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特表2024-509146コロナウイルスに対して保護するためのワクチン産生のための完全合成長鎖核酸

書誌要約請求の範囲詳細な説明課題実施例実施するための形態図面の説明

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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-29

(54)【発明の名称】コロナウイルスに対して保護するためのワクチン産生のための完全合成長鎖核酸

(51)【国際特許分類】

C12N 15/50 20060101AFI20240221BHJP

C12N 15/63 20060101ALI20240221BHJP

C07K 14/165 20060101ALI20240221BHJP

C12P 21/02 20060101ALI20240221BHJP

A61P 31/14 20060101ALI20240221BHJP

A61K 39/215 20060101ALI20240221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/50 ZNA

C12N15/63 Z

C07K14/165

C12P21/02 C

A61P31/14

A61K39/215

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553192

(86)(22)【出願日】2021-09-09

(85)【翻訳文提出日】2023-10-31

(86)【国際出願番号】 EP2021074738

(87)【国際公開番号】W WO2022184287

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】PCT/EP2021/055401

(32)【優先日】2021-03-03

(33)【優先権主張国・地域又は機関】EP

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】522350069

【氏名又は名称】ロケットヴァックスアーゲー

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森規雄

(72)【発明者】

【氏名】クリステン，マティアス

(72)【発明者】

【氏名】クミルジャノビックウラニック，ナタサ

(72)【発明者】

【氏名】クミルジャノビック，ウラジミール

【テーマコード（参考）】

4B064

4C085

4H045

【Ｆターム（参考）】

4B064AG31

4B064AG32

4B064CA19

4B064CC24

4B064CE10

4B064DA01

4C085AA03

4C085BA71

4C085CC01

4C085CC08

4C085DD62

4C085EE01

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA20

4H045AA30

4H045BA10

4H045CA01

4H045DA86

4H045EA20

4H045EA31

4H045FA74

4H045GA21

(57)【要約】

本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２および関連コロナウイルスのエンベロープタンパク質、ウイルスエンベロープおよびウイルスエンベロープの断片を高度に精製された形態で産生するバイオテクノロジー製造プロセスで使用できる完全合成長鎖核酸を記載し、これはワクチンとして、ＣＯＶＩＤ－１９および他のウイルス性疾患に対して保護するものである。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

少なくとも４，０００塩基を有する完全合成長鎖核酸であって、前記核酸が、
ａ）４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも２つを任意の配置で含み、ここで
ｉ）配列部分Ａが、配列番号５０で定義される配列、もしくは配列番号５０で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含み；
ｉｉ）配列部分Ｂが、配列番号４８で定義される配列、もしくは配列番号４８で定義される配列に対して少なくとも９８．３％の配列同一性を有する配列を含み；
ｉｉｉ）配列部分Ｃが、配列番号４９で定義される配列、もしくは配列番号４９で定義される配列に対して少なくとも９７．２％の配列同一性を有する配列を含み；
ｉｖ）配列部分Ｄが、配列番号１７で定義される配列、もしくは配列番号１７で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含むか；または
配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を包含し；
ｂ）１．）ＯＲＦ７ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列部分；および／または
２．）ＯＲＦ３ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列部分を含むことを特徴とする、核酸。

【請求項2】

定義された配列中に少なくとも８，０００塩基、好ましくは少なくとも２０，０００塩基を有することを特徴とする、請求項１に記載の核酸。

【請求項3】

ＯＲＦ関連核酸配列部分を１つ以下で含むか、または全く含まないことを特徴とし、前記ＯＲＦ関連核酸配列部分がＯＲＦ６またはＯＲＦ８によりコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、請求項１または２に記載の核酸。

【請求項4】

ＯＲＦ関連核酸配列部分を含まず、前記ＯＲＦ関連核酸配列部分がＯＲＦ６またはＯＲＦ８によりコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、請求項３に記載の核酸。

【請求項5】

ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、請求項１から４の一項に記載の核酸。

【請求項6】

ａ）配列番号５３によって定義されるＯＲＦ６配列、もしくは配列番号５３と少なくとも９４．１％の配列同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号５５によって定義されるＯＲＦ８配列、もしくは配列番号５５と少なくとも９９％の配列同一性を有する配列をさらに含む、請求項７に記載の核酸。

【請求項7】

配列部分Ａ～Ｃが配列番号１９または対応するリボ核酸配列に対応することを特徴とする、請求項１から６の一項に記載の核酸。

【請求項8】

４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも３つ、または前記配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を有する４つの配列部分のうち少なくとも３つを任意の配置で含むことを特徴とする、請求項１から７のいずれかに記載の核酸。

【請求項9】

４つの配列部分Ａ～Ｄ、または前記配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を有する４つの配列部分を任意の配置で含むことを特徴とする、請求項１から８のいずれかに記載の核酸。

【請求項10】

４つの配列部分Ａ～Ｄのうち２つまたは３つを含むことを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の核酸。

【請求項11】

４つの配列部分Ａ～Ｄのうち３つを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸。

【請求項12】

配列番号２８および／または配列番号２９または対応するリボ核酸配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１から１１の一項に記載の核酸。

【請求項13】

１，０００，０００塩基の最大サイズ、好ましくは２００，０００塩基の最大サイズを有することを特徴とする、請求項１から１２の一項に記載の核酸。

【請求項14】

請求項１から１３の一項に記載の核酸を含むベクター。

【請求項15】

配列番号４６および配列番号４７によって定義される配列を含む、請求項１４に記載のベクター。

【請求項16】

プラスミドベクターである、請求項１４から１５のいずれか一項に記載のベクター。

【請求項17】

請求項１から１３の一項に記載の２つ以上の核酸を含むキット。

【請求項18】

前記核酸が少なくとも１つのプラスミド、好ましくは２つ以上のプラスミドに存在する、請求項１７に記載のキット。

【請求項19】

請求項１４から１６に記載の少なくとも１つのベクターを含む、バイオテクノロジー産生ユニット。

【請求項20】

請求項１４から１６の一項に記載のベクターを使用して、請求項１７または１８の一項に記載のキット、または請求項１９に記載のバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、請求項１から３の一項に記載の少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質であって、請求項１から１３の一項に記載の少なくとも１つの核酸をパッケージングする、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質。

【請求項21】

請求項１から１３の一項に記載の少なくとも１つの核酸と、請求項１４から１６の一項に記載のベクターを使用して、特に請求項２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む産生生物において、請求項１７または１８の一項に記載のキットを使用して、請求項１から１３の一項に記載の少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン。

【請求項22】

タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、またはｄ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含み、
（ｉ）前記タンパク質成分ａが、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１４に記載の配列、もしくは配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１８に記載の配列、もしくは配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）前記タンパク質成分ｂ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号６に記載の配列、もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号２１に記載の配列、もしくは配列番号２１と少なくとも９０％の配列同一性を含み、
（ｉｉｉ）前記タンパク質成分ｃ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｍに類似した配列番号１０に記載の配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質Ｍに類似した配列番号２２に記載の配列、もしくは配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｖ）前記タンパク質成分ｄ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２に記載の配列、もしくは配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２６に記載の配列、もしくは配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列
を含む、請求項２１に記載のワクチン。

【請求項23】

コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）請求項１から１３の一項に記載のヌクレオチド酸配列を、バイオテクノロジー産生ユニット、特に細胞株に導入するステップであって、
前記タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択されるタンパク質成分の少なくとも２つをコードする核酸ベースｍＲＮＡが翻訳により調製される、ステップ、
ｂ）ステップａ）の前記バイオテクノロジー産生ユニットからタンパク質成分を得るステップ、および
ｃ）得られたタンパク質成分を精製して、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップ
を含む、方法。

【請求項24】

請求項２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）請求項１から１３の一項に記載のヌクレオチド酸配列をバイオテクノロジー産生ユニットに導入するステップであって、前記バイオテクノロジー産生ユニットが、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択されるタンパク質成分の少なくとも１つをコードするヌクレオチド酸を含む、ステップ、
ｂ）ステップａ）の前記バイオテクノロジー産生ユニットから、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を得るステップ、ならびに
ｃ）得られたタンパク質成分を精製して、請求項２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップ
を含む、方法。

【請求項25】

コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）請求項１４から１６の一項に記載のベクターを増幅バイオテクノロジー産生ユニットに導入するステップ、
ｂ）前記増幅バイオテクノロジー産生ユニットにおいて、請求項１から１３の一項に記載のヌクレオチド酸を増幅するステップ、
ｃ）ステップｂ）で増幅されたヌクレオチド酸を得るステップ、
ｄ）請求項２３または２４に記載の方法を使用して、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップ
を含む、方法。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

本発明は、独立請求項１に記載の完全合成長鎖核酸に関する。本発明はさらに、これらの核酸の２つ以上と、核酸を含む少なくとも１つのプラスミドを含むバイオテクノロジー産生ユニットとを含むキットに関する。本発明はさらに、前記核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関する。さらに、本発明は、核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物を含むワクチン、特にコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン、ならびにワクチンを産生する方法に関する。

【背景技術】

【0002】

ワクチンの急速な開発および利用可能性は、多くのウイルスおよび細菌と戦う上で重要である。適切なワクチンの産生は、多段階的な、複雑なプロセスであり、高い投資にもかかわらず、常に成功するわけではない。典型的には、適切なワクチンの開発には数年を要する。これらの長期の開発時間は、特に新しく生じる病原体、変異病原体に関する主要な問題からなり、これは、疫学的な観点から、新しい疾患の出現に対して、できたとしても遅すぎる反応しか可能でないためである。対照的に、新しい、または重度に変異した病原体の解析、同定およびさらなる検出は今では、数週間、または数日以内でも可能であり、これは、この１世紀の間での大きな進歩である。

【0003】

この文脈において、ウイルスは特別な標的であるが、これは、ウイルスが他の種からヒトへの拡散を引き起こす高度な変異頻度を保有するためである。これらのウイルスの急速な拡散により、ウイルスは現在の医学に対する主要な課題となっている。現在（２０２０）の、新規に出現したウイルスの検出／同定と、ワクチンの開発の間の通常の時間は、典型的には数年である。わずかな場合、十分に事前知識があれば、試験的なワクチンが数ヶ月以内に供給され得る。しかし、この期間、数千人または数百万人の人々が感染するまでの典型的な時間よりもはるかに長い。このような急速な拡散はまた、現代社会の高い移動性の直接的な結果である。

【0004】

新しいウイルスの同定の直後に、十分な量および最高品質のワクチンが利用可能であり、新しいウイルスの最初の激増地点に何とかして近接した全てのヒトの全国的なワクチン接種が可能であることが理想的である。さらに、このようなワクチンの理想的な方法は、ウイルスの進化および適応に反応できることであろう。このような理想的な産生可能性は、現在の当業者には実現不可能であると考えられる。

【0005】

特に直近の過去では、コロナの大流行によって、ワクチン産生の適切なツールの開発の妥当性が劇的に増大した。コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの開発は、長期間の大流行および関連する世界的な危機を含む証明されている唯一の手段であることは、一致して同意されている。

【0006】

この背景において、本発明の課題は、大量および高品質のコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンの産生を可能にする設備を提供することである。

【0007】

この課題は、請求項１に記載の完全合成長鎖核酸によって解決される。本発明の好ましい実施形態は、実施形態および従属請求項に反映されている。

【発明の概要】

【0008】

したがって、本発明は、とりわけ、以下の実施形態に関する：
１．少なくとも４，０００塩基を有する完全合成長鎖核酸であって、核酸が、
ａ）任意の配置の４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも２つを含み、ここで
ｉ）配列部分Ａが、
ａ）配列番号５０で定義される配列、もしくは配列番号５０で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列；または、
ｂ）配列番号３で定義される配列、もしくは配列番号３で定義される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
ｉｉ）配列部分Ｂが、
ａ）配列番号４８で定義される配列、もしくは配列番号４８で定義される配列に対して少なくとも９８．３％の配列同一性を有する配列；または
ｂ）配列番号７で定義される配列、もしくは配列番号７で定義される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み；
ｉｉｉ）配列部分Ｃが、
ａ）配列番号４９で定義される配列、もしくは配列番号４９で定義される配列に対して少なくとも９７．２％の配列同一性を有する配列；または
ｂ）配列番号１１で定義される配列、もしくは配列番号１１で定義される配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
ｉｖ）配列部分Ｄが、配列番号１７で定義される配列、もしくは配列番号１７で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含むか；または
配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を包含し；
ｂ）１．）ＯＲＦ７ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列部分；および／または
２．）ＯＲＦ３ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列部分を含まないことを特徴とする、長鎖核酸。
２．定義された配列中に少なくとも８，０００塩基、好ましくは少なくとも２０，０００塩基を有することを特徴とする、実施形態１に記載の核酸。
３．１つ以下のＯＲＦ関連核酸配列部分を含むか、または全く含まないことを特徴とし、ＯＲＦ関連核酸配列部分が、ＯＲＦ６またはＯＲＦ８によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、実施形態１または２に記載の核酸。
４．ＯＲＦ関連核酸配列部分を含まず、ＯＲＦ関連核酸配列部分が、ＯＲＦ６またはＯＲＦ８によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、実施形態３に記載の核酸。
５．ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、実施形態１～４の１つに記載の核酸。
６．ａ）配列番号５３によって定義されるＯＲＦ６配列、もしくは配列番号５３と少なくとも９４．１％の配列同一性を有する配列、および／または
ｂ）配列番号５５によって定義されるＯＲＦ８配列、もしくは配列番号５５と少なくとも９９％の配列同一性を有する配列をさらに含む、実施形態７に記載の核酸。
７．配列部分Ａ～Ｃが配列番号１９に記載の配列または対応するリボ核酸配列に対応することを特徴とする、実施形態１～６の１つに記載の核酸。
８．４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも３つ、または配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を有する４つの配列部分のうち少なくとも３つを任意の配置で含むことを特徴とする、実施形態１～７のいずれかに記載の核酸。
９．４つの配列部分Ａ～Ｄ、または配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を有する４つの配列部分を任意の配置で含むことを特徴とする、実施形態１～８のいずれかに記載の核酸。
１０．４つの配列部分Ａ～Ｄのうち２つまたは３つを含むことを特徴とする、実施形態１～６のいずれか１つに記載の核酸。
１１．核酸が、４つの配列部分Ａ～Ｄのうち３つを含むことを特徴とする、実施形態１０に記載の核酸。
１２．配列番号１５
配列番号２８
配列番号２９および
配列番号３０
からなる少なくとも１つの配列をさらに含むか、または
配列番号１５、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０の配列部分によるデオキシリボ核酸配列または対応するリボ核酸配列の１つを含むことを特徴とする、実施形態１～１１の１つに記載の核酸。
１３．１，０００，０００塩基の最大サイズ、好ましくは２００，０００塩基の最大サイズを有することを特徴とする、実施形態１～１２の１つに記載の核酸。
１４．実施形態１～１３の１つに記載の核酸を含むベクター。
１５．配列番号４６および配列番号４７によって定義される配列を含む、実施形態１４に記載のベクター。
１６．プラスミドベクターである、実施形態１４～１５のいずれか１つに記載のベクター。
１７．実施形態１～１３の１つに記載の２つ以上の核酸を含むキット。
１８．核酸が少なくとも１つのプラスミド、好ましくは２つ以上のプラスミドに存在する、実施形態１７に記載のキット。
１９．実施形態１４～１６に記載の少なくとも１つのベクターを含む、バイオテクノロジー産生ユニット。
２０．実施形態１４～１６の１つに記載のベクターを使用して、実施形態１７または１８のいずれかに記載のキット、または実施形態１９に記載のバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、実施形態１～３の１つに記載の少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質であって、実施形態１～１３の１つに記載の少なくとも１つの核酸をパッケージングする、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質。
２１．実施形態１～１３の１つに記載の少なくとも１つの核酸と、実施形態１４～１６の１つに記載のベクターを使用して、特に実施形態２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む産生生物において、実施形態１７または１８の１つに記載のキットを使用して、実施形態１～１３の１つに記載の少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチン。
２２．タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含み、
（ｉ）タンパク質成分ａが、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１４に記載の配列、もしくは配列番号１４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１８に記載の配列、もしくは配列番号１８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）タンパク質成分ｂ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号６に記載の配列、もしくは配列番号６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号２１に記載の配列、もしくは配列番号２１と少なくとも９０％の配列同一性を含み、
タンパク質成分ｂ２が、ＭＨＶ５９Ａのエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号８に記載の配列、もしくは配列番号８と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含み、
（ｉｉｉ）タンパク質成分ｃ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｍに類似した配列番号１０に記載の配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質Ｍに類似した配列番号２２に記載の配列、または配列番号２２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
タンパク質成分ｃ２が、ＭＨＶ５９Ａの膜タンパク質Ｍに類似した配列番号１２に記載の配列、もしくは配列番号１２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含み、
（ｉｖ）タンパク質成分ｄ１が、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２に記載の配列、もしくは配列番号２と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２６に記載の配列、もしくは配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、
タンパク質成分ｄ２が、ＭＨＶ５９Ａのヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号４に記載の配列、もしくは配列番号４と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含む、実施形態２１に記載のワクチン。
２３．コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）実施形態１～１３の１つに記載のヌクレオチド酸配列を、バイオテクノロジー産生ユニット、特に細胞株に導入するステップであって、
タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択されるタンパク質成分の少なくとも２つをコードする核酸ベースｍＲＮＡが翻訳により調製される、ステップ、
ｂ）ステップａ）のバイオテクノロジー産生ユニットからタンパク質成分を得るステップ、および
ｃ）得られたタンパク質成分を精製して、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップ
を含む、方法。
２４．実施形態２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）実施形態１～１３の１つに記載のヌクレオチド酸配列をバイオテクノロジー産生ユニットに導入するステップであって、バイオテクノロジー産生ユニットが、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択されるタンパク質成分の少なくとも１つをコードするヌクレオチド酸を含む、ステップ、
ｂ）ステップａ）のバイオテクノロジー産生ユニットから、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を得るステップ、ならびに
ｃ）得られたタンパク質成分を精製して、実施形態２０に記載のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップ
を含む、方法。
２５．コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを産生する方法であって、以下の連続的なステップ：
ａ）実施形態１４～１６の１つに記載のベクターを増幅バイオテクノロジー産生ユニットに導入するステップ、
ｂ）増幅バイオテクノロジー産生ユニットにおいて、実施形態１～１３の１つに記載のヌクレオチド酸を増幅するステップ、
ｃ）ステップｂ）で増幅されたヌクレオチド酸を得るステップ、
ｄ）実施形態２３または２４に記載の方法を使用して、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンを得るステップを含む、方法。

【図面の簡単な説明】

【0009】

【図1】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）（配列番号３５）、エンベロープタンパク質（Ｅ）（配列番号３６）、膜タンパク質（Ｍ）（配列番号３７）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）（配列番号３８）をコードするモノシストロン発現プラスミドのプラスミドマップ。プラスミドマップ内側の数字は、ＤＮＡの塩基対座標を示す。Ｎ、Ｅ、Ｍ、およびＳのタンパク質コード配列は矢印で表されており、配列表に記載されている配列番号１、２、３、および４（Ｎ）、５、６、７、および８（Ｅ）、９、１０、１１、および１２（Ｍ）、１３、および１４（Ｓ）のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表している。

【図2】実施例２に示すように、モノシストロン発現プラスミドｐｃＤＮＡ３４ｓｙｎＮ（配列番号３５）（下図）と共に細胞株におけるワクチン産生に使用できるポリシストロン発現構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮ（配列番号３３および３９）（上図）のゲノムマップ。数字は、ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮについてのキロベース（Ｋ）でのＤＮＡ座標を指し、ｐｃＤＮＡ３４ｓｙｎＮ構築物（配列番号３５）についての塩基対の位置を指す。ポリタンパク質１ａ、１ｂ、Ｅ、ＭＳ（上図）およびヌクレオキャプシドタンパク質ｓｙｎＮ（下図）のタンパク質コード配列は矢印で表されている。

【図3】ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）のモノシストロンのプラスミドベースの発現構築物のアガロースゲル電気泳動サイズ分離。ゲルの左側は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）および膜タンパク質（Ｍ）に対するＭＨＶＡ５９（ＭＨＶ）由来の構築物を示す。ゲルの右側は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に基づいて得られた構築物を示す。

【図4】環状の４０，５５６ｂｐのＤＮＡ構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮ（配列番号４０）（上図）および３８，３８３ｂｐのＤＮＡ構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮΔＨＥ（配列番号４０）（下図）の対応するＤＮＡ配列決定カバーグラフを有する模式図。矢印は、複製ポリタンパク質１Ａ、１Ｂ（１Ａ、１Ｂ）、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、スパイク糖タンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および膜タンパク質（Ｍ）のＣＤＳを再構成したタンパク質コード配列の位置を示す。ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮおよびＣＯＶＡＸ１９１ΔＮΔＨＥの完全なゲノムは、単一の酢酸リチウム酵母形質転換を用いて６つの合成ＤＮＡブロックからアセンブルし、補助栄養ＵＲＡ３マーカーで選択した。

【図5】ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムおよび作製した欠失バリアントの模式図。

【図6】ＯＲＦ７ａのトランス相補的発現のためのｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）＿ＯＲＦ７ａのベクターマップ（配列番号６１）

【図7】表Ｓ１：サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）（酵母）におけるＣＯＶＡＸ１９１のＤＮＡアセンブリ効率

【発明を実施するための形態】

【0010】

したがって、本発明は、少なくとも４，０００塩基を有する完全合成長鎖核酸であって、核酸が、４つの配列部分Ａ－Ｄの少なくとも２つを任意の配置で含み、ｉ）配列部分Ａが、ａ）配列番号１で定義される配列、もしくは配列番号１で定義される配列と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列、またはｂ）配列番号３で定義される配列、もしくは配列番号３で定義される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、ｉｉ）配列部分Ｂが、ａ）配列番号５で定義される配列、もしくは配列番号５で定義される配列と少なくとも９８．３％の配列同一性を有する配列、またはｂ）配列番号７で定義される配列、もしくは配列番号７で定義される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、ｉｉｉ）配列部分Ｃが、ａ）配列番号９で定義される配列、もしくは配列番号９で定義される配列と少なくとも９７．２％の配列同一性を有する配列、またはｂ）配列番号１１で定義される配列、もしくは配列番号１１で定義される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、ｉｖ）配列部分Ｄが、配列番号１３で定義される配列、もしくは配列番号１３で定義される配列と少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含むか、または配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸に対応するリボ核酸配列を包含することを特徴とする、核酸に関する。

【0011】

特定の実施形態において、本発明は、少なくとも４，０００塩基を有する完全合成長鎖核酸に関し、核酸は、ａ）４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも２つを任意の配置で含み、ｉ）配列部分Ａは、配列番号５０で定義される配列、もしくは配列番号５０で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含み；ｉｉ）配列部分Ｂは、配列番号４８で定義される配列、もしくは配列番号４８で定義される配列に対して少なくとも９８．３％の配列同一性を有する配列を含み；ｉｉｉ）配列部分Ｃは、配列番号４９で定義される配列、もしくは配列番号４９で定義される配列に対して少なくとも９７．２％の配列同一性を有する配列を含み；ｉｖ）配列部分Ｄは、配列番号１７で定義される配列、または配列番号１７で定義される配列に対して少なくとも９８．５％の配列同一性を有する配列を含むか；または配列部分Ａ～Ｄによるデオキシリボ核酸配列に対応するリボ核酸配列を包含する；およびｂ）１．）核酸配列部分は、ＯＲＦ７ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする；および／または２）核酸配列部分は、ＯＲＦ３ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする。

【0012】

本発明による核酸によって、言及されたワクチンの産生を有意に加速させることが可能になり、これは、ウイルスまたは変異に対して、特にコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して、非常に特異的な明確に定義されたワクチンをもたらす。

【0013】

以下にさらに示すように、本発明による核酸配列において構成される配列部分の特異的な配列特徴によって、核酸が完全合成によって、したがってオーダーメイドで産生されることが可能になる。本発明による核酸は、そのため、特定の実施形態においてＲＮＡではなくＤＮＡであることのみならず、天然に存在する配列と対照的に、化学的合成によって核酸の完全合成産生が可能になっている配列においても、コロナウイルスに天然に存在する核酸とは異なるものである。

【0014】

したがって、最終的に、本発明による核酸によって、分子的な精度で定義されているタンパク質成分を発現することが可能になる。これらのタンパク質成分がワクチンとして投与されると、最適な免疫化がそれによってワクチンレシピエントにおいて得られる。同時に、可能性のある副作用の危険性は、定義が不正確なタンパク質成分に高度に蔓延しているものであるが、これが大幅に最小化される。また、タンパク質発現に使用される一般的な発現システムを利用してタンパク質成分が産生され得るということは、ワクチンが大量に非常に迅速に産生され得ることを意味する。これは、コロナウイルスＳＡＲＳ－Ｃｏｖ－２のような、拡散によって大流行の比率が想定され、そのため封じ込めに広範なワクチン投与が必要なウイルスにとっては非常に重要なことである。

【0015】

以下の用語および概念を本発明の文脈で使用するものとする：

【0016】

用語「核酸」は、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびその任意の修飾のいずれかを指す。核酸は、一本鎖であっても二本鎖であってもよい。修飾は、さらなる電荷、分極率、水素結合、静電気相互作用および流動性を核酸リガンド塩基または核酸リガンド全体に取り込む他の化学基を提供するものを含むが、これに限定されない。そのような修飾としては、２’－位糖修飾、５－位ピリミジン修飾、８－位プリン修飾、環外アミンにおける修飾、４－チオウリジンの置換、５－ブロモまたは５－ヨード－ウラシルの置換、骨格修飾、メチル化、異常な塩基対の組合せ、例えばイソ塩基イソシチジンとイソグアニジンが挙げられるが、これらに限定されない。修飾としてはまた、キャッピング等の３’および５’修飾も含まれ得る。

【0017】

完全合成。化学的な観点からは、核酸は、反復単位、所謂塩基を有する非常に洗練された分子である。本文脈における、用語「完全合成」は、本発明による核酸は、化学的試薬を使用した一連の化学反応ステップによって産生されることを意味する。酵素等の生化学補助剤は、また、個々の後期産生ステップ、例えば既に長いオリゴマーの接合の間にも使用し得る。後者は、同様に任意に合成性であり得る。完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、以下の配列特徴の１つまたは複数において天然に存在する核酸とは異なる配列特徴を有する：
ｉ）当業者にとって公知である、１つまたは複数の制限酵素部位、特にＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼの制限酵素部位が存在しないこと、
ｉｉ）対応する天然に存在する核酸と比較して、完全合成核酸内に９を超える同一塩基の連続単位を有する反復核酸配列が存在しないか、または頻度が減少していること、
ｉｉｉ）対応する天然に存在する核酸と比較して、１２を超える塩基を有する反復塩基対配列が存在しないか、または頻度が減少していること、
ｉｖ）対応する天然に存在する核酸と比較して、その逆相補的配列として、当業者に公知の１２を超える塩基単位からなる間接的反復塩基対セグメントが存在しないか、または頻度が減少していること、
ｖ）対応する天然に存在する核酸と比較して、当業者に公知の９を超える連続的な重複塩基単位（ジヌクレオチド反復）の反復を有する核酸配列が存在しないか、または頻度が減少していること、および
ｖｉ）対応する天然に存在する核酸と比較して、当業者に公知の５を超える連続的な三重塩基単位（トリヌクレオチド反復）の反復を有する核酸配列が存在しないか、または頻度が減少していること。

【0018】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、Venetz, J. E., et al. , 2019, Proceedings of the National Academy of Sciences, 116(16), 8070-8079および／またはそのＳＩ添付に記載の方法にしたがって、部分的に産生されるか、および／または配列特徴を含む。

【0019】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、上述の配列特徴、特に上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ）の２つ以上において天然に存在する核酸と異なる配列特徴を含む。

【0020】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、上述の配列特徴、特に上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ）の３つ以上において天然に存在する核酸と異なる配列特徴を含む。

【0021】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、上述の配列特徴、特に上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ）の４つ以上において天然に存在する核酸と異なる配列特徴を含む。

【0022】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、上述の配列特徴、特に上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ）の５つ以上において天然に存在する核酸と異なる配列特徴を含む。

【0023】

いくつかの実施形態において、完全合成核酸は、化学的産生プロセスを可能にし、上述の配列特徴、特に上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ）の６つにおいて天然に存在する核酸と異なる配列特徴を含む。長鎖オリゴヌクレオチドは、長年、短い断片、典型的には６０、１００または２００塩基の産生断片で市販されていた。大幅に長いオリゴヌクレオチドは、容易には入手可能ではなく、これは、今日使用されている合成は、長い核酸を適切な量産生するにはエラー率が高すぎるためである。１０００塩基未満のそのような断片はしたがって、短鎖と呼ばれ、一方で１０００塩基以上の核酸は長鎖と呼ばれる。１０００～５０００塩基の長鎖核酸は、現在では相当な費用で（例えば、ＴｗｉｓｔＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｌｉｆｅ－ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって）産生し得る。５０００塩基を超える長鎖核酸は、非常に複雑であるが、化学的に明確に定義された分子である。それぞれの分子は、位置、種類、分子の他の部分との結合によって、古典的な有機化学の観点から完全に記載することができる。したがって、２つの同一の長鎖核酸は、その大きさおよび数万から数百万の原子を含んでいるという事実にもかかわらず、全ての成分が同一であり、同一に連結しているという点で、同一である。

【0024】

核酸合成時の末端基、保護基の任意の残基、その他の補助剤についての説明。上述の記載は、核酸中の塩基の種類に言及したものである。当業者は、合成が末端で切断される様々な補助剤を用いて行われることを認識している。しかし、時にはそのような基の残基が残るか、または分子の他の部分が合成段階の前または後に誘導体化される。そのような基は当業者に知られており、特に、ポリＡテール、修飾ＤＮＡ塩基、固相合成からの切断可能なリンカー、ビオチンまたはストレプトアビジン等の生化学基、およびその他のものが含まれる。

【0025】

他の可能な修飾および標準的な方法で使用される修飾は、蛍光マーカーに関する。これらの修飾またはその残基は、上述の記載に影響を及ぼすべきではなく、同一の核酸群は、位置および塩基の種類ごとにその位置のｎ個の塩基が全ての塩基に対して同一であれば、同一であるとみなされるべきである。言い換えれば、本発明の核酸は、本発明が必要とする塩基配列を有していれば、上記の修飾または残基を有する核酸も含むものである。

【0026】

したがって、第１の態様によれば、本発明は、特別な特性を有する核酸に関する。これらの特別な特性は、塩基配列、すなわち配列において構成され、本発明の核酸が特定の特性を有する場合にのみ得られるものである。これらの特性は、直接的には特定の分子の部分であるか、または特定の分子の包括的な化学的な記載全体である。しかし、簡略化のため、本文の記載では塩基配列を示し、常に特定の分子を意味していることを明確にする。したがって、塩基配列は実用的な記述形態に過ぎず、分子またはそのｌＵＰＡＣ名を直接示すよりも、明らかに本発明の文章表現により適している。

【0027】

本発明の分子は、特定の配列の存在によって特別な特性を獲得するが、これは、化学において通常「Ｒ」と略記され、その後「Ｒ」を記載することによってより詳細に記載することができる、１つまたは複数の分子部分を有する古典的な化学剤群の記述に類似している。したがって、本発明では、有機化学におけるこの通常の手順と類似して、本発明の長鎖完全合成核酸の特別な特性の原因となる配列群が記載される。

【0028】

本発明の核酸は、コロナウイルスのエンベロープタンパク質の４種類のタンパク質のうち、少なくとも２種類のタンパク質をコードする完全合成核酸を含むことを特徴とする。

【0029】

用語「コロナウイルスのエンベロープタンパク質の種類」は、本明細書で使用する場合、コロナウイルスのＡ群、Ｂ群、Ｃ群、またはＤ群のタンパク質を指す。用語「Ａ群」タンパク質は、本明細書で使用する場合、コロナウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ型）の群を指す。用語「Ｂ群」は、本明細書で使用する場合、コロナウイルスのエンベロープタンパク質（Ｅ型）の群を指す。用語「Ｃ群」タンパク質は、本明細書で使用する場合、コロナウイルスの膜タンパク質（Ｍ型）を指す。用語「Ｄ群」タンパク質は、本明細書で使用する場合、コロナウイルスのグリコシル化表面タンパク質（Ｓ型）を指す。

【0030】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載された核酸は、少なくとも１つのＡ群タンパク質と少なくとも１つのＢ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、少なくとも１つのＡ群タンパク質と少なくとも１つのＣ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、少なくとも１つのＡ群タンパク質と少なくとも１つのＤ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、少なくとも１つのＢ群タンパク質と少なくとも１つのＣ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、少なくとも１つのＢ群タンパク質と少なくとも１つのＤ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の核酸は、少なくとも１つのＣ群タンパク質と少なくとも１つのＤ群タンパク質とをコードする核酸を含むことを特徴とする。

【0031】

いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、
（ａ）明確に定義された塩基配列の４，０００塩基超を含み、
（ｂ）コロナウイルスの４種類のエンベロープタンパク質をコードする４つの配列群Ａ～Ｄに割り当てられた、特に重要な４つの配列のうち少なくとも２つを含み、ここで、
ｉ）第１の配列群Ａは、コロナウイルスのヌクレオキャプシドタンパク質Ｎのエンベロープタンパク質をコードし、
ｉｉ）第２の配列群Ｂは、コロナウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ型のエンベロープタンパク質をコードし、
ｉｉｉ）第３の配列群Ｃは、コロナウイルスの膜タンパク質Ｍ型のエンベロープタンパク質をコードし、
ｉｖ）第４の配列群Ｄは、コロナウイルスのグリコシル化表面タンパク質Ｓのエンベロープタンパク質をコードする
ことを特徴とする。

【0032】

本明細書で開示される配列部分Ａは、配列番号１または配列番号３に記載の配列を含み、配列番号２または配列番号４に記載の対応するタンパク質配列をコードしている。いくつかの実施形態において、配列番号５０によって定義される配列、または配列番号５０と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0033】

いくつかの実施形態において、配列部分Ａは、配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0034】

いくつかの実施形態において、配列部分Ａは、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0035】

いくつかの実施形態において、配列部分Ａは、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0036】

いくつかの実施形態において、配列部分Ａは、配列番号２および配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0037】

本明細書中に開示される配列部分Ｂは、配列番号５または配列番号７に記載の配列を含み、配列番号６または配列番号８に記載の対応するタンパク質配列をコードしている。いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号４８によって定義される配列、または配列番号４８と少なくとも９８．３％、少なくとも９８．６％、少なくとも９９．１％、または少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列を含む。

【0038】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号７と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0039】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0040】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0041】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号６および配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0042】

本明細書内で開示される配列部分Ｃは、配列番号９または配列番号１１に記載する配列を含み、配列番号１０または配列番号１２に記載する対応するタンパク質配列をコードしている。いくつかの実施形態において、配列部分Ｃは、配列番号４９によって定義される配列、または配列番号４９と少なくとも９７．２％、少なくとも９７．４％、少なくとも９７．６％、少なくとも９７．８％、少なくとも９８％、少なくとも９８．２％、少なくとも９８．４％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．６％、または少なくとも９９．８％の配列同一性を有する配列を含む。

【0043】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｃは、配列番号１１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。

【0044】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0045】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0046】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号１０および配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0047】

本明細書中に開示される配列部分Ｄは、配列番号１３に記載する配列を含み、これは配列番号１４に記載する対応するタンパク質配列をコードしている。いくつかの実施形態において、配列部分Ｄは、配列番号１７によって定義される配列、もしくは配列番号１７と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0048】

いくつかの実施形態において、配列部分Ｂは、配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含む。

【0049】

参照配列に対する用語「パーセント（％）配列同一性」は、配列のアラインメントを行い、最大パーセント配列同一性を達成するために必要であればギャップを導入した後の、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない場合の、参照配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基と同一である候補配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基のパーセント比率として定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のアライメントは、当業者の範囲内である様々な方法、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ－２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等の公に利用できるコンピューターソフトウェアを使用して達成できる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大限のアライメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアライメントするための適切なパラメータを決定することができる。

【0050】

いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド酸配列は、タンパク質生成物の特性を変更することなく、または実質的に変更しないことにより（例えば、ヌクレオチド酸配列またはその生成物の産生プロセスを促進するために）変更される。

【0051】

いくつかの実施形態において、本発明のヌクレオチド酸配列の変更は、以下の群から選択される少なくとも１つの変更を含む：
１）タンパク質生成物の特性を変更しない、または実質的に変更することがない、参照配列に対する塩基置換、挿入、または欠失、
２）コドンを同義形で置き換えること、および
３）（代替）ＯＲＦ、予測される遺伝子内部転写開始点、および／または翻訳速度を微調整する配列モチーフ（予測または潜在）（例えば、リボソーム停止モチーフ）等のタンパク質コード配列内に存在する仮説的遺伝エレメントの数の減少。

【0052】

本発明の変更されたヌクレオチド酸配列の遺伝子が機能的であり続けるかどうかを試験することにより、アミノ酸コードを超える追加情報が適切に機能するために必要とされる遺伝子を同定することができる。

【0053】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヌクレオチド酸配列は、コードされたタンパク質生成物の生物学的機能を改善するために変更される。

【0054】

このような生物学的機能としては、安定性の向上、産生の促進（例えば、追加の複製開始配列の挿入）、複製制限が挙げられるが、これらに限定されない。

【0055】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヌクレオチド酸配列は、類似の構造を有するが、変異ウイルスのタンパク質の機能等、代替の生物学的機能を有する少なくとも１つの目的の代替タンパク質をコードするように変更される。

【0056】

当業者は、目的の少なくとも１つの代替タンパク質をコードする配列（例えば、変異ウイルスのヌクレオチド酸配列）を解析し、関連する変更（例えば、変異）を本明細書に記載する最も類似したヌクレオチド酸配列に実施することにより、そのような変更されたヌクレオチド配列を得ることができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される最も類似したヌクレオチド酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、および／または配列番号１７により定義される配列である。

【0057】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される最も類似したヌクレオチド酸配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、配列番号１３によって定義される配列である。

【0058】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるコロナウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、系統Ｂ．１．１．２０７、系統Ｂ．１．１．７、クラスター５、５０１Ｍ２バリアント、系統Ｐ．１、系統Ｂ．１．４２９／ＣＡＬ．２０Ｃおよび系統Ｂ．１．５２５からなる群から選択されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントである。

【0059】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、群１９Ａ、２０Ａ、２０Ｃ、２０Ｇ、２０Ｈ、２０Ｂ、２０Ｄ、２０Ｆ、２０Ｉ、および２０Ｅから選択されるＮｅｘｔｓｔｒａｉｎクレイドによって記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントである。

【0060】

いくつかの実施形態において、目的の少なくとも１つの代替タンパク質をコードする配列は、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに特徴的なタンパク質をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントに特徴的なタンパク質は、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２および／または配列番号２６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列によってコードされるタンパク質である。

【0061】

この関連する変更の実施は、例えば、本明細書に記載されるヌクレオチド酸配列のパーセント比率を超えない、少なくとも１つの塩基の挿入、欠失、置換、および／または修飾により達成することができる。

【0062】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される最も類似したヌクレオチド酸配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、および／または配列番号１７によって定義される配列である。

【0063】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載される最も類似したヌクレオチド酸配列は、配列番号１、配列番号５、配列番号９、および／または配列番号１３によって定義される少なくとも１つの配列である。

【0064】

いくつかの実施形態において、挿入、欠失、または修飾は、本明細書に記載される化学試薬を用いた一連の化学反応ステップを用いた本発明の核酸のデノボ合成によって達成され得る。

【0065】

変更された配列は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、および／または配列番号１７によって定義されるヌクレオチド酸配列と比較して、より多い位置または異なる位置における変更された配列の化学的産生プロセスを可能にするおよび／または改善する配列特徴（例えば、上述の配列特徴ｉ）～ｖｉ））を含んでいてもよい。

【0066】

ＩＵＰＡＣ分類可能な分子へのそれらの可能な変換は、当業者には知られている。上記で定義されたデオキシリボ核酸の代替として、対応するリボ核酸も存在し得る。言い換えれば、配列部分Ａ～Ｄに記載するデオキシリボ核酸配列に加えて、本発明による定義は、対応するリボ核酸配列も含む。これらにおいて、対応するリボ核酸は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換された上記定義の配列部分を有する。

【0067】

ＭＨＶおよびＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳをコードする本発明の長鎖核酸の塩基対配列、および、該当する場合には、ＭＨＶのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼは、第１のステップにおいて、遺伝暗号の冗長性を考慮して、対応するタンパク質の天然のアミノ酸配列から出発する計算によって、多数の配列バリアントが形成される複雑な開発の結果を表している。

【0068】

特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のタンパク質Ｅ、Ｍ、Ｎおよび／またはＳをコードする本発明の長鎖核酸の塩基対配列は、第１のステップにおいて、遺伝暗号の冗長性を考慮して、対応するタンパク質の天然のアミノ酸配列から出発する計算によって、多数の配列バリアントが形成される複雑な開発の結果を表している。

【0069】

結果として得られた配列樹から、第２のステップにおいて、第１に、生物学的機能性の観点で天然配列に最も類似し、第２に、化学的産生プロセスを可能にする最適な配列特性をも有する、コードされた各エンベロープタンパク質のそれぞれについての塩基対配列が決定された。

【0070】

さらに、この配列は、野生型ウイルスの構造タンパク質を組み合わせてコードしている。これにより、Ｔ細胞エピトープを含む免疫系にとって利用可能な広範なエピトープが可能になる（例えば、Grifoni, A., et al. , 2020, Cell, 181(7), 1489-1501を参照）。この広範のエピトープによって、既存の免疫の有無にかかわらず、患者における広範なウイルスバリアントに対する免疫が可能になり得る。

【0071】

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、本発明の核酸が、制限された複製能を有するが元のウイルスと同様の抗原効果を有する組合せウイルス様タンパク質を効率的に産生することを可能にするという知見に基づくものである。

【0072】

前述のように、本発明による核酸は、少なくとも４，０００塩基または塩基対を有する。好ましくは、少なくとも８，０００塩基、特に好ましくは少なくとも２０，０００塩基を、定義された配列で有する。さらに、核酸は、１，０００，０００塩基の最大サイズ、好ましくは２００，０００塩基の最大サイズを有することが好ましい。

【0073】

大きな配列は、産生、増幅および／または発現が困難であることが繰り返し示されているが、塩基数が多いことは、元のウイルスと類似の抗原効果を有するウイルス様タンパク質の特定の組合せを一貫して産生するために有益である。

【0074】

本明細書で提供される手段および方法によって、本発明による核酸をある長さの範囲で産生することができる（例えば、実施例１～３を参照）。

【0075】

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、特定の長さ範囲の長さを有する本発明の核酸が、制限された複製能を有するが、元のウイルスと類似の抗原効果を有する組合せウイルス様タンパク質を効率的に産生することを可能にするという知見に基づいている。

【0076】

本発明による核酸は、単一の長鎖核酸の形態で存在しても、個別の長鎖核酸に分割されていてもよい。

【0077】

いくつかの実施形態において、本発明による核酸は、単一の長鎖核酸の形態で存在しても、または最大４つの個別の長鎖核酸に分割されていてもよい。

【0078】

個別の長鎖核酸への分離は、本発明の核酸の増幅を促進し得る（実施例３）。

【0079】

さらなる好ましい実施形態によれば、配列部分Ａ～Ｄは、配列番号１６の配列にしたがって配置される。

【0080】

また、配列部分Ｄが配列番号１７からなり、配列番号１８に記載のタンパク質配列をコードすることが好ましい。

【0081】

さらなる好ましい実施形態によれば、配列部分Ａ～Ｃは、配列番号１９の配列にしたがって配置され、それによって配列部分Ａは、配列番号２６に記載のタンパク質配列をコードし、配列部分Ｂは、配列番号２１に記載のタンパク質配列をコードし、配列部分Ｃは、配列番号２２に記載のタンパク質配列をコードし、さらに配列部分Ａ～Ｃは、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５および配列番号２７をコードする配列によって拡張されていてもよい。

【0082】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明によるヌクレオチド酸配列であって、配列番号１９または対応するリボ核酸配列と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列によって定義される、ヌクレオチド酸配列に関する。

【0083】

本明細書内に開示される配列部分Ａ～Ｄに、配列番号１５または配列番号３０に記載の、コロナウイルスのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの配列番号３１および配列番号３２に記載の、ポリタンパク質をコードする配列を含む、配列部分Ｅの核酸配列を補充することが特に好ましい。

【0084】

配列番号１５または配列番号３０に記載の配列は、本発明による核酸の構成要素を表し、したがって、配列部分Ａ～Ｄの２つ以上の配列と組み合わせて同一分子内に存在することができる。また、独立した分子の構成要素として、本発明による核酸とともにキット中に存在することも考えられる。ＩＵＰＡＣ分類可能な分子への可能な移行は、当業者に知られている。

【0085】

配列部分Ｅの存在は、対応するタンパク質の遺伝子発現のために、ＲＮＡがＤＮＡプラスミドの代わりにバイオテクノロジー産生ユニットに導入される場合に関連するものである。この点で、配列部分Ｅが、配列番号３３または配列番号３４に記載のＲＮＡの形態でキットに導入され、キット中に存在することも考えられる。これは、以下の具体的な実施例との関連でさらに説明する。

【0086】

これらの具体的な配列は、第１に天然配列との類似性またはその生物学的機能性に関して、第２に化学的産生プロセスに関して特に好都合であることが示されている。

【0087】

他の好ましい実施形態によれば、核酸は、４つの配列部分Ａ～Ｄのうち少なくとも３つを任意の配置で含む。この点において、核酸が、４つの配列部分Ａ～Ｄを任意の配置で含むことが特に好ましい。

【0088】

特定の実施形態において、本発明は、４つの配列部分Ａ～Ｄのうち２つまたは３つを含むことを特徴とする、本発明による核酸に関する。

【0089】

特定の実施形態において、本発明は、４つの配列部分Ａ～Ｄのうち３つを含むことを特徴とする、本発明による核酸に関する。

【0090】

したがって、いくつかの実施形態において、配列は、野生型ウイルスの２つまたは３つの構造タンパク質またはそれと同等の機能を有するタンパク質の組合せをコードする。これにより、Ｔ細胞エピトープを含む免疫系は広範囲のエピトープを利用可能にできる（例えば、Grifoni, A.et al., 2020, Cell, 181(7), 1489-1501を参照）。この広範なエピトープは、既存の免疫の有無にかかわらず、患者において広範なウイルスバリアントに対する免疫を可能にし得る。

【0091】

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、本発明の核酸が、制限された複製能を有するが元のウイルスと同様の抗原効果を有する組合せウイルス様タンパク質の効率的産生を可能にするという知見に基づくものである。

【0092】

さらに、核酸が、
配列番号１５
配列番号２８
配列番号２９および
配列番号３０
の群からなる少なくとも１つの配列をさらに含むことが好ましい。

【0093】

いくつかの実施形態において、本発明の核酸は、配列番号１５、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０の配列部分によるデオキシリボ核酸配列または対応するリボ核酸配列の１つを含む。

【0094】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２８、または対応するリボ核酸配列を含むことを特徴とする、本発明による核酸に関する。

【0095】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２９、または対応するリボ核酸配列を含むことを特徴とする、本発明による核酸に関する。

【0096】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２８および配列番号２９、または対応するリボ核酸配列を含むことを特徴とする、本発明による核酸に関する。

【0097】

本発明の核酸は、標準的な方法によって細胞株または他の産生生物に組み込み、ウイルスの断片またはエンベロープ全体の産生を刺激することができるという特別な性質を有する。この目的のために必要な標準的な方法は、当業者に知られており、具体例の文脈で記載される。

【0098】

特定の実施形態において、本発明は、１つ以下のＯＲＦ関連核酸配列部分を含むか、または全く含まないことを特徴とし、各ＯＲＦ関連核酸配列部分が、ＯＲＦ６またはＯＲＦ８によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、本発明の核酸に関する。

【0099】

いくつかの実施形態において、本発明は、１つのＯＲＦ関連核酸配列部分を含むことを特徴とし、各ＯＲＦ関連核酸配列部分が、ＯＲＦ６またはＯＲＦ８によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、本発明の核酸に関する。

【0100】

本発明者らは、元のウイルスの効果的な複製可能性に有用であると考えられる特定のＯＲＦが省略されているにもかかわらず、ウイルス粒子が増幅され、次いで翻訳されてアセンブリが成功し得ることを見出した。結果として得られたウイルス粒子は、依然として細胞に感染することができ、非感染性ウイルス断片の産生を誘導することができる。

【0101】

本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノム（図５参照）のＯＲＦ６およびＯＲＦ８を省略、機能不全または欠失させても、ウイルスアセンブリが依然として可能であることを見出した。

【0102】

特定の実施形態において、本発明は、１つのＯＲＦ関連核酸配列部分が、ＯＲＦ３ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有するアミノ酸配列をコードする、本発明の核酸に関する。

【0103】

本明細書中で使用される「ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有する配列」という語句は、配列番号６０によって定義される配列によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有する配列を指す。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の構造および機能は、当技術分野において公知である（例えば、Yadav, Rohitash et al., 2021, Cells 10,4 821；Arya, Rimanshee et al, 2021, Journal of molecular biology 433.2: 166725; Gorkhali, R., et al., 2021, Bioinformatics and Biology Insights, 15, 11779322211025876; Redondo N, et al., 2021, Front Immunol. Jul 7;12:708264）に記載されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能を有する配列は、配列番号６０に含まれる配列、または配列番号６０に含まれる配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列である。このような％配列変動は、例えば、配列番号６０中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントの１つ以上の変異、または挿入、欠失および／または置換から、好ましくは、コードされたアミノ酸配列の機能を変化させることなく、または実質的に変化させることなく配列を変化させる保存的挿入、欠失および／または置換に由来し得る。

【0104】

ＯＲＦ３ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能、ならびにＯＲＦ３ａ配列およびその変異は、当技術分野において公知である（例えば、Bianchi M, et al., 2021, Int J Biol Macromol. 2021;170:820-826を参照のこと）。ＯＲＦ３ａ配列における最も一般的な変異は、Ｖ１３Ｌ、Ｑ５７Ｈ、Ｑ５７Ｈ＋Ａ９９Ｖ、Ｇ１９６ＶおよびＧ２５２Ｖである。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ３ａの機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号２０をコードする配列、または配列番号２０をコードする配列に対して、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する、配列番号２０をコードする配列である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ３ａの機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号５２に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列番号５２によって定義される配列である。このような％配列変動は、例えば、Bianchi M, et al., 2021, Int J Biol Macromol. 2021;170:820-826に記載されている１つまたは複数の変異、または挿入、欠失および／もしくは置換、好ましくはコードされたアミノ酸配列の機能を変化させることなく、または実質的に変化させることなく配列を変化させる保存的挿入、欠失および／もしくは置換に由来する。

【0105】

ＯＲＦ６によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能、ならびにＯＲＦ６配列およびその変異は、当技術分野で公知である（例えば、Hassan, Sk Sarif, Pabitra Pal Choudhury, and Bidyut Roy, 2021, Meta Gene 28：100873を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ６の機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号２３をコードする配列、または配列番号２３をコードする配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ６の機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号５３に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列番号５３によって定義される配列である。このような％配列変動は、例えば、Hassan, Sk Sarif, Pabitra Pal Choudhury, and Bidyut Roy, 2021, Meta Gene 28: 100873に記載されている１つまたは複数の変異、または挿入、欠失および／もしくは置換、好ましくは、コードされているアミノ酸配列の機能を変化させることなく、または実質的に変化させることなく配列を変化させる保存的挿入、欠失および／もしくは置換に由来し得る。

【0106】

ＯＲＦ７ａによってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能、ならびにＯＲＦ７ａ配列およびその変異は、当技術分野において公知である（例えば、Yashvardhini, Niti, et al., 2021, Biomedical Research and Therapy 8.8: 4497-4504を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ７ａの機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号２４をコードする配列、または配列番号２４をコードする配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ７ａの機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号５４に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列番号５４によって定義される配列である。このような％配列変動は、例えば、Yashvardhini, Niti, et al., 2021, Biomedical Research and Therapy 8.8: 4497-4504に記載されている１つまたは複数の変異、または挿入、欠失および／もしくは置換、好ましくは、コードされているアミノ酸配列の機能を変化させることなく、または実質的に変化させることなく配列を変化させる保存的挿入、欠失および／もしくは置換に由来し得る。

【0107】

ＯＲＦ８によってコードされるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２アミノ酸配列の機能、ならびにＯＲＦ８配列およびその変異は、当技術分野において公知である（例えば、Badua, Christian Luke DC, Karol Ann T. Baldo, and Paul Mark B. Medina., 2021, Journal of medical virology 93.3: 1702-1721; Hassan, Sk Sarif, et al., 2021, Computers in biology and medicine 133: 104380を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ８の機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号２５をコードする配列、または配列番号２５をコードする配列に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列である。いくつかの実施形態において、ＯＲＦ８の機能を有するアミノ酸配列をコードするＯＲＦ関連核酸配列部分は、配列番号５５に対して少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列番号５５によって定義される配列である。このような％配列変動は、例えば、Badua, Christian Luke DC, Karol Ann T. Baldo, and Paul Mark B. Medina., 2021, Journal of medical virology 93.3: 1702-1721に記載される１つまたは複数の変異、または挿入、欠失および／もしくは置換、好ましくは、コードされるアミノ酸配列の機能を変化させることなく、または実質的に変化させることなく配列を変化させる保存的挿入、欠失および／もしくは置換に由来し得る。

【0108】

本発明者らは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスゲノムのＯＲＦ６、ＯＲＦ７ａおよびＯＲＦ８に相当する配列を省略、機能不全または欠失させることができ、ウイルスの組立てが依然として可能であることを見出した。

【0109】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、
ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｃ）配列番号５４によって定義されるＯＲＦ７ａ配列、もしくは配列番号５４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、核酸に関する。

【0110】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、
ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５４によって定義されるＯＲＦ７ａ配列、もしくは配列番号５４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｄ）配列番号５５によって定義されるＯＲＦ８配列、もしくは配列番号５５と少なくとも９９％、少なくとも９９．３％、もしくは少なくとも９９．６％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、核酸に関する。

【0111】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、
ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５４によって定義されるＯＲＦ７ａ配列、もしくは配列番号５４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｄ）配列番号５３によって定義されるＯＲＦ６配列、もしくは配列番号５３と少なくとも９４．１％、少なくとも９４．７％、少なくとも９５．２％、少なくとも９５．８％、少なくとも９６．３％、少なくとも９６．８％、少なくとも９７．４％、少なくとも９７．９％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．６％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、核酸に関する。

【0112】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、
ａ）１．）配列番号５１によって定義されるＯＲＦ１ａｂ配列、もしくは配列番号５１と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
２．）ｉ）配列番号５９によって定義されるＯＲＦ１ｂ配列、もしくは配列番号５９と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、および
ｉｉ）配列番号５８によって定義されるＯＲＦ１ａ配列、もしくは配列番号５８と少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｂ）配列番号５２によって定義されるＯＲＦ３ａ配列、もしくは配列番号５２と少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、
ｃ）配列番号５４によって定義されるＯＲＦ７ａ配列、もしくは配列番号５４と少なくとも９９．５％の配列同一性を有する配列、
ｄ）配列番号５３によって定義されるＯＲＦ６配列、もしくは配列番号５３と少なくとも９４．１％、少なくとも９４．７％、少なくとも９５．２％、少なくとも９５．８％、少なくとも９６．３％、少なくとも９６．８％、少なくとも９７．４％、少なくとも９７．９％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、もしくは少なくとも９９．６％の配列同一性を有する配列、ならびに
ｅ）配列番号５５によって定義されるＯＲＦ８配列、もしくは配列番号５５と少なくとも９９％、少なくとも９９．３％、もしくは少なくとも９９．６％の配列同一性を有する配列
をさらに含む、核酸に関する。

【0113】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、３’ＵＴＲ、５’ＵＴＲ、ＴＲＳ－Ｌ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｓ、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ３ａ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｅ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｍ、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ６、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ７ａ、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ８および／またはＴＲＳ－Ｂ：Ｎをさらに含む、核酸に関する。

【0114】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、配列番号５７によって定義される３’ＵＴＲおよび／または配列番号５６によって定義される５’ＵＴＲをさらに含む、核酸に関する。

【0115】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による核酸であって、ＴＲＳ－Ｌ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｓ、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ３ａ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｅ、ＴＲＳ－Ｂ：Ｍ、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ６、ＴＲＳ－Ｂ：ｏｒｆ７ａ、ＴＲＳ－Ｂ：０１Ｔ８および／またはＴＲＳ－Ｂ：Ｎをさらに含み、配列ＡＣＧＡＡＣで定義される、核酸に関する。

【0116】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４１によって定義される配列、または配列番号４１と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0117】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４２によって定義される配列、または配列番号４２と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0118】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４３によって定義される配列、または配列番号４３と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0119】

いくつかの実施形態において、核酸配列は、配列番号４４によって定義される配列、または配列番号４４と少なくとも９８．５％、少なくとも９８．６％、少なくとも９８．７％、少なくとも９８．８％、少なくとも９８．９％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0120】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるヌクレオチド酸配列は、対応するリボ核酸配列を指す。

【0121】

ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ６およびＯＲＦ８は、Ｉ型インターフェロンシグナル伝達経路を阻害し（Li, J. Y., et al. , 2020, Virus research, 286, 198074）、したがって十分な免疫応答を阻害する。したがって、ベクター中のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＯＲＦ６および／またはＯＲＦ８の配列を欠失または省略することによって、コードされたウイルス粒子の再現性を制限するだけでなく、その抗原性が増加する。

【0122】

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、本発明のヌクレオチド酸配列が、驚くべき抗原性および制限された複製能を有するウイルス粒子またはその一部をコードするという知見に基づくものである。

【0123】

いくつかの実施形態において、本発明の核酸配列は、ベクターまたはベクターの一部である。

【0124】

本明細書で使用される、用語「ベクター」は、それ自体および／または他の核酸分子を細胞内に移送または輸送することができる核酸分子を指す。移送された核酸は、一般的にベクター核酸分子に連結され、すなわち挿入される。ベクターは、細胞内での自律的な複製を指示する配列を含んでいても、または宿主細胞ＤＮＡへの組み込みを可能にするのに十分な配列を含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるベクターは、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、シャトルベクター、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体、およびウイルスベクターからなる群から選択されるベクターである。

【0125】

特定の実施形態において、本発明は、配列部分Ｂを含まず、配列部分Ａの調節が少なくとも１つのアクセサリータンパク質を含まない、本発明によるベクターに関する。

【0126】

特定の実施形態において、本発明は、プラスミドベクターである、本発明によるベクターに関する。

【0127】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるプラスミドベクターは、選択マーカーおよび複製起点を決定する配列を有する。いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４６および配列番号４７によって定義される配列を含む、本発明によるベクターに関する。

【0128】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＲＮＡポリメラーゼプロモーターをコードする少なくとも１つの配列と、ネガティブ鎖ＲＮＡの合成を可能にする、および／またはポジティブ鎖ＲＮＡの合成を可能にする配列を含む少なくとも１つの非翻訳領域とを含む、本発明によるベクターに関する。

【0129】

いくつかの実施形態において、本発明は、Ｔ７プロモーターをコードする少なくとも１つの配列と、ネガティブ鎖ＲＮＡの合成を可能にする、および／またはポジティブ鎖ＲＮＡの合成を可能にする配列を含む少なくとも２つの非翻訳領域とを含む、本発明によるベクターに関する。

【0130】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号２８によって定義されるＴ７プロモーターをコードする少なくとも１つの配列と、配列番号５６および５７に記載する配列を含む少なくとも２つの非翻訳領域とを含む、本発明によるベクターに関する。

【0131】

いくつかの実施形態において、本発明は、プラスミドベクターである、本発明によるベクターに関する。

【0132】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号４５に定義される配列を含む、本発明によるベクターに関する。

【0133】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のヌクレオチド酸配列は、配列番号４５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0134】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、ｉ）配列番号４５と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％の配列同一性を有し、ｉｉ）配列番号４７によって定義される選択マーカーおよび配列番号４６によって定義される複製起点を含む、配列を含む。

【0135】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のベクターは、少なくとも１つのトランスフェクションエンハンサー、例えばオリゴヌクレオチド、リポプレックス、ポリマーソーム、ポリプレックス、デンドリマー、無機ナノ粒子および細胞侵入ペプチドからなる群から選択されるトランスフェクションエンハンサーと組み合わせて使用される。

【0136】

本明細書に記載のベクターは、増幅バイオテクノロジー産生ユニットにおいて、本発明の核酸配列の効率的な移送および／または増幅に使用することができる（実施例３）。

【0137】

増幅バイオテクノロジー産生ユニット（例えば、酵母細胞）における増幅の生成物は、単離され、その後、さらなるバイオテクノロジー産生ユニット（例えば、ヒト細胞）において翻訳され得る。

【0138】

したがって、本発明は、少なくとも部分的には、本明細書に記載のベクターが、本明細書に記載の核酸の効率的な増幅および複製能が制限されているが、高い抗原性を有する組合せウイルス様タンパク質の効率的な産生を可能にするという知見に基づくものである。本発明の核酸は、上記の手順を経て、タンパク質および他の構成要素を含む分散物の産生をもたらす。

【0139】

当業者に知られている適切な分離方法、例えば遠心分離またはクロマトグラフィーを用いて、これらの構成要素を、必要に応じて、使用した産生細胞株または他の産生補助物または生物の残渣からも分離し、それによってそれらを精製することが可能である。

【0140】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載の構成要素は、クロマトグラフィー、沈殿化、超遠心分離、接線流濾過、および酵素消化の群から選択される少なくとも１つの分離方法を用いて精製される。

【0141】

これらの任意に精製されたウイルスエンベロープまたはその断片は、ワクチンの基礎を表し、これは、次いで、適用の種類に応じて異なる剤形に移される。

【0142】

一般的に、この目的のためにアジュバント、保存性を向上させるための安定剤、塩および緩衝剤が使用される。このため、ワクチンはここで記載した長鎖の完全合成核酸の生成物である。

【0143】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明によるベクターを使用して、本発明によるキット、または本発明によるバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関し、ここで、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質は、本発明による少なくとも１つの核酸をパッケージングする。

【0144】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明によるベクターを使用して、本発明によるキットを使用して、または本発明によるバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープに関する。

【0145】

本明細書において使用する、用語「ウイルスエンベロープ」は、ヌクレオチド酸配列（本発明のヌクレオチド酸配列等）の安定化機能を有するタンパク質層等のタンパク質アセンブリを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のウイルスエンベロープは、ヒト細胞への本発明のヌクレオチド酸配列の同化を可能にする。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のウイルスエンベロープは、スパイクタンパク質、エンベロープタンパク質および膜タンパク質を含む。

【0146】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明によるベクターを使用して、本発明によるキット、または本発明によるバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープの断片に関する。

【0147】

本明細書において使用する、用語「ウイルスエンベロープの断片」は、不完全なウイルスエンベロープを形成する、少なくとも２つのアセンブルされたタンパク質を指す。

【0148】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明によるベクターを使用して、本発明によるキット、または本発明によるバイオテクノロジー産生ユニットを使用して、本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0149】

本明細書において使用する、用語「ウイルスエンベロープタンパク質」は、ウイルスエンベロープの一部を形成することができる少なくとも１つのタンパク質を指す。

【0150】

【0151】

本明細書において使用する、用語「パッケージングされる」は、少なくとも部分的に飲み込まれる、および／または結合されることを指す。いくつかの実施形態において、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープのフラグメントおよび／またはウイルスエンベロープタンパク質中の本発明のパッケージングヌクレオチド酸は、ヒト細胞への侵入を可能にする。

【0152】

本発明の核酸および／またはベクターの生成物は、生成物がウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質で具現化されている場合、対応する機能性ウイルスに対して特に高い抗原的類似性を示す。したがって、誘発／誘導された免疫反応により、機能性ウイルスとの実際の接触に特に有益な免疫反応が誘導される可能性が高い。

【0153】

ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質にパッケージングされたヌクレオチド酸は、対象のヒト細胞に移送され、ヒト細胞におけるウイルスタンパク質の産生を誘導することが可能である。この結果、複製能が制限された抗原性ウイルス様タンパク質の露出が長期化し、増強される。

【0154】

したがって、本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に記載のベクターにより、複製能が制限されているが、元のウイルスと類似の抗原性を有する組合せウイルス様タンパク質を効率的に産生できるという知見に基づくものである。

【0155】

いくつかの実施形態において、本発明は、治療に使用するための本発明のベクターに関する。

【0156】

いくつかの実施形態において、本発明は、治療に使用するための本発明のバイオテクノロジー産生ユニットに関する。

【0157】

いくつかの実施形態において、本発明は、治療に使用するための本発明のウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0158】

本明細書において使用する、用語「治療」（および「治療する」または「治療すること」等のその文法的変形）は、治療される個体の自然経過を変更する試みにおける臨床介入を指し、予防のためまたは臨床病理の経過中のいずれでも実施することが可能である。治療の望ましい効果としては、疾患の発症または再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的または間接的な病理学的結果の軽減、疾患進行速度の低下、疾患状態の改善または緩和、寛解または予後の改善等が挙げられるが、これらに限定されない。

【0159】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療に使用するための、本発明のベクター、バイオテクノロジー産生ユニット、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0160】

いくつかの実施形態において、本発明は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の予防に使用するための、本発明のベクター、バイオテクノロジー産生ユニット、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0161】

いくつかの実施形態において、本発明は、活性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療に使用するための、本発明のベクター、バイオテクノロジー産生ユニット、ウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片、および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0162】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つの核酸と、産生生物において本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンに関する。

【0163】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つの核酸と、産生生物において本発明によるベクターを使用することによって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンに関する。

【0164】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つの核酸と、産生生物において本発明によるキットを使用することによって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンに関する。

【0165】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つの核酸と、本発明によるベクターを使用して、特に本発明によるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質を含む産生生物において、本発明によるキットを使用して、本発明による少なくとも１つの核酸を使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物とを含む、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンに関する。

【0166】

本明細書において使用される、用語「ワクチン」は、宿主において免疫応答を誘導／誘発することができ、感染症および／または疾患を治療および／または予防することを可能にする、任意の剤または組成物を指す。したがって、そのような剤の非限定的な例としては、タンパク質、ポリペプチド、タンパク質／ポリペプチド断片、免疫原、抗原、ペプチドエピトープ、エピトープ、タンパク質、ペプチドまたはエピトープの混合物、ならびに（目的のポリペプチド、タンパク質またはその断片をコードする）核酸、遺伝子および／または遺伝子の一部が挙げられる。

【0167】

本明細書において使用する、用語「コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対する」は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染の治療および／または予防を指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染症はＣＯＶＩＤ－１９である。

【0168】

コロナウイルスの構造タンパク質は、免疫応答を誘発することが示されている（例えば、Li, J. Y., et al. , 2020, Virus research, 286, 198074; Walls, A. C., et al., 2020, Cell, 181(2), 281-292. e6; Chen, Z, et al., 2004, Clinical chemistry, 50(6), 988-995; Peng, Y., et al., 2020, Nature immunology, 21(11), 1336-1345を参照されたい。）提供される手段および方法は、免疫回避機構を低減した、同等のエピトープおよび／または同等の粒子を有するワクチンの製造および投与により、同等の免疫応答を誘導／誘発することができる。いくつかの実施形態において、ワクチンは、対象において複製能が制限された粒子の産生を誘導する。

【0169】

これにより、これらのワクチンは、しばしば動物血清に由来し、したがって分子的に一貫性のない古典的なワクチンとは大きく異なる。動物生物からの産生は、伝統的に選択された方法である。しかし、分子的に不明確な生成物は、大規模な品質問題、および製造バッチごとの産生の変動をもたらす。このことは、長い承認期間、および発見が単に遅くなることがしばしばである副作用とも関連している。分子的に明確な生成物組成は、本発明による核酸を用いて得ることができるため、好都合である。

【0170】

さらに、本明細書に記載のワクチンは、明確に定義され、かつ幅広い抗原性エピトープを提供する。この結果、ワクチンは、免疫応答を増強するアジュバントの必要性が低いか、または全く必要としないという利点がある。免疫応答を増強するこのようなアジュバントは、典型的には、一部の患者におけるアレルギー反応等の副作用と関連している。さらに、本明細書に記載のワクチンの主要な活性成分は、タンパク質ベースであり、したがって、他のワクチン（例えば、ＲＮＡワクチン）と比較してより耐熱性である。したがって、本発明のワクチンは、その安定性により、容易に輸送および保管が可能である。

【0171】

したがって、本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に記載のワクチンがコロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して特に有用であるという知見に基づく。

【0172】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による２つ以上の核酸を含むキットに関する。

【0173】

いくつかの実施形態において、本発明は、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、および配列番号３８の群から選択される少なくとも２つの核酸を含むキットに関する。

【0174】

このベクターの組合せにおいて、キットは、ヒト細胞におけるウイルスタンパク質の産生を可能にする。

【0175】

また、本発明は、前記核酸に加えて、２つ以上の核酸を含むキットに関し、ここで、核酸は、前記請求項の一項に記載のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および／または対応する塩基対配列を有する対応するリボ核酸（ＲＮＡ）である。言い換えれば、対応するリボ核酸は、チミン（Ｔ）がウラシル（Ｕ）に置換されている、上記で定義された配列部分を有する。

【0176】

本明細書に記載するキットは、必要なバイオテクノロジー産生ユニットおよび試薬を集めることによって調製することができる。キットに含まれる核酸がＤＮＡの形態で存在する場合、少なくとも１つのプラスミド、好ましくは２つ以上のプラスミドで存在することがさらに好ましい。これにより、後述の具体例の文脈でも記載するように、対応するバイオテクノロジー産生ユニットに容易に核酸を導入することができる。

【0177】

本発明の具体的な実施形態において、本発明の（文脈で調製される）キットまたは本発明の方法および使用は、さらに取扱説明書を含むか、または取扱説明書とともに提供され得る。例えば、前記取扱説明書は、本明細書で提供される、本発明による診断用途において、本発明のキットを用いること（方法）を当業者にガイドすることができる。特に、前記取扱説明書は、本明細書で提供される方法または用途を使用または適用するためのガイダンスを含んでもよい。

【0178】

したがって、本発明は、少なくとも部分的に、ウイルス粒子および／またはその一部を効率的かつ安全に産生することが可能になるという知見に基づく。

【0179】

他の態様によれば、本発明は、したがって、上記で定義された少なくとも１つのプラスミド、特に２つ以上のプラスミドを含むバイオテクノロジー産生ユニットにも関する。本発明のこのさらなる態様の基礎となる産生ユニットは、通常、記載される目的のために当業者に知られている産生生物または細胞株である。

【0180】

他の態様によれば、本発明はまた、対応する長鎖完全合成核酸を適当な産生生物または細胞株で適用することから得られる生成物に関する。これらの生成物は、エンベロープタンパク質のクラスに属し、しばしば、追加の糖または脂肪酸基を有する。具体的には、このさらなる態様は、これにより、上記で定義された核酸を使用して、またはキットを使用して遺伝子発現によって得ることができるウイルスエンベロープ、ウイルスエンベロープの断片および／またはウイルスエンベロープタンパク質に関する。

【0181】

ここで重要なのは、この割り当てが数学的に曖昧でないことであり、核酸ｉは、それに正確に依存する生成物ｉを産生する。少しでも異なる核酸ｊは、それに正確に依存する他の生成物ｊを産生する。生成物と核酸の間の２つの関係は曖昧でなく、記述可能である。生成物ｋのそれぞれの種類は、核酸ｋに割り当てることができる。したがって、核酸と生成物、すなわちウイルスエンベロープまたはその断片との間に直接的な関係を表すように正当化される。

【0182】

個々の分離可能な特徴の代替案がここで「実施形態」として提示される場合、そのような代替案は、本明細書に開示される本発明の別々の実施形態を形成するために自由に組み合わせることができることは理解される。

【0183】

ウイルスエンベロープのアセンブリは、生物および種類によって、異なる速度で行われ、清浄度が異なるため、実際には、エンベロープおよびその断片は常に一緒に見出されることは言及すべきである。しかし、必要であれば、一般的な方法で分離することができる。

【0184】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のエンベロープは、クロマトグラフィー、沈殿化、超遠心分離、接線流濾過、および酵素消化の群から選択される少なくとも１つの精製方法を用いて精製される。

【0185】

本発明のさらなる態様によれば、本発明の長鎖核酸の直接生成物は、このように、任意の精製ステップおよび可能な補助手段によってワクチンに変換される。具体的には、このさらなる態様は、したがって、特に１つまたは複数の上記のタンパク質成分またはその一部を含む産生生物において上記で定義した少なくとも１つの核酸またはキットを使用した遺伝子発現によって得ることができる生成物を含むワクチンに関する。

【0186】

このワクチンは、典型的には、上記の添加物および典型的には少量の濃度の上記のウイルスエンベロープおよび／または断片を含む生理的食塩水溶液である。

【0187】

本明細書に記載のワクチンは、他のワクチンよりもアジュバントの効果への依存度が低いが、ワクチンは、ワクチンの効果を高めるために依然としてアジュバントを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、ワクチンは、無機化合物（例えば、ミョウバンカリウム、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、水酸化リン酸カルシウム）、油（例えば、パラフィン油、ピーナッツ油）、細菌生成物、サポニン、サイトカイン（例えば、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－１２）およびスクワレンの群から選択される少なくとも１つのアジュバントを含む。

【0188】

いくつかの実施形態において、ワクチンは、経口投与、直腸投与、吸入、鼻腔投与、非経口（ｐａｒｅｎｔａｌ）投与、筋肉内投与、皮下投与および皮内投与の群から選択される少なくとも１つの投与経路によって投与される。

【0189】

典型的なワクチンは、剤形に応じて、注射されるか、または粘膜から塗布することができる。

【0190】

上述したように、ワクチンは、具体的には、コロナウイルスＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対するワクチンである。具体的には、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１またはｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含み、これによって、
（ｉ）タンパク質成分ａは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１４および配列番号１８で定義される配列を含み；
（ｉｉ）タンパク質成分ｂ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号６および配列番号２１に記載された配列を含み、タンパク質成分ｂ２は、ＭＨＶ５９Ａのエンベロープタンパク質Ｅに類似した、配列番号８に記載の配列または同等のタンパク質を含み；
（ｉｉｉ）タンパク質成分ｃ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質Ｍに類似した配列番号１０および配列番号２２に記載の配列を含み、タンパク質成分（ｃ２）は、ＭＨＶ５９Ａの膜タンパク質Ｍに類似した配列番号１２に記載の配列、または同等のタンパク質を含み；
（ｉｖ）タンパク質成分ｄ１は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２および配列番号２６に記載の配列を含み、タンパク質成分ｄ２は、ＭＨＶ５９Ａのヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号４に記載の配列または同等のタンパク質を含む。

【0191】

タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２は、対応する天然に存在する類似体と類似しているが同一ではないことに留意すべきであるが、これは、それらが、対応する天然核酸の配列と異なる配列の合成核酸から産生されるという事実に起因するものである。

【0192】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ａは、配列番号１４および配列番号１８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ａは、配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0193】

いくつかの実施形態において、タンパク質成分ａは、配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0194】

本明細書中に開示されるタンパク質成分ｂ１は、配列番号６および配列番号２１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｂ１は、配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0195】

いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｂ１は、配列番号２１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0196】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ｂ２は、配列番号８に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｂ２は、配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0197】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ｃ１は、配列番号１０および配列番号２２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｃ１は、配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0198】

いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｃ１は、配列番号２２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0199】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ｃ２は、配列番号１２に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｃ２は、配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0200】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ｄ１は、配列番号２および配列番号２６に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｄ１は、配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0201】

いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｄ１は、配列番号２６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0202】

本明細書内に開示されるタンパク質成分ｄ２は、配列番号４に記載の配列を含む。いくつかの実施形態において、タンパク質成分ｄ２は、配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、または少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む。

【0203】

本明細書に記載のアミノ酸配列に対して一定の％配列同一性を有するタンパク質成分は、例えば、少なくとも１つアミノ酸の、しかし配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、および／または配列番号２６のアミノ酸配列に対して１０％以下、９％以下、８％以下、７％以下、６％以下、５％以下、４％以下、３％以下、２％以下、１％以下、０．９％以下、０．８％以下、０．７％以下、０．６％以下、０．５％以下、０．４％以下、０．３％以下、０．２％以下、または０．１％以下のアミノ酸の挿入、欠失、置換および／または修飾によって得ることができる。このような挿入、欠失、置換および／または修飾は、所望の挿入、欠失、置換および／または修飾をコードする本明細書に記載の対応するヌクレオチド酸配列（例えば、本明細書に記載されるタンパク質成分の変異バリアントをコードするＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２バリアントのヌクレオチド酸配列）に基づいて達成することができる。

【0204】

挿入、欠失、置換および／または修飾は、翻訳後修飾の結果でもあり得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質成分は、産生プロセスを改善するために翻訳後修飾される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質成分は、抗原性、タンパク質安定性、薬物動態、薬力学、薬剤との相互作用およびアジュバントとの相互作用の群から選択されるタンパク質特性等、記載のタンパク質成分の少なくとも１つのタンパク質特性を改善するために翻訳後修飾される。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のタンパク質成分は、官能基の付加、他のタンパク質またはペプチドへの連結、アミノ酸の化学修飾（例えば、シトルリン化、脱アミノ化、脱アミド化、エリミニル化）、ジスルフィド架橋、システインアミノ酸連結、ペプチド結合切断、イソアスパラギン酸形成、ラセミ化、およびタンパク質スプライシングの群から少なくとも選択される技術によって翻訳後修飾される。

【0205】

したがって、本明細書に記載のアミノ酸配列は必ずしも、本明細書に記載のヌクレオチド酸配列と重複する、比例した％配列同一性を有していない。いくつかの実施形態において、本発明のアミノ酸配列は、変更されたヌクレオチド酸配列が本明細書に記載のヌクレオチド酸配列と異なるより、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２１、配列番号２２、および／または配列番号２６に記載の配列から少なくとも１０％、少なくとも９％、少なくとも８％、少なくとも７％、少なくとも６％、少なくとも５％、少なくとも４％、少なくとも３％、少なくとも２％、少なくとも１％、少なくとも０．９％、少なくとも０．８％、少なくとも０．７％、少なくとも０．６％、少なくとも０．５％、少なくとも０．４％、少なくとも０．３％、少なくとも０．２％、少なくとも０．１％以上異なる。

【0206】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１またはｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む本発明によるワクチンに関し、ここで、
（ｉ）タンパク質成分ａは、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１４に記載の配列、もしくは配列番号１４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳタンパク質に類似した配列番号１８に記載の配列、もしくは配列番号１８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含み、
（ｉｉ）タンパク質成分ｂ１は、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号６に記載の配列、もしくは配列番号６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号２１に記載の配列、もしくは配列番号２１と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含み、
タンパク質成分ｂ２は、ＭＨＶ５９Ａのエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号８に記載の配列、もしくは配列番号８と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含み、
（ｉｉｉ）タンパク質成分ｃ１は、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のエンベロープタンパク質Ｅに類似した配列番号１０に記載の配列、もしくは配列番号１０と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の膜タンパク質Ｍに類似した配列番号２２に記載の配列、もしくは配列番号２２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含み、
タンパク質成分ｃ２は、ＭＨＶ５９Ａの膜タンパク質Ｍに類似した配列番号１２に記載の配列、もしくは配列番号１２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含み、
（ｉｖ）タンパク質成分ｄ１は、
ａ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２に記載の配列、もしくは配列番号２と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列、または
ｂ）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号２６に記載の配列、もしくは配列番号２６と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含み、
タンパク質成分ｄ２は、ＭＨＶ５９Ａのヌクレオキャプシドホスホタンパク質Ｎに類似した配列番号４に記載の配列、もしくは配列番号４と少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．１％、少なくとも９９．２％、少なくとも９９．３％、少なくとも９９．４％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．６％、少なくとも９９．７％、少なくとも９９．８％、もしくは少なくとも９９．９％の配列同一性を有する配列を含む同等のタンパク質を含む。

【0207】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0208】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0209】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0210】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、およびｄ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0211】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、およびｃ１からなる群から選択される少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0212】

いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分ａおよびｃ１を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0213】

いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分ａおよびｄ１を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0214】

いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分ｃ１およびｄ１を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0215】

いくつかの実施形態において、本発明は、少なくとも２つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分ａとｂ１、およびｃ１とｄ１を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0216】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択される少なくとも３つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0217】

いくつかの実施形態において、本発明は、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｃ１、およびｄ１からなる群から選択される３つの分子的に正確に定義されたタンパク質成分を含む、本発明によるワクチンに関する。

【0218】

本明細書に記載されたタンパク質成分を含む本発明によるワクチンは、実質的かつ広範な免疫応答を誘発することができる。同時に、ワクチンは、対象の体内で複製されないという点で、複製能が制限されている場合がある。そのような限定された複製能は、例えば、効率的な複製のために必要な配列を省略または変更することによって達成することができる。

【0219】

したがって、本発明は、少なくとも部分的に、本明細書に記載のタンパク質成分の組合せを含むワクチンが、抗原性をほぼ維持しながら、複製能において所望の制限を示すことができるという知見に基づく。

【0220】

さらに、本発明は、請求項１～１０の一項に記載の少なくとも１つの核酸をトランスフェクションによって、バイオテクノロジー産生ユニット、特に細胞株に導入する連続的なステップを含む、核酸ベースのｍＲＮＡから出発する、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群より選択される少なくとも２つのタンパク質成分が翻訳により調製され、その得られたタンパク質成分を精製することを含む、ワクチンを産生する方法に関する。

【0221】

いくつかの実施形態において、本発明は、以下の連続的なステップ：
ａ）実施形態１０～１４の１つに記載のベクターを、バイオテクノロジー産生ユニット、特に細胞株に導入するステップであって、
タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２からなる群から選択されるタンパク質成分の少なくとも２つをコードする核酸ベースのｍＲＮＡが翻訳によって調製される、ステップ、
ｂ）ステップａ）のバイオテクノロジー産生ユニットからタンパク質成分を得るステップ；ならびに
ｃ）得られたタンパク質成分を精製して、本発明によるワクチンを得るステップ
を含む、本発明によるワクチンを産生する方法に関する。

【0222】

いくつかの実施形態において、本発明は、本発明による少なくとも１つのベクターを含むバイオテクノロジー産生ユニットに関する。

【0223】

用語「バイオテクノロジー産生ユニット」および「産生生物」は、本明細書において互換的に用いられ、本発明の核酸が発現のために導入された少なくとも１つの宿主細胞、例えばこのような細胞の子孫、生物およびこのような細胞および／またはこのような細胞の子孫を含むバイオテクノロジー産生ユニットを指す。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、これは、継代回数に関係なく、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞と完全に同一の核酸含有量でなく、変異を含んでいてもよい。本明細書において、一次形質転換細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同一の機能または生物学的活性を有する変異子孫が含まれる。

【0224】

用語「増幅バイオテクノロジー産生ユニット」は、大きなベクター（例えば、４０００塩基超、１００００塩基超、３５０００塩基超）の増幅を可能にする任意のバイオテクノロジー産生ユニットを指す。いくつかの実施形態において、本明細書に記載の増幅バイオテクノロジー産生ユニットは、酵母細胞を含む。

【0225】

特定の実施形態において、宿主細胞は、幹細胞である。他の実施形態において、宿主細胞は分化した細胞である。

【0226】

本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、バイオテクノロジー産生ユニットの細胞の生成物がバイオテクノロジー産生ユニットのさらなる細胞に入ることができるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を可能にする細胞を含む場合、特に有用である。このバイオテクノロジー産生ユニットの細胞のその後の感染は、ベクターを宿主細胞に持ち込むプロセスを容易にし、加速させる。

【0227】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を可能にする細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、ヒトＡＣＥ２受容体または機能的なヒト様ＡＣＥ２受容体を発現する細胞を含む。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス侵入を可能にするヒト様ＡＣＥ２受容体は、当業者に知られている（例えば、Damas, J., et al., 2020, Proceedings of the National Academy of Sciences, 117(36), 22311-22322を参照）。

【0228】

いくつかの場合、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、ＨＥＫ２９３、ＭＤＣＫ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＳＦ９、Ｖｅｒｏ、ＭＲＣ５、Ｐｅｒ．Ｃ６、ＰＭＫ、およびＷＩ－３８の群から選択される少なくとも１つの細胞種を含む。

【0229】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、少なくとも部分的にヒトである細胞、または少なくとも部分的にヒト細胞株の細胞である細胞を含む。

【0230】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、本発明のヌクレオチドまたは、バイオテクノロジー産生ユニットの細胞において完全に複製可能であるが、ヒト身体の細胞において複製可能ではないか、または実質的に複製可能ではないという点で、選択的に複製可能である本発明のベクターを含むウイルス粒子の産生を可能にする細胞を含む。この選択的複製可能性は、ウイルス粒子の複製のための相補的なタンパク質を含む細胞によって達成される（例えば、実施例を参照）。

【0231】

いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、ウイルス複製のための少なくとも１つのタンパク質を発現することができる細胞を含む。いくつかの実施形態において、本明細書に記載のバイオテクノロジー産生ユニットは、本発明のヌクレオチド酸配列または本発明のベクターにコードされていない、ウイルス複製のための少なくとも１つのタンパク質成分を発現することができる細胞を含む。

【0232】

本発明のベクターによる宿主細胞の形質導入は、安定的または一過性の形質導入によって達成することができる（例えば、Stepanenko, A. A., and Heng, H. H., 2017, Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 773, 91-103を参照）。

【0233】

第１の実施形態による産生ユニットにＤＮＡを導入する場合、通常、この目的に適したプラスミドを用いて行われる。

【0234】

あるいは、ＤＮＡは、任意の種類のベクターによって、バイオテクノロジー産生ユニットに導入されてもよい。

【0235】

一方、第２の実施形態にしたがってＲＮＡを導入する場合、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする配列（配列番号３０に記載）が、タンパク質成分ａ、ｂ１、ｂ２、ｃ１、ｃ２、ｄ１またはｄ２をコードする配列に加えて導入される。この配列により、まず鋳型として存在するポジティブＲＮＡ鎖からネガティブＲＮＡ鎖を形成し、そこから対応するメッセンジャーＲＮＡを産生することが可能となる。

【0236】

この手順の第２の実施形態の文脈において、得られたワクチンが、酵素転写によって得ることができる完全合成長鎖リボ核酸（配列番号３３または３４に記載）をさらに含むことが好ましい。

【0237】

この手順の第２の実施形態の文脈において、得られたワクチンが、配列番号２８に記載の配列のＴ７転写を介して得ることができる、完全合成長鎖リボ核酸（配列番号３３または３４に記載）をさらに含むことがまた好ましい。

【0238】

「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、本明細書において、冠詞の文法的目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ、または１つ以上）を指すために使用される。

【0239】

「または」は、選択肢のいずれか一方、両方、またはその任意の組合せを意味すると理解されるべきである。

【0240】

「および／または」は、選択肢のいずれか１つ、または両方を意味すると理解されるべきである。

【0241】

本明細書を通じて、文脈上他に必要とされない限り、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載されたステップまたは要素、またはステップもしくは要素の群を含むことを意味するが、他のステップまたは要素、またはステップもしくは要素の群を除外しないことは理解されるであろう。

【0242】

用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義的に使用される。「好ましくは」は、他の選択肢を排除しない一連の選択肢のうちの１つの選択肢を意味する。「例えば」は、言及された例に制限されない１つの例を意味する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇｏｆ）」は、句「からなる」の後に続くものを全て含み、かつ、それに限定されることを意味する。

【0243】

本明細書を通じて、「一実施形態（ｏｎｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「ある実施形態（ａｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「具体的な実施形態（ａｐａｒｔｉｃｕｌａｒｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「関連する実施形態（ａｒｅｌａｔｅｄｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「特定の実施形態（ａｃｅｒｔａｉｎｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「追加の実施形態（ａｎａｄｄｉｔｉｏｎａｌｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」、「いくつかの実施形態（ｓｏｍｅｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔｓ）」、「特定の実施形態（ａｓｐｅｃｉｆｉｃｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」または「さらなる実施形態（ａｆｕｒｔｈｅｒｅｍｂｏｄｉｍｅｎｔ）」またはそれらの組合せへの言及は、その実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも一実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書を通じた様々な場所における前述の語句の出現は、必ずしも全てが同じ実施形態に言及しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つまたは複数の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせることができる。また、一実施形態における特徴の積極的な記載は、特定の実施形態における特徴を除外するための根拠となることが理解される。本発明は、添付の図と組み合わせた以下の設計例によってさらに説明されるが、これらは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を制限するものではない。

【0244】

（図面の説明）
（図１）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ２のヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）（配列番号３５）、エンベロープタンパク質（Ｅ）（配列番号３６）、膜タンパク質（Ｍ）（配列番号３７）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）（配列番号３８）をコードするモノシストロン発現プラスミドのプラスミドマップ。プラスミドマップ内側の数字は、ＤＮＡの塩基対座標を示す。Ｎ、Ｅ、Ｍ、およびＳのタンパク質コード配列は矢印で表されており、配列表に記載されている配列番号１、２、３、および４（Ｎ）、５、６、７、および８（Ｅ）、９、１０、１１、および１２（Ｍ）、１３、および１４（Ｓ）のＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表している。
（図２）実施例２に示すように、モノシストロン発現プラスミドｐｃＤＮＡ３４ｓｙｎＮ（配列番号３５）（下図）と共に細胞株におけるワクチン産生に使用できるポリシストロン発現構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮ（配列番号３３および３９）（上図）のゲノムマップ。数字は、ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮについてのキロベース（Ｋ）でのＤＮＡ座標を指し、ｐｃＤＮＡ３４ｓｙｎＮ構築物（配列番号３５）についての塩基対の位置を指す。ポリタンパク質１ａ、１ｂ、Ｅ、ＭＳ（上図）およびヌクレオキャプシドタンパク質ｓｙｎＮ（下図）のタンパク質コード配列は矢印で表されている。
（図３）ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）のモノシストロンのプラスミドベースの発現構築物のアガロースゲル電気泳動サイズ分離。ゲルの左側は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）および膜タンパク質（Ｍ）に対するＭＨＶＡ５９（ＭＨＶ）由来の構築物を示す。ゲルの右側は、ヌクレオキャプシドタンパク質（Ｎ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、膜タンパク質（Ｍ）、およびスパイク糖タンパク質（Ｓ）に対するＳＡＲＳ－ＣｏＶ２に基づいて得られた構築物を示す。
（図４）環状の４０，５５６ｂｐのＤＮＡ構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮ（配列番号４０）（上図）および３８，３８３ｂｐのＤＮＡ構築物ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮΔＨＥ（配列番号４０）（下図）の対応するＤＮＡ配列決定カバーグラフを有する模式図。矢印は、複製ポリタンパク質１Ａ、１Ｂ（１Ａ、１Ｂ）、ヘマグルチニンエステラーゼ（ＨＥ）、スパイク糖タンパク質（Ｓ）、エンベロープタンパク質（Ｅ）、および膜タンパク質（Ｍ）のＣＤＳを再構成したタンパク質コード配列の位置を示す。ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮおよびＣＯＶＡＸ１９１ΔＮΔＨＥの完全なゲノムは、単一の酢酸リチウム酵母形質転換を用いて６つの合成ＤＮＡブロックからアセンブルし、補助栄養ＵＲＡ３マーカーで選択した。
（図５）ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ゲノムおよび作製した欠失バリアントの模式図。
（図６）ＯＲＦ７ａのトランス相補的発現のためのｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（＋）＿ＯＲＦ７ａのベクターマップ（配列番号６１）
（図７）表Ｓ１：サッカロミセス・セレビシエ（S. cerevisiae）（酵母）におけるＣＯＶＡＸ１９１のＤＮＡアセンブリ効率

【実施例】

【0245】

以下の実施例は、エンベロープタンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳをコードする本発明の長鎖核酸がどのように産生され、細胞を刺激するバイオテクノロジープロセスにおいて使用されコロナウイルスエンベロープまたはその断片を産生するかを例示するものである。

【0246】

産生のために、本発明による（デジタル）配列は、化学的ＤＮＡ合成のプロセスによって、対応する物理的に存在する長鎖完全合成核酸分子に移送される。

【0247】

[実施例１]
最初の実施例では、エンベロープタンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳをコードする、結果として得られた長鎖完全合成核酸はモノシストロンである、すなわち、個別のプロモーター（ＳＶ４０、ＣＭＶ、ＥＦ－１、ニワトリｂアクチンプロモーターまたはハイブリッドプロモーター）および他の任意の翻訳開始シグナル（Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）および核ｍＲＮＡ輸出シグナル（ＣｈｕｃｋＷｏｏｄ配列）の制御下で真核細胞用の発現プラスミドに産生されている。配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８および図１で明らかにされた配列は、このような発現系の一例として機能する。他の発現プラスミド、対応する耐性遺伝子およびプロモーターを用いた他の実施形態も可能であり、当業者に知られている。

【0248】

結果として得られた４つの発現プラスミドを大腸菌（Escherichia coli）で増幅し、標準的な化学物理的手順で精製し、次に真核細胞株（ＦＩＥＫ２９３、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＳＦ９、Ｖｅｒｏ）へトランスフェクションにより導入する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム、リポフェクション、エレクトロポレーション等の標準的な手順で行われる。

【0249】

トランスフェクション後、細胞は、トランスフェクトされたプラスミドＤＮＡから出発して、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳を開始し、そこからエンベロープタンパク質Ｅ、Ｍ、ＮおよびＳが翻訳によって発現される。これらのタンパク質は細胞内で自発的にアセンブルしてコロナウイルスのエンベロープを形成し、その後、細胞からエキソサイトーシスによって培養培地中に放出され、ここで５～７日後に蓄積される。

【0250】

エンベロープタンパク質、ウイルスエンベロープおよびその断片の精製には、化学物理的プロセスが使用される。この目的のために、細胞培養上清が遠心分離によって細胞から分離される。次のステップで、ウイルスエンベロープは、クロマトグラフィーカラム分離法により、培養培地中の不純物および他の成分からさらに分離される。このように得られたコロナウイルスのエンベロープからなる純粋形態の物質がワクチンの基礎を形成し、これは、次いで用途の種類に応じて様々な投与形態に変換される。典型的には、この目的のためにアジュバント、保存性を向上させるための安定剤、塩、および緩衝剤が使用される。したがって、ワクチンは、ここに記載した長鎖の完全合成核酸の生成物である。

【0251】

[実施例２]
第２の実施例において、エンベロープタンパク質Ｅ、ＭおよびＳをコードする長鎖完全合成核酸は、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼをコードする完全合成核酸とともに発現される。配列番号３９および配列番号４０によって明らかにされ、図２に示される、このポリシストロン発現系において、エンベロープタンパク質Ｅ、ＭおよびＳは、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを含むネガティブＲＮＡ鎖から直接転写される。配列群Ａ～Ｄのエンベロープタンパク質の全てのクラスがＲＮＡ依存性に発現されない場合、実施例１に記載するような追加の発現プラスミドを用いて、細胞株におけるウイルスエンベロープのバイオテクノロジー産生のためのエンベロープタンパク質の完全セットを発現させることができる。実施例２では、Ｎタンパク質をコードする発現プラスミドをこの目的のために使用する（配列番号３５）（図２参照）。

【0252】

プラスミドの精製、長鎖核酸のトランスフェクション、ならびにウイルスエンベロープの精製は、実施例１に記載したプロセス順序にほぼ従っている。しかし、プロセスは、トランスフェクションの前に、配列番号３９および配列番号４０に記載の長鎖核酸を、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによって配列番号３３および配列番号３４に記載の対応するＲＮＡ形態に変換する追加のステップを含む。このポジティブＲＮＡ鎖は、細胞株におけるＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの産生をもたらし、そこからネガティブＲＮＡ鎖を産生させる。このネガティブＲＮＡ鎖からメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写が次いで行われ、これによりウイルスエンベロープのエンベロープタンパク質の産生およびアセンブリがもたらされる。

【0253】

このようにして産生されたワクチンは、対応するデオキシリボ核酸の遺伝子発現によって得られたエンベロープタンパク質に加えて、配列番号３９および配列番号４０の配列のＴ７転写を介して発現する完全合成長鎖リボ核酸を含む点で第１の実施例１に記載のワクチンと相違する。

【0254】

第２の実施例２は、Ｎタンパク質を発現するヘルパー細胞株で自己増殖するウイルスエンベロープを産生するという第１の適用例に対する利点を有する。これが可能であるのは、このようにして形成されたウイルスエンベロープが、ＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼとエンベロープタンパク質Ｅ、Ｍ、およびＳとをコードするポジティブＲＮＡ鎖をさらに含むためである。これらのウイルスエンベロープが細胞に取り込まれると、細胞自体が刺激を受けてウイルスエンベロープを産生する。ワクチン産生細胞株の場合のように、細胞がＮタンパク質をエピソーム的に発現する場合、自己複製ウイルスエンベロープが形成される。これは産生プロセスを単純化し、高価なトランスフェクション試薬なしで行うことができる。標的細胞がＮ－タンパク質を発現していない場合、そこからウイルスエンベロープも形成されるが、その場合はパッケージングされたＲＮＡ鎖を欠いており、もはや自己複製することはできない。これらのウイルスエンベロープは、実施例１に示した製造プロセスにより産生されたウイルスエンベロープと同じ化学的／物理的構造を有し、同じ抗原性を有する。実施例２は、さらなるヘルパー細胞株および産生生物におけるウイルスエンベロープ、断片、ウイルスエンベロープタンパク質の産生ならびにＲＮＡワクチンとしての直接適用を可能にする。

【0255】

方法
細菌および酵母株の培養
大腸菌（E. coli）ＤＨ５ａｌｐｈａをＬｕｒｉａ－Ｂｒｏｔｈ（ＬＢ）内で３７℃で培養した。サッカロミセス・セレビシエＶＬ６－４８Ｎ（Kouprina et al., 2006 Methods in Mol. Biol. 349, 85-101）は、酵母ペプトンデキストロース（ＹＰＤ）培地またはウラシルを含まない合成ドロップアウト（ＳＤ）培地で、３０℃で培養した。

【0256】

配列設計およびデノボＤＮＡ合成
モノシストロンおよびポリシストロン発現構築物のＤＮＡ配列は、添付の配列表（配列番号１～４０）に開示されている配列部分からアセンブルした。合成上の制限は、遺伝子間配列内の同義コドン置換および所望の塩基置換を適用することにより、コンピューター的に除去された。最適な逆合成アセンブリ経路を決定するために、合成最適化ＤＮＡ設計は、商業的供給元による低コストでの合成に適切な、より小さなＤＮＡ断片に階層的に分割された。分割戦略は、４ステップの階層的なアセンブリプロセスとして設計した。１．４ｋｂ（キロベース）のサイズのサブブロックは５．４ｋｂのブロックにアセンブルされ、さらに１６ｋｂのサイズのセグメントにアセンブルされ、次いで３５～４０ｋｂの最終ＣＯＶＡＸ構築物にアセンブルされた。線状ＤＮＡアセンブリ部分は、末端に相同性重複部を有し、ネスト化３’プレフィックスおよび５’サフィックス配列を有し、アセンブルされたＤＮＡ部分をベクターに組み込み、最終ＣＯＶＡＸＤＮＡ設計の階層的アセンブリを可能にするものであった。ＤＮＡアセンブリ部分は、配列が確認されたクローン性プラスミド構築物および二本鎖線状ＤＮＡとして、低コストのＤＮＡ合成により商業的供給元から入手した。

【0257】

モノシストロン発現構築物の作製
ＳＡＲＳ－２ＣｏＶのＳタンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２またはＭＨＶのＭタンパク質、Ｎタンパク質およびＥタンパク質の完全なタンパク質コード配列をカバーする合成核酸配列は、配列が確認された合成ＤＮＡからポリメラーゼ増幅技術（ＰＣＲ）により増幅された。開始コドンの前の翻訳開始部位はオリゴヌクレオチドプライマーによって導入した。ＰＣＲ生成物は分子量に応じてアガロースゲル電気泳動で分離し、次いでヌクレオスピンカラム（ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎＧｅｌａｎｄＰＣＲＣｌｅａｎｕｐＫｉｔ，Ｍａｃｈｅｒｅｙｎａｉｌ）上で精製した。ＰＣＲ生成物は、Ｔｏｐｏ－ＴＡクローニングキット（ＴＯＰＯ－ＴＡｃｌｏｎｉｎｇｋｉｔ，ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてｐｃＤＮＡ３．４ベクターにクローニングした。プラスミドの分子量はアガロースゲル電気泳動で決定し（図３）、ＤＮＡ配列はサンガー配列決定により確認した。

【0258】

ポリシストロンＣＯＶＡＸＤＮＡ構築物の作製：
ポリシストロニックＣＯＶＡＸＤＮＡ構築物のＤＮＡ組立て部分は、ＩＩＳ型制限酵素（ＢｂｓＩ、ＢｓｐＱＩ、ＰａｃＩおよびＰｍｅＩ（ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄＢｉｏｌａｂｓ））を用いた制限消化によってプラスミドから遊離した。等モル量のＤＮＡインサート（１００ｎｇ、０．１１５ｐｍｏｌ）と線状化ベクターｐＸＭＣＳ２（１００ｎｇ、０．０３８ｐｍｏｌ）をＴ５エキソヌクレアーゼ、フュージョンポリメラーゼおよびＴａｑＤＮＡリガーゼとともに５０℃で１時間インキュベートした。等温アセンブリ後、構築物を大腸菌ＤＦＩ５α細胞にエレクトロポレーションした（ＢｉｏＲａｄＭｉｎｉＰｕｌｓｅｒ）。細胞をＬＢ培地中で１時間インキュベートした後、ＬＢプレート上にプレートアウトした。酢酸リチウム形質転換法（Gietz et al 2007, Nature Protocols, 2, 31-34）にしたがって、プラスミドｐＭＲ１０Ｙ（ｐＭＲ１０：：ＣＥＮ／ＡＲＳ：：ＵＲＡ３、Christen et al. 2015, ACS Synthetic Biology, 4, 927-934）を用いた酵母組み換えによりブロックからセグメントおよび完全ＣＯＶＡＸ構築物をアセンブルした。サッカロミセス・セレビシエＶＬ６－４８Ｎを５ｍｌのＹＰＤで一晩増殖させ、５０ｍｌのＹＰＤで１：２０に希釈して４時間インキュベートした。１，０００ｒｃｆで５分間遠心分離して細胞を回収し、２５ｍｌの蒸留水で洗浄し、３，０００ｒｃｆで５分間遠心分離した。ペレットを１ｍｌの酢酸リチウム混合液（０．１Ｍ酢酸リチウム，０．０１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に溶解した。次に、１００μｌの一本鎖サケ精子ＤＮＡ（１ｗ／ｖ％サケ精子ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、０．０１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）および６ｍｌのＰＥＧ－混合物（４０ｗ／ｖ％ポリ（エチレングリコール）３０１５～３６８５ｇ／ｍｏｌ、０．０１ＭＴｒｉｓ－ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．００１ＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）を添加した。ＰＥＧ細胞混合物から、７１０μｌのアリコートを、１００ｎｇの消化ＤＮＡブロックと２５０ｎｇの線状化ｐＭＲ１０Ｙベクター（ＰａｃＩ、Ｐｍｅｌ）と組み合わせた。サンプルは３０℃で３０分間インキュベートした。インキュベート後、７０μｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加し、サンプルを４２℃で１５分間熱ショックにかけた。１０００ｒｃｆで２分間遠心分離して細胞を回収した後、ウラシルを含まないＳＤプレートにプレートアウトし、３０℃で３日間、コロニーが見えるようになるまで培養した（表Ｓ１参照）。

【0259】

ＣＯＶＡＸＤＮＡ構築物の配列の検証
アセンブルしたＤＮＡ構築物の配列検証は、ＮｅｘｔｅｒａＤＮＡＦｌｅｘＬｉｂｒａｒｙＰｒｅｐ－Ｋｉｔを使用してｉＳｅｑ装置（Iｌｌｕｍｉｎａ）で実施した。ｕｒａ＋酵母形質転換体のゲノムＤＮＡを、製造者が指定するタグ付けプロトコルにしたがって断片化および処理した。読み取った配列からデノボで配列を計算し、作成したコンティグをＣＬＣＧｅｎｏｍｉｃｓＷｏｒｋｂｅｎｃｈソフトウェア（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いて参照配列と比較した。ＣＯＶＡＸ１９１ΔＮとＣＯＶＡＸ１９１ΔＨＥＮの完全なアセンブリは、完全閉鎖配列カバレッジプロット（図４）により確認された。

【0260】

[実施例３]
環状配列（ウイルス配列、Ｔ７プロモーター、およびポリＡシグナル、ならびにベクター、全てが１つの酵母人工染色体（「ＹＡＣ」）中にある）の１つをそれぞれ含む酵母クローンを増殖させ、収穫して、そのＹＡＣを抽出した。このように得られたＹＡＣを制限酵素Ｅａｇｌで切断し、ポリＡ－シグナルの直後に線状化した二本鎖ＤＮＡ分子を得た。これらのＤＮＡ分子をＰｒｏｔｅｉｎａｓｅＫによる標準的な処理によってＲＮａｓｅフリーにした後、Ｔｒｉｚｏｌ（フェノール／クロロホルム）抽出を行い、ワクチンウイルスゲノムに対応する一本鎖ＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いたインビトロ転写により得た。このようにして得られたＲＮＡを適切な細胞株（ＨＥＫ２９３ＴまたはＶｅｒｏ細胞）にトランスフェクトした。陽性対照の場合、全長構築物「ＧＢｓｙｎ＿Ｖ３３」未変更ＨＥＫ２９３またはＶｅｒｏ細胞は、ＲＮＡゲノムの複製、サブゲノムｍＲＮＡの生成、ひいてはウイルスタンパク質への翻訳を支持した。これらは、ポジティブ鎖ＲＮＡゲノム、および細胞膜由来の成分とともに、子孫ウイルス、この場合は野生型天然ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスを形成した。欠失変異体の場合、ウイルスゲノムで欠失した遺伝子をＤＮＡの形態で細胞株にトランスフェクトし、タンパク質の一過性の発現をもたらし、それによって子孫ウイルスの生成を可能にするのに必要な欠失因子を提供する。あるいは（そして好ましいことに）、選択圧下でこれらの細胞を培養すると、遺伝子の細胞ゲノムへの安定した組み込みが引き起こされ、そこからタンパク質が連続的に発現される（発現とは、遺伝子からのｍＲＮＡの生成およびその後のタンパク質への翻訳であると理解する）。このような細胞は、ワクチンウイルスゲノムに欠損した遺伝子から作製されたタンパク質を一過性または安定的のいずれかで発現しており、構造タンパク質の完全セットと、１つまたはいくつかの遺伝子が欠失したワクチンウイルスゲノムによって特徴づけられるワクチンウイルスの連続産生を可能にしている。このようにして得られたワクチンウイルスは、清澄化（ワクチンウイルスから細胞の分離）、ベンゾアーゼによるＤＮＡ消化、限外濾過／ダイアフィルトレーション（「ＵＦ／ＤＦ」）、そして最後に無菌濾過（０．２２μｍ濾過）により特徴づけられる所謂下流処理（ＤＳＰ）プロセスで精製された。

【0261】

[実施例４]
追加の欠失またはＯＲＦ７ａを有する、実施例１～３に記載の方法に従う完全合成ベクターの新規合成：新規合成は、配列番号６０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４を参照配列とする。それによって、ＯＲＦ７ａをコードするヌクレオチド配列の機能性および／または発現は、配列番号６０のヌクレオチド２７３８８～２７３９３、配列番号４１のヌクレオチド２７０００～２７３６５、配列番号４２のヌクレオチド２７１９６～２７５６１、配列番号４３のヌクレオチド２７０００～２７３６５、または配列番号４４のヌクレオチド２７４７４～２７８３９の欠失および／または機能不全の実施によって除去し得る。したがって、ＯＲＦ７ａ単独の欠失またはＥ－タンパク質、ＯＲＦ６および／またはＯＲＦ８単独と組み合わせた欠失が達成され得る。

【0262】

このようなベクターの発現を容易にするために、配列番号６１を含むプラスミドを、ＯＲＦ７ａのトランス相補的発現のために使用することができる。

【図1】