特表 2024-509196 癌の治療のためのシャペロニン含有ＴＣＰ－１阻害剤

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-29

(54)【発明の名称】癌の治療のためのシャペロニン含有ＴＣＰ－１阻害剤

(51)【国際特許分類】

   A61K 45/00 20060101AFI20240221BHJP

   A61P 35/00 20060101ALI20240221BHJP

   A61P 43/00 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 38/08 20190101ALI20240221BHJP

   A61K 38/10 20060101ALI20240221BHJP

   A61P 35/04 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 31/519 20060101ALI20240221BHJP

   A61K 31/506 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/113 20100101ALN20240221BHJP

   C07K 16/18 20060101ALN20240221BHJP

   C07K 7/06 20060101ALN20240221BHJP

   C07K 7/08 20060101ALN20240221BHJP

【ＦＩ】

A61K45/00

A61P35/00

A61P43/00 111

A61K38/08

A61K38/10

A61P35/04

A61K31/519

A61K31/506

C12N15/113 Z ZNA

C07K16/18

C07K7/06

C07K7/08

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023553595

(86)(22)【出願日】2022-03-07

(85)【翻訳文提出日】2023-11-02

(86)【国際出願番号】 US2022019165

(87)【国際公開番号】W WO2022187744

(87)【国際公開日】2022-09-09

(31)【優先権主張番号】63/157,051

(32)【優先日】2021-03-05

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】510170730

【氏名又は名称】ユニバーシティ オブ セントラル フロリダ リサーチ ファウンデーション，インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100092783

【弁理士】

【氏名又は名称】小林 浩

(74)【代理人】

【識別番号】100120134

【弁理士】

【氏名又は名称】大森 規雄

(72)【発明者】

【氏名】キャレド，アネッテ

【テーマコード（参考）】

4C084

4C086

4H045

【Ｆターム（参考）】

4C084AA17

4C084BA01

4C084BA16

4C084BA17

4C084BA18

4C084MA02

4C084NA05

4C084NA14

4C084ZB26

4C084ZC02

4C086AA01

4C086AA02

4C086BC42

4C086CB09

4C086GA07

4C086GA08

4C086GA12

4C086MA01

4C086MA02

4C086MA04

4C086NA05

4C086NA14

4C086ZB26

4C086ZC02

4H045AA10

4H045AA11

4H045AA30

4H045BA10

4H045BA13

4H045BA14

4H045BA15

4H045BA17

4H045DA75

4H045DA76

4H045EA20

(57)【要約】

癌を治療するための組成物およびその使用が本明細書において開示される。
【選択図】図３７

【特許請求の範囲】

【請求項1】

その必要のある被験体における癌を治療する方法であって、前記被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む、方法。

【請求項2】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤である、請求項１に記載の方法。

【請求項3】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ２阻害剤である、請求項１または２に記載の方法。

【請求項4】

前記ＣＣＴ阻害剤が小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいヘアピンＲＮＡを含む、請求３に記載の方法。

【請求項5】

前記ペプチドがＣＴ２０ｐペプチドである、請求項４に記載の方法。

【請求項6】

前記ＣＴ２０ペプチドが項配列番号：１～６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の方法

【請求項7】

さらに前記被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することをさらに含む、、請求項１～６のいずれか１項に記載の方法。

【請求項8】

前記細胞周期阻害剤がＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤を含む、請求項７に記載の方法。

【請求項9】

前記ＣＤＫ４阻害剤がパルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブを含む、請求項８に記載の方法。

【請求項10】

前記癌が転移性癌である。請求項１～９のいずれか１項に記載の方法。

【請求項11】

前記癌が肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項12】

前記乳癌は、ルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項１１に記載の方法。

【請求項13】

前記癌が小児癌である、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項14】

前記小児癌が神経芽腫、腎明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である、請求項１３に記載の方法。

【請求項15】

前記被験体から得た癌細胞は、参照対照に相対的にＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１からなる群より選択される一つまたは複数の腫瘍生物マーカー増加したレベルを有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法

【請求項16】

その必要のある被験体における薬物抵抗性癌を治療する方法であって、前記被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む、方法。

【請求項17】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤である、請求項１６に記載の方法。

【請求項18】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ２阻害剤である、請求項１６または１７に記載の方法。

【請求項19】

前記ＣＣＴ阻害剤が小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはヘアピンＲＮＡを含む、請求１８に記載の方法。

【請求項20】

前記ペプチドがＣＴ２０ｐペプチドである、請求項１９に記載の方法。

【請求項21】

前記ＣＴ２０ペプチドが項配列番号：１～６に記載のアミノ酸配列を含む、請求項２０に記載の方法

【請求項22】

前記薬物抵抗性癌が細胞周期阻害剤に対する抵抗性である、請求項１６～２１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項23】

さらに前記被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することをさらに含む、請求項１６～２２のいずれか１項に記載の方法。

【請求項24】

前記細胞周期阻害剤がＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤を含む、請求項２２または２３に記載の方法。

【請求項25】

前記ＣＤＫ４阻害剤がパルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブを含む、請求項２４に記載の方法。

【請求項26】

前記癌が転移性癌である。請求項１６～２５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項27】

前記癌が肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌である。請求項１６～２６５のいずれか１項に記載の方法。

【請求項28】

前記乳癌は、ルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項２７に記載の方法。

【請求項29】

前記癌が小児癌である、請求項１６～２８の方法。

【請求項30】

前記小児癌が神経芽腫、腎明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である、請求項２９に記載の方法。

【請求項31】

前記被験体から得た癌細胞は、参照対照に相対的にＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１からなる群より選択される一つまたは複数の腫瘍生物マーカーの増加したレベルを有する、請求項１～１４のいずれか１項に記載の方法

【請求項32】

被験体が癌を有すると診断する方法であって、
ａ）シャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）のレベルを参照対照と比較して定量化すること；
ｂ）前記ＣＣＴのレベルが前記参照対照より高いときに前記被験体が癌を有すると決定すること；および
ｃ）前記ＣＣＴのレベルが前記参照対照より低いときに、前記被験体が癌を有さないと決定することを含む、方法。

【請求項33】

さらに被験体にＣＣＴ阻害剤の治療上有効な量を投与することをさらに含む、請求項３２に記載の方法。

【請求項34】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤である、請求項３３に記載の方法。

【請求項35】

前記ＣＣＴ阻害剤がＣＣＴ２阻害剤である、請求項３３または３４に記載の方法。

【請求項36】

前記ＣＣＴ阻害剤が小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはいヘアピンＲＮＡを含む、請求３５に記載の方法。

【請求項37】

前記ペプチドがＣＴ２０ｐペプチドである、請求項３６に記載の方法。

【請求項38】

さらに前記被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することをさらに含む、請求項３２～３７のいずれか１項に記載の方法。

【請求項39】

前記細胞周期阻害剤がＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤を含む、請求項３８に記載の方法。

【請求項40】

前記ＣＤＫ４阻害剤がパルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブを含む、請求項３９に記載の方法。

【請求項41】

前記癌が転移性癌である。請求項３２～４０のいずれか１項に記載の方法。

【請求項42】

前記癌が肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌である。請求項３２～４１のいずれか１項に記載の方法。

【請求項43】

前記乳癌は、ルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）－ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌である、請求項４２に記載の方法。

【請求項44】

前記癌が小児癌である、請求項１６～２８のいずれか１項に記載の方法。

【請求項45】

前記小児癌が神経芽腫、腎明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である、請求項２９２に記載の方法。

【請求項46】

前記被験体から得た癌細胞は、参照対照に相対的にＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１からなる群より選択される一つまたは複数の腫瘍生物マーカー増加したレベルを有する、請求項１６～３０のいずれか１項に記載の方法ある

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願の相互参照
本出願は、２０２１年３月５日に出願された、米国仮出願第６３／１５７，０５１号の優先権の利益を請求し、これは、参照によってその全体が援用される。

【背景技術】

【0002】

乳癌は、女性の中で最も一般的な癌であり、主な死因となっている。乳癌の年齢標準化した発症率および死亡率の世界的評価は、それぞれ１００，０００人あたり４６．３および１３．０である。乳癌は、典型的にはエストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）およびヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）の発現に基づいて分類される。乳癌の主な分子サブタイプは、以下のとおりである：ルミナールＡ、これは、ホルモン－受容体陽（ＥＲ＋ＰＲ＋ＨＥＲ２－、Ｋｉ６７低）、低グレードであり、ゆっくり成長し、および最もよい予後を有する；ルミナールＢ（またホルモン受容体陽性（ＥＲ＋ＰＲ＋ ＨＥＲ２＋／－、Ｋｉ６７高）、これは、ルミナールＡより速く成長し、およびより悪い予後を有する；ＨＥＲ２陽性またはエンリッチド、これは、ホルモン受容体は陰性だがＨＥＲ２陽性（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２＋）であり、ルミナール癌よりも速く成長し、予後が悪い。；およびトリプルネガティブ（ＴＮＢＣ）またはベーシック、これは、ホルモン受容体陰性（ＥＲ－ＰＲ－ＨＥＲ２－）であり、より侵襲的であり、ＢＲＣＡ１変異を持つ女性に一般的であり、かつその他のサブタイプと同様に内分泌療法またはＨＥＲ２阻害剤で治療することができない。乳癌のこれらのサブタイプは、患者を層別化するのに役立ち、および予後の予測および治療上の意思決定に影響を与える。しかし、乳癌は、これらのサブタイプを越える複雑さを持つ異質な疾患である。腫瘍サプレッサーの喪失および癌遺伝子の増幅は、乳房腫瘍において共通する。遺伝子増幅は、乳癌において最も頻繁に見られる遺伝的変異であり、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、線維芽細胞成長因子受容体（ＦＧＦＲ）、ＣＤＫ４およびＭＤＭ２は、原発性および再発性乳房腫瘍において最も頻繁に増幅される遺伝子である。これらの遺伝子における遺伝子変化は、患者の予後および臨床病理学的特徴と相関しており、およびこれらの治療上のターゲティングは、プレシジョンメディシンの目標のままである。必要なことは、癌を診断し、および治療するための組成物および方法である。

【発明の概要】

【0003】

被験体における癌および／または転移を治療し、予防し、減少させ、および／または阻害するための方法が、本明細書において開示される。また、癌を診断するための方法が、本明細書において開示される。

【0004】

本発明の一つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面および下以下の記述に記載してある。本発明のその他の特徴、目的および利点は、記述および図面から、および特許請求の範囲から明らかであろう。

【0005】

いくつかの態様において、その必要のある被験体においておける癌および／または転移を治療し、阻害し、低下させ、減少させ、寛解させ、および／または予防する方法であって、被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む方法が、本明細書において開示される。いくつかの実施形態において、本明細書において記述したＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤である。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ２阻害剤である。

【0006】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡを含む。

【0007】

いくつかの実施例において、本明細書において開示した方法は、さらに被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤（たとえば、パルボシクリブ、リボシクリブ、またはアベマシクリブ）を含む。
いくつかの実施形態において、癌は、転移性癌である。

【0008】

いくつかの実施形態において、癌は、肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌である。いくつかの実施形態において、乳癌は、ルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌を含む。

【0009】

いくつかの実施形態において、癌は、小児癌である。いくつかの実施形態において、小児癌は、神経芽腫、腎クリアセル肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である。

【0010】

いくつかの実施形態において、被験体から得られた癌細胞は、参照対照と比較してＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１から選択される一つまたは複数の腫瘍生物マーカーの増加したレベルを有する。

【0011】

また、その必要のある被験体における薬物抵抗性癌および／または転移を治療し、阻害し、低下させ、減少させ、寛解させ、および／または予防する方法であって、被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む方法が、本明細書において開示される。一つの実施例において、薬物抵抗性癌または転移は、細胞周期阻害剤に対して抵抗性である。一つの実施例において、薬物抵抗性癌または転移は、ＣＤＫ４阻害剤に対して抵抗性である

【0012】

被験体が癌を有すると診断する方法であって、ａ）シャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）のレベルを参照対照と比較して定量化すること；ｂ）ＣＣＴのレベルが参照対照より高いときに被験体が癌を有すると決定すること；およびｃ）ＣＣＴのレベルが参照対照より低いときに、被験体が癌を有さないと決定することを含む方法が、本明細書において開示される。

【0013】

いくつかの実施形態において、本方法は、さらに被験体に本明細書において開示されたＣＣＴ阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。

【図面の簡単な説明】

【0014】

【図1】ＣＣＴ２の遺伝的変異と細胞周期遺伝子の変異の同時存在は、機能的関係を示唆している。（図１Ａおよび図１Ｂ）ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒデータベースでは、ＣＣＴ２およびＣＣＴ３の遺伝的変異（図１Ａ）、並びにＣＣＴ２変容および無変容群の患者における全体的な生存率および無増悪生存率（図１Ｂ）についてｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して評価した。（図１Ｃ）ＣＣＬＥのデータをｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用してエクスポートしたＭＣＦ７およびＴ４７ＤＤ株化細胞のコピー数変化および突然変異プロファイルを示す。（図１Ｄ）Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞のＣＣＴ突然変異および発現は、ＣＯＳＭＩＣデータベースから得た。

【図2】ＣＣＴ２－ＦＬＡＧは、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７乳癌株化細胞において過剰発現される。（図２Ａ）レンチウイルスＣＣＴ２－ＦＬＡＧおよび対照ベクターと共に導入された細胞によるＧＦＰの発言を示してある。外来ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（ａｎｔｉ－ＦＬＡＧ抗体）、総ＣＣＴ２（Ｎ末端特異的ａｎｔｉ－ＣＣＴ２抗体）、および内在ＣＣＴ２（Ｃ末端特異的ａｎｔｉ－ＣＣＴ２抗体）タンパク質についてのウェスタンブロットである（図２Ｂ）。データは、総タンパク質に対して規準化した。代表的なブロットを示してあり、およびデータの複製をグラフにおいて要約した。（図２Ｃ）総ＣＣＴ２および外来ＣＣＴ２－ＦＬＡＧについての相対ｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲよって決定した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。計算は、式２－ΔΔＣｔ式を使用して行った。

【図3】ＣＣＴ２は、乳癌細胞による球状体形成を増強する。（図３Ａおよび３Ｂ）３Ｄ培養の３日目、５日目および８日目の２４ウェルＵＬＡ平底プレート上で成長したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７球状体のマージした明視野およびＧＦＰ画像である。倍率は２．５倍である。（図３Ｂ）Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞についてウェルあたりの総球状体細胞数を示してある。細胞を球状体から分離して、フローサイトメトリーを使用して係数した。（図３Ｃ）球状体成長の３日目、５日目および８日目の９６ウェルＵＬＡ丸底プレートで成長したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７の球状体のマージされた明視野およびＧＦＰ画像。９６ウェルＵＬＡプレートからの球状体を周囲長測定のために使用した。（図３Ｄ）総ＣＣＴ２および外来ＣＣＴ２－ＦＬＡＧについての相対ｍＲＮＡ発現をＲＴ－ｑＰＣＲよって決定した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。＊＊ｐ－値＜０．００５、＊＊＊ｐ値＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ値＜０．００００５。

【図4】ＣＣＴ２枯渇は、乳癌球状体形成を障害する。（図４Ａ）ＣＣＴ２または対照ｓｈＲＮＡ発現を誘導するためにドキシサイクリンを使用するＣＣＴ２枯渇の２４、４８、７２時間後におけるＥ０７７１細胞についての明視野画像。ＣＣＴ２枯渇は、３日目にて球状体成長の球状体を誘導した。（図４Ｂ）Ｅ０７７１細胞におけるＣＣＴ２枯渇を０日目（球状体培養の開始）にて誘導して、ＣＣＴ２または対照ｓｈＲＮＡの発現を誘導するためにドキシサイクリンを使用した４８時間および７２時間後にて撮像した。円は、小型の球状体コアを示し、一方で、矢印は、ゆるい細胞凝集体の形成を示す。

【図5】ＣＣＴ２過剰発現は、３Ｄ球状体培養後の乳癌細胞の付着を促進し、細胞内アクチンを促進する。（図５Ａ）標準的な組織培養プレート上に播種したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現、並びにレンチウイルス対照、細胞からの８日目の球状体の明視野およびＧＦＰオーバレイイメージを示してある。非接着細胞を洗い流して、接着細胞の画像を撮影した。次いで、接着細胞をフローサイトメトリーよって分離して、計数した。倍率は、２．５Ｘ。（図５Ｂ）Ｆ－アクチン（緑色蛍光ファロイジンで染色した、）ＤＡＰＩおよび２つのシグナルのオーバレイの共焦点顕微鏡画像をＴ４７Ｄ、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞について示してある。倍率は、４０Ｘであった。蛍光細胞をＩｍａｇｅＪを使用して定量化した。＊ ｐ値＜０．０５、＊＊＊ ｐ値＜０．０００５、＊＊＊＊ ｐ値＜０．００００５。

【図6】ＣＣＴ２は、３Ｄから２Ｄ単層培養への乳癌細胞の移行をサポートする。（図６Ａ）Ｔ４７Ｄ細胞ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照に由来した球状体の確立された２Ｄ単層培養の明視野顕微鏡画像を示してある。倍率は、２０Ｘであった。（図６Ｂ）移動後２日および５日における標準的な組織培養プレートへの球状体移動の結果を示す明視野およびＧＦＰ顕微鏡画像。倍率は、２．５Ｘであった。（図６Ｃ）２Ｄポスト３Ｄ単層培養において培養したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞からの総ＣＣＴ２およびＣＣＴ２－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ発現を評価した。使用した式は、２^{－ΔΔＣｔ}であり、ＧＡＰＤＨは、前述したように参照遺伝子であった。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ値＜０．００５。

【図7】ＣＣＴ２過剰発現は、３Ｄ培養における乳癌細胞の細胞分裂を増加させる。（図７Ａおよび７Ｂ）ＶｉａＦｌｕｏｒ（登録商標）色素を使用して、球状体３Ｄ培養の３－５日間にわたってＴ４７Ｄ細胞（図７Ａ）およびＭＣＦ７細胞（図７Ｂ）、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現並びにレンチウイルス対照について細胞分裂を評価した。細胞分裂は、フローサイトメトリーよって評価し、世代時間（ヒストグラム）およびパーセント細胞分裂（グラフ）を決定した。（図７Ｃおよび７Ｄ）ＰＩ排除アッセイを使用してＴ４７Ｄ細胞（図７Ｃ）およびＭＣＦ７細胞（図７Ｄ）について３Ｄ成長の３、５および８日目における球状体培養からの細胞の生存度を評価した。データは、ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓフロー・サイトメーターを使用して取得して、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアを使用して解析した。＊ｐ値＜０．０５、＊＊ｐ－値＜０．００５、＊＊＊ｐ値＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ値＜０．００００５。

【図8】ＣＣＴ２過剰発現は、Ｇ１／Ｓ以降を介して乳癌細胞の進行を促進する。２Ｄ培養におけるＴ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現並びにレンチウイルス対照、細胞の増殖を血清枯渇後に同期させて、細胞周期分布を２Ｄ単層培養（図８Ａおよび８Ｂ）および２Ｄポスト３Ｄ培養（図８Ｃおよび８Ｄ）からの細胞のＰＩ染色よって解析した。データは、ＣｙｔｏＦｌｅｘ Ｓフローサイトメーターを使用して取得して、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアで解析した。

【図9】ＣＣＴ２は、乳癌細胞におけるＭＹＣの発現および細胞周期遺伝子をアップレギュレートする。（図９Ａ）グラフは、３Ｄ成長の０（プレ球状体）３、５および８日目にてＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞におけるＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現に応答してそれぞれの遺伝子について（－ΔΔＣｔ）として測定した相対的遺伝子発現の結果を示す。ＭＣＦ７レンチウイルス対照を参照試料として使用した。このデータはを使用して表４において示した多重リニア混合モデルを決定した。（図９Ｂ）サイクリンＤ１発現をＴ４７Ｄレンチウイルス対照に関して評価し、および統計解析を表４において示した。（図９Ｃ）遺伝子発現比較を、２Ｄ（プレ球状体）および２Ｄポスト３Ｄ／球状体培養において成長したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞においてＣＣＴ－ＦＬＡＧ過剰発現に応答するそれぞれの遺伝子について測定した。このデータを使用して、表５において示したその複数因子ＡＮＯＶＡ解析を行った。

【図10】能性癌遺伝子としてのＣＣＴ２。（図１０Ａ）ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞、ＣＣＴ２過剰発現、並びにレンチウイルス対照におけるＭＹＣ、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）および総ＣＣＴ２間の遺伝子相互作用を証明するために、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数を決定した。組み合わせたデータセットからの結果を示してある。遺伝子発現は、参照としてＭＣＦ７レンチウイルス対照を使用して－ΔΔＣｔとして測定した。赤く着色した正方形は、相関がｐ値＜０．０５で有意だったことを示す。ｐ値は、Ｈｏｌｍ多重試験調整に基づいて調整した。（図１０Ｂ）ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒデータセットをＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＣＤＫ２およびＣＤＫ４ ｍＲＮＡとＣＣＴ２ ｍＲＮＡの同時発現について解析した。ＳｐｅａｒｍａｎおよびＰｅａｒｓｏｎ相関ｐ値を示してある。（図１０Ｃ）物理的および遺伝的インテグレーターでのＣＣＴ２相互作用ネットワークを示してある（ＢｉｏＧＲＩＤからのデータ）。より大きなノードのサイズは、増加した結合性を表し、およびより厚い縁サイズは、増加した証拠を表し、会合をサポートする。ＣＣＴ２インタラクターの一覧は、表６に含まれる。

【図11】乳癌ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞におけるＣＣＴ３発現。（図１１Ａ）Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞におけるＣＣＴ３タンパク質発現の代表的免疫ブロット。グラフは、総タンパク質に対して規準化したブロットからのデータを要約する。（図１１Ｂ）ＣＣＴ３相対的ｍＲＮＡ発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して評価した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。

【図12】乳癌細胞の球状体培養におけるＣＣＴ２タンパク質レベル。グラフは、Ｔ４７Ｄ（図１２Ａ）およびＭＣＦ７（図１２Ｂ）、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞における総タンパク質に対して規準化した総ＣＣＴ２タンパク質、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質（抗ＦＬＡＧ）および内因性ＣＣＴ２タンパク質を示す。データは、図１３において示した免疫ブロットから決定した。

【図13】ＣＣＴ２タンパク質についての免疫ブロット。０日目（２Ｄ培養、プレ球状体）、３日、５日および８日の球状体培養、並びに２Ｄポスト３Ｄ培養でのＴ４７Ｄ（図１３Ａ）およびＭＣＦ７（図１３Ｂ）における総タンパク質発現、Ｔ４７Ｄ（図１３Ｃ）およびＭＣＦ７（図１３Ｄ）におけるＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（抗ＦＬＡＧ）並びに内因性ＣＣＴ２についての代表的な免疫ブロット。総タンパク質染色をそれぞれのパネルを下に示してある。

【図14】乳癌細胞の球状体逆培養（２Ｄポスト３Ｄ）におけるＣＣＴ２タンパク質レベル。グラフは、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７における総タンパク質、ＣＣＴ２－ ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞に対して規準化したＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（抗ＦＬＡＧ）（図１４Ａ）、（図１４Ｂ）総ＣＣＴ２タンパク質および（図１４Ｃ）内因性ＣＣＴ２タンパク質発現を示す。細胞は、３Ｄ球状体培養において成長させ、次いで２Ｄ成長（２Ｄポスト３Ｄ）のための標準的組織培養プレートへ移した。データは、図１３において示した免疫ブロットから決定した。

【図15】球状体培養における乳癌細胞の生存度ゲーティング。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照細胞をＵＬＡプレート上で培養し、およびＰＩ排除染色のために回収した。球状体成長の３日、５日、８日でのＰＩ陰性細胞上の生細胞ゲーティングをＴ４７Ｄ（図１５Ａ）およびＭＣＦ７（図１５Ｂ）細胞について示してある。

【図16】血清枯渇は、乳癌細胞の細胞周期停止を生じさせる。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞は、２４時間血清を枯渇させ、および細胞を、ＰＩ染色を使用する細胞周期分布の解析のために収集した。（図１６Ａ～１６Ｄ）標準な２Ｄ培養（図１６Ａ、１６Ｂ）におけるＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞の、および３Ｄから２Ｄ培養（２Ｄポスト３Ｄ培養）（図１６Ｃ、１６Ｄ）へ移行する細胞の細胞サイクル分布。

【図17-1】乳癌細胞の成長同期培養の細胞サイクル分布は。成長を停止したＴ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞を２４～４８時間血清含有培地において培養して、細胞を、ＰＩ染色を使用する細胞周期分布の解析のために収集した。（図１７Ａ～１７Ｄ）標準的２Ｄ培養（図１７Ａ、１７Ｂ）におけるＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞の、および３Ｄから２Ｄ培養（２Ｄポスト３Ｄ培養）（図１７Ｃ、１７Ｄ）へ移行する細胞の細胞サイクル分布。

【図17-2】同上。

【図18】ＣＣＴ２は、癌進行と関連するアンプリコンに位置する。ＣＣＴ２は、癌における再発性増幅を受ける１２ｑ１３－１５染色体領域において見いだされる。（図１８Ａ～１８Ｃ）ＣＣＴ２、ＭＤＭ２、ＦＲＳ２、ＹＥＡＴＳ４、ＣＤＫ４遺伝子変化およびｍＲＮＡ発現についてのヒートマップＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒＡｔｒｕｓ研究組み合わせ、肉腫（図１８Ａ）および侵襲性乳房癌腫ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒ研究（図１８Ｂ）。侵襲性乳房癌腫（ＴＣＧＡ ＰａｎＣａｎｃｅｒ研究）における無変化群と比較したＣＣＴ２における遺伝子の同時増幅（図１８Ｃ）。

【図19-1】ＣＣＴ２レベルは神経芽細胞腫様の小児癌において存在する。図１９Ａ。ＣＣＴ２遺伝子発現レベルを比較するＵＣＳＣ ＸｅｎａデータセットＴＣＧＡ（青）、ＴＡＲＧＥＴ（赤）およびＧＴＥｘ（紫）コホート（ｎ＝１９，１３１）。図１９Ｂ。特異的小児癌におけるＣＣＴ２遺伝子発現を比較するＵＣＳＣ ＸｅｎａデータセットＴＡＲＧＥＴ。ＡＬＬ：急性リンパ芽球性白血病、ＡＭＬ：急性骨髄性白血病。図１９Ｃ。特異的小児癌におけるＣＣＴ２遺伝子発現を比較するＫｉｄｓＦｉｒｓｔデータセット。ＡＴＲＴ：非典型的テラトイドラブドイド腫瘍、ＤＮＥＴ：胚細胞性神経上皮腫、ＭＰＮＳＴ：悪性末梢神経鞘腫、ＳＥＧＡ：室下巨細胞星状細胞腫。膠腫／星細胞腫：高度（ＷＨＯ分類ＩＩＩ／ＩＶ）対低度（ＷＨＯ分類Ｉ／ＩＩ）。図１９Ｄ。いくつかの遺伝子：ＣＣＴ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１の発現レベルを比較する神経芽腫場合（ｎ＝１６７）に焦点をあてたＵＣＳＣ ＸｅｎａＴＡＲＥＴデータセット。

【図19-2】同上。

【図20】小児組織マイクロアレイにおけるＣＣＴ２に対する染色。図２０Ａ。ＰＣ７０１小児ＴＭＡのＣＣＴ２染色からの例示画像。ＣＣＴ２染色スコアをそれぞれの画像の下に列記してある。図２０Ｂ。ＮＢ６４２ｃ神経芽腫ＴＭＡのＣＣＴ２染色から例示画像。ＣＣＴ２染色スコア、並びにＴＭＡデータと共に示したＣＤ５６およびＣｇＡスコアをそれぞれの画像の下に列記してある。全ての画像は、２０ｘにて摂取した。

【図21-1】神経芽腫株化細胞におけるＣＣＴ２のレベル。図２１Ａ。ＩＭＲ３２対ＳＫＮＡＳにおけるＣＣＴの８サブユニットについてのｍＲＮＡ発現に注目するＮｅｍｏｕｒｓデータベース。色は、株化細胞間の遺伝子発現における変化を示す。赤は、遺伝子発現がＩＭＲ－３２と比較してＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞において減少したことを示し、緑は、遺伝子発現が増加したことを示す。ＣＣＴサブユニットの発現は、ＣＣＴ６Ｂを除き、非常に強かった（約１０，０００－３０，０００読み取りから検証）。典型的な発現された産物は、約３００－１０００読み取りでばらつく。５０未満の読み取りは、有意ではない。図２１Ｂ。ＣＣＴ２およびＣＣＴ３遺伝子発現についてのＩＭＲ３２およびＳＫＮＡＳのＲＴ－ＰＣＲ解析。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌株化細胞を参照として使用した。図２１Ｃ。ＣＣＴ２およびＣＣＴ３についてのＩＭＲ３２およびＳＫＮＡＳのウェスタン解析。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１乳癌株化細胞を参照として使用した。

【図21-2】同上。

【図22-1】ＳＫＮＡＳにおけるＣＣＴ２のノックダウンは、生存度を減少させ、ＩＭＲ３２ ｓｉＲＮＡ処理した細胞は、より少ないアクチンを有した。図２２Ａ。渡岸処理での活性化前および後にｓｈＲＮＡ－ＧＦＰまたはｓｈＲＮＡ－ＣＣＴ２をトランスフェクトしたＳＫＮＡＳ細胞のウェスタン解析。図２２Ｂ。ｓｈＲＮＡプラスミドでＳＫＮＡＳにおけるＣＣＴ２の一過性ノックダウン後のＭＴＴ生存度アッセイ。図２２Ｃ。ＣＣＴ２ ｓｉＲＮＡ処理前および後のＩＭＲ３２細胞におけるアクチンおよびＤＡＰＩ染色の代表的画像。

【図22-2】同上。

【図23-1】ＳＫＮＡＳおよびＩＭＲ３２細胞におけるＣＣＴ２の過剰発現は、ＲＮＡおよびタンパク質における増大を引き起こす。Ａ－Ｂ。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ７乳癌株化細胞と比較したレンチウイルス形質導入後のＳＫＮＡＳ（図２３Ａ）およびＩＭＲ３２（図２３Ｂ）における総ＣＣＴ２、ＣＣＴ３およびＦＬＡＧについてのＲＴ－ＰＣＲ解析。図２３（Ｃ－Ｄ）。レンチウイルス形質導入後のＳＫＮＡＳ（図２３Ｃ）およびＩＭＲ３２（図２３Ｄ）におけるＣＣＴ２、ＣＣＴ３、エンドＣＣＴ２およびＦＬＡＧについての総タンパク質およびウエスタンブロット。図２３Ｃ）レーンは：１．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，２．ＭＣＦ７，３．Ａｎｄ ４．ＳＫＮＡＳ－ＧＦＰ，５．および６．ＳＫＮＡＳ－ＣＣＴ２である。図２３Ｄ）レーンは、１．ＭＤＡ－ＭＢ－２３１，２．ＭＣＦ７，３．Ａｎｄ ４．ＩＭＲ３２－ＧＦＰ，５．および６．ＩＭＲ３２－ＣＣＴ２ＩＭＲ３２－ＣＣＴ２である。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＭＣＦ７株化細胞を参照として使用してある。図２３（Ｅ－Ｆ）。ＳＫＮＡＳ（図２３）およびＩＭＲ３２（図２３Ｆ）におけるウエスタンブロットからのバンドの定量化。

【図23-2】同上。

【図24-1】神経芽腫株化細胞の機能的アッセイは、ＣＣＴ２過剰発現についての最小の変化を示す。図２４Ａ。ＳＫＮＡＳ－ＧＦＰおよびＳＫＮＡＳ－ＣＣＴ２を比較する遊走アッセイ。図２４Ｂ。ＩＭＲ３２－ＧＦＰ対ＩＭＲ３２－ＣＣＴ２およびＳＫＮＡＳ－ＧＦＰ対ＳＫＮＡＳ－ＣＣＴ２におけるアクチンおよびＤＡＰＩ染色。図２４Ｃ。アクチン染色の定量化。

【図24-2】同上。

【図25】ＣＣＴ遺伝子発現は、正常組織と比較して癌組織において増加する。正常（ＧＴＥｘ）対癌性（ＴＣＧＡ）組織における全ての８ＣＣＴサブユニットを比較するＵＣＳＣ Ｘｅｎａデータベース。（図２５ａ）全ての癌（ｎ＝１７，２００）：最も有意な相違は、ＣＣＴ２およびＣＣＴ３遺伝子において観察され、最少の相違は、ＣＣＴ６Ｂ遺伝子においてであった。（図２５ｂ）能癌（ｎ＝１，２７７）：最も有意な相違は、ＣＣＴ２遺伝子において見られ、最少の相違は、ＣＣＴ６Ｂ遺伝子においてであった。（図２５ｃ）乳癌（ｎ＝１，６６０）：最も有意な相違は、ＣＣＴ３およびＣＣＴ８遺伝子において見られ、最少の相違は、ＣＣＴ６Ｂ遺伝子においてであった。（図２５ｄ）結腸癌（ｎ＝５９８）：最も有意な相違は、ＣＣＴ２遺伝子において見られ、最少の相違は、ＣＣＴ６Ｂ遺伝子においてであった。（図２５ｅ）灰癌（ｎ＝１，３０１）：最も有意な相違は、ＣＣＴ２およびＣＣＴ３遺伝子において見られ、最少の相違は、ＣＣＴ６Ｂ遺伝子においてであった。全ての試料についてｐ＜０．０００１。

【図26-1】図２６Ａは、ＣＣＴサブユニットの変化した発現を伴う小児癌を示す。ＣＣＴサブユニットの発現について小児汎癌解析をＴＡＲＥＴデータベースを使用して行った。分析は、全てのＣＣＴサブユニットについて原発性疾患よって行った。精巣において発現されるだけであるＣＣＴ６Ｂは、負の対照として含めてある。

【図26-2】図２６Ｂは、ＣＣＴサブユニットの変化した発現を伴う小児癌を示す。ＣＣＴサブユニットの発現について小児汎癌解析をＴＡＲＥＴデータベースを使用して行った。分析は、ＣＣＴ２サブユニットについて原発性疾患よって行った。ＲＴ、ラブドイド腫瘍；ＡＭＬ、急性顆粒球性白血病；ＡＬＬ、急性リンパ芽球性白血病；ＡＭＬ－ＩＦ、誘導失敗ＡＭＬ；ＮＢＬ、神経芽細胞腫；ＷＴ、ウィルムス腫瘍；ＣＣＳＫ、腎明細胞肉腫。矢印は、神経芽腫についての結果を示す。

【図27】ＣＣＴ２発現が小児腫瘍組織において増加することを示す。ＣＣＴ２タンパク質レベルは、小児悪性腫瘍組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ＰＣ７０１、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）を使用して、２１症例の腎芽細胞腫、１２神経芽腫プラス、７内胚葉洞癌腫、４網膜芽細胞腫、３肝芽腫、２髄芽腫、４リンパ腫、１つのそれぞれ脈絡叢パピローマ、神経膠芽腫、副腎皮質の癌腫、胚性横紋筋肉腫、上衣細胞腫、神経芽腫、原始神経外胚葉性腫瘍、歯槽横紋筋肉腫、未熟奇形腫、平滑筋肉腫、プラス７正常組織を含む、正常組織で、症例あたり単一コアで免疫組織化学よって調査した。それぞれの検体を独立した病理学者によって読み込み、ＣＣＴ染色スコアを公開されたデータ（Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ、ＣＣＲ、２０１６）に基づいて割り当てた。代表的な画像を示してある。表は、小児癌および正常組織のＴＭＡにおけるＣＣＴ２染色スコアの結果を要約する。

【図28】ＣＣＴ２発現が神経芽腫組織において増加することを示す。ＣＣＴ２タンパク質レベルは、神経芽腫組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）（ＮＢ６４２ｃ、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ）を使用して、２７症例の神経芽腫および５末梢神経組織、症例あたり２重コアを含む免疫組織化学よって調査した。それぞれの検体を独立した病理学者によって読み込み、ＣＣＴ染色スコアを我々の公開されたデータ（Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ ｅｔ ａｌ、ＣＣＲ、２０１６）に基づいて割り当てた。ＣＣＴ２ｎｅｇ、ＣＣＴ２ｌｏおよびＣＣＴ２ｈｉ染色についての代表的な画像を示してある。表は、神経芽腫および正常組織のＴＭＡにおけるスコアを染色するＣＣＴ２の結果を要約する。

【図29】ＣＣＴ２（およびＣＣＴ３）が神経芽腫細胞において高度に発現されることを示す。（図２９Ａ）総ＣＣＴ２およびＣＣＴ３についての相対的ｍＲＮＡ発現は、ＩＭＲ－３２およびＳＫ－Ｎ－Ａｓ神経芽腫株化細胞におけるＲＴ－ｑＰＣＲ（ｎ＝５）によって決定した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。算出は、計算は、式２－ΔΔＣｔ式を使用して行った。値は、平均±ＳＤである。ｐ値は、有意ではなかった。（図２９Ｂ）ＩＭＲ－３２およびＳＫ－Ｎ－ＡＳ株化細胞における総ＣＣＴ２（抗ＣＣＴ２抗体）および総ＣＣＴ２（抗ＣＣＴ３抗体）タンパク質についてのウェスタンブロットからのデータを示してある。データは、総タンパク質に対して規準化した（戻り染色）。データは、グラフにおいて要約して再現する（ｎ＝２）。＊ｐ－値＜０．０５またはｎｓ（有意でない）。

【図30】ＣＣＴ２を過剰発現する細胞は、対照細胞より１μＭパルボシクリブに対して抵抗性である。（図３０Ａ）１μＭパルボシクリブに対する長期薬物耐性を調査するための細胞培養スキームを示してある。（図３０Ｂ）培養プレートにおける細胞集密度に基づいて見積もった細胞成長曲線。

【図31】ＣＣＴ２発現は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるパルボシクリブでの処理の間の増加した細胞周期およびグルコース取り込み遺伝子と相関する。（図３１Ａ、３１Ｂ）細胞周期制御因子およびＧＬＵＴ１の遺伝子発現は、ＲＴ－ｑＰＣＲを使用して検討した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。０日目は、Ｔ４７Ｄ（図３１Ａ）およびＭＣＦ７（図３１Ｂ）について、一晩細胞培養を、６日目は、パルボシクリブ処理の６日目を、２または３日目の回復は、薬物を使用しない培地における処理後を表す。実験は、三回行った。＊ ｐ値＜０．５、＊＊ｐ－値＜０．００５、＊＊＊ｐ－値＜０．０００５、＊＊＊＊ｐ－値＜．００００５。

【図32】ＣＣＴ２発現は、パルボシクリブ処理の間に増加する。図３２（Ａ－Ｂ）総ＣＣＴ２およびＣＣＴ２－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡ発現は、ＧＡＰＤＨに相対的なＲＴ－ｑＰＣＲを使用して分析した。実験は、１μＭパルボシクリブ処理の０日目および６日目、並びに回復後３日目に三回行った（図２９Ａを参照されたい）＊＊ｐ－値＜０．００５、＊＊＊＊ｐ－値＜０．００００５。（図３２Ｃ）総ＣＣＴ２ ｍＲＮＡは、長期パルボシクリブ処理から上記のように図軸において示した位置にて評価した（図３０Ａを参照されたい）。

【図33】ＣＣＴ２タンパク質レベルは、パルボシクリブ処理の間に減少する。（図３３Ａ）内因性（エンド）ＣＣＴ２（抗－ＣＣＴ２－Ｃ－末端）、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（抗ＦＬＡＧ）、総ＣＣＴ２（抗－ＣＣＴ２－Ｎ末端基）および内因性ＣＣＴ３の相対的タンパク質レベルは、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧまたはレンチウイルス対照を安定して発現するＴ４７Ｄ（示した）およびＭＣＦ－７細胞（示さず）における免疫ブロット分析よって決定した。細胞を６日間１μＭパルボシクリブで処理し、次いで３日にわたって回復させた（図２９Ａを参照されたい）。（図３３Ｂ）ＣＣＴ２－ＦＬＡＧとＣＣＴ２およびＣＣＴ３のレンチウイルス対照との間の相対的タンパク質レベルは、総タンパク質に対して規準化した。エラーバーは、技術反復のｓ．ｅ．ｍでの平均を表す。

【図34】ＣＣＴ２タンパク質は、プロテオゾームを介した分解のためのターゲットとされる。（図３４Ａ）内因性ＣＣＴ２（抗－ＣＣＴ２－Ｃ－末端）、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（抗ＦＬＡＧ）、総ＣＣＴ２（抗－ＣＣＴ２－Ｎ末端基）および内因性ＣＣＴ３の相対的タンパク質レベルは、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧまたはレンチウイルス対照を安定して発現するＴ４７Ｄ（示さした）およびＭＣＦ－７（示さず）細胞における免疫ブロット分析よって決定した。細胞を６日間パルボシクリブ１μＭで処理し（図２９Ａを参照されたい）、１０μＭラクタシスチン（ラクタ）（プロテオゾーム阻害剤）または１０μｇ／ｍｌシクロヘキシミド（シクロ）（タンパク合成阻害薬）で５時間処理した。（図３４Ｂ）グラフは、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧとレンチウイルス対照、細胞との間の相対的なＣＣＴ２およびＣＣＴ３タンパク質レベルを示す。結果は、総タンパク質に対して規準化した。エラーバーは、技術反復のｓ．ｅ．ｍでの平均を表す。実施した２回の代表的な実験を示してある。

【図35】単量体ＣＣＴ２タンパク質は、パルボシクリブ処理後に増加する。図３５（Ａ－Ｂ）ＣＣＴ２－ＦＬＡＧまたはレンチウイルス対照を安定して発現し、およびパルボシクリブ１μＭで０－６日間処理したＴ４７Ｄ（示さした）およびＭＣＦ－７（示さず）細胞からのタンパク質可溶化液（図１４Ａを参照されたい）を天然の非変性ゲル上で流した。膜を、抗ＦＬＡＧ抗体（図３５Ａ、３５Ｃ）でＣＣＴ２－ＦＬＡＧまたは抗Ｎ末端ＣＣＴ２抗体（図３５Ｂ、３５Ｄ）で総ＣＣＴ２についてプローブした。オリゴマー複合体（＞９００ｋＤａ）における、および単量体（約６０ｋＤａ）としてのＣＣＴ２を矢印よって示してある。）ＣＣＴ２－ＦＬＡＧおよびレンチウイルス対照細胞におけるＣＣＴ２含有オリゴマーおよびＣＣＴ２単量体の相対的タンパク質レベルは、総タンパク質に対して規準化した。エラーバーは、技術反復のｓ．ｅ．ｍでの平均を表す。実施した２回の代表的な実験を示してある。

【図36】ＣＣＴ２の枯渇は、ルミナールＡ乳癌細胞において達成される。（図３６Ａ）Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７におけるＣＣＴ２枯渇は、ドキシサイクリン誘導性ｓｈＲＮＡレンチウイルス系を使用して達成した。ｓｈＲＮＡの誘導のために０．５ｍｇドキシサイクリン添加の４８および７２時間後のＴ４７Ｄ（示さした）およびＭＣＦ７（示さず）におけるＣＣＴ２ ｍＲＮＡ発現。ＲＴ－ｑＰＣＲについて；ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。（図３６Ｂ）ＣＣＴ２タンパク質は、（Ａ）からの細胞についてウエスタンブロットよって評価した。総タンパク質染色を規準化のために使用した。Ｔ４７Ｄ細胞にすいてのデータを示してある。（図３６Ｃ）ＣＣＴ２枯渇、および対照Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ－７細胞の生存率は、ｓｈＲＮＡ誘導の４８および７２時間の後にＭＴＴアッセイよって評価した。ｎｓ（有意でない）。

【図37】パルボシクリブとＣＣＴ２阻害の組み合わせ処理は、ルミナールＡ乳癌細胞において単独治療よりも有効である。ドキシサイクリン誘導性ＣＣＴ２ ｓｈＲＮＡを安定して発現するＴ４７Ｄ細胞は、０．５μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理され、ＣＣＴ２タンパク質の約５０％の枯渇（図２４Ａを参照されたい）もしくは２００ｎＭパルボシクリブまたは両方で４日間誘導した。生存度は、ＭＴＴアッセイによって評価した。＊＊＊＊ ｐ＜０．００００５。

【図38】神経芽腫細胞におけるＣＣＴ２枯渇は、生存度を減少させる。ドキシサイクリン誘導性ＣＣＴ２ ｓｈＲＮＡまたは対照ｓｈＲＮＡ（ウイルス対照）を安定して発現するＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞は０．５μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで処理されてＣＣＴ２タンパク質の枯渇を誘導した。（図３８Ａ）レンチウイルス導入した細胞のイメージた。（図３８Ｂ）生存土は、ＭＴＴアッセイによって評価した。

【図39】ＣＴ２０ｐ－ナノ粒子は、腫瘍成長を減少させて、マウスにおける生存を延長する。図３９（Ａ－Ｄ）１００μｌのＣＴ２０ｐ－ナノ粒子（１ｍｇ／ｋｇ／用量）またはＰＢＳで（ＩＶ）４回（斜線）静脈内処理した雄ヌードマウス（ｎ＝４）において移植したＬＮＣａＰ前立腺腫瘍のの成長曲線。（図３９Ｂ）実験の最後にＰＢＳ処理およびＣＴ２０ｐ処理したマウスの平均重量。（図３９Ｃ）検死後の腫瘍サイズ比較。（図３９Ｄ）実験最後にＰＢＳ処理した、およびＣＴ２０ｐ処理した腫瘍の平均重量。図３９（Ｅ－Ｆ）ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ トリプルネガティブ乳癌細胞を雌ヌードマウス（ｎ＝４）の乳房パッドに同所的に植設した。マウスは、１００μｌのＣＴ２０ｐ－ナノ粒子（１ｍｇ／ｋｇ／用量）（オレンジ）またはＰＢＳ（ピンク）で３回ＩＶ処理した。腫瘍成長は減少され（図３９Ｅ）、および生存は、延長した（図３９Ｆ）。ＡＵＣ、曲線下面積。

【図40】神経芽腫細胞は、色素充填した重合体ナノ粒子を取り込む。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ（図４０Ａ）およびＩＭＲ－３２（図４０Ｂ）細胞を３μｌのＤｉＩ色素充填したナノ粒子で２４時間処理して、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５複数モデルプレートリーダーを使用して取り込みを評価した。挿入図は、合わせた明視野および蛍光オーバレイのデジタル拡大された図を示す。

【図41】ＣＴ２０ｐ－ナノ粒子は、神経芽腫細胞を殺す。ＩＭＲ－３２細胞をＰＢＳ（媒体対照）、１００μｇ／ｍｌおよび２００μｇ／ｍｌ用量にてＣＴ２０ｐ－ナノ粒子で２４時間処理して、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５複数モデルプレートリーダーを使用して細胞者を撮像した。挿入図は、デジタル拡大した。

【図42】ＣＣＴ２過剰発現は、ＣＤＫ４／６阻害剤、パルボシクリブに対するルミナールＡ乳癌細胞感受性を減少させる。パルボシクリブの濃度増大に６日間曝露した細胞のための標準的なＭＴＴアッセイを使用して生存度を決定した。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現細胞は、レンチウイルス対照と比較してＴ４７Ｄ（図４２Ａ）およびＭＣＦ７（図４２Ｂ）においてより高いＩＣ５０を有した。モデルフィッティング：［阻害剤］対応答（３つのパラメーター）を使用して、ＧｒａｐｈＰａｄ ９を使用する用量－反応曲線をプロットした。実験は、四回行った。

【図43】ＣＣＴ２は、回復段階ポストパルボシクリブ処理における細胞周期進行および増殖を促進する。（図４３Ａ）パルボシクリブ処理および回復段階についての時系列を示してある。（図４３Ｂ）細胞サイクル解析は、パルボシクリブ処理の６日およびの回復ポストパルボシクリブ処理の２－３日後に細胞内ＰＩ染色よって行った。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現およびレンチウイルス対照Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞を使用した。（図４３Ｃ）回復段階ポストパルボシクリブ処理における細胞（上記のものから）における細胞分裂を追跡するためのＶｉａＦｌｕｏｒ ４０５希釈色素を使用する増色アッセイ。（図４３Ｄ）回復段階ポストパルボシクリブ処理における細胞（上記のものから）についての細胞数。数は、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓ）よって取得した。（図４３Ｅ）コロニー－形成アッセイは、回復段階ポストパルボシクリブ処理の間に１０日間行った。細胞は、クリスタルバイオレットで染色した。実験は、三回行った。

【発明を実施するための形態】

【0015】

本化合物、組成物、物品、装置および／または方法を開示し、および記述する前に、これらは、特に明記しない限り具体的合成の方法もしくは特定の組換えバイオテクノロジー方法に、または特に明記しない限り特定の試薬に限定されず、従ってもちろん変更してもよいことを理解すべきである。本明細書に使用される用語法は、詳細な実施形態のみを記述するためであり、および限定することは意図されないことを理解される。

【0016】

定義
この出願の全体にわたって、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物の開示は、これらの全体において、これが属する技術水準をより完全に記述するためにこの出願における参照により本明細書に援用される。また、開示される参照は、参照が依拠する文章において考察されるこれらに含まれる材料について、本明細書において個々におよび具体的に参照により援用される。

【0017】

本明細書および特許請求の範囲に使用されるときに、単数形、「一つのａ」「一つのａｎ」および「該」は、文脈が別途明確に記述しない限り、複数の言及を含む。たとえば、「細胞」用語は、複数の細胞を含み、その混合物を含む。

【0018】

本明細書に使用される用語「約」は、量、割合および同様のものなどの測定可能な値をいうときに、測定可能な値から±２０％、±１０％、±５％または±１％の変異を包含することが意味される。

【0019】

「賦活化」、「活性化すること」および「活性化」は、活性、応答、状態またはその他の生物学的パラメーターを増加させることを意味する。また、これは、たとえば、天然または対照レベルと比較して活性、応答または状態の１０％増大を含み得る。したがって、増大は、天然または対照レベルと比較するときに１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％または間の任意の減少量であることができる。

【0020】

被験体に対する「投与」または「投与する」ことは、被験体に薬剤を導入する、またはを送達する任意の経路を含む。投与は、腹腔内、静脈内および同様のものを含む任意の適切な経路によって実施することができる。投与は、任意の適切な経路によって実施することができ、経口、局所的、静脈内、皮下、皮内、経皮、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、内皮、脳室内、脳内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入による、植設されたリザーバを経て、または経皮パッチを経て、および同様のものを含む。投与は、自己投与および他人による投与を含む。

【0021】

用語「抗体」は、広義において本明細書に使用され、およびポリクローナル５およびモノクローナル抗体を含む。本明細書に使用される、用語「抗体」は、（任意のクラスの全イムノグロブリン（すなわち、無処置の抗体）を包含するが、限定されない。無処置の免疫グロブリン分子に加えて、また用語「抗体」に含まれるものは、これらの免疫グロブリン分子の断片または重合体およびヒトまたはヒト化もしくた免疫グロブリン分子またはその断片のバージョンである。「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、二重特異的抗体（二特異性抗体）または三重特異的抗体（三特異的抗体）であることができることが理解されるはずである。

【0022】

本明細書に使用される用語「モノクローナル抗体」は、抗体の実質的に均一な集団から得られる抗体をいい、すなわち、集団内の個体抗体は、抗体分子の小さなサブセットに存在しうる天然に存在しうる突然変異を除いて同一である。本明細書におけるモノクローナル抗体は、具体的にはその重鎖および／または軽鎖の部分が特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同的であり、一方、鎖（類）の残りは、これらが所望のアンタゴニストの活性を示す限り、もう一つの種に由来する、またはもう一つの抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一または相同的である、「キメラ」抗体、並びこのような抗体の断片を含む。

【0023】

開示されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を製造する任意の手順を使用して作製することができる。たとえば、開示されたモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５（１９７５）よって記述されたものなどのハイブリドーマ法を使用して調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウスまたはその他の適切な宿主動物を典型的には免疫薬で免疫して、免疫薬に特異的に結合するであろう抗体を産生する、または産生することができるリンパ球を誘発する。あるいは、リンパ球をインビトロにおいて免疫してもよい。

【0024】

本明細書に使用される、用語「抗体またはその断片」は、二重もしくは複数抗原またはエピトープ特異性をもつキメラ抗体およびハイブリッド抗体、並びにハイブリッド断片を包含するＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖおよび同様のものなどの断含む。したがって、保持するこれらの特異的抗原に結合する能力を持つ抗体の断片が提供される。たとえば、アネキシンＡ２に結合する活性を維持する抗体の断片は、用語「抗体またはこれらの断片」を意味する範囲内に含まれる。このような抗体および断片は、当該技術分野において公知の技術よって作製することができ、実施例における、並びに特異性および活性について抗体を産生し、および抗体をスクリーニングするための一般的な方法における記載に従って特異性および活性についてスクリーニングすることができる。（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，（１９８８）を参照されたい）。

【0025】

また、断片は、その他の配列に付着され、またはされないなかどうかにかかわらず、特定の領域または特異的アミノ酸残基の挿入、欠失、置換またはその他の選択された修飾を含むことができるが、ただし、抗体または抗体断片の活性は、未変性抗体または抗体断片と比較して著しく変化されない、または障害されない。これらの修飾は、ジスルフィド結合ができるアミノ酸を除去し／添加するために、そのバイオ寿命を増大するために、その分泌性特徴などを変化させるためなどのいくつかのさらなる特性のために提供することができる。任意の場合において、抗体または抗体断片は、その同族抗原に特異的に結合するなどの生物活性特性を有さなければならない。抗体もしくは抗体断片の機能的または活性領域は、タンパク質の特異的領域の突然変異誘発、続く発現されたポリペプチドの発現および試験よって同定してもよい。このような方法は、当業者には容易に明らかであり、および抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的突然変異を含むことができる。（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８－３５４，１９９２）。

【0026】

本明細書で使用される、用語「有益薬剤」および「活性な薬剤」は、有益な生物学的効果を有する化学化合物または組成物をいうために交換可能に本明細書において使用される。有益な生物学的効果は、治療的効果、すなわち障害またはその他の望ましくない生理的状態の治療および予防的効果、すなわち障害またはその他の望ましくない生理的状態の予防を含む。また、本用語は、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、異性体、断片、類似体および同様のものを含むが、限定されない本明細書において具体的に言及した薬効物質の薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体を包含する。本用語「薬効物質」または「活性薬剤」が使用されるとき、次いで、または特定の薬剤が特異的に同定されるとき、本用語は、薬剤それ自体、並びに薬学的に許容される、薬理学的に活性な塩、エステル、アミド、プロドラッグ、抱合体、活性代謝物、異性体、断片、類似体などと同様にを含むことを理解すべきである。

【0027】

用語「生体適合性である」は、一般にレシピエントに対して一般に無毒性であり、および被験体に対して有意な有害作用を生じさせない材料およびその任意の代謝産物または分解産物をいう。

【0028】

本明細書に使用される用語「生物学的試料」とは、生物学的組織または液の試料を意味する。このような試料は、動物から単離された組織を含むが、限定されない。また、生物学的試料は、生検および剖検試料、組織学的目的のために採取した凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙、粘液、毛髪および皮膚などの組織の切片を含むことができる。また、生物学的試料は、外植体、並びに患者組織に由来する初代および／または形質転換された細胞培養を含む。生物学的試料は、動物から細胞の試料を取り除くことよって提供することができるが、以前に単離された細胞（たとえば、別の人よって、別の時間に、および／または別の目的のために単離された）を使用することよって、またはインビボにおいて本明細書において開示した方法を行うことよっても達成することができる。また、治療または結果歴を有するものなどの保存組織を使用することができる。

【0029】

本明細書に使用される用語「を含む」は、組成物および方法が詳述された要素を含むが、その他を除外しないことを意味することが意図される。「本質的になる」は、組成物および方法を定義するために使用されるときは、組み合わせに対して有意な任意の必須のその他の要素を除外することを意味するはずである。したがって、本明細書で定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製方法、並びにリン酸緩衝食塩水、保存剤および同様のものなどの薬学的に許容される担体からの微量混入物を除外しないだろう。「からなる」は、その他の成分の微量要素および本発明の組成物を投与するための実質的方法工程以外を除外することを意味するはずである。これらの移行用語のそれぞれによって定義される実施形態は、本発明の範囲内である。

【0030】

「組成物」は、有益な生物学的効果を有する任意の薬剤をいう。有益な生物学的効果は、治療的有効性、たとえば障害またはその他の望ましくない生理的状態の治療および予防的効果、たとえば障害またはその他の望ましくない生理的状態の予防を含む。また、本用語は、
ベクター、ポリヌクレオチド、細胞、塩、エステル、アミド、プロ薬剤、活性代謝物、異性体、断片、類似体および同様のものを含むが、限定されない具体的に本明細書において言及した有益薬剤の薬学的に許容される、薬理学的に活性な誘導体を包含する。用語「組成物」が使用されるとき、次いで、または特定の組成物が具体的に同定されるとき、本用語は、組成物それ自体、並びに薬学的に許容される、薬理学的に活性なベクター、ポリヌクレオチド、塩、エステル、アミド、プロ薬剤、抱合体、活性代謝物、異性体、断片、類似体などを含むことを理解すべきである

【0031】

「対照」は、比較目的のために実験において使用される代替の被験体または試料である。対照は、「陽性」または「陰性」であることができる。用語「参照対照」は、一般的に被験体または研究集団（たとえば、健康対照）において検出されてレベルをいう。

【0032】

用語治療薬の「有効量」は、無毒であるが、所望の効果（たとえば、腫瘍サイズの減少、腫瘍の除去、予防もしくは転移の緩和、薬物耐性の逆転または抗癌剤に対して被験体を感作する）を提供する有益薬剤の十分な量を意味する。「有効である」有益薬剤の量は、被験体の年齢および一般的な状態、特定の有益な薬剤または薬剤類および同様のものに応じて被験体毎に変化するだろう。したがって、必ずしも正確な「有効量」を特定することは、できない。しかし、任意の被験体症例における適切な「有効な」量は、ルーチン試験を使用して当業者によって決定され得る。また、本明細書に使用され、および具体的に別途述べられない限り、有益の「有効量」は、また、治療的有効量および予防的有効量の両者を包含する量をいうことができる。治療効果を達成するために必要な薬物の「有効量」は、被験体の年齢、性交および重量などの要員に従って変化し得る。薬用量処方計画は、最適な治療応答を提供するように調整することができる。たとえば、いくつかの分割用量を毎日投与してもよく、または用量は、治療状況の緊急性よって示されるとおりに比例的に減少させてもよい。

【0033】

「減少」は、症候、疾患、組成物、状態または活性のより小さな量を生じる任意の変化をいうことができる。物質は、物質を伴う遺伝子産物の遺伝的結果が物質を伴わない遺伝子産物の結果に関してより少ないときに、遺伝子の遺伝的結果を減少させることが理解される。また、たとえば、減少は、症候が以前に観察されるより少ないような障害の症候における変化であることができる。減少は、統計的に有意な量における状態、症候、活性、組成物における任意の単位、中央値または平均の減少であることができる。したがって、減少は、減少が統計的に有意な限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５または１００％の減少であることができる。

【0034】

「抑制」、「抑制」および「阻害」は、活性、応答、状態、疾患またはその他の生物学的パラメーターを減少させることを意味する。これは、活性、応答、状態または疾患の完全な消失を含むが、限定されない。また、これは、たとえば天然または対照レベルと比較したときに活性、応答、状態または疾患における１０％の減少を含み得る。したがって、減少は、天然または対照レベルと比較したときに１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％または間の任意の量の減少であることができる。

【0035】

発現の、または活性の「阻害剤」は、それぞれ記述された標的タンパク質、たとえばリガンド、アンタゴニストおよびこれらの相同体および擬態の発現または活性についてインビトロおよびインビボアッセイを使用して同定される阻害分子をいうために使用される。阻害剤は、たとえば記述した標的タンパク質、たとえばアンタゴニストの発現または結合を阻害する、刺激もしくはプロテアーゼ活性を部分的にもしくは完全に遮断する、減少する、予防する、活性化を遅延させる、不活性化する、感度を下げる、または活性をダウンレギュレートする薬剤である。潜在性阻害剤で処理した記述した標的タンパク質を含む試料またはアッセイでは、効果の程度を調べるために阻害剤を伴わない対照試料と比較される。対照試料には、１００％の相対的活性値が割り当てられる。記述された標的タンパク質の阻害は、対照に対する活性値相対的が約８０％、任意に５０％または２５、１０％、５％または１％についてあるときに達成される。本明細書において記述したＣＣＰ阻害剤は、ＣＣＰ経路に関与する一つまたは複数のその他の因子（たとえば、一つまたは複数の遺伝子、タンパク質、ｍＲＮＡ）のための阻害剤であることができることを理解すべきである。

【0036】

本明細書に使用される用語「核酸」は、ヌクレオチドで構成される重合体、たとえばデオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）またはリボヌクレオチド（ＲＮＡ）を意味する。本明細書に使用される用語「リボヌクレイン酸」および「ＲＮＡ」は、リボヌクレオチドで構成される重合体を意味する。本明細書に使用される用語「デオキシリボ核酸」および「ＤＮＡ」は、デオキシリボヌクレオチドで構成される重合体を意味する。（「ポリヌクレオチド」および「ポリペプチド」と共に使用される。）
「薬学的に許容される」成分は、生物学的に、またはその他の望ましくなくないものでない成分をいうことができ、すなわち成分は、有意な望ましくない生物学的効果を生じさせることなく、またはそれが含まれる製剤のその他の成分のいずれかと有害な様式で相互作用せずに本発明の医薬品製剤に組み込まれてもよい、および本明細書において記述したように被験体に投与してもよいことをいうことができる。ヒトに対する投与への言及において使用されるときに、本用語は、一般に成分が中毒学的および製造試験の必要とされる標準を満たしたこと、または米国食品医薬品局よって準備された不活性成分ガイド Ｉにそれが含まれることを意味する。

【0037】

「薬学的に許容される担体」（時には「担体」といわれる）は、一般に安全かつ無毒性である医薬的または治療的組成物を調製する際に有用である担体または賦形剤を意味し、および獣医学的および／またはヒト薬学的もしくは治療的使用のために許容される担体を含む。用語「担体」または「薬学的に許容される担体」は、リン酸緩衝食塩水溶液、水、エマルジョン（油／水または水／油乳剤など）および／または種々のタイプの湿潤薬を含むことができるが、限定されない。

【0038】

本明細書に使用される、用語「担体」は、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、脂質、安定剤または医薬品製剤における使用のための当該技術分野において周知のその他材料を包含する。組成物における使用のための担体の選択は、組成物について意図される投与経路に依存するだろう。これらの材料を含む薬学的に許容される担体および製剤の調製は、たとえばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｅｄ．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，２００５に記述される。生理学的に許容される担体の例は、生理食塩水、グリセロール、ＤＭＳＯ、リン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、その他の有機酸との緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基より少ない）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含む単糖類、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩－形成対イオン；および／またはＴＷＥＥＮ(登録商標）（ＩＣＩ、Ｉｎｃ．； Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ、ニュージャージー）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）およびＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）（ＢＡＳＦ； ニュージャージー州フロームパーク）などの非イオン性界面活性剤を含む。所望の治療的処理を提供するためのこのような用量の投与のためには、本明細書において開示される組成物は、担体または希釈剤を含む総組成物の重量に基づいて、対照組成物の一つまたは複数の号液の量によって約０．１％～９９％の間の化合物を都合よく含むことができる。

【0039】

用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド単量体で構成される一本鎖または二本鎖重合体をいう。

【0040】

用語「ポリペプチド」は、ＤまたはＬアミノ酸の一本鎖またはペプチド結合よって連結されたＤおよびＬアミノ酸の混合物で構成される化合物をいう。

【0041】

用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、交換可能に使用され、
アミノ酸のカルボキシル基がもう一つのアルファアミノ基によって連結された２つ以上のアミノ酸を含む天然または合成の分子をいう。

【0042】

本明細書に使用される用語「増加する」または「増大」は、一般に統計学的に有意な量までの増大を意味し；任意の疑いの回避のために、「増加した」は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％の増大、たとえば少なくとも約２０％の、または少なくとも約３０％の、または少なくとも約４０％の、または少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも１００％増大までのおよび含む、または１０－１００％の間の任意の増大、あるいは基準レベルと比較して少なくとも約２倍、または少なくとも約３倍、または少なくとも約４倍、または少なくとも約５倍の、または少なくとも約１０倍の増大、または２倍～１０倍以上の間の任意の増大を意味する。

【0043】

本明細書に使用される用語「減少した」、「減少する」または「減少」は、一般に統計的に有意な量までの事象または特徴（たとえば、腫瘍成長）の低下または減少を意味する。しかし、疑いの回避のために、「減少した」は、基準レベルと比較して、少なくとも１０％までの減少、たとえばたとえば少なくとも約２０％の、または少なくとも約３０％の、または少なくとも約４０％の、または少なくとも約５０％の、または少なくとも約６０％の、または少なくとも約７０％の、または少なくとも約８０％の、または少なくとも約９０％の、または少なくとも１００％減少（すなわち、標準試料と比較して不存在レベル）までおよび含む、あるいは１０－１００％間の任意の減少を意味する。

【0044】

用語「被験体」は、霊長類（たとえば、ヒト）（ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウスおよび同様のものを含むが限定されない、哺乳類などの動物を含むことが本明細書において定義される。いくつかの実施形態において、被験体は、ヒトである。用語「患者」は、臨床医（たとえば、医師）の治療下における被験体をいう。

【0045】

本明細書に使用される、用語被験体の「治療」または「治療」は、疾患もしくは障害または疾患もしくは障害の症候を治癒する、癒やす、緩和する、軽減する、変化させる、直す、寛解させる、改善する、安定させる、または影響を及ぼす目的で被験体に対する薬物の投与を含む。また、用語「治療」および「治療」は、症候の重症度および／または頻度の減少、症候および／または根底にある原因の除去、並びに損傷の改善または治療をいい得る。本発明に従った治療は、予防的に、予防法に、緩和に、または治療上的に適用されてもよい。予防療法は、発症の前に（たとえば、癌の明らかな徴候の前に）、早期発症の間（たとえば、癌の初期徴候および症候まで）または癌の確立された発症の後に被験体に投与される。

【0046】

「防止」または「予防すること」もしくは「予防」などの本語のその他の形態は、特定の事象または特徴を止める、安定させる、または特定の事象または特徴の発症もしくは進行を遅延させる、または特定の事象または特徴が生じるであろう可能性を最小限にすることを意味する。防止は、典型的には、たとえばそれが減少するよりも絶対的であるので、対照に対する比較を必要としない。本明細書に使用される、何かを減少させ、しかし予防することができないが、減少される何かも、予防することができ得る。同様に、何かを予防するが、減少することができないがし、予防される何かも、減少すれることができ得る。減少または防止が使用される場合、具体的に別途示されない限り、その他の語の使用も、白に開示したものと理解される。

【0047】

組成物（たとえば、薬剤を含む組成物）の「治療上有効な量」または「治療的に有効な用量」は、所望の治療上の結果を達成するのに有効である量をいう。いくつかの実施形態において、所望の治療上の結果は、癌の制御である。いくつかの実施形態において、所望の治療上の結果は、転移または癌の症候の制御である。所与の治療薬の治療上有効な量は、典型的には治療される障害または疾患のタイプおよび重症度、並びにび被験体の年齢、性別および重量などの要員に関して変化するであろう。また、本用語は、癌の除去または再発の予防などの所望の治療効果を容易にするのに有効な治療薬の量または治療薬の送達の割合（たとえば、時間にわたる量）をいい得る。正確な所望の治療効果は、治療される状態、被験体の寛容性、投与される薬剤および／または薬剤製剤（たとえば、治療薬の作用強度、製剤における薬剤の濃度および同様のもの）および当業者よって認識される種々のその他の要素の多様性に従って変化するであろう。いくつかの例において、所望の生物学的または医学的応答は、日、週または年にわたる被験体に対する組成物の複数の用量の投与の後に達成される。本
明細書に使用される用語「癌」は、異常な細胞の迅速および抑制されない成長よって特徴づけられる疾患として定義される。癌細胞は、局所的に、または血流およびリンパ系を介して体のその他の部分まで広がり得る。癌は、たとえば原発性腫瘍または転移性成長など、癌の異なる組織学タイプ、細胞型および異なるステージを含み得る。癌は、たとえば乳癌、胆管細胞癌、結腸直腸癌、子宮内膜症、食道癌、胃癌、拡散型胃癌、膵癌、腎臓癌腫、軟部組織腫瘍、精巣癌、強心剤：肉腫（血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫）、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫；肺：気管支原性癌（扁平細胞、未分化細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞（細気管支）癌腫、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）；胃腸管系：食道（扁平細胞癌腫、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、胃（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、膵臓（管腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、類癌腫、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、類癌腫、カポシ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経繊維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路：腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽細胞腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および尿道（扁平細胞癌腫、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、テラトカルシノーマ、絨毛癌、肉腫、間細胞癌腫、線維腫、繊維腺腫、類腺腫瘍、脂肪腫）；肝臓：肝癌（肝細胞癌）、胆管癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫；骨：骨肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網肉腫）、複数の骨髄腫、悪性巨細胞腫脊索腫、骨軟骨性外骨腫（骨軟骨外骨腫症）、良性軟骨腫、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液線維腫、類骨骨腫および巨細胞腫；神経系：頭蓋骨（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜腫、神経膠腫症）、脳（星細胞腫、髄芽腫、膠腫、上衣細胞腫、胚細胞腫［松果体腫］、神経膠芽腫、神経膠芽腫多形、乏突起膠腫、シュワン細胞腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経繊維腫、髄膜腫、膠腫、肉腫）；婦人科：子宮（子宮内膜癌腫）、頚部（子宮頚癌、前腫瘍子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌、卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類されていない癌腫］、果粒層腱鞘細胞腫瘍、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、外陰部（扁平上皮癌、上皮内癌腫、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平上皮癌、ブドウ状肉腫（胚性横紋筋肉腫］、卵管（癌腫）； 血液学的：血液（顆粒球性白血病［急性および慢性的］、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、脊髄形成異常性症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］、ＣＭＬ 皮膚：黒色腫、悪性黒色腫、基底細胞癌、扁平上皮癌、カポシ肉腫、ほくろ、形成異常母斑、脂肪腫、血管腫、皮膚繊維腫、ケロイド、乾癬；および副腎：神経芽腫を含み得る。いくつかの実施形態において、癌は、非小細胞性肺癌（ＮＳＣＬＣ）を含む。いくつかの実施形態において、癌は、療法に対して抵抗性である。いくつかの実施形態において、癌は、療法に対して抵抗性ではない。

【0048】

用語「癌細胞」および「腫瘍細胞」は、交換可能に使用され、癌または腫瘍から、または腫瘍株化細胞または腫瘍細胞培養に由来する細胞をいう。

【0049】

用語「原発性腫瘍」は、癌起源の部位にて成長する腫瘍をいう。

【0050】

用語「転移性腫瘍」は、癌起源の部位と異なる部位にて成長する続発性腫瘍をいう。

【0051】

癌を治療する組成物および方法
細胞周期の阻害剤は、癌の治療において有効であるが、多くの患者におけるこれらの使用は、耐性の発症よって妨げられる。単一の薬剤阻害剤の制限を克服するための方法には、我々の研究を基礎をなす対処されていない医学的需要がある。シャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）、多サブユニットタンパク質折り畳み複合体は、多くの癌において高度に発現し、腫瘍タンパク質および変異した腫瘍サプレッサーと相互作用する。現在まで、ＣＣＴの複雑な多サブユニット性質は、ターゲットされた阻害剤の開発の挑戦であった。単一ＣＣＴサブユニット、ＣＣＴ２を過剰発現させることは、乳癌細胞（たとえば、ルミナールＡ乳癌）における細胞サイクリングを増強するために十分であること、およびこれらの細胞が培養においてより大きな球状体を産生し、および侵襲性および転移性様の特徴を取得することを本明細書において示した。これらの細胞において、ＣＣＴ２の発現がＭＹＣおよびＣＣＮＤ１と相関されることは、シャペロニンがこれらの増殖シグナルのためのノードの交差点であることを示す。その上、ＣＣＴ２は、癌性細胞において頻繁にゲノム増幅し、およびその他の癌遺伝子と関連するアンプリコンにおいて見いだされる。これらの所見は、まとめるとＣＣＴ２サブユニットが潜在的癌遺伝子であり得ることを支持し、その治療上ターゲティングは、ＣＣＮＤ１およびＭＹＣのような調節解除された細胞サイクリング因子を阻害し、および最前線の治療に対する耐性を獲得する患者に対する適用を有するだろう。一つの態様において、その必要のある被験体における癌および／または転移（たとえば、肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌）を治療し、阻害し、低下させ、減少させ、寛解させ、および／または予防する方法であって、被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む方法が、本明細書において開示される。

【0052】

本明細書において記述したＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤であることができる。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ２阻害剤である。

【0053】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む、遺伝子編集システムである。

【0054】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＴ２０ｐペプチドを含む、ペプチドである。ＣＴ２０ｐペプチドは、当該技術分野において公知である。たとえば、米国特許出願公開第２０１７０１６５３１８Ａ１を参照し、その全体において本明細書において参照よって援用される。ＣＴ２０ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に対して少なくとも６０％（たとえば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）の配列にて同一性を有する配列番号：１－６の任意のバリアントあるいは上記のものの２つ以上の組み合わせ：を含んでいてもよい。

【0055】

いくつかの実施形態において、治療処方計画のＣＴ２０ペプチドは、癌細胞内へのＣＴ２０ペプチドの送達のために適切なナノ粒子を経て送達してもよい。また、ナノ粒子は、ターゲティング部分の少なくとも一つのタイプ、たとえば癌細胞よって発現される受容体のためのリガンドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、癌細胞よって発現される受容体は、ＥＧＦ、ＨＥＲ２または葉酸塩受容体である。いくつかの実施形態において、ＣＴ２０ペプチドは、癌細胞内へのＣＴ２０ペプチドの送達のために適切な内部移行ドメインに連結される。

【0056】

本明細書に使用される、「ナノ粒子」は、医薬品化合物、核酸、ペプチドまたはタンパク質を送達することができる任意のナノ構造をいい得る。ナノ粒子は、天然または合成的に由来してもよい。いくつかの態様において、「ナノ粒子」は、血漿ベシクル粒子、リポソーム、エキソーム、タンパク質に基づいた粒子、アルブミン粒子、核酸に基づいた粒子、天然重合体、合成重合体、ヒドロゲル、デンドリマー、ケイ素に基づいた材料、金属に基づいた材料、炭素に基づいた材料、カルシウムに基づいた材料または上記のもののいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において記述されるナノ粒子は、米国特許第１１，１２９，８６８号において開示され、その全体が本明細書において参照よって組み込まれる。

【0057】

ある態様において、ナノ粒子は、超分枝ポリエステル重合体のナノ粒子である。ある態様において、ナノ粒子は、重合体ナノ粒子である。ある態様において、ナノ粒子は、ターゲティング部分を含むことができる。ある態様において、ターゲティング部分は、ターゲティングリガンドを含むことができる。ある態様において、ターゲティングリガンドは、癌細胞よって発現される受容体のためのものであることができる。ある態様において、癌細胞よって発現される受容体は、ＥＧＦ、ＨＥＲ２または葉酸塩受容体であることができる。ある態様において、癌細胞よって発現される受容体は、癌細胞よって発現されることが当業者に公知の任意の受容体であることができる。いくつかの実施形態において、受容体は。大腸癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞および／または乳癌細胞よって発現されることが公知であってもよい。

【0058】

ある態様において、ターゲティングリガンドは、葉酸化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマート化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、ポリグルタミン酸化された葉酸化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマートアジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、葉酸アジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマートアジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、二機能性グルタマート－葉酸ハイブリダイズされた化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、高比重である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、低比重である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、高原子価である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、低原子価である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、固体腫瘍特異的細胞タンパク質のための基質である。

【0059】

いくつかの実施例において、本明細書において開示される方法は、さらに被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤である。ＣＤＫ４阻害剤は、たとえば、パルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブ含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ラボピリドール、インジスラム、ＡＺＤ５４３８、ＳＮＳ－０３２、ブリオスタチン－１、セリシクリブ、ＰＤ ０３３２９９１およびＳＣＨ ７２７９６５からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、本明細書に使用される細胞周期阻害剤は、フラボピリドール、ＳＮＳ－０３２、ＡＴ７５１９、ジナシクリブ、パルボシクリブおよびＰ２７６－００からなる群より選択される。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ビンクリスチン、パクリタキセルまたはＣＹＴ９９７である。

【0060】

いくつかの実施形態において、本明細書において記述した方法は、たとえばルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌 を含む乳癌を治療することに対して有効である。

【0061】

いくつかの実施形態において、本明細書において記述した方法は、小児癌を治療するのに有効である。いくつかの実施形態において、小児癌は、神経芽腫、腎明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である。

【0062】

いくつかの実施形態において、被験体から得られる癌細胞は、参照対照と相対的にＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１相対的からなる群から選択される腫瘍生物マーカーの一つまたは複数の増加したレベルを有する。いくつかの実施形態において、被験体から得られた癌細胞は、参照対照と相対的にＭＹＣ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０１１０６）、ＭＹＣＮ（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０４１９８）、ＣＤＫ２（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ２４９４１）、ＣＤＫ４（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ１１８０２）、ＣＣＮＥ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ２４８６４）、ＣＣＮＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ２４３８５）、ＹＡＰ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ４６９３７）、およびＲＢ１、（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ：Ｐ０６４００）からなる群より選択される一つまたは複数の腫瘍生物マーカーの増加したレベルを有する。いくつかの実施形態において、参照対照は、非癌細胞または健康な対照から得られる細胞である。

【0063】

また、その必要のある被験体において薬物抵抗性癌および／または転移（たとえば、本明細書において開示される肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫、乳癌または小児癌）を治療し、阻害し、低下させ、減少させ、寛解させ、および／または予防する方法であって、被験体にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む方法が、本明細書において開示される。

【0064】

一つの例において、薬物抵抗性癌は、細胞周期阻害剤に対して抵抗性である一つの例において、薬物抵抗性癌は、ＣＤＫ４阻害剤に対して抵抗性である。一つの例において、薬剤耐性癌または転移は、化学療法に対して耐性である。

【0065】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤の投与は、細胞周期阻害剤および／または化学療法に対する癌の感度を高める。薬物に対する「無感覚」または「耐性」は、薬物が増殖阻害および／または細胞（たとえば、癌細胞）の死を生じさせないことを意味するが、限定されない。

【0066】

したがって、いくつかの態様において、サイクル阻害剤および／または化学療法に対して被験体を感作する方法であって、被験体にＣＣＴ阻害剤の治療上有効な量を投与することを含み、被験体がサイクル阻害剤および／または化学療法に非反応性である前記方法が、本明細書において開示される。たとえば、細胞周期阻害剤または化学療法薬剤の伝統的に推奨される用量は、Ｘ量における腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数を減少させることができる場合、ＣＣＴ阻害剤および細胞周期阻害剤または化学療法薬剤の組み合わせは、腫瘍サイズまたは腫瘍細胞数を約１０％、２０％、５０％、８０％、１００％、２倍、４倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍またはそれ以上の量において減少させることができる。

【0067】

本明細書において記述したＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤であることができる。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ２阻害剤である。

【0068】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡを含む。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む遺伝子編集システムを含む。

【0069】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＴ２０ｐペプチドを含むペプチドを含むＣＴ２０ｐペプチドは、当該技術分野において公知である。たとえば、米国特許出願公開第２０１７０１６５３１８Ａ１を参照され、その全体が本明細書において参照よって組み込まれる。

【0070】

いくつかの実施例において、本明細書において開示される方法は、さらに被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。
いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４害剤を含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤である。ＣＤＫ４阻害剤は、たとえばパルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブ含む。

【0071】

癌の発症のタイミングは、たいてい予測することができないので、癌を治療して、予防して、減少させ、および／または阻害する開示された方法は、癌の発症の前に、または癌の発症後の任意のときに実施することができることを理解すべきである。一つの態様において、開示された方法は、癌の発症より前３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２年、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２月、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３日、６０、４８、３６、３０、２４、１８、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３、２時間、６０、４５、３０、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２または１分；または癌の発症後１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、９０、１０５、１２０分、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０時間、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４５、６０、９０またはそれ以上の日、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２月、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０またはそれ以上の年に使用することができる
一つの態様において、被験体における癌の良好な治療が重要であり、およびそうすることには、さらなる治療の投与を含んでいてもよいことが理解され、および本明細書において想定される。したがって、本明細書において開示されるＣＣＴ阻害剤を使用する開示された治療は、アベマシクリブ、アビラテロン酢酸塩、アビトレキセート（メトトレキセート）、アブラキサン（パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤）、ＡＢＶＤ、ＡＢＶＥ、ＡＢＶＥ－ＰＣ、ＡＣ、ＡＣ－Ｔ、アドセトリス（ブレンツキシマブ ヴェドチン）、ＡＤＥ、アドトラスツズマブ エムタンシン、アドリアマイシン（ドキソルビシン塩酸塩）、アファチニブジマレイン酸塩、アフィニトール（エベロリムス）、アキンゼオ（ネツピタントとパロノセトロン塩酸塩）、アキンゼオ（イミキモド）、アルデスルーキン、アレセンサ（アレクチニブ）、アレクチニブ、アレムツヅマブ、アリムタ（ペメトレキセド二ナトリウム）、アリコパ（コパンリシブ塩酸塩）、アルケラン注射用（メルファラン塩酸塩）、アルケラン錠（メルファラン）、アロキシ（パロノセトロン塩酸塩）、アルンブリグ（ブリガチニブ）、アンボクロリン（クロランビュシル）、アンボクロリン（クロランビュシル）、アミホスチン、アミノレブリン酸、アナストロゾール、アプレピタント、アレディア（パミドロネート二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、アラノン（ネララビン）、三酸化ヒ素、アルゼラ（オファツムマブ）、アスパラギナーゼエルウィニアクリサンテミ、アテゾリズマブ、アバスチン（ベバシズマブ）、アベルマブ、アキシチニブ、アザシチジン、バベンシオ（アベルマブ）、ＢＥＡＣＯＰＰ、ベセヌム（カルムスチン）、ベレオダク（ベリノスタット）、ベリノスタット、ベンダムスチン塩酸塩、ＢＥＰ、ベスポンサ（イノツズマブオゾガミシン）、ベバシズマブ、ベキサロテン、ビクサー（トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１トシツモマブ）、ビカルタミド、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ブレオマイシン、ブリナツモマブ、ブリンツト（ブリナツモマブ）、ボルテゾミブ、ボスリフ（ボスチニブ）、ボスチニブ、ブレントキシマブベドチン、ブリガチニブ、ＢｕＭｅｌ、ブスルファン、ブスルフェックス（ブスルファン）、カバジタキセル、カボメティックス（カボザンチニブ－Ｓ－マレイン酸塩）、カボザンチニブ－Ｓ－マレイン酸塩、ＣＡＦ、カンパス（アレムツズマブ）、カンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、カペシタビン、ＣＡＰＯＸ、カラク（フルオロウラシル局所）、カルボプラチン、カルボプラチン－タキソール、カーフィルゾミブ、カルムブミス（カルムスチン）、カルムスチン、カルムスチン移植錠、カソデックス［（ビカルタミド）、カルマスチン、カスポジン（カスポジュム）、カスポファンギン、カスポファンギンアセチル）、カスポファンギンアセチル）、カチンガ、カチンガマ（カチンガマ）、カトプリル、キャンプトサール（イリノテカン塩酸塩）、キムリア（タチンゲルルクセル）、キムリア（タチンゲルルクセル）、クレマシン（ビンクリスチン硫酸塩）、クレマフォーゼンシノトキシンＡｂ、クレビキン（クレマフォーゼンシノトキシンＡｂ）、クレビン（ビンブラスチン硫酸塩）、クレビン）、クリストデックス（デキサメタゾン）、クリストデックス（デキサメタゾン）、クリスビン（ビンブラスチン硫酸塩）、クリスビン（ビンブラスチン硫酸塩）、クリソタイル（アスベスト）、クリソタイル（アスベスト）、クリトリムシン（クリンダマイシン）、クリトリムシン（クリンダマイシン）、クリトリムシン）、クリノビン（ビンデシン硫酸塩）、クリノビン（ビンデシン硫酸塩）、クリビオン（リボビリン）、クリビオン（リボビリン）、クリビン（ビンデシン硫酸塩）、クリビン（ビンデシン硫酸塩）、クロスビン（ビンデシン硫酸塩）、クロスビン（ビンデシン硫酸塩）、クロルビシン（クロラムブシル）、ＣＥＭ、セリチニブ、セルビジン（ダウノルビシン塩酸塩）、サーバリックス（組換えＨＰＶ 二価ワクチン）、セツキシマブ、ＣＥＶ、クロランビュシル、クロランビュシル－プレドニゾン、ＣＨＯＰ、シスプラチン、クラドリビン、クラフェン（シクロホスファミド）、クロファラビン、クロファレクス（クロファラビン）、クロラール（クロファラビン）、ＣＭＦ、コビメチニブ、コメトリク（カボザンチブ－ｓ－マラート）、コパンリシブ塩酸塩、ＣＯＰＤＡＣ、ＣＯＰＰ、ＣＯＰＰ－ＡＢＶ、コスメゲン（ダクチノマイシン）、コレリック（コビメチニブ）、クリゾチニブ、ＣＶＰ、シクロホスファミド、サイフォス（イホスファミド）、シラムザ（ラムシルマブ）、シタラビン、シタラビンリポソーム、サイトサール－Ｕ（シタラビン）、サイトキサン（シクロホスファミド）、ダブラファニブ、ダカルバジン、ダコゲン（デシタビン）、ダクチノマイシン、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ダサチニブ、ダサチニブ塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム、デシタビン、デフィブロチドナトリウム、デフィテリオ（デフィブロチドナトリウム）、デガレリクス、デニロイキンジフチトクス、デノスマブ、デポサイト（シタラビンリポソーム）、デキサメタゾン、デクスラゾキサン塩酸塩、ジヌツキシマブ、ドセタキセル、ドキシル（ドキソルビシン塩酸塩リポソームｅ）、ドキソルビシン塩酸塩、ドキソルビシン塩酸塩リポソーム、Ｄｏｘ－ＳＬ（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ＤＴＩＣ－ドーム（ダカルバジン）、デュルバルマブ、エフデクス（フルオロウラシル局所）、エリテック（ラスブリケース）、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エロツズマブ、エロキサチン（オキサリプラチン）、エルトロンボパグオラミン、エメド（アプレピタント）、エンプリシチ（エロツズマブ）、エナシデニブメシル酸塩、エンザルタミド、エピルビシン塩酸塩、ＥＰＯＣＨ、エルビタクス（セツキシマブ）、エリブリン メシル酸塩、エリベッジ（ビスモデジブ）、エルロチニブ塩酸塩、エルウィナゼ（アスパラギナーゼエルウィニアクリサンセミ）、エチオール（アミホスチン）、エポトフォス（エトポシドリン酸塩）、エトポシド、エトポシリン酸塩、エヴバセト（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、エベロリムス、エビスタ（ラロキシフェン塩酸塩）エボメラ（メルファラン塩酸塩）、エキセメスタン、５－ＦＵ（フルオロウラシル注射剤）、５－ＦＵ（フルオロウラシル 局所）、ファレストン（トレミフェン）、ファリダック（パノビノスタット）、ファスノデクス（フルベストラント）、ＦＥＣ、フェメラ（レトロゾール）、フィルグラスチム、フルダラ（フルダラビンリン酸塩）、フルダラビンリンリン酸塩、フルロプレクス（フルオロウラシル 局所）、フルオロウラシル注射剤（フルオロウラシル）－局所、フルタミド、フォレクス（メトトレキサート）、フォレクスＰＦＳ（メトトレキサート）、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＯＬＦＩＲＩ－ＢＥＶＡＣＩＺＵＭＡＢ、ＦＯＬＦＩＲＩ－ＣＥＴＵＸＩＭＡＢ、ＦＯＬＦＩＲＩＮＯＸ、ＦＯＬＦＯＸ、フォロチン（プララトレキサート）、ＦＵ－ＬＶ、フルベストラント、ガーダシル（組換えＨＰＶ四価ワクチン）、ガーダシル９（組換えＨＰＶ九価ワクチン）、ガジバ（オビヌツズマブ）、ゲフィチニブ、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムシタビン－シスプラチン、ゲムシタビン－オキサリプラチン、ゲムツズマブオゾガミシン、ガムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ジロトリフ（アファチニブ二マレイン酸塩）、グリベック（イマチニブメシル酸塩）、グリアデル（カルムスチン植込錠）、グリアデルウエハ（カルムスチン植込錠）、グルカルピダーゼ、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、ヘマンジオール（プロプラノロール塩酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ＨＰＶ二価ワクチン、組換え、ＨＰＶ九価ワクチン、組換え、ＨＰＶ 四価ワクチン、組換え、ハイカムチン（トポテカン塩酸塩）、ハイドレア（ヒドロキシ尿素）、ヒドロキシ尿素、ハイパー－ＣＶＡＤ、イブランス（パルボシクリブ）、イブリツモマブツリキセタン、イブリツニブ、ＩＣＥ、イクルシグ（ポナチニブ塩酸塩）、ダマイシン（イダルビシン塩酸塩）、イダルビシン塩酸塩、イデラリシブ、イジファ（エナシデニブメシル酸塩）、イフェックス（イホスファミド）、イホスファミド、イホスファミジウム（イホスファミド）、ＩＬ－２（アルデスロイキン）、イマチニブメシル酸塩、イムブルビカ（イブリチニブ）、イムフィンジ（ジュバルマブ）、イミキモド、イムリジク（タリモジンラヘルパレプベク）、インライタ（アキシチニブ）、イノツズマブオゾガマイシン、インターフェロンアルファ－２ｂ、組換え、インターロイキン－２（アルデスロイキン）、イントロンＡ（組換え、インターフェロンアルファ－２ｂ）、ヨウ素Ｉ１３１トシツモマブおよびトシツモマブ（イピリムマブ）イレッサ（ゲフィチニブ）、イリノテカン塩酸塩、イリノテカン塩酸塩リポソーム、イストダックス（ロミデプシン）、イキサベピロン、イクサゾミブクエン酸塩、イグゼンプラ（イクサベピロン）、ジャカフィ（ルキソリチニブリン酸塩）、ＪＥＢ、ジェブタナ（キャベジタキセル）、カドシラ（アド・トラスツズマブ・エムタンシン）、ケオキシフェン（ラロキシフェン塩酸塩）、ケピバンス（パリフェルミン）、キートルーダ（パムブロリツマブ）、キスカリ（リボシクリブ）、キムリア（チサゲンレクロイセル）、キプロリス（カーフィルゾミブ）、ランレオチド酢酸塩、ラパチニブジトシレート、ラルトルボ（オララツマブ）、レナリドミド、レンバチニブメシル酸塩、レンビマ（レンバチニブメシル酸塩）、レトロゾール、ロイコボリンカルシウム、ルーカラン（クロランブシル）、ルプロリド酢酸塩、 ロイスタチン（クラドリビン）、レブラン（アミノレブリン酸）、リンフォリジン（クロランブシル）、リポドックス（ドキソルビシン塩酸塩リポソーム）、ロムスチン、ロンサーフ（トリフルリジンおよびチピラシル塩酸塩）、リュープロン（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロンデポー（ロイプロリド酢酸塩）、リュープロンデポー－ペド（ロイプロリド酢酸塩）、リンパーザ（オラパリブ）、マルキボ（ビンクリスチン硫酸塩リポソームｅ）、マチュラン（プロカルバジン塩酸塩）、メクロレタミン塩酸塩、メゲストロール酢酸塩、メキニスト（トラメチニブ）、メルファラン、メルファラン塩酸塩、メルカプトプリン、メスナ、メスネクス（メスナ）、メタゾラストン（テモゾロマイド）、メトトレキセート、メトトレキセートＬＰＦ（メトトレキサート）、メチルナルトレキソンブロミド、メキサート（メトトレキサート）、メキサート－ＡＱ（メトトレキサート）、ミドスタウリン、マイトマイシンＣ、マイトマイシン塩酸塩、マイトジトレックス（マイトマイシンＣ）、ＭＯＰＰ、モゾビル（プレリキサホル）、マスタージェン（メクロレタミン塩酸塩）、ミュータマイシン（マイトマイシンＣ）、マイルラン（ブスルファン）、マイロサール（アザシチジン）、マイロターグ（ゲムトゥズマブオゾガミシン）、ナノ粒子パクリタキセル（アルブミン安定化パクリタキセルナノ粒子製剤）、ナベルビン（ビノレルビン酒石酸塩）、ネシツムマブ、ネララビン、ネオサール（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、ネルリンクス（ネラチニブマレイン酸塩）、ネツピタントおよびパロノセトロン塩酸塩、ニューレスタ（ペグフィルグラスチム）、ニューポジェン（フィルグラスチム）、ネクサバール（ソラフェニブトシラート）、ニランドロン（ニルタミド）、 ニロチニブ、ニルタミド、ニンラロ（イクサゾミブクエン酸塩）、ニラパミブトシレラート一水和物、ニボルマブ、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、エヌプレート（ロミプロスチム）、オビヌツズマブ、オデモ（ソニジェジブ）、ＯＥＰＡ、オファツムマブ、ＯＦＦ、オラパリブ、オララツマブ、オマセタキシンメペスシナート、オンカスパール（ペグアスパルガーゼ）、オンダンセトロン塩酸塩、オニバイド（イリノテカン塩酸塩リポソーム）、オンタック（デニロイキンジフチトクス）、オプディボ（ニボルマブ）、ＯＰＰＡ、
オシメルチニブ、オキサリプラチン、パクリタキセル、パクリタキセルアルブミン安定化ナノ粒子製剤、ＰＡＤ、パルボシクリブ、パリフェルミン、パロノセトロン塩酸塩、パロノセトロン塩酸塩およびネツピタント、パミドロン酸二ナトリウム、パニツムマブ、パノビノスタット、パラプラット（カルボプラチン）、パラプラチン（カルボプラチン）、パゾパニブ塩酸塩、ＰＣＶ、ＰＥＢ、 ペグアスパルガーゼ、ペグフィルグラスチム、ペグインターフェロンアルファ－２ｂ、ＰＥＧ－イントロン（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、ペムブロリズマブ、ペメトレキセド二ナトリウム、ペルジェタ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、プラチノール（シスプラチン）、プラチノール－ＡＱ（シスプラチン）、プレリキサホル、ポマリドミド、ポマリスト（ポマリドミド）、ポナチニブ塩酸塩、ポートラッザ（ネシツムマブ）、プララトレキサート、プレドニゾン、プロカルバジン塩酸塩、プロルーキン（アルデスロイキン）、プロリア（デノスマブ）、プロマクタ（エルトロンボパグオラミン）、プロプラノロール塩酸塩、プロベンジ（シプロイセルＴ［）、プリナソール（メルカプトプリン）、プリキサン（メルカプトプリン）、ラジウム２２３ジクロライド、ラロキシフェン塩酸塩、ラムシルマブ、ラスブリカーゼ、Ｒ－ＣＨＯＰ、Ｒ－ＣＶＰ、組換えヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）二価ワクチン、組換えヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）九価ワクチン、組換えヒト乳頭腫ウイルス（ＨＰＶ）四価ワクチン、組換えインターフェロンアルファ－２ｂ、レゴラフェニブ、レリストール（メチルナルトレキソンブロマイド）、Ｒ－ＥＰＯＣＨ、レブリミド（レナリドマイド）、リウマトレックス（メトトレキサート）、リボシクリブ、Ｒ－ＩＣＥ、リツキサン（リツキシマブ）、リツキサンハイセラ（リツキシマブおよびヒアルロニダーゼヒト）、リツキシマブ、リツキシマブおよびヒアルロニダーゼヒト、ロラピタンント塩酸塩、ロミデプシン、ロミプロスチム、ルビドマイシン（ダウノルビシン塩酸塩）、ルブラカ（ルカパリブスルホン酸塩）、ルカパリブスルホン酸塩、ルキソルチニブ リン酸塩、ライダプト（ミドスタウリン）、スクレロソル胸膜内エアロゾル（タルク）、シルツキシマブ、シプロイセルＴ、ソマツリンデポー（ランレオチド酢酸塩）、ソニデジブ、ソラフェニブトシラート、スプリセル（ダサチニブ）、ＳＴＡＮＦＯＲＤ Ｖ、無菌タルク粉末（タルク）、ステリタルク（タルク）、ストリバルガ（レゴラフェニブ）、スニチニブリンゴ酸塩、スーテント（スニチニブリンゴ酸塩）、サイラトロン（ペグインターフェロンアルファ－２ｂ）、シルバント（シルツキシマブ）、シンリボ（オマセタキシンメペスクシン酸塩）、タブロイド（チオグアニン）、ＴＡＣ、タフィンラー（デラフェニブ）、タグリッソ（オシメルチニブ）、タルク、タリモジェンラフェルパレベク、タモキシフェンクエン酸塩、タラビンＰＦＳ（シタラビン）、タルセバ（エルロチニブ塩酸塩）、ターグレチン（ベキサロテン）、タシグナ（ニロチニブ）、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、テセントリク（アテゾリズマブ）、テモダール（テモゾロマイド）、テモゾロミド、テムシロリムス、サリドマイド、サロミッド（サリドマイド）、チオグアニン、チオテパ、チサゲンレクロイセル、トラク（フルオロウラシル局所）、トポテカン塩酸塩、 トレミフェン、トリセル（テムシロリムス）、トシツモマブおよびヨウ素Ｉ１３１ トシツモマブ、トテクト（デクスラゾキサン塩酸塩）、ＴＰＦ、トラベクテジン、トラメチニブ、トラスツズマブ、トレンダ（ベンダムスチン塩酸塩）、トリフルリジンおよびティピラシル塩酸塩、トリセノックス（ヒ素トリセノックス）、タイケルブ（ラパチニブジトシラート）、ユニツキシン（ジヌツキシマブ）、ウリジ三酢酸塩、ＶＡＣ、バンデタニブ、ＶＡＭＰ、バルビ（ロラピタンント塩酸塩）、ベクチビックス（パニツムマブ）、ＶｅＩＰ、ベルバン（ビンブラスチン硫酸塩）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ベルサー（ビンブラスチン硫酸塩）、ベムラフェニブ、ベンクレクスタ（ベネトクラックス）、ベネトクラックス、バーゼニオ（アベマシクリブ）、びじゅーるい（ロイプロリド酢酸塩）、ビダザ（アザシチジン）、ビンブラスチン硫酸塩、ンカサール ＰＦＳ（ビンクリスチン硫酸塩）、ビンクリスチン硫酸塩、ビンクリスチン硫酸塩リポソーム、ビノレルビン酒石酸塩、ＶＩＰ、ビスモデジブ、ビストガード（ウリジン三酢酸塩）、ボラキサゼ（グルカルピダーゼ）、ボリノスタット、ボトリエント（パゾパニブ塩酸塩）、バイゼオス（ダウノルビシン塩酸塩およびシタラビンリポソーム）、ウェルコボリン（ロイコボリンカルシウム）、キサコリ（クリゾチニブ）、ゼローダ（カペシタビン）、ＸＥＬＩＲＩ、ＸＥＬＯＸ、ジェバ（デノスマブ）、ゾフィゴ（ラジウム２２３ジクロライド）、エクスタンジ（エンザスタウリン）、エルヴォイ（イピリムマブ）、ヨンデリス（トラベクテジン）、ザルトラップ（ジフ－アフリベルセプト）、ザルキソ（フィルグラスチム）、ゼジュラ（ニラパリブトシラート一水和物）、ゼルボラフ（ゼムラフェニブ）、ゼバリン（イブリツモマブチウキセタン）、ジネカード（デクスラゾキサン塩酸塩）、ジフ－アフリベルセプト、ゾフラン（オンダンセトロン塩酸塩）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）、ゾレドロン酸、ゾリンザ（ボリノスタット）、ゾメタ（ゾレドロン酸）、ザイデリグ（イデラリシブ）、ザイカディア（セリチニブ）および／またはザイチガ（アビラテロン酢酸塩）を含むが、限定されない当該技術分野において公知の任意の抗癌療法をさらに含むことができる。ＥＧＦＲスプライスバリアントイソ型が検出されない場合、治療方法は、ＰＤ－１（ニボルマブ（ＢＭＳ－９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ－０１１、ＭＫ－３４７５）、ＰＤ－Ｌ１（ＭＤＸ－１１０５（ＢＭＳ－９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０ＡまたはＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ－Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ－４（イピリムマブ（ＭＤＸ－０１０）、トレメミムマブ（ＣＰ－６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７－Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７－Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ－３（ＢＭＳ－９８６０１６）遮断する抗体を含むが限定されないチェックポイント阻害剤を含むこと、またはさらに含むことができる。

【0072】

この出願の全体にわたって記述したとおり、本明細書に記述した方法およびＣＣＴ阻害剤は、単独で、または養子免疫治療（たとえば、ＣＡＲ Ｔ細胞、ＣＡＲ ＮＫ細胞、ＴＩＬおよびＭＩＬ免疫療法）、セルサイクル阻害剤（たとえば、ＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤および／またはＣＤＫ４阻害剤）または本明細書において開示された任意のその他の抗癌療法と組み合わせて癌（たとえば、肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌を含むが、限定されない）などの抑制されていない細胞の増殖が生じる任意の疾患を治療して、阻害し、減少させ、寛解させ、および／または予防するために使用することができる。開示された組成物を治療に使用することができる癌の代表的であるが、非限定的な一覧は、以下である：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、ホジキン病、顆粒球性白血病、膀胱癌、脳癌、神経系癌、頭頸部癌、頸部扁平上皮癌腫、小細胞肺癌および非小細胞性肺癌などの肺癌、神経芽腫／神経膠芽腫、卵巣癌、皮膚癌、肝癌、黒色腫、口の扁平細胞癌腫、咽喉、喉頭および肺、子宮頸癌、頚部の癌腫、乳癌および上皮癌、腎癌、精巣癌（、肺癌、食道癌、頭頸部癌腫、大腸癌、血液癌；、精巣癌；大腸癌、直腸ガン、前立腺癌または膵癌。いくつかの実施形態において、本明細書において記述した方法は、たとえばルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌を含む乳癌を治療することに対して有効である。

【0073】

癌の診断
ＣＣＴ（たとえば、ＣＣＴ２）の発現は、これらの癌に侵襲性および転移性様の挙動を得させし、およびＭＹＣのように癌進行と関連するその他の癌遺伝子を発現し始める。結果は、治療のために患者の結果をモニターし、および薬物耐性の発症を予測するための癌のための生物マーカーとしてＣＣＴ２を使用する。

【0074】

したがって、被験体が癌を有すると診断する方法でであって、ａ）参照対照と相対的にシャペロニン含有ＴＣＰ１（ＣＣＴ）のレベルを定量化すること；ｂ）ＣＣＴのレベルが参照対照より高い（たとえば、少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％より高い）ときに、被験体が癌を有すると決定すること；および、ｃ）ＣＣＴのレベルが参照対照より低い（１％、５％、１０％、１５％、２０％（２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％より低い）ときに、被験体が癌を有さないと決定することを含む方法が、本明細書においてまた開示される。

【0075】

いくつかの実施形態において、本方法は、被験体にＣＣＴ阻害剤の治療上有効な量を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤の投与は、細胞周期阻害剤および／または化学療法に癌の感度を高める。

【0076】

したがって、いくつかの態様において、サイクル阻害剤および／または化学療法に対する被験体の応答性を感作する方法であって、ＣＣＴ阻害剤の治療上有効な量を被験体に投与することを含み、被験体は、サイクル阻害剤または化学療法に対して非反応性である、前記方法が本明細書において開示される。

【0077】

本明細書において記述したＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ１阻害剤、ＣＣＴ２阻害剤、ＣＣＴ３阻害剤、ＣＣＴ４阻害剤、ＣＣＴ５阻害剤、ＣＣＴ６阻害剤、ＣＣＴ７阻害剤またはＣＣＴ８阻害剤であることができる。いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、ＣＣＴ２阻害剤である。

【0078】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、小分子、抗体、ペプチド、ポリペプチド、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）または短ヘアピンＲＮＡを含む。 いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９を含む、遺伝子編集システムである。

【0079】

いくつかの実施形態において、ＣＣＴ阻害剤は、たとえばＣＴ２０ｐペプチドを含む、ペプチドである。ＣＴ２０ｐペプチドは、当該技術分野において公知である。たとえば、米国特許出願公開第２０１７０１６５３１８Ａ１を参照し、その全体において本明細書において参照よって援用される。ＣＴ２０ペプチドは、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６、配列番号１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５または配列番号：６に対して少なくとも６０％（たとえば、少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％）の配列にて同一性を有する配列番号：１－６の任意のバリアントあるいは上記のものの２つ以上の組み合わせ：を含んでいてもよい。

【0080】

いくつかの実施形態において、治療処方計画のＣＴ２０ペプチドは、癌細胞内へのＣＴ２０ペプチドの送達のために適切なナノ粒子を経て送達してもよい。また、ナノ粒子は、ターゲティング部分の少なくとも一つのタイプ、たとえば癌細胞よって発現される受容体のためのリガンドを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、癌細胞よって発現される受容体は、ＥＧＦ、ＨＥＲ２または葉酸塩受容体である。いくつかの実施形態において、ＣＴ２０ペプチドは、癌細胞内へのＣＴ２０ペプチドの送達のために適切な内部移行ドメインに連結される。

【0081】

本明細書に使用される、「ナノ粒子」は、医薬品化合物、核酸、ペプチドまたはタンパク質を送達することができる任意のナノ構造をいい得る。ナノ粒子は、天然または合成的に由来してもよい。いくつかの態様において、「ナノ粒子」は、血漿ベシクル粒子、リポソーム、エキソーム、タンパク質に基づいた粒子、アルブミン粒子、核酸に基づいた粒子、天然重合体、合成重合体、ヒドロゲル、デンドリマー、ケイ素に基づいた材料、金属に基づいた材料、炭素に基づいた材料、カルシウムに基づいた材料または上記のもののいずれかの組み合わせを含んでいてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書において記述されるナノ粒子は、米国特許第１１，１２９，８６８号において開示され、その全体が本明細書において参照よって組み込まれる。

【0082】

ある態様において、ナノ粒子は、超分枝ポリエステル重合体のナノ粒子である。ある態様において、ナノ粒子は、重合体ナノ粒子である。ある態様において、ナノ粒子は、ターゲティング部分を含むことができる。ある態様において、ターゲティング部分は、ターゲティングリガンドを含むことができる。ある態様において、ターゲティングリガンドは、癌細胞よって発現される受容体のためのものであることができる。ある態様において、癌細胞よって発現される受容体は、ＥＧＦ、ＨＥＲ２または葉酸塩受容体であることができる。ある態様において、癌細胞よって発現される受容体は、癌細胞よって発現されることが当業者に公知の任意の受容体であることができる。いくつかの実施形態において、受容体は。大腸癌細胞、前立腺癌細胞、肺癌細胞、肝癌細胞および／または乳癌細胞よって発現されることが公知であってもよい。

【0083】

ある態様において、ターゲティングリガンドは、葉酸化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマート化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、ポリグルタミン酸化された葉酸化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマートアジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、葉酸アジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、グルタマートアジド尿素である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、二機能性グルタマート－葉酸ハイブリダイズされた化合物である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、高比重である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、低比重である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、高原子価である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、低原子価である。ある態様において、ターゲティングリガンドは、固体腫瘍特異的細胞タンパク質のための基質である。

【0084】

いくつかの実施例において、本明細書において開示される方法は、さらに被験体に細胞周期阻害剤の治療上有効な量を投与することを含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＣＮＤ１阻害剤、ＣＤＫ２阻害剤またはＣＤＫ４阻害剤を含む。いくつかの実施形態において、細胞周期阻害剤は、ＣＤＫ４阻害剤である。ＣＤＫ４阻害剤は、たとえば、パルボシクリブ、リボシクリブまたはアベマシクリブ含む。

【0085】

いくつかの実施形態において、被験体は、成人である。いくつかの実施形態において、被験体は、小児である。

【0086】

いくつかの実施形態において、癌は、転移性癌である。いくつかの実施形態において、癌は、肉腫、膠腫、黒色腫、リンパ腫または乳癌である。いくつかの実施形態において、癌は、小児癌である。いくつかの実施形態において、小児癌は、神経芽腫、腎明細胞肉腫（ＣＣＳＫ）、ウィルムス腫瘍、腎ラブドイド腫瘍（ＲＴＫ）、横紋筋肉腫または脈絡叢癌である。いくつかの実施形態において、被験体から得られる癌細胞は、参照対照と相対的にＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１相対的からなる群から選択される腫瘍生物マーカーの一つまたは複数の増加したレベルを有する。

【0087】

いくつかの実施形態において、本明細書において記述した方法は、たとえばルミナールＡ乳癌、ルミナールＢ乳癌、エストロゲン受容体（ＥＲ）－プロゲステロン受容体（ＰＲ）ＨＥＲ２＋乳癌またはトリプルネガティブ乳癌を含む乳癌を治療することに対して有効である。

【実施例】

【0088】

別途定義されない限り、本明細書に使用される全ての専門的および科学的用語は、開示した発明が属する技術における当業者によって一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において引用される刊行物およびこれらが引用するものは、具体的に参照により援用される。

【0089】

当業者は、さらなるルーチン試験を使用することなく、本明細書において記述した発明の具体的実施形態に対して多くの均等物を認識し、または確認することができるだろう。本発明は、詳細な実施形態および実施実施形態に関して記述されている一方、種々の変更およびさらなる変化を行ってもよいこと、および均等物は、本発明またはその発明の概念の要旨を逸脱しない範囲でその要素を置換してもよいことが理解されるであろう。加えて、その必須範囲を逸脱しない範囲で本発明の教示に対して特定の状況または装置を適応するために、多くの改変をなしてもよい。このような等価物は、以下特許請求の範囲によって包含されることが意図される。本発明は、本明細書において開示される特定の実施実施形態にない限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲内入る全ての実施実施形態を含むであろうことが意図される。

【0090】

実施例１：導入
遺伝子変化は、抑制されていない増殖、特に細胞周期相－特にギャップ１（Ｇ１）相から合成（Ｓ）相移行を調節解除するものから生じる悪性形質転換をサポートする。したがって、癌増殖経路を治療的にターゲットすることは、有意な関心対象のものである。細胞周期は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）、サイクリンおよびｐ２１またはｐ２７などの阻害剤、並びにタンパク質分解経路によって厳密に調節されて細胞進行をＧ１期からＳ期を介し、ギャップ２（Ｇ２）相、次いで有糸分裂および細胞質分裂に駆動する。Ｇ１からＳへの移行は、網膜芽細胞腫タンパク質（Ｒｂ）およびヒストン脱アセチル化酵素の活性の制御を介して重要なチェックポイントとしての機能し、これがＥ２因子（Ｅ２Ｆ）を介して転写を制御する。乳癌においては、その他の癌と同様に、Ｇ１／Ｓ移行の調節解除により、チェックイントを迂回することによって抑制されていないＳへの移行を生じる。通常、有糸分裂のシグナルがサイクリンＤの発現を駆動し、これがＧ１キナーゼ、ＣＤＫ４／６に会合し、Ｒｂのリン酸化、Ｅ２Ｆの転写活性の活性化およびその後のＳ期キナーゼＣＤＫ２／サイクリンＥを引き起こす。乳癌において、特にＥＲ＋複数シグナリング経路が標的サイクリンＤに収斂する。また、ＭＹＣは、細胞増殖および分化に関与し、転写的に細胞周期制御因子を活性化し、および細胞周期阻害剤を抑制し、および制癌剤耐性の発症に関与する。そういう訳で、乳癌患者のための治療選択肢は、これらの腫瘍の分子分類およびターゲットされた治療の有効性に依存する。ＣＤＫ４をターゲットするものなどのＣＤＫ阻害剤での最近の成功は、これらの阻害剤が癌細胞の増殖を遮断するため、励みになる。しかし、ＣＣＮＤ１／サイクリンＤ１またはＭＹＣをターゲットする臨床における薬物はない。内分泌療法は、ＥＲ＋患者（ルミナール癌）のための最善の選択肢のままであるが、薬物耐性の発症が問題である。患者は、またＣＤＫ４阻害剤に対する耐性を発症し得るし、そのうちの３つが臨床用のために承認されている。新たなターゲット可能な癌遺伝子を同定することは、癌の進化および進行に対する知見を前進させることができ、癌患者、特に最前線の療法に耐性を発症するものの予後および長期生存を改善する新規治療アプローチを明らかにすることができる。

【0091】

癌療法のためにターゲット可能な因子の発見を前進させるために、ＣＣＴに焦点が集まった。ＣＣＴは、タンパク質を折り畳んでいるチャンバーを形成する８つの異なるサブユニット（ＣＣＴ１－８）からなる２つの積み重ねられた環で構成されるＩＩ型真核生物シャペロニンである。環においてシス（同じ）およびトランス（対向する）位置でその他のサブユニットに関して特定の位置にてそれぞれのＣＣＴサブユニットを構築する。ＣＣＴサブユニットは、３つのドメイン：チャンバーの基部を形成する赤道ドメイン、ＡＴＰ結合ポケットを有する中間ドメイン、頂端ドメインに付着するヒンジおよび頂端ドメインそれ自体を含む。頂端ドメインは、異なる基質を結合する複数の疎水領域を有する；それゆえに、基質結合は、タンパク質のアミノ酸配列でなくむしろその構造的特徴に基づく。ＣＣＴサブユニットは、
ＡＴＰに対して異なる結合親和性を有す、これが調節性の役割を有し、並びに基質に対して異なる結合親和性を有する。ＣＣＴ相互作用部の範囲および幅は、完全には理解されていないものの、報告は、ＣＣＴがプロテオーム約１－１５％と相互作用することができ、増殖、細胞周期進行および浸潤に関与するものなどの細胞プロセスをサポートすることを示唆する。骨格タンパク質、アクチンおよびチューブリンは、ＣＣＴのための絶対的基質である。加えて、ＰＬＫ１、ｃｄｃ２０、ＣＤＨ１、Ｃｙｃｌｉｎ Ｅ、ｐ５３、ＳＴＡＴ３およびその他の類のＣＣＴおよび細胞周期タンパク質、転写因子および腫瘍サプレッサーとの直接相互作用が報告されている。それ故、癌細胞は、ＣＣＴに高度に依存的となり、生存および成長のために必要とされる機能的な多くの腫瘍タンパク質および必須因子の折り畳まれた形態を提供し得る。

【0092】

ＣＣＴサブユニットは、正常組織と比較して乳癌において高度に発現し、これらの発現は、患者の腫瘍段階および転移と共に増加した。ＣＣＴサブユニットのうち、ＣＣＴ２発現は、乳癌患者の生存全体に対して逆相関することが判明した。したがって、ＣＣＴ２は、新規癌遺伝子であり得るし、予後の生物マーカーとして役立ち、これは、発癌プロセスにおいて、シャペロニン複合体および特にＣＣＴ２の役割におけるより深い研究をサポートする。癌におけるＣＣＴ２の役割の大部分の知識は、全ＣＣＴ折り畳み複合体および同定されたタンパク質－タンパク質相互作用の活性から推定される。このデータを増大するために、細胞周期進行におけるＣＣＴ２の役割を２Ｄおよび３Ｄ培養を使用して具体的に調査して、乳癌で最も共通のサブタイプ、ルミナールＡ細胞においてＣＣＴ２サブユニットを過剰発現することに直接関連する細胞および分子変化を調査した。ＣＣＴ２発現は、球状体培養において、並びに２Ｄ単層において癌細胞の増殖を駆動し、足場にかかわりなく成長適応を癌細胞に賦与することが判明した。また、ＣＣＴ２発現は、特に球状体培養においてＭＹＣなどの重要な増殖性因子の増加した発現に相関したる。これらの所見は、ＣＣＴ２が乳房およびその他の癌における予後徴候および治療価値をもつ細胞周期制御因子およびプロトオンコジーンであることを示す。

【0093】

実施例２：材料および方法
株化細胞およびＣＣＴ２過剰発現または枯渇細胞の生成：使用した株化細胞は、ＭＣＦ７（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－２２）ヒトＥＲ＋乳癌細胞、Ｔ４７Ｄ（ＡＴＣＣ ＨＴＢ－１３３）ヒトＥＲ＋乳癌細胞およびＥ０７７１（ＣＨ３ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）マウスＴＮＢＣ細胞であった。Ｔ４７Ｄ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（双子座）、１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および０．２ユニット／ｍＬヒト組換えインスリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を補ったＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養した。ＭＣＦ７細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ）、１％Ｐ／Ｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および０．０１ｍｇ／ｍＬヒト組換えインスリン（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）を補ったイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（ＡＴＣＣ）において培養した。ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞は、前述したとおりにレンチウイルス対照またはＣＣＴ２－ＦＬＡＧのためにプラスミドを導入した。選択のために、細胞を０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンジヒドロクロリド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で維持して、ＧＦＰ発現について顕微鏡観察した。Ｅ０７７１細胞は、１０％ＦＢＳ（Ｇｅｍｉｎｉ）および１％Ｐ／Ｓ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を補ったＲＰＭＩ－１６４０（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養した。Ｅ０７７１は、以前に報告した様に、ＣＣＴ２をターゲットするレンチウイルスに基づいた誘導性小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を導入した。ｓｈＲＮＡ発現を誘導するために、０．μｇ／ｍＬドキシサイクリンを２４－７２時間培地に添加した。

【0094】

細胞は、超低付着プレート（ＵＬＡ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養し、それぞれの株化細胞に対して適切な様に完全成長培地を補った。複数の球状体の形成を観察するために、２４ウェル平底面ＵＬＡプレートには、３０，０００細胞／ウェルで播種した。個体球状体の形成を観察するために、９６ウェル丸底面ＵＬＡプレートには、１０，００の細胞／ウェルで播種した。培養０日目は、球状体をプレートにまく開始をいう。球状体は、ＵＬＡプレート上８日間成長させ、異なる時点：３、５および８日目にてアッセイした。明視野画像およびオーバレイＧＦＰ画像は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５Ｃｅｌｌ Ｉｍａｇｉｎｇ Ｍｕｌｔｉ－Ｍｏｄｅ Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して取り込んだ。

【0095】

２Ｄポスト３Ｄ培養（球状体成長逆転）：球状体成長逆転を評価するために、２４ウェルＵＬＡプレートにおいて成長した８日目球状体を収集して、ピペットで繰り返しによって物理的に、またはＡｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して化学的に崩壊させ、ＰＢＳにおいて一度洗浄して、完全培地に再懸濁し、次いでそれぞれの株化細胞に適切な培地と共に標準的な組織培養Ｔ－２５フラスコにまいた。９６ウェルＵＬＡプレートからの無処置の８日目球状体を、それぞれの株化細胞に適切な培地と共に４８ウェル組織培養プレートへ移した。蛍光画像は、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５（ＢｉｏＴｅｋ）を使用して取り込んだ。明視野顕微鏡画像は、２０Ｘ対物（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）をもつＡＸＩＯ Ｏｂｓｅｒｖｅｒを使用して取り込んだ。

【0096】

増殖および生存度アッセイ：ＶｉａＦｌｕｏ（登録商標）４０５ ＳＥ細胞増殖キット（Ｂｉｏｔｉｕｍ）を使用して細胞分裂の数を追跡することよって増殖を評価した。３日目の球状体培養からの細胞を製造業者のプロトコルにしたがって染色し、４８時間インキュベートし、および解析のために５日目に収集した。参照集団として、３日目球状体からの細胞のサブセットを染色して、解析のために即時に収集した。試料は、Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用するフローサイトメトリーよって解析した。細胞の生存度は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）における染色を使用して評価した。５μｌ（１ｍｇ／ｍｌ）のＰＩを１０^６細胞／ｍｌの濃度の２００μｌの細胞懸濁液に添加した。試料は、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓ）よって解析した。データ解析は、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ６ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ）を使用して行った。

【0097】

細胞周期解析：細胞周期進行を評価するために、２００，０００細胞／ウェルを６ウェル組織培養プレートに添加して、完全成長培地を補った。細胞を一晩培養した。成長停止を誘導するために、細胞を洗浄し、次いで無血清培地を補充して２４時間培養した。１０％ＦＢＳを伴う完全成長培地の添加よって成長の開始を同期し、２４および４８時間後に細胞を評価した。試料を以下の通りにＰＩ細胞内染色のために収集した。簡潔には、同容積の洗浄剤緩衝液およびＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）溶液を１０^６細胞／ｍｌにて細胞に添加し、続いて１ｍｌの総容積当たり１５μｌのＲＮＡａｓｅ溶液（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加した。細胞を室温にて３時間インキュベートした。試料は、フローサイトメトリー（Ｃｙｔｏｆｌｅｘ Ｓ）よって解析した。データ解析は、ＦＣＳ Ｅｘｐｒｅｓｓ６ソフトウェア（ＤｅＮｏｖｏ）を使用して行った。

【0098】

洗浄剤緩衝液レシピ：８ｇｍ塩化ナトリウム、０．４ｇｍ塩化カリウム、０．０６ｇｍ ＫＨ_２ＰＯ_４、０．０９ｇｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、０．１４ｇｍ ＣａＣｌ_２、０．１０ｇｍ ＭｇＣｌ_２、０．１０ｇｍ ＭｇＳＯ_４、５．６ｇｍ ＨＥＰＥＳ、２ｇｍウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１０００ｍｌ蒸留水における４ｇｍノニデット（登録商標）Ｐ－４０。

【0099】

ＰＩ染色溶液レシピ：５００ｍｌ洗浄剤緩衝液中に２５ｇｍ ＰＩ。

【0100】

ＲＮＡａｓｅ溶液レシピ：１ｍｌ蒸留水中に０．００６ｇ ＲＮＡｓｅ
接着アッセイ。

【0101】

球状体を８日管上記の通りに９６ウェルＵＬＡプレートで成長させた。８日目に、球状体を９６ウェル標準組織培養プレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）へ移して、３時間ス着させた。３時間後に、球状体を洗浄して残りの浮遊細胞を除去し、Ｃｙｔａｔｉｏｎ５マルチモデルプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を使用してを撮像した。翌日、球状体をＣｙｔａｔｉｏｎ ５で再び撮像し、次いでプレートから持ち上げた。次いで、球状体を氷冷Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して１５分間振盪しながた分離した。一旦分離したら、Ｃｙｔａｔｉｏｎ ５リーダーおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レベルに基づいてＧｅｎ５ソフトウェアを使用して撮像することによって細胞を計数した。

【0102】

共焦点顕微鏡法のための免疫蛍光染色：２４ウェルＵＬＡプレートで成長させた球状体を収集して、Ａｃｃｕｍａｘ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して化学的に分離した。分離された球状体細胞をポリ－Ｌ－リジンコートの２５ｍｍのカバーガラス（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上にプレートにまき、細胞を１時間静置して固定前に付着した。細胞を１０分間４％ ＰＦＡで固定して、ＰＢＳで１０分間洗浄し、ＰＢＳ中の０．５％ ＴｒｉｔｏｎＸ－１００において５分間透過処理して、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡおよび０．０５％ Ｔｗｅｅｎで１時間ブロックし、ＡｃｔｉｎＲｅｄ（商標）５５５ ＲｅａｄｙＰｒｏｂｅｓ（商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ローダミンファロイジン）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で１時間染色し、および抗フェードＤＡＰＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と共にマウントした。画像は、２０Ｘ対物でＺｅｉｓｓ ＬＳＭ ７１０共焦点顕微鏡（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ ＡＧ）で取得した。

【0103】

ウェスタンブロット：細胞溶解、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、総タンパク質染色、ゲル視覚化およびゲルバンド定量化は、前述したとおりに行った。２Ｄ培養フラスコまたは２４ウェルＵＬＡプレートにおいて成長させた細胞から可溶化液を収集した。総タンパク質濃度は、製造業者のプロトコルにしがって Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ タンパク質アッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。
抗ＣＣＴ２（ａｂ１０９１８４）および抗ＦＬＡＧ（ａｂ１１６２）抗体は、Ａｂｃａｍから得て、抗ＣＣＴ３（ＭＡ５－２７８７２）抗体は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎからであり、および抗－ＣＣＴ－ベータ（ＭＡＢ１００５０）抗体は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅからであった。抗ＣＣＴ２（Ａｂｃａｍ）および抗－ＣＣＴ－ベータ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）抗体は、それぞれヒトＣＣＴ－ベータのＮ－末端アミノ酸１－１００およびＣ末端アミノ酸をターゲットすることに留意されたい。使用した二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷおよびＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷ（ＬＩ－ＣＯＲ）であった。

【0104】

定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ－ｑＰＣＲ）：総ＲＮＡは、製造業者の説明書にしたがって、Ｔｒｉｚｏｌ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して細胞から抽出した。ＲＮＡ濃度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ機器（Ｎａｎｏｄｒｏｐ ８０００、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用して決定した。およそ１ｇのＲＮＡを製造業者の説明書にしたがってＲＴ－ｑＰＣＲ（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）のためのｉＳｃｒｉｐｔ逆転写Ｓｕｐｅｒｍｉｘを使用してｃＤＮＡに逆転写した。ｃＤＮＡを１０ｎｇ／ｌに希釈した。ＲＴ－ｑＰＣＲについては、２０μｌＰＣＲ反応を５μｌＦａｓｔ Ｓｙｂｅｒ Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ）、０．２のフォワードプライマー、０．２リバースプライマーおよび２μｌ ｃＤＮＡ（１０ｇ／ｍｌ）およびＲＮａｓｅフリー水を使用して行われた、ＰＣＲ反応は、２回行った。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。ＰＣＲ反応は、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＱｕａｎｔＳｔｕｄｉｏ ７ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｌ－Ｔｉｍｅ ＰＣＲシステムを使用して９５℃３秒間および６℃３０秒間の４０サイクル行った。融解曲線をそれぞれの反応について評価して、単一の増幅産物を確認した。相対的ｍＲＮＡ発現は、２^－ΔＣｔ を使用して、および変化倍数は、２^{－ΔΔＣｔ} 式を使用して算出した。使用したプライマーを表１において示した。

【0105】

バイオインフォーマティックス解析：Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）データベースの照合は、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［ｃｂｉｏｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ］のためにｗｅｂｓｏｕｒｃｅ ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌを使用して達成し、異なる研究におけるコピー数変化、相互排他性および遺伝子の同時発現を視覚化した。ＴＣＧＡデータを解析し、およびグラフィックスは、ｗｅｂｔｏｏｌを使用してダウンロードした。ＣＣＴサブユニット変化は、Ｃａｔａｌｏｇ ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ（ＣＯＳＭＩＣ）を使用して解析した。Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ （ＣＣＬＥ）データベースからのｍＲＮＡ発現およびコピー数データは、Ｘｅｎａブラウザを使用してダウンロードした。

【0106】

統計解析：タンパク質レベル、画像形成データ、球状体成長、接着、生存度および増殖データの統計分析については、Ｐｒｉｓｍ ８（ＧｒａｐｈＰａｄ）を使用して統計的有意性を決定した。スチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して関連として異なる群を試験した。０．０５より少ないｐ値は、統計的に有意であるとみなした。遺伝子発現データの解析のために、我々は、最初にバッチ効果について生Ｃｔデータ照合した。それが存在する場合、下流の遺伝子発現解析の前にＲパッケージする（Ｌｉｍｍａ）を使用してバッチ効果を取り除いた。バッチ効果が修正された後、２^{－ΔΔＣｔ}法を使用して、それぞれの標的遺伝子についての遺伝子発現を算出し、および規準化し、式中：ΔＣｔ＝Ｃｔ標的遺伝子－Ｃｔハウスキーピング遺伝子である。全てのその後の解析において、倍数変化は、ｌｏｇ２形質転換された（２^－ΔΔＣｔ）、すなわち－ΔΔＣＣｔを使用して、それぞれの標的遺伝子の遺伝子発現に対するの異なる治療の効果を評価した。多重混合効果リニア回帰モデルを使用して、株化細胞、治療および時間の効果に応答するそれぞれの遺伝子の発現を評価した。時間は、０日目について０、３日目について１、５日目について２および８日目について３の値で計量値として設定した。多重因子ＡＮＯＶＡ解析を行って、それぞれの標的遺伝子の発現に応じたなどの株化細胞、ＣＣＴ２の過剰発現および培養タイプ個々の因子の効果を評価した。ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１および総ＣＣＴ２間の遺伝子相互作用を試験するために、Ｓｐｅａｒｍａｎ相関係数を適用した。これらの統計解析は、Ｓｔａｔａ ＭＰ １５（ＳｔａｔａＣｏｒｐ ＬＬＣ、２０１９）およびＲパッケージを使用して行った。全ての試験は、α（Ｉ型エラー）＜０．０５の有意水準で両側とした。ｐ値は、複数の試験を行ったときに、Ｈｏｌｍ調整に基づいた調整した。

【0107】

実施例３。細胞周期遺伝子変化を伴うＣＣＴ２遺伝子変化の同時存在は、機能的関係を示唆する
機能的に関連がある遺伝子組み替えの同時存在は、発癌のプロセスに寄与する。このようなパターンを同定することにより、新規の癌惹起経路および治療ターゲットを明らかにすることができる。細胞周期制御因子における遺伝子変化は、乳癌において共通であり、および癌細胞の抑制されていない増殖をサポートする。しかし、腫瘍タイプおよびサブタイプの異種性は、増殖のように生物学的機能を及ぼす単一の機構がなく、むしろ癌成長の複雑な動態を担う異なるシグナリング経路が収斂することを示唆する。将来の治療ターゲティングのために収斂の可能な位置を同定することは、本研究の基礎をなす。この目的のために、ＴＣＧＡのような汎癌データベースは、全ての癌におけるＣＣＴサブユニットの発現について探索し、ＣＣＴ２サブユニット遺伝子のコピー数変化で最も多くのタイプが増幅であり、およびこの遺伝子がまれに欠失したことが示された（図１Ａ）。比較として、ＣＣＴ３についてのデータを含めてある（図１Ａ）。癌進行におけるＣＣＴ２の重要性は、ＣＣＴ２における遺伝子変化を伴う癌患者が全体の、および進行しない生存を減少させた（図１Ｂ）という事実よってさらに強調される。サポートとそて、ＣＣＴ２遺伝子変化を伴う乳癌患者は、変化を伴わない患者よりも７０月まで早期に死亡したことが以前に報告されている。これらの所見は、ＣＣＴ２と細胞周期遺伝子発現との関係を調査して治療介入のために新たな経路を明らかにすることを支持する。ＣＣＴ２サブユニットは、乳癌成長および腫瘍形成のために必須であることを以前の調査で示したので、ＣＣＴ２遺伝子の変化が細胞周期遺伝子変化と関連したかどうかを最初に調べた。表２に示したように、ＣＣＴ２における遺伝子変化は、ＣＤＫ４、ＣＤＫ２、ＣＣＮＤ１およびＭＹＣで同時存在した。

【0108】

細胞周期制御におけるＣＣＴ２についての役割を調査するプラットフォームとして、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ－７株化細胞を選択して使用した。両株化細胞は、ルミナールＡ上皮性乳癌細胞（ＥＲ＋）であり、および胸水の転移性部位に由来する。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１のような基本の株化細胞と比較して低レベルの細胞内可溶質ＣＣＴ２タンパク質を有したことが以前に報告されていた。ルミナールＡサブタイプは、最も共通の乳癌サブタイプの一つであるが、分子異種性も示す。臨床的には、これは、ＣＣＮＤ１およびＣＤＫ４の過剰発現／増幅のためなど差動的治療結果および獲得した内分泌療法耐性の発症によって反映される。全体的および選択された遺伝子変化についてのＣａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ）データベースは、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ株化細胞が変わりやすいコピー数変化プロフィールおよび突然変異率を有することを示す（図１Ｃ）。細胞周期遺伝子のコピー数および発現レベル焦点を集めると、ＭＣＦ７細胞は、Ｔ４７Ｄ細胞（図１Ｄ）に相対的により高いＣＣＴ２およびＭＹＣのコピー数を、しかし相対的により低い遺伝子発現を有する。したがって、ＣＣＴ２遺伝子発現は、Ｔ４７Ｄ細胞においてより高い。また、ＭＣＦ７細胞は、Ｔ４７Ｄ細胞（図１Ｄ）と比較して同じコピー数を、しかしＣＣＮＤ１およびＣＤＫＮ１Ａについて相対的により高いｍＲＮＡ発現以を有した。さらに、これらの株化細胞がＣＣＴサブユニットにおいて任意の遺伝子変化を有していたかどうかを調べた。ＣＯＳＭＩＣウェブ－ツールを使用して、ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ細胞は、それぞれＣＣＴ６ＢおよびＣＣＴ８サブユニットにおいて突然変異を有することが判明した。加えて、ＣＣＴ３は、ＭＣＦ７細胞において過剰発現し、しかしＴ４７Ｄ細胞においてはしない。（表３）これらのデータは、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７株化細胞が乳癌の最も共通の形態を示す一方、これらは、癌性細胞において観察される遺伝的異質性を示し、したがってＣＣＴ２が特に局所から散在性の疾患への癌拡散として、癌細胞成長の制御において果たす役割を明らかにするのをサポートすることができる
実施例４。乳癌細胞におけるＣＣＴ２過剰発現は、球状体の成長を促進する
Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞におけるＣＣＴ２の外因性発現を達成するために、レンチウイルスシステムを使用してＦＬＡＧタグを付けたＣＣＴ２構築物を細胞に導入した。図２Ａに示したように、両株化細胞の形質導入は、レンチウイルスプラスミドからのＧＦＰ発現に相当するレベルよって示したときに同等であった。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現は、外来性ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質（抗ＦＬＡＧ）、総ＣＣＴ２タンパク質（抗ＣＣＴ２ Ｎ末端特異的）および内因性ＣＣＴ２タンパク質（抗ＣＣＴ２ Ｃ末端特異的）に対して特異的な抗体を使用するウエスタンブロットよって調べた。両株化細胞、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質を発現する一方、Ｔ４７Ｄ細胞は、ＭＣＦ７細胞と比較して総ＣＣＴ２タンパク質を増加させた（図２Ｂ）。これは、一部には、細胞を発現するＣＣＴ２－ＦＬＡＧにおける内因性ＣＣＴ２のダウンレギュレーションのためである（図２Ｂ）。
Ｔ４７Ｄ細胞において、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現は、総ＣＣＴ２ ｍＲＮＡ（図２Ｃ）を増加させ、これは、ＣＣＴ２タンパク質発現と相関した。ＭＣＦ７細胞において、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ ｍＲＮＡは、同様に増加した；しかし、これは、転写後機構における相違のため、レンチウイルス対照と比較して、増加した総ＣＣＴ２タンパク質と相関しなかった。細胞成長、増殖および細胞周期制御因子との相関によるＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現の効果が考慮されていたので、株化細胞間における総ＣＣＴ２発現におけるこの相違は、重要である。

【0109】

ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを過剰発現させることにより、内因性ＣＣＴ２における減少を生じさせたことが観察されたので、その他の内因性ＣＣＴサブユニットも減少したかどうかを決定した。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現するＭＣＦ７細胞では、内因性ＣＣＴ３タンパク質およびｍＲＮＡ発現がわずかに増加し、減少はせず、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ（図１１）を発現するＴ４７Ｄ細胞において統計的に有意な変化は確認されなかった。その他のＣＣＴサブユニット（たとえば、ＣＣＴ４、ＣＣＴ５）の内因性レベルは、同じであったか、またはＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現する細胞において増加したことが報告されていた。それ故、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧの発現による内因性ＣＣＴ２における減少は、その他のＣＣＴサブユニットの減少を伴わなかった。その上、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質の主要部分が、その他のＣＣＴサブユニットと物理的に会合して複合体を形成することが判明した。これは、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞におけるＣＣＴ２－ＦＬＡＧの生物学的活性がＣＣＴタンパク質－畳み込み複合体の一部として媒介される一方、これは単量体ＣＣＴ２ ｍＲＮＡまたはタンパク質についての生物学的機能を制御しないことを示す。

【0110】

３Ｄ培養モデルは、より優れた腫瘍成長動態を模倣し、および腫瘍成長メカニズムを調査するための有益なツールである。３Ｄ培養における細胞成長は、凝集し、および球状体を形成する傾向がある。これらの球状体のコアは、通常低酸素および壊死であり、成長因子に対してより少ないアクセスを有し、中間層は、静止細胞を含み、および外層は、典型的には周囲の培地と接触して活発に増殖する細胞で構成されるＵＬＡプレートの使用を介して可能となる。３Ｄ培養状態を利用することにより、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現が乳癌細胞による球状体形成に対して有することができる影響を調査した。２４ウェルＵＬＡ平底プレートにおいて、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現するＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞は、レンチウイルス対照プラスミドを発現する細胞と比較して複数の大きな球状体を形成した（図３Ａ）。形態学的には、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現するＴ４７Ｄ細胞によって形成される球状体は、むしろ複数で成長するシート様のパターンに、しかしＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現するＭＣＦ７細胞またはＴ４７ＤおよびＭＣＦ７レンチウイルス対照で見たときは個々の球状体に達した（図３Ａ）。ウェルあたりの球状体数を球状体形成の異なる日（３、５および８日目）にて、次に評価した。形成される球状体の数における統計的に有意な増大が、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを過剰発現させたＴ４７Ｄ細胞で見られ、および類似のこのと、しかし統計的に有意でない傾向ではないが、ＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現細胞で観察された（図３Ｂ）。個々ｂの球状体のサイズを測定するために、（単一の球状体をイメージングすることによる）、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞およびレンチウイルス対照を９６ウェル丸底ＵＬＡプレートにおいて成長させた。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７ ＣＣＴ２過剰発現細胞については、大きな球状体が形成され、これはそれぞれの時点３、５および８日で増加した（図３Ｃ）。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質レベルは、球状体成長の５日目を通じてそれぞれの株化細胞において維持され、一方で、レンチウイルス対照細胞において、内因性ＣＣＴ２タンパク質がダウンレギュレートされたことを確認した（図１２－１３）。Ｔ４７Ｄ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、より高い総ＣＣＴ２ ｍＲＮＡを維持し、これは３Ｄ培養の３日目にてピークに達した（図３Ｄ）。これらの結果は、ＣＣＴ２の増加した発現は、正常細胞のプロセスが減少するときにさえ、球状体成長を駆動することができ、およびＴ４７Ｄ細胞は、ＭＣＦ７細胞よりも高い総ＣＣＴ２の発現レベルを維持し、３Ｄ培養状態下における複数の、およびより大きな球状体の対応する増加した成長を示すことを証明する。

【0111】

ＣＣＴ２が球状体形成および成長のために必須であることを検証するために、ＣＣＴ２枯渇実験を、ドキシサイクリン（ドキシ）誘導性ｓｈＲＮＡを使用して行った。乳癌細胞におけるＣＣＴ２の枯渇は、致命的であったし、およびＴＮＢＣの同系マウスモデルにおける腫瘍成長を阻害することができる。ルミナールＡ乳癌細胞とは異なり、これらの細胞は、内因性ＣＣＴ２の増加した量を発現する傾向があり、および枯渇を受け入れられるので、ＴＮＢＣ細胞を使用した。Ｅ０７７１を使用する以前の研究において、ＴＮＢＣ細胞は、ドキシでの処理の７２時間後にＣＣＴ２の約５０％の枯渇を達成した。ＣＣＴ２を枯渇させるためにこの同じシステムを使用して、Ｅ０７７１対照またはＣＣＴ２ ｓｈＲＮＡ細胞を９６ウェルＵＬＡ丸底プレートに播き、および以下の通りに個体球状体の成長を評価した。図４Ａに示したように、Ｅ０７７１細胞（対照およびＣＣＴ２ ｓｈＲＮＡ）を０日目にプレートに播き、およびＣＣＴ２の枯渇は、球状体成長の３日目後にドキシで誘導した。細胞をドキシ処理後の２４、４８および７２時間にて撮像した。ＣＣＴ２枯渇では、これらの細胞がこれらの強固な相互作用を失い、およびウェルの底面にてゆるく凝集したため、球状体の形成を妨げた（図４Ａ）。図４Ｂに示したように、代わりにＣＣＴ２を球状体培養の開始にて枯渇させらて、実験を繰り返した、ＣＣＴ２枯渇が０日目に誘導されたとき、これは細胞が強固な球状体構造を形成することを妨げ、ゆるく凝集された（図４Ｂ）。両実験において、ＣＣＴ２枯渇後に形成される生じる凝集体は、ピペッティングによって容易に分散され、球状体を形成するために必要な強固な細胞間相互作用が失われたことを示している。これらの発見は、ＣＣＴ２が球状体形成および成長を促進することを確認するのをサポートする。

【0112】

実施例５。ＣＣＴ２過剰発現は、３Ｄ球状体から２Ｄ単層培養への細胞の移行をサポートする
３Ｄ培養において成長するＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、インビボにおいて腫瘍を模倣する。これらの細胞が３Ｄ成長の逆転を受けることができるかどうか、２Ｄ単層において再び付着し、および拡張を次に決定することが望まれた。このモデルは、これらの２Ｄ培養への移行ときに、球状体細胞の悪性の特徴（たとえば、侵襲性、幹細胞性）を保持することよって、転移を模倣することができる。
Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞、レンチウイルス対照およびＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現の８日目培養からの球状体を収集して、処理した組織培養プレートへ移して、３時間再び付着させた。細胞を洗浄してみ接着細胞を除去し、次いで撮像して定量化した。より多くのＣＣＴ２－ＦＬＡＧを発現する細胞ほど、レンチウイルス対照と比較して再び付着することができ、これは、これらの細胞が接着培養における成長の再建を可能にした特徴を保ったことを示した（図５Ａ）。Ｔ４７Ｄ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現細胞では、これらが細胞間付着を保持する一方、表面にもアンカリングするため、最も明らかであった。アクチンは、ＣＣＴ複合体の絶対基質であり、およびその他のサイトスケルトン成分と共に細胞間および細胞基質間の相互作用をサポートすることによって球状体形成において役割を有するので、Ｆ－アクチンの細胞内分布を顕微鏡で調べた。Ｔ４７Ｄ細胞は、この株化細胞からのＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、球状体成長の逆転および単層培養における再付着を示したため、Ｆ－アクチン視覚化のために選択した（図５Ａ）。Ｆ－アクチンレベルは、Ｆ－アクチンを結合する蛍光ファロイジンを使用して共焦点顕微鏡法によって評価した。Ｔ４７Ｄ球状体細胞におけるＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現は、レンチウイルス対照細胞と比較してＦ－アクチンレベルを有意にアップレギュレートした（図５Ｂ）。また、これらの細胞は、糸状仮足様の細胞伸長を有した（図５Ｂ）。また、ＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、球状体成長逆転を受ける一方（図５Ａ）、Ｔ４７Ｄ細胞とは逆に、これらの細胞は、強く被覆カバーガラスに付着しなかったし、および少数の細胞だけが顕微鏡法よってＦ－アクチンを撮像することができる。ひとまとめにすると、これらの結果は、ＣＣＴ２過剰発現が球状体成長逆転および増加したＦ－アクチンレベルをサポートすることを示す。

【0113】

球状体成長逆転に対するＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現の効果をさらに調査するために、２Ｄ単層における再成長のための２つの実験条件下で、Ｔ４７Ｄ細胞、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照からの球状体を調べたであった。最初に、８日目球状体を分離して、標準的な組織培養プレートに置いた。これらの状態下で、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、足場に独立した成長を得た。図６Ａに示したように、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞は、２Ｄ培養状態において、重畳された成長を示し、球状体様の構造を形成し、これがフラスコに付着した。提唱的に、球状体培養から回復したレンチウイルス対照細胞は、２Ｄ単層においてのみにおいて成長した（図６Ａ）。第２のアプローチにおいて、無処置の８日目球状体（分離されない）をＴ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照細胞から標準的な組織培養プレートに移して、異なる時点にて撮像した。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現は、３Ｄから２Ｄ培養への球状体の移行を移行後の２日目まで増強し、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞からの球状体は、付着して、レンチウイルス対照、特にＴ４７Ｄ細胞よりも速く成長した（図６Ｂ）。これらの細胞は、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧタンパク質レベル（図Ｓ３およびＳ４）およびより高い総ＣＣＴ２ ｍＲＮＡ（特にＴ４７Ｄ細胞）を維持した（図６Ｃ）。これらの観察に基づくと、ＣＣＴ２過剰発現は、懸濁液と接着の培養状態間のこれらの細胞移行時でさえ、腫瘍細胞に増強された成長能および適応性を与える、侵襲性および転移性様の挙動についての潜在性を示すと結論される。

【0114】

実施例６。ＣＣＴ２過剰発現は、３Ｄおよびポスト３Ｄ培養における細胞サイクリングを増加させる
ＣＣＴ２－ＦＬＡＧの過剰発現は、より大きな球状体を生じ、および球状体成長逆転を促進したことが示されたので、２Ｄおよび３Ｄ培養状態における細胞の増殖を、希釈色素（ＶｉａＦｌｕｏｒ（登録商標）４０５）を使用して調べた。球状体培養おける細胞（ＵＬＡプレートで成長する）を３日目に色素で処理して、球状体培養の５日目に解析のために収集した。この期間中に分裂した細胞のパーセントは、レンチウイルス対照と比較して、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを過剰発現するＴ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞について、有意に高かった。Ｔ４７Ｄ細胞については、レンチウイルス対照細胞の４０％と比較して、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞の６０％が時間とともに分裂した（図７Ａ）。ＭＣＦ７細胞については、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞の約８０％が、レンチウイルス対照細胞の約４０％と比較して、分裂した（図７Ｂ）。これらの細胞の生存度を、ＰＩ排除を使用して３、５および８日目に評価した。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞で形成された球状体は、両株化細胞においてレンチウイルス対照と比較して、後期の培養日においてより低い生存度を有し、これは、球状体成長の５および８日目にてＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞について最も明らかであった（図７Ｃおよび７Ｄ；図１５において示したゲーティング）。８日目におけるＴ４７Ｄ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞における生存度の喪失は、これらのより大きな球状体におけるより大きい壊死性コアによって説明することができる（図３Ｃ）。ＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞における生存度喪失は、球状体培養において成育することができなかった細胞の増殖の増のためであり得る。まとめると、これらの所見は、癌細胞の増殖および球状体の成長を促進する際のＣＣＴ２についてさらなるサポートを提供する。

【0115】

細胞周期遺伝子とＣＣＴ２の同時存在に明らかにするデータマイニング（表２）およびＣＣＴ２－ＦＬＡＧの過剰発現が２Ｄ単層培養における細胞分裂を促進したという以前の知見に基づいて、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現が細胞周期侵入および進行を増強することができるかどうかを試験した。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７、ＣＣＴ２過剰発現およびレンチウイルス対照、細胞の培養を成長について同期した。血清枯渇の２４時間後、ＤＮＡを染色するためにＰＩを使用する細胞周期解析により、細胞の大多数（約７０％）は、Ｇ１期停止にあったことを確認した（図１６Ａ～１６Ｄ）。血清添加培地を培養に導入して成長を同期して、細胞サイクリングを血清添加後２４および４８時間にて評価した。結果は、Ｔ４７Ｄ細胞におけるＣＣＴ２－ＦＬＡＧの過剰発現が細胞周期のＧ１からＳおよびＧ２期への細胞の移行を促進することを示した。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧを過剰発現さするＴ４７Ｄ細胞は、レンチウイルス対照細胞と比較して、血清添加後２４および４８時間にてＳおよびＧ２期により多くの細胞を有した（図８Ａ、図１７Ａ）。たＭＣＦ７ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現およびレンチウイルス対照細胞は、おおよそ血清添加後に同じ細胞周期分布を有した（図８Ｂ、図１７Ｂ）。

【0116】

また、２Ｄ単層培養を球状体成長逆転を受けた３Ｄ培養から確立した－２Ｄポスト３Ｄという。これらの細胞を使用して、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現が細胞周期進行に影響を与えたかどうかを試験した。Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７球状体に由来する２Ｄポスト３Ｄ細胞を血清枯渇によって同期して、細胞周期に対するＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現の効果について解析した。我々は、ＤＮＡ解析のためにＰＩ染色を使用して、細胞の約７０％が血清枯渇の２４時間後にＧ１にあることを確認した（図１６Ａ～１６Ｄ。
Ｔ４７Ｄ ＣＣＴ２過剰発現細胞は、レンチウイルス対照細胞と比較して、血清添加の２４および４８時間後にＳおよびＧ２期により多くの細胞を有した（図８Ｃ、図１７Ｃ）。ＭＣＦ７ ＣＣＴ２過剰発現およびレンチウイルス対照細胞は、血清添加後に相当する細胞周期分布を有したが、しかしこれらの細胞は、本質的により増殖性であった（図８Ｄ、図１７Ｄ）。ひとまとめにすると、ＣＣＴ２は、２Ｄ、球状体および２Ｄポスト３Ｄ培養において、Ｇ１／Ｓを介して乳癌細胞サイクル進行を促進し；しかし、この効果は、細胞タイプ依存的であり得るし、細胞の遺伝子構造に応じて異なる機構を含み得ることが見出された。

【0117】

実施例７。ＣＣＴ２は、異なる培養状態下でＭＹＣおよび細胞周期遺伝子の発現をアップレギュレートする
ＣＣＴ２過剰発現が細胞サイクリングに関与する遺伝子の発現を増加させたかどうかを調査するために、ＭＹＣおよび重要な細胞周期制御因子の遺伝子発現をＲＴ－ｑＰＣＲよって測定した。ＧＡＰＤＨを参照遺伝子として使用した。遺伝子発現は、ＭＣＦ７レンチウイルス対照参照 試料が最も低いＣＣＴ２発現を有したので、これらに相対的に－ΔΔＣｔとして表した。ＭＣＦ７およびＴ４７Ｄ株化細胞は、遺伝子発現において固有の相違を有した（表４；図９Ａ）。ひとまとめにすると、Ｔ４７Ｄ球状体は、ＭＣＦ７球状体と比較して、ＭＹＣ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４およびＣＣＮＥ１の統計的に有意な高レベルを示した（表４）。球状体培養が成長したとき、選択した遺伝子についての発現は、ダウンレギュレートされ、これは球状体成長で観察される細胞のプロセスにおける一般的な減少と一致する。遺伝子発現のピークは、球状体培養の３日目に最も一般的には生じ、これはＣＣＴ２のピークレベルと相関した（図９Ａ）。重要なことに、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現は、レンチウイルス対照細胞に相対的にＴ４７Ｄ細胞において、細胞周期制御因子、ＭＹＣ（図９Ａ）およびＣＣＮＤ１／サイクリンＤ１（参照試料としてＴ４７Ｄレンチウイルス細胞を使用）の発現を有意にアップレギュレートした（図９Ｂ、表４）。

【0118】

２Ｄ単層培養において成長した細胞の２つの異なる集団を評価したが、２Ｄ接着成長状態に適応される細胞および２Ｄポスト３Ｄ細胞は、より不均一で、これが球状体成長の選択プロセスを生存して、単層成長へ移行して戻った（球状体成長逆転を受けた）。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現は、２Ｄ培養からの細胞における、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＣＤＫ２およびＣＤＫＮ１Ａ遺伝子発現をアップレギュレートした（表５）。特に、有意なのは、レンチウイルス対照と比較して、Ｔ４７Ｄ ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞におけるＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の増加した発現であった（図９Ｃ、表５）。まとめると、ＣＣＴ２過剰発現細胞（特にＴ４７Ｄ細胞）において、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１などの細胞増殖の重要な制御因子の遺伝子発現が増加されて、２Ｄ、３Ｄおよび２Ｄポスト３Ｄ培養状態にわたって検出される増殖性拡張に寄与したことが見出した。

【0119】

実施例８。癌遺伝子としてのＣＣＴ２
Ｔ４７Ｄ株化ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞におけるＭＹＣについての最も高い遺伝子発現は、球状体培養の３日目で観察され（図９Ａ）、総ＣＣＴ２ ｍＲＮＡ発現と一致している（図９Ａ）。ＣＣＴ２、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１間に統計的に有意な相関があったかどうかを乳癌株化細胞において決定した。ＣＣＴ２、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の遺伝子発現は、Ｔ４７ＤおよびＭＣＦ７細胞、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧおよびレンチウイルス対照の２Ｄおよび３日目球状体培養の同じバッチから評価した。統計的力を増大するためにデータセットを組み合わせて、我々は、遺伝子相関解析を行い、および総ＣＣＴ２発現がＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の増加した発現と有意に、それぞれ０．８６４および０．８２４のＳｐｅａｒｍａｎ相関およびｐ＜０．０５で相関されることを見出した（図１０Ａ）。ＣＣＴ２、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の間の相関が臨床的に関連したかどうか決定するために、我々は、これらの遺伝子とのＣＣＴ２ ｍＲＮＡ同時発現についてＴＣＧＡデータを解析した。組み合わせたＰａｎＣａｎｃｅｒ研究を使用して、ＣＣＴ２ ｍＲＮＡの適度にポジティブな相関をＭＹＣ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１で見出し、ＣＣＮＤ１（わずかにネガティブな相関）では見出されなかった（図１０Ｂ）。しかし、ＵＣＳＣ Ｘｅｎａデータベースを使用する異なる相関試験では（研究：ＴＣＧＡ ＢＲＣＡ）ＣＣＴ２およびＣＣＮＤ１の間に弱いが、有意な相関を見出した（ピアソン相関０．０９５、ｐ値＜０．００１）。これらの所見は、ＣＣＴ２が癌細胞の抑制されていない成長において重要な細胞周期制御因子の相互作用のための可能性のあるノードであり得ることを示唆する。潜在的ＣＣＴ２インタラクターのデータを編集することにより生じるネットワークの解析（物理的および遺伝的な相互作用（ＢｉｏＧＲＩＤ）からの証拠）は、ＣＣＴ２相互作用部の一部としてＭＹＣ、ＣＤＫ２およびサイクリンＤ１を含み、ＣＣＴ２が癌増殖経路の制御のための中心的位置またはノードであり得るというアイデアをサポートした（図１０Ｃ、表６）。

【0120】

ＣＣＴ２は、その他の同定された癌遺伝子ＭＤＭ２、ＦＲＳ２、ＹＥＡＴＳ４およびその他とともに染色体１２ｑ１５上に位置する。ＣＤＫ４（１２ｑ１３）は、また染色体領域１２ｑ１３－１５にも及ぶ。それゆえに、ＣＣＴ２は、癌発症と関連するアンプリコンの部分である。ＣＣＴ２遺伝子増幅または増加した遺伝子発現を伴う試料／患者で最も高いパーセントは、肉腫のような軟部組織癌において観察される（肉腫試料／患者の１９％は、ＣＣＴ２（ＴＣＧＡ）において遺伝子変化を有する）（図１８Ａ）。また、ＣＣＴ２は、その他の１２ｑ１５癌遺伝子と共に侵襲性乳癌において遺伝子改変されており、そのパーセントは、研究および試料の利用能に応じて変化する（図１８Ｂ、１８Ｃ）。ＣＣＴタンパク質折り畳み複合体におけるその役割とともに、我々は、ＣＣＴ２が足場独立する癌細胞の増殖を促進し、ＭＹＣ様のその他の癌遺伝子の発現と相関し、およびしたがって、それが腫瘍化を駆動する変異性プロセスの間にゲノム増幅を受けるにつれて癌遺伝子のための基本的要求を果たし得ることを示した。

【0121】

ＣＣＴ複合体は、癌細胞のために必須の多くのタンパク質の畳み込み、安定性、成熟またはアセンブリーを支援する。しかし、８つのサブユニットで構成される大きな複合体であり、ＣＣＴの治療上のターゲティングは、挑戦である。これに対処するために、一つのサブユニット、ＣＣＴ２を過剰発現させることは、癌細胞の増殖を促進し、および転移に対する潜在性を増強するために十分であることが示される。我々は、異なる遺伝的背景を有する２つのルミナールＡ乳癌株化細胞を選択してＣＣＴ２の機能を研究した。また、Ｔ４７Ｄ細胞は、ＰＲ高であり、ＣＣＴ２過剰発現により最も大きな変化を現し、増加した球状体サイズおよび数および増強された増殖があった。また、Ｔ４７Ｄ細胞は、ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ発現、示された球状体成長逆転および足場独立した成長の高レベルを維持した。重要なことに、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の遺伝子発現における増大は、Ｔ４７Ｄ細胞においてＣＣＴ２と相関した。それ故、Ｔ４７Ｄ細胞は、ＣＣＴ２を過剰発現させることが抑制されていない増殖および攻撃的な、侵襲性の癌細胞の転移性様の挙動を生じ得るし、細胞周期制御因子の増加した発現に関連づけられることを示す。対照的に、ＭＣＦ７細胞は、Ｔ４７Ｄ細胞と比較してより高いＣＣＴ２コピー数を有し、本質的により多くのＣＣＴ２を発現せず、むしろＭＹＣおよびＣＣＮＤ１の高い内因性レベルを有する。ＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現がこれらの細胞において達成される一方、総ＣＣＴ２の高レベルは、持続されなかった。結果として、我々は、ＭＣＦ７対照細胞のものを越える、球状体成長または球状体成長逆転における有意な増大を観察しなかった。まとめると、これらの株化細胞からのデータは、ＣＣＴ２が細胞増殖の新規の制御因子であり、これが独立した足場である得るし、およびＭＹＣおよびＣＣＮＤ１を含む成長経路の相互作用のためのノードであり得ることをサポートする。

【0122】

ＭＹＣは、転写因子として機能し、および癌の細胞周期制御、形質転換、血管形成および成長に関与する。結果として、ＭＹＣは、乳癌において、特に不十分な予後を有するＨＥＲ２およびＢＲＣＡ－１関連する癌に対する、主要なプロトオンコジーンである。同様に、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）は、癌において増幅され、または過剰発現し、およびＭＹＣと協調して、形質転換を促進し得る。本明細書において、我々は、ＣＣＴ２発現がＭＹＣおよびＣＣＮＤ１遺伝子発現をアップレギュレートすることができ、典型的にはＭＹＣ増幅と関連する基礎様／ＴＮＢＣサブタイプよりも通常攻撃的でないルミナールＡ乳癌細胞における転移性様の挙動を促進することができることを示した。ＣＣＴ２は、ＭＹＣ相互作用タンパク質として同定された一方、ＭＹＣとＣＣＴ２（またはＣＣＴサブユニットのいずれか）の関係は十分に理解されていない。その他では、基礎様のＴＮＢＣ細胞におけるＣＣＴ３の過剰発現または抑制が細胞増殖を変化させ、ＭＹＣの発現を変えることを報告した。関心対象の一つの経路は、細胞成長を調節するＷＮＴ／□－カテニンシグナリングであり、これは、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１を介して乳癌細胞における増殖を駆動し得る。ＣＣＴ３の過剰発現は、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１およびＴ４７Ｄ乳癌細胞において□－カテニンを増加させ、これは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）２２３よって調節することができる。このｍｉＲＮＡは、ＣＣＴ３および□－カテニンの３′ＵＴＲに結合することが示された。この研究から描かれる結論は、ＣＣＴ３がｍｉＲＮＡ ２２３に結合し、および競争的に阻害することによって乳癌成長を媒介するということであった。しかし、ＣＣＴ２におけるｍｉＲＮＡ標的のための予測解析では、同様の所見は見出されなかった（ｗｗｗ．ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ．ｏｒｇ／ｃｇｉ－ｂｉｎ／ｔａｒｇｅｔｓｃａｎ／ｖｅｒｔ＿７２／ｖｉｅｗ＿ｇｅｎｅ．ｃｇｉ？ｒｓ＝ＥＮＳＴ０００００２９９３００．６＆ｔａｘｉｄ＝９６０６＆ｍｅｍｂｅｒｓ＝＆ｓｈｏｗｃｎｃ＝０＆ｓｈｏｗｎｃ＝０＆ｓｈｏｗｎｃｆ１＝＆ｓｈｏｗｎｃｆ２＝＆ｓｕｂｓｅｔ＝１）。その上、現在の研究においてＣＣＴ３ ｍＲＮＡおよびタンパク質は、レンチウイルス対照とＣＣＴ２－ＦＬＡＧ過剰発現細胞乳癌との間で実質的に変化しなかった。ＭＹＣ、サイクリンＤ１およびその後の増殖および球状体成長によるＣＣＴ２過剰発現の効果におけるｍｉＲＮＡおよびその他のＣＣＴサブユニットの寄与は、決定的に除外される一方、この相互作用を駆動する機構は、解明されていない。ＣＣＴ２、ＭＹＣとｐ５３の関係が検討されている。頭頸部癌における突然変異体ＴＰ５３の研究において、ＣＣＴ２は、ＭＹＣおよび突然変異体ＴＰ５３標的遺伝子として同定された。突然変異体ｐ５３の枯渇は、ＣＣＴ２プロモーターとＭＹＣの相互作用を減少させた。Ｔ４７Ｄ細胞は、ミスセンスＴＰ５３突然変異を有し、機能の潜在的獲得がある（ＭＣＦ７は、野生型ｐ５３を有する）ので、突然変異体ＴＰ５３－ＭＹＣ軸は、ＣＣＴ２過剰発現に対するこの株化細胞の応答性に関与し得ると推測することは興味深い。

【0123】

モデル乳房腫瘍成長に対して３Ｄ培養を使用して、複数およびより大きな球状体によって証明されたとおり、ＣＣＴ２過剰発現による増加した球状体形成が観察され、およびＣＣＴ２が枯渇されたときに球状体構造を支持する細胞間接触の喪失が観察される。サポートにおいて、またアクチンは、ＣＣＴ２過剰発現細胞において、特に細胞が３Ｄから単層培養へ移行するときに、アップレギュレートされたことが見出された。一つのグループは、３Ｄから２Ｄ培養への移行を受けている細胞が癌幹細胞マーカーの発現および化学療法抵抗性の発症などの転移性細胞に典型であるシグニチャを保持することを示した。これらのデータは、
ＣＣＴ２が、球状体が成長するだけでなく、または２Ｄ培養へ移行する可能性を増強し得ることを示し、これは、より攻撃的な表現型よび薬物耐性を促進する原因でありうるような表現型を示す。例として、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１細胞から球状体は、高いＣＣＴ２の内因性レベルを有することが報告されており、カルボプラチンまたはドキソルビシンでの処理に対して増大した抵抗を発症した。それ故、ＣＣＴ２の阻害は、癌薬剤耐性を逆転させるための治療アプローチとして使用することができる。ＣＣＴ２（またはＣＣＴ）阻害の適用は、ＣＤＫ４阻害剤と組み合わせたアプローチであることができる。これらの阻害剤に対する耐性の発症は、一部にはＲｂおよびＣＤＫ２活性の調整に起因していた。我々は、ＣＣＴ２過剰発現がＣＣＮＤ１およびＣＤＫ２を増加させることを見出したので、ＣＣＴ２阻害は、ＣＤＫ４阻害剤に対する感受性を改善し得る。

【0124】

ＣＣＴ（および特にＣＣＴ２）をターゲティングすることは、乳癌、並びにＣＣＴが高度に発現されるその他の癌のための有効な治療上のアプローチであり得る。ＣＣＴ２遺伝子の最も高い増幅割合は、軟部組織癌において見出された。ＣＣＴ２のための遺伝子は、１２ｑ１５アンプリコンにおいて位置し、これはまた、とりわけ癌遺伝子ＭＤＭ２、ＹＥＡＴＳ４、ＦＲＳ２を含む。このアンプリコンの高レベル増幅は、肉腫、並びに膠腫および黒色腫様のその他の癌を生じる前駆細胞における初期のイベントであり得る。この領域におけるゲノムアンバランスは、濾胞性リンパ腫などのその他の癌においても見いだされる。これを考慮すると、治療的にＣＣＴをターゲティングすることは、これがマルチサブユニット複合体であるという事実によって複雑化され、これが小分子阻害剤の開発の意欲をかき立てる。シャペロニン複合体の活性のために必須であるＣＣＴ２などのサブユニットを同定することは、臨床のためのＣＣＴ阻害剤を開発することに向けた最初の工程である。他者は、ＣＣＴ２－β－チューブリン相互作用を妨げる小分子を同定し、これはチューブリン－結合薬に対する耐性の治療における適用を有し得る。しかし、癌の遺伝的な異種性を考慮すると、基質同定において独立して機能するＣＣＴ阻害剤が必要である。この目的で、ＣＴ２０ｐと呼ばれる小さな両親媒性ペプチドを、ＣＣＴを高度に発現する癌細胞において細胞毒性であるとして同定した。全身にＣＴ２０ｐを送達するために重合体ナノ粒子を使用して、乳および前立腺腫瘍の後退がマウスにおいて達成され、ＣＴ２０ｐがＣＣＴ２サブユニットに直接結合することが証明された。したがって、ＣＴ２０ｐは、ＣＣＴ２およびシャペロニン複合体を治療的ターゲットすることができることを証明する。本明細書において、本研究は、ＭＹＣおよびＣＣＮＤ１のような重要な増殖性因子と相互作用する細胞周期制御因子としてその役割を証明することにより、新薬の開発につながる標的としてのＣＣＴ２の価値を示す。癌遺伝子としてのＣＣＴ２の機能は、確立され得るし、ＭＹＣとのその関係を解明することにより、根底にある癌成長および散在の新規の機構を暴くこと、並びに薬剤耐性癌および転移の治療における、および癌再発の予防におけるＣＣＴ阻害剤の使用を明らかにすることができる。

【0125】

実施例８。ＣＣＴ神経芽細胞腫
方法：バイオインフォーマティックス：データは、「Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ Ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｔｏ Ｇｅｎｅｒａｔｅ Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ（ＴＡＲＥＴ）に対するＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙにＡｐｐｌｉｃａｂｌｅなＲｅｓｅａｒｃｈおよびＧｅｎｏｔｙｐｅ Ｔｉｓｓｕｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（ＧＴＥｘ）試料」データセットの組合せコホートを使用して、ｘｅｎａ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕにてカルフォルニアサンタクルツ大学（ＵＣＳＣ）Ｘｅｎａ ａｔ ｘｅｎａ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ から収集した（Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１９）。ＣＣＴ２遺伝子についての発現をＧＴＥｘ、ＴＣＧＡおよびＴＡＲＥＴ試料において比較した。次いで、ＴＡＲＥＴ試料からの神経芽腫症例は、９つの異なる遺伝子発現：ＣＣＴ２、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＤ１、ＣＣＮＥ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１について単離して、解析した。ミュリエルのデータ。

【0126】

組織学：ホルマリン固定パラフィン包埋組織（ＦＦＰＥ）を伴うスライドは、ＵＳ Ｂｉｏｍａｘ １）ＰＣ７０１およびＮＢ６４２ｃから受けた。スライドは、ＣＣＴ２およびＳＴＡＴ３染色についての標準的な免疫組織化学（ＩＨＣ）法よって処理した［ｒｅｆ］。抗ＣＣＴβ抗体［ヒトＴＣＰ１ベータのアミノ酸２７７および４７３］を使用した（ＬｉｆｅＳｐａｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。スライドを染色して、以前に記述したように［ｒｅｆ］、独立してかつ、同定盲目の病理学者よってＣＣＴ２染色について記録した。画像は、ＢＺ－Ｘ８００キーエンスを使用して取得した。

【0127】

株化細胞：ＩＭＲ－３２細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）；ＣＣＬ－１２＆（商標））は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）および１％ペニシリン－ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびＬ－グルタミンを補ったイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養した。ＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）；ＣＲＬ－２１３７（商標））は、１０％ＦＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１Ｘ非必須アミノ酸、１％（Ｐ／Ｓ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）およびＬ－グルタミンを補ったダルベッコ修正イーグルの培地（ＤＭＥＭ）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）において培養した。ＩＭＲ－３２およびＳＫ－Ｎ－ＡＳ細胞にはレンチウイルスプラスミドを導入して、ＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号：７））をもつＣＣＴ２を発現し、以下ＩＭＲ３２－ＣＣＴ２またはＳＫＮＡＳ－ＣＣＴ２という。スクランブルしたレンチウイルスプラスミドを対照として使用し、およびこれらの細胞は、以下ＩＭＲ３２－ＧＦＰまたはＳＫＮＡＳ－ＧＦＰという。
０．５μｇ／ｍＬピューロマイシンジヒドロクロリド（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をＳＫＮＡＳ細胞におけるプラスミドを維持するために添加して、１．０μｇ／ｍＬをＩＭＲ３２細胞において使用した。

【0128】

ウェスタン。細胞溶解、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）、総タンパク質染色、ゲル視覚化およびゲルバンド定量化は、前述したとおりに行った（ｒｅｆ）。可溶化液を６ウェルプレートまたは２Ｄ培養フラスコから収集した。総タンパク質は、製造業者のプロトコルにしたがってＰｉｅｒｃｅ ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して決定した。一次抗体は：Ｎ末端アミノ酸１－１００をターゲットする総ＣＣＴ２（ａｂ１０９１８４）ａｂｃａｍ；ＣＣＴ３（ＭＡ５－２７８７２）Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃ末端アミノ酸をターゲットする内因性ＣＣＴ２（ＭＡＢ１００５０）ｍｉｌｉｐｏｒｅ；およびＦＬＡＧ（ａｂ１１６２）ａｂｃａｍを含んだ。二次抗体は、ＩＲＤｙｅ ８００ＣＷおよびＩＲＤｙｅ ６８０ＣＷ（ＬＩ－ＣＯＲ）を含んだ。画像は、ＬｉＣＯＲＥイメージャーで収集し、およびＩｍａｇｅＳｔｕｄｉｏを使用して処理した。

【0129】

ＲＴ－ＰＣＲ。ＲＮＡは、ＲＮＡ抽出のための製造業者の標準的プロトコルにしたがって、ＴＲＩｚｏｌＴＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して細胞から単離した。ＲＮＡは、Ｎａｎｏｄｒｏｐを使用して定量化した。Ｃｄｎａは、製造業者のプロトコルにしたがってｉＳｃｒｉｐｔＴＭ Ｃｄｎａ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（Ｂｉｏ－Ｒａｄ）を使用して合成した。Ｃｄｎａを１：５希釈し、および製造業者の推奨に従ってＦａｓｔ ＳＹＢＲＴＭ ＧｒｅｅｎＭａｓｔｅｒＭｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）と混合し、および次いで９５℃３秒および６２℃３０秒間にて４０サイクルの間Ｑｕａｎｔｓｔｕｄｉｏ ＰＣＲにおいて実行する、
遊走アッセイ。細胞は、９６ウェルプレートにおいて５０，０００細胞（ＳＫＮＡＳ）および６０，０００細胞（ＩＭＲ３２）の播種密度として培養、一晩座静置した。Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｃｒａｔｃｈ Ｗｏｕｎｄ Ａｓｓａｙキットを使用してスクラッチを作製し、細胞をプロトコルに従って洗浄した。画像は、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ Ｓ３を使用して４８時間の間２時間毎に収集して、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ ２０２１Ａソフトウェアを使用して解析した。

【0130】

アクチンおよびＤＡＰＩ染色。細胞を９６ウェルプレートにおいてウェルあたり１０，０００－３０，０００細胞にて播種した。次の日、細胞を１０分間１０％中性緩衝ホルマリンにおいて固定した。次いで、細胞を穏やかに攪拌しながら５分間、ＰＢＳ中の０．５％Ｔｒｉｔｉｏｎ Ｘ１００において透過処理した。次いで、細胞を穏やかな浸透化で室温で３０分間、１％ブロッキング溶液（ＰＢ中の１－２％ＢＳＡ、０．０５のＴｗｅｅｎ２０）に置いた。次いで、細胞を３０分間暗闇において９９μＬの１％ブロッキング溶液中の１μＬ悪因で染色した。細胞を洗浄溶液（ＰＢＳ中の０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）で３回洗浄して、１０分間乾燥させた。次いで、細胞を１０分間９５μＬのＰＢＳ中の５μＬＤＡＰＩを使用してＤＡＰＩを染色した。次いで、細胞をＰｉｃｏ下で河視化して、画像を取得し、Ｐｉｃｏソフトウェアを使用して解析した。

【0131】

コロニーアッセイ。細胞を６ウェルプレートにおいた１０，０００細胞にて播種して、６サイクルの間培養した。これは、ＩＭＲ３２について２週およびＳＫＮＡＳについて３週であった。

【0132】

緩衝液実験。プロトコルは、以前に記述したように（ｒｅｆ）、Ｌｏｗｅｓ ｅｔ ａｌ［ｒｅｆ］から適応した。試料を抗体染色後に希釈緩衝液で２回洗浄し、希釈緩衝液（３５０μＬ）に再懸濁して、ＣＳＳ磁石カートリッジに移して、ＣＳＳ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩにおいて実行して、解析した。

【0133】

統計。統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して実施した。ＲＴ－ＰＣＲ解析については、相対的遺伝子発現が対照試料におけるこの遺伝子の平均発現よってその試料における遺伝子の発現を割って、すなわち２－ΔΔＣｔ／平均（２－ΔΔＣｔ対照試料）で算出し、ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を対照試料として割り当てた。

【0134】

生物情報科学データベースは、小児癌がＣＣＴ２の高レベルを有することを示す。小児癌におけるＣＣＴ２の関連を決定するために、この研究は、ＵＣＳＣ Ｘｅｎａデータベースを使用して、ＧＴＥｘ（正常組織）、ＴＣＧＡ（成体癌組織）およびＴＡＲＥＴ（小児癌組織）を比較した。結果は、ＴＣＧＡ症例は、ＧＴＥｘより有意に高いＣＣＴ２のレベル（＜０．０００１）を有し、および小児症例は、ＴＣＧＡ症例より有意に高いＣＣＴ２のレベル（＜０．０００１）を有することを示す、図１９Ａ。小児症例を癌タイプによって分析したとき、腎明細胞肉腫、神経芽細胞腫およびウィルムス腫瘍が腎ラブドイド腫瘍より高いレベルを有したことを見出した、図１Ｂ。これらの所見を確認するために、ＫｉｄｓＦｉｒｓｔと呼ばれる異なるデータベースを使用し、ＣＣＴ２レベルをいくつかの小児癌にわたって評価した、図１９Ｃ。最も高いＣＣＴ２レベルのいくつかが神経芽細胞腫、脈絡叢癌および神経芽腫において見られた。ＣＣＴ２レベルをその他の腫瘍マーカーと比較した場合を決定するために、本研究は、ＵＣＳＣ Ｘｅｎａデータベースおよびいくつかの共通の生物マーカーにおける神経芽腫症例に注目した。ＣＣＴ２レベルは、ＭＹＣ、ＭＹＣＮ、ＣＤＫ２、ＣＤＫ４、ＣＣＮＥ１、ＣＣＮＤ１、ＹＡＰ１およびＲＢ１より高かった。ＣＣＴ２レベルは、ＣＣＮＤ１より低かった、図１９Ｄ。

【0135】

ＣＣＴ２染色は、複数の小児癌組織に存在し、および神経芽腫において高い。小児癌組織におけるＣＣＴ２染色を決定するために、小児癌についての組織マイクロアレイ（ＴＭＡ）を染色した。全ての癌がＣＣＴ２について高い（スコア３－４）染色を有することが判明した、図２０Ａ。一方、大部分の正常組織は、ＣＣＴ２のいくつかを有し、したがって我々は、神経芽腫ＴＭＡを染色して、より優れた腫瘍段階および攻撃性の範囲を得た。本研究は、染色が全ての腫瘍組織において存在し、正常組織において最小限であったことを見出した、図２０Ｂ。少ない試料のために統計的に有意ではないが、ここでは、増加した染色および増加腫瘍悪性度、ＣＤ５６染色および／またはＣｇＡである傾向があった。

【0136】

ＣＣＴ２は、神経芽腫株化細胞ＳＫＮＡＳおよびＩＭＲ３２における存在する。ＣＣＴ２が神経芽腫株化細胞において検出可能だったかどうかを決定するために、この研究は、ＩＭＲ３２およびＳＫＮＡＳ株化細胞に対してヌムールデータベースからのＲＮＡを最初に解析した。ＩＭＲ３２は、ＭＹＣＮ増幅された高リスク神経芽腫、処理前である。ＳＫＮＡＳは、ＭＹＣＮダウンレギュレートされた高リスク神経芽腫、転移性再発からの後処理である。ＣＣＴ１、ＣＣＴ２およびＣＣＴ４は、ＳＫＮＡＳと比較して、ＩＭＲ３２において統計的に有意な増大を示す、図２１Ａ。次いで、本研究は、ＩＭＲ３２およびＳＫＮＡＳ株化細胞を培養して、ＣＣＴ２およびＣＣＴ３レベルについてＲＮＡおよびタンパク質を測定した。ＲＴ－ＰＣＲは、トリプル陰性乳癌株化細胞であり、および歴史的にＣＣＴ２（ＲＥＦ）の高レベルを有するＭＤＡ－ＭＢ－２３１ものと比較してＩＭＲ３２およびＳＫＮＡＳにおいてＣＣＴ２の高レベルを示した。ＭＤＡ－ＭＢ－２３１を越えるＣＣＴ２におけるこの増大は、ＩＭＲ３２について統計的に有意なだけであった（ｐ＝０．００３１）、図２１Ｂ。ＣＣＴ３レベルは、ＩＭＲ３２、ＳＫＮＡＳおよびＭＤＡ－ＭＢ－２３１株化細胞にわたって比較的高かった。ウェスタン解析では、同様の結果が分かった。ＣＣＴ２およびＣＣＴ３レベルは、ＳＫＮＡＳを越えてＩＭＲ３２において統計学的に有意に高かった（それぞれｐ＝０．０１０８およびｐ＝０．０９１９）、図２１Ｃ。

【0137】

ＳＫＮＡＳ細胞におけるＣＣＴ２のノックダウンは、生存度を減少させ、アクチンＩＭＲ３２を減少させる。これらの神経芽腫株化細胞におけるＣＣＴ２の役割が生命維持だったかどうかを決定するために、株化細胞をＣＣＴ２－ｓｈＲＮＡでトランスフェクトした。ＧＦＰ－ｓｈＲＮＡを対照トランスフェクションのために使用した。図２２は、トランスフェクションがＳＫＮＡＳ株化細胞において良好だったことを示す。この誘導性システムは、ドキシサイクリンよって活性化される。ウェスタン解析は、ドキシサイクリンで処理後、総ＣＣＴ２（ｐ＝０．００９２）、ＣＣＴ３（ｐ＝０．０３０７）およびエンドーＣＣＴ２（ｐ＝０．０２８４）において統計的に有意な減少を示した、図２２Ａ。細胞生存度に対するノックダウンの効果を決定するために、ＭＴＴアッセイを一過性にトランスフェクトされた細胞で完了した。ＭＴＴアッセイは、ＧＦＰ－ｓｈＲＮＡ処理した細胞よりもＣＣＴ２－ｓｈＲＮＡ処理した細胞において４８時間後に生存可能な細胞における５０％の減少を示した（ｐ＜０．０００１）、図２２Ｂ。ＩＭＲ３２細胞は、同様にトランスフェクションを受け入れず、したがって、我々は、ＣＣＴ２をターゲットするｓｉＲＮＡのプールでこれらの細胞を処理した。アクチンおよびＤＡＰＩ染色は、対照と比較してｓｉＲＮＡで処理した細胞に存在するアクチンにおける８０－６０％の減少を示す、図２２Ｃ。

【0138】

ＣＣＴ２プラスミドのレンチウイルス形質導入は、ＣＣＴ２ ＲＮＡおよびタンパク質を増加させる。ＣＣＴ２がＳＫＮＡＳおよびＩＭＲ３２株化細胞において過剰発現することができるかどうかを決定するために、これらには、レンチウイルスプラスミドをトランスフェクトして、ＣＣＴ２を過剰発現させた。レンチウイルスＧＦＰを対照のために使用した。ＲＴ－ＰＣＲ解析は、ＳＫＮＡＳ（Ｐ＝０．０２１４）においてＣＣＴ２の統計的に有意な増加を示したが、ＩＭＲ３２（０．２５４０）においては示さなかった、図２３Ａ。ＣＣＴ３における増大は、統計的に有意でなかった（図２３Ａ）。ウェスタン解析は、ＳＫＮＡＳにおけるＣＣＴ２過剰発現が内因性ＣＣＴ２（ｐ＝０．０１０８）において統計的に有意な減少を、およびＦＬＡＧ（ｐ＝０．００４０）において統計的に有意な増大を生じることを示した。全体として、総ＣＣＴ２およびＣＣＴ３における増大は、統計的に有意でなかった。ＩＭＲ３２細胞において、ＣＣＴ２過剰発現は、総ＣＣＴ２（ｐ＝０．０３３７）およびＦＬＡＧ（ｐ＝０．０２１４）において統計的に有意な増大を、および内因性ＣＣＴ２（ｐ＝０．０１２１）において統計的に有意な減少を生じた。ＣＣＴ３は、不変のままであった。

【0139】

機能的アッセイは、神経芽腫株化細胞におけるＣＣＴ２の過剰発現から変化を示さなかった。ＣＣＴ２の過剰発現がＳＫＮＡＳ株化細胞に対して有する効果を決定するために、遊走アッセイを完了した。遊走アッセイは、ＳＫＮＡＳ－ＧＦＰ株化細胞とＳＫＮＡＳ－ＣＣＴ２株化細胞の間に有意な相違を示さなかった、図２４Ａ。シャペロニン活性における増大があるかどうかを決定するために、我々は、ＳＫＮＡＳおよびＩＭＲ３２株化細胞においてアクチンレベルを測定し、対照対ＣＣＴ２過剰発現を比較した。アクチン染色は、過剰発現株化細胞と対照の間で不変のままであった、図５）。

【0140】

【表1】

【0141】

【表2】

【0142】

【表3】

【0143】

【表4】

＊Ｔ４７Ｄレンチウイルス対照を使用したＴ４７Ｄ細胞におけるサイクリンＤ１以外の全ての解析のための参照試料としてＭＣＦ－７レンチウイルス対照を参照試料とし使用した。

【0144】

【表5】

【0145】

【表6】

【0146】

【表7】

【0147】

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３４．Ｗａｎｇ Ｑ，Ｈｕａｎｇ ＷＲ，Ｃｈｉｈ ＷＹ，Ｃｈｕａｎｇ ＫＰ，Ｃｈａｎｇ ＣＤ，Ｗｕ Ｙ，ｅｔ ａｌ．Ｃｄｃ２０ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｐｅｒｏｎｅ ＣＣＴ２ ａｎｄ ＣＣＴ５ ａｒｅ ｒｅｑｕｉｒｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｍｕｓｃｏｖｙ ｄｕｃｋ ｒｅｏｖｉｒｕｓ ｐ１０．８－ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ａｒｒｅｓｔ ａｎｄ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ．Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ．２０１９；２３５：１５１－６３．
３５．Ｄｅｋｋｅｒ Ｃ．Ｏｎ ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ＣＣＴ ｉｎ ｔｈｅ ｊｕｓｔ－ｉｎ－ｔｉｍｅ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｐｒｏｃｅｓｓ ｏｆ ＡＰＣ／ＣＣｄｃ２０．ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．２０１０；５８４（３）：４７７－８１．
３６．Ｃａｍａｓｓｅｓ Ａ，Ｂｏｇｄａｎｏｖａ Ａ，Ｓｈｅｖｃｈｅｎｋｏ Ａ，Ｚａｃｈａｒｉａｅ Ｗ．Ｔｈｅ ＣＣＴ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ａｎａｐｈａｓｅ－ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｃｏｍｐｌｅｘ ｔｈｒｏｕｇｈ ｔｈｅ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｃｄｃ２０．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２００３；１２（１）：８７－１００．
３７．Ｗｏｎ ＫＡ，Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ ＲＪ，Ｆａｒｒ ＧＷ，Ｈｏｒｗｉｃｈ ＡＬ，Ｒｅｅｄ ＳＩ．Ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ｃｙｃｌｉｎ Ｅ ｒｅｑｕｉｒｅｓ ｔｈｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ＣＣＴ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８；１８（１２）：７５８４－９．
３８．Ｔｒｉｎｉｄａｄ ＡＧ，Ｍｕｌｌｅｒ ＰＡ，Ｃｕｅｌｌａｒ Ｊ，Ｋｌｅｊｎｏｔ Ｍ，Ｎｏｂｉｓ Ｍ，Ｖａｌｐｕｅｓｔａ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ＣＣＴ ｃｏｍｐｌｅｘ ｐｒｏｍｏｔｅｓ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｗｉｌｄ－ｔｙｐｅ ｐ５３ ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．２０１３；５０（６）：８０５－１７．
３９．Ｋａｓｅｍｂｅｌｉ Ｍ，Ｌａｕ ＷＣ，Ｒｏｈ ＳＨ，Ｅｃｋｏｌｓ ＴＫ，Ｆｒｙｄｍａｎ Ｊ，Ｃｈｉｕ Ｗ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＳＴＡＴ３ ｆｏｌｄｉｎｇ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｂｙ ＴＲｉＣ／ＣＣＴ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ．ＰＬｏＳ Ｂｉｏｌ．２０１４；１２（４）：ｅ１００１８４４．
４０．Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ ＡＥ，Ｍａｒｔｉｎｉ ＡＣ，Ｎｉｅｒｅｎｂｅｒｇ Ｄ，Ｈｏｓａｎｇ Ｋ，Ｆａｈｍｉ ＮＡ，Ｇｏｐａｌａｎ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｎｇ Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ－Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＴＣＰ－１ ｓｕｂｕｎｉｔ ２ ａｓ ａｎ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｆｏｒ ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０２０；１０（１）：７９８．
４１．Ｇｕｅｓｔ ＳＴ，Ｋｒａｔｃｈｅ ＺＲ，Ｂｏｌｌｉｇ－Ｆｉｓｃｈｅｒ Ａ，Ｈａｄｄａｄ Ｒ，Ｅｔｈｉｅｒ ＳＰ．Ｔｗｏ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ＴＲｉＣ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ，ＣＣＴ２ ａｎｄ ＴＣＰ１ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ａｒｅ ｌｉｎｋｅｄ ｔｏ ｄｒｉｖｉｎｇ ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１５；３３２（２）：２２３－３５．
４２．Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ Ｒ，Ｎｅｍｅｃ ＫＮ，Ｉｋｅｔａｎｉ Ａ，Ｆｌｏｒｅｓ Ｏ，Ｓｈｏｗａｌｔｅｒ Ａ，Ｋｈａｌｅｄ ＡＳ，ｅｔ ａｌ．Ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＴＣＰ－１ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｅｖｅｌ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌｓ Ｐｒｅｄｉｃｔｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｐｅｐｔｉｄｅ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１６；２２（１７）：４３６６－７９．
４３．Ｃａｒｒ ＡＣ，Ｋｈａｌｅｄ ＡＳ，Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ Ｒ，Ｆｌｏｒｅｓ Ｏ，Ｎｉｅｒｅｎｂｅｒｇ Ｄ，Ｂｈａｔｔｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＴＣＰ１ （ＣＣＴ） ａｓ ａ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１７；８（６６）：１１０２７３－８８．
４４．Ｇａｏ Ｊ，Ａｋｓｏｙ ＢＡ，Ｄｏｇｒｕｓｏｚ Ｕ，Ｄｒｅｓｄｎｅｒ Ｇ，Ｇｒｏｓｓ Ｂ，Ｓｕｍｅｒ ＳＯ，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｍｐｌｅｘ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｐｒｏｆｉｌｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｃＢｉｏＰｏｒｔａｌ．Ｓｃｉ Ｓｉｇｎａｌ．２０１３；６（２６９）：ｐｌ１．
４５．Ｃｅｒａｍｉ Ｅ，Ｇａｏ Ｊ，Ｄｏｇｒｕｓｏｚ Ｕ，Ｇｒｏｓｓ ＢＥ，Ｓｕｍｅｒ ＳＯ，Ａｋｓｏｙ ＢＡ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ｃＢｉｏ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｐｏｒｔａｌ：ａｎ ｏｐｅｎ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ ｍｕｌｔｉｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；２（５）：４０１－４．
４６．Ｔａｔｅ ＪＧ，Ｂａｍｆｏｒｄ Ｓ，Ｊｕｂｂ ＨＣ，Ｓｏｎｄｋａ Ｚ，Ｂｅａｒｅ ＤＭ，Ｂｉｎｄａｌ Ｎ，ｅｔ ａｌ．ＣＯＳＭＩＣ：ｔｈｅ Ｃａｔａｌｏｇｕｅ Ｏｆ Ｓｏｍａｔｉｃ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ Ｉｎ Ｃａｎｃｅｒ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ．２０１９；４７（Ｄ１）：Ｄ９４１－Ｄ７．
４７．Ｇｏｌｄｍａｎ ＭＪ，Ｃｒａｆｔ Ｂ，Ｈａｓｔｉｅ Ｍ，Ｒｅｐｅｃｋａ Ｋ，ＭｃＤａｄｅ Ｆ，Ｋａｍａｔｈ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｓｕａｌｉｚｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔｉｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｇｅｎｏｍｉｃｓ ｄａｔａ ｖｉａ ｔｈｅ Ｘｅｎａ ｐｌａｔｆｏｒｍ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０２０；３８（６）：６７５－８．
４８．Ｚｗｉｊｓｅｎ ＲＭ，Ｗｉｅｎｔｊｅｎｓ Ｅ，Ｋｌｏｍｐｍａｋｅｒ Ｒ，ｖａｎ ｄｅｒ Ｓｍａｎ Ｊ，Ｂｅｒｎａｒｄｓ Ｒ，Ｍｉｃｈａｌｉｄｅｓ ＲＪ．ＣＤＫ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｓｔｒｏｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｂｙ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１．Ｃｅｌｌ．１９９７；８８（３）：４０５－１５．
４９．Ｇｕａｒｄｕｃｃｉ Ｃ，Ｂｏｎｅｃｈｉ Ｍ，Ｂｏｃｃａｌｉｎｉ Ｇ，Ｂｅｎｅｌｌｉ Ｍ，Ｒｉｓｉ Ｅ，Ｄｉ Ｌｅｏ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ ｏｆ Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ ＣＤＫ４／６ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ａｎｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ ｏｆ Ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｒｅ （Ｂａｓｅｌ）．２０１７；１２（５）：３０４－８．
５０．Ｋｕｎｊｉｔｈａｐａｔｈａｍ Ｒ，Ｋａｒｔｈｉｋｅｙａｎ Ｓ，Ｇｅｓｃｈｗｉｎｄ ＪＦ，Ｋｉｅｓｅｒｍａｎ Ｅ，Ｌｉｎ Ｍ，Ｆｕ ＤＸ，ｅｔ ａｌ．Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ ａｎｃｈｏｒａｇｅ－ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｍｕｌｔｉｃｅｌｌｕｌａｒ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｉｎｔｏ ａ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ ｍｉｍｉｃｓ ａ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｍｏｄｅｌ．Ｓｃｉ Ｒｅｐ．２０１４；４：６８１６．
５１．Ｓｍｙｒｅｋ Ｉ，Ｍａｔｈｅｗ Ｂ，Ｆｉｓｃｈｅｒ ＳＣ，Ｌｉｓｓｅｋ ＳＭ，Ｂｅｃｋｅｒ Ｓ，Ｓｔｅｌｚｅｒ ＥＨＫ．Ｅ－ｃａｄｈｅｒｉｎ，ａｃｔｉｎ，ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅｓ ａｎｄ ＦＡＫ ｄｏｍｉｎａｔｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｓｐｈｅｒｏｉｄ ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｐｈａｓｅｓ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｉｓｓｕｅ ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ．Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｐｅｎ．２０１９；８（１）：ｂｉｏ０３７０５１．
５２．Ｃｈｉｔｃｈｏｌｔａｎ Ｋ，Ａｓｓｅｌｉｎ Ｅ，Ｐａｒｅｎｔ Ｓ，Ｓｙｋｅｓ ＰＨ，Ｅｖａｎｓ ＪＪ．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ｇｒｏｗｔｈ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｃａｎｃｅｒ ｉｎ ｔｈｒｅｅ ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ （３Ｄ） ｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ ２Ｄ ｃｅｌｌ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ．Ｅｘｐ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２０１３；３１９（１）：７５－８７．
５３．Ｒｉｅｄｌ Ａ，Ｓｃｈｌｅｄｅｒｅｒ Ｍ，Ｐｕｄｅｌｋｏ Ｋ，Ｓｔａｄｌｅｒ Ｍ，Ｗａｌｔｅｒ Ｓ，Ｕｎｔｅｒｌｅｕｔｈｎｅｒ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｉｎ ２Ｄ ｖｓ ３Ｄ ｃｕｌｔｕｒｅ ｒｅｖｅａｌｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ ｉｎ ＡＫＴ－ｍＴＯＲ－Ｓ６Ｋ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ａｎｄ ｄｒｕｇ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．２０１７；１３０（１）：２０３－１８．
５４．Ｓｃｈｍｉｄｔ Ｍ，Ｓｃｈｏｌｚ ＣＪ，Ｐｏｌｅｄｎｉｋ Ｃ，Ｒｏｌｌｅｒ Ｊ．Ｓｐｈｅｒｏｉｄ－ｂａｓｅｄ ３－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｍｏｄｅｌｓ：Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ ｉｎ ｈｅａｄ ａｎｄ ｎｅｃｋ ｃａｎｃｅｒ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１６；３５（４）：２４３１－４０．
５５．Ｔａｎａｋａ Ｈ，Ｗａｔａｎａｂｅ Ｔ．Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ Ｕｎｄｅｒｌｙｉｎｇ Ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃａｎｃｅｒｓ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０２０；６（６）：４６２－７７．
５６．Ｊｏｎｓｓｏｎ Ｇ，Ｓｔａａｆ Ｊ，Ｖａｌｌｏｎ－Ｃｈｒｉｓｔｅｒｓｓｏｎ Ｊ，Ｒｉｎｇｎｅｒ Ｍ，Ｈｏｌｍ Ｋ，Ｈｅｇａｒｄｔ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｓｕｂｔｙｐｅｓ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｂｙ ａｒｒａｙ－ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｄｉｓｐｌａｙ ｄｉｓｔｉｎｃｔ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０；１２（３）：Ｒ４２．
５７．Ｎａｒｄｕｌｌｉ ＡＭ，Ｋａｔｚｅｎｅｌｌｅｎｂｏｇｅｎ ＢＳ．Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｔ４７Ｄ ｈｕｍａｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｂｙ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌａｂｅｌｉｎｇ ｏｆ ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｐｒｏｇｅｓｔｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１９８８；１２２（４）：１５３２－４０．
５８．Ｘｕ Ｊ，Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｏｌｏｐａｄｅ ＯＩ．ＭＹＣ ａｎｄ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ．Ｇｅｎｅｓ Ｃａｎｃｅｒ．２０１０；１（６）：６２９－４０．
５９．Ｃｈｅｎ Ｙ，Ｏｌｏｐａｄｅ ＯＩ．ＭＹＣ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｔｕｍｏｒ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｒｅｖ Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｔｈｅｒ．２００８；８（１０）：１６８９－９８．
６０．Ｗａｎｇ Ｙ，Ｔｈａｋｕｒ Ａ，Ｓｕｎ Ｙ，Ｗｕ Ｊ，Ｂｉｌｉｒａｎ Ｈ，Ｂｏｌｌｉｇ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｙｃｌｉｎ Ｄ１ ａｎｄ ｃ－Ｍｙｃ ｌｅａｄｓ ｔｏ ｍｏｒｅ ａｇｇｒｅｓｓｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｖａｓｉｖｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒｓ ｉｎ ｓｅｖｅｒｅ ｃｏｍｂｉｎｅｄ ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ ｍｉｃｅ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００７；６７（８）：３６９８－７０７．
６１．Ｓｐｉｎｉｅｌｌｏ Ｍ，Ｓｔｅｉｎｂｒｉｎｋ ＭＩ，Ｃｅｓｎｉｋ ＡＪ，Ｍｉｌｌｅｒ ＲＭ，Ｓｃａｌｆ Ｍ，Ｓｈｏｒｔｒｅｅｄ ＭＲ，ｅｔ ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｃ－Ｍｙｃ ｍＲＮＡ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ ｕｓｉｎｇ ＨｙＰＲ－ＭＳ．ＲＮＡ．２０１９；２５（１０）：１３３７－５２．
６２．Ｘｕ Ｇ，Ｂｕ Ｓ，Ｗａｎｇ Ｘ，Ｚｈａｎｇ Ｈ，Ｇｅ Ｈ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ＣＣＴ３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｔｈｅ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｉｎｔ．２０２０；２０：２１８．
６３．Ｑｕ Ｈ，Ｚｈｕ Ｆ，Ｄｏｎｇ Ｈ，Ｈｕ Ｘ，Ｈａｎ Ｍ．Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＣＴ－３ Ｉｎｄｕｃｅｓ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ Ｔｈｒｏｕｇｈ ｍｉＲ－２２３ Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｏｎ ａｎｄ Ｗｎｔ／β－Ｃａｔｅｎｉｎ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｐａｔｈｗａｙ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ ｏｎｃｏｌｏｇｙ．２０２０；１０：５３３１７６－．
６４．Ｗａｎｇ ＳＨ，Ｌｉ Ｎ，Ｗｅｉ Ｙ，Ｌｉ ＱＲ，Ｙｕ ＺＰ．ｂｅｔａ－ｃａｔｅｎｉｎ ｄｅａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ＷＮＴ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｄｉｃｉｎｅ ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１４；９（３）：９７３－８．
６５．Ｂｉｌｉｒ Ｂ，Ｋｕｃｕｋ Ｏ，Ｍｏｒｅｎｏ ＣＳ．Ｗｎｔ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ ｂｌｏｃｋａｇｅ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｍｉｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ ｉｎｄｕｃｅｓ ａｐｏｐｔｏｓｉｓ ｉｎ ｔｒｉｐｌｅ－ｎｅｇａｔｉｖｅ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１３；１１：２８０．
６６．Ｇａｎｃｉ Ｆ，Ｐｕｌｉｔｏ Ｃ，Ｖａｌｓｏｎｉ Ｓ，Ｓａｃｃｏｎｉ Ａ，Ｔｕｒｃｏ Ｃ，Ｖａｈａｂｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．ＰＩ３Ｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ Ｃｕｒｔａｉｌ ＭＹＣ－Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ Ｍｕｔａｎｔ ｐ５３ Ｇａｉｎ－ｏｆ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ Ｈｅａｄ ａｎｄ Ｎｅｃｋ Ｓｑｕａｍｏｕｓ Ｃｅｌｌ Ｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２０；２６（１２）：２９５６－７１．
６７．Ｈｕａｎｇ Ｚ，Ｙｕ Ｐ，Ｔａｎｇ Ｊ．Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒｉｐｌｅ－Ｎｅｇａｔｉｖｅ Ｂｒｅａｓｔ Ｃａｎｃｅｒ ＭＤＡ－ＭＢ－２３１ Ｃｅｌｌ Ｓｐｈｅｒｏｉｄ Ｍｏｄｅｌ．ＯｎｃｏＴａｒｇｅｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ．２０２０；１３：５３９５－４０５．
６８．Ｋｕｍａｒａｓａｍｙ Ｖ，Ｖａｉｌ Ｐ，Ｎａｍｂｉａｒ Ｒ，Ｗｉｔｋｉｅｗｉｃｚ ＡＫ，Ｋｎｕｄｓｅｎ ＥＳ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ ｏｆ ｃｅｌｌ－ｃｙｃｌｅ ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ＣＤＫ４／６ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０２０．
６９．Ｔｙｌｅｒ Ｒ，Ｗａｎｉｇａｓｏｏｒｉｙａ Ｋ，Ｔａｎｉｅｒｅ Ｐ，Ａｌｍｏｎｄ Ｍ，Ｆｏｒｄ Ｓ，Ｄｅｓａｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒｅｖｉｅｗ ｏｆ ｒｅｔｒｏｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ ｇｅｎｏｍｉｃｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｔｒｅａｔ Ｒｅｖ．２０２０；８６：１０２０１３．
７０．Ｉｔａｌｉａｎｏ Ａ，Ｃａｒｄｏｔ Ｎ，Ｄｕｐｒｅ Ｆ，Ｍｏｎｔｉｃｅｌｌｉ Ｉ，Ｋｅｓｌａｉｒ Ｆ，Ｐｉｃｈｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｇａｉｎｓ ａｎｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ ｏｆ ｔｈｅ １２ｑ１３－１５ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅｇｉｏｎ ｉｎ ｏｒｄｉｎａｒｙ ｌｉｐｏｍａｓ：ｔｈｅ “ｍｉｓｓｉｎｇ ｌｉｎｋ” ｂｅｔｗｅｅｎ ｌｉｐｏｍａｓ ａｎｄ ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａｓ？ Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００７；１２１（２）：３０８－１５．
７１．Ｂｅｒｇｌｕｎｄ Ｍ，Ｅｎｂｌａｄ Ｇ，Ｔｈｕｎｂｅｒｇ Ｕ，Ａｍｉｎｉ ＲＭ，Ｓｕｎｄｓｔｒｏｍ Ｃ，Ｒｏｏｓ Ｇ，ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃ ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｌｙｍｐｈｏｍａ ｔｏ ｄｉｆｆｕｓｅ ｌａｒｇｅ Ｂ－ｃｅｌｌ ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｍｏｄｅｒｎ ｐａｔｈｏｌｏｇｙ ：ａｎ ｏｆｆｉｃｉａｌ ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ ａｎｄ Ｃａｎａｄｉａｎ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．２００７；２０（１）：６３－７５．
７２．Ｌｉｎ ＹＦ，Ｔｓａｉ ＷＰ，Ｌｉｕ ＨＧ，Ｌｉａｎｇ ＰＨ．Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｂｅｔａ－ｔｕｂｕｌｉｎ／ｃｈａｐｅｒｏｎｉｎ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ＴＣＰ１－ｂｅｔａ ｃｏｍｐｌｅｘ ｓｅｒｖｅｓ ａｓ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｔａｒｇｅｔ ａｇａｉｎｓｔ ｄｒｕｇ－ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｔｕｍｏｒｓ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００９；６９（１７）：６８７９－８８．
７３．Ｌｅｅ ＭＷ，Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ Ｒ，Ｓｐａｒｒｏｗ ＮＡ，Ｉｋｅｔａｎｉ Ａ，Ｂｏｏｈａｋｅｒ ＲＪ，Ｍｏｓｋｏｗｉｔｚ Ｃ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ ＣＴ２０ ｐｅｐｔｉｄｅ ｃａｕｓｅｓ ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔ ａｎｄ ｄｅａｔｈ ｏｆ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔａｌ ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ．Ｃｅｌｌ Ｄｅａｔｈ Ｄｉｓ．２０１４；５：ｅ１２４９．
７４．Ｂｏｏｈａｋｅｒ ＲＪ，Ｚｈａｎｇ Ｇ，Ｌｅｅ ＭＷ，Ｎｅｍｅｃ ＫＮ，Ｓａｎｔｒａ Ｓ，Ｐｅｒｅｚ ＪＭ，ｅｔ ａｌ．Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ ｐｅｐｔｉｄｅ ｔｏ ｔｒｉｇｇｅｒ ｃｅｌｌ ｄｅａｔｈ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ．２０１２；９（７）：２０８０－９３．
７５．Ｆｌｏｒｅｓ Ｏ，Ｓａｎｔｒａ Ｓ，Ｋａｉｔｔａｎｉｓ Ｃ，Ｂａｓｓｉｏｕｎｉ Ｒ，Ｋｈａｌｅｄ ＡＳ，Ｋｈａｌｅｄ ＡＲ，ｅｔ ａｌ．ＰＳＭＡ－Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃ Ｎａｎｏｃａｒｒｉｅｒ ｆｏｒ Ｐｒｏｓｔａｔｅ Ｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ．２０１７；７（９）：２４７７－９４．

【図1】

【図2】

【図3】

【図4】

【図5】

【図6】

【図7】

【図8】

【図9】

【図10】

【図11】

【図12】

【図13】

【図14】

【図15】

【図16】

【図17-1】

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【図18】

【図19-1】

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【図20】

【図21-1】

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【図22-2】

【図23-1】

【図23-2】

【図24-1】

【図24-2】

【図25】

【図26-1】

【図26-2】

【図27】

【図28】

【図29】

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【図33】

【図34】

【図35】

【図36】

【図37】

【図38】

【図39】

【図40】

【図41】

【図42】

【図43】

【配列表】

2024509196000001.app

【国際調査報告】