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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-02-29
(54)【発明の名称】ＳＧＬＴ－１阻害剤およびその使用
(51)【国際特許分類】
A61K 45/00 20060101AFI20240221BHJP
A61P 43/00 20060101ALI20240221BHJP
A61P 1/16 20060101ALI20240221BHJP
A61K 31/7088 20060101ALI20240221BHJP
A61K 31/713 20060101ALI20240221BHJP
A61K 38/02 20060101ALI20240221BHJP
A61K 39/395 20060101ALI20240221BHJP
A61P 3/00 20060101ALI20240221BHJP
C12N 15/113 20100101ALI20240221BHJP
C12N 15/115 20100101ALI20240221BHJP
A61K 31/351 20060101ALI20240221BHJP
【ＦＩ】
A61K45/00 ZNA
A61P43/00 111
A61P43/00 105
A61P1/16
A61K31/7088
A61K31/713
A61K38/02
A61K39/395 D
A61K39/395 N
A61P3/00
C12N15/113 Z
C12N15/115 Z
A61K31/351
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023553556
(86)(22)【出願日】2022-03-04
(85)【翻訳文提出日】2023-10-31
(86)【国際出願番号】 US2022018958
(87)【国際公開番号】W WO2022187658
(87)【国際公開日】2022-09-09
(31)【優先権主張番号】63/157,435
(32)【優先日】2021-03-05
(33)【優先権主張国・地域又は機関】US
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】507238218
【氏名又は名称】ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン
(71)【出願人】
【識別番号】515252189
【氏名又は名称】ウェイン ステイト ユニバーシティー
(74)【代理人】
【識別番号】110000338
【氏名又は名称】弁理士法人 ＨＡＲＡＫＥＮＺＯ ＷＯＲＬＤ ＰＡＴＥＮＴ ＆ ＴＲＡＤＥＭＡＲＫ
(72)【発明者】
【氏名】シュー，ジエ
(72)【発明者】
【氏名】チャン，ケジョン
(72)【発明者】
【氏名】リアン，シウビン
(72)【発明者】
【氏名】チェン，ユチン ユージーン
【テーマコード（参考）】
4C084
4C085
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C084AA17
4C084BA03
4C084NA14
4C084ZA751
4C084ZA752
4C084ZB211
4C084ZB212
4C084ZC021
4C084ZC022
4C084ZC211
4C084ZC212
4C084ZC331
4C084ZC332
4C084ZC351
4C084ZC352
4C084ZC411
4C084ZC412
4C085AA13
4C085AA14
4C085CC22
4C085CC23
4C085DD62
4C085EE01
4C086AA01
4C086AA02
4C086BA07
4C086EA16
4C086MA01
4C086MA04
4C086NA14
4C086ZA75
4C086ZC02
4C086ZC21
4C086ZC41
(57)【要約】
本発明は、医薬薬理学の分野におけるものである。特に、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患ならびにＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
【特許請求の範囲】
【請求項1】
ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物。
【請求項2】
上記医薬剤が低分子、抗体、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、または模倣ペプチドである、請求項１に記載の組成物。
【請求項3】
上記医薬剤が、フロリジン、カナグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－｛３－［５－［４－フルオロ－フェニル］－チオフェン－２－イルメチル］－４－メチル－フェニル｝－６－ヒドロキシメチル－テトラヒドロ－ピラン－３，４，５－トリオール）、ダパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－（４－エトキシベンジル）フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）－テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリオール）、エムパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－［［４－［（３Ｓ）－オキソラン－３－イル］オキシフェニル］メチル］フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－３，４，５－トリオール）、レモグリフロジン（５－メチル－４－［４－（１－メチルエトキシ）ベンジル］－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、セルグリフロジン（２－（４－メトキシベンジル）フェニル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、およびトホグリフロジン（（１Ｓ，３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｓ，６’Ｒ）－６－（４－エチルベンジル）－６’－（ヒドロキシメチル）－３’，４’，５’，６’－テトラヒドロ－３Ｈ－スピロ［２－ベンゾフラン－１，２’－ピラン］－３’，４’，５’－トリオール水和物（１：１））、およびソタグリフロジン（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－（４－クロロ－３－（４－エトキシベンジル）フェニル）－６－（メチルチオ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリオール（ＬＸ４２１１）、またはその薬学的に許容される塩から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項4】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるＳＧＬＴ－１の活性を阻害する方法。
【請求項5】
上記被験体が、以下のうちの１つ以上を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状に罹患しているかまたは罹患するリスクがある、請求項４に記載の方法：ＳＧＬＴ－１活性の上昇；
小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加；および
肝炎の増加。
【請求項6】
ＳＧＬＴ－１活性の上昇、ＥＲストレスの増加、および／または肝炎の増加のうちの１つ以上を特徴とする上記１つ以上の肝臓の疾患および／または症状が、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害、薬剤誘発性肝障害、ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ）から選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項7】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項４に記載の方法。
【請求項8】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における以下のうちの１つ以上に関連する肝臓の疾患および／または症状に関連する１つ以上の症候を処置、改善および／または予防する方法：ＳＧＬＴ－１活性の上昇；
小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加；および
肝炎の増加。
【請求項9】
上記被験体が、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、ＥＲストレスの増加、および／または肝炎の増加（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎、胆汁うっ滞性肝疾患、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を特徴とする、１つ以上の肝臓の疾患および／または症状に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項８に記載の方法。
【請求項10】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項８に記載の方法。
【請求項11】
上記１つ以上の症候が、肝機能の低下、肝および代謝調節障害、ならびに肝ＥＲストレスおよび関連炎症反応から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項12】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるＣＦＬＤを処置、改善および／または予防する方法。
【請求項13】
上記被験体がＣＦＬＤに罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項１２に記載の方法。
【請求項14】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項１２に記載の方法。
【請求項15】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における自然発生的肝胆道系病変を処置、改善および／または予防する方法。
【請求項16】
上記被験体が自然発生的肝胆道系病変に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項１５に記載の方法。
【請求項17】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項１５に記載の方法。
【請求項18】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における肝障害を処置、改善および／または予防する方法。
【請求項19】
上記被験体が肝障害に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項１８に記載の方法。
【請求項20】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項１８に記載の方法。
【請求項21】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体におけるＮＡＳＨを処置、改善および／または予防する方法。
【請求項22】
上記被験体がＮＡＳＨに罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項２１に記載の方法。
【請求項23】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項２２に記載の方法。
【請求項24】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における脂質およびグルコースの恒常性の変化を処置、改善および／または予防する方法。
【請求項25】
上記被験体が、脂質およびグルコースの恒常性の変化に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項２４に記載の方法。
【請求項26】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項２４に記載の方法。
【請求項27】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応を処置、改善および／または予防する方法。
【請求項28】
上記被験体が、肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項２７に記載の方法。
【請求項29】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項２７に記載の方法。
【請求項30】
請求項１に記載の組成物を被験体に投与することを含む、被験体における肝および代謝調節障害の処置、改善および／または予防する方法。
【請求項31】
上記被験体が、肝および代謝調節障害に罹患しているかまたは罹患するリスクがあるまたは罹患するリスクがある、請求項３０に記載の方法。
【請求項32】
上記医薬剤の投与が、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす、請求項３０に記載の方法。
【請求項33】
（１）請求項１に記載の組成物、（２）容器、パックまたはディスペンサー、および
（３）投与のための説明書、
を含む、キット。
【請求項34】
請求項１に記載の組成物を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【0001】
〔関連出願への相互参照〕
本出願は、２０２１年３月５日出願の米国仮出願第６３／１５７，４３５号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、２０２１年３月５日出願の米国仮出願第６３／１５７，４３５号の優先権の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【0002】
〔連邦政府の支援を受けた研究または開発に関する記載〕
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＨＬ１３３１６２の政府支援を受けて成されたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＨＬ１３３１６２の政府支援を受けて成されたものである。政府は本発明について一定の権利を有する。
【0003】
〔発明の分野〕
本発明は、医薬薬理学の分野におけるものである。特に、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患ならびにＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
本発明は、医薬薬理学の分野におけるものである。特に、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患ならびにＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
【0004】
〔緒言〕
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体遺伝性疾患である（１）。ＣＦ関連肝疾患（ＣＦＬＤ）は、ＣＦにおける死亡原因の第３位を占めている（２）。この疾患は、呼吸器、外分泌膵臓、腸、肝胆道系および汗腺の上皮を含む複数の臓器に影響を及ぼすため複雑であり、これらはＣＦＴＲが発現し、重要な機能を担っている。１９８９年にＣＦＴＲ遺伝子がクローニング以来、ＣＦの病態解明は大きく進展している。２０１９年１０月、ＦＤＡは、ＣＦＴＲ増強剤ＶＸ－７７０ならびにＣＦＴＲコレクターＶＸ－４４５およびＶＸ－６６１の組合せであるトリカフタ（Trikafta）を承認し、９０％超のＣＦ患者に効果をもたらしている（３）。しかしながら、多くの臓器における病態および臓器レベルの治療に対する応答性に関する多くの重要な問題が残されている。
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）遺伝子の変異によって引き起こされる常染色体遺伝性疾患である（１）。ＣＦ関連肝疾患（ＣＦＬＤ）は、ＣＦにおける死亡原因の第３位を占めている（２）。この疾患は、呼吸器、外分泌膵臓、腸、肝胆道系および汗腺の上皮を含む複数の臓器に影響を及ぼすため複雑であり、これらはＣＦＴＲが発現し、重要な機能を担っている。１９８９年にＣＦＴＲ遺伝子がクローニング以来、ＣＦの病態解明は大きく進展している。２０１９年１０月、ＦＤＡは、ＣＦＴＲ増強剤ＶＸ－７７０ならびにＣＦＴＲコレクターＶＸ－４４５およびＶＸ－６６１の組合せであるトリカフタ（Trikafta）を承認し、９０％超のＣＦ患者に効果をもたらしている（３）。しかしながら、多くの臓器における病態および臓器レベルの治療に対する応答性に関する多くの重要な問題が残されている。
【0005】
ＣＦ関連肝疾患（ＣＦＬＤ）は、ＣＦ患者の約３分の１が罹患しており、ＣＦにおける肺が関連しない主要な死亡原因である（２）。ＣＦＬＤの臨床兆候は、胆汁うっ滞、巣状胆汁性肝硬変、肝脂肪症、線維化、微小胆嚢の存在等、多様である。ＣＦＬＤのピークは小児であるが、ＣＦ患者の寿命が延びたことに伴い、過去１０年間にＣＦ成人における肝疾患の第二波が報告されている。トリカフタ後の時代において、ＣＦＬＤ等の肺が関連しないＣＦ疾患は、新規で有効な治療法を必要とする優先順位リストに上がっている。
【0006】
今日まで、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）は、ＣＦＬＤの処置としてＦＤＡの承認を得ている唯一の薬剤である。しかし、少なくとも一部の臨床医および研究者によれば、肝組織の改善、死亡率、無肝移植生存率等のハードエンドポイントを評価したランダム化比較試験による説得力のあるデータがないため、ＣＦＬＤに対するＵＤＣＡの有効性については、依然として議論の余地がある（４）。トリカフタは、肺機能に顕著な効果があるにもかかわらず、主要な肝機能酵素であるＡＬＴ、ＡＳＴ等の値を上昇させる。実際、肝機能への悪影響はこの薬の主な副作用であり、ＣＦＬＤを悪化させる懸念がある。
【0007】
したがって、ＣＦＬＤおよび関連する臨床症候を処置および／または改善するための、方法および技術の改善が必要とされている。
【0008】
本発明はこの必要性に応えるものである。
【0009】
〔要約〕
選択的ＳＧＬＴ２阻害剤およびＳＧＬＴ１／２二重阻害剤（dual inhibitor）を含む、ナトリウム－グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）阻害剤は、糖尿病治療の主流になりつつある。今日のところ、肝疾患におけるＳＧＬＴ阻害剤の効果は体系的に検証されていない。本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験では、嚢胞性線維症肝疾患（ＣＦＬＤ）のウサギモデルを利用して、肝疾患に対するＳＧＬＴ阻害剤の効果を検討した。ＣＦウサギにおけるＣＦＬＤ様表現型には、自然発生的肝胆道系病変、肝障害および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）活性の上昇、脂質およびグルコースの恒常性の変化が含まれる。実験では、ＣＦウサギの肝臓において、加齢に伴う小胞体（ＥＲ）ストレス応答またはＵＰＲトランスデューサーであるＩＲＥ１αとその下流の転写因子スプライシング型（spliced）ＸＢＰ１（ＸＢＰ１ｓ）を介した不良タンパク質応答（ＵＰＲ、unfolded protein response）の活性化、ならびにＮＦ－ｋＢ炎症経路の活性化が確認された。ＣＦウサギおよびＷＴウサギのＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２の発現量を決定したところ、ＳＧＬＴ２の発現は、ヒトで報告されているように、大部分が腎臓に限局しており、ＣＦウサギおよびＷＴウサギで差がないことが明らかになった。一方、ＳＧＬＴ１の発現はＣＦウサギの肝臓および他の臓器において上昇していた。次に、ＣＦウサギにＳＧＬＴ１／２二重阻害剤であるソタグリフロジン（Ｓｏｔａ、１５ｍｇ／ｋｇ／日）を４週間毎日経口投与する実験を行った。Ｓｏｔａ処置は、体重および寿命を増加させ、血糖恒常性を回復させ、肝機能を改善させるという驚くべき有益な効果をＣＦウサギに及ぼした。重要なことは、Ｓｏｔａ処置は、ＣＦウサギにおいて、肝ＥＲストレスおよび炎症反応を緩和し、肝および代謝調節障害を減衰させたことである。このような結果は、Ｓｏｔａ等のＳＧＬＴ阻害剤が、グルコース輸送を抑制することにより、肝炎ストレス応答を減衰させ、ＮＡＳＨ状態を改善し、肝疾患の表現型を改善することで、ＣＦＬＤ等の肝疾患に有益な効果をもたらすことを示している。
選択的ＳＧＬＴ２阻害剤およびＳＧＬＴ１／２二重阻害剤（dual inhibitor）を含む、ナトリウム－グルコース共輸送体（ＳＧＬＴ）阻害剤は、糖尿病治療の主流になりつつある。今日のところ、肝疾患におけるＳＧＬＴ阻害剤の効果は体系的に検証されていない。本発明の実施形態を開発する過程で行われた実験では、嚢胞性線維症肝疾患（ＣＦＬＤ）のウサギモデルを利用して、肝疾患に対するＳＧＬＴ阻害剤の効果を検討した。ＣＦウサギにおけるＣＦＬＤ様表現型には、自然発生的肝胆道系病変、肝障害および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）活性の上昇、脂質およびグルコースの恒常性の変化が含まれる。実験では、ＣＦウサギの肝臓において、加齢に伴う小胞体（ＥＲ）ストレス応答またはＵＰＲトランスデューサーであるＩＲＥ１αとその下流の転写因子スプライシング型（spliced）ＸＢＰ１（ＸＢＰ１ｓ）を介した不良タンパク質応答（ＵＰＲ、unfolded protein response）の活性化、ならびにＮＦ－ｋＢ炎症経路の活性化が確認された。ＣＦウサギおよびＷＴウサギのＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２の発現量を決定したところ、ＳＧＬＴ２の発現は、ヒトで報告されているように、大部分が腎臓に限局しており、ＣＦウサギおよびＷＴウサギで差がないことが明らかになった。一方、ＳＧＬＴ１の発現はＣＦウサギの肝臓および他の臓器において上昇していた。次に、ＣＦウサギにＳＧＬＴ１／２二重阻害剤であるソタグリフロジン（Ｓｏｔａ、１５ｍｇ／ｋｇ／日）を４週間毎日経口投与する実験を行った。Ｓｏｔａ処置は、体重および寿命を増加させ、血糖恒常性を回復させ、肝機能を改善させるという驚くべき有益な効果をＣＦウサギに及ぼした。重要なことは、Ｓｏｔａ処置は、ＣＦウサギにおいて、肝ＥＲストレスおよび炎症反応を緩和し、肝および代謝調節障害を減衰させたことである。このような結果は、Ｓｏｔａ等のＳＧＬＴ阻害剤が、グルコース輸送を抑制することにより、肝炎ストレス応答を減衰させ、ＮＡＳＨ状態を改善し、肝疾患の表現型を改善することで、ＣＦＬＤ等の肝疾患に有益な効果をもたらすことを示している。
【0010】
したがって、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患およびＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
【0011】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を提供する。
【0012】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＳＧＬＴ－１の活性を阻害する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびに肝細胞癌（ＨＣＣ））を特徴とする、１つ以上の肝臓の疾患および／または症状に罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0013】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状を被験体において処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0014】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加に関連する肝臓の疾患および／または症状に関連する１つ以上の症候を被験体において処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0015】
このような方法は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、ＥＲストレスの増加、および／または肝炎の増加に関連する肝臓の疾患および／または症状に関連する特定の症候の処置、改善、および／または予防に限定されない。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0016】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＣＦＬＤを処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＣＦＬＤに罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0017】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における自然発生的肝胆道系病変を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、自然発生的肝胆道系病変に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0018】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝障害を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝障害に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0019】
特定の実施形態において、本発明は、被験体においてＮＡＳＨを処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＮＡＳＨに罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0020】
特定の実施形態において、本発明は、対象における脂質およびグルコースの恒常性の変化を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、脂質およびグルコースの恒常性の変化に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0021】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0022】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝および代謝調節障害を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝および代謝調節障害に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0023】
特定の実施形態において、本発明は、（１）ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物、（２）容器、パック、またはディスペンサー、および（３）投与のための説明書を含むキットを提供する。
【0024】
このような組成物、方法、およびキットは、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる特定のタイプまたは種類の医薬剤に限定されない。いくつかの実施形態において、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤は、低分子、抗体、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、または模倣ペプチドである。
【0025】
いくつかの実施形態において、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤は、例えば、フロリジン、カナグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－｛３－［５－［４－フルオロ－フェニル］－チオフェン－２－イルメチル］－４－メチル－フェニル｝－６－ヒドロキシメチル－テトラヒドロ－ピラン－３，４，５－トリオール）、ダパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－（４－エトキシベンジル）フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）－テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリオール）、エムパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－［［４－［（３Ｓ）－オキソラン－３－イル］オキシフェニル］メチル］フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－３，４，５－トリオール）、レモグリフロジン（５－メチル－４－［４－（１－メチルエトキシ）ベンジル］－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、セルグリフロジン（２－（４－メトキシベンジル）フェニル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、およびトホグリフロジン（（１Ｓ，３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｓ，６’Ｒ）－６－（４－エチルベンジル）－６’－（ヒドロキシメチル）－３’，４’，５’，６’－テトラヒドロ－３Ｈ－スピロ［２－ベンゾフラン－１，２’－ピラン］－３’，４’，５’－トリオール水和物（１：１））、およびソタグリフロジン（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－（４－クロロ－３－（４－エトキシベンジル）フェニル）－６－（メチルチオ）テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリオール（ＬＸ４２１１）、またはその薬学的に許容される塩から選択されるが、これらに限定されない。
【0026】
〔図面の簡単な説明〕
（図１）
ＣＦウサギの選択された典型的なＣＦ表現型。（Ａ）ＷＴ（黒色の点）と比較した、ＧＩ下剤あり（オレンジの点）またはなし（青色の点）のＣＦウサギの生存率。（Ｂ）ＣＦウサギ腸上皮細胞の典型的な欠陥短絡反応（グレーのバー）とＷＴウサギの正常反応（白のバー）。ＷＴ（左）のウサギでは観察されなかったが、グルコースとフロリジン（糞便ペレットのＳＧＬＴ１／２非存在）後に上昇したグレーのバー（ＣＦ）に注目。矢印：閉塞点。
（図１）
ＣＦウサギの選択された典型的なＣＦ表現型。（Ａ）ＷＴ（黒色の点）と比較した、ＧＩ下剤あり（オレンジの点）またはなし（青色の点）のＣＦウサギの生存率。（Ｂ）ＣＦウサギ腸上皮細胞の典型的な欠陥短絡反応（グレーのバー）とＷＴウサギの正常反応（白のバー）。ＷＴ（左）のウサギでは観察されなかったが、グルコースとフロリジン（糞便ペレットのＳＧＬＴ１／２非存在）後に上昇したグレーのバー（ＣＦ）に注目。矢印：閉塞点。
【0027】
（図２）
ＣＦウサギは肝胆道系病変および胆汁分泌異常を示す。ＣＦウサギの典型的な胆汁性肝硬変（矢印）および粘液栓を示す約６０日齢のＣＦウサギおよびＷＴウサギの肝臓切片のＨＥ（Ａ）およびシリウスレッドコラーゲン（Ｂ）の染色。（Ｃ）ＣＦウサギおよびＷＴウサギの胆嚢からの胆汁のカバースライド上の顕微鏡像。ＣＦウサギの胆汁には粘液および色素結石（矢印）が認められた。（Ｄ～Ｆ）胆汁ｐＨ値、血清総胆汁酸の量、相対的血清胆汁タンパク質存在量（ＣＦ対ＷＴの倍数変化）。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５ ＷＴまたは１０ ＣＦ）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギは肝胆道系病変および胆汁分泌異常を示す。ＣＦウサギの典型的な胆汁性肝硬変（矢印）および粘液栓を示す約６０日齢のＣＦウサギおよびＷＴウサギの肝臓切片のＨＥ（Ａ）およびシリウスレッドコラーゲン（Ｂ）の染色。（Ｃ）ＣＦウサギおよびＷＴウサギの胆嚢からの胆汁のカバースライド上の顕微鏡像。ＣＦウサギの胆汁には粘液および色素結石（矢印）が認められた。（Ｄ～Ｆ）胆汁ｐＨ値、血清総胆汁酸の量、相対的血清胆汁タンパク質存在量（ＣＦ対ＷＴの倍数変化）。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝５ ＷＴまたは１０ ＣＦ）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0028】
（図３）
ＣＦウサギは微小胆嚢および肝障害を示す。（Ａ）約６０日齢のＣＦウサギおよびＷＴウサギの微小嚢の比較。（Ｂ）ＣＦウサギの胆道門脈三管（矢印）に肝硬変を示す肝臓切片のＨＥ染色。（Ｃ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギのＡＬＴおよびＡＳＴの血清中の量。（Ｄ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギの相対肝重量（％肝重量／体重）。Ｃはｎ＝７、Ｄはｎ＝４。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギは微小胆嚢および肝障害を示す。（Ａ）約６０日齢のＣＦウサギおよびＷＴウサギの微小嚢の比較。（Ｂ）ＣＦウサギの胆道門脈三管（矢印）に肝硬変を示す肝臓切片のＨＥ染色。（Ｃ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギのＡＬＴおよびＡＳＴの血清中の量。（Ｄ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギの相対肝重量（％肝重量／体重）。Ｃはｎ＝７、Ｄはｎ＝４。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0029】
（図４）
ＣＦウサギはＮＡＳＨ表現型を示す。（Ａ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓組織切片における肝細胞構造（ＨＥ染色）、脂質蓄積（オイルレッドＯ染色）、コラーゲン線維（ゴモリのトリクローム染色）の組織学的解析。矢印は肝炎または線維化の部位を示す。（Ｂ）改変Ｂｒｕｎｔスコアリングシステム（１７）に基づくＣＦおよびＷＴウサギ肝臓のＮＡＳＨ活性のスコアリング。
ＣＦウサギはＮＡＳＨ表現型を示す。（Ａ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓組織切片における肝細胞構造（ＨＥ染色）、脂質蓄積（オイルレッドＯ染色）、コラーゲン線維（ゴモリのトリクローム染色）の組織学的解析。矢印は肝炎または線維化の部位を示す。（Ｂ）改変Ｂｒｕｎｔスコアリングシステム（１７）に基づくＣＦおよびＷＴウサギ肝臓のＮＡＳＨ活性のスコアリング。
【0030】
（図５）
ＣＦウサギは、脂質プロファイルの上昇および肝代謝調節因子の上方制御（up-regulation）を示した。（Ａ）約６０日齢のＷＴウサギおよびＣＦウサギの血漿コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝９）。（Ｂ）ＬＤＬとＨＤＬとの比。（Ｃ）異なる年齢（生後日数）のＷＴおよびＣＦにおけるＣＲＥＢＨ、ＰＰＡＲα、ＦＧＦ２１タンパク質の量のウェスタンブロット分析および定量化。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギは、脂質プロファイルの上昇および肝代謝調節因子の上方制御（up-regulation）を示した。（Ａ）約６０日齢のＷＴウサギおよびＣＦウサギの血漿コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）および低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の量。平均値±ＳＥＭ（ｎ＝９）。（Ｂ）ＬＤＬとＨＤＬとの比。（Ｃ）異なる年齢（生後日数）のＷＴおよびＣＦにおけるＣＲＥＢＨ、ＰＰＡＲα、ＦＧＦ２１タンパク質の量のウェスタンブロット分析および定量化。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0031】
（図６）
ＣＦウサギは耐糖能異常およびグリコーゲン貯蔵の減少を示す。（Ａ～Ｃ）約６０日齢のＷＴウサギおよびＣＦウサギの血糖値、インスリン量、体重。（Ｄ～Ｅ）ＣＦ、ＣＦＬＤ様、ＷＴ対照ウサギのＩＶＧＴＴ分析。（Ｆ～Ｇ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギ（ｎ＝７）のＰＡＳ染色および肝グリコーゲンの酵素アッセイ。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギは耐糖能異常およびグリコーゲン貯蔵の減少を示す。（Ａ～Ｃ）約６０日齢のＷＴウサギおよびＣＦウサギの血糖値、インスリン量、体重。（Ｄ～Ｅ）ＣＦ、ＣＦＬＤ様、ＷＴ対照ウサギのＩＶＧＴＴ分析。（Ｆ～Ｇ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギ（ｎ＝７）のＰＡＳ染色および肝グリコーゲンの酵素アッセイ。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0032】
（図７）
ＣＦウサギ肝臓では、ＪＮＫとＮＦκＢを介した炎症反応が活性化されている。異なる年齢（生後日数）のＷＴとＣＦにおけるリン酸化ＪＮＫ（Ｐ－ＪＮＫ）、総ＪＮＫ、リン酸化ＩκＢ（Ｐ－ＩκＢ）、総ＩκＢタンパク質のウェスタンブロット解析と定量化。グラフは、ウェスタンブロットのデンシトメトリーによって決定されたタンパク質シグナルの強度に基づくタンパク質の量の倍数変化を示す。平均値±ＳＤ（ｎ＝６ ＷＴ および ９ ＣＦ）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギ肝臓では、ＪＮＫとＮＦκＢを介した炎症反応が活性化されている。異なる年齢（生後日数）のＷＴとＣＦにおけるリン酸化ＪＮＫ（Ｐ－ＪＮＫ）、総ＪＮＫ、リン酸化ＩκＢ（Ｐ－ＩκＢ）、総ＩκＢタンパク質のウェスタンブロット解析と定量化。グラフは、ウェスタンブロットのデンシトメトリーによって決定されたタンパク質シグナルの強度に基づくタンパク質の量の倍数変化を示す。平均値±ＳＤ（ｎ＝６ ＷＴ および ９ ＣＦ）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0033】
（図８）
ＣＦウサギ肝臓ではＥＲストレスシグナルが活性化されている。（Ａ）異なる年齢のＷＴおよびＣＦにおけるＩＲＥ１αタンパク質の量のウェスタンブロット分析。（Ｂ）約６０日のＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓切片を使用したＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１のＩＨＣ染色。（Ｃ～Ｄ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓におけるＥＲストレス応答またはＥＲＡＤ経路におけるＥＲストレスセンサーまたはメディエーターをコードするｍＲＮＡのｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
ＣＦウサギ肝臓ではＥＲストレスシグナルが活性化されている。（Ａ）異なる年齢のＷＴおよびＣＦにおけるＩＲＥ１αタンパク質の量のウェスタンブロット分析。（Ｂ）約６０日のＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓切片を使用したＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１のＩＨＣ染色。（Ｃ～Ｄ）ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓におけるＥＲストレス応答またはＥＲＡＤ経路におけるＥＲストレスセンサーまたはメディエーターをコードするｍＲＮＡのｑＰＣＲ解析（ｎ＝４）。＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ≦０．０１。
【0034】
（図９）
ＣＦウサギにおけるＳＧＬＴ１。Ｉｎｔ：腸。Ｐａｎ：膵臓。
ＣＦウサギにおけるＳＧＬＴ１。Ｉｎｔ：腸。Ｐａｎ：膵臓。
【0035】
（図１０）
ヒトＣＦ細胞におけるＳＧＬＴ１。（Ａ）ＣＦＢＥ－ＷＴ細胞およびＣＦＢＥ－ｄＦ細胞におけるＳＧＬＴ１およびＣＦＴＲ。ＣＦＴＲ－ｄＦをレスキューするためにＶＸ８０９および低温（２７℃）を使用した。（Ｂ）ＷＴ、ｄＦ／ｄＦまたはｄＦ／Ｇ５５１Ｄ遺伝子型のｉＰＳＣ由来肺オルガノイドにおけるＳＧＬＴ１およびＣＦＴＲ。（Ｃ）ＣＦ患者の分泌気道細胞からの単一細胞ＲＮＡシークエンシング。
ヒトＣＦ細胞におけるＳＧＬＴ１。（Ａ）ＣＦＢＥ－ＷＴ細胞およびＣＦＢＥ－ｄＦ細胞におけるＳＧＬＴ１およびＣＦＴＲ。ＣＦＴＲ－ｄＦをレスキューするためにＶＸ８０９および低温（２７℃）を使用した。（Ｂ）ＷＴ、ｄＦ／ｄＦまたはｄＦ／Ｇ５５１Ｄ遺伝子型のｉＰＳＣ由来肺オルガノイドにおけるＳＧＬＴ１およびＣＦＴＲ。（Ｃ）ＣＦ患者の分泌気道細胞からの単一細胞ＲＮＡシークエンシング。
【0036】
（図１１）
Ｓｏｔａ処置前後のＣＦウサギのＩＶＧＴＴ分析。＊ｐ≦０．０５。
Ｓｏｔａ処置前後のＣＦウサギのＩＶＧＴＴ分析。＊ｐ≦０．０５。
【0037】
（図１２）
Ｓｏｔａ処置あり（緑色の点）または処置なし（赤色の点）のＣＦウサギの選択された血液化学検査結果。灰色の枠：正常範囲。Ｘ軸はＳｏｔａ処置後の週数を示す。
Ｓｏｔａ処置あり（緑色の点）または処置なし（赤色の点）のＣＦウサギの選択された血液化学検査結果。灰色の枠：正常範囲。Ｘ軸はＳｏｔａ処置後の週数を示す。
【0038】
（図１３）
ＳｏｔａはＣＦウサギの食欲（左）および体重増加（右）を促進する。
ＳｏｔａはＣＦウサギの食欲（左）および体重増加（右）を促進する。
【0039】
（図１４）
ＳｏｔａはＣＦウサギの寿命を延ばす。
ＳｏｔａはＣＦウサギの寿命を延ばす。
【0040】
（図１５）
Ｓｏｔａは、ＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させた。ウェスタンブロット分析によって決定された、４週間のＳｏｔａ処置（１５ｍｇ／ｋｇ／日）後のＣＦまたはＷＴウサギの肝臓におけるＳＧＬＴ１（Ａ）、ＨＲＤ１、ＸＢＰ１ｓ、およびリン酸化ＮＦ－κＢ Ｐ６５（Ｂ）タンパク質のレバー（lever）。（Ｃ～Ｄ）Ｘｂｐ１ｓ、ＧＲＰ７８、ＴＮＦα、ＩＬ６のｍＲＮＡ量のｑＰＣＲ解析。＊ｐ≦０．０５。
Ｓｏｔａは、ＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させた。ウェスタンブロット分析によって決定された、４週間のＳｏｔａ処置（１５ｍｇ／ｋｇ／日）後のＣＦまたはＷＴウサギの肝臓におけるＳＧＬＴ１（Ａ）、ＨＲＤ１、ＸＢＰ１ｓ、およびリン酸化ＮＦ－κＢ Ｐ６５（Ｂ）タンパク質のレバー（lever）。（Ｃ～Ｄ）Ｘｂｐ１ｓ、ＧＲＰ７８、ＴＮＦα、ＩＬ６のｍＲＮＡ量のｑＰＣＲ解析。＊ｐ≦０．０５。
【0041】
（図１６）
ＳＧＬＴ１はＣＦウサギ肝臓のアルブミン陽性細胞に発現している。
ＳＧＬＴ１はＣＦウサギ肝臓のアルブミン陽性細胞に発現している。
【0042】
（図１７）
ウサギ肝臓のＨＥ、シリウスレッド、ＰＡＳ染色。
ウサギ肝臓のＨＥ、シリウスレッド、ＰＡＳ染色。
【0043】
（図１８）
Ｓｏｔａ処置ありまたは処置なしのＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓（Ｂ）サンプルにおけるＢＡ種。＊Ｐ≦０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
Ｓｏｔａ処置ありまたは処置なしのＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓（Ｂ）サンプルにおけるＢＡ種。＊Ｐ≦０．０５。＊＊Ｐ≦０．０１。
【0044】
（図１９）
ＳｏｔａはＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させた。Ｓｏｔａ処置後のＣＦまたはＷＴウサギの肝臓における、（Ａ）ＳＧＬＴ１、ＨＲＤ１、ＸＢＰ１ｓ、リン酸化ＮＦκＢ Ｐ６５のタンパク質の量、（Ｂ）ＳＬＣ５Ａ１とＩＲＥ１ａの転写量。（Ｃ）Ｓｏｔａ処置ありまたは処置なしのＣＦウサギの肝臓のＨＥおよびＩＨＣ染色。
ＳｏｔａはＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させた。Ｓｏｔａ処置後のＣＦまたはＷＴウサギの肝臓における、（Ａ）ＳＧＬＴ１、ＨＲＤ１、ＸＢＰ１ｓ、リン酸化ＮＦκＢ Ｐ６５のタンパク質の量、（Ｂ）ＳＬＣ５Ａ１とＩＲＥ１ａの転写量。（Ｃ）Ｓｏｔａ処置ありまたは処置なしのＣＦウサギの肝臓のＨＥおよびＩＨＣ染色。
【0045】
（図２０）
ＸＢＰ１ｓはＳＬＣ５Ａ１の転写因子である。（Ａ）ＡｄｖによるＸＢＰ１ｓの過剰発現はＳＧＬＴ１のタンパク質の量の上昇をもたらした。（Ｂ）ＸＢＰ１ｓの過剰発現はＳＬＣ５Ａ１の転写を増加させた。（Ｃ）ＣｈｉＰアッセイにより、ＸＢＰ１ｓがＳＬＣ５Ａ１のプロモーターに結合することが確認された。（Ｄ）ＳＬＣ５Ａ１のプロモーター上の推定結合モチーフ（青色）。（Ｅ）ＳＧＬＴ１－ルシフェラーゼアッセイにより、変異モチーフ配列はＸＢＰ１ｓによって誘導される転写活性を消失させることが示された。
ＸＢＰ１ｓはＳＬＣ５Ａ１の転写因子である。（Ａ）ＡｄｖによるＸＢＰ１ｓの過剰発現はＳＧＬＴ１のタンパク質の量の上昇をもたらした。（Ｂ）ＸＢＰ１ｓの過剰発現はＳＬＣ５Ａ１の転写を増加させた。（Ｃ）ＣｈｉＰアッセイにより、ＸＢＰ１ｓがＳＬＣ５Ａ１のプロモーターに結合することが確認された。（Ｄ）ＳＬＣ５Ａ１のプロモーター上の推定結合モチーフ（青色）。（Ｅ）ＳＧＬＴ１－ルシフェラーゼアッセイにより、変異モチーフ配列はＸＢＰ１ｓによって誘導される転写活性を消失させることが示された。
【0046】
（図２１）
Ｓｏｔａ（５μｇ／ｍｌ）はＨｕｈ７細胞においてＰＡ（１０μｇ／ｍＬ）誘発性脂肪症を減衰させた。左：ビヒクル。ＰＡ：パルミチン酸塩。
Ｓｏｔａ（５μｇ／ｍｌ）はＨｕｈ７細胞においてＰＡ（１０μｇ／ｍＬ）誘発性脂肪症を減衰させた。左：ビヒクル。ＰＡ：パルミチン酸塩。
【0047】
（図２２）
ＳＧＬＴ１阻害が炎症性肝疾患を改善する作用機序の仮説。
ＳＧＬＴ１阻害が炎症性肝疾患を改善する作用機序の仮説。
【0048】
〔発明の詳細な説明〕
このように、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患、ならびに、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
このように、本発明は、ナトリウム－グルコース共輸送体１（ＳＧＬＴ－１）活性の阻害剤として機能する医薬剤に関する。本発明はさらに、嚢胞性線維症関連肝疾患、ならびに、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする疾患に関連する症候を処置および／または改善する方法に関する。
【0049】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＳＧＬＴ－１の活性を阻害する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を特徴とする、１つ以上の肝臓の疾患および／または症状に罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0050】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇、小胞体（ＥＲ）ストレス応答の増加、および／または肝炎の増加を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状を被験体において処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0051】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＳＧＬＴ－１の活性を阻害する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を特徴とする、１つ以上の肝臓の疾患および／または症状に罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0052】
特定の実施形態において、本発明は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状を被験体において処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。
【0053】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＳＧＬＴ－１活性の上昇に関連する肝臓の疾患および／または症状に関連する１つ以上の症状を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化、α－１アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、慢性ウイルス性肝炎（例えば、慢性Ｃ型肝炎およびＢ型肝炎）、胆汁うっ滞性肝疾患（例えば、原発性胆汁性胆管炎（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、遺伝性肝疾患および胆道閉塞等）、アルコール誘発性肝障害またはアルコール性脂肪肝疾患、高ホモシステイン血症、肝虚血／再灌流障害（例えば、肝虚血／再灌流（Ｉ／Ｒ）障害は、全身性低血圧、血管閉塞、および肝移植を含む手術中に起こり得る）、薬剤誘発性肝障害、ならびにＨＣＣ）を罹患しているかまたは罹患するリスクがある、ヒト被験体である。このような方法は、ＳＧＬＴ－１活性の上昇に関連する肝臓の疾患および／または症状に関連する特定の症候を処置、改善および／または予防することに限定されない。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0054】
特定の実施形態において、本発明は、被験体におけるＣＦＬＤを処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＣＦＬＤに罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0055】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における自然発生的肝胆道系病変を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、自然発生的肝胆道系病変に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0056】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝障害を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝障害に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0057】
特定の実施形態において、本発明は、被験体においてＮＡＳＨを処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、ＮＡＳＨに罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0058】
特定の実施形態において、本発明は、対象における脂質およびグルコースの恒常性の変化を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、脂質およびグルコースの恒常性の変化に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0059】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応を処置、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝ＥＲストレスおよび関連する炎症反応に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0060】
特定の実施形態において、本発明は、被験体における肝および代謝調節障害の治療、改善および／または予防する方法であって、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤を含む組成物を被験体に投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、被験体はヒト被験体である。いくつかの実施形態において、被験体は、肝および代謝調節障害に罹患しているヒト被験体である。いくつかの実施形態において、医薬剤の投与は、肝および代謝調節障害の減衰、肝ＥＲストレスおよび炎症反応の緩和、肝機能の改善、血糖恒常性の回復、体重の増加、ならびに寿命の延長のうちの１つ以上をもたらす。
【0061】
本発明は、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる特定のタイプまたは種類の医薬剤に限定されない。いくつかの実施形態において、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤は、低分子、抗体、核酸分子（例えば、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アプタマー）、または模倣ペプチドである。
【0062】
いくつかの実施形態において、ＳＧＬＴ－１活性を阻害することができる医薬剤は、例えば、フロリジン、カナグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－｛３－［５－［４－フルオロ－フェニル］－チオフェン－２－イルメチル］－４－メチル－フェニル｝－６－ヒドロキシメチル－テトラヒドロ－ピラン－３，４，５－トリオール）、ダパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－（４－エトキシベンジル）フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）－テトラヒドロ－２Ｈ－ピラン－３，４，５－トリオール）、エムパグリフロジン（（２Ｓ，３Ｒ，４Ｒ，５Ｓ，６Ｒ）－２－［４－クロロ－３－［［４－［（３Ｓ）－オキソラン－３－イル］オキシフェニル］メチル］フェニル］－６－（ヒドロキシメチル）オキサン－３，４，５－トリオール）、レモグリフロジン（５－メチル－４－［４－（１－メチルエトキシ）ベンジル］－１－（１－メチルエチル）－１Ｈ－ピラゾール－３－イル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、セルグリフロジン（２－（４－メトキシベンジル）フェニル ６－Ｏ－（エトキシカルボニル）－β－Ｄ－グルコピラノシド）、およびトホグリフロジン（（１Ｓ，３’Ｒ，４’Ｓ，５’Ｓ，６’Ｒ）－６－（４－エチルベンジル）－６’－（ヒドロキシメチル）－３’，４’，５’，６’－テトラヒドロ－３Ｈ－スピロ［２－ベンゾフラン－１，２’－ピラン］－３’，４’，５’－トリオール水和物（１：１））、およびソタグリフロジン（ＬＸ４２１１）、またはその薬学的に許容される塩から選択されるが、これらに限定されない。
【0063】
本発明の重要な態様は、本発明の組成物（例えば、ＳＧＬＴ－１活性の阻害剤として機能する医薬剤を含む組成物）が、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ）（例えば、ＣＦＬＤ様表現型（例えば、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化））の処置に有用であることである。
【0064】
本発明のいくつかの実施形態は、ＳＧＬＴ－１活性の阻害剤として機能する本発明の医薬剤と、少なくとも１つの追加の治療剤（例えば、ＳＧＬＴ－１活性の上昇を特徴とする１つ以上の肝臓の疾患および／または症状（例えば、ＣＦＬＤ）（例えば、ＣＦＬＤ様表現型（例えば、自然発生的肝胆道系病変、肝障害の増加、ＮＡＳＨ活性、脂質およびグルコースの恒常性の変化）の処置に有用である任意の医薬剤を含むが、これらに限定されない）と、を含む組成物の有効量を投与する方法を提供する。
【0065】
本発明の範囲内の組成物には、ＳＧＬＴ－１活性の阻害剤として機能する医薬剤が、その意図する目的を達成するのに有効な量で含有されるすべての組成物が含まれる。個々の必要性は様々であるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当業者の技術範囲内である。典型的には、ＳＧＬＴ－１活性の阻害剤として機能する医薬剤（例えば、低分子、抗体、模倣ペプチド）は、ＳＧＬＴ－１活性の阻害に応答する障害に対して処置される哺乳動物の体重の１日あたり０．００２５～５０ｍｇ／ｋｇの用量で、哺乳動物（例えば、ヒト）に経口投与してもよく、またはその薬学的に許容される塩の等価量を経口投与してもよい。一実施形態において、約０．０１～約２５ｍｇ／ｋｇは、このような障害を処置、改善、または予防するために経口投与される。筋肉内注射の場合、用量は一般に経口用量の約２分の１である。例えば、好適な筋肉内投与量は、約０．００２５～約２５ｍｇ／ｋｇ、または約０．０１～約５ｍｇ／ｋｇである。
【0066】
単位経口投与量は、約０．０１～約３０００ｍｇ、例えば約０．１～約１００ｍｇのＳＧＬＴ－１活性阻害剤を含んでいてもよい。単位用量は、それぞれ約０．１～約１０ｍｇ、好都合には約０．２５～約５０ｍｇのＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）またはその溶媒和物を含む１つ以上の錠剤もしくはカプセル、または液体もしくは気化／吸入形態として、１日１回以上投与してもよい。
【0067】
製剤（例えば、静脈内製剤、腹腔内製剤、筋肉内製剤、皮下製剤、注射製剤、局所製剤、経口製剤等）において、ＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）は、担体１ｇあたり約０．０１～１００ｍｇの濃度で存在していてもよい。一実施形態において、ＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）は、約０．０７～１．０ｍｇ／ｍｌ、例えば、約０．１～０．５ｍｇ／ｍｌ、一実施形態においては、約０．４ｍｇ／ｍｌの濃度で存在する。
【0068】
ＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）を原薬として投与することに加えて、本発明のＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）は、ＳＧＬＴ－１活性阻害剤を薬学的に使用できる製剤に処理することを容易にする賦形剤および補助剤を含む好適な薬学的に許容される担体を含む医薬製剤の一部として投与してもよい。当該製剤は、特に、任意の所望の方法（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、局所、経口、吸入等）で投与することができ、錠剤、糖衣錠、徐放性トローチ剤およびカプセル、口内リンスおよび口腔洗浄剤、ゲル、液体懸濁液、ヘアリンス、ヘアゲル、シャンプー等の、投与の一種について使用することができる製剤、ならびに座薬等の直腸投与することができる製剤、ならびに、静脈内注入、注射、局所または経口投与による投与に好適な溶液は、賦形剤と共に、約０．０１～９９パーセント、一実施形態においては約０．２５～７５パーセントの活性模倣ペプチドを含む。
【0069】
本発明の医薬組成物は、本発明のＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）の有益な効果を経験する可能性がある任意の患者に投与してもよい。このような患者の中で最も重要なのは哺乳動物（例えば、ヒト）であるが、本発明はそのように限定することを意図するものではない。その他の患者としては、家畜動物（ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ等）が含まれる。
【0070】
ＳＧＬＴ－１活性阻害剤（例えば、模倣ペプチド、低分子）および医薬組成物は、それらの意図される目的を達成する任意の手段によって投与されてもよい。例えば、投与は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経皮、口腔内（buccal）、くも膜下腔内、頭蓋内、鼻腔内または局所経路で行われてもよい。代わりにまたは並行して、投与は経口経路によるものであってもよい。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態、および体重、並行する処置の種類、必要に応じて、処置の頻度、および所望の効果の性質に依存する。
【0071】
本発明の医薬製剤は、例えば、従来の混合、顆粒化、糖衣錠製造、溶解、または凍結乾燥処理により周知の方法で製造される。したがって、経口使用のための医薬製剤は、活性模倣ペプチドを固体賦形剤と組み合わせ、任意で、得られた混合物を粉砕し、所望または必要であれば、好適な助剤を添加した後、顆粒の混合物を処理することによって、錠剤または糖衣錠コアを得ることができる。
【0072】
好適な賦形剤は特に、充填剤、例えば、糖類（例えば、ラクトースまたはスクロース）、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および／またはリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム）、ならびに結合剤、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および／またはポリビニルピロリドンを使用するデンプンペーストである。所望ならば、上記デンプンおよびカルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはその塩（例えば、アルギン酸ナトリウム）等の崩壊剤を添加してもよい。助剤はとりわけ、流量調節剤および滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸またはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、および／またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアは、所望であれば、胃液に対して耐性のある任意の好適なコーティングが施される。この目的のために、濃縮糖質溶液が使用してもよく、この溶液は任意で、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含んでいてもよい。胃液に対して耐性のあるコーティングを製造するために、好適なセルロース調製物（例えば、アセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチル－セルロースフタレート）の溶液が使用される。顔料または色素は、例えば、識別のために、または活性模倣ペプチドの用量の組み合わせを特徴付けるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加されてもよい。
【0073】
経口で使用できるその他の医薬製剤には、ゼラチン製の押し込み型カプセル（push-fit capsules）ならびにゼラチンおよびグリセリンまたはソルビトール等の可塑剤で製造された軟質密閉カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは粒状の活性模倣ペプチドを含むことができ、当該粒状の活性模倣ペプチドはラクトース等の充填剤、デンプン等の結合剤および／またはタルクまたはステアリン酸マグネシウム等の滑剤、ならびに任意で安定剤と混合してもよい。軟質カプセルでは、活性模倣ペプチドが一実施形態では脂肪油、または流動パラフィン等の好適な液体に溶解または懸濁される。さらに、安定剤を添加してもよい。
【0074】
直腸に使用することができる可能な医薬製剤として、例えば、１つ以上の活性模倣ペプチドと坐剤基剤との組合せからなる坐剤が挙げられる。好適な坐剤基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。さらに、活性模倣ペプチドと基剤との組合せからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。可能な基剤材料としては、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が挙げられる。
【0075】
非経口投与に好適な製剤として、水溶性形態の活性模倣ペプチドの水溶液、例えば、水溶性塩およびアルカリ性溶液が挙げられる。さらに、適切な油性注射懸濁液として活性模倣ペプチドの懸濁液が投与されてもよい。好適な親油性溶媒または媒体として、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルもしくはトリグリセリドまたはポリエチレングリコール－４００が挙げられる。水性注射懸濁液は懸濁液の粘度を増加させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトール、および／またはデキストランを含んでいてもよい。任意で、懸濁液は安定剤を含んでいてもよい。
【0076】
本発明の局所用組成物は、一実施形態において、適切な担体の選択により、オイル、クリーム、ローション、軟膏等として製剤化される。好適な担体には、植物油または鉱油、白色ワセリン（白色軟パラフィン）、分枝鎖脂肪または油、動物性脂肪および高分子量アルコール（Ｃ１２より大きい）が挙げられる。担体は、活性成分が可溶性であるものであってもよい。所望であれば、乳化剤、安定剤、保湿剤および酸化防止剤、ならびに着色または芳香を付与する薬剤が含まれてもよい。さらに、経皮浸透増強剤をこれらの局所製剤に使用することができる。このような増強剤の例は、米国特許第３，９８９，８１６号および４，４４４，７６２号に見出すことができる。
【0077】
軟膏は、アーモンド油等の植物油中の活性成分の溶液を温かい軟質パラフィンと混合し、この混合物を冷却させることによって製剤化してもよい。そのような軟膏の典型的な例は、約３０重量％のアーモンド油および約７０重量％の白色軟パラフィンを含むものである。ローションは、活性成分を、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール等の好適な高分子量アルコールに溶解することによって都合よく調製してもよい。
【0078】
当業者であれば、上記が本発明の特定の好ましい実施形態を詳細に説明したに過ぎないことを容易に認識するであろう。上記の組成物および方法の種々の改変および変更を、当該分野で利用可能な専門知識を使用して容易に行うことができ、そうした種々の改変および変更は本発明の範囲内である。
【0079】
これまでに本発明を十分に説明したが、当業者であれば、本発明またはその任意の実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、条件、配合、および他のパラメータの広範かつ同等な範囲内で同じことを実施できることが理解されよう。本明細書で引用したすべての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に完全に援用される。
【0080】
〔実験〕
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、さらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるものではない。以下の実験セクションを通じて使用される場合、用語「我々は」または「我々の」または「我々に」または同様の用語は、１人以上の本発明者を指す。
以下の実施例は、本発明の特定の好ましい実施形態および態様を示し、さらに説明するために提供されるものであり、その範囲を限定するものとして解釈されるものではない。以下の実験セクションを通じて使用される場合、用語「我々は」または「我々の」または「我々に」または同様の用語は、１人以上の本発明者を指す。
【0081】
＜実施例１＞
次の実験には２つのデータ系統が存在する：（１）ＣＦウサギおよびそれらの肝臓の表現型の開発；および（２）ＣＦウサギに対するＳｏｔａの有益な効果。ＣＦウサギモデルおよびそれらの肝臓の表現型。
次の実験には２つのデータ系統が存在する：（１）ＣＦウサギおよびそれらの肝臓の表現型の開発；および（２）ＣＦウサギに対するＳｏｔａの有益な効果。ＣＦウサギモデルおよびそれらの肝臓の表現型。
【0082】
（ＣＦウサギモデルの開発）
過去数年間、我々（本発明者ら）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＦＴＲ変異ウサギのいくつかの系統を作製してきた（１３、１４）。本研究に関連するＣＦＴＲΔ９変異は、ヌクレオチド結合ドメイン１（ＮＢＤ１）の３つのアミノ酸（Ｐ４７７、Ｓ４７８、Ｅ４７９）の欠失を導く９ｂｐ欠失であり、本企画ではΔＰＳＥと示す。ＣＦＴＲ－ΔＦ５０８ウサギ（１４）は、ヒトＣＦ患者に見られる最も一般的な変異を持っている。
過去数年間、我々（本発明者ら）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＣＦＴＲ変異ウサギのいくつかの系統を作製してきた（１３、１４）。本研究に関連するＣＦＴＲΔ９変異は、ヌクレオチド結合ドメイン１（ＮＢＤ１）の３つのアミノ酸（Ｐ４７７、Ｓ４７８、Ｅ４７９）の欠失を導く９ｂｐ欠失であり、本企画ではΔＰＳＥと示す。ＣＦＴＲ－ΔＦ５０８ウサギ（１４）は、ヒトＣＦ患者に見られる最も一般的な変異を持っている。
【0083】
（ＣＦウサギの一般的特徴）
我々が作製したＣＦウサギは、最近報告したように、最も典型的なＣＦ表現型を示す（１３）。簡単に述べると、非ＣＦ同腹子と比較して、ＣＦウサギは成長が遅く、体重が軽く、ほとんどのＣＦウサギは腸閉塞で死亡するが、この状態は下剤の使用により改善される（図１）。ＣＦウサギは、鼻および気管上皮の生体電気特性において気道異常を示した。ごく一部ではあるが、自然発生的に肺感染症を発症する動物もいた。
我々が作製したＣＦウサギは、最近報告したように、最も典型的なＣＦ表現型を示す（１３）。簡単に述べると、非ＣＦ同腹子と比較して、ＣＦウサギは成長が遅く、体重が軽く、ほとんどのＣＦウサギは腸閉塞で死亡するが、この状態は下剤の使用により改善される（図１）。ＣＦウサギは、鼻および気管上皮の生体電気特性において気道異常を示した。ごく一部ではあるが、自然発生的に肺感染症を発症する動物もいた。
【0084】
（ＣＦウサギは自然発生的肝胆道系病変および胆汁分泌異常を起こす）
ΔＰＳＥウサギの肝胆道系を調べたところ、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色およびコラーゲンのシリウスレッド染色で示されるように、粘液栓を伴う胆管周囲に、典型的なＣＦに伴う局所的な胆道線維化および肝硬変が確認された（図２Ａ～Ｂ）。さらに、ＣＦウサギは胆汁分泌に異常を示した。ＷＴウサギの胆嚢から採取された胆汁は流れ易かったが、ＣＦウサギの胆嚢から採取された胆汁は、濃く粘り気があり、結晶様色素を示した（図２Ｃ）。ＣＦウサギの胆汁ｐＨはＷＴウサギより有意に低かった（図２Ｄ）。しかしながら、ＣＦウサギの血清総胆汁酸の量は、ＷＴウサギのそれよりもはるかに高かった（図２Ｅ）。さらに、ＣＦウサギの血清胆汁タンパク質の量は、ＷＴウサギのそれと比べて、約３倍増加していた（図２Ｆ）。これらの結果から、ＣＦウサギの肝胆道系の主要な表現型は、ヒトＣＦＬＤを内包していることが明らかになった。
ΔＰＳＥウサギの肝胆道系を調べたところ、ヘマトキシリン・エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色およびコラーゲンのシリウスレッド染色で示されるように、粘液栓を伴う胆管周囲に、典型的なＣＦに伴う局所的な胆道線維化および肝硬変が確認された（図２Ａ～Ｂ）。さらに、ＣＦウサギは胆汁分泌に異常を示した。ＷＴウサギの胆嚢から採取された胆汁は流れ易かったが、ＣＦウサギの胆嚢から採取された胆汁は、濃く粘り気があり、結晶様色素を示した（図２Ｃ）。ＣＦウサギの胆汁ｐＨはＷＴウサギより有意に低かった（図２Ｄ）。しかしながら、ＣＦウサギの血清総胆汁酸の量は、ＷＴウサギのそれよりもはるかに高かった（図２Ｅ）。さらに、ＣＦウサギの血清胆汁タンパク質の量は、ＷＴウサギのそれと比べて、約３倍増加していた（図２Ｆ）。これらの結果から、ＣＦウサギの肝胆道系の主要な表現型は、ヒトＣＦＬＤを内包していることが明らかになった。
【0085】
（ＣＦウサギは微小胆嚢関連病理および肝障害を示す）
ＣＦ患者で観察される肝症状では、胆嚢の異常、すなわち、微小胆嚢が頻繁に見られる（１５）。ＣＦウサギは、微小胆嚢（図３Ａ）および門脈三管の肝硬変（図３Ｂ）を示した。ＣＦウサギでは、門脈三管を覆う上皮細胞は定位障害を起こし（disoriented）、管は狭窄していたが、ＷＴウサギでは見られなかった（図３Ｂ）。これらのデータから、ＣＦウサギは肝内胆管閉塞を有し、限局性の胆汁性肝硬変を引き起こし、図２に示すように、おそらく粘稠な粘液の過剰分泌による炎症を起こしていることが示された。さらに、肝臓の酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中の量を調べた。ＣＦウサギのＡＬＴおよびＡＳＴの量は、ＷＴウサギと比較して上昇しており（図３Ｃ）、ＣＦウサギの肝障害が増加していることを示している。同様に、ＣＦウサギの相対肝重量（肝重量／体重）は、ＷＴウサギに比べて減少していた（図３Ｄ）。
ＣＦ患者で観察される肝症状では、胆嚢の異常、すなわち、微小胆嚢が頻繁に見られる（１５）。ＣＦウサギは、微小胆嚢（図３Ａ）および門脈三管の肝硬変（図３Ｂ）を示した。ＣＦウサギでは、門脈三管を覆う上皮細胞は定位障害を起こし（disoriented）、管は狭窄していたが、ＷＴウサギでは見られなかった（図３Ｂ）。これらのデータから、ＣＦウサギは肝内胆管閉塞を有し、限局性の胆汁性肝硬変を引き起こし、図２に示すように、おそらく粘稠な粘液の過剰分泌による炎症を起こしていることが示された。さらに、肝臓の酵素であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）およびアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）の血清中の量を調べた。ＣＦウサギのＡＬＴおよびＡＳＴの量は、ＷＴウサギと比較して上昇しており（図３Ｃ）、ＣＦウサギの肝障害が増加していることを示している。同様に、ＣＦウサギの相対肝重量（肝重量／体重）は、ＷＴウサギに比べて減少していた（図３Ｄ）。
【0086】
（ＣＦウサギはＮＡＳＨ様表現型を示す）
ＣＦ患者の多くは、多因子性病因に関連した肝脂肪症および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を呈している（１５、１６）。ＣＦウサギのＮＡＳＨ関連活性を評価するために、我々は、６０日以下のＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓組織切片を使用して組織学的解析を行った。肝細胞構造のＨ＆Ｅ染色、肝脂質のオイルレッドＯ染色、および肝コラーゲン沈着のゴモリのトリクローム染色に基づき、ＣＦウサギの肝臓では、ＷＴ対照ウサギと比較して、肝脂肪症、小葉および門脈の炎症、ならびに類洞周囲線維症および門脈線維症の増加が確認された（図４Ａ）。ＮＡＦＬＤ活動性および線維化スコアシステム（NAFLD grading and staging score system；１７、１８）を使用すると（図４Ｂ）、６０日未満のＣＦウサギの約３６％が、脂肪症、肝炎、類洞周囲／門脈線維症を特徴とする典型的なＮＡＳＨ表現型を発症していることが確認された。
ＣＦ患者の多くは、多因子性病因に関連した肝脂肪症および非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）を呈している（１５、１６）。ＣＦウサギのＮＡＳＨ関連活性を評価するために、我々は、６０日以下のＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓組織切片を使用して組織学的解析を行った。肝細胞構造のＨ＆Ｅ染色、肝脂質のオイルレッドＯ染色、および肝コラーゲン沈着のゴモリのトリクローム染色に基づき、ＣＦウサギの肝臓では、ＷＴ対照ウサギと比較して、肝脂肪症、小葉および門脈の炎症、ならびに類洞周囲線維症および門脈線維症の増加が確認された（図４Ａ）。ＮＡＦＬＤ活動性および線維化スコアシステム（NAFLD grading and staging score system；１７、１８）を使用すると（図４Ｂ）、６０日未満のＣＦウサギの約３６％が、脂肪症、肝炎、類洞周囲／門脈線維症を特徴とする典型的なＮＡＳＨ表現型を発症していることが確認された。
【0087】
（ＣＦウサギは脂質プロファイルの上昇および肝代謝調節因子の上方制御を示す）
成人のＣＦ患者は、特に年齢が高くなるにつれて、糖尿病または耐糖能異常、高トリグリセリド血症を含むＮＡＳＨに典型的に関連する代謝リスク因子を発症する（１５）。ＷＴ対照ウサギと比較して、ＣＦウサギは、血漿中トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）の量が有意に増加していたが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は増加せず（図５Ａ～Ｂ）、高脂血症の表現型を包含していた。
成人のＣＦ患者は、特に年齢が高くなるにつれて、糖尿病または耐糖能異常、高トリグリセリド血症を含むＮＡＳＨに典型的に関連する代謝リスク因子を発症する（１５）。ＷＴ対照ウサギと比較して、ＣＦウサギは、血漿中トリグリセリド（ＴＧ）、総コレステロール（ＴＣ）、低密度リポタンパク質コレステロール（ＬＤＬ）の量が有意に増加していたが、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）は増加せず（図５Ａ～Ｂ）、高脂血症の表現型を包含していた。
【0088】
ＣＦウサギの脂質表現型に関する機序的知見を得るため、我々は、ウサギの肝臓におけるいくつかの主要な代謝調節因子の発現を調べた。サイクリックＡＭＰ応答性エレメント結合タンパク質Ｈ（ＣＲＥＢＨ）およびベルオキシソーム増殖剤活性化受容体α（ＰＰＡＲα）は、肝臓に濃縮されたストレス誘導性である２つのバイナリー転写制御因子であり、肝脂質およびグルコース代謝の制御に重要な役割を果たしている（１９～２２）。ＣＲＥＢＨ前駆体（ＣＲＥＢＨ－Ｐ）、活性化ＣＲＥＢＨタンパク質（ＣＲＥＢＨ－Ａ）、ＰＰＡＲαの発現量は、ＷＴ対照ウサギと比較して、ＣＦウサギの肝臓では、高年齢になるにつれて増加していた（図５Ｃ）。ＣＲＥＢＨ－ＰＰＡＲα転写複合体によって発現が制御されている線維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ２１）は、ストレス負荷に応答して脂質およびグルコースの動員を促進する主要なヘパトカインである（２０）。同様に、ＣＦウサギ肝臓におけるＦＧＦ２１の発現量は、年齢依存的に増加した（図５Ｃ）。ＣＲＥＢＨ／ＰＰＡＲα／ＦＧＦ２１制御軸の上方制御は、ＣＦＬＤ症状から肝臓を回復させようとするＣＦウサギ肝臓のフィードバック制御を表している可能性がある。
【0089】
（ＣＦウサギは耐糖能異常およびグリコーゲン貯蔵の減少を示す）
グルコース恒常性におけるＣＦＬＤの症状を評価するために、我々は、６０日齢以下のＷＴウサギおよびＣＦウサギの空腹時血糖値およびインスリンの量を調べた。ＣＦウサギの血中グルコースの量は、ＷＴ対照ウサギに比べて上昇した一方、血中インスリンの量は低下した（図６Ａ～Ｂ）。さらに、ＷＴウサギおよびＣＦウサギを使用して静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を行った。グルコースを投与したところ、検査した１１匹のＣＦウサギの血糖値は、すべてＷＴ対照ウサギよりも高い値であった（図６Ｄ）。これらの動物のうち、肝胆道病変、微小胆嚢、ＮＡＳＨ様表現型から決定された、４匹のＣＦＬＤ様ウサギは、ＷＴ対照と比較して、グルコースクリアランスの能力が有意に低下しており、有意な耐糖能異常を示した（図６Ｅ）。さらに、ＣＦウサギの体重は、ＷＴウサギと比較して減少していた（図６Ｃ）。次に、ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝グリコーゲン貯蔵を、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色および定量的酵素アッセイの両方で調べた。両アプローチとも、ＷＴウサギ肝臓と比較して、ＣＦウサギ肝臓の肝グリコーゲン量が有意に減少していることを特定した（図６Ｆ～Ｇ）。調査した１６匹のＣＦウサギのうち、１０匹（６２．５％）のＣＦウサギでは、ＰＡＳ染色によって示されるように、肝グリコーゲンの貯蔵が枯渇している。グルコース恒常性における肝グリコーゲン貯蔵の中心的役割を考慮すると、肝グリコーゲンの枯渇は、ＣＦウサギで観察された耐糖能異常の少なくとも部分的な原因である可能性がある。
グルコース恒常性におけるＣＦＬＤの症状を評価するために、我々は、６０日齢以下のＷＴウサギおよびＣＦウサギの空腹時血糖値およびインスリンの量を調べた。ＣＦウサギの血中グルコースの量は、ＷＴ対照ウサギに比べて上昇した一方、血中インスリンの量は低下した（図６Ａ～Ｂ）。さらに、ＷＴウサギおよびＣＦウサギを使用して静脈内グルコース負荷試験（ＩＶＧＴＴ）を行った。グルコースを投与したところ、検査した１１匹のＣＦウサギの血糖値は、すべてＷＴ対照ウサギよりも高い値であった（図６Ｄ）。これらの動物のうち、肝胆道病変、微小胆嚢、ＮＡＳＨ様表現型から決定された、４匹のＣＦＬＤ様ウサギは、ＷＴ対照と比較して、グルコースクリアランスの能力が有意に低下しており、有意な耐糖能異常を示した（図６Ｅ）。さらに、ＣＦウサギの体重は、ＷＴウサギと比較して減少していた（図６Ｃ）。次に、ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝グリコーゲン貯蔵を、過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色および定量的酵素アッセイの両方で調べた。両アプローチとも、ＷＴウサギ肝臓と比較して、ＣＦウサギ肝臓の肝グリコーゲン量が有意に減少していることを特定した（図６Ｆ～Ｇ）。調査した１６匹のＣＦウサギのうち、１０匹（６２．５％）のＣＦウサギでは、ＰＡＳ染色によって示されるように、肝グリコーゲンの貯蔵が枯渇している。グルコース恒常性における肝グリコーゲン貯蔵の中心的役割を考慮すると、肝グリコーゲンの枯渇は、ＣＦウサギで観察された耐糖能異常の少なくとも部分的な原因である可能性がある。
【0090】
（ＣＦウサギ肝臓におけるＥＲストレスおよび炎症反応の優勢）
ＣＦウサギのＣＦＬＤ表現型の根底にあるメカニズムの基礎を理解するため、ＣＦウサギの肝臓において、ＪＮＫおよびＮＦκＢによって媒介される主要な炎症経路の活性化を調べた。ＷＴと比較して、ＪＮＫおよびＮＦκＢによって媒介される炎症経路の指標であるリン酸化ＪＮＫ（Ｐ－ＪＮＫ）およびリン酸化ＮＦκＢ阻害剤（Ｐ－ＩκＢ）の量は、年齢依存的にウサギの肝臓で増加していた（図７）。次に、ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓において、炎症を促進し、代謝恒常性を再構築する細胞内ストレスシグナルであるＥＲストレス応答または不良タンパク質応答の活性化を調べた（２３、２４）。ウェスタンブロット分析により、ＣＦウサギの肝臓では、一次ＥＲストレスセンサーＩＲＥ１αおよびその下流の転写活性化因子ＸＢＰ１によって媒介されるＥＲストレス応答の年齢依存的な活性化が明らかになった（図８Ａ）。ウサギ肝組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、約６０日齢のＷＴウサギではなく、ＣＦウサギの肝胆管周辺にＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１の強い誘導が検出された（図８Ｂ）。ＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１によるＥＲストレス応答の活性化は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析によって確認され、ＩＲＥ１α、スプライシング型Ｘｂｐ１（Ｘｂｐ１ｓ）、ＥＲシャペロンＢｉＰ／ＧＲＰ７８（図８Ｃ）、さらにＨＲＤ１、Ｓａｌ１Ｌ、ＥＤＥＭ１、ＥＲｄｊ４を含むＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路におけるＩＲＥ１α／ＸＢＰ１標的のｍＲＮＡ発現量が示された（図８Ｄ）。これらの結果から、ＣＦウサギの肝臓、特に５０日齢超の肝臓において、ＥＲストレスおよび炎症反応が強く活性化されていることが明らかになった。
ＣＦウサギのＣＦＬＤ表現型の根底にあるメカニズムの基礎を理解するため、ＣＦウサギの肝臓において、ＪＮＫおよびＮＦκＢによって媒介される主要な炎症経路の活性化を調べた。ＷＴと比較して、ＪＮＫおよびＮＦκＢによって媒介される炎症経路の指標であるリン酸化ＪＮＫ（Ｐ－ＪＮＫ）およびリン酸化ＮＦκＢ阻害剤（Ｐ－ＩκＢ）の量は、年齢依存的にウサギの肝臓で増加していた（図７）。次に、ＷＴウサギおよびＣＦウサギの肝臓において、炎症を促進し、代謝恒常性を再構築する細胞内ストレスシグナルであるＥＲストレス応答または不良タンパク質応答の活性化を調べた（２３、２４）。ウェスタンブロット分析により、ＣＦウサギの肝臓では、一次ＥＲストレスセンサーＩＲＥ１αおよびその下流の転写活性化因子ＸＢＰ１によって媒介されるＥＲストレス応答の年齢依存的な活性化が明らかになった（図８Ａ）。ウサギ肝組織切片の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色により、約６０日齢のＷＴウサギではなく、ＣＦウサギの肝胆管周辺にＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１の強い誘導が検出された（図８Ｂ）。ＩＲＥ１αおよびＸＢＰ１によるＥＲストレス応答の活性化は、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）解析によって確認され、ＩＲＥ１α、スプライシング型Ｘｂｐ１（Ｘｂｐ１ｓ）、ＥＲシャペロンＢｉＰ／ＧＲＰ７８（図８Ｃ）、さらにＨＲＤ１、Ｓａｌ１Ｌ、ＥＤＥＭ１、ＥＲｄｊ４を含むＥＲ関連分解（ＥＲＡＤ）経路におけるＩＲＥ１α／ＸＢＰ１標的のｍＲＮＡ発現量が示された（図８Ｄ）。これらの結果から、ＣＦウサギの肝臓、特に５０日齢超の肝臓において、ＥＲストレスおよび炎症反応が強く活性化されていることが明らかになった。
【0091】
（ＳＧＬＴ１はＣＦウサギ組織およびヒトＣＦ細胞で上方制御されている）
まず、ＣＦウサギおよびＷＴウサギにおけるＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２の発現量を測定した。ＳＧＬＴ２の発現は、ヒトで報告されているように、大部分が腎臓に限られており、ＣＦウサギとＷＴウサギとの間に差はない。一方、ＳＧＬＴ１の発現は、ＣＦウサギの肺、膵臓および腸（図９）ならびに肝臓（図１５Ａ）を含むいくつかのＣＦ関連組織で上昇しており、ＳＧＬＴ１が肝臓を含む多くのＣＦ罹患臓器の標的であることを示唆している。このような上方制御は、ＣＦΔ１（Ｘ変異）およびΔ９（つまりΔＰＳＥ）の両系統で観察されることに注目する。
まず、ＣＦウサギおよびＷＴウサギにおけるＳＧＬＴ１およびＳＧＬＴ２の発現量を測定した。ＳＧＬＴ２の発現は、ヒトで報告されているように、大部分が腎臓に限られており、ＣＦウサギとＷＴウサギとの間に差はない。一方、ＳＧＬＴ１の発現は、ＣＦウサギの肺、膵臓および腸（図９）ならびに肝臓（図１５Ａ）を含むいくつかのＣＦ関連組織で上昇しており、ＳＧＬＴ１が肝臓を含む多くのＣＦ罹患臓器の標的であることを示唆している。このような上方制御は、ＣＦΔ１（Ｘ変異）およびΔ９（つまりΔＰＳＥ）の両系統で観察されることに注目する。
【0092】
ヒトＣＦ細胞におけるＳＧＬＴ１の発現量も調べた。ＣＦＢＥ細胞のＣＦＴＲバンディング（CFTR banding）は、遺伝子型と一致している。ＣＦウサギにおける所見と同様に、ＣＦＢＥにおけるＳＧＬＴ１シグナルは、ＣＦＴＲのシグナルと逆相関していた：ｄＦ細胞では高いが、ＷＴ細胞では低い（図１０Ａ）。さらに、ＶＸ８０９によるＣＦＴＲの薬理学的レスキュー、またはＣＦＢＥ－ｄＦ細胞における２７℃でのＣＦＴＲの低温レスキューは、いずれもＳＧＬＴ１の量の低下と関連していた（図１０Ａ）。一貫して、患者ｉＰＳＣ由来のｄＦ／ｄＦおよびｄＦ／Ｇ５５１Ｄ肺オルガノイドの両方において（図１０Ｂ）、ＳＧＬＴ１の量は、ＷＴ／ＷＴよりも高かった。このパターンは、ＣＦ患者気道細胞の単一細胞ＲＮＡシークエンシングが行われた最近のプロジェクトでも明らかになった。ＳＧＬＴ１は、ＣＦ患者（混合遺伝子型）の分泌気道細胞において、非ＣＦ患者の分泌気道細胞よりも発現量が高いだけではなく、高い割合で発現していた。一方、ＳＧＬＴ２は、微量しか発現していない（図１０Ｃ）。
【0093】
（ＳｏｔａはＣＦウサギの耐糖能を改善する）
ΔＰＳＥウサギにＳｏｔａ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を４週間毎日経口処置した。予想どおり、尿中グルコース量はＳｏｔａ処置時に急上昇し、薬剤を回収すると正常値に戻った。薬剤処置２週間後にＩＶＧＴＴ試験を実施した。Ｓｏｔａ処置動物は非処置群よりも血糖排泄率が高く（図１１）、ＣＦウサギの糖代謝に対するＳｏｔａの有益な効果が実証された。
ΔＰＳＥウサギにＳｏｔａ（１５ｍｇ／ｋｇ／日）を４週間毎日経口処置した。予想どおり、尿中グルコース量はＳｏｔａ処置時に急上昇し、薬剤を回収すると正常値に戻った。薬剤処置２週間後にＩＶＧＴＴ試験を実施した。Ｓｏｔａ処置動物は非処置群よりも血糖排泄率が高く（図１１）、ＣＦウサギの糖代謝に対するＳｏｔａの有益な効果が実証された。
【0094】
（ＳｏｔａはＣＦウサギの肝機能パラメータを改善する）
我々は、ΔＰＳＥ ＣＦウサギの血液化学を調べたところ、ＣＦウサギは、代謝パラメータ、血清ＡＬＰ、ＣＰＫ等に多くの異常を示すことが分かった。ＳｏｔａがＣＦウサギの血液化学パラメータに何らかの影響を及ぼすかどうかを評価するため、５匹のＣＦΔ９ウサギにＳｏｔａを１０週間処置した。対照群のＣＦΔ９ウサギ（ｎ＝５）には、Ｓｏｔａ処置を実施しなかった。驚くべきことに、Ｓｏｔａ処置は、Ｋ＋、ＡＬＰ、ＣＰＫ（図１２）、トリグリセリド（ＴＧ）、グルコース、総コレステロール等の平衡異常／異常パラメータを有意に改善した。対照群の動物では、これらのパラメータは徐々に悪化したが、Ｓｏｔａ群では、これらのパラメータは正常範囲に戻った（図１２のグレーの枠）。これらの所見は、Ｓｏｔａ処置がＣＦウサギにとって、電解質不均衡、脂質代謝、肝機能等、糖代謝以外にも有益であることを示唆している。
我々は、ΔＰＳＥ ＣＦウサギの血液化学を調べたところ、ＣＦウサギは、代謝パラメータ、血清ＡＬＰ、ＣＰＫ等に多くの異常を示すことが分かった。ＳｏｔａがＣＦウサギの血液化学パラメータに何らかの影響を及ぼすかどうかを評価するため、５匹のＣＦΔ９ウサギにＳｏｔａを１０週間処置した。対照群のＣＦΔ９ウサギ（ｎ＝５）には、Ｓｏｔａ処置を実施しなかった。驚くべきことに、Ｓｏｔａ処置は、Ｋ＋、ＡＬＰ、ＣＰＫ（図１２）、トリグリセリド（ＴＧ）、グルコース、総コレステロール等の平衡異常／異常パラメータを有意に改善した。対照群の動物では、これらのパラメータは徐々に悪化したが、Ｓｏｔａ群では、これらのパラメータは正常範囲に戻った（図１２のグレーの枠）。これらの所見は、Ｓｏｔａ処置がＣＦウサギにとって、電解質不均衡、脂質代謝、肝機能等、糖代謝以外にも有益であることを示唆している。
【0095】
（Ｓｏｔａ処置によりＣＦウサギの寿命が延びる）
最も予期せぬ重要な初見は、Ｓｏｔａ処置がΔＰＳＥ ＣＦウサギの寿命を延ばしたことである。Ｓｏｔａ処置したΔＰＳＥウサギ（ｎ＝６）は、処置しなかったウサギ（ｎ＝１１）よりも有意に長生きした（図１４）。この結果は、ＳＧＬＴ阻害剤がＣＦ個体に全身的な利益をもたらすことを示している。
最も予期せぬ重要な初見は、Ｓｏｔａ処置がΔＰＳＥ ＣＦウサギの寿命を延ばしたことである。Ｓｏｔａ処置したΔＰＳＥウサギ（ｎ＝６）は、処置しなかったウサギ（ｎ＝１１）よりも有意に長生きした（図１４）。この結果は、ＳＧＬＴ阻害剤がＣＦ個体に全身的な利益をもたらすことを示している。
【0096】
（ＳｏｔａはＣＦウサギ肝臓のＥＲストレス応答および炎症マーカーを緩和する）
Ｓｏｔａ処置したΔＰＳＥ ＣＦウサギの生活機能パラメータが改善したことから、肝臓のＳＧＬＴ１を調べた。他の組織での所見と一致し、ＳＧＬＴ１はＣＦウサギの肝臓で上方制御されたが、Ｓｏｔａ処置した肝臓では上昇しなかった（図１５Ａ）。注目すべきは、Ｓｏｔａ処置により、主要なＥＲストレスマーカーであるスプライシング型Ｘｂｐ１ ｍＲＮＡ（ＸＢＰ１ｓ）および主要な炎症反応マーカーであるリン酸化ＮＦκＢ ｐ６５タンパク質の量が低下したことである（図１５Ｂ）。ｑＰＣＲ解析により、Ｓｏｔａ処置なしのＣＦウサギと比較して（図１５Ｄ）、Ｓｏｔａ処置ありのＣＦウサギにおいて、ＸＢＰ１ｓ、主要ＵＰＲ制御因子ＢｉＰ／ＧＲＰ７８（図１５Ｃ）、ならびに炎症誘発性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ６をコードするｍＲＮＡの量が減少した。また、興味深いことに、ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１ ＵＰＲ経路（２５）の標的であるＥＲＡＤ関連Ｅ３リガーゼＨＲＤ１の量が、Ｓｏｔａ処置により減少することも見出され（図１５Ｂ）、ＣＦＬＤにおけるＥＲＡＤの潜在的な役割が示唆された。
Ｓｏｔａ処置したΔＰＳＥ ＣＦウサギの生活機能パラメータが改善したことから、肝臓のＳＧＬＴ１を調べた。他の組織での所見と一致し、ＳＧＬＴ１はＣＦウサギの肝臓で上方制御されたが、Ｓｏｔａ処置した肝臓では上昇しなかった（図１５Ａ）。注目すべきは、Ｓｏｔａ処置により、主要なＥＲストレスマーカーであるスプライシング型Ｘｂｐ１ ｍＲＮＡ（ＸＢＰ１ｓ）および主要な炎症反応マーカーであるリン酸化ＮＦκＢ ｐ６５タンパク質の量が低下したことである（図１５Ｂ）。ｑＰＣＲ解析により、Ｓｏｔａ処置なしのＣＦウサギと比較して（図１５Ｄ）、Ｓｏｔａ処置ありのＣＦウサギにおいて、ＸＢＰ１ｓ、主要ＵＰＲ制御因子ＢｉＰ／ＧＲＰ７８（図１５Ｃ）、ならびに炎症誘発性サイトカインＴＮＦαおよびＩＬ６をコードするｍＲＮＡの量が減少した。また、興味深いことに、ＩＲＥ１α／ＸＢＰ１ ＵＰＲ経路（２５）の標的であるＥＲＡＤ関連Ｅ３リガーゼＨＲＤ１の量が、Ｓｏｔａ処置により減少することも見出され（図１５Ｂ）、ＣＦＬＤにおけるＥＲＡＤの潜在的な役割が示唆された。
【0097】
（ＳＧＬＴ１は病態下で肝細胞に高発現する）
ＳＧＬＴ１は上皮細胞では発現しているが、肝細胞では発現していないことが知られている。予期せぬことに、ＳＧＬＴ１はＷＴウサギ肝細胞では発現していないが、ＣＦウサギ肝細胞では高発現しているという実験結果が得られた（図１６）。図１６に示すように、ＳＧＬＴ１のシグナルは肝細胞マーカーであるアルブミンのシグナルと共局在していた。
ＳＧＬＴ１は上皮細胞では発現しているが、肝細胞では発現していないことが知られている。予期せぬことに、ＳＧＬＴ１はＷＴウサギ肝細胞では発現していないが、ＣＦウサギ肝細胞では高発現しているという実験結果が得られた（図１６）。図１６に示すように、ＳＧＬＴ１のシグナルは肝細胞マーカーであるアルブミンのシグナルと共局在していた。
【0098】
（ＳｏｔａはＣＦウサギ肝臓のＮＡＳＨ様表現型を緩和する）
Ｓｏｔａ処置がＣＦウサギ肝臓のＮＡＳＨ様表現型に何らかの影響を及ぼすかどうかを調べる実験を行った。組織学的分析によると、Ｓｏｔａ処置したＣＦウサギの肝臓は、Ｓｏｔａ処置していないＣＦウサギと比較して、コラージュ（collage）のシリウスレッド染色によって明らかにされる線維化の程度ははるかに少ないが（図１７中央段）、ＰＡＳ染色によって明らかにされるグリコーゲン貯蔵能は増強されていた（図１７下段）。
Ｓｏｔａ処置がＣＦウサギ肝臓のＮＡＳＨ様表現型に何らかの影響を及ぼすかどうかを調べる実験を行った。組織学的分析によると、Ｓｏｔａ処置したＣＦウサギの肝臓は、Ｓｏｔａ処置していないＣＦウサギと比較して、コラージュ（collage）のシリウスレッド染色によって明らかにされる線維化の程度ははるかに少ないが（図１７中央段）、ＰＡＳ染色によって明らかにされるグリコーゲン貯蔵能は増強されていた（図１７下段）。
【0099】
小葉炎症、門脈炎症、小葉壊死炎症、マロリー小体、認定病理医による線維化ステージを含むＮＡＳＨ関連パラメータは、Ｓｏｔａ処置したＣＦウサギ肝臓ですべて有意に改善した（表１）。これらのデータは、ＳｏｔａがＣＦウサギ肝臓のＮＡＳＨ様表現型を緩和することを示している。
【0100】
【表1】
【0101】
（ＳｏｔａはＣＦウサギの肝臓における胆汁酸（ＢＡ）プロファイルを正常化する）
胆汁酸の調節異常がＣＦＬＤの一因であることが知られている。ＷＴウサギおよびＣＦウサギ（Ｓｏｔａの有無にかかわらず）からサンプルを採取し、ミシガン大学メタボロミクスコアで解析する実験を行った。胆汁酸ターゲットメタボロミクス解析の結果、ＣＦウサギの肝臓サンプルでは、一次および二次を含むＢＡ種の８０％以上が変化していた（図１８）。重要なことは、ＣＦウサギへのＳｏｔａ処置により、肝臓のＢＡプロファイルが正常化したことである（図１８）。
胆汁酸の調節異常がＣＦＬＤの一因であることが知られている。ＷＴウサギおよびＣＦウサギ（Ｓｏｔａの有無にかかわらず）からサンプルを採取し、ミシガン大学メタボロミクスコアで解析する実験を行った。胆汁酸ターゲットメタボロミクス解析の結果、ＣＦウサギの肝臓サンプルでは、一次および二次を含むＢＡ種の８０％以上が変化していた（図１８）。重要なことは、ＣＦウサギへのＳｏｔａ処置により、肝臓のＢＡプロファイルが正常化したことである（図１８）。
【0102】
（ＳｏｔａはＣＦウサギの肝臓および他の臓器におけるＥＲストレス応答を緩和する）
肝臓では、ＳＧＬＴ１がＣＦウサギの肝臓で上方制御されたが、Ｓｏｔａ処置したウサギでは上方制御されなかった（図１９Ａ）。注目すべきは、Ｓｏｔａ処置により、ＥＲストレスマーカーＸＢＰ１ｓおよび炎症マーカーリン酸化ＮＦκＢｐ６５タンパク質の量が低下したことである（図１９Ａ）。ｑＰＣＲおよびＩＨＣ分析により、これらの所見が確認された（図１９ＢおよびＣ）。これらのデータは、ＣＦＬＤ発症におけるＥＲストレスおよび炎症の潜在的な役割を示しており、ＣＦＬＤに対するＳｏｔａの有益な効果の作用機序は、ＥＲストレス応答および肝炎の抑制によるものである。
肝臓では、ＳＧＬＴ１がＣＦウサギの肝臓で上方制御されたが、Ｓｏｔａ処置したウサギでは上方制御されなかった（図１９Ａ）。注目すべきは、Ｓｏｔａ処置により、ＥＲストレスマーカーＸＢＰ１ｓおよび炎症マーカーリン酸化ＮＦκＢｐ６５タンパク質の量が低下したことである（図１９Ａ）。ｑＰＣＲおよびＩＨＣ分析により、これらの所見が確認された（図１９ＢおよびＣ）。これらのデータは、ＣＦＬＤ発症におけるＥＲストレスおよび炎症の潜在的な役割を示しており、ＣＦＬＤに対するＳｏｔａの有益な効果の作用機序は、ＥＲストレス応答および肝炎の抑制によるものである。
【0103】
（ＸＢＰ１ｓはＳＬＣ５Ａ１の転写因子である）
ＥＲストレストランスアクチベーターであるＸＢＰ１ｓは、ＳＧＬＴ１をコードするＳＬＣ５Ａ１遺伝子の転写因子であるという仮説を立てた。これを検証するために、ｄＦ（ＣＦＢＥ－ｄＦ）またはＷＴ ＣＦＴＲ（ＣＦＢＥ－ＷＴ）を所有する気管支上皮細胞を使用して実験を行った。ＸＢＰ１ｓの過剰発現は、ＷＴおよびｄＦ細胞の両方において、ＳＬＣ５Ａ１の転写量およびＳＧＬＴ１のタンパク質の量の上方制御をもたらしたことが示された（図２０ＡおよびＢ）。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにより、ＸＢＰ１ｓがＳＬＣ５Ａ１遺伝子プロモーターに結合することが示された（図２０Ｃ）。さらに、推定結合モチーフが－５９０ｂｐの位置にあることを突き止めた（図２０Ｄ）。このモチーフを変異させると、ルシフェラーゼアッセイで示されるように、ＸＢＰ１ｓの結合が消失した（図２０Ｅ）。
ＥＲストレストランスアクチベーターであるＸＢＰ１ｓは、ＳＧＬＴ１をコードするＳＬＣ５Ａ１遺伝子の転写因子であるという仮説を立てた。これを検証するために、ｄＦ（ＣＦＢＥ－ｄＦ）またはＷＴ ＣＦＴＲ（ＣＦＢＥ－ＷＴ）を所有する気管支上皮細胞を使用して実験を行った。ＸＢＰ１ｓの過剰発現は、ＷＴおよびｄＦ細胞の両方において、ＳＬＣ５Ａ１の転写量およびＳＧＬＴ１のタンパク質の量の上方制御をもたらしたことが示された（図２０ＡおよびＢ）。クロマチン免疫沈降（ＣｈＩＰ）アッセイにより、ＸＢＰ１ｓがＳＬＣ５Ａ１遺伝子プロモーターに結合することが示された（図２０Ｃ）。さらに、推定結合モチーフが－５９０ｂｐの位置にあることを突き止めた（図２０Ｄ）。このモチーフを変異させると、ルシフェラーゼアッセイで示されるように、ＸＢＰ１ｓの結合が消失した（図２０Ｅ）。
【0104】
（ＳｏｔａはインビトロＮＡＳＨモデルにおいてＥＲストレスによる脂肪症を抑制する）
ＥＲストレストランスデューサーであるＸＢＰ１ｓがＳＧＬＴ１の転写因子であること、Ｓｏｔａ阻害がＣＦウサギ肝臓におけるＥＲストレスを減衰させるという観察結果から、ＣＦに限らず病的な条件下では、肝細胞においてＳＧＬＴ１が活性化され、グルコースの高吸収、細胞内グルコース量の上昇に続き、ＥＲストレスの活性化および炎症反応につながるという仮説を立てた。そのため、ＳＧＬＴ１の阻害は、ＥＲストレスの減衰メカニズムを通じて、種々の肝疾患に効果をもたらす可能性がある。
ＥＲストレストランスデューサーであるＸＢＰ１ｓがＳＧＬＴ１の転写因子であること、Ｓｏｔａ阻害がＣＦウサギ肝臓におけるＥＲストレスを減衰させるという観察結果から、ＣＦに限らず病的な条件下では、肝細胞においてＳＧＬＴ１が活性化され、グルコースの高吸収、細胞内グルコース量の上昇に続き、ＥＲストレスの活性化および炎症反応につながるという仮説を立てた。そのため、ＳＧＬＴ１の阻害は、ＥＲストレスの減衰メカニズムを通じて、種々の肝疾患に効果をもたらす可能性がある。
【0105】
これを検証するため、ヒト肝細胞株Ｈｕｈ７を使用して、パルミチン酸（ＰＡ）誘導ＮＡＳＨモデルを確立する実験を行った。飽和脂肪酸であるＰＡは、ＥＲストレスに関連したハプチック脂肪症（haptic steatosis）を誘発することが知られている（２６）。Ｓｏｔａ（５μｇ／ｍｌ）を添加した培地および添加しなかった培地において、Ｈｕｈ７細胞を１０ｕｇ／ｍｌのＰＡで３６時間処理した。オイルレッド染色を使用して、脂肪症の程度を評価した。その結果、シリウスレッド染色で示されるように、Ｓｏｔａ処理によって脂肪症の程度が有意に減少することが示された（図２１）。
【0106】
（ＳＧＬＴ１阻害が炎症性肝疾患を改善する作用機序の仮説）
ＥＲストレスは多くの肝疾患の主要な原因である。ＥＲストレス／炎症→ＳＧＬＴ１の上方制御→ＥＲストレス／炎症の悪化という悪循環が一般的な肝疾患で形成され、このサイクルを薬理学的に破壊することが肝疾患の治療戦略であるという仮説を立てた（図２２）。
ＥＲストレスは多くの肝疾患の主要な原因である。ＥＲストレス／炎症→ＳＧＬＴ１の上方制御→ＥＲストレス／炎症の悪化という悪循環が一般的な肝疾患で形成され、このサイクルを薬理学的に破壊することが肝疾患の治療戦略であるという仮説を立てた（図２２）。
【0107】
［均等物］
本発明は、その思想または本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施されてもよい。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載された本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は上述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。
本発明は、その思想または本質的特性から逸脱することなく、他の特定の形態で実施されてもよい。したがって、上述の実施形態は、本明細書に記載された本発明を限定するのではなく、すべての点で例示的であると見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は上述の記載によってではなく、添付の特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲の均等性の意味および範囲内に入るすべての変更はその中に包含されることが意図される。
【0108】
［参照による援用］
本明細書で参照される特許文献および科学論文のそれぞれの開示内容全体が、あらゆる目的のために参照により援用される。本出願の全体を通して符号で示される以下の文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
本明細書で参照される特許文献および科学論文のそれぞれの開示内容全体が、あらゆる目的のために参照により援用される。本出願の全体を通して符号で示される以下の文献は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【0109】
1. D. A. Stoltz, D. K. Meyerholz, M. J. Welsh, Origins of cystic fibrosis lung disease. N Engl J Med 372, 351-362 (2015).
2. R. D. Baker, S. S. Baker, Cystic Fibrosis-related Liver Disease: The Next Challenge. J Pediatr Gastroenterol Nutr 71, 421-422 (2020).
3. F. S. Collins, Realizing the Dream of Molecularly Targeted Therapies for Cystic Fibrosis. N Engl J Med 381, 1863-1865 (2019).
4. K. Staufer, Current Treatment Options for Cystic Fibrosis-Related Liver Disease. Int J Mol Sci 21 (2020).
5. R. Fiorotto et al., Animal models for cystic fibrosis liver disease (CFLD). Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1865, 965-969 (2019).
6. R. Sano, Y. Shinozaki, T. Ohta, Sodium-glucose cotransporters: Functional properties and pharmaceutical potential. J Diabetes Investig 10.1111/jdi.13255 (2020).
7. G. Gyimesi, J. Pujol-Gimenez, Y. Kanai, M. A. Hediger, Sodium-coupled glucose transport, the SLC5 family, and therapeutically relevant inhibitors: from molecular discovery to clinical application. Pflugers Arch 472, 1177-1206 (2020).
8. E. D. Deeks, Sotagliflozin: A Review in Type 1 Diabetes. Drugs 79, 1977-1987 (2019).
9. M. F. Hassanabad, Z. F. H. Abad, Are SGLT2 inhibitors joining the mainstream therapy for diabetes type 2? Diabetes Metab Syndr 13, 1893-1896 (2019).
10. R. J. Chilton, Effects of sodium-glucose cotransporter-2 inhibitors on the cardiovascular and renal complications of type 2 diabetes. Diabetes Obes Metab 22, 16-29 (2020).
11. D. L. Bhatt et al., Sotagliflozin in Patients with Diabetes and Recent Worsening Heart Failure. N Engl J Med 384, 117-128 (2021).
12. D. L. Bhatt et al., Sotagliflozin in Patients with Diabetes and Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 384, 129-139 (2021).
13. J. Xu et al., Phenotypes of CF rabbits generated by CRISPR/Cas9-mediated disruption of the CFTR gene. JCI Insight 6 (2021).
14. D. Yang et al., Production of CFTR-ΔF508 Rabbits. Front Genet 11 (2021).
15. S. Sakiani, D. E. Kleiner, T. Heller, C. Koh, Hepatic Manifestations of Cystic Fibrosis. Clin Liver Dis 23, 263-277 (2019).
16. R. Fiorotto, M. Strazzabosco, Pathophysiology of Cystic Fibrosis Liver Disease: A Channelopathy Leading to Alterations in Innate Immunity and in Microbiota. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 8, 197-207 (2019).
17. E. M. Brunt, Nonalcoholic steatohepatitis: definition and pathology. Semin Liver Dis 21, 3-16 (2001).
18. Z. Zheng et al., Exposure to fine airborne particulate matters induces hepatic fibrosis in murine models. J Hepatol 63, 1397-1404 (2015).
19. C. Zhang et al., Endoplasmic reticulum-tethered transcription factor cAMP responsive element-binding protein, hepatocyte specific, regulates hepatic lipogenesis, fatty acid oxidation, and lipolysis upon metabolic stress in mice. Hepatology 55, 1070-1082 (2012).
20. H. Kim et al., Liver-enriched transcription factor CREBH interacts with peroxisome proliferator-activated receptor alpha to regulate metabolic hormone FGF21. Endocrinology 155, 769-782 (2014).
21. H. Kim, Z. Zheng, P. D. Walker, G. Kapatos, K. Zhang, CREBH Maintains Circadian Glucose Homeostasis by Regulating Hepatic Glycogenolysis and Gluconeogenesis. Mol Cell Biol 37 (2017).
22. S. Kersten, R. Stienstra, The role and regulation of the peroxisome proliferator activated receptor alpha in human liver. Biochimie 136, 75-84 (2017).
23. C. Hetz, K. Zhang, R. J. Kaufman, Mechanisms, regulation and functions of the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol 21, 421-438 (2020).
24. K. Zhang, R. J. Kaufman, From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature 454, 455-462 (2008).
25. K. Zhang et al., The unfolded protein response transducer IRE1alpha prevents ER stress-induced hepatic steatosis. EMBO J 30, 1357-1375 (2011).
26. C. S. Achard, D. R. Laybutt, Lipid-induced endoplasmic reticulum stress in liver cells results in two distinct outcomes: adaptation with enhanced insulin signaling or insulin resistance. Endocrinology 153, 2164-2177 (2012).
2. R. D. Baker, S. S. Baker, Cystic Fibrosis-related Liver Disease: The Next Challenge. J Pediatr Gastroenterol Nutr 71, 421-422 (2020).
3. F. S. Collins, Realizing the Dream of Molecularly Targeted Therapies for Cystic Fibrosis. N Engl J Med 381, 1863-1865 (2019).
4. K. Staufer, Current Treatment Options for Cystic Fibrosis-Related Liver Disease. Int J Mol Sci 21 (2020).
5. R. Fiorotto et al., Animal models for cystic fibrosis liver disease (CFLD). Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis 1865, 965-969 (2019).
6. R. Sano, Y. Shinozaki, T. Ohta, Sodium-glucose cotransporters: Functional properties and pharmaceutical potential. J Diabetes Investig 10.1111/jdi.13255 (2020).
7. G. Gyimesi, J. Pujol-Gimenez, Y. Kanai, M. A. Hediger, Sodium-coupled glucose transport, the SLC5 family, and therapeutically relevant inhibitors: from molecular discovery to clinical application. Pflugers Arch 472, 1177-1206 (2020).
8. E. D. Deeks, Sotagliflozin: A Review in Type 1 Diabetes. Drugs 79, 1977-1987 (2019).
9. M. F. Hassanabad, Z. F. H. Abad, Are SGLT2 inhibitors joining the mainstream therapy for diabetes type 2? Diabetes Metab Syndr 13, 1893-1896 (2019).
10. R. J. Chilton, Effects of sodium-glucose cotransporter-2 inhibitors on the cardiovascular and renal complications of type 2 diabetes. Diabetes Obes Metab 22, 16-29 (2020).
11. D. L. Bhatt et al., Sotagliflozin in Patients with Diabetes and Recent Worsening Heart Failure. N Engl J Med 384, 117-128 (2021).
12. D. L. Bhatt et al., Sotagliflozin in Patients with Diabetes and Chronic Kidney Disease. N Engl J Med 384, 129-139 (2021).
13. J. Xu et al., Phenotypes of CF rabbits generated by CRISPR/Cas9-mediated disruption of the CFTR gene. JCI Insight 6 (2021).
14. D. Yang et al., Production of CFTR-ΔF508 Rabbits. Front Genet 11 (2021).
15. S. Sakiani, D. E. Kleiner, T. Heller, C. Koh, Hepatic Manifestations of Cystic Fibrosis. Clin Liver Dis 23, 263-277 (2019).
16. R. Fiorotto, M. Strazzabosco, Pathophysiology of Cystic Fibrosis Liver Disease: A Channelopathy Leading to Alterations in Innate Immunity and in Microbiota. Cell Mol Gastroenterol Hepatol 8, 197-207 (2019).
17. E. M. Brunt, Nonalcoholic steatohepatitis: definition and pathology. Semin Liver Dis 21, 3-16 (2001).
18. Z. Zheng et al., Exposure to fine airborne particulate matters induces hepatic fibrosis in murine models. J Hepatol 63, 1397-1404 (2015).
19. C. Zhang et al., Endoplasmic reticulum-tethered transcription factor cAMP responsive element-binding protein, hepatocyte specific, regulates hepatic lipogenesis, fatty acid oxidation, and lipolysis upon metabolic stress in mice. Hepatology 55, 1070-1082 (2012).
20. H. Kim et al., Liver-enriched transcription factor CREBH interacts with peroxisome proliferator-activated receptor alpha to regulate metabolic hormone FGF21. Endocrinology 155, 769-782 (2014).
21. H. Kim, Z. Zheng, P. D. Walker, G. Kapatos, K. Zhang, CREBH Maintains Circadian Glucose Homeostasis by Regulating Hepatic Glycogenolysis and Gluconeogenesis. Mol Cell Biol 37 (2017).
22. S. Kersten, R. Stienstra, The role and regulation of the peroxisome proliferator activated receptor alpha in human liver. Biochimie 136, 75-84 (2017).
23. C. Hetz, K. Zhang, R. J. Kaufman, Mechanisms, regulation and functions of the unfolded protein response. Nat Rev Mol Cell Biol 21, 421-438 (2020).
24. K. Zhang, R. J. Kaufman, From endoplasmic-reticulum stress to the inflammatory response. Nature 454, 455-462 (2008).
25. K. Zhang et al., The unfolded protein response transducer IRE1alpha prevents ER stress-induced hepatic steatosis. EMBO J 30, 1357-1375 (2011).
26. C. S. Achard, D. R. Laybutt, Lipid-induced endoplasmic reticulum stress in liver cells results in two distinct outcomes: adaptation with enhanced insulin signaling or insulin resistance. Endocrinology 153, 2164-2177 (2012).
【図面の簡単な説明】
【0110】
【図1】ＣＦウサギの選択された典型的なＣＦ表現型を示す図である。
【図2】ＣＦウサギは肝胆道系病変および胆汁分泌異常を示す図である。
【図3】ＣＦウサギは微小胆嚢および肝障害を示す図である。
【図4】ＣＦウサギはＮＡＳＨ表現型を示す図である。
【図5】ＣＦウサギは、脂質プロファイルの上昇および肝代謝調節因子の上方制御を示した図である。
【図6】ＣＦウサギは耐糖能異常およびグリコーゲン貯蔵の減少を示す図である。
【図7】ＣＦウサギ肝臓では、ＪＮＫとＮＦκＢを介した炎症反応が活性化されていることを示す図である。
【図8】ＣＦウサギ肝臓ではＥＲストレスシグナルが活性化されていることを示す図である。
【図9】ＣＦウサギにおけるＳＧＬＴ１を示す図である。
【図10】ヒトＣＦ細胞におけるＳＧＬＴ１を示す図である。
【図11】Ｓｏｔａ処置前後のＣＦウサギのＩＶＧＴＴ分析を示す図である。
【図12】ＣＦウサギの選択された血液化学検査結果を示す図である。
【図13】ＳｏｔａはＣＦウサギの食欲および体重増加を促進することを示す図である。
【図14】ＳｏｔａはＣＦウサギの寿命を延ばすことを示す図である。
【図15】Ｓｏｔａは、ＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させたことを示す図である。
【図16】ＳＧＬＴ１はＣＦウサギ肝臓のアルブミン陽性細胞に発現していることを示す図である。
【図17】ウサギ肝臓のＨＥ、シリウスレッド、ＰＡＳ染色を示す図である。
【図18】Ｓｏｔａ処置ありまたは処置なしのＷＴウサギおよびＣＦウサギ由来の肝臓サンプルにおけるＢＡ種を示す図である。
【図19】ＳｏｔａはＣＦウサギ肝臓において、ＳＧＬＴ１ならびに主要なＥＲストレスおよび炎症メディエーターを減少させたことを示す図である。
【図20】ＸＢＰ１ｓはＳＬＣ５Ａ１の転写因子であることを示す図である。
【図21】Ｓｏｔａ（５μｇ／ｍｌ）はＨｕｈ７細胞においてＰＡ（１０μｇ／ｍＬ）誘発性脂肪症を減衰させたことを示す図である。
【図22】ＳＧＬＴ１阻害が炎症性肝疾患を改善する作用機序の仮説を示す図である。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【図10】
【図11】
【図12】
【図13】
【図14】
【図15】
【図16】
【図17】
【図18】
【図19】
【図20】
【図21】
【図22】
【配列表】
【国際調査報告】