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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-29
(54)【発明の名称】血小板生成用３Ｄ多孔質構造の使用
(51)【国際特許分類】
C12M 3/00 20060101AFI20240221BHJP
C12N 1/00 20060101ALI20240221BHJP
C12N 5/078 20100101ALI20240221BHJP
【ＦＩ】
C12M3/00 Z
C12N1/00 Z
C12N5/078
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023548198
(86)(22)【出願日】2022-02-08
(85)【翻訳文提出日】2023-10-05
(86)【国際出願番号】 EP2022052946
(87)【国際公開番号】W WO2022167676
(87)【国際公開日】2022-08-11
(31)【優先権主張番号】21155887.9
(32)【優先日】2021-02-08
(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】523299657
【氏名又は名称】ヘモストオーディー エスエー
(74)【代理人】
【識別番号】100092783
【弁理士】
【氏名又は名称】小林 浩
(74)【代理人】
【識別番号】100120134
【弁理士】
【氏名又は名称】大森 規雄
(74)【代理人】
【識別番号】100145791
【弁理士】
【氏名又は名称】加藤 志麻子
(74)【代理人】
【識別番号】100217663
【弁理士】
【氏名又は名称】末広 尚也
(72)【発明者】
【氏名】ダハン，エロディー
(72)【発明者】
【氏名】クラウデル，ソフィー
(72)【発明者】
【氏名】ハンバート，マガリ
【テーマコード（参考）】
4B029
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B029AA02
4B029AA09
4B029BB11
4B029CC01
4B029CC10
4B029DB15
4B029DG06
4B065AA93X
4B065AC20
4B065BC08
4B065BC42
4B065CA44
(57)【要約】
大スケールで血小板をｉｎ ｖｉｔｒｏ生成するための方法およびデバイスが提供される。方法は、巨核細胞から血小板を大スケールで生成するために、多孔質材料を収納するように構成された、回転可能なベッドリアクターを備える血小板生成デバイスを使用する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
巨核細胞から大スケールで血小板を生成するための血小板生成デバイス（１０、１０’）であって、容器（１２）と、その中に配置された回転可能なベッドリアクター（１６）とを備え、
前記ベッドリアクター（１６）が、多孔質材料（３０）を収納し、かつ前記容器（１２）内に収納された懸濁細胞（１４）中に浸漬されるように構成される、
血小板生成デバイス（１０、１０’）。
【請求項2】
細胞懸濁物（１４）が、成熟した巨核細胞を含む溶液を含み、前記多孔質材料（３０）が、フォーム、繊維、３Ｄ印刷された多孔質構造、織布フィルター、不織布フィルター、マイクロキャリア、ゲル、またはヒドロゲル、または充填されたビーズを含む、請求項１に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項3】
前記ベッドリアクター（１６）が、前記ベッドリアクター（１６）を通じた前記細胞懸濁物（１４）の流動を円滑化するための、前記ベッドリアクター（１６）の中央部に配置された貫通孔を備える、請求項１または２に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項4】
前記ベッドリアクター（１６）が、ベースプレートからトッププレートまで延在する周辺外壁を含む中空体を備え、前記周辺外壁が開口部（３２）を含むかまたはメッシュからなり、好ましくは前記中空体が円筒形状を有する、請求項１から３のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項5】
前記ベッドリアクター（１６）が、前記中空体内に配置され、かつ前記ベースプレートから前記トッププレートまで延在する内壁をさらに備え、前記内壁のそれぞれが、その上に形成された複数の開口部（３６）を含む、請求項４に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項6】
前記容器（１２）が、チャンバー（２０）を形成するヘッドキャップ（１８）を用いてキャップされるように構成され、好ましくは前記チャンバー（２０）がパージされるように構成される、請求項１から５のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項7】
前記ベッドリアクター（１６）が、コネクター２５を介してローターシャフト（２４）に連結するように構成され、前記コネクター（２５）が、前記細胞懸濁物（１４）が前記ベッドリアクター（１６）中に進入するのを円滑化するためのアパーチャーを備える、請求項１から６のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項8】
前記ヘッドキャップ（１８）が、前記細胞懸濁物を前記容器（１２）中に添加するための開口部を備える、請求項１から７のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項9】
前記細胞懸濁物（１４）を前記容器（１２）中にポンプ搬送するためのポンプをさらに含み、好ましくは前記ポンプがペリスタポンプを含む、請求項８に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項10】
前記容器（１２）が、冷却または加温ジャケットを使用してジャケットで覆われるようにさらに構成される、請求項１から９のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項11】
前記ベッドリアクター（１６）が最大１０００ｒｐｍで回転するように構成される、請求項１から１０のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項12】
前記ベッドリアクター（１６）が、前記ベッドリアクター（１６）内に配置構成されている多孔質材料の層間に配置されるように構成された中間壁（３４）をさらに備える、請求項１から１１のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項13】
前記容器（１２）が、その中に配置されたバッフル（２８）を備える、請求項１から１２のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項14】
前記ベッドリアクターの容積と前記容器の容積との間の比が、１：１～最大１：１００、好ましくは１：２～１：２０まで変化する、請求項１から１３のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項15】
前記ベッドリアクター（１６）が最大２８ｃｍ３の多孔質材料を含み、好ましくは、５００ｍＬの容器に適合するように構成される、請求項１から１４のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項16】
多孔質材料１立方ミリメートル当たりの巨核細胞の密度が、ＭＫ１０・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１００・１０６個／ｍｍ３の範囲、好ましくはＭＫ１００・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１０・１０６個／ｍｍ３の範囲である、請求項１から１５のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項17】
前記多孔質材料が、巨核細胞に対して親和性を有するリガンドでコーティングされ、好ましくは前記リガンドが、フォン・ヴィルブランド因子またはその機能的バリアント、ヴィルブランド因子の断片を含むポリペプチド、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ラミニン、ＩＶ型コラーゲン、ＩＩＩ型コラーゲン、Ｉ型コラーゲン、またはビトロネクチンを含む、請求項１から１６のいずれか一項に記載のデバイス（１０、１０’）。
【請求項18】
請求項１から１７のいずれか一項に記載の血小板生成デバイス（１０、１０’）を使用して、大スケールで血小板を生成するための方法であって、細胞懸濁物（１４）を、血小板生成デバイス（１０、１０’）の容器（１２）中に添加するステップと、
多孔質材料（３０）を、前記血小板生成デバイス（１０、１０’）のベッドリアクター（１６）中に導入するステップと、
前記ベッドリアクター（１６）をローターシャフト（２４）に取り付けるステップと、
前記ベッドリアクター（１６）を、前記血小板生成デバイス（１０、１０’）の前記容器（１２）内に配置するステップと、
任意選択的に、コントロールされた雰囲気を維持するために、ヘッドキャップ（１８）を用いて前記容器（１２）を閉鎖するステップと、
前記ベッドリアクター（１６）を事前に決定されたスピードで回転させるステップと、
任意選択的に、血小板およびＭＫを計数および特徴付けるために、細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を収集するステップと
を含む方法。
【請求項19】
下記のステップ：ＨＳＣ、工学操作されたＨＳＣから選択されるか、または胚性幹細胞、工学操作された胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および工学操作された人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を提供するステップと、
細胞を増殖させ、増殖した細胞をＭＫに分化させるために、前記幹細胞を培養するステップと
により、前記細胞懸濁物（１４）を取得するステップをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
前記多孔質材料（３０）を前記ベッドリアクター（１６）中に導入するステップが、前記多孔質材料（３０）のバルクで前記ベッドリアクターの全容積を充填するステップを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項21】
前記多孔質材料（３０）を前記ベッドリアクター（１６）中に導入するステップが、前記多孔質材料（３０）を、数百マイクロメートルのいくつかの層からなるアセンブリとして配置構成することを含み、好ましくは前記多孔質材料の層が、前記ベッドリアクター（１６）内に配置された中間壁（３４）により分離される、請求項１８または１９に記載の方法。【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明はｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板生成に関する。特に、本発明は、巨核細胞（ＭＫ）から血小板を大スケールで生成するための方法およびデバイスについて開示する。
【背景技術】
【0002】
血小板は、小型の無核血液細胞であり、その機能は出血を止めることである。ある特定の疾患、処置に起因して、または大出血の後に血小板数が少なくなった（血小板減少症）患者は、血小板輸液－救命医薬品を必要とする。現在のところ、唯一の供給源は供血である。それにもかかわらず、血小板の有効期間は５日間であるので、病院ストックは継続して更新される必要があり、また品不足問題が先進国（伝染病、悪天候、休暇期間．．．）において頻発する（約２０％）一方、新興国では必要量の半分超が未供給である。品不足問題は輸液ミスマッチをもたらす可能性があり、その結果、無効な輸液またはアロ免疫を含む有害事象を引き起こすおそれがある。血小板輸液を必要とする患者の虚弱集団において、そのような事象のいずれも対処すべき現実的障害であり、入院期間の長期化、入院患者の医療費増加、および生存率の低下と関連する。治療用途のためのｉｎ ｖｉｔｒｏでの血小板生成は魅力的代替案ではあるが、しかし特に工業生産に向けたプロセスのスケーラビリティーに関して、重要な技術的課題として存続する。
【0003】
血小板は成熟した巨核細胞に由来する。成熟した巨核細胞は、ＭＫ前駆体に向かう多能性造血幹細胞のコミットメント、この前駆体の増殖および分化、その多倍数化、およびその成熟と関係する、骨髄において生ずるプロセスの結果である。動的プロセスを通じて、成熟したＭＫの細胞質は、血管環境を通じて長い偽足伸長（血小板前駆体と呼ぶ）を形成して洞様毛細血管内で円盤状血小板を放出する。血小板生成「臓器」は、骨髄のみならず肺（ＭＫが肺微小循環においてこの伸長を流量依存性の方式で直接生成し得る）からも構成されることがやはり立証されている（Lefrancais et al.; “The lung is a site of platelet biogenesis and a reservoir for hematopoietic progenitors”; Nature. 2017 April 06; 544(7648): 105-109）。血小板生成に特化したバイオリアクターを設計する非常に多くの試みがなされてきた。
【0004】
骨髄環境モデルに基づくバイオリアクターは、２つのコンパートメント：ＭＫが播種されるコンパートメントと血小板が収集されるコンパートメントとを一般的に有する。骨髄（ＭＫコンパートメント）から血流（血小板コンパートメント）に至る動的通路が、異なる手段により模倣されている。
【0005】
２０１１年に、Ｂａｌｄｕｉｎｉとそのチームは、ＭＫ移動、洞様毛細管に対する接着、血小板前駆体形成、および血小板放出の研究を目的として、骨髄環境の最初の空間的再構築を代表する３Ｄシステムについて報告した（Pallotta et al.; “Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional platelet Production Using silk-Based vascular tubes”; Tissue Engineering: Part C Methods. 2011; 17(12): 1223-32）。シルクマイクロチューブ（５０±２０μｍの壁厚は血小板前駆体の長さに一致し、２～８μｍの細孔サイズは血小板前駆体を許容する）が、飼育化されたカイコ（カイコガ（Bombyx mori））繭から精製された生体由来のタンパク質ポリマーであるシルクフィブロインを用いて調製され、次にＳＤＦ１－α（化学誘引物質）、および異なるタンパク質（フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）、フィブリノゲン（ＦＢＧ）、またはＩ型コラーゲン）を用いて稀釈したマトリゲルでコーティングされた。臍帯血（ＣＢ）造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来するＭＫ３・１０５個の懸濁物が、コラーゲンＩゲル調製物（骨芽細胞ニッチを模倣する）とコーティングされたシルクチューブの外壁（血管ニッチを模倣する）との間の界面に添加された。１６時間インキュベートした後、播種したＭＫの７％±２％がマイクロチューブ壁（ＶＷＦおよびＦＢＧの組合せを含む）を通じて血小板前駆体に進展し、そして約２百万個の血小板が、３２μＬ／ｍＬの流速（約４０／秒の剪断速度）でマイクロチューブ内を灌流する溶液中で収集された。２０１５年には、ヒト骨髄ニッチ環境の生理学を完全に再構築するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）タンパク質で機能化されたシルクスポンジ（直径１００～５００μｍの範囲の相互に接続した細孔）内にシルクチューブ（壁厚５０±２０μｍおよび細孔直径２２±４μｍ）を埋め込むことにより、３Ｄシステムは改善された（Di Buduo et al.; “Programmable 3D silk bone marrow niche for platelet generation ex vivo and modeling of megakaryopoiesis pathologies”; Blood. 2015; 125(14): 2254-2264）。合計２．５・１０５個の成熟したＣＢ由来ＭＫが機能化されたシルクスポンジ内に播種された。１６時間後、システムは、ＭＫが血管チューブに向かって移動し、外壁に接着するのを可能にし、そして２４時間後には血小板前駆体はマイクロチューブの管腔内まで広がった。血小板（１．４百万個）が、マイクロチューブ内、６０／秒の剪断速度で培養培地を灌流させることにより取り出された。ＥＣＭコンポーネントが、多孔質シルク、例えばＩ型コラーゲン、フィブリノゲン、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、またはラミニン等を機能化するのに使用された一方、マイクロチューブは、フィブロネクチン、ＩＶ型コラーゲン、およびラミニンを用いて機能化された。より最近では、同一チーム（Di Buduo et al.; “modular flow chamber for engineering bone marrow architecture and function”; Biomaterials. 2017; 146: 60-71）が、矩形のモジュラーフローチャンバーから構成され、システムの灌流を可能にするために、インレットおよびアウトレットに接続されたセントラルキャビティー内に埋め込まれた細胞外マトリックスコンポーネントで機能化されたシルクスポンジ（３．４×２０×５ｍｍ；細孔直径３７０±１１５μｍ）を保持する単純化されたシステムを開発した。３～４・１０５個のＣＢ由来成熟ＭＫが、機能化されたシルクスキャフォールド内に２４時間播種された。この期間後、培養培地を約９０μＬ／分で８時間灌流させたとき（すなわち、平均壁剪断速度１．９ｓ－１）、アウトレットにおいて収集された血小板様粒子の流動による脱離が可能になった。システムが血小板生成のスケールアップを目的として記載されたとしても、公開資料はこの目標に関して何らかの性能を開示しなかった。このシステムは、幹細胞（造血または人工多能性）、すなわちＭＫの前駆体をシルクスポンジ内に播種しながら、患者における薬物応答を予測するための小型化された骨組織モデルとしてさらに使用された（Di Buduo et al.; “Miniaturized 3D bone marrow tissue model to assess response to Thrombopoietin-receptor agonists in patients”; eLife 2021; 10:e58775）。１５日以降、幹細胞を増殖させ、ＭＫに分化させることで、いくつか（４・１０５個）の血小板が生成した。最後に、Ｔｏｚｚｉらは、シルクスポンジ（細孔径１１７±４．９μｍ～１２６±３．７μｍ）内に機能化されたチャンネル（直径１ｍｍ）を再導入することにより、この単純化されたシステムを改善することを提案した（Tozzi et al.; “Multi-channel silk sponge mimicking bone marrow vascular niche for platelets production”; Biomaterials. 2018; 178: 122-133）。約１．５・１０６個のＣＤ４１＋ＣＤ４２ｂ＋ＣＢ由来ＭＫをシルクスキャフォールド内に一滴ずつ播種し（シルク１ｍｍ３当たりＭＫ１９０個）、そしてスポンジ内に血小板前駆体が形成されるまで３６時間培養した。次に、１０μＬ／分の流速で６時間にわたり灌流を行い、チャンネルの管腔において０．８～４．５・１０６個の血小板の収集が可能であった。単純化されたシステムにチャンネルを付加する理由は、異なる骨髄の環境を再構築するため、すなわち、スポンジ、空チャンネルの壁、および空チャンネルの間に異なる流動応力および剪断応力を導入するためであった。流動がシステム内に導入されるとき、チャンネル内では均質な流動が観察される一方、スキャフォールド内では流動は無視し得るほどであり、またチャンネルの壁とシルクスポンジとの間で剪断力値の急激な推移が認められる。指摘すべきこととして、バイオリアクターの設計は、スキャフォールドとバイオリアクター壁との間の「エッジフロー」を回避する。これらすべてのシルクデバイスは、複数の連続的生成ステップ－ＭＫを最終段階まで成熟（偽足伸長）させて血小板前駆体を形成するために播種するステップ、血小板を生成および収集するステップを一体化しており、スケールアップするための各ステップの最適化を難しくしている。例えば、ＭＫは血小板前駆体に進展するための空間を必要とするので、微多孔質材料内のＭＫ細胞の播種密度には制約があり（ＴｏｚｚｉではＭＫ１９０個／ｍｍ３）、したがって大容量の材料が要となる。Ｔｏｚｚｉでは、約１．３ｍ３のシルクスポンジが３・１０１１個の血小板（輸液１回、患者１人当たりの用量）を生成するのに必要とされ、したがってシルクスポンジを機能化するのに必要とされる大容量の媒体および製品もやはり必要とされる。複数のデバイスを積層しても、多量の消耗品が必要とされることへの解決策とはならず、工業化を複雑にする。
【0006】
Ａｖａｎｚｉらも、幹細胞から血小板を生成するための一体型システムについて記載した（国際公開第２０１２／１２９１０９号パンフレット（ＮＥＷ ＹＯＲＫ ＢＬＯＯＤ ＣＥＮＴＥＲ，ＩＮＣ．社）、２０１２年９月２７日）。最終ステップは一連の血小板放出チャンバーを含む。各血小板放出チャンバーは、３Ｄマトリックスまたはスキャフォールド（約２μｍ～６μｍの間の細孔を有し、血小板前駆体形成および血小板放出を刺激する因子でコーティングされている）を収納する上部チャンバーおよび血小板を収集するための下部チャンバーにおいて分離している。これまでのシステムと同様に、ＭＫはスキャフォールド上に播種される。ここでは、２つの分離した流動が上部および下部チャンバー内に適用され、再度、ＭＫが血管ニッチ内で血小板前駆体に成熟し、そして血流中で血小板が生成する最終ステップが再構築される。上部チャンバー内での血小板前駆体形成、および下部チャンバー内での血小板収集が、約１～２日間実施される。播種されたＭＫ１個につき収集された血小板の数に関してこのシステムが有望であるとしても、たかだかＭＫ（１・１０５）がチャンバーにより播種可能であり、１～３．３・１０６個の血小板が放出される（Avanzi MP et al.; “A novel bioreactor and culture method drives high yields of platelet from stem cells”; Transfusion. 2016; 56(1): 170-178）。
【0007】
Ｓｈｅｐｈｅｒｄらは、２０１８年において、ＭＫに対する構造的支持を提供するだけでなく、細胞サイズの相違に基づく篩分け能力も有する構造的に漸増するコラーゲンスキャフォールド（最上部の領域において最大細胞に対する接近性が高い一方、基部領域では、最大細胞に対する接近性はかなり低かった）を構築することを検討した（Shepherd JH et al.; “Structurally graduated collagen scaffolds applied to the ex vivo generation of platelets from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes: enhancing production and purity”; Biomaterials. 2018; 182: 135-144）。ＭＫ細胞の播種密度は、オーバーナイトで培養する（１９時間＋）ためのこれまでのシステム（５ｍＬの媒体において、４・１０５個のＭＫがコラーゲンスキャフォールドに負荷される）と同一範囲内であった。バイオリアクター内にとどまる巨核細胞１個から生成した血小板の数は２９．２±１５であったが、しかしデバイスに導入された全ＭＫを考慮すれば低めである。それに加えて、生成した血小板の質に関する懸念が表明された。
【0008】
骨髄脈管構造の内皮細胞の多孔質構造を模倣するマイクロ流体デバイスも提案された。
【0009】
Ｎａｋａｇａｗａらは、２つのマイクロ流体バイオリアクターを開示した（Nakagawa et al.; “Two differential flows In a bioreactor promoted platelets generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes”; Experimental Hematology. 2013; 41(8): 742-748）。このシステムでは、特定の方向に流れる流動が多孔質構造内にトラップされている巨核細胞に圧力を加える。第２の流動（主流動）が、多孔質構造のアウトレットにおいて血小板を放出するための剪断応力を創出するのに使用される。播種されたＭＫの数は少なく（１．２・１０５個）、また播種されたＭＫ１個当たりの血小板の数は１よりも小さかった。
【0010】
Ｔｈｏｎらは、媒体チャンネルと、スリット（０．１～２０μｍ）状の穴が開けられた上部または下部チャンネルとの間に壁が設けられた２－チャンネル、次に３－チャンネルバイオリアクターについて記載した（国際公開第２０１４／１０７２４０号パンフレット（ＢＲＩＧＨＡＭ ＆ ＷＯＭＥＮＳ ＨＯＳＰＩＴＡＬ、ＩＮＣ．社）２０１４年７月１０日；Thon et al.; “platelet bioreactor-on-a-chip”; Blood. 2014; 124: 1857-1867；国際公開第２０１５／１５３４５１号パンフレット（ＢＲＩＧＨＡＭ ＆ ＷＯＭＥＮＳ ＨＯＳＰＩＴＡＬ、ＩＮＣ．社）２０１５年１０月８日）。媒体チャンネルに導入されたＭＫはギャップを通じて押し出され、そこでＭＫはトラップされ、そして上部および下部チャンネル内の流動と接触することとなり、ＭＫは剪断応力に曝露される。このシステムでは、剪断速度の範囲は、これまでのシステムの範囲よりも高く（１００～２５００／ｓ）、ＧＡＰジャンクションにおいて剪断速度のピックが生ずる。２時間ほどの間において、巨核細胞１個当たりのＰＬＴの収率は３０個であったが、しかしシステムに導入されたＭＫの濃度は、１デバイス当たりのスリット／ギャップの数に限りがあることから、１ｍｌ当たりＭＫ１．９×ｌ０４±１．３×ｌ０４個と低かった。低能力を克服するために、システムは、国際公開第２０１７／０４４１４９号パンフレット（ＢＲＩＧＨＡＭ ＆ ＷＯＭＥＮＳ ＨＯＳＰＩＴＡＬ、ＩＮＣ．）２０１７年３月１６日に開示されるように、「ＭＫチャンネル」（インレットチャンネル）と「血小板」チャンネル（アウトレットチャンネル）との間のスリット／ギャップを、マイクロ流体経路（３～１０μｍの間の細孔径）を形成する透過性メンブレンに置換することにより、チャンネルの少なくとも１つを横方向に漸減させてＭＫ上の圧力と剪断応力のデカップリングを可能にすることにより、ならびに平行に配置された複数のインレット／アウトレットチャンネルを考慮することにより改変された。最初の１時間から血小板は生成し、そして血小板の数は２４時間の生成期間中に増加する。次に、各チャンネル内で流体を再循環させる可能性が付加され、そしてメンブレンの表面は、チャンネルをＳ字形状に伸ばすことにより、または単一のリザーバー容器バイオリアクターを横断するようにメンブレンを適用して２つの環境（ＭＫリザーバーおよび血小板リザーバー）を再構築することにより増加した（国際公開第２０１８／１６５３０８号パンフレット（ＰＬＡＴＥＬＥＴ ＢＩＯＧＥＮＥＳＩＳ，ＩＮＣ．）２０１８年９月１３日）。これらの改善のいずれにおいても原理は同一のままである：膜細孔のサイズは、ＭＫがメンブレンを通過するのを防止するためにＭＫより小さく、また１つのデバイスにおいて処理されるＭＫの数は、メンブレンにおいて利用可能な細孔の数により限定される。したがって、システムは、複数のデバイスを積層することによりスケールアップされる（国際公開第２０２０／０１８９５０号パンフレット（ＰＬＡＴＥＬＥＴ ＢＩＯＧＥＮＥＳＩＳ，ＩＮＣ．）２０２０年１月２３日）。
【0011】
最後に、２０１８年に、Ｅｔｏおよび共同研究者は、２つのコンパートメントを有さない新規培養システムを提案した（米国特許出願公開第２０２１／０１３０７８１号明細書（ＥＴＯら）２０２１年５月６日；Ito et al.; “Turbulence activates platelet biogenesis to enable clinical scale ex vivo production”; Cell. 2018; 174(3): 636-648）。マウス骨髄上で実施されたｉｎ ｖｉｖｏでの観察に基づき、上記筆者らは、剪断応力に付加して、乱流が血小板放出に対する重要な物理的因子であると仮定した。彼らは、動力軸に対して水平角および相互に直角に固定された２つのミキシングブレードを備える液体培養バイオリアクターを開発した。ブレードは上下往復運動を繰り返して、乱流、剪断応力、および渦度を創出する。剪断速度は、バイオリアクターのサイズを問わず６０／秒未満である。人工多能性細胞（ｉＰＳＣ）から生成された不死化細胞系（ｉｍＭＫＣＬ）に由来するＭＫを成熟させるための培養は、このバイオリアクターにおいて、ｉｍＭＫＣＬ１・１０５個または２・１０５個／ｍＬを用いながら、薬剤のカクテルを含む基本培地内で６～７日間実施された。バイオリアクター内で８Ｌを用いることで、血小板１０００億個の確保を実現した。この液体培養法は、より多量のＭＫの処理を可能にするが、しかしＭＫ成熟ステップと生成ステップがなおも混在しており、ＭＫの初期濃度は低いことが必要とされる。
【0012】
骨髄生物模倣体を凌駕し、そして肺脈管構造における血小板生成により近づくように、その他のデバイスが開発された。
【0013】
Ｄｕｎｏｉｓ－Ｌａｒｄｅらは、ヒト成熟ＭＫをＶＷＦ表面上で高剪断速度に曝露すると、細胞修飾が引き起こされ、その結果、２０分以内に血小板が放出されることを示した（Dunois-Larde et al.; “Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”; Blood. 2009; 27 Aug 27; 114(9): 1875-83）。次に、Ｂｌｉｎらは、マイクロ流体デバイス（平行に配置するマイクロチャンネル（固有の流動が適用される）内に分布したＶＷＦコーティングマイクロピラーの幅広のアレイに準拠する）に導入されたＭＫからｉｎ ｖｉｔｒｏで血小板を生成するための迅速な方法（２時間）を開発した（Blin et al.; “Microfluidic model of the plateletgenerating organ: beyond bone marrow biomimetics”; Scientific Reports. 6, 21700 (2016)）。高剪断速度において、自由に浮遊するＭＫがピラー上に停留し、血小板前駆体に伸長し、次に血小板を放出する。懸濁物は、ピラーにいまだ遭遇しないＭＫを係留させる新たな機会をもたらすために、デバイス内を再循環する。テクスチャー化された表面は、平面内のヘキサゴナルアレイのディスクおよび１Ｄアレイのピラーとしてチャンネル壁上に３Ｄパターンによって定義される（国際公開第２０１５／０７５０３０パンフレット（ＰＬＡＴＯＤ）２０１５年５月２８日）。係留されるＭＫの密度がチャンネルの進入口において高値化する（閉塞リスクがあることから高ＭＫ濃度処理を妨害する）のを克服するために、チャンネルの入口においてピラーからピラーまでのより大きな空間、およびデバイス内にさらに進入するに従いより幅の狭い空間を設けることが提案された（国際公開第２０１６／１８０９１８パンフレット（ＰＬＡＴＯＤ）２０１６年１１月１７日）。驚くべきことに、そのようなマイクロピラーマルチチャンネルデバイスを使用する実験において、ＭＫを係留するための追加表面を提供することを目的として、マイクロピラーの高さを増加させても、血小板収率は高くならなかった一方、インプットＭＫ濃度／容積の増加も可能にはならなかった。
【0014】
Ｋｕｍｏｎらは、様々なサイズのＭＫをトラップするために、流路に沿って高さが徐々に低下する、湾曲した形状の３Ｄマイクロチャンネルを工学的に生み出した（Kumon et al.; “On-Chip Platelet Production Using Three Dimensional Microchannel”; 2018 IEEE Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). 2018: 121-124）。トラップされたＭＫはマイクロチャンネル内の流体力に晒され、その結果血小板が生成した。そのようなシステムでは、チャンネルの高さが５μｍまで低下することでデバイスの閉塞が急速に引き起こされる。
【0015】
ワンフローマイクロ流体システムは、非常に短期間内に血小板生成を同期させる可能性を提供するが、しかし１つの問題は、各チャンネルに適用される剪断速度が高く、工業生産を実現するために多数のチャンネルを増倍させるかまたはデバイスを積層するとき、非現実的な大型ポンプを必要とするということである。
【0016】
合理的なコストで血小板生成をスケールアップすることを検討するとき、最良のシステムとは、高容積の細胞を高濃度で処理することを可能にし、ひいては少量の培養培地の使用および多量の血小板の取得を可能にするシステムである。血小板収率は別の重要なパラメーターであるが、しかしバイオリアクターが同一であっても、多くのその他の要因（例えば、細胞の種類、クローン、培養の媒体等）により変化する（Ito et al.; “Turbulence activates platelets biogenesis to enable clinical scale ex vivo production”; Cell. 2018; 174(3): 636-648）。
【発明の概要】
【0017】
本発明は、巨核細胞から大スケールで血小板を生成するための方法および血小板生成デバイスに関する。特に、多孔質材料を収納する回転可能なベッドリアクターを備えるデバイスが、短期間のうちに大スケールで血小板を生成するために使用されてきた。
【0018】
本発明による方法を用いれば、約１５分という短時間での血小板生成が実現可能である。血小板生成は、最長１２時間、好ましくは最長４時間継続し得る。
【0019】
欧州特許出願第２１１５５８８７号明細書（本明細書により参照により組み込まれる）に開示されるように、多孔質構造はマクロ多孔質材料を含む。多孔質構造は、したがって流動に対する障害物として機能し、またＭＫに対する係留部位として使用可能である。多孔質構造は、剪断応力に付されたときにＭＫが伸長するための十分なオープンスペース（細孔）を確保しつつ、ＭＫが付着するためのスキャフォールドを提供する。ＭＫが伸張すると、次にそれは血小板を形成する。血小板生成の増加を目的として、多孔質構造は細孔密度にグラジエントを有し得る。こうすることで、流れの向きに沿ってすべての巨核細胞が微細構造の入口のみに付着するのを防止することが可能であり、したがって巨核細胞による多孔質構造の占有を最大化する。
【0020】
したがって、本発明の複数の実施形態では、多孔質材料は、細孔（キャビティー、チャンネル、すき間等）を含有する材料として定義される。多孔質構造は天然または人工的であり得る。多孔質材料は、有機材料、無機材料、ポリマー（プラスチック）、金属、セラミック、および非結晶性であり得る。多孔質材料は２つ以上の材料の組合せを含み得る。多孔質材料は細孔を含有する１つの実体からなり得るか、またはいくつかの粒子、ビーズ、繊維、または共に積層された要素からなるアセンブリであり得る。これらの粒子のアセンブリはマクロ多孔質構造を形成し、その構造において粒子間の空間が細孔を構成する。粒子は、相互に結合、融合、もしくは接着し得るか、または単に近接した状態で並置され得る。多孔質材料は、その構造に基づき、異なる追加候補（フォーム、繊維、バブル様の発泡材料、格子、または充填されたビーズ）を有し得る。
【0021】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料は、異なる細孔径（細孔幅（直径）とも呼ばれ、細孔の２つの対向する壁の距離；１μｍ～１０ｍｍ、好ましくは５０μｍ～１ｍｍである）を有し得る。多孔質材料のバルクは、同一の細孔径またはグラジエントを構成するある範囲の細孔径（すなわち、異なる細孔径）を有し得る。多孔質材料のバルクは、同一の材料、または同一の細孔径もしくは異なる細孔径を有する２つ以上の材料の組合せから構成され得る。
【0022】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料の細孔は、半閉鎖状態または開放状態、好ましくは開放状態かつ相互に接続した状態（細孔または結合性の細孔を通じて）であり得、すなわち行き止まりまたは袋小路（袋またはパウチの形態を有する）が存在しない。細孔は、異なる形状、例えば漏斗形状、円筒形、ラフネス、インクビン形状等の細孔であり得る。細孔の断面形状は、卵形または多角形（規則的または非規則的、平滑または直線状、凹面または凸面）であり得る。多孔質材料の細孔は、規則的または不規則的配置構成、または両者の混合であり得る。多孔質材料は異なるアプローチを用いて調製され得る。
【0023】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料は、その多孔性（みかけの容積Ｖに対する全体的な細孔容積Ｖｐの比）に従い、単位容積当たりの細孔の数に基づき、低多孔性、中多孔性、または高多孔性として分類され得る。一般的に、低および中多孔性の多孔質材料は閉鎖した細孔を有する。多孔性は、２０％～９９．９％、好ましくは８０％～９９．９％に及ぶ可能性がある。
【0024】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料は硬質または可撓性であり得る。硬質な構造ほど、したがって流動の圧力下に置かれても変形しにくいほど、ＭＫとって流動の剪断応力に対抗する強力な係留物として作用し得る。
【0025】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料は、巨核細胞に対して親和性を有するリガンド、例えば（ｉ）フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）またはその機能的バリアント、（ｉｉ）ＶＷＦの断片を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）フィブリノゲン、（ｉｖ）フィブロネクチン、（ｖ）ラミニン、（ｖｉ）ＩＶ型コラーゲン、（ｖｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲン、（ｖｉｉｉ）Ｉ型コラーゲン、および（ｉｘ）ビトロネクチンでコーティングされ得る。
【0026】
一実施形態では、ＶＷＦまたはその機能的バリアントの溶液と共にインキュベートすることにより、多孔質材料はコーティングされる。一般的に、固相のコーティングに使用されるＶＷＦの濃度は、５～１００μｇ／ｍＬの間である。好ましくは、ＶＷＦの濃度は、２０～４０μｇ／ｍＬの間である。例えば、多孔質材料は、単量体または二量体ポリペプチドとして、大腸菌（E. coli）または哺乳動物細胞内で発現している組換え野生型ＶＷＦまたは突然変異したＶＷＦポリペプチドからなる群から選択されるＶＷＦの機能的バリアントを用いてコーティングされ得る。
【0027】
本発明の複数の実施形態では、血小板生成デバイスは、細胞懸濁物を収納する容器、および多孔質材料を収納するベッドリアクターを含み、ベッドリアクターは、細胞懸濁物中に浸漬される間、回転するように構成される。例えば、多孔質材料は、ベッドリアクター内で利用可能なキャビティーの寸法に対応する薄層に裁断される綿繊維（１００％オーガニックコットン）を含む。
【0028】
本発明の実施形態において、ベッドリアクターはベースプレートからトッププレートまで延在する外周壁を含む中空体を備え、そうすることで多孔質材料を収容するためのキャビティーがその間に形成される。
【0029】
ベッドリアクターは、ベッドリアクターを通じた流体流（例えば、細胞懸濁物の流動）を円滑化するために、トッププレートからベースプレートまで延在するベッドリアクターの中央部に配置された貫通孔をさらに含む。このように、細胞懸濁物は、貫通孔を経由してベッドリアクターのトッププレートおよび底部プレートの両方からベッドリアクターに進入することができる。
【0030】
好ましくは、ベッドリアクターは、対称的な形状、例えば円筒形状を有する。
【0031】
容器は、ヘッドプレート（ヘッドキャップ）を用いてキャップされるように構成され、これによりチャンバーを形成する。例えば、チャンバーはパージされ、コントロールされた空気組成物を生成するように構成される。
【0032】
ベッドリアクターは、ローターによりコントロールされるローターシャフトに連結するように構成される。例えば、ローターシャフトは、ヘッドキャップ内に形成された中心孔を通過するように構成される。代替的に、ローターシャフトは、シャフトカップリング機構を通じてヘッドキャップとカップリングするように構成される。
【0033】
ベッドリアクターは、ベッドリアクターのトッププレート上に配置されたコネクターを通じてローターシャフトと接続するように構成される。コネクター内のアパーチャーは、細胞懸濁物の流動を、貫通孔を経由してベッドリアクター内に誘導するように構成される。
【0034】
細胞懸濁物は、ヘッドキャップを配置する前に、容器内に直接添加され得る。代替的に、細胞懸濁物は、ヘッドキャップ内の開口部を通じて導入され得る。
【0035】
ヘッドプレートは、例えば、ヘッドプレートを容器上にクランピングする手段を使用して容器上に固定されるように構成される。
【0036】
さらに、細胞懸濁物は、ペリスタポンプまたはその他の循環ポンプを使用して容器内に注入されるか、またはポンプ搬送され得る。
【0037】
容器は、その中の細胞懸濁物の温度をコントロールするための冷却または加温ジャケットを使用してジャケットで覆われるようにさらに構成されている。
【0038】
ベッドリアクターは、メッシュからなる外壁を含む。代替的に、外壁はいくつかの開口部を含む。
【0039】
ベッドリアクターは、中空体内に配置された内壁であって、その上に形成された複数の開口部を有する内壁をさらに含み得る。
【0040】
容器は、ベッドリアクターを通じて流動の循環を保証するための、その中に配置されたバッフルをさらに含み得る。
【0041】
ベッドリアクターの容積と容器の容積との間の比は、１：１の直上～最大１：１００、好ましくは１：２～１：２０まで変化し得る。
【0042】
例えば、ベッドリアクターは、最大２８ｃｍ３の多孔質材料を収納することができ、また５００ｍＬの容器に適合するように構成される。特に、容器の容積に対する多孔質材料のこの比が好適であることが判明している。一般論として、より多量の多孔質材料も使用され得る。その場合、容器容積も増大し得る。したがって、２８ｃｍ３の多孔質材料および５００ｍＬの容器の代わりに、その他の数値も選択可能である。
【0043】
ベッドリアクターは、例えば、最大１０００ｒｐｍで回転するように構成される。
【0044】
多孔質材料１立方ミリメートル当たりの巨核細胞の密度は、ＭＫ１０・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１００・１０６個／ｍｍ３の範囲、好ましくはＭＫ１００・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１０・１０６個／ｍｍ３の範囲であり得る。
【0045】
本発明の複数の実施形態では、血小板生成デバイスを使用して、大スケールで血小板を生成するための方法は、
－ 細胞懸濁物（すなわち、成熟した巨核細胞を含有する溶液）を血小板生成デバイスの容器中に添加するステップと、
－ 多孔質材料を血小板生成デバイスのベッドリアクター内に導入するステップと、
－ ベッドリアクターをローターシャフトに取り付けるステップと、
－ ベッドリアクターを血小板生成デバイスの容器内に配置するステップと、
－ 任意選択的に、コントロールされた雰囲気を維持するために、ヘッドキャップを用いて容器を閉鎖するステップと、
－ ベッドリアクターを事前に決定されたスピードで回転させるステップと、
－ 任意選択的に、血小板およびＭＫを計数および特徴付けるために、細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を、例えば定期的に収集するステップと
を含み得る。
－ 細胞懸濁物（すなわち、成熟した巨核細胞を含有する溶液）を血小板生成デバイスの容器中に添加するステップと、
－ 多孔質材料を血小板生成デバイスのベッドリアクター内に導入するステップと、
－ ベッドリアクターをローターシャフトに取り付けるステップと、
－ ベッドリアクターを血小板生成デバイスの容器内に配置するステップと、
－ 任意選択的に、コントロールされた雰囲気を維持するために、ヘッドキャップを用いて容器を閉鎖するステップと、
－ ベッドリアクターを事前に決定されたスピードで回転させるステップと、
－ 任意選択的に、血小板およびＭＫを計数および特徴付けるために、細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を、例えば定期的に収集するステップと
を含み得る。
【0046】
本発明の複数の実施形態では、本発明の方法で使用するための「細胞懸濁物」は、例えば、下記のステップ：
－ ＨＳＣ（例えば、臍帯、末梢血液、または骨髄由来）もしくは工学操作されたＨＳＣから選択されるか、または胚性幹細胞、工学操作された胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および工学操作された人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を提供するステップ、
－ 幹細胞を培養するステップ、すなわち細胞を増殖させ、増殖した細胞をＭＫに分化させるステップ
により取得され得る。
－ ＨＳＣ（例えば、臍帯、末梢血液、または骨髄由来）もしくは工学操作されたＨＳＣから選択されるか、または胚性幹細胞、工学操作された胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および工学操作された人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を提供するステップ、
－ 幹細胞を培養するステップ、すなわち細胞を増殖させ、増殖した細胞をＭＫに分化させるステップ
により取得され得る。
【0047】
本発明の複数の実施形態では、多孔質材料をベッドリアクター中に導入するステップは、バルクの状態でベッドリアクターの全容積を充填するステップを含む。代替的に、多孔質材料は、数百マイクロメートルのいくつかの層からなるアセンブリとして配置構成され、多孔質材料はベッドリアクター内に配置された（例えば、トッププレートおよびベースプレートに対して平行に）中間壁により分離され得る。例えば、容器の容積が層状の多孔質材料で充填されないケースでは、ベッドリアクターは、インサート、例えばプラスチックインサートで充填され、これにより複数の層からなる多孔質材料のみを通過する流動を確立する。
【0048】
添付図面を参照しながら、本発明を事例的にここに記載する。
【図面の簡単な説明】
【0049】
【図1】２つの異なるコンフィギュレーション；１Ａ）ヘッドキャップ内の孔を通過するローターシャフトがベッドリアクターと接続するコンフィギュレーション；１Ｂ）シャフトカップリング機構を介してヘッドキャップとカップリングしたローターシャフトがベッドリアクターと接続するコンフィギュレーションを有する大スケール血小板生成デバイスの略図を示す図である。
【図2】図２Ａ）ベッドリアクターの３Ｄ描写を示す図である。図２Ｂ～図２Ｃ）多孔質材料で充填されたベッドリアクターの断面描写を示す図である。矢印は、ベッドリアクター中央部の貫通孔を通じた流動の方向を示す。図２Ｂおよび図２Ｃは、多孔質材料バルクおよび層状の多孔質材料で充填されたベッドリアクターをそれぞれ表す。
【図3】下流に位置するソーティングデバイスとカップリングしている血小板生成デバイスの略図を示す図である。図３Ａ）下流に位置するソーティングデバイスは、チューブおよびポンプを通じて接続する。図３Ｂ）下流に位置するソーティングデバイスは、血小板生成デバイスの容器に直接接続する。
【図4】小スケール血小板生成デバイスの略図を示す図である。ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）内にマイクロマシン化された６．６ｍｍ×３５．５ｍｍ×０．１ｍｍのキャビティー。
【図5】実験で使用されるようなベッドリアクターにおける多孔質材料の配置構成の略図を示す図である。図５Ａ）ベッドリアクターの中位の高さに配置された多孔質材料（例えば、綿）からなる２つの薄層のみを有するベッドリアクターの横方向の断面図；図５Ｂ）多孔質材料を有さないベッドリアクターの横方向の断面図；図５Ｃ）ベッドリアクター内に対称的に配置された多孔質材料からなる２つの層で充填されたベッドリアクターの最上部断面図。
【図6】血小板数が生成実験の開始から増加することを表す実験結果を示す図である：多孔質材料を有する大スケール構成におけるベッドリアクターの回転スピードの影響、および多孔質材料を含む小スケール構成との比較（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２）。
【図7】血小板収率（血小板生成開始時のＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋数に対する血小板の最大数）は、多孔質材料を有する小スケール構成と比較して、多孔質材料を有する大スケール構成において増加することを表す実験結果を示す図である（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２）。
【図8】９００ｒｐｍの回転スピードにおける、多孔質材料を有する小スケール構成および多孔質材料を有さない大スケール構成における血小板数の比較を表す実験結果を示す図である。
【図9】活性化した際の血小板の特徴付けを示す図である。小スケール生成構成および大スケール生成構成（いずれも多孔質材料を有する）における生成終了時の血小板の比較（平均±ＳＥＭ；ｎ＝２）。
【発明を実施するための形態】
【0050】
血小板を生成するために、巨核細胞系統に限定される造血前駆体から巨核細胞（ＭＫ）を派生させた。
【0051】
巨核細胞生成に関する一次シグナルは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＴＰＯ受容体アゴニスト、またはＴＰＯ模倣ペプチドである。ＴＰＯは、骨髄内の前駆体細胞が最終的な巨核細胞表現型に向かって分化するように誘発するのに必要である。巨核細胞分化のためのその他の分子シグナルとして、例えば、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－３、ＩＬ－６、ＩＬ－１１、Ｆｌｔ－３リガンド、ＳＣＦが挙げられる。
【0052】
ＭＫ前駆細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養により取得可能である。
【0053】
本明細書で使用される場合、用語「細胞懸濁物」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの培養により取得される血小板を速やかに生成する成熟したＭＫを含有する溶液を示す。この細胞懸濁物は、ＭＫ前駆体、血小板前駆体、および血小板も含み得る。
【0054】
好ましくは、本発明の方法で使用するための前記「細胞懸濁物」は、下記のステップ：
ａ）例えば、ＨＳＣ（例えば、臍帯、末梢血液、または骨髄に由来する）、工学操作されたＨＳＣから選択されるか、または胚性幹細胞、工学操作された胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および工学操作された人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を提供するステップ；
ｂ）前記幹細胞を培養するステップ、すなわち細胞を増殖させ、増殖した細胞をＭＫに分化させるステップ
により得られる。
ａ）例えば、ＨＳＣ（例えば、臍帯、末梢血液、または骨髄に由来する）、工学操作されたＨＳＣから選択されるか、または胚性幹細胞、工学操作された胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、および工学操作された人工多能性幹細胞からなる群から選択される幹細胞を提供するステップ；
ｂ）前記幹細胞を培養するステップ、すなわち細胞を増殖させ、増殖した細胞をＭＫに分化させるステップ
により得られる。
【0055】
【0056】
【0057】
ベッドリアクター１６は、取り付けられた状態で容器１２内に配置されている。
【0058】
容器１２は、ヘッドプレートまたはヘッドキャップ１８を用いてキャップされ、これによりチャンバー２０を形成し得る。このようにして、チャンバー内の空気組成をコントロールすることができる。例えば、空気組成は５％のＣＯ２から構成される。
【0059】
細胞懸濁物１４の温度をコントロールするために、容器１２は、冷却または加温ジャケット２２を使用してジャケットで覆うことができる。代替的に、任意のその他の適する温度コントロールユニットが温度をコントロールするのに使用可能である。
【0060】
例えば、水を循環させて３７℃に熱制御しながら、ジャケットで覆われた容器を使用した。
【0061】
細胞懸濁物１４は、ヘッドキャップ１８を配置する前に容器１２内に直接添加される。代替的に、細胞懸濁物は、ヘッドキャップ１８内の開口部を通じて導入され得る。
【0062】
さらに、細胞懸濁物１４は、ペリスタポンプまたはその他の循環ポンプを使用して容器１２中に注入されるかまたはポンプ搬送され得る。
【0063】
実験終了時には、細胞懸濁物１４は生成した血小板もその時点で含有するが、同懸濁物は容器の底部に位置するドレインアウトプットを使用して容器１２の外部に排出され得る（図示せず）。
【0064】
代替的に、血小板を含む細胞懸濁物１４は、容器１２内に挿入されたチュービングを通じて容器外部にポンプ搬送され得る。
【0065】
ベッドリアクター１６は、細胞懸濁物１４中に浸漬されるように構成される。
【0066】
ベッドリアクター１６は、ローター２６によりコントロールされるローターシャフト２４に連結するように構成される。このようにして、ベッドリアクター１６は高速で回転し得る。
【0067】
ローターシャフト２４は、図１Ａに示すようなヘッドキャップ１８内の中心孔を通過し得る。代替的に、ローターシャフト２４は、シャフトカップリング機構２７を通じてヘッドキャップ１８とカップリングし得る。この場合、ヘッドキャップは中心孔を有さない。例えば、ヘッドキャップは、クランピングプロセスを介して容器に固定され得る。
【0068】
【0069】
ベッドリアクター１６はベースプレートからトッププレートまで延在する外周壁を含む中空体を備え、そのため、キャビティーが多孔質材料を収容するようにその間に形成される。
【0070】
ベッドリアクター１６は、貫通孔（ベッドリアクターの中央部に配置され、そして図２Ｂおよび図２Ｃの矢印で表されるように、トッププレートからベースプレートまで延在する）を、それを通じた流動を円滑化するためにさらに含む。
【0071】
ベッドリアクター１６は、トッププレートに配置されたコネクター２５を通じてローターシャフト２４と接続するように構成される。コネクター２５内のアパーチャーは、コネクター２５を経由して、流動がベッドリアクター１６の中央部に位置する貫通孔内を通過するのを可能にする。
【0072】
図２Ａは、ベッドリアクター１６の周辺外壁はメッシュからなることを表す。代替的に、外壁はいくつかの開口部３２を含み得る。開口部３２を設けることで、ベッドリアクター１６に収納され細胞懸濁物１４と多孔質材料３０との間のより良好な接触が可能になる。
【0073】
ベッドリアクター１６は、図２Ｂおよび図２Ｃに示すように、内壁（中空体内に配置され、そしてその上に形成された複数の開口部３６を有する）をさらに備え得る。これは、ベッドリアクターが回転している間に流動がベッドリアクター１６を通じて循環することを可能にし、それによって多孔質材料と細胞懸濁物との間の接触をさらに強化する可能性がある。このように、ベッドリアクターを回転させることで、ベッドリアクターを通じた放射状の流動が誘発される。
【0074】
内壁および周辺外壁上の開口部３２、３６と共に、ベッドリアクター内に中央貫通孔を設けることで（これにより、流動がベッドリアクターの最上部および底部側から中心に向かって進入するのを可能にする）、流動（ベッドリアクターの中央部に進入し、そして多孔質材料を通過する間にベッドリアクターから放射状に流出する）のための経路が確保される。これは、ひいては、ベッドリアクター１６の高さ方向すべてを通じた流動の最適な再分割を引き起こす。この効果は、円筒形状のベッドリアクターにおいてさらに改善する。
【0075】
チャンバー２０を滅菌に保つために、ローターシャフト２４は、磁気シャフトカップリングを通じてベッドリアクター１６に接続することも可能である。
【0076】
ベッドリアクター１６を高速で回転させるときに、旋回流および渦流を防止するためのバッフル２８が容器１２に設けられる。これはベッドリアクター１６を通じた流動の循環を確実にする。
【0077】
細胞懸濁物１４が多孔質材料３０を通じて放射状に流動するとき、ＭＫは多孔質材料の微細構造に連結することができる。
【0078】
多孔質材料中に捕捉されたＭＫは剪断応力および／または引っ張り力を受ける。剪断応力の下、ＭＫの細胞質は伸長し、そして血小板を形成する。回転スピードが高いほど、多孔質材料を通過する流速も速くなり、より高い剪断応力が生ずる。
【0079】
また、多孔質材料３０を通過する流速は、多孔質材料の流体力学的抵抗にも比例する。
【0080】
血小板が生成されると、血小板は細胞懸濁物１４内に放出され、そして流動により運ばれ、容器１２内を自由に循環する。
【0081】
ＭＫは、多孔質材料に対する細胞表面結合により、またはそれをコーティングすることにより（例えば、その表面のインテグリンの恩恵により）、または多孔質材料のすき間に捕捉されることにより多孔質材料に連結する。
【0082】
ＭＫの連結は、永続的な場合もあればそうでない場合もある。ＭＫは多孔質材料から脱離することがあり、また多孔質材料を通じて再循環するときに再連結することがある。
【0083】
図２Ｂに示すように、多孔質材料３０は、バルクとしてベッドリアクター１６の全容積を満たすことができる。代替的に、図２Ｃに示すように、多孔質材料３０は、中間壁３４によって分離され、またはされない数百マイクロメートルのいくつかの層からなるアセンブリとして配置構成され得る。
【0084】
中間壁３４の存在は、ベッドリアクター１６内の多孔質材料３０にとって利用可能な空間を低下させるものの、追加の壁剪断速度をもたらす。
【0085】
ベッドリアクター１６は、血小板生成を増加させるためにスケールアップ可能である。容器１２は、大型のベッドリアクター１６に適合するように、それに応じてスケールアップされる。好ましくは、ベッドリアクターは、１ｍｍ３～最大１ｍ３の容積を有し得る。容器１２はベッドリアクターに適合するように十分大きくなければならないが、ただしより大型であってもよい。
【0086】
ベッドリアクターの容積と容器の容積との間の比は、１：１の直上～最大１：１００、好ましくは１：２～１：２０であり得る。
【0087】
例えば、ベッドリアクター１６は最大２８ｃｍ３の多孔質材料３０を収納可能であり、また５００ｍＬの容器１２に適合可能である。
【0088】
ベッドリアクターが大きいほど慣性力も高く、したがって到達し得る最大回転スピードも低くなる。好ましくは、２８ｃｍ３ベッドリアクターは最大１０００ｒｐｍで回転し得る。
【0089】
ＭＫ１個当たりの血小板生成収率を最適化するために、多孔質材料１立方ミリメートル当たりのＭＫ密度は、ＭＫ１０・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１００・１０６個／ｍｍ３の範囲、好ましくはＭＫ１００・１０３個／ｍｍ３～ＭＫ１０・１０６個／ｍｍ３の範囲である必要がある。
【0090】
ベッドリアクターと容器との間の容積比が、１：１の直上である場合には、細胞懸濁物は、ＭＫ１０・１０３個／ｍＬ～最大ＭＫ１００・１０６個／ｍＬを含有し得る。代替的に、ベッドリアクターと容器との間の容積比が、１：１００である場合には、細胞懸濁物は、ＭＫ０．１・１０３個／ｍＬ～最大ＭＫ１・１０６個／ｍＬを含有し得る。
【0091】
ベッドリアクターの高スピード回転の恩恵により、細胞懸濁物は多孔質材料を通じて高速で再循環し、ＭＫが多孔質材料に連結し、そして血小板を形成する機会を最大化する。このようにして、血小板生成は限定された時間内に実施可能である。
【0092】
細胞懸濁物が容器中に導入され、そしてベッドリアクターが回転を開始したときから、血小板は１５分という短時間内に生成し、そして生成は、最大１２時間、好ましくは４時間継続可能である。
【0093】
血小板生成は経時的に増加する。これは、細胞懸濁物をサンプリングし、そしてフローサイトメトリーまたは任意のセルカウンターを用いて血小板数を実施することによりモニタリングされ得る。経時的に、血小板数は増加し、またＭＫ数は減少する。
【0094】
バッチプロセスまたは連続プロセスにおいて血小板を生成させることが可能である。実際、血小板生成が進行するに従い、ＭＫ数は減少し、より多くのＭＫを容器に添加可能である。
【0095】
多孔質材料は、有機材料、無機材料、ポリマー（プラスチック）、金属、セラミック、および非結晶性であり得る。多孔質材料は２つ以上の材料の組合せから構成され得る。多孔質材料は、その構造に基づき、異なる追加候補（フォーム、繊維、バブル様の発泡材料、格子、または充填されたビーズ）を有し得る。
【0096】
多孔質材料は、１μｍ～１０ｍｍ、好ましくは５０μｍ～１ｍｍの異なる細孔径を有し得る。
【0097】
多孔質材料のバルクは、同一の細孔径またはグラジエントを構成するある範囲の細孔径を有し得る。バルクは、同一の材料、または同一の細孔径もしくは異なる細孔径を有する２つ以上の材料の組合せから構成され得る。
【0098】
例えば、多孔質材料は１００％綿繊維からなる。
【0099】
多孔質材料は、巨核細胞に対して親和性を有するリガンド、例えば、（ｉ）フォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）またはその機能的なバリアント、（ｉｉ）ＶＷＦの断片を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）フィブリノゲン、（ｉｖ）フィブロネクチン、（ｖ）ラミニン、（ｖｉ）ＩＶ型コラーゲン、（ｖｉｉ）ＩＩＩ型コラーゲン、（ｖｉｉｉ）Ｉ型コラーゲン、および（ｖｉｉｉ）ビトロネクチンでコーティングされ得る。
【0100】
多孔質材料は、ＶＷＦまたはその機能的バリアントの溶液と共にインキュベートすることによりコーティングされ得る。一般的に、固相のコーティングで使用されるＶＷＦの濃度は、５～１００μｇ／ｍＬの間である。好ましくは、ＶＷＦの濃度は２０～４０μｇ／ｍＬの間である。
【0101】
さらに、多孔質材料は、単量体または二量体ポリペプチドとして大腸菌（E. coli）または哺乳動物細胞内で発現される組換え野生型ＶＷＦポリペプチド、または突然変異したＶＷＦポリペプチドからなる群から選択されるＶＷＦの機能的バリアントでコーティングされ得る。
【0102】
有利には、回転式ベッドリアクターは無菌条件下で作動し得る。例えば、前記リアクターは滅菌性である。
【0103】
本発明に基づく多孔質材料を製造するための方法は、多孔質材料を滅菌処理するステップを含み得る。この滅菌処理ステップは、リアクターチャンバーの密封前後に生じ得る。
【0104】
本発明に基づく血小板生成デバイスは、任意選択的な手段、例えば：
（ａ）血小板生成デバイスの上流に配置された、懸濁物を巨核細胞について富化し、巨核細胞の前記懸濁物の細胞濃縮物をホモジナイズするための上流に位置するソーターおよび／またはミキサー、
（ｂ）任意選択的に、巨核細胞またはその他の細胞残留物から血小板をソーティングすることによって流出した懸濁物を精製するための、血小板生成デバイスより下流に配置されたソーター、
（ｃ）任意選択的に、流出した懸濁物を濃縮するための、血小板生成デバイスより下流に配置された血小板濃縮装置
等をさらに含み得る。
（ａ）血小板生成デバイスの上流に配置された、懸濁物を巨核細胞について富化し、巨核細胞の前記懸濁物の細胞濃縮物をホモジナイズするための上流に位置するソーターおよび／またはミキサー、
（ｂ）任意選択的に、巨核細胞またはその他の細胞残留物から血小板をソーティングすることによって流出した懸濁物を精製するための、血小板生成デバイスより下流に配置されたソーター、
（ｃ）任意選択的に、流出した懸濁物を濃縮するための、血小板生成デバイスより下流に配置された血小板濃縮装置
等をさらに含み得る。
【0105】
上流に位置するソーター（すなわち、巨核細胞ソーター）の使用は、ＭＫ集団に関して均質な懸濁物を取得し、ならびに血小板を工業生産するための一貫した収率および品質を取得するのに有利であり得る。特に、上流に位置するソーターは、血小板およびその他の細胞残留物からＭＫを分離するための手段を含む。以下に記載するような従来型のセルソーターは、事前定義された割合（１０％～約１００％）でＭＫが富化された細胞懸濁物の取得を可能にする下流に位置するソーター（例えば、血小板セルソーター）として使用可能である。
【0106】
血小板生成デバイスのアウトレットにおいて、流出物は生成した血小板を含有するが、しかし裸核および／または当初のＭＫをさらに含有する可能性がある。生成した血小板を分離するための手段は、したがって、有利には血小板生成デバイスの下流に配置され得る。従来型のセルソーターデバイスは、例えばエルトリエーションローター、またはアフェレーシス技術で使用される白血球減少フィルター等として使用され得る。下流に位置するソーターは、工業界における大スケール濾過、例えばメンブレン濾過等で使用される濾過デバイス、タンジェンシャルフロー濾過デバイス、例えば中空繊維またはスピニングフィルター等でもあってもよい。
【0107】
分離ステップは血小板生成の終了時に生じ得るか、または生成期間中に異なる間隔で、もしくは血小板生成期間中に連続モードで実施可能である。血小板生成期間中にＭＫから血小板を分離することで、血小板が形成されるに従い生成した血小板の抽出が可能になり、したがって血小板生成デバイス内に過剰に長期間とどまること（その品質に影響を及ぼす可能性がある）を防止する。
【0108】
バッチプロセスモードでは、下流に位置するソーターは、血小板生成デバイスから独立していてもよい。血小板生成の終了時に、細胞および血小板懸濁物はポンプを使用してセルソーターデバイスに移送される。
【0109】
半連続的または連続的プロセスでは、下流に位置するソーターデバイスはチュービングまたはパイプを通じて血小板生成デバイスの容器に接続され得る。
【0110】
図３Ａは、チュービング４０およびポンプ４２を通じて容器１２に接続する下流に位置するソーターデバイス３８を例証する。この場合、細胞および血小板懸濁物は下流に位置するソーターデバイス３８を通じて循環し、そしてセルソーターデバイス内で単離されたＭＫは容器１２内に再導入される。
【0111】
図３Ｂは、下流に位置するソーターデバイス３８が、ポンプを使用せずに血小板生成デバイス１０、１０’に直接接続する別のコンフィギュレーションについて例証する。このコンフィギュレーションでは、ベッドリアクターの回転が、細胞および血小板懸濁物をセルソーターデバイスに移送するのに使用される流動の変位を誘発する。
【0112】
血小板生成デバイスのアウトレットにおいて、またはソーターのアウトレットにおいて、流出懸濁物は、ヒトへの注射に適する血小板濃度に達するように濃縮され得る。従来型の細胞濃縮デバイス、例えば血液透析またはタンジェンシャルフロー濾過デバイス等が使用され得る。細胞培養培地を取り除くために血小板は洗浄され、そして血小板は、ヒト血漿を添加しながら、または添加しないで、保管溶液、例えばＰＡＳ－Ａ、ＰＡＳ－Ｂ、ＰＡＳ－Ｃ、ＰＡＳ－Ｄ、ＰＡＳ－Ｅ、またはＰＡＳ－Ｇのような血小板添加溶液（ＰＡＳ）の中に再懸濁される（Ashford et al.; “Standard terminology for platelet additive solutions”; The International Journal of Transfusion Medicine; Vol. 98, Issue 4, (2010). p. 577-578）。
【0113】
本発明は、例証目的に限定して、また添付の図面とも関連づけながら記載される、下記の非限定的な実施例を考慮すればさらに理解される。
【実施例】
【0114】
材料および方法
ＣＤ３４＋細胞の培養および分化
これまでに報告されたように（Poirault-Chassac et al., “Notch/Delta4 signaling inhibits human megakaryocytic terminal differentiation”; 2010; Blood Dec 16;116(25):5670）、ＣＤ３４＋細胞を、免疫磁気技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス）によりヒト臍帯血（ＣＢ）から単離した。１５％のＢＩＴ９５００血清代替物（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０９５００）、α－モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ６１４５－２５ＭＬ）およびリポソーム（３Ｌ－ａ－ホスファチジルコリンジパルミトイル（Ｐ０７６３－２５０ＭＧ）、コレステロール（Ｃ３０４５－５Ｇ）、およびオレイン酸（Ｏ３８８０－１Ｇ）；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ならびにＰａｎＲｅａｃからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ（Ａ２２４４．００５０））が補充されたＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１９８００２２）から構成される完全培地内、３７℃、５％のＣＯ２を含む多湿雰囲気において、ＣＤ３４＋細胞を６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、８３．３９２０．５００）内で培養した。ヒト組換え幹細胞因子（ＳＣＦ）（６．２５Ｕ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－６９６）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）（１０Ｕ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９５－０６８）、およびトロンボポエチンペプチドアゴニスト（ＴＰＯ）（１０ｎＭ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより合成）を、０日目に１回、培養培地に添加した。６日目に、細胞を遠心分離し、そして５０ｎＭのＴＰＯおよび０．５Ｕ／ｍＬのＳＣＦが補充された新鮮な完全培地中に追加の５～７日間再懸濁した。
ＣＤ３４＋細胞の培養および分化
これまでに報告されたように（Poirault-Chassac et al., “Notch/Delta4 signaling inhibits human megakaryocytic terminal differentiation”; 2010; Blood Dec 16;116(25):5670）、ＣＤ３４＋細胞を、免疫磁気技術（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｐａｒｉｓ、フランス）によりヒト臍帯血（ＣＢ）から単離した。１５％のＢＩＴ９５００血清代替物（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、０９５００）、α－モノチオグリセロール（Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ６１４５－２５ＭＬ）およびリポソーム（３Ｌ－ａ－ホスファチジルコリンジパルミトイル（Ｐ０７６３－２５０ＭＧ）、コレステロール（Ｃ３０４５－５Ｇ）、およびオレイン酸（Ｏ３８８０－１Ｇ）；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、ならびにＰａｎＲｅａｃからのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）フラクションＶ（Ａ２２４４．００５０））が補充されたＩｓｃｏｖｅ改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地（ＩＭＤＭ；Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１９８００２２）から構成される完全培地内、３７℃、５％のＣＯ２を含む多湿雰囲気において、ＣＤ３４＋細胞を６ウェルプレート（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、８３．３９２０．５００）内で培養した。ヒト組換え幹細胞因子（ＳＣＦ）（６．２５Ｕ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９６－６９６）、インターロイキン－３（ＩＬ－３）（１０Ｕ／ｍＬ；Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、１３０－０９５－０６８）、およびトロンボポエチンペプチドアゴニスト（ＴＰＯ）（１０ｎＭ；Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈにより合成）を、０日目に１回、培養培地に添加した。６日目に、細胞を遠心分離し、そして５０ｎＭのＴＰＯおよび０．５Ｕ／ｍＬのＳＣＦが補充された新鮮な完全培地中に追加の５～７日間再懸濁した。
【0115】
血小板生成のための小スケール構成
小スケール生成デバイス
小スケール血小板生成デバイスが、すべての実施例においてコントロールとしての役割を果たした（図４）。これは、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）内にマイクロマシン化された、寸法が６．６ｍｍ×３５．５ｍｍ×０．１ｍｍのキャビティーである。キャビティーはＰＭＭＡからなるフタで閉鎖される。キャビティーは多孔質材料で充填され、１つのインレットおよび１つのアウトレットを有し、したがって多孔質材料を通じて細胞懸濁物を循環させるのに使用されるペリスタポンプに接続可能である。
小スケール生成デバイス
小スケール血小板生成デバイスが、すべての実施例においてコントロールとしての役割を果たした（図４）。これは、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）内にマイクロマシン化された、寸法が６．６ｍｍ×３５．５ｍｍ×０．１ｍｍのキャビティーである。キャビティーはＰＭＭＡからなるフタで閉鎖される。キャビティーは多孔質材料で充填され、１つのインレットおよび１つのアウトレットを有し、したがって多孔質材料を通じて細胞懸濁物を循環させるのに使用されるペリスタポンプに接続可能である。
【0116】
小スケール生成システム構造
細胞懸濁物を、少なくとも３００ｒｐｍで回転するオービタルミキサー（ＩＫＡ ＭＳ３ ｂａｓｉｃ）上に固定された５０ｍＬファルコンチューブ内に配置した。ペリスタポンプ（ＩＰＣ８、ＩＳＭＡＴＥＣ、ドイツ）を、血小板生成デバイスを通じて細胞懸濁物を流動させるのに使用した。インレットおよびアウトレットチューブのいずれも細胞懸濁物を収納する同一のコンテナに帰着し、ＭＫ再循環をもたらす。前記コンテナを、可撓性の０．５７ｍｍＩＤチュービング（Ｔｙｇｏｎ ＳＴ Ｒ－３６０７、Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いて小スケールデバイスのインレットおよびアウトレットと接続させた。細胞懸濁物を、小スケールデバイスを通じて、０．９４ｍＬ／分の速度で２時間循環させた。小スケール血小板生成用の構成全体を、エアコントローラー（Ｔｈｅ Ｂｏｘ、Ｌｉｆｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、スイス）により３７℃に温度制御されたチャンバー内に閉じ込めた。細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を、血小板生成プロセス期間中に、血小板およびＭＫの計数および特徴付け用として、マイクロピペットを用いてファルコンチューブから定期的に収集した。
細胞懸濁物を、少なくとも３００ｒｐｍで回転するオービタルミキサー（ＩＫＡ ＭＳ３ ｂａｓｉｃ）上に固定された５０ｍＬファルコンチューブ内に配置した。ペリスタポンプ（ＩＰＣ８、ＩＳＭＡＴＥＣ、ドイツ）を、血小板生成デバイスを通じて細胞懸濁物を流動させるのに使用した。インレットおよびアウトレットチューブのいずれも細胞懸濁物を収納する同一のコンテナに帰着し、ＭＫ再循環をもたらす。前記コンテナを、可撓性の０．５７ｍｍＩＤチュービング（Ｔｙｇｏｎ ＳＴ Ｒ－３６０７、Ｉｄｅｘ Ｈｅａｌｔｈ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ドイツ）を用いて小スケールデバイスのインレットおよびアウトレットと接続させた。細胞懸濁物を、小スケールデバイスを通じて、０．９４ｍＬ／分の速度で２時間循環させた。小スケール血小板生成用の構成全体を、エアコントローラー（Ｔｈｅ Ｂｏｘ、Ｌｉｆｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、スイス）により３７℃に温度制御されたチャンバー内に閉じ込めた。細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を、血小板生成プロセス期間中に、血小板およびＭＫの計数および特徴付け用として、マイクロピペットを用いてファルコンチューブから定期的に収集した。
【0117】
血小板生成のための大スケール構成
大スケール血小板生成デバイスは、ジャケットで覆われた５００ｍＬ－ガラス製バッフル付き容器（ＶｅｓｓｅｌＶ２、ＳｐｉｎＣｈｅｍ、スウェーデン）であり、その中に２８ｃｍ３ベッドリアクター（ＲＢＲ Ｓ２、ＳｐｉｎＣｈｅｍ、スウェーデン）を配置し、そしてローターシャフト（ローターＩＫＡ ＲＷ ２０デジタル）に連結した。ローターは最大１０００ｒｐｍの回転スピードに到達可能である。中央アパーチャー（ローターシャフトがそこを通過する）を有するヘッドキャップを、容器上にクランプ固定した。ガスミキサーユニット（ＣＯ２ Ｂｉｏｂｒｉｃｋ、Ｌｉｆｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、スイス）が、２２Ｌ／時間の速度で５％のＣＯ２を含む空気をチャンバー内に提供した。容器を取り巻くジャケットを、３７℃に設定された温度コントロールユニット（Colora）（ジャケットを通じて温度制御された水を循環させた）に接続した。
この２８ｃｍ３ベッドリアクター全体を多孔質材料で充填することで、生成期間中に、ＭＫ１００・１０６個／ｍｍ３という高濃度でＭＫ２８・１０１１個を多孔質材料内に得ることが可能となる。この場合、ＭＫの懸濁物は、５００ｍＬ容器内でＭＫ５．６・１０９個／ｍＬという高濃度となる。
ベッドリアクターは、血小板生成に対する多孔質材料の量の影響を試験するために、多孔質材料からなる薄層を収納するように特別設計され得る。
大スケール血小板生成デバイスは、ジャケットで覆われた５００ｍＬ－ガラス製バッフル付き容器（ＶｅｓｓｅｌＶ２、ＳｐｉｎＣｈｅｍ、スウェーデン）であり、その中に２８ｃｍ３ベッドリアクター（ＲＢＲ Ｓ２、ＳｐｉｎＣｈｅｍ、スウェーデン）を配置し、そしてローターシャフト（ローターＩＫＡ ＲＷ ２０デジタル）に連結した。ローターは最大１０００ｒｐｍの回転スピードに到達可能である。中央アパーチャー（ローターシャフトがそこを通過する）を有するヘッドキャップを、容器上にクランプ固定した。ガスミキサーユニット（ＣＯ２ Ｂｉｏｂｒｉｃｋ、Ｌｉｆｅ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、スイス）が、２２Ｌ／時間の速度で５％のＣＯ２を含む空気をチャンバー内に提供した。容器を取り巻くジャケットを、３７℃に設定された温度コントロールユニット（Colora）（ジャケットを通じて温度制御された水を循環させた）に接続した。
この２８ｃｍ３ベッドリアクター全体を多孔質材料で充填することで、生成期間中に、ＭＫ１００・１０６個／ｍｍ３という高濃度でＭＫ２８・１０１１個を多孔質材料内に得ることが可能となる。この場合、ＭＫの懸濁物は、５００ｍＬ容器内でＭＫ５．６・１０９個／ｍＬという高濃度となる。
ベッドリアクターは、血小板生成に対する多孔質材料の量の影響を試験するために、多孔質材料からなる薄層を収納するように特別設計され得る。
【0118】
２つの実験において、１７９．６１ｍｍ２×０．２ｍｍの寸法を有する多孔質材料からなる２つの薄層をベッドリアクターの中間の高さに配置した（図５Ａ）。流動が多孔質材料からなる薄層のみを流通するように、残りのベッドリアクターにはプラスチックインサートを充填した。多孔質材料からなる薄層は四分円の形を有し、そしてベッドリアクターの縦方向の横断図（図５Ｃ）に認められるようにベッドリアクター内に対称的に配置された。多孔質材料の総量は、したがって小スケール血小板生成デバイスにおける総量よりも３．２倍高かった。
【0119】
１つの別の実験では、多孔質材料を含めずに上記ベッドリアクターを使用した（図５Ｂ）。細胞のサンプルおよび血小板懸濁物を、血小板およびＭＫの計数および特徴付け用として、血小板生成プロセス期間中に定期的に収集した。ピペットを使用して実施したサンプル収集期間中に、ローターを短時間のみ停止した。
【0120】
多孔質材料の調製
綿繊維（１００％オーガニックコットン）を、小スケールおよび大スケールデバイスのキャビティーの寸法でそれぞれ薄層状に裁断した。
綿繊維（１００％オーガニックコットン）を、小スケールおよび大スケールデバイスのキャビティーの寸法でそれぞれ薄層状に裁断した。
【0121】
タンパク質表面処理
多孔質材料のコーティングで使用されるヒトフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）はＷｉｌｆａｃｔｉｎ（ＬＦＢ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、フランス）であった。それを、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×）中で４０μｇ／ｍＬに稀釈し、そして小スケールデバイス内で灌流し、または大スケールリアクターで使用するように意図された多孔質材料のピース上に注入した。小スケールデバイスおよび多孔質材料のピースを、加湿チャンバー内、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。
多孔質材料のコーティングで使用されるヒトフォン・ヴィルブランド因子（ＶＷＦ）はＷｉｌｆａｃｔｉｎ（ＬＦＢ、Ｌｅｓ Ｕｌｉｓ、フランス）であった。それを、カルシウムおよびマグネシウムイオンを含まないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ １×）中で４０μｇ／ｍＬに稀釈し、そして小スケールデバイス内で灌流し、または大スケールリアクターで使用するように意図された多孔質材料のピース上に注入した。小スケールデバイスおよび多孔質材料のピースを、加湿チャンバー内、４℃、オーバーナイトでインキュベートした。
【0122】
細胞懸濁物の調製
培養から１１、１２、または１３日後に、細胞を６ウェルプレートから収集し、５０ｍＬチューブに移した。細胞濃度を手動計数により見積もった（Ｍａｌａｓｓｅｚ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒを使用して）。この初回細胞懸濁物から、５ｍＬの容積を収集し、そして小スケール生成構成で使用するために５０ｍＬチューブに移した。綿繊維の量は、小スケール構成と比較して、大スケール構成では３．２倍高いので、大スケール構成で使用される細胞懸濁物において、絶対細胞数を約３．２倍高く目標設定した。細胞懸濁物を、したがってそれに応じて調整し、また大スケール血小板生成デバイスで使用するために、２００ｍＬの容積に到達するように、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１９８００２２）を用いて補完した。
培養から１１、１２、または１３日後に、細胞を６ウェルプレートから収集し、５０ｍＬチューブに移した。細胞濃度を手動計数により見積もった（Ｍａｌａｓｓｅｚ ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｃｈａｍｂｅｒを使用して）。この初回細胞懸濁物から、５ｍＬの容積を収集し、そして小スケール生成構成で使用するために５０ｍＬチューブに移した。綿繊維の量は、小スケール構成と比較して、大スケール構成では３．２倍高いので、大スケール構成で使用される細胞懸濁物において、絶対細胞数を約３．２倍高く目標設定した。細胞懸濁物を、したがってそれに応じて調整し、また大スケール血小板生成デバイスで使用するために、２００ｍＬの容積に到達するように、ＩＭＤＭ（Ｇｉｂｃｏ Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、３１９８００２２）を用いて補完した。
【0123】
収集された血小板を特徴付けするための方法
収集された血小板を、フローサイトメーターＢＤ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ＰＬＵＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、フランス）を使用して特徴付けた。血小板の表面特異抗原を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４１（αＩＩｂ）およびＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（いずれもＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、フランス）を用いて分析した。血小板を、蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体と共に、暗光内、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＰＥマウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して、コントロールを実施した。血小板を、（ｉ）７μｍより小さいこと（前方散乱特性および校正済みビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国））に基づくゲート化、ならびに（ｉｉ）ＣＤ４１およびＣＤ４２ｂ標識に対する二重陽性（ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋）という獲得事象に従い定義した。
収集された血小板を、フローサイトメーターＢＤ Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｃｃｕｒｉ Ｃ６ ＰＬＵＳ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｌｅ Ｐｏｎｔ ｄｅ Ｃｌａｉｘ、フランス）を使用して特徴付けた。血小板の表面特異抗原を、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４１（αＩＩｂ）およびＲ－フィコエリトリン（ＰＥ）コンジュゲート抗ヒトＣＤ４２ｂ（ＧＰＩｂα）（いずれもＢｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｖｉｌｌｅｐｉｎｔｅ、フランス）を用いて分析した。血小板を、蛍光コンジュゲートモノクローナル抗体と共に、暗光内、室温（ＲＴ）で２０分間インキュベートした。ＦＩＴＣマウスＩｇＧ１（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）、ＰＥマウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用して、コントロールを実施した。血小板を、（ｉ）７μｍより小さいこと（前方散乱特性および校正済みビーズ（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ、Ｌｉｂｅｒｔｙｖｉｌｌｅ、ＩＬ、米国））に基づくゲート化、ならびに（ｉｉ）ＣＤ４１およびＣＤ４２ｂ標識に対する二重陽性（ＣＤ４１＋／ＣＤ４２ｂ＋）という獲得事象に従い定義した。
【0124】
収集された血小板の活性化を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ヒト活性化αＩＩｂβ３（ＰＡＣ１クローン）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびアロフィコシアニン（ＡＰＣ）抗ヒトＣＤ６２Ｐ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、生成終了時（小スケール構成の場合１２０分、および大スケール構成の場合１８０分）に収集された血小板と共に評価した。血小板を、自家製Ｔｙｒｏｄｅのバッファー（１４０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、５．５ｍＭのグルコース、２ｍＭのＣａＣｌ２、ｐＨ７．４（ＮａＯＨを用いて調整））内で活性化し、そしてＰＡＣ１－ＦＩＴＣ、ＣＤ６２Ｐ－ＡＰＣ、およびＣＤ４２ｂ－ＰＥと共に、暗光内、室温で３０分間インキュベートした。（ｉ）４０μＭのトロンビン受容体活性化因子ペプチド－６（［ＴＲＡＰ－６］、Ｂａｃｈｅｍ、Ｂｕｂｅｎｄｏｒｆ、スイス）＋１００μＭのアデノシンジホスフェート（［ＡＤＰ］、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）、または（ｉｉ）ホルボール１２－ミリステート１３－アセテート（［ＰＭＡ］、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて活性化を実施した。コントロールを、Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｓｅｒ（［ＲＧＤＳ］、Ｍｅｒｃｋ Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）、ＰＥマウスＩｇＧ１（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、およびＡＰＣマウスＩｇＧ１（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて実施した。
【0125】
結果
２つの実験を、大スケール構成における回転スピードの効果を試験するために、ならびに大スケール構成および小スケール構成について、その両者を多孔質材料を含め比較するためにも、同一日に連続して実行した。第１の実験では、大スケール構成に導入された、懸濁状態のＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋の合計数は８．１０・１０６個に対して、小スケールにおいては９．８９・１０５個であり、また第２の実験ではそれぞれ９．８２・１０６個と１．１５・１０６個であった。大スケール構成では、ベッドリアクターを、最初に５００ｒｐｍで６０分間、それに後続して９００ｒｐｍで２時間、回転させた。回転スピードを増加させることで、多孔質材料を通じてより高い流体速度が誘発される。ベッドリアクターの回転スピードを増加させると、その結果血小板生成が増加した（図６）：６０分間にわたり、血小板生成の平均増加量は、５００ｒｐｍと比較して９００ｒｐｍにおいて１．９４倍高かった。大スケール構成において９００ｒｐｍで行った実験の２時間の間に、血小板の数が連続的に増加した一方、小スケール構成においては６０～９０分の間に最大の生成に到達し、次に頭打ちとなった。各構成により生成された血小板の最大数を考慮すれば、生成収率、すなわち実験開始時に導入されたＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋の数に対する生成した血小板の数は、小スケール構成よりも大スケール構成において最大６倍高かった（図７）。
２つの実験を、大スケール構成における回転スピードの効果を試験するために、ならびに大スケール構成および小スケール構成について、その両者を多孔質材料を含め比較するためにも、同一日に連続して実行した。第１の実験では、大スケール構成に導入された、懸濁状態のＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋の合計数は８．１０・１０６個に対して、小スケールにおいては９．８９・１０５個であり、また第２の実験ではそれぞれ９．８２・１０６個と１．１５・１０６個であった。大スケール構成では、ベッドリアクターを、最初に５００ｒｐｍで６０分間、それに後続して９００ｒｐｍで２時間、回転させた。回転スピードを増加させることで、多孔質材料を通じてより高い流体速度が誘発される。ベッドリアクターの回転スピードを増加させると、その結果血小板生成が増加した（図６）：６０分間にわたり、血小板生成の平均増加量は、５００ｒｐｍと比較して９００ｒｐｍにおいて１．９４倍高かった。大スケール構成において９００ｒｐｍで行った実験の２時間の間に、血小板の数が連続的に増加した一方、小スケール構成においては６０～９０分の間に最大の生成に到達し、次に頭打ちとなった。各構成により生成された血小板の最大数を考慮すれば、生成収率、すなわち実験開始時に導入されたＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋の数に対する生成した血小板の数は、小スケール構成よりも大スケール構成において最大６倍高かった（図７）。
【0126】
第３の実験は、多孔質材料を有する小スケールデバイスおよび多孔質材料を一切含まない大スケールデバイスにおける血小板生成を比較した。こうすることで、同一の小スケールコントロールを使用しながら、ベッドリアクター内に多孔質材料を添加したときの利益が存在するかどうか間接的に推定することが可能であった。大スケール構成に導入された懸濁状態のＭＫ ＣＤ４１／ＣＤ４２＋の合計数は、１０．７８・１０６個（すなわちこれまでの実験で用いられた数の範囲と同一範囲）であった一方、小スケールでは３．４１・１０６個であった。大スケールデバイスにおいて、ベッドリアクターは９００ｒｐｍで回転した。１２０分間の期間において、血小板生成は、小スケールデバイスと比較して大スケール構成において若干高めであったが（図８）、しかし２構成間の差異は、多孔質材料が大スケール構成に添加されたこれまでの実験において観察された差異よりもかなり小さかった。
【0127】
最初の２つの実験の終了時に（小スケール構成の場合１２０分、および大スケール構成の場合１８０分）、収集された血小板をＴＲＡＰ６＋ＡＤＰまたはＰＭＡを用いて刺激した。活性化のエンドポイント、例えばＰ－セレクチンの表面発現（図９Ａ）や、ＰＡＣ１結合を伴うフィブリノゲン受容体αＩＩｂβ３の活性化（図９Ｂ）等をモニタリングした。両構成から得られた血小板は、そのＰ－セレクチン発現（ＣＤ６２Ｐに対して陽性であること）、およびフィブリノゲン受容体の活性化（ＰＡＣ１に対して陽性であること）を、ベースライン（非刺激状態）と比較して増加させることによる刺激に対して応答した。それに加えて、両活性化マーカーにおいて、多孔質材料を有する大スケール構成において生成した血小板について、小スケール構成と比較してより良好な活性化能が観察され、大スケール構成における生成血小板のより良好な品質が注目される。
【符号の説明】
【0128】
１０ 血小板生成デバイス
１０’ 血小板生成デバイス
１２ 容器
１４ 細胞懸濁物
１６ ベッドリアクター
１８ 中央孔を有するヘッドキャップ
２０ チャンバー
２２ ジャケット
２４ ローターシャフト
２５ アパーチャーを有するコネクター
２６ ローター
２７ カップリング機構
２８ バッフル
３０ 多孔質材料
３２ 外壁上の開口部
３４ 中間壁
３６ 内壁上の開口部
３８ 下流に位置するデバイス
４０ チュービング
４２ ポンプ
１０’ 血小板生成デバイス
１２ 容器
１４ 細胞懸濁物
１６ ベッドリアクター
１８ 中央孔を有するヘッドキャップ
２０ チャンバー
２２ ジャケット
２４ ローターシャフト
２５ アパーチャーを有するコネクター
２６ ローター
２７ カップリング機構
２８ バッフル
３０ 多孔質材料
３２ 外壁上の開口部
３４ 中間壁
３６ 内壁上の開口部
３８ 下流に位置するデバイス
４０ チュービング
４２ ポンプ
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】