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特表2024-509151ベータ－アラニン産生改善のための昆虫由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼおよびそれらのバリアント
(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-29
(54)【発明の名称】ベータ－アラニン産生改善のための昆虫由来のアスパラギン酸デカルボキシラーゼおよびそれらのバリアント
(51)【国際特許分類】
C12N 15/60 20060101AFI20240221BHJP
C12N 9/88 20060101ALI20240221BHJP
C12N 15/63 20060101ALI20240221BHJP
C12N 1/15 20060101ALI20240221BHJP
C12N 1/19 20060101ALI20240221BHJP
C12N 1/21 20060101ALI20240221BHJP
C12N 5/10 20060101ALI20240221BHJP
C12P 13/06 20060101ALI20240221BHJP
【ＦＩ】
C12N15/60
C12N9/88 ZNA
C12N15/63 Z
C12N1/15
C12N1/19
C12N1/21
C12N5/10
C12P13/06 A
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553235
(86)(22)【出願日】2022-03-03
(85)【翻訳文提出日】2023-10-25
(86)【国際出願番号】 CN2022079042
(87)【国際公開番号】W WO2022184134
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】PCT/CN2021/078949
(32)【優先日】2021-03-03
(33)【優先権主張国・地域又は機関】CN
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】522363737
【氏名又は名称】モジア・バイオテック・リミテッド
(74)【代理人】
【識別番号】100118902
【弁理士】
【氏名又は名称】山本 修
(74)【代理人】
【識別番号】100106208
【弁理士】
【氏名又は名称】宮前 徹
(74)【代理人】
【識別番号】100196508
【弁理士】
【氏名又は名称】松尾 淳一
(74)【代理人】
【識別番号】100135415
【弁理士】
【氏名又は名称】中濱 明子
(72)【発明者】
【氏名】ラウ，マン・キット
(72)【発明者】
【氏名】ルー，シュー
(72)【発明者】
【氏名】ス，ジンフアン
(72)【発明者】
【氏名】ゼン，コンミン
(72)【発明者】
【氏名】ジアン，タイロン
(72)【発明者】
【氏名】チュウ，アンセン
【テーマコード（参考）】
4B064
4B065
【Ｆターム（参考）】
4B064AE04
4B064CA02
4B064CA05
4B064CA06
4B064CA08
4B064CA10
4B064CA19
4B064CC24
4B064DA01
4B064DA10
4B064DA13
4B064DA20
4B065AA01X
4B065AA01Y
4B065AA57X
4B065AA57Y
4B065AA72X
4B065AA72Y
4B065AA83X
4B065AA83Y
4B065AA90X
4B065AA90Y
4B065AB01
4B065AC14
4B065BA02
4B065CA41
4B065CA43
4B065CA44
4B065CA46
(57)【要約】
ベータ－アラニン産生のための改善された性能を表す昆虫アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼのＮ末端切断型バリアントを提供する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
組換え切断型昆虫アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）であって、切断型ＡＤＣが対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣと比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表すように、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端領域内の十分な数の連続した残基が欠如している切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項2】
蚊、ハエ、カブトムシ、ノミ、ゴキブリ、またはシロアリのＡＤＣの切断型バリアントであるか、または野生型ＡＤＣ酵素の切断型バリアントであり、野生型ＡＤＣ酵素が、配列番号２９のアミノ酸配列と全体で少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一なアミノ酸配列によって定義される、請求項１に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項3】
Ｃｕｌｅｘ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、Ａｅｔｈｉｎａ、Ａｅｄｅｓ、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ、Ａｓｂｏｌｕｓ、またはＣｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ属の昆虫ＡＤＣの切断型バリアントである、請求項１または２に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項4】
Ｃｕｌｅｘ ｔａｒｓａｌｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ａｒａｂｉｅｎｓｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ａｅｔｈｉｎａ ｔｕｍｉｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、Ａｓｂｏｌｕｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓ、またはＣｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｅｃｕｎｄｕｓ種の昆虫ＡＤＣの切断型バリアントである、請求項１～３のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項5】
対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣが、（ａ）配列番号２、４、もしくは９～１５のいずれか１つと全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含む蚊ＡＤＣ、
（ｂ）配列番号１、３、もしくは５～６のいずれか１つと全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むカブトムシＡＤＣ、
（ｃ）配列番号８と全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を含むハエＡＤＣ、または
（ｄ）配列番号２９と全体で少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、もしくは９９％同一なアミノ酸配列を含むＡＤＣである、請求項１～４のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項7】
切断型ＡＤＣが、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または
（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位、
と全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項8】
切断型ＡＤＣが、配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の９６位に対応する位置にグリシン残基を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項9】
切断型ＡＤＣが、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端の少なくともＸ個の連続した残基を欠如しており、Ｘが５から５０の間の任意の整数である、請求項１～８のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項10】
切断が、完全長野生型昆虫ＡＤＣのｎ位に対応する残基のすぐＣ末端（下流）の位置で生じ、ｎが２からＹの間の任意の整数であり、Ｙが完全長野生型昆虫ＡＤＣ内の最もＣ末端の残基の位置であり、この位置でのＮ末端からの切断が完全長野生型ＡＤＣと比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表す切断型ＡＤＣを生じ得る、請求項１～９のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項11】
切断が、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７１位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７８位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～５５位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～５１位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７０位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７０位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７３位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７３位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７３位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～８２位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～７８位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９ １０、または１１～５２位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～５６位、または
（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位、
のいずれか１つに対応する残基のＣ末端（下流）の位置で生じる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項11】
切断が、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８０位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～８７位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～６４位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～６０位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～７９位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～７９位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～８２位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８２位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～８２位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～９１位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８７位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～６１位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～６５位、または
（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位、
のいずれか１つに対応する残基のＮ末端（上流）の位置で生じる、請求項１～１０のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項12】
切断が、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７５位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の８２位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５９位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５５位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７４位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７４位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７７位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７７位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７７位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８６位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の８２位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５６位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の６０位、または
（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位、
のいずれか１つに対応する残基のＮ末端（上流）の位置で生じる、請求項１～１１のいずれか１項に記載の組換え切断型昆虫ＡＤＣ。
【請求項13】
アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ活性を有する組換えタンパク質であって、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または
（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位、
と全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質。
【請求項14】
配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の９６位に対応する位置にグリシン残基を含む、請求項１３に記載の組換えタンパク質。
【請求項15】
請求項１～１２のいずれか１項で定義した組換え切断型昆虫ＡＤＣをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、または請求項１３もしくは１４で定義した組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド。
【請求項16】
昆虫ＡＤＣに関して異種であるプロモータに作動可能に連結した請求項１５で記載した単離または組換えポリヌクレオチドを含む発現カセット。
【請求項17】
請求項１～１２のいずれか１項で定義した組換え切断型昆虫ＡＤＣ、請求項１３もしくは１４で記載した組換えタンパク質を発現し、かつ／または請求項１５で記載したポリヌクレオチドもしくは請求項１６で記載した発現カセットで形質転換されるか、またはそれらを含むように操作された宿主細胞。
【請求項18】
細菌、昆虫、哺乳動物、酵母、または真菌の細胞である、請求項１７に記載の宿主細胞。
【請求項19】
アスパラギン酸からベータ－アラニンの工業的生産で使用するための、請求項１～１２のいずれか１項で定義した組換え切断型昆虫ＡＤＣ、請求項１３もしくは１４で定義した組換えタンパク質、または請求項１７もしくは１８で定義した宿主細胞。
【請求項20】
ベータ－アラニンの産生方法であって、（ａ）請求項１～１２のいずれか１項で定義した切断型昆虫ＡＤＣであるＡＤＣ酵素源、請求項１３もしくは１４で定義した組換えタンパク質、および／または請求項１７もしくは１８で定義した宿主細胞を提供するステップ、
（ｂ）ＡＤＣ酵素源がアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換を触媒することが可能である条件下で、ＡＤＣ酵素源をアスパラギン酸源と接触させるステップ、ならびに
（ｃ）産生したベータ－アラニンを単離および／または濃縮するステップを含む方法。
【請求項21】
ＡＤＣ酵素源が請求項１７または１８で定義した無傷の宿主細胞である、請求項２０に記載の方法。
【請求項22】
請求項２０または２１に記載の方法によって産生されたベータ－アラニンを含む組成物。
【請求項23】
配列番号１６～２７のいずれか１つの核酸配列、請求項１～１２のいずれか１項で定義した組換え切断型昆虫ＡＤＣをコードする核酸配列、請求項１３もしくは１４で定義した切断型組換えタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせの完全相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
この記載は、ベータ－アラニンの産生のための生物学的方法に関する。より詳細には、本明細書では、Ｌ－アスパラギン酸からのベータ－アラニン産生に特に有利な昆虫アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）酵素およびそれらのバリアントについて記載する。
【背景技術】
【0002】
ベータ－アミノプロピオン酸または３－アミノプロピオン酸としても知られているベータ－アラニンは、アミノ基がカルボキシレート基のベータ位にある天然に存在するアミノ酸である。ベータ－アラニンは多目的な有機合成の原料であり、主にパントテン酸およびパントテン酸カルシウム、カルノシン、パミドロン酸、バルサラジドなどの合成に使用される。医薬品、飼料、食品、およびその他の分野で広く使用されており、市場の需要は大きい。工業規模では、ベータ－アラニンは現在、安全性への懸念、高額な設備費用、および環境汚染を伴う過酷な反応条件を必要とする化学的方法によって生産されている。より安全で環境に優しい生物学的方法によるベータ－アラニンの生産は、酵素の活性、発現、および／または安定性が低いことが大きな妨げとなっており、そのため、化学的合成によるアプローチと比較してそのような方法は商業的に実行不可能となっている。
【発明の概要】
【0003】
したがって、ベータ－アラニンの生物学的生産に有用な改善された酵素が強く望まれている。
【0004】
一態様では、本明細書では、組換え切断型昆虫アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）であって、切断型ＡＤＣが完全長野生型昆虫ＡＤＣと比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表すように、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端領域内の十分な数の連続した残基が欠如している切断型昆虫ＡＤＣについて記載する。
【0005】
さらなる態様では、本明細書では、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ活性を有する組換えタンパク質であって、
（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または
（ｎ）配列番号２９のアミノ酸配列の１～４９１位
と全体的に少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質について記載する。
（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位；
（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位；
（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位；
（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位；
（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位；
（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位；
（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位；
（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位；
（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位；
（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位；
（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または
（ｎ）配列番号２９のアミノ酸配列の１～４９１位
と全体的に少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質について記載する。
【0006】
さらなる態様では、本明細書では、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣまたは本明細書で記載した組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドについて記載する。
【0007】
さらなる態様では、本明細書では、昆虫ＡＤＣについて異種であるプロモータに作動可能に連結した、本明細書で記載した単離または組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットについて記載する。
【0008】
さらなる態様では、本明細書では、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣ、本明細書で記載した組換えタンパク質を発現し、かつ／または本明細書で記載したポリヌクレオチドまたは本明細書で記載した発現カセットで形質転換されるか、またはそれらを含むように操作された宿主細胞について記載する。
【0009】
さらなる態様では、本明細書では、ベータ－アラニンの産生のための方法であって、（ａ）本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣであるＡＤＣ酵素源、本明細書で記載した組換えタンパク質、および／または本明細書で記載した宿主細胞を提供するステップ、（ｂ）ＡＤＣ酵素源がアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換を触媒することが可能である条件下で、ＡＤＣ酵素源をアスパラギン酸源と接触させるステップ、ならびに（ｃ）産生されたベータ－アラニンを単離および／または濃縮するステップを含む方法について記載する。
【0010】
さらなる態様では、本明細書では、本明細書で記載した方法によって産生されるベータ－アラニンを含む組成物について記載する。
【0011】
一般的定義
見出し、およびその他の識別符号、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書および特許請求の範囲を読みやすくするために表示されている。明細書または特許請求の範囲における見出しまたはその他の識別符号の使用は、ステップまたは要素がアルファベット順もしくは数字順、またはそれらが表示される順序で実施されることを必ずしも必要とするわけではない。
見出し、およびその他の識別符号、例えば、（ａ）、（ｂ）、（ｉ）、（ｉｉ）などは、単に明細書および特許請求の範囲を読みやすくするために表示されている。明細書または特許請求の範囲における見出しまたはその他の識別符号の使用は、ステップまたは要素がアルファベット順もしくは数字順、またはそれらが表示される順序で実施されることを必ずしも必要とするわけではない。
【0012】
特許請求の範囲および／または明細書において「含む」という用語と組み合わせて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という語の使用は、「１つ」を意味していてもよいが、「１つまたは複数」、「少なくとも１つ」、および「１つ以上」の意味とも一致する。
【0013】
「約」という用語は、値を判定するために使用されている装置または方法の誤差の標準偏差を値が含むことを示すために使用される。一般的に、「約」という用語は、最大１０％の変動の可能性を指摘することを意味する。したがって、「約」という用語には、値の１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０％の変動が含まれる。他に指示がない限り、範囲の前の「約」という用語の使用は、範囲の両端に用いられる。
【0014】
本明細書で使用したように、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などのあらゆる形態の含む）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」などのあらゆる形態の有する）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに「ｉｎｃｌｕｄｅｓ（含む）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などのあらゆる形態の含む）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などのあらゆる形態の含有する）は、包括的であるか、または非限定的であり、さらなる未記載の要素もしくは方法／方法のステップを排除するものではない。
【0015】
本明細書で使用したように、用語「ベータ－アラニン」は、ベータ－アラニンおよびベータ－アラニン塩（例えば、カルシウム、ナトリウム、またはカリウムのベータ－アラニン塩）を含む。
【図面の簡単な説明】
【0016】
【図1】様々な昆虫種のＡＤＣ酵素を８５％の配列同一性でグループ化した系統樹を示した図である。実施例２で試験したいくつかのＡＤＣの活性データを示す。
【図2-1】９種の異なる蚊種から同定されたＡＤＣのアミノ酸配列のアラインメントを示した図である。破線は、蚊ＡＤＣではあまり保存されていないＮ末端部分の領域を示している。ＣｔＡＤＣに特有の９６位のグリシン残基は黒で強調されている。各配列に対応する配列番号は括弧内にある。
【図3】実施例５および６で記載した蚊およびカブトムシのＡＤＣのＮ末端アミノ酸配列のアラインメントを示した図である。黒で強調した２つの残基間のＮ末端切断によって、対応する完全長のタンパク質と比較して活性が増加した切断型ＡＤＣがもたらされたが、白で囲われた２つの残基間のＮ末端切断によっては、ＡＤＣ活性が低いかまたは検出できない酵素がもたらされた。破線で示された領域は、Ｎ末端切断が酵素活性にとって有益でなくなると予想され得る位置を示している。
【0017】
配列表
このアプリケーションには、２０２１年３月１日に作成された約１００ｋｂのサイズのコンピュータ可読形式の配列表が含まれている。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
このアプリケーションには、２０２１年３月１日に作成された約１００ｋｂのサイズのコンピュータ可読形式の配列表が含まれている。コンピュータ可読形式は、参照により本明細書に組み込まれる。
【0018】
【表1】
【発明を実施するための形態】
【0019】
Ｌ－アスパラギン酸のアルファカルボキシル基の酵素触媒除去によるベータ－アラニンの工業規模の生物学的合成の試みは、酵素の活性、発現、および／または安定性が不十分であることが大きな妨げとなっており、そのため、化学的合成によるアプローチと比較してそのような方法は商業的に実行不可能となっている。活性、発現、および／または安定性が増加した、Ｌ－アスパラギン酸からベータ－アラニンへの変換を触媒する改善された酵素は、商業規模でのベータ－アラニンの生物学的合成を大幅に促進するであろう。この記載は、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ活性を有するある特定の昆虫由来酵素がベータ－アラニン産生に特に有利であり、さらに、そのような昆虫由来酵素の性能が、それらのＮ末端の一部を切断することによって大幅に改善され得るという発見に関する。
【0020】
第１の態様では、本明細書では、ベータ－アラニン産生に特に有利な組換え切断型昆虫アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）酵素について記載する。本明細書で使用したように、「アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ」または「ＡＤＣ」という表現は、Ｌ－アスパラギン酸のベータ－アラニンおよび二酸化炭素への酵素的変換を触媒する能力を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、このようなポリペプチドは、酵素クラスＥＣ４．１．１．１１に分類されるものを含んでいてもよい。一部の実施形態では、このようなポリペプチドはまた、その他の酵素クラスに分類される酵素（例えば、Ｌ－アスパラギン酸以外の基質に対しても活性を有する酵素）および／またはＡＤＣ以外の酵素（例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、システインスルフィン酸デカルボキシラーゼ）として（例えば、公共データベースにおいて）注釈が付けられているポリペプチドを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した昆虫ＡＤＣおよびそれらの切断型バリアントは、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ活性およびシステインスルフィン酸デカルボキシラーゼ活性の両方を有する酵素を含んでいてもよい。
【0021】
本明細書で使用したように、「切断された」または「切断」という用語は、末端残基から始まる（例えば、組換えタンパク質のＮ末端メチオニンから始まる）タンパク質のセグメントの除去を含むだけでなく、切断型タンパク質の末端部分が非切断型タンパク質の末端部分よりも短くなるように、タンパク質（例えば、野生型タンパク質）の末端領域または部分内の連続した残基の欠失を含んでいてもよい。
【0022】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣは、切断型ＡＤＣが親完全長野生型タンパク質と比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表すように、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端部分内の十分な数の連続した残基を欠如している。一部の実施形態では、アスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加は、対応する完全長野生型タンパク質と比較して、ＡＤＣ触媒活性の増加、ＡＤＣ安定性の増加、および／または発現の増加を含んでいてもよい。
【0023】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、昆虫綱の生物の切断型バリアントであってもよい（例えば、蚊、ハエ、カブトムシ、ノミ、ゴキブリ、またはシロアリＡＤＣ）。特定の実施形態では、本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣは、図１の系統樹において構造関係が示されている蚊、ハエ、またはカブトムシＡＤＣの切断型バリアントであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣは、Ｃｕｌｅｘ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、Ａｅｔｈｉｎａ、Ａｅｄｅｓ、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ、Ａｓｂｏｌｕｓ、またはＣｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ属の昆虫ＡＤＣの切断型バリアントであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣは、Ｃｕｌｅｘ ｔａｒｓａｌｉｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ａｒａｂｉｅｎｓｉｓ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ｃｕｌｅｘ ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ａｅｔｈｉｎａ ｔｕｍｉｄａ、Ａｅｄｅｓ ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ ａｅｇｙｐｔｉ、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ ｃａｓｔａｎｅｕｍ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ、Ｔｅｎｅｂｒｉｏ ｍｏｌｉｔｏｒ、Ａｓｂｏｌｕｓ ｖｅｒｒｕｃｏｓｕｓ、またはＣｒｙｐｔｏｔｅｒｍｅｓ ｓｅｃｕｎｄｕｓ種の昆虫ＡＤＣの切断型バリアントを含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣは、野生型ＡＤＣ酵素の切断型バリアントであってもよく、野生型ＡＤＣ酵素は、配列番号２９のアミノ酸配列と全体で少なくとも９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一なアミノ酸配列によって定義される。
【0024】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、配列番号２、４、または９～１５のいずれか１つと全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む蚊ＡＤＣの切断型バリアントであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、配列番号１、３、または５～６のいずれか１つと全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むカブトムシＡＤＣの切断型バリアントであってもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、配列番号８と全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むハエＡＤＣの切断型バリアントであってもよい。
【0025】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、その非切断型（例えば、完全長）親酵素と比較して増加した活性を表すＡＤＣのＮ末端切断断片と全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位、（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位、（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位、（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位、（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位、（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位、（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位、（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位、（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位、（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位に対して全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含んでいてもよい。これらのセグメントは、ベータ－アラニン産生において性能の向上を表すことが示されているか、または実施例５～７ならびに図２および３などの配列保存および多重配列アラインメントに基づいて性能の向上を表すことが予想され得る、野生型完全長昆虫ＡＤＣの断片に対応する。
【0026】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端の少なくともＸ個の連続した残基を欠如していてもよく、Ｘは５から５０の間の任意の整数である。一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端の長さに応じて、対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣのアミノ末端の少なくとも５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、または７０個の連続した残基を欠如していてもよい。
【0027】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、完全長野生型昆虫ＡＤＣのｎ位に対応する残基のすぐＣ末端（下流）の位置で切断されていてもよく、ｎは２からＹの間の任意の整数であり、Ｙは完全長野生型昆虫ＡＤＣ内の最もＣ末端の残基の位置であり、この位置での切断は完全長野生型ＡＤＣと比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表す切断型ＡＤＣを生じ得る。アミノ酸残基の番号付けに関連して本明細書で使用したように、「位置に対応する」という表現は、アミノ酸残基の番号付けが異なるタンパク質（例えば、異なる昆虫ＡＤＣ）間では異なるが、当業者であれば、本明細書で実証したように、広く利用可能なソフトウェア（例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ）を使用して、保存された残基を同定するための追加のオルソログを任意選択で含む２つのタンパク質間の配列アライメントを実施することによって、ある程度のアミノ酸配列同一性を共有する２つのタンパク質における対応する残基位置を決定できるであろうことを考慮する。
【0028】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７１位、（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７８位、（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～５５位、（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～５１位、（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７０位、（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７０位、（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７３位、（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７３位、（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７３位、（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～８２位、（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～７８位、（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～５２位、（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１～５６位、または（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸コンセンサス配列の１～４９１位のいずれか１つに対応する残基のＣ末端（下流）の位置で切断されていてもよい。上記のアミノ酸配列それぞれの上限は、表７および図３で示し、ＣｔＡＤＣのＫ７１に対応する完全長野生型昆虫ＡＤＣ内の残基位置を意味する。ＣｔＡＤＣの少なくともＫ７１までのＮ末端切断は、完全長野生型ＡＤＣと比較して、アスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表す切断型ＡＤＣ（ＣｔＡＤＣ７２－５６１）をもたらした。
【0029】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８０位、（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～８７位、（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～６４位、（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～６０位、（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～７９位、（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～７９位、（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～８２位、（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８２位、（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～８２位、（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～９１位、（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～８７位、（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～６１位、（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～６５位、または（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位のいずれか１つに対応する残基のＮ末端（上流）の位置で切断されていてもよい。これらの残基の位置は、表７および図３の破線で示された位置に対応する。
【0030】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣは、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７５位、（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の８２位、（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５９位、（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５５位、（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７４位、（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７４位、（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７７位、（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７７位、（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７７位、（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８６位、（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の８２位、（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５６位、（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の６０位、または（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位のいずれか１つに対応する残基のＮ末端（上流）の位置で切断されていてもよい。これらの残基位置は、図３でアラインメントした全昆虫配列全体で変換されているトリペプチド配列「ＳＬＰ」内に存在するＣｔＡＤＣのＳ７５に対応する。
【0031】
さらなる態様では、本明細書では、アスパラギン酸１－デカルボキシラーゼ活性を有する組換えタンパク質であって、（ａ）配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｂ）配列番号４で記載したＡａＡＤＣのアミノ酸配列の７９～５６８位、（ｃ）配列番号３で記載したＡｔＡＤＣのアミノ酸配列の５６～５４４位、（ｄ）配列番号１で記載したＴｃＡＤＣのアミノ酸配列の５２～５４０位、（ｅ）配列番号１０で記載したＡａ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６０位、（ｆ）配列番号１１で記載したＡａ３ＡＤＣのアミノ酸配列の７１～５６２位、（ｇ）配列番号９で記載したＣｑＡＤＣのアミノ酸配列の７４～５６３位、（ｈ）配列番号１３で記載したＡａ４ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｉ）配列番号１４で記載したＡｄＡＤＣのアミノ酸配列の７４～６２４位、（ｊ）配列番号１２で記載したＡｓＡＤＣのアミノ酸配列の８３～５７２位、（ｋ）配列番号１５で記載したＡｓ２ＡＤＣのアミノ酸配列の７２～５６１位、（ｌ）配列番号６で記載したＴｍＡＤＣのアミノ酸配列の５３～５４１位、（ｍ）配列番号５で記載したＡｖＡＤＣのアミノ酸配列の５７～５７２位、または（ｎ）配列番号２９で記載したアミノ酸配列の１～４９１位に対して全体で少なくとも８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％同一であるアミノ酸配列を含む組換えタンパク質について記載する。これらの領域は、本明細書において、少なくとも蚊およびカブトムシのＡＤＣの間で高度に保存されていることが判明しただけでなく、完全長野生型ＣｔＡＤＣと比較してアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換の増加を表すことが判明したＣｔＡＤＣ７２－５６１の切断型バリアントにも対応する。
【0032】
一部の実施形態では、本明細書で記載した切断型ＡＤＣおよび／または組換えタンパク質は、配列番号２で記載したＣｔＡＤＣのアミノ酸配列の９６位に対応する位置にグリシン残基を含んでいてもよい。ＣｔＡＤＣは、実施例２で実施した酵素活性試験から、約９７％のアミノ酸配列同一性を共有する蚊の対応酵素ＣｑＡＤＣの活性よりも３９％超増加していることなど、他の昆虫由来ＡＤＣより大いに優れていた。実施例８で実施した酵素の触媒部分におけるＣｔＡＤＣとＣｑＡＤＣとの間のアミノ酸の違いの比較によって、分析したその他の全昆虫配列の中で特有なＣｔＡＤＣの９６位の単一のグリシン残基が明らかになり（図３を参照）、この残基がＣｔＡＤＣに関連するベータ－アラニン産生の増大に役割を果たしている可能性があることを示唆している。
【0033】
さらなる態様では、本明細書では、組換え切断型昆虫ＡＤＣまたは本明細書で記載した組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドについて記載する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＤＮＡである。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドはＲＮＡである。
【0034】
さらなる態様では、本明細書では、配列番号１６～２７のいずれか１つの核酸配列、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣをコードする核酸配列、本明細書で記載した切断型組換えタンパク質をコードする核酸配列、またはそれらの任意の組み合わせの完全相補体とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチド分子について記載する。
【0035】
さらなる態様では、本明細書では、プロモータ（例えば、昆虫ＡＤＣに関して異種である）に作動可能に連結した本明細書で記載した単離または組換えポリヌクレオチドを含む発現カセットについて記載する。
【0036】
さらなる態様では、本明細書では、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣまたは組換えタンパク質を発現し、かつ／または本明細書で記載したポリヌクレオチドまたは発現カセットで形質転換されるか、またはそれらを含むように操作された宿主細胞について記載する。一部の実施形態では、宿主細胞は微生物細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞は細菌、昆虫、哺乳動物、酵母、または真菌細胞であってもよい。
【0037】
さらなる態様では、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣ、組換えタンパク質、または宿主細胞は、アスパラギン酸からのベータ－アラニンの工業的生産に使用するためのものであってもよい。さらなる態様では、本明細書では、ベータ－アラニンの産生のための方法であって、（ａ）本明細書で記載した切断型昆虫ＡＤＣであるＡＤＣ酵素源、本明細書で記載した組換えタンパク質、および／または本明細書で記載した宿主細胞を提供するステップ、（ｂ）ＡＤＣ酵素源がアスパラギン酸のベータ－アラニンへの変換を触媒することが可能である条件下で、ＡＤＣ酵素源をアスパラギン酸源と接触させるステップ、ならびに（ｃ）産生したベータ－アラニンを単離および／または濃縮するステップを含む方法について記載する。一部の実施形態では、本明細書で記載した組換え切断型昆虫ＡＤＣまたは組換えタンパク質を発現する宿主細胞を無傷の細胞として利用することができ、有利には、溶解細胞の細胞破片が産生されたベータ－アラニンに混入するのを防止することができる。
【0038】
さらなる態様では、本明細書では、本明細書で記載した方法によって産生されるベータ－アラニンを含む組成物について記載する。
【実施例】
【0039】
実施例１：全般的な材料および方法
Ｌ－アスパラギン酸－α－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）酵素のクローニングおよび発現
クローン化され細菌内で発現したＡＤＣのコドン最適化ｃＤＮＡ配列を配列番号１６～２７に示す。ＡＤＣのｃＤＮＡ配列を別の発現ベクターにクローン化し、誘導物質の添加によってＡＤＣの発現を増強するために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換した。Ｎ末端切断のために、開始剤メチオニンの下流の所望の数のアミノ酸を削除した。
Ｌ－アスパラギン酸－α－デカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）酵素のクローニングおよび発現
クローン化され細菌内で発現したＡＤＣのコドン最適化ｃＤＮＡ配列を配列番号１６～２７に示す。ＡＤＣのｃＤＮＡ配列を別の発現ベクターにクローン化し、誘導物質の添加によってＡＤＣの発現を増強するために大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）に形質転換した。Ｎ末端切断のために、開始剤メチオニンの下流の所望の数のアミノ酸を削除した。
【0040】
ＡＤＣ活性測定
ＡＤＣ活性は、まず目的のＡＤＣを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、カナマイシンおよび０．２％イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢブロス５００μＬ中で３０℃で２４時間増殖させることによって測定した。次いで、細胞をペレットにして上清を除去し、再懸濁して超音波破砕した。次に、プレートを遠心分離して破片を除去し、細胞溶解物を含有する上清を収集した。次に、最終濃度６０ｇ／ＬのＬ－アスパラギン酸および最終濃度０．２ｇ／Ｌのリン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）を含有する溶液５０ｍＬ中で上清５０μＬをｐＨ６．５、温度３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートすることによって、ＡＤＣを含有する細胞溶解物の活性を試験した。次いで、硫酸１Ｍを反応溶液に滴定してｐＨを維持した。１時間後、ＡＤＣ活性を直接測定するために、反応に使用された硫酸の量を判定した。実験は少なくとも３回実行し、平均活性値を算出した。
ＡＤＣ活性は、まず目的のＡＤＣを発現するＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、カナマイシンおよび０．２％イソプロピルβ－ｄ－１－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を含有するＬＢブロス５００μＬ中で３０℃で２４時間増殖させることによって測定した。次いで、細胞をペレットにして上清を除去し、再懸濁して超音波破砕した。次に、プレートを遠心分離して破片を除去し、細胞溶解物を含有する上清を収集した。次に、最終濃度６０ｇ／ＬのＬ－アスパラギン酸および最終濃度０．２ｇ／Ｌのリン酸ピリドキサール（ＰＬＰ）を含有する溶液５０ｍＬ中で上清５０μＬをｐＨ６．５、温度３７℃、２００ｒｐｍで撹拌しながらインキュベートすることによって、ＡＤＣを含有する細胞溶解物の活性を試験した。次いで、硫酸１Ｍを反応溶液に滴定してｐＨを維持した。１時間後、ＡＤＣ活性を直接測定するために、反応に使用された硫酸の量を判定した。実験は少なくとも３回実行し、平均活性値を算出した。
【0041】
実施例２：昆虫由来ＡＤＣの活性
細菌宿主細胞で組換え発現させた場合の、複数の異なる原核生物および真核生物のＡＤＣ酵素の発現および活性を比較するために、大規模なスクリーニングを実施した。このスクリーニングによって、昆虫種のＡＤＣで形質転換された細菌細胞の溶解物は、その他の生物のＡＤＣよりも一貫して高いベータ－アラニン産生を表すことが明らかになった。表２は、実施例１で記載したように測定した、蚊、ハエ、およびカブトムシ種のＡＤＣのコドン最適化ｃＤＮＡで形質転換された細菌の溶解物の相対的ＡＤＣ活性を示す。興味深いことに、蚊種Ｃｕｌｅｘ ｔａｒｓａｌｉｓのＡＤＣ（ＣｔＡＤＣ；配列番号２）で形質転換された細菌の溶解物は、試験したその他の全酵素よりも大いに優れた性能を示した。
細菌宿主細胞で組換え発現させた場合の、複数の異なる原核生物および真核生物のＡＤＣ酵素の発現および活性を比較するために、大規模なスクリーニングを実施した。このスクリーニングによって、昆虫種のＡＤＣで形質転換された細菌細胞の溶解物は、その他の生物のＡＤＣよりも一貫して高いベータ－アラニン産生を表すことが明らかになった。表２は、実施例１で記載したように測定した、蚊、ハエ、およびカブトムシ種のＡＤＣのコドン最適化ｃＤＮＡで形質転換された細菌の溶解物の相対的ＡＤＣ活性を示す。興味深いことに、蚊種Ｃｕｌｅｘ ｔａｒｓａｌｉｓのＡＤＣ（ＣｔＡＤＣ；配列番号２）で形質転換された細菌の溶解物は、試験したその他の全酵素よりも大いに優れた性能を示した。
【0042】
【表2】
ＣｔＡＤＣのアミノ酸配列は、様々な種のその他のＡＤＣを同定するためのＰｒｏｔｅｉｎ ＢＬＡＳＴ（商標）のベースとして使用した。５０００を超えるヒット配列を検索し、次にそのうちの最高のＢＬＡＳＴスコアを有する１８８配列を選択し、表２の昆虫由来ＡＤＣの配列と組み合わせて、８５％の配列同一性によってグループ化し、最終的に広範な昆虫系統樹に組み込んだ（図１）。図１に示した系統樹は、蚊およびハエのＡＤＣが構造的に関連しており、カブトムシ、ノミ、ゴキブリ、およびシロアリのＡＤＣが構造的に関連していることを示している。
【0043】
実施例４：蚊由来ＡＤＣの配列分析
９種の異なる蚊種から同定されたＡＤＣのアミノ酸配列のアラインメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（１．２．４）を使用して実施したので、図２に示す。以下の表３のパーセント同一性マトリックスで示したように、アラインメントによって、様々な蚊種全体で比較的高度に配列が保存されていることが明らかになった。
９種の異なる蚊種から同定されたＡＤＣのアミノ酸配列のアラインメントを、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｏｍｅｇａ（１．２．４）を使用して実施したので、図２に示す。以下の表３のパーセント同一性マトリックスで示したように、アラインメントによって、様々な蚊種全体で比較的高度に配列が保存されていることが明らかになった。
【0044】
【表3】
興味深いことに、図２のアライメントによって、図２に破線で示した蚊ＡＤＣのアミノ末端に向かって配列の保存性が低い領域が明らかになり、これは分析した蚊ＡＤＣ全てにわたって１００％保存されていた１５アミノ酸セグメント（ＳＧＳＤＳＡＧＶＳＥＤＥＤＶＱ；配列番号２８）の直後にあった。その活性におけるＣｔＡＤＣのＮ末端の役割を研究するために、細菌中で進行性Ｎ末端切断を生じさせて発現させ、それらのＡＤＣ活性を実施例１で記載したように特徴付けた。表４で示したように、１１～７１アミノ酸の範囲のＮ末端切断はベータ－アラニン産生を２４％～１００％と顕著に増加させた。しかし、ＣｔＡＤＣのＮ末端から８１アミノ酸以上を切断すると、ＡＤＣの酵素活性は検出されなかった。
【0045】
【表4】
【0046】
【表5-1】
２つのカブトムシＡＤＣについて、細菌中で進行性Ｎ末端切断を生じさせて発現させ、それらのＡＤＣ活性を実施例１で記載したように特徴付けた。結果は、ＡｔＡＤＣについては表５およびＴｃＡＤＣについては表６に示す。ＡｔＡＤＣについては、Ｎ末端４５アミノ酸を切断することによって、ベータ－アラニン産生の顕著な２５６％増加が認められた。しかし、ＡｔＡＤＣの１１４アミノ酸以上を切断すると、ＡＤＣの酵素活性は検出されなかった（表５）。ＴｃＡＤＣについては、１０～５０アミノ酸の範囲のＮ末端切断はベータ－アラニン産生を１０％～３３０％増加させた。しかし、ＴｃＡＤＣのＮ末端から６０アミノ酸を切断すると、ＡＤＣの酵素活性は検出されなかった（ＴｃＡＤＣＮ６、表６）。
【0047】
【表5-2】
【0048】
【表6】
実施例５および６で記載した蚊およびカブトムシのＡＤＣのＮ末端配列のアラインメントを図３に示す。図３のアラインメントは、実施例５および６におけるＮ末端切断の結果を視覚化し、理解するのに役立ち、黒で強調された２つの残基間のＮ末端切断は、対応する完全長タンパク質と比較して活性が増加した切断型ＡＤＣをもたらした。反対に、白で囲った２つの残基間のＮ末端切断は、検出可能なＡＤＣ活性を有さない切断型ＡＤＣをもたらした。したがって、最高の分解能をもたらすＣｔＡＤＣおよびＴｃＡＤＣに関する切断実験では、破線で示された領域が、Ｎ末端切断がベータ－アラニン産生に有益でなくなると予想される位置を示している。蚊およびカブトムシのＡＤＣにおける残基のそれぞれの位置を表７に示す。図３の破線で印した領域はまた、蚊とカブトムシのＡＤＣの間でより大きな配列保存の開始と一致しており、トリペプチド配列「ＳＬＰ」はアラインメントされた配列全ての間で１００％保存されている。特定の理論に束縛されることを望むものではないが、保存された「ＳＬＰ」トリペプチド内のセリン（またはその上流）のＮ末端の切断は、ベータ－アラニン産生の増加に有益であり得る一方、保存されたセリンの下流の切断は有害であり得る（表７）。
【0049】
【表7】
【0050】
実施例８：ＣｔＡＤＣとその他の蚊種のＡＤＣとの比較
ＣｔＡＤＣは、実施例２で実施した酵素活性試験から、その他の昆虫由来のＡＤＣの性能を大幅に上回った。表２で示した活性に基づくと、ＣｔＡＤＣは、次に優れた蚊（ＡａＡＤＣ）およびハエ（ＤｍＡＤＣ）の昆虫由来ＡＤＣよりもベータ－アラニン産生の２５％増加を表した。興味深いことに、ＣｔＡＤＣはＣｑＡＤＣ（これも蚊に由来する）と全体のアミノ酸配列の約９７％の同一性を共有しているが、表２の結果から、ＣｔＡＤＣがＣｑＡＤＣよりも３９％高いベータ－アラニン産生を表すことが明らかである。表４で示した結果は、ＣｔＡＤＣの少なくともＮ末端の７１残基が、ＡＤＣ活性を阻害することなく切断され得ることを明らかにしている（ＣｔＡＤＣＮ７）。したがって、ＣｔＡＤＣの残基７２～５６１内のＣｔＡＤＣとＣｑＡＤＣとの間のアミノ酸の違いを調べると、７つのアミノ酸置換のみが明らかになった。７つのアミノ酸置換のうち６つは、様々な蚊ＡＤＣオルソログに見いだされる残基に対応する。興味深いことに、ＣｔＡＤＣに特有の唯一の残基は９６位のグリシンであった（図２で黒く強調された残基を参照）。実際に、完全長ＣｔＡＤＣ（配列番号２）の９６位に対応するグリシンは、分析したその他のいかなる蚊またはカブトムシの配列にも見いだされず（図３を参照）、この残基が、ＣｔＡＤＣに関連するベータ－アラニン産生の強化に役割を担っている可能性を示唆している。
ＣｔＡＤＣは、実施例２で実施した酵素活性試験から、その他の昆虫由来のＡＤＣの性能を大幅に上回った。表２で示した活性に基づくと、ＣｔＡＤＣは、次に優れた蚊（ＡａＡＤＣ）およびハエ（ＤｍＡＤＣ）の昆虫由来ＡＤＣよりもベータ－アラニン産生の２５％増加を表した。興味深いことに、ＣｔＡＤＣはＣｑＡＤＣ（これも蚊に由来する）と全体のアミノ酸配列の約９７％の同一性を共有しているが、表２の結果から、ＣｔＡＤＣがＣｑＡＤＣよりも３９％高いベータ－アラニン産生を表すことが明らかである。表４で示した結果は、ＣｔＡＤＣの少なくともＮ末端の７１残基が、ＡＤＣ活性を阻害することなく切断され得ることを明らかにしている（ＣｔＡＤＣＮ７）。したがって、ＣｔＡＤＣの残基７２～５６１内のＣｔＡＤＣとＣｑＡＤＣとの間のアミノ酸の違いを調べると、７つのアミノ酸置換のみが明らかになった。７つのアミノ酸置換のうち６つは、様々な蚊ＡＤＣオルソログに見いだされる残基に対応する。興味深いことに、ＣｔＡＤＣに特有の唯一の残基は９６位のグリシンであった（図２で黒く強調された残基を参照）。実際に、完全長ＣｔＡＤＣ（配列番号２）の９６位に対応するグリシンは、分析したその他のいかなる蚊またはカブトムシの配列にも見いだされず（図３を参照）、この残基が、ＣｔＡＤＣに関連するベータ－アラニン産生の強化に役割を担っている可能性を示唆している。
【図1】
【図2-1】
【図2-2】
【図3】
【配列表】
【国際調査報告】