたって沈降し得る。粒子は、少なくとも１０秒、少なくとも２０秒、少なくとも３０秒、少なくとも４０秒、少なくとも５０秒、少なくとも６０秒、少なくとも１００秒、または少なくとも２００秒にわたって沈降し得る。いくつかの実施形態では、濃縮された粒子が流体チャネルを通過する流量は、高々５０μｌ／分（マイクロリットル／分）、高々４０μｌ／分、高々３０μｌ／分、高々２０μｌ／分、高々１０μｌ／分、高々５μｌ／分または高々２μｌ／分である。いくつかの実施形態では、濃縮された粒子が約２０μｌ／分の流量で流体チャネルを通過することにより、液体は流れ装置を通過するが、粒子は磁界の外部に蓄積することが可能になる。いくつかの実施形態では、濃縮された粒子が約１０μｌ／分の流量で流体チャネルを通過することにより、液体は流れ装置を通過するが、粒子は磁界の外部に蓄積することが可能になる。フローセルを通過する液体は、収集チャンバに通じる出口チャネルのうち１つを通って沈殿することになる。一旦、液体の大部分が装置を通過して、粒子がフローセルに入るのが見届けられたら、懸濁した粒子（たとえば懸濁した細胞）を有する液体は、関心のある粒子を収集するための特定の収集チャンバに通じる第２の出力チャネルへ、より大きい流量で通される。
【0166】
図１３は、処理チャネル内の、粒子濃縮画分の流れ支援の形成を示す。濃縮（粒子富化）画分が、下部の出口チャネルを通って収集され、粒子の高度に富化されたアリコートをもたらす。流れの粒子富化部分は、処理チャネル内の粒子を観測する撮像センサなどのセンサによって、または処理チャネル内の分画パターンが特徴付けられるサンプルの画分を、タイミングを計って収集することにより、識別され得る。
【0167】
図１４は、処理チャネルに入る前の粒子に磁気反発力を印加することによる、入口チャネル内の粒子の前濃縮を示す。処理チャネルへの粒子の流入は、チャネル内の磁気反発力を中止もしくは低減すること、流れを、磁気反発力を克服するように調整すること、または磁力低減と流れ調整との組み合せによって達成される。流れの調整は、サンプル媒体の流れの流量を増加すること、または入口チャネル圧力を脈動させるなど、流れを変動させることによって、処理チャネルに粒子を導入することを含み得る。
【0168】
図１５に示す粒子濃縮の方法では、処理チャネルのＸ軸に沿って整列した磁性部品が、入口チャネル内に磁気反発力を及ぼして、処理チャネルの中に粒子が流入するのを抑止する。流量は、入口チャネル内の粒子を濃縮するように維持される。粒子が十分に前濃縮されると、磁気反発力が克服されて、粒子は処理チャネルに導入される。前濃縮の度合いはサンプル媒体の流量によって調整される。処理チャネルに入る粒子は、沈降する／磁気的に反発されるか、または処理チャネルの流れの粒子富化層の中に吸引され、出口チャネルにおいて収集される。
【0169】
図１６による方法の一実施形態では、サンプル媒体が処理チャネルに流入するのに続いて、気泡または非混合性小滴（１６０１）が導入される。気泡または小滴は、処理チャネルにおいてサンプル媒体の後に流され、残っている粒子富化層および粒子枯渇層を、処理チャネルから出口チャネルへ実質的に洗い流す。こうすると、サンプル画分の実質的な完全単離が可能になり、離散サンプルまたはサンプル画分が処理される。空気を導入する頻度は、より効率的な処理のために、大きな初期のサンプル容量をより小さい単位に分解するように調節され得る。
【0170】
本発明の方法の一実施形態には、全血サンプルまたは希釈血液サンプルを用意することと、サンプルに、本明細書で説明されたサンプル濃縮方法を施すことと、全血サンプルまたは希釈血液サンプルから血漿および／または血液細胞を単離させることとを含む、血液サンプルを分画する方法がある。血液サンプルは、末梢血サンプル、臍帯血サンプルもしくは胎児血サンプル、または動脈血サンプルからの全血サンプルもしくは希釈血液サンプルでよく、容量は、約５０μＬ～約５０ｍＬ、５０μＬ～約２０ｍＬ、５０μＬ～約１０ｍＬ、または約５０μＬ～約５ｍＬでよい。この方法によれば、分離される血漿画分は、血液サンプル中の血液細胞の約１％未満～約０．０１％未満を含有してよく、または血液細胞を実質的に含有しなくてもよい。単離された血液サンプル画分は、酵素免疫アッセイ、化学発光の免疫アッセイ、赤血球凝集／粒子凝集アッセイ、核酸増幅技術アッセイ、薬品アッセイ、法医学アッセイ、または遺伝形質アッセイなどの診断アッセイにおいて使用され得る。
【0171】
血液細胞濃縮／血漿分離の一例として、本発明の粒子濃縮装置および方法において、臍帯血サンプルが血漿と細胞の画分とに分画された。（１０ｍＬの）血液サンプルが得られ、１００ｎＭの終濃度を得るためにガドブトロールの常磁性媒体が追加された。処理チャネル（寸法は、Ｘ×Ｙ×Ｚが５０×１．９×１ｍｍ）の最上部のＸ軸に沿って実質的に整列した単一磁性部品を伴って構成された処理チャネルの入口チャネルを通して、合計５００マイクロリットルのサンプル量が、平衡のために約５分を見越して導入され、次いで、２０マイクロリットル／分の開始流量で流された。組み合わされた２０マイクロリットル／分の流量は、最下部の収集チャネルに流れる１０マイクロリットル／分および最上部の収集チャネルに流れる１０マイクロリットル／分を含むものであった。ライブ撮像を使用して分離をモニタリングした後に、流量が５０マイクロリットル／分に増加され、次いで１００マイクロリットル／分に増加された。最下部収集チャネルへの流量と最上部収集チャネルへの流量との比は、それぞれ１：１から４：１へと調節され、次いで、１０：１（１０が最下部収集チャネル側、１が最上部収集チャネル側である）を超過するほど非対称に調節され、最下部チャネルに、より大きい割合の流体を取り出すことによって高純度が維持された。流れの最下層に血液細胞富化層の濃縮が生じ、最下部出口チャネルを通じて収集された。図１７は、前方の領域における処理チャネルの顕微鏡写真（スケールは流路高さが１．９ｍｍである）であり、サンプルスプリッタは、下部の血液細胞層と上部の血漿層との実質的な濃縮および単離を示している。
【0172】
ＶＩ．フローセルカートリッジ
精密さ、正確さ、および再現性は科学装置の要件である。さらなる検討は、使用の容易さおよび製造可能性を含む。本発明のフローセルは、不可能であった、あるいは、ときとして長期にわたり、および／または複雑な、高費用の手順でなければ達成できなかった、科学的な実験作業および開発を可能にする有効な装置に必要な特徴をすべて有するものである。
精密さ、正確さ、および再現性は科学装置の要件である。さらなる検討は、使用の容易さおよび製造可能性を含む。本発明のフローセルは、不可能であった、あるいは、ときとして長期にわたり、および／または複雑な、高費用の手順でなければ達成できなかった、科学的な実験作業および開発を可能にする有効な装置に必要な特徴をすべて有するものである。
【0173】
本発明のフローセルカートリッジは平面基板を備え、この平面基板は、上面および下面と、撮像面を形成する第１の長手方向の面と、照明面を形成する第２の長手方向の面と、第１および第２の横面と、上面における入口ウェルと、入口チャネルと、入口チャネルと流体連通し、長手方向の面に対して実質的に平行に配置されるサンプル処理チャネルと、処理チャネル内のサンプルスプリッタと、処理チャネルと流体連通する複数の出口チャネルと、複数の出口チャネルの各々と流体連通する複数の収集ウェルとを備え、基板が、光学的に透明な材料を適宜含み、処理チャネルが、撮像面に対して空間的に片寄るように基板の平面内でオフセットされる。平坦な構成によって、カートリッジに組み込まれるのに必要なすべてのフローセル機能が可能になり、研究所または臨床のセッティングにおける性能および再現性が向上する。動作において、性能向上のためには、処理チャネルを通る出口チャネルへの流れに、乱れができるだけないことが重要である。空気と液体との圧縮率の差や、流れを制限する可能性があるチャネル構成の影響が、サンプル溶液のメニスカスと相互作用するかまたは乱流を誘起することがあり、粒子分離の性能が低下する恐れがある。処理チャネルに入る前のサンプルの流れ条件を最小化すると、サンプル損失が減少し、サンプル付着の可能性および／またはフローセルのチャネルの内部に粒子が凝集する可能性も低下し、サンプル細胞または組織の生存率に対する、サンプル処理の影響も緩和する。本発明の機能によって、これらおよび他の影響が最小化され、性能および再現性が改善される。フローセルの内部の撮像が望まれる場合には、平面基板は光学的に透明な材料を含む。ガラス、プラスチック、またはサイクリックオレフィンポリマー（ＣＯＰ）もしくはサイクリックオレフィンコポリマー（ＣＯＣ）を含むポリマー材料は、この用途の要件に適合する。ＣＯＰまたはＣＯＣは、精密射出成形によって利用され得る。射出成形、エッチング、レーザオブレーション、機械加工、または３Ｄプリントによってカートリッジを形成することができる他の材料も利用され得る。平面基板の一般的な寸法は、長さが少なくとも５０ｍｍであり、幅が２０ｍｍであって、厚さが少なくとも１．５ｍｍである。オプションの範囲は、長さが少なくとも１００ｍｍであり、幅が３５ｍｍであって、厚さは約２～約６ｍｍである。カートリッジの長手方向の面は、照明および撮像のための導波路として働く。従って、処理チャネルは、基板の平面においてオフセットされ、基板の長手方向の撮像面に対して平行に隣接する。撮像側壁からの距離は、約０．５ｍｍ～約１０ｍｍ、好ましくは約０．５ｍｍ～約５ｍｍであり得、適宜約１ｍｍ～約３．５ｍｍであり得る。一実施形態では、撮像壁からの処理チャネルの間隔は約２ｍｍである。処理チャネルのチャネル寸法は、本明細書で以前に説明した実施形態のうち任意のものでよい。処理チャネルの容量は、約１０μＬ～約８００μＬに、好ましくは約５０μＬ～約６００μＬに構成され得、また、１００μＬ～約４００μＬまたは約１５０μＬ～約３００μＬに構成されてもよい。いくつかの実施形態では、この容量は、少なくとも約１５０μＬ、少なくとも約２００μＬ、少なくとも約２５０μＬ、または少なくとも約３００μＬである。出口チャネルの合わせた容量は、処理チャネルの容量よりも大きくなければならない。システムの実施形態において動作しているとき、２つの出口チャネルの間で分割される流量は、均等に分割され得、または約４：１～約１：４、約３：１～約１：３、もしくは約２：１～約１：２の範囲で分割され得、または１：１から、約５０％以内、約４０％以内、約３０％以内、もしくは約１５％以内で変化し得る。
【0174】
本発明のフローセルは、平面基板上の収集ウェルを含んでよい。収集ウェルは、出口チャネルと流体連通する入口を特徴とし、入口は第１のウェル高さにあり、入口ポートの開口からウェルの床に移行するステップを伴って構成される。これは、サンプル画分がウェルへと流れるための移行面をもたらし、サンプル画分の出口チャネルへの逆サイホン作用と、収集ウェル内の気泡形成とを抑止することができる。収集ウェル内の出口チャネルの開口は、収集ウェルの床から、入口チャネルの開口よりも高いところにある。内部出口は、流れ調整器と連通して配置され得、場合によっては、流れ調整器は、フローセルを通して流れを供給する個々のポンプである。動作において、収集ウェルは、材料の層またはフィルムで密封され、サンプルおよびサンプルの画分の、フローセルを通る流れまたはこれらのポンピングを可能にするための、密封されたシステムをもたらす。フローセル層を組み立てるとき、接着剤を使用するなら、生体適合性のある接着剤を用意することが重要である。接着剤の成分が溶液に浸出して、細胞に付着するか、または溶液からの分子を結合したり、自家蛍光性になったり、表面積を増加させる組織を有することによって細胞に影響を与えて過度に親水性または疎水性にしたりするのを、最小限にするかまたは防止するために、接着剤を正しく選択する必要がある。好ましい接着剤は、シリコーンまたはシリコーンベースの接着剤である。
【0175】
ＶＩＩ．細胞分離システム
本発明の細胞分離システムは、フローセルカートリッジを保持するための収容ブロックと、光センサ、レンズ、および照明光源を備える光学システムと、複数の流れ調整部品とを備え、収容ブロックによって、フローセルカートリッジが、光学システムに対して光学的に位置合わせして、取外し可能に配置され、磁性部品が、フローセルの処理チャネルに隣接して、取外し可能に係合し、フローセルカートリッジの複数の出口チャネルが、複数の流れ調整部品と流体連通して取外し可能に配置される。光学系は、前述のフローセルカートリッジの処理チャネルの微視的な撮像をもたらすように構成される。光学系は、オプションの紫外線励振器モジュールを用いて蛍光発光に関する撮像をもたらすように構成して配置されてもよい。光学系は、平面基板内の処理チャネルを通る光伝送をもたらすように構成して配置された可視光の照明光源を備え得る。収容ブロックは、平坦なフローセルカートリッジを、光学系に対して、撮像光学系が平坦なカートリッジの撮像面と整列し、しかも可視光放射源が平坦なフローセルカートリッジの照明面を照光するような配向に保持するように構成して配置される。光学系は、適宜、約４７４ｎｍおよび／または５６０ｎｍの波長の紫外線の照明を、カートリッジの処理チャネル内のフルオロフォアを励起するような、平坦なカートリッジの撮像面角度方向に当てるように構成して配置された１つまたは複数の紫外線照明光源をさらに備えてもよい。
本発明の細胞分離システムは、フローセルカートリッジを保持するための収容ブロックと、光センサ、レンズ、および照明光源を備える光学システムと、複数の流れ調整部品とを備え、収容ブロックによって、フローセルカートリッジが、光学システムに対して光学的に位置合わせして、取外し可能に配置され、磁性部品が、フローセルの処理チャネルに隣接して、取外し可能に係合し、フローセルカートリッジの複数の出口チャネルが、複数の流れ調整部品と流体連通して取外し可能に配置される。光学系は、前述のフローセルカートリッジの処理チャネルの微視的な撮像をもたらすように構成される。光学系は、オプションの紫外線励振器モジュールを用いて蛍光発光に関する撮像をもたらすように構成して配置されてもよい。光学系は、平面基板内の処理チャネルを通る光伝送をもたらすように構成して配置された可視光の照明光源を備え得る。収容ブロックは、平坦なフローセルカートリッジを、光学系に対して、撮像光学系が平坦なカートリッジの撮像面と整列し、しかも可視光放射源が平坦なフローセルカートリッジの照明面を照光するような配向に保持するように構成して配置される。光学系は、適宜、約４７４ｎｍおよび／または５６０ｎｍの波長の紫外線の照明を、カートリッジの処理チャネル内のフルオロフォアを励起するような、平坦なカートリッジの撮像面角度方向に当てるように構成して配置された１つまたは複数の紫外線照明光源をさらに備えてもよい。
【0176】
処理チャネル内の蛍光性エンティティを撮像するために、光学系は、好ましくは約５２４ｎｍの波長と６２８ｎｍの波長とに中心がある帯域の放射を通す二重帯域通過フィルタを備えてよい。
【0177】
収容ブロックのオプション機能には、フローセルカートリッジの最上部または最下部における出口とインターフェースする一連の流れ調整器アダプタがある。流れ調整器アダプタは、システムにおけるポンプなどの流れ調整器と、収集ウェル出口チャネルなどのフローセル出口チャネルとの流体連通を促進する。収容ブロックは、フローセルカートリッジを一旦挿入されると、カートリッジを支持し、平坦なカートリッジの照明および撮像の面を、光学撮像システムと整列させ、磁性部品をフローセル処理チャネルの上方および下方に整列させて、望ましい場合には、流れ調整器アダプタをフローセルカートリッジの対応する出口チャネルと流体連通させて配置するように、機械的に作動する。
【0178】
システムの流れ調整器は、フローセルカートリッジ内のサンプルおよびサンプル画分に対して流れを供給する。流れ調整器によって供給される流量は、分離中、１μＬ／分～１ｍＬ／分の範囲になり得る。流量は、少なくとも約２５μＬ／分、少なくとも約５０μＬ／分、少なくとも約１００μＬ／分、少なくとも約２００μＬ／分、少なくとも約２５０μＬ／分、少なくとも約３００μＬ／分、または約３００μＬ／分～約１ｍＬ／分であり得る。合計のサンプル流量は、約５０μＬ／分、約７５μＬ／分、約１００μＬ／分、約１５０μＬ／分、約２００μＬ／分または約３００μｌ／分であり得る。システムの実施形態において動作しているとき、２つの出口チャネルの間で分割される流量は、均等に分割され得、または約４：１～約１：４、約３：１～約１：３、もしくは約２：１～約１：２で分割され得、または１：１から、約５０％以内、約４０％以内、約３０％以内、もしくは約１５％以内で変化し得る。
【0179】
システムの磁性部品は、上記で説明されたような材料、サイズ、および強度であり得、上記および下記で説明されるような構成の中に配置され得る。
【0180】
ＶＩＩＩ．細胞および細胞核の分離および単離
生細胞と死細胞との混合物を分離するための方法は、処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備える、上記実施形態のフローセルカートリッジなどのフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルの合わせた容量が、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、処理チャネルに、生細胞および死細胞を含むサンプル溶液と、常磁性化合物とを流すことと、処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保って、生細胞を富化したサンプル画分と死細胞を富化したサンプル画分とを、出口チャネルに同時に回収することとを含む。この方法は、サンプル溶液を導入するまではいかなる液体または常磁性化合物も実質的に含んでいないフローセルカートリッジを用意することをさらに含んでよい。
生細胞と死細胞との混合物を分離するための方法は、処理チャネルおよび複数の出口チャネルを備える、上記実施形態のフローセルカートリッジなどのフローセルカートリッジを用意することであって、フローセルカートリッジの出口チャネルの合わせた容量が、処理チャネルよりも大きい容量を有する、フローセルカートリッジを用意することと、処理チャネルに、生細胞および死細胞を含むサンプル溶液と、常磁性化合物とを流すことと、処理チャネルに対して実質的に平行に整列された磁界の中にフローセルカートリッジを配置することと、処理チャネルおよびその中に含まれるサンプル全体を、処理チャネルの内部で、生細胞と死細胞とを垂直方向の距離によって分離するのに十分な期間にわたって、磁界の中に、流れ停止状態に保って、生細胞を富化したサンプル画分と死細胞を富化したサンプル画分とを、出口チャネルに同時に回収することとを含む。この方法は、サンプル溶液を導入するまではいかなる液体または常磁性化合物も実質的に含んでいないフローセルカートリッジを用意することをさらに含んでよい。
【0181】
本発明の方法において使用されるフローセルカートリッジは、処理チャネルの断面積よりも小さい断面積を有する出口チャネルであって、蛇行形状のチャネルの構成を一例とするコンパクトな経路を辿って配置される出口チャネルを備え得る。磁界は、処理チャネルの最上部垂直面の近接および最下部垂直面の近接に配置され、各磁界が、約０．５テスラ～約２．０テスラの間、適宜約０．９テスラ～約１テスラの間の類似の強度および表面磁界の強度を有する。表面磁界の強度は、約０．５テスラ、約０．６テスラ、約０．７テスラ、約０．８テスラ、約０．９テスラ、または約１．０テスラでよい。
【0182】
この方法は、サンプル溶液中に、常磁性化合物を、約５０ｍＭ～約２００ｍＭの濃度で、適宜約６５ｍＭ～約１７５ｍＭの濃度で、さらには適宜約７０ｍＭ～約１５０ｍＭの濃度で提供することをさらに含み得る。濃度は、約７０ｍＭ、約７５ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１６０ｍＭ、約１７０ｍＭ、約１８０ｍＭ、約１９０ｍＭ、または約２００ｍＭであってもよい。
【0183】
この方法は、サンプル画分を、出口チャネルへと、約７５μＬ／分～約１５０μＬ／分の流量で、適宜約７５μＬ／分、約９０μＬ／分、約１００μＬ／分、約１１０μＬ／分、約１２０μＬ／分、または約１５０μＬ／分の流量で、回収する工程をさらに含み得る。
【0184】
この方法は、生細胞画分の並外れた回収率および純度をもたらす。富化して回収されるサンプル画分には、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％。または少なくとも約９０％の生細胞が含まれ、富化して回収されるサンプル画分における生細胞の収率は、サンプルの全体の生細胞組成の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約７５％である。
【0185】
生Ｊｕｒｋａｔ細胞と死Ｊｕｒｋａｔ細胞とを分離するための試験が、別々のフローセル構成を有する別々の機器において実行された。新鮮なＪｕｒｋａｔ細胞を７０％エタノールで処理することにより、死Ｊｕｒｋａｔ細胞の集団が生成された。エタノールを除去し、媒体の中で死細胞を洗浄した後に、死細胞を元の生細胞集団に戻して混合することにより、混合集団が生成された。この最終的な混合物における死細胞の濃度は約２０％であった。本明細書で説明したフローセルおよびシステムを使用し、各機器構成に最適化された利用条件を使用して、細胞混合物のアリコートが分離された。図２５Ａおよび２５Ｂは、本明細書で説明した方法によって得られた、生細胞画分の生存率および生細胞の収率を示す。本明細書で説明された方法による、様々な細胞タイプに対して効率的な生細胞分離をもたらす能力が、図２６Ａおよび２６Ｂに実証されている。初代細胞、ヒトおよび動物の組織から単離された初代細胞、腫瘍から分離された細胞、培養細胞、および本明細書で説明された他の細胞に対して、生細胞分離および富化が実行された。
【0186】
細胞核または粒子の単離は、細胞核を、ＦＡＣＳまたは洗浄／遠心分離などの他の洗浄技術および／または分離技術に関連するストレスにさらす（subjecting）ことなく、迅速に達成される。細胞核の迅速な単離は、細胞核を含むサンプルと、常磁性化合物または磁性流体を含むサンプル媒体とを、分離チャネルに装填することと、少なくとも１つの磁石を用いてサンプルに磁力をかけて、分離に影響を与えることと、さらなる遠心分離なしで、細胞核を含む、分離されたサンプルの少なくとも１つの画分を収集することと、分離前、分離中、および／または分離後に、サンプル中の粒子を適宜撮像することとを含む方法によって実行される。この方法では、サンプルは約５０～約１０，０００，０００の細胞核を含むことができる。分離のための総時間は約１分～約２０分の範囲であり得る。この迅速な分離方法では、溶液の中または溶液の一部の中で、関心のある細胞核の濃度が、少なくとも１００倍、９０倍、８０倍、７０倍、６０倍、５０倍、４０倍、３０倍、２０倍、１０倍、５倍、３倍、２倍、１．５倍、または１．１倍に高められる。複数のタイプの粒子を含有している溶液中の細胞核は、溶液を処理した後に、他のタイプの粒子の濃度に対して、関心のある細胞核の比が高まった場合、またはこの細胞核の濃度と他のタイプの粒子の濃度との比が、少なくとも約１０％、５０％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、６００％、７００％、８００％、９００％、または１０００％向上した場合、または、溶液中の細胞核以外の粒子の濃度が、少なくとも約２０％、１５％、１０％、８％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、または０．５％低下した場合には、「分離された」と見なされ得る。細胞核富化方法の好ましい実施形態では、サンプルの富化して収集された部分の中の単離された細胞核の完全性は、遠心分離を含む方法によって単離された類似の細胞核の完全性の３０％よりも大きい。好ましくは、サンプルの富化して収集された部分における単離された細胞核の完全性は、遠心分離を含む方法によって単離された類似の細胞核の完全性の少なくとも３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、または９９％である。完全性は、単離された細胞核の中へのかなりの割合のＤＮＡおよびＲＮＡの封じ込めをもたらす核膜の完全性であると定義される。開始サンプルは、約５０～約１０，０００，０００の細胞核と、約５００～約１０，０００，０００、約２，０００～約１０，０００，０００、約１０，０００～約１０，０００，０００、約２５，０００～約１０，０００，０００、約５０，０００～約１０，０００，０００、約７５，０００～約１０，０００，０００、約１００，０００～約１０，０００，０００、約１５０，０００～約１０，０００，０００、約２００，０００～約１００，０００，０００、または約５００，０００～約１０，０００，０００の粒子とを含み得る。分離した粒子の画分を分離して収集する時間は、２０分以下、１８分以下、１５分以下、１２分以下、１０分以下、８分以下、５分以下、３分以下、または１分未満であり得る。上記の方法によって分離される細胞核のタイプは、ヒト細胞、ヒト以外の動物細胞、植物細胞、真核細胞（たとえば、それだけではないが、免疫細胞、内皮細胞、酵母およびＴ細胞）を含み得る。単離細胞核は、除核した細胞の単一核、二核、多核からえられる。複数の細胞タイプは、死細胞、生細胞、正常細胞、病的細胞、感染細胞、トランスフェクト細胞、または遺伝子組換え細胞を含み得る。本開示の方法によって単離される細胞核は、生体または増殖細胞もしくは培養細胞から直接得ることができる。迅速かつ大容量の分離方法の特定の実施形態では、生細胞が死細胞から分離される。単離方法の別の実施形態では、細胞核は、生存トランスフェクト細胞および／またはＣＲＩＳＰＲ改変細胞もしくは遺伝子編集細胞から単離される。この方法の別の実施形態では、細胞核は、細胞、細胞片、および／またはサンプル破片から分離される。様々な実施形態において、これらの方法は、本明細書で説明したカートリッジおよびシステムを利用して実行される。
【0187】
実施例１ 瞬間冷凍された肺組織および脳組織からの細胞核の単離
細胞核は、瞬間冷凍された肺組織および脳組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて氷上で３０分間インキュベートすることによって、単離された。次いで、細胞核は、０．１％のＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて２回洗浄されてから、Ｎｕｃｌｅｉ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍのスクロースを含む）の中に再懸濁された。本発明によれば、Ｎｕｃｌｅｉ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒの中にスクロースを使用すると、細胞核の保管を促進するのに有利であることが発見されている。細胞核は、１００ｍＭのＬｅｖｉｔａｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔを含有するＬｅｖｉｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの中に３×１０５の細胞核を再懸濁することによって、分離用に調製された。サンプルは、分離後の比較のために取っておいた。細胞核は、３０分の平衡期間を使用して、本明細書で説明された分離装置（カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ ＰａｒｋのＬｅｖｉｔａｓＢｉｏ社から入手可能なＬｅｖｉＣｅｌｌ）の中で分離された。出力はＰＩを用いて染色され、Ｅｃｈｏ顕微鏡を使用して撮像された。
細胞核は、瞬間冷凍された肺組織および脳組織から、Ｎｕｃｌｅｉ Ｌｙｓｉｓ Ｂｕｆｆｅｒ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いて氷上で３０分間インキュベートすることによって、単離された。次いで、細胞核は、０．１％のＢＳＡ含有ＰＢＳを用いて２回洗浄されてから、Ｎｕｃｌｅｉ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒ（１Ｍのスクロースを含む）の中に再懸濁された。本発明によれば、Ｎｕｃｌｅｉ Ｓｔｏｒａｇｅ Ｂｕｆｆｅｒの中にスクロースを使用すると、細胞核の保管を促進するのに有利であることが発見されている。細胞核は、１００ｍＭのＬｅｖｉｔａｔｉｏｎ Ａｇｅｎｔを含有するＬｅｖｉｔａｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒの中に３×１０５の細胞核を再懸濁することによって、分離用に調製された。サンプルは、分離後の比較のために取っておいた。細胞核は、３０分の平衡期間を使用して、本明細書で説明された分離装置（カリフォルニア州Ｍｅｎｌｏ ＰａｒｋのＬｅｖｉｔａｓＢｉｏ社から入手可能なＬｅｖｉＣｅｌｌ）の中で分離された。出力はＰＩを用いて染色され、Ｅｃｈｏ顕微鏡を使用して撮像された。
【0188】
細胞核はＰＩを用いて明るく染色され、細胞破片は染色されていない。ＬｅｖｉＣｅｌｌからの染色された入力の画像と出力の画像とが、両方の組織サンプルに関して、染色されていない破片の量の大幅な減少を示す。肺組織は脳組織（図２７ＡおよびＣ）よりも多くの破片を生成したが、どちらのサンプルも、ＬｅｖｉＣｅｌｌを用いて選別した後には、破片の著しい減少を示す（図２７ＢおよびＤ）。
【0189】
Ｊｕｒｋａｔ細胞から導出された、選別されていない細胞核のフローサイトメトリー分析（図２８Ａ）および選別された細胞核のフローサイトメトリー分析（図２８Ｂ）。サンプルは、ＰＩおよびＣｅｌｌＢｒｉｔｅ Ｆｉｘ Ｇｒｅｅｎを用いて室温で１５分間染色してから、Ｓｏｎｙ ＳＨ８００Ｓ選別機で分析された。選別後に、破片の集団と死細胞の集団との両方が低減され、細胞核集団が富化されている（５０．８１％から６３．５７％）。加えて、シングレット細胞核集団が、２８．２８％から４３．９８％に富化されている。
【0190】
実施例２ Ｊｕｒｋａｔ細胞からの細胞核の単離
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ＃ ＴＩＢ－１５２）は、細胞老化およびアポトーシスを誘起するために、培地を変更せずに数日間老化された。これらの細胞を収集し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒにおいてＡＯ／ＰＩを使用してカウントした。これらの細胞の一部は、総ＲＮＡの入力コントロールのために保存された。ＲＮＡｓｅ Ｏｕｔ ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有している細胞核ＥＺ溶解緩衝剤（ｓｉｇｍａ）を使用して、８００万の細胞から、約５０％の生存率において細胞核が抽出された。細胞核は、ペレットにされ、１００ｍＭのガドリニウム、１Ｘ ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、および０．２Ｕ／μｌまでのＲＮＡｓｅ Ｏｕｔを含有している浮上緩衝剤に再懸濁された。このサンプルはここで入力と称される。抽出された１００万の細胞核が、ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムにおいて３０分浮上された。細胞核はＬｅｖｉＣｅｌｌカートリッジの最下部チャネルから収集され、早期の工程（入力）において抽出された細胞核と並行して、初期サンプルから保存された全細胞が、ＲＮＥａｓｙ調整ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを得るために処理された。総ＲＮＡが正規化され、１０ｎｇの総ＲＮＡがｇＤＮＡイレーサキット（Ｔａｋａｒａ）を用いるＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴを使用して、ｃＤＮＡが作製された。１８Ｓ、ＳＣＡＲＮＡ５およびＳＮＨＧ６を対象とする、事前に設計して検証されたＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ分析（ＩＤＴ）が、５μｌの２ｘ ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ遺伝子発現マスター混合物（ＩＤＴ）およびｃＤＮＡの２００ｐｇ等価物を含有する１０μｌの反応量の中で多重分析された。３回の反応がＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５（Ｔｈｅｒｍｏ）機器において増幅された。増幅データは、ΔΔＣＴ方法を使用して分析され、１８Ｓの内在性コントロールで正規化された相対量として報告され、全細胞ＲＮＡと比較された。
Ｊｕｒｋａｔ細胞（ＡＴＣＣ＃ ＴＩＢ－１５２）は、細胞老化およびアポトーシスを誘起するために、培地を変更せずに数日間老化された。これらの細胞を収集し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ Ｓｐｅｃｔｒｕｍ ＣｅｌｌｏｍｅｔｅｒにおいてＡＯ／ＰＩを使用してカウントした。これらの細胞の一部は、総ＲＮＡの入力コントロールのために保存された。ＲＮＡｓｅ Ｏｕｔ ＲＮＡｓｅ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ）を含有している細胞核ＥＺ溶解緩衝剤（ｓｉｇｍａ）を使用して、８００万の細胞から、約５０％の生存率において細胞核が抽出された。細胞核は、ペレットにされ、１００ｍＭのガドリニウム、１Ｘ ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、および０．２Ｕ／μｌまでのＲＮＡｓｅ Ｏｕｔを含有している浮上緩衝剤に再懸濁された。このサンプルはここで入力と称される。抽出された１００万の細胞核が、ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムにおいて３０分浮上された。細胞核はＬｅｖｉＣｅｌｌカートリッジの最下部チャネルから収集され、早期の工程（入力）において抽出された細胞核と並行して、初期サンプルから保存された全細胞が、ＲＮＥａｓｙ調整ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して総ＲＮＡを得るために処理された。総ＲＮＡが正規化され、１０ｎｇの総ＲＮＡがｇＤＮＡイレーサキット（Ｔａｋａｒａ）を用いるＰｒｉｍｅｓｃｒｉｐｔ ＲＴを使用して、ｃＤＮＡが作製された。１８Ｓ、ＳＣＡＲＮＡ５およびＳＮＨＧ６を対象とする、事前に設計して検証されたＰｒｉｍｅＴｉｍｅ ｑＰＣＲプローブ分析（ＩＤＴ）が、５μｌの２ｘ ＰｒｉｍｅＴｉｍｅ遺伝子発現マスター混合物（ＩＤＴ）およびｃＤＮＡの２００ｐｇ等価物を含有する１０μｌの反応量の中で多重分析された。３回の反応がＱｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ５（Ｔｈｅｒｍｏ）機器において増幅された。増幅データは、ΔΔＣＴ方法を使用して分析され、１８Ｓの内在性コントロールで正規化された相対量として報告され、全細胞ＲＮＡと比較された。
【0191】
結果：図２９に示されるように、ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムにおいて処理された細胞核は、核に特異的なターゲット（ＳＣＡＲＮＡ５）に関してより高度に富化され、入力細胞核と比較して、より少ない混入した細胞質ターゲット（ＳＮＨＧ６）を有した。ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムにおいて処理された細胞核は、全細胞と比較して、核に特異的なシグナルに関してほぼ３倍の富化を示す一方で、細胞質ターゲットの富化は示していない。浮上されたサンプルはまた、入力細胞核と比較して、核に特異的なシグナルの、５０％を上回る富化を示した。比較すると、入力細胞核は、全細胞ＲＮＡと比較して、細胞核依存のターゲットシグナルの富化はより少ないものであり、大量の混入細胞質ＲＮＡを示した。これらのデータは、ＬｅｖｉＣｅｌｌシステムにおける細胞核の浮上が、通常の方法によって抽出される細胞核と比較して、細胞核および核に特有のＲＮＡの富化を可能にすることを示す。
【0192】
ＩＸ．開示された実施形態は非限定的である
本明細書では、本発明の様々な実施形態が示され、説明されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されたものであることが強調される。本明細書において、本発明から逸脱することなく、その様々な実施形態において多くの変形、変更および置換を行うことができる。具体的には、本明細書で何らかの範囲が記述されたとき、別段の明確な規定がない限り、その範囲は、その中のすべての値およびすべてのサブレンジを含む。
本明細書では、本発明の様々な実施形態が示され、説明されてきたが、そのような実施形態は例としてのみ提供されたものであることが強調される。本明細書において、本発明から逸脱することなく、その様々な実施形態において多くの変形、変更および置換を行うことができる。具体的には、本明細書で何らかの範囲が記述されたとき、別段の明確な規定がない限り、その範囲は、その中のすべての値およびすべてのサブレンジを含む。
【0193】
また、より一般的には、本明細書の開示、議論、例および実施形態によれば、当業者の技術の範囲内の、従来の流体工学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術が採用され得る。参照によって本明細書に組み込まれた資料は、そこに見出されるそれぞれの内容および教示に関するものである。そのような組み込みは、最低でも、その参考文献を本明細書に引用するとき指示され得る特定の教示および／または他の目的に関するものである。特定の教示および／または他の目的がそのように指示されない場合には、公表された資料は、参考文献の名称、要約、および／または概要のうち１つまたは複数によって指示される教示に関して具体的に組み込まれる。そのような具体的に識別される教示および／または他の目的が関連しない場合には、公表された資料は、本発明が属する現況技術をより十分に説明するため、および／または適用可能なものとして当業者に一般的に知られている教示を提供するために組み込まれる。しかしながら、本明細書における、公表された資料の引用が、本発明に対する従来技術であることの承認として解釈されないものと特に明示される。また、組み込まれる公開資料のうち１つまたは複数が、それだけではないが、定義された用語、用語の用法、説明された技術などを含めて、この出願と異なるかまたは矛盾する場合には、この出願が好ましい実施形態として制御し、いかなる矛盾も代替実施形態と見なされ得る。
【0194】
本明細書では、本発明の好ましい実施形態が示され、説明されてきたが、当業者には、そのような実施形態は例としてのみ提供されたものであることが明白であろう。当業者には、本発明から逸脱することなく、多くの変形、変更、および置換が思い浮かぶはずである。本発明を実施するのに、本明細書で説明された本発明の実施形態の様々な代替形態が採用され得ることを理解されたい。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8-1】
【図8-2】
【図9-1】
【図9-2】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【図23】
【図24】
【図25】
【図26】
【図27】
【図28】
【図29】
【国際調査報告】