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(19)【発行国】日本国特許庁(JP)
(12)【公報種別】公表特許公報(A)
(11)【公表番号】
(43)【公表日】2024-03-01
(54)【発明の名称】骨疾患を治療するための二糖類
(51)【国際特許分類】
A61K 31/7016 20060101AFI20240222BHJP
A61P 19/10 20060101ALI20240222BHJP
A61P 19/08 20060101ALI20240222BHJP
A61P 35/00 20060101ALI20240222BHJP
C07H 15/04 20060101ALI20240222BHJP
【ＦＩ】
A61K31/7016
A61P19/10
A61P19/08
A61P35/00
C07H15/04 A CSP
【審査請求】未請求
【予備審査請求】未請求
(21)【出願番号】P 2023539766
(86)(22)【出願日】2021-12-20
(85)【翻訳文提出日】2023-06-27
(86)【国際出願番号】 FR2021052408
(87)【国際公開番号】W WO2022144515
(87)【国際公開日】2022-07-07
(31)【優先権主張番号】2014257
(32)【優先日】2020-12-30
(33)【優先権主張国・地域又は機関】FR
(81)【指定国・地域】
(71)【出願人】
【識別番号】518436021
【氏名又は名称】ユニヴェルシテ・ドゥ・ピカルディ・ジュール・ヴェルヌ
(71)【出願人】
【識別番号】518436010
【氏名又は名称】サントル・オスピタリエ・ユニヴェルシテール・ダミアン－ピカルディ
(71)【出願人】
【識別番号】514282002
【氏名又は名称】アンセルム（アンスティチュ ナシオナル ドゥ ラ サンテ エ ドゥ ラ ルシェルシュ メディカル）
(71)【出願人】
【識別番号】519208029
【氏名又は名称】セントレ ナシオナル ドゥ ラ レシェルシェ サイエンティフィク
(74)【代理人】
【識別番号】100098394
【弁理士】
【氏名又は名称】山川 茂樹
(72)【発明者】
【氏名】オセイユ，ジェローム
(72)【発明者】
【氏名】コヴェンスキー，ジョゼ
(72)【発明者】
【氏名】トゥミュー，シルベストル
(72)【発明者】
【氏名】トレシュレル，エリック
(72)【発明者】
【氏名】デュスイ，クリストフ
【テーマコード（参考）】
4C057
4C086
【Ｆターム（参考）】
4C057BB03
4C057CC03
4C057DD03
4C057JJ03
4C086AA01
4C086AA02
4C086EA02
4C086EA03
4C086MA01
4C086MA02
4C086MA04
4C086MA05
4C086MA17
4C086MA66
4C086NA14
4C086ZA96
4C086ZA97
4C086ZB26
(57)【要約】
本発明は、有効成分としての次式（Ｉ）
【化１】
ALP activity (U/L/μG of proteins)：ＡＬＰ活性（Ｕ／Ｌ／μｇタンパク質）
を有する少なくとも１つの化合物（Ｉ）［式中、Ｒ１は Ｈ、ＳＯ３－から選択され、Ｒ２はＨ及びＣＯＣＨ３から選択され、Ｒ３はＨ、ＣＯＣＨ３、ベンジル、ＳＯ３－から選択される］及び上記化合物の薬学的に許容可能な塩（ただし、Ｒ１＝ＳＯ３－及びＲ２＝ＣＯＣＨ３及びＲ３＝Ｈ の式（Ｉ）の化合物及び上記化合物のナトリウム塩を除く）と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有することを特徴とする医薬組成物に関する。本発明は、生体適合性培地を含む関連キットにも関する。
【選択図】図８
【化１】
を有する少なくとも１つの化合物（Ｉ）［式中、Ｒ１は Ｈ、ＳＯ３－から選択され、Ｒ２はＨ及びＣＯＣＨ３から選択され、Ｒ３はＨ、ＣＯＣＨ３、ベンジル、ＳＯ３－から選択される］及び上記化合物の薬学的に許容可能な塩（ただし、Ｒ１＝ＳＯ３－及びＲ２＝ＣＯＣＨ３及びＲ３＝Ｈ の式（Ｉ）の化合物及び上記化合物のナトリウム塩を除く）と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤とを含有することを特徴とする医薬組成物に関する。本発明は、生体適合性培地を含む関連キットにも関する。
【選択図】図８
【特許請求の範囲】
【請求項1】
有効成分としての少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物
【請求項2】
少なくとも１つの薬学的に許容可能な塩を含有すること、及び前記塩（複数可）は、ナトリウム塩、カリウム塩、及びリチウム塩から互いに独立して選択されることを特徴とする、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項3】
前記賦形剤は、注射用塩化ナトリウム溶液から選択されることを特徴とする、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項4】
有効成分として、Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝Ｈ及びＲ３＝ＣＯＣＨ３である前記式（Ｉ）の化合物と、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＯＣＨ３及びＲ３＝Ｈである前記式（Ｉ）の化合物との混合物を含有することを特徴とする、請求項１～３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項5】
対象の体内に移植できる生体適合性支持体と、少なくとも１つの次式（Ｉ）の化合物：
【請求項6】
前記生体適合性支持体は、多孔性生体適合性支持体、特に生分解性ポリマー（複数可）、特にＰＬＡ、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、コラーゲン、ポリグリコリド、キトサン、ポリカプロラクトンを含む、又はこれらからなる支持体、セラミック（複数可）を含む又はセラミックからなる支持体、リン酸カルシウムを含む又はリン酸カルシウムからなる支持体、骨の石灰化部分を含む又は骨の石灰化部分からなる支持体から選択されることを特徴とする、請求項５に記載のキット。
【請求項7】
症状として、少なくとも局所的な骨密度の低下、特に骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症、糖尿病性骨粗鬆症、大理石骨病、骨パジェット病、骨腫瘍、癌性骨腫瘍を生じる病態の治療において、単独で又は２つ以上を組み合わせて使用するため、又は骨欠損であって、骨材料の欠失を有する骨の領域として定義される骨欠損、若しくは骨折、特に病的骨折を治療するための外科的方法において、単独で又は２つ以上を組み合わせて使用するための、次式（Ｉ）を有する化合物：
ａ）Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、及びＲ２＝ＣＯＣＨ３
ｂ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＯＣＨ３
ｃ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｄ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｅ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、及びＲ３＝ＣＯＣＨ３］及び
前記化合物の薬学的に許容可能な塩。
【請求項8】
ａ）及びｅ）に定義された前記化合物が組み合わせて使用されることを特徴とする、請求項７に定義された使用のための、請求項７に記載の化合物。
【請求項9】
次式（Ｉ）を有する化合物であって：
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【0001】
本発明は、前骨芽細胞のカルシウム産生を増加させることができ、したがって特定の骨疾患の治療に有用である、二糖類型化合物に関する。
【背景技術】
【0002】
骨折は、頻繁に起こる外傷及び骨緻密化（ｂｏｎｅ ｃｏｎｓｏｌｉｄａｔｉｏｎ）の合併症であり、整形外科医が実施した手術であるにもかかわらず、医学的問題となる。実際に、骨緻密化は不変の現象ではなく、非緻密化につながる骨折の症例が１０％存在し、これには特定の危険因子がない。対照的に、技術的誤り（特に長骨の骨幹骨折における、不十分な締結、回転制御）の場合、非緻密化のリスクは５０％と推測される。上記の２つの極値の間で、非緻密化のリスクは局所的及び全体的因子の存在に依存し、３０％に達し得る。こうした因子には、骨粗鬆症、１型糖尿病、アルコール等がある。骨粗鬆症に関連する骨折は、５０歳以上の女性の５０％と男性の２０％に影響する。骨粗鬆症は、骨の質及び量の劣化を特徴とし、骨折のリスクを著しく増加させる。
【0003】
現在の骨欠損の標準的管理は自家移植術である。骨部分は、海綿骨領から、又は皮質骨領域若しくは皮質骨－海綿骨領域から、のいずれかで採取される。これにより、石灰化画分、タンパク質画分並びにそのコラーゲン性及びコラーゲン性基質タンパク質の添加が可能になる。この細胞プールは、補填部位での骨形成プロセスの円滑な進行に十分である。
【0004】
皮質骨領域における海綿骨自家移植片の血行再建は、約１５日かかる。その後、種によって異なるが、その完全な統合には１～６ヶ月を要する。この移植片は、骨形成性、骨誘導性、骨伝導性であるという利点を有する。しかし、この技術には、痛み及び移植部位へのアクセスが限られること、外科医による大量採取が必要であること、及び採取部位での罹患など、重大な制限がある。その結果、様々な強度及び持続時間の一時的な跛行を生じ得る。自家移植の量は限られるため、外科医は、同種組織又は骨代替材料を移植し得る。これらの材料は骨伝導性であり、骨修復のための受動的支持体としてのみ使用される。しかし、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）又は自家濃縮骨髄液の経皮注入などの新たな解決策に向けた研究が行われている。後者は、骨コンピテント細胞の起源である間葉系幹細胞の導入を含む。この技術は、幹細胞の濃度に依存する一定数の骨誘導の特性を保持するが、軽度の罹患を伴う。この解決策は、採取段階による制限が残る。
【0005】
一方、ＢＭＰは、生体適合性の移植可能な支持体に導入される。これらは、骨基質の酸性化（吸収）によって、又は骨折の間に、一般的に放出される骨誘導性の内因性糖タンパク質である。ＢＭＰは、間葉細胞の局所的動員を誘発し、骨形成につながる生物学的カスケードのトリガーを可能にする。ＢＭＰはまた、合成生物学によって合成され、Ｏｓｉｇｒａｆｔ（登録商標）（ＢＭＰ７）、Ｉｎｄｕｃｔｏｓ（登録商標）、Ｉｎｆｕｓｅ（登録商標）Ｂｏｎｅ Ｇｒａｆｔ（ＢＭＰ２）の名称で、外科的治療と組み合わせて、骨緻密化分野における有効成分として販売されている。上記の薬剤は、溶液の形態であり、再構成（有効成分＋溶媒）された後、コラーゲン支持体（Ｉ型ウシコラーゲン）に導入される。この「浸漬された（ｓｏａｋｅｄ）」基質は、骨折骨緻密化手術の間、外科医によって、創傷を閉じる前に骨折した骨の上に配置される。販売承認は、ヒトでのランダム化多施設試験のおかげで得られており、その分析は、この種の製品の実際の有効性及び適応症のより適切な評価を可能にする。主な研究は、髄内釘を有する脚の開放骨折、長骨の偽関節症、脊髄関節症に焦点を合わせてきた。また、大腿骨頭の骨壊死と上顎洞の肥厚についても研究が行われている。これらでは正式承認を得ることができない。その副作用と、支持体製造の優良製造規範が存在しないことから、ＢＭＰ２及びＢＭＰ７の製造は、欧州では２０１６年に中止された。
【先行技術文献】
【特許文献】
【0006】
【特許文献1】国際公開第２００９０９８４００号
【非特許文献】
【0007】
【非特許文献1】Ｃ．Ｄｕｓｓｏｕｙ ｅｔ ａｌ，「Ｓｔｒｏｎｇ ａｐｈｉｃｉｄａｌ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ＧＩｃＮＡｃ（β→４）Ｇｌｃ ｄｉｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ：ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｅｆｆｅｃｔｓ ａｎｄ ｃｈｉｔｉｎａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ」，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａ Ｅｕｒｏｐｅａｎ ｊｏｕｒｎａｌ（独）（ＤＯＩ：１０．１００２／ｃｈｅｍ．２０１２００８８７）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【0008】
本発明が解決しようとする課題は、骨密度の低下に関連する疾患の治療において、及び／又は骨欠損若しくは骨折を治療するための外科的方法において、使用できる二糖類型化合物を提案することである。
【0009】
特に、本発明が解決しようとする別の課題は、骨誘導性（すなわち、骨形成につながる生物学的メカニズムのカスケードを誘導することができる）二糖類型化合物を提案することである。
【0010】
本発明の別の目的は、骨のより速い再生を可能にする上記のような化合物を提案することである。
【0011】
本発明の別の目的は、異所性骨形成（すなわち、他の組織の代わりに骨が形成すること）を防ぐ上記のような化合物を提案することである。
【0012】
本発明の別の目的は、骨欠損の治療を可能にするキットを提案することである。
【課題を解決するための手段】
【0013】
本発明は、特徴的に、有効成分としての少なくとも１つの式（Ｉ）の化合物
【0014】
【0015】
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３
－から選択され、Ｒ２は、Ｈ及びＣＯＣＨ３から選択され、Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ベンジル、ＳＯ３
－から選択される］及びこれらの化合物の薬学的に許容可能な塩であって、ただし、Ｒ１＝ＳＯ３
－及びＲ２＝ＣＯＣＨ３及びＲ３＝Ｈである式（Ｉ）の化合物、及びこの化合物のナトリウム塩を除き、且つＲ１＝Ｒ３＝Ｈ及びＲ２＝ＣＯＣＨ３－である式（Ｉ）の化合物を除く、化合物及び塩と、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤と、を含有する医薬組成物に関する。
【0016】
そのような組成物は、前骨芽細胞及びヒト骨芽細胞におけるカルシウム産生を増加させる可能性が高いことが証明されている。特許文献１は、次式を有する化合物を記載している。
【0017】
【0018】
この文献では、上記化合物は殺虫剤として使用されている。この文献は、上記化合物は、アレルギーや喘息のメカニズムに関与することが知られているキチナーゼを阻害する活性を有することから、薬剤として使用できることも示した。
【0019】
非特許文献１は、本発明の特定の化合物の合成、及び当該化合物を昆虫の飼育を可能にする食品組成物と混合したときに殺虫剤として使用することを記載している。これらの化合物の中にはキチナーゼを阻害する活性を持つものもあるが、全てではない。
【0020】
薬学的に許容可能な塩に関して、当該塩は、例えば、上記化合物のナトリウム塩、リチウム塩、又はカリウム塩であってもよい。
【0021】
したがって、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容可能な塩を含んでもよく、上記塩（複数可）は、ナトリウム塩、カリウム塩及びリチウム塩から互いに独立して選択される。
【0022】
好ましくは、上記組成物は、１つのナトリウム塩、又は数種のナトリウム塩を含有する。
【0023】
有利には、本発明の組成物は、有効成分として、１種以上のナトリウム塩のみを含む。
【0024】
有利には、本発明の組成物は液体形態である。したがって、組成物を、注入すること、又は支持体を含浸させるために使用することができる。
【0025】
本発明によると、賦形剤は限定されず、蒸留水、注射用塩化ナトリウム水溶液、特に９ｇ／Ｌの塩化ナトリウムを含む水溶液から選択できる。
【0026】
本発明の医薬組成物は、注射、皮下、静脈内、骨への注入、経口、粘膜、特に舌下又は鼻腔内に投与することができる。特に、当該組成物は、骨欠損に直接注入することによって使用できる。
【0027】
特定の実施形態によると、本発明の医薬組成物は、有効成分として、Ｒ１＝Ｈ；Ｒ２＝Ｈ及びＲ３＝ＣＯＣＨ３である式（Ｉ）の化合物と、Ｒ１＝Ｈ、Ｒ２＝ＣＯＣＨ３及びＲ３＝Ｈである第２の式（Ｉ）の化合物との混合物を含有する。発明者は、第２の化合物の溶媒和中の再配列により第１の上記化合物が現れることを実証した。
【0028】
有利には、混合物は、重量で２／３のＲ３＝Ｈである上記式Ｉの化合物と、１／３の第２の化合物とを含有する。
【0029】
本発明の医薬組成物は、その実施形態にかかわらず、患者の体内、特に、患者の骨若しくは骨欠損、又は密度の低い骨領域に注入すること、及びその中で固化することができるリン酸カルシウムセメントも含んでもよい。
【0030】
したがって、本発明の組成物を骨欠損に注入することにより、この欠損を埋めること、及び骨の形成を誘導する本発明の化合物を送達することが可能である。
【0031】
本発明は、対象の体内に移植できる生体適合性支持体と、次式（Ｉ）を有する少なくとも１つの化合物：
【0032】
【0033】
［式中、Ｒ１は、Ｈ、ＳＯ３
－、から選択され、Ｒ２は、Ｈ及びＣＯＣＨ３から選択され、Ｒ３は、Ｈ、ＣＯＣＨ３、ベンジル、ＳＯ３
－から選択される］、及びこれらの化合物の薬学的に許容可能な塩と、を含むキットに関する。
【0034】
発明者は、実際に、本発明の化合物が支持体上で骨量の産生を誘導することができることを実証した。
【0035】
生体適合性支持体は、有利には、骨及び／又は骨伝導性材料に置き換わることができる（すなわち、骨材料（骨）で被覆することができる）支持体である。
【0036】
上記化合物は、例えば、賦形剤が注射用塩化ナトリウム溶液である液体医薬組成物中に存在することもできる。本発明によると、上記生体適合性支持体は、有利には、多孔性生体適合性支持体、特に生分解性ポリマー（複数可）、特にＰＬＡ、ポリグリコール酸、ポリ（乳酸－ｃｏ－グリコール酸）、コラーゲン、ポリグリコリド、キトサン、ポリカプロラクトンを含む、又はこれらからなる支持体、セラミック（複数可）を含む又はセラミックからなる支持体、リン酸カルシウムを含む又はリン酸カルシウムからなる支持体、骨の石灰化部分を含む又は骨の石灰化部分からなる支持体、から選択される。
【0037】
有利には、生体適合性支持体は、コラーゲンを含む、又はコーティングからなる。
【0038】
支持体は、少なくとも１つの本発明による化合物で被覆することができ、又は本発明のキットを参照して上記で定義された化合物を含有する医薬組成物で含浸若しくは被覆することができる。
【0039】
本発明は、骨密度低下に関連する病態、特に骨粗鬆症、骨減少症、骨軟化症、骨形成不全症、糖尿病性骨粗鬆症（ｄｉａｂｅｔｏｐｏｒｏｓｉｓ）、大理石骨病、骨パジェット病、骨腫瘍、癌性骨腫瘍の治療において単独で又は２つ以上を組み合わせて使用するため、又は骨欠損若しくは骨折、特に病的骨折を治療するための外科的方法において単独で又は２つ以上を組み合わせて使用するための、次式（Ｉ）の化合物：
【0040】
【0041】
［式中、
ａ）Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、及びＲ２＝ＣＯＣＨ３
ｂ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＯＣＨ３
ｃ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｄ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｅ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、及びＲ３＝ＣＯＣＨ３］及び
これらの化合物の薬学的に許容可能な塩にも関する。これらの化合物を、生体適合性支持体と組み合わせて使用して、本発明のキットの特定の実施形態を形成できる。特定の実施形態によれば、上記のａ）およびｅ）に定義される化合物は、上記の病態の治療のため、又は上記のような外科的方法において、組み合わせて使用される。
ａ）Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ、及びＲ２＝ＣＯＣＨ３
ｂ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＯＣＨ３
ｃ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｄ）Ｒ１＝ＳＯ３ －；Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ
ｅ）Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ、及びＲ３＝ＣＯＣＨ３］及び
これらの化合物の薬学的に許容可能な塩にも関する。これらの化合物を、生体適合性支持体と組み合わせて使用して、本発明のキットの特定の実施形態を形成できる。特定の実施形態によれば、上記のａ）およびｅ）に定義される化合物は、上記の病態の治療のため、又は上記のような外科的方法において、組み合わせて使用される。
【0042】
本発明は、式中、Ｒ１＝Ｒ２＝Ｈ及びＲ３＝ＣＯＣＨ３である、次式（Ｉ）の化合物にも関する。
【0043】
【0044】
一般に、式（Ｉ）の化合物のプロポキシ置換基は、式（Ｉ）の波線によって示されるように、α位又はβ位にある。本発明の全ての実施形態に適用可能な、本発明の好ましい実施形態では、式（Ｉ）の化合物のプロポキシ置換基は、以下に示すようにα位にある。
【0045】
【0046】
定義
骨密度低下に関連する疾患又は病態は、本発明の意味の範囲内で、少なくとも局所的な骨密度低下を症状として発生する病理学的状態、又は骨密度低下、例えば骨折の結果生じる病理学的状態を指す。骨腫瘍、特に癌性骨腫瘍は、骨脆弱性を引き起こし、これを本発明の化合物で治療できる。
骨密度低下に関連する疾患又は病態は、本発明の意味の範囲内で、少なくとも局所的な骨密度低下を症状として発生する病理学的状態、又は骨密度低下、例えば骨折の結果生じる病理学的状態を指す。骨腫瘍、特に癌性骨腫瘍は、骨脆弱性を引き起こし、これを本発明の化合物で治療できる。
【0047】
病的骨折は、骨密度の低下によって引き起こされる骨折として定義される。
【0048】
本発明によると、骨欠損は、骨材料に欠損を有する骨の領域であり；骨材料内の穴又は骨材料の密度が低い領域であり得る。
【0049】
骨材料は、本発明の意味の範囲内で、固化した結合組織又は結合組織の固化を含む。
【0050】
「治療」という用語は、予防的治療と治療的治療とを含む。
【0051】
「有効成分」という用語は、対象の活性化合物が薬学的効果を得るのに十分な量で存在することを示す。
【図面の簡単な説明】
【0052】
【図1】細胞を、４ｍＭのＰｉ（Ｐｉ＝ホスホイノシチド３－キナーゼ）（対照＋Ｐｉ）、及びそれぞれ３０μＭの参照符号ＤＰ２ＳＮＡ、ＤＰ２ＮＡ、ＤＰ２Ｋ及びＤＰ２Ｓの化合物の存在下での４ｍＭのＰｉに、９日間曝露した後のＭＣ３Ｔ３－Ｅ１培養培地におけるカルシウム用量（１ウェルあたりのμｇ／ｍｇタンパク質）を示す。
【図2】二糖類並びにこれらの二糖類のナトリウム塩ＤＰ２及びＤＰ２ＮＡのそれぞれでＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を処理することによってＤ＝２５において得られたカルシウムイオン濃度の石灰化培地のみの場合に対する増加率を示す。
【図3】ＨＯｂ細胞石灰化条件下、１５、３０及び５０μＭのＤＰ２及びＤＰ２ＮＡの存在下での処理によってＤ＝１４において得られたカルシウムイオン濃度の石灰化培地のみの場合に対する増加率を示す。
【図4】ＨＯｂ細胞石灰化条件下、５、７．５、１０、１５、３０及び５０μＭのＤＰ２及びＤＰ２ＮＡの存在下での処理によってＤ＝１４において得られたカルシウムイオン濃度の石灰化培地のみの場合に対する増加率を示す。
【図5】ＤＰ２の存在下で平滑筋細胞によって産生されたカルシウムの量（μｇ）を表し、細胞は、石灰化条件下、５、７．５、１０、１５、３０及び５０μＭのＤＰ２の存在下で処理した。
【図6】石灰化条件下、３０μＭのＤＰ２Ｒ０及び１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２、又はこれらの混合物の存在下での処理の１４日後に得られたＨＯｂ細胞の石灰化のパーセンテージを表す。
【図7】石灰化条件下、（７Ａ）３０μＭのＤＰ２Ｒ２及び（７Ｂ）３０μＭのＤＰ２Ｒ２又はＤＰ２’、及び（７Ｃ）純度９５％の標識ＤＰ２Ｒ２（ＤＰ２Ｍ９５ ３０μＭ）の存在下、１４日間処理したＨＯｂ細胞で得られた石灰化のパーセンテージを表す。
【図8】以下について、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１及びＨＯｂ細胞で得られたアルカリホスファターゼの酵素活性（Ｕ／Ｌ／μｇタンパク質）を表す：（８Ａ）ＭＯ３Ｔ３－Ｅ１細胞、Ｄ＝１８日、１５、８０及び５０μＭのＤＰ２Ｒ０の存在下又は不在下、１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２との比較、（８Ｂ）ＨＯｂ細胞、Ｄ＝７日、３０μＭのＤＰ２Ｒ０の存在又は不在下、石灰化培地による１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７との比較、（８Ｃ）ＨＯｂ細胞、Ｄ＝７、３０μＭのＤＰ２Ｒ０の存在又は不在下、石灰化培地による処理、１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２及びＢＭＰ－７との比較。
【図9】ＭＴＴ試験（９Ａ）及びＷＳＴ－１試験（９Ｂ）を用いて、ＨＯｂ細胞で実施した３０μＭのＤＰ２細胞毒性のＤ＝１４における結果を表す。
【発明を実施するための形態】
【0053】
本発明の化合物の化学合成
本化合物の合成は、非特許文献１に記載のとおりである。
本化合物の合成は、非特許文献１に記載のとおりである。
【0054】
化合物ＤＰ２’の合成
化合物ＤＰ２’は、化合物ＤＰ２を水に溶解したときに形成されるＤＰ２－ＤＰ２’混合物から抽出した。化合物ＤＰ２’は、溶出溶媒として水を用いた分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分離された。
化合物ＤＰ２’は、化合物ＤＰ２を水に溶解したときに形成されるＤＰ２－ＤＰ２’混合物から抽出した。化合物ＤＰ２’は、溶出溶媒として水を用いた分取ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって分離された。
【0055】
本発明者らは、化合物ＤＰ２’が水中にあるとき、アセタート基の非局在化も存在するが、ＤＰ２→ＤＰ２’反応と比べて非常に低速であることを観察した。その結果、静置したＤＰ２’水溶液は、４４日後に、１０～１５％のＤＰ２を含有する。したがって、ＤＰ２’は、極めて長い所定の時間、水中に単独のまま残る。そのため、水溶液中のＤＰ２’の生物学的効果を試験することができる。
【0056】
同様に、本発明者らは、ＤＰ２→ＤＰ２’反応の速度が、生成化合物ＤＰ２’の抽出後に化合物ＤＰ２単独の生物活性を試験することも可能な速度であることを観察した。したがって、ＤＰ２及びＤＰ２’の２つの化合物は、所与の時間にわたって、水中で共存する可能性もしない可能性もある。
【0057】
更に、メタノールなどの他の溶媒中では、アセタート基の非局在化は観察されなかった。したがって、例えば、メタノール中では、化合物ＤＰ２は単独である。
【0058】
使用した参照符号
参照符号：ＤＰ２、ＤＰ２Ｒ０、ＤＰ２Ｒ２、ＤＰ２Ｋは、次式Ｉを有する化合物ｎ－プロピル，２－０－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル）に対応する：
参照符号：ＤＰ２、ＤＰ２Ｒ０、ＤＰ２Ｒ２、ＤＰ２Ｋは、次式Ｉを有する化合物ｎ－プロピル，２－０－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル）に対応する：
【0059】
【0060】
Ｒ０、Ｒ２及びＫの名称は、ＤＰ２分子の製造バッチを指す。
【0061】
ＤＰ２’は、次式１’を有する化合物ｎ－プロピル，３－０－アセチル－α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル）に対応する：
【0062】
【0063】
参照符号ＤＰ２Ｓは、式（Ｉ）［式中、Ｒ１＝ＳＯ３
－及びＲ２＝Ａｃである］の化合物、例えば、ｎ－プロピル，２－０－アセチル－６－Ｏ－スルホ－α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デスオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル），モノナトリウム塩に対応する。
【0064】
参照符号ＤＰ２ＮＡは、次式３を有する化合物ｎ－プロピル，α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル）に対応する：
【0065】
【0066】
参照符号ＤＰ２ＳＮＡは、化合物ｎ－プロピル，６－Ｏ－スルホ－α－Ｄ－グルコピラノシド，４－Ｏ－（２－アセトアミド－２－デスオキシ－β－Ｄ－グルコピラノシル），モノナトリウム塩に対応し、次式４を有する：
【0067】
【0068】
ｉｎ－ｖｉｔｒｏ実験
細胞培養
全ての実験で、マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ＡＴＣＣ）及びヒト初代骨芽細胞（ＨＯｂ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を用いた。マウス前骨芽細胞を、１５ｍＬのα－ＭＥＭ培地（Ｍ４５２６、ＳＩＧＭＡ）と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質及び１％グルタミンを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含む、７５ｃｍ２フラスコ内で培養した。同様に、ヒトＨＯｂ細胞を、１５ｍＬの増殖培地（ヒト骨芽細胞増殖培地、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を含む７５ｃｍ２フラスコ内で培養した。細胞は、オーブン内で、３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９０％に維持する。培地は、３日ごとに交換した。
細胞培養
全ての実験で、マウス前骨芽細胞株（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１、ＡＴＣＣ）及びヒト初代骨芽細胞（ＨＯｂ、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）を用いた。マウス前骨芽細胞を、１５ｍＬのα－ＭＥＭ培地（Ｍ４５２６、ＳＩＧＭＡ）と、１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質及び１％グルタミンを含む１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）とを含む、７５ｃｍ２フラスコ内で培養した。同様に、ヒトＨＯｂ細胞を、１５ｍＬの増殖培地（ヒト骨芽細胞増殖培地、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）を含む７５ｃｍ２フラスコ内で培養した。細胞は、オーブン内で、３７℃、５％ＣＯ２及び湿度９０％に維持する。培地は、３日ごとに交換した。
【0069】
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、６ウェルプレートに６３，７００細胞／ウェルで播種し、ＲＮＡを抽出するため、又はアルカリホスファターゼ酵素活性アッセイのために処理した。また、カルシウムアッセイのため、４８ウェルプレートに５２５０細胞／ウェルで播種した。ＨＯｂ細胞を、ＲＮＡの抽出、又はアルカリホスファターゼ酵素活性アッセイについては６ウェルプレートに１８２，０００細胞／ウェル；カルシウムアッセイについては４８ウェルプレートに１５，０００細胞／ウェル；ＭＴＴ試験又はＷＳＴ－１試験については４８ウェルプレートに１０，０００細胞／ウェル；タンパク質抽出又は蛍光については６ウェルプレートに１００，０００細胞／ウェルで播種した。
【0070】
細胞処理
石灰化を誘導するため、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸と５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸とを添加した５％ＦＣＳを含有するα－ＭＥＭ培地で処理した。ＨＯｂ細胞は、「骨芽細胞石灰化培地」（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で処理した。条件に応じて、ＤＰ２ＮＡ、ＤＰ２Ｒ０、ＤＰ２Ｒ２、ＤＰ２’、ＢＭＰ－２又はＢＭＰ－７を、種々の濃度で添加した。濾過後、細胞をそれぞれの培地で処理した（４８ウェルプレートの１ウェルあたり５００μＬ、６ウェルプレートの１ウェルあたり２ｍＬ）。
石灰化を誘導するため、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞を、１０ｍＭのβ－グリセロリン酸と５０μｇ／ｍＬのアスコルビン酸とを添加した５％ＦＣＳを含有するα－ＭＥＭ培地で処理した。ＨＯｂ細胞は、「骨芽細胞石灰化培地」（Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ）で処理した。条件に応じて、ＤＰ２ＮＡ、ＤＰ２Ｒ０、ＤＰ２Ｒ２、ＤＰ２’、ＢＭＰ－２又はＢＭＰ－７を、種々の濃度で添加した。濾過後、細胞をそれぞれの培地で処理した（４８ウェルプレートの１ウェルあたり５００μＬ、６ウェルプレートの１ウェルあたり２ｍＬ）。
【0071】
本発明の化合物の石灰化促進活性
マウス前骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）の培養培地におけるカルシウムの放出を調べた。結果を図１に示す：カルシウムの発現を大きく阻害するＤＰ２Ｓと異なり、３つのＤＰ２（ＤＰ２ＳＮＡ；ＤＰ２ＮＡ：ＤＰ２Ｋ）は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞によるカルシウム産生を増加する能力を有することを明らかに示す。
マウス前骨芽細胞（ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１）の培養培地におけるカルシウムの放出を調べた。結果を図１に示す：カルシウムの発現を大きく阻害するＤＰ２Ｓと異なり、３つのＤＰ２（ＤＰ２ＳＮＡ；ＤＰ２ＮＡ：ＤＰ２Ｋ）は、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞によるカルシウム産生を増加する能力を有することを明らかに示す。
【0072】
上記の結果に従い、ＤＰ２ＮＡ及びＤＰ２Ｒ０で２５日間処理したＭＣ３Ｔ３－Ｅ１に関する石灰化促進活性を調べた。１５μＭ（４０±２％）、３０μＭ（２８±１８％）及び５０μＭ（４０±２８％）のＤＰ２Ｒ０、並びに１５μＭ（１５±１４％）、３０μＭ（３３±１２％）及び５０μＭ（１０±１９％）のＤＰ２ＮＡの存在下、石灰化培地と比較して、石灰化の増加が観察された（図２）。
【0073】
石灰化は、ヒト骨芽細胞（ＨＯｂ、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、独国ハイデルベルク）でも研究した。上記細胞は、大腿部海綿骨組織から単離される。石灰化培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ）中で１４日処理した後、初代ＨＯｂ細胞では、石灰化条件と比較して、１５μＭ（２６±１０％）、３０μＭ（４０±１５％）のＤＰ２、並びに３０μＭ（４４±７％）及び５０μＭ（３５±８％）のＤＰ２ＮＡの存在下で、石灰化の有意な増加が観察された（図３参照）。５０μＭ（８±１７％）のＤＰ２及び１５μＭ（４５±４２％）のＤＰ２ＮＡ存在下で増加が観察されたが、それは標準偏差から有意ではない。
【0074】
ＨＯｂ細胞を低濃度（５、７．５及び１０μＭ）のＤＰ２Ｒ０及びＤＰ２ＮＡで処理した後、石灰化培地のみ場合と比べて、ＨＯｂ細胞の石灰化の低下が観察された（図４）。これは、低濃度のＤＰ２は、石灰化に対して作用せず、したがって、少し離れて、ＢＭＰの例で記載したものとは逆に、ＤＰ２の存在下では異所性骨の発達がないと考えられる。
【0075】
更に、図５に示す結果は、非石灰化対照条件において、ＤＰ２の存在は、平滑筋細胞に対する石灰化促進作用を持たない。したがって、これは、ＤＰ２は骨芽細胞以外の細胞に対して石灰化を誘発しないという仮説を補強する。
【0076】
上記の結果に基づき、ＤＰ２Ｒ０を対象分子として選択することで、研究を継続した。図６に示す結果は、３０μＭのＤＰ２Ｒ０及び１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２は、それぞれ石灰化を１８１．５７３±９．１５５％及び２１４．１５３±３７．９３８％増加することを示す。これは、３０μＭのＤＰ２Ｒ０は、文献に定義されている濃度（１００ｎｇ／ｍＬ）において、ＢＭＰ－２と同程度の活性を有することを示す。石灰化に対するＤＰ２とＢＭＰ－２との相乗効果も、ヒト骨芽細胞で研究されている。図６に見られる結果は、ＤＰ２Ｒ０及びＢＭＰ－２（１５２，９５０±１６，１７６％）は、ヒト骨芽細胞に対して相乗効果を持たないと思われることを示す。
【0077】
サービス提供業者のＲｏｏｗｉｎは、ＤＰ２Ｒ２（第２生産バッチ）と呼ばれるＤＰ２分子を供給した。上記で使用した名称ＤＰ２Ｒ０は、ＬＧ２Ａ研究所（ＵＰＪＶ、アミアン）で生産されたＤＰ２を指す。この分子の石灰化促進活性が研究されており、結果を下図７Ａに示す（ＤＰ２Ｒ２：１５９．０３±１８．７１９％）。
【0078】
ＤＰ２Ｒ２の水溶液の化学分析は、化合物ＤＰ２Ｒ２（ＤＰ２）が水と反応して化合物ＤＰ２’を与えることを示した。１／３のＤＰ２’に対して約２／３のＤＰ２Ｒ２が存在する。化合物ＤＰ２’は、３ＯＨ位へのアセタート基（Ｒ２）の移動から生じる。化合物ＤＰ２’は、前述のように単離及び合成が可能であった。化合物ＤＰ２’を水と混合したとき、ＤＰ２Ｒ２の形成につながる逆反応は観察されず、化合物ＤＰ２’のみが溶液中に存在する。この分子の石灰化促進活性も研究されており（図７Ｂ）、その結果は、３０μＭのＤＰ２’は３０μＭのＤＰ２Ｒ２と同程度の活性を持つと思われる（それぞれ１４３．８０６±３６．６５７％、１３７．０１２±５２．４５２％）ことを示す。
【0079】
本発明の分子の細胞浸透の仮説を研究するために、ＤＰ２Ｒ２を、蛍光色素分子であるフルオレセインと結合した。こうして、石灰化促進活性も試験されており、結果を図７Ｃに示す。石灰化は、３０μＭのＤＰ２Ｒ２については２０４．４７２％であり、純度９５％の標識ＤＰ２Ｒ２（ＤＰ２Ｍ９５ ３０μＭ）については２６０．４７９％である。
【0080】
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）酵素活性アッセイ
ＡＬＰは骨芽細胞によって合成される酵素である。ＡＬＰは、ヒドロキシル基とリン酸イオン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とを放出することによって、石灰化を阻害するリン酸エステルを加水分解する。骨芽細胞は、基質小胞、アルカリホスファターゼ及びイオンのリザーバを生成し、これは細胞外培地に放出されると、カルシウムイオンおよびリン酸イオンの局所的濃縮を促進することによって骨組織の石灰化を開始する。細胞を、６ウェルプレートに、ＭＣ３Ｔ３－Ｅについては１６３７００細胞／ウェル、ＨＯｂについては１８２０００細胞／ウェルで播種した。アッセイは、ＭＣ３Ｔ３－ＥＴ細胞に対して１３日間、ＨＯｂ細胞に対して７日間の処理を行った後、４８ウェルプレート上でＢｉｏＶｉｓｉｏｎアルカリホスファターゼ活性比色定量アッセイキット（ＡＬＰアッセイバッファー、ｐＮＰＰ錠剤、アルカリホスファターゼ酵素、停止液）を使用して実施した。
ＡＬＰは骨芽細胞によって合成される酵素である。ＡＬＰは、ヒドロキシル基とリン酸イオン（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）とを放出することによって、石灰化を阻害するリン酸エステルを加水分解する。骨芽細胞は、基質小胞、アルカリホスファターゼ及びイオンのリザーバを生成し、これは細胞外培地に放出されると、カルシウムイオンおよびリン酸イオンの局所的濃縮を促進することによって骨組織の石灰化を開始する。細胞を、６ウェルプレートに、ＭＣ３Ｔ３－Ｅについては１６３７００細胞／ウェル、ＨＯｂについては１８２０００細胞／ウェルで播種した。アッセイは、ＭＣ３Ｔ３－ＥＴ細胞に対して１３日間、ＨＯｂ細胞に対して７日間の処理を行った後、４８ウェルプレート上でＢｉｏＶｉｓｉｏｎアルカリホスファターゼ活性比色定量アッセイキット（ＡＬＰアッセイバッファー、ｐＮＰＰ錠剤、アルカリホスファターゼ酵素、停止液）を使用して実施した。
【0081】
ＰＢＳリンス後、５０μＬのＡＬＰアッセイバッファーをウェルに添加し、ウェルの底部をかき取って５０μＬを採取した。１３０００Ｇで３分間の遠心分離を実施して、不溶性材料を除去した。９６ウェルプレートに、各試験サンプル１０μＬを、７０μＬのＡＬＰアッセイバッファー及び５０μＬの５ｍＭ ｐＮＰＰ溶液と共に入れた。並行して、同じ９６ウェルプレートに入れることで、較正範囲を作成した。反応を、２５℃で６０分間インキュベートし、遮光した。２０μＬの停止液を加えることで反応を停止した。光学密度を４０５ｎｍで測定した。
【0082】
ＡＬＰ酵素活性アッセイの後、ＡＬＰアッセイの結果をタンパク質の数に応じて正規化するためにタンパク質アッセイを実施した。タンパク質のアッセイには、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒのＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ Ｋｉｔを用いる比色法を使用した。５ｍＬのチューブに、２ｍｇ／ｍＬのアルブミン溶液から標準範囲を調製した。９６ウェルプレートに、５μＬの標準範囲及び試験サンプルを分注した。その後、２００μＬのキット試薬をウェルに添加した。反応を５６℃で１５分間インキュベートした。光密度を５６５ｎｍで測定し、タンパク質の量を決定した。
【0083】
アルカリホスファターゼは、骨形成に不可欠な役割を果たす酵素である。骨芽細胞の分化の間、骨芽細胞によるアルカリホスファターゼの発現は時間とともに徐々に増加する。
【0084】
これに関して、ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１及びＨＯｂ細胞に対するアルカリホスファターゼ酵素活性を調べた。
【0085】
ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１では、１５μｍのＤＰ２Ｒ０（１１８．９０７±１０．４６６％）及び１５μｍのＤＰ２Ｒ０（１４８．８３３±１５．７６１％）が存在すると、石灰化培地のみ（１００％）と比較して酵素活性がわずかに増加する。この増加は、１００ｇ／ｍＬのＢＭＰ－２が存在する場合により顕著である（３０７．６４５±３０．４４０％：図８Ａ）。
【0086】
更に顕著には、ＨＯｂにおいて、処理後７日で、酵素活性は、石灰化培地のみ（１００％）と比較して、３０μＭのＤＰ２Ｒ０（２１０．４９４±１４．９７９％）及び１００ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ－２（２６２．５６７±４６．２０７％）の存在下で有意に増加する。骨石灰化で観察される結果と同様に、結果は、ＤＰ２及びＢＭＰ－２がヒト骨芽細胞に対して相乗効果がないと思われることを示す（図８Ｂ）。
【0087】
ＡＬＰ酵素活性は、３０μＭＤＰ２Ｒ２の存在下でも（１４９．７４９％）、石灰化培地のみ（１００％）の場合と比較して確認された（図８Ｃ）。
【0088】
細胞毒性試験
ＭＴＴ試験
ＤＰ２の毒性を調べるため、ＭＴＴ試験（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド）を使用して、細胞生存率を測定した。ＨＯｂ細胞を４８ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１０，０００細胞）、２日後に細胞を３０μＭのＤＰ２で処理し、処理後Ｄ２、Ｄ４、７、Ｄ１４に、ＭＴＴ試験を実施した。
ＭＴＴ試験
ＤＰ２の毒性を調べるため、ＭＴＴ試験（３－（４，５－ジメチル－２－チアゾリル）－２，５－ジフェニル－２Ｈ－テトラゾリウムブロミド）を使用して、細胞生存率を測定した。ＨＯｂ細胞を４８ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１０，０００細胞）、２日後に細胞を３０μＭのＤＰ２で処理し、処理後Ｄ２、Ｄ４、７、Ｄ１４に、ＭＴＴ試験を実施した。
【0089】
フェノールレッド不含ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地）で細胞を洗浄した後、希釈ＭＴＴ溶液２５０μＬを各ウェルに加え、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。ホルマザンに還元されたＭＴＴの量は、生細胞に比例する。紫色のホルマザン結晶を２２０μＬのＤＭＳＯで可溶化し、撹拌して着色を均質化した後、５６０ｎｍにおける吸光度を測定した（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。対照群と実験群との間で細胞生存率を比較することで、細胞毒性を評価した。
【0090】
ＷＳＴ－１試験
ＤＰ２の毒性は、別の細胞生存試験であるＷＳＴ－１（テトラゾリウム塩）でも研究されている。ＨＯｂ細胞を４８ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１０，０００細胞）、２日後、細胞を３０μＭのＤＰ２で処理し、処理後Ｄ２、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１４に、ＷＳＴ－１試験を実施した。
ＤＰ２の毒性は、別の細胞生存試験であるＷＳＴ－１（テトラゾリウム塩）でも研究されている。ＨＯｂ細胞を４８ウェルプレートに播種し（１ウェルあたり１０，０００細胞）、２日後、細胞を３０μＭのＤＰ２で処理し、処理後Ｄ２、Ｄ４、Ｄ７、Ｄ１４に、ＷＳＴ－１試験を実施した。
【0091】
処理の終了時に、１００μＬの希釈ＷＳＴ－１溶液（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を各ウェルに添加し、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。細胞増殖はミトコンドリア脱水素酵素の活性の増加を誘導し、これはテトラゾリウム塩を切断してホルマザンにする。ホルマザン染料の量は、４５０ｎｍにおける吸光度を測定することにより定量した（Ｅｎｖｉｓｉｏｎ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）。結果は、未処理の対照条件と比較した、生存率のパーセンテージで表される。
【0092】
本発明の分子が骨芽細胞の生存に影響を与えるか否かを判定する前に、その細胞毒性をＭＴＴ試験とＷＳＴ‐１試験によりＨＯｂ細胞で試験した。培養培地（Ｃｔｒｌ）又は石灰化培地（Ｍｉｎ）を用いて３０μＭのＤＰ２で２、４、７、及び１４日間（Ｄ）処理した。
【0093】
図９に示すように、４回の試験で異なる治療条件間に有意な差は認められない。骨芽細胞アポトーシスによる細胞生存率の低下がＤ１４で観察され、これは誘導された石灰化と相関する。これらの結果は、３０μＭのＤＰ２はＨＯｂ細胞に対する毒性を持たないことを示唆した。
【0094】
ｉｎ－ｖｉｖｏ実験
動物
動物の飼育と実験手順は、欧州連合指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施され、ピカルディ・ジュール・ヴェルヌ大学（ＵＰＪＶ）からの倫理委員会（ＣＲＥＭＥＡＰ，ＣＥＥＡ Ｎ°９６；ＡＰＡＦＩＳ＃１５４６４－２０１８０６０８１０５６６７６５ ｖ２）によってバリデーションされた。
動物
動物の飼育と実験手順は、欧州連合指令（２０１０／６３／ＥＵ）に従って実施され、ピカルディ・ジュール・ヴェルヌ大学（ＵＰＪＶ）からの倫理委員会（ＣＲＥＭＥＡＰ，ＣＥＥＡ Ｎ°９６；ＡＰＡＦＩＳ＃１５４６４－２０１８０６０８１０５６６７６５ ｖ２）によってバリデーションされた。
【0095】
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラットは、Ｊａｎｖｉｅｒ Ｌａｂｓ（仏国ル・ジェニスト＝サン＝イル）によって提供され、ＵＰＪＶのプラタン動物施設に収容されている。ラットを、１２時間の昼夜サイクル下、温度２２±２℃及び湿度５０％に維持した。全てのラットは水と食物ペレットを自由に利用でき、ラットの体重変化が監督された。
【0096】
実験計画
骨再構築現象の加速による二糖類の骨誘導能を評価するため、並びに最適なＤＰ２分子の濃度、及び骨折緻密化手術の生理学的条件下で最も適応された支持体の性質（炎症反応、細胞活性）を決定するため、ラットの頭蓋骨に２つの骨欠損を作成した。
骨再構築現象の加速による二糖類の骨誘導能を評価するため、並びに最適なＤＰ２分子の濃度、及び骨折緻密化手術の生理学的条件下で最も適応された支持体の性質（炎症反応、細胞活性）を決定するため、ラットの頭蓋骨に２つの骨欠損を作成した。
【0097】
３種の支持体と２種の濃度のＤＰ２を試験した。このため、８週間齢の雄のＳｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙラット１０２匹を、以下のような１２の実験群（グループ）に分けた。
【0098】
－支持体１：生物活性リン酸カルシウム骨代替品（ＭＢＣＰ：Ｂｉｏｍａｌｔａｎｔｅ、仏国ヴィニュー＝ド＝ブルターニュ）
グループ１（Ｓ１Ｌ１）：ＭＢＣＰ支持体のみ
グループ２（Ｓ１Ｌ２）：ＭＢＣＰ支持体＋ＤＰ２［３ｍＭ］
グループ３（Ｓ１Ｌ３）：ＭＢＣＰ支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ４（Ｓ１Ｌ４）：ＭＢＣＰ支持体＋ＢＭＰ－２
－支持体２：ウシ由来の石灰化部分からなる骨代替品（Ｂｉｏ－ｏｓｓ；仏国ロワシー＝アン＝フランス）
グループ５（Ｓ２Ｌ５）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体のみ
グループ６（Ｓ２Ｌ６）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＤＰ２［３ｍＭ］
グループ７（Ｓ２Ｌ７）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ８（Ｓ２Ｌ８）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＢＭＰ－２
－支持体３：ウシアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）
グループ９（Ｓ３Ｌ９）：コラーゲン支持体のみ
グループ１０（Ｓ３Ｌ１０）：コラーゲン支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ１１（Ｓ３Ｌ１１）：コラーゲン支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ１２（Ｓ３Ｌ１２）：コラーゲン支持体＋ＢＭＰ－２
グループ１（Ｓ１Ｌ１）：ＭＢＣＰ支持体のみ
グループ２（Ｓ１Ｌ２）：ＭＢＣＰ支持体＋ＤＰ２［３ｍＭ］
グループ３（Ｓ１Ｌ３）：ＭＢＣＰ支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ４（Ｓ１Ｌ４）：ＭＢＣＰ支持体＋ＢＭＰ－２
－支持体２：ウシ由来の石灰化部分からなる骨代替品（Ｂｉｏ－ｏｓｓ；仏国ロワシー＝アン＝フランス）
グループ５（Ｓ２Ｌ５）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体のみ
グループ６（Ｓ２Ｌ６）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＤＰ２［３ｍＭ］
グループ７（Ｓ２Ｌ７）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ８（Ｓ２Ｌ８）：Ｂｉｏ－ｏｓｓ支持体＋ＢＭＰ－２
－支持体３：ウシアキレス腱のＩ型コラーゲン（Ｓｉｇｍａ）
グループ９（Ｓ３Ｌ９）：コラーゲン支持体のみ
グループ１０（Ｓ３Ｌ１０）：コラーゲン支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ１１（Ｓ３Ｌ１１）：コラーゲン支持体＋ＤＰ２［９ｍＭ］
グループ１２（Ｓ３Ｌ１２）：コラーゲン支持体＋ＢＭＰ－２
【0099】
使用ラット数を減らすために、ラット１頭につき２つの骨欠損を作成し、１つの欠損はブランクのままとし、各ラットの内部対照として使用した。したがって、支持体のみのグループは、実験の対照とみなされる。ＤＰ２及びＢＭＰ－２を生理食塩水で希釈し、支持体と混合し、頭蓋欠損に入れた。支持体のみの条件では、後者は滅菌生理食塩水と混合される。
【0100】
手術
ラットは、上記の１２グループのいずれかに割り当てた後、マスクにＩｓｏＶｅｔ（イソフルラン）を使用して麻酔した（誘導５％、維持量２～３％）。５分後に、動物の足又は尾をつまんで侵害受容試験を行い、麻酔の有効性を確認した。ワークステーションでは、切開に次いで、シェービングとベテジンによる消毒を実施した。
ラットは、上記の１２グループのいずれかに割り当てた後、マスクにＩｓｏＶｅｔ（イソフルラン）を使用して麻酔した（誘導５％、維持量２～３％）。５分後に、動物の足又は尾をつまんで侵害受容試験を行い、麻酔の有効性を確認した。ワークステーションでは、切開に次いで、シェービングとベテジンによる消毒を実施した。
【0101】
局所麻酔は、５ｍｇ／ｍＬに希釈した７ｍｇ／ｋｇの２％リドカイン（２０ｍｇ／ｍＬ）も用いて実施した。
【0102】
ワークステーションで、正中線に沿って１５ブレードのコールドメスを用いて皮膚の切開を行い、その後皮下組織の剥離を行った。次に、骨膜の正中線に沿って切開し、持ち上げ及び横方向変位を行った。バリを用いて、出来るだけ大きな間隔をとることで、上矢状静脈洞に触れずに、矢状縫合の両側に直径５ｍｍの２つの頭蓋病変を実施した。ミリング工程では生理食塩水を使用した。グループに応じて、左側に支持体の移植を行い；支持体のない右側を、支持体なしの病変の影響及び自然修復プロセスを評価するための対照として使用した。骨膜を所定の位置に戻し、７－０皮膚縫合糸で縫合した。皮膚も所定の位置に戻し、４－０皮膚縫合糸で閉じた。
【0103】
ラットに鎮痛剤として０．０５ｍｇ／ｋｇのブプレノルフィンを皮下注射した。覚醒後、ラットを１ケージにつき１ラットを入れることで、従来の収容条件に戻した。動物は毎日監督され、動物福祉の監視が行われた。
【0104】
全ての動物は、合併症なく研究期間中生存した。３か月後、欠損部位への感染、血腫、壊死の臨床徴候は認められなかった。これは、ＤＰ２がｉｎ ｖｉｖｏ毒性効果を持たないことを示す。更に、全てのラットが骨再構成の均質性を示し、これは、各ラットの内部対照として使用された全て、空洞で得られた値を計算することで評価した。Ｄ１４とＤ６３との間に骨修復の有意な増加（ピーク）が観察され、Ｄ６３から始まる高原のように有意性の低い増加が見られた。３種の支持体について得られた結果を、次の表１に要約する。
【0105】
【0106】
表１の結果は、２つのＭＢＣＰ＋ＤＰ２群が術後Ｄ２９からのＭＢＣＰ単独群と比較して骨石灰化相対を増加させることを示している。３つのＢｉｏ－ｏｓｓ群はＢｉｏ－ｏｓｓ単独群と比較して効果がなく、これはウサギの頭蓋欠損モデルでも観察された（Ｌｅｖｅｎｔｉｓ ｅｔ ａｌ．２０１８年）。これは、支持体による放出の問題によって説明できる。コラーゲン＋ＤＰ２［３ｍＭ］群のみが、Ｄ１４の骨石灰化を増加させる。
【0107】
興味深いことに、ＭＢＣＰ＋ＢＭＰ－２群は時間の経過とともに異所性骨を形成することが確認され、これは、ＢＭＰ－２の副作用として観察されているものと同様と思われる。さらに、コラーゲン＋ＢＭＰ－２群は、古い骨と新しく形成された骨との間に連続的な骨修復を形成しない。これは、化合物ＤＰ２には当てはまらない。
【図1】
【図2】
【図3】
【図4】
【図5】
【図6】
【図7】
【図8】
【図9】
【国際調査報告】