特表 2024-509264 変異体ポリペプチドを含む組成物及びその使用

(19)【発行国】日本国特許庁(JP)

(12)【公報種別】公表特許公報(A)

(11)【公表番号】

(43)【公表日】2024-02-29

(54)【発明の名称】変異体ポリペプチドを含む組成物及びその使用

(51)【国際特許分類】

   C12N 15/09 20060101AFI20240221BHJP

   C12N 9/16 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/11 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/10 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/62 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/67 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/63 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/861 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/864 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/867 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/869 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/70 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/87 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 15/88 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 1/15 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 1/19 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 1/21 20060101ALI20240221BHJP

   C12N 5/10 20060101ALI20240221BHJP

【ＦＩ】

C12N15/09 110

C12N9/16 Z ZNA

C12N15/11 Z

C12N15/10 200Z

C12N15/62 Z

C12N15/67 Z

C12N15/63 Z

C12N15/861 Z

C12N15/864 100Z

C12N15/867 Z

C12N15/869 Z

C12N15/70 Z

C12N15/87 Z

C12N15/88 Z

C12N1/15

C12N1/19

C12N1/21

C12N5/10

【審査請求】未請求

【予備審査請求】未請求

(21)【出願番号】P 2023555272

(86)(22)【出願日】2022-03-09

(85)【翻訳文提出日】2023-10-03

(86)【国際出願番号】 US2022019525

(87)【国際公開番号】W WO2022192381

(87)【国際公開日】2022-09-15

(31)【優先権主張番号】63/158,738

(32)【優先日】2021-03-09

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(31)【優先権主張番号】63/176,021

(32)【優先日】2021-04-16

(33)【優先権主張国・地域又は機関】US

(81)【指定国・地域】

(71)【出願人】

【識別番号】518015608

【氏名又は名称】アーバー バイオテクノロジーズ， インコーポレイテッド

(74)【代理人】

【識別番号】100078282

【弁理士】

【氏名又は名称】山本 秀策

(74)【代理人】

【識別番号】100113413

【弁理士】

【氏名又は名称】森下 夏樹

(74)【代理人】

【識別番号】100181674

【弁理士】

【氏名又は名称】飯田 貴敏

(74)【代理人】

【識別番号】100181641

【弁理士】

【氏名又は名称】石川 大輔

(74)【代理人】

【識別番号】230113332

【弁護士】

【氏名又は名称】山本 健策

(72)【発明者】

【氏名】チョン， シャオロン

(72)【発明者】

【氏名】ルー， ウェイ－チェン

(72)【発明者】

【氏名】ヒルバート， ブレンダン ジェイ

(72)【発明者】

【氏名】ウェッセルズ， キントン ノーマン

(72)【発明者】

【氏名】アルフォンス， ローレン イー．

(72)【発明者】

【氏名】ギャリティ， アンソニー ジェイムズ

【テーマコード（参考）】

4B065

【Ｆターム（参考）】

4B065AA93X

4B065AB01

4B065BA01

4B065BA02

4B065BA05

4B065CA46

(57)【要約】

本発明は、変異体ポリペプチド、変異体ポリペプチドを調製する方法、変異体ポリペプチド、変異体ポリペプチドを含む組成物及び細胞を特性化するためのプロセス、並びに変異体ポリペプチドを使用する方法に関する。本発明は、変異体ポリペプチドを含む複合体、複合体を製造するための方法、複合体、複合体を含む細胞を特性化するためのプロセス、並びに複合体を使用する方法に更に関する。

【特許請求の範囲】

【請求項1】

配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、変異体ポリペプチド。

【請求項2】

前記変異体ポリペプチドが、配列番号３の親ポリペプチドの変異体である、請求項１に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項3】

前記変異体ポリペプチドが、表２の置換を含む、請求項１又は２に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項4】

前記変異体ポリペプチドが、次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項5】

配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、且つ配列番号３と比べてＥ３８、Ｔ６０、Ｄ８９、Ｓ２２３、Ｅ３１９、Ｐ３５３、Ｌ３５４、Ｑ３５５、Ｄ３５６、Ｎ３５７、Ｎ３５８、Ｑ３５９、Ｌ３６０、Ｋ３６８、Ｑ４２１、Ｔ４８０、Ｄ４８２、Ｎ５０１、Ｌ５２３、Ｑ５５６、Ｖ５５７、Ｅ５６６、Ｅ５７１、Ｎ５７９、Ｅ５８６、Ｅ５８９、Ｎ６２０、Ｑ６８３、Ｓ７２２、及びＤ７３０の位置のうちの１つ以上で置換を含むアミノ酸配列を含む、変異体ポリペプチド。

【請求項6】

配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有し、且つ次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含むアミノ酸配列を含む、変異体ポリペプチド。

【請求項7】

配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の前記配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項8】

配列番号３９に記載の前記配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項9】

配列番号５１に記載の前記配列を含む、請求項１～７のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項10】

前記変異体ポリペプチドが、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドとの二成分複合体形成の増加を示す、請求項１～９のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項11】

前記変異体ポリペプチドを含む二成分複合体が、親二成分複合体と比べて安定性の増加を示す、請求項１～１０のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項12】

前記変異体ポリペプチドが、親ポリペプチドと比べてヌクレアーゼ活性の増加を示す、請求項１～１１のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド。

【請求項13】

請求項１～１２のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドを含む組成物であって、前記組成物が、ＲＮＡガイド又は前記ＲＮＡガイドをコードする核酸を更に含み、前記ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む、組成物。

【請求項14】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９０％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項15】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項16】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７の配列を含む、請求項１３に記載の組成物。

【請求項17】

前記スペーサー配列が、約１５ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを含む、請求項１３～１６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項18】

前記スペーサー配列が標的核酸の標的鎖配列に結合し、前記標的核酸配列の非標的鎖配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する、請求項１３～１７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項19】

前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’であり、式中、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＲがＡ又はＧである、請求項１８に記載の組成物。

【請求項20】

前記ＰＡＭ配列が、５’－ＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、又は５’－ＡＴＴＧ－３’である、請求項１９に記載の組成物。

【請求項21】

前記変異体ポリペプチドが、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む、請求項１～２０のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は組成物。

【請求項22】

前記変異体ポリペプチドが、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は組成物。

【請求項23】

請求項１～２２のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド及び／又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む、組成物。

【請求項24】

前記核酸が、細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項２３に記載の組成物。

【請求項25】

前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項２３又は２４に記載の組成物。

【請求項26】

前記核酸が、ベクター内にある、請求項２３～２５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項27】

前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項２６に記載の組成物。

【請求項28】

前記変異体ポリペプチドが、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達系中に存在する、請求項１～２７のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は組成物。

【請求項29】

請求項１～２８のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は組成物を含む、細胞。

【請求項30】

前記細胞が、真核生物細胞である、請求項２９に記載の細胞。

【請求項31】

前記細胞が、哺乳動物細胞又は植物細胞である、請求項２９又は３０に記載の細胞。

【請求項32】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２９～３１のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項33】

変異体ポリペプチド又は前記変異体ポリペプチドを含む複合体を含む組成物であって、前記変異体ポリペプチドが、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、前記変異体ポリペプチド又は前記複合体が、親ポリペプチド又は前記親ポリペプチドを含む複合体と比べて、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す、組成物。

【請求項34】

前記変異体ポリペプチドが、表２の置換を含む、請求項３３に記載の組成物。

【請求項35】

前記変異体ポリペプチドが、次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含む、請求項３３又は３４に記載の組成物。

【請求項36】

前記変異体ポリペプチドが、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の前記配列を含む、請求項３３～３５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項37】

前記変異体ポリペプチドが、配列番号３９に記載の前記配列を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項38】

前記変異体ポリペプチドが、配列番号５１に記載の前記配列を含む、請求項３３～３６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項39】

前記酵素活性の増強が、ヌクレアーゼ活性の増強である、請求項３３～３８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項40】

前記変異体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドへの結合活性の増強を示す、請求項３３～３９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項41】

前記変異体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す、請求項３３～４０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項42】

前記変異体ポリペプチドを含む前記複合体が、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、前記変異体二成分複合体が、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合活性の増強（例えば、オンターゲット結合活性）を示す、請求項３３～４１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項43】

前記変異体ポリペプチドを含む前記複合体が、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、前記変異体二成分複合体が、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す、請求項３３～４２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項44】

前記変異体ポリペプチドを含む前記複合体が、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、前記変異体二成分複合体が、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す、請求項３３～４３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項45】

前記変異体二成分複合体と標的核酸とが変異体三成分複合体を形成し、前記変異体三成分複合体が、親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す、請求項３３～４４のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項46】

前記変異体ポリペプチドが、前記親ポリペプチドと比べて二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す、請求項３３～４５のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項47】

前記変異体二成分複合体が、前記親二成分複合体と比べて標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す、請求項３３～４６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項48】

前記酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、例えば、２０℃～６５℃の範囲の温度にわたって生じる、請求項３３～４７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項49】

前記酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、ある範囲のインキュベーション時間にわたって生じる、請求項３３～４８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項50】

前記酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる、請求項３３～４９のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項51】

前記酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強が、前記変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が前記親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体の前記Ｔ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる、請求項３３～５０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項52】

前記変異体ポリペプチドが、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む、請求項３３～５１のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項53】

前記親ポリペプチドが、前記配列番号３の配列を含む、請求項３３～５２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項54】

前記ＲＮＡガイドが、ダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む、請求項３３～５３のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項55】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９０％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項56】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項57】

前記ダイレクトリピート配列が、配列番号４若しくは配列番号５であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７の配列を含む、請求項５４に記載の組成物。

【請求項58】

前記スペーサー配列が、１５～３５ヌクレオチドの長さを含む、請求項５４～５７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項59】

前記スペーサー配列が、標的核酸の標的鎖配列に対して相補性を含む、請求項５４～５８のいずれか１つに記載の組成物。

【請求項60】

前記標的核酸が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する非標的鎖配列を含む、請求項５９に記載の組成物。

【請求項61】

前記ＰＡＭ配列が、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’であり、式中、Ｎが任意のヌクレオチドであり、ＲがＡ又はＧである、請求項６０に記載の組成物。

【請求項62】

前記ＰＡＭ配列が、５’－ＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、又は５’－ＡＴＴＧ－３’である、請求項６１に記載の組成物。

【請求項63】

前記変異体ポリペプチドが、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む、請求項３３～６２のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項64】

請求項１～１２又は３３～６３のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物であって、任意選択で、前記核酸が、細胞中の発現のためにコドン最適化されている、組成物。

【請求項65】

前記細胞が、真核生物細胞である、請求項６４に記載の組成物。

【請求項66】

前記細胞が、哺乳動物細胞又は植物細胞である、請求項６４又は６５に記載の組成物。

【請求項67】

前記細胞が、ヒト細胞である、請求項６４～６６のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項68】

前記変異体ポリペプチドをコードする前記核酸が、プロモーターに作動可能に連結されている、請求項６４～６７のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項69】

前記変異体ポリペプチドをコードする前記核酸が、ベクター内にある、請求項６４～６８のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項70】

前記ベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項６９に記載の組成物。

【請求項71】

前記組成物が、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する、請求項３３～７０のいずれか一項に記載の組成物。

【請求項72】

細胞中で遺伝子を編集するための方法であって、前記方法が、前記細胞を請求項１～２８又は３３～７１のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチド又は組成物と接触させることを含む、方法。

【請求項73】

請求項１～１２、２１又は２２のいずれか一項に記載の変異体ポリペプチドをコードする、核酸分子。

【請求項74】

前記核酸分子の前記配列が、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列に対して９５％同一である、請求項７３に記載の核酸分子。

【請求項75】

配列番号３９の変異体ポリペプチドをコードする核酸分子であって、前記核酸分子の前記配列が、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列に対して９５％同一である、核酸分子。

【請求項76】

前記核酸分子の前記配列が、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列を含む、請求項７５に記載の核酸分子。

【発明の詳細な説明】

【技術分野】

【0001】

関連出願
本出願は、２０２１年３月９日に出願された米国仮特許出願第６３／１５８，７３８号及び２０２１年４月１６日に出願された米国仮特許出願第６３／１７６，０２１号に対する優先権を主張するものであり、これらの各々の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。

【0002】

配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０２２年３月７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは、Ａ２１８６－７０４５ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔと名前が付けられ、サイズは２９１，５０３バイトである。

【背景技術】

【0003】

クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子は、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムと総称され、特定の種を外来の遺伝因子から防御する古細菌及び細菌における適応免疫系である。

【発明の概要】

【課題を解決するための手段】

【0004】

本発明は、上記の背景技術に対して、先行技術を超えるある特定の利点及び進歩を提供する。

【0005】

本明細書に開示される本発明は、特定の利点又は機能性に限定されるものではないが、本発明は、いくつかの態様では、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む変異体ポリペプチドを提供する。

【0006】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３の親ペプチドの変異体である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表２の置換を含む。

【0007】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含む。

【0008】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３に対してＥ３８、Ｔ６０、Ｄ８９、Ｓ２２３、Ｅ３１９、Ｐ３５３、Ｌ３５４、Ｑ３５５、Ｄ３５６、Ｎ３５７、Ｎ３５８、Ｑ３５９、Ｌ３６０、Ｋ３６８、Ｑ４２１、Ｔ４８０、Ｄ４８２、Ｎ５０１、Ｌ５２３、Ｑ５５６、Ｖ５５７、Ｅ５６６、Ｅ５７１、Ｎ５７９、Ｅ５８６、Ｅ５８９、Ｎ６２０、Ｑ６８３、Ｓ７２２、及びＤ７３０の位置のうちの１つ以上で置換を含む変異体ポリペプチドを提供する。

【0009】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含む変異体ポリペプチドを提供する。

【0010】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５１に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて、ＲＮＡガイドとの二成分複合体形成の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体は、親二成分複合体と比べて、安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて、ヌクレアーゼ活性の増加を示す。

【0011】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチドを含む組成物を提供し、組成物はＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドをコードする核酸を更に含み、ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む。

【0012】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９０％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７の配列を含む。

【0013】

いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、約１５ヌクレオチド～約３５ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的核酸の標的鎖配列に結合し、標的核酸配列の非標的鎖配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接している。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３であり、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＲはＡ又はＧである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、又は５’－ＡＴＴＧ－３’である。

【0014】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を更に含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0015】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチド及び／又はＲＮＡガイドをコードする核酸を含む組成物を提供する。

【0016】

いくつかの実施形態では、核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。いくつかの実施形態では、核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、核酸は、ベクター内にある。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージミドベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達系中に存在する。

【0017】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチド又は組成物を含む細胞を提供する。

【0018】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0019】

いくつかの態様では、本開示は、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体を含む組成物を提供し、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列に対して、少なくとも９５％の同一性を有する配列を含み、変異体ポリペプチド又は複合体は、親ポリペプチド又は親ポリペプチドを含む複合体と比べて、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0020】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表２の置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、次の置換：Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｅ３１９Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｔ４８０Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、Ｌ５２３Ｋ、Ｑ５５６Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｖ５５７Ｒ、Ｅ５６６Ｋ、Ｅ５６６Ｒ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｅ５８９Ｋ、Ｎ６２０Ｒ、Ｑ６８３Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、及びＤ７３０Ｒのうちの１つ以上を含む。

【0021】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３９に記載の配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５１に記載の配列を含む。

【0022】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドを含む複合体は、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合活性の増強（例えば、オンターゲット結合活性）を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドを含む複合体は、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドを含む複合体は、ＲＮＡガイドを更に含む変異体二成分複合体であり、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体と標的核酸は、変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて、二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて、標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す。

【0023】

いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定の範囲の温度にわたって、例えば、２０℃～６５℃で生じる。いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定の範囲のインキュベーション時間にわたって生じる。いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる。いくつかの実施形態では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる。

【0024】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む。いくつかの実施形態では、親ポリペプチドは、配列番号３の配列を含む。

【0025】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９０％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９０％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５に対して少なくとも９５％同一であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７に対して少なくとも９５％の同一性を有する配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４若しくは配列番号５であるか、又は配列番号６若しくは配列番号７の配列を含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチドの長さを含む。いくつかの実施形態では、スペーサー配列は、標的核酸の標的鎖配列に対する相補性を含む。

【0026】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接する非標的鎖配列を含む。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’であり、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＲはＡ又はＧである。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＴＡ－３’、又は５’－ＡＴＴＧ－３’である。

【0027】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ガイド制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0028】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチドをコードする核酸を含む組成物を提供し、任意選択で、核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0029】

いくつかの実施形態では、細胞は、真核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。

【0030】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内にある。いくつかの実施形態では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。

【0031】

いくつかの実施形態では、組成物は、ナノ粒子（例えば、脂質ナノ粒子）、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

【0032】

いくつかの態様では、本開示は、細胞中で遺伝子を編集するための方法を提供し、本方法は、細胞を本明細書に記載されるような変異体ポリペプチド又は組成物と接触させることを含む。

【0033】

いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。

【0034】

いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列に対して９５％同一である。

【0035】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３９の変異体ポリペプチドをコードする核酸分子を提供し、核酸分子の配列は、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列に対して９５％同一である。

【0036】

いくつかの実施形態では、核酸分子の配列は、配列番号５９～６６からなる群から選択される配列を含む。

【0037】

本明細書に開示される本発明は、特定の利点又は機能性に限定されるものではないが、本発明は、変異体ポリペプチド、及び／又は変異体ポリペプチドを含む組成物を提供し、変異体ポリペプチドは、配列番号３の親ポリペプチドと比べて改変を含み、変異体ポリペプチド又は変異体ポリペプチドを含む複合体は、親ポリペプチド又は親ポリペプチドを含む複合体と比べて、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0038】

いくつかの態様では、酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である。

【0039】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す。

【0040】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す。

【0041】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合活性の増強（例えば、オンターゲット結合活性）を示す。

【0042】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す。

【0043】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す。

【0044】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体と標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す。

【0045】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて、二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す。

【0046】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて、標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す。

【0047】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定の温度範囲にわたって、例えば、２０℃～６５℃にわたって生じる。

【0048】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定のインキュベーション時間にわたって生じる。

【0049】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる。

【0050】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる。

【0051】

他の態様では、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比べてアミノ酸配列の改変を含み、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比較すると、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上）の置換、挿入、欠失、及び／又は付加を含む。

【0052】

いくつかの態様では、改変は、配列番号３に記載の親ポリペプチド配列に比べてアミノ酸配列の改変を含み、改変は、表２に列挙されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。

【0053】

いくつかの態様では、改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、又はグリシンの置換を含む。

【0054】

いくつかの態様では、改変は、Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｅ５６６Ｒ、及び／又はＤ７３０Ｒの置換を含む。

【0055】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１のいずれか１つに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0056】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１のいずれか１つに対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0057】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。

【0058】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む。

【0059】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ３３６又はＥ５４５を含む。いくつかの態様では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ６９５、Ｄ６６１、又はＤ６３６を含む。

【0060】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドを含む組成物又は複合体は、ＲＮＡガイドを更に含み、ＲＮＡガイドはダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む。

【0061】

いくつかの態様では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４又は配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0062】

いくつかの態様では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0063】

いくつかの態様では、スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチドの長さを含む。

【0064】

いくつかの態様では、標的核酸は、スペーサー配列中のヌクレオチド配列に対する配列相補性を含む。

【0065】

いくつかの態様では、標的核酸は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列に隣接し、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’として記載のヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＲはＡ又はＧである。いくつかの態様では、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＴＧ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含む。

【0066】

いくつかの態様では、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである。

【0067】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0068】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0069】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0070】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内にある。

【0071】

いくつかの態様では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。

【0072】

いくつかの態様では、組成物は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

【0073】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ３８Ｒ置換を含む、変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ３８Ｒ置換を更に含む。

【0074】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ３８の位置で置換を含む（例えば、Ｅ３８Ｒ置換）ポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ３８の位置での置換（例えば、Ｅ３８Ｒ置換）を含む。

【0075】

本発明はなお、配列番号３と比べてＴ６０Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＴ６０Ｒ置換を更に含む。

【0076】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＴ６０の位置での置換（例えば、Ｔ６０Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＴ６０の位置での置換（例えば、Ｔ６０Ｒ置換）を含む。

【0077】

本発明はなお、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換を更に含む。

【0078】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＤ８９の位置での置換（例えば、Ｄ８９Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＤ８９の位置での置換（例えば、Ｄ８９Ｒ置換）を含む。

【0079】

本発明はなお、配列番号３と比べてＳ２２３Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＳ２２３Ｒ置換を更に含む。

【0080】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＳ２２３の位置での置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＳ２２３の位置での置換（例えば、Ｓ２２３Ｒ置換）を含む。

【0081】

本発明はなお、配列番号３と比べてＰ３５３Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＰ３５３Ｇ置換を更に含む。

【0082】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＰ３５３の位置での置換（例えば、Ｐ３５３Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＰ３５３の位置での置換（例えば、Ｐ３５３Ｇ置換）を含む。

【0083】

本発明はなお、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換を更に含む。

【0084】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＬ３５４の位置での置換（例えば、Ｌ３５４Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＬ３５４の位置での置換（例えば、Ｌ３５４Ｇ置換）を含む。

【0085】

本発明はなお、配列番号３と比べてＬ３６０Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＬ３６０Ｇ置換を更に含む。

【0086】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＬ３６０の位置での置換（例えば、Ｌ３６０Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＬ３６０の位置での置換（例えば、Ｌ３６０Ｇ置換）を含む。

【0087】

本発明はなお、配列番号３と比べてＫ３６８Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＫ３６８Ｇ置換を更に含む。

【0088】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＫ３６８の位置での置換（例えば、Ｋ３６８Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＫ３６８の位置での置換（例えば、Ｋ３６８Ｇ置換）を含む。

【0089】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５６６Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５６６Ｒ置換を更に含む。

【0090】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５６６の位置での置換（例えば、Ｅ５６６Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５６６の位置での置換（例えば、Ｅ５６６Ｒ置換）を含む。

【0091】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５６６Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５６６Ｋ置換を更に含む。

【0092】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５６６の位置での置換（例えば、Ｅ５６６Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５６６の位置での置換（例えば、Ｅ５６６Ｋ置換）を含む。

【0093】

本発明はなお、配列番号３と比べてＤ７３０Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＤ７３０Ｒ置換を更に含む。

【0094】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＤ７３０の位置での置換（例えば、Ｄ７３０Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＤ７３０の位置での置換（例えば、Ｄ７３０Ｒ置換）を含む。

【0095】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ３１９Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ３１９Ｒ置換を更に含む。

【0096】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ３１９の位置での置換（例えば、Ｅ３１９Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ３１９の位置での置換（例えば、Ｅ３１９Ｒ置換）を含む。

【0097】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ３５５Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ３５５Ｇ置換を更に含む。

【0098】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ３５５の位置での置換（例えば、Ｑ３５５Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ３５５の位置での置換（例えば、Ｑ３５５Ｇ置換）を含む。

【0099】

本発明はなお、配列番号３と比べてＤ３５６Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＤ３５６Ｇ置換を更に含む。

【0100】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＤ３５６の位置での置換（例えば、Ｄ３５６Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＤ３５６の位置での置換（例えば、Ｄ３５６Ｇ置換）を含む。

【0101】

本発明はなお、配列番号３と比べてＮ３５７Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＮ３５７Ｇ置換を更に含む。

【0102】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＮ３５７の位置での置換（例えば、Ｎ３５７Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＮ３５７の位置での置換（例えば、Ｎ３５７Ｇ置換）を含む。

【0103】

本発明はなお、配列番号３と比べてＮ３５８Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＮ３５８Ｇ置換を更に含む。

【0104】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＮ３５８の位置での置換（例えば、Ｎ３５８Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＮ３５８の位置での置換（例えば、Ｎ３５８Ｇ置換）を含む。

【0105】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ３５９Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ３５９Ｇ置換を更に含む。

【0106】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ３５９の位置での置換（例えば、Ｑ３５９Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ３５９の位置での置換（例えば、Ｑ３５９Ｇ置換）を含む。

【0107】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ４２１Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ４２１Ｒ置換を更に含む。

【0108】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ４２１の位置での置換（例えば、Ｑ４２１Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ４２１の位置での置換（例えば、Ｑ４２１Ｒ置換）を含む。

【0109】

本発明はなお、配列番号３と比べてＴ４８０Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＴ４８０Ｋ置換を更に含む。

【0110】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＴ４８０の位置での置換（例えば、Ｔ４８０Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＴ４８０の位置での置換（例えば、Ｔ４８０Ｋ置換）を含む。

【0111】

本発明はなお、配列番号３と比べてＤ４８２Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＤ４８２Ｋ置換を更に含む。

【0112】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＤ４８２の位置での置換（例えば、Ｄ４８２Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＤ４８２の位置での置換（例えば、Ｄ４８２Ｋ置換）を含む。

【0113】

本発明はなお、配列番号３と比べてＮ５０１Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＮ５０１Ｋ置換を更に含む。

【0114】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＮ５０１の位置での置換（例えば、Ｎ５０１Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＮ５０１の位置での置換（例えば、Ｎ５０１Ｋ置換）を含む。

【0115】

本発明はなお、配列番号３と比べてＬ５２３Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＬ５２３Ｒ置換を更に含む。

【0116】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＬ５２３の位置での置換（例えば、Ｌ５２３Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＬ５２３の位置での置換（例えば、Ｌ５２３Ｒ置換）を含む。

【0117】

本発明はなお、配列番号３と比べてＬ５２３Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＬ５２３Ｋ置換を更に含む。

【0118】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＬ５２３の位置での置換（例えば、Ｌ５２３Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＬ５２３の位置での置換（例えば、Ｌ５２３Ｋ置換）を含む。

【0119】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ５５６Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ５５６Ｒ置換を更に含む。

【0120】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ５５６の位置での置換（例えば、Ｑ５５６Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ５５６の位置での置換（例えば、Ｑ５５６Ｒ置換）を含む。

【0121】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ５５６Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ５５６Ｋ置換を更に含む。

【0122】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ５５６の位置での置換（例えば、Ｑ５５６Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ５５６の位置での置換（例えば、Ｑ５５６Ｋ置換）を含む。

【0123】

本発明はなお、配列番号３と比べてＶ５５７Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＶ５５７Ｒ置換を更に含む。

【0124】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＶ５５７の位置での置換（例えば、Ｖ５５７Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＶ５５７の位置での置換（例えば、Ｖ５５７Ｒ置換）を含む。

【0125】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５７１Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５７１Ｒ置換を更に含む。

【0126】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５７１の位置での置換（例えば、Ｅ５７１Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５７１の位置での置換（例えば、Ｅ５７１Ｒ置換）を含む。

【0127】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５７１Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５７１Ｋ置換を更に含む。

【0128】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５７１の位置での置換（例えば、Ｅ５７１Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５７１の位置での置換（例えば、Ｅ５７１Ｋ置換）を含む。

【0129】

本発明はなお、配列番号３と比べてＮ５７９Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＮ５７９Ｋ置換を更に含む。

【0130】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＮ５７９の位置での置換（例えば、Ｎ５７９Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＮ５７９の位置での置換（例えば、Ｎ５７９Ｋ置換）を含む。

【0131】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５８６Ｇ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５８６Ｇ置換を更に含む。

【0132】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５８６の位置での置換（例えば、Ｅ５８６Ｇ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５８６の位置での置換（例えば、Ｅ５８６Ｇ置換）を含む。

【0133】

本発明はなお、配列番号３と比べてＥ５８９Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＥ５８９Ｋ置換を更に含む。

【0134】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＥ５８９の位置での置換（例えば、Ｅ５８９Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＥ５８９の位置での置換（例えば、Ｅ５８９Ｋ置換）を含む。

【0135】

本発明はなお、配列番号３と比べてＮ６２０Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＮ６２０Ｒ置換を更に含む。

【0136】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＮ６２０の位置での置換（例えば、Ｎ６２０Ｒ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＮ６２０の位置での置換（例えば、Ｎ６２０Ｒ置換）を含む。

【0137】

本発明はなお、配列番号３と比べてＱ６８３Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＱ６８３Ｋ置換を更に含む。

【0138】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＱ６８３の位置での置換（例えば、Ｑ６８３Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＱ６８３の位置での置換（例えば、Ｑ６８３Ｋ置換）を含む。

【0139】

本発明はなお、配列番号３と比べてＳ７２２Ｋ置換を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９５％の同一性を含み、配列番号３と比べてＳ７２２Ｋ置換を更に含む。

【0140】

いくつかの態様では、本開示は、配列番号３に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、配列番号３と比べてＳ７２２の位置での置換（例えば、Ｓ７２２Ｋ置換）を含むポリペプチドを提供する。いくつかの態様では、本開示は、配列番号３の最大１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、又は３５個のアミノ酸位置で１つ以上の配列改変（例えば、置換、挿入、又は欠失、若しくはそれらの任意の組み合わせ）を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供し、配列改変のうちの１つは、配列番号３と比べてＳ７２２の位置での置換（例えば、Ｓ７２２Ｋ置換）を含む。

【0141】

本発明はなお、配列番号１４のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号１５のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号１６のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号１７のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号１８のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号１９のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２０のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２１のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２２のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２３のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２４のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２５のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２６のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２７のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２８のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号２９のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３０のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３１のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３２のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３３のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３４のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３５のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３６のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３７のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３８のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号３９のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号４０のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。本発明はなお、配列番号４１のアミノ酸配列を含む変異体ポリペプチドを更に提供する。

【0142】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は組成物を含む細胞を更に提供する。いくつかの態様では、細胞は、真核生物細胞又は原核生物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。

【0143】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は組成物を調製する方法を更に提供する。

【0144】

本発明は、本明明細書に開示される変異体ポリペプチドをＲＮＡガイドと複合体化する方法を更に提供する。

【0145】

本発明は、本明細書に開示される変異体二成分複合体を標的核酸と複合体化する方法を更に提供する。

【0146】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は組成物を送達する方法を更に提供する。

【0147】

本発明はなお、変異体ポリペプチドを含む組成物、又は変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む複合体を更に提供し、変異体ポリペプチドは、配列番号３の親ポリペプチドと比べて改変を含み、変異体ポリペプチド又は複合体は、親ポリペプチド又は親ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む複合体と比べて酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す。

【0148】

いくつかの態様では、酵素活性の増強は、ヌクレアーゼ活性の増強である。

【0149】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合活性の増強を示す。

【0150】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べてＲＮＡガイドに対する結合特異性の増強を示す。

【0151】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合活性の増強（例えば、オンターゲット結合活性）を示す。

【0152】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸に対する結合特異性の増強（例えば、オンターゲット結合特異性）を示す。

【0153】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、変異体二成分複合体を形成し、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて安定性の増強を示す。

【0154】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体と標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成し、変異体三成分複合体は、親三成分複合体と比べて安定性の増加を示す。

【0155】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて二成分複合体形成の増強、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強、及び／又はＲＮＡガイドからの解離の減少を更に示す。

【0156】

いくつかの態様では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体と比べて標的核酸からの解離の減少、及び／又は非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を更に示す。

【0157】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定の範囲の温度にわたって、例えば、２０℃～６５℃にわたって生じる。

【0158】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、所定のインキュベーション時間にわたって生じる。

【0159】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で生じる。

【0160】

いくつかの態様では、酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強は、変異体ポリペプチド、変異体二成分複合体、又は変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチド、親二成分複合体、又は親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃高い場合に生じる。

【0161】

他の態様では、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比べてアミノ酸配列改変を含み、改変は、配列番号３に記載の配列を有する親ポリペプチドと比較すると、１つ以上（例えば、１個、２個、３個、４個、５個、又はそれ以上）の置換、挿入、欠失、及び／又は付加を含む。

【0162】

いくつかの態様では、改変は、配列番号３に記載の親ポリペプチド配列と比べてアミノ酸配列改変を含み、改変は、表２に列挙されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。

【0163】

いくつかの態様では、改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アラニン、又はグリシンの置換を含む。

【0164】

いくつかの態様では、改変は、Ｅ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｅ５６６Ｒ、及び／又はＤ７３０Ｒの置換を含む。

【0165】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、ＲｕｖＣドメイン又はスプリットＲｕｖＣドメインを含む。

【0166】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、１つ以上の触媒残基（例えば、アスパラギン酸又はグルタミン酸）を含む。いくつかの態様では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ３３６及びＥ５４５を含む。いくつかの態様では、１つ以上の触媒残基は、Ｄ６９５、Ｄ６６１、又はＤ６３６を含む。

【0167】

いくつかの態様では、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列とスペーサー配列とを含む。

【0168】

いくつかの態様では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４又は配列番号５に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。

【0169】

いくつかの態様では、ダイレクトリピート配列は、配列番号４又は配列番号５のヌクレオチド配列を含む。

【0170】

いくつかの態様では、スペーサー配列は、１５～３５ヌクレオチドの長さを含む。

【0171】

いくつかの態様では、標的核酸は、スペーサー配列中のヌクレオチド配列に対する配列相補性を含む。

【0172】

いくつかの態様では、標的核酸はＰＡＭ配列に隣接しており、ＰＡＭ配列は、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含み、式中、Ｎは任意のヌクレオチドであり、ＲはＡ又はＧである。いくつかの態様では、ＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＴＧ－３’として記載されるヌクレオチド配列を含む。

【0173】

いくつかの態様では、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ又は二本鎖ＤＮＡである。

【0174】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、ペプチドタグ、蛍光タンパク質、塩基編集ドメイン、ＤＮＡメチル化ドメイン、ヒストン残基修飾ドメイン、局在化因子、転写修飾因子、光ゲート制御因子、化学誘導性因子、又はクロマチン可視化因子を更に含む。

【0175】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、細胞における発現のためにコドン最適化されている。

【0176】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、プロモーターに作動可能に連結されている。

【0177】

いくつかの態様では、変異体ポリペプチドをコードする核酸は、ベクター内にある。

【0178】

いくつかの態様では、ベクターは、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ファージベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、又は単純ヘルペスウイルスベクターを含む。

【0179】

いくつかの態様では、組成物又は複合体は、ナノ粒子、リポソーム、エクソソーム、マイクロベシクル、又は遺伝子銃を含む送達組成物中に存在する。

【0180】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は複合体を含む細胞を更に提供する。いくつかの態様では、細胞は、真核生物細胞又は原核生物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、哺乳動物細胞又は植物細胞である。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。

【0181】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は複合体を調製する方法を更に提供する。

【0182】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチドをＲＮＡガイドと複合体化する方法を更に提供する。

【0183】

本発明は、本明細書に開示される変異体二成分複合体を標的核酸と複合体化する方法を更に提供する。

【0184】

本発明は、本明細書に開示される変異体ポリペプチド及び／又は複合体を送達する方法を更に提供する。

【0185】

定義
本発明は、特定の実施形態に関してまた、ある特定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。以降に記載されるような用語は、別段の記載がない限り、一般に常識で理解されるべきである。

【0186】

別段の定めがない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。いずれかの潜在的曖昧性の場合には、本明細書で提供される定義が、あらゆる辞書又は外部の定義よりも先行する。文脈上他の意味に解する場合を除き、単数形用語には複数形が含まれるものとし、複数形用語には単数形が含まれるものとする。「又は」の使用は、特に明記されない限り、「及び／又は」を意味する。「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語、並びに他の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は限定的ではない。

【0187】

一般に、本明細書に記載される細胞及び組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学、並びにタンパク質及び核酸化学、並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は周知であり、当該技術分野において一般的に使用されている。本明細書に提供される方法及び技術は、特に明記されない限り、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書の全体を通して引用され、議論されている様々な一般的でより具体的な参考文献で記載されているように実施される。酵素反応及び精製技術は、当該技術分野において一般に達成されているか、又は本明細書に記載されているように、製造元の仕様に従って実施される。本明細書に記載の合成化学、合成有機化学、及び医薬品化学並びに創薬化学に関連して使用される命名法、及び実験室手順並びに技術は当該技術分において周知であり、一般的に使用されているものである。標準的な技術が化学合成、化学分析、医薬品の調製、製剤化、及び送達、並びに患者の治療のために使用される。

【0188】

以下に定義される用語を選択すると、本開示はより容易に理解され得る。

【0189】

「ａ」及び「ａｎ」という冠詞は、１つ又は２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）の項目の文法的対象物を指す。例として、「ａｎ ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」は、１つの要素又は２つ以上の要素を意味する。

【0190】

例えば、量、持続時間などの測定可能な値を指す場合に本明細書で使用される「約」は、±２０％又は±１０％、より好ましくは±５％、更により好ましくは±１％、及びなお更に好ましくは±０．１％の指定値からの変動を包含することを意味し、そのような変動は、開示された方法を実施するために適切である。

【0191】

本明細書で使用される場合、「活性」という用語は、生物学的活性を指す。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性は、酵素活性、例えば、ヌクレアーゼの触媒能を含む。例えば、ヌクレアーゼ活性は、ヌクレアーゼ活性を含み得る。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ活性は、結合活性、例えば、ＲＮＡガイド及び／又は標的核酸に対するヌクレアーゼの結合活性を含む。

【0192】

本明細書で使用される場合、「複合体」という用語は、２つ以上の分子のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、複合体は、互いに相互作用する（例えば、結合する、接触する、付着する）ポリペプチドと核酸分子とを含む。

【0193】

本明細書で使用される場合、「二成分複合体」という用語は、２つの分子（例えば、ポリペプチドと核酸分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、二成分複合体は、ポリペプチドと標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド）とのグループ化を指す。いくつかの実施形態では、二成分複合体は、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）を指す。本明細書で使用される場合、「変異体二成分複合体」という用語は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとのグループ化を指す。本明細書で使用される場合、「親二成分複合体」という用語は、親ポリペプチドとＲＮＡガイド又は参照ポリペプチドとＲＮＡガイドとのグループ化を指す。

【0194】

本明細書で使用される場合、「三成分複合体」という用語は、３つの分子（例えば、ポリペプチドと２つの核酸分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、「三成分複合体」は、ポリペプチド、ＲＮＡ分子、及びＤＮＡ分子のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、三成分複合体は、ポリペプチド、標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド）、及び標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ分子）のグループ化を指す。いくつかの実施形態では、「三成分複合体」は、二成分複合体（例えば、リボ核タンパク質）と第３の分子（例えば、標的核酸）とのグループ化を指す。

【0195】

本明細書で使用される場合、「ドメイン」という用語は、ポリペプチドの別個の機能及び／又は構造単位を指す。いくつかの実施形態では、ドメインは、保存されたアミノ酸配列を含み得る。

【0196】

本明細書で使用される場合、「親」、「親ポリペプチド」、及び「親配列」という用語は、本発明の変異体ポリペプチドを産生するために、改変が行われる元のポリペプチド（例えば、参照又は出発ポリペプチド）を指す。

【0197】

本明細書で使用される場合、「プロトスペーサー隣接モチーフ」又は「ＰＡＭ」という用語は、エフェクター（例えば、ヌクレアーゼ）及びＲＮＡガイドを含む複合体が結合する標的配列に隣接するＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは酵素活性に必要とされる。「標的核酸」は二本鎖分子であり、一方の鎖はＰＡＭに隣接する標的配列を含み、「ＰＡＭ鎖」（例えば、非標的鎖又は非スペーサー相補鎖）と称され、他方の相補鎖は「非ＰＡＭ鎖」（例えば、標的鎖又はスペーサー相補鎖）と称される。本明細書で使用される場合、「隣接する」という用語は、複合体のＲＮＡガイドがＰＡＭに直接隣接している標的配列と特異的に結合し、相互作用し、又は会合する場合が含まれる。そのような場合、標的配列とＰＡＭとの間には、ヌクレオチドは存在しない。「隣接する」という用語はまた、標的化部分が結合する標的配列とＰＡＭとの間に少数（例えば、１、２、３、４、又は５個）のヌクレオチドが存在する場合も含む。

【0198】

本明細書で使用される場合、「参照組成物」、「参照分子」、「参照配列」、及び「参照」は、陰性対照又は親（例えば、親配列、親タンパク質、又は野生型タンパク質）などの対照を指す。例えば、参照分子は、それに対して変異体ポリペプチドが比較されるポリペプチドを指す。同様に、参照ＲＮＡガイドは、それに対して修飾ＲＮＡガイドが比較される標的部分を指す。変異体又は改変分子は、配列に基づいて（例えば、変異体又は改変分子は、参照分子とＸ％の配列同一性又は相動性を有し得る）、熱安定性に基づいて、又は活性に基づいて（例えば、変異体又は改変分子は、参照分子のＸ％の活性であり得る）、参照分子に対して比較され得る。例えば、変異体又は改変分子は、参照ポリペプチドの１０％以下の活性を有すると特徴付けられてもよく、又は参照ポリペプチドの少なくとも１０％を超える活性を有すると特徴付けられてもよい。参照ポリペプチドの例としては、天然に存在する未修飾ポリペプチド、例えば、古細菌又は細菌種からの天然に存在するポリペプチドが含まれる。ある特定の実施形態では、参照ポリペプチドは、比較されている変異体ポリペプチドと最も近い配列同一性又は相動性を有する天然に存在するポリペプチドである。ある特定の実施形態では、参照ポリペプチドは、変異体ポリペプチドに行き着くために、突然変異が行われた天然に存在するか又は既知の配列を有する親分子である。

【0199】

本明細書で使用される場合、「ＲＮＡ」ガイド又は「ＲＮＡガイド配列」という用語は、本明細書に記載のポリペプチドの標的核酸への標的化を容易にする任意のＲＮＡ分子を指す。例えば、ＲＮＡガイドは、標的核酸を認識する（例えば、それに結合する）分子であり得る。ＲＮＡガイドは、標的核酸配列の標的鎖（例えば、非ＰＡＭ鎖）に対して相補的であるように設計され得る。ＲＮＡガイドは、ＤＮＡ標的化配列とダイレクトリピート（ＤＲ）配列とを含む。ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ、成熟ｃｒＲＮＡ、及びｇＲＮＡという用語もまた、ＲＮＡガイドを指すために本明細書で使用される。本明細書で使用される場合、「ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡ」という用語は、ＤＲ－スペーサー－ＤＲ配列を含む未処理のＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される場合、「成熟ｃｒＲＮＡ」という用語は、ｐｒｅ－ｃｒＲＮＡの処理された形態を指し、成熟ｃｒＲＮＡはＤＲ－スペーサー配列を含んでもよく、ここではＤＲはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのＤＲの切断型であり、及び／又はスペーサーはｐｒｅ－ｃｒＲＮＡのスペーサーの切断型である。

【0200】

本明細書で使用される場合、「実質的に同一」という用語は、参照配列に対してある程度の同一性を有する配列、ポリヌクレオチド、又はポリペプチドを指す。

【0201】

本明細書で使用される場合、「標的核酸」、「標的配列」、及び「標的基質」という用語は、ＲＮＡガイドが特異的に結合する核酸を指す。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドのＤＮＡ標的化配列は、標的核酸に結合する。

【0202】

本明細書で使用される場合、「変異体ポリペプチド」及び「変異体ヌクレアーゼポリペプチド」という用語は、親ポリペプチドと比較すると、１つ以上の残基位置で改変、例えば、限定されないが、置換、挿入、欠失、付加、及び／又は融合を含むポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、「変異体ポリペプチド」及び「変異体ヌクレアーゼポリペプチド」は、配列番号３のポリペプチドと比較すると、改変を含むポリペプチドを指す。

【図面の簡単な説明】

【0203】

【図1】実施例７に記載されるような配列番号３と比べて置換を有する変異体ポリペプチドによって、ＡＡＶＳ１標的（配列番号１３）、ＥＭＸ１標的（配列番号９）、及びＶＥＧＦＡ標的（配列番号１１）において誘導された％インデルを示す。図１における変異体ポリペプチドは、配列番号１４～１７及び１９～４１に記載のアミノ酸配列を有する。ＡＡＶＳ１標的に対応するバーは、各変異体についての２つの最も左側のバーであり、ＥＭＸ１標的に対応するバーは、各変異体についての中央の２つのバーであり、ＶＥＧＦＡ標的に対応するバーは、各変異体についての２つの最も右側のバーである。

【図2A】配列番号３と比べて点置換を有する変異体ポリペプチドによって、ＡＡＶＳ１標的（配列番号４２）、ＥＭＸ１標的（配列番号４６）、及びＶＥＧＦＡ標的（配列番号４４）において誘導された％インデルを示す。点線は、３つの標的の各々での配列番号３の親ポリペプチドによる平均インデル活性を表示する。示されたデータは、それぞれ２つの技術的複製物の２つの生物学的複製物の平均である。

【図2B】配列番号３と比べて点置換を有する変異体ポリペプチドによって、ＡＡＶＳ１標的（配列番号４２）、ＥＭＸ１標的（配列番号４６）、及びＶＥＧＦＡ標的（配列番号４４）において誘導された％インデルを示す。点線は、３つの標的の各々での配列番号３の親ポリペプチドによる平均インデル活性を表示する。示されたデータは、それぞれ２つの技術的複製物の２つの生物学的複製物の平均である。

【図3】配列番号３と比べてコンビナトリアル置換を有する変異体ポリペプチドによって、ＡＡＶＳ１標的（配列番号４２）、ＥＭＸ１標的（配列番号４６）、及びＶＥＧＦＡ標的（配列番号４４）において誘導された％インデルを示す。示されたデータは、それぞれ２つの技術的複製物の２つの生物学的複製物の平均である。

【発明を実施するための形態】

【0204】

いくつかの態様では、本発明は、配列番号３のポリペプチドの新規変異体、変異体を含む組成物、及びその調製並びに使用方法を提供する。他の態様では、本発明は、配列番号３のポリペプチドの変異体を含む複合体及び組成物、その調製並びに使用方法を更に提供する。いくつかの態様では、１つ以上の特性を有する複合体を含む組成物が本明細書に記載される。いくつかの態様では、複合体を含む組成物を送達する方法が記載される。

【0205】

組成物
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、親ペプチドと比べて酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、親複合体と比べて酵素活性の増強、結合活性の増強、結合特異性の増強、及び／又は安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを含む複合体を含む。

【0206】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む変異体二成分複合体を含む。

【0207】

組成物のいくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドとの複合体形成の増加（例えば、二成分複合体形成の増加）を有する。組成物のいくつかの態様では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較するとより大きな結合親和性を有する。組成物のいくつかの態様では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイドは、親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較するとより強いタンパク質－ＲＮＡ相互作用（例えば、イオン相互作用）を有する。組成物のいくつかの態様では、変異体二成分複合体は、親二成分複合体よりも安定である。

【0208】

いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、変異体ポリペプチドと、ＲＮＡガイドと標的核酸とを含む。いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、変異体ポリペプチドを含む変異体三成分複合体と、ＲＮＡガイドと標的核酸とを含む。

【0209】

組成物のいくつかの態様では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド及び標的核酸との複合体形成の増加（例えば、三成分複合体形成の増加）を有する。組成物のいくつかの態様では、変異体ポリペプチド及びＲＮＡガイド（例えば、変異体二成分複合体）は、親ポリペプチド及びＲＮＡガイド（例えば、親二成分複合体）と比較すると、標的核酸に対するより大きな結合親和性を有する。組成物のいくつかの態様では、変異体三成分複合体は、親三成分複合体よりも安定である。

【0210】

いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを含む。

【0211】

変異体ポリペプチド
一実施形態では、変異体ポリペプチドは、単離又は精製されたポリペプチドである。

【0212】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは親ポリペプチドの変異体であり、親は、配列番号１若しくは配列番号２などのヌクレオチド配列を含むか、又は配列番号３などのアミノ酸配列を含むポリヌクレオチドによってコードされる。表１を参照されたい。

【0213】

【表1】

【0214】

【表2】

【0215】

本明細書に記載の親ポリペプチドをコードする核酸は、参照核酸配列、例えば、配列番号１又は配列番号２に対して実質的に同一であり得る。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、親ポリペプチドをコードする配列、例えば、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む核酸によってコードされる。２つのそのような核酸の間のパーセント同一性は、２つの最適にアライメントされた核酸配列の精査によって手動で、又は標準的パラメータを使用したソフトウェア若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することによって決定することができる。２つの核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標は、核酸分子が他のストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度のストリンジェンシーの範囲内で）相補的配列に対してハイブリダイズすることである。

【0216】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照核酸配列、例えば、親ポリペプチドをコードする核酸配列、例えば、配列番号１又は配列番号２に対して少なくとも６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又はそれ以上の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない核酸配列によってコードされる。

【0217】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％の同一性を有するが、１００％の同一性を有さないポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、配列番号３に対して５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％超の同一性を有するが、１００％の同一性を有さないポリペプチド配列を含む。

【0218】

いくつかの実施形態では、本発明は、１つ以上の参照ポリペプチド、例えば、親ポリペプチドに対して指定された程度のアミノ酸配列同一性を有する、例えば、配列番号３のアミノ酸配列に対する少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は更には少なくとも９９％の配列同一性を有するが、１００％の配列同一性は有さない変異体ポリペプチドを記載する。相同性又は同一性は、本明細書に記載されるように、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、又はＣＬＵＳＴＡＬなどのプログラムを使用してアミノ酸配列アライメントによって決定することができる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、ポリペプチドをその対応の親／参照配列と区別するアミノ酸変化（又はこれらの変化のうちの少なくとも１、２、３、４、５個など）を維持する。

【0219】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドの１つ以上（例えば、数個）のアミノ酸で改変を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６２、１６４、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００個、又はそれ以上が改変される。

【0220】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、表２に列挙されるアミノ酸置換のうちの１つ以上を含む。

【0221】

【表3】

【0222】

【表4】

【0223】

【表5】

【0224】

【表6】

【0225】

【表7】

【0226】

【表8】

【0227】

【表9】

【0228】

【表10】

【0229】

【表11】

【0230】

【表12】

【0231】

【表13】

【0232】

【表14】

【0233】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＲＮＡガイドに対する相互作用を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドとの相互作用を増加させる改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、又はヒスチジンの置換である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドの標的核酸に対する相互作用を増加させる改変を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸との相互作用を増加させる改変は、アルギニン、リジン、グルタミン、アスパラギン、又はヒスチジンの置換である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、アラニン置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、グリシン置換を含む。

【0234】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｐ３５３からＬ３６０までに１つ以上の置換を含む。例えば、いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、以下の置換：Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｑ３５５Ｇ、Ｄ３５６Ｇ、Ｎ３５７Ｇ、Ｎ３５８Ｇ、Ｑ３５９Ｇ、及びＬ３６０Ｇのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、変異体は、１つ以上のＮ末端アルギニン置換を含む。

【0235】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ３８での置換、Ｔ６０での置換、Ｄ８９での置換、Ｓ２２３での置換、Ｐ３５３での置換、Ｌ３５４での置換、Ｌ３６０での置換、Ｋ３６８での置換、Ｅ５６６での置換、及び／又はＤ７３０での置換を含む。いくつかの実施形態では、Ｅ３８での置換はＥ３８Ｒ置換であり、Ｔ６０での置換はＴ６０Ｒ置換であり、Ｄ８９での置換はＤ８９Ｒ置換であり、Ｓ２２３での置換はＳ２２３Ｒ置換であり、Ｐ３５３での置換はＰ３５３Ｇ置換であり、Ｌ３５４での置換はＬ３５４Ｇ置換であり、Ｌ３６０での置換はＬ３６０Ｇ置換であり、Ｋ３６８での置換はＫ３６８Ｇ置換であり、Ｅ５６６での置換はＥ５６６Ｒ置換であり、及び／又はＤ７３０での置換はＤ７３０Ｒ置換である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ３８での置換、Ｔ６０での置換、Ｄ８９での置換、Ｓ２２３での置換、Ｐ３５３での置換、Ｌ３５４での置換、Ｌ３６０での置換、Ｋ３６８での置換、Ｅ５６６での置換、及び／又はＤ７３０での置換を含む、二重突然変異体、三重突然変異体、四重突然変異体、又は五重突然変異体である。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、Ｅ３８Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、Ｄ８９Ｒ置換、Ｓ２２３Ｒ置換、Ｐ３５３Ｇ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、Ｌ３６０Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及び／又はＤ７３０Ｒ置換を含む、二重突然変異体、三重突然変異体、四重突然変異体、又は五重突然変異体である。

【0236】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0237】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１５に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0238】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＫ３６８Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１６に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１６に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0239】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１７に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１７に記載のアミノ酸配列を含む。

【0240】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１８に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0241】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換及びＬ３５４Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１９に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0242】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２０に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0243】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換及びＫ３８６Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２１に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0244】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３４５Ｇ置換及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２２に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0245】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＫ３６８Ｇ置換及びＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２３に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0246】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＫ３６８Ｇ置換及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２４に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0247】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＥ５６６Ｒ置換及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２５に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0248】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、及びＫ３６８Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２６に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２６に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0249】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、及びＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２７に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２７に記載のアミノ酸配列を含む。

【0250】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２８に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0251】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２９に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号２９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0252】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３０に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0253】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３１に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0254】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３２に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0255】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３３に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0256】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３４に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0257】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３５に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0258】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＥ５６６Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３６に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３６に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0259】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３７に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を含む。

【0260】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３８に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0261】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３９に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0262】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＬ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４０に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0263】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、及びＤ７３０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４１に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0264】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、及びＤ３５６Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４９に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４９に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を含む。

【0265】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、Ｄ３５６Ｇ置換、及びＰ３５３Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５０に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５０に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５０に記載のアミノ酸配列を含む。

【0266】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、Ｄ３５６Ｇ置換、及びＥ５７１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５１に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５１に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５１に記載のアミノ酸配列を含む。

【0267】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、Ｄ３５６Ｇ置換、Ｐ３５３Ｇ置換、及びＥ５７１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５２に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５２に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５２に記載のアミノ酸配列を含む。

【0268】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、並びにＴ６０Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５３に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５３に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５３に記載のアミノ酸配列を含む。

【0269】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、並びにＤ３５６Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５４に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５４に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５４に記載のアミノ酸配列を含む。

【0270】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、並びにＤ３５６Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５５に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５５に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を含む。

【0271】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、並びにＰ３５３Ｇ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５６に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５６に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５６に記載のアミノ酸配列を含む。

【0272】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、並びにＥ５７１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５７に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５７に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５７に記載のアミノ酸配列を含む。

【0273】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べてＤ８９Ｒ置換、Ｌ３５４Ｇ及びＥ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、Ｔ６０Ｒ置換、Ｐ３５３Ｇ置換、Ｄ３５６Ｇ置換、並びにＥ５７１Ｒ置換を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５８に対して少なくとも９０％（例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５８に対して少なくとも９５％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％）の同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号５８に記載のアミノ酸配列を含む。

【0274】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、配列番号３と比べて以下の突然変異：Ｑ６８３Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｑ５５６Ｒ、Ｄ３５６Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、Ｑ３５９Ｇ、Ｖ５５７Ｒ、Ｎ６２０Ｒ、Ｅ５８９Ｋ、Ｔ４８０Ｋ、Ｌ５２３Ｋ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｅ５６６Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、及びＥ３１９Ｒのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１４～４１又は４９～４８のいずれか１つの変異体ポリペプチドは、以下の突然変異：Ｑ６８３Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｑ５５６Ｒ、Ｄ３５６Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、Ｑ３５９Ｇ、Ｖ５５７Ｒ、Ｎ６２０Ｒ、Ｅ５８９Ｋ、Ｔ４８０Ｋ、Ｌ５２３Ｋ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｅ５６６Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、及びＥ３１９Ｒのうちの１つ以上を更に含む。

【0275】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１つのＲｕｖＣモチーフ又はＲｕｖＣドメインを含む。

【0276】

本明細書に記載の変化は１つ以上のアミノ酸変化であり得るが、変異体ポリペプチドに対する変化はまた、アミノ末端伸長及び／又はカルボキシル末端伸長としてのポリペプチドの融合などの本質的な性質のものであってもよい。例えば、変異体ポリペプチドは、追加のペプチド、例えば、１つ以上のペプチドを含有してもよい。追加のペプチドの例としては、標識付けのためのエピトープペプチド、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ－ｔａｇ）、Ｍｙｃ、及びＦＬＡＧが含まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）又は黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ））などの検出可能な部分に融合され得る。

【0277】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）の核外搬出シグナル（ＮＥＳ）を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）のＮＬＳ及び少なくとも１個（例えば、２、３、４、５、６個、又はそれ以上）のＮＥＳを含む。

【0278】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドは、自己不活性化することができる。Ｅｐｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ａ Ｓｅｌｆ－Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ Ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２４（２０１６）：Ｓ５０（その全体が参照により組み込まれる）を参照されたい。

【0279】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、特定の宿主細胞又は生物中で使用するためにコドン最適化され得る。例えば、核酸は、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト霊長類を含む任意の非ヒト真核生物のためにコドン最適化され得る。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手可能な「コドン使用頻度データベース」で容易に入手可能であり、これらの表は様々な方法で適応することができる。Ｎａｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。特定の宿主細胞中の発現のために、特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）がそうである。

【0280】

配列番号３９の変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を表３に示す。いくつかの実施形態では、配列番号５９～６６のいずれか１つのヌクレオチド配列は、配列番号３と比べて、Ｄ８９Ｒ置換、Ｋ３６８Ｇ置換、Ｅ５６６Ｒ置換、Ｄ７３０Ｒ置換、及び本明細書に記載の１つ以上の追加の置換を含む変異体ポリペプチドをコードするように修飾され得る。

【0281】

【表15】

【0282】

【表16】

【0283】

【表17】

【0284】

【表18】

【0285】

【表19】

【0286】

【表20】

【0287】

【表21】

【0288】

変異体ポリペプチドの機能性
本明細書で使用される場合、「生物学的活性部分」は、親ポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持する（例えば、完全に、部分的に、最小限に）部分である（例えば、「最小」又は「コア」ドメイン）。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、酵素活性を親ポリペプチドと少なくとも同程度の活性で保持する。したがって、いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドよりを超える酵素活性を有する。

【0289】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、低減したヌクレアーゼ活性を有するか、又はヌクレアーゼ活性を伴わないポリペプチド（ｎｕｃｌｅａｓｅ ｄｅａｄ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）である。本明細書で使用される場合、本明細書に開示されるポリペプチドの触媒残基は、Ｄ３３６及びＥ５４５を含む。いくつかの実施形態では、Ｄ３３６及びＥ５４５での置換（例えば、Ｄ３３６Ａ及びＥ５４５Ａ）を含む変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて低減したヌクレアーゼ活性を示すか、又はヌクレアーゼ活性を示さない。いくつかの実施形態では、Ｄ６９５、Ｄ６６１、又はＤ６３６での置換（例えば、Ｄ６９５Ａ、Ｄ６６１Ａ、又はＤ６３６Ａ）を含む変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比べて低減したヌクレアーゼ活性を示すか、又はヌクレアーゼ活性を示さない。

【0290】

態様では、本発明は、二成分複合体形成、ＲＮＡガイド結合活性、及び／又はＲＮＡガイド結合特異性を増強させるために、親ポリペプチド配列に改変又は突然変異を導入するための方法を提供する。

【0291】

態様では、本発明はまた、三成分複合体形成、オンターゲット結合親和性、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合、及び／又はオンターゲット結合特異性を増強させるために、親ポリペプチド配列に改変又は突然変異を導入するための方法も提供する。態様では、本発明はまた、オンターゲット結合親和性（例えば、標的と相互作用するために要する親和性又は時間）、オンターゲット結合活性、オンターゲット結合（例えば、標的との相互作用の強さ）、及び／又は二成分複合体（例えば、リボ核タンパク質）のオンターゲット結合特異性（例えば、特異的標的に対する優先性）を増強させるために、親ポリペプチド配列に改変又は突然変異を導入するための方法も提供する。いくつかの実施形態では、改変又は突然変異が親ポリペプチド配列に導入されて、オンターゲット結合の増加及び／又は活性を有する変異体ポリペプチドを産生する。また、そのような実施形態では、オフターゲット結合及び／又は活性は、親ポリペプチドと比較すると、変異体ポリペプチドにおいて減少され得る。更に、オンターゲット結合対オフターゲット結合に関して特異性の増加又は減少があり得る。いくつかの実施形態では、改変又は突然変異が親ポリペプチド配列に導入されて、ＲＮＡガイドと複合体化される場合、オンターゲット結合の増加を有する変異体ポリペプチドを産生する。また、そのような実施形態では、オフターゲット結合は、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを含む複合体において減少され得る。更に、オンターゲット結合／活性対オフターゲット結合／活性に関して、特異性の増加又は減少があり得る。ある特定の実施形態では、改変又は突然変異が親ポリペプチド配列に導入されて、安定性及び／又はタンパク質－ＲＮＡ相互作用を増強させる変異体ポリペプチドを産生する。ある特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、変異体ポリペプチドの安定性及び／又はＲＮＡ相互作用、並びに酵素活性を促進する少なくとも１つの改変を含む。

【0292】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと同等の、又はそれを超える酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、約２０℃～約９０℃の温度範囲で酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、約２０℃～約２５℃の温度で、又は約３７℃の温度で酵素活性を有する。

【0293】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡに対する親和性（例えば、ＲＮＡ親和性）を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡ親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡ親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡ親和性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡ親和性の増強を示す。

【0294】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドとの複合体形成（例えば、二成分複合体形成）を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較すると二成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、二成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、二成分複合体形成の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、二成分複合体形成の増強を示す。

【0295】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドに対する結合活性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す。

【0296】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドに対する結合特異性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す。

【0297】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとタンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す。

【0298】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとタンパク質安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、タンパク質安定性の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、タンパク質安定性の増強を示す。

【0299】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離（例えば、二成分複合体解離）を減少させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較するとＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のうちの少なくともいずれか１つのインキュベーション期間にわたって親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体は、ＲＮＡガイドを異なるＲＮＡで交換しない。

【0300】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親ポリペプチドと比較すると、ＲＮＡガイドと標的核酸との三成分複合体の形成を増強させる少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親ポリペプチドと比較すると、三成分複合体形成の増強を示す。一実施形態では、変異体ポリペプチドは、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、三成分複合体形成の増強を示す。

【0301】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が標的核酸に対する結合親和性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、標的核酸に対する結合親和性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、親核酸に対する結合親和性の増強を示す。

【0302】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）がオンターゲット結合活性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合活性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、オンターゲット結合活性の増強を示す。

【0303】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）がオンターゲット結合特異性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、オンターゲット結合特異性の増強を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親二成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、オンターゲット結合特異性の増強を示す。

【0304】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す。

【0305】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親二成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む二成分複合体（例えば、変異体二成分複合体）が標的核酸からの解離の減少を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチドのＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親二成分複合体と比較すると、標的核酸からの解離の減少を示す。一実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が親ポリペプチドのＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、標的核酸からの解離の減少を示す。

【0306】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、親三成分複合体と比較すると、変異体ポリペプチドを含む三成分複合体（例えば、変異体三成分複合体）が安定性の増強を示すように少なくとも１つの改変を含む。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、５１℃、５２℃、５３℃、５４℃、５５℃、５６℃、５７℃、５８℃、５９℃、６０℃又は６５℃のいずれか１つよりも低い温度で、親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、約７．３～約８．６の範囲のｐＨを有する緩衝液中で親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。いくつかの実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも１℃、２℃、３℃、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、１５℃、１６℃、１７℃、１８℃、１９℃、又は２０℃大きい場合に、親三成分複合体と比較すると、安定性の増強を示す。一実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が親三成分複合体のＴ_ｍ値よりも少なくとも８℃大きい場合に、安定性の増強を示す。

【0307】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）ＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）ＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の保持、及び（ｂ）ＲＮＡ親和性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0308】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）二成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）二成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）二成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0309】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合活性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0310】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）ＲＮＡガイド結合特異性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0311】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）タンパク質－ＲＮＡ相互作用の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0312】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）タンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）タンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）タンパク質安定性の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0313】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）ＲＮＡガイドからの解離の減少を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0314】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３の親ポリペプチドと比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）三成分複合体形成の増強を示す変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0315】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）標的核酸に対する結合親和性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0316】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）オンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）オンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）オンターゲット結合活性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0317】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）オンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）オンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）オンターゲット結合特異性の増強を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0318】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0319】

いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の減少、及び（ｂ）標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）酵素活性の増加、及び（ｂ）標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの改変が配列番号３の親ポリペプチドに導入されて、配列番号３のポリペプチドを含む親二成分複合体と比べて、（ａ）保持された酵素活性、及び（ｂ）標的核酸からの解離の減少を示す変異体二成分複合体を形成する変異体ポリペプチドを産生する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される特徴を有する変異体ポリペプチドは、配列番号１４～４１又は４９～５８のいずれか１つに対して、少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。

【0320】

ＲＮＡガイド
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物又は複合体は標的核酸に結合し、変異体ポリペプチドと相互作用する標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド、アンチセンス、オリゴヌクレオチド、ペプチドオリゴヌクレオチドコンジュゲート）を含む。標的化部分は、標的核酸に結合することができる（例えば、標的核酸に対する特異的結合親和性で）。

【0321】

いくつかの実施形態では、標的部分はＲＮＡガイドを含むか、又はＲＮＡガイドである。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを特定の核酸配列に向ける。当業者は、以下の特定の種類のＲＮＡガイドの例を読み取れば、いくつかの実施形態でＲＮＡガイドが部位特異的であることを理解するであろう。すなわち、いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、１つ以上の標的核酸配列（例えば、特異的ＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列）と特異的に会合するが、非標的化核酸配列（例えば、非特異的ＤＮＡ又はランダム配列）とは会合しない。

【0322】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載される組成物は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドと会合し、変異体ポリペプチドを標的核酸配列（例えば、ＤＮＡ）に向けるＲＮＡガイドを含む。

【0323】

ＲＮＡガイドは、標的配列、例えば、部位特異的配列又は部位特異的標的の１つ以上のヌクレオチドを標的とすることができる（例えば、それと会合する、それに向けられる、それと接触し、又は結合することができる）。いくつかの実施形態では、変異体核タンパク質（例えば、変異体ポリペプチドに加えてＲＮＡガイド）は、ＲＮＡガイド中のＤＮＡ標的化配列に相補的である標的核酸（例えば、配列特異的基質又は標的核酸）への結合の際に活性化される。

【0324】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、約１１ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有するスペーサーを含む。例えば、ＤＮＡ標的化セグメントは、約１１ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１１ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、又は約１１ヌクレオチド～約１９ヌクレオチドの長さを有し得る。例えば、スペーサーは、約１９ヌクレオチド～約２０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約４５ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、約１９ヌクレオチド～約１００ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約２５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約３５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約４５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約５０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約６０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約７０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約８０ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド～約９０ヌクレオチド、又は約２０ヌクレオチド～約１００ヌクレオチドの長さを有し得る。

【0325】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、一般に、１１～５０ヌクレオチド（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチド）の長さを有し、特異的標的核酸配列に相補的であるように設計され得る。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＡガイドは、例えば、ゲノム遺伝子座の特異的ＤＮＡ鎖に対して相補的であるように設計されてもよい。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ標的化配列は、例えば、ゲノム遺伝子座の特異的ＤＮＡ鎖に対して相補的であるように設計される。

【0326】

ＲＮＡガイドは、参照核酸配列の相補鎖に対して実質的に同一であってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは参照核酸配列、例えば、標的核酸の相補鎖に対して少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する配列を含む。そのような２つの核酸の間のパーセント同一性は、２つの最適にアライメントされた核酸配列の精査によって手動で、又は標準的パラメータを使用したソフトウェア若しくはアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することによって決定することができる。

【0327】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的核酸の相補鎖に対して、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％の配列同一性を有する。

【0328】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、１１～５０ヌクレオチド（例えば、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチド）の長さであり、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的であるスペーサーを含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、例えば、最大５０の長さであり、標的核酸に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的であるＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ＤＮＡ配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、標的ゲノム配列に対して少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％相補的な配列を含む。

【0329】

ある特定の実施形態では、ＲＮＡガイドは、ＤＮＡ標的化配列に結合したダイレクトリピート配列を含むか、それから本質的になるか、又はそれを構成する。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、ダイレクトリピート配列及びＤＮＡ標的化配列、又はダイレクトリピート－ＤＮＡ標的配列－ダイレクトリピート配列を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは切断型ダイレクトリピート配列と、処理された又は成熟ｃｒＲＮＡに典型的なＤＮＡ標的化配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のポリペプチドは、ＲＮＡガイドと複合体を形成し、ＲＮＡガイドは、複合体をＲＮＡガイドの少なくとも一部に相補的である部位特異的標的核酸と会合するように向ける。

【0330】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表４に記載の配列又は表４に記載の配列の一部に対して少なくとも９０％同一である。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表４に記載の配列又は表４に記載の配列の一部に対して少なくとも９５％同一である。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピート配列は、表４に記載の配列又は表４に記載の配列の一部に対して同一である。

【0331】

【表22】

【0332】

いくつかの実施形態では、ダイレクトリピートは、ＣＣＵＧＵＵＧＵＧＡＡＵＡＣＵＣ（配列番号６）として記載される配列を含む。いくつかの実施形態では、ダイレクトリピートは、ＵＵＡＵＡＧＧＵＡＵＣＡＡＡＣＡＡＣ（配列番号７）として記載される配列を含む。

【0333】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の組成物又は複合体は、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８個、又はそれ以上）のＲＮＡガイド、例えば、複数のＲＮＡガイドを含む。

【0334】

いくつかの実施形態では、ＲＮＡガイドは、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット及び同第２０１５／０７００８３号パンフレット（それらの各々の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる）に類似した構造を有する。

【0335】

特に明記しない限り、本明細書に提供される全ての組成物及び複合体、並びにポリペプチドは、その組成物又は複合体若しくはポリペプチドの活性レベルを参照して作製され、市販の供給源において存在し得る不純物、例えば、残留溶媒又は副生成物は含まない。酵素成分の重量は、全活性タンパク質に基づく。全てのパーセンテージ及び比率は、特に明記されない限り、重量で計算される。全てのパーセンテージ及び比率は、特に明記されない限り、全組成に基づいて計算される。例示された組成では、酵素レベルは、全組成の重量で純粋な酵素によって表され、特に指定のない限り、成分は全組成の重量で表される。

【0336】

修飾
ＲＮＡガイド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸配列のいずれかは、参照配列、特に親ポリリボヌクレオチドに関して１つ以上の共有結合修飾を含んでもよく、これは本発明の範囲内に含まれる。

【0337】

例示的な修飾としては、例えば、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合への（例えば、リン酸結合への／ホスホジエステル結合への／ホスホジエステルバックボーンへの）、及びそれらの任意の組み合わせへのいずれかの修飾を含むことができる。本明細書に提供される例示的な修飾のいくつかは、以下に詳細に記載される。

【0338】

ＲＮＡガイド又は変異体ポリペプチドの成分をコードする核酸配列のいずれかは、例えば、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合への（例えば、リン酸結合への／ホスホジエステル結合への／ホスホジエステルバックボーンへの）、及びそれらの任意の組み合わせへのいずれかの有用な修飾を含むことができる。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択で置換されたアミノ、任意選択で置換されたチオール、任意選択で置換されたアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）、又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置き換えられるか、又は置換されてもよい。ある特定の実施形態では、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合の各々に存在する。修飾は、リボ核酸（ＲＮＡ）のデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、又はそれらのハイブリッドに対する修飾であり得る。追加の修飾は、本明細書に記載されている。

【0339】

いくつかの実施形態では、修飾は、化学的修飾又は細胞誘発修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２－２１０から“ＲＮＡ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ｃｏｏｐｅｒａｔｅ ｔｏ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ－ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ ａｎｄ Ｐａｎによって記載されている。

【0340】

異なる糖修飾、ヌクレオチド修飾、及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、バックボーン構造）は、配列の様々な位置で存在してもよい。当業者であれば、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が配列の任意の位置に配置されてもよく、それによって配列の機能は実質的に減少されないことを理解するであろう。配列は、約１％～約１００％の修飾ヌクレオチド（ヌクレオチド含量の全体に関して、又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ、又はＣのいずれか１つ以上に関してのいずれかで）又は任意のそれらの間のパーセンテージ（例えば、１％～２０％＞、１％～２５％、１％～５０％、１％～６０％、１％～７０％、１％～８０％、１％～９０％、１％～９５％、１０％～２０％、１０％～２５％、１０％～５０％、１０％～６０％、１０％～７０％、１０％～８０％、１０％～９０％、１０％～９５％、１０％～１００％、２０％～２５％、２０％～５０％、２０％～６０％、２０％～７０％、２０％～８０％、２０％～９０％、２０％～９５％、２０％～１００％、５０％～６０％、５０％～７０％、５０％～８０％、５０％～９０％、５０％～９５％、５０％～１００％、７０％～８０％、７０％～９０％、７０％～９５％、７０％～１００％、８０％～９０％、８０％～９５％、８０％～１００％、９０％～９５％、９０％～１００％、及び９５％～１００％）の修飾ヌクレオチドを含んでもよい。

【0341】

いくつかの実施形態では、糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位での）又は配列の１つ以上のリボヌクレオチドでの糖の置き換え、並びにバックボーン修飾は、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えを含んでもよい。配列の具体的な例としては、限定されないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置き換えを含む、修飾バックボーン又はヌクレオシド間修飾などの非天然ヌクレオシド間結合を含む配列が挙げられる。修飾バックボーンを有する配列としては、とりわけバックボーンにリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の目的のために、また当該技術分野において言及されることがあるように、それらのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有さない修飾ＲＮＡはまた、オリゴヌクレオシドであると見なされ得る。特定の実施形態では、配列は、そのヌクレオシド間バックボーンにリン原子を有するリボヌクレオチドを含むであろう。

【0342】

修飾配列のバックボーンとしては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート、例えば、３’－アルキレンホスホネート及びキラルホスホネート、ホスフィネート、ホスホロアミデート、例えば、３’－アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデート、チオノホスホルアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、及び通常の３’－５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’－５’結合類似体、並びにヌクレオシド単位の隣接する対が３’－５’から５’－３’に又は２’－５’から５’－２’に結合している反転した極性を有するものを挙げることができる。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。いくつかの実施形態では、配列は負に帯電していても正に帯電していてもよい。

【0343】

配列に組み込むことができる修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、リン酸バックボーン）上で修飾され得る。したがって、ポリヌクレオチドバックボーンに関して、「リン酸」及び「ホスホジエステル」という語句は、互換的に使用される。バックボーンリン酸基は、酸素原子のうちの１つ以上を異なる置換基で置き換えることによって修飾され得る。更に、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、未修飾リン酸部分の本明細書に記載されるような別のヌクレオシド間結合による大規模な置き換えを含み得る。修飾リン酸基の例としては、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェートエステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート、及びホスホトリエステルが挙げられるが、これらに限定されない。ホスホロジチオエートは、硫黄によって置き換えられている両方の非連結酸素を有する。リン酸リンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）、及び炭素（架橋メチレン－ホスホネート）による連結酸素の置き換えによっても修飾され得る。

【0344】

α－チオ置換リン酸部分は、非天然ホスホロチオエートバックボーン結合を通して、ＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を付与するために提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡはヌクレアーゼ提供性の増加を有し、その後細胞内環境においてより長い半減期を有するようになる。

【0345】

具体的な実施形態では、修飾ヌクレオシドとしては、アルファ－チオ－ヌクレオシド（例えば、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－アデノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シチジン（ａ－チオ－シチジン）、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－グアノシン、５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－ウリジン、又は５’－Ｏ－（１－チオホスフェート）－シュードウリジン）が挙げられる。

【0346】

リン原子を含有しないヌクレオシド間結合が含まれる、本明細書に従って利用され得る他のヌクレオシド間結合が、本明細書に記載されている。

【0347】

いくつかの実施形態では、配列は、１つ以上の細胞傷害性ヌクレオシドを含んでもよい。例えば、細胞傷害性ヌクレオシドは、二機能性修飾として配列に組み込まれてもよい。細胞傷害性ヌクレオシドとしては、アデノシンアラビノシド、５－アザシチジン、４’－チオ－アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）－シトシン、デシタビン、５－フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフールとウラシルの組み合わせ、テガフール（（ＲＳ）－５－フルオロ－１－（テトラヒドロフラン－２－イル）ピリミジン－２，４（１Ｈ，３Ｈ）－ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’－デオキシ－２’－メチリデンシジチン（ＤＭＤＣ）、及び６－メルカプトプリンを挙げることができるが、これらに限定されない。追加の例としては、リン酸フルダラビン、Ｎ４－ベヘノイル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－オクタデシル－１－ベータ－Ｄ－アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４－パルミトイル－１－（２－Ｃ－シアノ－２－デオキシ－ベータ－Ｄ－アラビノ－ペントフラノシル）シトシン、及びＰ－４０５５（シタラビン５’－エライジン酸エステル）が挙げられる。

【0348】

いくつかの実施形態では、配列は、１つ以上の翻訳後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ－Ａ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化、並びにチオール基及びチオシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の翻訳後修飾は、ＲＮＡ中で特定された１００個を超える異なるヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ ＲＮＡ Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９ ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２７：１９６－１９７）。いくつかの実施形態では、最初に単離された核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、ピリジン－４－オンリボヌクレオシド、５－アザ－ウリジン、２－チオ－５－アザ－ウリジン、２－チオウリジン、４－チオ－シュードウリジン、２－チオ－シュードウリジン、５－ヒドロキシウリジン、３－メチルウリジン、５－カルボキシメチル－ウリジン、１－カルボキシメチル－シュードウリジン、５－プロピニル－ウリジン、１－プロピニル－シュードウリジン、５－タウリノメチルウリジン、１－タウリノメチル－シュードウリジン、５－タウリノメチル－２－チオ－ウリジン、１－タウリノメチル－４－チオ－ウリジン、５－メチル－ウリジン、１－メチル－シュードウリジン、４－チオ－１－メチル－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－シュードウリジン、１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、２－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２－チオ－ジヒドロウリジン、２－チオ－ジヒドロシュードウリジン、２－メトキシウリジン、２－メトキシ－４－チオ－ウリジン、４－メトキシ－シュードウリジン、及び４－メトキシ－２－チオ－シュードウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、５－アザ－シチジン、シュードイソシチジン、３－メチル－シチジン、Ｎ４－アセチルシチジン、５－ホルミルシチジン、Ｎ４－メチルシチジン、５－ヒドロキシメチルシチジン、１－メチル－シュードイソシチジン、ピロロ－シチジン、ピロロ－シュードイソシチジン、２－チオ－シチジン、２－チオ－５－メチル－シチジン、４－チオ－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－シュードイソシチジン、４－チオ－１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、１－メチル－１－デアザ－シュードイソシチジン、ゼブラリン、５－アザ－ゼブラリン、５－メチル－ゼブラリン、５－アザ－２－チオ－ゼブラリン、２－チオ－ゼブラリン、２－メトキシ－シチジン、２－メトキシ－５－メチル－シチジン、４－メトキシ－シュードイソシチジン、及び４－メトキシ－１－メチル－シュードイソシチジンからなる群から選択される１つ以上のヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、２－アミノプリン、２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－アデニン、７－デアザ－８－アザ－アデニン、７－デアザ－２－アミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２－アミノプリン、７－デアザ－２，６－ジアミノプリン、７－デアザ－８－アザ－２，６－ジアミノプリン、１－メチルアデノシン、Ｎ６－メチルアデノシン、Ｎ６－イソペンテニルアデノシン、Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－（シス－ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６－グリシニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、２－メチルチオ－Ｎ６－スレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６－ジメチルアデノシン、７－メチルアデノシン、２－メチルチオ－アデニン、及び２－メトキシ－アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。いくつかの実施形態では、ｍＲＮＡは、イノシン、１－メチル－イノシン、ウィオシン、ウィブトシン、７－デアザ－グアノシン、７－デアザ－８－アザ－グアノシン、６－チオ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－グアノシン、６－チオ－７－デアザ－８－アザ－グアノシン、７－メチル－グアノシン、６－チオ－７－メチル－グアノシン、７－メチルイノシン、６－メトキシ－グアノシン、１－メチルグアノシン、Ｎ２－メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２－ジメチルグアノシン、８－オキソ－グアノシン、７－メチル－８－オキソ－グアノシン、１－メチル－６－チオ－グアノシン、Ｎ２－メチル－６－チオ－グアノシン、及びＮ２，Ｎ２－ジメチル－６－チオ－グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。

【0349】

配列は、分子の全長に沿って均一に修飾されても又は修飾されなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上又は全てのタイプ（例えば、天然に存在するヌクレオチド、プリン、若しくはピリミジン、又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのうちのいずれか１つ以上若しくは全て）は、配列において、若しくはその所定の配列領域において、均一に修飾されても又は修飾されなくてもよい。いくつかの実施形態では、配列は、シュードウリジンを含む。いくつかの実施形態では、配列はイノシンを含み、これは免疫系において配列をウイルスＲＮＡに対して内因性ＲＮＡとして特徴付けることで役立つ。イノシンの組込みはまた、改善されたＲＮＡ安定性／低減した分解を媒介し得る。例えば、その全体が参照により組み込まれる、Ｙｕ，Ｚ．ｅｔ ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｍａｒｋｓ ｄｓＲＮＡ ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ．２５，１２８３－１２８４を参照されたい。

【0350】

標的核酸
本明細書に開示される方法は、様々な標的核酸に適用可能である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡ遺伝子座などのＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡ遺伝子座又はｍＲＮＡなどのＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖（例えば、一本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、二本鎖（例えば、二本鎖ＤＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、一本鎖及び二本鎖領域の両方を含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、直線状である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、環状である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、メチル化ヌクレオチド、損傷したヌクレオチド、又はヌクレオチド類似体などの１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、修飾されていない。

【0351】

標的核酸は任意の長さのものであってもよく、例えば、約１００ｂｐ、２００ｂｐ、５００ｂｐ、１０００ｂｐ、２０００ｂｐ、５０００ｂｐ、１０ｋｂ、２０ｋｂ、５０ｋｂ、１００ｋｂ、２００ｋｂ、５００ｋｂ、１Ｍｂ、又はそれ以上の長さのうちの少なくともいずれか１つである。標的核酸はまた、任意の配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＧＣリッチであり、例えば、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又はそれより高いＧＣ含量のうちの少なくともいずれか１つを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、少なくとも約７０％、８０％、又はそれ以上のＧＣ含量を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非ＧＣリッチ標的核酸中のＧＣリッチ断片である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＧＣリッチではない。いくつかの実施形態では、標的核酸は、１つ以上の二次構造又はより高次の構造を有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸を変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体によってアクセス不能にするために、クロマチンなどの凝縮状態にはない。

【0352】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞の核中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞に対して内因性である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ゲノムＤＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、染色体ＤＮＡである。一実施形態では、標的核酸は、染色体外核酸である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、タンパク質コード遺伝子若しくはその機能的領域、例えば、コード領域、又は調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、５’若しくは３’非翻訳領域などである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非コード遺伝子、例えば、トランスポゾン、ｍｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、リボザイム、又はｌｉｎｃＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、プラスミドである。

【0353】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞に対して外因性である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ウイルス核酸、例えば、ウイルスＤＮＡ又はウイルスＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、水平伝播プラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中に組み込まれる。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中には組み込まれない。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞中のプラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、染色体外配列（ｅｘｔｒａｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ａｒｒａｙ）中に存在する。

【0354】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、単離された核酸、例えば、単離されたＤＮＡ又は単離されたＲＮＡである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、無細胞環境中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、単離されたベクター、例えば、プラスミドである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、超高純度プラスミドである。

【0355】

標的核酸は、ＲＮＡガイドにハイブリダイズする標的核酸のセグメントである。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の１つのコピーのみを有する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の２つ以上のコピー、例えば、約２、３、４、５、１０、１００、又はそれ以上のコピーの少なくともいずれか１つを有する。例えば、ウイルス核酸又は細菌のゲノム中の反復配列を含む標的核酸は、変異体核タンパク質によって標的化され得る。

【0356】

標的核酸は、本明細書に記載されるような本開示のプロトスペーサー隣接モチーフ又はＰＡＭに隣接している。ＰＡＭは、標的配列のすぐ隣にあってもよく、又は例えば、標的配列の少数（例えば、１、２、３、４、又は５個）のヌクレオチド内にあってもよい。二本鎖標的の場合には、標的化部分（例えば、ＲＮＡガイド）は、標的の第１の鎖に結合し、本明細書に記載されるＰＡＭ配列は、第２の相補鎖中に存在する。そのような場合、ＰＡＭ配列は、結合部分が結合する第１の鎖中の配列に対して相補的である第２の鎖中の配列のすぐ隣にある（又はその少数、例えば、１、２、３、４、又は５個のヌクレオチド内にある）。

【0357】

いくつかの実施形態では、配列特異性は、ＲＮＡガイド中のスペーサー配列の標的核酸の非ＰＡＭ鎖に対する完全な一致を必要とする。他の実施形態では、配列特異性は、ＲＮＡガイド中のスペーサー配列の標的核酸の非ＰＡＭ鎖への部分的（連続又は非連続）一致を必要とする。

【0358】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡガイド又はＲＮＡガイドと変異体ポリペプチドを含む複合体は、ＲＮＡガイドと標的核酸との間の相補性の領域によって画定される配列で標的核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＰＡＭ配列は、標的核酸の標的配列の上流に直接位置する（例えば、標的配列の５’に直接）。いくつかの実施形態では、ＰＡＭ配列は、標的核酸の非スペーサー相補鎖（例えば、非標的鎖）上の標的配列の５’に直接位置する。

【0359】

いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドに対応するＰＡＭは、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’を含む。本明細書で使用される場合、Ｎは、それぞれ、いずれかのヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣ）若しくはそのサブセット（例えば、Ｒ（Ａ又はＧ）、Ｙ（Ｃ又はＴ）、Ｋ（Ｇ又はＴ）、Ｂ（Ｇ、Ｔ、又はＣ）、Ｈ（Ａ、Ｃ、又はＴ）であり得る。いくつかの実施形態では、ＰＡＭは、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＣＧ－３’、５’－ＴＴＡＧ－３’、５’－ＴＡＣＧ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＣＴＧ－３’、５’－ＴＴＧＧ－３’、５’－ＣＧＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＡＡ－３’、５’－ＴＴＣＡ－３’、又は５’－ＴＧＣＧ－３’を含む。いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドを含む二成分複合体は、５’－ＮＮＲ－３’、５’－ＴＮＲ－３’、５’－ＮＴＴＮ－３’、５’－ＮＴＴＲ－３’、又は５’－ＴＴＴＮ－３’配列に隣接する標的核酸に結合する。いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドを含む二成分複合体は、５’－ＴＴＴＧ－３’、５’－ＴＴＣＧ－３’、５’－ＴＴＡＧ－３’、５’－ＴＡＣＧ－３’、５’－ＡＴＴＧ－３’、５’－ＡＴＣＧ－３’、５’－ＴＣＴＧ－３’、５’－ＴＴＧＧ－３’、５’－ＣＧＴＧ－３’、５’－ＧＴＴＡ－３’、５’－ＴＴＡＡ－３’、５’－ＴＴＣＡ－３’、又は５’－ＴＧＣＧ－３’配列に隣接する標的核酸に結合する。

【0360】

いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的核酸の容易にアクセス可能な領域中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的遺伝子のエクソン中に存在する。いくつかの実施形態では、標的核酸は、標的遺伝子のエクソン－イントロン接合部にわたってある。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非コード領域、例えば、遺伝子の調節領域中に存在する。標的核酸が細胞に対して外因性であるいくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞のゲノム中では見出されない配列を含む。

【0361】

好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件には、細胞において通常存在する生理学的条件が含まれる。他の好適なＤＮＡ／ＲＮＡ結合条件（例えば、無細胞系における条件）は、当該技術分野において既知であり、例えば、上記のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい。ＲＮＡガイドに相補的であり、ＲＮＡガイドにハイブリダイズする標的核酸の鎖は「相補鎖」と称され、「相補鎖」に相補的である（したがって、ＲＮＡガイドに相補的ではない）標的核酸の鎖は、「非相補鎖（ｎｏｎｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」又は「非相補鎖（ｎｏｎ－ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ ｓｔｒａｎｄ）」と称される。

【0362】

調製
いくつかの実施形態では、本発明の変異体ポリペプチドは、（ａ）本発明の変異体ポリペプチドを産生する細菌を培養し、変異体ポリペプチドを単離し、任意選択で変異体ポリペプチドを精製し、及び変異体ポリペプチドをＲＮＡガイドと複合体化することによって調製することができる。変異体ポリペプチドはまた、（ｂ）既知の遺伝子工学技術によって、具体的には本発明の変異体ポリペプチドをコードする遺伝子を細菌から単離し、組換え発現ベクターを構築し、次いで、ベクターを宿主細胞中でＲＮＡガイドと複合体化する組換えタンパク質の発現のためのＲＮＡガイドを発現する適切な宿主細胞中にベクターを移動させることによって調製することもできる。或いは、変異体ポリペプチドは、（ｃ）インビトロ結合転写－翻訳システムによって、次いで、ＲＮＡガイドと複合体化することによって調製することができる。本発明の変異体ポリペプチドの調製に使用され得る細菌は、それらが本発明の変異体ポリペプチドを産生することができる限り、特に限定されない。細菌のいくつかの非限定的な例としては、本明細書に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞が挙げられる。

【0363】

ベクター
本発明は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを発現するためのベクターを提供するか、又は本明細書に記載の変異体をコードする核酸はベクター中に組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本発明のベクターは、変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。

【0364】

本発明はまた、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチド、又は変異体ポリペプチドを含む組成物の調製に使用され得るベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載の組成物又はベクターを細胞中に含む。いくつかの実施形態では、本発明は、変異体ポリペプチドを含む組成物、又は変異体ポリペプチドをコードするベクター若しくは核酸を細胞中で発現する方法を含む。方法は、組成物、例えば、ベクター又は核酸を提供する工程と、組成物を細胞に送達する工程とを含み得る。

【0365】

天然又は合成ポリヌクレオチドの発現は、典型的には、目的の遺伝子をコードするポリヌクレオチド、例えば、変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクター中に組み込むことによって達成される。発現ベクターは、それが本発明の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、真核生物細胞中での複製及び組込みに好適であり得る限り、特に限定されない。

【0366】

典型的な発現ベクターは、所望のポリヌクレオチドの発現に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列、並びにプロモーターを含む。例えば、ＲＮＡポリメラーゼのための認識配列を担持するプラスミドベクター（ｐＳＰ６４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔなど）が使用されてもよい。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するものを含むベクターは、それらが導入遺伝子の長期的且つ安定した組込み及び娘細胞へのその増殖を可能にするため、長期的な遺伝子導入を達成するために好適なツールである。ベクターの例としては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシングベクターが挙げられる。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供されてもよい。

【0367】

ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、様々なウイルス学及び分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、ファージウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及びレンチウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能する複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。

【0368】

ベクターの種類は特に限定されず、宿主細胞中で発現され得るベクターを適宜選択することができる。更に具体的に言うと、宿主細胞の種類に応じて、変異体ポリペプチドのポリヌクレオチドからの発現を確実にするためにプロモーター配列が適宜選択され、このプロモーター配列及びポリヌクレオチドが発現ベクターの調製のために様々なプラスミドなどのいずれかに挿入される。

【0369】

更なるプロモーター要素、例えば、増強化配列は転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、プロモーターの数は細菌、開始部位の下流の機能的要素も同様に含有することが示されている。プロモーターに応じて、個々の要素が協調的又は独立して機能して、転写を活性化することができると思われる。

【0370】

更に、本開示は、構成的プロモーターの仕様に限定されるべきではない。誘導性プロモーターも本開示の一部として企図される。誘導性プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、分子スイッチはポリヌクレオチド配列の発現が望ましい場合に作動可能に連結しているポリヌクレオチド配列の発現をオンにすることができるか、又はその発現が望ましくない場合に発現をオフにすることができる。誘導性プロモーターの例としては、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及びテトラサイクリンプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

【0371】

導入される発現ベクターはまた、選択性マーカー遺伝子又はレポーター遺伝子のいずれか、又は両方を含有することができ、ウイルスベクターを通してトランスフェクト又は感染されようとする細胞の集団からの発現細胞の同定及び選択を容易にする。他の態様では、選択性マーカーは、ＤＮＡの別個の部分で運ばれ、コトランスフェクション手法で使用され得る。選択可能なマーカー及びレポーター遺伝子の両方は、適切な転写制御配列によって隣接され、宿主細胞中の発現を可能にすることができる。そのようなマーカーの例としては、真核生物細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子及びネオマイシン耐性遺伝子、並びに大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び他の細菌の培養については、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。そのような選択マーカーを使用することによって、本発明の変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが宿主細胞中に移動され、次いで、間違いなく発現されたかどうかを確認することができる。

【0372】

組換え発現ベクターのための調製方法は特に限定されず、その例としては、プラスミド、ファージ、又はコスミドを使用する方法が挙げられる。

【0373】

発現の方法
本発明は、本明細書に記載の変異体ポリペプチドを翻訳することを含む、タンパク質発現のための方法を含む。

【0374】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の宿主細胞は、変異体ポリペプチドを発現するために使用される。宿主細胞は特に限定されず、様々な既知の細胞が好ましく使用され得る。宿主細胞の具体的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌、酵母（出芽酵母、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、及び分裂酵母、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ））、線虫（カエノラブディティス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ））、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞、及び動物細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、及びＨＥＫ２９３細胞）が挙げられる。上記の発現ベクターを宿主細胞中に転移させるための方法、すなわち形質転換法は特に限定されず、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム法、リポソーム法、及びＤＥＡＥデキストラン法などの既知の方法を使用することができる。

【0375】

宿主が発現ベクターで形質転換された後に、変異体ポリペプチドの産生のために宿主細胞を培養し、栽培し、又は育種することができる。変異体ポリペプチドの発現後に、宿主細胞を回収し、従来の方法（例えば、濾過、遠心分離、細胞破壊、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーなど）に従って、変異体ポリペプチドを培養物などから生成することができる。

【0376】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド発現のための方法は、変異体ポリペプチドの少なくとも５個のアミノ酸、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも１５個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも５０個のアミノ酸、少なくとも１００個のアミノ酸、少なくとも１５０個のアミノ酸、少なくとも２００個のアミノ酸、少なくとも２５０個のアミノ酸、少なくとも３００個のアミノ酸、少なくとも４００個のアミノ酸、少なくとも５００個のアミノ酸、少なくとも６００個のアミノ酸、少なくとも７００個のアミノ酸、少なくとも８００個のアミノ酸、少なくとも９００個のアミノ酸、又は少なくとも１０００個のアミノ酸の翻訳を含む。いくつかの実施形態では、タンパク質発現のための方法は、変異体ポリペプチドの約５個のアミノ酸、約１０個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約５０個のアミノ酸、約１００個のアミノ酸、約１５０個のアミノ酸、約２００個のアミノ酸、約２５０個のアミノ酸、約３００個のアミノ酸、約４００個のアミノ酸、約５００個のアミノ酸、約６００個のアミノ酸、約７００個のアミノ酸、約８００個のアミノ酸、約９００個のアミノ酸、約１０００個のアミノ酸、又はそれ以上の翻訳を含む。

【0377】

様々な方法を宿主細胞中の成熟変異体ポリペプチドの産生のレベルを決定するために使用することができる。そのような方法としては、例えば、本明細書の他の箇所で記載されるような変異体ポリペプチドに特異的なポリクローナル抗体若しくはモノクローナル抗体のいずれか、又は標識付けタグを利用する方法が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な方法としては、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＭＡ）、蛍光イムノアッセイ（ＦＩＡ）、及び蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられるが、これらに限定されない。これら及び他のアッセイは、当該技術分野において周知である（例えば、Ｍａｄｄｏｘ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５８：１２１１［１９８３］を参照されたい）。

【0378】

本開示は、変異体ポリペプチドの細胞中のインビボ発現の方法であって、変異体ポリペプチドをコードするポリリボヌクレオチドを宿主細胞に提供することであって、ポリリボヌクレオチドが変異体ポリペプチドをコードする、提供することと、変異体ポリペプチドを細胞中で発現することと、変異体ポリペプチドを細胞から得ることと、を含む方法を提供する。

【0379】

改変又は突然変異の導入
変異体ポリペプチドをコードする核酸配列又は変異体ポリペプチドは、当該技術分野において既知の合成方法によって生成することができる。親ポリペプチドそれ自体をコードする核酸配列をフレームワークとして使用して、改変又は突然変異を１回以上挿入し、親ポリペプチドをコードする核酸配列を改変することができる。同じように考えて、変化をポリペプチド配列にそれが実効的に合成されるときに導入することによって親ポリペプチドを改変するか、又は突然変異させてもよい。これは、当該技術分野において周知の方法によって達成することができる。

【0380】

親ポリペプチド配列への改変又は突然変異の産生及び導入は、当業者に既知の任意の方法を使用して達成され得る。特に、いくつかの実施形態では、ＰＣＲのためのオリゴヌクレオチドプライマーを、変異体ポリペプチドをコードする核酸配列中に１つ以上の改変又は突然変異を含むＤＮＡテンプレートの迅速な合成のために使用することができる。部位特異的突然変異導入もまた、基礎となるＤＮＡの特定の突然変異誘発を通して、個々のペプチド又は生物学的に機能的に同等のタンパク質若しくはペプチドの調製に有用な技術として使用することもできる。１つ以上のヌクレオチド配列変化をＤＮＡに導入することによって、前述した考慮事項のうちの１つ以上を組み込む技術は、変異体を調製し、試験するための容易な能力を更に提供する。部位特異的突然変異導入は、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列、並びに十分な数の隣接するヌクレオチドの使用を通して変異体の産生を可能にし、十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供して、通過される欠失接合部の両側に安定した二本鎖を形成する。典型的には、約１７～２５ヌクレオチド長のプライマーが好ましく、改変される配列の接合部の両側に約５～１０個の残基を有する。

【0381】

アミノ末端伸長部及び／又はカルボキシル末端伸長部のようなポリペプチドの融合部などの構造変化の導入は、改変又は突然変異の親ポリペプチドの導入と同様な様式で達成することができる。追加のペプチドは、追加のペプチドをコードする適切な核酸配列を親ポリペプチド又は変異体ポリペプチドをコードする核酸配列に含めることによって、親ポリペプチド又は変異体ポリペプチドに添加され得る。任意選択で、追加のペプチドは、合成ポリペプチド産生を通して変異体ポリペプチドに直接付加されてもよい。

【0382】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチド配列と比較すると、標的核酸の２つ以上の遺伝子座（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９個、又はそれ以上）とのオンターゲット結合の増加を有する変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0383】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的配列の２つ以上の遺伝子座とのオンターゲット結合の増加を有する複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0384】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチドと比較すると、標的核酸の２つ以上の標的遺伝子座とのオンターゲット三成分複合体形成の増加を有する変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0385】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的核酸の２つ以上の遺伝子座との三成分複合体形成の増加を有する複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0386】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して親ポリペプチドと比較すると、標的核酸又は標的遺伝子座の標的化の数の増加を示す変異体ポリペプチドを産生するための方法も提供する。

【0387】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、複数の別個のＲＮＡガイドと個々に複合体化されると、複数の親ポリペプチド及びＲＮＡガイドと比較すると、標的核酸又は標的遺伝子座の標的化の数の増加を示す複数の変異体ポリペプチド（例えば、同じアミノ酸配列を有する別個の変異体ポリペプチド）を産生するための方法も提供する。

【0388】

態様では、本発明はまた、改変又は突然変異を親ポリペプチド配列に導入して、変異体ポリペプチドの安定性を増強させるための方法も提供する。変異体ポリペプチドの安定性は、限定されないが、熱変性アッセイ、サーマルシフトアッセイ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、パルスチェイス法、ブリーチチェイス法、シクロヘキシミドチェイス法、円二色性（ＣＤ）分光法、結晶化、及び蛍光ベース活性アッセイによって決定され得るか、又はこれらの技術を含み得る。

【0389】

変異体二成分複合体形成
一般に、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、約１：１のモル比で互いに結合して変異体二成分複合体を形成する。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、単独で又は一緒のいずれかで天然には存在しない。

【0390】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは宿主細胞中で過剰発現され、本明細書に記載されるように精製され、次いで、ＲＮＡガイドと複合して（例えば、試験管中で）変異体リボ核タンパク質（ＲＮＰ）（例えば、変異体二成分複合体）を形成する。

【0391】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、標的核酸に対する結合親和性の増加、オンターゲット結合活性の増加、オンターゲット結合特異性の増加、標的核酸との三成分複合体形成の増加、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる安定性の増加を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、非標的核酸に対するオフターゲット結合の減少、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる標的核酸からの解離の減少を示す。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、標的核酸複合体形成の増加、標的核酸活性、及び／又はインキュベーション時間の範囲にわたる標的核酸特異性を示す。

【0392】

いくつかの実施形態では、二成分複合体の複合体化は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、又は５５℃のいずれか１つよりも低い温度で起こる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、約３７℃で約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のうちの少なくともいずれか１つのインキュベーション時間にわたってＲＮＡガイドから解離しないか、又は遊離ＲＮＡに結合しない。いくつかの実施形態では、二成分複合体形成後に、変異体リボ核タンパク質複合体は、ＲＮＡガイドを異なるＲＮＡと交換しない。

【0393】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、二成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、二成分複合体化緩衝液で置き換えられる緩衝液中で保存され、ＲＮＡガイドとの複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、二成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0394】

いくつかの実施形態では、二成分複合体化緩衝液は、約７．３～８．６の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．３である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．４である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．５である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．６である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．７である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．８である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．９である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．０である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．１である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．２である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．３である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．４である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．５である。一実施形態では、二成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．６である。

【0395】

変異体ポリペプチドの熱安定性は、ＲＮＡガイドの添加、例えば、ＲＮＡガイドへの結合などの好ましい条件下で増加することができる。

【0396】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、本明細書に記載されるような精製の前に宿主細胞中で過剰発現され、ＲＮＡガイドと複合体化することができる。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ若しくはＤＮＡは細胞に導入され、それによって変異体ポリペプチドが細胞中で発現される。変異体ポリペプチドを所望の標的核酸に誘導するＲＮＡガイドもまた、単一のｍＲＮＡ若しくはＤＮＡ構築物と同時に、別々に、又は逐次的のいずれかで細胞に導入され、それによって必要なリボ核タンパク質複合体が細胞中で結合される。

【0397】

変異体二成分複合体の安定性及び機能性の評価
ある特定の実施形態では、最適な変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（本明細書では、変異体二成分複合体と称される）を特定するための方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを組み合わせて変異体二成分複合体を形成することと、（ｂ）変異体二成分複合体の値を測定することと、（ｃ）変異体二成分複合体の値が、参照分子の値よりも大きい場合に変異体二成分複合体が参照分子よりも最適であると決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、値としては、安定性測定値（例えば、Ｔ_ｍ値、熱安定性）、二成分複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は複合体活性を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0398】

いくつかの実施形態では、最適な変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとを組み合わせて変異体二成分複合体を形成する工程と、（ｂ）変異体二成分複合体のＴ_ｍ値を検出する工程と、（ｃ）変異体二成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値より大きいか、又はＴ_ｍ参照値より少なくとも８℃大きい場合に、変異体二成分複合体が安定であると決定する工程とによって特定される。

【0399】

変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）の熱安定性を測定するための工程を伴う方法としては、変異体二成分複合体の安定性を決定するための方法、安定な変異体二成分複合体を促進する条件を決定する方法、安定な変異体二成分複合体をスクリーニングする方法、及び最適なｇＲＮＡを特定して安定な変異体二成分複合体を形成するための方法を挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体の熱安定性値が測定されてもよい。

【0400】

更に、ある特定の実施形態では、参照分子の熱安定性値も測定されてもよい。ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体の測定された熱安定性値が、参照分子の測定された熱安定性値又は本明細書に記載されるような同じ実験条件下で測定された熱安定性参照値よりも大きい場合に、変異体二成分複合体は安定であると決定され得る。ある特定の実施形態では、参照分子は、ＲＮＡガイドが存在しない変異体ポリペプチドであり得る。

【0401】

ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、変性温度値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値である。ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、Ｔ_ｍ値であり得る。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、Ｔ_ｍ参照値であり得る。ある特定の実施形態では、熱安定性値は、サーマルシフトアッセイを使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、熱安定性を測定するために使用されるアッセイは、限定されないが、熱変性アッセイ、サーマルシフトアッセイ、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）、パルスチェイス法、ブリーチチェイス法、シクロヘキシミドチェイス法、円二色性（ＣＤ）分光法、結晶化、及び蛍光ベース活性アッセイが挙げられる、本明細書に記載の技術を伴い得る。

【0402】

ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は変異体二成分複合体の複合体活性が参照分子の値又は参照値（例えば、本明細書で親二成分複合体と称される親ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体の値）よりも大きい場合に特定され得る。例えば、ある特定の実施形態では、変異体二成分複合体は、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体形成の割合、ＲＮＡガイド結合特異性、及び／又は変異体二成分複合体の複合体活性の値が、参照分子の値又は参照値（例えば、親二成分複合体の値）よりも少なくともＸ％大きい場合に特定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されるような変異体二成分複合体の活性を測定することを含む工程を更に含んでもよい。

【0403】

変異体三成分複合体形成
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、変異体三成分複合体を形成する（例えば、試験管又は細胞中で）。一般に、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、約１：１：１のモル比で互いに会合して変異体三成分複合体を形成する。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、単独で又は一緒のいずれかで天然には存在しない。

【0404】

いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるような変異体二成分複合体（例えば、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとの複合体）は、標的核酸と更に複合体化され（例えば、試験管又は細胞中で）、変異体三成分複合体を形成する。

【0405】

いくつかの実施形態では、三成分複合体化は、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃、２６℃、２７℃、２８℃、２９℃、３０℃、３１℃、３２℃、３３℃、３４℃、３５℃、３６℃、３７℃、３８℃、３９℃、４０℃、４１℃、４２℃、４３℃、４４℃、４５℃、５０℃、又は５５℃のいずれか１つよりも低い温度で起こる。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、約３７℃で約１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、１時間、２時間、３時間、４時間、又はそれ以上の時間のうちの少なくともいずれか１つのインキュベーション時間にわたって標的核酸から解離しないか、又は遊離核酸（例えば、遊離ＤＮＡ）に結合しない。いくつかの実施形態では、三成分複合体の形成後に、変異体二成分複合体は、標的核酸を異なる核酸と交換しない。

【0406】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とは、三成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、三成分複合体化緩衝液と置き換えられる緩衝液中で保存され、ＲＮＡガイドと標的核酸との複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、三成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0407】

いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体と標的核酸とが、三成分複合体化緩衝液中で複合体化される。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、三成分複合体化緩衝液で置き換えられる緩衝液中で保存され、標的核酸との複合体を形成する。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体は、三成分複合体化緩衝液中で保存される。

【0408】

いくつかの実施形態では、三成分複合体化緩衝液は、約７．３～８．６の範囲のｐＨを有する。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．３である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．４である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．５である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．６である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．７である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．８である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約７．９である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．０である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．１である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．２である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．３である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．４である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．５である。一実施形態では、三成分複合体化緩衝液のｐＨは、約８．６である。

【0409】

変異体ポリペプチドの熱安定性は、ＲＮＡガイド及び標的核酸の添加などの好ましい条件下で増加することができる。

【0410】

変異体三成分複合体の安定性及び機能性の評価
ある特定の実施形態では、最適な変異体三成分複合体を特定するための方法が本明細書に提供され、方法は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とを組み合わせて変異体三成分複合体を形成することと、（ｂ）変異体三成分複合体の値を測定することと、（ｃ）変異体三成分複合体の値が、参照分子の値よりも大きい場合に変異体三成分複合体が参照分子よりも最適であると決定することと、を含む。いくつかの実施形態では、値としては、安定性測定値（例えば、Ｔ_ｍ値、熱安定性）、三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性測定値、ＤＮＡ結合特異性測定値、及び／又は複合体活性測定値（例えば、ヌクレアーゼ活性測定値）を挙げることができるが、これらに限定されない。

【0411】

いくつかの実施形態では、最適な変異体三成分複合体は、（ａ）試料中で変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドと標的核酸とを組み合わせて変異体三成分複合体を形成する工程と、（ｂ）変異体三成分複合体のＴ_ｍ値を検出する工程と、（ｃ）変異体三成分複合体のＴ_ｍ値が参照分子のＴ_ｍ値より大きいか、又はＴ_ｍ参照値より少なくとも８℃大きい場合に、変異体三成分複合体が安定であると決定する工程とによって特定される。

【0412】

変異体三成分複合体の熱安定性を測定する工程を伴う方法としては、変異体三成分複合体の安定性を決定する方法、安定な変異体三成分複合体を促進する条件を決定する方法、安定な変異体三成分複合体をスクリーニングする方法、及び最適な二成分複合体を特定して安定な変異体三成分複合体を形成するための方法を挙げることができるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体の熱安定性値が測定されてもよい。

【0413】

更に、ある特定の実施形態では、参照分子の熱安定性値も測定されてもよい。ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体の測定された熱安定性値が、参照分子の測定された熱安定性値又は本明細書に記載されるような同じ実験条件下で測定された熱安定性参照値よりも大きい場合に、変異体三成分複合体は安定であると決定され得る。ある特定の実施形態では、参照分子は、ＲＮＡガイド及び／又は標的核酸が存在しない変異体ポリペプチドであり得る。

【0414】

ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、変性温度値であってもよい。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、変性温度参照値である。ある特定の実施形態では、測定される熱安定性値は、Ｔ_ｍ値であり得る。これらの実施形態では、熱安定性参照値は、Ｔ_ｍ参照値であり得る。ある特定の実施形態では、熱安定性値は、サーマルシフトアッセイを使用して測定され得る。ある特定の実施形態では、熱安定性を測定するために使用されるアッセイは、限定されないが、示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）、示差走査熱量測定（ＤＳＣ）、又は等温滴定型熱量測定（ＩＴＣ）が挙げられる、本明細書に記載の技術を伴い得る。

【0415】

ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体の三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性、ＤＮＡ結合特異性、及び／又は複合体活性（例えば、ヌクレアーゼ活性）が参照分子の値又は参照値（例えば、親三成分複合体の値）よりも大きい場合に特定され得る。例えば、ある特定の実施形態では、変異体三成分複合体は、変異体三成分複合体の三成分複合体形成の割合、ＤＮＡ結合親和性、ＤＮＡ結合特異性、及び／又は複合体活性の値が、参照分子の値又は参照値（例えば、親三成分複合体の値）よりも少なくともＸ％大きい場合に特定され得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法は、本明細書に記載されるような変異体三成分複合体の活性を測定することを含む工程を更に含んでもよい。

【0416】

送達
本明細書に記載の組成物又は複合体は、例えば、担体及び／又はポリマー担体、例えば、リポソームなどの担体を含んで配合され、細胞（例えば、原核生物、真核生物、植物、哺乳動物など）に既知の方法によって送達することができる。そのような方法としては、トランスフェクション（例えば、脂質媒介、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）、エレクトロポレーション若しくは膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、マイクロインジェクション、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フュージーン（ｆｕｇｅｎｅ）、直接音響負荷、細胞圧縮、光学的トランスフェクション、原形質体融合、インペイルフェクション、マグネトフェクション、エクソソーム媒介転移、脂質ナノ粒子媒介転移、及びそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

【0417】

いくつかの実施形態では、方法は、１つ以上の核酸（例えば、変異体ポリペプチドをコードする核酸、ＲＮＡガイド、ドナーＤＮＡなど）、それらの１つ以上の転写物、及び／又は予め形成された変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）を細胞に送達することを含む。例示的な細胞内送達方法としては、ウイルス若しくはウイルス様物質；化学ベースのトランスフェクション法、例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム、又はカチオン性ポリマー（例えば、ＤＥＡＥ－デキストラン又はポリエチレンイミン）を使用するもの；非科学的方法、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、細胞圧縮、ソノポレーション、光学的トランスフェクション、インペイルフェクション、原形質体融合、細菌接合、プラスミド若しくはトランスポゾンの送達；粒子ベースの方法、例えば、遺伝子銃、マグネクトフェクション（ｍａｇｎｅｃｔｏｆｅｃｔｉｏｎ）若しくはマグネット支援トランスフェクション、粒子銃；並びにハイブリッド法、例えば、ヌクレオフェクションが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本出願は、そのような方法によって産生される細胞、及びそのような細胞を含むか、又はそれらから産生される生物（動物、植物、又は真菌など）を更に提供する。

【0418】

細胞
本明細書に記載のポリペプチド、組成物、又は複合体は、様々な細胞に送達され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、単離された細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、細胞培養物中にある。いくつかの実施形態では、細胞は、エクスビボにある。いくつかの実施形態では、細胞は、生きている生物から得られ、細胞培養物中で維持される。いくつかの実施形態では、細胞は、単細胞生物である。

【0419】

いくつかの実施形態では、細胞は、原核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は細菌細胞であるか、又は細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細菌細胞は、親ポリペプチドが由来する細菌種には関係しない。いくつかの実施形態では、細胞は、古細菌細胞であるか、又は古細菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細菌は、真核生物細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は植物細胞であるか、又は植物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は真菌細胞であるか、又は真菌細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は動物細胞であるか、又は動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は無脊椎動物細胞であるか、又は無脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は脊椎動物細胞であるか、又は脊椎動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は哺乳動物細胞であるか、又は哺乳動物細胞に由来する。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、ゼブラフィッシュ細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、齧歯類細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は合成的に作製され、人工細胞と呼ばれることもある。

【0420】

いくつかの実施形態では、細胞は、細胞株に由来する。組織培養のための多種多様な細胞株が、当該技術分野において知られている。細胞株の例としては、２９３Ｔ、ＭＦ７、Ｋ５６２、ＨｅＬａ、及びそれらのトランスジェニック品種が挙げられるが、これらに限定されない。細胞株は、当業者に既知の様々な供給源から入手可能である（例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）を参照されたい）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の核酸（Ａｇｏコードベクター及びｇＤＮＡなど）又はＡｇｏ－ｇＤＮＡ複合体でトランスフェクトされた細胞を用いて標的核酸に対して改変を含む新しい細胞株を確立するために、１つ以上のベクター由来細胞を含む新しい細胞株を確立する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の核酸（変異体ポリペプチドをコードするベクター及びＲＮＡガイドなど）又は変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）で一過性に又は非一過性にトランスフェクトされた細胞、又はそのような細胞から誘導された細胞株が１つ以上の試験化合物の評価で使用される。

【0421】

いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド）及び／又は変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上の核酸を宿主細胞に導入することを含む。一実施形態では、標的ＤＮＡを含む細胞は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボにある。他の実施形態では、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡガイド）及び／又は変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、例えば、アデノ随伴ウイルス構築物、組換えアデノウイルス構築物、組換えレンチウイルス構築物、組換えレトロウイルス構築物などが挙げられるが、これらに限定されない組換え発現ベクターに含まれる。

【0422】

いくつかの実施形態では、細胞は初代細胞である。例えば、初代細胞の培養は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、１５回、又はそれ以上継代され得る。いくつかの実施形態では、初代細胞は、任意の既知の方法によって固体から採取される。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球吸着除去療法、密度勾配分離法によって採取されてもよい。組織、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃などからの細胞は、生検によって採取され得る。適切な溶液を採取された細胞の分散又は懸濁のために使用してもよい。そのような溶液は、一般には、平衡塩類溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ハンクス平衡塩類溶液など）であってもよく、これらは低濃度での許容可能な緩衝液と共にウシ胎児血清又は他の天然に存在する因子で好都合に補充されている。緩衝液としては、ＨＥＰＥＳ、リン酸緩衝液、乳酸緩衝液などを挙げることができる。細胞はすぐに使用されてもよく、又はそれらは保存されてもよい（例えば、凍結することによって）。凍結細胞は融解され、再使用可能であり得る。細胞は、ＤＭＳＯ、血清、培地緩衝液（例えば、１０％ＤＭＳＯ、５０％血清、４０％緩衝化培地）中で凍結することができ、及び／又はいくつかの他のそのような一般的な溶液を凍結温度で用いて細胞を保存することができる。

【0423】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチドは、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）において二本鎖切断又は一本鎖切断を誘発させるヌクレアーゼ活性を有する。二本鎖切断は、相同組換え（ＨＤＲ）、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）、又は非相同末端再結合（Ａ－ＮＨＥＪ）を含む細胞内因性ＤＮＡ修復経路を刺激することができる。ＮＨＥＪは、相同テンプレートを必要とすることなく切断された標的核酸を修復することができる。これは、１つ以上のヌクレオチドの標的核酸への欠失又は挿入をもたらし得る。ＨＤＲは、ドナーＤＮＡなどの相同テンプレートと共に起こり得る。相同テンプレートは、標的核酸切断部位に隣接する配列に相同である配列を含み得る。いくつかの場合では、ＨＤＲは、外因性ポリヌクレオチド配列を切断された標的核酸に挿入することができる。ＮＨＥＪ及び／又はＨＤＲに起因する標的ＤＮＡの改質は、例えば、突然変異、欠失、変更、組換え、遺伝子修正、遺伝子置換、遺伝子タギング、導入遺伝子ノックイン、遺伝子破壊、及び／又は遺伝子ノックアウトに繋がり得る。

【0424】

いくつかの実施形態では、細胞培養は、本方法の効率を高めるために同調される。いくつかの実施形態では、Ｓ期及びＧ２期にある細胞は、ＨＤＲ媒介遺伝子編集に使用される。いくつかの実施形態では、細胞は、任意の細胞周期で本方法にかけられてもよい。いくつかの実施形態では、オーバープレーティングにある細胞は、本方法の効率を著しく低下させる。いくつかの実施形態では、本方法は、約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、又は７０％のいずれか１つ以下の集密度で細胞培養に適用される。

【0425】

いくつかの実施形態では、変異体ポリペプチド／ＲＮＡガイド複合体（すなわち、変異体二成分複合体）の細胞中での標的核酸への結合は、１つ以上の内因性細胞分子又はＤＮＡ修復経路以外の経路を動員して標的核酸を修飾する。いくつかの実施形態では、変異体二成分複合体の結合は、１つ以上の内因性細胞分子又は経路の標的核酸へのアクセスをブロックし、それにより標的核酸を修飾する。例えば、変異体二成分複合体の結合は、内因性転写又は翻訳機械をブロックして、標的核酸の発現を減少させることができる。

【0426】

いくつかの実施形態では、細胞中で標的ＤＮＡ分子を修飾するための方法が提供される。方法は、細胞内部で標的ＤＮＡ分子を本明細書に記載の変異体ポリペプチドと、５’から３’への順序で、標的ＤＮＡ分子の標的配列とハイブリダイズする第１のヌクレオチドセグメント、ヌクレオチドリンカー、及び第１のヌクレオチドセグメントとハイブリダイズして、二本鎖ＲＮＡデュプレックスを形成する第２のヌクレオチドセグメントを含む単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡとに接触させることを含む。変異体ポリペプチドは、細胞内部で単一分子ＤＮＡ標的化ＲＮＡと複合体を形成し、標的ＤＮＡ分子が修飾される。

【0427】

キット
本発明はまた、例えば、本明細書に記載の方法を実行するために使用され得るキットを提供する。いくつかの実施形態では、キットは、本発明の変異体ポリペプチド、例えば、表２の変異体を含む。いくつかの実施形態では、キットは、そのような変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、任意選択でポリヌクレオチドは、例えば、本明細書に記載されるようなベクター内に含まれる。キットはまた、任意選択で、例えば、本明細書に記載されるようなＲＮＡガイドを含む。本発明のキットのＲＮＡガイドは、当該技術分野において既知であるように、目的の配列を標的とするように設計され得る。変異体ポリペプチドとＲＮＡガイドとは、キット内の同じバイアル又は他の容器内にパッケージ化され得るか、又は別のバイアル若しくは他の容器にパッケージ化され得、それらの内容物は使用前に混合され得る。キットは更に、任意選択で、緩衝液及び／又は変異体ポリペプチド及び／又はＲＮＡガイドの使用のための説明書を含み得る。

【0428】

本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

【実施例】

【0429】

以下の実施例は、本発明のいくつかの実施例を更に例証するために提供されているが、本発明の範囲の限定することを意図するものではなく、当業者に既知の他の手法、方法論、又は技術が代替え的に使用されてもよいことがそれらの例示的な性質によって理解されるであろう。

【0430】

実施例１－変異体構築物の操作
この実施例では、変異体構築物を生成した。

【0431】

単一の突然変異を含むＤＮＡテンプレートを、ＩＤＴ（商標）（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）から注文した変異原性フォワードプライマー及び変異原性リバースプライマーを使用する２つのＰＣＲステップを介して構築した。第１のステップでは、ＰＣＲ反応の２つのセットを３８４のプレートで行い、２つの断片を生成した。２つのＰＣＲ断片の重複領域は所望の単一突然変異を含有し、第２のＰＣＲを介してのＤＮＡテンプレート全体のアセンブリを可能にした。第２のステップでは、第１のステップからの精製断片をオーバーラッピングＰＣＲ（ＯＬ ＰＣＲ）のためのテンプレートとして使用し、Ｆｗ及びＲｖオリゴをＯＬ ＰＣＲプライマーとしてベクターバックボーンにアニーリングした。得られた直線状ＤＮＡテンプレートは、Ｔ７プロモーター、Ｔ７ターミネーター、及びポリペプチド用のオープンリーディングフレームを含有した。

【0432】

これらの直線状ＤＮＡテンプレートを、無細胞転写及び翻訳システムで直接使用して、単一突然変異を含有するポリペプチド変異体を発現させた。変異体構築物を更に個々に一過性トランスフェクションベクター中に転移させた。更に、組み合わせ突然変異を含むＤＮＡテンプレートをＰＣＲによって調製し、その後一過性トランスフェクションベクターに転移させた。

【0433】

実施例２－変異体二成分複合体の検出のための蛍光偏光アッセイ
この実施例では、野生型若しくは変異体ヌクレアーゼポリペプチド及びＲＮＡガイドの二成分複合体を形成する能力を、蛍光偏光アッセイを通して評価する。

【0434】

ダイレクトリピート配列の上流のＴ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列の逆相補配列を含む直線状ｓｓＤＮＡ断片、及び所望の２０ｂｐ ＲＮＡガイド標的をＩＤＴ（商標）によって合成する。次いで、ユニバーサルＴ７フォワードオリゴを逆相補配列ｓｓＤＮＡにアニーリングし（５℃／分で９５～４℃）、Ｋｌｅｎｏｗ断片（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を用いて２５℃で１５分間埋めることによって、直線状ｄｓＤＮＡインビトロ転写（ＩＶＴ）テンプレートを生成する。次いで、得られたＩＶＴテンプレートを、ＨｉＳｃｒｉｂｅ Ｔ７ Ｈｉｇｈ Ｙｉｅｌｄ ＲＮＡ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））を用いて、３７℃で４時間ＲＮＡガイドに転写する。転写後に、各ＲＮＡガイドをＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、使用するまで－２０℃で保存した。

【0435】

次いで、ＲＮＡガイドを６－カルボキシフルオレセイン（６－ＦＡＭ）（ＩＤＴ（商標））で標識する。１×アッセイ緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ）中の２５ｎＭのヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）を、増加する濃度の標識されたＲＮＡガイド（７．５～２５０ｎＭ）で滴定する。複合体を３７℃で３０分間インキュベートし、その後マイクロプレートリーダー（Ｉｎｆｉｎｉｔｅ（登録商標）２００ Ｐｒｏ、Ｔｅｃａｎ）を使用して蛍光偏光測定値を取る。

【0436】

異なる温度での二成分複合体形成も調べる。更に、上述したような結合実験を、２５、５０、６０、及び７０℃で等温的に実施する。

【0437】

増加する濃度のＲＮＡガイドによるヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）の滴定の際の二成分複合体の形成（又は、増加する濃度のヌクレアーゼポリペプチドによるＲＮＡガイドの滴定の際の二成分複合体の形成）は、ミリ偏光（ｍＰ）単位での蛍光偏光シグナルにおける変化をもたらす。蛍光偏光シグナルにおける変化を、ＲＮＡガイド濃度の範囲にわたってプロットすることによって結合曲線を生成する。

【0438】

この実施例は、ヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）のＲＮＡガイドに対する結合親和性がどのように決定され、比較され得るかを示している。

【0439】

実施例３－変異体二成分複合体の検出のためのＲＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ
この実施例は、ヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体）のＲＮＡガイドに対する結合の能力を決定するためのＲＮＡ ＥＭＳＡの使用を記載する。

【0440】

ＩＤＴ（商標）からの合成ＲＮＡガイドを、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８に以前に詳述されたように、５’ＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ（ＩＲ８００染料又はＩＲ８００とも称される）で、５’ＥｎｄＴａｇ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｖｅｃｔｏｒ（登録商標）Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）及びＩＲＤｙｅ（登録商標）８００ＣＷ Ｍａｌｅｉｍｉｄｅ（ＬＩ－ＣＯＲ（登録商標）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して標識付けする。標識付けの後、ＲＮＡガイドを、フェノールクロロホルム抽出を介して浄化及び濃縮する。濃度を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）によって定量化する。

【0441】

ＲＮＡ結合アッセイについては、ヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）を１×結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中２．５μＭに希釈する。次いで、ポリペプチドを１×結合緩衝液中で２．５μＭから３７．５μＭまで段階希釈する。ポリペプチドを、１×結合緩衝液に５０ｎＭのＩＲ８００標識ＲＮＡガイドを加えたもので、１：１０に再度希釈し、十分に混合する。これらの反応物は、０．５～５μｇのｔＲＮＡを更に含めることができ、これはポリペプチドのＲＮＡへの非特異的結合を減少させるための競合的阻害剤として機能し、したがって正確な特異的結合の決定を容易にする。反応物を３７℃で１時間インキュベートする。染色全面可視化のために、１μＬの１００×ブロモフェノールブルーを反応物に添加し、全反応物を６％のＤＮＡ遅滞（Ｒｅｔａｒｄａｔｉｏｎ）ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））上に充填し、８０Ｖで９０分間移動させた。ゲルを、Ｌｉｃｏｒ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘで画像化する。

【0442】

このアッセイは、ＲＮＡがゲルを通って移動する速度がそのサイズによって決定されるという原理に基づいている。ＲＮＡのみの試料は、特定の距離を移動することができる。しかしながら、ＲＮＡがポリペプチドに結合する場合、より大きくあまり移動しないＲＮＡ複合体を表すバンドが出現し、これはゲル上で「アップシフトされる」。

【0443】

したがって、２つのバンド：１）ＲＮＡのみのバンド、及び２）ポリペプチドに結合した「アップシフトされた」ＲＮＡバンドが測定される。全てのＲＮＡがポリペプチドに結合している場合、アップシフトされたバンドのみが観察される。ポリペプチドの濃度が減少するにつれて、アップシフトされたバンドの強度が減少し、一方、ＲＮＡのみのバンドの強度が増加する。ヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）に対するＲＮＡ結合親和性の比較において、より高いポリペプチド／ＲＮＡ親和性は、より低い濃度のポリペプチドでのより特異的な結合によって特徴付けられる。

【0444】

この実施例は、野生型ヌクレアーゼポリペプチドのＲＮＡガイドに対する結合親和性及び変異体ポリペプチドのＲＮＡガイドに対する結合親和性がどのように決定され、比較され得るかを示している。

【0445】

実施例４－変異体二成分複合体についてのインビトロ切断アッセイ
この実施例は、ＲＮＰを調製するための方法及びＲＮＰのインビトロ生化学的活性を決定するための方法を記載する。

【0446】

野生型又は変異体ポリペプチドをコードするベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））に形質転換し、Ｔ７プロモーター下で発現させる。形質転換細胞を、最初に５ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ （ＴＥＫＮＯＶＡ（商標））＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で一晩増殖させ、続いて、１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＥＫＮＯＶＡ（商標））＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシンに接種した。細胞を、０．６～０．８のＯＤ_６００になるまで３７℃で増殖させ、次いで、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘導する。次いで、培養物を１８℃で更に１４～１８時間培養する。培養物を採取し、遠心分離によりペレット化し、次いで、５ｇの細胞ペレット当たり１ｍＬの抽出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中に再懸濁させる。細胞破砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を介して細胞を溶解し、次いで、溶解物を清澄化させるために、４℃にて２０，０００×ｇで２０分間遠心分離する。０．２％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を清澄化溶解物に添加し、一定の転倒型回転を用いて４℃で２０分間インキュベートする。次いで、溶解物を２０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離する。溶解物を、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製する。精製後、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動させ、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、３０ｋＤのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを使用して濃縮する。タンパク質を、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、及び５０％のグリセロールに緩衝液交換する。次いで、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて濃度を測定し、タンパク質を－２０℃で保存する。

【0447】

合成ｃｒＲＮＡ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）対タンパク質の２：１の比を使用して、ＲＮＰを調製する。ＲＮＰを１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）２（ＮＥＢ２；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）；５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中で３７℃にて３０分間複合体化する。複合体化後に、ＲＮＰを１×ＮＥＢ２を希釈緩衝液として使用して希釈する。アポ反応物（ＲＮＡガイドを含まないタンパク質）を同じ方法で調製し、Ｈ_２ＯでｃｒＲＮＡの体積に作り上げた。

【0448】

標的ｄｓＤＮＡ基質（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を２０ｎＭでＲＮＰ及びアポ試料に添加する。反応物を十分に混合した後、３７℃で１時間インキュベートし、次いで、１μＬの２０ｍｇ／ｍＬプロテイナーゼＫ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））でクエンチする。反応物を５０℃で更に１５分間インキュベートし、次いで、反応物全体を２％アガロースＥ－ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））上を移動させた。Ｇｅｌ Ｄｏｃ（商標）ＥＺ Ｇｅｌ Ｉｍａｇｅｒ（ＢｉｏＲａｄ（登録商標））で臭化エチジウムによってゲルを可視化した。

【0449】

２つのタイプのバンド：１）完全長（非切断）ＤＮＡバンド、及び２）１つ以上のダウンシフトされた切断ＤＮＡバンドの強度を測定する。不活性ＲＮＰは、完全長ＤＮＡバンドによって特徴付けられる。活性ＲＮＰは、１つ以上のダウンシフトされた切断ＤＮＡバンドをもたらす。活性ＲＮＰの濃度が減少するにつれて、完全長バンドの強度は増加し、切断バンドの強度は減少する。複数のＲＮＰの活性の比較において、別のものよりも高い活性を有するＲＮＰは、より低いＲＮＰ濃度でのより強い切断バンドによって特徴付けられる。

【0450】

この実施例の方法は、標的ＤＮＡに対する野生型又は変異体ＲＮＰ（二成分複合体）のインビトロ切断活性の比較を可能にする。

【0451】

実施例５－変異体ポリペプチド及び変異体二成分複合体のインビトロ安定性アッセイ
この実施例では、変異体ＲＮＰの安定性を評価する。

【0452】

加速安定性試験については、ＲＮＰ（５μＭ）を実施例４に記載されたものと同じ方法で生成し、試料をその後２５℃で４８時間保存する。

【0453】

インビトロ切断アッセイ（実施例４に記載されるような）をＲＮＰ試料に対して実施する。これらの結果を実施例４のものと比較して、２５℃で４８時間保存されたＲＮＰが生化学的活性を保持する範囲を決定する。

【0454】

アポポリペプチド（ＲＮＡガイドを含まない）も２５℃で４８時間インキュベートする。ＲＮＡ ＥＭＳＡアッセイを、実施例３に記載された方法を使用してアポ試料で実施する。これらの結果を実施例３のものと比較して、変異体ポリペプチドがＲＮＡガイドと二成分複合体を形成することができる範囲を決定する。

【0455】

２５℃で４８時間インキュベートしたアポ試料も、実施例４に記載された方法を使用して、ＲＮＡガイドと複合体化してＲＮＰを形成させる。次いで、実施例４の方法に従って、インビトロ切断アッセイを実施する。アッセイの結果を実施例４のものと比較して、２５℃でインキュベートしたタンパク質で形成された変異体ＲＮＰの活性レベルを評価する。

【0456】

この実施例の方法は、野生型及び変異体ポリペプチド、並びに野生型及び変異体ＲＮＰ（二成分複合体）の安定性の比較を可能にする。別のヌクレアーゼポリペプチドのＲＮＡガイドに対する特異的結合よりも大きなＲＮＡガイドに対する特異的結合を実証するヌクレアーゼポリペプチドは、より安定なポリペプチドの指標である。別のＲＮＰによる切断よりもロバストな標的ＤＮＡのインビトロ切断を実証するＲＮＰは、より安定な二成分複合体の指標である。

【0457】

実施例６－変異体三成分複合体の検出のためのＤＮＡ電気泳動移動度シフトアッセイ
この実施例は、三成分複合体を形成するためのＲＮＡガイド、ヌクレアーゼポリペプチド（野生型又は変異体ポリペプチド）、及び標的ＤＮＡ基質の能力を決定するためのＤＮＡ ＥＭＳＡの使用について記載する。

【0458】

野生型又は変異体ポリペプチドをコードするベクターを、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ ＢｉｏＬａｂｓ（登録商標））及びＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙＳＳ（Ｎｏｖａｇｅｎ（登録商標））に形質転換する。形質転換された細胞を、最初に５ｍＬのＬｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ（ＴＥＫＮＯＶＡ（商標））＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシン中で一晩増殖させ、続いて１ＬのＴｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ培地（ＴＥＫＮＯＶＡ（商標））＋５０μｇ／ｍＬのカナマイシンに接種する。細胞を０．６～０．８のＯＤ_６００になるまで３７℃で増殖させ、次いで０．５ｍＭＩＰＴＧを用いてタンパク質発現を誘発させる。次いで、培養物を１８℃で更に１４～１８時間増殖させる。培養物を採取し、遠心分離によってペレット化し、次いで５ｇの細胞ペレット当たり１ｍＬの抽出緩衝液（５０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％のｇｌｙｃｅｒｏｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ）中に再懸濁させる。細胞破砕器（Ｃｏｎｓｔａｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ Ｌｉｍｉｔｅｄ）を介して細胞を溶解し、次いで、溶解物を清澄化させるために、４℃にて２０，０００×ｇで２０分間遠心分離する。０．２％のポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を清澄化溶解物に添加し、一定の転倒型回転を用いて４℃で２０分間インキュベートする。次いで、溶解物を２０，０００×ｇで１０分間再度遠心分離する。溶解物を、イオン交換クロマトグラフィーを介して精製する。精製後、画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥゲル上を移動させ、適切なサイズのタンパク質を含有する画分をプールし、３０ｋＤのＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ１５ Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ Ｕｎｉｔｓを使用して濃縮する。タンパク質を、１２．５ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．０、１２０ｍＭのＮａＣｌ、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、及び５０％のグリセロールに緩衝液交換した。次いで、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて濃度を測定し、タンパク質を－２０℃で保存した。

【0459】

合成ＲＮＡガイド（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＩＤＴ（商標））対ポリペプチドの２：１の比を使用して、ＲＮＰを調製する。本明細書に開示されるＰＡＭ配列に隣接する標的を選択し、ＲＮＡガイドを本明細書に記載されるようなダイレクトリピート配列を使用して設計する。ＲＮＰを１×ＮＥＢｕｆｆｅｒ（商標）（ＮＥＢ２；Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標）；５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ_２、１ｍＭのＤＴＴ、ｐＨ７．９）中で３７℃にて３０分間複合体化する。複合体化後に、１×ＮＥＢ２を希釈緩衝液として使用して、５μＭから３７．５μＭまでの５ポイント１：２段階希釈を実施する。アポ反応物（ＲＮＡガイドを含まないタンパク質）を同じ方法で調製し、Ｈ_２ＯでＲＮＡガイドの体積に作り上げる。

【0460】

ｄｓＤＮＡ標的基質を、オリゴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）からのＰＣＲによって生成する。ＰＣＲの前に、Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２０１８に記載されるように、フォワードプライマーの５’末端をＩＲ８００染料で標識付けする。Ａｍｐｌｉｔａｑ Ｇｏｌｄ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を使用して、次いで、ｄｓＤＮＡをＩＲ８００標識フォワードプライマー及び非標識リバースプライマーを用いて増幅する。得られたｄｓＤＮＡをＤＮＡ Ｃｌｅａｎ ａｎｄ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ）を用いて精製し、Ｎａｎｏｄｒｏｐ（商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））によって定量化する。

【0461】

ＲＮＰ試料及びアポ（対照）試料を、１×結合緩衝液（５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ、１ｍＭのＴＣＥＰ、１０％のグリセロール、２ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）に２０ｎＭのＩＲ８００標識標的ＤＮＡ基質を加えたものに１：１０で希釈し、十分に混合する。反応物を３７℃で１時間インキュベートする。染色全面可視化のために、ブロモフェノールブルーを反応物に添加し、反応物全体を６％のＤＮＡ遅滞ゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））上に充填し、８０Ｖで９０分間移動させる。ゲルを、Ｌｉｃｏｒ（登録商標）Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）ＣＬｘで画像化する。

【0462】

このアッセイでは、ＤＮＡがゲルを通って移動する速度がそのサイズによって決定される。ＤＮＡのみの試料は、特定の距離を移動することができる。しかしながら、ＲＮＰがＤＮＡに結合する場合、より大きくあまり移動しないＤＮＡ複合体を表すバンドが出現し、これはゲル上で「アップシフトされる」。

【0463】

この実施例は、変異体ＲＮＰ（変異体二成分複合体）のＤＮＡ標的に対する親和性（三成分複合体を生成するための）が、野生型ＲＮＰ（野生型二成分複合体）のＤＮＡ標的に対する親和性とどのように比較され得るかを示している。

【0464】

実施例７－変異体ポリペプチドによる哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例は、一過性トランスフェクションによって哺乳動物細胞中に導入された変異体を使用する複数の標的に対するインデル評価を記載する。

【0465】

配列番号３の変異体を、ｐｃｄａ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中にクローニングした。ＲＮＡガイドをｐＵＣ１９バックボーン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））中にクローニングした。次いで、プラスミドをマキシ－プレップ（ｍａｘｉ－ｐｒｅｐｐｅｄ）し、希釈した。ＲＮＡガイド及び標的配列を表５に示す。使用したＰＡＭ配列は、５’－ＴＴＴＧ－３’であった。

【0466】

【表23】

【0467】

トランスフェクションのおよそ１６時間前に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｄ１０培地）中の２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの当日に、細胞は７０～９０％の集密度であった。トランスフェクションされる各ウェルについては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）との混合物を調製し、室温で５分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）：Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）混合物を、ヌクレアーゼプラスミド、ＲＮＡガイドプラスミド、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）を含有する別々の混合物に添加した（溶液２）。陰性対照の場合、ＲＮＡガイドプラスミドは、溶液２には含まれなかった。溶液１及び溶液２を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液１と溶液２の混合物を、細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに滴加した。トランスフェクションのおよそ７２時間後に、各ウェルの中心にＴｒｙｐＬＥ（商標）を添加することによって細胞をトリプシン処理し、３７℃でおよそ５分間インキュベートした。次いで、Ｄ１０培地を各ウェルに添加し、混合して細胞を再懸濁させた。再懸濁した細胞を５００ｇで１０分間遠心分離してペレットを得て、上清を廃棄した。次いで、細胞ペレットをＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））中に再懸濁させ、細胞を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、及び９８℃で１０分間インキュベートした。

【0468】

次世代シーケンシング用の試料を、２ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１のラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に依存する特異的ゲノム領域を増幅するために使用した。ラウンド２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）は、イルミナアダプター及びインデックスを添加するために実施した。次いで、反応物をプールし、カラム精製によって精製した。１５０ Ｃｙｃｌｅ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｍｉｄ又はＨｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２．５キットを用いて、シーケンシングランを実施した。

【0469】

配列番号３と比べて、単一のＥ３８Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ８９Ｒ、Ｓ２２３Ｒ、Ｐ３５３Ｇ、Ｌ３５４Ｇ、Ｌ３６０Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、Ｅ５６６Ｒ、又はＤ７３０Ｒ置換を含む変異体ポリペプチドは、配列番号３の親ポリペプチドと比べてインデル活性の増加を示した。変異体ポリペプチドの各々についてのインデル活性における増加は、親ポリペプチドによるインデル活性と比べておよそ２～４倍高かった。Ｄ８９Ｒ、Ｌ３５４Ｇ、Ｋ３６８Ｇ、又はＥ５６６Ｒ置換を有する変異体ポリペプチドについてのインデル活性を表１に示す。

【0470】

表６の組み合わせ突然変異を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で更にスクリーニングした。図１に示すように、組み合わせ突然変異体の各々は、配列番号３の野生型ポリペプチドのものよりも高いインデル活性を示した。

【0471】

【表24】

【0472】

【表25】

【0473】

【表26】

【0474】

【表27】

【0475】

【表28】

【0476】

【表29】

【0477】

【表30】

【0478】

この実施例は、配列番号３のポリペプチドがインデル（例えば、ヌクレアーゼ）活性を増加させるように操作されたことを示す。

【0479】

実施例８－点突然変異を含む変異体ポリペプチドによる哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例は、一過性トランスフェクションにより哺乳動物細胞中に導入された変異体を使用する複数の標的に対するインデル評価を記載する。

【0480】

それぞれが配列番号３と比べて単一のアミノ酸置換を含む４５個の変異体ポリペプチドを操作し、表７に列挙される３つの標的で活性を試験した。変異体ポリペプチドをｐｃＤＮＡ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中にクローニングした。表７のＲＮＡガイド（ｃｒＲＮＡ）を、ｐＵＣ１９バックボーン（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ（登録商標））中にクローニングした。プラスミドをプレップし（ｐｒｅｐｐｅｄ）、カラム精製して希釈した。

【0481】

【表31】

【0482】

トランスフェクションのおよそ１６時間前に、ＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ＋Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ（Ｄ１０培地）中の２５，０００個のＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに播種した。トランスフェクションの当日に、細胞は７０～９０％の集密度であった。トランスフェクションされる各ウェルについては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）とＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）との混合物を調製し、室温で５分間インキュベートした（溶液１）。インキュベーション後、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ２０００（商標）：Ｏｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）混合物を、ヌクレアーゼプラスミド、ＲＮＡガイドプラスミド、及びＯｐｔｉ－ＭＥＭ（商標）を含有する別々の混合物に添加した（溶液２）。陰性対照の場合、ＲＮＡガイドプラスミドは、溶液２には含まれなかった。溶液１及び溶液２を上下にピペッティングすることによって混合し、次いで、室温で２５分間インキュベートした。インキュベーション後、溶液１と溶液２の混合物を、細胞を含む９６ウェルプレートの各ウェルに滴加した。トランスフェクションのおよそ７２時間後に、各ウェルの中心にＴｒｙｐＬＥ（商標）を添加することによって細胞をトリプシン処理し、３７℃でおよそ５分間インキュベートした。次いで、Ｄ１０培地を各ウェルに添加し、混合して細胞を再懸濁させた。再懸濁した細胞を５００ｇで１０分間遠心分離してペレットを得て、上清を廃棄した。次いで、細胞ペレットをＱｕｉｃｋＥｘｔｒａｃｔ（商標）緩衝液（Ｌｕｃｉｇｅｎ（登録商標））中に再懸濁させ、細胞を６５℃で１５分間、６８℃で１５分間、及び９８℃で１０分間インキュベートした。

【0483】

次世代シーケンシング用の試料を、２ラウンドのＰＣＲによって調製した。第１のラウンド（ＰＣＲ１）は、標的に依存する特異的ゲノム領域を増幅するために使用した。ラウンド２のＰＣＲ（ＰＣＲ２）は、イルミナアダプター及びインデックスを添加するために実施した。次いで、反応物をプールし、カラム精製によって精製した。１５０ Ｃｙｃｌｅ ＮｅｘｔＳｅｑ ５００／５５０ Ｍｉｄ又はＨｉｇｈ Ｏｕｔｐｕｔ ｖ２．５キットを用いて、シーケンシングランを実施した。

【0484】

インデルを示すＮＧＳ読み取り値のパーセンテージとして計算された変異体ポリペプチドについてのインデル活性を図２Ａ及び２Ｂに示す。次の２１個の変異体は、配列番号３の親ポリペプチドと比較して、インデル活性の増加を示した：Ｑ６８３Ｋ、Ｅ５８６Ｇ、Ｑ５５６Ｒ、Ｄ３５６Ｇ、Ｑ４２１Ｒ、Ｑ５５６Ｋ、Ｎ５７９Ｋ、Ｎ５０１Ｋ、Ｄ４８２Ｋ、Ｓ７２２Ｋ、Ｑ３５９Ｇ、Ｖ５５７Ｒ、Ｎ６２０Ｒ、Ｅ５８９Ｋ、Ｔ４８０Ｋ、Ｌ５２３Ｋ、Ｅ５７１Ｒ、Ｅ５７１Ｋ、Ｅ５６６Ｋ、Ｌ５２３Ｒ、及びＥ３１９Ｒ。２１個の変異体は、Ｑ５５６Ｒ及びＱ５５６Ｋを除いて、標的の各々において親ポリペプチドと比較してインデル活性の増加をもたらし、Ｑ５５６Ｒ及びＱ５５６Ｋは、ＡＡＶＳ１標的において親ポリペプチドに対して同様なインデルレベルをもたらした。３つの標的に対してインデル活性を平均化すると、２１個の変異体の各々についてのインデル活性は、親ポリペプチドのものと比べておよそ１．２倍～３．４倍高かった。Ｅ３１９Ｒは、試験した全ての変異体のインデル活性において最も高い増加をもたらした。

【0485】

実施例９－組み合わせ変異体ポリペプチドによる哺乳動物遺伝子の標的化
この実施例では、組み合わせ変異体を一過性トランスフェクションにより哺乳動物細胞中に導入し、複数の標的に対するインデル活性を評価した。

【0486】

配列番号３と比べて４～８個の置換を含む１１の組み合わせ変異体をｐｃＤＮＡ３．１バックボーン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標））中にクローニングした。導入された置換は、実施例７及び８におけるインデル活性の増加と関連していた。アミノ酸配列を表８に示す。標的及びＲＮＡガイド配列を表７に示す。細胞トランスフェクションプロトコルを実施例８に記載するように実施した。

【0487】

【表32】

【0488】

【表33】

【0489】

【表34】

【0490】

【表35】

【0491】

図３に示すように、全ての変異体は、配列番号３の親ポリペプチドと比べてより高いインデル活性を示した。試験した３つの標的にわたって平均化された組み合わせ突然変異体についてのインデル活性は、親ポリペプチドのインデル活性と比較しておよそ７．３倍～９．９倍高かった。この実施例で試験した最も性能の高い変異体である配列番号５１は、次の７個の置換を含んでいた：Ｄ８９Ｒ、Ｋ３６８Ｇ、Ｅ５６６Ｒ、Ｄ７３０Ｒ、Ｔ６０Ｒ、Ｄ３５６Ｇ、Ｐ３５３Ｇ、及びＥ５７１Ｒ。

【図1】

【図2A】

【図2B】

【図3】

【配列表】

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【国際調査報告】